UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE MEDICINADE...

UNIVERSIDADE DE LISBOAFACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA

C O L O N O S C O P I A V I RT U A L E DNA F E C A L

ESTUDO DE VIABILIDADE COMO TESTES DERASTREIO DO CANCRO COLORRETAL

Celso António Rosa de Almeida e Silva

Doutoramento em Cirurgia Geral

Medicina

2014

UNIVERSIDADE DE LISBOAFACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA

C O L O N O S C O P I A V I RT U A L E DNA F E C A L

ESTUDO DE VIABILIDADE COMO TESTESDE RASTREIO DO CANCRO COLORRETAL

Celso António Rosa de Almeida e Silva

Orientador Principal: Professor Doutor Henrique Bicha Castelo

Co-orientador: Professora Doutora Alexandra Rosa

Doutoramento em Cirurgia Geral

Medicina

Todas as afirmações efetuadas no presente documento são da exclusivaresponsabilidade do seu autor, não cabendo qualquer responsabilidade àFaculdade de Medicina de Lisboa pelos conteúdos nele apresentados

A impressão desta dissertação foi aprovada pelo Conselho Científico daFaculdade de Medicina de Lisboa em reunião de 28 de Janeiro de 2014

i

Ao Dr. Jaime Ricardo Jorge

Ao Dr. Jorge Jardim Buhler

À mãe Isaura

iii

A inteligência avalia-se pela capacidade das espécies

em fazerem o necessário para sobreviver

Charles Darwin

Índice

v

Agradecimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

Lista de abreviaturas e siglas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xii

Lista de Figuras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xv

Lista de Quadros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi

Lista de Tabelas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii

Lista de Anexos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xviii

Resumo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix

Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi

Resumé. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxiii

1. Introdução

1.1 Justificação do estudo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

1.2 Hipótese e objetivos do estudo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

1.3 Estruturação geral do rastreio e equipas de trabalho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

2. Colonoscopia virtual

2.1 Conceito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15

2.2 Revisão da literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16

2.3 Material e métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19

2.3.1 Técnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19

2.3.2 Garantia de qualidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

2.3.3 Transferência de imagens e interpretação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

2.3.4 Colonoscopia ótica (CO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21

2.3.5 Cruzamento das lesões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21

2.3.6 Análise estatística . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

2.4 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

2.4.1 Caraterização da amostra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

2.4.2 Caraterísticas por indivíduos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

2.4.3 Caraterísticas por pólipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28

2.5 Discussão dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

Índice

vi

3. Satisfação com os exames de colonoscopia

3.1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37

3.2 Estudo 1 - Análise fatorial de componentes principais do questionário de

satisfação com os exames de colonoscopias (ESEC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40

3.2.1 Amostra e metodologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40

3.2.2 Apresentação dos resultados relativos à validade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

3.2.3 Dados relativos à precisão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44

3.3 Estudo 2 - Análise estatistica de componentes principais do questionário de

satifação com os exames de colonoscopias (ESEC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

3.3.1 Amostra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

3.3.2 Procedimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

3.3.3 Apresentação dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

3.3.3.1 Estatística descritiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

3.3.3.2 Satisfação em relação à CO e CV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48

3.3.3.3 Influência das variáveis género, idade e estatuto socioeconómico . . . .48


4 Significado epidemiológico dos Programas de Rastreio e sua importância em

Saúde Pública

4.1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55

4.2 Abordagem epidemiológica à avaliação dos programas de rastreio . . . . . . . . . . . .55

4.2.1 A história natural da doença . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56

4.2.2 Desenho de estudos para avaliação de rastreios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58

4.3 Avaliação da validade e fiabilidade dos testes de rastreio . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59

4.4 Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66

5. Aplicabilidade da análise molecular do DNA fecal para rastreio da patologia colorrectalesporádica

5.1 Revisão da literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69 5.1.1 A genética do cancro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69

5.1.2 Marcadores genéticos em DNA fecal para rastreio do CCR . . . . . . . . . . . .70

5.1.2.1 Mutações somáticas em APC, B-RAF, K-RAS e TP53 . . . . . . . . . . . . .71

5.1.2.2 Marcador de integridade do DNA (Long DNA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75

Índice

vii

5.1.2.3 Painéis multimarcadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75

5.2 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .775.3 Material e métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78

5.3.1 Amostragem e constituição do biobanco de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78

5.3.2 Pesquisa de mutações somáticas em regiões dos genes APC, K-RAS,

B-RAF e TP53 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78

5.3.2.1 Amplificação de DNA por Polimerase Chain Reaction (PCR) . . . . . . .78

5.3.2.2 Sequenciação e análise de sequências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80

5.3.2.3 Ensaio PCR em Tempo-Real para K-RAS (c. 12 e 13) e

B-RAF (c. 600) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80

5.3.3 Análise de L-DNA em amostras fecais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82

5.3.4 Análise estatística . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

5.3.5 Consulta de Bases de Dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

5.4 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84

5.4.1 Pesquisa de mutações somáticas em regiões génicas de APC, K-RAS,

B-RAF e TP53 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84

5.4.2 Análise de L-DNA em amostras fecais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88


6. Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99

7. Referências bibliográficas

7.1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .105

7.2 Colonoscopia virtual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .113

7.3 Satisfação com os exames de colonoscopia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .119

7.4 Significado epidemiológico e importância em Saúde Pública dos

Programas de Rastreio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .122

7.5 Aplicabilidade da análise molecular do DNA fecal para rastreio da

patologia colorretal esporádica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .123

Anexos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .145

Agradecimentos

ix

Agradecimentos

A realização deste projeto de investigação não teria sido possível sem a colaboração de muitaspessoas e o apoio de várias instituições, cujo contributo quero enaltecer, agradecer e sublinharindividualmente.

As primeiras palavras vão para o meio milhar de cidadãos que aceitaram participar no rastreio,decisão elevada que traduz a consciência da importância do envolvimento pessoal nainvestigação científica.

A conceção, a estruturação e a recolha de dados do estudo envolveu uma grande equipamultidisciplinar que durante cerca de quatro anos, mercê duma disponibilidade permanente ede uma paciência infinita, ajudou a definir, a planear e a ultrapassar todos os obstáculos até àobtenção dos resultados e à elaboração das conclusões.

Naturalmente, realço em primeiro lugar o Sr. Prof. Doutor Henrique Bicha Castelo, orientadorprincipal desta tese, pelo entusiasmo e pelo estímulo persistentes que sempre imprimiu nassuas intervenções de orientação científica, ajudando o discípulo duma forma dedicada, aconstruir progressivamente a sua obra.

A aceitação da coorientação da tese pela Sr.ª Prof. Doutora Patrícia Alexandra da Silva Rosa,doutorada em Biologia Molecular, Professora Auxiliar Convidada da Unidade de CiênciasMédicas da Universidade da Madeira (UMa) e colaboradora do Laboratório de GenéticaHumana da mesma Universidade (LGH-UMa), foi decisiva na viabilização do projeto. Apóscontatos infrutíferos com várias instituições universitárias e laboratórios privados nacionais, adisponibilização para a realização dos exames genéticos foi local. Com a anuência do Diretordo LGH-UMa, Sr. Prof. Doutor António Dias Brehm, um dos objetivos paralelos era tambémpoder contribuir para a implementação técnica do teste genético de rastreio, em caso desucesso. De grande competência profissional e com grandes qualidades pedagógicas ehumanas, foi o elevado sentido da responsabilidade, a grande capacidade de trabalho e aelevada resistência às adversidades que permitiram que a Prof. Alexandra Rosa, em parceriacom a Mestre Sara Gomes do LGH-UMa, infatigável companheira desde a primeira hora,tivessem a capacidade de ultrapassar inúmeros obstáculos técnicos para conduzir o doutorandoà melhor e possível execução desta parte do estudo.

À Sr.ª Prof. Doutora Glória Franco, do Departamento de Psicologia da UMa, coube a difíciltarefa na condução da idealização dos questionários de avaliação da satisfação dos indivíduos

Agradecimentos

x

rastreados, que posteriormente foram aplicados pela sua equipa de psicólogas, Drªs CristinaJesus, Sofia Pereira, Sandra Aveiro, Ana Catarina Côrte, Cláudia Andrade e Soraia Garcês.Como Sócrates na ágora de Atenas, a Prof. Glória Franco ensinou-me algumas especificidadesda sua área das ciências durante as muitas horas e semanas solitárias que trabalhámosconjuntamente no seu gabinete.

O meu amigo e colega radiologista, Dr. António Louis Rodrigues, do Núcleo de ImagemDiagnóstica, não faltou à chamada e predispôs-se efetuar as colonoscopias virtuais, com aajuda competente dos seus técnicos. Foi através dele que conheci o Dr. Philippe Lefere, quepor teleradiologia se prestou a fazer a leitura dos exames na Bélgica. Com grande experiêncianesta área, além do trabalho efetuado, foi de enorme importância os ensinamentos queconstantemente forneceu, quer em várias deslocações ao Funchal, quer por correio eletrónico,orientando, modelando e ajudando a interpretar os resultados. Colaborou ainda em váriostrabalhos apresentados internacionalmente.

O enquadramento matemático do projeto teve a ajuda da Prof. Doutora Rita Vasconcelos, doDepartamento de Matemática da UMa, cuja experiência profissional sobressai em todos osresultados estatísticos apresentados. Sempre com um sorriso nos lábios, nunca se agastou comas várias correções que foram necessárias efetuar na base de dados, obrigando a recomeçar denovo todos os cálculos.

Especialista em Informática, o meu amigo Lisandro Araújo foi um elemento fundamental eincansável do grupo. Soube interpretar toda a informação que lhe fornecemos e conseguiuorganizar uma Base de Dados sem falhas, facilmente interativa com os utilizadores e entresectores, em português e em inglês, com palavras-passe personalizadas, de tal forma que só oInvestigador Principal tinha acesso a todos os dados, aplicando rigorosamente os requisitosobrigatórios da Lei de Proteção de Bases de Dados.

Foram cinco os gastrenterologistas que executaram as colonoscopias óticas, exame padrão doestudo: Dr. Ricardo Teixeira, Diretor de Serviço, Dr. Henrique Morna, Dr.ª Isabel Jardim, Dr.ªCarla Andrade e Dr.ª Goreti Faria. Não se furtaram à exposição individual e profissional, nemao esforço diário durante um ano, ao participarem com grande rigor e qualidade, num trabalhoduplamente cego. Nesta tarefa quero realçar a colaboração imprescindível e competente da Sr.ªEnfermeira Odete Bacanhim e da técnica Patrícia Nóbrega.

O Dr. Francisco Henriques de Gouveia participou neste estudo com uma tripla função: é umamigo dedicado de muitos anos, que sempre soube dar força e estímulo nos momentos difíceis

Agradecimentos

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que foram acontecendo; é um distinto anatomopatologista ex-Assistente da Faculdade deMedicina da Universidade de Coimbra e ex-Diretor do Serviço de Anatomia Patológica doHospital Central do Funchal, a quem coube a responsável tarefa do exame histológico daspeças removidas; foi um importante suporte financeiro através do seu Laboratório deAnatomia Patológica e de Análises Clínicas, fornecendo as equipas de enfermeiros/as para ascolheitas de sangue e muitos consumíveis necessários à colheita e ao acondicionamento dostecidos e das fezes.

A D. Iva Marques responsabilizou-se pela formatação do texto e ao Dr. Rui Duarte da MotaGomes Pereira coube a difícil tarefa da revisão literária dum texto técnico com as novas regrasortográficas.

Várias instituições deram um contributo muito importante: Clínica de Santa Catarina, quecedeu gratuitamente instalações apropriadas para a realização das colonoscopias óticas e dosvários inquéritos, e para a colheita de sangue e fezes; Núcleo de Imagem Diagnóstica, serviçode radiologia localizado na Clínica de Santa Catarina, onde se efetuaram as colonoscopiasvirtuais; LANA, Laboratório de Anatomia Patológica e de Análises Clínicas, responsável pelosestudos histológicos e pelas colheitas de sangue; Laboratório de Genética Humana da UMa,local dos estudos genéticos e moleculares; CITMA (Centro de Ciência e Tecnologia daMadeira), entidade cedente duma Bolsa de Doutoramento (Projeto nº 1080/1974), actualmentedesignado por ARDITI (Agência Regional para o Desenvolvimento da Investigação,Tecnologia e Inovação, presidida pelo Prof. Dr. Nuno Jardim Nunes); Secretaria Regional dosAssuntos Sociais, que através do Instituto de Administração e Saúde (IA-Saúde) suportoufinanceiramente grande parte do projeto.

Ao Senhor Secretário Regional dos Assuntos Sociais, Dr. Francisco Jardim Ramos, à Sr.ª Prof.Doutora Isabel Torres, Presidente do CITMA, aos Diretores e responsáveis das instituiçõesreferidas, quero expressar os meus mais profundos agradecimentos.

A todos os funcionários anónimos que, duma forma ou de outra, prestaram a sua colaboraçãocom o estudo, expresso também a minha gratidão.

Lista de abreviaturas

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Lista de abreviaturas e siglas

AAR - Grupos de repetições de aminoácidos

ARDITI - Agência Regional para o Desenvolvimento da Investigação, Tecnologia eInovação ([email protected])

BI/CC - Bilhete de Identidade/Cartão de Cidadão

c. - codão

c.X Y>Z (V>W), em que X representa o número do codão (c.), Y a sequência do codãowildtype, Z a sequência do codão mutado, V o aminoácido wildtype e Wo aminoácido resultante da mutação

CCR - cancro colorrectal

CITMA - Centro de Ciência e Tecnologia da Madeira

CO - Colonoscopia ótica

CO2 - Dióxido de carbono

COSMIC - Catalogue on Somatic Mutations in Cancer

CS - Centros de Saúde

CTC - Colonografia por tomografia computorizada

CV - Colonoscopia virtual (CV=CTC)

DNA - ácido desoxirribonucleico

Dr./a/s - Doutor/a/s

ESEC - Escala de Satisfação dos Exames de Colonoscopias

ESGAR - European Society of Gastrointestinal and Abdominal Radiology

Fg - fentogramas (fg= 10-15g)

FMUL - Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

FN - Falsos negativos

FP - Falsos positivos


xiii

g. - genoma

H/M - Homens/Mulheres

HCF - Hospital Central do Funchal (atualmente Hospital Dr. Nélio deMendonça)

HGD - Displasia de alto grau

HP - Pólipos hiperplásicos ou hiperplásticos

IARC - International agency for research on cancer

IA-Saúde - Instituto de Administração e Saúde da SRAS

Kb - Kilobases, 1000 pares de bases nucleotídicas

KDa - KiloDaltons

KMO - Índice Kaiser-Meyer-Olkin

LANA - Laboratório de Anatomia Patológica e de Análises Clínicas, Funchal

LGD - Displasia de baixo grau

LGH-UMa - Laboratório de Genética Humana da Universidade da Madeira

LH- - Teste de verosimilhança negativo

LH+ - Teste de verosimilhança positivo

LOH - Loss of heterozigoty (perda de heterozigotia)

LOVD - Leiden Open Variation Database (base de dados de variações de sequên-cias genéticas, semelhante aos LSDB-in-a-box, locus-specific databases.Hum Mutat (2005). 26(2): 63-8

LSD - Fisher’s Least Significant Difference (post-hoc-test)

MAF - Minor allele frequency

MMR - Mismatch repair genes (genes de reparação de maus emparelhamentosnucleotídicos)

mRNA - RNA mensageiro

mtRNA - RNA mitocondrial

Ng - nanogramas (ng= 10-9g)


xiv

NPV - Valor preditivo negativo

NR - Não referenciado

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man

pb - pares de bases nucleotídicas

PPV - Valor preditivo positivo

RAM - Região Autónoma da Madeira

RNA - ácido ribonucleico

rRNA - RNA ribosomal

Sd=dp=DP - Desvio padrão

SESARAM, EPE - Serviços de Saúde da RAM

SNP - Single Nucleotide Polymorphism

SRAS - Secretaria Regional dos Assuntos Sociais

TC - Tomografia computorizada

tRNA- - RNA transferência

UMa - Universidade da Madeira

VCTC - Virtual Colonoscopy Teaching Center, Bélgica

VN - Verdadeiros negativos

VP - Verdadeiros positivos

Lista de figuras

xv

Lista de figuras

Figura 2.1 Distribuição dos indivíduos da amostra por género . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

Figura 2.2 Distribuição dos indivíduos da amostra por faixas etárias com intervalosde 10 anos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

Figura 2.3 Distribuição dos indivíduos da amostra por faixas etárias com intervalosde 5 anos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

Figura 2.4 Distribuição dos indivíduos da amostra por Concelho de Residência . . . . . . .24

Figura 4.1 Representação esquemática da história natural da doença e metodologiade intervenção . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57

Figura 5.1 Eletroforese de produtos de amplificação para análise de DNA Longoem amostras fecais em gel de agarose 2% corado com brometo deetídio (80V, 40mins) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88

Lista de quadros

xvi

Lista de quadros

Quadro 1.1 Guidelines do Working Group for Virtual Colonoscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . .7

Quadro 1.2 Fluxograma do Projeto de Investigação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12

Quadro 2.1 Colonoscopia virtual: estudos de centros académicos de excelência . . . . . . .16

Quadro 2.2 Sensibilidade da CV na deteção de adenocarcinoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

Quadro 2.3 Experiência da CV no rastreio individual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

Quadro 2.4 Sistema de classificação para a monitorização da qualidade da CV . . . . . . .20

Quadro 2.5 Fluxograma dos rastreados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

Quadro 2.6 Avaliação da precisão da CV com intervalos a 95% de confiança . . . . . . . . .26

Quadro 2.7 Utilização da CV como método de rastreio - ICaraterísticas da CV por indivíduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27

Quadro 2.8 Utilização da CV como método de rastreio - IICaraterísticas da CV por indivíduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27

Quadro 2.9 Distribuição dos pólipos por segmento cólico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30

Quadro 3.1. Itens que compõem a primeira dimensão: Satisfação com a CO . . . . . . . . . .41

Quadro 3.2 Itens que compõem a segunda dimensão: Ansiedade face aos exames . . . . .42

Quadro 3.3 Itens que compõem a terceira dimensão: Satisfação com a CV . . . . . . . . . . .42

Quadro 3.4 Itens que compõem a quarta dimensão: Receios face aos exames . . . . . . . . .42

Quadro 3.5 Itens que compõem a quinta dimensão: Perceção da eficácia dos exames . .43

Quadro 3.6 Itens retirados da escala . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43

Lista de tabelas

xvii

Lista de tabelas

Tabela 2.1 Comparação das características por indivíduo e por pólipo da CV e da CO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29

Tabela 3.1 Valores do alpha de Cronbach das diferentes dimensões . . . . . . . . . . . . . . . .44

Tabela 3.2 Mediana, moda, percentis e percentagens dos itens da ESECagrupados pelas escalas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

Tabela 3.3 Análise comparativa da satisfação com CO e CV com teste T-Studentpara amostras dependentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48

Tabela 3.4 Média, desvio padrão e T-Student da satisfação com a CO ou com aCV, da ansiedade, receio e eficácia da CO e da CV, em função do

género . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

Tabela 3.5 Média, desvio padrão e T-Student da satisfação com a CO ou com a CV, da ansiedade, receio e eficácia da CO e da CV, em função da idade (em anos) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

Tabela 3.6 Média, desvio padrão e T-Student da satisfação com a CO ou com a CV,da ansiedade, receio e eficácia da CO e da CV, em função do estatuto sócio- económico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50

Tabela 4.1 Tabela de duas entradas com quatro resultados possíveis de um teste de rastreio e as variáveis que o qualificam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60

Tabela 4.2 Tabela de duas entradas para avaliação da CV em pólipos ≥ 6 mm (IC a 95%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61

Tabela 5.1 Condições de PCR e primers utilizados na amplificação das regiões de interesse em APC, K-RAS, B-RAF e TP53 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81

Tabela 5.2 Pesquisa de mutações somáticas em regiões dos genes APC, K-RAS,B-RAF e TP53 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85

Tabela 5.3 Positividade do painel genético de acordo com a classificação histológica, localização e dimensão das lesões colorretais . . . . . . . . . . . . . . .87

Tabela 5.4 Positividade do marcador molecular L-DNA de acordo com as carate-rísticas da amostra e das lesões mais avançadas (colonoscopia ótica) . . . . . .89

Lista de anexos

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Lista de Anexos

1- Folha de informação ao sujeito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .145

2 - Questionário de Exclusão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .147

3 - Consentimento informado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .149

4 - Instruções para colheita de fezes e sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .151

5 - Instruções para a preparação cólica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .153

6 - Critérios para CO adequada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .163

7 - Diagnósticos de histologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .165

8 - Escala de satisfação com os exames de colonoscopias (ESEC) . . . . . . . . . . . . . . . . . .169

9 - Estatuto socioeconómico (Método Graffar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .171

10 - Tabela suplementar L-DNA1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .173

11 - Tabela suplementar L-DNA 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .175

Resumo

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Resumo

Pretendeu-se avaliar a utilização conjugada, ou isolada, da colonoscopia virtual e da deteçãode DNA humano mutado nas fezes, como métodos de rastreio do carcinoma colorretal emindivíduos de risco médio, entre os 50 e os 74 anos, e o seu impacto na população. Utilizou-se uma amostra de 510 indivíduos, estatisticamente representativa da população madeirense.

Neste estudo de campo, transversal e baseado numa amostra com critérios de seleção bemdefinidos, a colonoscopia virtual baseada na teleradiologia provou ser eficiente. Acolonoscopia virtual evidenciou um poder diagnóstico robusto com um alto grau deprevisibilidade para a presença ou ausência de doença. A colonoscopia virtual diagnosticou98,1% de indivíduos com pólipos adenomatosos ≥ 6 mm, número superior à colonoscopiaótica e esta diferença foi estatisticamente significativa (p=0.04).

Apesar da colonoscopia virtual já ter sido considerada precisa no rastreio do carcinomacolorretal por outros autores, este estudo, tanto quanto é do nosso conhecimento, é a primeiraavaliação da sua performance em que a colonoscopia ótica, como método comparativo, nãotem acesso prévio aos resultados da colonoscopia virtual, obtidos a posteriori, num centro deexcelência remoto. É verdade universal que a alta sensibilidade da colonoscopia virtual éindependente de aparelhagem de TC tecnologicamente muito desenvolvida. Ficou tambémdemonstrado que a colonoscopia virtual tem grande sensibilidade para lesões 6-9 mm (98%).

Os resultados da análise do DNA humano mutado nas fezes no presente estudo têm que serinterpretados de forma muito cautelosa, tendo em conta as limitações metodológicas e ouniverso amostral reduzido. Estes fatores limitam a elaboração de ilações generalizadas ecomprometem a sensibilidade do painel molecular, e como tal, tornaram inviável a aplicaçãodos testes de DNA fecal assim desenhados ao rastreio do carcinoma colorretal. A sensibilidadee a especificidade do L-DNA fecal na deteção de lesões avançadas ≥ 6 mm e adenocarcinomas(13,89% e 84,54%) esteve aquém do reportado internacionalmente (64% e 95%,respetivamente) (Abbaszadegan MR et al 2007), pelo que, na presente amostra, não se revelouum bom marcador molecular para rastreio de lesões cólicas. A sua capacidade de identificarlesões cólicas não se revelou associada à dimensão da lesão ou à região da sua localização. Éno entanto de salientar que se verificou uma associação de L-DNA à deteção de lesõespoliposas consideradas globalmente(28,6%), comparativamente com apenas os póliposadenomatosos (8,9%). Além disso, observou-se uma tendência para que o L-DNA seja maisfrequentemente detetado em indivíduos com uma maior número de lesões cólicas (38,5% vs13,4%), sendo também significativamente mais frequente em amostras do sexo feminino com

Resumo

xx

3 a 5 lesões cólicas (62,5%, quando comparadas com 14,3% em amostras com 1 a 2 lesões).Por outro lado, a análise de DNA nas lesões cólicas biopsadas produziu resultados que setraduzem em importante benefícios clínicos: a identificação de alterações somáticas em APC,K-RAS, B-RAF e TP53 é um complemento do diagnóstico, fornecendo indicações para avigilância e a seleção e racionalização da terapia farmacológica.

A aplicação de questionários de satisfação (ESEC) mostrou uma boa aceitação dos exames decolonoscopia virtual e colonoscopia ótica, mesmo que realizados no mesmo dia esequencialmente, havendo, no entanto, uma tendência para maior satisfação com acolonoscopia virtual (p=0.00).

Em resumo, a colonoscopia virtual revelou-se um exame de rastreio do carcinoma colorretalbem aceite pela população, incruento e bastante fiável. Evita a remoção desnecessária depólipos em pelo menos 70% dos indivíduos e é fácil de implementar com aparelhagem poucosofisticada e com o benefício do uso concomitante da teleradiologia. Os bons resultados doestudo do DNA fecal obtidos em laboratórios de referência não são ainda generalizáveis. Osexames moleculares fecais não estão ainda disponíveis para uso em rastreios do carcinomacolorretal.

Abstract

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Abstract

The aim of this study is to evaluate the use in conjunction, or in isolation, of the virtualcolonoscopy test and of the detection of mutated human DNA in the stools, as screeningmethods of colorectal cancer in average risk individuals, between the ages of 50 and 74, andits impact on the population. A sample of 510 individuals, statistically representative of theMadeira population, was used.

In this controlled cross-sectional study, CT Colonography based on teleradiology proved to beefficient. CT Colonography was shown to have good diagnostic capability with a high degreeof predictability for the presence or absence of illness. CT Colonography diagnosed 98,1% ofthe individuals with adenoma polyps ≥ 6 mm, number above of the same polyps detected byoptical colonoscopy test and this difference was statistically significant (p=0.04).

Although the CT Colonography had already been considered to be precise in screening forcolorectal cancer by other authors, this study, as much as we know, is the first evaluation ofits performance using optical colonoscopy, as the gold standart test, without previonsknowledge of CT Colonography results, obtained a posteriori in a remote academic centre. Itwas confirmed that the high sensitivity of CT Colonography is independent of the CTequipment being technologically very developed. It was also demonstrated that the CTColonography test has great sensitivity for 6-9 mm lesions (98%).

The results of the analysis of the mutated human DNA in stools in the present study must beinterpreted very cautiously, considering the methodological limitations and the small sampleuniverse. These factors limit the elaboration of generalized inferences and compromise thesensitivity of the molecular panel, and as such, made the application of the stool DNA teststhus designed, unviable in screening for colorectal cancer. The sensitivity and the specificityof the stool L-DNA in the detection of advanced lesions ≥ 6 mm and adenocarcinomas(13,89% and 84,54%) was below that reported internationally (64% and 95%, respectively)(Abbaszadegan MR et al, 2007), and which, in the present sample did not prove to be a goodmolecular marker for screening of colon lesions. Its capacity to identify colon lesions was notshown to be associated to the size of the lesion nor to the region of its location. It is howeverworth pointing out that an association of L-DNA to the detection of all polypoid lesions wasfound (28,6%), compared with only adenomatous polyps (8,9%). Besides this, a tendency forL-DNA to be more frequently detected in individuals with a higher number of colon lesions(38,5% vs. 13,4%) was observed, also significantly more frequent in female samples with 3 to5 colon lesions (62,5%, when compared with 14,3% in samples with 1 to 2 lesions). On the

Abstract

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other hand, analysis of the DNA in biopsied colic lesions produced results that translated intoimportant clinical benefits: the identification of somatic alterations in APC, K-RAS, B-RAF eTP53 are a complement to the diagnosis, providing indications for the monitoring andselection and rationalization of pharmacological therapy.

The use of satisfaction questionnaires (ESEC) indicated good acceptance of the CTColonography and optical colonoscopy tests, even when carried out on the same day ands e q u e n t i a l l y, there being, however, a tendency for greater satisfaction with the CTColonography (p =0.00).

In summary, the CT Colonography proved to be a colorectal cancer test that is readily acceptedby the population, bloodless and sufficiently reliable. It avoids the unnecessary removal ofpolyps in over 70% of individuals. It is easy to implement with not very sophisticatedequipment and with the benefit of the concomitant use of teleradiology. The good results of thestudy of the fecal DNA obtained in laboratories of reference cannot yet be generalized. Thestool molecular tests are not yet available for use in colorectal cancer screening.

Resumé

xxiii

Resumé

Notre but a été d’évaluer l’utilisation conjuguée, ou isolée, de la coloscopie virtuelle et de ladétection de DNA humain muté dans les selles, comme méthodes de dépistage du cancercolorectal chez des individus à risque moyen, âgés de 50 à 74 ans, et leur impact sur lapopulation. Nous avons utilisé un échantillon de 510 individus, statistiquement représentatifde la population madérienne.

Dans cette étude tranversal et controllée, la coloscopie virtuelle par téléradiologie s’est révéléeefficiente. La coloscopie virtuelle a mis en évidence un pouvoir de diagnostic robuste, avec undegré élevé de prévisibilité concernant la présence ou l’absence de maladie. La coloscopievirtuelle a diagnostiqué 98,1% de sujets présentant des polypes adénomateuses ≥ 6 mm,numèro superieur à la coloscopie optique et cette différence a été statistiquement significative(p=0.04).

Bien que la coloscopie virtuelle ait été considérée comme nécessaire au dépistage du cancercolorectal par d’autres auteurs, la présente étude, tant que nous le sachions, est la premièreévaluation de sa performance, où la colonoscopie optique, en tant que métode comparative, n’aeu pas d’acès préalable aux resultats de la colonoscopie virtuelle, obtenus a posteriori, dans uncentre d’excelence lointain. Il a été confirmé que la sensibilité élevée de la coloscopie virtuelleest indépendante d’appareils de tomographie informatisée technologiquement très développés.Il a également été démontré que la coloscopie virtuelle possède une grande sensibilité pour deslésions de 6-9 mm (98%).

