UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
Bruno Augusto Moreira Ribeiro
Síntese de nanocompósitos híbridos luminescentes
biocompatíveis
Lorena
2013
BRUNO AUGUSTO MOREIRA RIBEIRO
Síntese de nanocompósitos híbridos luminescentes biocompatíveis
Trabalho de conclusão de curso apresentado à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título Engenheiro Químico.
Orientador: Prof. Dr. Domingos Sávio Giordani
Lorena, 2013
Dedico este trabalho ao meu pai Sidnei,
minha mãe Ivete, minha irmã Ana Paula
e toda a minha família.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. José Paulo Sequeira Farina e ao Prof. Dr. Carlos Miguel
Calisto Baleizão pela oportunidade de realizar este trabalho no Centro
Química-Física Molecular (CQFM) em Lisboa, Portugal. Pela ótima orientação
recebida, paciência, ensinamentos, amizade e apoio para realização deste
projeto.
A todos os membros do CQFM pela oportunidade de convivência durante
a execução deste trabalho, tornando o ambiente bastante agradável. Em
principal a Sofia Martins e André Costa pela boa amizade, boa vontade,
ensinamentos, dicas valiosas e boas orientações, facilitando a execução deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Amilton Martins dos Santos pelos ensinamentos que levarei
para o resto da minha vida, pela confiança, paciência, amizade e orientações
que foram fundamentais para o meu crescimento profissional.
Ao Prof. Dr. Domingos Savío Giordani pela atenção e orientação deste
trabalho.
Aos meus pais Ivete e Sidnei, a minha irmã Ana Paula e toda a minha
família.
À Gizelda e a Simone que sempre me ajudaram com muita boa vontade e
amizade no LabPol.
Aos meus amigos no LabPol., pela amizade e boa vontade. Em especial
ao Rafael Caetano Jardim Pinto da Silva pela orientação, paciência e
ensinamento, que foram fundamentais na minha carreira.
"Imaginação é mais importante do que
conhecimento" (Albert Einstein)
"Para que tanta afobação? O futuro
sempre chega a uma velocidade
constante de 60 minutos por hora"
(Albert Einstein)
Resumo
Este projeto tem como objetivo a síntese de nanopartículas híbridas
luminescentes tipo núcleo-casca (“core-shell”), com núcleo de sílica e casca
polimérica. A superfície das partículas de sílica, obtidas pelo processo sol-gel,
foi modificada com um agente de transferência de cadeia, posteriormente
usado para sintetizar a casca polimérica pelo método de polimerização
radicalar controlada por Transferência Reversível de Cadeia por Adição-
Fragmentação (RAFT). Utilizou-se um copolímero biocompatível e
termossensível (“smart polymer”), formado a partir dos monômeros oligo(etileno
glicol)metacrilato (OEGMA) e 2-(2’metoxi-etoxi)etil-metacrilato (MEO2-MA). Foi
feita a incorporação de um corante fluorescente de elevado rendimento
quântico, derivado do perilenodiimida contendo dois grupos trietoxisilano (PDI),
na sílica (núcleo), permitindo a utilização destas partículas em técnicas de
imagem avançada, especificamente utilizando microscopia de varredura a
laser;
A caracterização das nanopartículas ao longo do processo de preparação
foi feito utilizando as técnicas de espalhamento dinâmico de luz (DLS), análise
de rasto de nanopartículas (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA), microscopia
eletrônica de transmissão (TEM), microscopia eletrônica de varredura (SEM),
microscopia de força atômica (AFM), ressonância magnética nuclear (NMR),
determinação do potencial zeta (ZP).
Obteve-se sucesso na síntese da sílica contendo o PDI, com diâmetro de
partícula (DP) médio de 189nm. Sucesso na modificação da superfície da sílica
com APTES, obtendo um grau de enxerto de 2 moléculas de APTES por nm2
de sílica. Sucesso na síntese do agente RAFT, obtendo um produto de elevada
pureza. Sucesso no acoplamento do agente RAFT na superfície da sílica,
obtendo 0,0445mMol de agente RAFT por grama de sílica. Sucesso na síntese
dos nanocompósitos híbridos, observando a variação do DP com a variação da
temperatura.
Lista de Figuras
Figura 1 - Relação de área superficial/volume para diversas geometrias de
nanocarga . ........................................................................................................ 18
Figura 2 - Esquema simplificado da síntese da partícula de sílica. ................... 20
Figura 3 - Esquema da modificação da superfície da sílica com agente silano.
........................................................................................................................... 21
Figura 4 - Representação dos possíveis mecanismos de nucleação de uma
polimerização em emulsão na presença de partículas inorgânicas modificadas
com moléculas reativas ..................................................................................... 22
Figura 5 - Influência do tamanho da cadeia de PEG na LCST do polímero. ..... 26
Figura 6 - Esquema da síntese SiO2 / PMPTS a partir da superfície da sílica via
polimerização ATRP .......................................................................................... 28
Figura 7 - Síntese do copolímero sensível à temperatura na superfície da sílica.
........................................................................................................................... 29
Figura 8 - Resultado da fluorescência liberada pelos nanocontentor em pH
ácido e básico. ................................................................................................... 30
Figura 9 - Esquema da modificação da superfície da sílica. ............................. 36
Figura 10 - Esquema da reação com Fmoc-Gh-Oh. ......................................... 38
Figura 11 - Esquema da quantificação de grupos aminas na superfície da
partícula. ............................................................................................................ 39
Figura 12 - Esquema da síntese do agente RAFT. ........................................... 40
Figura 13 - Síntese da sílica-RAFT. .................................................................. 41
Figura 14 - Imagens de TEM (A), SEM (B) e AFM (C) com distribuição de
tamanho das nanopartículas de sílica, a partir das contagens pelas imagens do
TEM. .................................................................................................................. 46
Figura 15 - Espectro de emissão das partículas fluorescentes. ........................ 47
Figura 16 - Quantificação dos grupas aminas. .................................................. 48
Figura 17 - Espectro de RMN 1H do agente RAFT. ........................................... 49
Figura 18 - Resultados obtidos na calibração do RAFT em dioxano. ............... 50
Figura 19 - Espectro das partículas modificas com o agente RAFT. ................ 51
Figura 20 - Síntese do polímero na superfície das nanopartículas. .................. 53
Figura 21 - Imagens de TEM (A) e SEM (B) com distribuição de tamanho das
nanopartículas de sílica com polímero. ............................................................. 54
Figura 22 - Variação do Dp em função da temperatura através da técnica de
Espalhamento de Luz Dinâmico. ....................................................................... 55
Figura 23 - Imagens de TEM (A) e SEM (B) com distribuição de tamanho das
nanopartículas de sílica com polímero. ............................................................. 57
Figura 24 - Variação do Dp em função da temperatura através da técnica de
Espalhamento de Luz Dinâmico. ....................................................................... 58
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Principais tipos de agente RAFT tiocarbonílicos. ............................. 31
Tabela 2 - Condições experimentais utilizadas nas polimerizações em solução
........................................................................................................................... 42
Tabela 3 - Potencial Zeta. .................................................................................. 48
Tabela 4 - Potencial Zeta ................................................................................... 52
Tabela 5 - Potencial Zeta. .................................................................................. 56
Tabela 6 - Resultado obtido pela análise do GPC ............................................. 56
Tabela 7 - Potencial Zeta. .................................................................................. 58
Tabela 8 - Resultado obtido pela análise do GPC ............................................. 59
Glossário
AFM............................Microscopia de Força Atômica
AIBN...........................2,2′-Azobis(2-metilpropilnitrila)
APTES........................3-aminopropiltrietoxisilano
ATRP...........................Polimerização Radicalar por Transferência de Átomo
CMC............................Compósitos de matriz cerâmica
CMM............................Compósitos de matriz metálica
CMP.............................Compósitos de matriz polimérica
CRP..............................Polimerizações radicalares controladas
CTA..............................Agente de Transferência de Cadeia
DIPEA...........................N,N-diisopropil-etilamina
DLS...............................Espalhamento de Luz Dinâmico
EDC..............................N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
GPC..............................Cromatografia de Permeação em Gel
LCST.............................Temperatura Crítica Inferior de Solubilidade
MAPMA..........................2 - (N-metil-N-(4-piridil) amino) de metacrilato de etila
MEO2-MA...................... 2-(2’Metoxi-Etoxi)etil Metacrilato
MPTS..............................γ-metacriloxi-propil-trimetoxi silano
MPS................................Metacril-oxi-propil trimetoxisilano
Mn...................................Massa molar numérica média
Mw..................................Massa molar ponderada
NMP................................Polimerizações mediadas por nitróxidos
NMP.................................N-metil-2-pirrolidona
OEGMA...........................Oligo (Etileno glicol) Metacrilato
PEG.................................Poli(Etileno Glicol)
PDI...................................Bis(propil)trietoxisilano perilenodiimida
PNIPAM......................... Poli(N-isopropilacrilamida)
PyBOP............................(Benzotriazo-1-il-oxi)-tripirrolidona-fosfonil-hexafluoro-fosfato
RAFT.............................Transferência Reversível de Cadeia por Adição-Fragmentação
SEM...............................Microscopia Eletrônica por Varredura
TEGMMA.......................Metacrilato de methoxytri (etileno glicol)
TEM...............................Microscopia eletrônica de transmissão
TEOS.............................Tetraetoxisilano
THF................................Tetrahidrofurano
UCST.............................Temperatura crítica superior de solubilização
ZP..................................Potencial Zeta
Sumário
1. Introdução ........................................................................................... 15
2. Revisão bibliográfica .......................................................................... 17
2.1. Compósitos .................................................................................. 17
2.2. Nanocompósitos .......................................................................... 17
2.3. Nanocompósitos de matriz polimérica ......................................... 19
2.4. Modificação da superfície da sílica .............................................. 20
2.5. Polímeros sensíveis a estímulos ................................................. 22
2.6. Polímeros sensíveis à variação de pH ......................................... 23
2.7. Polímeros sensíveis à variação de temperatura .......................... 24
2.8. Modificação da superfície da sílica com agentes controladores de
cadeia 27
2.9. Polimerização via RAFT .............................................................. 30
3. Objetivo .............................................................................................. 34
4. Materiais e Métodos ........................................................................... 34
4.1. Reagentes .................................................................................... 34
4.2. Metodologias ................................................................................ 35
Síntese das nanopartículas de sílica ..................................... 35 4.2.1.
