UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE FARMÁCIA...outsourcing com o grupo General Lab Portugal desde...

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMÁCIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

Inês Alexandra Tita Fernandes

ORIENTAÇÃO:

Dra. Joana Gomes

Laboratório do Hospital de Santiago

Grupo General Lab

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

LISBOA 2016

Mestrado em Análises Clínicas – Relatório de Estágio

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RESUMO

O presente documento consiste no elemento de avaliação final do Curso de

Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.

Este trabalho é constituído pelo Relatório de Estágio, na qual é apresentado o local de

estágio e a sua caracterização, bem como a descrição de cada uma das valências

abrangidas, com ênfase sobre os ensaios realizados, controlo de qualidade interno e a

avaliação externa da qualidade. Este estágio curricular do Mestrado em Análises

Clínicas decorreu no Laboratório do Hospital de Santiago, o qual pertence ao Grupo

General Lab, no qual foram abrangidas diferentes valências tais como Bioquímica,

Imunologia, Hematologia e Microbiologia. Cada uma das diversas áreas analíticas

Palavras-Chave:

Análises Clínicas; Bioquímica Clínica; Hematologia; Microbiologia; Imunologia


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ABSTRACT

The present document represents the element of final evaluation of the Master in

Clinical Analysis of the Faculty of Pharmacy, University of Lisbon. This paper work is

the Internship Report, in which it is presented the location and its characterization, as

well as the description of each of the valences covered, with emphasis on the assays

performed, the internal quality control and external evaluation of quality. This curricular

internship was conducted in the Laboratory of the Hospital de Santiago, which belongs

to General Lab group, where the following internship areas were performed:

Biochemistry, Immunology, Hematology and Microbiology.

Keywords:

Clinical Analysis; Clinical Biochemistry; Hematology; Microbiology; Immunology


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AGRADECIMENTOS

Venho desta forma exprimir os meus mais profundos agradecimentos à minha

orientadora, a Doutora Joana Gomes, que demonstrou o seu apoio e acompanhamento,

os quais foram indispensáveis para que conseguisse atingir o objectivo deste trabalho da

melhor forma. Agradeço também à restante equipa do laboratório, que foram

fundamentais na construção deste relatório.

Aos meus pais e irmã, por sempre terem demonstrado um apoio e carinho

valiosos, por terem dado sempre o melhor de si na minha educação, obrigado por

estarem presentes nos momentos mais importantes.

Aos meus colegas de curso, por todos os minutos dentro e fora da faculdade,

todos os momentos, ideias trocadas, paciência e consolo nas horas difíceis.

E por último, um agradecimento muito especial ao David, pelo grande

companheirismo, amor e compreensão. Obrigado pela motivação e sobretudo pela

eterna paciência que foram fundamentais em cada momento, desde os mais fáceis aos

mais difíceis.

A todos o meu Muito Obrigado!


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ÍNDICE

INTRODUÇÃO ……………………………………….…………………………….16

1. FASE PRÉ-ANALÍTICA……………………………….……………………….18

1.1. Preparação do doente ……………………………………………………….19

1.2. Colheita de Amostras …………………………………………………….…20

1.2.1. Colheita de Sangue ………………………………………..................20

1.2.2. Colheita de Urina ……………………………………………………21

1.2.3. Colheita de exsudados……………………………………………….22

1.2.4. Colheita de Outros Líquidos Biológicos……………………………..22

2. HEMATOLOGIA……………………………………………………………….25

2.1. Cell-Dyn 3500………………………………………………………………26

2.1.1. Hemograma…………………………………………………………..28

2.1.2. Reticulócitos………………………………………………………….37

2.1.3. Controlo de Qualidade Interno ……………………………………...38

2.1.4. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………..38

2.2. ACL 7000……………………………………………………….…………..38

2.2.1. PT, Tempo de Protrombina…………………………………………..39

2.2.2. aPPT, Tempo de Tromboplastina Parcial Activada……………….…42

2.2.3. Fibrinogénio…………………………………………………………..43

2.2.4. Controlo de Qualidade Interno…………………………………….…44

2.2.5. Avaliação Externa da Qualidade…………………………………..….44

2.3. ORTHO BioVue® System………………………………………………..…44

2.3.1. Tipagem AB0…………………………………………………..……..45

2.3.2. Tipagem RhD…………………………………………..……………..46

2.3.3. Teste de Coombs……………………………………………………..46


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2.4. Métodos Manuais………………………………………………………...……47

2.4.1. Velocidade de Sedimentação………………………………………...…47

2.4.2. Crioaglutininas……………………………………………………...…..49

3. MICROBIOLOGIA …………………………………………………………..…..51

3.1. Urocultura……………………………………………………………………..56

3.2. Exsudado Vaginal e Uretral…………………………………………………..59

3.3. Exsudado Faríngeo……………………………………………………………62

3.4. Exsudado Nasal…………………………………………………………….....63

3.5. Hemocultura……………………………………………………………..……64

3.6. Coprocultura………………………………………………………………..…66

3.7. Expectoração e Secreções Brônquicas……………………………………...…68

3.8. Exsudado Purulento………………………………………………………..…70

3.9. Outras actividades desenvolvidas na área da microbiologia…………….…....71

3.10. Antibiogramas…………………………………………………………..72

3.11. Controlo de Qualidade Interno……………………….……………..…73

3.12. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………….74

4. IMUNOLOGIA……………………………………………………………………75

4.1. Vidas…………………………………………………………………………..75

4.1.1. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)…………………………….76

4.1.2. Controlo de Qualidade Interno…………………………………………77

4.1.3. Avaliação Externa da Qualidade………………………………………..78

4.2. Serologia / Técnicas Manuais………………………………………………….78

4.2.1. Serologia para Treponema pallidum……………………………………79

4.2.2. Serologia para Salmonella………………………………………...……80

4.2.3. Serologia para Mononucleose Infecciosa…………………….……..….81


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5. BIOQUÍMICA…………………………………………………………………….83

5.1. Dimension Xpand……………………………………………………………..83

5.1.1. Glucose…………………………………………………………………85

5.1.2. Proteínas Totais…………………………………………………………87

5.1.3. Albumina……………………………………………………………….89

5.1.4. Ferritina…………………………………………………………………90

5.1.5. Proteína C reactiva……………………………………………………...92

5.1.6. Ureia…………………………………………………………………….93

5.1.7. Creatinina……………………………………………………………….95

5.1.8. Ácido Úrico…………………………………………………………….97

5.1.9. Bilirrubinas……………………………………………………………..98

5.1.9.1. Bilirrubina Total………………………………………………..99

5.1.9.2. Bilirrubina Directa……………………………………………..100

5.1.10. Triglicéridos…………………………………………………………..102

5.1.11. Colesterol Total……………………………………………………….103

5.1.12. Colesterol HDL……………………………………………………….105

5.1.13. Colesterol LDL……………………………………………………….107

5.1.14. Lactato Desidrogenase (LDH)……………………………………….108

5.1.15. Creatina Cinase (CK)…………………………………………………110

5.1.16. α-Amilase……………………………………………………………..111

5.1.17. Cálcio………………………………………………………………….113

5.1.18. Ferro………………………………………………………………….114

5.1.19. Fósforo……………………………………………………………….116

5.1.20. Magnésio……………………………………………………………..118

5.1.21. Gonadotropina Coriónica Humana (β-HCG)…………………………119


8

5.1.22. Hormona Estimulante da Tiróide (TSH)……………………………..120

5.1.23. Tiroxina Total (T4)…………………………………………………...122

5.1.24. Ionograma……………………………………………………………123

5.1.25. Aspartato Aminotransferase (AST) …………………………………126

5.1.26. Alanina Aminotransferase (ALT) …………………………………...127

5.1.27. Gama Glutamiltransferase (GGT) …………………………………...128

5.1.28. Fosfatase Alcalina (PAL) ……………………………………………130

5.1.29. Controlo de Qualidade Interno………………………………………131

5.1.30. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………..132

5.2. Hi-AUTO A1C………………………………………………………………132

5.2.1. Hemoglobina Glicada (HbA1c)………………………………………133

5.2.2. Controlo de Qualidade Interno……………………………………….134

5.2.3. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………...134

5.3. Clinitek 500………………………………………………………………….135

5.3.1. Urina Tipo II……………………………………………………….....135

6. CONTROLO DE QUALIDADE……………………………………………….141

6.1. Controlo de Qualidade Interno……………………………………………..141

6.2. Avaliação Externa da Qualidade……………………………………………142

7. VALIDAÇÃO BIOPATOLOGICA ……………………………………………143

BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………………….144


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INDICE DE TABELAS

Tabela 1. Equipamentos, parâmetros e metologias do sector de Hematologia….…….26

Tabela 2. Parâmetros constituintes do eritrograma.……………………………………29

Tabela 3. Importância clínica dos elementos do leucograma……………………….....30

Tabela 4. Alterações na contagem de plaquetas…………………………………….....32

Tabela 5. Alterações passíveis de serem observadas no esfregaço de sangue

periférico…………………………………………………………………………….….35

Tabela 6. Causas de INR aumentado………………………………………………...…41

Tabela 7. Causas de aPTT aumentado…………………………………………………42

Tabela 8. Alterações do fibrinogénio…………………………………………………..43

Tabela 9. Causas da elevação da VS e factores influentes…………………………….48

Tabela 10. Presença de Crioaglutininas………………………………………………..50

Tabela 11. Controlo de Qualidade Interno Microbiologia……………………………..74

Tabela 12. Alterações dos valores de glucose…………………………………………86

Tabela 13. Alterações dos valores das Proteínas totais………………………………..88

Tabela 14. Alterações dos valores da Albumina……………………………………….90

Tabela 15. Alterações dos valores da Ferritina………………………………………...91

Tabela 16. Causas do aumento de PCR………………………………………………..93

Tabela 17. Causas do aumento de ureia………………………………………………..95

Tabela 18. Alterações da creatinina……………………………………………………96


10

Tabela 19. Causas do aumento de ácido úrico…………………………………………98

Tabela 20. Causas do aumento das bilirrubinas………………………………………101

Tabela 21. Causas do aumento de triglicéridos……………………………………….103

Tabela 22. Alterações do colesterol total……………………………………………...105

Tabela 23. Alterações do colesterol HDL…………………………………………….106

Tabela 24. Situações que podem levar ao aumento de LDH…………………………109

Tabela 25. Situações que podem levar ao aumento de CK…………………………..111

Tabela 26. Situações que podem levar ao aumento de α-Amilase……………………112

Tabela 27. Alterações do Cálcio……………………………………………………..114

Tabela 28. Alterações do Ferro………………………………………………………116

Tabela 29. Alterações do Fósforo……………………………………………………117

Tabela 30. Alterações do Magnésio………………………………………………….119

Tabela 31. Alterações da TSH……………………………………………………….121

Tabela 32. Alterações da T4…………………………………………………………123

Tabela 33. Alterações do Ionograma…………………………………………………125

Tabela 34. Relação AST/ALT………………………………………………………..128

Tabela 35. Aumento da GGT………………………………………………………...129

Tabela 36. Aumento da ALP…………………………………………………………131

Tabela 37. Urina II……………………………………………………………………136

Tabela 38. Sedimento urinário………………………………………………………..139


11

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Cassete do ORTHO BioVue® System……………………………………..45

Figura 2. Como semear uma urocultura………………………………………………57


12

INDICE DE ESQUEMAS

Esquema 1. Fluxograma Urocultura………………………………………………….58

Esquema 2. Fluxograma Exsudade Vaginal e Uretral………………………………..61

Esquema 3. Fluxograma Exsudado Faríngeo…………………………………………63

Esquema 4. Fluxograma Exsudado Nasal……………………………………………64

Esquema 5. Fluxograma Hemocultura……………………………………………….65

Esquema 6. Fluxograma Coprocultura……………………………………………….67

Esquema 7. Fluxograma Expectoração e Secreções Brônquicas…………………….69

Esquema 8. Fluxograma Exsudado Purulento……………………….……………….70


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LISTA DE ABREVIATURAS

ADH – Hormona Anti Diurética

ALT – Alanina aminotransferase

aPPT - Tempo de Tromboplastina Parcial Activada

AST – Aspartato aminotransferase

β-HCG - Gonadotropina Coriónica Humana fracção β

BHI – Brain Heart Infusion

BK – Bacilo de Koch

CAM – Gelose Campylosel

CHGM - Concentração de Hemoglobina Globular Média

CK - Creatina Cinase

CLED - Cystine Lactose Electrolyte Deficient

CMV – Citomegalovírus

COS - Gelose Columbia + 5% sangue de carneiro

EDTA – Ácido Etilenodiaminatetracético

EIA - Imunoensaio enzimático

EIC - Empresa Internacional de Certificação

ELFA - Enzyme linked fluorescente assay

GGT – Gama glutamiltransferase


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GV – Glóbulos Vermelhos

HAEM2 - Gelose Chocolate Haemophilus 2

HbA1c - Hemoglobina Glicada

HDL – High Density Lipoprotein

HEKT - Gelose Hektoen

HGM - Hemoglobina Globular Média

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana

HPLC - Cromatografia de alta performance

INR - Razão de Normalização Internacional

ISI - International Sensitivity Index

LDH - Lactato Desidrogenase

LDL – Low Density Protein

MAPSS - Multi-Angle-Polarized-Scatter-Separation

MCK - Gelose Mac Conkey

MSA2 - Gelose Mannitol Salt Agar 2

NEQAS - National External Quality Assessment Schemes

PAL – Fosfatase Alcalina

PCR - Proteína C reactiva

PSA- Antigénio Específico da Próstata

PT – Tempo de Protrombina


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RDW - Coeficiente de Distribuição Eritrocitária

RIQAS - Randox International Quality Assessment Scheme

RNA – Ácido Ribonucleico

RPR - Rapid Plasma Reagin

SEHH - Sociedade Espanhola de Hematologia e Hemoterapia

SEQC - Sociedade Espanhola de Bioquímica Clínica e Patologia Molecular

SGC2 - Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2

SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

SMS – Slide-Maker-Stainer

STRB - Gelose Strepto B

TPHA - Treponema Pallidum Hemaglutination

TSH - Hormona Estimulante da Tiróide

VCAT3 - Gelose Chocolate + Gelose PolyViteX

VGM – Volume Globular Médio

VLDL – Very Low Density Lipoprotein


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INTRODUÇÃO

O estágio curricular em Análises Clínicas encontra-se contemplado no plano de

estudos do curso Mestrado em Análises Clínicas e tem por objectivos principais

fomentar a integração no meio profissional e o contacto com os outros profissionais de

saúde, aplicar os conhecimentos adquiridos ao longo do mestrado no contexto real de

trabalho de forma a desenvolver a capacidade de trabalho em equipa, compreender a

estrutura e organização de um laboratório bem como a cadência das actividades diárias,

e também promover o contacto com os doentes, aplicando princípios éticos e

deontológicos.

Este estágio decorreu no período compreendido entre Fevereiro e Agosto de

2015, no laboratório do Hospital de Santiago, em Setúbal, no qual foram englobadas as

valências de bioquímica, imunologia, hematologia e microbiologia. O Hospital de

Santiago disponibiliza uma ampla oferta de especialidades médicas e cirúrgicas, meios

complementares de diagnóstico com recurso a tecnologia recente e todas as condições

necessárias para internamento e realização de procedimentos cirúrgicos, estando

referenciado como a unidade privada de saúde com maior diferenciação na zona sul do

país, nomeadamente para tratamento de doentes oncológicos por radioterapia. Deste

hospital faz parte também o laboratório de análises clínicas que funciona em regime de

outsourcing com o grupo General Lab Portugal desde 2010, que se encontra sediado em

Lisboa. A General Lab Portugal inicia o seu percurso na gestão de laboratórios

hospitalares em 2006, tendo como primeiro parceiro o Grupo Espírito Santo Saúde, o

qual integra o Hospital de Santiago. Devido ao regime de outsourcing implementado,

grande parte das análises e parâmetros realizados são enviados para o laboratório central

através de um serviço de estafetas especializado no transporte deste tipo de produtos.


17

O laboratório do Hospital de Santiago é composto por diferentes sectores

principais tais como a hematologia, bioquímica e microbiologia, supervisionadas pelo

director técnico. O laboratório recebe todos os dias pedidos de ambulatório,

internamentos e urgências. São executadas cerca de 15000 análises por mês, destas 80%

são requisitadas por doentes em ambulatório, 5% a doentes internados e 15% em

urgência. Actualmente, cerca de 75% das análises estão automatizadas.

O laboratório encontra-se, na sua totalidade, inserido num sistema de

certificação Multisite Labco, certificado pela Empresa Internacional de Certificação

(EIC) de acordo com a NP EN ISO 9001:2008, num processo que ficou concluído a 24

de Março de 2014.

O presente trabalho tem como propósito apresentar o local de estágio, focando as

diferentes fases do processo analítico, desde a fase pré-analítica, passando pelo

processamento dos vários produtos biológicos, à realização dos diferentes ensaios para

os diversos parâmetros efectuados e seu significado clínico, à metodologia utilizada nos

vários equipamentos, validação biopatológica, e ainda o controlo de qualidade interno e

a avaliação externa da qualidade.


18

1. FASE PRÉ-ANALÍTICA

Os dados analíticos obtidos num laboratório de análises clínicas têm uma grande

influência relativamente à decisão dos clínicos no diagnóstico dos doentes, o que é

particularmente importante em doentes que se encontrem em condições clínicas graves.

Neste contexto é necessário tem em conta os níveis de qualidade com os quais se

trabalha. A fase pré-analítica está referenciada como a etapa onde se verificam a maioria

dos erros laboratoriais, sendo que engloba a preparação apropriada do indivíduo antes

da colheita da amostra, a obtenção da amostra propriamente dita, tratamento e

conservação da mesma e critérios de rejeição. A dificuldade reside sobretudo no

controlo das variáveis pré-analíticas, nomeadamente na preparação do utente, colheita

da amostra e sua identificação, e transporte e conservação dos diferentes produtos

biológicos. Trata-se de uma fase com maior erro associado ao factor humano pois

grande parte dos processos não é automatizada. De forma a prevenir o erro e garantir

resultados com maior qualidade, estão estabelecidos procedimentos a cumprir.

A Fase Pré-Analítica inicia-se com a chegada da prescrição médica à recepção

do laboratório, passando pelas diferentes etapas até à fase analítica. De seguida são

descritos alguns dos principais pontos e procedimentos da fase pré-analítica.


19

1.1. PREPARAÇÃO DO DOENTE

Antes da colheita das amostras propriamente ditas, é crucial que o doente seja

preparado e informado de forma adequada. A preparação do doente é importante na

medida em que permite minimizar a interferência que diversos factores biológicos

controláveis bem como factores extrínsecos e comportamento.

O laboratório dispõe de um folheto com instruções gerais de colheita para que o

doente possa estar preparado de forma correcta consoante as análises a realizar, como

exemplo:

Preparação para colheira de sangue – Jejum de 8 horas; evitar a ingestão de

gorduras na véspera e bebidas alcoólicas; jejum de 12 horas em caso de análises

ao perfil lipídico, etc.

Preparação para colheita de urina – Colheita da primeira urina da manhã em

boião esterilizado; Evitar toma de antibiótico na semana antecedente no caso de

uma urocultura, etc.

No caso de um pedido de PSA, evitar ecografias e exames prostáticos na semana

antecedente, entre outros exemplos.


