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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

LUCI AVEIRO CRIVELLARO

SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL

DE CITOCROMO c MODIFICADO COM

UMA 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA

Mogi das Cruzes, SP

2007

Livros Grátis

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES


SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL

DE CITOCROMO c MODIFICADO COM

UMA 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA

Dissertação apresentada ao mestrado em Biotecnologia da

Universidade de Mogi das Cruzes, como parte dos requisitos para

obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Área de Concentração: Ciências Biológicas

Orientador: Prof. Dr. Sergio Brochsztain

Co-Orientadora: Profª Drª. Iseli Lourenço Nantes

Mogi das Cruzes, SP

2007

FINANCIAMENTO:

FAEP – UMC - Fundação de Amparo ao Ensino e Pesquisa da Universidade de Mogi das Cruzes. Secretaria da Educação do Governo do Estado de São Paulo

FICHA CATALOGRÁFICA

Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central

Crivellaro, Luci Aveiro

Síntese e caracterização estrutural de citocromo c

com uma 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA / Luci Aveiro Crivellaro. -- 2007.

79 f.

Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade de Mogi das Cruzes, 2007

Área de concentração: Ciências Biológicas Orientador: Prof. Dr. Sergio Brochsztain

1. Citocromo c 2. Imidazol 3. Fluorescência I. Título II. Brochsztain, Sergio

CDD 572.6


SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE CITOCROMO c MODIFICADO COM UMA 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA

2007

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais, os responsáveis diretos pelo meu sucesso, devido ao

amor incondicional e aos valores morais incutidos desde sempre e ao meu filho, Renato, a

verdadeira razão de minha vida.

AGRADECIMENTOS

Agradecer é uma tarefa difícil quando se trata de citar todos aqueles que colaboraram para que eu pudesse realizar este trabalho. Inicialmente agradeço a compreensão, dedicação e companheirismo do meu eterno amigo Rinaldo por todas as horas difíceis que juntos passamos, sempre me apoiando de maneira tão generosa. As minhas irmãs e amigas Virgínia e Valéria por tudo que fizeram por mim e pelo meu filho durante esta fase de mil necessidades diferentes e de momentos difíceis. Aos meus amigos do CIIB que das mais variadas formas colaboraram para o sucesso do meu trabalho. A Kátia, a Daniela, Cíntia e Tatiana que dispuseram muitas vezes do seu tempo para me ajudar, agradeço de coração por tudo que aprendi com vocês. O Rodrigo, Vanessa, Rafael, Fabiane, Barbara, Felipe, Fabrício, Carolina, Juliana Conrado, Priscila, Juliana Mafra, Juliana Casares, Gabriel e Débora pelo carinho e atenção. Aos meus orientadores Prof Sergio e Profª Iseli que me deram a oportunidade de desenvolver minhas habilidades, pela atenção e estímulo necessários em um trabalho como este. Ao Profº Ivarne Tersariol pela oportunidade de aprimorar meu trabalho e de ter acreditado no meu potencial. Aos demais pesquisadores, Profº Caíres, Profº Thiago, Profº Flávio e Profª Claudia pela atenção e por tudo que aprendi durante este período. Agradeço também as supervisoras Izabel e Denise da Diretoria de Ensino de Mauá pela atenção, carinho e paciência em todos os momentos. Aos colegas do E.E. Dom José Gaspar, especialmente a Gisele, Daniela, Silvana, Suzemar, Leonor , Tereza e a equipe gestora: Fátima, Ivete e Vilma pelo carinho e atenção, ouvindo minhas histórias, colaborando de todas as maneiras, me apoiando e incentivando. Ao apoio financeiro da FAEP - UMC e da Secretaria da Educação do Estado de São Paulo.

RESUMO

Citocromo c é uma hemoproteina envolvida em eventos importantes da célula: a cadeia respiratória e a apoptose. No processo de apoptose o citocromo c liberta-se do interior da membrana mitocondrial e alcança o citosol, mas, devido à proteína não ser fluorescente, há dificuldade em seguir seu tráfego interno na célula através de técnicas microscópicas de fluorescência. O objetivo do presente trabalho é o de acoplar o composto fluorescente 4-amino-1,8-naftalimida (4-ANI) covalentemente ao citocromo c de maneira que se possa monitorar o fluxo da proteína durante o processo de apoptose. Realizou-se dois métodos para a inserção do fluoróforo: (i) incubação da proteína com carbodiimida (EDAC) como agente acoplador (ii) usando o anidrido, precursor da 4-ANI, em imidazol fundido. O sucesso das reações de inserção foram monitoradas por espectrometria UV/vis, dicroísmo circular, cromatografia de camada delgada (TLC) e espectrometria de massas (MALDI-ToFF). O método com imidazol fundido foi o mais eficiente para modificar o citocromo c. O citocromo c modificado não exibiu alterações significativas estruturais em seu grupo heme e, portanto deve manter algumas propriedades biológicas. Entretanto, foi observado que o grupo heme promove uma significativa supressão de fluorescência da imida. Estes resultados sugerem o uso desta proteína fluorescente modificada para os estudos de ligação em membrana e talvez para monitorar o trânsito do citocromo c na célula. Palavras-chave: citocromo c, imidazol, fluorescência.

ABSTRACT

Horse heart cytochrome c (cyt c) is a hemoprotein involved in two important cell events: the respiratory chain and the apoptosis. In the apoptosis process cyt c detaches from the inner mitochondrial membrane and attains the cytosol, but, because the protein is not fluorescent, it is difficult to follow its traffic inside the cells by fluorescence microscopy techniques. Therefore, the aim of the present work is to attach fluorescent 4-amino-1,8-naphthalimides (ANI) to the cyt c structure in a manner that preserves its native conformation. Coupling of the precursor 4-amino-1,8-naphthalic anhydride with cyt c was attempted by using three techniques: (i) incubation of the protein with the anhydride in molten imidazole; (ii) sonication of the mixture in water; (iii) using a carbodiimide (EDAC) as coupling agent. According to fluorescence spectrophotometric, chromatographic and mass spectrometric analysis, the use of molten imidazole was the most efficient method to modify cyt c. ANI-modified cyt c did not exhibit significant structural alterations and potentially should maintain some biological properties. However, significant quenching of the attached imide fluorescence by the heme group was observed. The quenching intensity was attenuated by the association of the protein with membranes. These results point to the use of this modified fluorescent protein as a probe for membrane binding studies and perhaps for monitoring cell traffic.

Key-words: cytochrome c, imidazole, fluorescent.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Representação esquemática de uma mitocôndria. . . . . . . . . . . . 16

Figura 2 – Estrutura do citocromo c de coração de cavalo destacando os resíduos de lisina e o grupo heme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . grupo heme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18

Figura 3 – Representação dos diferentes estados de spin dos íons Fe2+ e Fe3+ do citocromo c resultantes da interação com lipossomos modelos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

20

Figura 4 – Espectros de absorção do citocromo c em suas formas alto spin e baixo spin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

21

Figura 5 – Respiração aeróbia a partir da glicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Figura 6 – Reações envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23

Figura 7 – Cadeia respiratória. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

24

Figura 8 – Seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico. . . . . 27

Figura 9 – Mecanismo proposto para a reação entre citocromo c e DPAA. 29

Figura 10 – Estruturas de imidas aromáticas relevantes. . . . . . . . . . . . . . . .

31

Figura 11 – Reação geral de obtenção de imidas aromáticas . . . . . . . . . . . 32

Figura 12 – Mecanismo geral de formação de imidas. . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Figura 13 – Estrutura das 1,8 – naftalimidas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Figura 14 – Espectros de absorção e de emissão de 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)- 1,8-naftalimida (BNIP) e da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (ANIP) em acetonitrila e suas respectivas estruturas. . . . . . . . .

34

Figura 15 – Transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI . . . . . . . . . . . 35

Figura 16 – Preparação do derivado Ru(bpy)2(dcbpy)-citocromo c . . . . . . 36

Figura 17 – Estrutura da fluoresceína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Figura 18 – Estrutura do corante Lúcifer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Figura 19 – Preparação da 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-ANI-GLI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

48

Figura 20A – Espectro de 1H-RMN da 4-ANI-GLI em DMSO-d6 . . . . . . . . . . 48 Figura 20B – Ampliação da região dos prótons aromáticos do espectro da Fig. 20A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49

Figura 20C – Espectro de 1H-RMN do imidazol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Figura 21 – Espectros de absorção UV/vis da 4-ANI-GLI . . . . . . . . . . . . . 51

Figura 22 – Espectros de absorção da 4-ANI-GLI em diferentes pH . . . . . 52

Figura 23 – Espectros de emissão da 4-ANI-GLI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

Figura 24 – Espectros de emissão da 4-ANI-GLI em diferentes pH . . . . . . 54

Figura 25 – Estados de protonação da 4-ANI-GLI em água . . . . . . . . . . . . 55 Figura 26 – Mecanismo de reação entre o citocromo c e a 4-ANI-GLI por acoplamento com EDAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

56

Figura 27 – Espectro de absorção UV/vis do CIT-ANI-GLI . . . . . . . . . . . 57 Figura 28 – Reação entre citocromo c nativo e anidrido 4-amino-1,8-naftálico em presença de imidazol fundido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

59

Figura 29 – Resultados de cromatografia em camada delgada em sílica gel de citocromo c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

61

Figura 30 – Espectros UV/vis registrados para determinação da concentração do CIT-ANI em solução aquosa, após diálise . . . . . . . . . . . .

62

Figura 31 – Espectros UV/vis, normalizados, do citocromo c nativo e do citocromo c tratado com imidazol fundido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

63

Figura 32 – Espectros de emissão do CIT-ANI-7 e da 4-ANI-GLI . . . . . . 65

Figura 33A – Efeito do citocromo c no espectro de emissão da 4-ANI-GLI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

65

Figura 33B – Gráfico de Stern-Volmer para a supressão de emissão da 4-ANI-GLI pelo citocromo c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

65

Figura 34 – Espectros de IR (infravermelho) em ATR . . . . . . . . . . . . . . .

66

Figura 35 – Espectros no visível por CD de citocromo c em imidazol . . . . 67

Figura 36 – Espectros por CD em alfa-hélice de citocromo c nativo . . . . . 68

Figura 37 – Espectro de massa – MALDI ToF– CIT-ANI . . . . . . . . . . . . . 69

Figura 38 – Perfil eletroforético do citocromo c modificado (CIT-ANI). . 70

Figura 39 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25mM pH7 com adição de DPAA 0,2 mM em etanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

71

Figura 40 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão hidróxido de amônio pH10 com adição de DPAA 0,2 mM em etanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

72

Figura 41 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mM pH7,4 com adição de t-BuOOH 2 mM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

73

Figura 42 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mM pH10 com adição de t-BuOOH 2 mM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

74

LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Rendimento quântico de fluorescência de 1,8-naftalimidas com diferentes substituintes. ......................................................................................................... 35

Tabela 2 - Dados espectrais para a 4-ANI-GLI em solventes de diferentes polaridades........52 Tabela 3 – Rendimento quântico de fluorescência, λmax

abs, λmaxem e absortividade molar da 4-

ANI-GLI em diferentes pHs................................................................................. 53 Tabela 4 - Descrição sumarizada das condições empregadas na síntese pelo método por acoplamento com EDAC.................................................................................. 56

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1H-RMN ressonância magnético nuclear de hidrogênio

4-ANI 4-amino-1,8-naftalimidas

4-ANI-GLI 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida

AAN anidrido 4-amino-1,8-naftálico

ADP adenosina difosfato

ANIP 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida

ATP Adenosina trifosfato

BNIP 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida

Cit c Citocromo c

CIT-ANI citocromo c modificado equimolar

CIT-ANI-7 citocromo c modificado com excesso de AAN

CN- Cianeto

Co-Q redutase coenzima Q redutase

DMF dimetilformamida

DMSO dimetilsulfóxido

DNA ácido desoxirribonucléico

DPAA difenilacetaldeído

EDAC N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida

FADH2 flavina adenina dinucleotídeo

Fe2+ cátion ferro II

Fe3+ cátion ferro II I

HRP hidroperoxidase

Lys Lisina

MAA 3-metilacetoacetona

MB azul de metileno

N3- Nitreto

NAD+ cátion nicotinamida adenina

NADH nicotinamida adenina dinucleotídeo

Pi fosfato inorgânico

t-BuOOH t-butilhidroperóxido

UV/vis espectroscopia ultravioleta e vísivel

LISTA DE SÍMBOLOS

kDa quilo Dalton

∆Eº’ variação de potencial padrão de redução ∆Gº’ variação de energia livre padrão λmax

abs comprimento de onda máximo de absorção λmax

em comprimento de onda máximo de emissão ΦF rendimento quântico de fluorescência ε máx coeficiente de absortividade molar máximo Et(30) parâmetro empírico de polaridade Rf fator de referência µM micromolar Ksv constante de Stern-Volmer

SUMÁRIO

1. Apresentação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.1 Citocromos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.2 Citocromos c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.3 Imidas Aromáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.4 Modificadores fluorescentes de proteínas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4. Método . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.1 Materiais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.2 Equipamentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.3 Preparação do citocromo c modificado com imida aromática . . . . . 42

5. Resultados e discussão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5.1 Síntese da 4-ANI-GLI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5.2 Acoplamento do citocromo c com a 4-ANI-GLI . . . . . . . . . . . . . . . . 56

5.3 Síntese do CIT-ANI pelo método de imidazol fundido . . . . . . . . . . . 58

6. Conclusões e Sugestões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

Referências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

absorbância

comprim ento de onda (nm)

1 APRESENTAÇÃO A presente pesquisa destina-se a examinar diferentes métodos de preparação de

citocromo c fluorescente bem como caracteriza-lo. Através deste estudo são descritos vários

experimentos realizados para atingir tal objetivo, com a perspectiva de acoplar o composto

fluorescente 4-amino-1,8-naftalimida covalentemente ao citocromo c, uma vez que se acredita

na possibilidade do uso da referida proteína fluorescente para acompanhar o processo de

apoptose celular.