Modificação da superfície da sílica ....................................... 36 4.2.2.
Quantificação dos grupos aminas na superfície das 4.2.3.
nanopartículas de sílica .............................................................................. 37
Síntese do agente de transferência de cadeia ...................... 39 4.2.4.
Síntese da sílica-RAFT ......................................................... 40 4.2.5.
Polimerização em redispersão .............................................. 41 4.2.6.
Clivagem do polímero enxertado na superfície da sílica para a 4.2.7.
caracterização por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) .............. 42
4.3. Caracterização dos materiais ...................................................... 42
5. Resultados e Discussões ................................................................... 45
5.1. Síntese das nanopartículas de sílica ........................................... 45
5.2. Síntese da sílica-APTES .............................................................. 47
5.3. Síntese do agente de transferência de cadeia, agente RAFT ..... 49
5.4. Síntese da sílica-RAFT ................................................................ 50
5.5. Polimerização em redispersão via RAFT ..................................... 53
6. Conclusões ......................................................................................... 59
7. Dificuldades encontradas durante o projeto ....................................... 60
8. Evolução do projeto ............................................................................ 60
15
1. Introdução
Atualmente o estudo em biopolímeros sensíveis a estímulos vêm
chamando a atenção dos pesquisadores devido ao seu grande potencial na
aplicação em nanotecnologia e biomedicina. Nesse contexto biopolímeros
sensíveis à temperatura se destacam por apresentarem características
extremamente úteis para aplicação em biomedicina, separação biológica,
superfície bioativas e “ drug delivery” [1].
Polímeros termossensíveis são macromoléculas que sofrem mudanças
de fase, de um estado solúvel para insolúvel, dependendo do gradiente de
temperatura da solução aquosa. Os polímeros que precipitam com o
aquecimento da solução aquosa a uma temperatura superior a LCST
(Temperatura Crítica Inferior de Solubilização), ou seja, o aumento da
temperatura da solução aquosa acima da LCST causa transição do estado em
que as cadeias se encontram hidratadas para um estado em que as cadeias se
encontram na forma de aglomerados. O mesmo efeito é observado quando os
polímeros precipitam com o arrefecimento da solução aquosa, assim pode-se
dizer que a solução está a uma temperatura superior a UCST (Temperatura
Crítica Superior de Solubilização).
Nos últimos anos pesquisadores vêm priorizarando a síntese de
biopolímeros termossensíveis à base de PEGs como Poli((Oligoetileno glicol)
Metacrilato) ou Poli((Oligoetileno glicol) Acrilato). Esses biopolímeros
apresentam propriedades químicas desejáveis que os tornam extremamente
úteis para aplicações biológicas e farmacêuticas, com um grande potencial no
ramo da nanotecnologia, com o objetivo principal na liberação controlada de
fármacos.
16
Através da nanotecnologia, pesquisadores sintetizaram nanocompósitos
“core-shell”, constituídos por um núcleo inorgânico e uma casca polimérica.
Esses nanocompósitos apresentam uma grande aplicação na área biomédica,
por apresentarem um mecanismo de abertura e fechamento, através de
estímulos, em nanopartículas inorgânicas porosas.
Porém, é de extrema importância sintetizar a casca polimérica utilizando
um mecanismo de polimerização radicalar controlada, pois sem o controle da
polimerização a resposta a estímulos torna-se bastante prejudicada. Neste
contexto, a Polimerização Radicalar por Transferência de Átomo (ATRP)
ganhou destaque. Entretanto, não existe na literatura nanocompósitos
fluorescentes à base de PEGs, utilizando um mecanismo de polimerização
radicalar controlada por Transferência Reversível de Cadeia por Adição-
Fragmentação (RAFT).
Portanto, este projeto teve como objetivo a síntese da sílica coloidal
fluorescente recoberta com biopolímero a base de PEGs, utilizando o
mecanismo de polimerização radicalar controlada por Transferência Reversível
de Cadeia por Adição-Fragmentação, de forma a criar um mecanismo de
liberação de fármaco e monitoramento das nanopartículas na célula.
17
2. Revisão bibliográfica
2.1. Compósitos
Materiais compósitos podem ser definidos como materiais formados de
dois ou mais constituintes com distintas composições químicas, estruturas e
propriedades e que estão separados por uma interface. Estes materiais, por
sua vez, exibem as propriedades de ambas as fases que os constituem, de tal
maneira que se obtém uma melhor combinação de suas propriedades [2].
Os materiais compósitos são geralmente formados por duas fases; a
primeira fase é conhecida como matriz, a qual deve ser contínua. A segunda
fase, a qual é chamada de fase dispersa ou simplesmente carga. Assim os
diferentes tipos de compósitos podem ser classificados em três classes
principais, agrupados de acordo com a natureza da matriz: compósitos de
matriz cerâmica (CMC), compósitos de matriz metálica (CMM) e compósitos de
matriz polimérica (CMP) [3].
2.2. Nanocompósitos
São considerados nanocompósitos os materiais híbridos que apresentam
uma das fases contendo pelo menos uma de suas dimensões em escala
nanométrica, na ordem de 1 a 100 nm. Os nanocompósitos representam uma
nova classe de materiais, podendo ser polímeros, cerâmicos ou metais.
Atualmente, o interesse em nanotecnologia engloba diversas áreas e
encontra diversas aplicações, como nanobiotecnologia, nanoeletrônicos e
materiais nanoestruturados, dos quais os nanocompósitos representam uma
parcela significativa.
18
Podem-se distinguir três tipos de nanocompósitos, dependendo de
quantas dimensões dos objetos dispersos estão na escala nanométrica,
conforme ilustrado na Figura 1.
Figura 1 - Relação de área superficial/volume para diversas geometrias de nanocarga [4].
Quando as três dimensões estão na ordem de nanômetros, trata-se de
nanocargas isodimensionais que podem ser obtidas através da polimerização
promovida diretamente das superfícies das partículas de sílica [5], podendo
nestas nanocargas serem incluídos também grupamentos semicondutores [6],
entre outros [7].
Se apenas duas dimensões se encontram na escala nanométrica e a
terceira possui dimensão maior, formando uma estrutura alongada, os mesmos
são chamados de nanotubos ou nanofilamentos, como por exemplo, os
nanotubos de carbono [8], os nanotubos de gadolínio [9], os filamentos de
celulose [10] ou ainda, imogolita sintética [11]. Estes tipos de materiais vêm sendo
estudados extensivamente como nanocargas de reforço e permitem a obtenção
de novos materiais com propriedades diferenciadas.
Por fim, o terceiro tipo de nanocarga é caracterizado por possuir apenas
uma dimensão na escala nanométrica. Neste caso, a carga apresenta-se na
19
forma de folha com espessura de um a poucos nanômetros, enquanto que sua
largura e comprimento podem possuir até centenas de nanômetros. Um
exemplo deste tipo de nanocompósito são os nanocompósitos do tipo polímero-
silicatos lamelares.