Les résultats de l’analyse de l’DNA humain muté dans les selles de la présente étude doiventêtre interprétés avec beaucoup de prudence, en prenant en compte les limitationsméthodologiques et l’échantillonnage réduit. Ces facteurs limitent l’élaboration de conclusionsgénéralisées et compromettent la sensibilité du panel moléculaire, et ont, de ce fait, inviabilisél’application des tests d’ADN fécal ainsi dessinés au dépistage du cancer colorectal. Lasensibilité et la spécificité du L-DNA fécal dans la détection de lésions avancées ≥ 6 mm etd’adénocarcinomes (13,89% et 84,54%) s’est située en-dessous de ce qui a été rapporté auniveau international (64% et 95%, respectivement) (Abbaszadegan MR et al 2007) et, dans leprésent échantillon, ne s’est donc pas révélée être un bon marqueur moléculaire pour ledépistage de lésions coliques. Sa capacité à identifier des lésions coliques ne s’est pas révéléeêtre associée à la taille de la lésion ou à la région où elle était localisée. Il faut néanmoinssouligner que nous avons constaté une association de L-DNA à la détection de toutes les lésionspolypeuses (28,6%), par comparaison aux lesions adénomateuses seulement (8,9%). En outre,

xxiv

nous avons observé une tendance pour que le L-DNA soit plus fréquemment détecté chez desindividus présentant un plus grand nombre de lésions coliques (38,5% vs 13,4%) et il estégalement significativement plus fréquent dans des échantillons de sexe féminin présentant 3à 5 lésions coliques (62,5%, lorsque comparées à 14,3% dans des échantillons présentant 1 à2 lésions). Par ailleurs, l’analyse de DNA dans les lésions coliques biopsées a donné desrésultats qui se traduisent par d’importants bénéfices cliniques: l’identification d’altérationssomatiques en APC, K-RAS, B-RAF et TP53 sont un complément de diagnostic, fournissantdes indications pour la surveillance et le choix et la rationalisation de la thérapiepharmacologique.

La réalisation d’enquêtes de satisfaction (ESEC) a montré une bonne acceptation des examensde coloscopie virtuelle et de coloscopie optique, même réalisés le même jour et l’un aprèsl’autre. Il existe, cependant, une tendance à une plus grande satisfaction par rapport à lacoloscopie virtuelle (p=0.00).

En résumé, la coloscopie virtuelle s’est révélée être un examen de dépistage du cancercolorectal bien accepté par la population, non invasif et assez fiable. Il évite l’ablation nonnécessaire de polypes chez plus de 70% des sujets et il est facile à mettre en œuvre avec desappareils moins sophistiqués et en bénéficiant de l’usage concomitant de la téléradiologie. Lesbons résultats de l’étude de DNA fécal obtenus dans des laboratoires de référence ne sont pasencore généralisables. Les examens moléculaires fécaux ne sont pas encore disponibles pourêtre utilisés dans des dépistages du cancer colorectal.

Resumé

1

Introdução

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1. INTRODUÇÃO

1.1 JUSTIFICAÇÃO DO ESTUDO

No mundo ocidental, o CCR está rapidamente a atingir o topo das causas de morte por cancro,quase a ultrapassar os cancros da mama, da próstata e do pulmão1-3. Na grande maioria doscasos tem origem num pólipo adenomatoso que alcança a fase de cancro só ao fim de 10 a 15anos, após várias transformações funcionais, histológicas e mutações genéticas4,5a, 5b, 5c.

Enquanto uma pequena percentagem do CCR incide em doentes de alto risco, geneticamentepredispostos (10 a 20%), a grande maioria ocorre esporadicamente em adultos de risco médio,assintomáticos, a partir dos 50 anos de idade (80%)6.

Rastreio significa a avaliação dos indivíduos no sentido de diagnosticar uma qualquer doençanum estádio precoce do seu desenvolvimento e obedece a vários critérios 74:

a) A situação médica deve ser um importante problema de Saúde Pública;

b) O desenvolvimento da doença passa por um período de latência assintomático erelativamente longo (vários anos);

c) A história natural da doença deve estar bem definida e bem compreendida;

d) Deve haver um esquema terapêutico devidamente formalizado, isto é,tratamentos baseados na evidência devem estar a ser usados;

e) Devem procurar-se testes de rastreio com alta sensibilidade, de fácilaceitabilidade e realização, não cruentos ou pouco cruentos, e económicos.

Para além da eficácia e do custo, a aceitabilidade de um teste pelos indivíduos constitui umaspeto importante subjacente ao êxito de um programa de rastreio baseado nesse teste. Aconstrução de uma ferramenta capaz de parametrizar esse maior ou menor grau de satisfaçãoé uma etapa imprescindível de avaliação global do teste avaliado.

A introdução dum método de rastreio do CCR de âmbito nacional é, assim, uma medidaimportante e urgente na área da Saúde Pública, com reflexos sociais e económicos evidentes7-

10.

Introdução

Introdução

4

Porque a prevalência do CCR detetado no rastreio duma população assintomática é muitobaixa (<1%), foi definida como lesão-alvo o pólipo adenomatoso com 10 mm de diâmetro ousuperior, contendo componentes vilosos ou displásicos ao exame histológico14, 5d, lesão a queLittle chama de neoplasia avançada. Apesar do interesse morfológico deste conceito emtermos óticos, o conflito que desperta em termos anatomopatológicos leva a considerá-lo commuita precaução.

Contudo, não devemos esquecer as lesões planas, cuja incidência pode variar entre 7% e 44%dos adenomas. Uma lesão considera-se plana na CV e na CO quando a altura é ≤ 3mm ou≤2,5mm respetivamente. As lesões deprimidas são mais sujeitas a desenvolverem displasia dealto grau e transformação carcinomatosa do que as lesões elevadas ou totalmente planas.Representam quase sempre uma via carcinogénica ‘de novo’ e originam-se diretamente damucosa colorretal normal, sem passarem por um componente adenomatoso. Uma lesão planacom depressão central e com mais de 6 mm de diâmetro, detetada na CV, obriga a avaliação eremoção imediata por CO 77, 78, 79.

O princípio conceptual e a grande mais valia do rastreio do CCR são a triagem de prevençãodo cancro, ao contrário do rastreio do cancro da mama, em que a intervenção assenta nadeteção precoce do cancro.

Vários testes de rastreio têm sido utilizados: pesquisa de sangue oculto nas fezes,sigmoidoscopia/colonoscopia esquerda, associação dos dois métodos anteriores, clister opacocom duplo contraste, colonoscopia ótica total (CO)8, entre outros. A pesquisa de sangue ocultonas fezes tem uma sensibilidade baixa porque apenas deteta o sangue eliminado pela lesão-alvo: o CCR sangra intermitentemente e a lesão pré-cancerosa praticamente não sangra.15-20.Contudo, é de realçar que o Hemoccult II foi o único teste prospetivamente avaliado e queprovou diminuir a mortalidade por CCR67, 68.

A sigmoidoscopia flexível/colonoscopia esquerda não preenche o critério estrutural devisualização de todo o intestino grosso e o clister opaco é um método insuficiente na traduçãoexata das alterações morfológicas da parede intestinal.

A controvérsia na sua utilização é enorme porque nenhum dos testes é ideal. A necessidadedum exame anatómico que contemple a observação de todo o intestino grosso elegeu a COcomo teste gold standard11-13.

Todavia, por diferentes ordens de razão, também a CO não é um método ideal de rastreio

Introdução

5

porque:

i - Apesar das campanhas publicitárias, menos de 50% das populações aderem à CO,exame considerado desagradável e embaraçoso; 21-26

ii - Os pólipos cólicos são frequentes a partir dos 50 anos e aumentam com aidade10,11. No contexto dum rastreio do CCR, a prevalência de pólipos ≥ 10 mm,com displasia de alto grau e/ou transformação vilosa, é bastante baixa eaproximadamente de 5 a 10%. Quando se usa a CO para rastreio, todos os pólipossão removidos;

iii - A polipectomia não é isenta de riscos, com a perfuração a obrigar a intervençãocirúrgica urgente;

iv - A maioria dos pequenos pólipos são hiperplásicos ou o resultado duma respostainflamatória não específica. Mesmo que fossem adenomas, são tão pequenos queo potencial para a degenerescência maligna provavelmente nunca será expressodurante a vida do doente; 27,28

v - Não haverá, ou será muito difícil que a Gastrenterologia tenha capacidade deresposta às solicitações dum rastreio nacional baseado na colonoscopiaconvencional 29,30;

vi - Em Portugal, apesar da CO ser considerada o teste gold standard, a utilização deum especialista de gastrenterologia torna o custo/benefício de cada exameincomportável num rastreio nacional;

vii - Em estudos de rastreio por CO em populações de risco médio, aproximadamente60% dos adultos não têm evidência de lesões e 20 a 25% dos indivíduos têm 1 ou2 pólipos subcentimétricos. Em termos de prevenção do cancro cólico, a deteçãoe remoção destes pólipos diminutos não traz qualquer benefício ao doenteindividual; 28

viii - É um exame observador-dependente, sendo que uma segunda CO, efetuadaimediatamente após a primeira, deteta lesões não observadas anteriormente em6% dos casos. 31,32

ix - Em casos de lesões obstrutivas ou semi-obstrutivas, a CO torna-se um exameinviável na avaliação do cólon a montante dessas lesões porque não ultrapassa asmesmas33.

O debate tem girado à volta de duas questões nucleares, quanto às linhas orientadoras pararastreio:

- Deve a CO ser um exame único, universal, a efetuar por volta dos 60 anos, ou,em alternativa;

- Deve o objetivo geral do rastreio centrar-se na triagem pelos métodos menosinvasivos e assim, deve a CO ser reservada para os casos positivos da seleçãoinicial? (teste fecal- pesquisa de sangue oculto ou DNA humano mutado)?

A colonoscopia virtual (CV) ou colonografia por tomografia computorizada (CTC) é umexame iniciado nos últimos 15 anos como uma moderna técnica de imagem radiológica docólon e potencial enorme para aplicação alargada em rastreios populacionais do CCR.

De fato, apenas em 1994 Vining e Gelfand construíram a primeira CV 34, para em 1996, Haraet al. da Mayo Clinic35, e em 1997, Royster et al. da Universidade de Boston36, confirmarema capacidade da CV para a deteção do pólipo (90%).

Em 1999, Fenlon et al.37 confirmaram, definitivamente, a eficiência da CV, comprovando quea sensibilidade da CV era igual à CO na deteção de neoformações vegetantes,volumetricamente significativas, pólipos e neoplasias malignas. Com efeito, se a CV apenasdiagnosticou 82% das lesões entre 6 e 9 mm, a sua sensibilidade aumentou para 91% naslesões ≥ 10 mm e para 100% no carcinoma.

O grande potencial de evolução tecnológica permitirá o reforço da posição da CV, cuja relaçãocusto-beneficio, em termos de eficiência e comodidade, está já a afirmá-la como alternativasólida no processo do rastreio do CCR, enquanto técnica inovadora. O seu carácter totalmentenão invasivo tem cativado médicos e motivado doentes. A sua inocuidade está provada pelacapacidade residual e desprezível de poder originar um cancro.3 8 A necessidade deaprendizagem de leitura é um facto incontornável,26,39-48 mas a utilização de ferramentas deajuda para o diagnóstico (CAD – Computed Assisted Diagnosis) 49-55 associada ao faecaltagging (marcação de resíduos fecais com corante),56 aumentaram a sensibilidade e aespecificidade do teste e diminuiram a taxa de falsos negativos. Os gastrenterologistasrapidamente compreenderão que a CV não é um teste competitivo, mas um teste de referênciapara mais colonoscopias óticas.

Se a Imagiologia já a interiorizou, a Gastrenterologia rapidamente virá a considerar a CV como

6

Introdução

Introdução

7

uma excelente metodologia diagnóstica e de referenciação de lesões do cólon. Na verdade, éjá grande a preocupação em caracterizar a história natural dos pólipos detectados por CV.Novo e muito interessante debate é o que agora se centra na questão de como lidar com a lesãopolipóide detectada pela CV, em termos de vigilância ou referência para polipectomiacolonoscópica 46,47.

As guidelines definidas pelo Working Group on Virtual Colonoscopy no 5º SimpósioInternacional de Colonoscopia Virtual de Boston, em Outubro de 2004, são (Quadro 1) 73,76:

Substantivamente, o tema central de discussão que agora se inicia será o de equacionar sobreo tipo e o modo de vigilância a efetuar nos 20% da população com pólipos entre 6 e 9 mm.

Nesta perspetiva, o rastreio do CCR assume, naturalmente, papel dominante porque a questãocentra-se no consenso quanto à indicação duma estratégia precisa ou dum teste simples para atriagem do CCR.

É no âmbito deste domínio do conhecimento que as alterações moleculares de mutações doDNA fecal de células esfoliadas de neoplasias colorretais, constitui hoje um outro campo deestudo muito promissor57. A genética molecular do CCR constitui a base da análise do DNAfecal. Pelo menos 80% dos cancros colorretais resultam de instabilidade cromossómica, comaparecimento de mutações no gene APC, no gene supressor do tumor p53 e no oncogene K-Ras. Os outros 15 a 20% de CCR envolvem a perda de genes que controlam a reparação deerros do DNA (mismatch repair, MMR genes) e manifestam-se pela instabilidade de

Quadro1.1 Guidelines do Working Group on Virtual Colonoscopy76

Lesão Pacientes (%) Recomendações

Nenhum pólipo 40 Nenhuma açãoVigilância de rotina

Pólipo<6mm 30 Idem

Pólipo 6-9mm 20 Individualizar

Pólipo≥ 10mm 10 Colonoscopia ótica total

Introdução

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microssatélites. O CCR pode ainda ser detetado por duas outras vias: uso de marcadores deDNA associado a perturbação da apoptose (L-DNA ou DNA longo) e uso de marcadores deDNA associados a alterações epigenéticas traduzidas por fenómenos de metilação 27,58-61.Vários estudos já provaram a exequibilidade desta tecnologia na deteção de lesões colorretaisjá identificadas por CO em estudos-piloto de rastreio de populações assintomáticas acima dos50 anos 62-66.

A utilização individualizada dos testes de DNA fecal como método de rastreio simples e nãoinvasivo do CCR, em substituição do Hemoccult II, não está ainda averiguada, emboraSchubbert et al tenham comprovado que a sua sensibilidade é muito superior à pesquisa desangue oculto nas fezes (40,8% versus 14,1%, p<0.001, respetivamente) 62. A grande limitaçãodiagnóstica dos testes de DNA assenta na baixa sensibilidade para a deteção de póliposadenomatosos o que limita o seu valor como teste único, porque não detetam muitas lesõesidentificadas pela CO 62. Contudo, por ser muito mais sensível que o Hemoccult II 62, pode serde grande utilidade num programa de rastreio do CCR, numa de duas alternativas:

i - O seu uso, a intervalos regulares e suficientemente frequentes, pode ser tãoefetivo na deteção das lesões poliposas como um teste muito mais sensível, masusado infrequentemente, como a CO;

ii - A sua utilização associada a um exame de CV pode ser determinante noesclarecimento do subgrupo da progressão neoplásica, no grupo de pólipos entre6 a 9mm, que obrigatoriamente necessitará de CO.

A comunidade médica anseia que um painel molecular suficientemente amplo para detetar ummáximo de tumores esporádicos, associado ao armazenamento adequado e ao envio atempadodas fezes para análise, possa melhorar a sensibilidade do teste em relação aos pólipos detamanho médio ou grande 58,62,72-74.

A criação de um biobanco associado a este projeto de investigação das alterações mutagénicasdo DNA fecal humano tornou-se indispensável como infraestrutura para recolha,armazenamento e distribuição de material biológico. No presente estudo foram recolhidasamostras de sangue, tecido e fezes, preservadas a -80º C e os respetivos DNAs a -20º C,suportadas por uma base de dados com informação clínica e que estão à disposição paraestudos de investigação de novos testes de diagnóstico e para apoiar a formação científica pós-graduada de jovens licenciados, médicos e outros profissionais de saúde 80-84.

Introdução

9

Portugal tem um programa de rastreio do CCR baseado num exame inicial de deteção desangue oculto na fezes e cujas orientações programáticas estão contidas no Plano Nacional dePrevenção e Controle das Doenças Oncológicas 2007/2010, elaborado por uma equipemultidisciplinar e publicitado em Dezembro de 2007 (ver site da Sociedade Portuguesa deGastrenterologia). Juridicamente, emana da Resolução do Conselho de Ministros nº 129/2001de 2 de Agosto, que definiu um Plano Oncológico Nacional inicial 2001/2005. Obedece avárias orientações baseadas na evidência dos últimos 10 anos, e que foram recentementecoletadas por especialistas da Agência Internacional de Pesquisa sobre o Cancro (IARC) epublicadas pelo Conselho da Comissão Europeia num documento de 450 páginas, dividido em10 capítulos 75.

1.2 HIPÓTESE E OBJECTIVOS DO ESTUDO

A questão central que procurámos estudar no presente estudo é a posição que a CV e/ou oD N A fecal humano mutado podem representar numa estratégia de rastreio do CCR,comparativamente com a CO. Por forma a testá-la, definiram-se os seguintes objetivosespecificos (procurando quantificar a sua qualidade e eficiência, de modo que possam ser,sustentadamente, utilizados com eficácia num programa de rastreio do CCR):

i - Avaliar o desempenho da CV como método de rastreio do CCR;

ii - Construção de um instrumento de avaliação da satisfação e comparação daaceitação pelos indivíduos rastreados dos 2 exames colonoscópicos;

iii - Avaliar a capacidade de um painel de testes de DNA fecal humano mutado, játestado internacionalmente;

iv - Avaliar a utilização conjugada dos dois métodos anteriores, para as mesmascircunstâncias;

v - Constituição de um biobanco de DNA extraído de sangue, tecido biopsado ematéria fecal de todos os participantes

Introdução

10

1.3 ESTRUTURAÇÃO GERAL DO RASTREIO E EQUIPAS DE TRABALHO

Este estudo necessitou da aprovação prévia de duas Comissões de Ética: inicialmente, dosServiços de Saúde da Região Autónoma da Madeira (SESARAM, EPE) e em seguida daFMUL. Foi necessário também obter o apoio científico e financeiro do Instituto deAdministração e Saúde (IA-Saúde), instituição da Secretaria Regional dos Assuntos Sociais(SRAS), para que, conjugadamente com a aceitação do Projeto de Investigação, fossefinalmente dado parecer favorável à realização do estudo conducente a doutoramento peloConselho Científico da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa. Estavam, assim,criadas as condições para que o trabalho de campo fosse efetuado na Região Autónoma daMadeira.

Através duma campanha nos meios de comunicação social, coordenada com a utilização decartazes e fliers e informação aos profissionais de saúde no HCF e CS, a população da Madeirafoi informada da realização dum estudo de rastreio do CCR para indivíduos de risco médio,entre os 50 e os 74 anos.

Metodologicamente, o estudo foi estruturado em sete etapas (Quadro 1.2):

Etapa 1 - Delineamento experimental: estudo da dimensão da amostra e da posterioranálise estatística

Etapa 2 - Utilização dos meios de comunicação social para divulgação do projeto àpopulação e informação e formação dos técnicos de saúde interessados (HCF,CS e elementos das equipas de trabalho)

Etapa 3 - Admissão de rastreantes, efetuada pelo Investigador Principal, comfornecimento inicial da “Folha de informação ao sujeito” (Anexo 1), comexplicação oral complementar detalhada dos exames a efetuar durante o rastreioe eventuais complicações, meios de as resolver, e despiste de indivíduos aexcluir através da aplicação dum “Questionário de Exclusão” (Anexo 2). Aosrastreantes admitidos foi nesta fase lido em voz alta um “ConsentimentoInformado” (Anexo 3), que após aceite, foi assinado de acordo com a mesmaassinatura do BI/CC e foi fornecido um folheto de “Instruções para colheita defezes e sangue” (Anexo 4)

Etapa 4 - Colheita, armazenamento em arca refrigerada a -20º e envio das amostras defezes e de sangue para o LGH-UMa, num período de tempo inferior a duashoras. Fornecimento de folheto com as “Instruções para a preparação cólica”(Anexos 5).

Introdução

11

Etapa 5 - Após a preparação intestinal, no dia imediato, de manhã e pelas 8 horas,execução sequencial da CV seguida da CO. Após pausa obrigatória de trintaminutos, aplicação do “Questionário de satisfação” (Anexo 8)

Por protocolo, todas as lesões detetadas durante a CO foram removidas ecortadas para exame histológico e genético, sendo uma metade enviada para oLaboratório de Anatomia Patológica (LANA) e a outra metade para o LGH-UMa

Etapa 6 - Análise e interpretação dos resultados, com informação aos rastreados quanto àclassificação das lesões clinicamente importantes

Etapa 7 - Elaboração do manuscrito para dissertação

O anonimato e confidencialidade dos registos foram garantidos com a utilização de umnúmero de identificação e o recurso a uma base de dados em suporte informático, com acessoapenas com credenciais autorizadas.

Todos os médicos, biólogas e psicólogas envolvidos no Projeto são especialistas muitoexperimentados. A CV, efetuada pelo Dr. António Rodrigues, com mais de vinte anos deexperiência em tomografia computorizada, foi avaliada por teleradiologia pelo Dr. PhilippeLefere do VCTC (Virtual Colonoscopy Teaching Center), coadjuvado, sempre que necessário,pelo seu colega de trabalho, Dr. Stefaan Gryspeerdt, ambos com grande experiência em CV(mais de 5.000 exames analisados). Os cinco gastrenterologistas, Drs. Ricardo Teixeira,Henrique Morna, Isabel Jardim, Carla Andrade e Goreti Faria, têm pelo menos quinze anos deexperiência clínica, incluindo a execução de endoscopias. Os exames histológicos foramefetuados pelo Dr. Francisco Henriques de Gouveia, Chefe de Serviço de Anatomia Patológica,definidos segundo classificação histológica identificada no Anexo 7. A aplicação dos“Questionários de satisfação” foi feita por especialistas em Psicologia devidamentehabilitadas, sob a orientação da Profª Doutora Glória Franco, Professora Auxiliar na UMa. Osexames genéticos e moleculares foram executados pela Profª Doutora Alexandra Rosa,Professora Auxiliar Convidada na Unidade de Ciências Médicas da UMa e Colaboradora doLGH-UMa, e pela Mestre Sara Gomes.

Introdução

12

Quadro 1.2 Fluxograma do Projeto de Investigação

Admissão de rastreantesAplicação do Questinário de ExclusãoObtenção do Consentimento Informado

Fornecimento das Instruções para colheita de fezes

Divulgação do projeto de investigação à população, informação e formação dostécnicos de saúde

Delineamento experimental: estudo da dimensão da amostra e da posterioranálise estatística

Armazenamento e envio das amostras de fezes para olaboratório

Fornecimento das Instruções para preparação cólica e domaterial de preparação

Execução da CV após preparação cólicaExecução da Colonoscopia total ótica

Preenchimento do Questionário de Satisfação

Avaliação de resultados“Feedback” aos rastreados

(Classificação dos individuos de acordo com a lesão maisavançada identificada)

Elaboração do manuscrito para dissertação

2

Colonoscopia virtual

15


2. COLONOSCOPIA VIRTUAL

2.1 CONCEITO

Após um período introdutório de quinze anos de refinamentos tecnológicos e de apuramentoda metodologia diagnóstica, a CV afirma-se hoje como um exame radiológico do cólon e retoem toda a sua extensão que permite detetar lesões tumorais, benignas ou malignas, através davisualização combinada de imagens 2D e 3D, estas últimas obtidas por reconstrução de 500 a600 cortes 2D 1. Fato importante de registo é que, como qualquer exame de imagem, a CVdeteta ‘formas’ em massa e volume, e não a sua natureza histológica.

A técnica comporta quatro tempos: preparação intestinal, distensão da parede intestinal,aquisição de imagens em cortes e interpretação das mesmas61:

i - A preparação intestinal decorre num único dia, a véspera da realização do exame,e consta duma dieta pobre em resíduos, sem gorduras, para redução do volumefecal. Administração de laxantes para acelerar o trânsito intestinal e tornar o cólontão limpo quanto possível. Fixação de conteúdo fecal residual através da ingestãode produtos com bário e/ou iodo (faecal tagging);

ii - A distensão da parede intestinal obtêm-se pelo relaxamento do músculo lisoatravés da injeção intravenosa de 20 mg de butilbrometo de escopolamina,seguida pela insuflação cólica de dióxido de carbono (CO2), através de cateterretoanal, com monitorização automática da pressão de insuflação com aparelhoapropriado (PROTOCO2 EVM). O procedimento é feito de forma gradativa etendo em atenção o conforto e a tolerância do indivíduo. O relaxante do músculoliso limita os espasmos da parede, indutores de falsas imagens. Como o dióxidode carbono é altamente difusível, após uma adequada distensão cólica, favorecidapelo posicionamento do indivíduo em duas posições sequenciais de supinação epronação/decúbito lateral esquerdo, a sensação de distensão abdominaldesaparece rapidamente .

iii - Não há administração de contraste intravenoso. As aquisições de imagens,obtidas em poucos segundos, são efetuadas nas posições de supinação e pronaçãoou decúbito lateral esquerdo e fazem-se através dum CT scanner multicorte comutilização duma baixa dose de radiação (50 mAs) e espessura de cortes de 1.5mm.

iv - A interpretação das imagens decorre numa estação de trabalho com softwareapropriado, a qual reporta dois tipos de lesões: lesões com expressão intra-luminal e lesões extra-cólicas.

16


16

O exame comporta dois tipos de riscos ou complicações, nomeadamente: o risco de cancroinduzido pela radiação e a perfuração da parede intestinal.

O risco de lesões pela radiação é hoje negligível 31. Com as novas tecnologias houve umaredução de 50% das doses de radiação utilizadas. O risco de perfuração cólica é também muitoreduzido (0.01 a 0.06%) 32-34, e apenas há um caso descrito na literatura internacional, tratadoconservadoramente, quando a CV foi utilizada como teste de rastreio 34. Na CV diagnóstica há18 casos descritos, 12 dos quais não necessitaram de intervenção cirúrgica, e não houvemortalidade 34. De salientar que esta técnica não deve ser utilizada em indivíduos com doençainflamatória do intestino.

2.2– REVISÃO DA LITERATURA

Desde 2008 que a CV é considerada como mais uma ferramenta útil no rastreio do CCR empopulações de ‘risco médio’1. Alguns estudos de amostras robustas conseguiram resultados deconfiança na deteção de pólipos ≥ 6 mm (Quadro 2.1) 2-4,21,22,35,61.

Contudo, estes estudos provêm apenas de alguns centros académicos de excelência, comgrupos de radiologistas altamente treinados6, e pretendem atingir três grandes objetivos:estudo dos pólipos, desde os hiperplásicos aos adenomatosos; estudo do carcinoma colorretal,segundo a sequência adenoma-carcinoma; estudo da lesão≥ 10 mm com presença decomponentes viloso e/ou alto grau de displasia, numa proporção ≥ 25% 12.

Quadro 2.1 Colonoscopia virtual: estudos de centros académicos de excelência

Grupo de estudo Ano Nº Indiv % Homens Sensibilidade (%) PPV (%) NPV (%)≥6 mm 6-9 mm ≥10 mm

Pickhardt P et al NEJM 2 2003 1233 59 89 89 94 30 NR

Macari et al Radiology 62 2004 68 100 NR 53 100 NR NR

Kim D et al NEJM 3 2007 6283 44 NR NR NR NR NR

Cornett et al Am J Gastr63 2008 159 51 NR 82 94 NR NR

Johnson CD et al NEJM 4 2008 2600 48 78 78 90 45 90

Regge D et al JAMA22 2009 937 NR 85 NR NR 62 96

Graser A et al Gut 21 2009 311 55 91 92 92 48 84

de Haan et al Eur Rad 64 2011 4086 NR NR 79 88 NR NR

17


Os pólipos < 6 mm são denominados pólipos pequenos ou diminutos: 35 a 50% sãoadenomatosos, 2.7 a 3.4% são lesões pré-neoplásicas e a incidência de carcinoma varia de 0 a0.1% 2; a sensibilidade da CV é baixa, com uma taxa de omissão de 26 a 27 %36-38. A maioriados estudos recentes (Quadro 2.1) desprezam-nos, considerando-se que as lesões importantes,após crescimento lento, serão detetadas em exames posteriores. Os pólipos entre 6 e 9 mm sãodenominados pólipos pequenos a intermédios: 60 a 70% são adenomatosos, 4 a 9.7% sãolesões pré-neoplásicas e a incidência de cancro varia entre 0.5 a 1.0%; a sensibilidade da CVé alta, com uma taxa média de omissão de 13% 2,4,21,22. Assim, devemos sublinhar que as lesõesdiminutas não necessitam ser reportadas pela CV, e que as ≥ 6 mm detetadas pela CV têmindicação para ser removidas por CO67. Os pólipos ≥ 10 mm são considerados grandespólipos em que é obrigatória a realização duma CO terapêutica e/ou diagnóstica. Asensibilidade da CV é alta, com uma taxa de omissão de 2.1 a 6% 2, 4, 21, A deteção deadenocarcinoma pela CV nos diversos estudos variou entre 86 e 100%, com um valor médiode 94% (Quadro 2.2) 2, 4, 21, 22, 65, 66. É de realçar que o diagnóstico histológico definitivo épertença da Anatomia Patológica. A CO também não faz diagnóstico absoluto, apenas indiciasuspeita pela morfologia.

Quadro 2.2 Sensibilidade da CV na deteção de adenocarcinoma

Sensibilidade

Estudo Ano Deteção %

Pickhardt P et al NEJM 2 2003 2/2 100

Halligan S et al Trials 65 2007 1195/1285 93

Johnson CD et al NEJM 4 2008 6/7 86

Regge D et al JAMA22 2009 39/41 95

Graser A et al Gut 21 2009 1/1 100

von Wagner C et al Eur Radiol 66 2011 538/538 100

Os resultados estatísticos referentes a estudos de centros de excelência evidenciam claramente

que a CV aproxima-se dos valores da CO, teste de referência.

