UNIVERSIDADE DE LISBOA Farmacogenética em Toxicologia ...

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA

Farmacogenética em Toxicologia Forense:

Estudo do gene CYP2D6 em amostras post mortem com tramadol

Suzana de Morais Valente Martins da Fonseca Orientador: Mestre Mário João Dias Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P.

Co-Orientador: Prof. Doutor Jorge Costa Santos Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Dissertação especialmente elaborada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Legal e Ciências Forenses

Lisboa, 2016

Todas as afirmações contidas neste trabalho são da exclusiva responsabilidade do seu

autor, não cabendo à Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa qualquer

responsabilidade pelos conteúdos apresentados.

A impressão desta dissertação foi aprovada pelo Conselho Científico

da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa em reunião de

19 de janeiro de 2016.

Divulgação Científica

Os resultados obtidos com este trabalho foram submetidos para publicação sob a forma

de artigo científico com o título “Sequencing CYP2D6 for the detection of poor-

metabolizers in post-mortem blood samples with tramadol” na revista Forensic Science

International, estando à data em fase de revisão.

O trabalho desenvolvido foi também alvo de divulgação na comunidade científica

através de comunicações orais e comunicações em painel (“poster”), em encontros

nacionais e internacionais.

Comunicações orais:

Sequencing CYP2D6 in post-mortem blood samples with high concentration of

tramadol for the detection of *3, *4, *6, *8, *10 and *12 alleles, 53rd TIAFT

Meeting, 31 - 4 agosto, 2015, Florença, Itália.

Farmacogenética em toxicologia forense aplicação a amostras post mortem para

interpretação de resultados em casos de tramadol; II Jornadas Ibéricas de

Toxicologia, 13-15 de Novembro de 2014, Covilhã, Portugal.

Patologia molecular: aplicação da farmacogenética na interpretação de

resultados toxicológicos de amostras post mortem; I Conferência do Instituto

Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, 30 a 31 de Outubro de 2014,

Coimbra, Portugal.

Comunicações em painel:

Pharmacogenetics application to forensic toxicology: Sequencing CYP2D6 in

post-mortem blood samples with high concentration of tramadol for the

detection of *3, *4, *6, *8, *10 and *12 alleles; 9th ISABS Conference on

Forensic and Anthropologic Genetics, June 22-26, 2015, Republic of Croatia

Pharmacogenetics application to forensic toxicology: Sequencing CYP2D6 in

post mortem blood samples with high concentration of tramadol; SPGH 18th

annual reunion, 19 – 21 November, 2014, Lisbon, Portugal.

Agradecimentos

Ao meu orientador, Mestre Mário João Dias, o meu profundo reconhecimento

por me ter dado esta oportunidade, pela inspiração quer na escolha do tema quer na

pessoa que é, pelos conselhos e críticas que me permitiram fazer mais e melhor, e acima

de tudo por acreditar em mim.

Aos meus orientadores Mestre António Amorim e Mestre Heloísa Afonso Costa

pela disponibilidade, incentivo, confiança e por todos os conhecimentos científicos que

me transmitiram, guiando os meus passos na descoberta desse “mundo novo” da

Genética Forense.

Ao meu orientador Professor Jorge Costa Santos por toda a disponibilidade,

aconselhamento e apoio prestado.

À Mestre Maria João Porto, na qualidade de Diretora do Serviço de Genética e

Biologia Forenses, e também à Dra. Teresa Ribeiro, na qualidade de Coordenadora da

Unidade Funcional da delegação Sul, por me permitirem a realização do projeto nas

instalações deste Serviço e disponibilização dos meios necessários à sua concretização.

Também um sincero agradecimento a toda a equipa do laboratório de Genética, bem

como colegas de estágio e mestrandas, pelas ajudas técnicas, apoio e boa disposição.

Ao Mestre João Miguel Franco, na qualidade de Director do Serviço de Química

e Toxicologia Forenses, mas também na qualidade de colega e amigo, com quem muito

aprendi desde que entrei no, então, IMLL.

Aos meus colegas e amigos do SQTF, companheiros de venturas e desventuras

deste e de outros projetos: Carla Mustra, Mário Barroso, Suzel Costa, Nuno Gonçalves,

Francisco Vale, Susana Simões, António Castañera, Elsa Rodrigues, Luísa Almeida e

Paula Rodrigues. Também à Catarina Mourato, à Rita Garção, ao David Pereira e à

Alexandra Gonçalves pelo incentivo e pela troca de ideias.

Aos Amores da minha vida: Gabriel Morais Gonçalves, Joana Morais Gonçalves,

Miguel Costa, Célia Figueira, Tiago Martins da Fonseca e José Martins da Fonseca, que

são o meu suporte, a minha força e estão sempre a meu lado.

À restante família e amigos e a todos os que de uma forma ou de outra estiveram

presentes e me ajudaram neste percurso.

O meu muito grande OBRIGADA!

Desloquei-me para tudo ver de um outro lado:

Levei o meu olhar, o desejo de um princípio infinitamente retomado.

Ganhei sonoridade nas vozes que me habitavam silenciosamente.

Entre mar e terra eu preferia ser espuma, ter raiz e poente entre oceano e continente.

Raiz de orvalho, Mia Couto

Suzana Fonseca Página 1

Índice

Índice ................................................................................................................................. 1

Índice de Anexos ............................................................................................................... 4

Índice de tabelas ................................................................................................................ 5

Índice de figuras ................................................................................................................ 7

Abreviaturas e Siglas ......................................................................................................... 9

2 Resumo .................................................................................................................... 13

Abstract ........................................................................................................................... 15

3 Introdução ................................................................................................................ 17

3.1 A Medicina Legal em Portugal ......................................................................... 17

3.2 Interpretação de resultados post mortem .......................................................... 20

3.3 Farmacocinética ................................................................................................ 24

3.4 Farmacogenética ............................................................................................... 28

3.4.1 Resumo histórico ....................................................................................... 28

3.4.2 Aplicação da farmacogenética .................................................................. 30

3.4.3 Genótipo e Fenótipo .................................................................................. 31

3.4.4 Farmacogenética em contexto forense ...................................................... 33

3.5 CYP2D6 ........................................................................................................... 35

3.5.1 Enzima CYP2D6 ....................................................................................... 39

3.5.2 Gene CYP2D6 ........................................................................................... 41

3.5.3 Variantes genéticas .................................................................................... 42

3.5.4 Diferenças populacionais .......................................................................... 43

3.5.5 Casos publicados ....................................................................................... 45

3.6 Tramadol ........................................................................................................... 46

3.7 Técnicas e métodos de genotipagem ................................................................ 52

4 Objetivos .................................................................................................................. 55

5 Materiais e Métodos ................................................................................................. 57

5.1 Amostragem ..................................................................................................... 57

5.2 Metodologia de análise genética ...................................................................... 58

5.2.1 Preparação das amostras ........................................................................... 59


5.2.2 Extração de ADN ...................................................................................... 59

5.2.3 Quantificação ............................................................................................ 60

5.2.4 Seleção dos alelos ..................................................................................... 60

5.2.5 Amplificação por PCR .............................................................................. 61

5.2.6 Purificação dos produtos amplificados ..................................................... 64

5.2.7 Verificação em gel de poliacrilamida ....................................................... 64

5.2.8 Sequenciação ............................................................................................. 64

5.2.9 Detecção por eletroforese capilar .............................................................. 66

5.2.10 Análise dos resultados ............................................................................... 67

5.3 Validação do método de análise genética ......................................................... 67

5.3.1 Especificidade e Exatidão ......................................................................... 68

5.3.2 Limiares analíticos .................................................................................... 70

5.3.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade ............................ 70

5.3.4 Qualidade média dos resultados. ............................................................... 71

5.4 Metodologia de quantificação de tramadol e metabolitos ................................ 71

5.4.1 Preparação das amostras ........................................................................... 72

5.4.2 Extração em fase sólida ............................................................................. 72

5.4.3 Análise por GC/MS ................................................................................... 73

5.4.4 Avaliação dos resultados ........................................................................... 73

5.5 Validação do método de quantificação de tramadol e metabolitos .................. 74

5.5.1 Especificidade/seletividade, capacidade de identificação e avaliação de

interferentes ............................................................................................................. 75

5.5.2 Eficiência da extração ............................................................................... 76

5.5.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação ........ 76

5.5.4 Linearidade e Modelo de Calibração ........................................................ 76

5.5.5 Precisão Intermédia, Repetibilidade e Exatidão. Arrastamento entre

análises consecutivas. .............................................................................................. 77

5.5.6 Robustez .................................................................................................... 78

5.6 Metodologia para a análise estatística da correlação entre os resultados da

análise genética e toxicológica .................................................................................... 78

6 Resultados ................................................................................................................ 79

6.1 Validação do método de análise genética ......................................................... 80

6.1.1 Especificidade e exatidão .......................................................................... 81

6.1.2 Limite de detecção .................................................................................... 84


6.1.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade ............................ 85

6.1.4 Qualidade média dos resultados. ............................................................... 86

6.2 Validação do método de quantificação do tramadol e metabolitos .................. 89

6.2.1 Especificidade/Seletividade, Capacidade de Identificação e Avaliação de

interferentes ............................................................................................................. 89

6.2.2 Eficiência da extração ............................................................................... 89

6.2.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação ........ 90

6.2.4 Linearidade e Modelo de Calibração ........................................................ 90

6.2.5 Precisão Intermédia e Repetibilidade ........................................................ 92

6.2.6 Exatidão ..................................................................................................... 92

6.3 Resultados de amostras ..................................................................................... 94

6.4 Estudo de casos ............................................................................................... 104

7 Discussão ............................................................................................................... 107

7.1 Metodologia de análise genética .................................................................... 107

7.2 Metodologia de análise toxicológica .............................................................. 113

7.3 Resultados do estudo das amostras ................................................................. 114

8 Perspetivas futuras ................................................................................................. 117

9 Conclusões ............................................................................................................. 119

10 Bibliografia ............................................................................................................ 121


Índice de Anexos

Anexo I – Certificados dos Materiais de Referência usados na Validação do Método

de Análise Genética ................................................................................................... A3

Anexo I.1. Certificado do material de referência MR1 (CYP2D6*4) .................. A3



Anexo II – Resultados de Validação do Método de Análise Genética...................... A6

Anexo II.1. Sequências analisadas no software Sequencing analysis .................. A6

Anexo II.2. Variantes genéticas identificadas com o SeqScape nas amostras. ..... A8

Anexo III – Fórmulas de Cálculo Utilizadas na Validação do Método de

Quantificação de Tramadol e Metabolitos ................................................................ A9

Anexo III.1. Recuperação ..................................................................................... A9

Anexo III.2. Teste da Homogeneidade de Variâncias (Teste F) ........................... A9

Anexo III.3. Modelo de Calibração .................................................................... A10

Anexo III.4. Precisão Intermédia, Repetibilidade e Limite de Repetibilidade ... A11

Anexo III.5. Exatidão e Cálculo da Incerteza ..................................................... A12

Anexo IV – Resultados de Validação do Método de Quantificação de Tramadol e

Metabolitos .............................................................................................................. A14

Anexo IV.1. Linearidade .................................................................................... A14

Anexo IV.2. Precisão intermédia e repetibilidade .............................................. A18

Anexo IV.3. Exatidão e Incerteza do método ..................................................... A23

Anexo IV.4. Espectros de massa do Tramadol, N-desmetil-tramadol e O-

desmetil-tramadol ............................................................................................... A27


Índice de tabelas

Tabela 1. Classificação dos genótipos CYP2D6 em função do fenótipo esperado...... 32

Tabela 2. Distribuição populacional da prevalência dos alelos mais estudados e a

correspondente atividade enzimática. .......................................................... 44

Tabela 3. Prevalência dos fenótipos da enzima CYP2D6 na população caucasiana ... 44

Tabela 4. Sequências dos primers e localização dos fragmentos. ................................ 63

Tabela 5. Condições dos ciclos de temperatura da reação de PCR. ............................. 63

Tabela 6. Condições dos ciclos de temperatura da reação de sequenciação. ............... 65

Tabela 7. Extração em fase sólida com colunas Waters Oasis HLB®. ....................... 72

Tabela 8. Descrição dos parâmetros de análise instrumental por GC/MS. .................. 73

Tabela 9. Tolerância máxima para as áreas relativas dos iões diagnóstico. ................ 74

Tabela 10. Códigos das amostras utilizadas nos ensaios de validação do método. ..... 81

Tabela 11. Resultados da pesquisa das sequências obtidas para 3 amostras com o

BLAST. ........................................................................................................ 82

Tabela 12. Perfil genético dos Materiais de Referência. .............................................. 84

Tabela 13. Resultados obtidos no ensaio do limite de detecção. ................................. 84

Tabela 14. Resultados obtidos no ensaio de reprodutibilidade para 15 amostras. ....... 85

Tabela 15. Resultados obtidos no ensaio de repetibilidade. ......................................... 85

Tabela 16. Valores médios de sinal e de sinal/ruído obtidos no ensaio de validação da

qualidade média dos resultados. .................................................................. 87

Tabela 17. Valor de sample score obtidos no ensaio de validação .............................. 87

Tabela 18. Critérios de aceitação usados no ensaio de validação da qualidade média

dos resultados .............................................................................................. 88

Tabela 19. Resultados de recuperação ......................................................................... 90


Tabela 20. Somatório dos desvios dos calibradores em 5 curvas de calibração, bem

como o fator de correlação médio, para cada fator de ponderação ............. 91

Tabela 21. Coeficientes de variação do estudo da precisão intermédia. ...................... 92

Tabela 22. Recuperações médias obtidas nas três gamas de concentrações. ............... 92

Tabela 23. Incerteza obtida durante a avaliação do parâmetro da exatidão. ................ 93

Tabela 24. Resumo dos resultados de validação do método de quantificação. ............ 93

Tabela 25. Resumo dos resultados de genotipagem e de quantificação de tramadol... 96

Tabela 26. Frequências alélicas obtidas nas amostras post mortem. ............................ 98

Tabela 27. Frequência de genótipo e fenótipo previsto para as amostras post mortem.

..................................................................................................................... 98

Tabela 28. Estatística descritiva das concentrações de tramadol (TMD), N-

desmetiltramadol (NDT) e O-desmetiltramadol (ODT) obtidas nas 100

amostras post mortem analisadas. ................................................................ 99

Tabela 29. Resultados de p-value por aplicação dos testes de Mann-Whitney e de

Jonckheere-Terpstra (JT) para comparação entre grupos. ......................... 103

Tabela 30. Resumo da informação fornecida ao SQTF e dos resultados obtidos na

análise toxicológica e genética dos casos de metabolizadores lentos. ...... 105


Índice de figuras

Figura 1. Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450 ....... 36

Figura 2. Representação esquemática do funcionamento das CYP ............................. 37

Figura 3. Distribuição das enzimas CYP de acordo com o número de medicamentos

que metabolizam e fatores que podem influenciar a sua variabilidade. ...... 38

Figura 4. Representação da estrutura química dos enanteómeros do tramadol ........... 47

Figura 5. Representação esquemática do metabolismo do tramadol. .......................... 49

Figura 6. Fluxograma do método de análise genética. ................................................. 58

Figura 7. Variantes do gene CYP2D6 estudadas neste trabalho. ................................. 61

Figura 8. Demonstração esquemática da sequenciação com BigDye Terminator v. 3,1.

..................................................................................................................... 66

Figura 9. Pesquisa da sequência FH da amostra CYP016 no BLAST ......................... 82

Figura 10. Sequências obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências

dos pseudogenes, segundo a entrada M33387.1 do Genebank. ................... 83

Figura 11. Eletroferogramas dos polimorfismos identificados nos materiais de

referência: .................................................................................................... 83

Figura 12. Alinhamento das sequências obtidas durante o ensaio de repetibilidade na

amostra CYP025. ......................................................................................... 86

Figura 13. Sobreposição das sequências obtidas com a de referência utilizando o

SeqScape. ..................................................................................................... 86

Figura 14. Fenótipo previsto com base nas variantes alélicas encontradas nas amostras.

..................................................................................................................... 94


Figura 15. Correlação entre a razão logarítmica de concentração TMD/ODT e

TMD/NDT com o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência

de variantes; IM ao genótipo *10/*10 ou *4/*10; PM ao genótipo *3/*4 e

*4/*4. ........................................................................................................... 99

Figura 16. Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/ODT com o

fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; IM

ao genótipo *10/*10 ou *4/*10; PM ao genótipo 3/*4 e *4/*4. ................ 100

Figura 17. Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/TMD e o

genótipo do indivíduo, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes;

EM1 a um alelo *10; EM2 a um alelo *4 ou *6; IM a *10/*10 ou *4/*10 e

PM a *4/*4 ou *3/*4. ................................................................................ 101

Figura 18. Correlação entre a razão de concentrações TMD/ODT, TMD/NDT e

NDT/TMD e o fenótipo previsto do indivíduo, onde INIB é o grupo dos

casos com inibidores enzimáticos. ............................................................. 102


Abreviaturas e Siglas

ºC graus Celcius

µL / µg / µM microlitro / micrograma / micromolar

A Adenina

AB Applied Biossystems

ADME Fase da Farmacocinética: Absorção, Distribuição, Metabolização e

Excreção

ADN / DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês deoxyribonucleic acid)

ADR Reações adversas (do inglês adverse reactions)

BLAST Ferramenta de pesquisa em bases de dados genéticas disponibilizada

online pela NCBI (do inglês Basic Local Alignment Search Tool)

C Citosina

CNV Variação do número de cópias do gene

(do inglês Copy Number Variation)

CV Coeficiente de variação percentual

CYP450 Citocromo P450

CYP2D6 Proteína da família CYP450, família 2, subfamília D, isoforma 6

Gene que codifica a síntese da proteína CYP2D6

Cypallele Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Database

(disponível em http://www.cypalleles.ki.se)

dNTPs Desoxinucleótidos trifosfatados

(do inglês deoxy-nucleotide triphosphate)

ddNTPs Di-desoxinucleótidos trifosfatados

(do inglês di-deoxy-nucleotide triphosphate)


EI Ionização Electrónica (do inglês, Electronic Ionization)

EM Metabolizador extensivo/normal (do inglês Extensive Metabolizer)

EMR Erro médio relativo

ER% Erro relativo percentual

eV electrão volt

Fcrit Valor tabelado da distribuição F para (N-1;N-1;\)

FDA Food and Drug Admistration

G Guanina

GC-MS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa

(do inglês Gas Chromatography-Mass Spectrometry)

ID Índice de Degradação

IM Metabolizador intermédio (do inglês Intermediate Metabolizer)

INMLCF Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P.

(Instituto Público)

ISO International Organization for Standardization

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

LC-MS Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massa

(do inglês Liquid Chromatography-Mass Sprectrometry)

LOD Limite de detecção (do inglês Limit of Detection)

LOQ Limite de quantificação (do inglês Limit of Quantification)

m/z Razão massa/carga

MeOH Metanol

min minuto

NCBI National Center for Biotechnology Information

NDT N-desmetil-tramadol


ODT O-desmetil-tramadol

OMS Organização Mundial de Saúde

OPRM1 Gene que codifica o receptor opióide µ.

pb / kb Pares de bases / 1000 pares de bases

PCR Reação de polimerase em cadeia

(do inglês Polymerase Chain Reaction)

PharmGKB PharmGKB Knowledge Base (disponível em www.pharmgkb.org)

PI Padrão interno

pka Constante de ionização

PM Metabolizador lento (do inglês Poor Metabolizer)

r2 Coeficiente de correlação

rpm Rotações por minuto

Sy/x Desvio-padrão residual, erro-padrão

SIM Monitorização seletiva de iões (do inglês Selective Ion Monitoring)

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Polimorfismo de nucleótido único

(do inglês Single Nucleotide Polimorphism)

SGBF Serviço de Genética e Biologia Forenses

SPE Extração em Fase Sólida (do inglês Solid Phase Extraction)

SQTF Serviço de Química e Toxicologia Forenses

S/R Razão sinal/ruído (do inglês signal-to-noise)

SSRIs Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina

(do inglês Selective serotonin reuptake inhibitor)

SWGDAM Scientific Working Group for DNA Analysis Methods

T Timina


TMD Tramadol

tr Tempo de retenção

trr Tempo de retenção relativo

UM Metabolizador ultra-rápido (do inglês Ultrarapid Metabolizer)

WADA World Anti-Doping Agency

Wi Fator de ponderação (do inglês weighing)

WT Sequência genética de referência (do inglês Wild Type)


1 Resumo

A variabilidade genética tem impacto na resposta individual aos fármacos, com

repercussões nas concentrações e nos efeitos observados. Os exames de toxicologia

forense são importantes para conhecer a contribuição dos xenobióticos na causa de

morte e as circunstâncias em que esta ocorreu. A aplicação das metodologias de

farmacogenética a casos post mortem é ainda pouco frequente, dependendo sobretudo

das características do gene a estudar e da existência de metodologias adequadas à

análise de amostras da rotina pericial. Por outro lado, para que os resultados possam

ser utilizados como prova em tribunal, é essencial dispor de fundamentação científica

para a sua interpretação, que pode ser obtida através de estudos de correlação entre os

resultados da genética e da toxicologia.

O tramadol é bioactivado por metabolização em O-desmetiltramadol, por acção da

enzima CYP2D6. Algumas variantes genéticas são responsáveis por alterações na

expressão enzimática e, portanto, na resposta analgésica e nas concentrações

encontradas nas amostras post mortem, para o tramadol e para os seus metabolitos.

Nos casos post mortem com tramadol, a identificação dos metabolizadores lentos pela

pesquisa de variantes genéticas descritas como não-funcionais pode ser útil para

explicar algumas circunstâncias relacionadas com a morte.

O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologia de sequenciação

parcial do gene CYP2D6 para a detecção de variantes genéticas responsáveis pela

inativação da atividade enzimática, tendo em vista a identificação de metabolizadores

lentos. A metodologia foi aplicada a casos post mortem positivos para tramadol.

Foram selecionadas e analisadas 100 amostras de sangue post mortem com tramadol.

O ADN foi extraído pelo método de Chelex 100® e quantificado por Real-time PCR


usando Quantifiler Trio da Applied Biosystems (AB). A amplificação dos fragmentos

de interesse do gene CYP2D6 foi efetuada por PCR com MasterMix da Qiagen. Os

fragmentos amplificados foram sequenciados com Big Dye v.3.1 cycle sequence e

detetados por eletroforese capilar num Genetic Analyser 3130 (AB). As sequências

obtidas foram comparadas com a de referência usando o programa informático

SeqScape v3. O método foi validado de acordo com recomendações internacionais. Foi

também validado o método de confirmação quantitativa de tramadol e dos seus

metabolitos N-desmetil-tramadol e O-desmetil-tramadol.

Os métodos foram aplicados com sucesso às amostras de sangue post mortem. As

distribuições de alelos e de genótipos das amostras analisadas estão de acordo com o

esperado para a população portuguesa e europeia. O metabolismo do tramadol,

expresso pela razão de concentrações entre os seus metabolitos (N-desmetil-

tramadol/O-desmetil-tramadol), demonstrou estar correlacionado com os fenótipos

previstos na análise genética, em particular no caso dos metabolizadores lentos. Foi

demonstrada também a importância da pesquisa de substâncias inibidoras da atividade

enzimática, nos casos de tramadol. De acordo com o nosso conhecimento, este é o

primeiro estudo em que a metodologia de sequenciação do gene CYP2D6 foi validada

e aplicada com sucesso a amostras post mortem, em Portugal. As metodologias

desenvolvidas permitem a recolha sistemática de resultados em casos post mortem,

constituindo ferramentas essenciais para fundamentar a utilidade da farmacogenética

na interpretação de casos de tramadol, numa avaliação conjunta entre a patologia, a

toxicologia e a genética forenses.

Palavras-chave: farmacogenética; CYP2D6; tramadol; post mortem; toxicologia

forense


Abstract

Genetic variation is related to individual drug response, with influence in the

concentration and effects observed. Forensic toxicology is important to know the

contribution of drugs to the cause of death and its circumstances. Forensic

pharmacogenetics is a relatively new and growing area of research and to be used in

the court decisions it is essential to have reliable methodologies that can be applied to

routine analysis. On the other hand, the interpretation of the results depends on the

knowledge based on scientific research with statistical coverage that can be obtained

by correlation studies between genetic and toxicology results.

Tramadol is bioactivated by metabolization to O-demethyl-tramadol, by CYP2D6

enzyme. Some genetic polymorphisms are responsible for the variability in the

expression of this enzyme, changing the individual drug response and also the post-

mortem concentrations of tramadol and its metabolites. The poor-metabolizers

identification by detection of allelic variants described as non-functional can be useful

to explain some circumstances of death in the study of post-mortem cases with

tramadol.

The aim of this work was the development of a Sanger sequencing methodology for

CYP2D6 gene to identify genetic variants that cause absence of enzyme activity and

its application to post-mortem cases with tramadol.

100 post-mortem blood samples were selected and analyzed. DNA was extracted by

Chelex 100® method and quantitated with Applied Biosystems (AB) Quantifiler Trio

Kit ® by Real-time PCR. Genetic fragments amplification was done by PCR using

Qiagen MasterMix. Sanger sequencing was performed with Big Dye v.3.1 cycle

sequence and detected in a Genetic Analyser 3130 (AB). Allelic variants were found


comparing the results with a reference sequence using SeqScape v3 software. The

sequencing method was validated following international guidelines as well as the

method used for tramadol and main metabolites quantification.

The methods were successfully applied to post mortem blood samples. Alleles and

genotype frequencies were in accordance with the expected for European population.