2.3. Nanocompósitos de matriz polimérica
Atualmente vem crescendo o interesse na síntese de nanocompósitos
caracterizado por partículas inorgânicas dispersas em uma matriz polimérica. A
incorporação de cargas inorgânicas em polímeros origina materiais com maior
resistência mecânica, maior estabilidade térmica ou com propriedades ópticas,
magnéticas ou elétricas superiores, ou seja, combinam as vantagens dos
materiais inorgânicos, como a sua rigidez e estabilidade térmica, com as
vantagens dos materiais orgânicos, como a sua flexibilidade [12].
Entretanto, a incorporação de partículas muito pequenas em polímeros
não leva necessariamente a um forte aumento da resistência. De fato,
partículas muito finamente divididas tendem a aglomerar e são extremamente
difíceis de dispersar [13]. Além disso, a incorporação de inclusões micrométricas
leva a uma perda de transparência devido ao espalhamento de luz [14]. A falta
de afinidade entre a nanocarga inorgânica e o polímero causa aglomeração do
mineral na matriz polimérica. Portanto, modificações na superfície da carga
facilitam a compatibilidade para que se obtenha uma boa dispersão e se
obtenha propriedades físicas superiores.
20
2.4. Modificação da superfície da sílica
As nanoesferas de sílica foram sintetizados pela primeira vez na década
de 60, por Stöber et al. [15]. Stöber reportou um método para preparar partículas
de sílica perfeitamente esféricas e monodispersas com qualidade suficiente
para condensar matrizes perfeitamente ordenadas. A principal vantagem deste
método é a síntese de partículas com tamanho controlado. Estas
nanopartículas são formadas através de hidrólise e condensação de um alquil
silicato em uma solução alcoólica na presença de amônia, sendo que a amônia
é utilizada como catalisador [15]. A Figura 2 apresenta um esquema simplificado
da síntese da partícula de sílica através da hidrólise e condensação do
Tetraetoxisilano (TEOS) pelo método de Stöber.
Figura 2 - Esquema simplificado da síntese da partícula de sílica.
Entretanto o crescente interesse em materiais híbridos gerou a
necessidade da modificação química da superfície das partículas de sílica,
visando melhorar as interações intermoleculares, facilitando a compatibilidade
entre as partículas de sílica (inorgânico) e o polímero (orgânico).
21
Os grupos hidroxílicos na superfície das partículas de sílica podem ser
facilmente adaptados com compostos orgânicos ou polímeros, desde que
sejam funcionalizados com agentes de acoplamento adequados. A superfície
da sílica pode ser modificada com alquiltrialcoxisilanos (agente de acoplamento
silano), possibilitando a interação entre a sílica e o polímero. A Figura 3 ilustra
um esquema da modificação da superfície da sílica.
Figura 3 - Esquema da modificação da superfície da sílica com agente silano.
Bourgeat-Lami et al. [16] encapsularam nanopartículas de sílica
previamente modificadas com agente de acoplamento silano, metacril-oxi-propil
trimetoxisilano (MPS), via polimerização em emulsão na presença dos
monômeros: estireno, acrilato de n-butila e metacrilato de butila, em meio
aquoso/alcoólico. As partículas de sílica foram todas cobertas pelos polímeros,
indicando o sucesso desta técnica de encapsulação. Eles mostraram que o
sucesso na encapsulação depende do tamanho e da concentração da sílica.
O mesmo grupo também investigou a influência do grau de enxertia de
MPS e da natureza do surfatante sobre a cinética de polimerização e sobre a
morfologia das partículas, via polimerização em emulsão. Foi demonstrado que
variando a densidade de ligações duplas reativas, ou seja, o grau de
concentração do agente de acoplamento silano (MPS) na superfície das
OHOH
OHOH
OHOH
HOHO
HO
HO
HOHO
SiO2
X
SiX
X
R+ Solvente
OHO
OO
OO
HOHOO
HO
OO
SiO2 SiR
X: -OC2H5, -OCH3, Cl
R: -COOH, -Br, -Cl, -I, -NH2, -SH, -OH, -NCO, etc.
22
partículas de sílica ou a natureza do surfatante, diferentes morfologias podem
ser obtidas [16], como ilustra a Figura 4.
Figura 4 - Representação dos possíveis mecanismos de nucleação de uma polimerização em emulsão na presença de partículas inorgânicas modificadas com moléculas reativas - (adaptado de Bourgeat-Lami e
Lansalot [16])
Quando se aumenta o grau de enxertia do agente de acoplamento silano
na superfície da sílica, permite-se a encapsulação na nanocarga, devido a uma
captura eficiente de radicas. Quando o grau de enxertia é baixo, as cadeias
poliméricas se formam em domínios separados devido à presença de grupos
silanóis que não reagiram.
2.5. Polímeros sensíveis a estímulos
Polímeros sensíveis a estímulos são materiais que respondem a
pequenas alterações do meio, tais como temperatura, pH, força iônica, entre
outros, causando uma mudanças drásticas em suas propriedades químicas ou
físicas. Essas respostas são manifestadas como mudança de forma,
características de superfície, solubilidade, etc. A temperatura e o pH são os
estímulos mais utilizados nos sistemas constituídos por esses polímeros,
devido a grande importância para aplicações biomédicas [17].
Partícula de Sílica funcionalizada com MPS
Polimerização em Emulsão
23
Os polímeros sensíveis a estímulos utilizados em aplicações biomédicas
apresentam grupos funcionais em suas macrocadeias capazes de formar
interações com outras moléculas. Macromoléculas hidrossolúveis funcionais
incluem polímeros com várias arquiteturas que podem ser eletricamente
carregadas ou possuir grupos capazes de formar pontes de hidrogênio com
outras substâncias, levando a interações físicas reversíveis.
As propriedades dos polímeros sensíveis a estímulos, em geral, tais como
solubilidade, viscosidade, transparência e condutividade, podem ser
controladas modificando-se a estrutura e organização das cadeias poliméricas.
Tal característica permite a utilização destes polímeros como agentes de
liberação controlada de princípios ativos, entre outras aplicações [18].
2.6. Polímeros sensíveis à variação de pH
Polímeros sensíveis ao pH são materiais capazes de variar suas
dimensões, sofrendo colapso ou intumescimento, devido às alterações no pH
do meio no qual se encontram. Este comportamento é atribuído a determinados
grupos funcionais presentes nestes materiais. Basicamente, estes polímeros
podem ser classificados em macromoléculas que apresentam grupos ácidos, (-
COOH, -SO3H) ou que apresentam grupamentos básicos (-NH2) [19].
Os polímeros sensíveis ao pH encontram aplicações potenciais em
sistemas de transporte e liberação controlada de drogas. O pH fisiológico varia
entre 1,2 e 7,4, sendo que o estômago, por exemplo, possui pH igual a 1,2,
enquanto o pH do intestino é de 7,4. Dessa forma, polímeros sensíveis ao pH
possuem particular relevância na liberação controlada de fármaco ou peptídeos
em regiões específicas do trato gastrointestinal, por exemplo. A liberação pode
24
igualmente ser feita por meio de pequenas mudanças de pH em tecidos com
doenças patológicas, tal como os tumores [20].
2.7. Polímeros sensíveis à variação de temperatura
Polímeros termossensíveis são materiais capazes de alterar alguma de
suas propriedades em função de uma alteração na temperatura do meio. Estes
materiais, quando se encontram em solução, variam determinadas
propriedades físicas em resposta à alteração da temperatura do meio no qual
se encontram. Em certa temperatura tais materiais exibem uma transição de
fases que resulta em mudanças na conformação, solubilidade e balanço
hidrofóbico-hidrofílico.
Polímeros termossensíveis podem exibir características hidrofóbicas
acima de certo valor de temperatura, isto é, sua solubilidade diminui e abaixo
deste valor, denominado temperatura crítica inferior de solubilização ou “lower
critical solution temperature” (LCST), as interações entre as macro-cadeias e a
água se tornam dominantes, levando à solubilização do polímero. Por outro
lado, existem macromoléculas que se tornam solúveis sob aquecimento,
apresentando assim a chamada UCST (temperatura crítica superior de
solubilização ou “upper critical solution temperature”). Os conceitos de LCST e
UCST não são restritos a sistemas que apresentam solventes aquosos, mas
somente estes são adequados para aplicações biomédicas [21].
Diversos polímeros são conhecidos por possuírem propriedades
termossensíveis, porém o mais estudado é o Poli(N-isopropilacrilamida),
PNIPAM. Entretanto, a maioria dos trabalhos descreve a utilização do PNIPAM
somente para aplicações in vitro. A perda de grupos amidas com a hidrólise
25
das macromoléculas limita o uso deste polímero para aplicações in vivo, devido
à ausência de biocompatibilidade [22].