Em resumo, quais são então as indicações atuais para a realização duma CV? Seguramente em

todas as situações de falência da CO: após uma CO incompleta, nas contraindicações da CO

18


(anticoagulação, doença cardiopulmonar grave, doente idoso fragilizado), na situação de

recusa da CO. Mas isto é pouco e muito redutor, o que pretendemos estudar vai no sentido de

podermos afirmar que a CV é alternativa segura e eficiente à CO.

Existem bons resultados no rastreio individual de CCR com CV quando o grupo de

radiologistas é experiente (Quadro 2.3)3.

Quadro 2.3 Experiência da CV no rastreio individual 3

A análise dos resultados do Quadro 2.3 é bastante interessante:

i - Não há diferenças entre as duas colonoscopias na deteção das lesões pré-neoplásicas, isto é, ambas cerca de 3,9% (p=0.80);

ii - Só 8% dos indivíduos que se submeteram à CV é que necessitaram de fazer CO;

iii - A razão de polipectomias nos dois grupos CV:CO foi de cerca de 1:5, isto é, naCO removeram-se todos os pólipos, incluindo os diminutos, enquanto que na CVsó foram removidos pólipos ≥ 6 mm, em 8% dos casos;

iv - Foram observadas menos complicações na CV (apenas um caso tratadoconservadoramente e já anteriormente descrito)3.

CV CO

Nº Indivíduos 3120 3163

Polipectomia 250 (8%) 2434 (77%)

Lesões pré-neoplásicas 123 (3,9%) 121 (3,9%)

19


2.3 MATERIAL E MÉTODOS

2.3.1 Técnica

A CV foi efetuada no Núcleo de Imagem Diagnóstica, centro radiológico situado na Clínica deSanta Catarina, Funchal.

Todos os rastreados submeteram-se a uma preparação cólica, consistindo numa dieta semresíduos iniciada três dias antes dos exames, limpeza catártica e administração de produtocorante de resíduos fecais (faecal tagging) na véspera. Para a limpeza intestinal utilizou-seuma combinação de dois comprimidos de 5mg de bisacodil (Dulcolax, Boehringer Ingelheim,Ingelheim am Rhein, Alemanha) e 2X15.08 g de picossulfato de sódio (CitraFleet, De Witt,Cheshire, Reino Unido). Para a coloração dos resíduos fecais utilizou-se 225 ml dumasuspensão de bário a 4.2% peso/volume (EZ CAT, Bracco, Milano, Itália) e 50 ml deamidotrizoato de meglumina e amidotrizoato de sódio (Telebrix Gastro, Guerbet, Villepinte,França) (Anexo 5). Tem havido alguma preocupação quanto à utilização pouco criteriosa defosfato de sódio oral como produto de limpeza intestinal, o qual pode provocar nefropatiaaguda com diminuição da função renal e necessidade de diálise e em indivíduos maissuscetíveis, idosos, portadores de insuficiência renal crónica que tomam diariamentediuréticos, inibidores da enzima de conversão da angiotensina ou bloqueadores dos recetoresda angiotensina, anti-inflamatórios não esteroides, bem como os que padecem de insuficiênciacardíaca ou de desequilíbrio hidroeletrolítico39,43-60. Os esquemas de preparação cólicaadotados tiveram em conta todas as anteriores considerações, que foram despistadas nomomento da admissão dos rastreados pelo investigador principal.

Após relaxamento do músculo liso com injeção intravenosa de butilbrometo de escopolamina(Buscopan®, Boehringer Ingelheim) e insuflação automática do cólon com dióxido de carbono(PROTOCCO 21, Bracco, Milano, Itália), todos os indivíduos foram examinados com duasaquisições (supinação/pronação ou supinação/decúbito esquerdo).

A CV realizou-se num CT Scanner de 6 cortes (Emotion G, Siemens, Forcheim, Alemanha),usando 130 KW (=default setting), 50 mAs, uma colimação de corte de 1.5 mm, 600 msec derotação de tubo. O tempo de aquisição para cada conjunto de imagens foi de 25-30 segundos.As imagens foram reconstruídas com uma espessura de corte de 1.25 mm e um intervalo de 1mm. Neste estudo, o hardware utilizado permitiu um exame de CV em 64 segundos.

20


2.3.2 Garantia de Qualidade

Todos os rastreados receberam uma cuidadosa informação sobre a preparação cólica. Paraassegurar uma CV de boa qualidade que permitisse uma adequada interpretação, a preparaçãoe a distensão cólicas foram escrupulosamente monitorizadas no Centro de Teleradiologia daBélgica, usando uma escala de três valores (Quadro 2.4). Considerou-se como falsos positivosos casos em que um segmento cólico ou parte dele não era visualizado em ambas as aquisiçõesde supinação e pronação, devido a má preparação ou deficiente distensão. Na prática clínicacorrente isto deverá desencadear a realização duma CO.

Score Preparação Distensão

1 Fezes não impregnadas pelo corante ou Colapsoimpregnação não homogénea, impedindo a interpretação

2 Idem, mas não impedindo a interpretação Espaço endoluminal patente.Má qualidade da imagem 3D

3 Impregnação fecal homogénea Distensão adequada

2.3.3 Transferência de imagens e interpretação

As imagens adquiridas foram enviadas em formato DICOM para o Centro de Teleradiologiade Hooglede, Bélgica, através do sistema comercial de transferência YouSendIt, Campbell,CA, USA, e transferidas para estação de trabalho móvel (EliteBook 8730w, Hewlett-Pakard,Palo Alto,CA, USA) provida com software adequado (Vitrea;Vital Images, Minnetonka, MI,USA).

Todos os exames foram analisados com um método de interpretação 3D primário, comimagens em 2D para resolução de eventuais dificuldades de caracterização das lesões. Orelatório da CV era então registado na base de dados criada antecipadamente pelo investigadorprincipal.

Quadro 2.4 Sistema de classificação para a monitorização da qualidade da CV

21


2.3.4 Colonoscopia Ótica (CO)

Após a realização da CV, os rastreados submetiam-se imediatamente à CO sob sedaçãoconsciente com 3mg endovenosos de midazolam, não sendo necessária qualquer preparaçãocólica adicional. Nenhum dos produtos utilizados, nas quantidades referidas, são deletériospara o colonoscópio. A CO foi efetuada por um dos cinco gastrenterologistas referenciadosque observaram rigorosos critérios de qualidade de execução (Anexo 6). As lesões foramdivididas em pólipos não-neoplásicos, adenomas (LGD e HGD) e carcinoma11. Todos ospólipos detectados, incluindo os diminutos (< 6mm) foram removidos, registados e enviadospelo investigador para exame histológico e genético.

2.3.5 Cruzamento das lesões

A CV e CO foram comparadas para todas as lesões refenciadas. Qualquer dos operadores,gastrenterologista e radiologista, desconheciam sempre a informação do outro. No caso dumaCO incompleta, a CV foi comparada com a CO nos segmentos examinados por esta. A CO foiconsiderada o exame padrão. Todas as lesões foram comparadas quanto ao número, tamanhoe localização. O cruzamento das lesões (comparação volumétrica das mesmas lesõesidentificadas e caraterizadas pelos dois exames) foi definido por consenso. A CO definia otamanho da lesão com uma pinça de biopsia aberta. Na CV, as lesões foram medidas nasimagens 2D usando uma combinação janela/nível de 1500/-200 unidades Houndsfield13-15. Aslesões foram classificadas como <6 mm, 6-9 mm e ≥ 10 mm. Uma lesão era consideradacruzada se pertencia ao mesmo tamanho ou a um tamanho aproximado, ou se a lesão tivessequalquer tamanho maior que a lesão detectada pela CO, e ainda se a mesma estivesselocalizada no mesmo ou num segmento cólico adjacente16. O sistema de avaliação dossegmentos cólicos pela CO dita “não cega” não foi possível porque a interpretação da CV foisempre efetuada depois da execução da CO, não podendo, por isso, influenciar a observaçãoendoscópica. Por este motivo, um método de localização mais detalhada das lesões foiadotado, em comparação com estudos anteriores. O cólon foi dividido em onze segmentos:reto inferior (parte do reto abaixo da valva rectal inferior), reto médio e reto superior ( partedo reto acima da valva rectal superior), sigmoide, cólon descendente, ângulo esplénico, cólontransverso, ângulo hepático, cólon ascendente, cego e válvula ileo-cecal. Este método permitiuum cruzamento mais preciso das lesões. Para a listagem final das lesões o cólon foi divididoem seis segmentos, (Quadro 2.9, página 32). Nos casos em que a CV detetou lesões com altograu de probabilidade, que não foram detectadas e recuperadas durante a CO, foi proposto uma

22


CO de revisão, sabendo agora o endoscopista o resultado da CV. Em caso de confirmação, osresultados foram adicionados como positivos verdadeiros em relação à referência padrão. Emalguns destes casos, o exame de CO de revisão continuou normal, apesar dos achados da CVserem altamente sugestivos de lesão, e nesta eventualidade foi proposto aos rastreados uma CVde revisão. No caso duma CV negativa, a CV inicial foi considerada um falso positivo. No casoda CV de revisão confirmar a CV inicial, o indivíduo foi retirado do cálculo dos resultados.

2.3.6 Análise estatística

Tendo em vista responder às hipóteses formuladas, a dimensão da amostra foi calculada paraum erro máximo de estimativa de 5% com 95% de confiança, tendo em conta a distribuição dapopulação da ilha da Madeira, de acordo com a idade e o sexo. Cerca de 50% da populaçãocom ≥ 50 anos foi considerada elegível para o estudo. Os índices de sensibilidade,especificidade, valores preditivos positivo e negativo (PPV, NPV), razões de verosimilhançapositiva e negativa (LH+, LH-), foram calculados para todas as lesões ≥ 6mm e ≥ 10 mm, . Opadrão de referência foi a CO inicial, a que se adicionou as lesões detectadas nas CO de revisãoou através de cirurgia.

A sensibilidade foi calculada como a proporção de indivíduos com lesão na CV em relação aostestes positivos da CO (teste de referência). A especificidade foi calculada como a proporçãode rastreados sem lesão na CV em relação aos testes negativos da CO. O valor preditivopositivo (PPV) foi calculado como a proporção de pessoas com diagnóstico positivo pelo testepadrão sobre os indivíduos com CV positivo. O valor preditivo negativo (NPV) foideterminado como a proporção de indivíduos com o teste de referência negativo sobre aquelescom uma CV negativa. A precisão (accuracy) foi obtida com a proporção de resultados certosda CV sobre toda a amostra. A razão de verosimilhança positiva (LH+) foi calculada como aproporção de indivíduos com uma CV positiva relativamente aos indivíduos com CO positiva,dividida pela proporção de indivíduos com uma CV positiva relativamente aos que tiveram umresultado negativo na CO. A razão de verosimilhança negativa (LH-) resulta da proporção derastreados com CV negativa relativamente aos indivíduos com CO positiva, dividida pelaproporção de indivíduos com diagnóstico negativo na CO e com CV negativa.

A análise estatística dos resultados teve por base o teste de McNemar40-42, com a utilização dosoftware SPSS (PASW) 18.

23


2.4 RESULTADOS

2.4.1 Caracterização da amostra

Foram observados 514 indivíduos entre Maio de 2010 e Maio de 2011, dos quais 510 foramsubmetidos a CV seguida de CO (dois indivíduos recusaram a CO e perderam-se as imagensde CV de outros dois). A CO foi incompleta em 30 rastreados, o que corresponde a uma taxade 6% de CO totais. Nestes 6% foi possível examinar 85 segmentos da CO, os quais foramincluídos no estudo. Não houve eventos adversos. Dos 510 participantes submetidos a CV,59.5% (304) dos elementos da amostra são do sexo feminino e 40.5% (206) são do sexomasculino (Figura 2.1).

No que diz respeito à idade, observou-se que os participantes têm uma idade média 59.7 anos,com desvio padrão de 6.4 anos. No que respeita a esta variável, e para uma melhorcaraterização da amostra, optou-se por organizar os dados de duas formas:

i - faixas etárias com intervalo de dez anos, onde vemos que a mais representada éaquela que compreende os indivíduos entre os 50 e os 59 anos, com 56% doselementos da amostra (Figura 2.2);

ii - faixas etárias com intervalo de 5 anos, onde a classe mais frequente é a de 50-54anos (29.2%) (Figura 2.3).

Quanto ao concelho de residência, podemos verificar que 67.5% dos elementos da amostraresidem no concelho do Funchal (Figura 2.4).

Sexo

59.5%

40.5%

MasculinoFeminino

Figura 2.1 Distribuição dos indivíduos da amostra por género

24


56.0%

37.3%

6.7%

0.0%

10.0%

20.0%

30.0%

40.0%

50.0%

60.0%

50-59 60-69 70-74

Idade

Figura 2.2 Distribuição dos indivíduos da amostra por faixas etárias com intervalos de 10anos

29.2%26.8%

21.0%

16.3%

6.7%

0.0%

5.0%

10.0%

15.0%

20.0%

25.0%

30.0%

50-54 55-59 60-64 65-69 70-74

Idade

Figura 2.3 Distribuição dos indivíduos da amostra por faixas etárias com intervalos de 5anos

67.5%

5.4% 3.8%0.8% 2.8% 0.6% 0.2% 1.4%

4.2%0.8%

12.3%

Func

hal

Câmara

de L

obos

Ponta

do S

olRi

beira

Brav

a

Calhe

taSã

o Vice

ntePo

rto M

oniz

Santa

na

Mac

hico

Porto

San

toSa

nta C

ruz

Concelho

Figura 2.4 Distribuição dos indivíduos da amostra por Concelho de Residência

25


2.4.2 Características por indivíduos

O fluxograma dos rastreados esté representado no Quadro2.5. Após o cruzamento dosresultados da CV com os da CO obtiveram.se 461resultados concordantes, 3 falsos negativos(FN) e 23 falsos positivos (FP), isto é, 487 casos que somaram para o cálculo de resultados.Noutros 23 casos,a CV evidenciou lesões não detetadas pela CO. Destes, 15 aceitaramsubmeter-se a uma CO de revisão que confirmou 5 lesões, mas continuou a considerar normal10 casos. Estes 10 casos, em conjunto com os 8 que recusaram a CO de revisão, aceitaram arealização de uma CV de revisão. Num dos casos, as imagens eram fortemente sugestivas delesão maligna cecal, o que motivou hemicolectomia direita laparoscópica imediata. 3 casosforam normais e por isso considerados como FP, perfazendo um total de 26 FP no estudo. Em14 casos a CV de revisão continuou a evidenciar lesões, pelo que foram retirados do estudo esumetidos a um programa de follow-up. Assim sendo, prefez-se uma amostra de 496indivíduos resultantes dos 487 iniciais com os 9 casos obtidos quer da CO quer da CV derevisão (5+1+3).

Em 427 (86.1%) destes, o cólon não evidenciou lesões ≥ 6 mm. Em 53 indivíduos, cada umadas técnicas detetou pelo menos um adenoma ≥ 6 mm. Em 16 participantes apenas foramdetetados pólipos hiperplásicos ≥ 6 mm. As características da performance da CV numa basepor indivíduo para a deteção de pelo menos um adenoma ≥ 6 mm estão listadas no Quadro 2.6.Os Quadros 2.7 e 2.8 completam as informações do Quadro 2.6.

COLONOSCOPIA VIRTUAL COLONOSCOPIA ÓTICA

23 CV+ com CO - 23 FP 3 FN 461 concordantes

15 CO revisão

10 normal 4965 lesões confirmadas

18 CV revisão 1 cirurgia

14 lesões confirmadas 3 Normal=FP

v

v

vv

v v

v v

v

v

Quadro 2.5 Fluxograma dos rastreados

8

26


≥ 6mm ≥ 6mm ≥ 6mm ≥ 10mm ≥ 10mmTodos os Adenomas Adenomas Todos os Adenomaspólipos c/ HGD e/ou pólipos c/ HGD e/ou

transf. vilosa transf. vilosa

N Total 69 53 32 32 26

Sensibilidade 0.96 0.98 1 1 1(0.87-0.99) (0.89-1) (0.87-1) (0.85-1) (0.84-1)

Especificidade 0.94 0.91 0.87 0.98 0.98(0.91-0.96) (0.88-0.93) (0.84-0.90) (0.96-0.99) (0.96-0.99)

PPV 0.72 0.56 0.35 0.74 0.74Valor preditivo (0.61-0.80) (0.46-0.67) (0.25-0.45) (0.56-0.86) (0.56-0.86)positivo

NPV 0.99 0.99 1 1 1Valor preditivo (0.98-1) (0.98-1) (0.99-1) (0.99-1) (0.99-1)negativo

Razão de 15.71 10.86 7.73 46.8 52.22verosimilhança (10.79-22.88) (8.07-14.63) (6.10-9.79) (25.35-84.40) (27.3-99.7)positiva (LH+)

Razão de 0.05 0.02 0 0 0verosimilhança (0.02-0.14) (0-0.14) negativa (LH-)

Quadro 2.6 Avaliação da precisão da CV com intervalos a 95% de confiança

27


TODAS ADENOMAS ADENOMAS COM ADENOMAS COM ADENOHGD E/OU HGD E/OU CARCINOMAS

TRANSF. VILOSA TRANSF. VILOSA

% 13.9 10.7 6.5 5.2 0.895% CI 11-17.3 8.2-13.8 4.5-9 3.5-7.7 -

N 69/496 53/496 32/496 26/496 4/496

% 95.65 98.11 100 100 10095% CI 87-98.9 89-100 87-100 84.4-100

N 66/69 52/53 32/32 26/26 4/4

% 93.91 90.97 87.07 98.08 10095% CI 91.1-95.9 87.8-93.4 83.6-89.9 96.3-99

N 401/427 403/443 404/464 461/470 492/492

Quadro 2.7 Utilização da CV como Método de Rastreio - ICaracterísticas da CV por Indivíduo

≥ 6 mm ≥ 10 mm

TODAS ADENOMAS ADENOMAS COM ADENOMAS COM ADENOHGD E/OU HGD E/OU CARCINOMAS

TRANSF. VILOSA TRANSF. VILOSA

% 71.4 56.52 34.78 74.29 11.4395% CI 61.2-80.4 45-66.7 25.3-45.5 56.4-86.9 -

N 66/92 52/92 32/92 26/35 4/35

% 99.26 99.7 100 100 -95% CI 97.7-99.8 98.4-99.9 98.8-100 99-100 -

N 401/404 403/404 404/404 461/461 -

% 15.71 10.86 7.73 52.22 -95% CI 10.8-22.9 8.1-14.6 6.1-9.8 27.3-99.7 -

% 0.05 0.02 0 0 -95% CI 0.02-0.14 0.03-0.15 - - -

≥ 6 mm ≥ 10 mm

Quadro 2.8 Utilização da CV como Método de Rastreio - IICaracterísticas da CV por Indivíduo

28


Nestes indivíduos, a prevalência de todas as lesões ≥ 6 mm e adenomas ≥ 6 mm foi 13.9% e10.7%, respetivamente. Os pólipos ≥ 10 mm estiveram presentes em 32 indivíduos (6.5%).Houve 4 casos (0.8%) com adenocarcinoma.

A CV detetou 98.1% (95% IC, 88.6 – 99.9%) dos indivíduos com adenomas ≥ 6 mm ediagnosticou corretamente todos os casos de ≥ 10 mm.

A CO obteve uma sensibilidade por indivíduo de 90.6% para os adenomas ≥ 6 mm e de 92.3%para os pólipos ≥ 10 mm. A CO não detetou lesões significativas em 5 indivíduos: doisadenomas 6-9 mm com displasia de baixo grau (LGD), um pólipo de 6-9 mm com displasia dealto grau (HGD) e dois adenocarcinomas ≥ 10 mm. Estas lesões foram removidas por CO derevisão em 4 casos e por cirurgia num caso. Três destes casos estavam localizados no cólondireito, incluindo dois adenocarcinomas.

Considerando todos os indivíduos com pólipos hiperplásticos como verdadeiros positivos, aCV obteve uma especificidade de 93.9% com um PPV (valor preditivo positivo) de 71.7%.Considerando todos os indivíduos com pólipos hiperplásticos como falsos positivos, aespecificidade para adenomas ≥ 6mm foi de 90.5% com um PPV de 55.3%.

A discordância entre a CV e a CO na deteção de adenomas ≥ 6 mm foi significativa com a CVdetetando mais adenomas ≥ 6 mm do que a CO (p=0.04, teste de McNemar).

A Tabela 2.1 evidencia a comparação das caraterísticas por indivíduo e por pólipo da CV e daCO.

2.4.3 Características por pólipos

A distribuição dos pólipos por segmento cólico está listada no Quadro 2.6, sendo que um totalde 62 adenomas ≥ 6 mm foram removidos. As características por pólipo dos resultados da CVe da CO estão listadas na Tabela 2.1. A CV não diagnosticou 5 lesões: 3 pólipos hiperplásticos(HP), 1 adenoma LGD 6-9 mm e 1 HP ≥ 10 mm. Daqui resultou uma sensibilidade para a CVde 98.4% e 100% para adenomas ≥ 6mm e adenomas com HGD e/ou transf. vilosa (adenomaspré-neoplásicos) ≥ 6 mm, respetivamente.

A CO obteve uma sensibilidade de 91.9% e 92.6% para todos os adenomas ≥ 6mm e adenomascom HGD e/ou transf. vilosa ≥ 6 mm, respetivamente, não tendo detetado 5 lesões, duas dasquais eram adenomas

29


Tabela 2.1 Comparação das caraterísticas por indíviduo e por pólipo da CV e da CO

Caraterísticas por indivíduo CV CO% (95% CI) N % (95% CI) N

Adenomas≥6 mm 98.1 (88.6-99.9) 52/53 90.6 (78.6-96.5) 48/53

6-9 mm 96.3 (79.1-99.8) 26/27 88.8 (69.7-97.1) 24/27≥10 mm 100.0 (84-100) 26/26 92.6 (74.2-98.7) 24/26

Adenomas com HGD e/ou transf. vilosa (adenomas pré-neoplásicos)

≥ 6mm 100.0 (86.7-100) 32/32 90.6 (73.8-97.5) 33/366-9 mm 100.0 (51.7-100) 6/6 88.9 (50.7-99.4) 8/9≥ 10mm 100.0 (84-100) 26/26 92.3 (73.4-98.6) 24/26

Caraterísticas por pólipo% (95% CI) N % (95% CI) N

Adenomas≥6 mm 98.4 (90.2-99.9) 61/62 91.9 (81.5-97) 57/62

6-9 mm 97.1 (83.4-99.9) 34/35 91.4 (75.8-97.8) 32/35≥10 mm 100.0 (84.5-100) 27/27 92.6 (74.2-98.7) 25/27

Adenomas com HGD e/ou transf. vilosa (adenomas pré-neoplásicos)

≥ 6mm 100.0 (88-100) 36/36 91.7 (76.4-97.8) 33/366-9 mm 100.0 (62.9-100) 9/9 88.9 (50.7-99.4) 8/9≥ 10mm 100.0 (84.5-100) 27/27 92.6 (74.2-98.7) 25/27

30


Quadro 2.9 Distribuição dos pólipos por segmento cólico

6-9 mm ≥ 10 mm Totais

CegoAdenomatoso 0 1 1Não adenomatoso 0 1 1

Cólon ascendenteAdenomatoso 7 2 9Não adenomatoso 4 3 7

Cólon transversoAdenomatoso 5 6 11Não adenomatoso 3 0 3

Cólon descendenteAdenomatoso 5 2 7Não adenomatoso 2 0 2

SigmoideAdenomatoso 13 12 25Não adenomatoso 9 0 9

RetoAdenomatoso 5 4 9Não adenomatoso 4 0 4

Totais 57 31 88Adenomatoso 35 27 62Não adenomatoso 22 4 26

31


2.5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

Neste estudo, a CV ponderada por teleradiologia provou ser eficiente no rastreio dum coortede 510 indivíduos de risco médio para o CCR, habitantes do Arquipélago da Madeira, comcerca de 250.000 habitantes. A amostra reflete as caraterísticas populacionais dos gruposetários estudados, em termos de idade, sexo e distribuição geográfica pelos concelhos daRAM, mimetizando os dados percentuais obtidos pelo censo de 2011.

A CV evidenciou um poder diagnóstico robusto com um alto grau de previsibilidade para apresença ou ausência de doença17. A CV diagnosticou todos os casos com lesões pré-neoplasicas ≥ 6 mm e 98.1% de indivíduos com adenomas ≥ 6 mm. Na base do diagnósticopor pólipo, a sensibilidade foi de 100% para os pólipos pré-neoplásicos e 98.4% paraadenomas ≥ 6 mm. A CV detetou mais adenomas ≥ 6 mm do que a CO e esta diferença foiestatisticamente significativa ( p=0.04).

É em geral aceite que estes bons índices só são conseguidos quando o estado da arte da técnicade colonografia por tomografia computorizada (CV) é aplicado por radiologistas experientesna sua execução e na sua leitura6. Neste rastreio, estas condições foram conseguidas através douso da teleradiologia que permitiu o envio das imagens, obtidas no Funchal, para um centrobelga de excelência.

Apesar da CV já ter sido considerada precisa no rastreio do cancro colorretal2-5, a avaliação dasua performance através do uso da teleradiologia para leitura das imagens, tanto quantosabemos nunca foi averiguada no contexto de um estudo de rastreio, com o departamentoradiológico local apenas realizando a execução da técnica. A decisão de assim termosprocedido tem subjacente o princípio da benevolência, no sentido de podermos ultrapassardificuldades logísticas locais, se a estratégia demonstrar eficácia na ultrapassagem de taisdificuldades. Esta decisão, associada à utilização da CO como exame de comparação em todosos indivíduos, permitiu-nos chegar a importantes observações. Em primeiro lugar, no presenteestudo, a CV atingiu uma alta sensibilidade utilizando um aparelho de TC de 6 cortes e cominterpretação primária 3D. Isto corrobora os resultados de Pickhardt e colaboradores2,confirmando que não é mandatória a existência de hardware de TC de alta tecnologia.Associadamente, a interpretação 3D parece ser crucial para obter bons resultados. Além disso,demonstrámos que a CV tem grande sensibilidade para lesões 6-9 mm. Em segundo lugar, ateleradiologia permitiu uma deteção fidedigna e segura de lesões polipóides por radiologistasexperientes localizados a grande distância. Isto sublinha o grande potencial da teleradiologiana disseminação desta subespecialidade20 e torna acessível a utilização da CV como mais umaopção no rastreio do CCR em locais com experiência insuficiente com a técnica, mesmo que

32

localizados em áreas remotas18,19. Alternativamente, a teleradiologia pode ser utilizada quercomo guia durante a curva de aprendizagem do jovem radiologista local, quer como meio deobtenção duma avaliação por especialista credenciado em problemas locais de diagnósticodifícil. Em terceiro lugar, a CV avaliou melhor que a CO e apresentou uma capacidadesignificativamente maior do que a CO de detetar um adenoma ≥ 6 mm (98.4% versus 91.9%,respetivamente), e esta diferença seria ainda maior se tivéssemos tido em conta os resultadosda CV de revisão. O desconhecimento dos resultados prévios da CV durante a realização daCO (absence of segmental unblinding na designação inglesa) pode ter tido uma influênciaprejudicial, eliminando o incentivo psicológico da pressão de não visualização duma lesãodescrita pelo exame anterior2,21,22. Finalmente, uma mais baixa sensibilidade da CO na deteçãode lesões do cólon direito é um fenómeno conhecido23-26. Combinando os cinco adenomas nãodiagnosticados pela CO com as 14 lesões confirmadas pela CV de revisão, 13 em 19 (68.4%)das lesões estavam localizadas no cólon direito.

Vários estudos têm demonstrado esta dificuldade de diagnóstico de lesões do cólon direito pelaCO. Hewett e Rex reexaminaram o cólon ascendente e o cego com o colonoscópio emretroflexão após uma CO inicial em 1000 indivíduos. Encontraram taxas de 4 e 12% de nãodiagnóstico, respetivamente, em adenomas 6-9 mm e ≥ 10 mm do cólon proximal27. Em 1731pacientes submetidos a CO de revisão um ano após a CO inicial, Laiyemo e colaboradoresdemonstraram que as lesões não detetadas ocorreram sobretudo no cólon proximal,sublinhando a importância duma inspeção meticulosa deste segmento28.

Os resultados do presente estudo são consistentes com os de uma meta-análise recente nadeteção do CCR pela CV, em que num total de 11151 pacientes se obteve uma sensibilidadede 96.1%29. Além disso, de acordo com esta meta-análise, a sensibilidade para o cancro foi de100% se os doentes tivessem sido preparados devidamente com catárticos e corantes fecais.Os autores concluíram que a CV poderia complementar a CO na deteção de cancros do cólondireito. Os dados do presente estudo também demonstraram que sempre que a CV deteta umalesão com grande probabilidade, todos os esforços devem ser feitos para que a CO confirme oachado. Nos casos negativos, estes indivíduos devem ser propostos para follow-up adequado.

Este estudo teve várias limitações. Uma delas foi a relativa falta de consistência do testepadrão, a CO, traduzida pelos casos positivos de CV confirmados posteriormente, quer pelaprópria CO, quer por cirurgia, fatos indiciadores que algumas lesões não terão sido detetadaspor ambos os exames.

Não foi feita uma caraterização das lesões diminutas (< 6 mm) e no sentido da identificação


33

das lesões planas (≤ 3 mm na CV e ≤ 2,5 mm na CO). Não se considerou relevante a suaindividualização porque no contexto de rastreio deve-se prioritizar lesões com período delatência relativamente longo.

Mas neste estudo, a prevalência de adenomas e de pólipos pré-neoplásicos é comparável aoutros coortes de rastreio3,4. De fato, a prevalência é até mais alta, se tivermos em conta osresultados da CV de revisão.