20

1.2. COLHEITA DE AMOSTRAS

A colheita de amostras é um dos passos mais decisivos num laboratório de análises

clínicas, pois trata-se do momento no qual existe um contacto íntimo e privilegiado

entre o doente e o laboratório afectando a credibilidade e confiança nos resultados.

As amostras são maioritariamente colhidas nas salas de colheita adjacentes ao

laboratório, sendo as restantes colhidas no Serviço de Observação do Atendimento

Médico Permanente, no Internamento ou ainda nos serviços de gastroenterologia e

ginecologia.

1.2.1. Colheita de Sangue

O produto biológico mais requisitado é o sangue, O sangue é o produto

biológico mais utilizado nas análises clínicas, atribuído ao facto de a grande maioria dos

analitos se encontrar disponível neste.

O técnico que executa a colheita chama o utente pelo nome que consta na folha

de colheita, confirmando o nome completo do utente na credencial. Os tubos destinados

à colheita são identificados com etiquetas com código de barras, com o nome do utente,

número do tubo e data. Nesta fase são também recepcionadas outras amostras, como

seja, urina, fezes, etc. Confirma-se a conformidade no que se refere à preparação do

utente. O técnico deve proceder à higienização das mãos com uma solução alcoólica a

70º, ou protecção das mesmas colocando luvas novas. Verifica-se o material de colheita

a utilizar, sendo utilizado geralmente o sistema de tubos com vácuo e agulha com

adaptador. É então colocado o garrote, para melhor detecção das veias e selecionar a

zona de punção, tendo o cuidado de selecionar uma veia que seja facilmente palpável,


21

evitar o braço do lado de um peito que tenha sofrido mastectomia, evitar algum local

com hematoma, edema ou contusão visíveis. A zona onde se realiza a punção deve ser

desinfectada com algodão embebido em álcool a 70%, e é pedido ao utente que feche a

mão. Efectua-se a punção e colheita do volume de sangue necessário, de forma suave e

rápida, com a agulha num ângulo de 15 a 45º. Assim que o sangue começar a fluir no

tubo, o garrote é desapertado, deve ser pedido ao doente para abrir a mão e no final

retira-se a agulha colocando-se de imediato um algodão para compressão da picada. A

agulha é descartada em contentor próprio para perfurantes (tipo IV) e procede-se à

homogeneização dos tubos por inversão. É colocado um penso rápido no local da

punção e retirado o garrote. A colheita é terminada depois de se assegurar que o utente

se encontra bem. (1)

Da colheita de sangue total podem resultar outros produtos derivados, sendo

estes o soro, quando o sangue é colhido para tubos secos e posteriormente centrifugado,

e o plasma, quando o tubo tem anticoagulante. Os anticoagulantes mais utilizados são o

EDTA, em hematologia, e o citrato de sódio, especialmente na área do estudo da

coagulação. Deve-se ter em conta a proporção sangue/anticoagulante no que se refere ao

enchimento dos tubos durante a colheita, a qual deverá ser sempre respeitada de forma a

garantir os melhores resultados possíveis. Desta forma, tubos têm geralmente uma

marca que define o limite de enchimento.

1.2.2. Colheita de Urina

A colheita da urina é normalmente efectuada pelo próprio doente, uma vez que

se trata de um procedimento fácil de executar, onde geralmente basta apenas colher uma


22

porção de urina para um boião esterilizado. Existem algumas exceções como no caso

dos bebés e crianças, imobilizados ou acamados, em que são usados sacos colectores.

Os diferentes tipos de urina, de acordo com o modo como são colhidos e

dependendo da análise em questão, são os seguintes:

Urina tipo II – colhida geralmente em boião esterilizado

Urina ocasional – colhida geralmente em boião esterilizado

Urina de 24 horas – colhida em recipiente próprio com a capacidade de 2 litros,

por vezes com ácido clorídrico para conservação de analitos específicos

Urocultura – colhida em boião esterilizado

1.2.3. Colheita de exsudados

Os diferentes exsudados são colhidos com o auxílio de zaragatoas, que são

colocadas em meio de transporte apropriados.

1.2.4. Colheita de Outros Líquidos Biológicos

A colheita de outros líquidos biológicos, como o líquido pleural,

cefalorraquidiano, ascítico, entre outros, é um acto médico.


23

Todas as amostras são identificadas através de um sistema de etiquetas de

código de barras, que posteriormente serão triadas no sistema informático Apollo,

através de um leitor próprio. Associado ao código de barras encontra-se o número de

inscrição, o número interno de hospital, número do tubo, data e sector a que se destina

(bioquímica, imunologia, etc). As amostras são recepcionadas por técnicos e de

seguidas triadas, acompanhadas das respectivas requisições e folhas de colheitas que

serão conferidas posteriormente. De seguida são avaliadas de forma a verificar o

cumprimento dos critérios de aceitação ou rejeição de amostras, ou se exigem condições

especiais de processamento, como centrifugação imediata e separação para congelação.

As amostras recepcionadas são centrifugadas, quando aplicável, e distribuídas pelos

vários sectores. (1)

Relativamente aos critérios de rejeição de amostras, este encontra-se

documentado como uma Instrução de Trabalho, na qual se definem esses mesmos

critérios e acções correctivas em caso das amostras não se encontrarem nas condições

desejadas.

Deverão ser rejeitadas amostras biológicas nas seguintes condições:

Amostras não identificadas (sem código de barras)

Amostras sem prescrição médica/ pedido verbal

Amostras em tubo ou contentor inadequado

Atraso excessivo que comprometa o resultado, entre a colheita e a recepção no

laboratório

Colheitas especiais que não obedeçam às condições referidas no manual de

colheitas

Contentores conspurcados


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Poderão ainda ter lugar ocorrências que comprometem a disponibilização dos

resultados, entre as mais comuns:

Soro ou plasma muito hemolisado

Presença de coágulos

Tubos com volume incorrecto de amostra (1)

Depois de efectuada toda a verificação necessária as amostras passam à

respectiva área de trabalho. As amostras que se destinam ao laboratório central são

conservadas nas condições aplicáveis até à sua transferência, a qual é assegurada por

uma empresa transportadora e que garante as condições de conservação conforme

aplicável. Daqui segue-se para a fase analítica propriamente dita, referente a cada uma

das diferentes áreas de trabalho.


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2. HEMATOLOGIA

A actividade nesta secção foi orientada no sentido de efectuar o estudo e

controlo de doenças do foro hematológico, diagnosticar as alterações ao nível da

hemostase e controlo de doentes hipocoagulados, entre outros. Pretende-se não fazer

uma descrição exaustiva de todos os passos do processamento de uma análise neste

sector, mas sim falar das técnicas utilizadas, aspectos fundamentais e relevantes para

uma correcta realização e validação da mesma. A hematologia é o estudo do sangue e

órgãos hematopoiéticos e das suas alterações patológicas.

O sangue é constituído por um conjunto de células dispersas num líquido

complexo, o

plasma. Estas células denominam-se glóbulos vermelhos (eritrócitos), glóbulos brancos

(leucócitos) e plaquetas (trombócitos). Os leucócitos, por sua vez dividem-se em células

mononucleares (mónocitos e linfócitos) e granulócitos ou polimorfonucleares

(neutrófilos, eosinófilos e basófilos).

O sector da Hematologia está organizado de acordo com os equipamentos

utilizados, metodologias e natureza dos parâmetros (Tabela 1.)

Equipamento Parâmetro Metodologia

Cell Dyn Hemograma Citometria de fluxo

MAPSS

Impedância eléctrica

Reticulócitos


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ACL 7000 PT Coagulometria

aPTT Coagulometria

Fibrinogénio Coagulometria

ORTHO BioVue Tipagem AB0

Coombs Directo

Coombs Indirecto

Métodos Manuais

- VS Método de Westergreen

- Crioaglutininas

Tabela 1. – Equipamentos, parâmetros e metologias do sector de Hematologia.

2.1. Cell-Dyn 3500

O Cell-Dyn 3500 é um equipamento da marca Abbott, da gama SMS

(SlideMaker/Stainer), no qual se realizam os hemogramas. Trata-se de um aparelho

completamente automático que conta, mede e classifica as células utilizando a

combinação de várias metodologias, tais como:

Citometria de fluxo MAPSS (Multi-Angle-Polarized-Scatter-Separation) – para

contagem e classificação dos leucócitos e contagem de reticulócitos recorrendo

ao novo azul-de-metileno. É um processo em que células isoladas ou outras

partículas biológicas, envolvidas num fluido, passam alinhadas, uma a uma, em

frente de um sensor, que avalia as suas características físicas e químicas. Este


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sistema recorre à dispersão de luz proveniente de um laser (dispositivo gerador

de um feixe de radiações visíveis monocromático e de elevada intensidade). (2)

Impedância eléctrica – para contagem e medição dos eritrócitos, plaquetas e

leucócitos. Este método baseia-se na passagem constante de corrente eléctrica

entre dois eléctrodos que se encontram em reservatórios diferentes, separados

por uma placa com um orifício micrométrico de dimensões conhecidas e

mergulhados num líquido condutor. Quando uma partícula em suspensão passa

pelo orifício, há um aumento de resistência transitório à passagem de corrente

eléctrica, gerando-se um impulso eléctrico que é quantificado. Cada impulso é

amplificado e comparado com uma referência interna de canais com voltagens

conhecidas. Estes canais estão calibrados de modo a cada um receber um só tipo

de impulsos de determinada amplitude. A cada canal está associado um

determinado tamanho de partículas de acordo com a sua amplitude. (2)

A amostra é aspirada através de uma sonda fraccionada por uma válvula, que a

leva para as diferentes câmaras de diluição onde se dá a mistura da amostra com os

respectivos reagentes, passando em seguida para os locais de leitura. Em termos de

processo óptico da citrometria de fluxo, este contador de hematologia utiliza como fonte

de luz um laser de Hélio-Neon. Este sistema detecta a luz em forma de dispersão

(SCATTER), proveniente de uma superfície celular e de estruturas internas das células

sanguíneas. Por cada célula atravessada pelo laser, gera-se um sinal óptico que se

detecta como sinal eléctrico e se converte posteriormente em sinal digital que é

armazenado numa base de dados. (2)

É também possível fazer a medição da hemoglobina, pelo método

espectrofotométrico. Este é um método físico-químico fundamentado na utilização de


28

espectros de absorção. Existe um reagente de lise para leitura dos glóbulos vermelhos,

que forma um complexo estável cuja concentração é proporcional à hemoglobina.

Desta forma, temos um equipamento com sensibilidade e capacidade para

quantificar e diferenciar os elementos figurados do sangue, de maneira a obtermos o

hemograma.

2.1.1. Hemograma

O hemograma consiste essencialmente numa análise quantitativa dos elementos

celulares presentes no sangue periférico e calculo dos índices eritrocitários. Trata-se de

uma das análises mais requisitadas que permite a determinação de vários parâmetros,

sendo constituído pelo eritrograma e pelo leucograma, além da contagem de plaquetas.

Amostra:

Sangue total com EDTA K3

Eritrograma

O estudo da série vermelha consiste na análise dos glóbulos vermelhos,

relativamente ao seu número e características, conjugado com a concentração de

hemoglobina presente no sangue. Na Tabela 2. estão descritos os vários parâmetros

constituintes do eritrograma.


29

Parâmetro Importância clínica

Hematócrito (%) Volume relativo ocupado

pelos GV, num dado volume

de sangue total, o qual foi

centrifugado em condições

padronizadas

Poliglobulias

Determinação dos índices

eritrocitários.

Hemoglobina

(g/dL)

Anemias

Monitorização da terapêutica no

tratamento da anemia

Nº de eritrócitos Número de eritrócitos

circulantes, presentes num

dado volume de sangue (por

litro)

Índices

Eritrocitários

VGM (fL) Volume médio de um

eritrócito

Diminuído: microcitose

Aumentado: macrocitose

Normal: normocitose

HGM (pg) Quantidade média de

hemoglobina contida num

GV médio

Diminuídos: hipocromia

Normais: normocromia

CHGM aumentada (raro):

situações de esferocitose (não

existem eritrócitos

hipercrómicos)

CHGM (g/dL) Concentração média de

hemoglobina por unidade de

volume de GV

Tabela 2. Parâmetros constituintes do eritrograma (3)

Nota: O coeficiente de dispersão eritrocitária (RDW), o qual indica a variação na

distribuição do volume eritrocitário, é calculado no contador automático a partir do


30

histograma de distribuição de volume dos GV, sendo expresso em percentagem. No

entanto o laboratório não inclui este parâmetro nos seus boletins analíticos.

Leucograma

O leucograma consiste na contagem total de glóbulos brancos e respectiva

fórmula leucocitária.

Parâmetro Importância clínica

Nº total de

leucócitos

Na maioria dos casos valores aumentados ocorrem em inflamações,

infecções, stress físico, etc. Também aumentado nas grávidas.

Fórmula leucocitária - Contagem diferencial de leucócitos

Neutrófilos

(%)

Neutrofilia:

Infecções agudas (bactérias, vírus, fungos, parasitas)

Doenças reumáticas e auto-imunes

Doenças neoplasicas

Trauma (Cirurgia, Lesões físicas, hipotermia)

Doenças hematológicas não neoplasicas (Anemias hemolíticas

agudas)

Menstruação, gravidez, stress, esforço físico, etc

Neutropenia:

Infecções (bacterianas – tuberculose; virais – mononucleose)

Fármacos

Doenças hematológicas (Leucemias, anemia aplásica)


31

Lesão renal grave

Hiperesplenismo.

Linfócitos

(%)

Linfocitose:

Leucemia linfocítica aguda e crónica

Infecções virais

Doenças neoplásicas

Doença inflamatória intestinal, reações a fármacos

Linfocitopénia:

Infecções virais, bacterianas e fúngicas

Doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, infecções granulomatosas

disseminadas, anemia aplásica

Hemorragia e insuficiência cardíaca

Quimioterapia citotóxica e radiação

Eosinófilos

(%)

Eosinofilia:

Doenças alérgicas (asma, alergia ao pólen, urticária)

Doenças infecciosas (parasitas, fungos, vírus)

Doenças neoplasicas e hematológicas

Eosinopénia:

Infecções agudas, neoplasias disseminadas, lesões graves

Uso de corticosteroides

Monócitos

(%)

Monocitose:

Infecções (tuberculose, malária)

Doenças neoplasicas (mieloma, leucemia monocitica aguda,

mielodisplasia)

Doença inflamatória intestinal, cirrose hepática, Sarcoidose

Monocitopénia:

Anemia aplásica

Basófilos

(%)

Basofilia:

Infecções (sinusite crónica, infecção viral)


32

Doenças inflamatórias

Doenças mieloproliferativas (Leucemia mieloide crónica, policitemia

vera)

Doença de Hodgkin, Anemia hemolítica crónica, Leucemia basofílica

Tabela 3. Importância clínica dos elementos do leucograma (3) (4)

Contagem Automática de Plaquetas

A contagem de plaquetas é um parâmetro particularmente útil na medida em que

está relacionado com o risco de hemorragia. As plaquetas são fragmentos do

megacariócito, geralmente de pequenas dimensões, que têm tendência para formar

agregados quando activadas, tornando a sua quantificação mais problemática.

Valores Aumentados: Trombocitose Valores Diminuídos: Trombocitopénia

- Doenças mieloproliferativas (Leucemia

mielocitica crónica, policetimemia vera)

- Hemorragia aguda, deficiência em ferro,

doença maligna, doenças inflamatórias

crónicas, etc.

- Infecções virais agudas

- Insuficiência medular global (quando

acompanhada com outras citopénias)

- Recção imunitária (medicamentosa,

lúpica)

- Pós cirurgia

Tabela 4. Alterações na contagem de plaquetas (3)


33

Realiza-se ainda uma análise da distribuição volumétrica das plaquetas e

interpretação de possíveis alarmes fornecidos pelo equipamento. Sempre que seja

necessário, nomeadamente para confirmação de baixas contagens de plaquetas, faz-se

uma contagem manual de plaquetas a partir de um esfregaço de sangue periférico.

Esfregaço de Sangue Periférico

O estudo microscópico do esfregaço de sangue corado para análise da

morfologia globular fornece informação de grande relevância. Este consiste numa

preparação de uma fina camada de células sobre uma lâmina de vidro para exame

microscópico. A observação do esfregaço é realizada sempre que seja necessário

complementar ou confirmar os resultados obtidos no hemograma ou mediante

solicitação do médico.

No exame microscópico observa-se a morfologia dos eritrócito e leucócitos,

efectua-se a contagem diferencial dos leucócitos, identificando as diferentes sub-

populações e faz-se a contagem de plaquetas.

Como amostra é utilizado sangue total, geralmente a partir do tubo que foi utilizado

para o hemograma.

Como executar um esfregaço de sangue periférico:

a) Depositar uma gota de sangue perto da extremidade de uma lâmina de vidro


34

b) Segurar a lâmina com uma mão, com a outra mão segurar uma lamela que se

apoia na lâmina à esquerda da gota, entre as quais deverá existir um ângulo de

30º a 45º

c) Deslocar a lamela (sempre apoiada na lâmina) até encontrar a gota e deixar que

esta se difunda ao longo da lamela

d) Com um movimento rápido e uniforme, deslizar a lamela no sentido da

extremidade livre até que o sangue se esgote

e) A lâmina é corada pela coloração de May-Grünwald-Giemsa. Este tipo de

coloração combina

os componentes citoplasmáticos básicos (eosinófilos ou acidófilos) de rosa-

alaranjado; o azul-de-metileno (corante básico) que cora o núcleo e componentes

citoplasmáticos ácidos (basófilos), de azul-arroxeado; e o azur de metileno que

cora as granulações azurófilas de vermelho-púrpura. (1)

Segue-se uma tabela com exemplos de alterações passíveis de serem observadas

no esfregaço de sangue periférico quando observado ao microscópio:

Alterações da Série Vermelha

Dimensão Anisocitose

Normócitos

Micrócitos

Macrócitos

Coloração Normocromia

Hipocromia

Forma Poiquilocitose (variadas formas sem

predomínio de nenhuma)


35

Drepanocitose

Ovalocitose

Esferocitose

Células em alvo

Acantócitos

Esquisócitos

Inclusões eritrocitárias Pontuado basófilo

Anéis de Cabot

Corpos de Heinz

Siderócitos

Corpos de Howell-Jolly

Alteração da estrutura Persistência do núcleo (Eritroblastos)

Persistência de restos nucleares

Propriedades tinturiais Eritrócitos ortocromáticos

Eritrócitos policromatófilos

Eritrócitos basófilos

Recticulócitos

Alterações da Série Branca

Neutrófilos com granulação tóxica

Linfócitos atípicos

Blastos das diferentes linhagens, diversos graus de maturidade

Segmentação dos neutrófilos

Alterações da Série Plaquetária

Agregados plaquetários

Anisocitose plaquetária

Tabela 5. Alterações passíveis de serem observadas no esfregaço de sangue periférico (3) (4)


36

Valores de Referência:

Homem Mulher Unidades

Eritrograma

Eritrócitos 4.5 – 5.9 3.9 – 5.0 x 102/L

Hemoglobina 13.5 – 17.5 12 – 16 g/dL

Hematócrito 40.6 – 50.4 36 – 46 %

VGM 80 – 100 80 – 100 fL

HGM 26 – 34 26 – 34 pg

CHGM 32 – 36 32 – 36 g/dL

Leucograma

Leucócitos 4 – 10 4 – 10 x 10 9 /L

Neutrofilos 50 – 75 50 – 75 %

Eosinófilos 1 – 5 1 – 5 %

Basófilos 0 – 2 0 – 2 %

Linfócitos 20 – 45 20 – 45 %

Monócitos 1 – 12 1 – 12 %

Plaquetas 150 – 400 150 – 400 x 10 9 /L


37

2.1.2. Reticulócitos

Os reticulócitos são os precursores imediatos dos eritrócitos. Consistem em

células anucleadas que contêm restos de RNA no citoplasma. A contagem de

reticulócitos é indicada sobretudo para diagnóstico diferencial das anemias (anemias

regenerativas e não regenerativas).