15

2 INTRODUÇÃO

Os citocromos, moléculas cuja função foi elucidada em 1924 por David Keilin

(KEILIN, 1966; SCOTT,1996) , são proteínas com atividade redox presentes em todos os

organismos, exceto em poucos tipos de anaeróbios obrigatórios. Essas proteínas contêm

grupos heme que alternam entre seus estados de oxidação Fe2+ e Fe3+ durante o transporte

de elétrons. Dentre eles destacamos o citocromo c, o qual desde a sua descoberta muito tem

sido estudado a respeito de sua estrutura e função, principalmente por se tratar de uma

biomolécula importante na cadeia respiratória. Por ser também uma proteína estável,

hidrossolúvel, fácil de manipular e um componente importante do sistema de transporte

mitocondrial de elétrons, utilizamos neste projeto o citocromo c de coração de cavalo

(SCOTT,1996).

2.1 Citocromos

Os citocromos são proteínas que se localizam na membrana interna da mitocôndria e

apresentam como característica uma intensa absorção da luz visível devido a seus grupos

prostéticos heme que contêm ferro. As mitocôndrias contêm três classes de citocromos

designados por a, b e c, que podem ser distinguidos pelas diferentes estruturas dos grupos heme,

com conseqüentes alterações nos espectros de absorção de luz. Os grupos heme dos citocromos a

e b estão ligados às suas proteínas associadas de forma não-covalente. Os grupos heme dos

citocromos do tipo c, por outro lado, estão ligados covalentemente por meio de resíduos de

cisteína (SCOTT,1996).

2.2 Citocromos c

A partir dos dados obtidos com o sequenciamento de aminoácidos do citocromo c foram

definidas quatro classes dessa molécula:

� classe I, citocromo c mitocondrial, possui geralmente baixo-spin em sua forma

oxidada, tem resíduos de histidina e metionina coordenados com o grupo heme, o

16

qual é único e está ligado próximo ao grupo N-terminal. A metionina é o sexto

ligante e encontra-se próxima ao C-terminal. Atualmente, são conhecidos dezesseis

subtipos dessa molécula;

� classe II, citocromo c bacteriano, são alto-spin, havendo somente a histidina

coordenada ao heme, ou baixo-spin, onde aparece também a metionina coordenada

ao heme próxima ao N-terminal;

� classe III, citocromos c que apresentam múltiplos grupos heme (três grupos em

média) em sua estrutura, relacionados cada um com 30 a 40 aminoácidos e

coordenação com múltiplas histidinas;

� classe IV, podem ter de um a quatro grupos heme, são grandes, ligados a cadeias

polipeptídicas que podem variar de 20 a 35 kDa (SCOTT,1996).

2.2.1 Estrutura do citocromo c mitocondrial

A mitocôndria é responsável por processar e converter oxigênio e glicose em energia, sob a

forma de ATP (adenosina trifosfato). As mitocôndrias são constituídas de uma membrana externa

lisa e de uma membrana interna extensamente invaginada conforme pode ser observado na Figura

1.

Figura 1 - Representação esquemática de uma mitocôndria .

Cristas

Matriz

Membrana Interna

Membrana Externa

17

O citocromo c de coração de cavalo é uma proteína hidrossolúvel fortemente catiônica, com

ponto isoelétrico 10. Está localizado na parte externa da membrana interna da mitocôndria, é uma

hemoproteína composta de 104 aminoácidos que apresenta o grupo heme ligado covalentemente

à proteína por meio de ligações tioéter de dois resíduos de cisteína (Figura 2) (BRAUTIGAN,

1978).

Os resíduos positivamente carregados do citocromo c são predominantemente lisinas

(Lys), compreendendo 18% do total de resíduos, além de duas argininas e três histidinas. Vários

resíduos de Lys invariáveis no citocromo c localizam-se na forma de anel ao redor da

extremidade exposta do grupo heme (Figura 2A). Esses resíduos constituem um sítio de ligação

identificado por meio de um tratamento do citocromo c com anidrido acético (que acetila os

resíduos de Lys do citocromo c) (SCOTT,1996).

A estrutura secundária do citocromo c, determinada por análise de difração de raio-X,

apresenta três α-hélices maiores e duas menores que correspondem a cerca de 40% do

polipeptídeo. Suas α-hélices estão interligadas pela porção de cadeias polipeptídicas. Estas

contem curvaturas, voltas, segmentos estendidos ou enrolados irregularmente, que envolvem o

grupo heme em um arranjo esférico (SCOTT, 1996). Estudos demonstram que o número e a

natureza dos ligantes coordenados ao átomo de ferro central, o tipo de ligação entre o heme e a

proteína, a geometria do complexo e a natureza dos aminoácidos presentes nas cadeias

circunvizinhas ao sítio ativo são aspectos de grande relevância para a compreensão da estrutura e

das funções de uma hemoproteína e de suas propriedades redox. O ferro hemínico oxidado no

citocromo c está octaedricamente coordenado com quatro átomos de nitrogênio do anel

tetrapirrólico da porfirina, estando a 5ª e a 6ª posições ocupadas pelo resíduo de metionina 80 e

de histidina 18, respectivamente, na cadeia da proteína (Figura 2B) (SCHEJTER, 1988

OSHEROFF,1980).

18

Figura 2 – Estrutura do citocromo c de coração de cavalo destacando os resíduos de lisina e o grupo HEME. A: Estrutura secundária destacando sítio A (Lys 72 e Lys 73) e sítio L (Lys 22, Lys 25 e Lys 27); B: HEME – anel pirrólico com os 5º e 6º ligantes coordenados com o átomo de ferro; C: HEME – evidenciando as ligações tioéter nos resíduos de Cisteína 14 e 16.

Fe

N

NN

S

N

NHis 18

N+

+

Met 80A B

C

19

O enxofre da metionina 80 e o nitrogênio da histidina 18 formam ligações do tipo ligantes

fortes e mantêm o heme em um estado de baixo spin quando na forma oxidada (Fe3+). Entretanto,

a sexta coordenação, em razão de não ser muito estável, pode ser quebrada facilmente pelo

aumento de pH ou da temperatura, ou pode ter seu enxofre substituído por ligantes aniônicos

como CN-, N3- ou ainda pelo imidazol. A ruptura desta ligação promove a transição do estado de

spin do átomo de ferro hemínico do citocromo c, de baixo spin para alto spin. O estado de alto

spin favorece a atividade peroxidásica do citocromo c em reações que geram radicais do tipo

peroxil, alcoxil e alquil, os quais possuem potencial para propagar danos biológicos, exercendo

papel importante no estresse oxidativo, além de expor o grupo heme, fato este que também

facilita o processo de transporte de elétrons (LIU, 1996; BANCI, 2001; MILLER, 1978;

MOORE, 1980).

2.2.2 Citocromo c mitocondrial e seus diferentes estados de spin

A mecânica quântica considera que o elétron apresenta tanto características de partícula

como de onda. De acordo com o princípio de Pauling, cada orbital pode conter um ou dois

elétrons, que possuem spins (rotações de partículas) opostos. O comportamento magnético da

matéria é conseqüência do conjunto de seus spins eletrônicos. Se elétrons estiverem submetidos a

um campo magnético, seus spins tornam-se alinhados. O citocromo c no seu estado férrico (Fe3+)

ou ferroso (Fe2+) apresenta orbitais com a configuração 3d5 e 3d6, respectivamente, estando seus

elétrons distribuídos conforme representado na Figura 3.

A interação do ferro hemínico do citocromo c com seus ligantes promove a redistribuição

eletrônica e o desdobramento de seus orbitais d, possibilitando a existência da forma baixo e alto

spin, 1/2 e 5/2, respectivamente, para o ferricitocromo c (Fe3+). Conforme pode ser visto na

Figura 3, tanto a forma baixo spin como a forma alto spin apresentam número ímpar de elétrons

com spins desemparelhados. Porém, no ferrocitocromo c (Fe2+), como existem seis elétrons para

serem distribuídos nos orbitais d, tanto na forma alto como baixo spin, não há número ímpar de

elétrons com spins desemparelhados (ZUCCHI,2001).

20

Spin alto Spin Intermediário Spin Baixo

5 elétrons 3d-Fe3+

S=5/2

S=3/2

S=1/2

6 elétrons 3d-Fe2+

S=2

S=1

S=0

Figura 3 – Representação dos diferentes estados de spin dos íons Fe2+ e Fe3+ do citocromo c resultantes da

interação com lipossomos modelos (ZUCCHI, 2001).

A Figura 4 mostra os espectros de absorção do citocromo c em suas formas alto e baixo

spin, oxidado e reduzido, com bandas características. Uma metaloproteína, como o citocromo c,

por exemplo, apresenta duas transições eletrônicas em seu espectro de absorção: a banda Q, na

região entre 550 e 600 nm (baixa intensidade) e a banda Soret, entre 380 e 450 nm (alta

intensidade). Alterações neste espectro podem revelar mudanças na estrutura da proteína devido a

sua interação com o ambiente (SCOTT, 1996).

21

Figura 4 – Espectros de absorção UV/vis do citocromo c em suas formas alto spin (a) e baixo spin (b). O espectro de absorção do citocromo c oxidado e reduzido na forma alto spin (a) mostrando banda evidente de absorbância em torno de 550 nm enquanto que a baixo spin (b) mostra duas bandas ao redor de 525 nm e 556 nm (ZUCCHI, 2001).

2.2.3 Funções fisiológicas do citocromo c

O citocromo c faz parte do transporte de elétrons da cadeia respiratória, na superfície

externa da membrana mitocondrial interna. Outras funções do citocromo c referem-se à sua

participação na apoptose celular e atividade oxidase/peroxidase sobre vários substratos, incluindo

t-butilhidroperóxido (t-BuOOH), difenilacetaldeído (DPAA) e 3-metilacetoacetona (MAA)

(NANTES,2001) .

2.2.3.1 Citocromo c e a cadeia respiratória

A respiração celular compreende três etapas básicas: glicólise, ciclo de Krebs e cadeia

respiratória (também chamada de cadeia de transporte de elétrons). A Figura 5 mostra a

seqüência dos processos envolvidos na respiração celular, tanto na fase anaeróbia, que ocorre no

Oxidado

Reduzido Reduzido

Oxidado

22

citosol,quanto na fase aeróbia, na mitocôndria, organela que contem o citocromo c

(LEHNINGER,2006; MARZOCCO, 1999; VOET, 1995).

A cadeia respiratória consiste num sistema de transferência de elétrons provenientes dos

transportadores NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo) e FADH2 (flavina adenina

dinucleotídeo) até a molécula de oxigênio. Também designada cadeia de transporte de elétrons, é

formada por um conjunto de proteínas denominadas citocromos. Esse conjunto de carregadores

de elétrons, está disposto linearmente na membrana interna da mitocôndria.

O processo de transporte de elétrons tem início quando os elétrons do NADH são

transferidos para a primeira molécula da cadeia, a coenzima CoQ-redutase. Nessa etapa, o íon

H+ (próton hidrogênio) é liberado para a matriz mitocondrial e o NAD+ torna-se apto para receber

mais elétrons e íons H+ do ciclo de Krebs.

Figura 5 - Respiração aeróbia a partir da glicose (UFMT, 2006).

23

Os elétrons provenientes do NADH são transferidos de um complexo proteico para outro da

cadeia respiratória. Durante esse fluxo de elétrons, ocorre transferência de íons H+ dispersos na

matriz, para o espaço inter membranas, gerando um gradiente de concentração. Esse mecanismo

de bombeamento de H+, acoplado a um sistema de transferência de elétrons, é denominado

quimiosmose, fenômeno também presente na fotossíntese.

Esse gradiente de concentração que se estabelece, no espaço intermembranas, é uma forma

de armazenar energia, pois os íons H+ tendem a voltar para a matriz, onde sua concentração é

menor. O processo denominado fosforilação oxidativa refere-se a passagem dos íons H+ através

do complexo da enzima ATP sintase, determinando a formação de ATP a partir de adenosina

difosfato (ADP) e fosfato inorgânico (Pi).

O oxigênio só participa na etapa final da cadeia respiratória, em que desempenha a função

de aceptor final de elétrons e dos íons H+ presentes na matriz mitocondrial, formando moléculas

de água. No caso de não haver oxigênio disponível, não há retirada dos elétrons da cadeia e,

portanto, os citocromos permanecem com os elétrons, o bombeamento de elétrons cessa e o

processo é interrompido.

A Figura 6 mostra, com mais detalhes, a série de complexos protéicos contendo centros

redox com afinidade progressiva por elétrons, ou seja, com aumento do potencial de redução

padrão, promovendo a oxidação do NADH e FADH2. Os elétrons são passados através dessa

cadeia, do menor ao maior potencial de redução padrão. Os elétrons são carregados do Complexo

I e do Complexo II para o Complexo III pela coenzima Q (CoQ ou ubiquinona) e do Complexo

III para o Complexo IV pelo citocromo c.

Figura 6 –Reações envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória, os respectivos potenciais padrão de

redução de cada espécie ( ∆Eº’) e os valores de energia livre de Gibbs ( ∆Gº’) (VOET,1995).

Complexo I: NADH + CoQ(oxidada) → NAD+ + CoQ(reduzida)

∆Eº’ = 0,360 v ∆Gº’ = -69,5 kJ.mol-1

Complexo II: FADH2 + CoQ (oxidada) → FAD + CoQ (reduzida)

∆Eº’ = 0,085 v ∆Gº’ = - 16,4 kJ.mol-1

Complexo III: CoQ(reduzida) + cit c(oxidado) → CoQ(oxidada) + cit c(reduzido)

∆Eº’ = 0,190 v ∆Gº’ = -367,5 kJ.mol-1

Complexo IV: cit c(reduzido) + ½ O2 → cit c(oxidado) + H2O

∆Eº’ = 0,580 v ∆Gº’ = -112 kJ.mol-1

24

O Complexo I catalisa a oxidação de NADH pela CoQ, enquanto que o Complexo II

catalisa a oxidação de FADH2 pela CoQ. O Complexo III catalisa a oxidação da CoQ(reduzida)

pelo citocromo c (cit c), que transfere elétrons para o Complexo IV que catalisa a oxidação do

citocromo c reduzido pelo O2 , o aceptor terminal de elétrons do processo de transporte de

elétrons. Conforme um par de elétrons atravessa, sucessivamente, os Complexos I, III e IV, é

liberada energia livre suficiente em cada uma das etapas para gerar a síntese de uma molécula de

ATP (Figura 7). A reação redox do Complexo II, não libera energia livre suficiente para sintetizar

o ATP; ela serve somente para injetar os elétrons a partir do FADH2 na cadeia de transporte de

elétrons (LEHNINGER, 2006; VOET, 1995).