O envolvimento de mais Centros de Leitura de CV teria com certeza dado outra robustez aoestudo. Também provavelmente será necessário um estudo comparativo de leituras efetuadaslocalmente com leituras efetuadas por um centro de referência, que enalteça a melhoria daqualidade introduzida pelo uso da teleradiologia. Contudo, vários estudos prévios já provaram,suficientemente, a importância da experiência, donde se pode deduzir que a leitura feita porexperimentados através da teleradiologia ultrapassa em qualidade a leitura local feita porjovens radiologistas com pouca experiência 6,30.

Face à variabilidade de resultados, o uso em grande escala da CV na prática clínica diária édifícil, tendo em vista o treino intensivo necessário que obriga a um grande turnover derastreados. Além disso, na maioria dos países este método não tem ainda comparticipação dasinstituições públicas ou das companhias seguradoras, o que tem conduzido a pouca procura,utilização inadequada e resultados pouco satisfatórios7,8.

A teleradiologia oferece a oportunidade do acesso remoto a centros de excelência comradiologistas experientes9,10,61, conseguindo-se bons resultados na deteção de pólipos comexames realizados em regiões periféricas, tal como efetuado no presente estudo11,13. A CV estápronta para ser aplicada no rastreio em massa das populações sendo necessários resultadosrobustos de estudos multicêntricos que o confirmem.


3

Satisfação com os exames de Colonoscopia

37

ESEC

3. SATISFAÇÃO COM OS EXAMES DE COLONOSCOPIA

3.1 – INTRODUÇÃO

Em Portugal não há o hábito de medir a satisfação dos pacientes com os exames médicos. Naárea dos diversos exames colonoscópicos desconhecemos mesmo qualquer trabalho nacionalou internacional. A pesquisa bibliográfica conduz-nos invariavelmente para a análise de grausde satisfação com os serviços, atos médicos e com a perceção de doença, e não com as áreasde exames médicos propriamente ditos 1-3,5,6,8,11,15,17,19,21.

Começa a haver interesse e perceção da necessidade de se realizarem estudos neste campo,numa área de grande interesse em Saúde Pública, dada a evolução exponencial das incidênciae prevalência do CCR na população ocidental. A atualidade e interesse desta questão foiassinalada pela apresentação dum trabalho sobre satisfação com os exames de colonoscopia:Screening CT Colonography: Multicenter Survey of Patient Experience, Preference andImpact on Adherence, pelo grupo de trabalho do Professor Pickhardt no Congresso de 2011 daRadiological Society of North America (RSNA) (97º Congresso, Chicago).

Tanto na área da Clínica Médica como na área da Psicologia da Saúde verificamos um vaziona aplicação destes questionários de satisfação face aos diferentes exames das diversasespecialidades médicas25.

O conceito de satisfação tem sido mais desenvolvido na área da Psicologia Social, quer emrelação ao consumo, quer às diferentes áreas de desempenho profissional, donde parte,portanto, a sua conceptualização. Pode definir-se satisfação a partir do produto, como sendo onível de sentimento duma pessoa, tradutor das suas expectativas em relação a esse produto, ouentão a partir do estado cognitivo de adequação ou inadequação do produto às necessidades dosujeito 14.

O estado emocional pode também constituir uma medida para se classificar as diferentesformas de se obter satisfação. Oliver et al 14 propõe quatro reações-tipo face ao produto:

a) Contentamento, quando o consumidor conhece o resultado, mantendo omesmo nível de satisfação;

b) Prazer, quando o consumidor busca o prazer e o obtém, tornando-se maissatisfeito;

c) Encantamento, quando os resultados do processo de comparação ocorrem

38

ESEC

acima das expectativas, tornando o consumidor extremamente satisfeito;

d) Alívio, quando o consumidor deixa de estar insatisfeito.

Na conceptualização da satisfação pode-se identificar na literatura quatro grandes teorias:

1) Teoria da desconfirmação das expectativas (The Disconfirmation Paradigm, deWeaver e Brickman, 1974) 22, cuja ideia central parte do pressuposto que umindivíduo cria uma expectativa em relação a um determinado elemento (produto,serviço, relacionamento, etc.), posteriormente percebe que o facto real ocorreu (odesempenho) e faz uma comparação entre a expectativa e a sua perceção. Aofazer esta comparação, o sujeito pode ou não confirmar as suas expectativas,sendo a distância entre a expectativa e a perceção aquilo que leva ao sentimentode satisfação ou insatisfação;

2) Teoria da atribuição (Bitner, 1990) 7, em que a atribuição é o que as pessoaspercebem como sendo a causa do seu comportamento, do comportamento dosoutros ou dos eventos observados (Almeida 1999). Quando o indivíduo se sentesatisfeito, tende a atribuir a responsabilidade a si mesmo. Porém, quando ocorreinsatisfação, a maior probabilidade é que responsabilize os agentes externos emmaior ou menor grau. Weiner (1985) 20 classifica essa responsabilização em trêsdimensões:

a) A fonte do problema, interna ou externa;b) O controlo (houve intenção de provocar o problema?);c) A estabilidade (foi uma ocorrência isolada ou tende a repetir-se?);

3) Teoria da equidade (Equity Theory) 23,24, em que a satisfação surge quando umindivíduo percebe que o seu esforço para adquirir um produto ou serviço está emequilíbrio com o que lhe é dado.

Da conjunção da teoria da equidade com a teoria da atribuição, o nível desatisfação ou insatisfação está fortemente enraizado nos sentimentos positivos enegativos que o consumidor associa ao produto – gerando a Teoria daafetividade;

4) Teoria da dissonância cognitiva (Festinger 1975)1 0, baseia-se naincompatibilidade que pode surgir da perceção que o indivíduo tem de duas oumais das suas atitudes ou entre o seu comportamento e as suas atitudes. Sendo

39

ESEC

que a dissonância provoca incómodo, esta pode ser desencadeada quando oindivíduo não perceciona como justa a comparação entre o produto e o seu valor.

Ao analisarmos a satisfação, tomando como produto os exames médicos de colonoscopias,procurámos avaliar as seguintes dimensões:

a) Expetativas dos sujeitos em relação à CO e à CV;

b) Sentimentos desencadeados por estas;

c) Perceção da eficácia das mesmas;

d) Importância da informação que se tem dos exames;

e) Avaliação comparativa das duas colonoscopias.

Tal como referimos anteriormente, a ausência de instrumentos que nos permitissem avaliar adimensão da satisfação com ambos os exames colonoscópicos, obrigou-nos à necessidade decriar, em primeiro lugar, uma Escala de Satisfação com os Exames de Colonoscopias (ESEC)- Estudo 1, para sequencialmente estudarmos a reação dos participantes aos exames, aplicadapor Psicólogas, cerca de 30 minutos após a realização de ambos os exames clínicos.

40

ESEC

3.2 ESTUDO 1 - ANÁLISE FATORIAL DE COMPONENTES PRINCIPAIS DOQUESTIONÁRIO DE SATISFAÇÃO COM OS EXAMES DE COLONOSCOPIAS(ESEC)

A ESEC foi construída para a realização deste trabalho de investigação. A necessidade deconstrução e utilização de uma escala de satisfação no estudo justifica-se, uma vez que, naopção pelo exame de rastreio a utilizar, a controvérsia é enorme porque nenhum dos testes éideal. Além disso, nos critérios de seleção do exame de rastreio, há que ter em conta, não só aeficácia de cada um dos testes dum ponto de vista médico, mas também o seu impacto dumponto de vista psicológico.

A ESEC tem como principal objetivo compreender a satisfação que os indivíduos sujeitos aexames de CO ou CV têm em relação a cada uma das técnicas, a preferência que têm entreelas, assim como compreender a ansiedade e receios dos indivíduos a estes exames. A ESECcontinha inicialmente 27 itens (Anexo 8), ponderados numa escala de Likert de 4 pontos(1=discordo muito, 2= discordo, 3= concordo, 4= concordo muito). Procurou-se que a escalamedisse todos os aspetos ligados aos exames, desde os aspetos dolorosos, à eficácia dastécnicas, à ansiedade e medos, à informação que se tem dos exames e a importância que estatem para a realização destes.

Os itens foram formulados tanto na positiva como na negativa, tendo sempre o cuidado daformulação ser idêntica para as técnicas, por exemplo, o item 5 “Não me custou fazer o examede CO” e o item 7 “Não me custou fazer o exame de CV”, ou o item 8 “Senti-me ansiosoenquanto estava a fazer o exame de CV” e o item 21 “Senti-me ansioso enquanto estava a fazero exame de CO”. Teve-se igualmente o cuidado de que os itens fossem desalinhados de modoa não serem seguidos itens que avaliassem o mesmo exame ou o mesmo aspeto, em ambos osexames. Começou-se primeiro por perguntas mais ligeiras, como o item 1 “Foi fácil fazer apreparação para estes exames” ou o item 2 “Não senti qualquer efeito da medicamentaçãousada para me preparar para estes exames”, para depois se passar para itens de maiorprofundidade, como o item 11 “Enquanto estive a fazer o exame de CV tive pensamentosnegativos” ou o item 14 “Tive receio quando me estavam a fazer o exame de CO”.

3.2.1 Amostra e Metodologia

Para a validação desta escala analisaram-se os primeiros 426 sujeitos, 257 do sexo feminino

41

ESEC

(60.3%) e 169 do sexo masculino (39.7%), com idades compreendidas entre os 50 e os 74 anos(M= 60.5 e DP= 6.5). Os participantes foram primeiro submetidos ao exame de CV e depoisao exame de CO. Findos os exames médicos, descansaram pelo menos 30 minutos e só depoisresponderam à escala de satisfação. A ESEC foi aplicada por técnicos licenciados empsicologia e especificamente treinados para trabalhar com a escala. Em primeiro lugar eramlidas as instruções de aplicação da escala aos participantes e depois o técnico lia em voz altacada uma das questões e registava as respostas. Sempre que necessário foram prestados osesclarecimentos solicitados pelos participantes.

3.2.2 Apresentação dos resultados relativos à validade

Para o exame da validade de constructo procedemos à análise fatorial de componentes dositens. Previamente à análise fatorial calculamos o coeficiente KMO. O valor de KMO de 0,804permite-nos concluir da boa qualidade das correlações entre os itens que formam oquestionário. Estavam reunidas as condições para a aplicação da análise fatorial.

Da análise de componentes principais, seguida de rotação varimax, obtiveram-se 9 dimensões,mas apenas analisamos as cinco primeiras dimensões que explicam 60.29% da variância total.

A primeira dimensão explica 16.05% da variância, e engloba 4 itens (itens 3, 5, 10 e 19),relacionados com aspectos positivos do exame de CO e que podemos denominar porsatisfação com o exame de CO (Quadro 3.1).

A segunda dimensão compreende 5 itens (itens 4, 8, 16, 21 e 26), que se relacionam com aansiedade com que os sujeitos enfrentam este tipo de exames médicos (12.9 % da variância),e por isso se designa ansiedade face aos exames (Quadro 3.2).

19. O exame de CO não é doloroso de fazer

5. Não me custou fazer o exame de CO

3. Senti-me bem enquanto durou o exame de CO

10. Prefiro fazer o exame de CO do que o de CV

Quadro 3.1 Itens que compõem a primeira dimensão: Satisfação com a CO

42

ESEC

21. Senti-me ansioso enquanto estava a fazer o exame de CO

4. Estava nervoso quando estava à espera que me chamassem para estes exames

16. Não vinha descontraído quando vim para estes exames

8. Senti-me ansioso enquanto estava a fazer o exame de CV

26. Pensei em muitas coisas enquanto esperava para realizar estes exames

Quadro 3.2 Itens que compõem a segunda dimensão: Ansiedade face à CV e à CO

A quarta dimensão, com 4 itens (itens 11, 14, 20 e 25), congrega aspetos relacionados com osmedos em relação a estes exames médicos (10.6 % da variância), e por tal designada receiosface aos exames (Quadro 3.4).

A terceira dimensão junta 3 itens (itens 15, 7 e 18) relacionados com os aspetos negativos da

CV (12.3 % da variância), e que podemos denominar como Satisfação com a CV (Quadro

3.3).

15. O exame de CV não é doloroso de fazer

7. Não me custou fazer o exame de CV

18. Senti-me bem enquanto durou o exame CV

Quadro 3.3 Itens que compõem a terceira dimensão: Satisfação com a CV

Quadro 3.4 Itens que compõem a quarta dimensão: Receios face à CV e à CO

25. Enquanto estive a fazer o exame de CO tive pensamentos negativos

11. Enquanto estive a fazer o exame de CV tive pensamentos negativos

20. Tive receio quando me estavam a fazer o exame de CV

14. Tive receio quando me estavam a fazer o exame de CO

43

ESEC

Por último, a quinta dimensão conta com 2 itens (itens 9 e 13), ligados à eficácia das técnicas,e pode ser por isso denominada perceção da eficácia das técnicas (8.44 % da variância)Quadro 3.5).

As restantes quatro dimensões encontradas, apesar de contribuírem para compreender avariância da resposta dos sujeitos, quando se foi analisar a consistência destes agrupamentosverificou-se que a mesma era baixa (alphas de Cronbach ≤ 0.6), pelo que optou-se por retirá-las da escala. Assim, foram excluídos 8 itens (item 1, 2, 6, 12, 17, 22, 23 e 27) ( Quadro 3.6).

Quadro 3.5 Itens que compõem a quinta dimensão: Perceção da eficácia da CV e da CO

13. Acho que o exame de CV é eficaz

9. Acho que o exame de CO é eficaz

Quadro 3.6 Itens retirados da escala

1. Foi fácil fazer a preparação para estes exames

2. Não senti qualquer efeito da medicamentação usada para me preparar para estes

exames

6. Compreendi bem as instruções que me foram dadas para me preparar para este

exame

12. As instruções que o médico me deu enquanto fazia os exames foram importantes

para me relaxar

17. Ter ar nos intestinos não me incomodou na CO

22. Sabia o suficiente sobre os exames antes de os realizar

23. A informação sobre o que nos vão fazer durante os exames é importante

27. Ter ar nos intestinos não me incomodou na CV

44

ESEC

3.2.3 Dados relativos à precisão

Para a análise da coerência existente nas respostas dos sujeitos aos itens da ESEC, foi usado ocoeficiente alfa de Cronbach. Na análise feita a cada uma das dimensões encontradas, osvalores obtidos são aceitáveis (0.63< alfa Cronbach <0.79). Apesar da precisão consideradaapropriada ser superior a 0.7, certos autores, como DeVellis (1991, citado por Maroco &García-Marques, 2006) 12 consideram que em “cenários de investigação das ciências sociais,um alfa de 0.60 é aceitável, desde que os resultados obtidos com esse instrumento sejaminterpretados com precaução (Tabela 3.1).

Tabela 3.1 Valores do alpha de Cronbach das diferentes dimensões

Dimensão Alpha de Cronbach

Satisfação com a CO 0.79

Ansiedade face aos exames médicos 0.72

Satisfação com a CV 0.67

Receios face aos exames médicos 0.63

Perceção da eficácia dos exames médicos 0.67

45

ESEC

3.3 ESTUDO 2 - ANÁLISE ESTATISTICA DE COMPONENTES PRINCIPAIS DOQUESTIONÁRIO DE SATISFAÇÃO COM OS EXAMES DE COLONOSCOPIAS(ESEC)

3.3.1 Amostra

A amostra deste estudo é constituída por 496 sujeitos, 295 do sexo feminino (59.5%) e 201 dosexo masculino (40.5%), com idades compreendidas entre os 50 e os 74 anos de idade (média=60.24, sd= 6.44), recrutados aquando da participação no rastreio do CCR.

3.3.2 Procedimentos

À semelhança do primeiro estudo, a ESEC foi aplicada por técnicos de psicologia, meia horaapós a realização de ambos os exames médicos. As instruções das escalas e as perguntas eramlidas aos participantes pelo técnico e as respostas anotadas pelos mesmos. Quando necessárioforam prestados os esclarecimentos solicitados pelos participantes.

3.3.3 Apresentação dos resultados

3.3.3.1 Estatística Descritiva

A leitura dos resultados foi feita tendo em conta as cinco dimensões da escala de ESEC(Tabela 3.2).

Em relação à satisfação com o exame de CO podemos afirmar que os indivíduos estãodivididos, pois se a tendência dos participantes (moda =4) é afirmar que não é doloroso realizareste exame, a maioria 54.1 % discorda ou discorda muito com esta afirmação. De igual modo,apesar de 52.5% dos participantes afirmarem não ter sido custosa a realização da CO, e ser estaa principal tendência (moda= 4), uma grande percentagem (47.5%) discorda ou discorda muitodesta afirmação. Já a maioria dos participantes (37.9%, moda =1), prefere não fazer a CO emdetrimento do exame de CV. Em relação à CO, os participantes só são mais unânimes aoafirmarem terem-se sentido bem a realizar este exame (44.2%, moda=4).

4646

ESEC

O exame de CO não é doloroso de fazer

Não me custou fazer o exame de CO

Senti-me bem enquanto durou exame CO

Prefiro fazer o exame de CO do que o CV

O exame de CV não é doloroso de fazer

Não me custou fazer o exame de CV

Senti-me bem enquanto durou exame CV

Senti-me ansioso enquanto estava a fazero exame de CO

Estava nervoso/a quando estava à esperaque me chamassem para estes exames

Não vinha descontraído quando vim fazerestes exames

Senti-me ansioso enquanto estava a fazero exame de CV

Pensei em muitas coisas enquantoesperava para realizar estes exames.

Enquanto estive a fazer o exame de CVtive pensamentos negativos

Tive receio quando me estavam a fazer oexame de CV

Enquanto estive a fazer o exame de COtive pensamentos negativos

Questões

Percentis

496 2 4 2 4 22,0 32,1 13,7 32,3

496 3 4 2 4 16,7 30,8 20,2 32,3

496 3 4 2 4 11,1 17,1 27,6 44,2

496 2 1 1 3 37,9 17,5 20,2 24,4

496 3 4 2 4 4,8 29,0 18,3 47,8

496 3 2 2 4 8,9 36,1 23,2 31,9

496 4 4 3 4 3,0 11,1 30,8 55,0

496 1 1 1 3 54,8 12,1 25,0 8,1

496 2 1 1 3 48,2 9,5 29,2 13,1

496 1 1 1 2 59,3 20,0 13,1 7,7

496 2 1 1 3 46,4 10,5 32,3 10,9

496 1 1 1 2 65,5 11,7 14,1 8,7

496 1 1 1 1 82,7 8,3 6,5 2,6

496 1 1 1 1 81,5 8,7 7,5 2,4

496 1 1 1 1 78,0 8,5 11,5 2,0

Tive receio quando me estavam a fazer oexame de CO

496 1 1 1 3 64,1 9,7 19,4 6,9

Acho que o exame de CV é eficaz 496 4 4 3 4 0,2 1,6 39,5 58,7

Acho que o exame de CO é eficaz 496 4 4 3 4 0,4 0,4 27,2 72,0

N25 75

Percentagem

Tabela 3.2 Mediana, moda, percentis, percentagens itens da ESEC agrupados pelas escalas

47

ESEC

Já em relação ao exame de CV, os participantes parecem ser mais unânimes: 66.1% (moda =4)afirmam concordar ou concordar muito que este exame não é doloroso de ser efetuado, e85.8% concorda ou concorda muito que se sentiram bem na sua realização. Apesar da maiortendência (moda=2), ter sido a de afirmar que não concordavam que o exame da CV nãocustou fazer, a maioria dos participantes (55.1%) concorda ou concorda muito que não custoufazer este exame.

Os participantes nos diferentes itens que se relacionam com a ansiedade face aos examesdizem não ter sentido ansiedade com a realização destes (moda=1, em todos os itens, 48.2%-65.5%). O mesmo se passa em relação aos medos, a maioria nos itens relacionados com esteassunto diz não ter tido receios durante os exames (moda=1, em todos os itens, 64.1% -82.7%).

Os participantes percecionam ambos os exames como sendo eficazes (moda=4), sendo que58.7% e 72.0% destes entendem a CV e a CO como exames eficazes, respetivamente.

Se optarmos por fazer uma média dos itens para as duas primeiras dimensões como indicativasda satisfação com os exames da CO e da CV, vemos que a média para a dimensão 1 (satisfaçãocom o exame de CO) é de 2.6, o que pode indicar que os participantes estão satisfeitos com omodo como correu a realização deste exame. Da mesma maneira, a média dos itens da segundadimensão (média=2.8), satisfação com o exame de CV, indica que os participantes tambémestão satisfeitos com este exame.

48

ESEC

3.3.3.2 Satisfação em relação à CO e CV

A análise de satisfação CO e CV com a aplicação de teste T - Student para amostrasemparelhadas (Tabela 3.4), mostra que existem diferenças significativas entre estes doisexames (t = - 6.17, p= 0.00), sendo que o exame de CV apresenta uma média de satisfaçãomais elevada, permitindo dizer que os participantes estão mais satisfeitos com este exame.

Tabela 3.3 Análise comparativa da satisfação com CO e CV com teste T - Student paraamostras dependentes

3.3.3.3 Influência das variáveis género, idade e estatuto socioeconómico

Nesta seção analizou-se a forma como o género, a idade e o estatuto socioeconómico dosparticipantes são ou não importantes para compreendermos a satisfação com os exames de COou de CV, e as ansiedades e receios que manifestam em relação a ambos os exames. Achámosimportante analisar estas variáveis para podermos avaliar da possibilidade de homogeneizaçãodos exames.

No que diz respeito ao género verificámos que este influencia a forma como os participantesavaliam a sua satisfação com a CO, assim como a ansiedade e receio que têm em relação aosdois exames (Tabela 3.4). Ambos os géneros encontram-se mais satisfeitos com a CV do quecom a CO, sendo que os homens dizem-se estar mais satisfeitos com a CO, enquanto que asmulheres manifestam mais ansiedade e receios em relação a ambos os exames.

SD - desvio padrão, Mean - média, t - valor de teste T-Student, df - graus de liberdade, Sig. - significância

Paired Differences

95% Confidence

Interval of the

Difference

Mean Std. Std. Error

Deviation Mean Lower Upper t df Sig. (2 tailed)

Satis CO -.24081 .80553 .03903 -.31752 -.16409 -6.170 425 .000Pair 1

Satis CV

49

ESEC

Tabela 3.4 Média, desvio padrão e T - Student da satisfação com a CO ou com a CV, daansiedade, receio e eficácia da CO e da CV, em função do género

Feminino MasculinoDimensões t df Sig. (2-

tailed)Média Desvio Média Desvio

Padrão Padrão

Satisfação CO 2.4237 .87172 2.9826 .81299 -7.202 494 .000

Satisfação CV 3.0859 .73113 3.0796 .70021 .095 494 .924

Ansiedade CV e CO 1.9329 .73083 1.7841 .70267 2.261 494 .024

Receio CV e CO 1.4653 .57316 1.3433 .51509 2.423 494 .016

Eficácia CV e CO 3.6525 .45601 3.6144 .42935 .936 494 .350

<55 55-59 60-64 65-69 70-74 ANOVADimensões

M DP M DP M DP M DP M DP F. Sig.

Satisfação CO 2.68 0.84 2.78 0.93 2.74 0.92 2.47 0.85 2.44 0.93 2.460 .032

Satisfação CV 2.01 0.72 1.86 0.72 1.91 0.71 1.94 0.76 1.85 0.66 2.061 .069

Ansiedade CV e CO 1.75 0.69 1.86 0.71 1.99 0.73 1.96 0.76 1.77 0.68 1.792 .113

Receio CV e CO 1.30 0.43 1.45 0.58 1.48 0.64 1.48 0.57 1.46 0.52 2.183 .055

Eficácia CV e CO 3.64 0.44 3.65 0.44 3.66 0.41 3.63 0.50 3.59 0.46 .358 .877

Tabela 3.5 Média, desvio padrão e T - Student da satisfação com a CO ou com a CV, daansiedade, receio e eficácia da CO e da CV, em função da idade (anos)

DP - desvio padrão, M - média, t - valor de teste T-Student, df - graus de liberdade, Sig. - significância

DP - desvio padrão, M - média, F - teste de Fisher, Sig. - significãncia

Para a análise da idade, foram definidas categorias com intervalo de 5 anos, de modo a termosuma distribuição homogénea dos sujeitos por cada uma delas. A variável idade parece sóinfluenciar a forma como os participantes estão satisfeitos com o exame de CO, verficando-seque os participantes mais jovens (idade < a 55 anos) parecem estar menos satisfeitos com esteexame (Tabela 3.5).

LSD

55-59>65-69

60-64>65-69

50

ESEC

Classe I Classe II Classe III Classe IV ANOVA

M DP M DP M DP M DP F Sig.

Satisfação CO 2.45 0.81 2.67 0.87 2.74 0.90 2.61 0.91 1.35 0.26

Satisfação CV 2.01 0.70 1.93 0.69 1.90 0.78 1.89 0.69 0.34 0.80

Ansiedade CV e CO 1.69 0.65 1.88 0.64 1.83 0.75 1.95 0.76 1.82 0.14

Receio CV e CO 1.29 0.36 1.41 0.54 1.40 0.58 1.45 0.57 1.04 0.38

Eficácia CV e CO 3.53 0.47 3.62 0.43 3.65 0.49 3.67 0.41 1.26 0.29

Tabela 3.6 Média. desvio padrão e T Student da satisfação com a CO ou com a CV, daansiedade, receio e eficácia da CO e da CV, em função do estatutosócioeconómico

No estudo do estatuto socioeconómico utilizamos a escala de Graffar (1956) (anexo 9). Parecenão influenciar nem a satisfação com ambos os exames (CO ou CV) nem a ansiedade, receiose eficácia dos mesmos (CO e CV) (Tabela 3.6)

DP - desvio padrão, M - média, F - teste de Fisher, Sig. - Significância

Dimensões

51

ESEC


Como já referido, a ausência de instrumentos específicos impôs que tivéssemos de construiruma escala de avaliação da satisfação para as colonoscopias. Depois de sucessivas avaliaçõescríticas que impuseram a eliminação de alguns items incluídos no modelo inicial, adoptamoscomo instrumento para este objetivo específico a escala apresentada na Tabela 3.2, que incluia análise de resultados obtidos, de acordo com variáveis valorizadas pelos modelos teóricos desatisfação 4, 5, 10, 22, 23, 24, nomeadamente a emocionalidade e a perceção da eficácia: satisfaçãocom a CV, satisfação com a CO, a ansiedade e os receios face aos exames e a perceção daeficácia.

Os rastreados não valorizaram a informação detalhada sobre o funcionamento das técnicas, ouseja, informação mais cognitiva que lhes foi fornecida parece não ter sido preponderante paraa avaliação da satisfação. Por tal, houve necessidade de retirar da escala os items relacionadoscom a importância da detenção de informação sobre os exames médicos. Relativamente àprecisão da escala e como já foi referido anteriormente, os resultados são apenas satisfatórios,o que nos levou a fazer sempre uma leitura cuidada das opiniões dos participantes.

Na generalidade, os indivíduos manifestaram uma valorização de ambos os exames,salientando os aspetos positivos e relativizando os aspetos negativos. Tratando-se de umrastreio gratuito e tendo em conta comentários que foram registados ao longo das entrevistas,podemos pensar que este fato enviesou as suas opiniões. Será importante em futuros estudostentar controlar esta variável. Contudo, dado que a valorização influenciou ambos os exames,é nossa convicção que continuava a ser pertinente a leitura comparativa dos resultados.Adicionalmente, faz parte do protocolo da realização duma CO a administração defarmacoterapia redutora do mal-estar provocado pelo exame. Usou-se uma benzodiazepinahidrossolúvel, de metabolização rápida e sem metabolitos intermediários, que proporcionaamnésia retrógrada, tornando-a uma droga cómoda para uso em ambulatório. Ao contrário daCO, no protocolo da CV não é utilizada qualquer medicação, razão porque, apesar do intervalode espera de trinta minutos antes da passagem do questionário de satisfação, este fato podetambém ter distorcido a opinião dos participantes. Apesar de todas estas limitações, osresultados permitem-nos concluir que existe uma tendência significativa para os rastreadosestarem mais satisfeitos com a CV (Tabela 3.3).

Houve diversidade de comportamentos nos dois géneros, apesar de ambos preferirem a CV emdetrimento da CO. Os homens manifestaram preferência pela CO e as mulheres referiram maisansiedade e receios perante os dois exames. Por outro lado, os participantes mais jovens, com

52

ESEC

idades inferiores a 55 anos, mostraram-se menos satisfeitos. Na verdade, muitos fatores podeminfluenciar a satisfação dos indivíduos. Várias teorias psicológicas têm sido usadas paraexaminar a influência das preocupações de saúde na aderência ao tratamento de váriasdoenças, verificando-se muitas vezes diferenças entre sexos e idades 1, 9, 13, 18, pelo que nestedomínio julgámos adequado apresentar alguns resultados.

Das várias teorias, o modelo de Crença sobre a Saúde (health belief model) 5 e a teoria docomportamento planeado4 têm sido as mais usadas e têm fornecido algumas informações úteis.A primeira teoria propõe que os indivíduos com preocupações de saúde sobrepõem osbenefícios da sua ação ou das suas decisões à ansiedade e aos receios de possíveiscomplicações. No presente estudo, isto explicaria a menor resistência e a maior complacênciados homens em relação à CO. A teoria do comportamento planeado, por outro lado, descrevea ação como secundária à intensão, que por sua vez é dependente da emocionalidade e daopinião de terceiros, sendo que no nosso estudo as mulheres foram mais suscetíveis a estesfatores.

Porque a satisfação dos rastreados é fundamental para o êxito e sucesso dos rastreios em geral,e do CCR em particular, é nosso entendimento que isto seja um aspeto a estudar maisprofundamente em trabalhos futuros.

