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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA DENYSE CAVALCANTE LAGO Genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento do ovário de abelhas Apis mellifera Ribeirão Preto - SP 2016
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DENYSE CAVALCANTE LAGO
Genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento do ovário de abelhas Apis
mellifera
Ribeirão Preto - SP
2016
Versão corrigida. A versão original encontra-se disponível tanto na Biblioteca da Unidade que
aloja o Programa, quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP (BDTD)
DENYSE CAVALCANTE LAGO
Genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento do ovário de abelhas Apis
mellifera
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências,
área de concentração em Genética.
Orientador: Prof. Dr. Klaus Hartmann Hartfelder
Ribeirão Preto – SP
2016
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Lago, Denyse Cavalcante
Genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento do ovário de
abelhas Apis Mellifera / Denyse Cavalcante Lago; orientador: Prof. Dr. Klaus
Hartmann Hartfelder. - Ribeirão Preto, 2016.
76p; 30cm
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências, área
de concentração em Genética – USP/ FMRP/ Departamento de Genética.
1- Diferenciação de castas; 2- Ovário; 3- Expressão gênica diferencial; 4 –
Biologia do Desenvolvimento.
Nome: Lago, Denyse Cavalcante
Título: Genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento do ovário de abelhas
Apis mellifera
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Ciências, área de
concentração em Genética
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ___________________________________ Instituição________________________
Julgamento: ________________________________ Assinatura: _______________________
Prof. Dr. ___________________________________ Instituição________________________
Julgamento: ________________________________ Assinatura: _______________________
Prof. Dr. ___________________________________ Instituição _______________________
Julgamento:_________________________________Assinatura: ______________________
Aos meus pais, que mesmo distantes estão presentes em todas as
minhas decisões e me dão força para continuar.
AGRADECIMENTOS
- Ao meu orientador, Prof. Dr. Klaus Hartfelder, pela confiança em meu trabalho, paciência,
aprendizado e orientação. É uma honra poder trabalhar ao seu lado, aprendendo cada vez
mais.
- Aos meus pais, que mesmo distante apoiam cada decisão e me dão suporte e força para
continuar. Tudo que conquistei até hoje, é em resultado ao seu amor, compreensão, carinho e
paciência. Amo vocês.
- Aos colegas de laboratório, Carlos Jr., Gustavo, Karina, Mário, Giovanna, Amanda, Roseli e
Douglas pela convivência agradável, pelos almoços e gargalhadas de todos os dias. Muito
obrigada por serem minha família e me fornecerem o apoio profissional e emocional durante
essa jornada;
- À técnica do laboratório Roseli, pelo carinho, atenção e palavras de conforto em momentos
de desespero;
- Em especial à pós-doutoranda Karina, que merece um agradecimento à parte, por “salvar”
minha vida e meu projeto inúmeras vezes em dois anos. Por trazer alegria e alto astral para o
laboratório. Muito Obrigada my darling!!
- Ao meu amigo Carlos Jr. por todas as dicas, ajuda e apoio, não só nas clonagens, mas em
todas as etapas deste trabalho, aguentando cada desespero e cada chuva de lágrimas. Muito
Obrigada meu anjo!
- À todos os funcionários e alunos do departamento de Biologia Celular e Molecular, que me
acolheram durante esse tempo, sempre dispostos a ajudar e esclarecer questões fundamentais
para elaboração deste trabalho;
- Àos funcionários e alunos do departamento de Genética, pela ajuda e companhia em todos
os eventos e disciplinas;
- À todos do laboratório Laboratório de Biologia de Desenvolvimento de Abelhas (LBDA),
que sempre disponibilizam toda ajuda teórica e prática para desenvolvimento de
experimentos;
- Ao técnico de apiário, Luíz, pela ajuda com todo material biológico tão necessário para o
desenvolvimento deste projeto de mestrado;
- Aos amigos da pós-graduação, em especial: Camila, Felipe, Maria Luíza, Paula, Mariana,
Cibele, Estela, Frank, Johnny, Julianne, Amanda e Lucas. Por toda força, apoio, paciência e
horas de copinha dedicadas à minha sanidade mental;
- Em especial à minha amiga Camila, que esteve torcendo por mim desde que nos
conhecemos num curso de verão. Obrigada por permanecer ao meu lado em todas as minhas
boas e más escolhas, me acolhendo em seus braços, me dando conselhos, se preocupando e
me puxando minha orelha quando necessário. Obrigada por tudo.
- Aos amigos da academia, Giovana, Vinícius e Gabriela, que muitas vezes me escutaram
falar da pós-graduação e me fizeram respirar fundo e relaxar através de exercícios;
- Ao Dr. Eduardo Luís Bin, que conseguiu manter sob controle a minha gastrite durante esses
anos de stress intenso;
- À minha família, que sempre acreditou em mim e nos meus objetivos;
- Àos meus amigos distantes, que não caberia citar aqui, que hoje estão distribuídos pelo
Brasil e mundo a fora, mas que mesmo longe continuam presentes na minha vida, acreditando
em cada passo meu e aguardando ansiosamente cada visita;
- À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte
financeiro referente ao processo nº2014/08147-3, com vigência de 01/08/2014 a 31/01/2016;
- À Deus.
Muito obrigada a todos!!
RESUMO
LAGO, D. C. Genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento do ovário de
abelhas Apis mellifera. 2016. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, 2016.
A alimentação diferencial durante o desenvolvimento das abelhas Apis mellifera
desencadeia respostas endógenas em vias de sinalização e sistema endócrino, que promovem
o desenvolvimento de fenótipos alternativos nas castas femininas. Rainhas e operárias diferem
em sua fisiologia, morfologia, longevidade, função na colônia, comportamento, e
principalmente, na ativação do sistema reprodutivo. Em relação aos ovários, resultados
prévios baseados em ensaios de microarranjos revelaram um conjunto de genes como
diferencialmente expressos (DEGs) em larvas de rainhas e operárias. Esse trabalho teve como
objetivo analisar os padrões de expressão desses DEGs em mais detalhe em ovários larvais de
rainhas e operárias. Com esse objetivo, foram selecionados 18 DEGs para validação por RT-
qPCR. Estas análises foram realizadas em ovários dissecados de rainhas e operárias em quatro
estágios larvais que representam fases críticas no desenvolvimento ovariano (L4, L5F1, L5F2
e L5F3). Dentre os 18 DEGs candidatos, 11 foram confirmados como de fato
diferencialmente expressos. Entre esses, quatro genes que codificam enzimas: short chain
dehydrogenase reductase (GB54419), 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737),
SCPEP1-like gene (GB11273) e glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902), exibiram
um pico de expressão em L5F1 em ovários de operárias. Dentre os dois genes relacionados à
estocagem ou transporte de proteínas, o gene apolipoprotein III (GB20117) encontrou-se mais
expresso em operárias enquanto que hexamerin 70b (GB10869) se mostrou superexpresso em
ovários de rainhas. Os genes relacionados à tradução de mRNA e vias de sinalização:
elongation factor 1α (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90
(GB40976) e mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) estavam significativamente
superexpressos em ovários de rainhas. O gene OCLP-1 (GB19297), que possui uma função
hipotética como inibidor de cistina foi encontrado como superexpresso em ovários de
operárias. A fim de avaliar a modulação desses genes por hormônio juvenil, foi realizado o
tratamento in vivo de larvas de operárias com aplicação tópica do hormônio. Após seis horas
de tratamento, os ovários foram dissecados e as amostras analisadas por RT-qPCR. Dos onze
DEGs testados para resposta a HJ, seis se mostraram significativamente modulados pelo
hormônio Dois genes, short chain dehydrogenase reductase e heat shock protein 90, que
também respondem a ecdisona, são up-regulados por HJ, enquanto os genes OCLP-1,
hexamerin 70b, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase e apolipoprotein III eram down-
regulados. A expressão diferencial desses genes que codificam enzimas, proteínas de
transporte/estocagem e fatores de vias de sinalização, indica que estes genes são importantes
no desenvolvimento casta-especifíco dos ovários, uma vez que sua expressão está fortemente
modulada durante os estágios em que ocorre a morte celular programada em ovários de
operárias.
Palavras-chave: Apis mellifera, Expressão gênica, Ovário larval, Desenvolvimento, RT-
qPCR.
ABSTRACT
LAGO, D. C. Genes differently expressed during ovary development in the bee, Apis
mellifera. 2016. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, 2016.
Differential feeding during larval development of the honey bee (Apis mellifera)
triggers endogenous responses in signaling pathways and the endocrine system which
promote the development of alternative phenotypes in the female castes. Queens and workers
differ in physiology, morphology, longevity, function in the colony, behavior, and, especially
so, the activation of the reproductive system. Concerning the ovaries, previous results based
on microarray assays revealed a set of differentially expressed genes (DEGs) in queen and
worker larvae.This project now aimed to further analyze the expression patterns of DEGs in
the ovaries of larval workers and queens. From the microarray assays we selected a set of 18
DEGs for validation by qPCR. These analyses were performed on ovaries dissected from
queens and workers of four larval stages representing critical phases of ovary development
(L4, L5F1, L5F2, L5F3). Among the 18 DEG candidates, 11 were confirmed as differentially
expressed. Four genes that code for enzymes: a short chain dehydrogenase reductase
(GB54419), a 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), an SCPEP1-like gene
(GB11273) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902) exhibited an expression
peak at L5F1 in worker ovaries. Among the two genes encoding storage or transport proteins,
apolipoprotein III (GB20117) was more expressed in workers and hexamerin 70b (GB10869)
was overexpressed in queen ovaries. Among the genes related to mRNA translation and
signaling pathways: elongation fator 1α (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat
shock protein 90 (GB40976) and a mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) were found
significantly overexpressed in queen ovaries. The gene OCLP-1 (GB19297), which has a
hypothetical function as an inhibitor cystine knot peptide, was found higher expressed in
worker ovaries. So as to evaluate the modulation of these genes by juvenile hormone, an in
vivo treatment of workers larvae was performed with cuticular application of the hormone.
After six hours of treatment, the ovaries were dissected and the samples analyzed by RT-
qPCR. Of the eleven DEGs tested for response to JH, six were significantly modulated by the
hormone. Two genes, short chain dehydrogenase reductase and heat shock protein 90, which
also respond to ecdysone, were up-regulated by JH, while OCLP-1 hexamerin 70b, 15-
hydroxyprostaglandin dehydrogenase and apolipoprotein III were down-regulated.The
differential expression of these genes encoding enzymes, storage/transport and signaling
pathway proteins indicates that they are important in caste-specific ovary development, as
their expression is strongly modulated during stages when programmed cell death takes place.