Para quantificação dos reticulócitos, o Cell-Dyn utiliza um método que se baseia

na difracção da luz laser nas células previamente coradas com tiazina azul-de-metileno

novo. O RNA das células é corado e posteriormente a amostra diluída.

Amostra:

Sangue total com EDTA K3


0.5 – 1.5 %

A validação dos resultados do hemograma é feita tendo em conta diversos

factores importantes tais como a idade e sexo, contexto clínico do doente, sinais de

alarme emitidos pelo contador, correlação com outros parâmetros laboratoriais (ferro,

ferritina, transferrina, velocidade de sedimentação, etc). No decorrer da validação são

seleccionadas as amostras que necessitam de ser repetidas e/ou execução do esfregaço

de sangue periférico.


38

2.1.3. Controlo de Qualidade Interno

Para efeitos de controlo de qualidade interno, são utilizados três níveis, baixo,

normal e alto de Cell-Dyn 26 Plus Control. Diariamente são efectuados dois desses

níveis, os quais vão alternando. São passados no aparelho da parte da manhã em modo

automático e ao fim do dia em modo manual. Os critérios de aceitação são os do

programa UNITY (software de controlo de qualidade, que utiliza ≤ 3 sd de acordo com

os critérios definidos pelo comité de da qualidade). Para os reticulócitos, apenas é

efectuado controlo nos dias em que existem pedidos.

2.1.4. Avaliação Externa da Qualidade

O laboratório, na área de hematologia geral, participa mensalmente em ensaios

inter-laboratorias através de um programa da SEHH (Sociedade Espanhola de

Hematologia e Hemoterapia) exceptuando os reticulócitos, para os quais é utilizado um

programa do NEQAS (National External Quality Assessment Schemes) de dois em dois

meses.

2.2. ACL 7000

O ACL 7000 é um equipamento totalmente automatizado, controlado por micro-

computador, utilizado no estudo da hemostase. A hemostase é um processo complexo

que assegura permanentemente o equilíbrio entre a possibilidade de hemorragias

espontâneas e formação de trombos, controlando também hemorragias resultantes de


39

qualquer lesão vascular, estando assim dependente da interação de diversos

componentes complexos e equilíbrio entre os processos de coagulação e fibrinólise. (5)

A coagulação sanguínea (hemostase secundária) é um processo dinâmico que

culmina com a formação de trombina em quantidades suficientes para a conversão do

fibrinogénio em fibrina. A cascata da coagulação é classicamente dividida em duas vias,

a via intrínseca e a via extrínseca, as quais conduzem à formação do coágulo de fibrina.

O ACL 7000 consegue a determinação dos diferentes parâmetros relacionados

com a

hemostase através do método por coagulometria (detecção óptica do coágulo). A

formação do coágulo é detectada graças a um fotodíodo que mede a variação da

densidade óptica. Este aparelho requer a utilização duma pool de plasma normal

(plasma de calibração), o qual verifica e monitoriza as condições de ensaio em todo o

sistema durante o decorrer da análise. (5)

O estudo da hemostase é essencial para a detecção de patologias hemorrágicas e

trombóticas bem como para a monitorização da terapêutica anticoagulante.

2.2.1. PT, Tempo de Protrombina

O tempo de protrombina corresponde ao tempo de recalcificação de um plasma

citratado e pobre em plaquetas, na presença de excesso de tromboplastina e iões cálcio.

Este parâmetro explora a via extrínseca da coagulação, reflectindo alterações em alguns

dos diferentes factores de coagulação, nomeadamente dos dependentes da vitamina K. É

uma análise bastante prescrita pois é essencial para monitorização da terapêutica com


40

anticoagulantes orais, sendo indicada também no rastreio de distúrbios do sistema da

coagulação ou avaliação da função hepática.

Amostra:

Plasma em Citrato

Fundamento do Método

Adição de tromboplastina tecidular e cloreto de cálcio ao plasma do doente para

a avaliação do tempo de formação do coágulo de fibrina.

Os valores podem ser expressos em:

Tempo de protrombina


Tempo de Protrombina: 11.8 – 15.1 segundos

Percentagem (Taxa de Protrombina): mediante uma curva de calibração

para a protrombina, o tempo é convertido em taxa.


41


Taxa de Protrombina: 74 – 132 %

INR (Razão de Normalização Internacional): devido às variações das

diversas tromboplastinas e de modo assegurar a uniformidade de

resultados, foi necessário padronizá-las segundo uma referência

internacional, e desde então todas as tromboplastinas são acompanhadas

pelo ISI (International Sensitivity Index - valor fornecido pela marca).

O cálculo do INR efectua-se por elevação de razão de protrombina ao valor de ISI.

Valores de referência:

INR: ≤ 1.18, mas é variável consoante a patologia

Valores de INR Aumentados

- Deficiências em protrombina, factor VII, X, vitamina K

- Terapêutica com anticoagulantes orais, doenças hepáticas, etc.

Tabela 6. Causas de INR aumentado (3)


42

2.2.2. aPPT, Tempo de Tromboplastina Parcial Activada

O tempo de tromboplastina parcial activada corresponde ao tempo de

recalcificação de um plama citratado e pobre em plaquetas, na presença de uma

substância fosfolipídica. Este parâmetro explora a via intrínseca da cascata da

coagulação. É importante na monitorização da terapêutica com heparina, rastreio de

distúrbios da via intrínseca e comum da coagulação sanguínea e detecção de inibidores

da coagulação.

Amostra:

Plasma em Citrato


É adicionada cefalina (substituto de fosfolípido incapaz de activar a via

extrínseca) e cloreto de cálcio ao plasma do doente, para a avaliação do tempo de

formação do coágulo de fibrina.


24.3 – 35 segundos

Valores de aPTT Aumentados

- Deficiências em factores da via intrínseca (hemofilia A e B, factores XI e XII, doença

de Von Willebrand)

- Doenças hepáticas, contaminação com heparina, doença intravascular disseminada

Tabela 7. Causas de aPPT aumentado (3)


43

2.2.3. Fibrinogénio

O fibrinogénio é uma glicoproteina sintetizada exclusivamente pelos

hepatócitos, sendo clivado pela trombina para formar o coágulo de fibrina. O seu

doseamento é considerado um teste específico para a avaliação da coagulação estando

indicado no estudo de discrasias sanguíneas sem causa aparente.

Amostra:

Plasma em Citrato


Adiciona-se ao plasma diluído do doente excesso de trombina e determina-se o

tempo de formação do coágulo de fibrina. O tempo de formação do coágulo é

inversamente proporcional à concentração de fibrinogénio presente na amostra.


169 – 515 mg/dl

Valores de Fibrinogénio Aumentados Valores de Fibrinogénio Diminuídos

- Gravidez, diabetes mellitus, síndrome

nefrótico, mieloma múltiplo, etc

- Processos inflamatórios (proteína de fase

aguda positiva)

- Diminuição da síntese de fibrinogénio

(ex: doença hepática grave)

- Aumento do catabolismo (ex. após

grandes hemorragias, queimaduras)

Tabela 8. Alterações do fibrinogénio (3)


44


Para realizar o controlo de qualidade interno, são utilizados dois níveis

diariamente de HemosIL Control Assayed. São passados no aparelho da parte da

manhã, preferencialmente antes dos doentes. Os critérios de aceitação são os do

programa UNITY (software de controlo de qualidade, que utiliza ≤ 3 sd de acordo com

os critérios definidos pelo comité de da qualidade).


O laboratório participa mensalmente em ensaios inter-laboratorias através de um

programa da SEHH (Sociedade Espanhola de Hematologia e Hemoterapia).

2.3. ORTHO BioVue® System

Este equipamento foi concebido de forma a automatizar a execução de testes

imuno-hematológicos que eram na sua maioria, técnicas manuais. A tecnologia do

aparelho baseia-se na utilização de cassetes com 6 colunas onde cada coluna contém

uma câmara de reacção e um reagente com esferas de vidro. Um resultado é negativo

quando os eritrócitos atravessam a coluna e se depositam no fundo da coluna enquanto

que um resultado é positivo quando se forma uma aglutinação que fica no topo da

coluna.


45

Figura 1. Cassete do ORTHO BioVue® System (3)

Neste laboratório a tipagem sanguínea é realizada não só no âmbito da

prescrição médica de rotina mas também como pré-operatórios e situações antecedentes

a transfusões sanguíneas, de forma a ser administrado um sangue compatível com o

receptor. Existem vários sistemas de classificação dos grupos sanguíneos, sendo os mais

comuns a tipagem AB0 e a tipagem Rh.

2.3.1. Tipagem AB0

A determinação do grupo sanguíneo de um individuo é possível devido à

expressão antigénica na superfície dos eritrócitos, em que os antigénios presentes se

ligam a anticorpos que circulam no soro. O processo de determinação do grupo

sanguíneo pode ser executado de duas formas, a prova directa e prova reversa. Na

tipagem direta, são pesquisados os antigénios do sistema AB0 existentes na membrana

do eritrócito, através de uma reação dos eritrócitos da amostra com soros comerciais que

contenham anticorpos anti-A, anti-B e anti-AB. Na tipagem reversa, investiga-se a

presença de anticorpos do sistema AB0 presentes no soro do indivíduo, através de uma


46

reação desse soro com dois reagentes eritrocitários comerciais. O resultado das duas

provas deverá ser concordante (6).

2.3.2. Tipagem RhD

Além da tipagem AB0, é realizada a tipagem RhD, também com significado

clínico na medicina transfusional e materno-fetal. Os eritrócitos do dador são testadas

com um soro anti-D e com soro controlo RhD. Poderemos ter RhD positivo, negativo

ou fraco. Quando a pesquisa do D fraco for positiva, o concentrado de eritrócitos é

rotulado como RhD positivo. Quando ambas as provas resultarem negativas, o sangue

deve ser rotulado como RhD negativo (6).

2.3.3. Teste de Coombs

Outro dos testes realizados neste equipamento, é o teste de Coombs, muito

utilizado para diagnosticar doenças hemolíticas causadas por autoanticorpos que se

ligam à membrana do eritrócito, como a anemia hemolítica do recém-nascido ou

anemias hemolíticas auto-imunes. Geralmente são pesquisados anticorpos maternos IgG

anti-Rh fetal (anti-D), através da utilização de um soro com anticorpos que reagem com

os anticorpos maternos.

O teste da antiglobulina pode ser realizado de duas formas:


47

Directo: Detecção de anticorpos maternos anti-D que já se ligaram aos

eritrócitos fetais, através da utilização de um soro com anti-IgG.

Indireto: Pesquisa de anticorpos anti-D no soro materno, o qual é

incubado com eritrócitos RhD positivos e posteriormente são

adicionados os anticorpos anti-IgG. Permite detectar anticorpos

antieritrocitários irregulares. (6)

2.4. Métodos Manuais

2.4.1. Velocidade de Sedimentação

A velocidade de sedimentação é traduzida como a velocidade de queda espontânea

dos elementos figurados do sangue em suspensão no plasma por acção da força da

gravidade. A velocidade de sedimentação é um processo resultante da combinação de

vários mecanismos:

a) Diferença de gravidade existente entre os eritrócitos (que são mais densos) e

o plasma

b) Atracção electrostática gerada entre as cargas eléctricas negativas da

membrana dos eritrócitose as cargas eléctricas positivas de determinadas

proteínas plasmáticas

c) Contra-corrente plasmática

A velocidade de sedimentação é expressa em unidades de distância (mm), que os

eritrócitos percorrem ao longo de uma hora. Este processo decorre em três fases:

1º - Agregação: formação de pilhas de eritrócitos (rouleaux)


48

2º - Sedimentação: queda dos rouleaux a velocidade constante

3º - Sedimentação final: empilhamento dos eritrócitos no fundo do tubo

Amostra:

Plasma em Citrato

Método

Método de Westergreen (método de referência). A determinação é efectuada

num sistema da marca Aquisel, que consiste no conjunto do tubo e duma pipeta. Os

tubos têm incorporada uma válvula que permite a introdução manual da pipeta,

pressionando até o sangue subir até à marca ‘’0’’. Este conjunto é colocado num suporte

próprio, que fica em repouso durante uma hora. Ao fim desse tempo é feita a leitura

visual dos resultados, pela escala existente ao longo da pipeta.


Homem: <15 mm

Mulher: <20 mm

Valores de VS Aumentados Factores que influenciam a VS

- Variações fisiológicas (gravidez,

menstruação)

- Infecções agudas e crónicas

- Processos inflamatórios agudos

- Número, forma e tamanho dos eritrócitos

- Viscosidade do sangue

- Aumento do fibrinogénio

- Altura e diâmetro do tubo


49

- Doenças reumatismais

- Anemias

- Leucemias, mielomas, neoplasias

- Posição do tubo (vertical);

- Vibrações

- Proporção sangue/anticoagulante

Tabela 9. Causas da elevação da VS e factores influentes (3)

2.4.2. Crioaglutininas

As crioaglutininas são proteínas, autoanticorpos (imunocomplexos) geralmente

da classe IgM, dirigidos contra o antigénio de superfície dos eritrócitos, que precipitam

com o frio e se redissolvem a 37ºC. Podemos suspeitar que estamos na presença destas

crioaglutininas quando obtemos resultados aberrantes dos índices eritrocitários VGM e

CHGM.

Amostra:

Plasma em EDTA

Método

Colheita de sangue para um tubo de vidro a 37ºC. Fazer a retracção de coágulo

na estufa. Retira-se o coágulo, centrifuga-se e retira-se o sobrenadante que é colocado

imediatamente no frio durante 10 dias, nos quais é verificado se ocorreu aglutinação.


Presença de precipitado – Resultado positivo

Ausência de precipitado – Resultado negativo


50

Presença de Crioaglutininas

- Mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenström, linfoma imunoblastico,

leucemia linfocitica crónica, anemias hemolíticas, doenças autoimunes (lúpus

eritematoso sistémico), diversas infecções

Tabela 10. Presença de Crioaglutininas (3)


51

3. MICROBIOLOGIA

A microbiologia, tal como o nome indica, estuda as características biológicas

dos microorganismos (bactérias, parasitas, fungos). O estágio neste sector teve como

principal objectivo contactar com todas as actividades aqui desenvolvidas:

acompanhamento desde a entrada dos produtos biológicos a analisar, observação de

exames a fresco e lâminas coradas, observação das culturas e consequente interpretação

dos resultados, valorização ou não dos agentes isolados, entre outros. A identificação

dos agentes isolados com interesse patogénico e a realização de testes de sensibilidade

aos antibióticos não foram efectuados, uma vez que, todas as culturas selecionadas são

enviadas para o laboratório central onde serão então efectuados esses procedimentos. A

identificação é feita num equipamento Maldi-Tof e os testes de sensibilidade aos

antibióticos são executados na sua maioria num Vitek.

O principal objectivo em microbiologia é detectar e identificar o agente causal,

de forma a estabelecer o diagnóstico correcto e o tratamento adequado à doença

infecciosa. Desta maneira, é necessário dar a devida importância a todas as etapas da

análise para que o resultado seja coerente com a situação clínica do doente,

nomeadamente as condições em que a colheita ocorre. Assim sendo, a microbiologia é a

área analítica onde o rigor da colheita, a conservação e manipulação da amostra se

reveste de maior importância, sendo essencial para o resultado final.

Antes de passar à parte do processamento das amostras, segue-se uma breve

descrição dos meios de cultura utilizados neste laboratório bem como em que consiste o

exame bacteriológico na sua generalidade.


52

Meios de Cultura

Gelose Columbia + 5% sangue de carneiro (COS)

A gelose Columbia é um meio de isolamento seletivo que permite o crescimento

de microrganismos fastidiosos. Complementada com sangue de carneiro, é altamente

nutritiva e portanto adaptada à cultura da maior parte das espécies bacterianas,

independentemente do seu metabolismo. Permite o crescimento da maior parte dos

microorganismos e põe em evidência o tipo de hemólise.

Gelose Mac Conkey (MCK)

A gelose MacConkey é um meio de isolamento seletivo e de diferenciação para

deteção de Enterobacteriaceae em amostras de origem diversa. Destina-se

especialmente a detetar a fermentação da lactose:

- colónias lactose (+): rosa a vermelho

- colónias lactose (-): incolor ou ligeiramente bege

Gelose Hektoen (HEKT)

A gelose Hektoen é um meio seletivo e de diferenciação recomendado para a

deteção das espécies de Salmonella e Shigella. O meio é inoculado a partir de amostras

de fezes, suspensão de fezes ou caldo de enriquecimento.

- As colónias de Salmonella são verdes ou verdes-azuladas, com ou sem centro

negro.


53

- As colónias de Shigella são verdes ou verdes-azuladas sem centro negro.

A inibição de microrganismos Gram-positivo obtém-se pela mistura de sais biliares e de

corantes.

Gelose CLED

A gelose CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient) é especialmente útil no

isolamento de microrganismos do trato urinário. Permite também diferenciar as

bactérias que fermentam a lactose das que não fermentam (indicador azul de

bromotimol):

- As bactérias lactose (+) produzem colónias amarelas pálidas ou amarelas, por

acidificação do meio

- As bactérias que não fermentam a lactose produzem colónias verdes, azuis ou

incolores.

Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 (SGC2)

Esta gelose é um meio seletivo recomendado para o isolamento de leveduras e

fungos. A presença de gentamicina inibe muitas bactérias Gram-negativo e Gram-

positivo.

A presença de cloranfenicol melhora a seletividade para certas espécies que

podem ser resistentes à gentamicina. O pH da gelose que é ligeiramente ácido,

favorecendo mais o crescimento dos fungos do que o crescimento das bactérias.


54

Gelose Campylosel (CAM)

A gelose Campylosel é um meio seletivo para o isolamento

do Campylobacter intestinal (C. jejuni e C. coli principalmente) a partir de amostras de

fezes. As colónias características de Campylobacter são pequenas e acinzentadas, e por

vezes estendem-se ao longo das estrias de inoculação.

Gelose Chocolate + Gelose PolyViteX (VCAT3)

Este meio é seletivo para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae & Neisseria

meningitidis a partir de amostras polimicrobianas (urogenitais, orofaríngeas,

hemoculturas...).

Gelose Chocolate Haemophilus 2 (HAEM2)

Esta gelose é seletiva para o isolamento das diferentes espécies de Haemophilus.

O isolamento das espécies de Haemophilus provenientes das vias respiratórias é muitas

vezes difícil devido à presença de uma flora saprófita.

Gelose Mannitol Salt Agar 2 (MSA2)

O Mannitol Salt Agar é uma formulação concebida para a diferenciação de

estafilococos com resultados positivos para a coagulase (ex: Staphylococcus aureus)

dos estafilococos com resultados negativos para a coagulase.