Tramadol metabolism, expressed as its metabolites concentration ratio (N-

desmethyltramadol/O-desmethyltramadol), has been shown to be correlated with the

predicted phenotypes based on genetic characterization. It was also demonstrated the

importance of enzyme inhibitors identification in the toxicology analysis. According

to our knowledge, this is the first time that a CYP2D6 sequencing methodology is

validated and applied to post-mortem samples, in Portugal. The developed

methodology allows the data collection of post-mortem cases, which is of primordial

importance to enhance the use of these pharmacogenetic tools to explain some

circumstances of death in the study of tramadol positive cases and demonstrate the

importance of this pharmacogenetics tools to forensic toxicology and pathology.

Keywords: pharmacogenetics, CYP2D6, tramadol, post-mortem, forensic toxicology


2 Introdução

A Medicina Legal e o mundo das Ciências Forenses vivem em progressiva fusão de

conhecimentos, no sentido de conseguir as melhores soluções na aplicação da Lei para

a realização da Justiça, contribuindo ainda para a melhoria da saúde pública e para o

desenvolvimento científico. O crescimento conjunto desta diversidade disciplinar vai

esbatendo as suas fronteiras, no ressurgir de um conhecimento abrangente e com

grande potencial de crescimento.

2.1 A Medicina Legal em Portugal

O Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P. (INMLCF), é um

instituto público dotado de autonomia administrativa e financeira e de património

próprio, sob a superintendência e a tutela do membro do governo responsável pela área

da justiça. Tem a natureza de laboratório do Estado com jurisdição sobre todo o

território nacional e é considerado “instituição nacional de referência” na área da

Medicina Legal e Ciências Forenses. (DL n.º 166/2012, de 31 de Julho)

Em 1899, com a Carta-Lei de 17 de Agosto, foram criadas as morgues de Lisboa,

Coimbra e Porto destinadas a efetuar exames médico-forenses e vocacionadas para o

ensino da Medicina Legal. Em Lisboa, a morgue estava localizada nas proximidades

do “Campo de Sant’Ana”, onde se encontrava sediada a Faculdade de Medicina. Os

exames químicos e toxicológicos foram realizados no Laboratório Químico da Escola

Politécnica até 1 de Abril de 1912, data em que, sob a direção do Prof. Dr. Azevedo

Neves, começou a funcionar o Laboratório de Química da morgue de Lisboa (Reys,

1985).


Durante a 1ª República, em 1918, com a presidência de Sidónio Pais, foram

construídos e criados os Institutos de Medicina Legal de Lisboa, Coimbra e Porto, cuja

direção era reservada a docentes das Faculdades de Medicina. O decreto-lei 5:023

publicado a 3 de Dezembro de 1918, regulamenta a organização dos serviços periciais

medico-forenses, definindo as circunscrições territoriais de cada Instituto. Este

decreto-lei estabeleceu ainda que, para o seu funcionamento, os Institutos deveriam

estar equipados com um laboratório químico, destinado a análises toxicológicas e

outras de química forense, além de outros laboratórios (de medicina-legal, de

antropologia, de psicologia experimental e de fotografia) e ainda um museu, um

arquivo e uma biblioteca.

No final do século XX a evolução tecnológica foi fundamental para a renovação dos

serviços técnicos, com a introdução de novas técnicas e tecnologias, quer de análise

toxicológica (como a aquisição de equipamentos de GC/MS e HPLC), quer de

genética e biologia molecular (com o desenvolvimento de técnicas de PCR e de

eletroforese).

Em 2001 foi criado o Instituto Nacional de Medicina Legal, de âmbito nacional,

sediado em Coimbra e com 3 delegações sem autonomia administrativa nem

financeira, na dependência das quais funcionam os Gabinetes Médico-Legais da sua

área de atuação: a delegação do Norte no Porto, a delegação do Centro em Coimbra e

a delegação do Sul em Lisboa.

Em 2012, a nova Lei Orgânica estabelece que o Instituto passa a designar-se Instituto

Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P. (INMLCF), com novas

competências funcionais na área das ciências forenses. Os Serviços de Genética e

Biologia Forenses e de Química e Toxicologia Forenses passam a ser unidades


orgânicas de carácter nacional, estando sediados em Coimbra e Lisboa, respetivamente,

dispondo de extensões funcionais nas outras delegações.

A atividade pericial do INMLCF está enquadrada pela Lei nº 45/2004 de 19 de

Agosto, que estabelece o regime jurídico das perícias médico-legais e forenses; pela

Lei Orgânica, constante do DR no Decreto-Lei n.º 166/2012 de 31 de Julho; e pelos

Estatutos, constantes da Portaria n.º 19/2013 de 21 de Janeiro. Os serviços técnicos do

INMLCF são o Serviço de Clínica e Patologia Forenses; o Serviço de Genética e

Biologia Forenses e o Serviço de Química e Toxicologia Forenses.

O Serviço de Clínica e Patologia Forenses compreende duas unidades funcionais: a de

Clínica Forense e a de Patologia Forense. À unidade funcional de Clínica Forense

compete a realização de exames e perícias em pessoas: para a descrição e avaliação

dos danos provocados na integridade psicofísica relevantes para os diversos domínios

do Direito, bem como os exames de natureza psiquiátrica e psicológica ou outros atos

neste domínio. A unidade funcional de Patologia Forense assegura a realização das

autópsias médico-legais; dos exames de anatomia patológica forense; da identificação

de cadáveres e de outros restos humanos; do embalsamamento e do estudo de peças

anatómicas. Entre 2010 e 2014, foram realizadas em média 6200 autópsias por ano

( http://www.inml.mj.pt/).

O Serviço de Química e Toxicologia Forenses assegura a realização de perícias e

exames laboratoriais químicos e toxicológicos, para a determinação, confirmação e

quantificação de substâncias químicas, nomeadamente: drogas de abuso;

medicamentos; pesticidas; etanol e outros voláteis; monóxido de carbono; cianeto ou

alguns metais. As pesquisas são efetuadas em diversas matrizes, principalmente

biológicas, nos seguintes âmbitos: perícias médico-legais efetuadas no vivo ou post

mortem; fiscalização da condução sob a influência de substâncias psicotrópicas ou de


estupefacientes; controlo de consumo de substâncias psicoativas em meio laboral;

avaliação dos estados de influência como causa de perigosidade ou de

inimputabilidade; caracterização do estado de toxicodependência, entre outras. Como

exame complementar de autópsia, a perícia toxicológica é requerida sempre que o

perito médico considere necessário avaliar a presença de substâncias que possam

explicar a causa da morte ou das circunstâncias em que a mesma ocorreu. São

requisitados exames toxicológicos em cerca de 84% das autópsias realizadas no

INMLCF. As principais substâncias pesquisadas são o etanol, os medicamentos e as

drogas de abuso tendo uma prevalência de casos positivos de 38%, 47% e 12%,

respetivamente (J. M. Franco, 2015).

O Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) assegura a realização de perícias e

exames de identificação genética de indivíduos vivos, cadáveres ou restos cadavéricos,

perícias de investigação de parentesco biológico e perícias de criminalística biológica.

As perícias são realizadas em diversos vestígios biológicos, tais como: sangue, sémen,

saliva, cabelos, ossos, dentes ou outros tecidos. Como exame complementar de

autópsia, uma das principais finalidades da investigação genética é a identificação de

desconhecidos.

2.2 Interpretação de resultados post mortem

A autópsia médico-legal é efetuada sempre que haja suspeita de morte violenta ou de

causa desconhecida, sendo também relevante em mortes aparentemente não violentas

mas inexplicadas. Os principais objetivos são:

a. A identificação do indivíduo;

b. Determinar a causa e circunstâncias da morte;

c. Determinar a data e a hora da morte,


d. Estabelecer a etiologia médico-legal.

O recurso a exames complementares de autópsia é frequente e é habitualmente

efetuado por requisição aos laboratórios de toxicologia, de genética ou de anatomia

patológica do INMLCF. O relatório de autópsia deverá reunir toda a informação do

processo e a sua interpretação integrada, numa perspetiva multidisciplinar. A

interpretação dos resultados do exame complementar de toxicologia deve ser sempre

enquadrada pela informação prévia (v. g. a informação recolhida pela investigação

policial e os dados clínicos), pelos achados autópticos e também pelos resultados de

outros exames complementares (Mozayani & Raymon, 2004).

Os resultados toxicológicos podem ser qualitativos ou quantitativos. Nos resultados

qualitativos faz-se a confirmação da presença ou da ausência de substâncias exógenas,

em particular as passíveis de ter um efeito tóxico ou de promoverem um estado de

influência. Quando a presença de uma substância é confirmada, pode ser fundamental

a determinação da sua concentração, em particular nas amostras de sangue (Schulz,

Iwersen-bergmann, Andresen, & Schmoldt, 2012). Para a interpretação dos resultados

quantitativos, é frequentemente necessário comparar as concentrações obtidas em cada

caso com os valores de referência publicados na literatura, onde se estabelecem os

intervalos considerados terapêuticos, tóxicos ou letais (F Musshoff, Padosch,

Steinborn, & Madea, 2004; Repetto & Repetto, 2015; Schulz et al., 2012). Contudo a

comparação com os valores das tabelas deve ser feita de uma forma crítica e prudente.

Por um lado, nestas tabelas de concentração, os limites tóxicos ou letais são

suportados por casos clínicos ou post mortem já publicados, muitas vezes com pouca

expressão estatística e influenciados por fatores circunstanciais, nomeadamente pela

presença de outras substâncias. Por outro lado, as tabelas geralmente não têm valores

de referência para as concentrações dos metabolitos nem a sua relação com as


concentrações da substância primária. Estes valores são muito importantes nas

avaliações de resultados post mortem, quando se desconhecem os hábitos de consumo,

fenómenos de tolerância ou as características de cada indivíduo (Verrecas, Knaepen,

Gilissen, Cassiman, & Decorte, 2004).

Na avaliação de resultados quantitativos é ainda preciso considerar a possibilidade de

existência de variabilidade individual nas concentrações, mesmo com administração

de doses equivalentes e padronizadas. Os fatores de variabilidade individual podem ser

de natureza diversa (Frank Musshoff, Stamer, & Madea, 2010b), tais como:

a. Fisiológicos – a idade, o género ou o peso;

b. Patológicos – as patologias renais ou hepáticas, diabetes;

c. Ambientais/culturais – os hábitos alimentares ou de consumo; a exposição

continuada a substâncias tóxicas;

d. Circunstanciais – co-medicação; o stress emocional, intelectual ou físico;

e. Genéticos – as alterações genéticas que afetam a atividade enzimática ou

proteica.

As diferenças genéticas podem, portanto, ser responsáveis pela variabilidade na

resposta dos organismos à exposição a substâncias exógenas, alterando a sua

concentração e o tempo de permanência no organismo (farmacocinética), e também o

grau e o tipo de acção (farmacodinâmica). A variabilidade das concentrações reflete-se

nos efeitos observados, alterando a eficácia e a segurança da utilização dos fármacos,

podendo ocorrer reações adversas com impacto na saúde ou no comportamento do

indivíduo, podendo até conduzir à morte (Madadi et al., 2008; Frank Musshoff et al.,

2010b; Silva, Soares, & Martins, 2012). A elevada frequência de reações adversas

repercute-se também na gestão dos cuidados de saúde e nos custos associados.

Segundo Johansson et al, as reações adversas (ADR) correspondem à 5ª causa de


morte nos Estados Unidos da América e são responsáveis por mais de 7% das

hospitalizações, prevalência que ultrapassa os 30% na população com mais de 70 anos

de idade (Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011; Lazarou, Pomeranz, & Corey,

1998). As reações adversas mais graves estão geralmente relacionadas com

cardiotoxicidade e hepatotoxicidade (Buscemi & Tagliabracci, 2011; Chan, Jin, Loh,

& Brunham, 2015; Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011).

Considerando a existência de variantes genéticas responsáveis pela alteração da

resposta farmacológica, as metodologias adequadas à sua detecção em amostras post

mortem podem constituir ferramentas de particular relevância para a interpretação das

concentrações observadas em cada caso (Pelotti & Bini, 2011). Holmgren et al, tal

como descrito por Musshoff et al, (Frank Musshoff et al., 2010b) propõe critérios para

a seleção dos casos em que seria adequado recorrer ao estudo de variantes genéticas, a

saber:

Quando as concentrações relativas entre o composto administrado e os seus

metabolitos não são as esperadas;

Quando existem reações adversas relacionadas com a alteração da

biodisponibilidade da substância;

Quando a administração foi efetuada de forma controlada e as concentrações

não são correspondentes;

Quando estão presentes outras substâncias que podem ter funcionado como

inibidores enzimáticos.

As variantes genéticas mais estudadas em farmacogenética são as que têm influência

na farmacocinética da substância, em particular as que alteram a capacidade funcional

das enzimas de metabolização.


2.3 Farmacocinética

O efeito das substâncias depende da concentração disponível no seu local de acção. A

farmacocinética procura descrever a sua distribuição e transformação no organismo,

com o objetivo de conhecer a concentração disponível no órgão em que vão exercer o

efeito e qual a duração dessa disponibilidade. Para conhecer a farmacocinética das

substâncias são estudados todos os fatores que afetam a capacidade de absorção, a

distribuição, o metabolismo e a excreção, habitualmente designados por ADME (Y. O.

Franco & Franco, 2003).

A absorção consiste na passagem das substâncias do local de exposição para a corrente

sanguínea e depende muito da via de administração. A administração dos xenobióticos

pode ser oral, rectal, dérmica, por inalação ou parentérica (v.g. intramuscular,

intravenosa), entre outras. Na administração intravenosa, a substância entra

diretamente na corrente sanguínea e neste caso não há uma fase de absorção. A

administração oral é a mais frequente nos medicamentos e a absorção faz-se ao longo

de todo o trato gastrointestinal, desde o estôm go ao reto, mas com maior incidência na

parte inicial do intestino delgado (Meyer & Maurer, 2014). A absorção pode ser feita

por transporte ativo ou por difusão passiva, dependendo das características de cada

substância. A difusão passiva é mais frequente, particularmente para substâncias de

pequena dimensão molecular e lipofílicas (Asic & Of, 2008). Em algumas situações as

substâncias administradas podem não ser absorvidas, seja porque são degradadas pelo

ácido gástrico, pelas enzimas intestinais ou devido às suas características físico-

químicas (Jickells & Negrusz, 2008).

A distribuição descreve a transferência reversível da substância entre o sangue e os

tecidos e a sua extensão pode ser traduzida por um parâmetro quantitativo: o Volume

de Distribuição. A distribuição depende do fluxo sanguíneo nos tecidos e ainda de


diversos fatores associados à substância – tais como o tamanho da molécula, o grau de

ionização ao pH do sangue, a afinidade para a ligação às proteínas plasmáticas ou aos

tecidos adiposos; e associados ao indivíduo - tais como o género, a idade ou a

existência de patologias. Numa fase inicial, a distribuição faz-se pelos órgãos mais

irrigados, como o fígado, o coração, os rins e o cérebro. Com o tempo, pode haver

distribuição para os órgãos periféricos, tecidos musculares ou adiposos. O Volume de

Distribuição será elevado para as substâncias com maior afinidade para o tecido

adiposo ou a outras estruturas celulares, onde podem ficar armazenadas prolongando a

sua permanência no organismo. A distribuição das substâncias entre o plasma e os

tecidos depende também da via e frequência de administração (Jickells & Negrusz,

2008; Meyer & Maurer, 2014).

O metabolismo e a excreção são frequentemente referidos como a eliminação porque

em conjunto promovem a remoção das substâncias do organismo. A eliminação

compreende principalmente 2 vias: a via renal, por excreção dos compostos polares e

hidrofílicos na urina; e a via hepática, quer por metabolização, quer por excreção biliar.

Alguns compostos podem ser eliminados por outras vias, como é o caso do etanol que

é excretado pelo ar expirado, ou em menor quantidade por outros fluidos corporais tais

como o leite materno, o suor ou as lágrimas.

As substâncias mais hidrofóbicas são geralmente eliminadas por excreção biliar, em

particular alguns metabolitos glucoronidos e sulfatos. Quando a bílis é excretada e

libertada nos intestinos, as enzimas produzidas por algumas bactérias podem hidrolisar

estes grupos conjugados, deixando a substância livre para a reabsorção. Este fenómeno

é designado por recirculação enterohepática e, em algumas substâncias como a

morfina, tem um impacto grande no tempo de permanência no organismo (Asic & Of,

2008). Nestes casos, a presença das substâncias no conteúdo gástrico não se deve


necessariamente à administração por via oral mas sim a fenómenos de refluxo ou à

difusão passiva a partir da mucosa gástrica, em particular nos compostos alcalinos.

(Meyer & Maurer, 2014).

A absorção das substâncias exógenas por difusão passiva no epitélio intestinal é

efetuada através da bicamada fosfolipídica das membranas. Por essa razão, as

substâncias lipofílicas e com estrutura molecular pequena são mais facilmente

absorvidas de acordo com o gradiente de concentração. Em contrapartida, a sua

excreção na urina é mais difícil devido à baixa solubilidade em água e, sendo de

pequena dimensão, podem ser reabsorvidas a nível renal.

A metabolização é um mecanismo de defesa do organismo que consiste na

biotransformação dos compostos exógenos lipofílicos em substâncias hidrofílicas, para

facilitar a excreção por via renal. Os produtos de reação são os metabolitos que podem

ser substâncias activas também. Por essa razão, a metabolização altera a intensidade e

a duração da resposta farmacológica. As reações de metabolização são catalisadas

enzimaticamente, ocorrendo no local ou órgão com maior expressão da enzima

específica para cada reação, mais frequentemente no fígado.

O processo de biotransformação pode dividir-se em duas fases: numa primeira fase o

organismo procura aumentar a solubilidade em meio aquoso (metabolização de fase I)

e na fase seguinte evitar a reabsorção renal (metabolização de fase II).

O metabolismo de fase I visa transformar as substâncias lipofílicas em substâncias

mais polares, com a introdução ou exposição de grupos funcionais (–OH, –NH2, –SH

ou –COOH) através de reações de oxidação, redução, hidrólise ou desalquilação. As

reações são mediadas por enzimas, em particular pelas enzimas microssomais do

Citocromo P450 (CYP), que se localizam essencialmente no retículo endoplasmático

no fígado, mas podem também encontrar-se noutros órgãos como intestino delgado,


rins, pulmões, cérebro e pele. As substâncias lipofílicas e hidrofóbicas penetram bem

na bicamada lipídica do retículo endoplasmático dos hepatócitos, onde estão situadas

as enzimas responsáveis pela metabolização. Deste tipo de reações resultam

metabolitos polares que podem ser também ativos, e que podem diferir muito do

composto administrado no tipo, no grau e na duração dos efeitos (Asic & Of, 2008).

O metabolismo de fase II envolve reações de conjugação, formando compostos muito

polares e de maior massa molecular. Os metabolitos são conjugados por

glucuronização, sulfatação, acetilação ou metilação (Asic & Of, 2008). As enzimas

envolvidas no metabolismo de conjugação são transferases, tais como, metiltransferase

(MT), N-acetiltransferase (NAT) ou UDP-glucuroniltransferase (UGT) e os

metabolitos resultantes são geralmente inativos.

Quando uma substância é administrada por via oral, após a absorção no epitélio

intestinal, há uma primeira passagem no fígado antes da distribuição. Tanto nas células

do epitélio como nos hepatócitos existem enzimas de metabolização. Dependendo da

extensão desta primeira metabolização, o impacto nas concentrações sujeitas a

distribuição e disponíveis para exercer o efeito no órgão alvo pode ser elevado. Este

fenómeno é designado por eliminação pré-sistémica e pode alterar muito a

biodisponibilidade da substância.

A caracterização da ADME faz-se com recurso a parâmetros calculados com base em

valores observados da concentração plasmática ao longo do tempo. Os parâmetros

principais (primários) são a biodisponibilidade, o volume de distribuição e a depuração

(clearance). Os parâmetros secundários são dependentes do tempo e são o tempo de

semi-vida de eliminação (t1/2), a área da curva de concentração plasmática em função

do tempo (AUC) e a concentração máxima no plasma (Cmax) (Asic & Of, 2008; Meyer

& Maurer, 2014).A metabolização é catalisada por enzimas e a sua expressão depende


dos genes que as codificam. As variantes genéticas podem interferir na

farmacocinética da substância, alterando a biodisponibilidade e a capacidade de

eliminação. A análise dos genes responsáveis pela expressão das enzimas que

catalisam a metabolização de fase I e de fase II pode facilitar a interpretação da

distribuição das substâncias no organismo (Gaedigk, 2013; Frank Musshoff, Stamer,

& Madea, 2010a; Sajantila, Palo, Ojanperä, Davis, & Budowle, 2010).

2.4 Farmacogenética

A farmacogenética é a disciplina que estuda a relação existente entre as características

genéticas de cada indivíduo e a sua resposta às substâncias administradas. As

diferenças nos efeitos das substâncias podem dever-se à existência de polimorfismos

nos genes que codificam as enzimas que metabolizam essas substâncias, os

transportadores e os receptores no órgão alvo, entre outros.

2.4.1 Resumo histórico

Os aspetos históricos da farmacogenética remontam ao ano 510 AC, quando Pitágoras

relacionou o surgimento de anemia hemolítica com a ingestão de favas apenas em

alguns indivíduos, atribuindo o fenómeno observado às características individuais.

Surgiu como disciplina nos anos 50 do século XX com a descoberta do mesmo tipo de

anemia hemolítica subsequente à administração de primaquina (anti-malárico) e que se

verificou ser devida a um défice enzimático de glucose-6-fosfato hidrogenase (G6PD).

A deficiência enzimática tinha uma prevalência significativa maior entre afro-

americanos que entre caucasianos, concluindo-se que se deveria a um fator genético.

Outros estudos foram desenvolvidos nos anos 50 relacionados com as diferenças

genéticas e variabilidade individual da resposta aos fármacos, tais como o

metabolismo de acetilação da isoniazida pela enzima N-acetil-transferase (NAT2) e da


hidrólise da succinilcolina pela enzima butirilcolinesterase (BCHE). O termo

farmacogenética foi introduzido por Vogel em 1959 para designar esta nova área de

estudo.

Nos anos 70 dois grupos de investigação independentes (Eichelbaum em 1979 e

Mahgoub em 1977) observaram reações adversas (ADR) inesperadas após a

administração da esparteína e da debrisoquina, respetivamente. As ADR observadas

seriam devidas a diferenças de metabolização por uma enzima que é responsável pela

oxidação de ambas as substâncias, a que na altura se chamou debrisoquina ou

esparteína hidroxilase. Usando estudos farmacocinéticos para compreender os efeitos

observados, diferenciaram-se os indivíduos que teriam uma metabolização normal

(EM) dos de metabolização lenta (PM). A sequenciação do gene que codifica essa

enzima, que passou a designar-se por CYP2D6, foi conseguida pela primeira vez em

1988 por Gonzalez et al. Alguns estudos seguintes identificaram as primeiras variantes

genéticas e comprovaram a existência dos pseudogenes CYP2D7 e CYP2D8 (ver

2.5.2), com elevada homologia com o CYP2D6 (Kimura, Umeno, Skoda, Meyer, &

Gonzalez, 1989). Em 1993, Johansson et al identificaram pela primeira vez um

metabolizador ultrarrápido (UM) (Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011).

O desenvolvimento das técnicas de biologia molecular, em particular a PCR, permitiu

aprofundar o estudo da influência genética na variabilidade de resposta aos fármacos e

distingui-la de outros fatores (v.g. idade, género, patologias, etc.). Os primeiros

estudos incidiram nos genes relacionados com a farmacocinética, em particular os que

codificam enzimas de metabolização, tendo sido estabelecido em 1996 o The Human

Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee

(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm). O gene que codifica a enzima CYP2D6 foi

o primeiro a ser caracterizado e tem servido de modelo para outros estudos


farmacogenéticos, não só a nível das enzimas de metabolização mas também nos

transportadores e receptores.

2.4.2 Aplicação da farmacogenética

O objetivo principal dos estudos farmacogenéticos é, atualmente, a individualização da

terapia com base em informação genética. O estudo genético dos indivíduos permite

adequar a farmacoterapia, facilitando a escolha dos fármacos e as dosagens para cada

indivíduo de modo a obter o efeito terapêutico desejado, reduzindo substancialmente a

probabilidade de existência de reações adversas, bem como os custos dos tratamentos

e a ocorrência de mortes acidentais (Abraham & Adithan, 2001; Gupta, 2013;

Saladores, Precht, Schroth, Brauch, & Schwab, 2013; Samer, Lorenzini, Rollason,

Daali, & Desmeules, 2013; Sorich & Coory, 2014). Existem já recomendações

internacionais para adequar a terapêutica tendo em conta o genótipo do indivíduo,

principalmente a nível dos genes que alteram a expressão das enzimas de

metabolização (guidelines em http://www.pharmgkb.org/ e Ehmann et al. 2015). A

FDA publicou uma lista dos biomarcadores genéticos com demonstrada relevância

clínica para as substâncias medicamentosas aprovadas nos EUA, onde, com maior

frequência, aparecem os genes que codificam as enzimas de metabolização, em

particular o CYP2D6 (http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/

Pharmacogenetics/ucm083378.htm).