Keywords: Apis mellifera, Gene expression, Larval ovary, Development, RT-qPCR.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Genes selecionados a partir dos resultados de microarranjos em amostras de
ovários de rainhas e operárias em L4 e
L5.......................................................................................................................29
Tabela 2 – Características para identificação dos estágios e fases de desenvolvimento de
rainhas e operárias de Apis mellifera (baseado em Michelette e Soares,
1993)..................................................................................................................30
Tabela 3 – Sequências dos primers testados e utilizados nos ensaios RT-
qPCR.................................................................................................................32
Tabela 4 - Padronização dos primers para os genes selecionados e para os genes de
controle endógeno (actin e
rp49)..................................................................................................................36
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Os três diferentes tipos de indivíduos de uma colmeia de abelhas Apis
mellifera.............................................................................................................18
Figura 2 - Rainhas e operárias e os seus respectivos sistemas
reprodutivos.......................................................................................................21
Figura 3 – Representação esquemática do desenvolvimento de abelhas Apis mellifera até a
fase
adulta.................................................................................................................23
Figura 4 - Genes com padrão de expressão similar, com pico em L5F1 de
operárias............................................................................................................38
Figura 5 – Genes que codificam proteínas de transporte e
armazenamento..................................................................................................41
Figura 6 – Genes relacionados à transcrição e vias de
sinalização.........................................................................................................42
Figura 7 – Demais genes analisados...................................................................................45
Figura 8 – Níveis dos transcritos de krüppel homolog 1 (krh1) (GB45427) em resposta ao
tratamento in vivo com hormônio juvenil (HJ).................................................46
Figura 9 – Genes com expressão aumentada por hormônio juvenil...................................47
Figura 10 – Genes com expressão diminuída após tratamento com hormônio juvenil........48
Figura 11 – Genes com expressão não alterada por hormônio juvenil.................................49
LISTA DE ABREVIATURAS
15-PGDH 15-Hydroxyprostaglandin dehydrogenase
ACPEP1 Retinoid-inducible serine carboxypeptidase-like
ADH Short-chain alcohol dehydrogenase
Apid14 Apidaecin 14
apoLp-III ApolipoproteinIII
CA Corpora allata
DeRe Short-chain Dehydrogenase Reductase
EF-1 Elongation fator 1α
ERK(s) Kinase(s) reguladas por sinais extracelulares
GPDH Glycerol-3-phosphate dehydrogenase
Hex70b Hexamerin70b
HJ/JH Hormônio Juvenil / Juvenile Hormone
HKG Housekeeping gene(s)
Hsp60 Heat shock protein 60
Hsp90 Heat shock protein 90
ICK Inhibitor Cysteine Knot
L4 Estágio Larval 4
L5 Estágio Larval 5
L5F Estágio Larval 5 – feeding
MAPK-3 Mitogen-activated protein kinase 3
RT-qPCR Reação da Polimerase em Cadeia quantitativa (PCR em Tempo Real)
SDR Short-chain dehydrogenase/reductase Family
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 16
1.1. Eussocialidade ................................................................................................. 17
1.2. Apis mellifera: Importância e organização social ................................................ 17
1.3. As principais diferenças morfológicas entre as castas de abelhas melíferas ....... 18
1.4. Sistema reprodutivo e morte celular programada ................................................ 19
1.5. Processos de desenvolvimento das castas em Apis mellifera: hormônio juvenil (HJ) e
expressão gênica diferencial ....................................................................................... 21
2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 25
2.1. Objetivo Geral ...................................................................................................... 26
2.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 26
3. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 27
3.1. Lista de genes selecionados para análise ............................................................. 28
3.2. Material Biológico ............................................................................................... 29
3.3. Extração e quantificação do RNA........................................................................ 30
3.4. Confecção de cDNA ............................................................................................ 30
3.5. Desenho e testes dos primers ............................................................................... 31
3.6. Reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-qPCR) .............................. 32
3.7. Padronização dos Primers .................................................................................... 33
3.8. Sequenciamento produto dos Primers .................................................................. 33
3.9. Tratamento com HJ .............................................................................................. 34
4. RESULTADOS .......................................................................................................... 35
4.1. Padronização dos primers para ensaios RT-qPCR .............................................. 36
4.2. Perfis de expressão gênica ................................................................................... 37
4.2.1. Genes codificadores de enzimas e OCLP1 ................................................... 37
4.2.2. Genes que codificam proteínas de transporte e armazenamento ................... 40
4.2.3. Genes relacionados à transcrição e vias de sinalização ................................. 41
4.2.4. Outros genes analisados, mas com expressão diferente da identificada nos
microarranjos ........................................................................................................... 43
4.3. Tratamento com hormônio juvenil....................................................................... 46
5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 50
5.1. Expressão gênica diferencial no desenvolvimento larval dos fenótipos ovárianos51
5.2. Efeitos de tratamento com hormônio juvenil sobre expressão gênica ................. 57
6. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 59
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 61
8. ANEXOS .................................................................................................................... 73
ANEXO 1 – Curvas de dissociação dos produtos amplificados em RT-qPCR. ......... 74
ANEXO 2 – Curvas da avaliação da eficiência dos primers. ..................................... 75
16
_____________________________________________ _1. INTRODUÇÃO
17
1.1. Eussocialidade
A eussocialidade, o maior nível de organização social dos animais, é definida pelas
características: cuidado com a cria, sobreposição de gerações, divisão do trabalho em grupos
reprodutivos e não reprodutivos (Michener, 1974). A divisão do trabalho cria grupos
comportamentais especializados dentro da sociedade (castas). Animais eussociais se
distinguem dos outros sistemas sociais pela perda de pelo menos uma característica realizada
por indivíduos de outra casta, como por exemplo, operárias perdem a capacidade de
reprodução (Ronai et al., 2015). A eussocialidade está presente em certos insetos, crustáceos e
possivelmente em alguns mamíferos, sendo mais estudados em hymenopteros (formigas,
abelhas e vespas) e cupins (Patalano et al., 2015).
A eussocialidade envolve três fenômenos evolutivos e ecológicos interligados: as
forças da seleção (seleção por parentesco e/ou seleção por grupos) que geram e formam a
eussocialidade, a raridade da origem da eussocialidade e a hegemonia ecológica dos insetos
eussociais em que, o surgimento do altruísmo, comportamento que beneficia os outros
membros do grupo, resultou na sobrevivência e reprodução diferencial de grupos cooperativos
(Wilson; Hölldobler, 2005; Rehan; Berens; Toth, 2014).
Os insetos eussociais são conhecidos por apresentarem uma sociedade organizada e
complexa. A cooperação entre os membros da colônia no cuidado da prole e a presença de
castas na divisão do trabalho, em que os indivíduos realizam tarefas especializadas conforme
a casta, estabelece importante organização social (Gullan; Cranston, 1994; Almeida; Porto,
2014).
1.2. Apis mellifera: Importância e organização social
Dentre os insetos altamente eussociais, caracterizados pela presença de castas na
divisão do trabalho, as espécies pertencentes ao grupo de abelhas melíferas são as mais bem
estudadas. Entre as nove espécies do gênero Apis, Apis mellifera é a de maior distribuição
mundial e também é a mais cultivada. Assim desempenha papel econômico e ecológico de
grande importância na polinização em culturas agrícolas e reservas ecológicas nativas,
contribuindo para o aumento de produtividade de > 75% das culturas agrícolas mundialmente
importantes (Klein et al., 2007), e por meio de polinização acrescenta um valor de 12 bilhões
de USD anualmente à economia americana (Calderone, 2012). Além deste serviço ecológico a
abelha melífera produz mel, própolis e cera, produtos diretamente utilizados na indústria
18
farmacêutica e de alimentos, além de produtos de alto valor de mercado como geléia real e
derivados de veneno.
Essas abelhas vivem em colônias estruturadas, tipicamente compostas de uma rainha e
centenas de operárias, ambas do sexo feminino, além de um número variável de machos
(zangões) (Figura 1). A rainha bota dois tipos de ovos, não fertilizados e, assim, haploides,
que dão origem a zangões, e fertilizados, diploides, que geram as castas femininas. O sistema
de castas no sexo feminino está na base da divisão de trabalho e garante a coesão social das
suas colônias perenes, sendo que as rainhas são responsáveis pela produção de ovos, enquanto
as operárias cuidam e nutrem a prole, forrageiam para coleta de néctar e pólen, além de
desempenhar todas as demais tarefas necessárias para a manutenção da colônia (Michener,
1974; Winston, 1987).
Figura 1 – Os três diferentes tipos de indivíduos de uma colmeia de abelhas Apis mellifera
(http://www.britannica.com).
1.3. As principais diferenças morfológicas entre as castas de abelhas melíferas
As castas do sexo feminino em A. mellifera possuem diferenças que abrangem a
morfologia, fisiologia, longevidade, comportamento e função na colônia (Winston, 1987;
Page; Peng, 2001). Essas diferenças são decorrentes da alimentação diferencial oferecida
durante o desenvolvimento (Cameron; Duncan; Dearden, 2013; Hartfelder et al., 2015).
As diferenças na cabeça entre as castas estão diretamente relacionadas às suas funções
para a manutenção da colônia (Winston, 1987). As operárias possuem glândulas hipofaríngeas
e mandibulares responsáveis pela produção de alimento para a cria, enquanto que as rainhas
19
não possuem glândulas hipofaríngeas, e suas mandibulares produzem compostos para atrair
zangões e inibir a criação de novas rainhas (Winston, 1987).
Diferenças entre as castas também existem no metabolismo intermediário, este
principalmente relacionado à função do corpo gorduroso que permite trocas metabólicas
constantes (Chapman, 1998). Durante a fase larval, esse tecido possui a capacidade de
armazenamento, convertendo e fornecendo nutrientes para as células e órgãos do inseto no
seu desenvolvimento, servindo precursores para a síntese de diversos compostos (Cruz-
Landim, 2008).
Outra importante diferença morfológica entre rainhas e operárias está relacionada com
o forrageamento, sendo esta uma atividade exclusiva das operárias, e somente estas possuem
nas suas pernas posteriores uma estrutura especializada para coleta de pólen, a corbícula
(Snodgrass, 1956). O desenvolvimento desta estrutura foi investigado por Bomtorin et al.
(2012), revelando alterações na expressão de genes Hox. Interessantemente, a corbícula
representa uma característica sinapomórfica na clade das abelhas corbiculadas, a qual o
gênero Apis pertence, e a estrutura foi mantida na casta operária, enquanto em rainhas o seu
desenvolvimento aparentemente fica bloqueado durante o processo da metamorfose.
As diferenças mais evidentes entre as castas de A. mellifera estão diretamente ligadas
ao sistema reprodutivo. O papel reprodutivo da rainha está diretamente relacionado a um
ovário bem desenvolvido, com 150-200 ovaríolos em cada ovário, quando comparado ao das
operárias, com ovários bem menores, geralmente compostos de apenas 2-20 ovaríolos cada
(Snodgras, 1956; Leimar et al., 2012). O número diferencial de ovaríolos entre as castas
permite uma maior ovoposição pela rainha, processo iniciado logo após o acasalamento e que
lhe permite botar até 2000 ovos por dia (Winston, 1987; Hartfelder; Engels, 1998). Ademais,
a rainha assegura o seu monopólio reprodutivo na colônia por meio de feromônios com
função repressora na progressão da oogênese nos ovários das operárias (Hoover et al., 2003).
1.4. Sistema reprodutivo e morte celular programada
Como em todos os himenópteros, os ovários são do tipo politrófico meroístico,
compostos de número variável de ovaríolos elongados com numerosos folículos em estágios
sequenciais de ovogênese no eixo próximodistal (Tanaka; Hartfelder, 2004).
Nas abelhas eussociais, o desenvolvimento do aparelho reprodutor nas operárias é
menor que na rainha, tanto no que diz respeito aos ovários como à porção do aparelho
20
reprodutor relacionada aos dutos genitais, razão pela qual estas não se acasalam (Figura 2)
(Cruz-Landim, 2008; Kapheim et al., 2015; Shorter et al., 2015).
A diferenciação dos ovários durante a vida pós-embrionária é controlada por
hormônios, especialmente o hormônio juvenil e ecdisteróides (Hartfelder; Emlen, 2012),
responsáveis pelo controle da transição metamórfica e consequentemente duração do período
de crescimento em insetos (Mirth et al., 2014). As diferenças nos títulos hormonais entre as
castas (Rachinsly et al., 1990; Hartfelder; Engels, 1998) são possivelmente resultantes da
quantidade e qualidade de alimento ingerido durante o desenvolvimento (Cameron; Duncan;
Dearden, 2013; Hartfelder et al., 2015).
A partir do momento em que alimentação das larvas diploides torna-se diferencial (3°
ou 4° estágio larval), estabelece-se nos ovários de operárias um processo de morte celular, que
atinge inicialmente as células germinativas (Hartfelder; Steinbrück, 1997; Schmidt-Capella;
Hartfelder, 1998; Cruz-Landim, 2008).