55

Gelose Strepto B (STRB)

Meio para rastreio de Streptococcus agalactiae e prevenção das infecções

neonatais por estreptococos do Grupo B. Este microorganismo é o principal agente

responsável por infecções bacterianas invasivas nos recém-nascidos nos países

industrializados.

O meio cromogénicos permite o seu isolamento, apresentando colónias cor-de-rosa

claro a vermelho.

Meios de enriquecimento

Meio Selenito

O caldo de selenito é utilizado no enriquecimento e isolamento de Salmonellas

e Shiguelas, para posteriormente ser inoculado numa gelose de Hektoen. A turvação do

meio indica crescimento de microrganismos.

Meio BHI

Este é um meio de utilização geral, adequado para a cultura de uma grande

variedade de tipos de organismos, incluindo bactérias, leveduras e fungos filamentosos

provenientes das amostras clínicas. Neste caso, é habitualmente utilizado para inocular

amostras como pus provenientes de feridas, para posteriormente ser semeado em MCK,

COS e MSA2.

Meio Todd Hewitt

Caldo que é usado para o cultivo de Streptococcus agalactiae, antes de ser

inoculado no meio de Strepto B.


56

Exame Bacteriológico

Na pesquisa de agentes patogénicos são utilizadas diversas técnicas como:

Exame directo:

- Macroscópico - Volume, cor, consistência e, em alguns casos, selecção

da porção da amostra mais adequada para a análise

- Exame a fresco (microscópico) – antes ou após centrifugação, com soro

fisiológico ou água destilada

- Exame corado - Colorações de Gram e Ziehl-Neelsen

Exame cultural:

- Selecção de meios adequados atendendo ao tipo de amostras

3.1. Urocultura

O exame bacteriológico da urina é um meio complementar de diagnóstico capaz

de confirmar a presença de infecção urinária. As infecções do aparelho urinário são das

infecções mais frequentes, geralmente causadas por bactérias da flora intestinal

saprófita, que invadem o aparelho urinário por via ascendente através da uretra. Os

agentes etiológicos mais frequentes nas crianças e adultos, sem outras doenças

associadas, são as enterobacteriáceas com grande destaque para a Escherichia coli,

Proteus spp. e Klebsiella spp. Em doentes internados e com factores de risco como

algaliação permanente, cálculos urinários e outras patologias do aparelho urinário, o

leque de agentes etiológicos alarga-se a outros microrganismos, como Pseudomonas


57

spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. e fungos (Candida spp.), estes últimos

particularmente em doentes que estão sob terapêutica antibiótica. Em situações clínicas

particulares poderão ser pesquisados outros microrganismos de acordo com a

informação clínica disponível (7). A identificação do agente microbiano na urina baseia-

se na execução da Urina tipo II e exame directo a fresco do sedimento urinário, na

observação microscópica de esfregaços corados pelo método de Gram e de Ziehl-

Neelsen (quando aplicável) da amostra e no exame cultural em meio CLED. Utilizando

uma ansa descartável, com um volume de 10μL, semear a urina pelo método

quantitativo, no meio CLED. A ansa deve fazer uma linha recta atravessando o centro

da placa (a) e seguidamente fazer as chamadas estrias de isolamento (b). (1)

Figura 2. Como semear uma urocultura.


58

Esquema 1. Fluxograma Urocultura

De um modo geral, deveremos interpretar e relacionar os resultados do exame a

fresco, dos exames microscópicos corados e do exame cultural. No dia a seguir ao envio

para o laboratório central, chega a identificação bacteriológia e o antibiograma, os quais

são interpretados e valorizados de acordo com o contexto clinico. As infecções urinárias

tratadas devem ser seguidas com nova colheita 1 a 2 semanas após a terapêutica

antibiótica.

Frasco de urina estéril

Concentração por centrifugação (10 ml de

urina a 2000 rpm durante 10

minutos). Despreza-se o sobrenadante

fazendo-se a observação do sedimento

Exame directo a fresco:

Quantificação de células, leucócitos, piócitos,

eritrócitos, cilindros, cristais, bactérias, leveduras, parasitas

(Trichomonas), etc

Exame corado (quando aplicável):

- Coloração de Gram (pesquisa de bactérias e leveduras)

- Coloração de Ziehl-Neelsen (para

pesquisa de bacilos álcool-ácido-resistentes), quando requisitada

ou sempre que existe

piúria asséptica

Semear com ansa calibrada (10μl), seguida de uma

incubação a 37ºC, por um período de 16 a 24

horas

Leitura das culturas e contagem das colónias.

Observação das lâminas coradas pelas colorações de

Gram e Ziehl-Neelsen.

Resultado negativo – Saída às 24 horas Resultado positivo:

Cultura mista: repicagem para nova placa e

incubação

Cultura pura: envio para o laboratório

central para identificação e TSA


59

3.2. Exsudado Vaginal e Uretral

No aparelho genital feminino podem ocorrer diversas infecções, de etiologia

bacteriana, fúngica, parasitária e viral. Grande parte dessas infecções pode ser

assintomática ou causar sintomas muito discretos podendo passar despercebidos pela

mulher. Devido à grande variedade de agentes possíveis de serem pesquisados, é muito

importante que a suspeita clínica seja bem direccionada para que os exames

laboratoriais mais indicados sejam realizados. A colheita adequada das amostras, o seu

transporte e processamento laboratorial são fundamentais para o diagnóstico preciso.

A flora vaginal normal é complexa e resultante de um equilíbrio dinâmico,

variando consoante o período de vida e a fase do ciclo menstrual. O elemento bacteriano

predominante em condições normais é o lactobacilo (ou bacilo de Doderlein), associado

ao bifidobacterium, ao estafilococo epidermidis, enterococos, bacilos coliformes, etc

(7).

A partir das zaragatoas com meio de transporte é realizado:

Exame a fresco:

- Exame citológico: contagem de células e leucócitos

- Exame parasitológico: pesquisa de Trichomonas vaginalis

- Exame micológico: pesquisa de células leveduriformes


60

Exame corado:

- Coloração de Gram: avaliação da flora Gram + (bacilos de Doderlein) e flora

Gram -. Verificar a presença de “clue-cells” sugestiva de Gardnerella vaginalis

Exame Bacteriológico:

Em meio COS, que permite a observação da presença ou não de hemólise e do

tipo de hemólise, em meio VCAT3 para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae, e

meio SGC2 para pesquisa de leveduras. (1)

O exsudado uretral é geralmente efectuado nos homens, sendo processado tal

como um exsudado vaginal.

Mais uma vez, o isolamento e posterior valorização de colónias suspeitas será

em função do conjunto de exames e contexto clínico.


61

Esquema 2. Fluxograma Exsudado Vaginal e Uretral

Quando o meio SGC2 apresenta colónias, é feito o teste da blastese para

identificação da Candida albicans. Em conclusão, esta avaliação permite-nos observar o

equilíbrio da flora saprófita normal para a idade em questão, avaliação do número de

bacilos de Doderlein e flora associada, e pesquisar de bactérias potencialmente

patogénicas.

Zaragatoa em Meio de Stuart

Exame a fresco:

Quantificação de células, leucócitos, bacilos de

Doderlein, “clue-cells”, leveduras, parasitas

Exame corado:

Coloração de Gram: avaliação da flora Gram +

(bacilos de Doderlein) e flora Gram -, “clue-

cells”

Semear em COS e VCAT3 com incubação 24-48

horas a 37˚C em atmosfera de 10% de CO2

+

SGC2 com incubação 48 -72 horas a 30ºC

Leitura das culturas

Observação das lâminas de Gram

Resultado negativo – Saída às 48 horas Colónias suspeitas: repicagem para nova

placa e incubação

Se valorizável: envio para o laboratório

central para identificação e TSA

Zaragatoa em Meio de Carvão

COS VCAT3 SGC2


62

3.3. Exsudado Faríngeo

As infecções das vias respiratórias superiores são muito frequentes, sendo a

maior parte de etiologia viral. O diagnóstico bacteriológico dessas situações representa

uma tentativa de identificar, entre uma flora indígena abundante, o agente implicado na

infecção. Existe uma flora mista abundante na garganta, constituída por variados

microorganismos. Vários agentes patogénicos tais como o S. pneumoniae, S. pyogenes,

H. influenzae, N. meningitidis, leveduras e membros das Enterobacteriaceae, podem

constituir uma flora transitória ou estar presente em pequeno número na orofaringe de

indivíduos saudáveis. Na faringite bacteriana a principal causa é o Streptococcus β-

hemolítico do grupo A (Streptococcus pyogenes) (7).

No exame directo, são observados na coloração de Gram cocos Gram positivo,

esféricos, que ocorrem em cadeias de comprimento variável. No exame cultural em

COS, as colónias apresentam-se transparentes ou translúcidas, pouco convexas de

superfície lisa e bordo inteiro com larga zona de hemólise. Para complementar o estudo,

faz-se a prova da catalase, a qual é negativa para o Streptococcus pyogenes, e podemos

também recorrer ao teste de susceptibilidade à bacitracina, que é positivo (identificação

presuntiva). (1)


63

Esquema 3. Fluxograma Exsudado Faríngeo

3.4. Exsudado Nasal

As infecções das vias respiratórias superiores são muito frequentes, sendo a

maior parte de etiologia viral. O diagnóstico bacteriológico dessas situações representa

uma tentativa de identificar, entre uma flora indígena abundante, o agente implicado na

infecção.

Vários agentes patogénicos tais como o Staphylococcus aureus ou Streptococcus.

Pneumoniae ou leveduras e membros das Enterobacteriaceae, podem constituir uma

Exame corado:

Coloração de Gram: avaliação da flora Gram + e

flora Gram -

Semear em COS com incubação 24-48 horas a 37˚C

em atmosfera de 10% de CO2



Resultado negativo – Saída às 48 horas Colónias suspeitas: Prova da Catalase e

repicagem se necessário (nova incubação)

Envio para o laboratório central para

identificação e TSA


COS


64

flora transitória ou estar presente em pequeno número em indivíduos saudáveis.

Normalmente a pesquisa está direcionada para o Staphylococcus aureus (7).

Esquema 4. Fluxograma Exsudado Nasal

3.5. Hemocultura

A grande maioria das doenças infecciosas podem decorrer com bacteriémia

transitória, intermitente, ou persistente (ex. endocardite). Como o sangue é um produto

biológico estéril, o isolamento de um microrganismo a partir duma hemocultura é

geralmente o agente etiológico da infecção. É utilizado um meio de cultura difásico, o

Hemoline. O frasco contém dois meios de cultura que correspondem a fórmulas

Exame corado:

Coloração de Gram: avaliação da flora Gram + e

flora Gram -

Semear em COS com incubação 24-48 horas a 37˚C

em atmosfera de 10% de CO2

+

MSA2 com incubação 24-48 horas a 37ºC



Resultado negativo – Saída às 48 horas Colónias suspeitas: Prova da Catalase e

Slidex, repicagem se necessário (nova

incubação)




COS MSA2


65

enriquecidas com factores de crescimento que permitem o desenvolvimento das

bactérias anaeróbias estritas e aero-anaeróbias responsáveis por septicémias. É

particularmente aconselhado para um crescimento rápido dos seguintes

microorganismos: enterobactérias, Pseudomonas sp, Staphylococcus, Streptococcus,

Candida sp (7). A incubação é em atmosfera de aerobiose a 37ºC durante 10 dias.

Realiza-se o exame macroscópico diariamente com inversão do frasco para contacto do

meio líquido com a gelose. O aparecimento de turvação, hemólise no caldo, produção

de gás, depósitos na superfície do caldo, desenvolvimento de colónias na gelose são

sinais de positividade da amostra. Obrigatoriamente ao 5º e 10º dias são feitas passagens

para COS e feito uma lâmina para Gram, ou quando houver sinais de positividade. (1)

Esquema 5. Fluxograma Hemocultura

Incubado em estufa a 37ºC durante 10 dias Verificação diária: turbidez, gás, crescimento na fase sólida.

Lâminas de Gram

Colónias suspeitas:



Meio Hèmoline

COS

5º e 10º dia

(ou apresentar turbidez

suspeita, gás ou crescimento)


66

A positividade de uma hemocultura é sempre reportada ao clínico, mesmo

tratando-se de um agente da flora comensal da pele. Os microorganismos patogénicos

mais frequentemente isolados são Escherichia coli, Enterobacter, Staphylococcus

aureus, Pseudomona sp.

3.6. Coprocultura

A identificação de microorganismos patogénicos nas fezes é complicada uma

vez que existe uma abundante microflora fecal normal. Na realidade, a flora fecal no

indivíduo normal contém 10¹¹- 10¹² organismos/g de fezes, sendo cerca de 99%

aeróbios. As infecções do aparelho gastrointestinal têm uma alta incidência na

população em geral, com grande morbilidade em determinados grupos etários (crianças

e idosos). Os microrganismos responsáveis por estas infecções têm vindo a alterar-se

devido a vários factores tais como o aumento dos movimentos migracionais, a maior

frequência de viagens intercontinentais, o aumento do número de doentes

imunodeprimidos e o desenvolvimento de métodos de diagnóstico cada vez mais

sensíveis (7). Os antecedentes epidemiológicos, a existência de factores predisponentes,

a presença de sinais e sintomas clínicos e o tipo de diarreia devem orientar na pesquisa

do agente etiológico.

No laboratório faz-se por rotina o despiste de Salmonella spp,, Shigella spp., e

Campylobacter spp. Após o utente entregar a amostra em recipiente estéril, seco, de

boca larga e tampa de rosca, esta é levada para a área da microbiologia para mais tarde

ser processada. Inicialmente é feita a sementeira das fezes nos meios apropriados:

MCK, CAM e HEKT, sendo também inoculado em meio de enriquecimento de selenito


67

para posterior sementeira novamente em HEKT, seguindo para estufa a 37ºC durante

24h (meio CAM mantém-se 5 dias em atmosfera de microaerofilia). (1)

Esquema 6. Fluxograma Coprocultura

O exame micológico das fezes é apenas realizado quando há um pedido

específico do clínico. Quando assim é, as fezes são também semeadas em meio SGC2 e

seguem para a estufa a 30ºC durante 72 horas. (1)

Em meio MCK são consideradas colónias suspeitas todas que as forem lactose

negativas (bege claras a transparentes) e no meio HEKT todas as que foram esverdeadas

ou com centro negro.

Amostra de fezes

Semear em MCK, CAM, HEKT e selenito, incubar a

37ºC durante 24h (meio CAM mantém-se 5 dias em

atmosfera de microaerofilia).


Resultado negativo – Saída às 72 horas Resultado positivo:

Colónias suspeitas: envio para o

laboratório central para identificação

e TSA

CAM HEKT MCK

Meio Selenito

HEKT


68

3.7. Expectoração e Secreções Brônquicas

O diagnóstico das infecções respiratórias inferiores é frequentemente dificultado

pela contaminação das amostras por flora comensal da orofaringe durante a colheita.

Geralmente a expectoração consiste num exsudado inflamatório do sistema respiratório

inferior misturado com saliva.

O Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) é o agente mais frequente da

pneumonia. O Haemophilus influenzae é o segundo microrganismo mais prevalente,

verificando-se um aumento da frequência na presença de doença pulmonar crónica. Os

microrganismos atípicos, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila e a

Chlamydia pneumoniae são responsáveis por menor número de casos. A Pseudomonas

aeruginosa é um agente etiológico pouco frequente, sobretudo na ausência de alterações

estruturais pulmonares, estando geralmente associada a formas graves de pneumonia

(7).

Para pesquisa destes agentes patogénicos, é realizado um exame directo a partir

de lâminas coradas por Gram, bem como o exame cultural em meio COS, MCK e

HAEM. Na lâmina de Gram, além da avaliação da flora existente, também é avaliada a

quantidade de células polimorfonucleares presentes bem como a de células epiteliais (no

caso da presença de muitas células epiteliais, a amostra é rejeitada por contaminação). O

meio COS permite a observação da presença ou não de hemólise e do tipo de hemólise.

É a partir deste meio que se fazem os teste da catalase e coagulase se necessário. O

Streptococcus pneumoniae é um microrganismo anaeróbio facultativo que após 18-24h

de incubação a 37ºC numa atmosfera com 5 % de CO2 apresenta colónias, na gelose

sangue, com cerca de 1 mm de diâmetro, redondas de bordo inteiro e circundadas por

uma zona de a hemólise. O teste da optoquina permite a identificação presuntiva do


69

Streptococcus pneumoniae. Este teste baseia-se na susceptibilidade desta bactéria à

optoquina, inibindo o seu crescimento o que origina um halo de inibição da cultura em

placa. A valorização clínica das culturas é efectuada de acordo com a informação clínica

e exame directo. O exame micológico é efectuado pelo exame cultural em meio SGC2

apenas quando é expressamente pedido pelo clínico. (1)

Poderá ser também pedido um exame directo e cultural para a pesquisa de BK (

Bacilo de Koch) para despiste de tuberculose. Neste caso, a expectoração é enviada

assim que possível para o laboratório central para ser processada, sendo que no

laboratório apenas é feita a lâmina para Ziehl (pesquisa de bacilos álcool-ácido-

resistentes).

Esquema 7. Fluxograma Expectoração e Secreções Brônquicas

Semear em COS e HAEM com incubação 24-48 horas

a 37˚C em atmosfera de 10% de CO2

+

MCK 18 – 24 horas a 37ºC


Observação das lâminas de Gram e Ziehl

Resultado negativo – Saída às 48 horas

Expectoração / Secreção Brônquica

COS HAEM MCK

Colónias suspeitas: eventual prova da

Catalase e Slidex, repicagem se necessário

(nova incubação)




70

3.8. Exsudado Purulento

O exsudado purulento pode variar consoante a zona na qual é recolhido o pus.

Podemos estar na presença de um exsudado auricular, de uma úlcera ou de uma ferida,

entre outros. Os meios utilizados são o COS, MCK e MSA2, além de ser também

incubado em meio de enriquecimento BHI para ser novamente semeado em COS, MCK

e MSA2 após 24 horas (no caso de turvação do meio) ou 48 horas. Juntamente com a

cultura é realizada uma lâmina para coloração de Gram. (1)

Esquema 8. Fluxograma Exsudado Purulento


Semear em COS, MCK, MSA2 e BHI, incubar a 37ºC

durante 24 – 48 horas


Resultado negativo – Saída às 72 horas

Resultado positivo:

Colónias suspeitas: envio para o

laboratório central para identificação

e TSA

COS

MSA2 MCK

BHI

MSA2

COS

MCK


71

3.9. Outras actividades desenvolvidas na área da microbiologia

Exame parasitológico das fezes

Antes da preparação da amostra é essencial ter em atenção a eventual presença

de estruturas macroscópicas sugestivas de parasitas. A amostra é preparada por

concentração pelo método de Ritchie, o qual se baseia-se no processo de

centrifugação/sedimentação das formas parasitárias num sistema de formol e éter. Neste

laboratório é utilizado o Kit comercial IBERKIT®. Posteriormente faz-se a observação

ao microscópio óptico com ampliação de 10x e 40x, depois de homogeneizar a

suspensão. Apesar de raramente obtermos amostras positivas, os parasitas mais

frequentes são quistos de Giardia lamblia, Entamoeba histolytica e Entamoeba coli,

ovos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e de Taenia spp.(1).