Os anestésicos e analgésicos opióides são, a par com a terapia oncológica (Woods,

Veenstra, & Hawkins, 2011; Zafra-Ceres et al., 2013) e os antidepressivos (Hicks et al.,

2013; Prado, 2009), das substâncias medicamentosas mais estudadas em

farmacogenética, estando já publicados vários artigos de revisão (Book, Stamer,

Lehmann, & Stüber, 2013; Coller, Christrup, & Somogyi, 2009; M. Jin, Gock,

Jannetto, Jentzen, & Wong, 2005; Kleine-Brueggeney, Musshoff, Stuber, & Stamer,


2010; Leppert, 2011; Palmer et al., 2005; Somogyi, Barratt, & Coller, 2007; Světlík &

Hronová, 2013; Zahari & Ismail, 2013).

A Farmacogenética tem sido também utilizada na área forense, embora com pouca

frequência. Quando as concentrações encontradas na pesquisa toxicológica post

mortem são diferentes do que seria de esperar, de acordo com a informação de cada

caso e com as tabelas de referência, a pesquisa de variantes genéticas que alterem a

capacidade de metabolização pode ser útil para a sua interpretação. A sua utilidade é

maior ainda quando as concentrações são tão elevadas que há suspeita de intoxicação,

servindo para diferenciar uma morte intencional (homicídio ou suicídio) de uma morte

acidental, devida ao desconhecimento das características genéticas do indivíduo, como

no caso apresentado, em 2000, por Sallee et al (Sallee, DeVane, & Ferrell, 2000).

2.4.3 Genótipo e Fenótipo

O Fenótipo é a expressão qualificável ou quantificável das características genéticas.

No caso dos genes que codificam as enzimas de metabolização traduz-se na

capacidade de metabolização, que é usualmente avaliada através da determinação do

índice metabólico fazendo a medição das concentrações das substâncias e dos seus

metabolitos após a administração de substâncias de teste, de forma controlada. O tipo

de metabolização observado é categorizado em quatro classes: metabolizadores

extensivos/normais, intermédios, lentos ou ultra-rápidos, (EM, IM, PM e UM - do

inglês extensive, intermediate, poor, ultrarapid metabolizers, respectivamente)

(Ingelman-Sundberg, Sim, Gomez, & Rodriguez-Antona, 2007). Os metabolizadores

extensivos/normais têm a atividade enzimática e a resposta ao medicamento de acordo

com o que é esperado. Nos metabolizadores intermédios observa-se uma redução da

velocidade de metabolização, podendo ter uma resposta aumentada ou, no caso de pro-

fármacos, diminuída. Os metabolizadores lentos são indivíduos com atividade


enzimática residual, o que clinicamente se manifesta por uma grande deficiência na

formação de metabolitos e um aumento da biodisponibilidade da substância

administrada. A deficiência enzimática pode ser devida a alterações genéticas que

impeçam a codificação da enzima ou então que codifiquem enzimas não funcionais.

Os ultra-metabolizadores têm uma atividade enzimática muito superior à esperada

(Abraham & Adithan, 2001). Nestes dois perfis de metabolização, PM e UM,

observam-se alterações nas concentrações das substâncias e dos seus metabolitos que

se repercutem no tipo e duração da resposta, com uma maior probabilidade de

ocorrência de falha terapêutica, de reações adversas ou de intoxicação.

O perfil genético dos indivíduos (genótipo) pode ser então correlacionado com as

alterações no índice metabólico (fenótipo) e classificado de modo semelhante, tal

como é apresentado na Tabela 1.

Tabela 1. Classificação dos genótipos CYP2D6 em função do fenótipo esperado

Classe Genótipo observado Atividade enzimática prevista

EM N + N; N + R

Pelo menos um alelo funcional

Normal

IM N + 0; 0 + R; R + R

1 alelo nulo ou 2 de função reduzida

Reduzida

PM 0 + 0

homozigóticos para alelos nulos

Nula

UM N + nN

(múltiplas cópias do gene)

Aumentada

Onde, N corresponde a um alelo que codifica a enzima com atividade normal; R corresponde a um alelo com atividade enzimática reduzida; 0 corresponde a um alelo relacionado com inativação enzimática; n corresponde ao número de cópias do gene e é maior que 1.

O estudo das correlações entre os fenótipos e os genótipos tem como objectivo prever

a atividade enzimática com base nas variantes genéticas e já é possível para algumas

enzimas de metabolização (v.g. CYP2D6 conforme publicado em

http://www.cypalleles.ki.se/ cyp2d6.htm).


Assim, o conhecimento das características genéticas individuais revela-se uma

ferramenta importante para aplicação à prática clínica, estando por isso a ser utilizado

no desenvolvimento e aprovação de novos medicamentos segundo as recomendações

da agência europeia do medicamento (European Medicines Agency, 2012).

As principais vantagens da pesquisa das variantes genéticas para a previsão dos

fenótipos relativamente a outros métodos, como o cálculo do índice metabólico, são:

Os resultados da análise genética não serem afetados pelas condições

fisiológicas, nem por outra medicação administrada simultaneamente;

Não ser necessário sujeitar indivíduos à administração de uma substância

de teste;

A amostra para análise genética poder ser colhida de forma não invasiva;

Uma só amostra fornecer informação sobre a capacidade de metabolização

de diversas substâncias e é válida para toda a vida do indivíduo (Sajantila

et al., 2010).

Contudo, indivíduos com o mesmo genótipo podem ter fenótipos diferentes,

explicados por outros fatores não genéticos tais como: a idade, o género, alterações

fisiológicas e de funcionamento dos órgãos (especialmente o fígado e rins), a

existência de vias metabólicas alternativas ou de patologias, o tipo de dieta e nutrição,

os hábitos de consumo (tabagismo, álcool, drogas de abuso) ou medicação, que

deverão ser tidas sempre em conta na altura da decisão terapêutica (Frank Musshoff et

al., 2010b).

2.4.4 Farmacogenética em contexto forense

Nos casos post mortem, o cálculo de um “índice metabólico” com base nas

concentrações relativas da substância e dos seus metabolitos não permite uma correta

aferição do fenótipo devido a diversos fatores que podem interferir nesta avaliação. A


colheita da amostra é efetuada durante a autópsia, não se sabendo qual a fase cinética

em que se encontrava a distribuição da substância no organismo, pois são geralmente

desconhecidos os factos relativos à administração, tais como a dose, o modo e o tempo

decorrido até ao momento da morte (Koski, 2005). A existência de concentração baixa

de um determinado metabolito relativamente à substância primária, pode ser indicativa

de duas situações: ou o tempo decorrido entre a administração e a morte foi tão curto

que não houve ainda tempo para a metabolização; ou o indivíduo estava com a

capacidade de metabolização diminuída. Estas situações podem gerar conclusões

médico-legais diferentes. Nestes casos, a caracterização do genótipo pode trazer

informação adicional e explicar as concentrações encontradas (Kupiec, Raj, & Vu,

2006; Sistonen, 2008; Zackrisson, 2009).

A primeira vez que se aplicaram ferramentas de genotipagem a amostras post mortem

foi em 1999 por Druid et al, com o estudo do gene CYP2D6, não tendo sido

identificados metabolizadores lentos (Druid, Holmgren, Carlsson, & Ahlner, 1999).

Posteriormente, foram já publicados vários estudos em amostras post mortem que

estabelecem a existência de correlação entre fenótipo e genótipo (em metabolizadores

lentos), nomeadamente em casos de tramadol (Levo, Koski, Ojanperä, Vuori, &

Sajantila, 2003), oxicodona (Jannetto et al., 2002), metadona (Wong et al., 2003),

fentanil (M. Jin et al., 2005) e amitriptilina (Koski et al., 2006; Sistonen, 2008). Além

destes, existem, atualmente, muitos trabalhos publicados que procuram evidenciar a

relevância da farmacogenética aplicada à Medicina Legal e às Ciências Forenses

(Buscemi & Tagliabracci, 2011; Koski, 2005; Kupiec et al., 2006; Langford, Bolton,

Carlin, & Palmer, 2015; Madea, Saukko, Oliva, & Musshoff, 2010; Frank Musshoff et

al., 2010b; Pelotti & Bini, 2011; Sajantila et al., 2010; Zackrisson, 2009).


A maior parte dos estudos post mortem foram efetuados com um número limitado de

amostras e apenas algumas variantes genéticas (consideradas as mais relevantes). A

falta de dados que correlacionem, de forma segura, as características genéticas

(genótipo) com os efeitos observados (fenótipo) são a principal limitação para a

aplicação destas ferramentas na área forense (Buscemi & Tagliabracci, 2011). Por esta

razão, o desenvolvimento de mais estudos em farmacogenética é da maior relevância

para a recolha de dados que permitam entender melhor a relação entre o genótipo e o

fenótipo, em particular nos casos de intoxicação ou de falha terapêutica, contribuindo

também para a aplicação à prática clínica e para a determinação dos limites de

segurança das substâncias. Sajantila et al. recomenda que os fatores genéticos da

metabolização sejam estudados de forma sistemática para aumentar a fiabilidade na

previsão do fenótipo, sendo para tal necessária a disponibilidade de metodologias

adequadas, seletivas, exatas e precisas (National Academy of Sciences, 2009; Sajantila

et al., 2010).

2.5 CYP2D6

O Citocromo P450 é uma família de enzimas cuja designação advém do facto de que

quando são reduzidas e ligadas ao monóxido de carbono, geram um composto rosado

(designando-se com um P, de pigmento), a que corresponde um pico de absorção

espectral a 450 nm (http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf).

As enzimas deste sistema identificam-se com as siglas CYP e dividem-se em 18

famílias (com mais de 40 % de semelhança entre si; designadas por um algarismo), 44

subfamílias (com mais de 55% de semelhança; designadas por uma letra) e cada

enzima designada por um número final (Zanger & Schwab, 2013). A nomenclatura

encontra-se esquematizada na Figura 1.

Suzana Fonseca

Figura 1. Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450

Os genes que codificam as enzimas

são conhecidos 115 genes,

(CYP1A1/2, CYP1B1; CYP2A6/7/13, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6,

CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1;

CYP3A4/5/7/43; CYP4A11/22, CYP4B1, CYP4F2/3/8/11/12/22, CYP4V2, CYP4X1,

CYP4Z1; CYP5A1; CYP7A1, CYP7B1; CYP8A1

CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP2

CYP27B1, CYP27C1/39/46/51),

presentes noutras espécies animais e vegetais

coelho (http://drnelson.uthsc.edu.htm

As enzimas CYP localizam

hepatócitos. São proteínas hidrofóbicas

terminação N, o que facilita o acesso dos substratos lipofílico

bicamada lipídica. A atividade

Figura 2).

Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450

as enzimas têm a mesma denominação e na espécie humana

115 genes, entre os quais 57 conseguem codificar enzimas funcionais




CYP4Z1; CYP5A1; CYP7A1, CYP7B1; CYP8A1, CYP8B1; CYP11A1,

CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP2

CYP27B1, CYP27C1/39/46/51), e os restantes são pseudogenes. Os

presentes noutras espécies animais e vegetais, como por exemplo no rato, cão, boi ou

p://drnelson.uthsc.edu.htm).

enzimas CYP localizam-se principalmente no retículo endoplasmático liso dos

São proteínas hidrofóbicas ligadas à membrana por uma

facilita o acesso dos substratos lipofílicos, que se deslocam na

atividade catalítica dá-se na superfície endoplasmática (ver

Página 36

Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450

têm a mesma denominação e na espécie humana

ificar enzimas funcionais




, CYP8B1; CYP11A1,

CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP27A1,

os restantes são pseudogenes. Os CYP estão

no rato, cão, boi ou

plasmático liso dos

por uma sequência com

s, que se deslocam na

se na superfície endoplasmática (ver

Suzana Fonseca

Figura 2. Representação esquemática do funcionamento das CYP(adaptado de http://www.pnas

No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a

P450 oxiredutase (NADPH:P450

o grupo heme da CYP consiga

molecular, gerando água, NADP reduzido e radicais livres de oxigénio que ficam

disponíveis para integrar o substrato.

reação de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabol

efetuada pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso

se denominam monooxigenases.

Existem diversos fatores

indução ou inibição enzimática e modificam a expressão d

450 (ver Figura 3).

Representação esquemática do funcionamento das CYP(adaptado de http://www.pnas.org/content/101/31/11459/F8.large.jpg)

No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a

NADPH:P450) , responsável pela transferência de eletrões

o grupo heme da CYP consiga efetuar a clivagem da ligação dupla


disponíveis para integrar o substrato. Estas enzimas podem catalisar vários tipos de

de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabol

pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso

se denominam monooxigenases. (http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf

fatores, internos e externos ao organismo, que podem causar a

ndução ou inibição enzimática e modificam a expressão das enzimas

Página 37

Representação esquemática do funcionamento das CYP .org/content/101/31/11459/F8.large.jpg).

No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a citocromo

eletrões para que

gação dupla do oxigénio


Estas enzimas podem catalisar vários tipos de

de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabolização e é

pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso

http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf).

, internos e externos ao organismo, que podem causar a

do citocromo P-


Figura 3. Distribuição das enzimas CYP de acordo com o número de medicamentos que metabolizam e fatores que podem influenciar a sua variabilidade.

Gráfico retirado de (Zanger & Schwab, 2013).

As famílias CYP 1 a 3 são responsáveis pela catálise da metabolização de fase I de 70

a 80% das substâncias medicamentosas mais utilizadas e também das drogas de abuso,

enquanto as restantes famílias fazem a biossíntese e metabolismo de substâncias

endógenas (Ingelman-Sundberg et al., 2007; Zanger & Schwab, 2013). A família

CYP2 é a mais numerosa e conta com 13 subfamílias, 16 genes e 16 pseudogenes;

pode sofrer indução na presença de outras substâncias, mas a indução é seletiva a cada

uma das subfamílias (por exemplo a CYP2E sofre indução na presença de etanol e a

CYP2B na presença de fenobarbital). Desta família, as enzimas CYP2A6, CYP2B6,

CYP2C9, CYP2C19 e CYP2D6 são responsáveis pelo metabolismo da maior parte dos

medicamentos (exceto os de tratamento oncológico), são muito polimórficas e a

variabilidade genética repercute-se no perfil metabólico dos indivíduos (Johansson &

Ingelman-Sundberg, 2011). Yang et al. fizeram uma investigação sistemática da


funcionalidade, da interação e dos sistemas regulatórios entre as enzimas CYP no

fígado através do estudo das características genéticas com redes bayseanas (Yang et al.,

2010). Demonstrou que a correlação entre genótipo e a atividade enzimática é

particularmente elevada para a enzima CYP2D6.

2.5.1 Enzima CYP2D6

A enzima do citocromo P450 mais estudada é CYP2D6, responsável pela

metabolização de mais de 70 substâncias, muitas delas relevantes no contexto médico-

legal, tais como antidepressivos, antipsicóticos, analgésicos, antiarrítmicos e beta-

bloqueantes (Ingelman-Sundberg et al., 2007; Kleine-Brueggeney et al., 2010). O local

de ligação da enzima aos substratos está estruturalmente bem definido, junto ao grupo

heme, estabelecendo ligações fortes e seletivas com os seus substratos, que

tipicamente têm um átomo de azoto e um anel aromático. São substratos da enzima

CYP2D6 (https://www.pharmgkb.org/):

Analgésicos opióides: codeína, dihidrocodeína, fenacetina, fentanil, morfina,

oxicodona, petidina, propoxifeno ou tramadol;

Antidepressivos: amitriptilina, citalopram, clomipramina, desipramina,

doxepina, fluoxetina, fluvoxamina, imipramina,

maprotilina, mianserina, nortriptilina, paroxetina,

venlafaxina, trazodona

Antipsicóticos: cloropromazina, clozapina, haloperidol, perfenazina,

risperidona, tioridazina e zuclopentixol;

Antiarrítmicos: flecainida, mexiletina, propafenona;

Beta-bloqueantes: carvedilol, metoprolol, propranolol, timolol;

Medicamentos usados em oncologia: debrisoquina, esparteina, tamoxifeno

outros: dextrometorfano, anfetamina, clonidina, donepezil


A metabolização pela enzima CYP2D6 é a que apresenta maior variabilidade

individual entre as enzimas CYP, variação atribuída em grande parte a alterações

genéticas (Mathew, 2010). Outra característica relevante é o facto de não sofrer

indução e serem poucos os fatores que afetam a expressão enzimática além das

variantes genéticas e das patologias (ver a Figura 3).

As CYP2D6 correspondem a apenas 2% do conteúdo hepático em enzimas CYP

(Zanger & Schwab, 2013). A baixa expressão enzimática e a elevada afinidade para

muitos substratos podem levar à saturação e à competição pela enzima. Os substratos

com mais afinidade comportam-se como inibidores, diminuindo a metabolização de

outras substâncias por vezes com efeitos de relevância clínica (Abraham & Adithan,

2001; Bernard, Neville, Nguyen, & Flockhart, 2006; Mathew, 2010). Nestes casos, um

indivíduo de características metabólicas normais (EM) pode ter temporariamente, um

comportamento metabólico semelhante a um metabolizador lento (PM), fenómeno

habitualmente chamado phenocopying. Este fenómeno tem sido cada vez mais

estudado, principalmente no desenvolvimento de novos medicamentos, devido às

consequências clínicas das interações com inibidores enzimáticos (Abraham &

Adithan, 2001; European Medicines Agency, 2012; Samer et al., 2013). Os principais

inibidores da CYP2D6 são os inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRR),

em particular a paroxetina e a fluoxetina (reduzem a capacidade de metabolização em

mais de 80%), mas também: Sertralina, Fluvoxamina, Venfalafaxina, Flufenazina;

Haloperidol, Perfenazina, Tioridazina e a Quinidina. A Metadona é também

considerada um forte inibidor da CYP2D6 (Coller et al., 2012; Y. Jin et al., 2005;

Saladores et al., 2013).


Autophenocopying é um fenómeno semelhante que pode ocorrer quando existe uma

administração continuada de um substrato do CYP2D6, em que a inibição é

desenvolvida pelo próprio substrato ao longo do tempo, quando a sua concentração se

aproxima do equilíbrio. Estes fenómenos podem justificar elevadas diferenças

observadas nas concentrações das substâncias e dos seus metabolitos nos casos com a

administração de uma dose única relativamente aos tratamentos prolongados

(https://www.pharmgkb.org/).

2.5.2 Gene CYP2D6

O gene que codifica a enzima CYP2D6 é designado pelo mesmo nome e está

localizado no braço longo do cromossoma 22, na região 1, banda 3 e sub-banda 1:

22q13.1. É constituído por 4378 pares de bases e por 9 exões, codificando uma

proteína com 497 aminoácidos. O gene pertence a um conjunto de 3 genes homólogos,

mas o CYP2D7 e o CYP2D8 não conseguem codificar a enzima funcional devido a

diversas alterações observadas na sequência genética.

A sequência de referência (wild-type ou WT) do gene CYP2D6 é designada por

CYP2D6*1 e corresponde à que foi inicialmente publicada por Kimura em 1989

(Kimura et al., 1989), sendo a entrada M33388.1 do Genbank (Gaedigk, 2013). Os

nucleótidos são numerados a partir da translação ATG do codão inicial. As variantes

encontradas foram sendo designadas por alelos, representados por um asterisco e o

número, conforme as regras do Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature

Committee, e registadas numa base de dados disponível em

http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm. O gene CYP2D6 tem uma grande

variabilidade individual e está presente em várias espécies além da humana, tais como,

nos chimpanzés, ratos, rãs e galinhas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore

/NM_000106).


2.5.3 Variantes genéticas

O CYP2D6 caracteriza-se por ser muito polimórfico, estando já descritas mais de 100

variantes alélicas na população humana. Os polimorfismos são variações no código

genético que têm uma prevalência geralmente superior a 1% na população em estudo.

Quando a prevalência é inferior a 1% na população designam-se apenas por variantes

genéticas. As variantes deste gene compreendem: alterações de base única

(substituição - SNP, deleção ou inserção - indel); de uma cadeia curta de pares de

bases (repetição, inserção ou deleção de mini e microssatélites); variação do número

de cópias do gene inteiro (CNV) ou hibridação com os pseudogenes CYP2D7 e

CYP2D8 (Mathew, 2010). A identificação das variantes e da sua localização no gene

segue o mesmo sistema de nomenclatura recomendado por Human Cytochrome P450

Allele Nomenclature Committee.

Algumas variantes afetam a atividade enzimática, inibindo a sua expressão ou

produzindo proteínas deficientes, com repercussões na capacidade metabólica. No

caso do CYP2D6 mais de 20 alelos estão correlacionados com a inativação enzimática,

habitualmente designados por alelos nulos (http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).

Por outro lado, quando existem mais do que duas cópias de gene, a atividade

enzimática pode ficar muito aumentada. A amplificação da atividade genética por

duplicação do gene CYP2D6 foi a primeira a ser descrita em humanos. Johansson et al

encontrou 13 cópias activas num indivíduo, e também nos seus filhos, que

demonstraram um metabolismo da debrisoquina muito rápido (Johansson et al. 1993,

tal como descrito por (Sistonen, 2008)).

Os metabolizadores lentos (homozigóticos para alelos nulos) e ultrarrápidos (com mais

de 2 cópias de gene) têm uma maior probabilidade de sofrerem reações adversas, quer


por falha terapêutica quer por alteração das concentrações das substâncias em

circulação. Os alelos nulos mais estudados são os seguintes:

Alelo *3: 2549 delA (rs35742686);

Alelo *4: 1846 G>A (rs3892097);

Alelo *5: deleção total do gene

Alelo *6: 1707 delT (rs5030655).

Segundo Hersberger, a sua genotipagem pode prever 93 a 97,5% dos metabolizadores

lentos (Hersberger, Marti-jaun, Rentsch, & Hanseler, 2000).

De grande interesse é também o polimorfismo 100C>T (rs1065852: Pro34Ser) que

caracteriza o alelo *10, estando presente também no alelo *4 e em outros menos

prevalentes, a que corresponde uma diminuição significativa da atividade enzimática,

devida ao decréscimo da estabilidade da enzima que dificulta o reconhecimento do

substrato. Esta variante é substrato-dependente (Bagheri et al., 2015; Gan, Ismail, Wan

Adnan, & Zulmi, 2007; Leppert, 2011; Li et al., 2010).

A variabilidade genética do CYP2D6 verifica-se quer a nível individual, quer a nível

populacional.

2.5.4 Diferenças populacionais

Existem diferenças populacionais significativas nas variantes genéticas do CYP2D6

(Bernard et al., 2006; Chan et al., 2015; Sistonen et al., 2007). A tabela seguinte

apresenta a distribuição da prevalência dos alelos mais estudados em diferentes

populações (Tabela 2).


Tabela 2. Distribuição populacional da prevalência dos alelos mais estudados e a correspondente atividade enzimática.

(Adaptado de Gaedigk et al., PharmGKB CYP2D6 Allelic Variation Summary Table, conforme consultado a 08/01/2015 em http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6. htm)

População *1 *2 *3 *4 *5 *6 *9 *10 *17 *35 *41 *1N *2N *4N

Portugal* 75 - 1,4 13,3 2,8 1,9 - - - - - - - -

Espanha 63 27 0,9 16,9 2,4 0,6 2,5 1,8 0,9 3,9 4,9 1,4 1,1 0,2

Europa 54 27 1,3 18,5 2,7 1,0 2,1 3,2 0,3 5,8 8,6 0,8 1,3 0,2

África 41 14 0,3 6,2 6,1 0,2 0,5 4,2 18,2 0,8 9,4 0,4 1,6 2,1

América 64 24 0,7 11,3 1,9 0,4 1,3 3,4 3,0 4,8 5,9 0,7 2,4 0,6

Asia Oriental 34 13 0 0,4 5,6 0 0,1 42,3 0 0,2 2,0 0,3 0,4 0

Médio Oriente 58 22 0,1 7,8 2,3 0,7 0 3,5 1,6 2,0 20 3,1 3,9 0

Oceânia 70 1,2 0 1,1 5,0 0 0 1,6 0 0 0 11,8 0 0

Ásia Central 54 34 0 6,6 2,5 0 1,4 19,8 0,4 n/a 10 0,5 0,5 0

Atividade S S N N N N R R R S R A A N

Legenda (atividade enzimática) : S– normal; N – nula; R – reduzida; A – aumentada * (Correia, Santos, Coutinho, & Vicente, 2009)

Outro estudo mais recente efectuado na população do Sul de Portugal indica que a

prevalência da variante 100C>T de 14.2% (10.8%-17.5%; num intervalo de confiança

de 95%) (Gaio et al., 2015).

A distribuição populacional das variantes genéticas está de acordo com os estudos

fenotípicos, realizados com o cálculo do índice metabólico. A distribuição fenotípica

na população caucasiana encontra-se na Tabela 3.

Tabela 3. Prevalência dos fenótipos da enzima CYP2D6 na população caucasiana

(Zanger & Schwab, 2013)

Metabolizadores População caucasiana

Lentos (PM) 5-10%

Intermédios (IM) 10-17%

Extensivos/normais (EM) 70-80%

Ultra-rápidos (UM) 3-5%


2.5.5 Casos publicados

Existem já publicados alguns casos em que a caracterização do gene CYP2D6

permitiu estabelecer a correlação entre a dose administrada de alguns medicamentos e

as reações adversas observadas.

O 1º caso post mortem foi publicado por Sallee et al.em 2000. Este trabalho relata um

caso de intoxicação por fluoxetina, num indivíduo com 9 anos, metabolizador lento,

que era homozigótico para alelos nulos (Sallee et al., 2000).