Durante o desenvolvimento de organismos multicelulares, o processo de morte celular
programada desempenha papel essencial no balanço para homeostase dos tecidos e órgãos
juntamente com a proliferação (Kerr et al, 1972). A morte celular programada ocorre quando
células danificadas precisam ser eliminadas, em casos, por exemplo, de infecções virais e
danos irreversíveis ao DNA. Deficiências na regulação de morte celular estão relacionadas a
muitas doenças humanas, como doenças degenerativas, auto-imunes, diabetes e câncer
(Edinger; Thompson, 2003).
O avanço nos estudos no campo de morte celular contribui para a descrição de muitos
processos e maquinarias envolvidas. Em abelhas, os sinais de morte celular programada foram
observados em diferentes tipos celulares e tecidos durante a metamorfose (Pinto et al., 2003).
A morte celular tem papel central na diferenciação de castas (Cruz-Landim et al., 2006). Por
consequência da ocorrência maciça de morte celular programada nos ovários larvais de
operárias, há uma diminuição de 90 a 99% nos números de ovaríolos (Hartfelder; Steinbrück,
1997). Interessantemente, a ocorrência de morte celular é modulada pela presença hormonal.
Foi observada em ovários de operárias tratadas com hormônio juvenil uma diminuição
acentuada do número de núcleos TUNEL-positivos, indicando que esse hormônio inibe a
indução de morte celular programada nas gônadas larvais. Sendo assim, níveis elevados desse
hormônio garante a sobrevivência dos ovaríolos ao longo do desenvolvimento em ovários de
rainha (Schmidt-Capella; Hartfelder, 1998).
21
Figura 2 – Rainhas e operárias e os seus respectivos sistemas reprodutivos. Os ovários da
rainha (acima) são compostos de 150-180 ovaríolos cada, enquanto os da operária (abaixo)
são de apenas 2-20 ovaríolos (modificado de Snodgrass, 1956).
O processo de diferenciação de castas em Apis mellifera envolvendo o
desenvolvimento dos ovários de rainhas e operárias é muito bem caracterizado no ponto de
vista morfofisiológico (Hartfelder; Engels, 1998; Hartfelder; Steinbrück, 1997; Schmidt-
Capella; Hartfelder, 1998), porém, ainda há lacunas na relação deste processo de
diferenciação com a genética molecular e seus mecanismos de ativação ou repressão da morte
celular programada e consequente ativação do sistema reprodutivo.
1.5. Processos de desenvolvimento das castas em Apis mellifera: hormônio juvenil (HJ) e
expressão gênica diferencial
A diferenciação entre rainhas e operárias é definida por eventos que ocorrem durante o
desenvolvimento larval e se deve primariamente à alimentação diferencial das larvas (Figura
3) (Hartfelder; Emlen, 2012; Leimar et al., 2012; Wang; Li-Byarlay, 2015; Kapheim et al.,
2015).
22
Até o terceiro estágio larval as larvas são alimentadas com uma mistura de secreções
das glândulas hipofaríngeas e mandibulares das operárias nutridoras, ricas em carboidratos,
proteínas e lipídios (Michener, 1969; Rembold, 1987; Shorter et al., 2015). As larvas
destinadas a serem rainhas são alimentadas com grandes quantidades de geléia real durante
toda a fase de alimentação larval, enquanto àquelas destinadas a se desenvolver em operárias
recebem inicialmente uma mistura de secreções glandulares similares a da rainha, mas com
menor conteúdo de carboidratos, e depois, nas duas últimas fases larvais, secreções
glandulares misturadas com mel e pólen (Asencot; Lensky, 1985; Kamakura, 2011; Leimar et
al., 2012; Cameron; Duncan; Dearden, 2013; Hartfelder et al., 2015; Mao, Schuler;
Berenbaum, 2015).
As diferenças morfológicas entre as duas castas começam a se estabelecer a partir do
terceiro instar larval, e se tornam cada vez mais evidentes no quarto e no último, quinto instar
larval, a partir do qual a larva sofre a metamorfose, entra na fase pupal e por fim emerge
como adulta (Dedej et al., 1998). A alimentação diferencial das larvas desencadeia alterações
casta-específicas no sistema endócrino, especialmente nos títulos de hormônio juvenil
(Rembold, 1987; Rachinsky et al., 1990; Hartfelder; Engels, 1998) e nos padrões da
expressão gênica diferencial (Evans; Wheeler, 2001; Cristino et al., 2006; Barchuk et al.,
2007, Cameron; Duncan; Dearden, 2013).
O papel de hormônio juvenil (HJ) no desenvolvimento das castas de abelhas melíferas
é mais bem estudado no contexto de desenvolvimento dos ovários larvais, sendo que as altas
concentrações de HJ na hemolinfa de larvas de rainhas impedem a morte celular programada
nos ovários destas, enquanto nas operárias 95-99% dos primórdios de ovaríolos são
degradados no último instar larval (Schmidt-Capella; Hartfelder, 1998; Cruz-Landim et al.,
2006).
23
Figura 3 - Representação esquemática do desenvolvimento de abelhas Apis mellifera até a
fase adulta, evidenciando o momento da alimentação diferencial (retângulo vermelho).
O sequenciamento do genoma de A. mellifera completado em 2006 (The Honey Bee
Genome Sequencing Consortium, 2006) representa um divisor de águas em termos de
abordagens possíveis, tanto em estudos básicos da biologia desta espécie como em programas
de melhoramento genético (Robinson et al., 2005). As pesquisas principalmente beneficiadas
pelo sequenciamento do genoma são as de análises de expressão gênica, tanto em estudos de
expressão de genes de interesse específico, frequentemente denominados de genes candidatos,
quanto os estudos não direcionados, as análises globais de RNAs.
No que diz referência ao desenvolvimento de castas em A. mellifera, a análise da
expressão gênica diferencial por microarranjos levou à proposta de redes de regulação de
eventos que, por meio do seu potencial heurístico permitem direcionar abordagens
experimentais para aspectos importantes do dimorfismo das castas (Barchuk et al., 2007;
Silva, 2012). A primeira plataforma para Apis mellifera foi direcionada para estudos de
expressão gênica no cérebro de abelhas adultas referente ao processo de transição nutridora-
forrageira (Whitfield et al., 2002, 2003), e uma segunda por Barchuk et al. (2007) que
24
investigaram a expressão gênica durante o processo de desenvolvimento das castas na fase
larval.
Entretanto, a plataforma mais utilizada foi criada após o sequenciamento do genoma
de Apis mellifera. Esta consiste de oligonucleotídeos sintéticos espotados sobre lâminas que
representam o conjunto dos 13 mil genes preditos na época (The Honey Bee Genome
Sequencing Consortium, 2006), sendo que esta estimativa foi recentemente corrigida para
cerca de 15 mil (Elsik et al., 2014). Esta plataforma de microarray, produzido pelo William
Keck Center da Universidade de Illinois e disponibilizado comercialmente à comunidade
científica, tem sido amplamente utilizada nos mais diversos contextos de pesquisas em
abelhas, de comportamento e operárias (Whitfield et al., 2006; Sem Sarma et al., 2009),
fertilidade e esterilidade de rainhas e operárias (Thompson et al., 2006; Grozinger et al., 2007;
Kocher et al., 2007), efeitos de parasitas e vírus sobre a saúde das abelhas (Navajas et al.,
2008; Johnson et al., 2009), e efeitos de alterações epigenéticos sobre perfis transcricionais
(Foret et al., 2009).
Pelo fato de o desenvolvimento do ovário ser um fator crucial para o desenvolvimento
de castas, e, em estudo de expressão gênica diferencial por Análise de Representação
Diferencial (RDA) terem sido descobertos genes potencialmente envolvidos em processo de
morte celular programada nos ovários larvais de operárias (Humann; Hartfelder, 2011;
Humann; Tibério; Hartfelder, 2013), foi realizada posteriormente recentemente também uma
análise global dos transcriptomas de ovários de larvas de rainha e operária no quarto e quinto
instar larval por meio do microarranjo do Keck Center. Por meio destes microarranjos foram
revelados genes diferencialmente expressos (Fernanda Carvalho Humann, Angel Roberto
Barchuk, resultados não publicados), dos quais 18 foram selecionados para análise mais
aprofundada, conforme proposto nesse trabalho.
25
_________________________________________________________2. OBJETIVOS
26
2.1. Objetivo Geral
O objetivo deste estudo foi validar e analisar em detalhe genes revelados como
diferencialmente expressos nos ovários de rainhas e operárias durante estágios larvais críticos
para o desenvolvimento de castas. Estes genes foram selecionados a partir de listas de genes
revelados como diferencialmente expressos por meio de microarranjos realizados em
experimentos que antecederam este projeto.
2.2. Objetivos específicos
1. Anotar por meio de ferramentas de bioinformática um conjunto de 18 genes revelados
como diferencialmente expressos no ovário larval de rainhas e operárias e desenhar primers
para os mesmos.
2. Analisar os padrões de expressão destes genes por meio de RT-qPCR quantitativa em
ovários de larvas de rainhas e operárias.
3. Verificar a influência do hormônio juvenil na modulação da expressão dos genes que
apresentaram maiores diferenças entre as castas.
27
_____________________________________________3. MATERIAIS E MÉTODOS
28
3.1. Lista de genes selecionados para análise
Os genes analisados por RT-qPCR neste trabalho foram selecionados a partir de
análises de microarranjos realizados em amostras de ovários de rainhas e operárias nos
estágios críticos do desenvolvimento (L4 e L5F) (Fernanda Carvalho Humann, Angel Roberto
Barchuk, resultados não publicados). Foram selecionados genes que se destacaram por
expressão diferencial entre as amostras, gerando um total de 18 genes (Tabela 1). O critério de
inclusão principal para tal seleção era o valor fold change log2FC > 1,5. A estrutura destes foi
analisado por meio de ferramentas do Genome Browser do genoma de A. mellifera
desenvolvido pela Universidade de Califórnia em Santa Cruz (https://genome.ucsc.edu/),
atualizado para as versões do genoma de A. mellifera Amel 4.5 e OGS 2.0, implementado no
cluster computacional de bioinformática do Departamento de Genética da FMRP-USP, pelo
Projeto Temático FAPESP (2011/03171-5) (http://kerr.fmrp.usp.br:88/). Para esses genes
foram desenhados primers para análise dos níveis de expressão em ovários de rainhas e
operárias nos estágios L4 e L5 por RT-qPCR. O número de genes incluídos a partir dos dados
dos microarranjos difere entre os estágios L4 e L5F devido ao número superior de genes
difereincialmente expressos (DEGs) no estágio L5F comparado ao L4.
29
Tabela 1 – Genes selecionados a partir dos resultados de microarranjos em amostras de
ovários de rainhas e operárias em L4 e L5. R - mais expresso em rainhas (log2-fold change >
1,5); O - mais expresso em operárias (log2-fold > 1,5); X – gene de interesse devido
características funcionais preditas, diferencialmente expresso, mas com log2-fold entre 1,0 e
1,5.
L4 L5 GeneBank ID GenBank ID
Nome
R
GB46223 NM_001040223.1 Obp14
O
GB54419 NM_001011620.1 DeRe
O
GB13966 XM_001123053.2 Gbpartial
O
GB52028 NM_001011628.2 EF-1
R GB18969 XM_392899.5 HSP60
R GB13049 XM_394471.1 Tubulin
R GB47546 NM_001011613.1 Apid14
O GB18737 XM_623815.2 15-PGDH
O GB20117 NM_001114198.1 apoLp-III
O GB19297 XM_001120252.2 OCLP-1
O GB11273 XM_392686.3 ACPEP1
X GB50902 XM_393605.5 GPDH
X GB10869 NM_001011600.1 Hex70b
X GB12860 XM_624635.4 Tudor
X GB13214 XM_624891.4 Helicase25e
X GB41845 XM_006564514.1 MAPK-3
X GB40976 NM_001160064.1 HSP90
X GB50048 NM_001011629.1 E93
3.2. Material Biológico
Larvas de rainhas e operárias de Apis mellifera eram provenientes de colmeias
provenientes do apiário do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto (FMRP-USP). Larvas de operárias das idades desejadas foram removidas diretamente
de quadros de cria. As larvas de rainhas utilizadas neste estudo foram obtidas através da
transferência de larvas de operárias de primeiro estágio larval para células realeiras
aprovisionadas com geléia real e colocadas em suportes especiais dentro de colônias para seu
desenvolvimento até o estágio desejado. A caracterização das fases seguiu os critérios
estabelecidos por Michelette e Soares (1993) (Tabela 2).