Figura 7 - Cadeia respiratória : CoQ – coenzima Q(círculo lilás) e citocromo c(círculo vermelho) (VOET,1995).

A síntese endergônica de ATP a partir de ADP e Pi na mitocôndria, é catalisada por uma

ATP-sintase (também conhecida como Complexo V), dirigida pelo processo de transporte de

elétrons. A energia livre do transporte de elétrons, através dos Complexos I ao IV (Figura 7),

deve ser conservada em uma forma que a ATP-sintase possa utilizá-la, chamada de energia de

acoplamento (VOET,1995).

25

2.2.3.2 Citocromo c e apoptose

A apoptose é definida como morte celular programada ocorrida sem reação inflamatória. A

apoptose é uma forma de morte celular ativa, necessária tanto para processos que envolvem

desenvolvimento de órgãos, como por exemplo, no controle de diferenciação de tecidos (na

formação das fendas interdigitais nos membros superiores e regressão do timo no ser humano)

quanto para destruir células que representem uma ameaça à integridade do organismo (RIBEIRO,

2004).

A apoptose é um processo fisiológico no desenvolvimento de animais e plantas, sendo tão

importante quanto o processo de mitose, pois garante indivíduos com quantidade e qualidade celular

para a manutenção da vida. Por ser um processo ativo, a apoptose é caracterizada por uma

seqüência bem definida e repetitiva de alterações morfológicas, que envolvem núcleo, citoplasma

e membrana plasmática, assim produzem como resultados contração da célula, drástica

reorganização nuclear e fragmentação celular. As células apoptóticas aglomeram-se perdendo

contato com as células vizinhas.

A morfologia do processo apoptótico inclui diminuição do tamanho celular e condensação

da cromatina no núcleo, permanecendo preservadas as membranas e as endomembranas. Nesta

fase do processo, não é possível corá-las com Azul de Tripan em um procedimento de contagem

de células, porque este só cora células mortas, ou seja, aquelas cujas membranas tenham sido

alteradas.

A apoptose é iniciada através da depleção de um fator de crescimento, pela interação de

citocinas ou outros ligantes com receptores de superfície da célula. Entretanto, células

danificadas por substâncias químicas, radiação, calor ou outras tensões também podem ativar

apoptose (OLEINICK,2001).

Estudos apontam o citocromo c como uma proteína envolvida na iniciação da apoptose por

ativar caspases, sendo sua liberação para o citosol um passo importante nesta ativação. No citosol

o citocromo c liga-se a proteína Apaf-1 (proteína adaptadora), a qual se liga a procaspase 9,

ativando-a . O complexo chamado apoptossomo [citocromo c, Apaf-1, caspase 9 e ATP] depende

de energia para ser formado, e irá se agregar no citosol. Desta maneira, a caspase cliva e ativa

outras caspases. Essa ativação seqüencial de uma caspase por outra, cria uma cascata de atividade

26

proteolítica, que leva à digestão de proteínas estruturais no citoplasma com degradação do DNA

cromossomal e morte da célula (SKULACHEV, 1998).

A Figura 8 mostra a seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico. Há vários

fatores que levam à liberação do citocromo c para o citosol: sobrecarga intramitocondrial de Ca2+

(induzindo a abertura de um poro na parte interna, contribuindo para a dissipação do potencial

elétrico da membrana e do inchamento mitocondrial); radiação ultravioleta e substâncias

oxidantes (CAI, 1998).

A iniciação do processo apoptótico sugere ser dependente de passos de ativação e inibição

gênica, com efeito, em cascata, que resulta no balanço intracelular entre fatores letais e de

sobrevivência. A existência de mecanismos, tanto inibidores como ativadores da apoptose, levam

a crer que todas as células possuam uma capacidade intrínseca para sofrer tal processo. Os

primeiros reguladores de apoptose descritos, foram revelados por análises genéticas e pertencem

a uma família de proteínas chamadas Bcl-2. Assim, em células não apoptóticas, as membranas

externas das mitocôndrias expressam em sua superfície as proteínas Bcl-2 e Bcl-X (anti-

apoptóticas). Estas proteínas são importantes para manutenção da fisiologia mitocondrial, porque

estão envolvidas no controle da impermeabilidade da membrana. A regulação da apoptose está

diretamente relacionada à atividade dessas proteínas que são codificadas pelo gene bcl-2.

A inibição da atividade da Bcl-2 (proteína anti-apoptótica) ou aumento na expressão de Bax

(proteína da família Bcl-2, pró-apoptótica) leva a um aumento da permeabilidade da membrana

mitocondrial, com o conseqüente aumento no volume da matriz da mesma, expansão e

fragmentação de sua membrana interna. Esse evento favorece a liberação do citocromo c para o

espaço intermembranas e para o citosol. Uma característica importante da apoptose é a

fragmentação do DNA. Nos estágios iniciais, são produzidos fragmentos de 50 a 300 kb,

apresentando a cromatina separada da matriz nuclear, isto é geralmente seguido por uma rápida

fragmentação da dupla fita de DNA em sítios internucleossomais. As enzimas que catalisam esta

fragmentação são, geralmente, endonucleases nucleares não-lisossomais. Em certas células elas

são ativadas por Ca2+ e Mg2+e inibidas por Zn2+. O DNA ativo é hidrolisado preferencialmente

por estas enzimas, rompendo-se em longos fragmentos de oligonucleotídeos. Esses, quando

submetidos à eletroforese, apresentam um padrão típico de 200 pares de base, correspondentes ao

DNA com fragmentos internucleossomais.

27

A fragmentação do DNA pelas endonucleases foi inicialmente utilizada como diagnóstico

de apoptose. No entanto, atualmente, já se sabe que nem todos os tipos de células mostram esta

característica, ou seja, as mudanças nucleares pela apoptose podem ocorrer sem ativação de

endonucleases ou produção de oligonucleotídeos (OLEINICK, 2001).

Figura 8 – Seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico (WEIZMANN, 2007).

p53

Bax PUMA

Bcl-2

Estímulos apoptóticos

Smac

Cyt c /ATP

Apaf-1 p53

Caspase-9

Caspase-3

Células Alvo

IAPs

Mitocôndria

Apoptose

28

2.2.4 Reações do citocromo c

Desde 1973, muitos pesquisadores têm realizado testes de reatividade do citocromo c a fim

de avaliar seu potencial de redução. O seu comportamento encontra-se descrito em relação a sua

atividade peroxidase/oxidase sobre aldeídos, como difenilacetaldeído (DPAA), β-cetonas e

hidroperóxidos, como o t-butilhidroperóxido (t-BuOOH), assim como em presença de azul de

metileno (MB) irradiado ou de β-mercaptoetanol (NANTES, 2001; ESTEVAM, 2004;

MUGNOL, 2004; PRIETO, 2004; KAWAI, 2005).

2.2.4.1 Reação com DPAA

O difenilacetaldeído (DPAA) é um aldeído hidrofóbico que se difunde livremente através

de membranas biológicas e pode ser oxidado por várias hemoproteínas como citocromo c, além

de outras como: peroxidase de raiz forte (HRP), mioglobina e hemoglobina. O mecanismo

proposto para esta reação é mostrado a seguir (Figura 9).

A etapa (a) mostra as estruturas de ressonância do DPAA, sendo a forma enólica a que tem

maior capacidade doadora de elétrons para o citocromo c, produzindo o radical alcoxil e o

citcocromo c reduzido (cyt c Fe2+) conforme descrito na etapa (b). O radical alcoxil em meio

aerado reage com oxigênio molecular e forma o radical peroxil que pode ciclizar para um

intermediário dioxetano como mostrado na etapa (c). O dioxetano é instável e sofre termólise a

37ºC produzindo benzofenona triplete e ácido fórmico, conforme etapa (d).

A benzofenona triplete produzida nesta reação é uma espécie excitada de vida longa (100

µs), fonte potencial de oxigênio singlete em meio aerado por um processo de transferência

colisional. A geração de oxigênio singlete para este sistema foi detectada durante a reação e

suprimida por histidina, com a mesma constante de supressão determinada indicada para o

oxigênio singlete.

Os dados da literatura de redução de citocromo c por DPAA sugerem a relação com a

ionização das cadeias laterais de dois resíduos de tirosina, presentes na estrutura de citocromo c.

A reação de oxidação do DPAA pelo ferro hemínico é favorecida quando um resíduo de tirosina

está ionizado e o outro não. A cadeia lateral do resíduo não ionizado faz stacking com os anéis

29

aromáticos do DPAA e a cadeia lateral de tirosina ionizada favorece a doação de elétrons do

DPAA pois deve diminuir seu potencial de redução (RINALDI, 2004).

O2

HO HOH

HOH

Fe3+

HO

Fe2+

HO OH

.OOO

H

OH

O

OH

OH

O

O

HCOOH

e-

+ cyt c + cyt c

meio aerado

+

(a)

(b)

(d)

(c)

37ºC3 *

Figura 9 – Mecanismo proposto para a reação entre citocromo c e DPAA (NANTES,2001).

2.2.4.2 Reação com t-BuOOH

Dados da literatura demonstram que o citocromo c reage com hidroperóxidos orgânicos

formando radicais livres, fato importante no processo de peroxidação lipídica e danos a proteínas.

A reação do citocromo c com t-butil hidroperóxido (t-BuOOH) resulta em progressiva queda de

absorção da banda Soret, em 409 nm, juntamente com a conversão do estado de spin do ferro

hemínico, de baixo spin para alto spin com simetria rômbica. (NANTES, 2001).

30

2.3 Imidas Aromáticas

Neste trabalho, fez-se a modificação do citocromo c com uma 4-amino-1,8-naftalimida

principalmente por se tratar de uma substância que exibe fluorescência. Imidas aromáticas

constituem uma classe de compostos de grande interesse em razão de suas diversas aplicações na

área biológica e no campo de novos materiais (RODRIGUES, 1999) . A importância biológica

das 1,8-naftalimidas e das 1,4,5,8-naftalenodiimidas se referem principalmente a suas atividades

anticarcinogênicas e antivirais que resultam das suas capacidades de intercalação no DNA.

Além do mais, a ativação fotoquímica encontrada favorece a atividade biológica das imidas

naftalênicas, resultando em clivagem específica na seqüência de DNA (SAITO, 1992). As 1,8-

naftalimidas e seus derivados substituídos com grupos doadores de eletrons no carbono na

posição 4 são coloridas, amarelo brilhantes, exibindo intensa fluorescência e ótima

fotoestabilidade, sendo por esse fato importantes na modificação do citocromo c apresentada

neste trabalho.

2.3.1 Estrutura das Imidas

As imidas contêm o grupo -CO-N(R)-CO- em sua estrutura, sendo que R pode ser um

átomo de hidrogênio, um grupo alquila ou um grupo arila. Elas podem ser classificadas como

monoimidas e diimidas considerando o número de grupos imida, ou também como benzênicas,

naftalênicas e perilênicas se considerarmos o número de anéis aromáticos. A Figura 10 mostra as

estruturas de imidas aromáticas importantes em vários estudos envolvendo fluorescência

(BROCHSZTAIN, 1999; CAMPOS, 2004; BARROS, 1996; COSNARD, 1998; FURTADO,

2005; GRABCHEV, 2003; POTEAU, 2000; ).

As imidas aromáticas têm sido recentemente muito estudadas no desenvolvimento de

novos materiais. Isto se deve à versatilidade de sua síntese, permitindo variar amplamente a

estrutura do grupo R. A modificação do grupo R permite a modelação de propriedades destas

moléculas, tais como: solubilidade e capacidade de se incorporar em sistemas supramoleculares

(SAHA, 2002; GUNNLAUGSSON, 2003).

31

Figura 10 – Estruturas de imidas aromáticas relevantes. A numeração das imidas naftalênicas segue a ordem indicada na estrutura do naftaleno que consta no alto da página (BROCHSZTAIN, 1999).

NH2

N OO

CH2COOHN

N

OO

OO

R

R

N OO

NH2

R

8 1

2

3

456

7

N-R

O

O

N-R

O

O

N OO

R

1,8-naftalimidas

ftalimidas 2,3-naftalimidas

4-amino-1,8-naftalimidas

1,4,5,8-naftalenodiimidas 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida

(4-ANI-GLI)

32

2.3.2 Síntese de imidas aromáticas

As imidas aromáticas podem ser facilmente sintetizadas, permitindo a incorporação de

vários N-substituintes. Para este procedimento usa-se um anidrido aromático e uma amina

primária. É uma reação muito versátil sendo que qualquer imida aromática pode ser sintetizada

desde que exista uma amina primária (R-NH2) com o substituinte “R” desejado

(GRABCHEV,2003). A Figura 11 mostra a reação geral de obtenção de imidas aromáticas a

partir de um anidrido 1,8-naftálico e uma amina primária.

Figura 11 – Reação geral de obtenção de imidas aromáticas (BROCHSZTAIN, 1999).

O mecanismo proposto para explicar a formação das imidas, descrito na Figura 12, sugere

a presença de um intermediário, neste caso o ácido âmico, que ao sofrer rearranjo intramolecular

passa a exibir o anel imídico. A reação é uma abertura do anel seguida de fechamento com perda

de uma molécula de água (CECHINEL, 2003).

O OON OO

NH2+

R2

R1

R2

R1

33

Figura 12 – Mecanismo geral de formação de imidas (CECHINEL, 2003).