É neste contexto que os Poli(etileno glicol) e seus derivados como,
Poli((Oligoetileno glicol) Metacrilato) ou Poli((Oligoetileno glicol) Acrilato)
ganharam atenção dos pesquisadores, por possuírem propriedades químicas
desejáveis que os tornam especialmente úteis para aplicações biológicas e
farmacêuticas. Os Poli(OEG-MA) podem ser usados para modificar diversos
materiais biológicos como, superfície de nanopartículas de polímero/proteína
biconjugadas (peptídeos, RNA, etc), conferindo propriedades anti-incrustantes,
melhorando a circulação sanguínea [23].
Os polímeros à base de OEG-MA apresentam diferentes LCSTs
dependendo do comprimento da cadeia lateral de PEG, em caso de
homopolímero, ou dependente da composição da cadeia polimérica, em caso
de copolímero. Lutz et al.[24] investigaram a influência do tamanho da cadeia
lateral de PEG na LCST. Observou-se que houve um aumento da LCST com o
aumento da cadeia lateral de PEG. O Poli(MEO2-MA) apresentou uma LCST
de 29°C, o Poli(MEO3-MA) apresentou uma LCST de 39°C, já o Poli(OEG-MA)
com massa molar de 475 g/mol (repetições de etileno glicol de 8-9) apresentou
uma LCST de 90°C, como representado na Figura 5.
26
Figura 5 - Influência do tamanho da cadeia de PEG na LCST do polímero.
Já Luzon et al.[25] sintetizaram, pela primeira vez, nanocompósitos
híbridos constituídos por um núcleo de nanopartículas de ouro e uma casca de
copolímero a base de PEGs, via polimerização RAFT. Foi demostrado que as
nanopartículas apresentaram um comportamento termossensível ajustável,
com variações de LCST entre 15°C-90°C, dependente da composição da
cadeia polimérica. As nanopartículas também apresentaram uma superfície
anti-incrustante com características hidrofílico-hidrofóbica controláveis,
proveniente da composição do copolímero. Essa nanoestrutura exclusiva
apresenta um grande potencial para aplicação em biomedicina.
27
2.8. Modificação da superfície da sílica com agentes controladores de
cadeia
Na última década, as técnicas de polimerizações radicalares controladas
(CRPs) ou “controlled/living free-radical polymerization” têm sido o foco de
intensa pesquisa, devido a sua versatilidade e ao enorme potencial em suas
aplicações. Com estes novos mecanismos é possível controlar a massa molar
e a distribuição de massas molares dos polímeros, além de possibilitar a
síntese de novos materiais poliméricos com arquiteturas moleculares
complexas. Os mecanismos de polimerização que mais se destacam desse
contexto são a Polimerização Radicalar por Transferência de Átomo (ATRP),
polimerização por Transferência Reversível de Cadeia por Adição-
Fragmentação (RAFT) e polimerizações mediadas por nitróxidos (NMP). Com o
surgimento desses mecanismos foi possível controlar o crescimento da cadeia
polimérica na superfície das partículas de sílica, previamente modificadas.
Wu el al. [26] reportaram a modificação da superfície das partículas de sílica
com 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES), seguida de uma reação para
“ancorar” um pré-iniciador à base de brometo na superfície da partícula. O
objetivo foi realizar uma polimerização via ATRP, utilizando o monômero γ-
metacriloxi-propil-trimetoxi silano (MPTS), como ilustra o esquema da Figura 6.
28
Figura 6 - Esquema da síntese SiO2 / PMPTS a partir da superfície da sílica via polimerização ATRP (adaptado de Wu et al. [26])
O grupo conseguiu obter com sucesso o nanocompósito híbrido com uma
distribuição de massa molar controlada, apresentando Mw/Mn=1,31. O grupo
também observou que as propriedades hidrofóbicas das nanopartículas
híbridas tornaram-se intensas em relação ao polímero puro [26].
Já o grupo de Jiang [27] estudou a influência nas nanopartículas de sílica
na LCST de um copolímero, sensível à temperatura, constituído por metacrilato
de methoxytri (etileno glicol) (TEGMMA) e 2 - (N-metil-N-(4-piridil) amino) de
metacrilato de etila (MAPMA), poli(TEGMMA-co-MAPMA), via polimerização
ATRP. Os resultados mostraram que as transições térmicas começaram a uma
temperatura inferior e estenderam-se por um período de tempo maior em
relação ao polímero puro. A superfície da sílica foi modificada com um iniciador
à base de brometo, em seguida foi feita a polimerização a partir da superfície
da sílica, via ATRP. A Figura 7 ilustra o esquema da síntese do nanocompósito
[27].
29
Figura 7 - Síntese do copolímero sensível à temperatura na superfície da sílica (adaptado de Jiang [27]).
Hong, Li e Pan [28] apresentaram um trabalho pioneiro na síntese de
nanocompósitos. O grupo utilizou partículas de sílica mesoporosas, com
superfície modificada com agente RAFT. Eles também utilizaram um corante,
com características fluorescentes, presentes no interior dos poros das
nanopartículas. Depois se realizou a polimerização do ácido acrílico na
superfície da partícula.
O objetivo foi criar um “nanocontainer” capaz de liberar um corante em
condição de variação de pH, pois o poli(ácido acrílico) é um polímero sensível a
pH. Quando o meio se encontra em condições alcalinas (pH>7) as cadeias
poliméricas do poli(ácido acrílico) ficam hidratadas. Porém, se o meio estiver
em condições ácidas (pH<7) as cadeias poliméricas ficam colapsadas. Essas
condições criam uma abertura ou fechamento dos poros, para a liberação do
corante, como ilustra a Figura 8. O mesmo mecanismo pode ser utilizado para
a liberação controlada de fármacos, que é o grande foco dos pesquisadores na
atualidade.
30
Figura 8 - Resultado da fluorescência liberada pelos nanocontentor em pH ácido e básico (adaptado de Hong, Li e Pan [28]).
2.9. Polimerização via RAFT
A técnica RAFT apresenta vantagens com relação às demais técnicas de
polimerização radicalar controlada devido ao fato de ser compatível com um
extenso número de monômeros, grupos funcionais e técnicas de polimerização
(massa, solução, suspensão, emulsão e miniemulsão) [29].
Um agente de transferência de cadeia típico é constituído do grupo
funcional [RSC(Z)=S], sendo (Z) um grupo estabilizante, e (R), um grupo de
saída. Os grupos estabilizantes e de saída irão influenciar no grau de controle
da polimerização e na cinética da reação.
A eficiência de cada agente RAFT utilizado depende de uma série de
fatores, destacando o tipo de monômero que está sendo polimerizado, a
capacidade de reiniciação do grupo de saída (R) e a reatividade da dupla
ligação entre enxofre (S) e carbono (C), determinada pelo grupo estabilizante
utilizado (Z) [29], conforme apresentado na Tabela 1.
31 Tabela 1 - Principais tipos de agente RAFT tiocarbonílicos.
Na polimerização controlada via RAFT a iniciação ocorre da mesma
maneira que em uma polimerização radicalar convencional: inicialmente, ocorre
a decomposição do iniciador, gerando radicais que irão incorporar unidades do
monômero, formando radicais oligoméricos, iniciando a polimerização:
I 2 R *
R * + M Pm *
Nos primeiros estágios da polimerização, os radicais oligoméricos
gerados no processo de iniciação (Pm*) se adicionam à dupla ligação carbono-
enxofre do agente de transferência (1) dando origem a um radical intermediário
(2) que, logo em seguida, sofrerá decomposição originando um composto
tiocarbonílico polimérico (3) e a um novo radical (R*). Esta primeira etapa do
processo é denominada pré-equilíbrio:
Pm*+
Kp
Monômero
S S R
Z
(1)
Kadd
K -add
S S R
Z
Pm
(2)
KB
K-B
S S
Z
Pm + R*
(3)
32
em que kadd e k-β são as constantes de adição para a formação do radical
intermediário e k-add e kβ são as constantes de fragmentação do radical
intermediário.
A reação deste radical com outras moléculas de monômero dará origem a
um novo radical propagante (Pn *):
R * + M Pn *
Um rápido equilíbrio, conhecido como equilíbrio principal, é então
estabelecido entre as espécies propagantes ativas (Pn * e Pm*) e os
compostos tiocarbonílicos poliméricos dormentes (3 e 5), fornecendo igual
probabilidade para o crescimento de todas as cadeias poliméricas permitindo,
desta maneira, a obtenção de cadeias poliméricas com estreita distribuição de
massas moleculares e aumento linear da massa molar com a conversão do
monômero:
A etapa de terminação ocorre da mesma maneira que uma polimerização
radicalar convencional: a cadeia propagante é desativada sem a formação de
um novo centro ativo, terminando, assim, o crescimento da macromolécula:
Pn * + Pm * "polímero morto"
Em uma polimerização radicalar controlada via RAFT, deve-se escolher
adequadamente a relação [agente RAFT]/[iniciador] pois ela é fator
determinante para a eficiência desse método de polimerização.