Ovários foram dissecados de larvas do quarto (L4) e quinto (L5F1, L5F2 e L5F3)
instar sob estereomicroscópio, homogeneizados e armazenados em TRIzol (Invitrogen) e
guardados à -80 °C, para posterior extração de RNA.
30
Tabela 2 – Características dos estágios e fases de desenvolvimento de rainhas e operárias de
Apis mellifera (Michelette e Soares, 1993). Estágios utilizados, marcados em negrito.
Instares
Larvais
Intervalo de pesos (mg) e características
Operárias Rainhas
L1 0,11 – 0,30 0,10 – 0,45
L2 0,31 – 1,05 0,35 – 1,50
L3 1,50 – 4,45 1,30 – 7,0
L4 4,80 – 24,80 3,80 – 44,00
L5F1 27,12 – 42,62 35,00 – 90,00
L5F2 53,09 - 91 91,00 – 180,00
L5F3 106,78 – 115,86 181,00 – 260,00
3.3. Extração e quantificação do RNA
A extração do RNA das amostras armazenadas em TRIzol (Invitrogen) foi realizada
conforme o protocolo da empresa. O RNA foi completamente seco após sua precipitação em
etanol e posteriormente ressuspendido em água tratada com DEPC. Em seguida, o RNA foi
tratado com DNase livre de RNase (Fermentas), com o propósito de eliminar resquícios de
DNA genômico, utilizando-se 10 U de DNAse I e 10 U de inibidor de RNase (Fermentas)
para cada 10 μg de RNA. À reação ocorreu por 30 min à 37 °C, seguido de aquecimento a 65
°C por 10 min para inativação da enzima. As amostras assim obtidas foram estocadas a -80
°C.
O RNA foi quantificado utilizando-se espectrofotometria em equipamento NanoVue
(GE Healthcare) considerando comprimento de onda de 260 nm para leitura, onde uma
unidade de absorbância corresponde a 40 µg/ml de RNA. A pureza da amostra foi avaliada
pela razão da leitura 260/280 nm que deve ser maior que 1,6.
3.4. Confecção de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada, utilizando o sistema de transcrição reversa
SuperScript II (Invitrogen). A 1 μg de RNA foi adicionado 1 μl de primer oligo(dT)12-18
(conc. 500 μg/μl; Invitrogen), 1 μl de dNTPmix (10 mM; Invitrogen) e 12 μl de H2O DEPC e
a mistura foi mantida por 5 min a 65 ºC. Em seguida, 4 μl de 5x First Strand Buffer
(Invitrogen), 2 μl de DTT (0,1M; Invitrogen) e 1 μl de RNaseOUT (40 U/μl; Invitrogen)
foram adicionados e a mistura mantida por 2 min a 42 ºC. Por fim, foi adicionado 1 μl de
31
enzima SuperScript II RT (Invitrogen) e a reação de síntese da primeira fita de cDNA
realizada durante 50 min a 42 ºC. A reação foi terminada com desnaturação da enzima por
incubação a 70 ºC por 15 min.
As amostras foram armazenadas a -20 °C e usado posteriormente para padronização
dos primers por RT-PCR convencional, seguido dos ensaios RT-qPCR.
3.5. Desenho e testes dos primers
Primers para os genes selecionados foram desenhados utilizando o software do NCBI,
Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). As sequências dos primers
que deram resultados positivos nos testes por PCR convencional encontram-se na Tabela 3.
Os primers foram testados em sistema de PCR gradiente de termociclador (PTC 200,
MJ Research). Nestes, 1 μl de uma amostra cDNA diluído 10x foi utilizado para amplificar os
respectivos fragmentos gênicos utilizando 10 µl de Master Mix (Fermentas) em volume final
de 20 µl. O controle negativo foi realizado sem adicionar cDNA. A amplificação ocorreu nas
seguintes condições: desnaturação inicial de 95 °C por 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C
por 30 s, gradiente de 58-62 62 °C (intervalo de 2 oC) por 30 s, 72 °C por 30 s e extensão final
a 72 °C por 10 min.
Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose (1% ou
1,5%) em tampão TAE (Tris-acetato-EDTA). O marcador usado foi GeneRuler 100 bp
DNA Ladder (Fermentas). O gel foi corado com GelRedTM (UniScience) e os fragmentos
visualizados em Foto Documentador (ImageQuant 150, GE).
O cDNA foi testado, quanto à qualidade por meio de análise do gene codificador da
proteína ribossomal 49 (rp49), que pode amplificar dois fragmentos, um deles contendo 150
bp correspondente ao cDNA e outro fragmento de 240 bp que apareça caso haja contaminação
genômica por inclusão de intron. Os genes rp49 e codificador de uma actina citoplasmática
têm sido validados como genes de controle endógeno em ensaios RT-qPCR de abelhas
melíferas (Lourenço et al., 2008).
32
Tabela 3 – Sequências dos primers testados e utilizados nos ensaios RT-qPCR. Os últimos
dois da lista são os primers dos genes de controle endógeno.
Genes Sequência dos primers
Foward Reverse
GB46223 Obp14 CTGGCATTGATCAGCAAAAAGC GACTGCTTTGATTCCTTGTGGT
GB54419 DeRe CTGGAGCTAACTCGGGCATT CGTTTTGGTTGGAAAGATCGCA
GB18969 HSP60 GGAGGCGGTACTGCTCTTTT TAGCATCCACGCCTGCATTT
GB18737 15-PGDH TGTGCCCTGGTGTTACAACT GCGTTTGCGGGATGTCTTTT
GB50902 Gpdh CTGCACAGACCCGAGTGAAT CAACAACCTGAGCACCGAAC
GB10869 Hex70b GGGTGACACAGCTGACATGA GAGGCCAACATCTTCGGTGA
GB12860 Tudor GTTACCAGTGGATCGCGTCT AGCAATGCTCTCGGGTGAAA
GB41845 Kinase TCCCGAGTGGTGTGAAGGTA CCTCAGGACCAACGGAATCA
GB40976 HSP90 TGGCAAACAGTTGGTCTCTG ACAGCATGGAGAATCAACTAACCT
GB47546 Apid14 CGGCACGAGAGAATTGGTGT AGTAGGCGGATCTAGGTTGGT
GB52028 eEF-1 GATGGACATGACCGATCCCC TTGTACCACGGTGTCTTCGG
GB20117 apoLp-III CTCCCGAATTGGAAAGATCA GCTCAGAGATTTCGCAGCTT
GB11273 ACPEP1 TCGCCATGTACTGGGTGAAC TCCTTTGGTACCTGTGCGAC
GB13214 Helicase25e TTGTTGGTACTCCAGGTCGC ACGTCCCTACGCATGTCTAA
GB13049 Tubulin ACGGAGACTCGGACCTACAA GGGCGGAATATATGGCCGAA
GB19297 OCLP1 CGAACATCGTTTCAGCTGCC AGCTCCTCCTCTGTGATCCT
GB13966 Gbpartial GACTACGTGCCGCCTAAAGT AAGAGCAGCCTTCACAGCAT
GB50048 E93 GGTGGACGCGTGGATTTGA CGATCGAGACACCGAGAGGA
GB47227 RP49 CGTCATATGTTGCCAACTGGT TTGAGCACGTTCAACAATGG
GB44311 Actina TGCCAACACTGTCCTTTCTG AGAATTGACCCACCAATCCA
3.6. Reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-qPCR)
Para as reações de amplificação em tempo real foram utilizados os primers da Tabela
3. Os níveis de transcritos do gene ribossomal rp49 e uma actina citoplasmática serviram para
normalização das quantidades de RNA nas amostras (Lourenço et al., 2008) e o cálculo da
expressão relativa seguiu a metodologia de Pfaffl et al. (2001).
Nos ensaios RT-qPCR foi utilizada a metodologia SYBR Green (Applied Biosystems)
em sistema Real-Time PCR StepOne Plus (Life Technologies). Para as reações utilizou-se 7,5
μl de SYBR Green (Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, Fermentas), 0,5 μl de cada um
dos respectivos primers forward e reverse (diluídos a 10 pM), 1,5 μl de cDNA e 5 μl de
água autoclavada, totalizando um volume final de 15 μl. As reações ocorreram nas
seguintes condições: 50 °C por 2 min, 95 °C por 10 min, 40 ciclos a 95 °C por 15 s e 60 °C
por 1 min. A curva de dissociação para verificação da especificidade da reação foi
33
obtida ao final do ultimo ciclo, aquecendo os produtos de amplificação a 95 °C por 15 s,
60 °C por 1 min e 95 °C por 15 s.
Os ensaios foram realizados em triplicatas biológicas, cada uma dessas sendo
analisada em triplicata técnica. A abundância dos transcritos foi calculada em relação aos
valores Ct (threshold cycle) do respectivo gene alvo e da média dos genes de controle
endógeno rp49 (GB47227) e actin (GB44311) (Lourenço et al., 2008). Os valores da
expressão relativa foram calculados seguindo metodologia ΔΔCt (Pfaffl, 2001).
3.7. Padronização dos Primers
Para a padronização inicial dos primers nos ensaios RT-qPCR foram misturados 1 ul
de 6 amostras de cDNA de ovário de rainha e operária. Essa mistura de cDNAs serviu como
template para estabelecer as curvas de eficiência dos primers. Do template utilizado para cada
gene, 5 ul foi adicionado a 45 ul de água autoclavada e a partir dessa, foram feitas outras
quatro diluições em passos de 10x (1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000 e 1:100000).
Com estes templates diluídos, reações de qPCR foram realizadas para obter curvas de
eficiência, resultando em valores de slope, r2
,temperatura de dissociação (ºC) e eficiência
(%). Apenas primers com eficiência entre 80% e 105% foram utilizados nas análises das
amostras de cDNA que se seguiram.. Os resultados das análises das curvas de eficiência e
dissociação encontram-se nos Anexos 1 e 2.
3.8. Sequenciamento produto dos Primers
Reações de sequenciamento foram realizadas com o objetivo de verificar se a
sequência do produto amplificado com o uso dos primers desenhados correspondia às
sequências dos genes escolhidos. Como template para o sequenciamento Sanger foram
utilizados os produto de PCR, em diretamente purificados pelo kit Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System (Promega), ou, caso não satisfatórios para sequenciamento, clonados por
inserção em DNA plasmidial (pGEM®-T e pGEM®-T Easy Vector Systems, Promega) e
transformação de bactéria E. coli DH5α.
Para a reação de sequenciamento foi adicionado 50 ng de produto de PCR ou 300 ng
de DNA plasmidial pGEM a 6 ul de tampão de sequenciamento 2,5X, 1 μl de
34
oligonucleotídeo (5 pmol/μl), 2 μl de reagente Big Dye (Applied Biosystems), completando
para 20 μl com água. As reações de amplificação ocorreram nas seguintes condições: 96 ºC
por 5 min, 40 ciclos de 96 ºC por 30 s, 50 ºC por 30 s e 60 ºC por 4 min. Os produtos de
amplificação foram precipitados com isopropanol. Após homogeneização e centrifugação o
pellet foi lavado em etanol 70%, e após centrifugação ressuspenso em formamida e o DNA
densaturado por 5 min a 95 ºC. O sequenciamento foi realizado no sistema ABI 3100 Genetic
Analyzer (Applied Biosystems). As reações de sequenciamento forma realizadas no
laboratório da Profa. Maria Helena Souza Goldman (FFCLRP-USP).