Dois outros casos post mortem de intoxicação por morfina, subsequente à

administração de codeína em indivíduos com metabolização ultrarrápida foram

publicados por Koren et al em 2006 e por Gasche et al 2004 (Johansson & Ingelman-

Sundberg, 2011). O primeiro destes casos é particularmente interessante por se tratar

de um recém-nascido cuja intoxicação se deveu à excreção de morfina através do leite

materno. A elevada concentração de morfina foi resultante do facto da mãe ser

metabolizadora ultrarrápida de codeína. Este caso deu origem a uma recomendação da

FDA relativamente ao uso da codeína para controlo da dor post parto (Madadi et al.,

2008). Dalen et al (1997) e Voronov et al (2007), tal como foi descrito por (Johansson

& Ingelman-Sundberg, 2011), reportaram a ocorrência de reações adversas (dor

abdominal e apneia, respetivamente) relacionadas com o aumento de concentração de

morfina, por metabolização ultrarrápida da codeína.

Em 2004, Lee et al reportaram a ocorrência de reações adversas e concentrações

tóxicas de nortritpilina num metabolizador lento com genótipo CYP2D6 *5/*10B (S.-

Y. Lee, Ki, Hong, & Kim, 2004).

Já em Março de 2015 Orliaguet publicou um caso de uma depressão respiratória aguda

após a administração de tramadol em contexto post-cirúrgico. O indivíduo de 5 anos,

deu entrada no hospital em estado comatoso e recuperou totalmente com a


administração de um antagonista opióide (naloxona), ficando demonstrada a

intoxicação por um opiáceo. Após caracterização genética verificou-se que o indivíduo

é portador de 3 cópias activas do gene que codifica a enzima CYP2D6, e é, portanto,

um metabolizador ultrarrápido. O conhecimento do genótipo permitiu explicar o

quadro de intoxicação, que terá sido devido a um aumento da concentração do

metabolito ativo do tramadol (Orliaguet et al., 2015).

2.6 Tramadol

O Tramadol é um analgésico sintético, estruturalmente relacionado com a codeína,

muito utilizado no controlo de dor moderada ou intensa, aguda ou crónica, em

contexto cirúrgico, traumático ou em doenças oncológicas. Foi sintetizado em 1962,

começou a ser comercializado em 1977, na Alemanha Oriental, e mais tarde noutros

países da Europa, nos Estados Unidos da América e na Austrália.

A capacidade analgésica do tramadol é de aproximadamente 10% relativamente à

observada na morfina, sendo geralmente bem tolerado, com menos reações adversas

graves, principalmente a nível de depressão respiratória ou de dependência. As ADR

registadas com maior prevalência são a náusea, tonturas e cansaço, mas com

prevalências menores (<1%) pode ocorrer ainda: sonolência/sedação, hipotensão,

taquicardia, distúrbios gástricos, dor abdominal, diarreia e obstipação. Em casos mais

graves pode ocorrer a depressão respiratória e o coma (Orliaguet et al., 2015). Quando

administrado em contexto cirúrgico (não crónico), o tramadol não desenvolve

fenómenos de acumulação nem de tolerância, tem um baixo potencial de abuso, pelo

que não é uma substância controlada, e pode ser coadministrado com outros

analgésicos não opióides, como o paracetamol. Tem uma farmacocinética que não

depende da idade ou do género (Allegaert, Rochette, & Veyckemans, 2011), mas as

Suzana Fonseca

patologias renais ou hepáticas podem alterar a capacidade de eliminação, aumentando

o tempo de semivida, a

Grond & Sablotzki, 2004)

mas que podem ser revertidas com antagonistas

2011).

O Tramadol é geralmente administrado numa mistura racémica 1:1 e ambos os

enanteómeros contribuem para a

de forma complementar (ver

Figura 4. Representação((1RS, 2RS)-2-[(dimetilamino)metil]

O R(+)- tramadol inibe a recaptação da serotonina e o S

da norepinefrina, sendo estes efeitos

transmissão de dor a nível da coluna vertebral

A capacidade analgésica após a

à acção do seu metabolito (+)

nos receptores µ opióides.

isómeros (Grond & Sablotzki, 2004)

A administração de tramadol

tipos de formulações), por via rectal ou parentérica (intravenosa,

subcutânea). Quando administrado por v


, a clearance e o volume de distribuição (Coller et al., 2012;

Grond & Sablotzki, 2004). Nestas patologias há maior prevalência de reações

que podem ser revertidas com antagonistas opióides, como a naloxona

geralmente administrado numa mistura racémica 1:1 e ambos os

enanteómeros contribuem para a atividade analgésica, com mecanismos diferentes mas

de forma complementar (ver Figura 4).

. Representação da estrutura química dos enanteómeros do tramadol [(dimetilamino)metil]-1-(3-metoxifenil)-ciclohexanol)

a recaptação da serotonina e o S(-)-tramadol inibe a recaptação

da norepinefrina, sendo estes efeitos inibitórios responsáveis pela diminuição da

transmissão de dor a nível da coluna vertebral (Pedersen, Damkier, & Brøsen, 2006)

após a sua administração de tramadol deve-se essencialmente

seu metabolito (+)-O-desmetil-tramadol (ODT), que atua como agonista

opióides. O (+)-TMD e o (+)-ODT são mais ativo

(Grond & Sablotzki, 2004).

tramadol pode ser feita por via oral (estando disponíveis

, por via rectal ou parentérica (intravenosa, intramuscular

subcutânea). Quando administrado por via oral é totalmente absorvido,

Página 47


(Coller et al., 2012;

reações adversas

aloxona (Leppert,

geralmente administrado numa mistura racémica 1:1 e ambos os

analgésica, com mecanismos diferentes mas

da estrutura química dos enanteómeros do tramadol ciclohexanol)

inibe a recaptação

responsáveis pela diminuição da

(Pedersen, Damkier, & Brøsen, 2006).

se essencialmente

tua como agonista

ativos que os seus

estando disponíveis diversos

intramuscular ou

ia oral é totalmente absorvido, atingindo a


concentração máxima após 1-2 h, sendo a metabolização pré-sistémica a principal

responsável pela redução da biodisponibilidade a 70% (Grond & Sablotzki, 2004).

Nos tratamentos continuados, a biodisponibilidade aumenta até aos 100%,

provavelmente devido a um mecanismo de saturação da capacidade metabólica. É

rapidamente distribuído e tem aproximadamente 20% de ligação às proteínas

plasmáticas após uma dose única, mas que é inferior a 5% em caso de tratamento

continuado (García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007). O tramadol atravessa a

barreira placentar, sendo a concentração no feto cerca de 80% da verificada na mãe.

Aproximadamente 90% do tramadol é excretado por via renal (25-30% na forma

inalterada), sendo o restante por via fecal, biliar e salivar. Rapidamente a urina atinge

concentrações muito superiores às do plasma. Apenas 0,1% do TMD e do ODT podem

ser excretados no leite materno até 16h após a administração. O tempo de semivida de

eliminação do tramadol é de 5 a 6 h (Grond & Sablotzki, 2004).

As principais vias de metabolização de fase I, mediadas por enzimas CYP, dão origem

aos seus dois principais metabolitos: o O-desmetil-tramadol (ODT), cuja formação é

exclusivamente mediada pela enzima CYP2D6; e o N-desmetil-tramadol (NDT),

através da reação mediada pelas enzimas CYP2B6 e CYP3A4. A formação de um

terceiro metabolito, o N,O-didesmetil-tramadol (DDT), depende da catálise pelas 3

enzimas e, apesar de ter alguma atividade opióide, ela não é significativa. A

metabolização de fase II dá origem a vários metabolitos conjugados (glucuronidos e

sulfatos) e não são ativos (Grond & Sablotzki, 2004). São conhecidos mais de 30

metabolitos do tramadol (Grond & Sablotzki, 2004), resultantes da metabolização de

fase I e II (ver Figura 5).

Suzana Fonseca

Figura 5. Representação esquemática do metabolismo do tramadol.(retirado de https://www.pharmgkb.org/pathway/PA165946349

O metabolito NDT não tem

e 31% da concentração do tramadol

pico de concentração que nunca ultrapassa 18

tramadol e o tempo de semi

ODT é cerca de 700 vezes mais

. Representação esquemática do metabolismo do tramadol.https://www.pharmgkb.org/pathway/PA165946349

o tem atividade e a sua concentração máxima pode variar entre 4

e 31% da concentração do tramadol (Coller et al., 2012). O metabolito ODT tem um

concentração que nunca ultrapassa 18-26% da concentração máxima de

e o tempo de semi-vida é de aprox 7h (Grond & Sablotzki, 2004)

ODT é cerca de 700 vezes mais ativo nos receptores µ opióides do que a mistura

Página 49

. Representação esquemática do metabolismo do tramadol. https://www.pharmgkb.org/pathway/PA165946349)

e a sua concentração máxima pode variar entre 4

O metabolito ODT tem um

26% da concentração máxima de

(Grond & Sablotzki, 2004). O (+)-

opióides do que a mistura


racémica de tramadol. A metabolização é estereoseletiva, sendo o (-)-tramadol mais

rapidamente desmetilado em (+)-ODT (García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007).

Quando uma via metabólica está bloqueada, as vias alternativas são estimuladas.

Estudos in vitro revelam que quando a concentração de tramadol é baixa o metabolito

principal é o ODT. Quando a concentração de tramadol aumenta, a atividade

metabólica alternativa para NDT também aumenta, provavelmente devido à saturação

enzimática. Este fenómeno funciona também como um mecanismo de protecção do

organismo, porque o NDT é um metabolito inativo. Garcia-Quetglas et al. obteve

concentrações de (+)-NDT duas vezes superior nos metabolizadores CYP2D6 lentos

relativamente aos extensivos/normais, não se verificando o mesmo com o (-)-NDT

(García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007).

A grande variabilidade individual dos efeitos do tramadol pode ser parcialmente

explicada por fatores genéticos (Gan et al., 2007; Somogyi et al., 2007; Svetlik,

Hronová, Bakhouche, Matoušková, & Slanar, 2013), em particular os que estão

relacionados com a sua metabolização (Leppert, 2011). O gene que codifica a enzima

CYP2D6 é muito polimórfico e algumas variantes genéticas afetam a expressão

enzimática. Dependendo do genótipo de cada indivíduo, as concentrações plasmáticas

do TMD e do ODT podem variar, refletindo-se na resposta farmacológica. Foi já

demonstrada a correlação entre a ausência de alelos funcionais (metabolizadores lentos)

e o aumento do rácio metabólico TMD/ODT, bem como uma diminuição do efeito

analgésico (Gan et al., 2007; García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007; Pedersen,

Damkier, & Brosen, 2005; Pedersen et al., 2006). Koski em 2005 demonstrou que, nos

casos estudados, o fator genético foi o que mais influenciou as concentrações

observadas (Koski, 2005).


Garcia-Quetglas avaliou ainda a prevalência de efeitos adversos, verificando uma

maior prevalência nos metabolizadores extensivos/normais que nos PM e concluindo

que provavelmente se devem à acção opióide do (+)-ODT. Existe ainda um estudo que

demonstra haver diferenças de metabolização mesmo entre os metabolizadores

extensivos/normais, quando estão presentes 2 alelos funcionais ou apenas 1.

Comparando estas duas populações ficou demonstrado que a razão metabólica

TMD/ODT aumenta significativamente, e a de TMD/NDT diminui, no grupo que

apresenta um alelo funcional relativamente ao grupo com dois alelos funcionais

(García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007).

Os ultra-metabolizadores (UM) têm concentrações superiores de ODT, com maior

efeito analgésico, mas também maior risco de reações adversas, nomeadamente

depressão respiratória grave ou cardiotoxicidade (Elkalioubie et al., 2011; Stamer,

Stüber, Muders, & Musshoff, 2008). Foi recentemente publicado por Orliaguet et al

um caso de depressão respiratória aguda num indivíduo UM com 5 anos de idade após

a administração de tramadol (Orliaguet et al., 2015).

O Dutch Pharmacogenetics Working Group publicou em 2011 recomendações para a

prescrição e dosagem de tramadol, tendo em conta a caracterização do gene CYP2D6

(http://www.pharmgkb.org/guideline/PA166104959), sugerindo que nos casos dos

metabolizadores lentos seja alterada a prescrição para analgésicos com outra via

metabólica (não pode ser codeína nem oxicodona). Na página da PharmGKB foi

publicada uma nota clínica onde se referem expressamente as variantes genéticas que

têm elevado nível de correlação com as concentrações de tramadol (CYP2D6 *1, *10,

*1XN, *2, *2XN, *3, *4, *5, *6) (http://www.pharmgkb.org). Também a FDA emitiu

uma recomendação para a utilização de um medicamento com Tramadol e

Paracetamol (ULTRACET®) a qual adverte relativamente à sua utilização por


metabolizadores lentos e às interações com substâncias inibidoras da atividade da

enzima CYP2D6 (http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2001

/21123lbl.pdf; Coller et al. 2012).

O estudo da caracterização genética e fenotípica contribui para que se consiga prever a

atividade enzimática a nível individual, permitindo a escolha da terapia adequada (em

casos clínicos) ou entender as reações adversas que possam ocorrer, bem como

justificar e entender as concentrações encontradas nas perícias em toxicologia forense

(Sistonen, 2008; Zackrisson, 2009).

A possibilidade de aplicação das metodologias de detecção das variantes genéticas em

amostras post mortem foi demonstrada por Levo et al, que analisou 33 casos de

autópsia tendo verificado a existência de correlação entre o genótipo dos indivíduos e

os resultados de quantificação do tramadol e dos seus metabolitos no sangue post

mortem(Levo et al., 2003).

2.7 Técnicas e métodos de genotipagem

A genotipagem consiste na caracterização genética de um indivíduo, ou de uma

amostra de ADN, com um determinado painel de marcadores que são selecionados de

acordo com a aplicação que se pretende. No caso da farmacogenética, a genotipagem

tem como objectivo identificar as variantes genéticas que tenham influência na

resposta aos fármacos e pode incluir genes de enzimas de metabolização, de proteínas

de transporte ou de receptores (Frank Musshoff et al., 2010a).Na pesquisa

bibliográfica verificou-se a existência de várias metodologias já testadas e

implementadas em diversos laboratórios, muitas delas desenhadas de acordo com os

objetivos de cada trabalho, havendo também sistemas comerciais (Hicks et al., 2013;

Koch, 2004; H. K. Lee et al., 2007; Lyon et al., 2012). Segundo um estudo publicado


em 2011 por Fleeman et al, o custo cobrado por laboratórios subcontratados para a

genotipagem variava, à data, entre 30£ e 500£/amostra, havendo também grandes

diferenças na tecnologia utilizada por cada laboratório e no número de alelos

pesquisado (Fleeman et al., 2011).

Entre as metodologias mais utilizadas, destacam-se as que utilizam enzimas de

restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism analysis - RFLP) com maior

número de publicações (Bagheri et al., 2015; Barreto, 2011; Dorado et al., 2005; Levo

et al., 2003; Sachse, Brockmöller, Bauer, & Roots, 1997). Esta metodologia requer um

elevado número de reações de amplificação (além da amplificação de gene inteiro,

requer pelo menos uma PCR para cada variante), é muito seletiva mas pouco

abrangente, pois não deteta outras variantes além das que foram incluídas no seu

desenvolvimento. Esta característica também se verifica nas tecnologias específicas

para a detecção de SNPs.

Os kits comerciais são tecnologias desenvolvidas para aplicar em laboratórios de

ensaio clínico, caracterizando os indivíduos relativamente a um grande número de

polimorfismos em vários genes (Almoguera et al., 2010; Chou et al., 2003; Galan,

Guivier, Caraux, Charbonnel, & Cosson, 2010; Kramer et al., 2009; H. K. Lee et al.,

2007). Pratt et al. fizeram a comparação entre seis metodologias de detecção de

variantes em genes CYP, utilizando para tal 107 materiais de referência do Coriell

Cell Repositories (Pratt et al., 2010). As plataformas comerciais mais utilizadas são

Amplichip CYP450 Test da Roche e xTAG CYP2D6 Kit da Luminex. No entanto, são

onerosas, apenas rentáveis quando se destinam a um grande volume de amostras. Estas

tecnologias não existem no SGBF da delegação Sul do INMLCF.


A sequenciação de Sanger usa tecnologia atualizada para obter sequências de ADN

com elevada qualidade até 1000 pb, em 1 a 2 dias, e com custos operacionais e de

consumíveis relativamente baixos, dependendo do tipo de aplicação (v.g. o fluxo de

amostras, que em casos forenses será baixo). É a tecnologia de referência para

validação de todos os outros métodos, tendo apenas a limitação de não ser possível a

detecção do número de cópias de gene (CNV).

A metodologia de sequenciação demonstra-se, assim, adequada ao objetivo forense,

conseguindo identificar as variantes com maior relevância clínica, com especificidade,

abrangência (pois pode detetar outras variantes além das selecionadas), rapidez e baixo

custo (Riccardi et al., 2013). Além disso, permite incluir na pesquisa qualquer novo

polimorfismo relevante, logo que seja identificado, desde que esteja nos fragmentos

amplificados. A metodologia de sequenciação de Sanger é já utilizada no SGBF em

ADN mitocondrial, sendo possível implementar o método de sequenciação do

CYP2D6 utilizando os consumíveis e equipamentos existentes.


3 Objetivos

O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver uma metodologia de caracterização do

gene CYP2D6 em amostras de sangue post mortem, tendo em vista a identificação de

metabolizadores lentos em casos positivos para tramadol.

Do objetivo global derivam objetivos parcelares, a saber:

1. Desenvolvimento e validação de uma metodologia de sequenciação parcial do

gene CYP2D6 para a detecção de variantes nulas em amostras de sangue post

mortem;

2. Validação da metodologia de quantificação de tramadol e dos seus metabolitos

em amostras de sangue post mortem;

3. Aplicação das metodologias desenvolvidas a amostras de sangue post mortem

positivas para tramadol;

4. Avaliação da existência de correlação entre os resultados obtidos pelas duas

metodologias.


4 Materiais e Métodos

4.1 Amostragem

Neste trabalho foram analisadas amostras colhidas no âmbito das perícias realizadas

no INMLCF, ao abrigo do artigo 31º da Deliberação nº 849/2010, de 07 de maio

(Regulamento Interno do INMLCF), que prevê a utilização de amostras da rotina

pericial para fins de investigação científica, pelo que não suscita questões de natureza

ética ou legal.

Foram selecionadas 100 amostras de sangue post mortem dos casos que deram entrada

no SQTF entre janeiro de 2012 e junho de 2015 e com resultado positivo para

tramadol. A seleção de casos positivos para tramadol como objeto de estudo neste

trabalho, tem os seguintes fundamentos:

a. A elevada prevalência na casuística do SQTF;

b. O metabolismo do tramadol ser bem conhecido e a atividade opióide depender

quase só da enzima CYP2D6 (Grond & Sablotzki, 2004);

c. A correlação entre fenótipo e genótipo já ter sido demonstrada em amostras

post mortem (Levo et al., 2003) e o tramadol ser considerado como substância

de teste para a obtenção de rácios metabólicos em alguns ensaios clínicos

(Pedersen et al., 2005);

d. A disponibilidade de método analítico no SQTF com sensibilidade para a

quantificação do tramadol e também dos metabolitos principais (NDT e ODT);

e. As dificuldades de interpretação de alguns casos registados nos últimos anos

em Portugal, casos esses com concentração de tramadol superior ao intervalo

terapêutico, sem que haja quaisquer indício ou suspeita de intoxicação

voluntária ou acidental.

Suzana Fonseca

1. Preparação das amostras

2. Extracção do ADN

3. Quantificação de ADN

Foram ainda selecionadas, para a validação do método de quantificação de tramadol e

metabolitos, 40 amostras de sangue periférico e de sangue colhido na cavidade

cardíaca negativas para medicamentos.

As amostras de sangue periférico foram colhidas durante a autópsia para tubos de 10

mL com fluoreto de sódio, usado como conservante, e foram armazenadas a

Nos 5 casos em que o sangue periférico tinha volume insuficiente, foram usadas

amostras de sangue colhido na cavidade cardíaca.

4.2 Metodologia de

A caracterização do gene

amplificados, onde se localizam os polimorfismos com maior relevância na expressão

enzimática. Para tal, após a extraçã

por PCR, que depois foram analisados pelo método de sequenciação de

Figura 6).

Figura

Durante o desenvolvimento do método revelou

a amostras degradadas e a necessidade de aumentar a sensibilidade para a a

de ADN fragmentado.

4. Reacção de Amplificção por PCR

5. Purificação com ExoSAPiT

6. Verificação em gel de poliacrilamida

7. Reacção de sequenciação

8. Detecção por Electroforese Capilar

9. Análise dos resultados



cardíaca negativas para medicamentos.

tras de sangue periférico foram colhidas durante a autópsia para tubos de 10

mL com fluoreto de sódio, usado como conservante, e foram armazenadas a

casos em que o sangue periférico tinha volume insuficiente, foram usadas

lhido na cavidade cardíaca.

Metodologia de análise genética

caracterização do gene CYP2D6 foi efetuada por sequenciação de fragmentos


Para tal, após a extração do ADN, fez-se a amplificação dos fragmentos

por PCR, que depois foram analisados pelo método de sequenciação de

Figura 6. Fluxograma do método de análise genética.

envolvimento do método revelou-se importante o fator de aplicabilidade

a amostras degradadas e a necessidade de aumentar a sensibilidade para a a

Página 58

7. Reacção de sequenciação

8. Detecção por Electroforese Capilar

9. Análise dos resultados



tras de sangue periférico foram colhidas durante a autópsia para tubos de 10

mL com fluoreto de sódio, usado como conservante, e foram armazenadas a -10ºC.

casos em que o sangue periférico tinha volume insuficiente, foram usadas

por sequenciação de fragmentos


se a amplificação dos fragmentos

por PCR, que depois foram analisados pelo método de sequenciação de Sanger (ver

de aplicabilidade

a amostras degradadas e a necessidade de aumentar a sensibilidade para a amplificação


4.2.1 Preparação das amostras

As manchas de sangue foram preparadas em papel Whatman®

FTA, com o

procedimento habitualmente utilizado no SGBF. Este é um bom meio de conservação

da amostra, que permite um longo período de armazenamento (Healthcare 2009 -

Whatman FTA™ data file 51750), tendo já sido demonstrada a sua aplicabilidade a

metodologias de farmacogenética (Mas, Crescenti, Gassó, Vidal-Taboada, & Lafuente,

2007).

As manchas de sangue foram codificadas de modo a garantir a confidencialidade e

também a rastreabilidade. O código único para cada mancha consiste nas 3 letras

“CYP” seguidas de 3 algarismos sequenciais a partir do 001 e pela ordem de

preparação da mancha (exemplo: CYP001).

4.2.2 Extração de ADN

A extração de ADN das manchas de sangue foi realizada pelo método de Chelex®

100

da BioRad a 5% (m/v), segundo o método de Walsh (Walsh, Metzger, & Higuchi,

1991) e conforme procedimento recomendado pela Whatman (GE Healthcare 2010 -

Application note 28-9822-22 AA).

O Chelex100® é uma resina de troca iónica quelante (copolímero de divinilbenzeno)

que através de um processo simples e a temperatura elevada promove a lise

membranar, precipita a hemoglobina e retém iões metálicos, proteínas desnaturadas e

outros inibidores de PCR. Este processo de captura dos iões metálicos, com maior

afinidade para o cobre, chumbo e ferro, promove também a inativação da enzima

responsável pela quebra das ligações entre os nucleótidos, protegendo a integridade do

ADN (Barea, Pardini, & Gushiken, 2004; Bio-Rad Laboratories, 2000).

No final do processo de extração, e após a centrifugação, o ADN extraído encontra-se

no sobrenadante (aproximadamente 150µL), existindo um depósito formado com o


Chelex e todas as substâncias a desprezar. As amostras assim extraídas foram

armazenadas a -20ºC.

4.2.3 Quantificação

A determinação da concentração e da pureza do ADN genómico extraído foi efetuada

com um kit Quantifiler®

Trio DNA Quantification da Applied Biosystems (AB),

seguindo as recomendações do fabricante (Applied Biosystems, 2014).

O Quantifiler Trio faz a amplificação e a quantificação de vários loci em simultâneo

(para aumentar a sensibilidade) e em zonas com menor variabilidade individual e

populacional (para aumentar a precisão), com 3 objetivos: amplificar pequenos

fragmentos autossómicos (80 pb), amplificar grandes fragmentos autossómicos (214pb)

e determinar o género (75 pb no cromossoma Y).

O Quantifiler Trio permite efetuar uma análise quantitativa por sondas TaqMan® num

sistema RealTime PCR 7500, e assim obter além da concentração, também a qualidade

do ADN humano de cada amostra através de um índice de degradação (Vernarecci et

al., 2015). A concentração de ADN amplificável é útil para ajustar o volume de

amostra a utilizar na preparação da reação de amplificação. O índice de degradação e

de inibição permite aferir a possibilidade de amplificar fragmentos com mais de 200pb.

4.2.4 Seleção dos alelos

Os polimorfismos alvo da metodologia foram selecionados utilizando como critério a

sua correlação com a atividade enzimática e a frequência populacional, segundo

revisão da literatura. De acordo com o exposto no ponto 2.5.3. e tendo em conta a

limitação desta metodologia relativamente à detecção da variação do número de cópias

do gene (ver ponto 2.7), as variantes alélicas do gene CYP2D6 selecionadas para o

estudo são:

Suzana Fonseca

CYP2D6 *3 (rs4986774)

CYP2D6 *4 (rs3892097

CYP2D6 *6 (rs5030655)

Dada a abrangência do método, foi possível

localizadas nos fragmentos sequenciados,

(1758G>T), *10 (100C>T)

ainda *40 (1863_1864ins TTTCGCCCCx2)

(73C>T), *49 (1611T>A)

Figura 7. Variantes do gene CYP2D6 estudadas

4.2.5 Amplificação por PCR

A amplificação do ADN é um processo de replicação de um fragmento

aumentando a sua concentração

A Polymerase Chain Reaction

seguido pela replicação natural

espaço de tempo, a frequência n

delimitado pelos iniciadores d

3 fases, que se repetem ciclicamente:

(rs4986774) – 2549delA;

(rs3892097) – 100C>T e 1846G>A;

(rs5030655) – 1707delT.

ada a abrangência do método, foi possível pesquisar outras variantes genéti

nos fragmentos sequenciados, em particular as seguintes:

(100C>T), *12 (124G>A), *14 (1758G>A), *15 (137_138insT)

(1863_1864ins TTTCGCCCCx2), *43 (77G>A), *44

(1611T>A), *50 (1720A>C), entre outros (ver Figura 7).

