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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA AMANDA ACORCE DE AMORIM Produção biotecnológica de Flavor LORENA 2014

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

AMANDA ACORCE DE AMORIM

Produção biotecnológica de Flavor

LORENA 2014

AMANDA ACORCE DE AMORIM

Produção biotecnológica de Flavor

Trabalho de Graduação apresentado à Escola

de Engenharia de Lorena da Universidade de

São Paulo como requisito parcial para

conclusão da Graduação do curso de

Engenharia Bioquímica. Orientador: Prof. Dra. Maria Eleonora Andrade de Carvalho

LORENA 2014

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO Serviço de Biblioteca Escola de Engenharia de Lorena

Amorim, Amanda Acorce de

Produção biotecnológica de Flavor/ Amanda Acorde de Amorim. -

Lorena, 2014. 23 f.

Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão do

Curso de Graduação de Engenharia Bioquímica - Escola de Engenharia de

Lorena da Universidade de São Paulo.

Orientadora: Maria Eleonora Andrade de Carvalho

I. Síntese química. 2. Síntese (Biolotecnologia). 3. Aromatizantes.4.

Aditivos alimentares I. Carvalho, Maria Eleonora Andrade de , Orient.

Dedico este trabalho aos meus pais, que

sempre me ensinaram que não se chega

a lugar algum sem educação. Obrigada

por me incentivarem a estudar e a

sempre ir atrás dos meus sonhos e,

acima de tudo, obrigada por todo amor e

apoio.

AGRADECIMENTOS

Á minha família, meus pais Débora C. A. Amorim e Marcio G. de Amorim, que

nunca mediram esforços para que eu realizasse meus objetivos.

Aos meus irmãos, Matheus e Victória, sem vocês por perto enquanto eu

crescia eu não teria a coragem que tenho hoje de enfrentar todos os desafios.

Ao meu namorado, Renan M. Araújo, obrigada por todo o apoio, incentivo e

amor durante todo esse tempo, e por não ter me deixado desistir.

À minha orientadora, Prof. Dra. Maria Eleonora Andrade de Carvalho, obrigada

pelos conselhos e auxilio na conclusão deste trabalho.

À EEL e seus funcionários e professores, obrigada por transformar uma aluna

em uma Engenheira.

Aos meus amigos que se transformaram em minha segunda família tão longe

de casa, sem vocês esses anos teriam sido muito mais difíceis.

AMORIM, Amanda Acorde de. Produção biotecnológica de Flavor. 2014. 23 f. Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso de Graduação em Engenharia Bioquímica) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2014.

RESUMO

A indústria de flavors atualmente é responsável por um quarto do mercado de

aditivos alimentícios mundial, devido a esta alta demanda houve um grande

interesse no desenvolvimento de pesquisas relacionadas a novos métodos de

produção. Como consequência da presente preocupação com o meio ambiente

e com a alimentação saudável, houve um crescimento da procura por flavors

considerados naturais. Visto que a extração vegetal destes compostos

encontra diversos problemas, como a baixa produtividade no processo de

extração e dificuldade s no cultivo de plantas, o foco de estudos foi direcionado

para as técnicas de produção biotecnológica de compostos de flavor. Neste

trabalho de revisão bibliográfica, foram abordados os conceitos relacionados ao

estudo das moléculas de flavor, o cenário do atual mercado industrial e suas

perspectivas para o futuro, assim como os métodos encontrados para a

produção de flavor. Os métodos de produção são a síntese química ou

biotecnológica, da qual consta o cultivo de células vegetais, a produção

microbiológica e enzimática.

Palavras-chave:

Flavors, aromas, naturais e “nature identical”, síntese química, reação de

Maillard, síntese biotecnológica.

ABSTRACT

The flavor industry currently accounts for a quarter of global food additives

market, due to this high demand there was great interest in research

development leasing new production methods. In consequence to the present

concern with the environment and with healthier alimentation, there was a

growth of natural flavors considered and, as plant extraction process has

several problems, like low productivity process and difficulty in plants growth,

the focus was directed to studies of biotechnological production techniques of

flavor compounds. In this work of literature review, was addressed the concepts

related to the study of molecules of flavor, the scenario of the current industrial

market and its perspectives of the future and the methods that were found for

production of flavor, being them for chemical or biotechnological synthesis, like

the cultivation of plant cells, microbiological and enzymatic production.

Key words:

Flavor, aromas, naturals, nature identical, chemical synthesis, Maillard

reaction, biotechnological synthesis.