As sequências geradas foram utilizadas para comparação com os dos genes de
interesse depositados em GenBank utilizando o software BLASTN
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
3.9. Tratamento com HJ
Foram escolhidos os seguintes genes que, nas análises RT-qPCR, mostraram
expressão diferencial significativa na comparação de ovários de rainha e operária: apolipoIII
(GB20117), OCLP1 (GB19297), hsp60 (GB18969), DeRe (GB54419) EF-1 (GB52028),
Hex70b (GB10869), 15-PGDH (GB18737), MAPK-3 (GB41845), GPDH (GB50902), Hsp60)
(GB18969) e hsp90 (GB40976). Estes dez genes juntamente com o gene krüppel-homolog1
(Amkr-h1); (GB45427; XM_001123084), gene de resposta imediata a hormônio juvenil
(Belles; Santos, 2014), foram analisados em ovários de larvas de operárias tratadas com o
hormônio, verificando a influência deste hormônio na modulação da expressão.
A metodologia do tratamento seguiu o exemplo de Schmidt-Capella e Hartfelder
(1998), com aplicações de 10 µg de hormônio juvenil III (Fluka, Buchs, Suiça) dissolvido em
acetona diretamente na cutícula de larvas operárias do estágio L4. Os controles foram larvas
tratadas com acetona e larvas não tratadas. Os ovários destas foram dissecados 6 horas após o
tratamento para extração de RNA e subsequente análise por RT-PCR em tempo real.
35
_______________________________________________________4. RESULTADOS
36
4.1. Padronização dos primers para ensaios RT-qPCR
Os genes analisados por RT-qPCR neste trabalho foram selecionados a partir de
análises de microarranjos realizados em amostras de ovários de rainhas e operárias nos
estágios críticos do desenvolvimento (L4 e L5F). Foram selecionados os genes que mais se
destacaram por expressão diferencial entre as amostras, gerando uma lista total de 18 genes
(Tabela 1).
A eficiência dos primers foi avaliada após obtenção de uma curva padrão de eficiência
para cada gene e cálculo dos valores de eficiência (E) utilizando a fórmula E = 10-1
/slope
(Pfaffl, 2001). Os dados gerados encontram-se na Tabela 4 e imagens das curvas geradas nos
Anexos 1 e 2. Os primers mostraram-se eficientes para utilização nas reações de amplificação
em tempo real, com eficiência entre 80% e 105% e apenas um pico na curva de dissociação.
Tabela 4 – Padronização dos primers para os genes selecionados e para os genes de controle
endógeno (actin e rp49). Temperatura de dissociação em ºC, valor de r2 (0.999), slope (-3.2) e
eficiência (E = 10-1/slope) (80% a 105%).
ID Genes Nome Temperatura
Dissociação (°C) r² slope Eficiência %
GB46223 Obp14 73.35 0.993 -3.313 100.366
GB54419 DeRe 76.49 0.936 -3.616 89.024
GB18969 HSP60 77.23 0.998 -3.605 89.405
GB18737 15-PGDH 74.37 0.991 -3.729 85.431
GB50902 GPDH 78.87 0.988 -3.492 93.346
GB10869 Hex70b 78.54 0.994 -3.278 101.845
GB12860 Tudor 76.33 0.999 -3.631 88.535
GB41845 MAPK-3 77.23 0.995 -3.567 90.692
GB40976 HSP90 75.41 0.998 -3.625 88.726
GB47546 Apid14 75.44 0.994 -3.764 84.348
GB52028 EF-1 74.99 0.999 -3.758 84.547
GB20117 apoLp-III 76.48 0.881 -3.428 95.752
GB11273 ACPEP1 77.08 0.971 -3.506 92.867
GB13214 Helicase25e 74.66 0.998 -3.401 96.815
GB13049 Tubulin 84.51 0.993 -3.765 84.348
GB19297 OCLP1 83.79 0.999 -3.656 87.729
GB13966 Gbpartial 75.59 0.996 -3.766 84.292
GB50048 GB47227
E93 RP49
81.25 75.89
0.997 0.996
-3.931 -3.257
79.645 102.774
GB44311 Actin 79.3 0.998 -3.243 103.403
37
Reações de sequenciamento realizadas com o objetivo de validar que o produto gerado
pelos ensaios de PCR correspondem com a sequência dos genes escolhidos. As comparações
foram realizadas por meio de análises BLASTN com identidade nucleotídica mínima de 80%.
4.2. Perfis de expressão gênica
4.2.1. Genes codificadores de enzimas e OCLP1
Dos dezoito genes analisados, onze foram confirmados como diferencialmente
expressos. Interessantemente, os genes que codificam enzimas, tais como: 15-
hydroxyprostaglandin dehydrogenase, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, short-chain
dehydrogenase reductase e retinoid-inducible serine carboxypeptidase-like (ACPEP1)
(Figura 4A-D), apresentaram-se mais expressos em ovários de operárias, com um claro pico
de expressão em L5F1, momento no qual intensifica-se a morte celular programada nos
ovários nesta casta. O gene OCLP-1 apresentou o mesmo padrão de expressão (Figura 4E).
38
Figura 4 – Genes com padrão de expressão similar, com pico em L5F1 de operárias.
Estes codificam enzimas e o gene OCLP-1. Quantificação relativa por RT-qPCR dos genes
(A) 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (15-PGDH), (B) glycerol-3-phosphate
dehydrogenase (GPDH), (C) short-chain dehydrogenase reductase, (D) retinoid-inducible
serine carboxypeptidase-like (ACPEP1) e (E) OCLP-1 (GB19297) em ovários larvais de
rainhas e operárias de Apis mellifera. O cDNA usado foi de ovários de larvas do quarto (L4) e
quinto instar (L5F1, L5F2 e L5F3). Os níveis relativos de expressão foram calculados pelo
método ∆∆Ct (Pfaffl, 2001), utilizando para normalização a média dos Cts dos genes rp49
(GB47227) e actin (GB44311), seguido de calibração contra uma amostra de ovário larval de
operária na fase L4. São mostradas as médias e erro padrão da média de três amostras
biológicas, cada uma delas analisada em triplicata experimental. Os asteriscos indicam
diferenças estatisticamente significantes (two-way ANOVA, teste de comparação múltipla de
Sidak; *P <0.05).
O gene 15-PGDH codifica a enzima responsável pelo metabolismo de
prostaglandinas, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase, atuando numa variedade de
processos fisiológicos e celulares como em inflamações, estando associada ao câncer em
D
A B
E
C
39
humanos (Myung et al., 2006). Nas análises quantitativas esse gene mostrou-se mais expresso
em L4 e L5F1 seguido de queda em L5F2 sem voltar a subir em L5F3. Em rainha, o gene
apresenta expressão constante e basal, mostrando que o gene tem alteração apenas em
operárias durante as fases de alimentação (Figura 4A). Os resultados são de acordo com o
esperado pelos resultados dos microarranjos,
O gene glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase (amGpdh) mostrou um pico de
expressão em L5F1 e era significativamente mais expresso em ovários de operária na fase
L5F3 (Figura 4B). Os níveis de transcrito desse gene, que tem sido alvo em estudos de
padronização de ensaios knockdown por RNAi por estar expresso em vários tecidos e como
gene de controle endógeno em ensaios RT-qPCR (Jarosch; Moritz, 2011) varia
consideravelmente em nossas amostras, causando assim preocupação quando à sua utilidade
como “housekeeping gene” em ensaios PCR em tempo real.
A família de enzimas dehydrogenase/redutase está envolvida em diferentes aspectos
do metabolismo energético. Esta família inclui a enzima short chain alcohol dehydrogenase
(ADH) de Drosophila melanogaster, uma das enzimas mais bem estudadas em insetos
(Kavanagh; Persson; Oppermann, 2008). Em estudos anteriores do nosso grupo o mesmo
gene já tinha sido detectado como diferencialmente expresso em ovários de larvas de abelhas,
mostrando uma reação de resposta a ecdisteróides (Guidugli et al., 2004). Assim, esse gene,
confirmado agora por metodologias diferentes como diferencialmente expresso, pode de fato
exercer um papel importante no desenvolvimento casta-específico dos ovários (Figura 4C).
O gene codificador da enzima proteolítica retinoid-inducible serine carboxypeptidase-
like (ACPEP1) possui um pico de expressão, em comum com os outros genes que codificam
enzimas em L5F1 em operárias, fase onde ocorre a morte celular programada nos ovários
desta casta (Figura 4D). A expressão desse gene em ovários de rainha se manteve basal
durante todas as fases amostradas, o que indica uma função potencialmente marcante dessa
enzima na morte celular programada.
O gene OCLP-1 é conhecido como inibidor de nó de cistina (ICK) e é evolutivamente
conservado entre os himenópteros. Sua expressão foi anteriormente encontrada como
onipresente nos tecidos em todas as fases do ciclo de vida dos membros da colônia de A.
mellifera, levando à hipótese de que esse gene funciona como um inibidor microbiano
expresso em todo o corpo (Bloch; Cohen, 2014). Os nossos resultados não estão de acordo
com essa hipótese, pois, os transcritos do gene OCLP-1, encontrado nos microarranjos entre
os DEGs mais expressos em ovários do quinto instar larval, resultado agora confirmado pelas
nossas análises RT-qPCR. A expressão desse gene apresentou um pico em L5F1, decrescendo
40
em L5F2 e voltando a aumentar em L5F3 (Figura 4E), ou seja, além de variar entre rainhas e
operárias, esse gene apresentou um padrão de expressão bem variável durante o
desenvolvimento dos ovários larvais.
4.2.2. Genes que codificam proteínas de transporte e armazenamento
As apolipoproteínas são conhecidas por suas funções no transporte de lipídios, além de
estarem relacionadas à resposta imune. Estudos com a mariposa Manduca sexta indicaram
que a expressão de apoLp-III é regulada positivamente em tecido muscular durante a morte
programada das células, sugerindo um papel adicional ao transporte de lipídios (Sun et al.,
1995). O gene codificador da apolipoprotein III também está mais expresso em ovários de
operárias, porém, sem um pico de expressão em L5F1 (Figura 5A). Existe, portanto a
possibilidade que a maior expressão dessa proteína nos ovários de operárias esteja associada à
morte celular programada que ocorre nos ovários das larvas de operárias durante as fases de
desenvolvimento analisadas.
Assim como vitelogenina e apolipoproteínas, as hexamerinas são proteínas de
estocagem, acumuladas em grandes quantidades na hemolinfa larval. Estão envolvidas no
fornecimento de aminoácidos e energia para metamorfose (Lourenço et al., 2008). A
expressão do gene hex70b (GB10869) começou levemente, mas estatisticamente não
significante, maior em operárias no quarto instar, porém, passou a ser mais expresso em
ovários de rainhas nos estágios seguintes (Figura 5B). Isso pode sugerir um envolvimento
com maior estocagem de metabólitos para a metamorfose dos ovários das rainhas, mas dados
recentes indicam funções alternativas para hexamerinas devido à sua localização nuclear
(Martins et al., 2011, 2012).
41
Figura 5 – Genes que codificam proteínas de transporte e armazenamento. Quantificação
relativa por RT-qPCR dos níveis dos transcritos dos genes (A) apolipoprotein III (apoLp-III)
e (B) hexamerin70b (hex70b) em ovários larvais de rainhas e operárias de A. mellifera. O
cDNA usado foi de ovários de larvas do quarto (L4) e quinto instar (L5F1, L5F2 e L5F3). Os
níveis relativos de expressão foram calculados conforme detalhado na legenda da Figura 4.