2.3.3 Espectroscopia das imidas

Em geral, as transições eletrônicas de mais baixa energia (S0→S1) das naftalimidas

apresentam um caráter π→π*. Entretanto, a presença de um substituinte doador de elétrons na

posição 4, como no caso das 4-amino-1,8-naftalimidas (4-ANI, Figura 10), altera totalmente as

propriedades fotofísicas da molécula (Figura 13) (PESCE,1971). Neste caso, a transição S0→S1

possui um caráter de transferência de carga (CT) intramolecular, de acordo com a literatura

(ALEXIOU, 1990; SAHA, 2002). A influência do substituinte na posição 4 fica evidente ao

compararmos os espectros característicos da 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (BNIP)

com o da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (ANIP), mostrados na Figura 14. Nota-se

que o espectro da BNIP apresenta resolução vibracional típica de transições π→π*. A

substituição de um átomo de bromo por um grupo amino, entretanto, leva a alterações dramáticas

no espectro de absorção, resultando em um deslocamento para o vermelho do λmaxabs de cerca de

100 nm e da perda da resolução vibracional, características típicas de uma transição do tipo CT.

A natureza do substituinte na posição 4 também influi na fluorescência dos compostos

(Figuras 13, 14 e Tabela 1). Alexiou (1990) e colaboradores prepararam uma série de 1,8-

naftalimidas substituídas e determinaram suas propriedades fotofísicas. Os resultados desses

estudos (Tabela 1) mostraram que a presença do bromo como substituinte na posição 4 diminui

significativamente o rendimento quântico de fluorescência da 1,8-naftalimida (ΦF = 0,003).

Entretanto, se o substituinte for o grupo amino este valor aumenta para 0,64, confirmando a

influência da natureza do substituinte na fluorescência do composto (ALEXIOU, 1990;

O

O

O

H2N - RNH - R

OH

O

O

N - R

O

O

+

34

WOODS,2003; YIN,1998). No caso da BNIP a presença de um átomo de bromo suprime

totalmente a fluorescência. Outras características das ANI típicas de transições por transferência

de carga (CT) são o acentuado deslocamento de Stokes, da ordem de 100 nm (Figura 14) e a

elevada sensibilidade dos λ max de absorção e emissão à polaridade do meio (vide seção 4.1.1).

Figura 13 – Estrutura das 1,8 – naftalimidas (BROCHSZTAIN, 1999).

Figura 14 – Espectros de absorção (ABS) e de emissão (EM) de 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (BNIP) e da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (ANIP) em acetonitrila e suas respectivas estruturas (BROCHSZTAIN, 1999).

300 350 400 450 500 550 6000,0

0,2

0,4

0,6

ANIPANIPBNIPA

bsor

bânc

ia

Comprimento de onda nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

ABSABS EM

Inte

nsid

ade

u.a.

N

PO3H2

Br

OO N

PO3H2

NH2

OO

BNIP ANIP

R1 = praticamente não influi nas propriedades fotofísicas. R2 = aceptor de elétrons (compostos incolores, não fluorescentes).

-NO2 ; -Cl; -Br. R2 = doador de elétrons (compostos amarelos altamente fluorescentes). -NH2; -NHR; -NR2; -OCH3

N OO

R1

R2

35

Tabela 1 – Rendimento quântico de fluorescência de 1,8-naftalimidas com diferentes substituintes (ALEXIOU, 1990).

A transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI pode ser melhor visualizada através das

estruturas de ressonância mostradas na Figura 15.

Figura 15 – Transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI.

R1 R2 ΦF

Propil - Br 0,003

Butil - H 0,040

Butil - NH2 0,640

NH2

N OO

NH2

NO O

: +

R1R1

hν

36

2.4 Modificadores fluorescentes de proteínas

Uma vez que o objetivo é sintetizar um citocromo c fluorescente procurou-se na literatura

trabalhos referentes a modificadores fluorescentes de proteína. As modificações químicas de

proteínas têm sido amplamente utilizadas para obter informações sobre o papel de diferentes

grupos funcionais em seu mecanismo de ação. Além disso, quando ambas, a seqüência de

aminoácidos e a estrutura tridimensional da proteína são conhecidas, como no caso do citocromo

c, os resultados das modificações de resíduos funcionais importantes podem ser interpretados. Os

modificadores mais utilizados encontrados na literatura são: complexos de rutênio, fluoresceína e

os corantes Lúcifer (CATÁLOGO SIGMA, 2006).

1.4.1. Complexos de rutênio

Os ésteres ativados de complexo de rutênio são modificadores fluorescentes por acilação de

aminas em aminoácidos de cadeias laterais de proteínas (Figura 16). Comercialmente, estão

disponíveis em uma série de corantes baseados em complexos de rutênio com diversas

aplicações. Estes corantes podem ser usados para marcar biomoléculas sob condições brandas.

Figura 16 – Preparação do derivado Ru(bpy)2(dcbpy)-citocromo c

N-O-C

O

O

O

N

N

OC

O

O

N

N

C

O

C

O

N

H

Proteína -

Proteína - NH2

Ru(bpy)2CO3

O

N

N

C

O

C

O

N

H

Proteína -

Ru(bpy)2+2+

37

As vantagens destes corantes como marcadores de proteínas incluem: alta fotoestabilidade,

boa solubilidade em água, ausência de interações corante – corante e amplos deslocamentos

Stokes, ou seja, com significativo efeito batocrômico (para o vermelho) ou hipsocrômico (para o

azul ). Além disso, os sinais de fluoróforos de longa vida podem ser utilizados para eliminar a

emissão dos de vida curta e a autofluorescência de células e biomoléculas para melhorar ainda

mais a sua sensibilidade (SCOTT , 1996).

2.4.2 Fluoresceína

John A. Thomas e colaboradores relataram um método adequado para monitorar o

transporte de cátions hidrogênio em partículas mitocondriais, evento importante no processo de

fosforilação oxidativa. Os pesquisadores prepararam citocromo c modificado por isotiocianato de

fluoresceína (Figura 17) na proporção 1:5, reagindo por 4 horas em pH 7,8 (THOMAS, 1975).

Figura 17 – Estrutura da fluoresceína

Sabe-se que o citocromo c de coração de cavalo apresenta 19 resíduos de lisina com amino

grupos primários e que estes reagiram com isotiocianato fluoresceína, fato esse que possibilitou a

preparação de 19 derivados modificados. Entretanto, duas lisinas se mostraram muito mais

reativas do que outras.

O OOH

COOH

38

2.4.3 Corantes Lúcifer

A estrutura dos corantes Lúcifer (Figura 18) se assemelha ao modificador do citocromo c

utilizado neste trabalho por se tratar de um derivado de 4-ANI. Desde sua apresentação, em 1978,

amarelo Lúcifer CH e amarelo Lúcifer VS têm sido usados com sucesso como marcadores

intracelulares em uma ampla variedade de sistemas biológicos. Ambos contêm o mesmo grupo 4-

amino-1,8-naftalimida, mas eles diferem no substituinte do nitrogênio da imida. As suas sínteses

estão baseadas no pigmento comercial sulfoflavina. Os pigmentos têm propriedades espectrais

semelhantes: absorção máxima entre 280 nm e 430 nm com emissão máxima perto de 540 nm.

Figura 18 –Estrutura do corante Lúcifer.

Stewart (1980) e colaboradores relatam ter desenvolvido um método de obtenção do

conjugado covalente a proteína, em filamentos de actina, de cultura de fibroblastos, sinalizados

por conjugados desse gênero, e que o mesmo seria publicado posteriormente, porém, após

extensa pesquisa, buscando a possível publicação dos referidos autores não a encontramos.

O Lúcifer amarelo VS é similar ao isotiocianato de fluoresceína em sua facilidade de uso e

intensidade de fluorescência e tem a vantagem de que seu pico de emissão de 540 nm é

consideravelmente para o vermelho da fluoresceína em 515nm, e aí que seu contraste

fluorescente mais fortemente com tecido autofluorescente. Mas desde que o Lúcifer não tem

outra vantagem clara e já que é menos conhecido a cerca de sua química e estabilidade de ligação

que é formada, é provável que isotiocianato de fluoresceína permanecerá o pigmento escolhido

para mais aplicações imunofluorescentes. Quando a fluorescência é necessária em pHs abaixo de

6, Lúcifer amarelo VS é mais útil. A intensidade fluorescente do Lúcifer VS continua sendo a

mesma de pH 2 a pH 10, assim como a atípica propriedade de solubilidade em água do pigmento.

NH2

SO3-Li+Li+-O3S

N OO

R

39

Esta independência do pH faz com que o pigmento seja apropriado para monitoramento de

mudanças conformacionais induzidas por alterações de pH em macromoléculas

(STEWART,1981).

40

3 OBJETIVOS

Os principais objetivos deste trabalho são:

• Modificar o citocromo c, uma importante proteína, com um cromóforo pertencente

a um grupo de substâncias bastante explorado pelos pesquisadores nos últimos

anos, uma 4-amino-1,8-naftalimida, a fim de obter uma biomolécula fluorescente

que possa ser utilizada para seguir o curso da apoptose.

• Desenvolver diferentes métodos de inserção da imida no citocromo c: (i) através de

síntese por acoplamento com EDAC; (ii) síntese com imidazol fundido; (iii) síntese

utilizando tratamento por microondas e ultra-som.

• Purificar e caracterizar o citocromo c modificado de acordo com os métodos

citados no item anterior.

41

4 MÉTODO

4.1 Materiais

- Citocromo c de coração de cavalo (Cytochrome c horse heart) – (cit c)12384

g/mol (Sigma).

- Anidrido 4-amino-1,8-naftálico – MM 213 g/mol – (AAN) (Aldrich).

- Imidazol, MM 68,08 g/mol ,(Merck).

- Dimetilformamida (DMF) – (J.T. Baker).

- EDAC – (N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida)-MM 191,7 g/mol -

- Fosfato de sódio mono e dibásico – (Sigma).

- Fosfato de potássio – (Sigma)

- Glicina MM 75 g/mol – (Carlo Erba).

- Cromatofolhas de plástico – Silicagel 60 – F254 – marcador – (Merck)

- Membrana de nitrocelulose – 6,000-8,000 – 23 mm de largura – (Spectrum

Laboratório Inc.).

- Carboximetil-celulose 32 – (Whatman).

- (4-ANI-GLI) - (4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida), preparada no Centro

Interdisciplinar de Investigação Bioquímica da Universidade de Mogi das

Cruzes, UMC.

- Dimetilsulfóxido – (DMSO) – (Sigma).

Todos os demais reagentes utilizados são de grau analítico e as soluções foram

preparadas com água deionizada em sistema Mili-Q TM Water System da Millipore Corp.

(Bedford, MA,USA).

4.2 Equipamentos

- Agitadores: Vortex – Genie 2, modelo G250, Scientific Industries (Boemia,

NY,EUA).

- Banhos de temperatura constante PRECISION.

- Centrifuga refrigerada, Hitachi modelo CF 15R (Tóquio, Japão).

- Espectrofotômetro Shimadzu Modelo 1501 MultiSpec (Tóquio, Japão).

- Espectrofluorímetro Hitachi F2500 (Tóquio, Japão).

- Espectropolarímetro JASCO J-810 (CD).

42

- Infravermelho FTIR/ATR – Perkin Elmer modelo Spectrum One.

- pHmetro modelo Orion 900 - A.

- Purificador de água Mili-Q TM Water System da Millipore Corp. (Bedford,

MA,USA).

- Shaker Tecnal TE-053.

- Espectrômetro de massas – MALDI-TOFF.

- Liofilizador STS Systems modelo EZ550R.

- Lâmpada compacta 4W modelo UVGL-25 (UVP).

- Forno microondas

- Sonicador

- Ressonância Magnética Nuclear – RMN – Equipamento Bruker AC 200 (200

MHz) - Central Analítica do Instituto de Química da USP.

4.3 Preparação do citocromo c modificado com imida aromática (CIT-ANI)

4.3.1 Síntese de 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-ANI-GLI) por acoplamento com citocromo c

A preparação de 4-ANI-GLI foi realizada em presença de imidazol fundido. Misturou-

se 100 mg (470 µmoles) de anidrido 4-amino-1,8-naftálico e 40 mg (533 µmoles) de glicina

com 0,5 g de imidazol fundido. A mistura permaneceu sob agitação e aquecimento (120ºC)

por 30 minutos. Após esfriar, adicionou-se cerca de 10 mL de clorofórmio à mistura reacional

para dissolver o excesso de glicina e imidazol. O sólido resultante foi recolhido por filtração

em funil de Büchner e lavado com um pouco de clorofórmio e finalmente seco a vácuo.

Obteve-se 150 mg do produto (117,62 % de rendimento), fato este que pode ser explicado

pela formação do produto na forma do sal de imidazol. A reação foi monitorada por

cromatografia de camada delgada (TLC) utilizando etanol para eluição. O espectro RMN da

4-ANI-GLI em DMSO-d6 apresenta δ (ppm): 4,67(s), Ha, 2H; 6,87(d), Hc, 1H; 7,04(s), Hb’,

2H; 7,55(s), Hg (NH2), 2H; 7,68(t), He, 1H; 7,72(d), Ha’, 1H; 8,20(d), Hb, 1H; 8,44(d), Hd, 1H;

8,65(d), Hf, 1H.

43

4.3.2 Acoplamento entre citocromo c e 4-ANI-GLI com EDAC

- Método A

Misturou-se em um béquer: 1mL de ácido clorídrico 10-5 M, 3 µL de EDAC 50 mM

(0,14 µmol) e 10,5 µL de uma solução aquosa de 4-ANI-GLI 13,8 mM (0,14 µmol). Em

seguida adicionou-se 50 µL de uma solução aquosa de citocromo c 2,9 mM (0,14 µmol). A

mistura permaneceu por 30 minutos sob agitação e a reação foi interrompida com a adição de

100µL de tampão acetato de sódio 0,2 M pH 5,0. O produto obtido foi dialisado em água por

quatro horas, duas vezes.