33
A concentração de radicais propagantes deverá ser muito menor do que a
concentração de espécies dormentes, com a finalidade de evitar as reações de
terminação, uma vez que estas concorrem com a propagação dos radicais em
crescimento. Essa etapa de propagação é extremamente importante quando se
deseja manter um bom controle da polimerização.
Por isso é utilizada uma pequena quantidade de iniciador e elevadas
razões de [CTA]/[Iniciador]. Por outro lado, razões muito altas conferem
lentidão à reação, podendo comprometer o controle da polimerização. Existe,
portanto, uma condição ótima entre cinética e controle da polimerização,
estabelecida pela razão [CTA]/[Iniciador].
A razão [CTA]/[Iniciador] também influencia na terminação das cadeias
poliméricas com o grupo do agente de transferência (CTA). Quando a razão é
alta, menor é a concentração de iniciador presente no meio, assim menos
radicais serão gerados, diminuindo a probabilidade de terminação com o grupo
pertencente ao CTA. Entretanto, esse valor deve ser próximo ou inferior a 10,
uma vez que a razão [CTA]/[Iniciador] também influencia na cinética de
polimerização [30]. Esse parâmetro é extremamente útil para a realização da
aminólise do grupo trítio ou dítio pertencente ao CTA, formando cadeias com
terminação em SH.
Normalmente pesquisadores utilizam uma razão [CTA]/[Iniciador] próxima
de 5, quando a polimerização chega ao fim, cerca de 90% das cadeias
possuem no final o grupo do agente de transferência (CTA), e os polímeros
podem ser isolados como materiais estáveis e, deste modo, ser utilizados em
novas polimerizações como macro-agentes de transferência de cadeia.
34
3. Objetivo
Este trabalho teve como objetivo sintetizar nanopartículas de sílica/PEGs
pela técnica de polimerização controlada/viva (RAFT). Foram sintetizadas as
nanopartículas de sílica, pelo método de Stöber [15]; o agente RAFT [31] e a
polimerização contendo os monômeros à base de PEGs, Oligo (Etileno glicol)
Metacrilato (OEGMA) e 2-(2’Metoxi-Etoxi)etil Metacrilato (MEO2-MA) [23], para
aplicação em células vivas.
4. Materiais e Métodos
4.1. Reagentes
Etanol absoluto (Panreac, 99,5%); solução de hidróxido de amônia 25%
(Fluka); tetraetoxisilano (TEOS) (Aldrich, 98%); corante bis(propil)trietoxisilano
perilenodiimida bis(propil)trietoxisilano perilenodiimida (PDI), previamente
sintetizado e caracterizado; ácido 3-mercaptopropiónico (Aldrich, 99%);
hidróxido de potássio (Riedel-de Haёn, 85%); dissulfeto de carbono (Aldrich,
99,5%); brometo de benzila (Aldrich, 98%); clorofórmio (Aldrich, 99,5%);
clorofórmio deuterado (Aldrich, 99,8%); ácido clorídrico (Panreac, 37%);
hexano (Aldrich, 98%) previamente destilado; tolueno (Aldrich, 96%)
previamente destilado; 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (Aldrich, 98%);
etanol (Panreac, 95%) previamente destiado; (benzotriazo-1-il-oxi)-
tripirrolidona-fosfonil-hexafluoro-fosfato (PyBOP) (Aldrich, 98%); N-metil-2-
pirrolidona (NMP) (Aldrich, 99%); N,N-diisopropil-etilamina (DIPEA) (Aldrich,
99%); piperidina (Aldrich, 99%); N-α-Fmoc derivado de amino ácidos (Fmoc-
Gh-OH) (Aldrich, 99,8%); diclorometano (Aldrich, 96%) previamente destilado;
N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (Aldrich, 98%); dioxano
35
(Aldrich, 96%); 2,2′-Azobis(2-metilpropilnitrila) (AIBN) (Aldrich, 99%); Oligo
(Etileno glicol) Metacrilato (OEGMA) (Aldrich, 98%); 2-(2’Metoxi-Etoxi)etil
Metacrilato (MEO2-MA) (Aldrich, 98%); água destilada; tetrahidrofurano HPLC
(THF) (Aldrich, 99%).
4.2. Metodologias
Síntese das nanopartículas de sílica 4.2.1.
As nanopartículas de sílica foram sintetizadas de acordo com o método
de Stöber [15]. Em um frasco de plástico com volume de 150 mL, adicionou-se
86 mL (86% v/v) de etanol absoluto e 6 mL (6% v/v) de solução de hidróxido de
amônio (25% amônia), sob agitação magnética a 300 rpm, durante 10 minutos
a temperatura ambiente. Em seguida adicionou-se lentamente 3 mL (3% v/v)
de TEOS e uma solução contendo 5 mL (5% v/v) de etanol e PDI (0,01% de
moles em relação ao TEOS [32]). Após a adição, elevou-se a temperatura do
banho de óleo a 50°C.
Após 24 horas, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a
10krpm, com duração de 15 minutos, seguidas de redispersões em etanol
destilado. Esse procedimento foi repetido quatro vezes para a remoção do
TEOS residual e a eliminação do hidróxido de amônio, garantindo a sua
máxima pureza.
Em seguida as nanopartículas foram caracterizadas por DLS, ZP, TEM,
AFM, SEM e fluorescência.
36
Modificação da superfície da sílica 4.2.2.
Utilizou-se como reator um tubo de Schlenk equipado com fluxo de
argônio, agitação magnética e condensador de refluxo. Foram adicionados 0,9g
das nanopartículas de sílica previamente secas em vácuo durante 3 horas e
3,2 mL de tolueno seco (razão molar [Tolueno]/[SiO2] igual a dois) a
temperatura ambiente [33].
Em seguida o meio reacional foi levado ao banho de ultrassom durante 15
minutos. Logo após esse período, foram adicionados 0,7 mL de APTES (razão
molar [SiO2]/[APTES] igual a cinco) ao meio reacional. Deixou-se a reação em
refluxo a 120ºC, com agitação de 400rpm na presença de argônio durante 24
horas [33].
Após esse período, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a
10krpm, com duração de 15 minutos, seguidas de redispersões em etanol
destilado. Esse procedimento foi repetido quatro vezes para a máxima
purificação. As nanopartículas modificadas foram caracterizadas por DLS e ZP.
A Figura 9 ilustra o esquema da modificação da superfície da sílica.
Figura 9 - Esquema da modificação da superfície da sílica.
37
Quantificação dos grupos aminas na superfície das 4.2.3.
nanopartículas de sílica
A quantificação dos grupos amina na superfície das nanopartículas foi
feita de acordo com o seguinte procedimento: em um frasco de vidro com
volume de 20 mL foram adicionados 20 mg de sílica-APTES; 93 mg de Fmoc-
Gh-OH; 156 mg de PyBOP (catalisador); 157 uL de DIPEA (ativador do
catalisador); 10 mL NMP (solvente) a temperatura ambiente e sob agitação
magnética a 300rpm durante 12 horas [34], como ilustra o esquema da Figura
10.
38
Figura 10 - Esquema da reação com Fmoc-Gh-Oh.
Após esse período, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a
10krpm, com duração de 15 minutos, seguidas de redispersões em
diclorometano. Esse procedimento foi repetido quatro vezes, e após, as
nanopartículas foram redispersas em 5 mL de NMP.
Em seguida, em um frasco de vidro, contendo um volume de 15 mL,
foram adicionados a redispersão das nanopartículas em NMP, 5 mL de NMP e
3 mL de piperidina. O meio foi mantido a temperatura ambiente sob agitação
magnética a 300 rpm durante 30 minutos.
OH
HNO
O
O
Fmoc-Gh-OH
N
DIPEA
N
N
N
O P
N
NN
PyBOP
N
O
NMP
NH2
SiO2
+ 12 hTemperatura
Ambiente
HN
O
HN
O
O
O
39
Em seguida utilizou-se novamente a centrifugação a 10krpm durante 15
minutos, seguidos de redispersão em NMP, entretanto aferiu-se o
sobrenadante em um balão volumétrico de 20 mL, sendo possível a sua
quantificação. O esquema da quantificação está ilustrado na Figura 11.
Figura 11 - Esquema da quantificação de grupos aminas na superfície da partícula.
Síntese do agente de transferência de cadeia 4.2.4.
Utilizou-se como reator um balão de fundo redondo com duas bocas com
volume de 250 mL, equipado com agitação magnética e condensador de
refluxo. Foram adicionados 10 mL de ácido 3-mercaptopropiónico e 125 mL de
uma solução contendo água e 13g de hidróxido de potássio a temperatura
HN
O
HN
O
O
O
+HN
Piperidina
HNO
H2N
O
+
SiO2
N
O
O
Aferiu-se
QuantificaçãoU.V./Vísivel
40
ambiente. Deixou-se o meio reacional sob agitação magnética a 400 rpm
durante 30 minutos.