Pesquisa de sangue oculto nas fezes

Este teste é usado na deteção nas fases iniciais de problemas gastrointestinais

tais como o cancro do cólon, úlceras, pólipos, colite, diverticulite, que possam não

mostrar quaisquer sintomas visíveis a não ser sangue oculto. É realizado com o

dispositivo CLEARVIEW®FOB, o qual é um imunoensaio cromatográfico rápido para

detecção qualitativa de sangue humano oculto nas fezes. Este dispositivo tem uma

membrana revestida de anticorpos anti-hemoglobina na região da linha de teste. Durante

o teste, a amostra reage, formando uma linha colorida, revelando um resultado positivo.


72

Deverá sempre aparecer uma segunda banda colorida, como indicador do bom

desempenho e controlo do teste. (1)(8)

Pesquisa de Mycoplasma e Ureaplasma

A pesquisa destes agentes patogénicos é apenas efetuada mediante pedido

específico, sendo efectuada em exsudados vaginais ou uretrais.

É utilizado um kit próprio, o MycoView®, que permite a identificação, a

titulação diferencial e a determinação de sensibilidade aos antibióticos de Ureaplasma

urealiticum e de Mycoplasma hominis, a partir de diferentes amostras urogenitais. Este

teste baseia-se em propriedades metabólicas específicas e resistência natural de cada

espécie de micoplasma. O Ureaplasma urealiticum faz a hidrólise da ureia e é resistente

à lincomicina, enquanto o Mycoplasma hominis hidrolisa a arginina e é resistente à

eritromicina (8). Este teste associa um caldo de cultura seletivo a uma galeria, que é

incubada a 37ºC durante 48 horas, e fornecem um resultado qualitativo/semi-

quantitativo. O crescimento das duas espécies é visualizado por uma mudança de cor do

indicador de pH de amarelo-laranja para vermelho ou rosa. A identificação do

Ureaplasma urealiticum é feita às 24 horas enquanto a do Mycoplasma hominis é feita

às 48 horas (1).

7.1. Antibiogramas

Os antibiogramas não se realizam neste laboratório, sendo que todos são

efectuados no laboratório central. No entanto é importante deixar uma breve nota


73

referente a esta questão, uma vez que, quando o resultado do antibiograma

correspondente a qualquer produto enviado fique pronto, é feita uma selecção rigorosa

dos antibióticos que vão efectivamente ser validados e apresentados no boletim de

análises, pelo especialista. Esta selecção é feita tendo em conta a idade, o estado

fisiológico e patologias associadas ou contexto clínico, com base nas guidelines da

Direcção Geral da Saúde.

7.2. Controlo de Qualidade Interno

Como controlo de qualidade interno do sector de microbiologia são utilizadas

estirpes de referência, obtidas a partir de culturas de colecção, as quais são processadas

como estirpes isoladas a partir de amostras clínicas.

As estirpes, a periodicidade e os processamentos utilizados nestes procedimentos

estão indicados na tabela seguinte:

Estirpes Processamento Objectivo Critérios de

Aceitação

Periodicidade

Staphylococcus

aureus ATCC

29213

Teste da

catalase +

Slidex + Gram

Testar

reagentes da

catalase,

Slidex e

coloração de

Gram

Catalase

positiva,

Slidex

positivo, Gram

positivo

Mensal /

Abertura de

novo lote de

reagente

Escherichia coli

ATCC 25922

Gram Testar os

reagentes da

coloração de

Gram

Gram negativo Mensal /

Abertura de

novo lote de

reagente

Streptococcus Teste da Testar os Sensível à Mensal /


74

pneumoniae

ATCC 49619

optoquina discos de

optoquina

optoquina Abertura de

novo lote de

reagente

Tabela 11. Controlo de Qualidade Interno Microbiologia

As estirpes são conservadas congeladas a – 20º C em sistema CRYO-BEADS.

É igualmente realizado um controlo de esterilidade da câmara de fluxo laminar

mensalmente. Para tal são colocadas no interior da câmara, durante uma hora, três meios

COS e três meios SCG2 abertos, seguindo depois para a estufa onde ficam a incubar 48

horas, a 37ºC e 30ºC respectivamente.

7.3. Avaliação Externa da Qualidade

Para efeitos de avaliação externa da qualidade, o laboratório participa num

programa específico, o NEQAS – Microbiologia Geral, Micobactérias, Microscopia e

Coloração, mensalmente.


75

4. IMUNOLOGIA

A Imunologia é uma das valências com pouca expressão técnica neste

laboratório, uma vez que a maior percentagem de análises imunológicas são todas

encaminhadas para o laboratório central. Desta forma, esta área foi pouco explorada.

Apesar disso, o sector de imunologia do laboratório inclui um equipamento onde são

feitos alguns parâmetros imunológicos, o Vidas®, sendo as restantes técnicas, manuais.

A imunologia é uma área de grande complexidade, é necessário estar sempre ciente das

situações fisiológicas dos indivíduos para conseguir discernir possíveis interferências

nos resultados.

4.1. Vidas

O Vidas® é um equipamento com um sistema multiparamétrico de imunoensaio

com cinco secções diferentes, tendo cada uma 6 posições de testes, o que permite que

diversos parâmetros sejam efectuados em simultâneo. É um aparelho rápido e muito

simples de utilizar.

Fundamento do método:

ELFA (Enzyme linked fluorescente assay): O princípio do doseamento associa o método

imunoenzimático sandwich em 2 etapas com uma detecção final em fluorescência. O

cone, de utilização única, serve tanto de fase sólida como de suporte de pipetagem. Os

outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados e pré-repartidos na


76

barrete. Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente no aparelho, o que se

traduz numa sucessão de ciclos de aspiração e dispensa do meio reaccional. A amostra é

colocada na barrete e no seu local correspondente, sendo depois diluída e incubada com

o cone. Posteriormente, é aspirada e dispensada no interior do cone durante um tempo

determinado. O interior do cone está revestido com antigénios ou anticorpos

complementares aos anticorpos ou antigénios que se pretende determinar na amostra. Os

anticorpos e os antigénios ligam-se. Os componentes não ligados à amostra são

eliminados por lavagens. Durante a etapa final de revelação, o substrato é aspirado e

dispensado pelo cone; a enzima do conjugado catalisa a reacção de hidrólise deste

substrato no produto cuja fluorescência emitida é medida. O valor do sinal de

fluorescência é proporcional à concentração do anticorpo presente na amostra.

Terminado o teste, os resultados são calculados automaticamente pelo equipamento

relativamente à curva de calibração em memória. Todos os reagentes utilizados no

sistema são pré-calibrados. Cada kit trás uma carta de calibração em formato de código

de barras que tem de ser lida cada vez que se utiliza um novo lote. A cada 14 dias, é

necessário passar o calibrador no equipamento (9).

4.1.1. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)

O HIV é um retrovírus RNA, transmitido principalmente através do contacto

sexual mas também por infecção pré-natal ou perinatal, ou contacto directo de ferida ou

mucosa com sangue ou produtos contaminados. Este vírus é responsável pela SIDA

(Síndrome da Imunodeficiência Adquirida). Actualmente o HIV é classificado em dois

tipos, o HIV-1 e o HIV-2, sendo estes muito semelhantes na estrutura morfológica,

organização genómica, e tropismo celular, entre outras características. Após uma


77

primeira exposição ao vírus, existe uma fase de latência, antes de se manifestar a severa

imunodepressão que caracteriza a SIDA. Pouco tempo depois da infecção pelo HIV,

mas antes da seroconversão, os antigénios do HIV podem ser detectados em amostras

de soro ou plasma. A proteína estrutural do HIV mais frequentemente utilizada como

marcador antigénico é a proteína p24 (10). É utilizado um kit específico, o Vidas® HIV

DUO Quick, tratando-se de um teste automatizado que permite a detecção combinada

das imunoglobulinas totais anti-HIV 1 e anti-HIV 2 e do antigénio p24 do HIV 1, em

soro ou plasma humano, pela técnica de ELFA.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:

ELFA


O controlo de qualidade interno é feito com base no controlo interno do próprio

kit utilizado. Existem três níveis, controlo nível 1 (patológico), controlo nível 2 (não

patológico) e controlo nível 3 (patológico), com intervalos de referência pré-

estabelecidos que acompanham o kit. Este controlo é efectuado semanalmente ou

sempre que seja realizado o ensaio.


78


Na avaliação externa da qualidade, o laboratório participa num programa ao

SEQC (Sociedade Espanhola de Bioquímica Clínica e Patologia Molecular)

trimestralmente.

4.2. Serologia / Técnicas Manuais

A serologia compreende diferentes técnicas que nos auxiliam no diagnóstico de

patologias infeciosas. Estas técnicas têm como principal base a detecção sérica de

anticorpos específicos produzidos contra antigénios, como resposta à presença de um

agente infeccioso.

Fundamento do Método:

Aglutinação Directa – Na presença de um agente patogénico ocorre a

formação de anticorpos, nomeadamente aglutininas. Um soro que contenha

estas aglutininas específicas, em presença dos antigénios homólogos e em

condições devidamente controladas, são capazes de causar aglutinação

visível. O grau de aglutinação depende da concentração do antigénio, do

número de anticorpos presentes e da temperatura.


79

4.2.1. Serologia para Treponema pallidum

O Treponema pallidum é o agente etiológico da sífilis, uma doença sexualmente

transmissível e infecção crónica, que progride através de diferentes fases (sífilis

primária, secundaria, terciária e quaternária), produzindo diferentes sintomas clínicos

que se iniciam com as lesões cancroides típicas, seguidas de rash e, por fim, problemas

cardiovasculares e neurosífilis (7). O diagnóstico da sífilis é feito maioritariamente por

reacções serológicas, através da detecção de anticorpos (métodos não-treponémicos) ou

de antigénios de T. pallidum (métodos treponémicos). Ao nível deste laboratório é

utilizado um método não-treponémico, o RPR (Rapid Plasma Reagin).

Amostra:

Soro ou plasma

Método:

RPR – Inespecífico, apenas detecta anticorpos da classe IgG e IgM. O antigénio

utilizado é constituído por cardiolipina, lecitina e colesterol. É avaliado o grau de

floculação dos antigénios lipídicos com o soro dos doentes. O RPR utiliza partículas de

carvão activado com os antigénios lipídicos adsorvidos e a reacção é visível a olho nu. É

também utilizado na monitorização da terapêutica com antibióticos. A metodologia é

aglutinação directa em placa. Se houver agregados de partículas de cor negra, estamos

perante um resultado positivo. Neste caso, fazemos diluições do soro com soro

fisiológico, até deixarem de aparecer agregados. A última diluição em que se observa

um resultado positivo, será o resultado da titulação (8).


80

Esta análise apresenta várias interferências (pouco específica), podendo ocorrer

resultados falsos-positivos, os quais requerem a confirmação dos resultados por

métodos treponémicos. Tal facto deve-se ao aparecimento de anticorpos antilipídicos,

em resposta a doenças não-treponémicas, agudas e crónicas, em que ocorre destruição

tecidular (ex. doenças autoimunes), nas grávidas e nos idosos. Nenhum título único é,

por si só, diagnóstico. O método treponémico utilizado para confirmação do RPR é o

TPHA (Treponema Pallidum Hemaglutination), realizado a nível do laboratório central.

4.2.2. Serologia para Salmonella

As bactérias do género Salmonella, vulgarmente designadas por salmonelas, são

bacilos Gram-negativos da família Enterobacteriaceae, que provocam infecções

gastrointestinais. A salmonelose é adquirida por contacto fecal-oral através da ingestão

de alimentos e água contaminados. Para melhor compreender a linguagem ao nível das

diferentes espécies de Salmonella, é necessário referenciar que para a sua nomenclatura

usa-se frequentemente o nome do serótipo como sendo o nome da espécie (ex. S.

paratyphi A). A serotipagem baseia-se na caracterização dos antigénios somáticos (O),

antigénios flagelares (H) e antigénios de superfície (Vi). O diagnóstico laboratorial da

febre tifóide (S. typhi) e paratifóide (S. paratyphi A e B) é feito através da reacção de

Widal.

Amostra:

Soro ou plasma


81

Método:

Reacção de Widal - Quantificação dos anticorpos anti-O e anti-H, presentes no

soro do doente, por reacções de aglutinação directa em placa com suspensões

antigénicas padronizadas de Salmonella (typhi O e H; paratyphi AO, AH, BO e BH). Os

resultados são expressos em título, dado pela última diluição do soro que ainda

apresenta aglutinação.

Podem existir reacções cruzadas devido a imunização prévia, infecções antigas ou

presença de anticorpos dirigidos a antigénios relacionados (8).

4.2.3. Serologia para Mononucleose Infecciosa

A mononucleose infecciosa é uma infecção herpética aguda causada

maioritariamente pelo vírus Epstein-Barr, transmitida por via oral, a qual afecta

principalmente crianças e adolescentes. É caracterizada por um conjunto de sintomas

que podem incluir linfadenopatia generalizada, hepatoesplenomegália moderada,

faringite acompanhada de febre, mal-estar, astenia, mialgias, entre outros. Os linfócitos

T respondem imunologicamente às células B infectadas, sobretudo através da activação

e proliferação das células T supressoras (CD8), originando uma linfocitose e o

aparecimento (superior a 10 %) de linfócitos atípicos no sangue periférico. Durante a

fase aguda da doença, anticorpos heterófilos (primariamente IgM) aparecem em 80 a

90% dos casos, os quais podem ser detectados por técnicas de aglutinação (3).


82

Amostra:

Soro ou plasma

Método:

MONOSPOT – Kit Clearviem IM: Imunoensaio para a determinação qualitativa

de anticorpos IgM heterófilos por técnica de aglutinação directa. A amostra do doente é

adicionada à placa absorvente na janela de amostra. A placa absorvente contém

microesferas ligadas a uma glicoproteína de eritrócitos bovinos. Quando a amostra é

aplicada, estas microesferas são mobilizadas e a amostra migra ao longo da tira teste. Se

estiverem presentes anticorpos heterófilos, estes conjugam-se com as glicoproteínas,

formando um complexo com as microesferas na linha de teste originando uma linha

com cor. Podem surgir falsos-negativos associados a situações em que o doente

permanece negativo para anticorpos heterófilos, ou eventualmente apresenta uma

resposta tardia a este tipo de anticorpos (8).


83

5. BIOQUÍMICA

A valência de bioquímica corresponde a um dos sectores mais importantes das

Análises Clínicas. É dos sectores com maior volume de trabalho e igualmente dos mais

extensos, onde é analisado um elevado número de parâmetros, segundo inúmeras

técnicas e com diferentes fundamentos. Desta forma, houve a possibilidade de percorrer

todas as fases do processo laboratorial (fase pré-analitica, fase analítica e pós-analitica)

e perceber a importância de cada uma delas, nomeadamente a importância de uma boa

colheita e do transporte correcto e rápido da amostra até ao processamento laboratorial

para a obtenção de um resultado correcto. Neste laboratório não existem muitos

equipamentos diferentes, no entanto foram executados desde métodos totalmente

manuais aos totalmente automáticos, passando pelos semi-automáticos, sempre com a

preocupação da maior familiarização possível com os fundamentos de funcionamento

dos equipamentos e da metodologia utilizada, para além de participação na validação de

resultados, sempre com auxílio de profissionais qualificados.

5.1. Dimension Xpand

Este é o equipamento onde são realizadas a maioria das análises em todo o

laboratório. Os sistemas de bioquímica clínica deste equipamento são sistemas de

química integrados, independentes, controlados por microprocessador, que medem

diversos analitos, incluindo enzimas. Os sistemas funcionam com cartuchos de reagente

para testes múltiplos, as flex, cuvetes de reacção descartáveis, tecnologia de


84

microssensores integrados (IMT), de forma a fornecer resultados rápidos, exactos e

precisos.


Espectrofotometria - Método definido como uma medida da intensidade da luz

absorvida a um determinado comprimento de onda da radiação que incide na amostra. A

absorvância varia linearmente com a concentração do analito, a qual é determinada por

extrapolação gráfica com base na Lei de Lambert Beer. Neste método, é adicionado um

reagente produzindo uma reação que altera a absorvância. Esta alteração é detectada por

um fotodetector. Dentro da espectrofotometria temos o método colorimétrico, que

quantifica a intensidade da cor formada na reação. Existem também métodos que

envolvem reacções enzimáticas, incluindo a determinação da actividade enzimática a

um tempo fixo (método enzimático) e a determinação contínua da actividade enzimática

(método cinético).

Potenciometria - Baseia-se na medição de potencial de um eléctrodo indicador

em relação a um eléctrodo de referência. Este potencial depende das actividades das

espécies iónicas que entram nas reacções de oxidação-redução correspondentes. Neste

caso é utilizado um sensor que desenvolve um potencial elétrico proporcional à

actividade de casa ião específico na amostra. Os iões estabelecem um equilíbrio com a

superfície do eléctrodo. É gerado um potencial proporcional ao logaritmo da actividade

do analito. Este potencial gerado na amostra é comparado com uma solução standard e

a concentração iónica calculado com base na equação de Nernst.


85

Turbidimetria – A turbidimetria é uma medida da diminuição da intensidade da

luz incidente causada pela dispersão, reflecção e absorção do feixe de luz incidente

numa solução de partículas. A imunoturbidimetria compreende a formação de

imunocomplexos Ag/Ac in vitro, de forma a aumentar a turbidez, medindo a formação

progressiva de imuncomplexos numa célula fotoeléctrica, na forma de densidade óptica.

Imunoensaio enzimático – Técnica realizada através da fixação de antigénios ou

anticorpos a uma superfície sólida que se vão ligar especificamente aos anticorpos ou

antigénios a pesquisar, durante um período de incubação. O material ligado é

posteriormente detectado por um segundo anticorpo marcado com uma enzima. O

conjugado que não estiver ligado é removido por lavagem. É adicionado um substrato,

que será degradado pela enzima, originando cor ou quimioluminescência. A leitura dos

resultados é feita geralmente utilizando um espectrofotómetro de absorvância (quando o

produto da reacção é corado) ou de emissão (quando o produto da reacção emite

radiação/fluorescência). A absorvância/fluorescência será proporcional à quantidade de

antigénios ou de anticorpos específicos presente na amostra testada.(11)

5.1.1. Glucose

A glucose é um monossacárido presente no sangue que funciona como um

substrato fornecedor de energia. A determinação da glicémia é utilizada como meio de

diagnóstico e monitorização da terapêutica de pacientes com diabetes mellitus,

investigação de hiper e hipoglicémia e rastreio de factores de risco cardiovascular.


86

Amostra:

Soro ou plasma e urina

Método:

Espectrofotometria (Enzimático)

Hexocinase-glucose-6-fosfato desidrogenase:

A leitura da absorvância é feita a 340 nm e 383 nm e é devida à formação de NADH, a

qual é proporcional à concentração de glucose na amostra.


74 – 106 mg/dl

Valores de Glucose Aumentados Valores de Glucose Diminuídos

-Diabetes mellitus

- Hemocromatose

- Fármacos

- Deficiências nutricionais

Hexocinase

Glucose + ATP Glucose-6-fosfato + ADP

Glucose-6-fosfato desidrogenase

Glucose-6-fosfato + NAD+

Gluconato-6-fosfato + NADH + H+


87

- Síndrome de Cushing

- Feocromocitoma

- Stress

- Pancreatite aguda

- Fármacos

- Doenças hepáticas e cardíacas

- Hipotiroidismo

- Doenças pancreáticas (tumores

pancreáticos secretores de insulina)

- Hipoglicémia auto-imune (ex. Ac. Anti

células beta)

Tabela 12. Alterações dos valores de glucose (12)

Para além da determinação única de glicémia, são também realizadas outras

provas com a determinação de glicémia a tempos determinados. As mais comuns são a

Glicémia Pós-Prandial e a Prova de Tolerância Oral à Glucose, que são provas de

sobrecarga de açúcares, com vista a avaliar a capacidade funcional do pâncreas.