- Método B

Em um balão misturou-se 5 mg (0,4 µmol) de citocromo c nativo, 22 mg (80 µmoles) de

4-ANI-GLI e 12,5 mg (65 µmoles) de EDAC em 1,25 mL de tampão fosfato de potássio 50

mM pH 6,0. O tampão fosfato foi previamente deaerado em argônio, por 30 minutos. A

mistura permaneceu sob agitação em sistema fechado e em banho de gelo (~ 4ºC) por 12

horas. A mistura reacional foi dialisada em 2 L de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0

até que a solução externa não apresentasse mais imida (seis vezes).

- Método C

5 mg (0,4 µmol) de citocromo c nativo, 22 mg (80 µmoles) de 4-ANI-GLI e 12,5 mg

(65 µmoles) de EDAC foram misturados em 1,25 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM

pH 6,0. O tampão fosfato foi previamente deaerado em argônio, por 30 minutos. A mistura

permaneceu sob agitação em sistema fechado e em banho de gelo (~ 4ºC) por 24 horas.

Adicionou-se 14 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0 ao produto obtido que foi

centrifugado por 30 minutos, 18000 rpm à temperatura de 20ºC. O líquido sobrenadante foi

dialisado com membrana de nitrocelulose, 6,000 – 8,000, em 2 L de tampão fosfato de

potássio 50 mM pH 6,0 com troca do tampão a cada duas horas, por seis vezes.

44

- Método D

Em um frasco foram colocados 0,8 mg (4 µmoles) de EDAC, 2,2 mg (8 µmoles) de 4-

ANI-GLI e 1 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0 que foram misturados

vigorosamente por 15 minutos, à temperatura ambiente. Uma solução de citocromo c nativo:

0,4 µmol em 500 µL tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0 foi preparada e

posteriormente adicionada lentamente (~20minutos) à mistura imida + EDAC. O sistema

reacional permaneceu sob agitação por mais dez minutos. A mistura reacional foi dialisada

em 2 L de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0, com troca a cada 2 horas por seis vezes.

4.3.3 Acoplamento de citocromo c com anidrido 4-amino-1,8-naftálico

(AAN) usando imidazol fundido

- Método A

Em um balão misturou-se 3 mg (2,34 µmoles) de citocromo c, 7,4 mg (34,7 µmoles) de

anidrido 4-amino-1,8-naftálico e 750 mg de imidazol. A mistura foi mantida a 90ºC por 10

minutos sob agitação. A dissolução da mistura reacional foi feita com adição de 25 mL de

água deionizada. A seguir a mistura foi centrifugada a 20ºC por 5 minutos e 1000 rpm. O

líquido sobrenadante foi retirado e dialisado em água deionizada por 12 horas.

- Método B

Em um balão misturou-se 517 mg de imidazol e 161,5 µL de solução 0,01M (1,6

µmoles) de anidrido 4-amino-naftálico em DMF (dimetilformamida) a 90ºC. A seguir

adicionou-se 1,6 µmoles de citocromo c deixando-se a mistura sob agitação por 2 minutos.

Após o resfriamento da mistura foram adicionados 20 mL de água deionizada e procurou-se

dissolver a mistura que na seqüência foi centrifugada a 20ºC, 5 minutos e 1000 rpm. O

líquido sobrenadante foi retirado e dialisado em membrana de nitrocelulose (6,000-8,000) e

água deionizada por duas horas.

45

4.3.4 Síntese por ultra-som e microondas

Em um tubo de ensaio misturou-se 2 µmoles de citocromo c nativo, 81µL de solução de

anidrido 4-amino-1,8-naftálico 0,01M (0,8 µmol) em DMF (dimetilformamida) e 500µL de

água deionizada. O tubo foi coberto com parafilme e sonicado por 10 minutos e em seguida

registrou-se seu espectro UV/vis. Repetiu-se essa operação em intervalos de 10 minutos por

mais duas vezes. Em seguida sonicou-se por mais 24 horas e um novo espectro UV/vis foi

registrado. Utilizou-se uma solução controle como referência para avaliação do processo. Essa

solução continha: 0,4 µmol de citocromo c nativo, 40,5 µL de DMF e 250 µL de água

deionizada. Após o tratamento por sonicação submeteu-se essas mesmas amostras à

microondas por 20 segundos monitoradas . Repetiu-se o procedimento por mais três vezes.

4.3.5 Monitoração das preparações

4.3.5.1 Teste de estabilidade térmica do citocromo c

Testamos a estabilidade térmica do citocromo c dissolvido em água, submetido a 90ºC

durante 1min, 2 min e 15 min e avaliamos através de espectroscopia UV-VIS.

4.3.5.2 Cromatografia por camada delgada (TLC)

Após a diálise do liquido sobrenadante do CIT-ANI aplicamos em cromatofolhas e

eluimos com etanol junto a citocromo c nativo e o anidrido 4-amino-1,8-naftálico (AAN)

conforme figura 16 mostrada em resultados.

4.3.5.3 Espectroscopia Ultra-Violeta/Vísivel

Em um espectrofotômetro de rede de fotodiodo Multispec 1501 da Shimadzu

Corporation realizou-se medidas em cubetas de quartzo de caminho ótico de 10 mm para

soluções de menor concentração e de 1mm para soluções de maior concentração. O software

Shimadzu Hyper-UV foi utilizado para obtenção do espectros, cujas medidas foram feitas a

temperatura ambiente. O equipamento contém uma lâmpada de halogênio para medidas na

faixa de luz visível e uma lâmpada de deutério para medidas na faixa de luz ultra-violeta.

46

4.3.5.4 Dicroísmo Circular

As medidas de CD, na região de ultravioleta distante (190-260 nm), foram realizadas

em um espectropolarímetro Power Suply JASCO, à 25ºC, em uma velocidade de varredura de

50 nm/min. Foram utilizadas cubetas de 0,5mm de caminho óptico. Os experimentos foram

realizados com 20µM do citocromo c modificado em água à 25ºC. Os espectros por

dicroísmo circular foram registrados em colaboração com a Profª Adelaide Faljoni Alário, do

Instituto de Bioquímica da USP.

4.3.5.5 Espectroscopia por Infravermelho (IR)

Dispersou-se 100 µL da solução aquosa do CIT-ANI em uma placa de Zn/Se e secou-

se com ar quente, por 15 minutos, a fim de eliminar a interferência provocada pela presença

de água e registrou-se os espectros por infravermelho a partir da média de 32 leituras. Os

espectros foram corrigidos com acerto de linha base e retirada de ruídos.

47

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Geralmente, o método mais utilizado para acoplar biomoléculas com modificadores

orgânicos emprega carbodiimidas como agentes acoplantes (FRAGOSO, 2002), uma vez que a

reação é feita em meio aquoso e à temperatura ambiente, ao contrário dos métodos de síntese

convencional, os quais empregam condições drásticas, como solventes orgânicos e altas

temperaturas que sabidamente causam danos às biomoléculas. Assim sendo, procurou-se

primeiramente fazer a modificação do citocromo c por acoplamento com EDAC (FRAGOSO,

2002), porém os resultados iniciais dos experimentos por TLC e espectroscopia UV/vis indicam

não ter ocorrido a reação. Decidiu-se, portanto, tentar um método alternativo que consiste em

utilizar imidazol fundido como solvente para a reação de acoplamento. Apesar do método

empregar condições drásticas julgou-se ser viável testá-lo devido a grande estabilidade do

citocromo c e ao sucesso de nosso grupo na síntese de imidas com o mesmo método. Além desses

métodos, procuramos também sintetizar o CIT-ANI por ultra-som e microondas.

5.1 Síntese da 4-ANI-GLI O acoplamento de uma proteína com EDAC acontece a partir da reação entre um grupo

carboxila e um grupo amino formando uma amida. Portanto, existem duas possibilidades de

acoplamento: (a) uma 4-ANI carboxilada (4-ANI-COOH) reagindo com um grupo amino da

proteína (proteína-NH2) ou (b) uma 4-ANI substituída com grupo amino (4-ANI-NH2) reagindo

com um grupo carboxila da proteína (proteína-COOH). Uma vez que o citocromo c é uma

proteína que apresenta considerável quantidade de resíduos do aminoácido lisina (18% dos

resíduos), parece mais lógico utilizar a opção (a). Portanto, decidiu-se sintetizar o composto 4-

ANI-GLI por condensação do AAN com o aminoácido glicina (Figura 19).

Preparou-se a 4-ANI-GLI utilizando-se imidazol fundido como solvente. Após a reação,

foram feitos testes de solubilidade com a mistura obtida (4-ANI-GLI + imidazol + glicina) nos

solventes etanol, água e clorofórmio com o objetivo de purificar a imida. Descobriu-se que o

clorofórmio dissolve apenas o imidazol e a glicina e por isso foi escolhido para a purificação da

4-ANI-GLI. Obteve-se para a reação um rendimento superior a 100% (vide seção 3.3.1),

sugerindo que o produto foi obtido na forma do sal imidazólico (Figura 19). Ao refazer os

48

cálculos para a fórmula molecular 4-ANI-GLI . imidazol, obteve-se um rendimento de 94 % , o

que é coerente com a formação do sal. O espectro de 1H-RMN do produto (Figuras 20A e B)

confirmou este resultado uma vez que os picos atribuíveis ao imidazol (Figura 20C) estavam

presentes em proporções estequiométricas.

Figura 19 – Preparação da 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-ANI-GLI)

Figura 20A – Espectro de 1H-RMN da 4-ANI-GLI em DMSO-d6 : 4,67(s), Ha, 2H; 6,87(d), Hc, 1H; 7,04(s), Hb’, 2H; 7,55(s), Hg (NH2), 2H; 7,68(t), He, 1H; 7,72(d), Ha’, 1H; 8,20(d), Hb, 1H; 8,44(d), Hd, 1H; 8,65(d), Hf, 1H.

O OO

NH2

NH2-CH2-COOH

N OO

NH2

CH2COOH

H 2 O+ +imidazol

90ºC

0.4

86

7

0.5

097

0.5

150

1.0

636

0.1

422

0.9

853

1.3

009

0.5

463

1.0

916

0.0

717

Inte

gra

l

8.6

753

8.6

336

8.4

602

8.4

251

8.2

233

8.1

816

7.7

165

7.6

967

7.6

792

7.6

397

7.5

51

9

7.0

429

6.8

893

6.8

47

6

4.6

711

3.8

681

2.5

122

2.0

887

-0.0

000

(ppm)

-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.5

13968 SERGIO-UMC LUCI01

Hg

Ha

H2O

Hf

Hd

Hb

He +

Ha’

Hb’

� �� DMSO

X

X

Hc

DMSO-d6

0.4

86

7

0.5

097

0.5

150

1.0

636

0.1

422

0.9

853

1.3

009

0.5

463

1.0

916

0.0

717

Inte

gra

l

8.6

753

8.6

336

8.4

602

8.4

251

8.2

233

8.1

816

7.7

165

7.6

967

7.6

792

7.6

397

7.5

51

9

7.0

429

6.8

893

6.8

47

6

4.6

711

3.8

681

2.5

122

2.0

887

-0.0

000

(ppm)

-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.5


Hg

Ha

H2O

Hf

Hd

Hb

He +

Ha’

Hb’

� �� DMSO

X

X

Hc

DMSO-d6

N OO

Hb

HcNH2Hd

He

Hf

Hg

CH2Ha

COO

N NH2+

Hb' Hb'

Ha'

}

}

-

.

49

0.48

67

0.50

97

0.51

50

1.06

36

0.14

22

0.98

53

1.30

09

0.54

63

Inte

gral

8.67

538.

6336

8.46

028.

4251

8.22

338.

1816

7.71

657.

6967

7.67

927.

6397

7.55

19

7.04

29

6.88

936.

8476

(ppm)

6.46.56.66.76.86.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.08.18.28.38.48.58.68.78.88.99.09.19.2


Hc

Hb’

Hg

(NH2)Ha’

Hb

Hd

Hf

He

DMSO-d6

0.48

67

0.50

97

0.51

50

1.06

36

0.14

22

0.98

53

1.30

09

0.54

63

Inte

gral

8.67

538.

6336

8.46

028.

4251

8.22

338.

1816

7.71

657.

6967

7.67

927.

6397

7.55

19

7.04

29

6.88

936.

8476

(ppm)

6.46.56.66.76.86.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.08.18.28.38.48.58.68.78.88.99.09.19.2


Hc

Hb’

Hg

(NH2)Ha’

Hb

Hd

Hf

He

DMSO-d6

Figura 20B – Ampliação da região dos prótons aromáticos do espectro da Figura 20A.

50

Figura 20C – Espectro de 1H-RMN do imidazol (SBDS – AIST, 2007).

Ha

(7,73 ppm)

Hb

(7,13 ppm)

X H2O

�� CDCl3

Ha

(7,73 ppm)

Hb

(7,13 ppm)

X H2O

�� CDCl3

N NH2+

Hb' Hb'

Ha'

51

5.1.1 Caracterização fotofísica da 4-ANI-GLI 5.1.1.1 Caracterização por UV/vis As 4-ANI apresentam propriedades fotofísicas interessantes, como emissão de

fluorescência, exibindo comportamento diferente em diversos solventes. Como é típico em

transições de transferência de carga (CT), um aumento na polaridade do meio provoca

deslocamento batocrômico (SAHA,2002). A Figura 21 mostra os espectros de absorção UV/vis

da 4-ANI-GLI em diferentes solventes. Pode-se observar uma banda de absorção (ε máx = 9544 a

10272 M-1 cm-1 ) que não apresenta estrutura vibracional, com comprimento de onda de máxima

absorção (λmaxabs) variando de 408 nm a 430 nm e deslocamento batocrômico conforme a

polaridade do meio aumenta, indicando transição eletrônica do tipo CT. Os dados espectrais

estão resumidos na Tabela 2.

Figura 21 - Espectros de absorção UV/vis da 4-ANI-GLI 4x10-5 M em solventes de diferentes polaridades.

350 400 450 500 5500

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Abs

ortiv

idad

e M

olar

M-1. c

m-1


(___)clorofórmio(___)acetonitrila(___)água(___)etanol

52

Tabela 2. Dados espectrais para a 4-ANI-GLI em solventes de diferentes polaridades. Os respectivos parâmetros empíricos de polaridade de solvente ET(30) (REICHARDT,1994) são também apresentados. (a) solvente aprótico; (b) solvente prótico.