São mostradas as médias e o erro padrão da média de três amostras biológicas, cada uma delas
analisada em triplicata experimental. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente
significantes (two-way ANOVA, teste de comparação múltipla de Sidak; *P <0.05).
4.2.3. Genes relacionados à transcrição e vias de sinalização
Os genes relacionados à tradução de mRNA e a vias de sinalização: elongation fator
1α, heat shock protein 60, heat shock protein 90 e mitogen-activated protein kinase 3
encontraram-se mais expressos em ovários de rainhas (Figura 6).
O alongamento da cadeia de aminoácidos durante a tradução envolve uma série de
componentes proteicos que são conhecidos como fatores de tradução. Por estar relacionado à
tradução, o gene ef-1 era anteriormente testado gene de controle endógeno em ensaios RT-
qPCR (Lourenço et al., 2008). Curiosamente, porém, este fator de tradução apresentou-se
entre os genes diferencialmente expressos nos microarranjos durante o quarto instar larval em
operária. Nas análises quantitativas por RT-qPCR esse gene apresentou expressão constante
em operárias enquanto que sua expressão era significante maior e variou consideravelmente
em ovários de rainha (Figura 6A). Por um lado isso é contraindicativo para sua utilização
como calibrador endógeno, por outro lado é de interesse para a morfogênes dos ovários por
estar de acordo com o maior crescimento destes em larvas de rainha na fase L5.
.
A B
42
Figura 6 – Genes relacionados à transcrição e vias de sinalização. Esses se mostraram
significativamente mais expressos em ovários de rainha. Quantificação relativa por RT-qPCR
dos níveis dos transcritos dos genes (A) elongation fator 1α (ef-1), (B) heat shock protein 60
(hsp60), (C) heat shock protein 90 (hsp90) e (D) mitogen-activated protein kinase 3 (MAPK-
3) em ovários larvais de rainhas e operárias de A. mellifera. O cDNA usado foi de ovários de
larvas do quarto (L4) e quinto instar (L5F1, L5F2 e L5F3). Os níveis relativos de expressão
foram calculados conforme detalhado na legenda da Figura 4. São mostradas as médias e o
erro padrão da média de três amostras biológicas, cada uma delas analisada em triplicata
experimental. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (two-way
ANOVA, teste de comparação múltipla de Sidak; *P <0.05).
O gene hsp60, conhecido como codificador do precursor da proteína HSP60
mitocondrial, apresentou-se mais expresso no quarto instar larval de rainhas, não no quinto
instar (Figura 6B), de certa forma contradizendo o resultado dos microarranjos, onde era visto
como mais expresso durante o quinto instar larval. O padrão de expressão desse gene pode
estar relacionado às diferenças no número de mitocôndrias entre as castas (Hartfelder et al.,
2015).
As proteínas da família Hsp90 são entre as expressas em maior abundancia em
situações de estresse (Xu et al., 2010). Em nossas análises os transcritos do gene hsp90
apresentaram-se mais expressos em ovários de larvas de rainhas (Figura 6C). Nestas, os níveis
de ecdisona são maiores que em operárias (Rachinsky et al. 1990), indicando que esse gene é
modulado por hormônios.
Os níveis de transcritos do gene referente à proteína mitogen-activated kinase
phosphatase-3 (MKP-3) não apresentaram diferença estatisticamente significante entre as
A B
C D
43
castas. Sua expressão apresentou padrão parecido em ambas as castas, com modulação entre
as fases amostradas (Figura 6D).
4.2.4. Outros genes analisados, mas com expressão diferente da identificada nos
microarranjos
Os demais genes analisados: apidaecin 14, Gbpartial; e93, helicase 25e, obp14, tudor
e tubulin (Figura 7) não apresentaram padrão de expressão com diferenças estatisticamente
significantes entre rainhas e operárias.
O gene codificador da proteína apidaecin 14, representante de uma família de
antibióticos peptídicos helicoidais ativos contra bactérias, apresentou maior expressão em
operárias, com um aumento em L5F3, enquanto sua expressão era basal e constante em
ovários de rainha (Figura 7A).
O gene denominado aqui de Gbpartial (GB13966) é predito no genoma de A.
mellifera, mas visto como representando um ORF apenas parcial. O mesmo não se mostrou
diferencialmente expresso em nossas análises (Figura 7B), ao contrário do indicado nos
mircoarranjos.
O gene codificador do fator de transcrição MBLK-1, também conhecido como E93
(GB50048) tem a sua transcrição induzida por ecdisona (Mou et al., 2012). E93 há muito
tempo é considerado como sendo um regulador de morte celular larval, expresso em adultos e
necessário durante a metamorfose além de responder à presença de hormônios (Mou et al.,
2012). Nos ovários das larvas de abelhas melíferas, entretanto, esse gene, ao contrário do
esperado, não apresentou variação em sua expressão, permanecendo constante durante as
fases larvais (Figura 7C). Era esperada uma variação na expressão desse gene entre as castas
nas fases críticas em sua diferenciação uma vez que há variação hormonal entre as fases em
rainhas e operárias (Rachinsky et al., 1990; Hartfelder; Engels, 1998).,
A proteína helicase 25e é conhecida por estar relacionada ao ciclo celular, envolvida
na remodelação de complexos ribonucleo-proteína no núcleo (Meignin; Davis, 2008). Essa
proteína apresentou expressão constante e similar entre as castas (Figura 7D), ao contrário das
diferenças indicadas pelos microarranjos.
Nas análises realizadas nos ovários de ambas as castas, a expressão de gene Obp14 era
levemente, mas estatisticamente não significante maior em rainhas durante o quarto instar,
diminuindo nos estágios seguintes. Em operárias, esse gene apresentou um leve pico em L5F1
(Figura 7E). Assim como Obp14, outras proteínas da família de Olfactory Binding Proteins já
44
foram encontradas neste tecido, como Obp9, expresso em ovários de rainha (Foret; Maleszka,
2006).
A proteína globular, tubulin beta-1, apresentou padrão contrário aos resultados dos
microarranjos. Enquanto os transcritos de tubulin beta-1 tinham sido detectados como mais
expressos durante o quinto instar em rainha, nos ensaios RT-qPCR mostraram-se mais
expressos em operárias, com um pico significante maior em L5F1 (Figura 7F).
A proteína tudor foi identificada inicialmente em Drosophila melanogaster como fator
de esterilidade (Boswell, Mahowald, 1985) e em Arabidopsis, onde foi reportado como sendo
envolvido na adaptação a estresse (Yan et al., 2014). Em ovários de rainhas e operárias, a
expressão desse gene se mostrou maior em operárias, porém, não apresentou diferença
significante em relação a rainhas nos primeiros estágios amostrados (Figura 7G). A nossa
hipótese é que a maior expressão de tudor em ovários de operárias possa estar relacionado à
sua função como alvo primário de proteólise associada à morte celular programada, função
previamente identificada em eucariotos (Frey et al., 2010).
45
Figura 7 – Demais genes analisados. Quantificação relativa por RT-qPCR dos níveis dos
transcritos de (A) apidaecin 14, (B) Gbpartial, (C) E93, (D) helicase 25e, (E) obp14, (F)
tubulin e (G) tudor em ovários larvais de rainhas e operárias de Apis mellifera. O cDNA
usado foi de ovários de larvas do quarto (L4) e quinto instar (L5F1, L5F2 e L5F3). Os níveis
relativos de expressão foram calculados conforme detalhado na legenda da Figura 4. São
apresentados a média o erro padrão da média de três amostras biológicas, cada uma delas
analisada em triplicata experimental. Asteriscos indicam diferenças estatisticamente
significantes (two-way ANOVA, teste de comparação múltipla de Sidak; *P <0.05).
A B
C D
E F
G
46
4.3. Tratamento com hormônio juvenil
Apenas os genes diferencialmente expressos foram analisados em resposta ao
tratamento com hormônio juvenil, sendo estes: short-chain dehydrogenase reductase, heat
shock protein 90, hexamerin 70b, apolipoprotein III, 15-hydroxyprostaglandin
dehydrogenase, OCLP-1, heat shock protein 60, elongation factor 1α, mitogen-activated
protein kinase 3 e glycerol-3-phosphate dehydrogenase.
Foi incluído nessa análise a expressão do gene krüppel homolog-1 (kr-h1), que é o
gene de resposta imediata a hormônio juvenil (Jindra et al., 2013), diminuindo sua expressão
com a presença do hormônio. Sua expressão, analisada para confirmar a eficiência do
tratamento com HJ, mostrou-se significativamente aumentada, assim validando o tratamento
realizado (Figura 8).
Figura 8 – Níveis dos transcritos de krüppel homolog-1 (kr-h1) (GB45427) em resposta
ao tratamento in vivo com hormônio juvenil. Larvas L4 receberam aplicações cuticulares
de hormônio juvenil III (10 μg) em acetona. Depois de 6 horas de tratamento os ovários foram
dissecados e preparados para análise por PCR quantitativa. Os resultados foram analisados
por teste de Kruskal-Wallis.
Sete dos dez genes se mostraram significativamente modulados por hormônio juvenil.
Interessantemente, os dois genes que também respondem a ecdisona, o codificador da short
chain dehydrogenase reductase e da heat shock protein 90, eram up-regulados por HJ (Figura
9).
K r h 1
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0 .0
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ão
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lati
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*
*
47
Figura 9 – Genes com expressão aumentada por hormônio juvenil. Os genes short-chain
dehydrogenase reductase (A) e heat shock protein 90 (B) se mostraram mais expressos após
tratamento in vivo com hormônio juvenil. Larvas L4 receberam aplicações cuticulares de
hormônio juvenil III (10 μg) em acetona. Depois de 6 horas de tratamento os ovários foram
dissecados e o RNA preparado para PCR quantitativa. Os resultados foram analisados por
teste de Kruskal-Wallis.
Já a expressão dos genes hexamerin 70b, apolipoprotein III, 15-hydroxyprostaglandin
dehydrogenase, OCLP-1 e heat shock protein 60 eram significativamente down-regulados
pela presença do hormônio (Figura 10).
Os genes elongation factor 1α (EF-1), mitogen-activated protein kinase 3 (MAPK-3) e
glycerol-3-Phosphate Deydrogenase (GPDH), apresentaram diferenças em sua expressão
entre as castas (Figuras 4 e 6), porém, essa expressão não pode ser explicada por uma ação
direta do hormônio juvenil (Figura 11).
Nã
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2
4
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*
*
A B
48
Figura 10 – Genes com expressão diminuída após tratamento com hormônio juvenil.
Quantificação relativa dos transcritos dos genes hexamerin 70b (A), apolipoprotein III (B),
15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (C), OCLP-1 (D) e heat shock protein 60 (E) Larvas
L4 receberam aplicações cuticulares de hormônio juvenil III (10 μg) em acetona. Depois de 6
horas de tratamento os ovários foram dissecados e o RNA preparado para PCR quantitativa.
Os resultados foram analisados por teste de Kruskal-Wallis.
H e x a m e r in 7 0 b
Não
Tra
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49
Figura 11 – Genes com expressão não alterada por hormônio juvenil. Quantificação
relativa por RT-qPCR dos níveis dos transcritos de (A) elongation fator 1α (EF-1), (B)
mitogen-activated protein kinase 3 (MAPK-3), (C) glycerol-3-phosphate dehydrogenase
(GPDH). Larvas L4 receberam aplicações cuticulares de hormônio juvenil III (10 μg) em
acetona. Depois de 6 horas de tratamento os ovários foram dissecados e o RNA preparado
para PCR quantitativa. Os resultados foram analisados por teste de Kruskal-Wallis.