Sumário

1. OBJETIVOS .............................................................................................................. 1

2. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 2

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 4

3.1. Produtos Naturais, “Nature Indenticals” e Artificiais .................................... 4

3.1.1. Produtos Naturais......................................................................... 4

3.1.1.1. “Cold pressing” – Óleos cítricos ..................................... 4

3.1.1.2. Óleos de destilação gasosa ........................................... 5

3.1.2. “Nature Indentical” ....................................................................... 5

3.1.2.2. Álcoois ........................................................................... 5

3.1.2.3. Ácidos ............................................................................ 5

3.1.2.4 Ésteres ........................................................................... 6

3. 1.2.5. Lactonas ....................................................................... 6

3.1.2.4. Aldeídos ......................................................................... 6

3.1.3. Artificiais ...................................................................................... 7

3.2. Indústria de flavor ....................................................................................... 7

3.3. Produção .................................................................................................... 8

3.3.1. Produção Química ........................................................................ 9

3.3.1.1. Reação de Maillard ........................................................ 9

3.3.1.2. Formação de compostos de flavor pela reação de

Maillard ......................................................................... 11

3.3.2. Produção Biotecnológica ............................................................ 12

3.3.2.1. Cultura de Células Vegetais ......................................... 13

3.3.2.2. Produção Microbiológica .............................................. 15

3.3.2.3. Produção Enzimática ................................................... 17

Enzimas Hidrolíticas ................................................................................. 18

Enzimas Oxirredutases ............................................................................. 19

4. Conclusão ............................................................................................................... 21

5. Obras Citadas ......................................................................................................... 22

1

1. OBJETIVOS

O presente trabalho tem como objetivo revisar os recentes avanços na

produção de compostos de flavor. Foram analisados métodos de produção

química, com ênfase para a reação de Maillard, extração vegetal e de produção

biotecnológica, incluindo os processos de cultivo de células vegetais, produção

microbiológica e enzimática.

2

2. INTRODUÇÃO

Há muitos anos, compostos de flavor variando de substâncias simples à

complexas são extraídos de plantas. Eventualmente, após a elucidação de sua

estrutura, a síntese de flavors vem sendo feita quimicamente.

Atualmente, flavors representam mais de um quarto do mercado de

aditivos alimentícios e a grande maioria dos compostos é produzida por síntese

química ou extração de materiais naturais. Entretanto, recentes pesquisas de

mercado mostraram que os consumidores preferem comidas rotuladas como

“naturais” (Longo & Sanromán, 2006). Com isso a demanda industrial para

flavors naturais está constantemente aumentando, e atualmente o volume de

produtos disponíveis para a indústria de alimentos está crescendo, já que estes

estão sendo cada vez mais processados para serem consumidos prontos

(Bosse, Fratz, & Zorn, 2013).

Apesar dos compostos de flavor serem produzidos por transformação

química de substâncias naturais, os produtos resultantes não podem ser

rotulados como tal. Além disso, a síntese química resulta muitas vezes em

produções que prejudicam o meio ambiente e não tem seletividade para os

substratos, o que pode causar a formação de misturas racêmicas indesejáveis,

reduzindo a eficiência do processo e aumentos os custos de purificação. Por

outro lado, a produção de flavors considerados naturais pela extração direta de

plantas, também está sujeita a muitos problemas. Essas matérias-primas

muitas vezes contêm baixas concentrações das substâncias desejadas,

aumentando o custo do processo, além de depender de fatores difíceis de

controlar, como condições climáticas e pragas em plantações (Longo &

Sanromán, 2006).

Com o aumento da popularidade de produtos naturais nas ultimas

décadas houve um aumento significativo das pesquisas para o uso de

biocatalisadores na produção de compostos de flavor, já que produtos

derivados de bioprocessos com substratos naturais são em principio definidos

como “naturais”, se eles já foram identificados anteriormente em plantas ou

outras fontes naturais (Schrader, Etschmann, Sell, Hilmer, & Rabenhorst,

2004).

3

Como rotas alternativas à síntese química e à extração natural, foram

encontrados processos baseados na biossíntese ou biotransformação de

matérias primas através de microrganismos e seus componentes (Longo &

Sanromán, 2006).

4

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Como esperado, a definição de flavor varia de acordo com a fonte. O

FDA (Food and Drug Administration) dos Estados Unidos define agentes

flavorizantes e adjuvantes como “substâncias adicionadas para conferir ou

ajudar a conferir o gosto ou aroma nos alimentos”. O órgão americano identifica

flavor como “substâncias adicionadas para suplementar, realçar, ou modificar o

sabor e/ou aroma de um alimento, sem transmitir seu próprio gosto ou aroma”

(Burdock, Dec 3, 2004).

