UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

WILIAN FIORELI MARCONDES

Caracterização e análise do poplar híbrido de rápido crescimento como biomassa

para a produção de etanol de segunda geração, comparando-o com outras

biomassas de mercado.

Lorena

2014

WILIAN FIORELI MARCONDES

Caracterização e análise do poplar híbrido de rápido crescimento como biomassa

para a produção de etanol de segunda geração, comparando-o com outras

biomassas de mercado.

Trabalho de Graduação apresentado à

Escola de Engenharia de Lorena da

Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Engenheiro

Bioquímico.

Orientadora: Prof.ª Maria da Rosa

Capri

Lorena

2014

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizado

da Escola de Engenharia de Lorena,

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Marcondes, Wilian Fioreli Caracterização e análise do poplar híbrido de

rápido crescimento como biomassa para a produção de etanol de segunda geração, comparando-o com outras biomassas de mercado. / Wilian Fioreli Marcondes; orientadora Maria da Rosa Capri. - Lorena, 2014. 59 p.

Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão de Graduação do Curso de Engenharia Bioquímica - Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo. 2014 Orientadora: Maria da Rosa Capri 1. Etanol segunda geração. 2. Poplar híbrido. I. Título. II. Capri, Maria da Rosa , orient.

DEDICATÓRIA

A todos que me apoiaram nesta jornada em direção a minha formação acadêmica

de Engenheiro Bioquímico. Em especial à minha família, que sempre me deu apoio e

forças, mesmo quando a distância era grande, para seguir em frente e não desistir.

AGRADECIMENTOS

A todos os professores e orientadores que foram peças fundamentais para minha

formação.

Ao professor Dr. Adilson Roberto Gonçalves pelas oportunidades a mim

oferecidas, pela confiança depositada, desde minha formação técnica e posteriormente

durante minha graduação.

À professora Maria da Rosa Capri por todos os aprendizados a mim passados,

todo o esforço e dedicação.

À professora Dr. Renata Bura que me acolheu e orientou em minha experiência no

exterior.

Ao Doutorando Chang Dou que teve muita paciência ao me ensinar, mesmo com

as dificuldades, devido ao idioma.

À Naila que foi uma das pessoas que mais me ajudou, sou grato pela paciência e

sua imensa colaboração nessa minha jornada.

A todos meus companheiros de classe que foram bons companheiros e amigos,

sem os quais este caminho seria bem mais difícil de trilhar.

“Aprender é a única coisa de que a mente

nunca se cansa, nunca tem medo e nunca

se arrepende”.

Leonardo da Vinci

RESUMO

MARCONDES, W. F. Caracterização e análise do poplar híbrido de rápido

crescimento como biomassa para a produção de etanol de segunda geração,

comparando-o com outras biomassas de mercado. 60 f. Monografia (Graduação) –

Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de são Paulo, Lorena, 2014

Brasil e estados Unidos lideram a produção mundial de etanol, utilizando,

respectivamente, cana-de-açúcar e milho como matéria prima. Os resíduos desta

biomassa estão sendo estudados para a produção de etanol de segunda geração, como

meio de aperfeiçoar a produção de etanol por área plantada. Outros materiais

lignocelulósicos estão sendo foco do mesmo estudo, a fim de encontrar alternativas

energéticas para uma maior produção por área. Este trabalho estudou a viabilidade do

uso de poplar de rápido crescimento, dois anos, retirado diretamente do campo para o

processo de obtenção de etanol. Foi realizada a caracterização física e química deste

material onde, comparado com outras fontes de biomassa lignocelulósica, apresentou

menor teor de açúcares e maiores teores de lignina. Comparado com cavaco de poplar

com 12 anos de crescimento, a recuperação de açúcares após pré-tratamento de

explosão a vapor e hidrólise enzimática apresentou rendimento 30 % inferior, e o

potencial para produção de etanol por tonelada obteve valor próximo a 30 % do valor

obtido para o cavaco. A principal justificativa encontrada para estes resultados foi à alta

quantidade de folhas na mistura do poplar retirado do campo, o que resultou em alta

concentração de lignina e baixa concentração de celulose.

ABSTRACT

MARCONDES, W. F. Caracterização e análise do poplar híbrido de rápido

crescimento como biomassa para a produção de etanol de segunda geração,

comparando-o com outras biomassas de mercado. 60 f. Monografia (Graduação) –

Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de são Paulo, Lorena, 2014

Brazil and the United States lead the world in ethanol production using sugar cane

and corn, respectively, as raw material. The residues of this biomass are being studied

for the production of second generation ethanol, as a mean of improving the production

of ethanol per area. Other lignocellulosic materials have been visualized in the same

study, in order to find energy alternatives to greater production per area. This study

investigated the feasibility of using fast-growing poplar, two years harvest, removed

directly from the field to the ethanol’s process. Physical and chemical characterization

of this material was performed, which, compared with other sources of lignocellulosic

biomass, showed a lower sugar content and higher content of lignin. Compared with

poplar chips with 12 years harvest, the recovery of sugars after pretreatment with steam

explosion and enzymatic hydrolysis yield was 30% lower, and the potential for ethanol

production per ton obtained was about 30% of the value obtained for the chip. The main

reason for these results was the high amount of leaves in the mixture withdrawn from

the field, resulting in a high lignin content and low concentrations of cellulose.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 13