A Figura 22 mostra o efeito de pH sobre os espectros de absorção da 4-ANI-GLI em água.

Em pH 6,0 obtivemos o maior valor de ε , fato este que corresponde também ao melhor

rendimento quântico de fluorescência (vide seção 4.1.1.2). Os dados estão resumidos na Tabela 3.

Figura 22 - Espectros de absorção da 4-ANI-GLI em água em diferentes pH, em tampão triplo (5mM de acetato de sódio + 5mM tris(hidroxi-metil-aminometano) + 5mM de hidróxido de amônio) na concentração de 4 x 10-5 M;(....) pH 4,5; (__) pH 8,5; (----) pH 6,0.

Solvente

Et(30) λmaxabs nm ε M-1 cm-1 λmax

em nm ΦF

Clorofórmio (a) 39,1 408 9545 501 0,40 Acetonitrila(a) 45,6 418 9544 508 0,25

Etanol(b) 51,9 430 10272 517 0,24 Água (b) 63,1 428 9909 540 0,06

350 400 450 5000

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Abs

ortiv

idad

e M

olar

M-1.c

m-1


53

Tabela 3 – Rendimento quântico de fluorescência, λmaxabs

, λmaxem e absortividade molar da 4-ANI-GLI em

diferentes pHs.

5.1.1.2 Caracterização por espectroscopia de emissão

A Figura 23 mostra os espectros de fluorescência da 4-ANI-GLI que foram obtidos em

solventes de diferentes polaridades. Os λmaxem aumentam (deslocamento batocrômico) a medida

que a polaridade do solvente aumenta, variando de 500 a 538 nm. Os dados espectrais estão

resumidos na Tabela 2.

Figura 23- Espectros de emissão da 4-ANI-GLI 4x10-5 M em solventes de diferentes polaridades. Espectros normalizados de emissão, registrados após excitação de solução em 375 nm.

pH

λmaxabs

nm ε M-1 cm-1 λmax

em nm

ΦF

4,5 430 10188 538 0,0625 6,0 428 10334 538 0,0778 8,5 429 9889 538 0,0671

450 500 550 6000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Inte

nsid

ade

a.u.


Clorofórmio Acetonitrila Etanol Água

54

Pode-se observar que o efeito de solvente sobre os espectros de emissão é muito mais

pronunciado do que o observado com os espectros de absorção seguindo a ordem de polaridade

de acordo com o parâmetro empírico Et(30) (Tabela 2) introduzido por Reichardt (1994).

A Figura 24 mostra o efeito de pH sobre os espectros de emissão da 4-ANI-GLI. Observa-

se que mudanças de pH não alteram significativamente o comprimento de onda máximo de

emissão da 4-ANI-GLI. A intensidade de emissão, por outro lado, é sensível ao pH do meio,

aumentando de pH 4,5 para 6,0 e diminuindo novamente ao aumentar-se o pH para 8,5. Este

fenômeno pode ser explicado através dos estados de protonação da 4-ANI-GLI, de acordo com o

Figura 25. Os resultados obtidos sugerem que a forma “zwitteriônica” é mais emissiva que as

outras possivelmente devido à supressão pelo contra-íon nas formas aniônica e catiônica. Outros

autores observaram efeitos semelhantes com naftalimidas utilizadas como quimiosensores

(GUNNLAUGSSON,2003).

Figura 24 - Espectros de emissão da 4-ANI-GLI em água em diferentes pH, em tampão triplo (5mM de acetato de sódio + 5mM tris(hidroxi-metil-aminometano) + 5mM de hidróxido de amônio).

450 500 550 600 6500

10

20

30

40

50

60

70

Inte

nsid

ade


pH 4,5 pH 6,0 pH 8,5

55

Figura 25 – Estados de protonação da 4-ANI-GLI em água.

CH2COOH

NH3

N OO

Cl

H

H

H

H

NaCH2COO

NH3

N OO

CH2COO

NH2

N OO

-

-+

+

+ -

+

+

+

-

+

+

+

-

56

5.2 Acoplamento do citocromo c com a 4-ANI-GLI utilizando-se EDAC Procurou-se fazer o acoplamento em duas etapas, como mostrado nA Figura 26. Na

primeira etapa, reagiu-se a 4-ANI-GLI com EDAC, gerando um éster de isoaciluréia. Na segunda

etapa, adicionou-se a solução de citocromo c à mistura do éster de isoaciluréia. Tentou-se fazer o

acoplamento utilizando-se diferentes condições como resumido na Tabela 4 (vide seção 3.3.2

para maiores detalhes) . Deve-se considerar que no método A os três reagentes foram adicionados

juntos, já em B variou-se apenas o tampão. Todas as condições de B foram repetidas em C e

apenas o tempo de reação foi o dobro. No método D colocou-se EDAC e a 4-ANI-GLI para

reagir e após quinze minutos adicionou-se o citocromo c.

Figura 26 – Mecanismo de reação entre o citocromo c e a 4-ANI-GLI por acoplamento com EDAC.

Tabela 4 - Descrição sumarizada das condições empregadas na síntese pelo método por acoplamento com EDAC (MARGALIT,1973a b)

Método Cit c : 4-ANI-GLI: EDAC pH Tampão A 1:1:1 5 Ácido clorídrico B 1:200:165 (12 horas) 6 Fosfato de potássio 50 mM C 1:200:165 (24 horas) 6 Fosfato de potássio 50 mM D 1:20:10 6 Fosfato de potássio 50 mM

N

N

C

N

NH2

N OO

CH2COOH

H+ NH2

cyt c

NHcyt c

N

N

C

N

O

H

H

NH2

N

O

O

CH2C

O

N

N

C

N

H

H+

NH2

N OO

CH2CO

O

+ +

57

Os resultados por TLC (não mostrados) indicam que a imida não se ligou ao

citocromo c nativo. A Figura 27 mostra o espectro de absorção UV/vis com a banda Soret

inalterada, diferente dos espectros do citocromo c modificado preparado pelo método com

imidazol (vide seção 4.3.3) que apresenta um ombro característico da imida na região da banda

Soret. Se houvesse ocorrido o acoplamento seria esperado um espectro semelhante ao da solução

contendo uma mistura do citocromo c com a 4-ANI-GLI (linha verde na Figura 27)

Figura 27 – Espectro de absorção UV/vis do cit c nativo (linha preta), 4-ANI-GLI (linha vermelha), solução contendo cit c + 4-ANI-GLI (linha verde) e do produto isolado da reação de acoplamento de acordo com o método D (linha azul).

Alguns fatores devem ser considerados com relação ao insucesso da reação de

acoplamento com EDAC: a) o fato de a imida 4-ANI-GLI estar na forma de sal imidazólico pode

ter dificultado a reação uma vez que a EDAC reage com nucleófilos diversos; b) fosfatos reagem

também com EDAC, por isso o uso do referido tampão descrito na Tabela 4 implica em consumo

da carbodiimida. Diante do exposto verifica-se a possibilidade de sucesso a partir da eliminação

de tais problemas no desenvolvimento de trabalhos futuros.

300 350 400 450 500 550 600

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abs

orbâ

ncia


58

5.3 Síntese do CIT-ANI pelo método de imidazol fundido Devido a todas as tentativas de acoplar a imida ao citocromo c pelo método da

carbodiimida não apresentarem resultados satisfatórios decidiu-se pelo método com imidazol. As

reações de acoplamento em imidazol fundido foram realizadas utilizando duas condições

diferentes (Figura 28): excesso de anidrido 4-amino-1,8-naftálico (Método A) e na proporção

equimolar citocromo c : anidrido (Método B). Os produtos isolados nestas reações foram

designados como CIT-ANI-7 e CIT-ANI, respectivamente. Como controle aqueceu-se o

citocromo c em imidazol fundido nas mesmas condições utilizadas nas reações de acoplamento

com o objetivo de avaliar as alterações provocadas pelo tratamento.

Para evitar a degradação da proteína misturou-se primeiro o anidrido com o imidazol

sólido, aqueceu-se a mistura até a fusão do imidazol (PF = 90ºC) e só então adicionou-se o

citocromo c e o tempo de tratamento foi minimizado (no máximo 10 minutos). Após a reação

deixou-se esfriar a mistura e adicionou-se água para dissolver o produto, uma vez que esperava-

se que este fosse hidrossolúvel, já que tanto o citocromo c quanto as ANI são bastante solúveis

em água. Entretanto, observou-se que parte do sólido residual não se dissolveu, por isso

centrifugou-se a mistura e retirou-se o liquido sobrenadante para dar prosseguimento à

caracterização. O liquido sobrenadante foi então dialisado para remover o excesso de anidrido e o

imidazol. A diálise foi conduzida até que na solução externa não houvesse mais anidrido e

imidazol, monitorada por UV-VIS. O dialisado apresentou uma coloração vermelho-alaranjada

diferente das soluções originais de citocromo c e do anidrido e mostrou uma fluorescência

alaranjada quando examinada com uma lâmpada de UV (λ = 365 nm) em uma placa de TLC

(vide infra) sugerindo que a modificação deva ter ocorrido. O conteúdo do tubo de diálise foi

armazenado sem nenhum outro processamento e utilizado desta forma para a caracterização.

A presença de precipitado após a adição de água nos produtos da reação, tanto na

presença quanto na ausência do anidrido (controle), sugere a formação de oligômeros de

citocromo c induzida pelo imidazol fundido. Tentou-se dissolver este precipitado em vários

solventes (água em pH ácido e alcalino, DMF a quente, DMSO, SDS, etanol) sem sucesso.

Diante deste resultado decidiu-se desprezar o precipitado, seguindo a caracterização apenas com

o produto dialisado.

59

Figura 28 – Reação entre citocromo c nativo e anidrido 4-amino-1,8-naftálico em presença de imidazol fundido. Método A: cit c: anidrido (1:14) . Método B: cit c : anidrido (1:1). (a)Lys 22; (b)Lys 25; (c)Lys 27; (d)Lys 73; (e) Lys 72; (f) Lys 87; (g) Lys 88. As estruturas apresentadas para os produtos são apenas uma sugestão uma vez que não é possível determinar a estrutura exata com a nossa metodologia.

N

O

O

NH2

N

O

O

NH2

N OO

NH2

N

O

O

NH2

NO O

NH2

NO O

NH2

NO O

NH2 CIT-ANI-7

NH2

NH2

NH2

NO O

NH2

2HN

2HN

2HN

CIT-ANI

NH2

NH2

NH2

2HN

2HN

2HN

NH2

imidazol

90ºC

Cit c : anidrido (excesso)

1:14

Cit c : anidrido 1:1

Método A

Método B

O OO

NH2

+

(a) (b)

(c)

(d)(e)

(f) (g)

60

5.3.1 Caracterização do CIT-ANI pelo método do imidazol fundido O CIT-ANI-7 (Figura 28), ou seja, o produto obtido a partir da reação de citocromo c com

excesso de anidrido 4-amino-1,8-naftálico (AAN), apresentou alterações que permitiram a sua

caracterização por diversas técnicas, exceto por espectrometria de massa (MALDI-Toff), já que

não foi possível a ionização do mesmo após inúmeras tentativas. Por outro lado, o produto obtido

em proporções equimolares (CIT-ANI) (Figura 28), foi detectado por espectrometria de massa,

mas não pôde ser caracterizado pela maioria das outras técnicas. Por isso a maior parte dos

resultados apresentados a seguir referem-se ao CIT-ANI-7.

5.3.1.1 Caracterização por TLC

As reações foram monitoradas inicialmente por TLC (Figura 29) comparando-se o

comportamento do CIT-ANI-7 com o dos reagentes puros, utilizando etanol como eluente.

Nessas condições o citocromo c não sai da origem (Rf = 0), enquanto que o AAN se desloca com

Rf = 0,9, portanto há uma diferença significativa entre ambos, o que pode ser confirmado quando

se aplica os dois reagentes no mesmo ponto. A mancha do CIT-ANI-7 permaneceu na origem

(Rf=0) de forma semelhante ao observado com o cit c nativo, sugerindo se tratar de uma

macromolécula, mas diferentemente do citocromo c apresentou fluorescência sob irradiação UV

e uma coloração alaranjada (a cor da mancha do citocromo c é avermelhada). Nota-se a total

ausência do AAN na análise do dialisado. Todas essas observações constituem forte evidência do

sucesso da modificação.

61

Figura 29 - Resultados de cromatografia em camada delgada em sílica gel de citocromo c modificado pelo método de imidazol: (1) citocromo c nativo; (2) AAN; (3) AAN + citocromo c nativo; (4) CIT-ANI-7. Eluente: etanol.

62

5.3.1.2 Caracterização por UV/vis

O sucesso da modificação foi confirmado por espectroscopia de UV/vis no caso do CIT-

ANI-7 (Figura 30). O espectro UV/vis do citocromo c nativo é dominado pela banda Soret com

máxima intensidade em 409 nm. Já as 4-ANI apresentam uma banda larga centrada em cerca de

430 nm. O espectro do CIT-ANI-7 mostra claramente a presença da banda Soret e de um ombro

na região onde a imida absorve sugerindo que a imida ligou-se à proteína.

Figura 30 – Espectros UV/vis registrados para determinação da concentração do CIT-ANI em solução aquosa, após diálise, por comparação com mistura física. Imida-4-amino-1,8-naftálica – [ANIP] - 4,2 x 10-5M (linha cheia); citocromo c nativo 3,8 x 10-6M (linha tracejada); mistura física – [cit c nativo 3,8x10-6M + ANIP 3,8 x 10-5M] (linha pontilhada) e CIT-ANI-7 3,8 x 10-6M (linha traço-ponto); inserto destacando a banda de transferência de carga em 695 nm. O espectro do CIT-ANI-7 é bastante semelhante ao espectro de uma solução contendo o

cit c nativo e uma 4-ANI pura na proporção molar 1:7 (cit c : 4-ANI) sugerindo que o citocromo

foi modificado com cerca de 7 moléculas de imida, daí a denominação CIT-ANI-7. Em geral,

reações que envolvem modificações de proteínas resultam em uma distribuição de produtos com

populações de números diferentes de modificador (THEODORAKIS, 1995; THOMAS, 1975).