Em seguida adaptou-se um funil de adição, adicionando-se lentamente,
15 mL de dissulfeto de carbono. Após a adição a mistura foi mantida sob
agitação magnética, a 400 rpm durante 5 horas.
Após esse período, foram adicionados 19,8g de brometo de benzila. A
reação foi mantida sob agitação magnética a 400 rpm e a temperatura de 80°C
durante 12 horas. A Figura 12 ilustra o esquema da síntese do agente RAFT
[35].
Figura 12 - Esquema da síntese do agente RAFT.
O produto obtido foi seco no rota-evaporador, obtendo-se um sólido de
coloração amarela. Após a secagem, o produto foi solubilizado em hexano sob-
refluxo e reprecipitado, sucessivas vezes, até a máxima purificação. O produto
foi caracterizado por RMN 1H.
Síntese da sílica-RAFT 4.2.5.
Em um tubo de Schlenk equipado com agitação magnética, foram
adicionados 0,9 g de sílica-NH2 previamente secas em vácuo durante 3 horas,
41
148 mg de agente RAFT, 101 mg de EDC e 20 mL de diclorometano seco. A
mistura foi mantida sob agitação magnética a 400 rpm a temperatura ambiente
durante 24 horas [33], como ilustra a Figura 13.
Figura 13 - Síntese da sílica-RAFT.
Após 24 horas, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a
10krpm, com duração de 15 minutos, seguidas de redispersões em etanol
destilado. Esse procedimento foi repetido quatro vezes para a máxima
purificação, obtendo um pó com coloração amarela. Em seguida as
nanopartículas foram caracterizadas por U.V./visível, DLS e ZP.
Polimerização em redispersão 4.2.6.
As polimerizações em solução da nanopartículas híbridas foram
realizadas em sistemas do tipo batelada, utilizando-se como reator um tubo de
Schlenk equipado com fluxo de argônio e barra magnética de agitação.
Inicialmente foram preparadas duas soluções: uma contendo etanol, as
nanopartículas de sílica-RAFT e os monômeros MEO2-MA e OEGMA e a outra
composta de etanol e iniciador. As polimerizações foram realizadas com
diferentes composições da cadeia polimérica, como mostra a Tabela 2. As
42
duas soluções foram homogeneizadas separadamente, através de agitação
magnética e ultrassom e então misturadas no reator, sendo que inicialmente o
meio reacional foi “degaseificado” com fluxo de argônio e agitação magnética
por um período de 45 minutos. Em seguida, o balão foi imerso em um banho de
óleo a 70 oC e a reação foi conduzida por um período de 24 horas.
Tabela 2 - Condições experimentais utilizadas nas polimerizações em solução a
Experimentos Composição da cadeia polimérica SNP_1 [OEGMA]0/[MEO2-MA]0 = 10/90 SNP_2 [MEO2-MA]0 = 100%
a Todos os experimentos foram realizados com um volume de 3mL de etanol destilado; com 0,1g de nanopartículas de sílica-RAFT; com quantidade de monômero pré-calculado para obter uma casca
com espessura de 20nm; e uma razão molar [CTA]/[Iniciador] =1/5.
Clivagem do polímero enxertado na superfície da sílica para a 4.2.7.
caracterização por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)
Em uma Placa de Petri de plástico, dissolveu-se 200 mg de sílica com
polímero (aproximadamente 50 mg de polímero puro) em 3 mL de THF. Em
seguida adicionou-se 0,2 mL de HF (49% aquoso). A solução ficou sob
agitação durante a noite a temperatura ambiente. Logo após deixou-se
evaporar a solução de forma natural. Após obter uma fina camada de polímero
seco, adicionou-se THF para injetar no equipamento de GPC [36].
4.3. Caracterização dos materiais
• Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H):
O agente RAFT obtido foi caracterizado utilizando-se a técnica de
Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H) em um equipamento da marca
Bruker Avance II a 300 MHz, com os sinais de próton do tetrametilsilano (TMS)
utilizados como padrão interno. A preparação das amostras foi feita de acordo
com a seguinte metodologia: 10-15 mg de amostra foram dissolvidos em
43
aproximadamente 700 µl de clorofórmio deuterado (CDCl3) e adicionado em um
tubo específico para RMN 1H.
• Cromatografia de Permeação em Gel (GPC):
As cascas dos polímeros foram caracterizadas por cromatografia de
permeação em gel. usando um equipamento da marca Waters 510, com fase
movél em THF. O aparelho é equipado com detector de dispersão da luz de
multi-ângulo (GPC-MALS), com bomba de alta pressão e três colunas
(PhenolgelTM de Phenomenex, com tamanho de poros de 100, 1000 e 10000
Å; temperatura das colunas: 20ºC, ligadas em série e um detector de
espalhamento de luz a laser (miniDAWN-Treos multi-ângulo) da marca Wyatt
Technologies e um detector de índice de refracção da marca Waters 2410 a
30°C.
• Microscopia eletrônica de transmissão (TEM):
As nanopartículas tiveram sua morfologia analisada por microscopia
eletrônica de transmissão (TEM), utilizando um microscópio da marca Hitachi,
modelo H-8100, com filamento de LaB6, e usou-se sempre uma tensão de
aceleração de 100 kV. Este aparelho é equipado com uma câmara KeenView,
da Soft Imaging System, que usa o programa iTEM para adquirir e tratar as
imagens.
As amostras foram diluídas em etanol. Uma gota de cada amostra foi
colocada em cada grelha e quando secaram, colocou-se uma amostra de cada
vez no suporte e este foi inserido no microscópio. Observou-se a amostra e
tiraram-se micrografias da mesma.
44
• Microscópio eletrônico de varredura (SEM):
O FEG-SEM é da marca JEOL, modelo JSM7001F, e tem acoplado um
detector EDS para elementos leves da marca Oxford modelo INCA 250.
A deposição foi feita em um equipamento da marca Quorum
Technologies, modelo Q150T ES. As deposições foram de crômio com
espessura de 15/20 nm.
• Microscopia de força atômica (AFM):
Nanosurf® EasyScan 2 FlexAFM com isolamento de vibração ativa e
estágio de tradução micrômetro.
• Análise de Diâmetro Médio de Partículas por espalhamento de luz
dinâmico (DLS):
As medições do diâmetro médio das nanopartículas foram realizadas pelo
método de espalhamento de luz dinâmico (DLS) realizadas em um
equipamento da marca Brookhaven (BI-200SM goniómetro e BI-9000 AT), um
correlator usando um laser de He-Ne (632,8, 35 mW, modelo 127, Spectra
Physics) e um detector de fotodiodo de avalanche.
As amostras foram diluídas em água destilada, previamente microfiltrada
em filtro de membrana de acetato de celulose com 0,2 µm de porosidade.
• Potencial Zeta (ZP):
As medições do potencial zeta das nanopartículas foram realizadas em
um equipamento Zetasizer Nano ZS, modelo ZEN3601, mediante diluição em
água destilada.
45
• Fluorescência:
O bis(propil)trietoxisilano perilenodiimida (PDI) e as nanopartículas
obtidas foram caracterizadas pela técnica de fluorescência, na qual utilizou-se
o equipamento SPEX Fluorolog F112 com largura da banda de 0,9nm para
excitação e 0,45nm para emissão. O espectro obtido foi realizado a
temperatura ambiente e utilizando células de Quartzo com dimensões da base
de 1cm x 1cm.
• UV/Visível
Os espectros de absorção obtidos foram registrados em um
espectrofotómetro da marca Jasco V-660, com unidade de controle de
temperatura Peltier. Todos os espectros obtidos foram realizados a
temperatura ambiente e utilizando células de Quartzo com dimensões da base
de 1cm x 1cm.
Todos os experimentos e as caracterizações relatados acima foram
realizados no Instituto Superior Técnico em Lisboa, no Centro de Química-
Física Molecular (CQFM).
5. Resultados e Discussões
5.1. Síntese das nanopartículas de sílica
A síntese das nanopartículas de sílica foi feita pelo método de Stöber [15]
na presença de um corante com elevado rendimento quântico (PDI) [32] a 50°C.
As nanopartículas apresentaram uma forma perfeitamente esférica com
diâmetro médio de 189±3nm, a partir das contagens das imagens do TEM,
SEM e AFM, conforme ilustrado na Figura 14.
46
Figura 14 - Imagens de TEM (A), SEM (B) e AFM (C) com distribuição de tamanho das nanopartículas de sílica, a partir das contagens pelas imagens do TEM.