Variantes do gene CYP2D6 estudadas neste trabalho.

Amplificação por PCR

A amplificação do ADN é um processo de replicação de um fragmento

concentração na amostra, de forma a possibilitar a análise.

Polymerase Chain Reaction (PCR) é uma reação em cadeia baseada no princípio

seguido pela replicação natural que aumenta, de forma exponencial e num curto

espaço de tempo, a frequência na amostra de um determinado fragmento de ADN

iniciadores da reação, denominados primers. Para tal são necessárias

3 fases, que se repetem ciclicamente:

Página 61

pesquisar outras variantes genéticas

em particular as seguintes: CYP2D6*8

(137_138insT), e

4 (82C>T), *47

).

neste trabalho.

A amplificação do ADN é um processo de replicação de um fragmento de ADN,

de forma a possibilitar a análise.

baseada no princípio

aumenta, de forma exponencial e num curto

fragmento de ADN

. Para tal são necessárias


1. Desnaturação: separação das cadeias complementares do ADN a T> 90ºC;

2. Hibridização ou Annealing: ligação dos primers às cadeias simples de ADN a

temperatura mais baixa (entre 50 e 65ºC). A seleção da temperatura de

annealing é dependente dos primers e do meio e é um fator crítico no

desenvolvimento do método.

3. Extensão: ligação dos dNTP (desoxinucleótidos trifosfatados) às duas cadeias

simples de ADN sempre a partir do extremo 3’ de cada primer, criando duas

cadeias duplas. A extensão é catalisada pela enzima Taq polimerase a 72ºC,

exclusivamente na direção 5’ para 3’do ADN.

A repetição dos ciclos, com um controlo rigoroso de temperaturas e tempos, usando

para tal um termociclador, permite um aumento exponencial do número de fragmentos.

Para que as reações em cadeia se possam realizar é necessária, além da amostra, a

presença de uma enzima catalítica (HotStarTaq®

DNA Polymerase), do controlo de

meio por utilização de um tampão com cloreto de magnésio (QIAGEN Multiplex PCR

Buffer com 6 mM MgCl2), de dNTPs (desoxinucleótidos trifosfatados: adenina,

citosina, guanina e timina) e dos primers específicos para o fragmento alvo.

Neste trabalho, a amplificação por PCR foi efetuada com a química Multiplex PCR

Master Mix da Qiagen, segundo as recomendações do fabricante (Qiagen, 2010).

Os iniciadores ou primers são sequências de nucleótidos sintetizadas quimicamente

com 20 a 25 pb, complementares ao ADN das extremidades do fragmento alvo. A

escolha dos primers é o fator fundamental para a especificidade do método e para cada

fragmento de ADN que se pretende amplificar. São necessários dois primers que se

ligam a cada uma das extremidades 3' das cadeias de ADN simples já desnaturadas.

Os primers utilizados neste trabalho encontram-se descritos na Tabela 4.


Tabela 4. Sequências dos primers e localização dos fragmentos.

primer Sequência pb Localização Referência

F1 CAGTCAACACAGCAGGTTCA 437 1446 a 1883 Levo et al. 2003

R1 CCTGTGGTTTCACCCACCAT (-173 a 264)

FH TCCCAGCTGGAATCCGGTGTCG 736 2918 a 3653 Hersberger 2000

R2 GAGACTCCTCGGTCTCTCG (1300 a 2034) Levo et al. 2003

F3 GCTGGGGCCTGAGACTT 200 3988 a 4188 Levo et al. 2003

R3 GGCTGGGTCCCAGGTCATAC (2369 a 2569)

A reação de PCR preparou-se para um volume final de 25 µL, com: 12,5 µL de

Multiplex PCR Master Mix 2x; DMSO a 5%; 200 nM de cada primer e

aproximadamente 200 nM de ADN, perfazendo o volume final com água.

O termociclador foi programado para uma desnaturação inicial de 15 minutos a 95ºC,

os ciclos específicos para cada par de primers e uma extensão final de 7 minutos a

72ºC, conforme se descreve na Tabela 5.

Tabela 5. Condições dos ciclos de temperatura da reação de PCR.

F1+R1 FH+R2 F3+R3

Desnaturação inicial 95ºC/15 min 95ºC/15 min 95ºC/15 min

Nº ciclos 40 40 35

desnaturação 94ºC/30s 94ºC/30s 94ºC/30s

hibridação 55ºC/30s 55ºC/30s 57ºC/30s

extensão 72ºC/30s 72ºC/30s 72ºC/30s

Extensão final 72ºC/7 min 72ºC/7 min 72ºC/7 min

Na amplificação de cada grupo de amostras juntou-se um controlo de reagentes de

amplificação e, sempre que possível, um controlo de amostra.


4.2.6 Purificação dos produtos amplificados

Os produtos de amplificação foram purificados com ExoSAP-IT® da Affymetrix. Este

reagente de purificação é constituído por duas enzimas hidrolíticas: a Exonuclease 1

remove primers residuais e outros resíduos de ADN; a fosfatase alcalina de camarão

(Shrimp Alkaline Phosphatase: SAP) remove dNTPs residuais. A reação de

purificação foi efetuada num termociclador, conforme as recomendações do fabricante

[ExoSAP-IT®

protocol], mantendo a temperatura a 37ºC durante 15 minutos, seguido

de uma inativação dos resíduos e das enzimas a 80ºC durante 15 minutos.

4.2.7 Verificação em gel de poliacrilamida

O rendimento da reação de amplificação foi verificado por eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis (Amersham Biosciences, 1998)) seguida de revelação de coloração de

prata (Silver Staining), com um equipamento Phastsystem da GE Healthcare.

A eletroforese foi efetuada com o gel PHASTGEL gradient 10-15 e o tampão em gel

PHASTGEL buffer strips. Para a coloração foi utilizado o PhastGel DNA Silver

Staining Kit, seguindo as recomendações do fabricante.

Pela observação do gel foi possível avaliar a existência de produtos amplificados, o

tamanho relativo dos fragmentos e a negatividade do controlo de reagentes de

amplificação.

4.2.8 Sequenciação

A sequenciação de Sanger é um método que foi desenvolvido por este autor em 1977 e

que permite conhecer a localização e ordem dos nucleótidos de um fragmento de ADN

(Sanger, Nicklen, & Coulson, 1977). O método é semelhante ao PCR, utilizando-se

apenas um primer de cada par, DNA polimerase, nucleótidos (dNTPs) e

dideoxinucleótidos (ddNTPs). Durante a extensão, além de serem incorporados os


dNTPs, vão sendo incluídos também os ddNTPs, que se caracterizam por não ter o

grupo hidroxilo que permite ligar ao nucleótido seguinte, terminando a extensão. São

então formados produtos de dimensões diferentes com um ddNTP na extremidade 3’.

Cada ddNTP tem um marcador fluorescente de acordo com a base a que corresponde,

marcando o nucleótido final. Os fragmentos de ADN de tamanho diferente são então

separados por eletroforese capilar e o último nucleótido é identificado pelo detetor de

fluorescência induzida por LASER (Applied Biosystems, 2009).

A sequenciação foi efetuada com a química BigDye Terminator v. 3,1 Cycle

Sequencing Kit da Applied Biosystems (AB), segundo as recomendações do fabricante

(Applied Biosystems, 2002). Para controlo do meio utilizou-se Better Buffer e os

primers descritos anteriormente para as reações de amplificação por PCR.

A reação de sequenciação foi preparada para um volume final de 10 µL, com: 2 µL de

BigDye Terminator v. 3,1; 4 µL de Better Buffer; DMSO a 5%; 500nM de um dos

primers do fragmento amplificado e 1µL de produto amplificado, perfazendo o

volume final com água. As reações de sequenciação foram efetuadas em placa de 96

poços e a cada grupo de amostras juntou-se um controlo de reagentes de sequenciação

e, quando possível, um controlo de amostra.

O termociclador foi programado conforme as condições de tempos e temperaturas

apresentadas na Tabela 6.

Tabela 6. Condições dos ciclos de temperatura da reação de sequenciação.

F1+R1 FH+R2 F3+R3

Desnaturação inicial 95ºC/3 min 95ºC/3 min 95ºC/3 min

Nº ciclos 35 35 35

desnaturação 95ºC/20s 95ºC/20s 95ºC/20s

hibridação 55ºC/20s 55ºC/20s 57ºC/20s

extensão 60ºC/6 min 60ºC/6 min 60ºC/6 min

Suzana Fonseca

Os produtos de sequenciação foram purificados com

kit da Applied Biosystems

dos produtos, seguindo as indicações do fabricante

4.2.9 Detecção por eletroforese

Os produtos de sequenciação foram separados de acordo com o seu

por eletroforese capilar: os fragmentos de ADN com carga negativa deslocam

o cátodo a uma velocidade inversamente proporcional ao seu peso molecular.

dos capilares está colocado um

Figura 8). Este processo consegue diferenciar os produtos de extensão com a resolução

de 1 base (Applied Biosystems, 2009)

Figura 8. Demonstração esquemática da sequenciação com

A análise por eletroforese

sequenciador automático

equipado com 4 capilares de 36 cm.

capilares o polímero POP

utilizados neste método

simultâneo, sendo que cada corrida demora cerc

Obtém-se assim um eletroferograma

sequência de sinais de fluorescência

Os produtos de sequenciação foram purificados com BigDye Xterminator Purification

Applied Biosystems para a remoção dos resíduos de sequenciação e estabilização

tos, seguindo as indicações do fabricante (Applied Biosystems, 2007)

eletroforese capilar

Os produtos de sequenciação foram separados de acordo com o seu

: os fragmentos de ADN com carga negativa deslocam

o cátodo a uma velocidade inversamente proporcional ao seu peso molecular.

dos capilares está colocado um detetor de fluorescência por indução com LA

Este processo consegue diferenciar os produtos de extensão com a resolução

(Applied Biosystems, 2009).

. Demonstração esquemática da sequenciação com BigDye Terminator v. 3,1

eletroforese capilar dos produtos sequenciados foi

sequenciador automático Genetic Analyser 3130 da Applied Biosystems (AB)

lares de 36 cm. Utilizou-se como matriz de separação nos

POP-6 da AB, que é adequado para o tamanho dos

utilizados neste método. O equipamento permite a análise de 4 amostras em

simultâneo, sendo que cada corrida demora cerca de 1:30h.

eletroferograma, que corresponde à representação gráfica da

sinais de fluorescência correspondentes ao ddNTP terminal de cada

Página 66

BigDye Xterminator Purification

para a remoção dos resíduos de sequenciação e estabilização

(Applied Biosystems, 2007).

Os produtos de sequenciação foram separados de acordo com o seu peso molecular

: os fragmentos de ADN com carga negativa deslocam-se para

o cátodo a uma velocidade inversamente proporcional ao seu peso molecular. No final

por indução com LASER (ver

Este processo consegue diferenciar os produtos de extensão com a resolução

BigDye Terminator v. 3,1.

s produtos sequenciados foi efetuada num

Applied Biosystems (AB),

se como matriz de separação nos

o tamanho dos fragmentos

O equipamento permite a análise de 4 amostras em

representação gráfica da

correspondentes ao ddNTP terminal de cada


fragmento em função do tempo de migração na matriz do capilar. Tendo em conta que

para cada amostra foram analisados 3 fragmentos delimitados por 2 primers cada um,

obtiveram-se 6 eletroferogramas por amostra.

4.2.10 Análise dos resultados

A qualidade dos eletroferogramas obtidos foi avaliada usando o programa informático

Sequencing Analysis versão 5.2 da AB (Applied Biosystems, 2009). Verificou-se a

resolução dos sinais detetados e a sua altura (que será proporcional à concentração

final), o número de bases detetadas em cada sequência, bem como a existência de

interferências.

A comparação com a sequência de referência (CYP2D6*1,entrada M33388.1 no

GenBank) e a classificação das variantes de cada amostra foi efetuada com recurso ao

programa informático SeqScape versão 3, da AB (Applied Biosystems, 2012b). Este

programa faz automaticamente o alinhamento das sequências obtidas com a de

referência, de acordo com os parâmetros de análise definidos no método.

O SeqScape permite de uma forma expedita, verificar as diferenças relativamente à

sequência de referência e, após uma avaliação cuidada de cada base, identificar as

variantes genéticas da amostra.

4.3 Validação do método de análise genética

A validação dos métodos permite conhecer os seus limites e demonstrar a

adequabilidade ao uso que se pretende, através do estudo de parâmetros objetivos e

cientificamente aceites. É importante, em particular, a demonstração da possibilidade

de utilização na rotina pericial e a sua exatidão.

Para a seleção dos parâmetros a avaliar na validação do método de análise genética,

consideraram-se:


os objetivos específicos do método e as suas características;

o tipo de amostras em que será aplicado – sangue post mortem;

as recomendações da SWGDAM para validação de métodos (Scientific

Working Group on & Methods, 2012);

as recomendações da ENFSI para validação de métodos (ENFSI DNA

WORKING GROUP, 2010);

o Procedimento Geral de Validação de Ensaios em vigor no SGBF;

a revisão bibliográfica sobre validação de métodos de sequenciação

(Branicki, Kupiec, & Pawlowski, 2003; Budowle et al., 2014; Holland

& Parsons, 1999; Pont-kingdon et al., 2012; Wilson, DiZinno,

Polanskey, Replogle, & Budowle, 1995).

Os parâmetros avaliados são:

1. Especificidade e exatidão;

2. Limite de detecção;

3. Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade;

4. Qualidade média dos resultados.

4.3.1 Especificidade e Exatidão

A metodologia de sequenciação de Sanger é, por natureza, muito específica dado que

se analisam sequências com mais de 200 pb e todos são comparados com a sequência

de referência (Sanger et al., 1977). Para tal é essencial escolher uma sequência de

referência credível e utilizar primers seletivos. A sequência de referência foi

selecionada tendo em conta a utilizada pelo Human Cytochrome P450 Allele

Nomenclature Committee: a entrada do Genbank m33388.1

(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).


A avaliação da especificidade deve garantir que os primers são suficientemente

seletivos para que os produtos de sequenciação obtidos sejam efetivamente os

pretendidos, neste caso, fragmentos do gene CYP2D6. A ferramenta de pesquisa

BLAST disponibilizada pela NCBI em http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi, pode

ser utilizada para verificar a especificidade, quer dos primers utilizados (no Primer

BLAST), quer das sequências obtidas (Branicki et al., 2003; Morgulis et al., 2008;

Pont-kingdon et al., 2012). Os 6 primers utilizados e os produtos de sequenciação de 3

amostras com variantes genéticas diferentes foram assim verificados (6 sequências por

amostra). Dada a elevada homologia dos pseudogenes CYP2D7 e CYP2D8 com o

gene CYP2D6, procuraram-se ainda as diferenças entre as sequências obtidas apara as

amostras e a de referência dos 2 pseudogenes (entrada no Genbank m33387.1).

A exatidão consiste na concordância entre os resultados obtidos pela metodologia

desenvolvida e os reais, isto é, se as variantes detetadas são as que efetivamente estão

presentes (Pont-kingdon et al., 2012; Scientific Working Group on & Methods, 2012).

A exatidão pode aferida por comparação com os resultados de outro laboratório, outro

método ou outros primers e usando sempre controlos negativos, mas deve ser sempre

confirmada com recurso a materiais de referência como os que são disponibilizados

pelo Coriell Cell Repositories ou então com ensaios de aptidão interlaboratoriais (Pratt

et al., 2010). Neste trabalho, utilizaram-se materiais de referência do Coriell Cell

Repositories com as variantes dos 3 alelos mais prevalentes e que contêm todas as

variantes que foram detetadas nas amostras post mortem analisadas:

a. MR1: CYP2D6 *4/*4 ref Coriell - NA17226

b. MR2: CYP2D6 *3/*2 ref Coriell - NA17280

c. MR3: CYP2D6 *6/*1 ref Coriell – NA17300


Aplicou-se o procedimento de ensaio completo (excluindo extração) e identificaram-

se as variantes nas sequências obtidas, comparando-as depois com os certificados, que

se encontram no Anexo I.

4.3.2 Limiares analíticos

O método desenvolvido é um método qualitativo, pelo que dos limiares analíticos

apenas o limite de detecção tem relevância (ENFSI DNA WORKING GROUP, 2010;

Scientific Working Group on & Methods, 2012).

Selecionaram-se duas amostras controlo com concentração conhecida: controlo THP

(10 ng/uL) e controlo 007 (0.1 ng/uL) (Applied Biosystems, 2012a, 2014). Fizeram-se

diluições de cada amostra em água de forma a obter 6 amostras com as concentrações:

10 ng/uL; 1 ng/uL; 0.5 ng/uL; 0.1 ng/uL; 0.05 ng/uL e 0.01 ng/uL. Aplicou-se o

procedimento de amplificação e sequenciação completo. Avaliou-se a capacidade de

resposta da sequenciação através dos seguintes parâmetros: sinal; S/R; identificação do

genótipo.

4.3.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade

A precisão é uma forma de medir a variabilidade dos erros aleatórios, através da

dispersão observada nos resultados de ensaios independentes da mesma amostra.

4.3.3.1 Repetibilidade

Fizeram-se triplicados de 5 amostras de genótipo diferente, em simultâneo e mantendo

todas as condições de análise, excepto a localização no termociclador e na placa do

sequenciador (ENFSI DNA WORKING GROUP, 2010; Scientific Working Group on

& Methods, 2012).


4.3.3.2 Reprodutibilidade

Aplicou-se o método desenvolvido a 15 amostras com genótipo diferente, em 3 dias

diferentes, tendo sido contempladas as fontes de variabilidade que simulam o normal

funcionamento do laboratório (data, reagentes, condições ambientais, termocicladores,

pipetas, etc.) (ENFSI DNA WORKING GROUP, 2010; Scientific Working Group on

& Methods, 2012).

4.3.4 Qualidade média dos resultados.

A qualidade média dos resultados pode ser aferida utilizando parâmetros fornecidos

pelo programa de análise das sequências (SeqSCAPE) durante o estudo da

reprodutibilidade (Pont-kingdon et al., 2012). Calculou-se a média e o coeficiente de

variação para 5 amostras:

a. Intensidade de sinal;

b. Sinal / ruído das bases;

c. Sample score.

A utilização de controlos de reagentes e de amostra permite aferir se os reagentes,

primers, consumíveis e equipamentos utilizados em cada conjunto de amostras, bem

como as condições ambientais em cada dia de análise, estão aptos a gerar resultados

que cumpram critérios de qualidade.

4.4 Metodologia de quantificação de tramadol e metabolitos

A quantificação de tramadol e dos metabolitos ODT e NDT foi efetuada por

cromatografia gasosa com detetor de espectrometria de massas (GC/MS), após

extração em fase sólida (SPE).


4.4.1 Preparação das amostras

As amostras de sangue total post mortem foram homogeneizadas agitando suavemente

durante pelo menos 10 minutos, até atingirem uma temperatura próxima da ambiente.

Para tubos de 10 mL adicionaram-se 5 mL de tampão fosfato pH 7.00 da Merck; 25

µL de uma solução de padrão interno (solução a 1 ug/mL de fentanil) e a toma de

ensaio de sangue total (500µL). Após homogeneização por rotação/inversão durante

cerca de 5 minutos, centrifugaram-se a 3500 rpm durante 15 minutos.

Paralelamente às amostras em duplicado, prepararam-se 7 calibradores na gama de

trabalho (50 ng/mL a 1000 ng/mL), controlos em 3 níveis de concentração (150 ng/mL,

500 ng/ml e 850 ng/mL) e os controlos negativos: de reagentes e do sangue branco

usado como matriz para os calibradores e restantes controlos. Os calibradores e os

controlos foram preparados por fortificação com soluções de padrões primários

Cerilliant de tramadol, O-desmetil-tramadol, N-desmetil-tramadol e fentanil, com as

concentrações de 1 ug/mL e 10 ug/mL..

4.4.2 Extração em fase sólida

Usando colunas de extração em fase sólida Waters Oasis HLB® de 3cc e 60 mg, fez-se

a extração das substâncias de interesse com o procedimento descrito na Tabela 7.

Tabela 7. Extração em fase sólida com colunas Waters Oasis HLB®.

Ativação Acondicionamento

2 mL de metanol p.a.

2 mL de água ultra-pura

Aplicação da amostra Amostra

Lavagem 2 mL de metanol a 5%

Secagem das colunas Secar as colunas sob vácuo cerca de 30 min

Eluição para tubos de vidro 2 mL de metanol p.a.

Levou-se o extrato à secura sob corrente de azoto a 35 ºC (cerca de 30 minutos) e

redissolveu-se em 75 µL de metanol. Transferiu-se o extrato para um vial adequando

ao injector automático.


4.4.3 Análise por GC/MS

A análise das amostras foi efetuada num cromatógrafo gasoso Agilent 6890 acoplado a

um detetor de massa Agilent 5973, com as condições do método que se encontram

descritas na Tabela 8.

Tabela 8. Descrição dos parâmetros de análise instrumental por GC/MS.

Parâmetro Descrição

Modo e volume de injeção 2 µL, split 1:10

Fluxo inicial 1 mL/min

Temperatura e tempo inicial 150 °C, 1 min

Gradiente 5 °C/min

Temperatura e tempo final 290 °C, 8 min

Modo de ionização Impacto Eletrónico

Modo de aquisição SIM, SCAN

Iões adquiridos e tempos de retenção: Iões / TR

tramadol 58, 263, 135 / 12,2 min

N-desmetil-tramadol 188, 249, 135 / 12,6 min

O-desmetil-tramadol 58, 249, 121 / 13,5 min

fentanil 245 / 25 min

4.4.4 Avaliação dos resultados

Após integração dos sinais cromatográficos obtidos para cada ião ao tempo de

retenção de cada composto, para todas as amostras, calibradores e controlos, foram

efetuados os cálculos de confirmação qualitativa e quantitativa em Microsoft®

Excel.

A identificação das substâncias presentes nas amostras é efetuada por comparação das

áreas dos sinais cromatográficos obtidos com os de um controlo fortificado preparado

em simultâneo e em condições idênticas, por cumprimento dos seguintes critérios

(documentados no Procedimento Operacional de Avaliação e cálculo de resultados,

em vigor no SQTF):


a. a razão sinal/ruído (S/R) deve ser superior a 3 para todos os sinais;

b. o tempo de retenção relativo (TRR) de cada substância não deve diferir

mais que 1% do obtido para o controlo;

c. as relações iónicas dos três iões característicos e no tempo de retenção de

cada composto não devem diferir mais do que o limite admitido de acordo

com a Tabela 9, tendo como referência as obtidas para o controlo.

Tabela 9. Tolerância máxima para as áreas relativas dos iões diagnóstico.

Áreas relativas (% do pico base, no controlo)

Tolerância Máxima (na amostra)

> 50% 10% (absoluto)

25%> Ar> 50% 20% (relativo)

5%> Ar> 25% 5% (absoluto)

< 5% 50% (relativo)

A quantificação das substâncias presentes nas amostras é efetuada pelo método do

padrão interno, com uma curva de calibração obtida por ajuste de regressão linear aos

calibradores, que deverá cumprir os seguintes critérios de aceitação:

a. Curva de calibração com pelo menos 5 calibradores;

b. Coeficiente de correlação linear (r2) superior a 0,99;

c. Controlos com desvio inferior a 20%, relativamente à concentração

teórica.

4.5 Validação do método de quantificação de tramadol e metabolitos

A validação do método de análise quantitativa de tramadol e dos seus metabolitos

ODT e NDT foi efetuada segundo os critérios em vigor no SQTF, tendo sido avaliados

os seguintes parâmetros:


1. especificidade/seletividade, capacidade de identificação e avaliação de

interferentes;

2. eficácia de extração;

3. limiares analíticos: limites de detecção e de quantificação;

4. linearidade e modelo de calibração;

5. precisão intermédia e repetibilidade;

6. exatidão;

7. arrastamento entre análises consecutivas;

8. robustez.

4.5.1 Especificidade/seletividade, capacidade de identificação e avaliação de

interferentes

Quarenta amostras brancas foram agrupadas em dez pools de sangue total: oito

constituídas de sangue periférico e duas de sangue cardíaco. A partir de cada uma das

pools foram preparadas duas alíquotas de 500uL: uma das alíquotas foi fortificada com

as substâncias em estudo a 100 ng/mL. Aplicou-se o procedimento de ensaio e

compararam-se os resultados obtidos nas alíquotas fortificadas com os resultados

obtidos nas alíquotas da mesma matriz que não foram fortificadas, aplicando-se os

critérios de identificação.

Para a avaliação de interferentes foram selecionadas aleatoriamente três pools e de

cada uma delas foram utilizadas três alíquotas (500uL): uma foi fortificada com 100

ng/mL dos compostos em estudo e sem padrão interno; outra apenas com padrão

interno; e a terceira foi fortificada com 500 ng/mL de compostos passíveis de serem

encontrados em casos de rotina no STF, nomeadamente, cocaína e metabolitos,

opiáceos, anfetaminas e benzodiazepinas.