3.1. Produtos Naturais, “Nature Indenticals” e Artificiais

3.1.1. Produtos Naturais

Materiais que ocorrem naturalmente são à base das indústrias de flavor

e fragrâncias e da química orgânica. Os óleos essenciais são um desses

materiais obtidos de plantas por simples processos físicos, especialmente “cold

pressing” e destilação gasosa.

3.1.1.1. “Cold pressing” – Óleos cítricos

As cascas da família dos cítricos, que inclui laranja, limão, lima,

bergamota, toranja, tangerina e mexerica, contem glândulas que liberam óleos

quando esmagadas. “Cold pressing” é o processo no qual a casca sofre

pressão a frio e com isso libera uma mistura de óleo e água, facilmente

separada. O componente principal de todos esses óleos é o hidrocarboneto

monoterpeno limonene (fig. 1), cerca de 95% nas laranjas e toranjas e um

pouco menos em limões e limas. O caráter do óleo é determinado pelos

“traços” de seus componentes, também considerados “marcadores” para a

qualidade do óleo.

Figura 1. (4S) Limonene

5

3.1.1.2. Óleos de destilação gasosa

A maioria das plantas contém óleos menos voláteis do que os das frutas

cítricas, na maioria das vezes menos de 1%, e estes são obtidos por destilação

gasosa. Como exemplos: cássia, canela, menta, rosa e lavanda. Este processo

pode levar a mudanças na composição devido à decomposição térmica,

oxidação e hidrólise. Tradicionalmente, o melhor óleo de lavanda é produzido

em altas altitudes, já que o baixo ponto de ebulição leva à menor hidrólise de

ésteres, como os acetatos de linalyl (fig. 2) e lavandulyl (fig. 3).

3.1.2. “Nature Indentical”

A grande maioria dos aromas químicos usados em flavor são “nature

indentical” (NI), ou seja, foram identificados ocorrendo em alimentos

encontrados na cadeia alimentar humana, mas são sintetizados quimicamente.

3.1.2.2. Álcoois

O etanol (fig.4) é um flavor de bebidas alcoólicas, pode ser considerado

um solvente (especialmente em fragrâncias), flavor ou aditivo.

Figura 4. Etanol

3.1.2.3. Ácidos

Ácidos simples contribuem para notas agudas que se tornam frutadas

em diluição, o ácido 2metil-butírico (fig.5) é um exemplo.

Figura 2. Acetato de Lavandulyl

Figura 3. Acetato de Linalyl

6

3.1.2.4 Ésteres

Inúmeros ésteres são usados em flavors, como é o caso de quase todos

os flavors de álcoois combinados com os flavors de ácidos. Entre os ésteres

frutados simples importantes inclui-se o etil butirato (fig. 6).

3. 1.2.5. Lactonas

Estes ésteres cíclicos são usualmente encontrados como gama-lactonas

(5 anéis) e delta-lactonas (6 anéis). Como seus primos acíclicos, são usados

em flavors frutados e derivados de leite, especialmente os delta-lactonas, como

o delta-decalactona (fig.7).

3.1.2.4. Aldeídos

O aldeído cíclico mais importante, e um dos mais significantes aromas

químicos é a vanilina (fig.8).

Figura 5. Ácido 2 metil butírico

Figura 5. Etil Butirato

Figura 6. Delta-decalactona

7

3.1.3. Artificiais

Há ainda um grande numero de materiais de flavor que ainda não foram

encontrados na natureza. Eles são usualmente usados por terem propriedades

que faltam aos NI, como por exemplo, a etil vanilina (fig. 9), que possuí um

limiar de odor menor que a vanilina, e é mais solúvel em solventes orgânicos,

sendo mais conveniente para o uso em flavors com base oleosa (Goodner &

Rouseff, 2011).

3.2. Indústria de flavor

Flavors e fragrâncias são componentes amplamente usados nas

indústrias de alimentos, bebidas e cosméticos. O preço destes produtos varia

de acordo com os métodos usados para a produção, um exemplo típico dessa

variação é a baunilha. O preço da baunilha vinda de extração vegetal varia

entre US$1200 e US$4000 por quilo. Em contraste, o preço da baunilha por

síntese química de guaiacol é menor que US$15. Recentemente, de acordo

com o FDA (Food and Drugs Administration) dos Estados Unidos e a legislação

Europeia, produtos obtidos por processos biotecnológicos podem ser

considerados naturais se o substrato usado no processo for de origem natural.

Logo, muitos dos estudos recentes têm em foco a produção biotecnológica de

flavors e fragrâncias (Xu, Hua, & Ma, 2007).