4

Significado epidemiológico dos Programas de Rastreio e sua importância em Saúde Pública

Epidemiologia

55

4.1 Introdução

Um dos grandes avanços na medicina contemporânea é a capacidade de previsibilidade. Oestudo epidemiológico dos fatores condicionantes e determinantes do processo saúde-doençana população humana permitiu o desenvolvimento da Medicina Preventiva (prevençõesprimária, secundária e terciária) e de estratégias eficazes para promoção dum maior bem-estarfísico-psíquico e de uma maior longevidade dos indivíduos, no âmbito da Saúde Pública.Paralelamente, o controle dos fatores de risco de doença tem permitido importantes reduçõesnas intervenções socioeconómicas para a diminuição da pobreza, melhoria das condições devida e desenvolvimento do saneamento básico do meio ambiente

1,2,3.

A utilização de programas de rastreio eficientes e fáceis de aplicar, incruentos ou poucocruentos, de baixo custo e bem aceites pelas populações, insere-se na estratégia de viabilizaçãoe manutenção duma política de Saúde Pública assente na previsão e no controle antecipado deeventos pré-patológicos, com grande economia dos custos sociais e financeiros. Todos osestudos de investigação que se traduzam na criação de rastreios que respondam a estes quesitossão bem-vindos, positivos e de grande utilidade.

4.2 Abordagem epidemiológica à avaliação dos programas de rastreio

Um dos campos da Epidemiologia é a avaliação da efetividade dos programas de rastreio paraa deteção precoce da doença, como atividade de prevenção secundária. Deteção precoce dadoença significa deteção numa fase pré-sintomática anterior àquela em que seria normalmentedescoberta na prática clínica, quando o indivíduo ainda não tem queixas clínicas (sintomas esinais) e por isso, não tem razões para procurar cuidados médicos. Ao realizarem-se rastreiosassume-se que existe uma intervenção apropriada, e que podem ser tanto mais eficazes se adoença for detetada numa fase precoce, e se vários quesitos, adiante descriminados, foremsatisfatoriamente resolvidos.

Epidemiologia

56

4.2.1 História natural da doença

Para discutir as questões metodológicas da avaliação dos benefícios do rastreio, temos queanalisar detalhadamente a história natural da doença

3,4, esquematizada na Figura 4.1. O período

que antecede o início biológico da doença, em que o indivíduo é saudável/sem a doença, deveser aproveitado para a prevenção primária (controle dos fatores de risco, eliminação das causasgeradoras de doença, imunização). No seu início biológico, molecular ou celular, a doença éainda indetetável, o que corresponde à fase pré-clínica, de duração variável. O aparecimentodos primeiros sinais e sintomas indiciam o avanço para a fase clínica, também de duraçãovariável, e durante a qual ocorre o diagnóstico e o início do tratamento apropriado.

Durante a fase pré-clínica, a partir de um certo momento a doença é detetável por um teste derastreio. O tempo que medeia desde o diagnóstico por rastreio até ao aparecimento dosprimeiros sintomas denomina-se fase pré-clínica detetável da doença (período da prevençãosecundária). Quando a doença é detetável por rastreio, o diagnóstico é deslocado para umponto anterior na história natural da doença. Esta antecipação (lead time) define-se como ointervalo de adiantamento do momento habitual do diagnóstico.Outro conceito importante emrastreio é o de pontos críticos da história natural da doença, antes dos quais o tratamento é maisefetivo, menos difícil de administrar e a doença é provavelmente curável. O ponto crítico é umconceito teórico difícil de localizar na história natural da doença, mas é o fundamento dorastreio e da deteção precoce.

Há um benefício potencial do rastreio, se assumirmos que a maior parte dos casos clínicospassam por uma fase pré-clínica detetável e que na ausência de intervenção na fase pré-clínica,progridem para a fase clínica. Aliás, não há indicação para efetuar testes de rastreio periódicosse: i) nenhum dos casos pré-clínicos evoluir para a fase clínica; ii) nenhum dos casos clínicospassar por uma fase pré-clínica; iii) a fase pré-clínica for tão curta que é pouco provável que adoença seja detetada; iv) ocorrer regressão espontânea das doenças, sem evolução para a faseclínica.

Epidemiologia

57

Epidemiologia

58

4.2.2 Desenho de estudos para avaliação de rastreios2,3

Estudos aleatorizados

São os de maior relevância epidemiológica e os que fornecem maior grau de evidência clínica,além de nivelarem os resultados de estratos sociais e raciais diversos. Da amostra populacionalselecionada aleatoriamente, metade é sumetida a rastreio e a outra metade não é rastreada. Sãodispendiosos, difíceis de preparar e na prática, difíceis de implementar.

Estudos não aleatorizados coorte

A maioria dos estudos de programas de rastreio usa um desenho de coorte, em que um grupode pessoas rastreadas é comparado com um grupo de pessoas não rastreadas. Podem apresentarvários vieses. O viés de voluntarismo é um viés de seleção criado por indivíduos ansiosos, masmotivados e sobreavaliados medicamente, que se oferecem frequentemente para participarnestes projetos. Por isso, a comparação entre participantes e não participantes não é geralmenteuma estratégia aconselhável para avaliação dum teste de rastreio. Outro viés é a possibilidadedos testes detetarem doenças de melhor prognóstico por terem fases pré-clínica e clínica maislongas que as de pior prognóstico. Em oposição, aparecem casos de intervalo que escapam aostestes de rastreio regulares. Estes evidenciam uma progressão rápida e agressiva da doença,com fases pré-clínica e clínica curtas e alta letalidade. O viés de antecipação do diagnósticopor rastreio pode determinar falsas sobrevivências aos cinco anos (a sobrevivência no grupode rastreio tem que ser superior à sobrevivência do grupo de controlo, adicionada ao períodode antecipação). Outro enviesamento potencial é o do sobrediagnóstico, devido ao entusiasmode quem executa o rastreio e que conduz a uma taxa alta de falsa positividade, econsequentemente, a uma estimativa inflacionada de sobrevivência.

Estudos não aleatorizados caso-controlo

Tem-se utilizado também o desenho caso-controlo, em que indivíduos com doença avançada(casos), rastreados e não rastreados anteriormente, são comparados com indivíduos comdoença inicial ou sem doença, (controlos), rastreados ou não rastreados anteriormente eprovenientes da mesma população dos casos avançados. Avaliamos a história de realização dorastreio tanto nos casos avançados como nos controlos, e este será efetivo se tiver uma maiorprevalência nos controlos, com uma razão de possibilidades (odds ratio) e respetivo intervalode confiança a 95% inferiores a 1.0.

Epidemiologia

59

4.3 Avaliação da validade e fiabilidade dos testes de rastreio2,3

Quando avaliamos uma determinada população, não sabemos quem tem ou quem não temdoença, e se esta dicotomia já estivesse estabelecida os testes deixariam de ter sentido. Paradeterminarmos quantitativamente a sensibilidade e a especificidade dum teste de rastreio oude diagnóstico, temos que ter um teste gold standard como fonte de verdade e com o qualcomparamos os resultados dos exames.

A validade dum teste define-se como a sua capacidade de distinguir entre quem tem doença equem a não tem, e traduz-se por duas componentes:

i. Sensibilidade, a capacidade de identificar corretamente os indivíduos que têm doença,ou melhor, a proporção de pessoas afetadas pela doença que foram corretamenteidentificadas como verdadeiros positivos pelo teste;

ii. Especificidade, a capacidade de identificar os indivíduos que não têm doença, ou melhor,a proporção de pessoas não afetadas pela doença que foram corretamente identificadascomo verdadeiros negativos pelo mesmo teste.

A sensibilidade e a especificidade têm grande interesse em Saúde Pública, mas na práticaclínica a questão define-se com as seguintes perguntas: se o resultado dum teste é positivo numdeterminado indivíduo, qual a probabilidade do mesmo ter a doença? A resposta é dada pelovalor preditivo positivo (PPV) do teste. Mas se o resultado for negativo, qual a probabilidadeda pessoa não ter a doença? A resposta é dada pelo valor preditivo negativo (NPV). Nocontexto do presente estudo, o PPV representa a probabilidade dum indivíduo que obteve umaCV+, obter uma posterior CO+; pelo contrário, o NPV representa a probabilidade dumrastreado que obteve uma CV-, obter uma posterior CO-. A Tabela 4.1 esquematiza todos osresultados e as variáveis que se podem obter para qualificar um teste de rastreio.

Epidemiologia

60

+

VPac

FN

-

FPbd

VN

Doença

+

-

Sensibilidade = Especificidade =aa + c

db + d

PPV = NPV =aa + b

dc + d

LH+ = LH- =

aa + c

bb + d

ca + c

db + d

Tabela 4.1 Tabela de duas entradas, com os quatro resultados possíveis e as variáveis quequalificam um teste de rastreio

Epidemiologia

61

Tabela 4.2 Tabela de duas entradas para avaliação da CV em pólipos ≥ 6 mm (IC a 95%)

+

66ac

3

-

26bd

401

Pólipos ≥ 6 mm

+

-

PPV = NPV =V PV P + F P

V NV N + F N

Sensibilidade =

Especificidade =

aa + c

6 66 9 0 . 9 5= =

db + d

4 0 14 2 7 0 . 9 3

15.71s e n s i b i l i d a d e

proporção de FP entre os casos negativos

=

= = =

=

LH+ =

aa + c

bb + d

0.9526

427

0.05proporção de FN entre os casos positivos

e s p e c i f i c i d a d e= = =LH- =

ca + c

db + d

369

0.93

Acuidade (accuracy) = Nr. casos concordantesNr. casos da amostra

4 6 14 9 6 0 . 9 3= =

Nota: Estes resultados são discutidos no capítulo 2

Epidemiologia

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A Tabela 4.2 exemplifica o esquema da Tabela 4.1 utilizando valores do presente projeto deinvestigação e referentes aos resultados da CV em relação aos pólipos ≥ 6 mm.

Quando a sensibilidade sugere a existência duma lesão, se LH (Razão de verossimilhança –Likelihood ratio) é positiva, a probabilidade de que esta lesão exista é tanto maior quanto maisalto é o valor de LH+. LH+ indica quanto vale a sensibilidade, tendo em conta a proporção defalsos positivos. LH- qualifica a especificidade, tendo em conta a proporção de falsosnegativos.

.A Precisão ou acuidade é a razão entre o número de casos concordantes (CV+,CO+ e CV-+CO-) e o número total de casos da amostra.

Ao contrário da sensibilidade e da especificidade, que são características do teste que está a serusado, o PPV é afetado por dois fatores:

i. Quanto mais alta é a prevalência da doença na população submetida ao rastreiomaior é o valor de PPV;

ii. Quanto mais baixa é a prevalência da doença, a especificidade aumenta o valor dePPV.

Um programa de rastreio é mais eficiente se aplicado a uma população de alto risco (altaprevalência), mais motivada para participar e mais disponível para aderir às recomendações seos resultados forem positivos. Assim, os resultados de qualquer teste devem ser interpretadosno contexto da prevalência da doença na população onde o indivíduo se encontra inserido. Poroutras palavras, um teste com PPV alto tem um valor se aplicado numa população de alto risco,mas não tem o mesmo valor e significado se aplicado numa população de baixo risco, pelo queo PPV deverá ser modelado pelo valor de baixa prevalência desta segunda população. Nocontexto do presente estudo, em que se avaliou uma população de risco médio, o valor alto daespecificidade (0,93), em consequência da maioria dos rastreados se encontrar na célula d(VN=401), valoriza o valor alto do PPV encontrado. Garantidamente, a especificidade tem ummaior efeito no PPV do que a sensibilidade.

O ideal seria que todos os rastreados estivessem totalmente distribuídos pelos VP e VN, o quena prática não acontece. Alguns indivíduos que não têm a doença são erradamente designadospelo teste como positivos – falsos positivos, e alguns indivíduos que têm a doença sãoerradamente designados como negativos – falsos negativos. Qual a importância destes

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resultados?:

i. Todos os rastreados com resultados positivos são levados a fazer testes maissofisticados e dispendiosos, aumentando a carga orçamental individual e/ou dossistemas de saúde, nacional ou privados;

ii. Desencadeiam-se estados de depressão e ansiedade pela preocupação subjacente;

iii. Criam-se estigmas individuais e sociais graves, mesmo na verificada ausência dedoença;

iv. A gravidade que pode advir dum indivíduo com doença ser informado danegatividade do teste, perdendo-se muitas vezes a oportunidade de cura.

Quando as variáveis a avaliar por um teste de rastreio são contínuas (p.ex tensão arterial,glicémia), há necessidade de se estabelecer um ponto de corte acima do qual o teste éconsiderado positivo, e abaixo do qual o resultado é considerado negativo. Coloca-se oproblema dos falsos positivos ou dos falsos negativos aumentarem ou diminuirem,respetivamente, conforme o nível de corte é colocado mais alto ou mais baixo. Criamos doisgrupos, um dos positivos e outro dos negativos, mas não temos qualquer informação daverdadeira situação da doença, razão do rastreio. O grupo de indivíduos com resultadospositivos irá ser reencaminhado para futuros exames e aos indivíduos do grupo com resultadosnegativos não serão efetuados mais exames. A escolha do ponto de corte está relacionada coma importância relativa da falsa positividade e da falsa negatividade, com potenciais eimportantes implicações financeiras e/ou emocionais, já atrás explicitadas.

Na prática, por vezes utiliza-se mais do que um teste, de forma sequencial ou simultanea. Numrastreio sequencial, ou em duas fases, geralmente executa-se inicialmente o teste menosdispendioso e mais confortável, cujos casos positivos são encaminhados para testes posterioresmais dispendiosos, mais invasivos e mais desconfortáveis, mas com maior sensibilidade emaior especificidade. Nos testes sequenciais há uma perda global no valor da sensibilidade eum aumento global da especificidade. Por outro lado, nos testes simultâneos há um aumentoglobal da sensibilidade e um decréscimo global da especificidade, quando comparadas com osvalores de cada teste individual. A escolha da estratégia a seguir, utilização em simultâneo ouem sequência dos testes, depende de vários fatores relacionados com o contexto de aplicaçãodos mesmos, o seu custo em termos de saúde pública e de agressividade individual, entreoutros.

Epidemiologia

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Se os resultados dum teste não se podem reproduzir, o seu valor e utilidade são mínimos,independentemente da sensibilidade e da especificidade do mesmo. Interferem com afiabilidade ou reprodutibilidade vários fatores, nomeadamente:

i. Variação intraindividual

Os valores que se obtém quando se medem muitas das características humanas variam muitasvezes ao longo do tempo, mesmo durante curtos períodos. Ao avaliarmos qualquer resultadodum teste é importante considerar as condições em que o mesmo foi efetuado, incluindo a horado dia;

ii. Variação intraobservador

Muitos testes são observador-dependentes e quanto maior é o grau em que os fatores subjetivosintervêm nos resultados, mais provável se torna que a variação intraobservador seja maior;

iii. Variação interobservadores

Dois examinadores podem variar na avaliação das mesmas alterações. Da necessidade dequantificação desta discrepância evoluiu o conceito de Concordância Percentual Global e aestatística Kappa:

1. Concordância Percentual Global

A razão entre o número de leituras concordantes e o número total de leituras, multiplicada por100, dá-nos o valor da concordância percentual:

Dum modo geral, a maior parte das pessoas que são submetidas a testes têm resultadosnegativos. É provável que haja uma considerável concordância entre dois observadores quantoaos resultados negativos (casos saudáveis/sem doença), o que pode constituir um viés nacomparação das leituras, aumentando o valor da concordância percentual, e minimizandoeventual discordância na avaliação dos casos positivos. Assim, uma forma de evitar este viés

Concordância Percentual = Nr. leituras concordantes

Nr. total de leituras

Epidemiologia

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é excluir dos cálculos os verdadeiros negativos, quer no numerador, quer no denominador daequação acima esquematizada;

2. Estatística Kappa

Uma forma de melhor precisar a concordância interobservadores é utilizar a estatística Kappa,proposta por Cohen5 em 1960, que vem dar resposta à seguinte pergunta: até que ponto é quea concordância entre dois observadores excede o nível de concordância que resulta apenas doacaso?

Kappa =

(Concordância Percentualobservada)

(Concordância Percentualesperada apenas por acaso)-

100% - (Concordância Percentual esperada apenas po acaso)

(Em que 100% representa o máximo de concordância possível)

Landis e Koch6, em 1977, definiram os valores significativos de Kappa:

K ≥0.75 -> Concordância excelente para além do acaso0.40 ≤ K <0.75 -> Concordância intermédia a boa

K <0.40 -> Concordância fraca

Para um melhor entendimento da estatística Kappa sugere-se a leitura dos trabalhos deMacLure e Willett

7e também de Fleiss

8.

66

4.4 Conclusões

1. A decisão de rastrear uma população em relação a uma doença tem de ter em conta aprevalência e a gravidade da mesma, o seu comportamento biomolecular, a praticabilidade dedetetá-la precocemente, a possibilidade de intervir eficazmente nos casos positivos e o cálculoglobal do custo-benefício em todos os seus aspetos, financeiros e emocionais;

2. Um ensaio aleatorizado controlado é o melhor desenho de estudo, mas na maioria dos casosé difícil de implementar por razões já descritas anteriormente;

3. Os estudos que comparam grupos rastreados com grupos não rastreados têm vieses que têmque ser controlados;

4. A avaliação da sensibilidade e da especificidade tem que ter em conta a falsa positividade ea falsa negatividade;

5. A ausência de benefício dum rastreio pode não ser apenas devida a uma história naturalinapropriada da doença, mas também a uma terapêutica disponível inadequada no momento dodiagnóstico precoce;

6. O balanço do custo-efetividade pressupõe custos financeiros e psicossociais. Um teste porser barato não deve ser implementado se tiver grande falsa positividade e conduzir a testesdispendiosos, incómodos e com algumas complicações, além de poderem permitir perda dotempo oportuno de tratamento nos casos de falsa negatividade. Terapêuticas altamenteinvasivas, mas desnecessárias, aplicadas na sequência de testes de rastreio positivos malavaliados, têm também que ser consideradas.

Epidemiologia

5

Aplicabilidade da análise molecular do DNA Fecal

para rastreio da patologia colorretal esporádica

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DNA fecal

5.1 REVISÃO DA LITERATURA

5.1.1 A genética do cancro

Desde cedo, os estudos a nível celular e molecular mostraram que os agentes de iniciação eprogressão da neoplasia assentam em alterações no genoma1,2, 160, mais frequentemente osilenciamento de genes supressores de tumores (ou oncossupressores) e a ativação de proto-oncogenes. As proteínas codificadas pelos oncossupressores assumem um papel crucial noscheckpoints do ciclo celular, inibindo a proliferação celular e o desenvolvimento de tumores.Os oncossupressores são assim divididos em gatekeepers (genes que regulam diretamente aprogressão do ciclo celular, ex. TP53, APC, RB1) e caretakers (genes que reparam danos noDNA, evitando a instabilidade genética, ex. BRAC1, BRAC2 e MMR, genes de mismatchrepair)3,4. Se a lesão não for reparada, os oncossupressores promovem a morte celularprogramada5,6. O seu processo de inativação segue o modelo “2-hit”, que implica mutaçãobialélica para que o efeito se manifeste. A inativação de oncossupressores é assim tida comorecessiva surgindo frequentemente em consequência de deleções ou perda de heterozigotia(LOH, “loss-of-heterozygosity”), que levam à perda do gene e seus produtos, ou ainda graçasa fenómenos epigenéticos como sejam a hipermetilação de DNA, transmitida de forma estávelpor mitose. Há no entanto exceções a este modelo recessivo, em que o alelo wildtype não écapaz de compensar o efeito do alelo mutado por haploinsuficiência (ex. CDKN1B7) ou porefeito dominante negativo (ex. TP53 no carcinoma colorretal8).

Os oncogenes são formas irregularmente expressas ou mutadas de proto-oncogenes comcontribuição para o comportamento cancerígeno das células, ao favorecer a proliferaçãocelular ou promover a falha da morte celular por apoptose. No primeiro caso, as proteínasatuam em vias estimuladas por fatores de crescimento e regulam componentes do ciclo celularque promovem a progressão para além de G1, quer sejam os próprios fatores de crescimento(estimulação autócrina), os seus recetores (ex. PDGFR e HER2), sinalizadores intracelulares(ex. Ras e Raf), fatores de transcrição (ex. Fos e Jun, componentes de AP-1) ou reguladores dociclo celular (ex. ciclina D1)9. Exemplos da segunda situação são as alterações nos genes PI3-cinase e Akt e a sobre-expressão de Bcl-2, por translocação, que bloqueia a apoptose emlinfomas9. A ativação de oncogenes requer apenas mutação de um dos alelos do proto-oncogene, normalmente mutações pontuais que resultam na substituição de aminoácidos emposições críticas, daí que se caracterize por um efeito oncogénico dominante. Por outro lado,alguns cancros apresentam alterações de outra natureza, nomeadamente de estruturacromossómica, como sejam translocações, duplicações ou deleções. Tais rearranjos originam

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DNA fecal

oncogenes como c-myc no linfoma de Burkitt ou o gene de fusão Bcr/Abl na leucemia mieloidecrónica10,11. Entre os mecanismos de ativação de oncogenes está também a amplificaçãogénica, que resulta num aumento de expressão de determinadas proteínas como N-myc noneuroblastoma infantil e HER2 no cancro da mama e do ovário9.

Por ser mais comum em fases mais tardias da vida, o desenvolvimento do cancro é tido comoum processo de múltiplas etapas. A iniciação do tumor surge com a proliferação anormal deuma célula mutada, que se divide clonalmente e transmite à progenia as mesmas alteraçõesgenéticas, dando origem a um pólipo adenomatoso. A progressão do tumor resulta dapromoção de mutações somáticas e a seleção de células com vantagens proliferativas e maiorcapacidade de sobrevivência, invasão e metástase, logo, maior malignidade. Este processo édesignado por seleção clonal e dá origem ao carcinoma. Vários modelos foram desenvolvidospara representar a iniciação e progressão do cancro12-14, no entanto duas etapas centraispermanecem como base ao modelo proposto por Knudson15, e bem conhecido pelo modelo járeferido ‘2-hit’14,16-18: transformação inicial para um estádio pré-neoplásico, de crescimentoexponencial, em que uma das células adquire uma segunda transformação que leva aodesenvolvimento neoplásico. A partir deste modelo foram desenvolvidos modelos mais gerais,com maior concordância com os dados biológicos14,16-19

.

5.1.2 Marcadores genéticos em DNA fecal para rastreio do CCR

A nível molecular assistiu-se a um largo progresso nas últimas décadas, no sentido deidentificar e caraterizar as alterações genéticas envolvidas na transformação neoplásica20-23. Omodelo inicialmente proposto por Fearon e Vogelstein 199024, e suportado por muitos outrosestudos das áreas epidemiológicas e clínicas25,26, aponta que a evolução da morfologia dotecido, desde mucosa saudável até ao carcinoma in situ, é acompanhada pela acumulaçãoprogressiva de mutações em APC, K-RAS e TP53.

O aumento progressivo do conhecimento relevou inicialmente para primeiro plano a deteçãode sangue oculto nas fezes, a qual, conceptualmente, tem vindo a ser ultrapassada pela análisede marcadores moleculares em DNA fecal para rastreio de alterações pré-neoplásicas eneoplásicas. A análise de DNA fecal foi assim gradualmente ganhando terreno como métodode diagnóstico e rastreio27-31. A metodologia desenvolvida deteta alterações genéticas nas

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DNA fecal

células epiteliais esfoliadas do lúmen intestinal e excretadas diariamente em número que, numadulto saudável, se estima ser da ordem das 1010 células32. Aspeto ainda mais interessante é oda quantidade de DNA humano nas fezes de pacientes com cancro colorrectal parecer estaraumentada comparativamente à de indivíduos saudáveis (na ordem das 4-5 vezes), por umpossível aumento de esfoliação inerente à desagregação física do tumor para o lúmencólico27,33. Contudo, apenas um número restrito de genes supera os limites aceitáveis desensibilidade e especificidade requeridos para rastreio de diagnóstico sendo as classes maispromissoras de marcadores moleculares os oncogenes e genes oncossupressores comresponsabilidades diretas no crescimento celular neoplásico, tal como a seguir se descrimina.

5.1.2.1 Mutações somáticas em APC, B-RAF, K-RAS e TP53

A proteína APC, com 321 kDa, participa na adesão celular e migração, na transdução de sinal,na organização dos microtúbulos e segregação cromossómica34-36 bem como na regulação dociclo celular e da apoptose35. O desempenho das suas funções está intimamente relacionadocom a sua estrutura, da qual fazem parte: i) um domínio de oligomerização na porção N-terminal (resíduos 128-208)41 ; ii) região armadillo (resíduos 309-767)42; iii) região centralrepetitiva, com 3 domínios de ligação (resíduos 1020-1186) seguidos de 7 domínios deregulação da ß-catenina (resíduos 1256-2031)41-43, intercalados por 3 regiões SAMP, (“Ser-Ala-Met-Pro”, de ligação à axina e condutina; resíduos 1569, 1719 e 2034); iv) domínio básicode ligação a microtúbulos e proteínas associadas na extremidade C-terminal (resíduos 2223-2579)41-45. APC assume-se como um supressor tumoral, já que integra o complexo dedegradação da ß-catenina e regula assim os níveis intracelulares desta proteína na viasinalizadora Wnt36,37. Nesta via, e em condições normais, a proteína ß-catenina ativa aexpressão de fatores de transcrição das famílias TCF (T-cell factor) e Lef-1 (lymphoidenhancer factor-1), por sua vez reguladores de genes que incitam a progressão do ciclocelular38-45.

O gene APC (Adenomatous Polyposis Coli, HGNC:583) localiza-se em 5q21-q22 e éconstituído por 21 exões, dos quais apenas 16 são expressos42,43. Pelas suas funções, APC é umalvo preferencial para mutações oncogénicas associadas a ambas a tumorigénese familiar eesporádica. Mutações somáticas em APC são apontadas como o evento iniciador da maioriadas neoplasias colorretais, já que surgem com a mesma frequência em pequenos adenomas

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DNA fecal

com escassas alterações displásicas e em adenomas avançados e carcinomas colorretais36,46. Aanálise mutacional indica que 60% das mutações em APC são mutações truncantes36,46,48 queocorrem na região denominada Mutation Cluster Region (MCR c.1286-1513)41,43,47, e quecomo tal interrompem os primeiros 3 domínios de regulação da ß-catenina (resíduos 1256-1510). Há assim inativação de APC como oncossupressor uma vez que por aumento da ß-catenina livre, a via de sinalização Wnt fica constitutivamente ativa, na ausência de fator Wnt.No entanto, os domínios de ligação são frequentemente mantidos, pelo que tanto APC normalcomo truncado mantêm a capacidade e afinidade de ligação à ß-catenina42,43. Por outro lado,se mantidos um mínimo de 3 domínios de regulação41 e a primeira região SAMP (resíduo1569), constata-se uma eficiente formação e função do complexo de degradação da ß-catenina39,43,48,49. De acordo com o estudo de Traverso et al (2002)27, a análise de DNA fecalpermite a deteção de 57% das mutações em APC encontradas em tecido tumoral.

K-RAS pertence a um pequeno grupo de GTPases com expressão ubíqua no organismo eostenta o importante papel de regulador-chave e transdutor intracelular das vias RAS-RAF-mitogen-activated protein-kinase kinase (MEK) - extracelular signal-regulated kinase/MAPkinase (ERK/MAPK) e PI3K-AKT50,51. K-RAS alterna entre a forma inativa ligada a GDP e aforma ativa ligada a GTP, por ação de tirosinas cinases, em resposta ao sinal do recetor demembrana EGFR (epidermal growth factor receptor). Uma vez ativada, liga-se e exerce a suaação de GTPase sobre as moléculas efetoras subsequentes nas cascatas de sinalização em queparticipa e que induzem à proliferação e diferenciação celular, à invasão, à angiogénese e àapoptose32,52-55. A isoforma K-RAS4B é a mais comumente expressa e apresenta os seguintesdomínios: i) domínio G, conhecido como o domínio catalítico, que engloba o domínio N-terminal (resíduos 1-85) e que contém as regiões GTP-binding pocket (resíduos 10-16, 56-61e 116-119); ii) core effector region (resíduos 32-40); e iii) domínio C- terminal (resíduos 165-189), que determina as modificações pós-traducionais e ancoragem à membrana plasmática,assim como inclui uma região hipervariável (resíduos 166-185)56-58,113.

O gene K-RAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, HGNC:6407)localiza-se em 12p11.1-12.1 e apresenta 6 exões distribuídos por 45kb57. Na presença demutações específicas que dificultem a hidrólise de GTP pela GTPase-activating protein, K-RAS é constitutivamente mantida na conformação ligada a GTP121 e atua assim comooncogene. Foi demonstrado ainda que as mutações em K-RAS podem contribuir para aangiogénese tumoral, já que aumentam a expressão do fator de crescimento do endotéliovascular (VEGF)59,60. Para além das formas hereditárias em leucemia mieloide aguda,leucemia mielomonocítica juvenil, síndrome de Noonan tipo 361-63 e síndrome cardio-facio-cutâneo64, são também frequentes as formas oncogénicas somáticas presentes em cancros do

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DNA fecal

pâncreas, do pulmão, colorretal, gástrico e astrocitoma policítico65-68 e, embora maisraramente, também em neoplasias do fígado, do endométrio, da mama e cervicais62,69,70. Cercade 96% das mutações pontuais descritas em CCR são missense e afetam os c. 12, 13 e 61 71-

73,76,78, sendo que 80-90% destas são mutações somáticas no c. 1274-77,79,80. A evidência maisrecente aponta para um papel determinante de K-RAS na progressão do CCR mas não na suainiciação visto as alterações serem mais frequentes em CCR (40-50%)52,73-77 ou pólipos ≥ a10mm (15-40%) do que adenomas71,74,77,81,82. Alguns autores reportam que a sensibilidadedeste marcador em detetar lesões em amostras fecais fica-se pelos 40%, embora aespecificidade para pólipos adenomatosos e hiperplásicos seja de 60-70%73,79. Além disso, asalterações genéticas associadas ao gene K-RAS observam-se também em célulashiperproliferativas não neoplásicas, o que pode limitar seriamente a sua especificidade83.