5.1.2. Proteínas Totais

O total de proteínas no soro consiste na soma de todas as proteínas em

circulação. O valor das proteínas totais séricas pode sofrer variações devido a alterações

de uma ou mais proteínas específicas ou alteração a nível do volume de água no plasma.

As alterações nos níveis de proteínas totais apresentam uma correlação clínica variada e

a sua determinação é, essencialmente, utilizada no diagnóstico e tratamento de diversas

patologias que envolvem o fígado, os rins ou a medula óssea bem como outras

perturbações metabólicas e nutricionais.


88

Amostra:

Soro ou plasma

Método:

Espectrofotometria (colorimetria)

Biureto:

A leitura da absorvância é feita a 540 nm e 700 nm e é devida à formação do complexo

azul-violeta que é proporcional à concentração de proteínas na amostra.


6.4 – 8.2 g/dl

Proteínas Totais Aumentados Proteínas Totais Diminuídas

- Desidratação

- Mieloma múltiplo

- Hemorragias

- Síndrome nefrótico

- Queimaduras graves

- Défice na absorção de proteínas

- Síndrome de retenção de sal

Tabela 13. Alterações dos valores das Proteínas totais (12)

OH-

Proteínas + Cu2+

Complexo


89

5.1.3. Albumina

A albumina é a proteína mais abundante no soro humano (55-65% das proteínas

plasmáticas totais), sendo a principal responsável pela manutenção da pressão oncótica,

transporte e armazenamento de uma grande variedade de ligandos. Os níveis séricos de

albumina poderão indicar deficiências nutricionais ou serem utilizados como marcador

de desordens do metabolismo proteico (redução da síntese ou perda acentuada de

proteínas).

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A leitura da absorvância é feita a 600 nm, nos quais o complexo formado absorve. A

quantidade de complexo formado é proporcional à quantidade de albumina presente na

amostra.


3.4 – 4.8 g/dl

Albumina + Roxo de Bromocresol Complexo


90

Albumina Aumentada Albumina Diminuída

- Desidratação

- Estase venosa excessiva

- Deficiência de síntese (doença hepática)

- Ingestão alimentar inadequada

- Absorção diminuída

- Gravidez, hipertiroidismo

- Destruição aumentada (infecções,

neoplasias, traumas)

- Perda excessiva (queimadura,

hemorragia, síndrome nefrótico,

enteropatia)

Tabela 14. Alterações dos valores da Albumina (12)

5.1.4. Ferritina

A ferritina é uma molécula constituída por um invólucro proteico e um núcleo de

ferro. Está presente em quantidades elevadas nas células do fígado e medula óssea.

Constitui a reserva principal de ferro, mantendo o organismo protegido aquando de

excesso de ferro em circulação (até saturação). Encontra-se também em circulação no

plasma, onde a sua concentração reflecte em que condições que se encontram as

reservas. O doseamento de ferritina é útil na detecção e monitorização de deficiência de

ferro, diagnóstico diferencial entre anemia ferropénica e anemia da doença crónica.


91

Amostra:

Soro ou plasma heparinizado

Método:

Imunoensaio enzimático

Este método consiste num só passo baseado no princípio de sandwich. A

amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos

monoclonais específicos para a ferritina e com um reagente conjugado (anticorpos

monoclonais específicos para um segundo local na molécula de ferritina), formando um

complexo sandwich partícula-ferritina-conjugado. O conjugado não ligado e o analito

são separados magneticamente e por lavagem, correspondentemente. Posteriormente, a

sandwich é combinada com um substrato cromogénico que é catalisado de forma a

originar a cor vermelha. A concentração de ferritina presente é directamente

proporcional intensidade da cor formada. A leitura é bicromática a 577 e 700 nm.


10 – 291 µg/dL

Ferritina Aumentada Ferritina Diminuída

- Sobrecargas de ferro (transfusões)

- Processos inflamatórios (Fase aguda

positiva)

- Depleção das reservas de ferro (Anemia

ferropénica, gravidez, insuficiência renal)


92

- Hemocromatose

- Doenças hepáticas

- Tumores malignos

Tabela 15. Alterações dos valores da Ferritina (12)

5.1.5. Proteína C reactiva

A proteína C reactiva (PCR) é uma proteína de fase aguda positiva não

específica, que normalmente aumenta precocemente durante a resposta imunitária

generalizada inespecífica a processos inflamatórios não infecciosos e infecciosos, como

por exemplo artrite reumatoide ou doenças cardiovasculares. A PCR é sintetizada no

fígado e tem como principal função a fixação e desintoxicação das substâncias tóxicas

endógenas produzidas em resultado de lesões tecidulares. A sua determinação é

relevante no screening de inflamação aguda e avaliação da terapêutica anti-inflamatória.

Trata-se de um parâmetro muito sensível, no entanto é pouco específico.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:

Turbidimetria


93

Partículas sintéticas coberta de anticorpos para a PCR complexam na presença

desta. A formação de complexos vai aumentar a turbidez, a qual é proporcional à

concentração de PCR na amostra.

PCR Aumentada

- Doenças inflamatórias (ex: artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal)

- Infecções bacterianas ou virais

- Danos tecidulares (neoplasias, enfarte do miocárdio)

- Complicações pós-operatórias

Tabela 16. Causas do aumento de PCR (12)


<0,6 mg/dl

5.1.6. Ureia

A ureia é um composto azotado sintetizado no fígado como produto final do

metabolismo das proteínas e dos aminoácidos. Na sua degradação, as proteínas são

hidrolisadas em aminoácidos e estes desaminados. A amónia que resulta desse processo

é convertida em ureia no fígado, lançada na circulação sanguínea e excretada pela urina.

Mais de 90% da ureia é filtrada pelo rim, não sendo reabsorvida nem secretada

PCR + Ac Anti-PCR Complexo


94

activamente. Esta constitui a principal via de desintoxicação do organismo humano para

o excesso de amoníaco.

A determinação da ureia é um dos testes mais utilizados para a avaliação da

função renal e da nutrição proteica e também no diagnóstico de determinadas doenças

metabólicas. Esta análise é frequentemente prescrita em conjunto com a creatinina para

o diagnóstico diferencial da hiperurémia pré-renal, renal e pós-renal.

Amostra:


Método:

Espectrofotometria (cinético)

Ensaio de UV cinético

A mudança da absorvância a 340 nm devido ao consumo de NADH é directamente

proporcional à concentração de ureia. A leitura é bicromática a 340 e 383 nm.


Homem: 18 – 55 mg/dl

Mulher: 21 – 43 mg/dl

Glutamato desidrogenase

Urease

Ureia + H2O 2 NH3 + CO2

NH3 + α-cetoglutarato + NADH L-glutamato + NAD


95

Ureia Aumentada

Pré-renal - Insuficiência cardíaca

- Catabolismo proteico elevado

- Depleção hídrica

Renal - Nefropatias

Pós-renal - Obstrução das vias urinárias

Tabela 17. Causas do aumento de ureia (12)

5.1.7. Creatinina

A creatinina é sintetizada endogenamente a partir de creatina e de fosfato de

creatina no metabolismo muscular. Em condições de função renal normal, é excretada

por filtração glomerular. O valor da creatinina está dependente da massa muscular,

filtração glomerular e nutrição. As determinações de creatinina são realizadas para o

diagnóstico e a monitorização da insuficiência renal aguda e crónica e monitorização da

diálise renal.

A análise da creatinina na urina é utilizada para calcular a clearance da

creatinina.


96

Cálculo da clearance da creatinina e expressão dos resultados:

Amostra:


Método:

Espectrofotometria (colorimetria, cinético)

Método de Jaffé

A taxa de alteração na absorvância a 510 nm é proporcional à concentração de

creatinina na amostra. Leitura bicromática a 510 e 600 nm.


Homem: 0.80 – 1.30 mg/dl

Mulher: 0.60 – 1.00 mg/dl

Creatinina Aumentada Creatinina Diminuída

- Insuficiência renal - Gravidez

NaOH

Creatinina + Picrato Cromoforo vermelho

Clcr = Crurina x Volume(urina 24 horas)

Crsérica


97

- Doenças musculares

- Dieta rica em creatina (carne vermelha)

- Tratamento de diálise prolongado

- Hepatopatia crónica (a creatinina é

sintetizada a nível hepático)

Tabela 18. Alterações da creatinina (12)

5.1.8. Ácido Úrico

O ácido úrico resulta do metabolismo das purinas e ácidos nucleicos. É

excretado pelos rins, mas em situações de disfunção renal pode acumular-se. O aumento

dos níveis de ácido úrico pode levar à formação de depósitos de cristais de urato nas

articulações (gota) ou nos rins (cálculos renais). A determinação do ácido úrico permite

avaliar se a inflamação nas articulações está relacionada com a gota e é útil para

monitorizar a produção de ácido úrico, em doentes sujeitos a quimioterapia.

Amostra:


Método:

Espectrofotometria (colorimetria, enzimático)

Uricase

Ácido Úrico + 2 H2O + O2 Alantoína + H2O2 + CO2


98

O ácido úrico, que absorve a 293 nm, é convertido em alantoína pela uricase, a

qual não absorve a esse comprimento de onda. Esta alteração na absorvância é

directamente proporcional à concentração de ácido úrico na amostra. Leitura

bicromática a 293 e 700 nm.


2.5 – 6.0 mg/dl

Ácido Úrico Aumentado

- Insuficiência renal

- Gota

- Leucemia

- Psoríase

- Transtornos nutricionais

- Terapêutica citostática

Tabela 19. Causas do aumento de ácido úrico (12)

5.1.9. Bilirrubinas

Cerca de 80-85% da bilirrubina produzida diariamente tem origem na

hemoglobina libertada pela decomposição de eritrócitos através do sistema

reticuloendotelial do fígado, baço e medula óssea, no qual o grupo heme, assim que


99

perde o ferro, é convertido em bilirrubina. Os restantes 15-20% resultam da ruptura de

proteínas que possuem hemoglobina tais como mioglobina, citocromos e catalase. A

bilirrubina, por ser insolúvel em água, liga-se à albumina. A esta fracção chamamos

bilirrubina indirecta ou não-conjugada. No fígado, a bilirrubina é conjugada com o

ácido glucorónico para formar a bilirrubina conjugada, ou bilirrubina directa, que é

excretada através do sistema biliar para o intestino. A eliminação é quase completa e os

níveis séricos são normalmente insignificantes. A bilirrubina total é a soma das fracções

não-conjugadas e conjugadas. A diferenciação entre a bilirrubina directa e indirecta é

importante para o diagnóstico diferencial das formas de icterícia. Se a bilirrubina directa

constituir menos de 20% da bilirrubina total, é indicativo de icterícia pré-hepática. Se

for superior a 50% pode sugerir a existência de uma icterícia hepática ou pós hepática.

5.1.9.1. Bilirrubina Total

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A bilirrubina não-conjugada é solubilizada, à qual é adicionado ácido sulfanílico

diazotado, convertendo-a em diazo-bilirrubina, um cromóforo de cor vermelha que

Bilirrubina solubilizada + ácido sulfanílico diazotado Cromóforo vermelho


100

representa a bilirrubina total, absorvendo a 540 nm. Leitura bicromática a 540 e 700 nm.

É realizada uma amostra de ‘’branco’’ para reduzir a interferência do soro endógeno.


< 1.1 mg/dl

5.1.9.2. Bilirrubina Directa

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A bilirrubina conjugada é diluída em HCl, à qual é adicionado ácido sulfanílico

diazotado, convertendo-a em diazo-bilirrubina, um cromóforo de cor vermelha que

absorve a 540 nm. Leitura bicromática a 540 e 700 nm. É realizada uma amostra de

‘’branco’’ para reduzir a interferência do soro endógeno.


< 0.2 mg/dl

Bilirrubina conjugada + ácido sulfanílico diazotado Cromóforo vermelho


101

No estado fisiológico, a bilirrubina plasmática está quase exclusivamente sob a

forma não conjugada. Nas afecções hepáticas agudas, a bilirrubina total é um bom

indicador da gravidade da afecção. O doseamento da bilirrubina plasmática, livre e

conjugada, permite confirmar a icterícia clínica e determinar a origem.

Aumento das Bilirrubinas

- Icterícias por excesso de bilirrubina (icterícias hemolíticas): Exclusivas da bilirrubina

não-conjugada (origem extrahepática)

- Icterícias ligadas a um defeito do metabolismo da bilirrubina (doença de Gilbert,

síndroma de Crigler-Najar, icterícia do recém-nascido): Exclusivas da bilirrubina não-

conjugada

- Icterícias por obstrução biliar intra ou extra-hepática (icterícias colestáticas):

Maioritariamente da bilirrubina conjugada quase exclusiva. As concentrações séricas

das enzimas da colestase são muito elevadas

- Icterícias ligadas a um defeito de excreção celular biliar (síndroma de Dubin-Johnson):

Bilirrubina não-conjugada um pouco elevada e bilirrubina conjugada predominante

- Icterícias hepato-celulares: associação de um defeito de conjugação e de excreção

celular biliar (hepatites virais, tóxicas ou medicamentosas, cirroses, carcinoma

hepatocelular): Aumento das duas formas de bilirrubina

Tabela 20. Causas do aumento das bilirrubinas (12)


102

5.1.10. Triglicéridos

Os triglicéridos são lípidos compostos pela esterificação do glicerol. A

esterificação pode produzir mono, di ou triglicéridos. Os triglicéridos constituem a

gordura armazenada no tecido adiposo, sendo a principal reserva energética do

organismo em caso de ausência de ingestão ou incapacidade de metabolização dos

hidratos de carbono. Os triglicéridos de origem exógena (alimentação) são transportados

no plasma em partículas lipoproteicas designadas de quilomicras, que são rapidamente

catabolizadas pelas lipoproteínas lipase expressas no endotélio capilar, tecido adiposo e

músculo-esquelético sob controlo da insulina. Os triglicéridos de origem endógena

(hepática) são transportados no plasma em VLDL, sintetizadas no fígado, com a função

de suprir os tecidos de ácidos gordos na ausência das quilomicras. A avaliação dos

triglicéridos é utilizada no diagnóstico e tratamento de doentes com pancreatite aguda e

crónica, diabetes mellitus, nefrose, obstrução biliar extra-hepática e outras doenças que

envolvem o metabolismo dos lípidos (hiperlipidémias) ou várias perturbações

endócrinas.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:

Espectrofotometria (enzimático)

Lipoproteína Lipase

Triglicéridos Glicerol + Ácidos Gordos

Glicerol cinase

Glicerol + ATP Glicerol-3-fosfato + ADP

Glicerolfosfato oxidase

Glicerol-3-fosfato + O2 Dihidroacetona fosfato + H2O2

Peroxidase

2 H2O2 + Aminoantipirina Quinoneimina + HCl + 4 H2O + 4-Clorofenol


103

A leitura da absorvância é feita a 510 e 700 nm e é devida à formação de quinoneimina,

sendo proporcional ao teor de triglicéridos na amostra.


40 – 150 mg/dl

Triglicérido Aumentados

- Pancreatite

- Diabetes mellitus

- Doenças genéticas

- Hipercolesterolémias

- Gravidez

Tabela 21. Causas do aumento de triglicéridos (12)

5.1.11. Colesterol Total

O colesterol é sintetizado no fígado e intestinos, embora todas as células o

possam sintetizar a partir de acetil-CoA. Trata-se de um componente essencial das

membranas das células e lipoproteínas e é igualmente um percursor para a síntese das

hormonas esteroides e ácidos biliares. O colesterol é sobretudo transportado pelo LDL e

HDL. Estas duas lipoproteínas desempenham diferentes papéis na patogénese das

perturbações lipídicas (as LDL levam o colesterol para as células e o HDL retira o

colesterol das células). Por conseguinte, a concentração de colesterol total proporciona


104

apenas um valor de base que tem de ser analisado conjuntamente com o LDH, HDL e

triglicéridos.

A determinação de colesterol é utilizada no screening do risco aterosclerótico e

no diagnóstico e tratamento de desordens que envolvem elevados níveis de colesterol e

metabólicas dos lípidos e lipoproteínas.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A leitura da absorvância é policromática a 452, 550 e 700 nm e é devida à formação de

um cromóforo, o qual é directamente proporcional à concentração de colesterol total na

amostra.


< 190 mg/dl

Colestrol esterase

Ésteres do Colesterol Colesterol + Ácidos Gordos

Colesterol oxidase

Colesterol + O2 Colest-4-ene-3-ona + H2O2

Peroxidase

2 H2O2 + DEA-HCl/AAP 4 H2O + DEA-HCl/AAP oxidado (cromóforo)


105

Colesterol Total Aumentado Colesterol Total Diminuído

- Hiperlipoproteinémias

- Obstrução biliar

- Hipotiroidismo

- Nefrose

- Doenças pancreáticas

- Gravidez

- Fármacos (contraceptivos orais,

corticosteróides)

- Doenças que provoquem dano hepático

- Hipertiroidismo

- Infecção e inflamação aguda

Tabela 22. Alterações do colesterol total (12)

5.1.12. Colesterol HDL

Lipoproteina de alta densidade responsável pelo transporte reverso do colesterol

das células periféricas para o fígado. No fígado, o colesterol é transformado em ácidos

biliares, os quais são excretados para o intestino através do tracto biliar. A

monitorização do colesterol-HDL no soro tem importância clínica na medida em que

existe correlação inversa entre o valor deste parâmetro e o risco de doença

aterosclerótica. A redução na concentração plasmática de Colesterol-HDL em

conjugação com a elevação dos triglicéridos aumenta o risco cardiovascular.


106

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A leitura da absorvância é feita a 600 e 700 nm. A intensidade da cor é directamte

proporcional à concentração de colesterol HDL na amostra.


Homem: > 40 mg/dl

Mulher: > 45 mg/dl

Colesterol HDL Aumentado Colesterol HDL Diminuído

- Exercício vigoroso - Stress

Sulfato dextrano + Sulfato de Mg

HDL, LDL, VLDL, Quilomicras LDL, VLDL e Quilomicras não reactivos +

Ésteres de Colesterol HDL

PEG-Colesterol esterase

Ésteres de Colesterol HDL + H2O Colesterol HDL + RCOOH

PEG-Colesterol oxidase

Colesterol HDL + O2 Δ Colestenona + H2O2

Peroxidase

2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + HSDA + H+ + H2O Desenvolvimento de Cor + 5

H2O


107

- Consumo moderado de álcool

- Tratamento com insulina

- Estrogénios orais

- Obesidade

- Diabetes mellitus

- Doença hepática

- Doenças genéticas (Tangier,

Hipoalfalipoproteinémia)

- Urémia

- Nefrose

- Doenças mieloproliferativas

- Tabagismo

- Hipo ou Hipertiroidismo

Tabela 23. Alterações do colesterol HDL (12)

5.1.13. Colesterol LDL

Estas lipoproteínas de baixa densidade são as principais transportadoras

plasmáticas de colesterol com consequente desenvolvimento de aterosclerose. Ainda

que estejamos dentro do intervalo de referência de concentrações de colesterol total,

pode ocorrer um aumento do colesterol LDL com um elevado risco associado de

doenças cardiovasculares, nomeadamente doença coronária.