350 400 450 5000,0

0,2

0,4

0,6

Abs

orbâ

ncia

Comprimento de onda (nm)

550 600 650 700

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

660 670 680 690 7000,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

63

Presume-se a partir do exposto na Figura 30 que o produto com sete modificações seja o mais

populoso. Como foi visto na introdução, o cit c nativo apresenta 19 resíduos de lisina, com sete

deles mais expostos, sendo possível modifica-los por acetilação, o que esta de acordo com a

sugestão da estrutura mostrada na Figura 28 (SCOTT, 1996). O espectro do CIT-ANI, por outro

lado, não mostrou diferença significativa em relação ao espectro do cit c nativo devido ao baixo

grau de modificação.

A Figura 31 mostra as alterações do citocromo c nativo fundido em imidazol (controle

negativo). Estas diferenças são: desvio de 2 nm para o azul do pico da banda Soret (Figura 31 A)

e o desaparecimento da banda de transferência de carga (CT) em 695 nm (Figura 31 C), o que

indica a perda de coordenação da metionina-80 na sexta posição.

Figura 31 – Espectros UV/vis, normalizados, do citocromo c nativo (linha tracejada) e do citocromo c tratado com imidazol fundido (linha cheia). Figura 31 A: banda Soret; Figura 31 B: banda β e Figura 31 C: inserto destacando a banda de transferência de carga (695 nm).

350 400 4500,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

500 550 6000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Abs

orbâ

ncia

u.a


650 675 700 725 7500,04

0,06

0,08

A B C

64

5.3.1.3 Caracterização por fluorescência A Figura 32 mostra o espectro de emissão do CIT-ANI-7 em comparação com o da imida

4-ANI-GLI, utilizada como referência. Em ambos os espectros a concentração da imida foi

ajustada para 1 µM. Como o citocromo c nativo não apresenta fluorescência, o simples fato de o

CIT-ANI-7 apresentar um espectro de emissão semelhante ao da 4-ANI-GLI é mais uma prova

do sucesso da modificação. Nota-se um deslocamento para o vermelho do λmaxem no caso do CIT-

ANI-7, o que sugere que as moléculas de imida em média estão em um ambiente mais polar do

que a água quando incorporadas à proteína. O CIT-ANI, por outro lado, não apresentou

fluorescência detectável, devido ao baixo grau de modificação.

Pode-se observar na Figura 32 que a intensidade de fluorescência da imida é reduzida no

CIT-ANI-7 em comparação com a imida livre (os espectros foram registrados nas mesmas

condições), o que pode ser explicado pelo efeito supressor do ferro hemínico da proteína ligada

covalentemente à imida. Para avaliar o efeito supressor do grupo heme, realizaram-se

experimentos de supressão de fluorescência adicionando-se citocromo c nativo como supressor

externo à uma solução aquosa contendo 1 µM de 4-ANI-GLI (Figura 33A). Como visto na Figura

32, é necessário adicionar 12 µM de citocromo c nativo para que a solução 1 µM de 4-ANI-GLI

tenha a mesma fluorescência do que a solução de CIT-ANI-7 0,14 µM (contendo, portanto, 1 µM

de imida). Pode-se concluir que o citocromo c, quando ligado covalentemente à imida, agindo

como um supressor interno, apresenta uma eficiência de supressão cerca de duas ordens de

grandeza maior do que quando adicionado externamente à uma solução da imida livre. A

supressão neste caso é provavelmente devida à “quenching” estático.

A Figura 33A mostra o efeito da adição de alíquotas sucessivas de citocromo c nativo á

solução 1 µM de 4-ANI-GLI. Pode-se observar que a fluorescência da imida é totalmente

suprimida quando a [cit c] é cerca de 1 x 10-4 M. O gráfico de Stern-Volmer correspondente é

mostrado na Figura 33B. Uma alta constante de supressão (Ksv ≈ 1 x 106 M-1) pode ser observada.

65

Figura 32 - Espectros de emissão do CIT-ANI-7 e da 4-ANI-GLI 1x 10-6 M em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0. O comprimento de onda de excitação foi 430 nm para os três espectros: (_____)[CIT-ANI-7] = 0,14 micromolar; (----) citocromo c nativo 12 x 10-6 M + 4-ANI-GLI 1 x 10-6 M ; (_ . _) 4-ANI-GLI 1 x 10-6 M.

Figura 33 - A - Efeito do citocromo c no espectro de emissão da 4-ANI-GLI: citocromo c nativo em adições sucessivas e a imida controle (4-ANI-GLI) 1µM em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0. B – Gráfico de Stern-Volmer para a supressão de emissão de fluorescência da 4-ANI-GLI pelo citocromo c em tampão fosfato de potássio pH 6,0. [4-ANI-GLI] = 10-6 M; excitação = 430 nm; emissão = 435 nm. Regressão linear: y = 1,02 x + 0,065; coeficiente de correlação (r) = 0,999.

450 500 550 600 650 7000

100

200

300

400

500

600

700

800

Inte

nsid

ade

comprimento de onda (nm)

1 x 10-6

100 x 10-6

0 1 2 3 4 5 6 7 81,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

I 0/I

[cit c] 10-6 M

A B

450 500 550 600 650 7000

100

200

300

400

500

600

700

800

Inte

nsid

ade

comprimento de onda (nm)

CIT-ANI-7 [cit c 12 x 10-6M +ANI1x10-6M] 4-ANI-GLI 1 x 10-6M

66

5.3.1.4 Caracterização por Infravermelho (IR)

A Figura 34 mostra espectros de IR do citocromo c nativo, da ANIP, uma 4-ANI utilizada

como referência (vide estrutura na Figura 6), e dos citocromos modificados CIT-ANI e CIT-ANI-

7. O espectro do citocromo c nativo é dominado por duas bandas intensas em 1542 e 1653 cm-1.

Estas bandas, que são características de proteínas, são denominadas amida II e amida I,

respectivamente. Já o espectro da ANIP apresenta três bandas proeminentes em 1583, 1644 e

1687 cm-1, que podem ser atribuídas ao estiramento dos grupos carbonila (-C=O) da imida

aromática. Os espectros dos citocromos modificados CIT-ANI e CIT-ANI-7, por outro lado,

mostram bandas provenientes tanto da proteína como da imida, o que constitui mais uma

evidência de que as modificações ocorreram. Apesar de os espectros de CIT-ANI e CIT-ANI-7

serem dominados pelas bandas amida II e amida I da proteína (linhas pontilhadas em vermelho),

pode-se observar também as bandas de 4-ANI sobrepostas a estas (linhas pontilhadas em azul),

em especial a banda em 1583 cm-1, a qual é mais visível por estar situada entre as bandas da

proteína. Além disso, a intensidade relativa das bandas de absorção de 4-ANI em CIT-ANI e

CIT-ANI-7 correspondem ao esperado conforme o grau de modificação dos mesmos, sendo mais

intensas em CIT-ANI-7 do que em CIT-ANI.

Figura 34- Espectros de IR (infravermelho) em ATR – A: (azul) citocromo c nativo; (verde) ANIP (ester dietílico);

(vermelho) CIT-ANI; (preto) CIT-ANI-7. Espectros em escala original. B: (a) citocromo c nativo; (b) ANIP (ester

dietílico); (c)CIT-ANI; (d) CIT-ANI-7. Os espectros foram redimensionados para melhor visualização.

1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450

60

70

80

90

100

110

% T

rans

mitâ

ncia

cm-1

1900 1850 1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450 1400

d

153215791651

1655

Tra

nsm

itânc

ia

Número de onda (cm-1)

c

15411570

1644

b

1583

1687

1900 1850 1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450 1400

a

1542

1653

A B

67

5.3.1.5 Caracterização por Dicroísmo Circular

A Figura 35 mostra significativas mudanças espectrais entre o citocromo c nativo, o

citocromo c modificado por imida (CIT-ANI-7 e CIT-ANI) e o citocromo c tratado em imidazol

fundido (controle negativo). A diminuição da banda negativa no CIT-ANI e o desaparecimento

dessa mesma banda no CIT-ANI-7 e no citocromo c em imidazol fundido sugere afastamento do

sexto ligante do ferro hemínico, ou seja, existe a possibilidade do imidazol ter alterado a

coordenação da metionina 80, tornando o citocromo c mais simétrico devido a presença do grupo

imidazol da histidina próxima à cavidade heme (LIU,1997).

Figura 35 - Espectros no visível por CD de citocromo c tratado com imidazol fundido 20 µM (.....), CIT-ANI-7 20 µM (_____), CIT-ANI 20 µM (----), citocromo c nativo 20mM (-.-.-.).

O citocromo c nativo apresenta em sua estrutura 40% de α-hélice e 9% de folhas-β

indicadas no espectro mostrado na Figura 36 pela banda positiva em 190 nm e a banda negativa

em 222 nm. A diminuição destas bandas mostra perda da estrutura em α-hélice.

360 380 400 420 440-2

-1

0

1

2

3

4

θ M

olar

(gr

au.d

mol

-1.c

m2 )


68

190 200 210 220 230 240 250-60

-40

-20

0

20

40

60

[θ

] (gr

au.d

mol

-1.c

m2 )


Figura 36 - Espectros por CD em alfa-hélice de citocromo c nativo 20 µM ( ____ ), citocromo c nativo em imidazol

fundido 20 µM (-----) e CIT-ANI-7 20 µM (-..-..-).

69

5.3.1.6 Caracterização por espectrometria de massas

O espectro de massa do citocromo c nativo (MALDI-ToF) apresenta basicamente um pico

referente ao íon molecular com massa de 12384 Da (Figura 37A). A escolha dessa técnica para

caracterização do CIT-ANI-7 e do CIT-ANI deve-se ao fato de ser possível identificar alterações

de massa a partir da formação dos fragmentos ionizados. Trata-se de uma técnica qualitativa,

onde a amostra pode ou não ser ionizada em decorrência de mudanças em sua estrutura

(ALTERMAN, 2004).

As amostras (CIT-ANI-7 e CIT-ANI) foram diluídas, em uma faixa de concentração de 10

a 20 µM, na matriz de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico em solução saturada de acetonitrila

e ácido trifluoroacético e submetidas a uma voltagem de 20 kV. A amostra de CIT-ANI-7 não

ionizou, fato este que impossibilitou uma análise mais detalhada de suas modificações.

Entretanto, esse fato está de acordo com os resultados encontrados, inicialmente, com a formação

de partículas insolúveis, logo após o tratamento e com o perfil eletroforético (Figura 38).

Figura 37 – A: Espectro de Massa– MALDI ToFF MS– do citocromo c nativo; B: Espectro de massa CIT-ANI.

O espectro de massa do CIT-ANI (Figura 37B) mostra três séries de picos com massa

maior do que o cit c nativo. A diferença de massa entre as séries é de exatamente 195 Da, que é a

massa esperada do modificador, o qual é uma molécula de AAN (PM = 213) que perdeu uma

molécula de água ao se condensar com o grupo –NH2 de uma lisina para formar a imida.

Presume-se, portanto, que as séries correspondem ao citocromo c modificado com uma (picos a-

12300 12400 12500 126000

500

1000

1500

2000

inte

nsid

ade

m/z

citocromo c nativo

12400 12600 12800 13000

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

B

∆=195 Da

(j)

(i)

(h)(g)

(f)(e)

(d)

(c)(b)

(a)

Inte

nsid

ade

massa/carga

A

70

e), duas (picos f-j) e três moléculas de 4-ANI, sendo a população com uma única modificação a

mais importante. Além do espaçamento de 195 Da entre as séries, observa-se dentro de cada série

um espaçamento de 28 Da, o que pode indicar a incorporação de número variável de um segundo

fragmento à proteína (a massa deste fragmento é compatível com um grupo etila). Até o presente

momento não foi possível estabelecer a origem deste segundo fragmento.

4.3.1.7 Caracterização por eletroforese

O perfil eletroforético do CIT-ANI-7 foi comparado: a) com o padrão (1) na faixa de

14400 Da a 97000 Da de massa e b) com o citocromo c nativo em duas concentrações (2) 5µM e

(3) 10 µM. Nota-se a presença de uma banda intensa no CIT-ANI-7 (4, 5, 6 e 7) coincidindo com

a banda do citocromo c nativo que está abaixo da banda de 14400 Da do padrão. Este fato sugere

a presença de moléculas de CIT-ANI-7 com variadas modificações ou até mesmo de moléculas

de citocromo c em sua forma nativa. Entretanto, outras bandas situadas logo acima da banda

14400 Da indica um acréscimo de massa da ordem de 2016 Da (padrão – citocromo c nativo) que

corresponderiam a 10 ou 11 modificações (massa do modificador = 195 Da). Outra banda de

menor intensidade pode ser vista na Figura 25 indicando haver a possibilidade de ter um outro

grupo de moléculas de CIT-ANI com um número ainda maior de modificações, ou formação de

oligômeros.

Figura 38 – Perfil eletroforético do citocromo c modificado (CIT-ANI): 1 – Padrão Low Range 14400 – 97000 Da; 2 – cit c nativo 10 µM; 3- cit c nativo 5 µM; 4 e 6 – CIT-ANI-7 10 µM; 5 e 7 - CIT-ANI-7 5 µM.

1 2 3 4 5 6 7

Cit c nativo

10 µµµµM 5 µµµµM 10 µµµµM 5 µµµµM

10 µµµµM 5 µµµµM

Padrão

71

5.3.1.8 Reatividade do CIT-ANI-7

O citocromo c apresenta atividade catalítica sobre peróxidos e compostos carbonílicos. As

modificações do citocromo c podem ser acompanhadas por espectroscopia UV/vis em função das

alterações de intensidade e absorbância máxima, principalmente na região da banda Soret e da

banda de transferência de carga em 695 nm, a partir de sua reatividade com substâncias como

DPAA (difenilacetaldeído), t-Bu-OOH (t-butil-hidroperóxido). Portanto, os resultados a seguir

demonstram a atividade oxidante do CIT-ANI-7 em comparação ao citocromo c nativo.