A demanda mundial por estes compostos - incluindo misturas de flavor e

fragrâncias, óleos essenciais e aromas químicos - irá crescer 4,4% anualmente

Figura 7. Vanilina

Figura 8. Etil vanilina

8

até 2016, alcançando um mercado de 26,5 bilhões de dólares. O aumento da

produção de alimentos processados, especialmente produtos que requerem

uma alta concentração de flavors, vai determinar um rápido crescimento do

mercado, especialmente em países em desenvolvimento.

O acelerado desenvolvimento da renda e urbanização em países

emergentes está estimulando o interesse em alimentos processados, como

congelados, e “fast food”, o que impulsionará o setor de alimentos e bebidas, já

que estas comidas necessitam de altas porcentagens de flavors para preservar

o gosto em uma manufatura de larga escala. Este fato acarretará o rápido

crescimento da indústria de flavor em países como China e Índia, além de

países na América do Sul (World Flavors & Fragrances Market, October,

2012).

As indústrias de fragrância e flavors desenvolvem produtos únicos e

inovadores para os seus clientes ao redor do mundo. O foco de investimento

da indústria é o crescimento em mercados em desenvolvimento, com produtos

como alimentos processados, bebidas, cuidados pessoais e para residências.

Dentre estas indústrias destaca-se a Givaudan S.A. responsável por 25% da

produção mundial. Dentre os objetivos mais buscados estão sabores autênticos

para macarrões instantâneos, bebidas energéticas, lanches prontos e soluções

de sabor que possuem bom custo benefício (Report, 2013).

Os clientes preferenciais da indústria de favor são os grandes produtores

de alimentos como Unilever, Kraft Foods Inc. e Nestlé S.A (McLaughlin, 24, Jun

2012).

3.3. Produção

Plantas são fontes ricas para a extração de flavor, muitas delas são

exploradas para aumentar o prazer e a gratificação em comidas e bebidas.

Estes vegetais produzem compostos de flavors desejáveis, porém com

rendimento variável e geralmente muito baixo, não sendo produzidos por todos

os tecidos das plantas, ou em todos os estágios de desenvolvimento. Na

verdade, eles são usualmente produzidos apenas em tecidos específicos

encontrados em órgãos específicos, como frutas, flores, folhas e raízes, e em

apenas alguns estágios de desenvolvimento. Além disso, outra restrição

importante é que muitos vegetais que produzem compostos de flavor, como a

9

baunilha e a canela, são limitadas a alguns lugares com geografia e clima

favoráveis ao seu crescimento.

Devido a essas restrições na extração e cultivo de plantas, foram feitas

tentativas de se explorar a produção de flavor através de metabólitos

secundários produzidos pelo cultivo de células, pela síntese química e também

pela produção biotecnológica como alternativa para a produção de um grande

número de compostos. Porém muitos consumidores ainda preferem compostos

naturais, ao invés de sintéticos (Havkin-Frenkel & Belanger, 2008).

3.3.1. Produção Química

Apenas após o século XIX o primeiro composto sintético de flavor foi

criado, transmitindo uma impressão “frutada” ele foi introduzido na forma de

cadeias curtas de ésteres de ácido graxo. Conforme as estruturas de base

foram sendo descobertas, mais compostos sintéticos ficaram disponíveis no

mercado (Armstrong & Yamazaki, 1986).

A maior parte da produção de flavours no mercado mundial é obtida por

síntese química. Menos de 5% dos compostos são extraídos de plantas e,

portanto, podem ser classificados como naturais (Xu, Hua, & Ma, 2007).

Apesar da preferência dos consumidores por produtos “naturais” ou

“orgânicos” ser um atrativo no setor alimentar, os benefícios econômicos da

produção de flavors naturais será certamente limitada a produtos das linhas de

alimentos consideradas premium, uma vez que estes compostos de flavor

possuem preços mais altos que seus análogos com produção por síntese

química (Schrader, Etschmann, Sell, Hilmer, & Rabenhorst, 2004).

3.3.1.1. Reação de Maillard

Desde que os alimentos são cozidos, a reação de Maillard possui um

papel importante na melhora de sua aparência e sabor. Esta reação tem sido

um desafio central e importante na indústria de alimentos, pois está relacionada

com aroma, sabor e cor, especialmente em processos tradicionais, como a

torrefação dos grãos de café e do cacau, a produção de pães, bolos e cereais e

o cozimento da carne. Além do mais, durante a reação de Maillard, é formada

nos alimentos uma grande variedade de produtos com importância nutricional

(Martins, Jongen, & Boekel, 2001).

10

A reação de Maillard é usualmente dividida em três partes. O estágio

inicial começa com a condensação entre um grupo amino e um açúcar redutor,

levando a formação de um N-glicosamina no caso de um açúcar aldose que se

rearranja no produto Amadori (ou Heyns, se o açúcar redutos for uma cetose).