O colesterol LDL é obtido indirectamente através de um determinado cálculo:

LDL = Colesterol Total – Colesterol HDL – Triglicéridos/5


108


< 130 mg/dl

5.1.14. Lactato Desidrogenase (LDH)

A LDH é uma enzima que podemos encontrar na maioria dos tecidos, como o

coração, pulmão, fígado, rim ou músculo-esquelético. Apresentam-se cinco diferentes

isoenzimas, consoante o tecido onde predomina. Em termos clínicos, a LDH é útil na

detecção de pequenas lesões nos tecidos. Níveis aumentados de LDH poderão ocorrer

numa diversidade de condições patológicas, uma vez que a sua distribuição é bastante

alargada, como por exemplo enfartes do miocárdio, hemólise, doenças hepáticas,

pulmonares e musculares.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:

Espectofotometria (cinético)

Em aerobiose, esta enzima transforma o lactato em piruvato que será de seguida

utilizado na glicogénese. Em anaerobiose, intervém no final da degradação da glicose

em lactato libertando energia sob a forma de ATP.


109

A leitura da absorvância é feita a 340 nm e é devido à formação de NADH, o qual é

proporcional à actividade da enzima na amostra.


85 – 227 UI/L

LDH Aumentada

- Enfarte do miocárdio

- Embolia pulmonar

- Doenças musculares

- Hepatites

- Anemias hemolíticas

- Linfomas

- Choque séptico

- Alguns Tumores

Tabela 24. Situações que podem levar ao aumento de LDH (12)

Lactato Desidrogenase

Lactato + NAD+ Piruvato + H

+ + NADH

pH 9.4


110

Creatina Cinase

Creatina Fosfato + ADP Creatina + ATP

Mg2+

, NAC, EDTA

Hexocinase

ATP + Glucose ADP + Glucose-6-fosfato

Mg2+

Glucose-6-fosfato Desidrogenase

Glucose-6-fosfato + NADP+ 6-fosfogluconolactona + NADPH + (H

+)

5.1.15. Creatina Cinase (CK)

A CK é uma enzima que catalisa a transferência de um grupo fosfato para o

ADP, permitindo a reconstituição das reservas de ATP. Encontra-se em abundância no

miocárdio, músculo-esquelético e cérebro, a cada tecido correspondendo uma

isoenzima: CK-MB (miocárdio), CK-MM (músculo esquelético) e CK-BB (cérebro). A

determinação da CK trata-se de um indicador importante de dano muscular ou cardíaco.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A leitura da absorvância é bicromática a 340 e 540 nm e é devida ao consumo de

NADH, o qual é directamente proporcional à actividade da CK.


111


Homem: 39 – 308 UI/L

Mulher: 26 – 192 UI/L

- Enfarte do miocárdio

- Distrofia muscular

- Exercício físico intenso

- Danos no sistema nervoso

Tabela 25. Situações que podem levar ao aumento de CK (12)

5.1.16. α-Amilase

A α-amilase trata-se de uma enzima que é produzida ao nível do pâncreas e das

nossas glândulas salivares. A determinação da actividade desta enzima tem interesse no

diagnóstico da pancreatite ou outras perturbações pancreáticas. Ao obtermos elevados

níveis de α-amilase no sangue, poderemos estar perante uma situação de pancreatite

aguda, ou na pancreatite crónica recidivante. Estão também associados a síndromes

abdominais dolorosos sem lesão pancreática, pelo que a amilase, apesar de sensível, não

é um teste específico de doença pancreática.

Amostra:

Soro, plasma ou urina


112

Método:


O CNPG3 funciona como substrato da α-Amilase, produzindo o CNP e o

resultante aumento da absorvância é directamente proporcional à actividade da α-

Amilase na amostra.

A leitura da absorvância é bicromática a 405 e 577 nm e é devida ao aumento da

absorvância, a qual é directamente proporcional à actividade da enzima.




α-Amilase Aumentada

- Pancreatite

- Diversos tipos de tumores malignos (pulmão, ovário, mama e cólon)


- Queimaduras

- Doença hepática crónica

- Gravidez

- Cetoacidose diabética

Tabela 26. Situações que podem levar ao aumento de α-Amilase (12)

α-Amilase

CNPG3 (Substrato) CNP + CNPG2 + G3 + glucose


113

5.1.17. Cálcio

O cálcio é um oligoelemento que se encontra no nosso organismo, na sua

maioria no osso sob a forma de hidroxiapatite. No entanto, uma pequena fracção

encontra-se presente no soro, tendo diversas funções. Esta fracção, por sua vez, é

composta por três: uma fracção livre ou ionizada (cerca de 50% do total de cálcio

sérico), correspondente à fracção fisiologicamente activa; outra fracção ligada às

proteínas (cerca de 45% do total de cálcio sérico), na sua maioria à albumina; e outra

fracção ligada a aniões (cerca de 5% do total de cálcio sérico). Dentro das diversas

funções temos a participação na transmissão dos impulsos nervosos, na preservação da

contractilidade muscular, no processo da coagulação e mineralização óssea. A calcémia

é regulada pela acção conjugada da hormona paratiróide, da vitamina D e da

calcitonina. A determinação do cálcio é utilizada no diagnóstico de hipo e

hipercalcémias bem como no diagnóstico diferencial de nefrolitiase.

Amostra:


Método:


Ca2+

+ OCPC Ca-OCPC (Complexo roxo)

pH 9.7

Mg2+

+ 8-quinolinol Quinolinato de magnésio


114

A leitura da absorvância é bicromática a 577 e 540 nm e é devida á formação do

complexo roxo que é directamente proporcional à concentração de cálcio.


8.5 – 10.1 mg/dL

Hipercalcémia Hipocalcémia Hipercalciúria Hipocalciúria

-Hiperparatireoidismo

primário ou

secundário

- Tumores malignos

- Excesso de vitamina

D

- Hipoparatiroidismo

- Deficiência de

vitamina D

- Remoção cirúrgica

total da tireoide

- Doença renal

crónica

-Hiperparatiroidismo

- Metástases ósseas

- Sarcoidose

- Hipoparatireoidismo

- Metástases de

carcinoma da próstata


crónica

- Osteomalácia

- Fármacos

(diuréticos tiazidicos).

Tabela 27. Alterações do Cálcio (12)

5.1.18. Ferro

O ferro plasmático resulta de um equilíbrio entre as reservas do nosso

organismo, a absorção através da alimentação e a hemólise fisiológica. Na sua maioria,

o ferro provém da dieta sob a forma férrica (Fe3+

), posteriormente convertida na forma

ferrosa (Fe2+

). No sangue, encontra-se em circulação ligado à transferrina (proteína


115

transportadora). Por outro lado, na medula óssea os precursores da série vermelha

utilizam parte do ferro disponível, deixando o restante armazenado sob a forma de

ferritina e hemossiderina nas células do sistema reticuloendotelial do fígado, baço e

medula óssea.

O doseamento do ferro sérico está indicado no diagnóstico diferencial de anemia

e de hemocromatose.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


Sob condições acídicas, o ferro (Fe3+

) deixa de estar ligado à transferrina, sendo

de seguida reduzido e complexa-se com um sal, formando um complexo azul.


complexo azul, cuja intensidade é directamente proporcional à concentração de ferro na

amostra.

Fe3+

-Tranferrina Fe3+

+ Tranferrina

2 Fe3+ + Ácido Ascórbico 2 Fe2+

+ Ácido Dehidroascórbico + 2 H+

Fe2+

+ 3-Fereno® Fe2+

-Fereno® (Complexo)


116


50 – 170 µg/dL

Ferro Aumentado Ferro Diminuído

- Hemocromatose

- Hemossiderose (transfusões ou

terapêutica)

- Talassemias

- Anemias hemolíticas

- Doença hepática

- Anemia ferropénica

- Anemias normocrómicas das infecções e

doenças crónicas

- Glomerulopatias (perda proteica)

- Hemorragias (Menstruação)

Tabela 28. Alterações do Ferro (12)

5.1.19. Fósforo

No nosso organismo, o fósforo encontra-se presente na matriz óssea e na

circulação sob a forma de fosfato inorgânico. O fósforo sérico está intimamente

relacionado com o cálcio, sendo que um aumento ou decréscimo dos seus níveis

condicionam directa e inversamente os do cálcio. O doseamento do fósforo é

geralmente utilizada, em conjunto com outros parâmetros, no diagnóstico de alterações

relacionadas com o metabolismo do cálcio, monitorização dos níveis séricos de fósforo

em doentes renais, diagnóstico e monitorização da síndrome de lise tumoral.

Amostra:



117

Método:

Espectofotometria

A leitura da absorvância a 340 nm é marcada pela formação do fosfomolibdato

reduzido, a qual é proporcional à concentração do analito.


2.5 – 4.9 mg/dL

Fósforo Aumentado Fósforo Diminuído

- Insuficiência renal, hipoparatireoidismo,

Hipertiroidismo ( ↓ excreção renal)

- Anemia hemolítica, terapêutica

citotoxica, doença de Paget, mieloma

múltiplo (estados catabolicos, lise celular,

dano tecidular)

- Absorção intestinal de fósforo aumentada

( ↑ Ingestão de vitamina D)

- Hiperparatiroidismo ( ↓ Reabsorção

tubular)

- Deficiência em vitamina D ( ↓ absorção

intestinal)

- Síndrome de Cushing

Tabela 29. Alterações do Fósforo (12)

NaMoO4 + PO4-3

Fosfomolibdato

Fosfomolibdato + PMAPS + NaHSO3 Fosfomolibdato Reduzido


118

5.1.20. Magnésio

O magnésio é um mineral essencial que se encontra envolvido em diversas

funções bioquímicas. Tratando-se de um catião intracelular presente nos ossos e

músculos, é um factor essencial nas mais variadas reacções enzimáticas (e reacções

dependentes de ATP, fosforilação oxidativa, etc). Grande parte do magnésio encontra-se

complexada com o cálcio e o fosfato no osso. A determinação de magnésio sérico é

utilizada para verificar situações de hipomagnesémia e hipermagnesémia.

Amostra:


Método:


O magnésio forma um complexo de cor azul. O cálcio é complexado de forma a

evitar a sua interferência na reacção.


complexo azul, cuja quantidade é proporcional à concentração de magnésio na amostra.


1.8 – 2.4 mg/dL

Mg2+

+ MTB Mg-MTB (Complexo) (Absorve a 600nm)

Ca2+

+ Ba-EGTA Complexo (Não absorve a 600nm)


119

Magnésio Aumentado Magnésio Diminuído


- Desidratação

- Acidose severa

- Doença de Addison

- Terapêutica com antiácidos contendo

magnésio

- Má-absorção

- Diabetes mellitus

- Alcoolismo crónico

- Diurese forçada

- Hipertiroidismo

- Pancreatite aguda

- Hipocalcemia

- Hipoparatiroidismo

Tabela 30. Alterações do Magnésio (12)

5.1.21. Gonadotropina Coriónica Humana (β-HCG)

A β-HCG é a fracção beta de uma glicoproteína hormonal produzida pelas

células trofoblásticas da placenta pouco tempo depois da implantação do óvulo

fecundado na parede uterina. Esta hormona é composta por duas subunidades (α e β)

ligadas não covalentemente. A sua determinação é geralmente pedida no âmbito do

diagnóstico da gravidez, rastreio pré-natal da síndrome de Down e tumores

germinativos dos testículos e dos ovários.


120

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


Este método consiste num imunoensaio enzimático com dois passos. Durante o

primeiro passo, a amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas

com anticorpos monoclonais específicos para a subunidade α, formando então um

complexo partícula-HCG. As partículas são separadas magneticamente e o sobrenadante

removido. No segundo passo, o complexo partícula-HCG é incubado com um reagente

conjugado (anticorpos monoclonais específicos para a subunidade β) formando uma

sandwich partícula-HCG-conjugado. O conjugado que não se liga é removido

magneticamente. A sandwich é combinada com um substrato cromogénico que é

catalisado de forma a originar a cor vermelha. A concentração de β-HCG é directamente

proporcional intensidade da cor formada. A leitura é bicromática a 577 e 700 nm.


Mulher não grávida: < 2.0 UI/L

5.1.22. Hormona Estimulante da Tiróide (TSH)

Esta hormona consiste numa glicoproteína secretada pela hipófise (lóbulo

anterior), que se vai ligar a receptores na tiróide, permitindo estimular e regular a

produção de tiroxina (T4) e triiodotironina (T3). O seu doseamento é realizado no


121

âmbito do diagnóstico diferencial do hipotiroidismo e a monitorização da terapêutica de

substituição das hormonas da tiróide.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


Este método consiste num só passo baseado no princípio de sandwich. A

amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos

monoclonais específicos para a TSH e com um reagente conjugado, formando um

complexo sandwich partícula-TSH-conjugado. O conjugado não ligado e o analito são

separados magneticamente e por lavagem, correspondentemente. Posteriormente, a

sandwich é combinada com um substrato cromogénico que é catalisado de forma a

originar uma mudança de cor. A concentração de TSH presente é directamente

proporcional alteração da cor formada.


0.4 – 4.82 mUI/L

TSH Aumentada TSH Diminuída

- Hipertiroidismo secundário (↑produção) - Hipertiroidismo primário


122

- Hipotiroidismo

- Tiroidite de Hashimoto

- Doença de Graves

-

Tabela 31. Alterações da TSH (12)

5.1.23. Tiroxina Total (T4)

A T4 é a principal hormona produzida pela tiróide, encontrando-se na sua

maioria ligada a proteínas transportadoras plasmáticas. A determinação desta hormonas

é importante na medida em que reflecte o estado funcional da tiróide, em conjunto com

outros marcadores.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


Este método detecta a quantidade total de T4 (ligada e livre). É utilizada uma

solução para libertar as T4 das proteínas ligantes. A T4 liga-se então a anticorpos anti-

T4, competindo com um conjugado na ligação a esses anticorpos, reduzindo a

quantidade de conjugado ligado. O conjugado que fica livre catalisa a oxidação de

glucose-6-fosfato com formação de NADH, o qual absorve a 340 nm. A formação de

NADH é proporcional à quantidade de T4 presente na amostra.


123


60 – 171 nmol/L

T4 Aumentada T4 Diminuída

Tabela 32. Alterações da T4 (12)

5.1.24. Ionograma

O ionograma consiste na determinação da concentração dos iões sódio (Na+),

potássio (K+) e cloro (Cl

−), o que permite avaliar, de uma forma global, o equilíbrio

electrolítico do organismo. Estes electrólitos intervêm num grande número de processos

metabólicos, nomeadamente, manter a pressão osmótica e a hidratação de vários

compartimentos de fluidos corporais, pH adequado do organismo e regulação das

funções cardíacas e musculares apropriadas, reacções de oxidação-redução e reacções

enzimáticas.

Sódio (Na)

Catião maioritário no fluido extracelular. É responsável pela

osmolalidade plasmática, manutenção da distribuição normal de água e

da pressão osmótica no compartimento extracelular. Os seus níveis

sanguíneos são regulados pela excreção e reabsorção nos rins.


124

Potássio (K)

Catião maioritário no fluido intracelular. Os níveis deste catião são

mantidos a nível intracelular pela bomba sódio/potássio. É importante na

contracção muscular e manutenção do ritmo cardíaco normal

Cloro (Cl)

Anião principal no meio extracelular. Encontra-se envolvido na

manutenção da distribuição normal de água, pressão osmótica e balanço

iónico do compartimento extracelular.

Amostra:


Método:

Potenciometria

Este método utiliza um sistema específico com sensor, o QuikLYTE Integrated

Multisensor Technology, o qual desenvolve um potencial eléctrico proporcional à

actividade de cada ião na amostra. Os iões estabelecem um equilíbrio com a superfície

do eléctrodo, gerando um potencial proporcional ao logaritmo do analito. Esse potencial

é comparado com o potencial eléctrico de uma solução standard e a concentração do ião

é calculada com base na equação de Nernst.


Na: 136 – 145 mmol/L

K: 3.5 – 5.1 mmol/L

Cl: 98 – 107 mmol/L


125

Na K Cl

Diminuído

- Hiponatrémia (diluição):

Aporte excessivo de água

Retenção excessiva de

água (insuficiência renal

ou cardíaca)

- Hiponatrémia (perda):

Aporte insuficiente

Perdas digestivas (vómitos,

diarreias) ou renais

(Nefropatias)

Aumentado

A hipernatrémia:

- Aporte excessivo de

sódio

- Aporte hídrico deficiente

- Perdas renais (deficiente

produção de ADH

hipofisária) ou

extra-renais de água

Diminuído

- Hipocaliémia:

- Aporte deficiente

- Perdas urinárias

(diuréticos,

hiperaldosteronismo)

- Perdas digestivas

(diarreias, vómitos)

Aumentado

- Hipercaliémia:

- Aporte excessivo

- Eliminação renal

deficiente (insuficiência

renal grave, doença de

Addison,

hipoaldosteronismo.

Diminuído

- Hipoclorémia (diluição):

hiperhidratação hipotonica

- Perdas digestivas

(vómitos)

- Perdas renais (alcaloses

metabólicas)

Aumentado

- Hiperclorémias:

- Perdas de líquidos

(desidratação hipertonica)

- Aporte excessivo (excesso

de soro fisiológico)

- Eliminação deficiente

(Acidose tubular por falta de

HCO3)

Tabela 33. Alterações do Ionograma (12)


126

5.1.25. Aspartato aminotransferase (AST)

Esta enzima pertence a um grupo de enzimas que catalisam a transferência do

grupo amina de um aminoácido para um ácido alfa-cetónico. A AST ocorre numa vasta

variedade de tecidos, entre os quais o tecido hepático, tecido muscular e cardíaco, sendo

constituída por duas isoenzimas, uma citoplasmática e outra mitocondrial. A AST

aparece no soro em caso de hemólise hepática ou muscular. Faz parte das provas de

avaliação das funções hepáticas e cardíacas.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A leitura da absorvância é feita a 340 e 700 nm e é devida ao consumo de NADH, que é

proporcional à actividade da AST.


15 – 37 UI/L

AST (pH 7.8)

L-aspartato + α-cetoglutarato L-glutamato + Oxalacetato

Malato desidrogenase

Oxalacetato + NADH Malato + NAD


127

5.1.26. Alanina aminotransferase (ALT)

Esta enzima pertence a um grupo de enzimas que catalisam a transferência do

grupo amina de um aminoácido para um ácido alfa-cetónico. Encontra-se sobretudo no

fígado, pelo que é considerada um marcador mais específico, do que a AST, para

doenças hepáticas. No entanto, esta especificidade não é absoluta, pois a ALT também

se encontra em tecidos como o rim, coração e músculo-esquelético, mas em

concentrações mais baixas. É exclusivamente citoplasmática.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A leitura da absorvância é feita a 340 e 700 nm e é devida ao consumo de NADH, que é

proporcional à actividade da ALT.