Uma vez que a presença de mutações somáticas em K-RAS ativa as vias RAS-RAF- MEK-ERK/MAPK e PI3K-AKT independentemente da ação do ligando EGF, é biologicamenteplausível que estes pacientes demonstrem resistência à terapia com inibidores das tirosinascinases de EGFR184,85. A determinação do estado mutacional de K-RAS é assim um dos maisimportantes indicadores da resposta ao tratamento biológico, anticorpos monoclonais dirigidosaos EGFR em CCR metastático80,86-89, e atualmente usados como terapia de segunda linha empacientes cujos tumores não respondem à quimioterapia. A sua identificação ajuda assim aselecionar a terapia, otimizando-se recursos e evitando-se toxicidade desnecessária.

B-RAF é também uma interveniente na via de sinalização RAS-RAF- MEK-ERK/MAPK50,51,subsequente a K-RAS. A proteína B-RAF, expressa em todos os tecidos do organismo, pertenceà família RAF/Mil de serina-treonina cinases e é composta pelos seguinte domínios funcionaise estruturais: i) RAS-binding domain BD (resíduos 155-227); ii) Phorbol-ester/DAG-type Zincbinding domain (resíduos 235-280); iii) serina-treonina cinase (resíduos 457–714) e iv) ATPbinding domain (resíduos 463-471).

O gene B-RAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, HGNC:1097) localiza-seem 7q34 com 190kb e é composto por 18 exões. Mutações neste gene frequentemente alteramo seu domínio regulatório em N-terminal, dando origem a uma oncoproteína com atividadedesregulada associada a diversos cancros9 0 - 9 2, como sejam CCR9 3 , 9 4, do pulmão9 5,melanoma96 e linfoma não-Hodgkin. As alterações somáticas em B-RAF ocorrem em 10-18%dos CCR, embora presente em cerca de 30% das lesões colorretais não malignas e pólipos depequenas dimensões. Especula-se assim que tais eventos genéticos são precoces na lesãocolorretal71 e que uma fração destas não progride para CCR, sugerindo a sua cooperação comoutros fatores genéticos e epigenéticos para a transformação maligna71,97. As mutações

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DNA fecal

potencialmente oncogénicas localizam-se, na sua quase totalidade, no hotspot mutacionalc.600 GTG>GAG (Val>Glu) e surgem associadas a pólipos hiperplásticos e serreados,instabilidade de microssatélites e fenótipo metilado nos ilhéus CpG (CIMP)71,98,99. De acordocom o estudo de Jin et al (2006)73, a análise de DNA fecal permite a deteção de 75% dasalterações B-RAF encontradas em tecido tumoral. A identificação de mutações em B-RAF étambém importante para determinar a resistência à terapia anti-EGFR, assim como apresentamum pior prognóstico e sobrevivência quando tratados com estes antagonistas100,101. Os estudosmais recentes demonstram que, para além destes, deve ser considerado o estado mutacional dePIK3CA e PTEN78,100,102.

A proteína p53, a ‘guardiã do genoma’ como lhe chamou Levine (103) pelo seu envolvimentono controlo da proliferação celular e pelas suas funções oncossupressoras em resposta a danode DNA, stress oxidativo, choque osmótico e ativação de oncogenes103.É uma fosfoproteínacom localização nuclear, com 393 resíduos e vários domínios estruturais e funcionais: i)domínio N-terminal (resíduos 1-42); ii) região rica em prolinas (resíduos 64-92); iii) DNA-binding core domain (DBD, resíduos 102-292); iv) domínio de oligomerização (resíduos 307-355); v) sinal de importação nuclear (resíduos 316-325) e vi) região C-terminal (resíduos 356-393)104. Em condições celulares normais, a proteina p53 encontra- se ligada a MDM2, umaubiquitina ligase que inibe a sua atividade, promove a exportação para o citoplasma e a suaubiquitinação para degradação proteolítica105. Em situações de stress celular, o domínio N-terminal de p53 é fosforilado pelas cinases MAPK, ATK, ATM ou CHK1/2, ou ativado porp14ARF estimulado por oncogenes, e o complexo p53-MDM2 dissocia-se106. Assiste-se a umaalteração da conformação de p53, com aumento do seu tempo médio de vida e acumulação nonúcleo107. A proteína interage assim com o DNA, assumindo-se como um regulador datranscrição de genes-alvo que promovem i) a paragem do ciclo celular em G1 (p21, uminibidor de CdK2); ii) a reparação de DNA (ex. p48) e iii) a apoptose (PUMA, Bax e Noxa, dafamília Bcl-2),

O gene TP53 (tumor protein p53, HGNC:11998) localiza-se em 17p13.1 e contém 20kb, com11 exões108. São conhecidas mutações germinativas neste gene no Síndrome de Li-Fraumeni( O M I M : 1 5 1 6 2 3 )1 0 9, no entanto, é em cancros esporádicos que TP53 s u rge maisfrequentemente mutado, estando descritas alterações somáticas em 40-50% dos CCR110-113. Asformas mutadas são incapazes de desempenhar corretamente a sua ação oncossupressora,instalando-se assim um ambiente permissivo a alterações genéticas e cromossómicas que éselecionado positivamente pelas células cancerígenas. Em CCR, mais de 95% das mutaçõesdetetadas em TP53 ocorrem na porção c.126-331110, a qual integra o domínio DBD queinterage fisicamente com o DNA e medeia assim a resposta ativadora de p53114,115. Cerca de

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DNA fecal

80% das mutações descritas são não sinónimas responsáveis por uma proteína estável, com onúmero normal de resíduos116. Quando alteradas exercem uma ação dominante negativa sobreo alelo normal, silenciando-o, o que faz com que os níveis de p53 funcional sejam bastanteinferiores a 50%117. Embora as mutações somáticas possam ser observadas em vários estádios,estas são mais comuns nos mais avançados (10-40% dos adenomas do cólon e reto e póliposserreados, 50-80% dos CCR)81,112,118-120. É sugerido mesmo que a inativação de TP53 ocorrecom a transição de adenomas para displasia de alto grau8. A análise de TP53 em tecido tumorale fezes tem uma sensibilidade de 60% para deteção de CCR79, um achado ilustrando bem quãoimportante é o seu índice de evidência útil no rastreio não invasivo.

5.1.2.2 Marcador de integridade do DNA (Long DNA)

De entre as células do lúmen intestinal esfoliadas diariamente, uma certa proporção mantém asua integridade genómica por bypass ao mecanismo apoptótico ou por resistência das célulastumorais a várias enzimas de degradação29. A disfunção do mecanismo apoptótico graças aalterações genéticas ou epigenéticas de um dos seus intervenientes poderá poupar o materialgenómico da típica fragmentação em pequenos segmentos de 180 a 210 pb121,122. Através dautilização de testes moleculares, é possível avaliar a integridade do DNA com a pesquisa deDNA de elevado peso molecular (mais de 1 kb; designado por Long DNA ou L-DNA). Oestudo de Abbaszadegan e colegas relata uma diferença estatisticamente significativa entre asproporções de L-DNA em DNA fecal de indivíduos com CCR (64%) e DNA fecal deindivíduos com tecido cólico normal (5%; p <0.001)29. Segundo este mesmo trabalho, aespecificidade L-DNA como marcador tumoral em amostras fecais atinge os 95%, o que odestaca como um potencial marcador para rastreio não invasivo. Um estudo anterior detetouL-DNA em 55% de adenomas e 70% dos casos de cancro colorretal123. Publicações maisrecentes, com ensaios de PCR em Tempo Real, apontam para uma associação mais robusta efiável dos níveis de L-DNA, significativamente mais elevados em amostras fecais compatologia colorretal124,125.

5.1.2.3 Painéis multimarcadores

Os painéis multi-marcadores em DNA de lesões biopsadas revelaram-se de grande utilidade,sobretudo na identificação de 45-92% dos casos de CCR com mutações identificadas em pelo

76

DNA fecal

menos um marcador73,79. A inclusão destes marcadores em painéis de análise fecal desde cedomostrou-se bastante promissora, com sensibilidade para 52-91% dos CCR (especificidade de92- 95%)28,43,73,79,123,126,127. A sua deteção é mais frequente em casos do cólon distal,provavelmente devido ao menor tempo de degradação desde a exfoliação à captação. Emborainferior, a sensibilidade de deteção de lesões avançadas varia entre os 32-82% (especificidade93-95%)28,43,123,126,127, a qual importa melhorar como ferramenta de rastreio não invasivo. Osintervalos de sensibilidade podem ser explicados por painéis de marcadores distintos e emnúmero variável (entre 15 a 23 marcadores), assim como na metodologia do estudo ediferenças no espetro clínico da doença (tamanho, estádio e localização das lesões).

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5.2 OBJETIVOS

Para além dos objetivos definidos na secção 1.2, era nossa proposta inicial vários objetivosespecíficos 1.1 - pesquisar mutações somáticas em regiões génicas de APC, B-RAF, K-RAS eTP53 em 30 lesões colorretais com dimensão ≥6mm e diferentes localizações cólicas eclassificações histológicas, assim como interpretar o seu significado biológico com recurso àliteratura e bases de dados da especialidade; 1.2 – avaliar a sensibilidade da análise destesmarcadores genéticos no DNA fecal, dos mesmos participantes, em identificar lesões pré-malignas e malignas; 2 – analisar a associação da integridade de DNA (L-DNA) em DNA fecala vários estádios da patologia colorretal, com base numa amostra caso-controlo,respetivamente composta por amostras fecais de indivíduos com e sem lesões cólicas nacolonoscopia ótica (casos n=95, controlos n=97), assim como a sua sensibilidade eespecificidade.NOTA: Todavia, fatores limitativos da maior relevância, em que assume papel preponderanteas limitações financeiras com que nos confrontámos, impediram que tivéssemos podidocumprir este estudo em todos os rastreados. Neste âmbito, destacamos os objetivos que nãoforam cumpridos: i) o estudo de associação caso-controlo de um painel de alteraçõesgenéticas em APC, BRAF, KRAS, TP53, mt DNA D310, BAT26, L-DNA e epigenéticas emMLH1, ADAMTS1, HOXA9, MAL, MGMT, p16 e Vimentina, em DNA de sangue e tecidocólico de 100 indivíduos com lesões cólicas em vários estádios de progressão da patologiacolorretal e 100 indivíduos sem lesões cólicas, rastreados por CO. Para os loci que severificassem associados à patologia colorretal pretendia-se prosseguir com a sua análise emDNA fecal. O estudo genético ficou comprometido por limitações técnicas evidenciadas nasseccões seguintes. A análise epigenética não foi realizada, pela impossibilidade de seconservar as amostras de tecido biopsado e amostras fecais em azoto líquido nos 30 minutossubsequentes à sua recolha e pelo orçamento apresentado para aquisição do ensaiocomercial; ii) genotipagem de BAT26 não se revelou bem sucedida, mesmo após rigorosas ecriteriosas tentativas para otimização da PCR29,143; iii) genotipagem de mtDNA D310, deacordo com as condições descritas128-135, ficou igualmente comprometida, por tratar-se deuma repetição mononucleotídica (C)n, que não é detetável por corrida de fragmentos emsequenciador automático ABI 310 (Applied Biosystems). No sentido de ultrapassardificuldades de cariz técnico tentou-se estabelecer uma colaboração com a empresa norte-americana Exact Sciences que, em Novembro de 2010, lançou o primeiro kit comercial depesquisa de DNA fecal, atualmente em aprovação pel FDA. A equipa, no nome do Dr. BarryBerger demonstrou grande interesse na colaboração e reconheceu a importância e qualidadedo desenho do presente estudo. A colaboração foi, no entanto, comprometida uma vez que oprocedimento estabelecido por esta equipa implicava um volume mínimo de 10g de amostrafecal e a utilização de um tampão de estabilização aquando da recolha.

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5.3 MATERIAL E MÉTODOS

5.3.1 Amostragem e constituição do biobanco de DNA

Para a análise molecular foram recolhidas amostras de sangue, biopsia de tecido cólico e fezesde todos os participantes. A amostra de sangue foi colhida por venipunctura em tubos EDTA5 ml, por profissionais devidamente creditados. O tecido cólico foi biopsado aquando da COe conservado a -20ºC por um período inferior a 2 horas pós-biópsia, após o qual foi conservadoa -80ºC até ao procedimento de extração. A amostra fecal foi colhida previamente à preparaçãopara a colonoscopia. Foram recolhidos ~3g de amostra fecal (o equivalente à dimensão de umanoz), em recipiente de plástico esterilizado, e conservado imediatamente entre -10ºC a -20ºCnum período máximo de 24h. A cada amostra foi atribuído um código, para sua fácilidentificação e de forma a garantir o anonimato durante a análise laboratorial. As amostrasbiológicas foram transferidas para as instalações do Laboratório de Genética Humana (LGH)da UMa, em contentor refrigerado, e mantidas a - 80ºC. O isolamento de DNA no materialbiológico recolhido foi efetuado por métodos estandardizados, nomeadamente salting-out paraa fração leucocitária de sangue periférico (procedimento optimizado pelo LGH) e pelautilização de kits comerciais para as amostras de tecido cólico biopsado (DNeasy Blood &Tissue, Qiagen) e fezes (Stool DNA Mini kit, Qiagen), seguindo-se as instruções dosfabricantes. A amostra de sangue determina a informação genética germinal, não neoplásica, erepresenta assim uma referência para que se compare com a sequência de DNA dos loci deinteresse no tecido e DNA fecal. O restante volume de amostras de tecido, sangue e fezes foiconservado a -80ºC, e constituiu um backup de material genético. A conservação do materialgenético a -20ºC, assim como os respetivos dados em base de dados construída para o efeito,seguem normas e procedimentos restritos que priorizam e garantem a segurança, a integridade,a gestão e o controlo de qualidade das amostras, bem como o cumprimento das consideraçõeséticas. A qualidade e concentração de DNA obtidos pelos métodos inframencionados foramacedidos por espetrofotometria (rácios Abs 260/230nm e 260/280nm) e visualmente, poreletroforese em gel agarose a 0.5% com brometo de etídio (80V, 45 mins), com marcador detamanho Lambda DNA/Eco91I (BstEII) (Fermentas).

5.3.2 Pesquisa de mutações somáticas em regiões dos genes APC, K-RAS, B-RAF e TP53

5.3.2.1 Amplificação de DNA por Polimerase Chain Reaction (PCR)

A pesquisa de mutações somáticas foi realizada em amostras de DNA extraído de sangue e detecido, de um subgrupo de 24 indivíduos com 30 lesões colorretais, detetadas e biopsadas

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endoscopicamente e histologicamente caraterizadas140,140a,140b,140c. Quando detetadas mutaçõessomáticas, estas foram pesquisadas no DNA fecal correspondente. Este subgrupo é compostopor 4 adenocarcinomas bem diferenciados, 12 adenomas tubulares sésseis com displasia dealto grau, 1 adenoma viloso séssil com displasia de alto grau, 3 adenomas tubulares sésseiscom displasia de baixo grau, 7 pólipos hiperplásicos sésseis serreados e 3 pólipos hiperplásicossésseis140a,140b,141 . No que respeita à forma e dimensão, as lesões analisadas classificam-secomo: pólipos ≥10mm (n=21), 6-9mm (n=8) e lesão plana/prega (n=1). Topograficamenteestas lesões localizaram-se: reto – 10; cólon sigmoide – 8; cólon descendente – 2; cólontransverso – 5; cólon ascendente – 3; cego – 2. Todo o procedimento da genotipagemsubsequente foi efetuado sem qualquer tipo de informação ou cruzamento clínico dosparticipantes. As regiões génicas a analisar foram priorizadas de acordo com a maiorprobabilidade de ocorrência de mutações somáticas, descrita em COSMIC Database(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, Wellcome Trust, Sanger I n s t i t u t e,http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)112,113, nomeadamente APC (c. 1202-1674), K-RAS (c. 12 e 13), B-RAF (c. 600) e TP53 (exões 5-9, c. 1202-1674). Para a amplificação porPCR, utilizaram-se primers selecionados na literatura (ver Tabela 5.1), cuja especificidadepara a amplificação de regiões genómicas humanas foi individualmente verificada pelautilização do freeware BLAST Genomic Tools for Human, Eukaryotic and Microbial genomes(NCBI Genomes, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/).

Cada mistura de reação de PCR continha 1x tampão PCR, 2.0-2.7mM MgCl2, 200nM de cadaprimer forward e reverse, 200-270nM dNTP mix, 2-3U de Taq DNA Polimerase e 20-100ng/mlde DNA molde. Após optimização, revelaram-se de maior sucesso as condições sumarizadasna Tabela 5.1. Para a amplificação de DNAs extraídos de sangue e de tecido utilizou-se aFirepol Taq DNA Polimerase (Solys Biodyne, Estonia). Para a amplificação de DNA extraídode fezes utilizaram-se as enzimas Firepol Taq DNA Polimerase (Solys Biodyne, Estónia),GreenTaq DNA Polimerase (Fermentas) e Hot Start Plus Taq Polimerase (Qiagen) e respetivostampões de reação. Adicionalmente, nas amplificações de DNA fecal, revelou-se necessária autilização de 10mg BSA (Bovine Serum Albumin, Fermentas), e de dimetil-sulfóxido a 15%(DMSO, Sigma) em algumas amostras.

O sucesso da PCR, a sua especificidade e tamanho dos fragmentos foram verificados poreletroforese em gel de agarose a 1-2% (80 V, 45 mins), corado com brometo de etídio e com0,4µg marcador de tamanho O’Gene Ruler 100bp Plus DNA Ladder, ready-to-use (Fermentas,Lituânia). A visualização e arquivo da imagem foram feitos em transiluminador UV UniversalHood II (Biorad) com o software Quantity One 1D Analysis (version 4.5.2, Biorad).

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5.3.2.2 Sequenciação e análise de sequências

Os fragmentos de DNA amplificados por PCR foram submetidos a purificação enzimática comExonuclease I (ExoI, Fermentas): Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP, Fermentas), de acordocom as recomendações do fabricante. Os fragmentos foram sequenciados em sequenciadorautomático local ABI 310 (Applied Biosystems), com os primers forward usados para aamplificação (10pmol/µl) e com recurso à química BigDye® Terminator v3.1 CycleSequencing Kit (Applied Biosystems, Portugal), num total de 10µl e mínimo de 1µl de produtoPCR a 50ng/µl. Os produtos da reação de sequenciação foram purificados em colunas MiniSpin (Qiagen) com SephadexTM G-50 (GE Healthcare) e desidratados a 94ºC. Para aeletroforese capilar, adicionou-se 20µl formamida aos produtos da reação de sequenciação,seguidamente desnaturados a 94ºC durante 3 mins e colocados a 0ºC durante 3 mins, para quese obtivessem ssDNA (single-stranded DNA)

As sequências em formato *.abi, obtidas com o software ABI PRISM 310TM Collection(software Sequencing Analysis version 3.4.1) foram analisadas com o software Sequencher4.10.1 – Build 5828, tendo como referência as sequências NCBI Reference Sequences(RefSeq). Utilizaram-se os parâmetros default do software e definiram-se os seguintes critériosadicionais:

i) trim ends;

ii) mínima qualidade da sequência de 80%;

iii) extensão do fragmento esperado mínima de 70%;

iv) deteção picos secundários com área mínima de >20% (e inspeção visual peloutilizador).

Quando detetadas mutações, repetiu-se a amplificação por PCR para essa mesma amostra emarcador molecular e repetiu-se a sequenciação com ambos os primers forward e reverse.

5.3.2.3 Ensaio PCR em Tempo-Real para K-RAS (c. 12 e 13) e B-RAF (c. 600)

A utilização de K-RAS e B-RAF por PCR Real-Time destina-se a comparar a sensibilidade datécnica para a pesquisa destes marcadores relativamente à sequenciação tal como antesreferenciado. Para o efeito, utilizou-se o kit comercial K-RAS/B-RAF (Entrogen, EUA),

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seguindo-se as recomendações do fabricante. Este ensaio deteta 11 génes mutados em c. 12,13 e 61 de K-RAS e c. 600 de B-RAF, pela hidrólise de sondas TaqMan marcadas naextremidade 5’ com fluoróforos FAM (mutação) e VIC (wildtype). A amplificação das regiõese deteçao do sinal foi feita no termociclador em Tempo-Real iQ5 (BioRad) com o OpticalSystem Software (Biorad). Os valores do threshold cycle (Ct) foram usados para interpretar osinal positivo num intervalo de ciclos entre 22 e 29. Em cada set de amostras analisadas éutilizado um controlo endógeno da amplificação

5.3.3 Análise de L-DNA em amostras fecais

O marcador L-DNA foi analisado num universo amostral de 192 amostras de DNA fecal, entreas quais 97 participantes sem alterações cólicas observáveis em colonoscopia ótica (controlos)e de 95 participantes com lesões cólicas (casos). A análise teve em conta a amplificação porPCR de um fragmento com cerca de 1500pb que compreende os exões 6-9 do gene TP53(primers e condições descritas em Beroud et al 1995 e Abbaszadegan et al 2007)29,142.Utilizou-se como controlo de amplificação um fragmento do gene APC com aproximadamente120pb (designado por Short DNA ou S-DNA). A reação de PCR foi efetuada com o kit QiagenMultiplex PCR (Qiagen) em termociclador BioRad iQ5 Thermocycler, de acordo com asrecomendações do fabricante. O DNA extraído de sangue e água ultrapura foram utilizadoscomo controlo positivo para a presença de L-DNA e controlo de contaminação,respetivamente. O sucesso da amplificação e os resultados foram aferidos por eletroforese emgel de agarose 2%, corado com brometo de etídio (80V, 45mins), e visualizado emtransiluminador UV Universal Hood II (Biorad) com o software Quantity One 1D Analysis(version 4.5.2. Biorad).

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5.3.4 Análise estatística

Para o universo amostral analisado com os marcadores APC, K-RAS, B-RAF e TP53 (n=30), apositividade do painel molecular foi avaliada em cada categoria considerada, nomeadamentea caraterização histológica, a dimensão, a localização da lesão e o número de lesões, pelaaplicação do teste χ2 (com correção de Yates), para todas as classes e em cada classe individualcomparada com as restantes agrupadas (OR determinado em tabelas 2x2). Os resultados domarcador L-DNA, obtidos para um total de 192 amostras em ambas as classes com e semlesões colonoscópicas detetadas (casos e controlos, respetivamente), foram igualmenteanalisados em cada categoria com o teste χ2 (com correção de Yates ou teste exato de Fischer)e por modelos de regressão logística, ajustada para fatores estratificantes. A razão dasprobabilidades (Odds Ratio, OR) e respetivo intervalo de confiança a 95% foram determinadospara os testes χ2 e modelos de regressão logística. A análise comparativa da variávelcategórica L-DNA com variáveis contínuas da amostra foi feita com o teste t-Student. Osresultados foram interpretados a um nível de significância de 5%. Toda a análise estatística foirealizada em software SPSS for Windows (release 16.0) e com o auxílio da ferramentaOpenEpi version 2.3.1192

5.3.5 Consulta de Bases de Dados

Para a interpretação dos resultados dos marcadores analisados e interpretação do significadobiológico das alterações encontradas, recorreu-se à consulta de bases de dados, nomeadamenteCOSMIC Database (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, Wellcome Trust, SangerI n s t i t u t e, h t t p : / / w w w. s a n g e r. a c . u k / g e n e t i c s / C G P / c o s m i c / )11 2 , 11 3 e IARC TP53 mutationdatabase (International Agency for Research in Cancer, R15 update, November 2010, http://www.iarc.fr/ p53)110. A informação detalhada sobre polimorfismos foi acedida em dbSNP,Short Genetic Variations (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp,)193. Para a informação relativa aproteínas, suas caraterísticas e variações recorreu-se à UniProt (http://www.uniprot.org/)194.

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5.4 RESULTADOS

5.4.1 - Pesquisa de mutações somáticas em regiões génicas de APC, K-RAS, B-RAF e TP53

Apesar das várias tentativas de otimização da PCR, inclusivamente com a utilização de TaqDNA Polimerases com diferentes características, a taxa de sucesso para os marcadorespropostos ronda os 70% em DNA de sangue e tecido, não ultrapassando 20% em DNA fecal.Adicionalmente, apenas cerca de 60% das sequências em cada set apresentaram boa qualidadepara a análise. Tendo em conta estas limitações, a determinação dos resultados que se seguemfoi garantido por sucessivas tentativas de amplificação e sequenciação, que não é compatívelcom um procedimento de rotina ou análise de amostras em média/larga escala.

Os resultados da sequenciação dos marcadores analisados nestas amostras encontram-sesumarizados na Tabela 5.2. Com a análise mutacional de APC c. 1202-1674 detetaram-se setemutações somáticas entre c. 1286-1398. Destas, cinco ocorrem em adenomas tubulares sésseis,quatro dos quais com displasia de alto grau, dimensão ≥ 10mm e localizadas no reto e cólonsigmoide, enquanto que uma em lesão com displasia de baixo grau, dimensão ≥ 10mm elocalizada no cólon transverso. Destacam-se três mutações nonsense c. 1286 GAA>TAA(Glu>STOP, g. 3856), c. 1294 CAG>TAG (Gln>STOP, g. 3880), c. 1306 GAA>TAA(Glu>STOP, g. 3916) e duas frameshift, tais como c. 1398 AGT>delAG (Arg>Phe Fs*9, g.4192-4193) e c. 1319 CCT>delC (Pro>Leu, Fs *2, g. 3956). Identificaram-se a mutaçãononsense c. 1309 GAA>TAA (Glu>STOP, g. 3925) num pólipo séssil serreado com dimensãoentre 6-9mm localizado no reto e a mutação missense c. 1317GAA>CAA (Glu>Gln, g. 3949)num pólipo hiperplástico séssil com dimensão < 6 mm localizado no cólon transverso.Encontrou-se uma alteração sinónima germinativa em c. 1493ACG>ACA (Thr>Thr, g. 4479)em cerca de 80% dos indivíduos analisados, 54% dos quais em heterozigotia.

Na análise de K-RAS c. 1-37 foram detetadas 4 mutações somáticas não sinónimas em trêsadenomas tubulares sésseis com displasia de alto grau e dimensão ≥ 10mm, no reto, cólonsigmoide e cólon ascendente (c. 13 GGC> GAC (Gly>Asp)), c. 12 GGT>GAT(Gly>Asp) e c.12GGT>TGT (Gly>Cys), respetivamente) e um adenoma tubular séssil com displasia debaixo grau, dimensão≥ 10mm, biopsado do cólon transverso(c. 12GGT>GTT(Gly>Val)).

De entre as amostras analisadas, observou-se que o exão 15 do gene B-RAF encontra-semutado em c. 600 GTG>GAG (Val>Glu) em dois pólipos hiperplásicos sésseis serreados, umdos quais com 6-9mm no cólon sigmoide e outro com ≥ 10mm na ampola cecal.

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Tabela 5.2 Pesquisa de mutações somáticas em regiões dos genes APC, K-RAS, B-RAF e TP53.

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Na região priorizada para análise de TP53 c. 126-331 foram observadas: i) uma mutaçãosinónima germinativa c. 213 CGA>CGG (Arg>Arg), encontrada em 2 lesões de dimensões 6-9mm, biopsadas do cólon sigmoide e cólon descendente do mesmo indivíduo, ambas comcaracterização histológica de adenoma tubular séssil com displasia de alto grau; ii) umatransição somática c. 273 CGT>CAT(Arg>His), em adenoma tubular séssil com displasia dealto grau e adenoma viloso séssil com displasia de alto grau, ambos com dimensão ≥ 10 mme biopsados no reto; iii) mutações intrónicas somáticas I5 pb14G>A e I8 pb10C>A em doispólipos hiperplásicos sésseis serreados, com ≥ 10 mm e 6-9mm, biopsados no cego e cólondescendente, respetivamente; iv) uma mutação intrónica germinativa I9 pb12T>C, ocorrendoem simultâneo com a mutação somática c. 273 CGT>CAT(Arg>His) numa das lesões nomesmo indivíduo.

Se se considerarem positivas as análises de DNA em que pelo menos um dos marcadores dopainel apresenta mutação somática, obtêm-se os resultados sumarizados na Tabela 5.3. Apositividade do painel genético, de cerca de 53,3% para a totalidade das amostras (16 em 30),não se revelou estatisticamente significativa para nenhuma das categorias consideradas. Nãoforam detetadas mutações somáticas em APC, K-RAS, B- RAF ou TP53 nos adenocarcinomasbem diferenciados. Além disso, apenas um adenoma tubular com displasia de alto grau, comdimensão ≥ 10mm, biopsado no reto apresenta mutações somáticas simultâneas nosmarcadores em estudo, nomeadamente em APC e TP53.

À exceção das mutações em B-RAF c.600 que não foram detetadas, os resultados por PCR emTempo-Real com kit comercial estão em consonância com os obtidos por sequenciação para asmesmas amostras, tendo sido automaticamente detetados pelo software de análise.

Ao contrário das análises moleculares em fragmentos de tecido biopsado e no sanque, apesquisa em DNA fecal não detetou nenhuma destas alterações somáticas mas sim ainformação germinativa de cada indivíduo (determinada no DNA de sangue), pelo que invalidaa avaliação da sensibilidade do DNA fecal em identificar lesões cólicas.