4.3.1.8.1 Estudo da reatividade do CIT-ANI-7 com DPAA Conforme descrito na introdução, a reação do citocromo c com DPAA depende de sua

estrutura protéica que pode ser modulada por associações com bicamadas lipídicas e sofrer

efeitos decorrentes de mudanças do pH do meio em que se encontra. A Figura 39 mostra a

alteração espectral do citocromo c nativo comparada à do CIT-ANI-7.

Figura 39 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25mM pH7 com adição de DPAA 0,2 mM em etanol. Cit c nat - tempo zero (linha tracejada); cit c nat – tempo 1800s (linha cheia); CIT-ANI-7 – tempo zero (linha traço ponto) e CIT-ANI-7 – tempo 1800s (linha pontilhada).

300 350 400 450 5000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Abs

orbâ

ncia


500 550 600 650

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

72

Figura 40 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão hidróxido de amônio pH10 com adição de DPAA 0,2 mM em etanol. Cit c nat - tempo zero (linha tracejada); cit c nat – tempo 1800s (linha cheia); CIT-ANI-7 – tempo zero (linha traço ponto) e CIT-ANI-7 – tempo 1800s (linha pontilhada)

A reação entre o citocromo c nativo e o DPAA é favorecida em pH alcalino devido a

desprotonação do resíduo de tirosina próximo do heme que facilita a redução. A Figura 40 mostra

o espectro do citocromo c nativo comparado aos do CIT-ANI-7 no inicio da reação e após 1800

s. Observa-se uma alteração significativa do espectro do citocromo c nativo, típica da redução do

ferro hemínico, enquanto que o CIT-ANI-7 permanece praticamente inalterado.

300 350 400 450 5000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Abs

orbâ

ncia


cit c nat t=1800s cit c nat t=0s citim t=1800 s citim t = 0 s

500 550 600 650

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

73

5.3.1.8.2 Estudo da reatividade do CIT-ANI-7 com t-BuOOH

A Figuras 41 e 42 mostram o citocromo c nativo, utilizado como controle, apresentando

“bleaching”da banda Soret, devido a mudanças em seu potencial de redução, enquanto que o

CIT-ANI-7 não apresenta alterações estruturais significativas, tanto em pH 7,4 quanto em pH 10.

Figura 41 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mM pH7,4 com adição de t-BuOOH 2 mM. Cit c nat - tempo zero (linha cheia); cit c nat – tempo 1800s (linha tracejada); CIT-ANI-7 – tempo zero (linha pontilhada) e CIT-ANI-7 – tempo 1800s (linha traço ponto)

300 350 400 450 5000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

abso

rbân

cia


cit c nat t=0s cit c nat t=1800 s citim t=0 citim t=1800s

500 550 600 650

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

74

Figura 42 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mM pH10 com adição de t-BuOOH 2 mM. Cit c nat - tempo zero (linha cheia); cit c nativo – tempo 1800s (linha pontilhada); CIT-ANI-7 – tempo zero (linha traço ponto) e CIT-ANI-7 – tempo 1800s (linha tracejada)

300 350 400 450 5000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5A

bsor

bânc

ia


citim t=0 citim t=1800s cit c nat t=0s cit c nat t=1800 s

500 550 600 650

75

6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES

- A tentativa de sintetizar o CIT-ANI através dos métodos por acoplamento com

EDAC, sonicação e microondas não obteve o sucesso desejado.

- O método por imidazol fundido mostrou ser o mais eficaz, sendo possível caracterizar

o CIT-ANI-7 por diferentes técnicas.

- O CIT-ANI mostrou evidentes alterações por espectrometria de massa e por

infravermelho mostrando a presença da imida no citocromo c.

- As mudanças espectrais observadas por UV/vis e CD mostram possíveis alterações

na estrutura secundária do CIT-ANI-7 e CIT-ANI.

- Experimentos envolvendo a ativação de caspase , a fim de avaliar o potencial do CIT-

ANI-7 (e do CIT-ANI), como fator apoptótico, estão em desenvolvimento.

76

REFERÊNCIAS

ALTERMAN, M. A. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry-based amino acid analysis. Analytical Biochemistry, v. 335, pp. 184-191, 2004. ALEXIOU, M.S. The UV-Visible Absorption and Fluorescence of some Substituted 1,8-Naphthalimides and Naphthalic Anhydrides. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1990. BANCI, L. Effects of extrinsic imidazole ligation on the molecular and electronic structure of cytochrome c. J. Biol. Inorg. Chem.,v. 6: pp.628-637, 2001. BARROS, T.C. Preparação e Caracterização de N- alquilnaftalimidas.Tese de Doutorado,Universidade de São Paulo,1996. BRAUTIGAN, D. L. Definition of Cytochrome c Binding Domains by Chemical Modification. The Journal of Biological Chemitry, vol.253 (1)pp.130-139;(1)pp.140-148, 1978. BROCHSZTAIN, Sergio; POLITI, Mario José. Solubilization of 1,4,5,8-Naphthalenediimides and 1,8-Naphthalimides through the formation of novel host - guest complexes with α-cyclodextrin. Langmuir, 15, pp. 4486-4494, 1999. CADEIA RESPIRATÓRIA. Disponível em: < www.fundamentodebioquimica.hpg.ig.com.br/Cadeia_respiratoria.html> Acesso em: 11 de jan. de 2007. CAI J. Mitochondrial control of apoptosis: the role of cytochrome c. Biochim. Biophys. Acta, vol 1366, pp. 139-149, 1998. CAMPOS, I. Photochemical reduction of cytochrome c by 1,4,5,8-naphthalenediimide radical anion. Photochemistry and Photobiology, 2004 . CECHINEL, Valdir Filho. Aspectos químicos e potencial terapeutico de imidas cíclicas: uma revisão da literatura. Química Nova, vol. 26, nº 2, São Paulo, 2003. CERM. Espectros de absorção UV/vis do citocromo c. Disponível em: <http://www.cerm.unifi.it/CHBIOIN/lez5a.htm> Acesso em: 07 de ago. de 2007). COSNARD, Frédéric, WINTGENS, Véronique. A New Fluoroionophore Derived from 4-Amino-N-Methyl-1,8-Naphthalimide. Tetrahedron Letters, vol. 30, p.p. 2751-2754, 1998. ESTEVAM, Mauren Luciana. Changes in the spin and Reactivity of Cytochrome c Induced by Photochemically generated singlet oxygen and Free Radicals. The Journal of Biological Chemistry, 2004. FRAGOSO, Alex. Immobilization of Adamantane Modified Cytochrome c at Electrode Surfaces through Supramolecular Interactions. Langmuir, 18, 5051-5054, 2002.

77

FURTADO, K.M. F. Caracterização de Novos Materiais à Base de Imidas Aromáticas. Dissertação de Mestrado, Universidade de Mogi das Cruzes,,UMC,2005. GRABCHEV, Ivo, STANEVA, Desislava. Photophysical Properties of new Polymerizable 1,8-Naphtalimides and their Copolymers with Methylmethacrylate. Z. Naturfosch, vol. 58a, pp. 558-562, 2003. GUNNLAUGSSON, Thorfinnur. Towards the development of controllable and reversible ‘on-off’ luminescence switching in soft-matter: synthesis and spectroscopic investigation of 1,8-naphthalimide-based PET (photoinduced electron transfer) chemosensors for pH in water-permeable hydrogels. ARKIVOC, vol. II, pp. 216-228, 2003. KAWAI, Cintia. pH-Dependent interaction of cytochrome c with mitochondrial mimetic membranes: the role of an array of positively charged amino acids. J. Bio. Chem., vol. 280, nº 41, pp. 34709-34717, 2005. KEILIN, D. The history of cell respiration and cytochrome. Cambridge University Press, London, 1966. LEHNINGER, Tradução: Nelson, David L., Cox, Michael M. Princípios de Bioquímica. Sarvier, 4ª edição, 2006. LIU, Gaohua. Structural studies of imidazole-cytochrome c: resonance assignments and structural comparison with cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta, 1277, pp. 61-82, 1996. LIU, Gaohua. The effects of imidazole binding on the conformation of cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta, 1338, pp. 199-206, 1997. MARGALIT, Rimona, Schejter, Abel. Cytochrome c: A Thermodynamic Study of the Relationships among, Oxidation State, Ion-binding and Structural Parameters. Eur.J.Biochem., 32, pp492-499, 1973a. MARGALIT, Rimona, Schejter, Abel. Cytochrome c: A Thermodynamic Study of the Relationships among, Oxidation State, Ion-binding and Structural Parameters. Eur.J.Biochem., 32, pp500-505, 1973b. MARZZOCO, Anita, TORRES, Bayardo Baptista. Bioquímica Básica. Guanabara Koogan, 2ªedição, 1999. MILLER-FERGUSON, S. Definition of Cytochrome c Binding Domains by Chemical Modification. The Journal of Biological Chemistry, vol.253 (1)pp.149-159, 1978. MOORE, G.R., Williams, R.J.P. The Stability of Ferricytochrome c. Eur. J. Biochem, 103, 523-532, 1980.

78

MUGNOL, Katia Cristina Ugolini. Caracterização Espectroscópica de Citocromo c Baixo Spin com Baixo Grau de Rombicidade Através de Uso de Micelas Reversas de AOT/Hexano e Micelas Aquosas de SDS. Dissertação de Mestrado, Universidade de Mogi das Cruzes, UMC, 2004. NANTES, Iseli Lourenço. Modifications in heme iron free and vesicle bound cytochrome c by tert-butyl hydroperoxide: a magnetic circular dichroism and electron paramagnetic resonance investigation. Free Radical Biology & Medicine, vol. 28 nº 5, pp. 786-796, 2001. OLEINICK, N.L. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem. Photobiol. Sci., vol. 1, pp. 1-21, 2002. OSHEROFF, Neil. Mapping of anion binding sites on cytochrome c by differential chemical modification of lysine residues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, 8, pp-4439-4443, 1980. PESCE, J. A. Fluorescence Spectroscopy – An Introduction for biology and medicine. New York: Marcel Dekker Inc., 1971. POTEAU, X. Fluorescence switching in 4-amino-1,8-naphtalimides: “on-off-on” operation controlled by solvent and cations. Dyes and Pigments, vol 47, pp.91-105, 2000. PRIETO, Tatiana. Microperoxidases associadas a micelas de CTAB: Uma lipoenzima com atividade de peroxidase. Dissertação de Mestrado, Universidade de Mogi das Cruzes, UMC, 2004. QU, Da-Hui. A [3]Rotaxane with Three Stable States That Responds to Multiple-Inputs and Displays Dual Fluorescence Addresses. Chem. Eur. J., vol. 11, pp. 5929-5937, 2005. REICHARDT, Christian. Solvatochromic Dyes as Solvent Polarity Indicators. Chem. Rev., 94, 2319-2358, 1994. RINALDI, Tatiana Alvarez. Comparação entre a estrutura e a reatividade de citocromo c nativo e holocitocromo c não covalentemente ligado ao grupo heme. Dissertação de Mestrado, Universidade de Mogi das Cruzes, UMC, 2004. | RODRIGUES, M.A. pH-dependent Excited-State Properties of N,N’- di(2-phosphonoethyl)-1,4,5,8-naphthalenediimide. Photochemistry and Photobiology, vol. 70(1), 1999. SAHA, Satyen, SAMANTA, Anunay. Influence of the Structure of the Amino Group and Polarity of the medium on the Photophysical Behavior of 4-Amino-1,8-naphthalimide Derivatives. J. Phys. Chem. A., vol. 106, pp. 4763-4771, 2002. SBDS-AIST. Espectro de 1H-RMN do imidazol – Disponível em: <http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi?lang=eng> - Acesso em: 07 de ago. de 2007; SBDS - Spectral Database for Organic Compounds - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Japan. SCHEJTER, Abel; PLOTKIN, Batya. The binding characteristics of the cytochrome c iron. Biochem. J., 255, pp. 353-356, 1988.

79

SCOTT, R.A., Mauk, A. Grant. Cytochrome c – A multidisciplinary approach, University Science Books. Chapters 4, 5 e 17, Califórnia: USA, 1996. SKULACHEV, V.P. Cytochrome c in apoptotic and antioxidant cascades. FEBS Letters, pp.275-280, 1998. SIGMA-ALDRICH, Catálogo, Protein Analysis/Proteomics, p.811.Disponível em: www.sigma-aldrich.com. Acesso em: 20 de mar. De 2006. STEWART, W. W. Lucifer dyes-higly fluorescent dyes for biological tracing. Nature, Vol.292, pp17-21, 1981. THEODORAKIS, J.L. β-Thiopropionyl cytochrome c modified at lysil residues: preparation and characterization of the monosubstituted horse cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta, 1252, pp. 114-125, 1995. THEODORAKIS, J. A chemical modification of cytochrome c lysines leading to changes in heme iron ligation. Biochimica et Biophysica Acta, 1252, pp. 103-113, 1995. THOMAS, J.A. Fluorescein conjugates of cytochrome c as internal pH probes in submitochondrial particles. Biochemical and Biophysical Research Communications,1975. UFMT. Respiração aeróbia a partir da glicose. Disponível em: <http://www.ufmt.br/bionet/conteudos/01.01.05/Respir1.jpg> Acesso em: 07 de ago. de 2007. VOET, D. Fundamentos de Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 1995. WEIZMANN. Seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico. Disponível em: <http://www.weizmann.ac.il/home/ligivol/apoptosis_project/apoptosis.jpg>. Acesso em: 20 de mar. de 2007. WOODS, J. Protein crosslinking by 1,8-naphthalimides: influence of the 4-substituent. Arkivoc, vol. XIII, pp. 109-118, 2003. YIN, S. Eletroluminescent properties of naphthalimide derivative thin film devices. Thin Solid Films, vol. 325, pp. 268-270, 1998. ZUCCHI, M.R. Existência de diferentes estados de spins dos íons Fe2+ e Fe3+ do citocromo c resultantes da interação com lipossomos modelos. São Carlos, 2001.

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