Entretanto, o valor do diâmetro médio obtido no DLS foi de 199±18nm, um
diâmetro médio maior em relação ao encontrado nas imagens de TEM. A
diferença ocorre porque o DLS obtêm valores de diâmetro hidrodinâmico, que
por definição são maiores que o diâmetro seco [32] (diâmetro obtido a partir das
contagens feitas pelas imagens do TEM). Entretanto, pode-se levar em conta o
surgimento de aglomerados que surgem durante a leitura. Portanto, era
esperado que o diâmetro médio obtido pelo DLS fosse maior que o obtido pelas
imagens do TEM.
As nanopartículas também apresentaram caráter fluorescente, como se
pode observar no espectro de emissão (excitada a 510nm [32]) na Figura 15.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
182 184 186 188 190 192 194 196
Freq
uênc
ia (%
)
DP (nm)
A B
C
47
Figura 15 - Espectro de emissão das partículas fluorescentes.
Obteve-se o mesmo resultado encontrado na literatura [32], mostrando o
sucesso da síntese das nanopartículas na presença do corante PDI. Obteve-se
0,9887g de nanopartículas secas, um valor típico encontrado na literatura.
5.2. Síntese da sílica-APTES
Nesta etapa modificou-se a superfície da sílica com APTES de acordo
com a literatura [33]. Logo após, quantificou-se as aminas da superfície das
nanopartículas de acordo com o procedimento descrito no item 4.2.3.
Utilizaram-se como padrões três soluções com concentrações conhecidas de
Fmoc. A Figura 16 mostra os resultados obtidos.
50000
100000
150000
200000
250000
300000
510 530 550 570 590 610 630 650 670
CP
S/M
icro
Am
ps
Comprimento de onda (nm)
48
Figura 16 - Quantificação dos grupas aminas.
Observou-se que o comprimento de onda onde ocorre a máxima
absorção do Fmoc é a 301nm. A amostra (Sílica-APTES) contendo Fmoc,
proveniente da superfície das nanopartículas de sílica, apresentou uma
absorbância de 0,428 a 301nm, correspondente a uma concentração dos
grupos amina, em sua superfície, de 0,0509mMol/g de sílica, ou seja, um
enxerto de 2 moléculas de APTES em cada nm2 de superfície de sílica.
Também foi estudado o Potencial Zeta das nanopartículas modificadas
com APTES e a Tabela 3 mostra os resultados obtidos.
Tabela 3 - Potencial Zeta.
ZP(mV) SNP -50,83
SNP-APTES 27,4
Pode-se observar que o ZP tornou-se positivo, ou seja, obteve-se a
modificação da superfície da sílica com grupos NH2 (cargas positivas).
0,00000 0,00005 0,00010 0,000150,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Abs
Conc. (Mol/L)
Y=0,0265+8197,3071.X0
Corr=00,99970
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
290 295 300 305 310 315 320 A
bsor
bânc
ia
Comprimento de onde (nm)
Padrão-1 Padrão-2 Padrão-3 Sílica-APTES
Comprimento de onda a 301 nm
Experimentos Absorbância Conc.(mol/L) ε
Padrão-1 0,220 2,4242E-05 9,0752E+03
Padrão-2 0,627 7,2000E-05 8,7083E+03
Padrão-3 1,005 1,2000E-04 8,3750E+03
Sílica-APTES 0,428 4,8983E-05
49
5.3. Síntese do agente de transferência de cadeia, agente RAFT
A síntese do agente RAFT foi feita de acordo com a literatura [35],
entretanto modificou-se a purificação solubilizando o produto em hexano sob-
refluxo, durante 3 horas, seguidas de precipitações. Esse procedimento foi
repetido três vezes. A Figura 17 ilustra o espectro de RMN 1H obtido do
produto.
Figura 17 - Espectro de RMN 1H do agente RAFT.
Foi possível obter um produto de elevada pureza, como mostra do
espetro de RMN 1H. O mesmo resultado foi encontrado na literatura [35],
entretanto os autores purificaram o produto por uma coluna cromatografica
utilizando sílica gel (70-230 mesh) como fase estacionária.
Obteve-se 27,6g de um produto sólido de coloração amarela,
apresentando um rendimento próximo de 90%, o mesmo relatado na literatura
[35].
50
5.4. Síntese da sílica-RAFT
Nesta etapa reagiram-se os grupos aminas, na superfície das
nanopartículas da sílica, com o grupo ácido pertencente ao agente RAFT,
como detalhado no item 4.2.5, com o objetivo de modificar a superfície das
partículas com o agente de transferência de cadeia.
Primeiramente realizou-se as medições das soluções padrões contendo o
agente RAFT em dioxano, com concentrações conhecidas. O solvente foi
escolhido de acordo com o índice de refração, pois o dioxano apresenta um
índice de refração próximo ao índice de refração das partículas de sílica. O
objetivo foi de minimizar o “scatterring” causado pelas partículas. A Figura 18
mostra a curva de calibração, os espectros obtidos e as concentrações
utilizadas.
Figura 18 - Resultados obtidos na calibração do RAFT em dioxano.
Obteve-se uma curva de calibração com um ótimo ajuste, apresentando
um Corr de 0,9999. O comprimento de onda onde ocorreu a máxima absorção
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
260 280 300 320 340 360
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onde (nm)
Padrão_1
Padrão_2
Padrão_3
Padrão_4
Padrão_5
0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,070,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
ABS
Concentração (mMol/L)
Y= -0,0027+13,9824.X Corr= 0,9999
Comprimento*de*onda*a*310nm
Experimentos Absorbância Concentração*(mMol/L) ε
Padrão_1 0,229 0,0165 13,9209
Padrão_2 0,239 0,0173 13,8390
Padrão_3 0,567 0,0411 13,7922
Padrão_4 0,722 0,0514 14,0467
Padrão_5 0,858 0,0617 13,9105
51
do agente RAFT é de 310 nm, típico do grupo trítio, apresentado na molécula
do agente RAFT.
Em seguida analisou-se o espectro das partículas de sílica, modificadas
com o agente RAFT, em conjunto com as partículas de sílica pura (SNP), com
o propósito de descontar o efeito do “scattering” das nanopartículas. Ambas as
amostras foram analisadas em dioxano e com a mesma concentração em
relação às partículas. A Figura 19 ilustra os resultados obtidos.
Figura 19 - Espectro das partículas modificas com o agente RAFT.
Observou-se que o espectro das nanopartículas modificadas com RAFT
(sílica-RAFT) apresentou uma absorbância de 0,312 em 310nm. Entretanto
corrigiu-se o valor da absorbância subtraindo o valor da absorbância obtida da
sílica pura (SNP) a 310 nm, causada pelo “scattering” das nanopartículas, de
forma a obter um valor real da concentração de RAFT na superfície das
partículas.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
260 360 460 560 660 760 860
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
SNPSílica-RAFT
Comprimento de onda a 310nm
Experimentos Absorbância Concentração (mMol/L)
SNP 0,077
Sílica-RAFT 0,312 0,0225
Sílica-RAFT corrigido 0,235 0,0170
52
Dessa forma obteve-se um valor de absorbância corrigido de 0,235 a
310nm, que corresponde a uma concentração de 0,0445mMol de agente RAFT
por grama de sílica, apresentando um rendimento de 87,5% na reação de
acoplamento.
Estudou-se o ZP das nanopartículas modificadas com o agente RAFT. A
Tabela 4 mostra os resultados obtidos.
Tabela 4 - Potencial Zeta
ZP (mV) SNP -50,83
SNP-APTES 27,4 SNP-RAFT -15
Pode-se observar que o ZP das nanopartículas modificadas com agente
RAFT tornou-se negativo novamente, como era esperado. Esse fenômeno
acontece devido ao fato que os grupos ácidos do agente RAFT reagiram com
os grupos NH2 existentes na superfície da sílica. Como a reação de
acoplamento é de elevada conversão, sobrou poucos grupos NH2 “livres” na
superfície. Entretanto, o sinal negativo significa a existência de uma quantidade
maior de OH “livre” na superfície das nanopartículas em relação ao NH2 “livre”,
ou seja, existe grupos de OH que não reagiram com o APTES, uma vez que os
resultados obtidos anteriormente revelam que não foi possível modificar toda a
superfície das nanopartículas com APTES (NH2).
53
5.5. Polimerização em redispersão via RAFT
Nesta etapa realizaram-se as polimerizações na presença das
nanopartículas com a superfície modificada com o agente de transferência de
cadeia (agente RAFT) e dos monômeros MEO2-MA e OEGMA. A Figura 20
ilustra o esquema da síntese do polímero termossensível na superfície das
nanopartículas.
Figura 20 - Síntese do polímero na superfície das nanopartículas.
Primeiramente realizou-se a síntese do copolímero contendo uma razão
molar [MEO2-MA]/[OEGMA] igual a 9, com o objetivo de se obter uma LCST
54
próxima de 39°C [37], que é semelhante à temperatura fisiológica. A morfologia
das nanopartículas foi analisada por TEM e SEM, como ilustra a Figura 21.