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Painel Total χ2 /pgenéticopositivo

Classificação histológicaAdenocarcinoma bem 0 4 nd

diferenciado Adenoma tubular séssil com 7 12 0.94

displasia alto grau Adenoma viloso séssil com 1 1 nd

displasia alto grau Adenoma tubular séssil com 2 3 0.90

displasia baixo grauPólipo hiperplástico séssil 1 3 0.90Pólipo hiperplástico séssil 5 7 0.50

serreadoLocalização

A-C Reto 6 10 0.89D Cólon sigmoide 3 8 0.52

E Cólon descendente 1 2 0.52F-H Cólon transverso 3 5 0.87

I Cólon ascendente 1 3 0.90J.K Cego 2 2 nd

Dimensão6-9 mm 3 8 0.52≥ 10 mm 13 21 0.30

Lesão plana 3 0 1 nd

Tabela 5.3 Positividade do painel genético de acordo com a classificação histológica,localização e dimensão das lesões colorretais

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5.4.2 Análise de L-DNA em amostras fecais

Para o universo de 192 amostras de DNA fecal analisadas para este marcador molecular, foramobtidos os resultados que constam da Tabela 4.4. A positividade de L-DNA é indicada pelapresença do fragmento de 1300pb, sendo que os resultados foram apenas considerados quandoocorreu a amplificação simultânea do fragmento S-DNA de 120pb, usado como controlo deamplificação (Figura 5.1). A análise comparativa da positividade de L-DNA nos grupos deamostras definidos de acordo com a presença ou ausência de lesões, não revelou associaçãoestatisticamente significativa (16,8% e 15,5% respetivamente; p=0,84, OR=1,10, IC a95%=0,513-2,389). A sensibilidade e especificidade deste marcador em detetar lesões cólicasna amostra, ficam-se assim pelos 16,84% e 84,54% (ou 13,89% e 84,54% respetivamente, nadeteção de adenomas ≥ 6 mm e lesões malignas). Com a análise dos resultados de L- DNA porclassificação histológica, dimensão e região de localização da lesão mais avançada, não severificou qualquer significância estatística (valor p>0,05). Por outro lado, há uma tendênciapara que o L-DNA seja mais frequentemente detetado em indivíduos com um maior númerode lesões cólicas (L-DNA positivo em 13,4% das amostras com 1 a 2 lesões vs 38,5% dasamostras com 3 a 5 lesões; p=0,06; OR=3,95, IC a 95%=1,01-14,67). É também encontradauma associação de L-DNA às lesões poliposas na globalidade comparativamente com ospólipos apenas adenomatosos (L-DNA positivo em 28,57% pólipos vs 8,89% em adenomas;p=0,03, OR=4,03, IC a 95%=1,22-15,76).

Figura 5.1 Eletroforese de produtos de amplificação para análise de DNA Longo emamostras fecais em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio (80V,40mins). a) S-DNA 120 pb, b) L-DNA 1300 pb, c) marcador de tamanhoO’Gene Ruler 100bp Plus DNA Ladder, ready-to-use (Fermentas, Lituania)

a

b

c

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A presença/ausência de lesões cólicas detetadas por colonoscopia ótica revelou-se associadaao sexo (Regressão logística B= -0,62, p=0,03; Qui-quadrado p=0,04, OR=0,53; IC a95%=0,29-0,94), sendo mais frequentes nas amostras do sexo feminino (22,0% vs 11,1% nosexo masculino). A análise foi assim subestruturada de acordo com o sexo não tendo sidoencontradas associações, à exceção da deteção de L-DNA ser significativamente maisfrequente em amostras do sexo feminino com 3 a 5 lesões, quando comparada com a taxa dedeteção em amostras com 1 a 2 lesões (dados não apresentados, 62,5% vs 14,3% p=0,01,OR=9,33, IC a 95%=1,73-59,10). Em alternativa, tomou-se também por referência osresultados da colonoscopia ótica de amostras com apenas 1 lesão (n=132) e da colonoscopiavirtual (n=192), para análise dos resultados de L-DNA com as mesmas variáveis acimaconsideradas. Não foi revelada nenhuma associação estatisticamente significativa (TabelasSuplementares L- DNA 1 e L-DNA 2, respetivamente) (Anexos 10 e 11).

Tabela 5.4 Positividade do marcador molecular L-DNA de acordo com as caraterísticas daamostra e das lesões mais avançadas (colonoscopia ótica)

Os valores –p<0,05 encontram-se destacados a negritoa) Regressão logística, variável ‘Presença de lesões’, método B-step (Wald), com L-DNA, Sexo e Idadeb) Na caraterização histológica, não foram considerados classes com n<3

L-DNANegativo Positivo χ2/teste t p OR (IC a 95%) RL a)

(n=161) (n=31) B p

SexoMasc/ Fem (% Masc) 69/92 (42,8) 17/14 (54,8) 1,50 0,24 0,61 (0,28-1,33) -0,62 0,03

IdadeMédia anos (d.p.) 59,6 (6,1) 58,3 (6,9) 1,09 0,27 0,04 0,07

Presença de lesõesCom lesões % 79 (83,2) 16 (16,8) 0,06 0,84 1,10 (0,51-2,38)Sem lesões % 82 (84,5) 15 (15,5)

Lesão mais avançadaDimensão %

1-5mm 48 (81,4) 11 (18,6) 0,40 0,816-9mm 17 (85,0) 3 (15,0)

>9mm, maligna 14 (87,5) 2 (12,5)

RegiãoRecto 26 (92,9) 2 (7,1) 5,72 0,33

Cólon sigmóide 19 (79,2) 5 (20,8)Cólon descendente 10 (76,9) 3 (23,1)

Cólon transverso 11 (68,8) 5 (31,3)Cólon ascendente 7 (77,8) 2 (22,2)

Cego 5 (100,0) 0 (0,0)

Caraterização histológica) b) %Adenocarcinoma bem diferenciado 3 (100,0) 0 (0,0) 7,09 0,13

Adenoma titular séssil com displasia alto grau 14 (82,4) 3 (17,6)Adenoma tubular séssil com displasia baixo grau 27 (96,4) 1 (3,6)

Pólipo hiperplásico séssil 21 (72,4) 8 (27,6)Pólipo hiperplásico séssil serreado 9 (75,0) 3 (25,0)

Adenoma 41 (91,1) 4 (8,9) 4,37 0,03 4,03 (1,22-15,76)Pólipo 30 (71,4) 12 (28,6)

Nº Lesões1-2 71 (86,6) 11(13,4) 3,29 0,06 3,95 (1,01-14,67)3-5 8 (61,5) 5 (38,5)

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Na componente molecular do presente estudo procedeu-se à pesquisa de mutações somáticasem DNA extraído de tecido, sangue e fezes em regiões génicas de APC, K-RAS, B-RAF eTP53 selecionadas de entre as mais frequentemente alteradas na progressão adenoma-carcinoma colorretal. Contudo, desde cedo evidenciaram-se sérios comprometimentos àrealização desta intenção, uma vez que as condições de amplificação por PCR e desequenciação das amostras revelaram-se de ajuste quase individual. Adicionalmente e deacordo com o referido em Lin et al (2007)195 e van Kricken et al (2008)196, verificou-se que atécnica de sequenciação por dideoxinucleótidos terminadores e os equipamentos automáticosABI310 e ABI 3730XL apenas detetam variantes de DNA que estão representadas em mais de30% do material genético em análise (dados não apresentados, o que impõe limitações àdeteção de mutações somáticas. Reformulou-se então a estratégia inicial reduzindo a análise aum subgrupo de 30 amostras selecionadas de entre 24 participantes no rastreio em váriosestádios de progressão da lesão, e classificadas de acordo com a sua dimensão, localização ecaracterização histológica. Iniciou-se a análise molecular dos DNAs extraídos de tecido esangue e, quando detetadas mutações somáticas, estas foram pesquisadas no DNA fecalcorrespondente.

A ausência de mutações em APC nos carcinomas estudados não se enquadra nos valoresapresentados em estudos anteriores com uma frequência de mutações de 50% a 83% em CCResporádico144,145. Por outro lado, se considerarem as classes adenoma tubular séssil comdisplasia de alto grau e pólipo hiperplástico séssil, as mutações em APC chegam a representar33% de cada classe. Esta proporção em estádios menos avançados, acusando a importância deAPC na iniciação da displasia mas não na sua progressão, está de acordo com aliteratura30,34,75,146, e com as proporções indicadas na base de dados COSMIC (35% emadenomas do cólon e 43-56% em adenomas do reto)112,113. No presente estudo, revelou-seserem mais frequentes as mutações nonsense (57%), surgindo em menor número as mutaçõesframeshift (28%) e missense (14%). Estes dados são concordantes com estudos anteriores onde95% das mutações encontradas correspondiam a alterações frameshift e nonsense48,147.

Tendo em conta os domínios funcionais e estruturais de APC, a literatura descreve quemutações patogénicas ocorrem sobretudo nos primeiros 3 domínios de regulação da ß-catenina(em c. 1256-1510) e na primeira repetição SAMP em c. 1569 48,148,149,151, originando proteínastruncadas estáveis que conseguem manter entre zero a três domínios de ligação à ß-catenina48.De entre as mutações identificadas na presente amostra, as nonsense c . 1 2 8 6

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GAA>TAA(Glu>STOP), c.1294 CAG>TAG(Gln>STOP), c.1306 GAA>TAA(Glu>STOP), ec.1309 GAA>TAA(Glu>STOP), e a frameshift c.1319 CCT>delC(Pro>Leu Fs*2) geramproteínas truncadas com apenas um domínio de regulação. Por outro lado, a mutaçãoframeshift c.1398 AGT>delAG(Arg>Phe Fs*9) situa-se entre a segunda e terceira repetição 20AAR, originando uma proteína com dois domínios de regulação48. Estudos in vitro parecemdemonstrar que proteínas truncadas com dois ou três domínios de regulação mantêm atividaderesidual considerável, podendo reduzir a expressão de ß-catenina de forma quase tão eficientecomo a proteína APC, regulando assim a divisão celular35,150-153. Por outro lado, aquelas comapenas um domínio de regulação da ß-catenina têm uma atividade residual, insuficiente paramanter os níveis de ß-catenina embora mantenham capacidade de exportá-la do núcleo35,154,155.Com a inativação do oncossupressor APC, há um aumento ß-catenina livre e a via desinalização Wnt fica constitutivamente ativa, incitando o progresso do ciclo celular. Segundoo modelo just-right signalling, a manutenção de proteína APC truncadas com actividaderesidual parece conferir uma vantagem selectiva à progressão tumoral, comparativamente àcompleta inactivação de APC35,49,144,149,151. Assim, as lesões em que foram encontradasmutações que mantêm apenas um domínio de regulação podem ser alvo de seleção positiva eevoluir para a neoplasia colorretal. Na verdade, as mutações c.1286 GAA>TAA (Glu>STOP),c.1306 GAA>TA A ( G l u > S TOP), c.1294 CAG>TAG (Gln>STOP), c.1309 GAA>TA A(Glu>STOP e C.1319 CCT>delC (Pro>Leu Fs*2) correspondem a cerca de 4% das mutaçõesreportadas nas bases de dados COSMIC, sobretudo em CCR e adenomas médios eavançados112,113. No que respeita à mutação missense c.1317 GAA>CAA(Glu>Gln), e muitoembora não se localize num dos domínios funcionais reconhecidos, demonstrou-se em algunsestudos que suprime a via APC/ß-catenina, conferindo assim um risco aumentado para lesõescolorretais e CCR187,188,189-191. Na região analisada, nenhuma amostra apresentou um segundoevento mutacional em APC, contudo, há que considerar que raramente ambos ocorrem emMCR144 e que, com a metodologia utilizada, não é possível avaliar as perdas de heterozigotia.

APC c.1493 ACG>ACA (Thr>Thr) é um polimorfismo frequentemente encontrado em 40-56% das populações europeias (MAFG=0.338, rs41115; NCBI dbSNP)156-159, que como tal,está representado em indivíduos com e sem lesões colorretais. Na presente amostra, estepolimorfismo surge em 79,2% dos indivíduos analisados, dos quais 49,5% em heterozigotia e29,7% em homozigotia, concordando com estudos anteriores onde se assevera a altafrequência da heterozigotia em indivíduos normais e em CCR familiar esporádico (42,2% -54,3%)157. Salvaguarda-se aqui o interesse de no futuro realizar um estudo caso-controlo napopulação da Madeira com o intuito de se avaliar a associação deste polimorfismo ao risco delesões colorretais.

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As mutações encontradas em K-RAS c.12 GGT(Gly) e c.13 GGC(Gly) listadas na Tabela 4.2,representam 13% das amostras analisadas, entre as quais 26% dos adenomas tubulares sésseis.Estas proporções estão de acordo com as encontradas noutros estudos71-73, em que estes codõessão hotspots mutacionais em 35-60% de CCR esporádico, 30-40% de adenomas do cólon e<25% de adenomas do reto e pólipos serreados com diferentes localizações74-77,112. Estasalterações particulares representam 84% de todas as mutações somáticas descritas na literaturae bases de dados da especialidade: c.12 GGT>GAT(Gly>Asp) foi observada em 30% daslesões do pâncreas e 12-14% das lesões do trato biliar e colorretais1 6 9; c.12GGT>GTT(Gly>Val) está presente em 18% das lesões do pâncreas e 5-8% das lesões docólon, trato biliar, ovário e endométrico169 e foi associada a uma forma mais agressiva, comfalha no tratamento com anticorpos anti-EGFR e baixa sobrevivência197; c.12 GGT>TGT(Gly>Cys) foi identificada em 3-7% dos cancros do pulmão e CCR112; c.13 GGC>GAC(Gly>Asp) está presente em 3-6% das lesões em tecidos moles e CCR112. A ativaçãoconstitutiva do efeito oncogénico de K-RAS por alteração destes resíduos em GTP-binding-pocket é mais frequente em estádios patológicos mais avançados, daí pareça ser importantepara a progressão do CCR, mas não para a sua iniciação71,73,74,77,81,160, para além de que seassocia a uma sobrevivência mais curta78. As mutações identificadas neste estudo estãopresentes em 3 adenomas tubulares sésseis com displasia de alto grau, no reto, cólon sigmoidee cólon ascendente, com dimensão ≥ 10 mm e 1 adenoma tubular séssil com displasia de baixograu no cólon transverso, com dimensão ≥ 10 mm, estando ausentes nos adenocarcinomas bemdiferenciados. Apesar do baixo número de indivíduos analisados, a sua presença em lesõescom a mesma caraterização histológica pode sugerir que uma das vias de transformação dosadenomas tubulares sésseis é K- RAS-dependente.

Foram detetadas duas alterações somáticas em B-RAF c.600 GTG>GAG (Val>Glu) em doispólipos hiperplásicos sésseis serreados. Estudos anteriores reportam já uma associação destamutação particular à via de diferenciação de lesõe hiperplásicas serreadas98,99,162,163. Acredita-se que nesta mutação o domínio serina-treonina cinasa (resíduos457-714) mimifica afosforilação do domínio de ativação N-terminal de B-RAF, também um efetor da via RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK, promovendo uma ação cinática máxima e constitutiva sobre os seusalvos161. Células com alterações oncogénicas em B-RAF tornam se assim alvo de uma forteseleção funcional para o crescimento de tumores. No entanto, a maior frequência em lesõesnão malignas (30% vs 10-18% em CCR) sugere a ativação de B-RAF como um evento precocena tumorigénese mas que nem todos progridem para cancro71,73, podendo necessitar de outrosfatores genéticos e epigenéticos para a transformação maligna71,97. Na verdade, a ocorrênciade B-RAF mutado na transformação maligna com sequência pólipo hiperplásico serreado-carcinoma é muitas vezes associada a instabilidade de microssatélites e metilação71,54,162-165,

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mas que não nos foi possível determinar no presente estudo. A literatura refere ainda que naslesões não malignas B-RAF e K-RAS são mutuamente exclusivas, já que a sua coexistênciaparece ser incompatível com a proliferação78,166, o que se observa também nas amostrasanalisadas, apesar do seu baixo número.

O valor de K-RAS e B-RAF como marcadores de rastreio para a patologia colorretal não estábem estabelecido, dado que alterações em K-RAS são também observadas em célulashiperproliferativas não neoplásicas83 e uma fração considerável das lesões com mutações emB-RAF não progridem para neoplasia71,97. Por outro lado, o seu valor clínico na seleção daterapia é claro, pois algumas das suas mutações conferem resistência aos fármacos Cetuximabe Panitumumab, anticorpos monoclonais anti-EGFR80,86-89, por tornarem as vias sinalizadorasRAS-RAF-MEK-ERK/MAPK e PIK3CA/AKT constitutivamente ativas. Assim, alterações nesteloci indicam ausência ou má resposta, pior prognóstico e uma menor taxa de progressão esobrevivência, quando tratados com estes fármacos100,10. A Sociedade Americana de OncologiaClínica emitiu em 2009 uma Opinião Clínica Provisional, sugerindo que todos os potenciaispacientes para terapia anti-EGFR sejam rastreados para mutações somáticas em K-RAS168,otimizando-se assim recursos e evitando-se o pouco ou nenhum benefício em cerca de 40-50%de casos de CCR. Foi recentemente proposto que, adicionalmente, deve ser considerado oestado mutacional de B-RAF, PIK3CA e PTEN78,100,102.

A utilização de um ensaio de PCR em Tempo Real objetivava contornar parcialmente aslimitações de deteção das técnicas e equipamentos, já que o fabricante anuncia a deteção devariantes de DNA que estejam representadas em <1% da mistura e um maior sucesso emamostras com algum grau de degradação de DNA. O ensaio identificou e confirmou atotalidade das mutações K-RAS sequenciadas em tecidos mas não detetou nenhuma das 2mutações B-RAF. Note-se que, apesar da literatura e empresas da especialidade referirem maisde 60 métodos de deteção de mutações em K-RAS e B-RAF, poucos se encontram validadospela Comunidade Europeia167 e o utilizado não se encontra entre os referidos.

De uma forma geral, prevê-se que a pesquisa de mutações em TP53 seja útil na deteção delesõees precoces, em estádios pré-malignos mas com elevado risco de evolução para neoplasia,assim como indicador de um prognóstico mais reservado dada a natureza mais agressiva dotumor78,120,145,146,174-176. A análise de TP53 (c.126-331) identificou 3 mutações na regiãocodificante e 3 mutações em regiões intrónicas em lesões de alto grau, para as quais éimportante esclarecer o seu significado biológico. A mutação sinónima germinativa TP53c.213 CGA>CGG (Arg>Arg), identificada em heterozigotia num dos indivíduos analisados elesões respetivas, está presente em 2-11% das populações europeias (MAFG= 0 . 0 1 6 ;

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rs1800372; NCBI dbSNP). Embora outras mutações somáticas neste mesmo codão tenhamsido associadas a neoplasias colorretais110,171 e os estudos funcionais mostrem o seu efeitodeletério na ação de p53169,170, não existe qualquer evidencia de associação de c.213CGA>CGG (Arg>Arg) à suscetibilidade de CCR.

A mutação somática c.273 CGT>CAT (Arg>His; rs28934576 NCBI dbSNP) é considerada umhotspot mutacional em TP53, fazendo-se representar em 5-11% dos CCR bem como noutrostumores110,112,113,171, o que revela a ausência de uma associação particular ao epitélio intestinal.Pelo seu efeito dominante negativo, esta mutação que altera um ponto de contato em DNA-binding domain escapa à inativação bialélica dos oncossupressores e revela-se deletéria para aação de p53 em cascatas moleculares para reparação do DNA, paragem do ciclo celular ouapoptose114,115. Com o desenho experimental adotado não é possível avaliar a perda deheterozigotia (LOH), que surge frequentemente em paralelo a alterações em c.273154,155,172. Naregião não codificante, à exceção de I9 pb12T>C que se verificou tratar de um polimorfismo(MAFC=0.017, rs1800899, NCBI dbSNP), as restantes alterações não se encontram descritasna literatura e não constam como alterações somáticas ou germinativas na base de dados IARC.Apesar de não integrarem a sequência consenso de splicing125, estas alterações podeminterferir com o processamento do mRNA e alterar os transcritos de TP53. Curiosamente,ambas as mutações intrónicas foram encontradas em dois pólipos hiperplásicos sésseisserreados, localizados no cólon descendente e no cego, pelo que podem indicar um perfil demutações pontuais distinto para a evolução deste tipo de lesão colorretal. O valor clínico daanálise genética de TP53 é ainda considerado controverso177-181, uma vez que os mutantes sãofuncionalmente heterogéneos e a sua interpretação clínica não é universal, já que requer umconhecimento crescente da estrutura da proteína e dos complexos mecanismos de ação111.Melhor estabelecido está o seu papel na seleção da intervenção farmacológica: muitos estudosreferem tumores p53-mutados como resistentes à terapia com 5-fluoracilo78,174-176 e outrosdescrevem a utilização de moléculas que reativam os oncossupressores das células tumorais175.

TP53 c.72 CGC>CCC (Arg>Pro) é o polimorfismo mais amplamente analisado em TP53, nocontexto da variação genética e suscetibilidade para cancro1 8 0 , 1 8 1. Este polimorfismo(MAFG=0.393, rs1042522, NCBI dbSNP) está presente em mais de 70% das populaçõescaucasianas e, embora as associações difiram entre grupos populacionais174, alguns estudosrelatam associações positivas dos homozigóticos c.72 Pro>Pro com CCR 174,183. Esta variantec.72Arg tem uma capacidade 15 vezes superior em induzir a apoptose do que c.72Pro,provavelmente devido à maior capacidade de interagir com MDM2, que facilita a suaexportação nuclear e localização mitocondrial182. Ressalva-se assim o interesse de numaoportunidade futura se analisar o polimorfismo c.72 CGC>CCC (Arg>Pro) numa amostra

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caso-controlo para a patologia colorretal.

A sensibilidade do painel de marcadores deste estudo em detetar lesões colorretais, de cerca de54%, revelou-se dentro dos limites reportados por outros grupos de trabalho73,79 embora,curiosamente, não foram detetadas quaisquer mutações nos adenocarcinomas bemdiferenciados. Esta observação deve-se com certeza ao baixo número de adenocarcinomasanalisados e sugere que estas lesões malignas particulares tenham alterações em regiões nãoanalisadas ou tenham seguido uma via carcinogénica independente de APC, K-RAS, B-RAF ouTP53. Apenas uma das lesões avançadas estudadas apresentou duas mutações somáticascumulativas em APC e TP53, nomeadamente um adenoma tubular séssil com displasia de altograu. A existência de mutações em APC e TP53 é a combinação mais frequente no estudo deJeon et al (2008)75, tendo sido encontrada em 15.4% dos tumores analisados. apesar de existirevidência da ação sinergética de APC, K-RAS, B-RAF e TP53 para a transformação maligna184,185, estes resultados estão em concordância com estudos anteriores, que verificaram que aacumulação de mutações nestas regiões não é um pré-requisito para o desenvolvimento delesões colorretais e CCR esporádico74,77,185,186. Os resultados em Frattini et al (2004)76 indicamque cerca de 90% dos tumores apresentam mutações em pelo menos um destes genes, 27%dos quais em apenas um gene, 23% em APC+K-RAS+TP53, 21% em APC+K-RAS e 18% emAPC+TP53.

Ao contrário do que reportam estudos anteriores29,122,123, não se encontrou associação de L-DNA à patologia colorretal, em adenocarcinomas ou adenomas e pólipos de várias dimensõese localizações cólicas. Adicionalmente, a sensibilidade e especificidade do L-DNA fecal nadeteção de adenomas ≥ 6 mm e adenocarcinomas (13,89% e 84,54%) encontram-se muitoaquém do reportado (64% e 95% respetivamente)29. Assim, o marcador molecular L-DNA nãose evidenciou como um bom método para rastreio não invasivo de lesões colorretais nas nossasamostras fecais. É no entanto de salientar a maior frequência de L-DNA em lesões poliposasquando consideradas globalmente (28,6%), comparativamente aos pólipos adenomatosos(8,9%), podendo refletir uma associação particular a este tipo de lesão com uma probabilidade4x superior de L-DNA positivo identificar um pólipo (valor p=0.036; OR=4.035, 95%IC=1220-15.760). Além disso, há uma tendência para que seja mais frequente em indivíduoscom maior número de lesões cólicas (38,5% vs 13,4%), estando significativamente associadosa amostras do sexo feminino com 3 a 5 lesões cólicas (62,5%, quando comparadas com 14,3%em amostras com 1 a 2 lesões). Na interpretação dos resultados acima referidos, não se podedescurar que a positividade de L-DNA pode ter origem em lesões ou fonte hemorrágicas naporção superior do trato digestivo ou em doença inflamatória do intestino187.

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Um dos objetivos futuros é o de avaliar a integridade do DNA fecal por qPCR em Tempo Real,como descrito em Zou et al 2006125 e Zhang et al 2012124. De acordo com os seus resultados,em que os níveis de L-DNA são significativamente mais elevados em pacientes com CCR doque em indivíduos sem lesões (49 vs 5ng/g DNA fecal, p<0.001), esta é uma abordagembastante promissora, rápida, de baixo custo e cuja sensibilidade é semelhante a muitos paíneismultimarcadores31,77. Os resultados obtidos no presente estudo têm uma interpretação muitolimitada, tendo em conta as dificuldades metodológicas e a reduzida representatividade douniverso amostral, no que respeita a diferentes classes de dimensão, localização ecaraterização histológica das lesões. Entre as dificuldades metodológicas destacam-se a baixasensibilidade da sequenciação automática em identificar espécies raras de DNA (inferiores a30% de uma mistura) e a falha na análise do DNA fecal, por não ter sido possível fazer oenriquecimento das regiões-alvo do estudo (à semelhança de procedimentos descritosem27,72,79,123). Note-se que se estima que o DNA humano represente cerca de 1% do DNA fecaltotal e que, como tal, a fração mutada seja significativamente inferior. Não obstante o limitadovalor dos resultados, sugeriu-se uma monitorização regular dos indivíduos em que seidentificaram mutações somática em APC, K-RAS, B-RAF ou TP53 e que a literatura associaa um risco de progressão para neoplasia ou que auxiliam na seleção da terapia.

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Conclusões

Conclusões

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6. CONCLUSÕES

O cancro colorretal esporádico, de baixo a médio risco, representa 80 % de casos, e assume-se atualmente como a segunda ou terceira causa de morte por cancro, no mundo ocidental. Aintrodução de métodos de rastreio não invasivos e com maior fiabilidade e sensibilidade é umamedida urgente, com vista à deteção precoce de lesões avançadas, sobretudo pré-malignas,com importante interferência na prevenção do cancro colorretal, e com grande repercussão emSaúde Pública, não só em termos de melhoria da qualidade de vida das populações, como emtermos de poupança financeira no erário público.

A colonoscopia ótica é o exame que permite fazer o diagnóstico formal do cancro colorretalassim como das lesões pré-cancerosas. Contudo, é impossível executar regularmente esteexame a todos os indivíduos, num programa de rastreio nacional, pelos custos humanos,financeiros e por algumas complicações graves, não negligenciáveis, resultantes da suaaplicação. A introdução da tomografia computorizada helicoidal e de potentes computadoresnas estações de trabalho para tratamento da imagem radiológica permitiu o aparecimento dacolonoscopia virtual, com um potencial excecional para utilização alargada em rastreiospopulacionais do cancro colorretal.

A fraca sensibilidade dos testes de pesquisa de sangue oculto nas fezes, estimada entre 25% e50%, motivou o desenvolvimento de diferentes técnicas de extração do DNA a partir das fezes.O DNA é relativamente estável nas fezes e mutações pontuais são já identificadas emadenomas cólicos, para além dos casos de cancro. Em oposição aos testes baseados napresença de sangue nas fezes, a análise de DNA fecal é facilitada pela libertação de células dolúmen cólico de forma regular devido à renovação celular e porque o DNA alterado é semprede origem tumoral.

Pretendeu-se avaliar a utilização da colonoscopia virtual e da deteção de DNA fecal, comométodos de rastreio do cancro colorretal em indivíduos de risco médio, entre os 50 e os 74 anosde idade, e o seu impacto na população madeirense. Resumidamente:

1- Neste estudo, a colonoscopia virtual evidenciou um poder diagnóstico robusto com umaelevada sensibilidade para a presença ou ausência de lesões cólicas: identificou 98.1% deindivíduos com adenomas ≥ 6 mm, 98% das lesões 6 a 9 mm e 100% de pólipos ≥10mm.Inclusivamente, a colonoscopia virtual detetou mais adenomas ≥ 6 mm do que a colonoscopiaótica. A maioria de falsos negativos da colonoscopia ótica localizou-se no cólon direito, áreaonde a colonoscopia virtual se revelou um exame com melhores resultados, como também

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referido em vários estudos internacionais, e reconfirmados por colonoscopias virtuais derevisão, executadas no decurso do estudo. Ficou também evidente a importância do uso dateleradiologia, que permite a leitura das películas radiográficas por especialista localizado emlocal remoto, ao contrário da colonoscopia ótica em que a execução de cada exame necessitasempre da intervenção dum especialista;

2- Com utilização de metodologia apropriada, avaliou-se e comparou-se o impacto napopulação das colonoscopias virtual e ótica. Os rastreados aceitaram bem a realização dos doisexames no mesmo dia e de forma sequencial (99.6% aceitação). O estudo revelou que nageneralidade houve satisfação com ambos os exames, sem manifestações de grande ansiedadeou receios (9 e 10%, respetivamente) e com uma perceção positiva da eficácia dos mesmos(98.2% e 99.2%, respetivamente). Há uma tendência para maior satisfação com a colonoscopiavirtual, mas que se revela importante confirmar em futuras investigações. Há indícios queparecem apontar para uma associação entre a perceção da eficácia dos exames com a satisfaçãopara com estes, e ainda que a satisfação com a colonoscopia virtual ou com a colonoscopiaótica se relacionou inversamente com a ansiedade e os receios para com estes exames médicos(0.63<alfa de Cronbach<0.79).

Encontraram-se ainda diferenças de género, sendo que os homens pareceram estar um poucomais satisfeitos com a colonoscopia ótica e as mulheres manifestaram mais receios e ansiedadeem relação a ambos os exames.

Uma das vantagens desta investigação foi a realização dos questionários de satisfaçãoimediatamente a seguir à realização dos dois exames, evitando-se que os participantestivessem tido tempo de controlar as suas emoções.