O estágio intermediário começa com o produto Amadori/Heyns, passando

pelos produtos de fermentação do açúcar e liberando do grupo amino. A última

etapa leva a reações de desidratação, fragmentação, ciclização e

polimerização, nas quais o grupo amino participa novamente. Relacionado à

formação de flavor, a chamada degradação de Strecker é de máxima

importância, nela os aminoácidos são degradados por dicarbonilos formados

na reação de Maillard, levando a desaminação e à descarboxilação do

aminoácido. Deve-se mencionar também que as reações de degradação do

açúcar na ausência de grupos aminos (caramelizaçao) levam a formação de

produtos similares. Porém na reação de Maillard o grupo amino age como

catalisador, com rendimento maior e maior rapidez. Os possíveis caminhos que

a reação tomará dependem fortemente da temperatura, pressão e natureza dos

reagentes.

No caso de proteínas ou peptídeos, os grupos reagentes são os grupos

ε-amino das lisinas, pois os grupos α-amino estão presos na ligação peptídica e

não estão disponíveis para as reações de Maillard ou Strecker. Isso resulta em

comportamento diferente dos aminoácidos com relação às proteínas e

peptídeos. Para as proteínas, a reação de Maillard normalmente leva a

formação de ligações cruzadas, enquanto a pigmentação marrom ocorre

devido à formação de furfural que é polimerizado em melanoidinas. Uma visão

geral da reação é apresentada abaixo (fig. 10) (M.A.J.S. van Boekel, 2006).

11

Figura 9. Visão geral da reação de Maillard mostrando a formação de compostos de flavor

3.3.1.2. Formação de compostos de flavor pela reação

de Maillard

A origem dos compostos voláteis responsáveis pelo flavor é difícil de

determinar devido à suas múltiplas origens. O interesse demonstrado pela

indústria de alimentos vem do desejo de se controlar as características de

aroma, cor e sabor obtidos no cozimento, forneamento e torrefação de seus

produtos (Martins, Jongen, & Boekel, 2001). A formação dos compostos de

flavor pela reação de Maillard depende do (1) tipo de açúcar e aminoácidos

envolvidos e (2) da temperatura, pH e volume de água da reação. No geral, o

primeiro fator determina o tipo de flavor formado, enquanto o segundo define a

cinética da reação. Alguns exemplos do primeiro fator são os compostos

relacionados ao sabor da carne, em sua maioria eles contêm enxofre derivado

da cisteína e ribose (a partir dos nucleotídeos), enquanto que o aminoácido

prolina dá origem aos sabores do pão, arroz e pipoca. A tabela 1 mostra a

classe de alguns compostos importantes para formação de flavor, e a figura 11

indica onde eles são formados na reação de Maillard.

Os caminhos químicos gerais levando a classes de compostos são mais

ou menos conhecidos, mas ainda não se sabe como estes caminhos de reação

12

podem ser direcionados de forma desejada (M.A.J.S. van Boekel, 2006).

Figura 10. Esquema da reação de Maillard com glicose/glicina

Tabela 1 Visão geral de algumas classes de compostos de flavor formados pela reação de Maillard

Classe do

Composto Flavor/Aroma associado Exemplos

Pirazinas assados, tostados, cozidos Alimentos cozidos

Alquilapirazinas noz tostada café

Alquilapiridinas amargo, adstringente, queimado cevada, malte

Acilpiridinas bolacha craquer produtos de cereais

Pirrole Cereais produtos de cereais, café

Furanos doce, queimado, caramelo Alimentos cozidos

Oxazol noz, doces chocolate, carne, café

Tiofeno carnes carne assada

3.3.2. Produção Biotecnológica

Apesar de inicialmente o rótulo de produto “natural” ter sido um dos

principais motivos para a procura por métodos biotecnológicos alternativos para

a produção de flavor, atualmente, após várias décadas de pesquisa, o

conhecimento acumulado das vantagens inerentes da biocatálise é a força

motriz por trás de suas aplicações e continuidade de pesquisa neste campo.

13

Operações em condições amenas que protegem produtos instáveis, e a

funcionalização de precursores de moléculas complexas com alta

especificidade são dois dos fatores mais importantes que permitem a

biocatálise se impor sobre o uso da síntese química em certos casos

(Schrader, Etschmann, Sell, Hilmer, & Rabenhorst, 2004).