Figura 21 - Imagens de TEM (A) e SEM (B) com distribuição de tamanho das nanopartículas de sílica com polímero.
Observou-se uma diferença na morfologia das nanopartículas em relação
às partículas de sílica pura, apresentando uma superfície irregular, o que
sugere uma possível camada fina de polímero. Também se observou uma
variação do diâmetro médio das partículas a partir da contagem pelas imagens
do TEM, aumentando para 226±16nm, ou seja, uma camada média de 19nm
de espessura do polímero.
Em seguida estudou-se a variação do diâmetro das partículas em função
da temperatura, utilizando a técnica de Espalhamento de Luz Dinâmico com
aquecimento de 20°C a 60°C (analisaram-se cinco pontos) e arrefecimento de
60°C a 20°C (analisaram-se três pontos). A Figura 22 mostra os resultados
obtidos.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
190 200 210 220 230 240 250
Freq
uênc
ia (%
)
Dp(nm)
A" A"
B"
55
200220240260280300320340360380400
10 20 30 40 50 60
Dp(
nm)
Temperatura (°C)
SNP_1_Aquecimento
SNP_1_Arrefecimento
Figura 22 - Variação do Dp em função da temperatura através da técnica de Espalhamento de Luz Dinâmico.
Os resultados obtidos revelam uma dependência do Dp com temperatura.
Quando o sistema é submetido a um aquecimento o Dp diminui, uma
característica típica dos polímeros à base de PEGs. Observou-se que a partir
de 50°C, as nanopartículas apresentaram um diâmetro de 230±1nm, próxima
do diâmetro encontrado pela contagem das imagens de TEM, indicando que o
polímero, a 50°C, está acima da LCST, ou seja, totalmente colapsado.
Porém, quando o sistema é submetido a um arrefecimento, observa-se
um aumento do Dp, ou seja, as nanopartículas que antes estavam a uma
temperatura superior a LCST (colapsada) passam a estar a uma temperatura
inferior a LCST (cadeias solvatadas), apresentando um aumento do Dp.
Observou-se que no arrefecimento o Dp encontrado a 20°C é menor em
relação ao Dp encontrado durante o aquecimento. A provável causa desta
histerese é que durante o aquecimento, as nanopartículas a 60°C encontram-
se na forma colapsada, existindo interações intercadeias da mesma partícula
(agregação), devido à desidratação da casca. Porém, quando a temperatura
diminui, a casca volta a hidratar, mas as interações intercadeias são mais
fortes e as cadeias não expandem da mesma forma, ou seja, no arrefecimento
56
são formados entrelaçamentos nas cadeias devido ao estado colapsado,
impossibilitando que as partículas voltem ao tamanho original.
Também foi observado o potencial zeta das nanopartículas sem polímero
e com polímeros. A Tabela 5 relata os resultados obtidos.
Tabela 5 - Potencial Zeta.
ZP (mV) SNP -50,83
SNP-RAFT -15 SNP_1 4,95
Notou-se que o potencial zeta das partículas de sílica com polímero
aumentou em relação às partículas de sílica-RAFT, sugerindo a modificação da
superfície das nanopartículas com o polímero.
Em seguida analisou-se a massa molar e a distribuição das massas
molares na casca do polímero através de GPC, utilizando o procedimento
descrito no item 4.2.7..
Tabela 6 - Resultado obtido pela análise do GPC
SNP_1 Mw/Mn 1,23
Mn 2,85.105 g/mol
Observou-se que a distribuição da massa molar (polidispersidade) foi de
1,23, ou seja, conseguiu-se obter uma síntese polimérica de forma controlada.
Lutz e Ann Hoth [37] estudaram a polidispersidade utilizando o mesmo sistema
(condições poliméricas e monômeros) utilizado neste projeto, porém o grupo
utilizou outro mecanismo de polimerização controlada, a ATRP, obtendo um
valor superior ao valor obtido, ou seja, conseguiu-se obter um melhor controle
na polimerização utilizando o mecanismo RAFT.
57
Em seguida, realizou-se a síntese do polímero contendo 100% do
monômero MEO2-MA com o objetivo de se obter uma LCST próxima de 28°C
[37]. A morfologia das nanopartículas foi analisada por TEM e SEM, como ilustra
a Figura 23.
Figura 23 - Imagens de TEM (A) e SEM (B) com distribuição de tamanho das nanopartículas de sílica com polímero.
Pode-se observar novamente que houve uma diferença na morfologia das
nanopartículas, comparadas com a morfologia das partículas de sílica pura, o
que sugere a existência de uma fina camada de polímero em sua superfície.
Também se notou um aumento do Dp, apresentando um valor de 220±10nm,
ou seja, uma camada de 16nm de espessura do polímero.
Em seguida, realizou-se o estudo da variação do Dp em função da
temperatura utilizando a técnica de Espalhamento de Luz Dinâmico com
aquecimento de 20°C a 60°C (analisaram cinco pontos) e um arrefecimento de
60°C a 20°C (analisaram três pontos). A Figura 24 relata os resultados obtidos.
0%5%10%15%20%25%30%35%40%45%
210 220 230 240 250 260
Freq
uênc
ia (%
)
Dp (nm)
A A
B
58
200220240260280300320340360380400
10 20 30 40 50 60
Dp(
nm)
Temperatura (°C)
SNP_2_Aquecimento
SNP_2_Arrefecimento
Figura 24 - Variação do Dp em função da temperatura através da técnica de Espalhamento de Luz Dinâmico.
Novamente os resultados obtidos revelam uma dependência do Dp em
função da temperatura. Quando o sistema é submetido a um aquecimento,
observa-se uma diminuição da Dp e quando o sistema é submetido a um
arrefecimento, observa-se um aumento do Dp, característica típica dos PEGs.
Observou-se também que a partir de 40°C não há variação significativa do Dp,
apresentando um valor médio de 228±2, um valor próximo ao encontrado pelas
contagens das imagens de TEM, o que sugere que a LCST é próxima de 40°C.
Também foi analisado o potencial zeta das nanopartículas. A Tabela 7
mostra os resultados obtidos.
Tabela 7 - Potencial Zeta.
ZP (mV) SNP -50,83
SNP-RAFT -15 SNP_2 -5,95
Observou-se que o potencial zeta das partículas de sílica com polímero
aumentou em relação às partículas de sílica-RAFT, sugerindo a modificação da
superfície das nanopartículas com o polímero.
59
Por fim analisou-se a massa molar e a distribuição das massa molares na
casca do polímero através de GPC, utilizando o procedimento descrito no item
4.2.7.. A Tabela 8 relata os resultados obtidos.
Tabela 8 - Resultado obtido pela análise do GPC
SNP_2 Mw/Mn 1,27
Mn 1,46.105 g/mol
Pose-se observar que novamente conseguiu-se obter um polímero de
forma controlada, porém o valor da polidispersidade foi superior ao obtido
anteriormente. O mesmo resultado fora encontrado na literatura [37], porém os
autores utilizaram outro tipo de mecanismo de controle de polimerização, a
ATRP. Novamente notou-se um melhor controle de polimerização utilizando o
mecanismo RAFT, ou seja, conseguiu-se obter um valor de polidispersidade
inferior ao encontrado na literatura, utilizando o mesmo sistema polimérico
(condições poliméricas e monômeros) utilizado neste projeto.
6. Conclusões
Após analisar os resultados apresentados neste relatório, pode-se
concluir que:
• Obteve-se sucesso na síntese das nanopartículas de sílica pelo método
de Stöber, modificada com um corante de elevado rendimento quântico;
• Notou-se que houve a modificação da superfície das nanopartículas de
sílica com APTES, na qual se substituiu os grupos -OH pelos grupos aminas;
• Obteve-se sucesso na síntese do agente RAFT e um produto de
elevada pureza, memso após a modificação da rota de purificação;
• Sucesso no acoplamento do agente RAFT na superfície da sílica;
60
• Notou-se a existência de uma fina camada polimérica na superfície da
sílica;
• Conseguiu-se obter polímero de forma controlada;
7. Dificuldades encontradas durante o projeto
• Dificuldades em analisar o tamanho das nanopartículas através do
“Nano Tracking Analysis” (NTA), devido a grande quantidade de aglomerados
que surgem durante a análise, uma vez que não foi possível a utilização de
surfatante;
• Dificuldade em analisar a morfologia e o tamanho das nanopartículas de
sílica revestida com polímero através da Microscopia de Força Atômica (AFM)
devido ao “arrastamento” das nanopartículas durante a análise.
8. Evolução do projeto
• Aplicação das nanopartículas com e sem polímero em células vivas e
analisar qual é o tamanho ideal para a sua incorporação;
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