4.5.2 Eficiência da extração

O estudo da eficiência da extração foi efetuado com três níveis de concentração (150,

500 e 850 ng/mL) e foram preparados dois conjuntos de triplicados para cada nível.

Um destes conjuntos foi fortificado no início do procedimento de preparação das

amostras, enquanto o outro logo após a extração (antes da evaporação do extrato). O

padrão interno foi adicionado a todas as alíquotas antes da etapa de evaporação.

4.5.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação

Para a avaliação do limite de detecção foram preparados 5 conjuntos de 3 alíquotas de

sangue branco, com diferentes níveis de concentração: 10, 12.5, 15, 25 e 50 ng/mL.

Aplicou-se o procedimento de ensaio e, utilizando a primeira alíquota de 50 ng/mL

como referência, selecionou-se como limite de detecção a concentração mais baixa

para a qual foram cumpridos os critérios de identificação.

O limite de quantificação de 50 ng/mL foi estabelecido com base na sensibilidade do

método e nos limites inferiores do intervalo terapêutico estabelecido para o tramadol,

de acordo com a tabela de referência (Repetto & Repetto, 2015). Simultaneamente a

uma curva de calibração, prepararam-se seis replicados a 50 ng/mL, que foi definido

como primeiro calibrador. Aplicou-se o procedimento de ensaio e calculou-se o

coeficiente de variação para as concentrações obtidas nos seis replicados para cada um

dos compostos.

4.5.4 Linearidade e Modelo de Calibração

O estudo da linearidade e modelo de calibração permite, num determinado intervalo de

concentrações avaliar se o sinal analítico é proporcional à concentração e, se existir

heterocedasticidade, selecionar a ponderação a utilizar na curva de calibração de cada

substância (Almeida, Castel-Branco, & Falcao, 2002).


Para avaliar os parâmetros de linearidade e modelo de calibração prepararam-se cinco

curvas de calibração, mediante fortificação de alíquotas de 500 µL de uma amostra de

sangue branco, num total de sete calibradores (50, 100, 200, 400, 600, 800 e 1000

ng/mL). Prepararam-se ainda 6 replicados do primeiro e do último calibrador e

aplicou-se o procedimento de ensaio.

4.5.5 Precisão Intermédia, Repetibilidade e Exatidão. Arrastamento entre análises

consecutivas.

A precisão intermédia, a repetibilidade e o limite de repetibilidade foram estudados

através da preparação de cinco curvas de calibração e controlos em triplicado aos 3

níveis de concentração, em 5 dias diferentes. Foram ainda preparados seis replicados

dos controlos aos três níveis de concentração. Aplicou-se o procedimento de ensaio,

tendo sido contempladas as fontes de variabilidade que simulam o normal

funcionamento do laboratório (tempo, reagentes, curva de calibração, temperatura

ambiente e equipamentos diferentes).

A exatidão do método é a razão entre o valor observado e o valor real, para verificar a

existência de erros sistemáticos e quando relevante estimar a incerteza associada.

Utilizaram-se os resultados obtidos durante o estudo da precisão intermédia,

calcularam-se as recuperações médias em três sub-gamas de trabalho (baixa, média e

alta), verificou-se se são estatisticamente diferentes de 100% e estimou-se a incerteza

do método conforme se refere no Anexo III.5..

A contaminação entre amostras sucessivas por arrastamento, só se pode verificar na

análise instrumental, dado que todo o processo extrativo é efetuado de forma

independente. Para avaliar a possibilidade de arrastamento injetou-se metanol entre

cada calibrador durante um dos ensaios de precisão intermédia.


4.5.6 Robustez

Durante todo o procedimento de validação foram introduzidas naturalmente pequenas

variações no decurso do normal funcionamento do laboratório que permitiram avaliar

a robustez do método, nomeadamente: lotes de reagentes, equipamentos de medição

de volumétrica (material de vidro e micro-pipetas), condições ambientais, desgaste de

colunas analíticas, manutenção do equipamento, entre outros. Não se verificaram

efeitos que afetassem significativamente os parâmetros de validação, nomeadamente a

precisão, a exatidão e a capacidade de identificação do método.

4.6 Metodologia para a análise estatística da correlação entre os

resultados da análise genética e toxicológica

Aplicou-se o teste de normalidade Kolmogorov-Smirnova para testar se as razões de

concentração de tramadol e metabolitos têm uma distribuição normal. Utilizando

testes não paramétricos, fez-se a comparação de medianas pelo teste de Mann-Whitney

e de Jonckheere-Terpstra. São testes robustos e adequados à análise de modelos

genéticos (Câmara, 2001; Yang et al., 2010). Foram ainda visualizados gráficos de

medianas e quartis, usando como escala o logaritmo decimal das razões de

concentração dos compostos detetados. Todos os dados obtidos foram tratados e

analisados com o programa de cálculo estatístico SPSS Statistics, versão 17.0, com um

nível de significância de 0,05.


5 Resultados

O desenvolvimento de um método para a análise genética do CYP2D6 em amostras

post mortem envolve dificuldades acrescidas que se prendem com dois aspetos

principais:

a. a especificidade de amplificação, devido à elevada semelhança entre o gene e

os pseudogenes CYP2D7 e CYP2D8 (Gaedigk, 2013);

b. a necessidade de amplificação de ADN fragmentado e degradado (Riccardi et

al., 2013).

Para ultrapassar estas dificuldades optou-se por utilizar primers previamente

desenvolvidos e validados por autores diferentes e publicados em artigos científicos

(Gaedigk, 2013; Hersberger et al., 2000; Levo et al., 2003). Estes primers têm um

conteúdo em guanina-citosina superior a 60% e, portanto, uma elevada temperatura de

fusão, o que faz subir a temperatura necessária à hibridação. As temperaturas de

annealing muito altas têm geralmente baixas recuperações de amplificaçãoPor outro

lado, as amostras degradadas têm também baixo rendimento de amplificação e ruído

devido à fragmentação do ADN. Para aumentar a recuperação da reação de

amplificação verificou-se, durante o desenvolvimento do método, ser necessário

utilizar dimetilsulfóxido (DMSO). O DMSO liga-se às citosinas, alterando a sua

conformação e tornando-as mais lábeis, isto é, baixando a sua temperatura de fusão

(Montgomery & Wittwer, 2014).As condições de PCR, de purificação e de

sequenciação foram então otimizadas, de forma a obter a melhor sensibilidade e

especificidade, por ajuste dos seguintes parâmetros:

a. volume de amostra;

b. volume total de reação;


c. volumes e concentrações de reagentes;

d. utilização de DMSO a 5%;

e. temperaturas e tempos de annealing;

f. tempos de extensão;

g. número de ciclos.

De notar que o fragmento 3 tem condições de amplificação e de sequenciação

diferentes, tendo sido mais difícil de otimizar. As sequências deste fragmento alinham

com a sequência de referência mas, mesmo após os ensaios de otimização, não há

sobreposição total entre as sequências obtidas com os primers complementares. A

variante 2549delA foi sempre detetada apenas com o fragmento sense (forward).

Todas as amostras que apresentaram uma variante nula, foram confirmadas por

repetição do ensaio correspondente.

5.1 Validação do método de análise genética

O método demonstrou um desempenho conforme os requisitos aplicáveis para a

detecção das variantes genéticas correspondentes aos alelos CYP2D6 *3, *4, *6 e *10.

Os códigos das amostras que foram utilizadas nos ensaios de validação são

apresentados na Tabela 10. As amostras a analisar por este método são de origem

conhecida e colhidas durante a autópsia, não existindo a possibilidade de uma amostra

ser de mais que um indivíduo. Por outro lado, a sequenciação deteta bases que tenham

mais do que 10% da base mais abundante em cada posição. Desta forma a

contaminação cruzada teria que ser superior a 10%, facto que seria facilmente

identificado pelo operador. Por estas razões não se considerou relevante efetuar o

ensaio de contaminação cruzada conforme recomendado pela SWGDAM (Scientific

Working Group on & Methods, 2012). A avaliação da contaminação por reagentes é

feita através da inclusão de controlos negativos em todas as séries.


Tabela 10. Códigos das amostras utilizadas nos ensaios de validação do método.

Especificidade Reprodutibilidade

Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3

CYP015 CYP015 CYP015 CYP002 CYP002 CYP002



CYP017 CYP017 CYP017

Limite de detecção CYP018 CYP018 CYP018

Controlo THP - 10 ng/uL CYP019 CYP019 CYP019

Controlo 007 - 0,1 ng/uL CYP021 CYP021 CYP021

CYP024 CYP024 CYP024

Repetibilidade CYP025 CYP025 CYP025

Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 CYP026 CYP026 CYP026






5.1.1 Especificidade e exatidão

O método cumpre os critérios de especificidade e de exatidão.

A avaliação da especificidade do método foi efetuada por pesquisa das 6 sequências

obtidas (F1, R1, FH, F2, F3 e R3) para cada uma das 3 amostras selecionadas

(CYP015, CYP016 e CYP018) em bases de dados genéticos com a ferramenta BLAST

do NCBI. Para tal, utilizou-se o Standard Nucleotide BLAST, na base de dados de

nucleótidos nucleotide collection nr/nt; human (taxid:9606) procurando sequências

com um elevado grau de semelhança (megablast) (Morgulis et al., 2008). As 18

sequências verificadas têm 99-100% de correspondência (dependendo das variantes

presentes) com a entrada “Homo sapiens CYP2D6 (CYP2D6) gene, complete cds,

Sequence ID: gb|JF307778.1|Length: 6587”, como se pode observar no resumo dos

resultados que estão na Tabela 11.


Tabela 11. Resultados da pesquisa das sequências obtidas para 3 amostras com o BLAST.

CYP015 (*4/*10) CYP016 (wt) CYP018 (*4/*10)

Seq. n/N match n/N match n/N match

F1 329 / 330 99% 356 / 356 100% 361 / 362 99%

R1 369 / 370 99% 373 / 373 100% 313 / 314 99%

FH 593 / 595 99% 522 / 522 100% 346 / 348 99%

R2 429 / 431 99% 499 / 499 100% 581 / 583 99%

F3 148 / 149 99% 152 / 153 100% 156 / 157 99%

R3 125 / 125 100% 154 / 154 100% 140 / 140 100%

Quando pesquisadas na base de dados NCBI Genomes (chromosome), apenas há

correspondência com o cromossoma 22, onde está situado o gene CYP2D6, como se

pode observar no exemplo apresentado na Figura 9.

Figura 9. Pesquisa da sequência FH da amostra CYP016 no BLAST (NCBI Genomes)

As sequências destas amostras foram também procuradas diretamente na sequência do

CYP2D7 e do CYP2D8 (M33387.1 do Genbank). Na Figura 10 são apresentadas

partes dos fragmentos sequenciados, estando assinaladas as bases que os diferenciam

das sequências dos pseudogenes. Pode assim verificar-se que as sequências obtidas são

específicas para o CYP2D6.

Suzana Fonseca

Figura 10. Sequências obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências dospseudogenes,

A exatidão do método foi verificada pela análise do material de referência adquirido

ao banco de células do Coriell Cell Repositories

*4/*4; MR2 – CYP2D6 *2/*3 e MR3

para os materiais de referência são apresentados

Tabela 12.

Figura 11. EletroferogramaMR1 – CYP2D6 *4/*4;

obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências dospseudogenes, segundo a entrada M33387.1 do Genebank.

do método foi verificada pela análise do material de referência adquirido

Coriell Cell Repositories, com os genótipos: MR1

CYP2D6 *2/*3 e MR3 – CYP2D6 *6/*1. Os eletroferograma

para os materiais de referência são apresentados na Figura 11 e o perfil genético na

Eletroferogramas dos polimorfismos identificados nos materiais de referência: CYP2D6 *4/*4; MR2 CYP2D6 *2/*3; MR3 – CYP2D6 *2/*6

Página 83

obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências dos

do método foi verificada pela análise do material de referência adquirido

, com os genótipos: MR1 – CYP2D6

eletroferogramas obtidos

e o perfil genético na

fismos identificados nos materiais de referência: CYP2D6 *2/*6


Tabela 12. Perfil genético dos Materiais de Referência.

Variante 100C>T 124G>A 137insT 1661G>C 1707delT 1758G>T 1846G>A 2549delA

MR1 TT GG - CC TT GG AA na

MR2 CC GG - GG TT GG GG A/del A

MR3 CC GG - CG T/del T GG GG na

na – não analisado.

Foram identificados corretamente os alelos CYP2D6 *4, *3 e *6. A identificação da

variante 100 C>T ficou também validada.

5.1.2 Limite de detecção

A concentração definida como limite de detecção foi a mais baixa para a qual se

cumpriram os critérios de identificação de todas as variantes nos 3 fragmentos. O

genótipo foi consistente em todas as sequências obtidas. As diluições com

concentrações mais baixas (0.05 ng/uL e 0.01 ng/uL) foram analisadas utilizando o

volume máximo de amostra em cada reação, mas sem qualquer alteração nas restantes

condições do método (v.g. número de ciclos de amplificação). Os resultados são

apresentados na Tabela 13.

Tabela 13. Resultados obtidos no ensaio do limite de detecção. Conc

(ng/uL) 100C>T 124G>A 137insT 1661G>C 1707delT 1758G>T 1846G>A 2549delA

10 TT GG - CC TT GG GG A

1,0 TT GG - CC TT GG GG A



0,05 TT GG - nd nd GG nd A

0,01 nd GG - nd nd GG nd A

nd – não detectado.

O perfil genético foi corretamente identificado ao limite de detecção de 0,1 ng/µL. Os

fragmentos menores permitem limites de detecção menores (0,05 ng/µLpara o

fragmento 1 e 0,01ng/µL para o fragmento 3). Entre as 100 amostras post mortem

estudadas com o método foi ainda possível sequenciar com sucesso os 3 fragmentos de

uma amostra com 0.06ng/µL.


5.1.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade

O estudo da reprodutibilidade foi efetuado com 15 amostras em 3 dias diferentes,

fazendo variar os reagentes, consumíveis, equipamentos (como termocicladores e

micropipetas), contemplando ainda as flutuações normais do estado do equipamento

de eletroforese capilar (tais como o desgaste dos capilares, o estado e nível do tampão,

o lote do polímero POP6, bem como as condições ambientais. Para cada

fragmento/variante obtiveram-se, portanto, 90 replicados (15 amostras x 3 dias x 2

sequências). O resumo dos resultados é apresentado na Tabela 14.

Tabela 14. Resultados obtidos no ensaio de reprodutibilidade para 15 amostras.

Alelo *4, *10 *12 *15 *6 *8 *4 *3

Variante 100C>T 124G>A 137insT 1707delT 1758G>T 1846G>A 2549delA

Dia 1 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 14/152 15/15

Dia 2 15/15 15/15 15/15 14/151 14/151 14/151 15/15

Dia 3 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15

1 – fragmento não amplificado; 2 – variante não sequenciada.

As amostras com erro de amplificação (CYP032) e de sequenciação (CYP002) são

amostras com elevado índice de degradação: 1,6 e 1,3 respectivamente.

O estudo da repetibilidade foi efetuado com 5 amostras em triplicado no mesmo dia,

fazendo apenas variar a localização dos replicados no termociclador e na placa do

sequenciador. Para cada fragmento/variante obtiveram-se, portanto, 30 replicados (5

amostras x 3 réplicas x 2 sequências). O resumo dos resultados e o alinhamento das

sequências obtidas para os 3 fragmentos são apresentados na Tabela 15 e na Figura 12.

Tabela 15. Resultados obtidos no ensaio de repetibilidade.

Alelo *4, *10 *12 *15 *6 *8 *4 *3

Variante 100C>T 124G>A 137insT 1707delT 1758G>T 1846G>A 2549delA

Réplica 1 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5

Réplica 2 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5

Réplica 3 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5

Suzana Fonseca

Figura 12. Alinhamento das sequê

5.1.4 Qualidade média dos resultados.

As sequências de primers

ao programa informático

boa sobreposição com a sequ

variantes.

Figura 13. Sobreposição das

O fragmento 3 não demonstra

especificidade e a exatidão

Selecionando 5 amostras das analisadas no decorrer do estudo da reprodutibilidade

retiraram-se os valores médios de sinal e da razão sinal/ruído (S/R),

Sample Score (parâmetro de avaliação da qualidade da sequência), que são

apresentados na Tabela 16

Alinhamento das sequências obtidas durante o ensaio de repetibilidadeCYP025.

Qualidade média dos resultados.

primers complementares foram alinhadas corretamente

SeqScape (ver Figura 13). Os fragmentos 1, 2 e 3 têm uma

boa sobreposição com a sequência de referência, sendo detetadas as principais

Sobreposição das sequências obtidas com a de referência utilizando o SeqScape.

O fragmento 3 não demonstra a sobreposição das sequências complementares, mas a

exatidão não são comprometidas.

ndo 5 amostras das analisadas no decorrer do estudo da reprodutibilidade

se os valores médios de sinal e da razão sinal/ruído (S/R),

(parâmetro de avaliação da qualidade da sequência), que são

16 e na Tabela 17.

Página 86

ante o ensaio de repetibilidade na amostra

corretamente com recurso

s 1, 2 e 3 têm uma

tadas as principais

ncia utilizando o SeqScape.

a sobreposição das sequências complementares, mas a

ndo 5 amostras das analisadas no decorrer do estudo da reprodutibilidade

se os valores médios de sinal e da razão sinal/ruído (S/R), bem como o

(parâmetro de avaliação da qualidade da sequência), que são


Tabela 16. Valores médios de sinal e de sinal/ruído obtidos no ensaio de validação da qualidade média dos resultados.

Fragmento 1 F1 Sinal S/R R1 Sinal S/R CYP025 385 156 956 293 CYP026 2122 795 2099 718 CYP028 692 229 999 216 CYP032 1758 646 2400 661 CYP025r 937 232 1098 383

Fragmento 2 FH Sinal S/R R2 Sinal S/R

CYP015 1743 593 1545 531 CYP016 1333 302 1713 496 CYP018 1696 580 2025 688 CYP019 1341 490 1709 578 CYP020 1302 306 2000 558

Fragmento 3 F3 Sinal S/R R3 Sinal S/R CYP024 763 302 487 228 CYP025 594 268 296 136 CYP026 707 316 348 131 CYP027 2130 793 337 115 CYP028 1291 545 278 121

Tabela 17. Valor de sample score obtidos no ensaio de validação da qualidade média dos resultados.

Fragmento 1 F1 R1

CYP025 51 45 CYP026 28 39 CYP027 41 51 CYP028 39 48 CYP032 23 44

Fragmento 2 FH R2


Fragmento 3 F3 R3



Os critérios de qualidade de sequenciação recomendados pela Applied Biosystems

(Applied Biosystems, 2009) são apresentados na Tabela 18 e foram genericamente

cumpridos.

Tabela 18. Critérios de aceitação usados no ensaio de validação da qualidade média dos resultados (Applied Biosystems, 2009).

Variável Critério

Sinal Maior que 50

S/R Maior que 25

Sample score Entre 20 e 50


5.2 Validação do método de quantificação do tramadol e metabolitos

O método demonstrou um desempenho conforme os requisitos aplicáveis para a

confirmação quantitativa de tramadol, O-desmetil-tramadol e N-desmetil-tramadol.

As fórmulas de cálculo utilizadas na validação do método encontram-se no Anexo III.

Os resultados da validação encontram-se no Anexo IV, apresentando-se aqui apenas o

resumo dos parâmetros mais importantes.

5.2.1 Especificidade/Seletividade, Capacidade de Identificação e Avaliação de

interferentes

O método cumpre os critérios de especificidade e de seletividade.

As alíquotas de sangue não fortificadas deram resultado negativo. Nas alíquotas

fortificadas, as substâncias foram detetados e cumpriram os critérios de identificação

de S/R> 3, de TRR e das relações iónicas. Não existiram falsos negativos, nem falsos

positivos.

O ensaio de avaliação de interferentes permite concluir que os analitos não sofrem

interferência do padrão interno, nem dos restantes compostos que podem estar

presentes nas amostras de rotina. Foram detetadas interferências de matriz no

fragmento iónico de m/z 135 do tramadol, que contudo não afetam a capacidade de

detecção, dado que só se verificam para um dos fragmentos iónicos e as áreas dos

sinais são muito menores do que as que se verificam quando o composto está presente.

5.2.2 Eficiência da extração

As áreas relativas obtidas com e sem processo extrativo foram comparadas. A

eficiência de extração é superior a 80% nos 3 níveis de concentração (Tabela 19).


Tabela 19. Resultados de recuperação

Recuperação 150 ng/mL 500 ng/mL 850 ng/mL Média

N-desmetil-tramadol 82% 97% 86% 88%

O-desmetil-tramadol 90% 100% 95% 95%

Tramadol 90% 100% 88% 93%

5.2.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação

A concentração definida como limite de detecção foi a mais baixa entre as testadas

para a qual se cumpriram todos os critérios de identificação (S/R, TRR e relações

iónicas), nas cinco alíquotas de sangue fortificadas e nos equipamentos validados. O

limite de detecção obtido para o tramadol e para o N-desmetil-tramadol foi de 10

ng/mL e para o O-desmetil-tramadol foi de 12,5 ng/mL.

Verificou-se que o coeficiente de variação dos seis replicados ao limite de

quantificação de 50 ng/mL é inferior a 20% para todos os compostos, nos

equipamentos utilizados.

5.2.4 Linearidade e Modelo de Calibração

O modelo clássico de regressão linear pressupõe que exista uma dispersão aleatória e

uniforme dos desvios dos calibradores na gama de trabalho, ou seja,

homocedasticidade. A homocedasticidade deve ser testada aplicando um teste de

homogeneidade de variâncias. Para tal calcularam-se as variâncias das áreas relativas

dos seis replicados no limite inferior da curva de calibração (calibrador 1) e dos seis

replicados no limite superior (calibrador 7). Aplicando o teste de homogeneidade de

variâncias ANOVA obtém-se um p-value inferior a 0,05 para todas as substâncias,

concluindo-se que o teste de homocedasticidade é falso nas gamas de trabalho

utilizadas. Os desvios ao nível do calibrador 1 são significativamente superiores aos

do nível de concentração superior.


Na presença de heterocedasticidade é necessário estudar os fatores de ponderação a

utilizar na curva de calibração de forma a minimizar as variâncias entre os desvios dos

calibradores ao longo da gama de concentrações. Os fatores de ponderação testados

foram 1/x, 1/x2, 1/y, 1/y2, 1/x1/2 e 1/y1/2 (Almeida et al., 2002). Por observação da

representação gráfica dos resíduos verificou-se se a distribuição é aleatória. O fator de

ponderação foi determinado pelo somatório dos erros relativos, desde que com fator de

correlação médio superior a 0,99 (Tabela 20).

Tabela 20. Somatório dos desvios dos calibradores em 5 curvas de calibração, bem como o

fator de correlação médio, para cada fator de ponderação em dois equipamentos.

Ponderação GCMSD004 GCMSD005 Ponderação Selecionada

R2 (média) %ER R2 (média) %ER

N-desmetil-tramadol

1/x 0,998 151,7 0,996 106,7 1/ x2

1/x2 0,995 141,9 0,994 100,3

1/y 0,998 150,3 0,995 103,6

1/y2 0,993 143,4 0,993 103,7

1/x1/2 0,998 163,9 0,996 131,3

1/y1/2 0,993 161,1 0,996 126,4

O-desmetil-tramadol

1/x 0,999 106,8 0,998 80,5 1/ x2

1/x2 0,997 104,6 0,998 72,1

1/y 0,999 106,5 0,998 79,6

1/y2 0,997 106,4 0,998 71,3

1/x1/2 0,999 111,4 0,998 86,5

1/y1/2 0,999 111,2 0,998 85,3

Tramadol 1/x 0,999 94,8 0,998 70,6 1/x2

1/x2 0,998 87,8 0,998 64,5

1/y 0,999 95,1 0,998 69,3

1/y2 0,998 88,7 0,998 65,9

1/x1/2 0,999 109,0 0,997 85,0

1/y1/2 0,999 108,9 0,997 83,7

Demonstrou-se a existência de heterocedasticidade das curvas de calibração das três

substâncias, e o fator de ponderação com menor somatório de desvios foi 1/x2.


5.2.5 Precisão Intermédia e Repetibilidade

Os resultados de concentração obtidos para os controlos durante o estudo da precisão

intermédia foram tratados por aplicação da ferramenta estatística ANOVA de fator

único para a avaliação da homogeneidade de variâncias. Foram então calculados os

coeficientes de variação da precisão intermédia para as 3 gamas de concentração dos

controlos (Tabela 21).

Tabela 21. Coeficientes de variação do estudo da precisão intermédia.

% CV 150 ng/mL 500 ng/mL 850 ng/mL ponderado

N-desmetil-tramadol 12,4 6,51 6,47 10,7

O-desmetil-tramadol 4,19 5,81 5,57 5,24

Tramadol 7,49 5,71 6,39 6,57

Os resultados cumprem os critérios estabelecidos para todos os compostos analisados,

isto é, o CV é inferior a 20% para a gama baixa e inferior a 10% para as gamas média

e alta.

Para verificar a repetibilidade do método foram calculados os coeficientes de variância

das concentrações obtidas para 6 replicados de cada um dos controlos analisados em

simultâneo e verificou-se que são inferiores a 10% (ver Anexo IV).

5.2.6 Exatidão

As recuperações médias (calculadas conforme se indica no anexo III) aos 3 níveis de

concentração dos controlos analisados durante o estudo da precisão intermédia são

apresentadas na Tabela 22.