Existem três formas possíveis para a produção biotecnológica de flavor:

cultivo de células vegetais, enzimas isoladas ou por microrganismos (fig.12). A

biotransformação em culturas de tecidos de plantas é um processo caro devido

ao baixo rendimento dos compostos formados e ao crescimento lento das

células, portando este método pode sem empregado efetivamente apenas em

sistemas em que as vias bioquímicas do composto necessário são plenamente

conhecidas. Catálise microbiológica e enzimática têm como vantagens a alta

seletividade de substratos e os poucos produtos formados por reação,

resultando em um isolamento mais fácil do produto desejado no final do

processo de produção, e consequentemente, sendo consideradas as

estratégias mais promissoras (Xu, Hua, & Ma, 2007).

Figura 11. Processos biotecnológicos para a produção de flavor

3.3.2.1. Cultura de Células Vegetais

Plantas são fontes ricas para vários tipos de metabólitos secundários.

Mais de 80% dos aproximadamente 30.000 produtos naturais conhecidos tem

origem vegetal. A biotecnologia oferece a oportunidade de se explorar a célula,

14

tecido ou organismo realizando crescimento in vitro e os manipulando

geneticamente para se obter os compostos desejados(Rao & Ravishankar,

2002).

A cultura de células de plantas aparenta ser um método viável para uma

ampla variedade de flavors e aromas característicos de sua planta de origem.

Esta abordagem é baseada na capacidade exclusiva bioquímica e genética, e

no potencial de diferenciação das células das plantas (Longo & Sanromán,

2006).

Alguns autores resumem as vantagens da tecnologia de cultura celular

sobre o processo convencional de agricultura nos seguintes aspectos:

É independente da geografia e variações de estações do ano, de

interferências politicas e de outros fatores ambientais. Também oferece

um sistema de produção definido, o que garante um fornecimento

constante do produto, além de qualidade e produtividade uniforme.

É possível produzir novos compostos que não são normalmente

encontrados em plantas-mãe, diretamente ou através de

biotransformação de precursores baratos.

Espécies com alta seletividade podem ser selecionadas

Com a automatização do controle para crescimento celular e regulação

metabólica do processo, os custos podem ser diminuídos e a

produtividade aumentada.

Alta recuperação de produto no final do processo.

Rápida produção.

Há um grande número de cultura de células de plantas produzindo uma

quantidade maior de metabólitos do que as plantas intactas, entretanto, ainda

há problemas na produção de metabólitos secundários que merecem atenção

(tab.2) (Rao & Ravishankar, 2002).

15

Tabela 2. Estratégias para aumentar o rendimento de metabólitos secundários

1. Obtenção de linhagens de células com alta eficiência

2.

Seleção da linhagem com maior crescimento celular para a produção

de metabolitos de interesse

a Mutação de células

b Fácil manipulação do meio para aumento de rendimento

3.

Imobilização de células para se aumentar o rendimento de metabólitos

extracelular e facilitar as biotransformações

4.

Uso de elicitores para aumentar a produtividade em um curto período

de tempo

5. Permeação de metabólitos para facilitar processos de downstream

6.

Superação da inibição do meio devido ao excesso de produtos pela

adsorção dos metabólitos

7. Aumento de escala de culturas de célula em biorreatores convenientes

A tecnologia para a cultura de células em suspensão deve ser

desenvolvida, já que difere do método comumente usado para sistemas

microbiológicos. Sensibilidade ao cisalhamento, longos ciclos de crescimento,

perda progressiva de atividade biosintética e rara produção de secreção são

algumas das características da cultura de células vegetais que devem ser

analisadas com atenção.

Algumas estratégias foram desenvolvidas para estimular a atividade

biosintética, como a otimização das condições de cultivo celular, seleção de

linhagens com alta produtividade e alimentação continua de substratos.

Técnicas de imobilização celular podem ajudar a prolongar os períodos viáveis,

mantendo uma alta densidade celular nos biorreatores e reduzindo o estresse

por cisalhamento, entre outras vantagens. Além disso, a regulação do

metabolismo secundário em níveis bioquímicos e genéticos pode levar a uma

melhora no sistema de produção (Longo & Sanromán, 2006).

3.3.2.2. Produção Microbiológica

Por milhares de anos processos microbiológicos acompanham a

humanidade fazendo o papel decisivo, porem não reconhecido, de produzir

flavors para alimentos e bebidas, como pães, queijos, cervejas, vinhos e molho

de soja. Foi em 1923 que a primeira revisão microbiológica na produção de

16

flavor surgiu. Com o dinâmico desenvolvimento de técnicas modernas de

análise no meio do século XX, quando o isolamento, a separação

cromatográfica e a identificação de compostos voláteis se tornaram uma rotina,

foi possível ter uma base para a elucidação sistemática da geração de flavor

por microrganismos.

Atualmente, a produção biotecnológica de flavors é uma disciplina

amplamente conhecida na indústria química, com uma estimativa de 100

moléculas comercializadas produzidas por via enzimática ou microbiológica

(Berger, 2007).