12 – 78 UI/L

ALT (pH 7.4)

L-alanina + α-cetoglutarato L-glutamato + Piruvato

Lactato desidrogenase

Piruvato + NADH (H+) Lactato + NAD

+


128

Relação AST/ALT – Diagnóstico Diferencial de Lesões Hepáticas

- Normal: 0.7 – 1.4

- Relação AST/ALT<1: Hepatite viral aguda, Colestase extra-hepática, outras lesões

hepáticas agudas

- Relação AST/ALT> 1: Hepatopatia secundária a isquémia, hepatite crónica, cirrose,

neoplasias hepáticas, colestase intra-hepática

- Relação AST/ALT> 2: Álcool, Doença de Wilson, Hepatotoxicidade por fármacos

Tabela 34. Relação AST/ALT (12)

5.1.27. Gama Glutamiltransferase (GGT)

A GGT é uma enzima que catalisa a transferência de resíduos gama-glutamil do

glutatião para receptores peptídicos. Encontra-se nos rins, pâncreas, baço, intestino e em

menor quantidade no fígado, cérebro e no coração. Embora o rim apresente o nível mais

elevado de GGT, a enzima presente no soro parece ter origem, sobretudo no sistema

hepatobiliar, apresentando-se elevada em muitas formas de doença hepática. O aumento

dos níveis de GGT é identificado mais precocemente e é mais acentuado relativamente a

outras enzimas hepáticas em casos de obstrução hepatobiliar. Por este motivo a GGT é

considerada um indicador sensível para estas doenças. O álcool estimula a síntese de

GGT e por isso o seu doseamento é útil para detectar casos de alcoolismo.


129

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A leitura da absorvância é feita a 405 e 600 nm e é devida à formação do 5- amino-2-

nitrobenzoato, que é proporcional à actividade da GGT na amostra.




GGT Aumentada

- Colestase

- Carcinomas hepatocelulares e metástases hepáticas

- Hepatite viral e na cirrose hepática

- Álcool

- Fármacos

Tabela 35. Aumento da GGT (12)

Nota: Existe uma tendência de correlacionar a GGT com a fosfatase alcalina

(PAL) na interpretação das alterações do fígado e das vias biliares. A GGT e a PAL

GGT

Gama-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilido + glicilglicina L-gamaglutamilglicilglicina + 5-amino-2-nitrobenzoato


130

aumentadas significam que estamos provavelmente na presença de um problema de

origem hepática. A GGT normal e a PAL aumentadas significam que possivelmente o

problema é de origem óssea. O aumento isolado da GGT resulta geralmente do

consumo de álcool ou de medicamentos.

5.1.28. Fosfatase Alcalina (PAL)

A ALP ma enzima composta por um grupo de pelo menos cinco isoenzimas que

catalisam a hidrólise de ésteres fosfóricos a pH alcalino. Estão presentes no fígado, nos

ossos, no intestino, nos pulmões, nos eritrócitos e na placenta. Contudo encontram-se

em maior quantidade no fígado e nos ossos, daí serem doseadas para reconhecer as

afecções hepáticas ou ósseas. Uma variedade de processos patológicos pode resultar na

libertação de quantidades elevadas de ALP no sangue.

Amostra:

Soro ou plasma

Método:


A actividade da fosfatase alcalina é determinada através da medição da taxa de

conversão de p-nitro-fenilfosfato (pNPP) em p-nitrofenol (pNP) na presença de iões de

magnésio e de zinco e de 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP) como aceitador de

fosfato.

ALP (pH 10.25; Mg/Zn)

pNPP + AMP pNP + AMP-PO4


131

A leitura da absorvância é feita a 404 e 510 nm e é devida a formação do pNP que é

proporcional à actividade de ALP na amostra.


46 – 116 UI/L

ALP Aumentada

- Aumentos fisiológicos: crescimento ósseo na infância, gravidez

- Elevação de origem hepática: Colestase intra ou extra-hepática (cálculos, tumores ou

inflamação)

- Elevação de origem óssea:

Na criança – raquitismo

No adulto – Doença de Paget, Osteomalacias, hiperparatiroidismo com lesões ósseas,

nas metástases ósseas relacionadas com o cancro da próstata

Tabela 36. Aumento da ALP (12)


Para efeitos de controlo de qualidade interno, para todos os analitos,

exceptuando os que são doseados na urina, β-HCG e PCR, são realizados diariamente

dois níveis (de três possíveis: baixo, normal e alto) alternados de Liquid Assayed

Multiqual Bio-Rad. Para os analitos que são doseados na urina e β-HCG, os controlos


132

são executados apenas nos dias em que existem pedidos, dois níveis apenas para os

analitos urinários e dois níveis alternados para a β-HCG. Para a PCR existem apenas

dois níveis que são realizados todos os dias. São passados no aparelho da parte da

manhã antes dos soros dos doentes preferencialmente. Os critérios de aceitação são os

do programa UNITY (software de controlo de qualidade, que utiliza ≤ 3 sd de acordo

com os critérios definidos pelo comité de da qualidade).


Para realização da avaliação externa da qualidade da bioquímica geral, o

laboratório participa num programa da SEQC, mensalmente.

5.2. Hi-AUTO A1C

Este é um equipamento de cromatografia de alta performance (HPLC) com

leitura bi-cromática (415 – 500 nm) para determinação das fracções da hemoglobina. É

semi-automático, constituído essencialmente pela unidade analítica (onde se procede à

análise das amostras) ao qual está acoplada uma unidade de “auto-sampler” (onde se

colocam as amostras). O equipamento é muito simples de manusear, bastando apenas

colocar as amostras e proceder ao start. Após a análise, os resultados são impressos e

introduzidos manualmente no sistema informático.


133


HPLC - Trata-se de uma cromatografia de troca iónica de fase reversa. As

fracções de hemoglobina são separadas através de interacções electrostáticas com o gel

da coluna, cuja superfície contem grupos hidrófobos e grupos de troca iónica. Assim, a

mistura é separada nos seus diferentes componentes individuais, mediante processos de

adsorção e desadsorção dos diversos componentes na superfície da coluna (fase

estacionária). Daqui resulta que os diversos componentes da mistura sejam eluídos a

tempos diferentes. As fracções eluídas são examinadas através de um colorímetro e os

resultados são analisados por um microprocessador. Este equipamento faz o ajuste

automático do factor de diluição das amostras para compensar as anemias. Os resultados

da HbA1c obtidos deste equipamento não sofrem interferência da hemoglobina

carbamilada ou acetilada, ou da HbA1c lábil, que é removida pelo hemolisante H.

Permite determinar várias fracções da hemoglobina e detectar variantes da

hemoglobina. Neste equipamento apenas é realizada uma análise paramétrica, a

determinação da hemoglogina glicada (HbA1c).

5.2.1. Hemoglobina Glicada (HbA1c)

A HbA1c é uma molécula de hemoglobina ligada covalentemente a uma

molécula de glucose. Geralmente é determinada para meio auxiliar na monitorização

dos doentes diabéticos ou seu diagnóstico. A HbA1c é tanto mais elevada quanto mais

frequentes tenham sido os períodos de hiperglicemia durante os últimos três meses. Os

indivíduos aos quais foi diagnosticada diabetes mellitus apresentam, geralmente, uma


134

percentagem elevada de HbA1c. O ensaio para a determinação de HbA1c mede a

concentração desta relativamente à concentração de hemoglobina total.

Amostra:

Sangue total em EDTA

Método:

HPLC


3,4 – 6,0 %


Como controlo de qualidade interno são feitos diariamente dois níveis de Glyco

Hb Control.


Em termos de avaliação externa da qualidade, o laboratório participa no

programa RIQAS (Randox International Quality Assessment Scheme) mensalmente.


135

5.3. Clinitek 500

O Clinitek 500 é um analisador semi-automático específico para a leitura de tiras

teste que avaliam diversos parâmetros bioquímicos urinários. Este equipamento tem

como metodologia a reflectofotometria: a luz emitida por uma lâmpada incandescente,

com comprimento de onda e ângulo definidos, incide na superfície das tiras teste,

constituídas por pequenos quadrados de celulose absorventes impregnados com

reagente. Quando a tira de teste entra em contacto com a urina, ocorre uma reacção

química que produz uma mudança de cor. A luz proveniente das tiras, captada pelo

fotodetector, é reflectida e diminui proporcionalmente à intensidade da cor produzida. A

luz detectada é convertida para valores de reflectância, originando resultados

semiquantitativos.

5.3.1. Urina Tipo II

A análise da urina tipo II é formada por duas partes: determinação das

características físicas e químicas da urina e o sedimento urinário.

Esta análise é importante na medida em que nos fornece várias informações

clínicas úteis no que diz respeito a patologias renais e do tracto urinário inferior.

Amostra:

Urina

Método:

Reflectância (acima descrito) e microscopia


136

Exame Físico e Químico da Urina

Determinação qualitativa ou semiquantitativa, de pH, leucócitos, nitritos,

proteínas, glucose, corpos cetónicos, hemoglobina, urobilinogénio, bilirrubina,

densidade e cor. Esta determinação é feita através do uso de tiras de teste pelo

método da reflectofotometria. Na tabela seguinte são indicados todos os parâmetros

avaliados bem como a sua relevância clínica.

Parâmetro

Cor Normal: amarelo claro a âmbar

A cor deve-se à presença de urocromo (pigmento), podendo variar

desde a quase ausência de cor até ao negro. Estas variações podem

ser de natureza patológica, ou não, existindo variações de cor com

importância clínica. Exemplo: incolor - poliúria típica da diabetes

insipidus; vermelho - presença de eritrócitos

Densidade Representa a concentração iónica da urina.

Os limites fisiológicos variam de 1.005 a 1.040, sendo uma

densidade de 1.018 correspondente a uma capacidade de

concentração renal preservada.

Densidade aumentada – cetoacidose (poderá ser resultado também de

presença de muco ou células na urina)


137

Densidade diminuída - ingestão elevada de água ou diminuição da

capacidade de concentração da urina a nível renal

pH Pode variar desde 4,5 a 8,5.

Detecção de possíveis distúrbios electrolíticos de origem metabólica

ou respiratória.

Importante na identificação de cristais observados no exame

microscópico do sedimento urinário, bem como na verificação do

estado de conservação da amostra (o pH da urina recém-eliminada

não atinge valores superiores a 8,5, tanto em condições normais ou

patológicas, pH superiores revelam má conservação da amostra)

Proteínas Valores normais: 40 - 100 mg/dia

Útil na detecção de patologia renal.

Aumento - Alterações da permeabilidade glomerular

- Diminuição da reabsorção tubular ou aumento das

proteínas plasmáticas a filtrar

Glucose Em circunstâncias normais, a urina contém quantidades mínimas de

glucose, pois quase toda a glucose filtrada pelos glomérulos é

reabsorvida no túbulo proximal. O limiar de reabsorção renal no caso

da glucose é de 160 a 180 mg/dL.

Aumentada – Diabetes mellitus, Síndroma de Cushing,

feocromocitoma, hipertireoidismo, acromegalia

Corpos Usualmente não são detectados na urina.


138

Cetónicos A cetonúria ocorre em situações de jejum, febre ou diabéticos

descompensados com acidose metabólica

Bilirrubina Quando positiva deve ser feita comparação com os valores de

bilirrubina no soro do doente.

A presença de bilirrubina na urina pode indicar a existência de

doença a nível hepato-biliar

Urobilinogénio Pigmento biliar que resulta da redução da bilirrubina pelas bactérias

intestinais. Pode aumentar em patologias hepáticas e distúrbios

hemolíticos

Nitritos Detectar possíveis infecções do tracto urinário, devido à capacidade

de determinadas bactérias reduzirem nitratos a nitritos

Hemoglobina A presença de hematúria (eritrócitos íntegros) ou de hemoglobinúria

(hemoglobina livre) podem ter diversas origens.

Hematúria - mais relacionada com distúrbios de origem renal ou

urogenital.

Hemoglobinúria - lise dos eritrócitos no tracto urinário; hemólise

intravascular com consequente filtração de hemoglobina através dos

glomérulos.

Leucócitos Possível infecção no sistema urogenital.

Tabela 37. Urina II (12)


139

Exame Microscópico do Sedimento Urinário

O exame microscópico do sedimento urinário tem como objectivo detectar e

identificar os diversos elementos presentes na urina. O sedimento urinário normal pode

conter vários elementos figurados, sendo a presença de um pequeno número de

elementos como os eritrócitos, leucócitos e cilindros, normal. Grande parte das urinas

contêm apenas raras células epiteliais ou filamentos de muco.

A amostra de urina, após ter sido analisada no equipamento, é centrifugada a

1500 rotações por minuto (rpm) durante 10 minutos. Posteriormente é colocada uma

gota do sedimento entre lâmina e lamela, e realiza-se uma avaliação quantitativa e

qualitativa dos elementos presentes no sedimento. Na tabela seguinte temos os

elementos que podemos observar numa análise microscópica do sedimento urinário:

Elementos a observar:

Células

epiteliais

Encontram-se normalmente no sedimento urinário.

Representam descamação celular normal do epitélio.

Três tipos: Células epiteliais escamosas (sem significado clínico),

células do epitélio de transição (geralmente sem significado clínico),

células do epitélio tubular renal (sugestivas de necrose tubular,

pielonefrite, etc)

Eritrócitos Distúrbios de origem renal ou urogenital.

Leucócitos Possível infecção no sistema urogenital.

Leveduras As leveduras, geralmente da espécie Candida albicans, podem ser


140

Parasitas observadas na urina de doentes com diabetes mellitus, contaminação

vaginal.

Podemos encontrar Tichomonas vaginalis devido a contaminação

vaginal.

Cilindros Constituídos essencialmente por proteína de Tamm-Horsfall a qual é

excretada pelas células dos túbulos renais. Não detectável nas tiras

teste.

Diversos elementos presentes nos túbulos renais, tais como células,

bactérias ou grânulos, podem prender-se à matriz do cilindro e estão

na base da sua classificação (cilindros hialinos, leucocitários,

eritrocitários, etc).

Cristais Raramente têm significado clínico. Formam-se por precipitação de

sais na urina submetidos a alterações de pH, de temperatura ou de

concentração. Os sais precipitados aparecem na urina na forma de

cristais verdadeiros ou de material amorfo. O pH da urina é

importante pois vai determinar o tipo de substâncias químicas

precipitadas. Os cristais são geralmente classificados de acordo com

o pH da urina em que estão presentes, ácido ou alcalino. Cristais mais

frequentementes: ácido úrico, uratos amorfos, cristais de oxalato de

cálcio, fosfato amónio magnesiano, fosfatos amorfos.

Tabela 38. Sedimento urinário (12)


141

6. CONTROLO DE QUALIDADE

O controlo da qualidade consiste num conjunto de medidas e técnicas utilizadas

para obter os melhores resultados possíveis com a máxima qualidade. Para que isto

aconteça, o laboratório propõe-se a cumprir determinados requisitos de qualidade,

participando num programa de gestão da qualidade. De forma a garantir que o

desempenho dos métodos utilizados é capaz de medir os parâmetros com exactidão e

precisão, o laboratório realiza o Controlo de Qualidade Interno e participa em

programas de Avaliação Externa da Qualidade.

6.1. Controlo de Qualidade Interno

O laboratório deverá ter amostras de controlo adequadas para todos os

parâmetros que executa e deve usá-las sempre que os efectua, de modo a controlar a

precisão dos seus sistemas analíticos. O objectivo do controlo de qualidade interno é

manter as condições de validação no laboratório ao longo do tempo, garantindo a

reprodutibilidade dos resultados. Caso não se verifique, poderá haver a necessidade de

proceder a acções correctivas para que os resultados obtidos possam cumprir os

requisitos de qualidade exigidos.

Para realização do controlo de qualidade interno, recorremos à utilização de

controlos, isto é, são amostras cujos valores relativos ao analito em questão são

perfeitamente conhecidos, com os quais verificamos o desempenho das técnicas,

reagentes e equipamentos usados para o diagnóstico analítico. Salvo raras excepções, o

controlo de qualidade interno é executado diariamente, de preferência antes do


142

processamento das amostras dos doentes, e idealmente também ao fim do dia. Para

podermos interpretar os resultados, estes são registados em forma de gráfico e

comparados com os limites aceitáveis (geralmente a média ± 2 desvios padrões),

denominadas Cartas de Controlo de Levey-Jennings.

Quando um determinado parâmetro analítico se apresenta fora dos limites de

aceitação, são investigadas quais as suas causas, e de uma forma geral recorre-se a uma

calibração do equipamento, com posterior processamento dos controlos. A calibração

consiste num conjunto de operações que estabelecem, em condições especificadas, a

relação entre valores de grandeza indicados por um instrumento de medição ou um

material de referência e os correspondentes valores obtidos através de padrões. Para tal

recorre-se a um calibrador - um material de referência de composição qualitativa ou

quantitativa bem definidas, adequado para o analito em questão, adaptado ao método

utilizado e aferido por padrões de referência. A calibração também é efectuada sempre

os lotes de reagente se alteram ou de acordo com os critérios do fornecedor.

Para todos as secções do laboratório, encontram-se descritos no ponto

correspondente, quais os níveis de controlos utilizados.

6.2. Avaliação Externa da Qualidade

Por outro lado, a avaliação externa da qualidade é importante porque permite ao

laboratório verificar e aferir a exactidão dos resultados obtidos. É realizada através da

participação em programas/ensaios inter-laboratoriais, de forma a comparar-se com os

restantes laboratórios.


143

Os programas geralmente enviam ao laboratório diversas amostras das diferentes

áreas analíticas, as quais têm que ser processadas exactamente da mesma forma como as

amostras normais dos doentes, cujos resultados são posteriormente enviados e

avaliados. Mais tarde o laboratório receberá um resultado com a classificação que

obteve consoante a exactidão dos resultados que enviou.

Para todos as secções do laboratório, encontram-se descritos no ponto

correspondente, quais os programas de avaliação externa da qualidade em que o

laboratório se encontra inscrito.

7. VALIDAÇÃO BIOPATOLOGICA

Após a conclusão da fase analítica, temos os resultados dos parâmetros

analisados que necessitam de ser validados no seu conjunto para posterior emissão do

boletim de análises. A esta validação chamamos de validação biopatológica, cujo

objectivo é verificar a concordância de todos os parâmetros analíticos e contextualiza-

los com o perfil e historial clínico do utente, condições fisiológicas presentes,

terapêutica, etc. A validação biopatológica é efectuada apenas por especialistas em

análises clínicas. Nesta fase, poderá haver necessidade de entrar em contacto com o

clínico ou com o utente, para confirmação de alguma informação adicional ou de algum

resultado


144

BIBLIOGRAFIA

1. Instruções de Trabalho do Laboratório do Hospital de Santiago (General Lab).

2. Manual do Equipamento Cell-Dyn 3500.

3. Apontamentos e Slides de Hematologia II do Mestrado em Análises Clínicas

2014.

4. Theml H, Diem H, Haferlach T. Color Atlas of Hematology. Second. Thieme;

2004.

5. Manual Do Equipamento ACL-7000.

6. Dean L. Blood Groups and Red Cell Antigens. ABO blood Gr. 2005;

7. Ferreira W, Sousa J. Microbiologia Volume 2. LIDEL; 2000.

8. Bula do Reagente em vigor.

9. Manual do Equipamento Vidas.

10. Kindt TJ, Goldsby R a, Osborne B a. Kuby Immunology. Sixth. Kuby

Immunology. W. H. Freeman & Company; 2006. 574 p.

11. Manual do Equipamento Dimension Xpand.

12. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinical Chemistry - Techniques, Principles,

Correlations. Sixth. Wolters Kluer - Lippincott Williams & Wilkins; 2010.

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