Tabela 22. Recuperações médias obtidas nas três gamas de concentrações.

Substância % Recuperação média

150 ng/mL 500 ng/mL 850 ng/mL

N-desmetil-tramadol 95,0 96,2 104,9

O-desmetil-tramadol 98,5 96,5 102,0

Tramadol 100,6 99,3 98,1


O método é considerado exato uma vez que as recuperações médias estão todas

incluídas no intervalo 90 – 110 %. Na Tabela 23 pode verificar-se que a recuperação

média do O-desmetil-tramadol a 500 ng/mL é estatisticamente diferente de 100%, mas

a exatidão é elevada e o nível de incerteza calculado é baixo.

Tabela 23. Incerteza obtida durante a avaliação do parâmetro da exatidão.

Substância 150 ng/mL 500 ng/mL 850 ng/mL

T exp* Incerteza (%)



N-desmetil-tramadol 1,34 4,44 0,29 2,43 -0,15 1,76

O-desmetil-tramadol 1,15 1,34 3,48 2,12 -0,85 2,29

Tramadol -0,31 1,88 0,40 1,91 0,72 2,75

* Sabendo que o T crítico para 5 graus de liberdade e 95% de intervalo de confiança é 2,57.

Não se observou a existência de arrastamento entre análises consecutivas na gama de

trabalho das três substâncias e o método demonstrou ser robusto.

A Tabela 24 apresenta os resultados dos parâmetros mais relevantes da validação.

Tabela 24. Resumo dos resultados de validação do método de quantificação.

Substância Recuperação LOD (ng/mL)

LOQ (ng/mL)

Fator de Ponderação CV

N-desmetil-tramadol 88% 10 50 1/x2 11%

O-desmetil-tramadol 95% 12.5 50 1/x2 5,2%

Tramadol 93% 10 50 1/x2 6,6%

Suzana Fonseca

5.3 Resultados de am

As metodologias desenvolvidas, para a genotipagem e para a quantificação do

tramadol e dos seus metabolitos principais, foram aplicadas a 100 amostras

mortem, não tendo sido possível obter o perfil genético

Dadas as dificuldades inerentes à análise de ADN em amostras degradadas,

considerou-se como uma sequenciação satisfatória sempre que as duas sequências de

cada fragmento se encontraram alinhadas com a de referência na localização das

variantes pesquisadas (segundo os crité

correspondentes às variantes seja inequívoca.

A cada genótipo foi associado um fenótipo previsto tal como se apresenta na

14 .

Figura 14. Fenótipo previst

O resumo dos resultados obtidos na análise toxicológica e na análise genética das

amostras é apresentado na

a. A concentração de tramadol e dos meta

b. A concentração de ADN e respetivo índice de degradação;

c. As variantes genéticas mais relevantes

(alelos *3, *4, *6, *8, *10, *12, *14, *15);

d. O genótipo correspondente às variantes;

e. O fenótipo previsto com base no genótipo;

f. Indicação da presença de inibidores enzimáticos confirmados.

Resultados de amostras


tramadol e dos seus metabolitos principais, foram aplicadas a 100 amostras

, não tendo sido possível obter o perfil genético em apenas 3 casos

ades inerentes à análise de ADN em amostras degradadas,

se como uma sequenciação satisfatória sempre que as duas sequências de


variantes pesquisadas (segundo os critérios do SeqSCAPE) e cuja leitura das bases

correspondentes às variantes seja inequívoca.

A cada genótipo foi associado um fenótipo previsto tal como se apresenta na

Fenótipo previsto com base nas variantes alélicas encontradas nas amostras


na Tabela 25, que contém:

A concentração de tramadol e dos metabolitos ODT e NDT;

A concentração de ADN e respetivo índice de degradação;

As variantes genéticas mais relevantes

(alelos *3, *4, *6, *8, *10, *12, *14, *15);

O genótipo correspondente às variantes;

O fenótipo previsto com base no genótipo;

resença de inibidores enzimáticos confirmados.

Página 94


tramadol e dos seus metabolitos principais, foram aplicadas a 100 amostras post

casos.

ades inerentes à análise de ADN em amostras degradadas,

se como uma sequenciação satisfatória sempre que as duas sequências de


rios do SeqSCAPE) e cuja leitura das bases

A cada genótipo foi associado um fenótipo previsto tal como se apresenta na Figura

o com base nas variantes alélicas encontradas nas amostras.



Tendo em conta que a prevalência dos alelos nulos que não foram pesquisados é muito

baixa e para facilitar o tratamento dos resultados, considerou-se que a ausência de

variantes nos fragmentos analisados corresponde à sequência de referência (WT, do

inglês wild type) e a um fenótipo de metabolizador extensivo/normal (EM). A

caracterização de género e de idade dos indivíduos não é apresentada porque estes

fatores não são responsáveis por alterações à função enzimática da CYP2D6 (Zanger

& Schwab 2013).


Tabela 25. Resumo dos resultados de genotipagem e de quantificação de tramadol e metabolitos (ODT e NDT) para 100 amostras de sangue post mortem.

nd: não detetada; na: não analisada; I – c/ inibidor; S – c/ substrato

amostra TMD NDT ODT fen gen ADN ID 100 124 137_138 1661 1707 1758 1846 2549

CYP2D6*1 EM *1 C G - G T G G A

CYP001 1392 90 344 EM WT 1,82 0,63 C G - T G G A

CYP002 I 1137 1479 161 PM *4/*3 0,25 1,281 CT G - GC T G GA del A

CYP003 - - - - - 0,001 12,1 - - - - - - - A

CYP004 1307 49 78 EM WT 3,26 0,46 C G - G T G G A

CYP005 1986 54 56 EM WT 1,51 0,55 C G - C T G G A

CYP006 874 56 245 EM WT 4,56 0,57 C G - G T G G A

CYP007 1682 40 538 EM WT 0,61 0,61 C G - GC T G G A

CYP008 1455 57 76 IM *4/*10 1,21 0,56 TT G - C T G GA A

CYP009 1941 303 251 EM WT 3,10 0,51 C G - G T G G A

CYP010 1742 36 252 EM WT 0,80 0,41 C G - G T G G A

CYP011 I 1835 881 315 IM *4/*10 0,10 0,55 TT G - C T G GA A

CYP012 I 18000 1479 325 EM WT 0,24 0,50 C G - G T G G A

CYP013 863 nd 49 EM *4/WT 1,29 0,52 CT G - GC T G GA A

CYP014 1651 362 176 EM *4/WT 5,47 0,50 CT G - GC T G GA A


CYP016 1186 nd nd EM WT 2,00 0,59 C G - G T G G A

CYP017 1427 nd nd EM WT 1,68 0,58 C G - GC T G G A


CYP019 I 2288 nd 551 EM WT 3,94 0,67 C G - GC T G G A


CYP021 2045 59 352 EM WT 4,24 0,74 C G - GC T G G A

CYP022 287 44 nd EM WT 1,09 0,73 CT G - C T G G A

CYP023 1014 32 158 EM WT 1,84 0,59 C G - G T G G A

CYP024 866 1809 16 IM *4/*10 1,01 0,80 CT G - GC T G GA A

CYP025 1839 123 168 EM WT 9,16 0,62 C G - G T G G A

CYP026 1400 61 nd EM *4/WT 0,54 0,91 CT G - GC T G GA A

CYP027 994 191 208 EM WT 4,69 0,52 C G - G T G G A

CYP028 12000 1820 3127 EM WT 0,30 0,87 C G - G T G G A

CYP029 5600 1338 167 PM *4/*4 1,18 0,62 TT G - C T G AA A

CYP030 3175 196 732 EM *10/WT 0,24 1,015 CT G - C T G G A

CYP031 I 611 464 69 EM *10/WT 1,30 0,67 CT G - GC T G G A

CYP032 2130 1502 50 PM *4/*4 0,45 1,629 TT G - C T G AA A

CYP033 3739 99 nd EM *4/WT 0,94 0,98 CT G - GC T G GA A

CYP034 1696 73 136 - - 0,004 6,479 CT G - ? - - - A

CYP035 1502 66 nd - - 0,004 4,157 CT G - ? - - - A

CYP036 620 30 29 EM WT 0,70 0,54 C G - G T G G A

CYP037 I 366 28 18 EM *10/WT 0,25 0,36 CT G - GC T G G A

CYP038 528 221 30 PM *4/*4 5,65 0,47 TT G - C T G AA A

CYP039 I 618 23 65 EM WT 0,44 0,45 C G - G T G G A

CYP040 686 nd 77 EM *10/WT 0,063 0,87 CT G - GC T G G A

CYP041 1514 169 559 EM WT 0,45 0,59 C G - G T G G A


CYP043 34000 154 nd IM *4/*10 0,51 0,43 TT G - C T G GA A

CYP044 S 1116 1436 414 EM WT 2,66 0,32 C G - C T G G A

CYP045 1142 119 222 EM WT 0,54 0,56 C G - G T G G A

CYP046 7106 1003 1345 EM WT 4,96 0,55 C G - C T G G A

CYP047 I 4205 3863 212 EM *4/WT 5,75 0,47 CT G - CG T T GA A

CYP048 2682 246 487 EM *10/WT 4,30 0,42 CT G - C T T G A

CYP049 S 1416 186 22 EM WT 1,99 0,52 C G - CG T G G A

CYP050 I 863 26 18 EM *10/WT 2,88 0,51 CT G - C T G G A

(concentração: ng/mL)


Tabela 25. (continuação) Resumo dos resultados de genotipagem e de quantificação de tramadol e metabolitos (ODT e NDT) para 100 amostras de sangue post mortem.

nd: não detetada; na: não analisada; I – c/ inibidor; S – c/ substrato

A reanálise de algumas amostras foi necessária quando a amplificação não foi bem-

sucedida ou quando as sequências obtidas não foram satisfatórias. Todas as amostras

que apresentaram variantes genéticas foram confirmadas por repetição da

sequenciação do fragmento correspondente ao polimorfismo detetado.

CYP051 648 63 254 EM *10/WT 2,11 0,36 CT G - C T G G A

CYP052 S 463 96 24 IM *4/*10 2,30 0,64 TT G - C T G GA A

CYP053 369 5889 357 IM *4/*10 1,29 0,47 TT G - C T G GA A

CYP054 I 782 28 16 EM *10/WT 3,53 0,41 CT G - C T G G A

CYP055 226 nd 33 EM WT 1,72 0,45 C G - G T G G A

CYP056 222 nd 53 EM *10/WT 8,34 0,43 CT G - C T G G A

CYP057 I 94 89 nd EM *10/WT 1,76 0,54 CT G - C T G G A

CYP058 205 103 13 PM *4/*4 2,51 0,38 TT G - C T G AA A

CYP059 342 36 258 EM WT 1,33 0,37 CT? G - G T G G A

CYP060 172 102 277 EM WT 1,46 0,43 C G - G T G G A

CYP061 759 65 47 EM *10/WT 0,21 0,70 CT G - CG T G G A

CYP063 116 nd 70 EM WT 0,27 0,45 C G - CG T G G A

CYP065 330 65 45 IM *4/*10 4,09 0,58 TT G - C T G GA A

CYP066 789 nd 72 EM WT 0,80 0,57 C G - G T G G A

CYP067 528 126 111 EM *4/WT 1,19 0,44 CT G - CG T G GA A

CYP068 219 nd 105 EM *4/WT 1,99 0,39 CT G - CG T G GA A


CYP070 292 68 99 EM WT 4,62 0,48 C G - CG T G G A

CYP071 I 147 262 15 PM *4/*4 2,51 0,41 TT G - C T G AA A

CYP072 770 35 43 IM *4/*10 2,87 0,47 TT G - C T G GA A


CYP074 421 150 242 EM WT 2,58 0,55 C G - CG T G G A

CYP075 I 714 250 101 EM *4/WT 0,78 0,55 CT G - CG T G GA A

CYP076 644 454 262 EM WT 1,56 0,56 C G - G T G G A


CYP078 335 67 122 EM *6/WT 2,67 0,79 C G - G T/del G G A

CYP079 198 nd nd EM WT 3,86 0,50 C G - C T G G A

CYP080 I 598 nd nd EM WT 1,48 0,51 C G - G T G G A

CYP081 I 674 nd nd EM WT 1,56 0,73 C G - G T G G A

CYP082 621 136 145 EM *10/WT 0,86 0,53 CT G - G T G G A

CYP083 257 37 83 IM *4/*10 3,24 0,52 TT G - C T G GA A

CYP084 480 nd nd EM WT 1,26 0,43 C G - CG T G G A

CYP085 459 59 62 EM WT 1,06 0,53 C G - G T G G A

CYP086 557 326 62 IM *4/*10 1,82 0,66 TT G - C T G GA A



CYP089 227 37 39 EM WT 1,99 0,56 C G - G T G G A


CYP091 709 83 44 IM *4/*10 1,13 0,49 TT G - C T G GA A

CYP092 813 199 496 IM *10/*10 0,79 1,37 TT G - C T G G A

CYP093 669 nd nd EM *10/WT 1,89 0,63 CT G - C T G G A


CYP095 2971 232 531 EM WT 1,81 0,80 C G - G T G G A

CYP096 1162 865 206 EM WT na na C G - G T G G A

CYP097 732 nd nd IM *4/*10 na na TT G - C T G GA A

CYP098 1030 20 102 EM WT na na C G - CG T G G A

CYP099 1503 474 643 EM WT na na C G - C T G G A

CYP100 258 14 61 EM WT na na C G - G T G G A

CYP101 988 112 98 IM *4/*10 na na TT G - C T G GA A

CYP102 563 12 67 EM WT na na C G - CG T G G A


As frequências alélicas e de genótipo são apresentadas na Tabela 26 e na Tabela 27.

Tabela 26. Frequências alélicas obtidas nas amostras post mortem.

Alelo n Prevalência

CYP2D6 *3 1 0,5%

CYP2D6 *4 38 19,6%

CYP2D6 *6 1 0,5%

CYP2D6 *10 32 16,5%

Tabela 27. Frequência de genótipo e fenótipo previsto para as amostras post mortem.

Genótipo Fenótipo n Prevalência

*4/*4 PM 5 5,2%

*3/*4 PM 1 1,0%

*4/*10 IM 15 15,5%

*10/*10 IM 1 1,0%

*4/WT EM 12 12,4%

*6/WT EM 1 1,0%

*10/WT EM 15 15,5%

WT EM 47 48,4%

Nas 100 amostras analisadas, 50 apresentavam uma concentração de tramadol inferior

a 800 ng/mL, ou seja no intervalo considerado terapêutico de acordo com os níveis de

referência (Repetto & Repetto, 2015; Schulz et al., 2012). Em 27 casos não foi

possível detetar pelo menos um dos metabolitos por estar ausente ou em concentração

inferior ao limite de detecção do método analítico. A estatística descritiva dos

resultados da análise de tramadol e dos seus dois metabolitos principais (NDT e ODT)

é apresentada na Tabela 28.

Suzana Fonseca

Tabela 28. Estatística descritiva das concentrações de tramadol (TMD), N(NDT) e O-desmetiltramadol (ODT) obtidas nas

TMD < 800ng/mL

TMD

média 439

mediana 421

máximo 789

mínimo 94

* os valores < 50 ng/mL e > 5000 ng/mL

Os fenótipos previstos foram comparados com as razões de concentração TMD/ODT e

TMD/NDT (Koski, 2005; Levo et al., 2003)

casos em que não foi possível a genotipagem e também todos os que não foi possível

quantificar algum dos metabolitos. Após exclusões, fez

estatística num total de 73 casos. A análise da distribuição avaliou

de medianas e quartis com escala logarítmica (

Figura 15. Correlação entre a razão logarítmica de concentração TMD/o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes;

*10/*10 ou *4/*10

Ao contrário do esperado, e apesar de se observar uma tendência, os grupos não

demonstraram uma separação clara entre si. A razão de concentração entre metabolitos

Estatística descritiva das concentrações de tramadol (TMD), N-desmetiltramadol desmetiltramadol (ODT) obtidas nas 100 amostras post mortem

NDT ODT TMD>

800ng/mL TMD

312 114 média 3070

77 75 mediana 1514

464 482 máximo 34000*

12 29 mínimo 813

> 5000 ng/mL foram obtidos por extrapolação das curvas de calibração.


(Koski, 2005; Levo et al., 2003). Para tal foi necessário excluir os três


quantificar algum dos metabolitos. Após exclusões, fez-se a avaliação gráfica e

num total de 73 casos. A análise da distribuição avaliou-se usando gráficos

de medianas e quartis com escala logarítmica (Figura 15).

Correlação entre a razão logarítmica de concentração TMD/ODT e TMD/NDT com

o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; IM *10/*10 ou *4/*10; PM ao genótipo *3/*4 e *4/*4.


ação clara entre si. A razão de concentração entre metabolitos

Página 99

desmetiltramadol post mortem analisadas.

NDT ODT

497 363

161 222

3863 3127

20 18

obtidos por extrapolação das curvas de calibração.


. Para tal foi necessário excluir os três


se a avaliação gráfica e

se usando gráficos

ODT e TMD/NDT com IM ao genótipo


ação clara entre si. A razão de concentração entre metabolitos

Suzana Fonseca

(NDT/ODT) parece apresentar uma melhor relação

se pode observar na Figura

Figura 16. Correlação entre a rprevisto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes;

Neste caso, as amostras consideradas

extensivos/normais são também positivas para substâncias que induzem inibição

enzimática. Os casos positivos para inibidores da enzima CYP2D6, t

fluoxetina, paroxetina, sertraline, citalopram, metadona e ticlopidina

Saladores et al., 2013), foram então separados num grupo: INIB. Além disso,

subdividiram-se os metabolizadores

os diferentes genótipos

diferenças significativas entre os diferentes genótipos dos metabolizadores

extensivos/normais. Por outro lado, nos casos em que está presente

as concentrações entre metabolitos formam um grupo distinto dos restantes genótipos,

aproximando-se das observadas nos metabolizadores lentos.

parece apresentar uma melhor relação com os fenótipos previstos

Figura 16.

Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/ODT com o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; IM ao genótipo

*4/*10; PM ao genótipo 3/*4 e *4/*4.

Neste caso, as amostras consideradas outliers do grupo de metabolizadores

são também positivas para substâncias que induzem inibição

enzimática. Os casos positivos para inibidores da enzima CYP2D6, t

sertraline, citalopram, metadona e ticlopidina (Flockhart, 2007;

, foram então separados num grupo: INIB. Além disso,

se os metabolizadores extensivos/normais em subgrupos, de a

os diferentes genótipos encontrados (ver Figura 17). Verificou-se que não há


. Por outro lado, nos casos em que está presente um inibidor forte


se das observadas nos metabolizadores lentos.

Página 100

com os fenótipos previstos como

azão logarítmica de concentração NDT/ODT com o fenótipo ao genótipo *10/*10 ou

do grupo de metabolizadores

são também positivas para substâncias que induzem inibição

enzimática. Os casos positivos para inibidores da enzima CYP2D6, tais como

(Flockhart, 2007;

, foram então separados num grupo: INIB. Além disso,

em subgrupos, de acordo com

se que não há


um inibidor forte



Figura 17. Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/TMD e o genótipo do indivíduo, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; EM1 a um alelo *10; EM2 a

um alelo *4 ou *6; IM a *10/*10 ou *4/*10 e PM a *4/*4 ou *3/*4.

Voltando a agrupar os metabolizadores extensivos/normais, fez-se por fim a

representação gráfica das concentrações relativas em função dos grupos com

distribuições de medianas e quartis aparentemente diferentes: EM; IM; INIB -

positivos para inibidores; PM (Figura 18).

Para avaliar o tipo de distribuição das concentrações relativas utilizou-se o teste de

normalidade Kolmogorov-Smirnova no SPSS, usando um nível de significância de

0.05. A hipótese nula foi rejeitada para as 3 variáveis de concentração relativa

(NDT/ODT, TMD/ODT e TMD/NDT), portanto a sua distribuição não é normal.

Como não se conhece a distribuição de frequências dos grupos e o número de

observações é relativamente pequeno, recorreu-se a testes não paramétricos para

comparação entre as medianas das concentrações relativas dos 4 grupos (EM, IM,

INIB e PM) por aplicação dos testes de Mann-Whitney (comparação entre grupos 2 a

2) e de Jonckheere-Terpstra (comparação dos 4 grupos). Os resultados da aplicação

dos testes são apresentados na Tabela 29. Verifica-se que os metabolizadores lentos

têm concentrações relativas estatisticamente diferentes dos extensivos/normais e dos

Suzana Fonseca

intermédios. Os casos em que se confirmou a presença de substâncias que inibem a

enzima CYP2D6 apenas se conseguem distinguir dos metabolizadores le

razão das concentrações dos metabolitos (NDT/ODT). Usando esta variável fez

ainda a comparação estatística dos diferentes genótipos de metabolizadores

extensivos/normais e não há diferenciação estatística entre o genótipo wt e os

heterozigóticos (*4/wt, *6/wt e *10/wt), apenas se conseguindo verificar diferença

estatística relativamente aos metabolizadores intermédios com genótipo *4/*10 (ver

Tabela 29).

Figura 18. Correlação entre a razão fenótipo previsto do indivíduo, onde INIB é o grupo


enzima CYP2D6 apenas se conseguem distinguir dos metabolizadores le

razão das concentrações dos metabolitos (NDT/ODT). Usando esta variável fez



óticos (*4/wt, *6/wt e *10/wt), apenas se conseguindo verificar diferença


. Correlação entre a razão de concentrações TMD/ODT, TMD/NDT e NDT/TMD e o fenótipo previsto do indivíduo, onde INIB é o grupo dos casos com inibidores enzimáticos.

Página 102


enzima CYP2D6 apenas se conseguem distinguir dos metabolizadores lentos usando a

razão das concentrações dos metabolitos (NDT/ODT). Usando esta variável fez-se



óticos (*4/wt, *6/wt e *10/wt), apenas se conseguindo verificar diferença


o de concentrações TMD/ODT, TMD/NDT e NDT/TMD e com inibidores enzimáticos.


Tabela 29. Resultados de p-value por aplicação dos testes de Mann-Whitney e de Jonckheere-Terpstra (JT) para comparação entre grupos.

TMD/ODT n EM IM INIB PM Teste JT

EM 43 - - - -

IM 11 0.367 - - - p-value:

INIB 13 < 0,001 0,030 - - < 0,001

PM 6 < 0,001 0,048 0,980 -

TMD/NDT Teste JT

EM 43 - - - -

IM 11 0,307 - - - p-value:

INIB 13 0,054 0,569 - - 0.001

PM 6 < 0,001 0,020 0,036 -

NDT/ODT

Teste JT

EM 43 - - - -

IM 11 0,053 - - - p-value:

INIB 13 < 0,001 0,006 - - < 0.001

PM 6 < 0,001 0,002 0,005 -

NDT/ODT n wt *10/wt *4/wt *4/*10 Teste JT

wt 30 - - - - *10/wt 8 0,923 - - - p-value:

*4/wt 5 0,151 0.222 - - 0.019

*4/*10 10 0,026 0,101 0,572 -


5.4 Estudo de casos

A avaliação de casos post mortem com tramadol deve ter em conta toda a informação

disponível: exame do local, dados clínicos, investigação circunstancial policial,

achados da autópsia, relatórios de outros exames complementares como os de

anatomia patológica, tentando também excluir outras causas possíveis (Mozayani &

Raymon, 2004). A informação disponível relativamente aos casos analisados não é

suficiente para que as conclusões sejam tidas como prova forense. Procurou-se apenas

enquadrar circunstancialmente os resultados da análise genética (presença de alelos

nulos para a CYP2D6) e de análise toxicológica (concentração do tramadol e dos seus

metabolitos e a presença de inibidores enzimáticos).

As informações fornecidas ao SQTF quando foram requisitados os exames

toxicológicos nos casos de indivíduos que se verificou serem metabolizadores lentos,

todos eles do género masculino, estão sumarizadas na Tabela 30, assim como os

resultados obtidos por aplicação das metodologias desenvolvidas.

Os primeiros 3 casos têm concentração de tramadol superior ao intervalo terapêutico,

de acordo com as tabelas de referência (Repetto & Repetto, 2015; Schulz et al., 2012),

mas as concentrações de ODT são aceitáveis, tendo em conta os resultados publicados

por Grod et al (Grond & Sablotzki, 2004). Em particular, o caso 3 tem uma

concentração de ODT no intervalo terapêutico apesar da elevada concentração de

tramadol. O conhecimento do seu genótipo permitiu concluir que é um metabolizador

lento, explicando as concentrações encontradas no sangue periférico, sendo a do ODT

comparável às obtidas por metabolizadores extensivos/normais nos estudos

farmacocinéticos (García-Quetglas, Azanza, Cardenas, Sábada, & Campanero, 2007;

Grond & Sablotzki, 2004). A concentração elevada do tramadol pode ser devida à

acumulação pela deficiente metabolização ou então a um aumento de dosagem, que


pode estar relacionado com o baixo efeito analgésico de origem opióide. Contudo,

sendo o caso de um doente oncológico não se pode excluir a possibilidade de

desenvolvimento de tolerância em tratamento prolongado. Apenas foi encontrado um

comprimido no conteúdo gástrico e a causa de morte foi determinada como natural.

Tabela 30. Resumo da informação fornecida ao SQTF e dos resultados obtidos na análise toxicológica e genética dos casos de metabolizadores lentos.