A desejabilidade social teria sido um fator importante a controlar neste estudo para avaliar ainfluência da gratuitidade dos exames na valorização que os indivíduos fizeram da suasatisfação e eficácia das técnicas. Também teria sido importante controlar o uso do ansiolíticomidazolam durante a execução da colonoscopia ótica, fator que, obviamente, enviesou emalguma percentagem, os valores da satisfação a favor da mesma;

3- A análise de DNA das lesões cólicas biopsadas no presente estudo produziu resultados quepodem traduzir-se em importantes benefícios clínicos. De acordo com as bases de dados daespecialidade e com a literatura mais recente, as alterações somáticas encontradas em APC,K-RAS, B-RAF e TP53 são de interesse como complemento do diagnóstico, indicação paravigilância e seleção da terapia. As alterações nos oncossupressores APC e TP53 são comunsem estádios pré-malignos mas com elevado risco de evolução para neoplasia. Por outro lado,

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as mutações ativadoras do proto-oncogene K-RAS encontram-se descritas mais frequentementeem fases mais avançadas e, em conjunto com TP53, associam-se a um pior prognóstico, commaior agressividade e sobrevivência mais curta. As mutações em B-RAF sugerem umaassociação particular a pólipos hiperplásicos sésseis serreados. A determinação do marcador L-DNA, com os métodos aplicados, não se evidenciou como um marcador robusto para rastreioda patologia colorretal. No entanto, os resultados sugerem que esteja associado a amostras commaior número de lesões cólicas, em particular no sexo feminino.

Os resultados da análise de DNA têm de ser interpretados de forma muito cautelosa e requeremestudos futuros. Em primeira instância, é necessário ter em conta que o universo amostralanalisado é bastante reduzido, o que limita as ilações e a associação de mutações em regiõesgenómicas particulares à dimensão, localização ou classificação histológica da lesão. Aslimitações metodológicas evidenciadas no presente estudo comprometem também asensibilidade do painel molecular, sobretudo do DNA fecal e, como tal, inviabilizam a suaaplicação ao rastreio da patologia colorretal. Além disso, o valor destes marcadores napatologia colorretal é complexo e pouco universal, já que é necessário um conhecimentocrescente dos mecanismos de ação e estrutura das proteínas. Para além de se determinar anatureza germinativa ou somática da mutação, há que esclarecer o significado biológico dasmutações, distinguindo-se as funcionalmente neutras das que possivelmente contribuem paraa origem e progressão da lesão. É igualmente necessário ter em conta que muitas dasalterações, sobretudo em K-RAS e B - R A F, são também observadas em célulashiperproliferativas não neoplásicas e que nem todas progridem para neoplasia. Melhorestabelecido está o seu papel na escolha e racionalização da terapia farmacológica: tumoresTP53-mutados são resistentes à terapia com 5-fluoracilo, assim como as mutações somáticasem K-RAS c.12 e c.13 e B-RAF c.600 conferem resistência aos fármacos Cetuximab ePanitumumab;

4- Os resultados obtidos permitem afirmar que a colonoscopia virtual é um método de estudodo intestino grosso com potencial interesse num programa de rastreio do CCR tão eficaz comoa colonoscopia ótica, mas menos cruento, menos operador dependente e bem tolerado pelapopulação. No entanto, são necessários estudos multicêntricos mais robustos que confirmemesta assunção. Os testes de DNA humano mutado nas fezes não são ainda aplicáveis comométodos de rastreio generalizado. A sua eventual função num programa de rastreio nacionalestá ainda por determinar.

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Referências Bibliográficas

Referências bibliográficas

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7.1 Introdução

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Anexos

Anexos

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Anexos

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1 - FOLHA DE INFORMAÇÃO AO SUJEITO

No mundo ocidental, o carcinoma do cólon e do reto (CCR) está rapidamente a atingir o topodas causas de morte por cancro. Na grande maioria dos casos tem origem numa lesão benigna(pólipo) que alcança a fase de cancro só ao fim de 10 a 15 anos, após várias transformações emutações genéticas.

Enquanto que uma pequena percentagem do CCR incide em pessoas de alto risco (10 a 20%)com predisposição genética, em mais de 80% dos adultos a lesão ocorre duma formaesporádica e insidiosa, a partir dos 50 anos de idade (pessoas ditas de risco médio).

A introdução dum método de rastreio do CCR, de âmbito nacional, é uma medida importantede Saúde Pública com reflexos sociais e económicos evidentes, tendo em conta que na maioriados casos é possível detectar lesões pré-cancerosas, totalmente curáveis.

Vários testes de rastreio têm sido analisados: pesquisa de sangue oculto nas fezes,colonoscopia ótica do cólon e reto, clister opaco com papa radiopaca. Nenhum destes testes éideal, ou porque são dolorosos e podem ter complicações por vezes muito graves, ou porquetêm baixa sensibilidade e baixa especificidade para as lesões, ou ainda porque são muitodispendiosos ou consomem muito tempo aos técnicos de saúde que as executam.

Recentemente apareceu uma nova técnica radiológica denominada colonoscopia virtual (CV),totalmente não invasiva e inócua, isto é, sem risco de emissão de radiações em doses perigosaspara a saúde.

Por outro lado, o desenvolvimento da biologia molecular permitiu um melhor conhecimentodas alterações do ADN (ácido desoxirribonucleico) de muitos tumores, tais como o CCR.

O presente estudo pretende analisar a validade da CV e a importância das alterações do ADNhumano nas fezes, como métodos de rastreio ideais, utilizados isoladamente ou em conjunto,no despiste do CCR e das lesões que a ele conduzem, nas populações de risco médio,assintomáticas.

A participação nesta pesquisa é voluntária e não acarreta quaisquer despesas para os indivíduosrastreados para além das deslocações à Clínica de Santa Catarina, local de realização dosexames. Será fornecido, a pedido, certificado de participação no Projeto de Investigação pararelevação de faltas ao trabalho.

Anexos

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Metodologicamente, o estudo terá sete etapas:

Etapa 1 - Delineamento experimental: estudo da dimensão da amostra e da posterior análiseestatística.

Etapa 2 - Utilização dos meios de comunicação social para divulgação do projeto àpopulação e informação e formação dos técnicos de saúde interessados no projeto(centros de saúde, hospitais e elementos de campo);

Etapa 3 - Admissão de rastreantes em dois tempos: fornecimento individual da FOLHA DEINFORMAÇÃO AO SUJEITO e aplicação do QUESTIONÁRIO DEEXCLUSÃO, sendo o despiste efectuado por pessoal médico devidamentequalificado das áreas da Gastrenterologia e Cirurgia Geral e supervisionado peloInvestigador Principal. Aos rastreados admitidos será fornecido, nesta fase, umfolheto de INSTRUÇÕES PARA COLHEITA DE FEZES E SANGUE;

Etapa 4 - Colheita, armazenamento e envio das amostras de fezes e sangue para olaboratório. Fornecimento das INSTRUÇÕES PARA A PREPARAÇÃO CÓLICAe do material necessário para a preparação;

Etapa 5 - Após a preparação intestinal, execução sequencial (na mesma manhã ou na mesmatarde) e pela ordem indicada, dos dois exames e do questionário:

Colonoscopia virtual (CV)

Colonoscopia ótica (CO)

QUESTIONÁRIO DE SATISFAÇÃO (entrevista a ser efetuada por especialistas dePsicologia, devidamente preparadas e credenciadas com a disciplina de AvaliaçãoPsicológica)

Etapa 6 - Avaliação de resultados com “feedback” aos rastreantes. A classificação dosindivíduos será feita de acordo com a lesão mais avançada identificada;

Etapa 7 - Apresentação de resultados

A estimação da amostra é de 528 adultos de ambos os sexos, com idades compreendidas entreos 50 e os 74 anos, residentes na Região Autónoma da Madeira.

Anexos

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2 - QUESTIONÁRIO DE EXCLUSÃO

1. Tem história familiar de CCR hereditário (PAF, HNPCC)?

2. Tem história de pelo menos 3 familiares com cancro associado ao NHPCC(CCR, endométrio, intest. delgado, urotélio)? Pelo menos um familiar de 1ºgrau em relação aos outros dois; pelo menos duas gerações sucessivasafectadas; pelo menos um cancro diagnosticado antes dos 50 anos; cancroscom confirmação histológica

3. Tem história de qualquer cancro visceral coexistente?

4. Tem história de doença inflamatória intestinal?

5. Teve resseção cólica anterior?

6. Fez sigmoidoscopia, retosigmoidoscopia, colonoscopia, clister opaco nos dezanos anteriores?

7. Teve alteração do hábito intestinal no mês precedente?

8. Teve início de dor abdominal no mês precedente, que se mantém?

9. Teve hemorragia digestiva no mês precedente? (hematemeses, melenas,hematoquézia, retorragias)

10. Tem anemia ferropénica?

11. Teve pesquisa positiva de sangue oculto nas fezes nos 6 meses precedentes?

12. Recusa participar na investigação?

13. Tem más condições físicas para se submeter aos exames?

Nota – Qualquer sim é eliminatório

S N

Anexos

148

Anexos

149

3 - CONSENTIMENTO INFORMADO

E u , _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ___________________, aceito realizar o conjunto de avaliações que me foram explicadas nodomínio do Projecto de Investigação sobre rastreio do cancro colorrectal(CCR) , sem qualquercompensação pecuniária para deslocações, faltas ao serviço ou taxas moderadoras.

Foi-me explicado que tenho o direito de retirar-me dos testes e das avaliações, a qualquermomento, e sem qualquer penalização. Compreendo, também, que tenho a liberdade deformular perguntas que possam surgir e que estas serão respondidas de maneira satisfatória.

Se achar que fui lesado em virtude dos exames efectuados, compreendo que possa contactar oInvestigador Responsável para esclarecer as minhas preocupações.

Está salvaguardado o meu direito à privacidade.

Li, compreendo e aceito os termos e as condições acima referidos e ofereço-me comovoluntário para participar no projecto de investigação intitulado RASTREIO DO CANCROCOLORRETAL – UTILIZAÇÃO CONJUGADA DA COLONOSCOPIA VIRTUAL E DADETERMINAÇÃO DO DNA HUMANO MUTADO NAS FEZES.

O presente documento será assinado em duas vias, uma para o Investigador Responsável e aoutra para o Participante.

_____________________, ______/ ______/______

Nome do participante: ____________________________________________________

Nome da testemunha: _____________________________________________________

Assinatura do participante:_________________________________________________

Assinatura da testemunha: _________________________________________________

O Investigador Responsável, _______________________________________________

(Celso Almeida e Silva)

Anexos

150

Anexos

151

4 - INSTRUÇÕES PARA COLHEITA DE FEZES E SANGUE

Em recipiente bem lavado e seco (exemplo: bacio ou bacia), evacuar sem misturar com urina.Das fezes depositadas retirar, com colher de café, lavada e seca, porção de fezes (tamanhoaproximado de uma noz) para pequeno contentor de plástico (fornecido pelo laboratório).

Entregar no mais curto espaço de tempo no local combinado, para que a amostra sejarefrigerada no laboratório até à realização das análises.

Deverá apresentar-se em jejum.

Anexos

152

Anexos

153

5 - INSTRUÇÕES PARA A PREPARAÇÃO CÓLICA

Nota Prévia: A sua atitude é muito importante para o êxito dos exames que vai realizar.Colabore com o médico e técnicos que o irão atender, seguindo as suas instruções. Ambospodem esclarecer as suas dúvidas. Se tem qualquer doença renal deve referi-la imediatamenteao investigador responsável ou ao médico que estiver a atendê-lo/a.

A realização destes exames necessita de uma rigorosa limpeza intestinal. Os exames exigemque o seu intestino esteja o mais limpo possível, pelo que deve seguir atentamente asinstruções de preparação. Uma limpeza deficiente do intestino pode obrigar à repetição doexame. Por favor, siga as instruções abaixo descriminadas.

Anexos

154

Anexos

155

PREPARAÇÃO CÓLICA

INSTRUÇÕES PARA INDIVÍDUO NORMAL

Nos 3º e 2º dias anteriores ao dia dos exames:

Pequeno almoço:

Infusão de tília, erva cidreira ou qualquer tipo de chá

Torradas com compota (tipo geleia, sem gomos de frutos e sem cascas), biscoitos secos

Almoço e jantar:

Sopas brancas (batata, cenoura, arroz e massa), caldos de carne

Carnes ou peixes magros, cozidos ou grelhados (galinha, vitela, fiambre, pescada, etc.)

Arroz, puré de batata, ovo cozido

Pão branco, biscoitos secos, queijo fresco, iogurte

NÃO COMER FRUTA

Na véspera do exame, DIETA TOTALMENTE LÍQUIDA

9.00 horas – Pequeno almoço


12.00 horas – Almoço

Caldos de carne coados (água do caldo) + gelatina de ananás

Tomar 2 comprimidos de DULCOLAX (Bisacodil 5mg)

15.00 horas – Tomar uma dose de CITRAFLEET (Phosphosoda 45ml)

(num copo grande, deite o conteúdo do Fleet e complete-o com água e beba a totalidade). Deseguida, beber dois litros de água ou chá

Anexos

156

18.00 horas – Jantar



Tomar 1 embalagem de EZ CAT (não diluir)

19:00 horas – Beber a 2ª dose de CITRAFLEET. De seguida, beber mais dois litros de águaou chá

21:00 horas – Tomar 50 ml de gastrografina (ou telebrix gastro)

PODE BEBER ÁGUA E CHÁ ATÉ 7 HORAS ANTES DOS EXAMES. A PARTIR DAÍ NÃO DEVEINGERIR QUALQUER ALIMENTO OU LÍQUIDO

Anexos

157


INSTRUÇÕES PARA INDIVÍDUO COM INSUFICIÊNCIA RENALLIGEIRA A MODERADA


Pequeno almoço:



Almoço e jantar:





NÃO COMER FRUTA







15.00 horas – Tomar a dose de CITRATO DE MAGNÉSIO fornecida. De seguida, beberdois litros de água ou chá

Anexos

158





19:00 horas –Tomar a 2ª dose de CITRATO DE MAGNÉSIO. De seguida, beber dois litrosde água ou chá

19:30 horas – Tomar 2 comprimidos de DULCOLAX (bisacodíl 5 mg)



Anexos

159


INSTRUÇÕES PARA INDIVÍDUO COM INSUFICIÊNCIA RENALGRAVE


Pequeno almoço:



Almoço e jantar:





NÃO COMER FRUTA







15.00 horas – Tomar 1 litro de KLEAN-PREP (diluir 1 saqueta num 1 litro de água morna etomar 250ml de 10 em 10 minutos)


Anexos

160




18:00 horas – Tomar 1 litro de KLEAN-PREP (diluir 1 saqueta num 1 litro de água morna etomar 250ml de 10 em 10 minutos)

19:00 horas – Tomar 2 comprimidos de DULCOLAX (bisacodíl 5 mg)

Tomar 1 litro de KLEAN-PREP (diluir 1 saqueta num 1 litro de água mornae tomar 250ml de 10 em 10 minutos)



Anexos

161

MATERIAL A FORNECER AO PARTICIPANTE

• 1 embalagem de EZ CAT

• 2 a 4 comprimidos de DULCOLAX (Bisacodil 5mg)

• 2 embalagens de CITRAFLEET (45ml de Phosphosoda)(ou CITRATO DE MAGNÉSIO ou KLEAN-PREP)

• 50 ml de GASTROGRAFINA (ou TELEBRIX GASTRO)

Anexos

162

PRODUTOS PARA A PREPARAÇÃO INTESTINAL

1 embalagem de EZ CAT = 225 ml de sulfato de bário a 4,6% (p/p) – 49,2 mg/ml

2 a 4 comprimidos de DULCOLAX (bisacodil 5mg)

Preparado farmacológico de CITRATO DE MAGNÉSIO

2 embalagens de CITRAFLEET (45 ml de Phosphosoda)

50 ml de GASTROGRAFINA (ou Telebrix gastro)

3 embalagens de KLEAN-PREP (Angelini) (polietilenoglicol –PEG)

Cada saqueta de polietilenoglicol contém (em pó):

Polietilenoglicol 3350 59,0000 g

Sulfato de Sódio Anidro 5.6850 g

Bicarbonato de Sódio 1,6850 g

Cloreto de Sódio 1,4650 g

Cloreto de Potássio 0,7425 g

Aspartame 0,0494 g

Aroma de baunilha 0,3291 g

O conteúdo de cada saqueta é preparado com um litro de água norma.

Anexos

163

6 - CRITÉRIOS PARA CO ADEQUADA

Exame realizado por especialista

Intestino grosso devidamente preparado

A válvula ileocecal deve ser sempre visualizada e pelo menos 90% da mucosa colorretalobservada

Deve ser feita colheita de todos os pólipos observados, os quais devem ser todos enviadospara exame histológico

Exame histológico realizado por especialista

Classificação dos indivíduos de acordo com a lesão mais avançada identificada

Divisão do intestino grosso para referenciação das lesões colhidas por CO (11 regiões):

Anexos

164

Anexos

165

7 - DIAGNÓSTICOS DE HISTOLOGIA

Formações poliposas do Intestino Grosso

A - Lesões epiteliais:

Harmartomas

1. Pólipo de Peutz-Jeghers

2. Doença de Cowden

3. Pólipos juvenis

Pólipos Hiperplásicos (sem displasia)

4. Pólipo Hiperplásico séssil

5. Pólipo Hiperplásico pediculado

Pólipos Hiperplásicos serreados

6. Pólipo Hiperplásico séssil serreado

7. Pólipo Hiperplásico pediculado serreado

Pólipos Neoplásicos - Adenomas (com displasia)

8. Adenoma tubular séssil com displasia de baixo grau

9. Adenoma tubular séssil com displasia de alto grau

10. Adenoma tubular pediculado com displasia de baixo grau

11. Adenoma tubular pediculado com displasia de alto grau

12. Adenoma viloso séssil com displasia de baixo grau

13. Adenoma viloso séssil com displasia de alto grau

14. Adenoma viloso pediculado com displasia de baixo grau

15. Adenoma viloso pediculado com displasia de alto grau

16. Adenoma tubulo-viloso séssil com displasia de baixo grau

17. Adenoma tubulo-viloso séssil com displasia de alto grau

Anexos

166

18. Adenoma tubulo-viloso pediculado com displasia de baixo grau

19. Adenoma tubulo-viloso pediculado com displasia de alto grau

Adenocarcinomas

20. Adenocarcinoma bem diferenciado

Adenocarcinomas produtores de muco

21. Adenocarcinoma muco-celular

22. Adenocarcinoma mucoso

23. Adenocarcinoma com estroma embebido em muco

24. Adenocarcinoma hepatoide

25. Adenocarcinoma com metaplasia malpighiana

26. Adenocarcinoma com diferenciação trofoblástica

Carcinomas

27. Carcinoma basaloide (cloacogénico)

28. Carcinoma de células claras

29. Carcinoide

B - Outras lesões

I - Lesões conjuntivas e vasculares

30. Leiomioma

31. Leiomiossarcoma

32. Lipoma

33. Lipossarcoma

34. Schwanoma benigno

35. Schwanoma maligno

36. Fibroma

Anexos

167

37. Fibrossarcoma

38. Hiperplasia linfóide

39. Linfoma

40. Neuroma

41. Neurossarcoma

42. Ganglioneuroma

43. Tumores endócrinos

44. Ganclioneuromatose

45. Linfangioleiomiomatose

46. Angiomiolipoma

47. Melanoma

48. Sarcoma de Kaposi

49. Rabdomioma

50. Rabdomiossarcoma

51. Tumor metastático

52. Quisto dermóide

53. Ectasia vascular

54. Angioma

55. Angiossarcoma

56. Hemangiopericitoma benigno

57. Hemangiopericitoma maligno

II - Lesões Parasitárias

58. Lesões parasitárias

III - Lesões Inflamatórias

59. Doença de Crohn

Anexos

168

60. Colite ulcerosa

61. Colite e rectite

IV - Lesões Degenerativas

62. Diverticulose

63. Epitélio gástrico heterotópico retal

64. Tecido glandular salivar retal

65. Melanosis coli

66. Endometriose

67. Amiloidose

68. Malakoplakia

69. Alterações pelas radiações

70. Granuloma do Bário

71. Pneumatose

72. Colite quística profunda

Anexos

169

8 - ESCALA DE SATISFAÇÃO COM OS EXAMES DECOLONOSCOPIAS (ESEC)

INSTRUÇÕES

Com os diferentes itens desta escala, não se pretende apurar se a metodologia deste examemédico está certo/errado. Pretendemos apenas que nos diga, o mais objectivamente possível,qual o seu nível de satisfação para com cada um destes exames médicos.

Para cada item da escala existe uma ponderação de 1 a 4, com a seguinte correspondência:

1 – Discordo muito;2 – Discordo;3 – Concordo;4 – Concordo muito.

Assinale com um X na quadrícula a que melhor se ajusta ao seu caso (só poderá assinalarapenas uma quadrícula por pergunta)

1 2 3 4

1. Foi fácil fazer a preparação para estes exames � � � �

2. Não senti qualquer efeito da medicamentação usada para me � � � �preparar para estes exames

3. Senti-me bem enquanto durou o exame de Colonoscopia Ótica � � � �

4. Estava nervoso/a quando estava à espera que me � � � �chamassem para estes exames

5. Não me custou fazer o exame de Colonoscopia Ótica � � � �

6. Compreendi bem as instruções que me foram dadas para � � � �me preparar para este exame

7. Não me custou fazer o exame de Colonoscopia Virtual � � � �

8. Senti-me ansioso enquanto estava a fazer o exame de Colonoscopia Virtual � � � �

9. Acho que o exame de Colonoscopia Ótica é eficaz � � � �

10. Prefiro fazer o exame de Colonoscopia Ótica do que o � � � �de Colonoscopia Virtual

11. Enquanto estive a fazer o exame de Colonoscopia Virtual tive � � � �pensamentos negativos

Anexos

170

12. As instruções que o médico me deu enquanto fazia os exames � � � �foram importantes para me relaxar

13. Acho que o exame de Colonoscopia Virtual é eficaz � � � �

14. Tive receio quando me estavam a fazer o exame de Colonoscopia Ótica � � � �

15. O exame de Colonoscopia Virtual não é doloroso de fazer � � � �

16. Não vinha descontraído quando vim para estes exames � � � �

17. Ter ar nos intestinos não me incomodou na Colonoscopia Ótica � � � �

18. Senti-me bem enquanto durou o exame de Colonoscopia Virtual � � � �

19. O exame de Colonoscopia Ótica não é doloroso de fazer � � � �

20. Tive receio quando me estavam a fazer o exame de Colonoscopia Virtual � � � �

21. Senti-me ansioso enquanto estava a fazer o exame de Colonoscopia Ótica � � � �

22. Sabia o suficiente sobre os exames antes de os realizar � � � �

23. A informação sobre o que nos vão fazer durante os exames é importante � � � �

24. Estava indisposto quando fiz os exames � � � �

25. Enquanto estive a fazer o exame de Colonoscopia Ótica tive � � � �

pensamentos negativos

26. Pensei em muitas coisas enquanto esperava para realizar estes exames � � � �

27. Ter ar nos intestinos não me incomodou na Colonoscopia Virtual � � � �

Anexos

171

9 - ESTATUTO SÓCIOECONÓMICO (MÉTODO GRAFFAR)

1. Profissão1.1 Directores de bancos, directores técnicos de empresas, licenciados profissionais com

títulos universitários e militares de alta patente

1.2 Chefes de secções administrativas ou de negócios empresariais, subdirectores, peritos ecomerciantes.

1.3 Ajudantes técnicos, desenhadores, caixeiros, contra-mestres, oficiais de primeira,encarregados capatazes, e mestres-de-obra.

1.4 Operários especializados com ensino primário completo (ex. motoristas, polícias,cozinheiros, etc)

1.5 Trabalhadores manuais ou operários não especializados (ex:, ajudantes de cozinha,mulheres de limpeza, etc).

2. Nível de instrução2.1 Ensino universitário ou equivalente (12 ou mais anos de estudo)

2.2 Ensino médio ou técnico superior (10 a 11 anos de estudo). Por exemplo, técnicos eperitos.

2.3 Ensino médio ou técnico inferior (8 a 9 anos de estudo).

2.4 Ensino primário completo (6 anos de estudo).

2.5 Ensino primário incompleto

3.Fontes de rendimento familiar3.1 A fonte principal é fortuna herdada ou adquirida

3.2 Os rendimentos consistem em lucros de empresas, altos honorários, lugares bemremunerados, etc

3.3 Os rendimentos correspondem a um vencimento mensal fixo, tipo funcionário

3.4 Os rendimentos resultam de salários, ou seja remuneração por semana, por horas ou àtarefa

3.5 A família é sustentada pela beneficência. Não incluir neste grupo as pensões dedesemprego ou de incapacidade

4.Conforto do alojamento4.1 Casas ou andares luxuosos, muito grandes, oferecendo aos seus moderadores o máximo

Anexos

172

conforto.

4.2 Casas ou andares que, sem serem tão luxuosos como os da categoria precedente, masespaços e confortáveis.

4.3 Casas ou andares modestos, bem construídos e em bom estado de conservação,iluminadas e arejadas

4.4 Categoria intermédia entre 3 e 5.

4.5 Alojamentos impróprios para uma vida decente, sem conforto, ventilação, iluminação ousuperlotado

5.Aspecto do bairro onde habita5.1 Bairro residencial elegante, onde o valor do terreno ou os alugueres são elevados.

5.2 Bairro residencial bom, de ruas largas com casas confortáveis e bem conservadas.

5.3 Ruas comerciais ou estreitas e antigas, com casas de aspecto geral menos confortável.

5.4 Bairro social, populoso, mal arejado ou bairro em que o valor do terreno é baixo

5.5 Bairros de lata

Critérios de cotação do estatuto sócio-económico

Nível Classificação Pontos1 superior 5 a 92 médio superior 10 a 133 média 14 a 174 média baixa 18 a 215 inferior 22 a 25

Cotação Final

PontuaçãoProfissãoNível de instruçãoFontes de rendimento familiarConforto do alojamentoAspecto do bairro onde habita

Total

Anexos

173

10 -TABELA SUPLEMENTAR L-DNA1

Tabela 1 - Positividade do marcador molecular L-DNA de acordo com as caraterísticasda amostra e das lesões mais avançadas (CV, indivíduos com apenas 1 lesão)

L-DNA

- + χ2/teste t valor-p OR IC a 95% RLa)

n=113 n=19 B valor-p

Sexo Masc/Fem (% Masc) 54/59 (47,8%) 9/10 (47,3%) 0,001 1 1,017 0,384-2,691 -0,726 0,041

Idade Média anos (d.p.) 58,9 (6,1) 56,1 (4,6) 1,926 0,056 0,033 0,280

Presença de lesões Com lesões (%) 53 (86,9%) 8 (13,1%) 0,151 0,806 0,823 0,308-2,200Sem lesões (%) 60 (84,5%) 11 (15,5%)

Lesão mais avançada Dimensão1-5mm 36 (83,7%) 7 (16,3%) 1,524 0,4676-9mm 11 (91,7%) 1 (8,3%)

>9mm,maligna 6 (100%) 0 (0%)Outras

RegiãoRecto 15 (93,8%) 1 (6,3%) 4,433 0,489

Cólon sigmóide 15 (93,8%) 1 (6,3%)Cólon descendente 7 (77,8%) 2 (22,2%)

Cólon transverse 8 (72,7%) 3 (27,3%)Cólon ascendente 5 (83,3%) 1 (16,7%)

Cego 3 (100%) 0 (0%)

Caraterizção histológicab)

Adenocarcinoma bem diferenciado 1 (100%) 0 (0%) 7,256 0,123Adenoma tubular séssil com displasia alto grau 9 (90%) 1 (10%)

Adenoma tubular séssil com displasia baixo grau 20 (95,2%) 1 (4,8%)Pólipo hiperplásico séssil 15 (88,2%) 2 (11,8%)

Pólipo hiperplásico séssil serreado 4 (57,1%) 3 (42,9%)

Adenoma 29 (93,5%) 2 (6,5%) 1,391 0,239 3,723 0,663-30,140

Pólipo 19 (79,2%) 5 (20,8%)

Os valores-p<0,05 encontram-se destacados a negritoa) Regresão logística, variável "Presença de lesões", método B-step (Wald), com L-DNA, Sexo e Idadeb) Na caraterização histológica, não foram consideradas classes com n<3.

Anexos

174

Anexos

175

11 - TABELA SUPLEMENTAR L-DNA2

Tabela 2 - Positividade do marcador molecular L-DNA de acordo com as caraterísticasda amostra e das lesões mais avançadas (Colonoscopia Virtual)

- + 2/teste t valor-p OR IC a 95%

n=161 n=31 B valor-p

SexoMasc/Fem (% Masc) 69/95 (42,3%) 17/14 (54,8%) 1,643 0,238 0,605 0,279-1,309 -0,376 0,197

IdadeMédia anos (d.p.) 59,5 (6,1) 58,3 (6,9) 1,034 0,303 0,025 0,290

Presença de lesõesCom lesões (%) 86 (81,0%) 20 (19,0%) 1,597 0,241 1,668 0,752-3,703Sem lesões (%) 78 (87,6%) 11 (12,4%)

Lesão mais avançadaDimensão

1-5mm 44 (78,6%) 12 (21,4%) 0,247 0,8846-9mm 21 (80,8%) 5 (19,8%)

>9mm,maligna 20 (83,3%) 4 (16,7%)

Região b)

Recto 24 (82,8%) 5 (17,2%) 1,999 0,849Cólon sigmóide 31 (84,2%) 6 (15,8%)

Cólon descendente 6 (75,0%) 2 (25,0%)Cólon transverso 12 (75,0%) 4 (25,0%)

Cólon ascendente 6 (66,7%) 3 (33,3%)Cego 6 (85,7%) 1 (14,3%)

a) Regressão logística, variável "Presença de lesões", método B-step (Wald), com L-DNA, Sexo e Idade

b) Na caraterização histológica, não foram consideradas classes com n<3.

L-DNA

RL a)

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