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A B
C
50
_________________________________________________________5. DISCUSSÃO
51
Nos insetos altamente sociais ocorre, a partir da alimentação diferencial recebida
durante o desenvolvimento larval, a diferenciação de um genótipo em dois fenótipos
diferentes. Isso ocorre em resultado a um fenômeno denominado plasticidade fenotípica, em
que, a partir de diferentes condições ambientais torna-se possível a alteração do
desenvolvimento do organismo (Hartfelder; Emlen, 2012; Cameron; Duncan; Dearden, 2013;
Cristino et al., 2006). A alteração do regime alimentar durante o desenvolvimento larval em
abelhas melíferas provoca uma série de reações endógenas e alterações na expressão gênica
resultando nas duas castas femininas, com diferente morfologia, fisiologia, longevidade,
comportamento e principalmente, função na colônia (Winston, 1987; Page; Peng, 2001;
Nijhout, 2003). A ativação do sistema reprodutivo é uma diferença evidente entre rainhas e
operárias. Sendo assim, entender a expressão diferencial modulada por hormônios durante o
desenvolvimento dos ovários nesses indivíduos é de grande importância para o estudo da
determinação de castas.
5.1. Expressão gênica diferencial no desenvolvimento larval dos fenótipos ovárianos
O desenvolvimento das castas em abelhas melíferas se separa em duas fases: a inicial
baseada no desenvolvimento, onde a larva pode mudar sua trajetória pela alimentação
diferencial, seguida da fase comprometida a uma trajetória de desenvolvimento específico
(Evans; Wheeler, 1999; Cameron; Duncan; Dearden, 2013). Diferenças na expressão gênica
entre larvas de rainhas e operárias são observadas desde o início do estágio larval (Evans;
Wheeler, 1999; Evans; Wheeler, 2001; Barchuk et al., 2007). Algumas mudanças se mantêm
durante o desenvolvimento, indicando que as trajetórias casta-específicas no desenvolvimento
são estabelecidas mais cedo do que se pensava (Cameron; Duncan; Dearden, 2013).
Uma das mudanças que se mantêm ao longo do desenvolvimento remete-se à ativação
do sistema reprodutivo. Essa diferenciação morfológica ocorre em resultado à alimentação
diferencial, estabelecendo expressão gênica casta-específica, gerando diferentes bibliotecas
que permitem direcionar abordagens importantes no estudo do dimorfismo das castas
(Humann; Hartfelfer, 2011). Com o objetivo de descobrir genes diferencialmente expressos
potencialmente envolvidos no processo de morte celular programada nos ovários larvais de
operárias, foram geradas bibliotecas gênicas a partir de análises por microarranjos (Fernanda
Carvalho Humann, Angel Roberto Barchuk, resultados não publicados). Por meio destas, 18
52
genes foram selecionados para análise mais aprofundada de seu padrão de expressão e como
esta é modulada pela presença do hormônio juvenil.
Genes com funções parecidas tendem a possuir padrão de expressão parecido, como
ocorre nos genes que codificam enzimas, nestes, a expressão é maior em ovários larvais de
operárias, possuindo um pico de expressão na fase L5F1 (Figura 4). Possivelmente, as
mudanças na alimentação iniciam uma série de eventos moleculares determinantes para a
expressão desses genes nos ovários de operárias, enquanto os em rainhas continuam a crescer
rapidamente (Hartfelder; Steinbrück, 1997).
O gene 15-PGDH (15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase) codifica uma enzima
responsável pelo metabolismo de prostaglandinas (Ensor; Tai, 1995; Persson; Krook;
Jornvall, 1991), atuando em diversos processos fisiológicos e celulares, inclusive estando
associada a câncer em humanos (Myung et al., 2006; Wolf et al., 2006). O aumento da
expressão dessa enzima diminui os níveis de prostaglandinas e seu knockout leva ao aumento
de células tumorais. Essas descobertas sugerem que 15-PGDH seria um supressor tumoral
agindo na regulação negativa dos níveis de prostaglandinas (Myung et al., 2006; Wolf et al.,
2006) de importante interesse farmacológico (Ensor; Tai, 1995). Considerando a função dessa
enzima no controle da proliferação celular, é possível relacionar seu alto nível de expressão
em operárias com a diminuição da proliferação celular e presença de morte celular
programada nos ovários no período amostrado.
15-PGDH possui similaridade de sequência com outras dehydrogenases, tais como as
da família desidrogenase/redutases de cadeia curta (short-chain dehydrogenase reductase,
SDR) (Krook et al., 1993). Essa família de enzimas está envolvida em diferentes aspectos do
metabolismo energético, incluindo a enzima short-chain alcohol dehydrogenase (ADH) de
Drosophila melanogaster, uma das enzimas mais bem estudadas em insetos (Persson; Krook;
Jornvall, 1991). Considera-se que a short-chain dehydrogenase reductase revelada como
diferencialmente expressa nos ovários larvais de abelhas melíferas, possua papel crítico no
metabolismo de lipídios, carboidratos, aminoácidos e fatores hormonais, em rotas metabólicas
na transcrição e vias de sinalização (Kavanagh; Persson; Oppermann, 2008). Guidugli et al.
(2004) detectaram essa enzima em ovários larvais de abelhas melíferas em resposta hormonal,
estando mais expressos em larvas de operárias, padrão também confirmado nos resultados
aqui obtidos. Como os membros dessa família de enzimas possuem papel na conversão de
compostos do metabolismo energético, sua alteração de expressão entre as castas está
possivelmente relacionada ao tipo de alimento recebido durante o desenvolvimento, o que
explicaria sua variação entre as rainhas e operárias.
53
Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) é uma enzima importante no
metabolismo de carboidratos e metabolismo lipídico além de ser um dos principais
contribuintes para a cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria (Merrit et al., 2006). Seu
papel na manutenção de energia e no metabolismo de lipídios faz com que a GPDH seja um
fator essencial em casos de obesidade. Devido à sua função no metabolismo de triglicérides e
no transporte de elétrons, a GPDH exerce importante função no voo em Drosophila
melanogaster (Merrit et al., 2006). Apesar de ter sido considerado um gene de manutenção
celular, com níveis de expressão relativamente constantes (Rodrigues et al., 2014), os
transcritos desse gene variaram consideravelmente nos ovários larvais de rainhas e operárias,
apresentando padrão de expressão similar aos das outras enzimas amostradas, possivelmente
estando relacionada aos eventos moleculares provocados pela alimentação diferencial (Evans;
Wheeler, 1999).
A enzima retinoid-inducible serine carboxypeptidase-like (ACPEP1) é pouco estudada
e é relatada como envolvida na proliferação celular de músculo liso, representando um novo
mediador de remodelação vascular e sendo alvo terapêutico para o tratamento de doenças
vasculares (Lee; Chen; Miano, 2009). Essa enzima pertence a uma família de serina proteases
mais encontradas no reino vegetal onde estão relacionadas ao crescimento e desenvolvimento
e associadas à atividade lisossomal (Kollman et al., 2009). Estudos de perda de função dessa
enzima mostram alteração do crescimento e proliferação celular (Lee; Chen; Miano, 2009). A
nossa hipótese é que, em abelhas, essa enzima estaria atuando junto aos lisossomos, associada
à morte celular nos ovários de operárias, onde se encontra mais expressa.
O gene OCLP-1 é predito como um inibidor de nó de cistina (ICK) e aparentemente é
evolutivamente conservado entre os himenópteros. Anteriormente, sua expressão foi relatada
como omnipresente nos tecidos de todos os membros de abelhas melíferas, funcionando como
um inibidor microbiano, expresso em todos tecidos do corpo (Bloch; Cohen, 2014).
Interessantemente, esse gene mostrou-se mais expresso em ovários larvais de operárias, com
padrão similar às demais enzimas analisadas, apresentando um pico de expressão em
operárias na fase L5F1.
Entre as proteínas associadas a funções de estoque, a apolipoproteina III (apoLp-III),
também se mostrou mais expresso em ovários larvais de operárias (Figura 5A). A proteína é
geralmente encontrada como molécula livre de lipídios na hemolinfa, mas em demanda por
energia, essa proteína sofre alteração conformacional podendo transportar uma grande
quantidade de lipídios (Weers; Ryan, 2006). Essa proteína é considerada importante em
insetos devido a esse papel crucial no transporte de lipídios, com propriedades semelhantes à
54
das apolipoproteínas em vertebrados (Lourenço et al.,2009). Essa proteína serve como fonte
de energia para o metabolismo, desenvolvimento e reprodução em que a modulação de sua
expressão deve estar relacionada ao redirecionamento de recursos no combate a infecções em
resposta à ativação do sistema imunológico (Lourenço et al., 2009).
As hexamerinas, proteínas de estocagem que acumulam na hemolinfa larval, estão
envolvidas no fornecimento de aminoácidos e energia para metamorfose (Lourenço et al.,
2008; Martins et al., 2010). A proteína hexamerina 70b, cujos níveis de transcritos foram
analisados aqui, possui papel na diferenciação de castas estando relacionada à trajetória de
cada larva associada e regulada pela presença de HJ (Cameron; Duncan; Dearden, 2013).
Hex70b é encontrada tanto no citoplasma quanto no núcleo das células, o que implicaria
funções biológicas além da função estocagem para essa proteína, assim como relatado para a
proteína Hex70a (Martins; Bitondi, 2012; Martins et al., 2011).
Conforme Cameron e colaboradores (2013), o gene codificador da Hex70b possui
pouca diferença na sua expressão entre rainhas e operárias, resultado confirmado em nossas
análises (Figura 5B). Apesar disso, esses autores escolheram o gene hex70B entres os
codificadortes das quatro hexamerinas para experimentos de knockdown em larvas de rainhas.
O tratamento com RNAi resultou em mudanças significantes na proporção de indivíduos
fenotipicamente similares a rainhas quando comparado ao grupo controle, apesar de não ter
sido observada diferença significativa nos níveis de expressão entre os grupos. Desta forma,
considera-se que o gene hex70b teria um papel chave no desenvolvimento das castas uma vez
que o destino da larva está definido, implicando que sua expressão pode mudar a trajetória da
larva possivelmente agindo na regulação da atividade do HJ (Cameron; Duncan; Dearden,
2013; Martins et al., 2010).
Quanto a genes relacionados a funções envolvidos na transcrição, tradução,
enovelamento de proteínas e genes envolvidos na produção de energia, Cameron e
colaboradores (2013) evidenciaram que larvas destinadas a serem rainhas possuem altos
níveis de expressão destes genes. De acordo, dos genes selecionados e analisados neste
trabalho, os genes relacionados à transcrição, vias de sinalização e estocagem (Figuras 6 e 5B)
apresentaram-se mais expressos em ovários larvais de rainhas.
Muitos estudos têm demonstrado que é comum genes utilizados como controles
endógenos apresentarem variação de expressão em diferentes condições experimentais (Pan et
al., 2015). O fator de alongamento EF-1(elongation factor 1) consiste de três proteínas: EF-
1α, EF-1β e EF-1γ, em que EF-1α catalisa o transporte de aminoacil-tRNA para o ribossomo
80 S (Walldorf; Hovemannl, 1990). Por estar relacionado à tradução, esse gene é utilizado
55
como gene de controle endógeno em experimentos de análise de expressão, participando na
fase crucial de interpretação de resultados (Rodrigues et al., 2014). O gene codificador do EF-
1α foi analisado em abelhas melíferas (Lourenço et al., 2008), em Diabrotica virgifera
virgifera (Rodrigues et al., 2014) e em Danaus plexippus (Pan et al., 2015) Em todos esses
trabalhos, o gene era um gene com expressão estável nas diferentes situações amostradas
(fases de desenvolvimento, tecido, sexo) e após diversos tratamentos. Ao contrario do
esperado, em nossas análises o gene mostrou-se significantemente mais expresso em ovários
larvais de rainhas e com expressão variável entre os estágios larvais amostrados, assim sendo
claramente inapropriado para uso como normalizador endógeno neste tecido em Apis
mellifera.
Proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas altamente conservadas, encontradas
em todas as células procarióticas e eucarióticas (Bajzert; Stefaniak, 2015). A proteína dessa
família, a Hsp90, foi relatada como expressa em níveis constantes em situações não
patológicas, sendo considerada um gene de manutenção ou housekeeping gene (Rodrigues et
al., 2014). Essa proteína também é abundante em células não estressadas, onde desempenha
funções no controle de atividade e tráfico de proteínas envolvidas na transdução de sinal
(Pratt; Toft, 2008). As nossas análises revelaram esse gene como diferencialmente expresso
em ovários de rainhas e operárias, estando significativamente mais expresso em ovários de
rainhas em todos os estágios amostrados, porém, sem muita variação entre as fases. A
proteína de estresse Hsp90 encontra-se mais expressa quando o organismo sofre algum tipo de
estresse ambiental, seja por choque térmico, presença de hormônios, ou outros fatores (Xu et
al., 2010). Por estar associado à resposta hormonal, esse gene pode estar funcionalmente
associado aos altos níveis de HJ e ecdisona nas larvas de rainha (Rachinsky et al. 1990).
O gene codificador do precursor mitocondrial Hsp60 também se mostrou mais
expresso em ovários de rainhas, expressão possivelmente relacionada ao número maior de
mitocôndrias nesta casta (Hartfelder et al., 2015). Adicionalmente ao seu papel como proteína
de resposta a estresse, é responsável pelo enovelamento e transporte de proteínas do
citoplasma para a matriz mitocondrial (Cheng; Hartl; Horwich, 1990; Okamoto et al., 2015).
No citoplasma, essa proteína desempenha papel fundamental na prevenção de apoptose, além
de estar relacionada à resposta imune (Kol et al., 2000; Ohashi et al., 2000; Grundtman et al.,
2011; Bajzert; Stefaniak, 2015). Outros estudos têm relacionada Hsp60 a diabetes, câncer e
certos distúrbios imunológicos em mamíferos (Pockley et al., 2000; Grundtman et al., 2011;
Bajzert; Stefaniak, 2015 ).
56
O gene codificador da proteína MAPK-3 (mitogen-activated protein kinase -3)
apresentou expressão padrão parecida entre as castas. A proteína é membro da família MAP
kinases, também conhecidas como kinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs).
MAPK-3 atua em cascatas de sinalização que regulam diversos processos celulares como
proliferação, diferenciação, apoptose e progressão do ciclo celular em resposta a estímulos
extracelulares (Cobb, 1999; Kyriakis; Avrych, 2001; Pearson et al., 2001; Roux; Blenis,
2004). Após sua ativação, cada MAPK fosforila um substrato distinto, incluindo enzimas
regulatórias, proteínas do citoesqueleto, receptores nucleares, reguladores de apoptose e
diversos fatores de transcrição (Roux; Blenis, 2004). Devido a essas funções, MAPK-3 vêm
sido relacionada a diversas doenças em mamíferos, como câncer, obesidade e diabetes (Cui et
al., 2006).
Os demais genes analisados neste projeto não apresentaram diferenças nos níveis de
expressão entre rainhas e operárias (Figura 7). A família de proteínas ligadores de compostos
odorantes (OBPs) já foi encontrada em outros tecidos não olfatórios, sugerindo que devem
possuir funções versáteis em processos fisiológicos e de desenvolvimento (Foret; Maleszka,
2006). Apesar do gene obp14 estar expresso em ovários, sua função não é clara neste tecido,
podendo estar desempenhando papel semelhante em ambas as castas, uma vez que não é
diferencialmente expresso entre elas. As apidaecinas representam uma família de antibióticos
peptídicos helicoidais ativos contra bactérias. São mais encontradas em hemolinfa de abelhas
adultas, e em forma inativa nas larvas (Casteels et al, 1989). Interessantemente, membros
dessa família gênica apareceram em diversos estudos de expressão gênica diferencial,
(Flenniken; Andino, 2013; Mao; Schuler; Berenbaum, 2015), e provavelmente esses genes
possuem função no desenvolvimento larval de abelhas, apesar de não estarem diretamente
envolvidos na diferenciação de castas.
A proteína Tudor têm sido relacionada a diversos processos celulares, tais como
transcrição, processamento de splicing alternativo e manutenção do citoesqueleto (Friberg et
al., 2009). Sem apresentar diferença entre as castas, o gene mostrou uma tendência de ser
mais expresso em operárias no ultimo estágio amostrado (L5F3). Assim, a proteína pode
estaria associada à morte cellular programada devido sua função como alvo primpario de
proteólise (Frey et al., 2010).
E93 é uma proteína da resposta primária a ecdisona, ajudando na regulação de genes
de resposta secundária (Mou et al., 2012). Estudos recentes indicaram que esse fator de
transcrição está relacionado à morfogênese em Blattella germânica, Tribolium castaneum e
Drosophila melanogaster (Belles; Santos, 2014). Além disso, a expressão de E93 era
57
inversamente relacionada à de krüppel homolog-1 (kr-h1), fator de resposta imediata a HJ. A
diminuição de kr-h1 aumentou a expressão de E93, desencadeando a morfogênese precoce em
baratas (Belles; Santos, 2014).
De forma geral, as diferenças na expressão gênica vistas nos ovários comparando
larvas rainha e operária indicam e estão de acordo com a hipótese que redes gênicas
envolvidas no desenvolvimento do sistema reprodutivo desses insetos sociais enfrentaram
pressões de seleção direcionadas sendo efetivamente moduladas em resposta a hormônios
(Evans; Wheeler, 2001). Trata-se de uma questão que merece ser abordada em mais detalhe e,
por meio de tratamento in vitro de ovários larvais com hormônio juvenil seguido de análise de
expressão de alguns dos genes de interesse desse estudo, procuramos dar um passo inicial
nessa direção.
5.2. Efeitos de tratamento com hormônio juvenil sobre expressão gênica
O papel do hormônio juvenil (HJ) está relacionado à regulação do tempo de muda dos
insetos, além de estar envolvido na regulação do tamanho final do inseto, conforme visto por
Mirth e colaboradores (2014) que avaliaram o modo como HJ regula o tamanho do corpo no
desenvolvimento das larvas de Drosophila melanogaster através da sua produção nos corpora
allata (CA). Larvas alatectomizadas eram menores e possuiamm taxa de crescimento menor,
e os efeitos do HJ sobre a taxa de crescimento se mostraram dependentes do fator de
transcrição FOXO, esse regulado pela via de sinalização de insulina. Larvas sem os CA
apresentaram altos níveis de atividade de FOXO, enquanto que a perda de função desse fator
de transcrição alterou o funcionamento dos CA, afetando o tamanho final do corpo. Além
disso, o efeito de HJ no crescimento aparece mediado também, pela síntese de ecdisona na
glândula protorácica. Ou seja, o HJ regula a taxa de crescimento do corpo larval através de
efeitos sobre as vias de ecdisona e insulina. Em Manduca sexta, o HJ regula a duração do
crescimento em relação ao peso crítico, ponto que determina o fim do crescimento e começo
da metamorfose (Mirth et al., 2014).
Considera-se que muitos aspectos da diferenciação de castas estão controlados por
hormônios que, por sua vez, controlam a expressão gênica diferencial. Interessantemente, os
níveis de expressão dos genes que respondem diretamente à presença de hormônios, o short-
shain dehydrogenase reductase e heat shock protein 90 aumentam na presença de HJ.
Guidugli e colaboradores (2004) detectaram o gene short-chain dehydrogenase reductase
como diferencialmente expresso em ovários larvais de abelhas melíferas em resposta a
ecdisteróides. A regulação hormonal na determinação de castas é bem estudada (Hartfelder;
58
Engels, 1998; Hartfelder et al., 2015), mas pouco se sabe sobre os mecanismos destes dois
genes que estariam respondendo diretamente à presença hormonal, uma vez que a sua
expressão nos ovários tratados se assimila aos nosd ovários de rainhas.
Quanto às hexamerinas, Martins e colaboradores (2010) observaram que em larvas
tratadas no final da fase de alimentação do último estágio larval (L5F), HJ aumentou os níveis
de da expressão de hexamerinas em larvas de operárias. O contrário foi observado em nosso
trabalho, em que o tratamento com HJ em larvas de operárias diminuiu a expressão do gene
hex70b (Figura 10A). Essa divergência na resposta hormonal pode ser explicada pela
diferença das fases amostradas e do tecido coletado. Nos ovários, a expressão deste gene era
menor no fim da alimentação larval, explicando seu aumento nessa fase após o tratamento
com HJ, enquanto o padrão era inverso no momento de tratamento, na fase L4. Estes
resultados levam à hipótese de que o título de HJ está relacionado à interação com
hexamerinas, e que Hex70b teria papel no controle da ação do HJ, fazendo parte de um
complexo multiproteico envolvido no sequestro e transporte desse hormônio (Cunha et al.,
2005; Martins et al., 2010).
Assim como hex70b, os genes relacionados à demanda de energia, o apoLp-III, o 15-
PGDH, o OCLP-1 e o precursor mitocondrial hsp60, eram down-regulados pelo tratamento
com HJ (Figura 10). Esses genes encontravam-se mais expressos em ovários larvais de
operárias, e quando tratados com HJ, sua expressão diminuiu, assimilando-se à expressão
desses genes em ovários larvais de rainhas. Estes resultados estão de acordo com os de
Guidugli e colaboradores (2004) que detectaram genes codificadores de enzimas como
diferencialmente expressas em ovários larvais de abelhas melíferas em resposta ao tratamento
hormonal. Como estão relacionadas à conversão de energia e consequente metabolismo
energético, a alteração da expressão desses genes na presença do HJ pode estar relacionada ao
tipo de alimento recebido durante o desenvolvimento e como esta altera os níveis de
hormônio (Kavanagh; Persson; Oppermann, 2008).
Apesar de terem apresentado padrão de expressão diferencial entre as castas, a
expressão dos genes codificadores de EF-1, MAPK-3 e GPDH não se mostrou modulada pela
presença de HJ (Figura 11), esse resultado pode estar relacionado à função de manutenção
celular exercida por esses genes. (Roux; Blenis, 2004; Pan et al., 2015; Rodrigues et al.,
2014).
59
_______________________________________________________6. CONCLUSÕES
60
- A partir de resultados prévios de microarranjos foram selecionados 18 genes para análise
mais detalhada dos seus níveis de transcritos ao longo do desenvolvimento larval dos ovários
de rainhas e operárias. Diferenças estatisticamente significantes foram observadas em 11 dos
18 genes, indicando um papel importante destes no desenvolvimento casta-específico dos
ovários.
- Entre esses 11 genes, seis eram mais expressos em ovários de rainhas e cinco em operárias.
E nessa divisão de padrão de expressão notou-se uma certa associação com funções gênicas,
sendo que entre os mais expressos em operárias a maioria codifica para enzimas, enquanto
entre os mais expressos em rainhas predominam funções de regulação (tradução, estrutura
protéica, vias de sinalização). Concluimos que tal divisão funcional deve estar associada a
processos de morte celular programada nas operárias versus desenvolvimento progressivo dos
ovários em rainhas.
- Os resultados indicam que as castas no sexo feminino compartilham genes e módulos de
regulação durante o desenvolvimento dos órgãos reprodutivos no período larval. Visto desse
modo, os genes revelados como diferencialmente expressos em ovários e sob controle
hormonal, podem ter funções relevantes também no desenvolvimento das gônadas dos
zangões, posicionando-os assim como o problema biológico maior, o de como gerar sistemas
gonadais divergentes.
61
_____________________________________7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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73
____________________________________________________________8. ANEXOS
74
ANEXO 1 – Curvas de dissociação dos produtos amplificados em RT-qPCR.
75
ANEXO 2 – Curvas da avaliação da eficiência dos primers.