Caso Idade (anos)

Causa provável de morte

TMD

NDT (ng/mL)

ODT

Outras substâncias

(ng/mL)

DNA (ng/µL)

DI GEN

1 66 Desconhecida 1137 1479 161

Petidina (12)

Sertralina (212)

Benzodiazepinas

(< C terapêutica)

0,25 1,28 *4/*3

2 64 Desconhecida 5600 1338 167

Ticlopidina(401)

Trazodona(156)

Bromazep.(54)

Flurazepam(291)

1,18 0,62 *4/*4

3 71 Natural

(Neoplasia) 2130 1502 50 Negativo 0,45 1,63 *4/*4

4 71 Acidente

(traumático) 528 221 30 Negativo 5,65 0,47 *4/*4

5 55 Desconhecida 205 103 < 25 Negativo 2,51 0,38 *4/*4

6 83 Suicídio

(enforcamento) 147 262 < 25

Paroxetina(160)

Alprazolam(6) 2,51 0,41 *4/*4

(onde: TMD, NDT e ODT são as concentrações do tramadol, N-desmetil-tramadol e O-desmetil-tramadol; DNA é a concentração de ADN; DI é o fator de degradação dado por

aplicação do Quantifiler trio kit e GEN é o genótipo).

Nos casos post mortem de tramadol, a determinação do genótipo de um indivíduo, em

particular se for metabolizador lento, permite já interpretar as concentrações

encontradas no sangue e clarificar as circunstâncias específicas em algumas situações.

No entanto, para que se possam usar estes resultados como prova em tribunal, é

fundamental o estudo aprofundado dos mecanismos de metabolização e do grau


interferência das variantes genéticas, de forma a melhor compreender a sua

repercussão no organismo. Por outro lado, a pesquisa e recolha de dados de casos de

rotina é também essencial para aplicar a farmacogenética a casos forenses, em

particular tratando-se de amostras post mortem. Os dados devem compreender, não

apenas os resultados obtidos nas análises laboratoriais de toxicologia e de genética

forenses, mas também toda a informação resultante da investigação policial, a

informação clínica e os restantes achados autópticos.


6 Discussão

As características genéticas de cada indivíduo podem ter influência nas concentrações

das substâncias presentes no sangue post mortem, pelo que o seu conhecimento

constitui mais uma ferramenta de apoio ao patologista para o estabelecimento da causa

de morte ou das circunstâncias em que ocorreu (Kupiec et al., 2006). A metodologia

de análise genética aqui desenvolvida permite a identificação dos polimorfismos do

gene CYP2D6 mais prevalentes na população caucasiana que estão relacionados com

o decréscimo da atividade metabólica. Em particular, nos casos com tramadol, o défice

metabólico conduz a um aumento do tempo de permanência desta substância no

organismo e, por vezes, ao aumento da sua concentração, sem que isso se reflita no

efeito opióide. Assim, a informação obtida pela genotipagem e o conhecimento da

concentração do metabolito ativo do tramadol (ODT) através da análise toxicológica,

podem ser contributos importantes para a exclusão do diagnóstico de intoxicação por

sobredosagem, que constituiria uma causa de morte violenta, exclusão esta que nem

sempre é possível recorrendo apenas aos resultados toxicológicos ou aos dados

clínicos.

6.1 Metodologia de análise genética

A farmacogenética no âmbito forense não tem como objetivo a caracterização genética

total do indivíduo, mas sim saber se naquele contexto e de acordo com as substâncias

detetadas nas amostras, existem variantes genéticas com repercussão nas

concentrações observadas. As plataformas comerciais de genotipagem, como

Amplichip CYP450 Test da Roche, detetam muitas variantes de muitos genes e a

informação obtida tem relevância clínica mas, para aplicar em casos forenses, torna-se


excessiva, pouco específica e dispendiosa(Almoguera et al., 2010). Além disso, os kits

são desenvolvidos para amostras colhidas para ensaios clínicos, armazenadas nas

melhores condições, podendo ser de difícil aplicação a amostras degradadas. Mesmo

que essas metodologias sejam validadas para amostras forenses, dependerá da

qualidade de ADN da amostra em questão. A utilização de metodologias seletivas para

o gene que se pretende caracterizar, mas com sensibilidade e flexibilidade para adaptar

às amostras disponíveis é vantajosa.

O método desenvolvido neste trabalho é eficaz para a detecção das variantes nulas

mais frequentes, em particular os alelos *3, *4 e *6 do gene CYP2D6. É aplicável à

rotina pericial usando os equipamentos e consumíveis existentes no SGBF do

INMLCF e com custos relativamente baixos. A sequenciação de Sanger é considerada

a metodologia de referência para a genotipagem pela sua exatidão e abrangência e

possibilita a análise de outras variantes genéticas presentes nos fragmentos

amplificados, variantes que frequentemente não são detetadas pelas plataformas

comerciais. O método pode ser complementado com a amplificação de outros

fragmentos do gene que se considerem relevantes, quando haja necessidade. A

sequenciação é uma metodologia rápida, podendo dar resposta de uma amostra em

menos de 24h.

A metodologia desenvolvida pretende discriminar claramente os metabolizadores

lentos, ou seja, com dois alelos nulos. Para facilitar o tratamento dos resultados e

tendo em conta que a prevalência das variantes nulas não pesquisadas é muito baixa,

considerou-se que a ausência de polimorfismos nos fragmentos analisados

corresponde a um fenótipo de metabolizador extensivo/normal (EM). No entanto, para

a interpretação de resultados forenses deverá ser sempre salvaguardada a possibilidade

do indivíduo ser portador de alelos não pesquisados, raros ou desconhecidos.


Uma limitação da metodologia desenvolvida é a incapacidade de identificar a variação

do número de cópias do gene (CNV), tal como a deleção total ou multiplicação. A

deleção total do gene em ambos os alelos de um indivíduo corresponde a um fenótipo

de metabolizador lento. Se a amostra tem uma quantidade e uma qualidade de ADN

satisfatória (o que pode ser verificado no passo de quantificação), a ausência de

produtos de sequenciação pode ser indicadora de que o indivíduo é homozigótico para

a variante CYP2D6*5 (deleção do gene). Nas amostras analisadas neste trabalho não

foi encontrada nenhuma nesta situação, o que pode ser justificado pela baixa

prevalência deste alelo (ver Tabela 2). No entanto, para a confirmação deste genótipo

seria adequado desenvolver e validar um método passível de aplicação a amostras

degradadas, como aquele que é proposto por Bodin et al (Bodin, Beaune, & Loriot,

2005). Por outro lado, a possibilidade de detetar a duplicação do gene CYP2D6 é

essencial para identificar os ultra-metabolizadores (UM), genótipo que frequentemente

está na origem de reações adversas e tem uma prevalência média de 2,3% (ver Tabela

2). No entanto, o objetivo do método é identificar os PM e, se for detetada pelo menos

uma cópia funcional do gene, considera-se que existe atividade metabólica e que o

indivíduo não é metabolizador lento.

As amostras em mancha e a metodologia de extração são as habitualmente utilizadas

no SGBF para diversas aplicações de rotina, tendo-se verificado adequadas à

generalidade das amostras estudadas. As manchas foram efetuadas entre 2 meses e 2

anos após a colheita de sangue no cadáver, que entretanto esteve armazenado a -10ºC.

Obtiveram-se resultados satisfatórios mesmo nas amostras mais antigas. Apenas 3

amostras não foram totalmente genotipadas devido ao elevado índice de degradação

(amostras com o código CYP003, CYP034 e CYP035). Nestes casos ou nas amostras

que revelaram mais ruído no eletroferograma, poderá ser importante testar outro


método de extração com maior rendimento e seletividade. As amostras de ADN

extraídas pelo método de Chelex foram armazenadas a -20ºC, tendo sido obtidos bons

resultados mais de um ano após a sua extração. Os produtos amplificados já

purificados, bem como os produtos de sequenciação, foram armazenados durante 1

semana a -20ºC e depois analisados com sucesso.

As amostras post mortem estão geralmente sujeitas a fatores de degradação, o que

pode inibir a amplificação e, portanto, a genotipagem (Neville et al., 2002; Sistonen,

2008). A qualidade do ADN é um fator limitante para a obtenção de resultados, em

particular para a amplificação do gene (5000pb) ou de fragmentos longos (736 pb).

Por essa razão utilizou-se o kit Quantifiler®

Trio que consegue discriminar as amostras

que se encontram mais degradadas e que permite avaliar a possibilidade de amplificar

fragmentos com mais de 200 pb. No entanto, os resultados obtidos na quantificação

não são diretamente relacionáveis com a capacidade de amplificação do gene inteiro,

como ficou demonstrado durante o desenvolvimento do método. A sensibilidade do

método é adequada à concentração de ADN nas amostras de sangue post mortem, com

um limite de detecção de 0,1 ng/uL. Durante o ensaio verificou-se que os fragmentos

mais pequenos têm limites de detecção inferiores de 0,01 ng/uL para a zona 3 (200 pb)

e 0,05ng/uL para a zona 1 (437 pb). Durante a análise das amostras de casos de rotina

foi possível verificar que estes limites são adequados, tendo em conta as concentrações

de ADN obtidas. Por outro lado, a quantidade de amostra não é também um fator

limitante porque os volumes habitualmente colhidos para análise toxicológica são

elevados, permitindo fazer várias manchas se tal for necessário.

A amplificação dos 3 fragmentos selecionados demonstrou ser específica, tendo a

vantagem de não ser necessário amplificar o gene inteiro. No entanto, deverá ter-se em

conta que poderão existir variantes ainda não reportadas que, se se localizarem nos


fragmentos de ligação dos primers, podem diminuir o rendimento de amplificação ou,

nos heterozigóticos, gerar produtos resultantes de apenas um dos cromossomas, sendo

nesse caso considerados homozigóticos. Tal também acontece no caso de o indivíduo

ser heterozigótico para o alelo CYP2D6*5.

A avaliação dos eletroferogramas foi efetuada com o programa informático

Sequencing analysis da AB, sendo a qualidade das sequências considerada satisfatória

na globalidade das amostras testadas. A degradação dos reagentes utilizados na

amplificação, na purificação, na sequenciação e na análise foi o fator que teve mais

influência no sinal e no ruído dos eletroferogramas, bem como no número de bases

identificadas em cada fragmento.

A identificação das variantes genéticas com o programa informático SeqSCAPE da

AB, é simples para substituições de bases mas pode constituir um desafio para detetar

deleções ou inserções em heterozigóticos. A seleção de primers que permitissem que o

alelo CYP2D6*6 ficasse localizado a meio do fragmento 2 (e não nas extremidades),

permitiu o alinhamento de ambas as sequências (sense e anti-sense), facilitando a

detecção da variante. Tal não foi possível para o alelo CYP2D6*3, porque a variante

está situada na extremidade final do fragmento, e foi sempre detetado apenas com a

sequência sense. A utilização de controlos negativos e positivos em todos os ensaios é,

particularmente nestes casos, essencial para o controlo da metodologia e a validação

dos resultados.

A interpretação dos resultados teve por base o princípio de que o gene CYP2D6 é um

bloco não recombinante no genoma. Portanto, a combinação das variantes detetadas de

acordo com os alelos do CYP Allele Nomenclature Comitee foi considerada como

pertencendo a um cromossoma, constituindo um haplótipo distinto. Por exemplo, a

existência das variantes 100C>T e 1846G>A numa amostra, foi considerada com


pertencendo a um só cromossoma, constituindo o alelo CYP2D6*4. O erro introduzido

por esta assunção não é relevante dada a baixa prevalência do alelo CYP2D6*4M, que

tem a variante 1846G>A mas não 100C>T. No entanto, se for este o alelo presente,

estaremos a atribuir o genótipo *4/wt (EM) em vez de *4/10 (IM). Também a presença

do polimorfismo 100C>T sem que esteja presente o 1846G>A foi considerada como

marcador do alelo *10, apesar de poder pertencer a outros alelos (*36, *37, *47, *49,

*52, *54, *56B, *57, *64, *65, *68, *69, *72, *100 ou *101), quase sempre

acompanhado pelo 1661 G>C. Para além da baixa frequência dos outros alelos, o

polimorfismo 100C>T é o responsável pela redução significativa da atividade

enzimática, estando também na origem da discriminação de alguns substratos. Por essa

razão, independentemente do alelo presente, a repercussão no metabolismo existe.

A exatidão do método ficou demonstrada pela identificação das variantes em materiais

de referência adquiridos ao repositório genético do Coriell Cell Repositories, pelo

correcto alinhamento dos fragmentos com a sequência de referência (m33388.1), pela

análise comparativa dos resultados de sequenciação de amplificações com primers

diferentes e pela pesquisa das sequências obtidas no BLAST. Apesar da detecção do

alelo CYP2D6*3 no fragmento 3 só ser possível com a sequência obtida para o primer

sense, a variante foi facilmente identificada no material de referência.

Qualquer metodologia deve ser validada antes da sua aplicação para que se conheçam

as suas vantagens e limitações, demonstrando a fiabilidade dos resultados. A validação

é particularmente importante na área forense, para que os resultados possam ser

utilizados como meio de prova. O método de análise genética foi validado segundo as

recomendações da SWGDAM (Scientific Working Group on & Methods, 2012),

adequando os ensaios à metodologia de sequenciação e complementando com o

procedimento de validação em vigor no SGBF e com informação recolhida na


pesquisa bibliográfica (ENFSI DNA WORKING GROUP, 2010; Pont-kingdon et al.,

2012; Zackrisson, 2009). O método revelou-se específico, exato, sensível, reprodutível,

robusto e adequado à aplicação em amostras post mortem, para o fim a que se destina.

6.2 Metodologia de análise toxicológica

A metodologia de confirmação quantitativa de tramadol (TMD), N-desmetil-tramadol

(NDT) e O-desmetil-tramadol (ODT) em amostras post mortem é importante para

avaliar a influência destas substâncias no organismo. O tramadol é um analgésico de

acção central, mas a acção opióide ocorre através da bioativação por metabolização

em ODT. O tramadol é um composto de elevada frequência na casuística do SQTF por

ser muito utilizado em contexto hospitalar e oncológico. Entre os casos positivos é

frequente a concentração de tramadol ser elevada, ultrapassando o intervalo

terapêutico. Em contexto oncológico tal poderia ser explicado pela tolerância

desenvolvida em tratamentos continuados e na necessidade do aumento da dosagem.

No entanto, em contexto hospitalar as dosagens são controladas e conhecidas, não

sendo fácil explicar os resultados encontrados. Nestes casos a comparação apenas com

as concentrações de referência não é adequada. O conhecimento da concentração dos

metabolitos, em particular do ODT por ser o principal responsável pela analgesia por

acção nos receptores µ, pode ser um indicador na capacidade metabólica do indivíduo.

Pode também ser importante na ausência de informação acerca da administração, dos

hábitos de consumo e da atividade enzimática. Caso as concentrações dos metabolitos

sejam diferentes das esperadas, será importante complementar os resultados

toxicológicos com a pesquisa de variantes genéticas com influência na expressão da

enzima de metabolização CYP2D6.


O método foi desenvolvido tendo em conta as características das amostras de sangue

post mortem, bem como os intervalos de concentrações de referência para as

concentrações do tramadol e dos seus metabolitos. Com base na experiência adquirida,

a metodologia de extração foi otimizada para uma melhor recuperação, de forma a

aumentar a sensibilidade do método e a diminuir o volume de amostra necessário,

fator muitas vezes limitante em toxicologia post mortem. A seletividade e

especificidade foram também otimizadas através da alteração das condições

cromatográficas e dos iões monitorizados. No decorrer deste trabalho verificou-se que

é importante a pesquisa de outras substâncias, em particular de inibidores enzimáticos.

O método foi também validado para a confirmação quantitativa dos inibidores da

CYP2D6 mais relevantes, tais como a fluoxetina, a paroxetina, a sertralina, o

citalopram, a metadona e a ticlopidina, entre outros (Flockhart, 2007).

A análise por GC/MS não permite a distinção de isómeros ópticos. Apesar de estar

comprovada a diferença de atividade entre os enanteómeros do TMD e também do

ODT, a sua análise diferenciada não será relevante na medida em que a administração

de TMD é efetuada em mistura racémica. A metodologia foi validada segundo as

recomendações da Agência Mundial de Anti-Dopagem (WADA), adequando e

complementando os ensaios de acordo com o procedimento de validação em vigor no

SQTF, bem como com publicações de referência [Almeida 2002]. O método

demonstrou ser seletivo, sensível, preciso, exato e robusto, adequado à utilização na

rotina pericial de toxicologia forense em amostras post mortem.

6.3 Resultados do estudo das amostras

Foram analisadas 100 amostras post mortem, sendo que em 3 não foi possível obter o

genótipo o que corresponde a uma taxa de sucesso de 97%, que é comparável à obtida

por outros autores (Koski, 2005). A degradação da amostra é provavelmente o fator


limitante para a dificuldade de amplificação, o que no caso da amostra com o código

CYP003 ficou evidenciado pelos resultados da quantificação Quantifiler Trio. Esta

amostra tem uma concentração de ADN inferior ao limite de detecção do método (0.1

ng/uL) e um coeficiente de degradação muito elevado (ID=12). No entanto, outras

explicações poderiam ser colocadas, tais como as amostras serem homozigóticas para

o alelo CYP2D6*5 ou então para um alelo híbrido que impedisse a amplificação. Em

qualquer destes casos, os alelos seriam nulos e a capacidade metabólica estaria

comprometida, o que não é evidenciado pela observação dos resultados toxicológicos,

como no caso da amostra CYP034 que tem uma concentração de ODT (136 ng/mL)

superior à de NDT (73 ng/mL).

As frequências alélicas encontradas para os alelos nulos são semelhantes às das

esperadas para a população europeia mas diferem das reportadas por Correia et al

(Correia et al., 2009), o único estudo da população portuguesa presente na tabela de

frequências alélicas de Gaedigk com hiperligação em

http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm. Relativamente ao alelo *10 a prevalência é

muito elevada (16,5%) quando comparada com a média europeia de 3.2% (ver Tabela

3 e Tabela 26). A prevalência do genótipo *10/WT foi de 16%, o *4/*10 de 16% e o

*10/*10 de 1% (ver Tabela 27). Por observação do gráfico de medianas e quartis

apresentado na Figura 17, verifica-se que os heterozigóticos para o alelo *4 ou *6 têm

aparentemente uma mediana ligeiramente superior aos que não apresentam variantes.

Apesar das diferenças nestas medianas não serem estatisticamente comprovadas (ver

Tabela 29) pode observar-se que os genótipos *4/wt, *6/wt e *10/wt não se distinguem

dos EM, mas os metabolizadores intermédios sim (*4/*10 e *10/*10). Wang et al.

(2006) estudou o controlo da dor pós-operatória com tramadol e demonstrou que os

indivíduos saudáveis portadores de um alelo CYP2D6*10 (heterozigóticos) têm uma


semi-vida de tramadol no plasma significativamente maior que os portadores de 2

alelos funcionais, o que pode ser justificado pela diminuição da velocidade de

eliminação devida a uma deficiente metabolização (G. Wang, Zhang, He, & Fang,

2006). No estudo efetuado não foi possível distinguir este genótipo do dos

metabolizadores normais.

Nas amostras estudadas, os metabolizadores lentos têm razões de concentração de

tramadol em relação aos seus metabolitos diferentes dos metabolizadores intermédios

ou extensivos/normais. Verificou-se que a razão entre as concentrações dos

metabolitos principais NDT/ODT é um marcador do nível de metabolização mais

evidente do que os rácios metabólicos habitualmente utilizados - TMD/ODT e

TMD/NDT (Koski, 2005; Levo et al., 2003). Com o índice NDT/ODT foi possível

distinguir estatisticamente todos os genótipos com exceção dos IM relativamente aos

EM (ver Tabela 29). Mas ainda assim foi possível distinguir estatisticamente o

genótipo *4/*10 do WT (ver Tabela 29). Foram analisados 13 casos em que, além de

tramadol, foi confirmada a presença de substâncias conhecidas por serem inibidores

enzimáticos. Nesses casos, independentemente do genótipo, a interação exercida pelos

inibidores é um fator mais importante na metabolização, pelo que as razões de

concentração distinguem-se estatisticamente dos restantes genótipos, constituindo um

grupo com comportamento metabólico diferenciado e que se aproxima do observado

em metabolizadores lentos. Estes resultados estão de acordo com estudos já publicados

por outros autores (Y. Jin et al., 2005; Saladores et al., 2013; Sistonen, 2008; Stearns

et al., 2003). A avaliação da presença de substâncias inibidoras da enzima CYP2D6

nas amostras durante a análise toxicológica parece ser fundamental para a apreciação

de casos com tramadol ou com outras substâncias que tenham a mesma via metabólica.


7 Perspetivas futuras

O método escolhido para a extração de ADN das amostras de sangue total post mortem

demonstrou ser satisfatório, tendo sido possível obter concentrações aceitáveis na

generalidade das amostras. No entanto, algumas sequências apresentaram ruído que,

por comparação com as amostras de referência utilizadas no ensaio de exatidão e de

limite de detecção, devem-se à qualidade de ADN utilizado (Stephen, Lin, & Lai,

2015). Por essa razão, a extração poderá ser otimizada utilizando outras metodologias

com melhor recuperação e qualidade de resultados.

A sequenciação do fragmento 3, que permite a identificação do alelo CYP2D6*3,

deverá ser otimizada através da seleção de novos primers, em particular o anti-sense

(R3), de forma a permitir a amplificação de um fragmento específico e seletivo, com

um número razoável de pb, que permita obter 2 sequências (sense e anti-sense) de

todo o fragmento e em que a variante alvo (2549A>G) fique centrada, para facilitar a

sua identificação. O alelo CYP2D6*5, ou seja a deleção do gene inteiro, é um alelo

nulo com uma frequência significativa (2,7%) mas apenas os indivíduos

homozigóticos para este alelo têm alterações metabólicas. No entanto, seria importante

o desenvolvimento e validação de uma metodologia para a detecção da variação do

número de cópias (Bodin, Beaune, & Loriot, 2005). Tal permitiria também a

identificação dos metabolizadores ultra-rápidos que são um genótipo particularmente

sensível, no caso da administração de substâncias que necessitam da bioativação,

como o tramadol e a codeína, podendo estar na origem de intoxicações (Madadi et al.,

2008; Orliaguet et al., 2015; Sallee et al., 2000).


A evolução rápida das técnicas de biologia molecular como a sequenciação de nova

geração (NGS) (Rehm et al., 2013) que permitirá a sequenciação integral do gene

CYP2D6 e se necessário dos seus pseudogenes, associada a metodologias que

identifiquem CNV de forma mais fácil como real-time PCR (Bodin et al., 2005; Book

et al., 2013; Schaeffeler, Schwab, Eichelbaum, & Zanger, 2003), permitirá a

genotipagem completa com a identificação de outras variantes, a seleção de melhores

biomarcadores e estabelecer correlações melhores com os fenótipos observados. No

entanto, as características complexas associadas aos polimorfismos do gene CYP2D6,

nomeadamente a sua semelhança com os pseudogenes e a existência de hibridação,

constitui um grande desafio quer para os especialistas em análise genética quer para o

desenvolvimento e utilização de ferramentas informáticas adequadas (Gaedigk, 2013).

Na análise toxicológica, a utilização de uma metodologia mais sensível, que permita a

identificação e quantificação dos metabolitos e a distinção enanteomérica, por LC/MS,

poderá contribuir para aumentar a correlação com os genótipos A metodologia de

sequenciação pode ser complementada quando se considere necessário com novos

fragmentos para identificar outros polimorfismos. Poderá também ser aplicada a casos

positivos para outras substâncias que metabolizem pela mesma via (CYP2D6), tais

como antidepressivos (amitriptilina e nortriptilina (Hicks et al., 2013; Koski et al.,

2006), citalopram (Holmgren et al., 2004), fluoxetina (Z. Wang et al., 2014)),

antipsicóticos (haloperidol (Brockmöller et al., 2002)) ou outros analgésicos opióides

(codeína (Madadi et al., 2008; Yee, Atayee, Best, & Ma, 2014), metadona (Fonseca et

al., 2011; Shiran et al., 2009)).


8 Conclusões

As metodologias desenvolvidas e validadas para a identificação das variantes nulas

mais prevalentes do gene CYP2D6 e para a quantificação de tramadol e metabolitos

em amostras de sangue post mortem demonstraram ser sensíveis, seletivas, específicas,

exatas, precisas e robustas, sendo adequadas à rotina pericial e à análise de amostras

forenses até 3 anos após a colheita.

As 100 amostras de sangue post mortem, selecionadas da casuística do SQTF entre

2012 e 2015 e positivas para tramadol, foram analisadas pelas metodologias

desenvolvidas. Foi possível a análise toxicológica de todas as amostras selecionadas e

a genotipagem de 97. Os resultados obtidos pelas duas metodologias foram

comparados e verificou-se a existência de uma relação entre a razão de concentrações

dos metabolitos do tramadol (NDT/ODT) e os diferentes genótipos, em particular para

o perfil metabólico dos metabolizadores lentos que é estatisticamente diferente dos

metabolizadores extensivos/normais e intermédios. Este parâmetro pode ser uma

alternativa para a avaliação das características metabólicas especialmente em casos

post mortem.

A análise dos resultados destas metodologias e o cruzamento com informação

toxicológica adicional permitiu ainda concluir que a triagem e identificação de

substâncias responsáveis pela inibição enzimática da CYP2D6 que estejam presentes

nas amostras com tramadol é fundamental para a interpretação das concentrações

obtidas.

A utilização da farmacogenética post mortem só é possível se, tendo sempre em conta

os fatores externos e circunstanciais, houver uma correta articulação dos

conhecimentos da patologia, da toxicologia e da genética forenses.


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