Apesar do potencial metabólico para a biossíntese de flavors ser imenso

e da grande variedade de produtos valiosos detectados em culturas

microbiológicas, as concentrações normalmente encontradas são muitos

baixas para aplicações comerciais. Além disso, a diversidade metabólica

muitas vezes leva a um amplo espectro de produtos relacionados. Exceções a

essa regra são encontradas onde os compostos de flavor são derivados do

metabolismo primário do microrganismo, como é o caso de alguns compostos

não voláteis (ex.: ácido glutâmico e acido cítrico). Portanto, a conversão

biocatalitica de um precursor estruturalmente relacionado é uma estratégia

superior que permite um aumento da acumulação do produto de flavor

desejado.

Como um pré-requisito para esta estratégia, o precursor deve estar

presente na natureza e deve ser de fácil isolamento da fonte natural em

quantidades suficientes para ser economicamente viável. Além disso, se

produto e precursor estão intimamente relacionadas com respeito às suas

propriedades físico-químicas, uma recuperação seletiva de produto durante o

processamento torna-se um grande problema para o desenvolvimento de

bioprocessos(Dubal, Tilkari, Mimin, & Borkar, 2008).

A biossíntese de flavor por microrganismos como um metabólito

secundário pode ser realizado de duas maneiras(Longo & Sanromán, 2006):

Produção de flavor “in situ”, como uma parte integral do processo

de produção da bebida ou comida (ex. queijos, iogurtes, cervejas

e vinhos), o que determina as características organolépticas do

produto final.

17

Culturas de microrganismos selecionados para a obtenção de

compostos que podem ser isolados e usados como aditivos na

manufatura de alimentos. Esta estratégia permite a obtenção de

compostos considerados naturais.

Compostos aromáticos podem ser classificados em famílias baseado em

suas estruturas químicas e propriedades físico-químicas ou sensoriais (tab.3).

Classificações alternativas podem ser estabelecidas em função da família

química do precursor usado para sua bioconversão(Longo & Sanromán, 2006).

3.3.2.3. Produção Enzimática

Existem cerca de 2500 enzimas presentes na natureza, e cerca de 400

destas vem sendo comercializadas principalmente para síntese orgânica de

compostos estéricamente seletivos e na produção biotecnológica de flavor. O

mercado mundial de enzimas é de mais de US $1 bilhão (Berger, 2007).

O uso de catálise enzimática contorna diversos problemas encontrados

na produção química de flavors, como baixo rendimento e baixa seletividade

que leva a formação de reações indesejadas. Escolhendo as enzimas

adequadas, compostos enantioméricos puros podem ser obtidos em apensas

um passo, aumentando, portanto, a eficiência e diminuindo os custos de

recuperação de produto (Longo & Sanromán, 2006).

A maioria das enzimas usadas para a produção de alimentos em

biotecnologia compreende enzimas hidrolíticas, oxirredutases e outras (Dubal,

Tilkari, Mimin, & Borkar, 2008).

18

Tabela 3. Classificação de flavor baseada em sua estrutura química

Álcoois Aldeídos Ésters Ácidos Graxos Cetonas

1,2-butanodiol

2-butanol

2,3-butanodiol

etanol

2-etilbutanol

2-etilhexanol

2-heptanol

hexanol

isobutanol

2-metilbutanol

3-metilbutanol

2-metilpropanol

2-nonanol

cis-1,5-octadienol

3

2-octanol

1-octadienol 3

1-pentanol

feniletanol

2-feniletanol

acetaldeído

decanal

heptanal

cis-4-heptanal

hexanal

2-hexanal

isohexanal

2-metilbutanal

3-metilbutanal

2-metilpropanal

nonanal

trans-trans-2,4-

nonadienal

cis-2-nonenal

trans-2-nonenal

octanal

butanal

pentanal

propanal

propenal

acetato de metila

acetato de etila

butirato de etila

hexanato de etila

isobutanato de etila

octanato de etila

butanoato de etila

butanoato de isobutila

acetato de 2-metil-1-

butila

acetato de 3-metil-1-

butila

acetato de 3-octila

acetato de pentila

acetato fenetilico

butirato de propila

propanoato de 2-

hidroxietila

propanoato de 2-metil-2-

etil-3-hidroxietila

2-metilbutanoato de etila

3-metilbutanoato de etila

Acetato

butirato

Ácido capróico

decanoato

isobutirato

ácido 2-metilbutírico

ácido 3-metilbutírico

octanoato

acetato de fenil

propanoato

valerato

acetofenona

acetona

2,3-butenodiona

2,3-pentenodiona

2-butanona

3-hidroxi-2-

butanona

2-heptanona

2-hexanona

3-metil-2-butanona

4-metil-2-

pentanona

2-eneanona

2-octanona

1,3-octenona

2-pentanona

3-pentanona

2-tridecanona

2-hendecanona

Lactonas

δ-decalactona

ϒ-decalactona

ϒ-butirolactona

δ-dodecalactona

δ-octalactona

cis-6-dodecano-δ-

lactona

Compostos Aromáticos Pirazinas

vanilina

benzaldeído

ácool β-feniletil

trimetil benzendo

2,3-dietil-5-metilpirazina

2-etil-3,5-dimetilpirazina

2-metóxi-3-isopropilpirazina

Enzimas Hidrolíticas

Lipases

Lipases são serina hidrolases que catalisam a hidrólise de lipídeos à ácidos

graxos e glicerol. Em contraste com esterases, elas se encontram na interface

entre lipídeos e agua e apresentam baixa atividade em soluções aquosas.

Lipases possuem um papel importante na síntese orgânica e também na

produção biotecnológica de flavor. Extrato pancreático de porco e

especialmente, várias lipases de origem microbiológica são usadas na

hidrólise, esterificação (álcool e ácido), transesterificação (éster e álcool),

19

interesterificação (éster e ácido) e transferência de grupos acil de ésteres para

outros nucleófilos como aminas e tiols (Dubal, Tilkari, Mimin, & Borkar, 2008).

Glicosidases

Glicosidases podem ser usadas para se melhorar o aroma de alguns vinhos

pela quebra da ligação glicosídica de terpenos voláteis e precursores de

moléculas de flavor. Terpenos em uvas são encontrados em sua maioria em

forma de ligações glicosídicas, não possuindo odores. A adição de enzimas

durante ou após a fermentação tem se provado o modo mais efetivo de se

melhorar a hidrólise dos compostos precursores do aroma e alcançar um

aumento no flavor do vinho.

Este fenômeno é agora explorado por indústrias de enzimas que produzem

especificamente β-glicosidase para o enriquecimento do aroma de certos

vinhos.

Glicosidases também podem ser utilizadas para sintetizar glicosídeos como

uma forma de liberação lenta de aromas. Flavors voláteis evaporam durante a

estocagem, levando a uma diminuição de sua concentração até o momento de

consumo, mas se eles estão presentes em uma ligação não volátil podem ser

liberados com o aquecimento do produto, otimizando as características

organolépticas. Glicosídeos são compostos adequados para a lenta liberação

de compostos de flavor, pois possuem baixa pressão de vapor e tem a

possibilidade de serem obtidos naturalmente (Longo & Sanromán, 2006).

Enzimas Oxirredutases

Lipoxigenase

Lipoxigenases, pertencentes à classe das oxirredutases, são dioxigenases

que catalisam a adição molecular de oxigênio às moléculas de ácidos graxos

poliinsaturados, possuindo isomerismo geométrico, no sistema cis,cis-1,4-

pentadieno (Batista, et al., 2002).

Essas enzimas têm grande importância no uso de enzimas derivadas de

plantas em larga escala na produção de flavors naturais, especificamente os

grupos de aldeídos e álcoois isoméricos com 6 carbonos (Dubal, Tilkari, Mimin,

& Borkar, 2008).

20

Álcool Vanílico Oxidase

Álcool Vanílico Oxidase (AVO) é uma enzima do ascomiceto Penicillium

simplicissimim que converte uma grande variedade de 4-hidroxibenzil álcoois e

de 4-hidroxibenzil aminas em seus correspondentes aldeídos. A alta

especificidade para substrato torna possível se obter vanilina por duas vias. A

primeira sendo através do isso de AVO para a determinação oxidativa de

capsaicina, obtendo-se vanilina por meio da clivagem de capsaicina isolada da

pimenta conhecida como capsicum. A segunda pelo uso de AVO para a

catálise da oxidação de álcool vanílico em vanilina (Dubal, Tilkari, Mimin, &

Borkar, 2008).

21

4. Conclusão

Este trabalho revisou os principais métodos de produção de compostos

de flavor. A partir dos dados encontrados na bibliografia disponível, foi possível

realizar um apanhado dos principais métodos de produção de flavor. Foram

observadas as implicações econômicas e culturais no uso de compostos

naturais ao invés dos sintetizados quimicamente, uma exigência que o

mercado consumidor vem fazendo nos últimos anos. Os processos

biotecnológicos de cultivo de células vegetais, produção microbiológica e

produção enzimática se mostram como um caminho promissor para suprir a

demanda de flavors naturais. Tais processos apresentam também uma

metodologia de processos menos agressiva para o meio ambiente.

22

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