1.1 Objetivo ................................................................................................................... 13

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 14

2.1 Biocombustivel ........................................................................................................ 14

2.2 Biomassas lignocelulósicas ...................................................................................... 15

2.2.1 Celulose .......................................................................................................... 16

2.2.2 Hemicelulose .................................................................................................. 16

2.2.3 Lignina ............................................................................................................ 17

2.3 Poplar híbrido ........................................................................................................... 18

2.4 Conversão de biomassa em etanol ............................................................................ 18

2.4.1 Pré-tratamento ................................................................................................ 19

2.2.2 Hidrólise ......................................................................................................... 20

2.2.3 Fermentação..................................................................................................... 21

3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 22

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 24

4.1 Composição do poplar híbrido ................................................................................. 24

4.1.1 Caracterização física ............................................................................................. 24

4.1.2 Caracterização química......................................................................................... 25

4.1.2.1 Poplar híbrido de rápido crescimento .......................................................... 25

4.1.2.2 Cavaco com 12 anos de crescimento ........................................................... 28

4.1.3 Comparação da composição química com outras biomassas ................................. 28

4.2 Recuperação de açucares após pré-tratamento e hidrólise e produção teórica

de entaol ............................................................................................................................... 29

5 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 32

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 33

ANEXOS ................................................................................................................................. 36

13

1 INTRODUÇÃO

A perspectiva de aumento no consumo de biocombustíveis, principalmente após

resoluções de diversos países, como os Estados Unidos, de aumentar sua utilização até

2021, impulsionam a expansão das indústrias de biocombustíveis nos próximos anos[1]. O

estudo de melhorias no processo e de novas fontes é inevitável.

Brasil e Estados Unidos lideram a produção mundial de etanol [2], e pesquisas

cooperativas entre estes países são importantes para o desenvolvimento de suas

tecnologias. Atualmente é utilizado a cana-de-açúcar e o milho para a produção de etanol

no Brasil e Estados Unidos, respectivamente, e o resíduo gerado desta produção tem um

grande potencial para a produção de etanol de segunda geração. Além destes resíduos,

outros materiais lignocelulósicos estão sendo estudados para aumentar a produção mundial

dos biocombustíveis [3][4].

1.1 Objetivo

Este trabalho teve como objetivo analisar o poplar híbrido de rápido crescimento,

com dois anos de corte, como alternativa para a produção de etanol de segunda geração e

compará-lo com cavacos de poplar híbrido com 12 anos de crescimento, bagaço de cana-

de-açúcar e palha de milho.

14

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Biocombustível

De acordo com a norma técnica da lei nº 9.478, de 6 de agosto de 1997,

biocombustível é toda “substância derivada de biomassa renovável, tal como biodiesel,

etanol e outras substâncias estabelecidas em regulamento da ANP, que pode ser empregada

diretamente ou mediante alterações em motores a combustão interna ou para outro tipo de

geração de energia, podendo substituir parcial ou totalmente combustíveis de origem

fóssil”[5].

O etanol é o biocombustível mais produzido no mundo, com cerca de 87.2 bilhões de

litros produzidos em 2013. [6]. A produção se concentra nos Estados Unidos e Brasil, que

se utilizam do milho e da cana-de-açúcar, respectivamente, como matéria-prima para a

obtenção do etanol [2].

Com projeções de aumento do uso de etanol como combustível, o aumento da

produtividade por hectare tem sido um foco de estudo, e uma das vertentes muito

estudadas é a utilização de biomassa lignocelulósica como fonte para a obtenção de etanol,

conhecido como etanol de segunda geração (2G) [7].

No Brasil há uma geração de cerca de 174 milhões de toneladas de bagaço de cana

[8] e nos Estados Unidos cerca de 75 milhões de toneladas de palha de milho [9], ambos

oriundos do processamento de cana-de-açúcar e milho para fins alimentícios e energéticos.

Estes resíduos são fonte de material lignocelulósico com grande potencial para a produção

do etanol 2G, mas que ainda precisam de maior tecnologia para ser economicamente

viáveis.

Além dos resíduos das produções atuais de etanol utilizando milho e cana-de-açúcar,

resíduos agrícolas e culturas de rápido crescimento estão sendo estudadas como fontes de

biomassa para produção de biocombustíveis 2G.

15

2.2 Biomassas lignocelulósicas

Fontes dos combustíveis de segunda geração, as biomassas lignocelulósicas são mais

complexas do que as biomassas com base em amido (utilizado no etanol de primeira

geração). Os lignocelulósicos são formados por um conjunto de açúcares (celulose e

hemicelulose) e lignina, conforme ilustra a figura 1.

Figura 1 – Estrutura material lignocelulósico [10]

Estes compostos estão ligados físico e quimicamente, mas podem ser analisadas

individualmente.

16

2.2.1 Celulose

A celulose é um polímero formado por moléculas de glicose ligadas entre si por

ligações β-1,4-glicosídicas. A cada duas glicoses esterificada pela ligação β-1,4 temos o

dissacarídeo celobiose, que possui seis grupos hidroxilas estabelecendo ligações intra e

intermocelucar, o que proporciona uma forte tendência da celulose a formar cristais,

conferindo a ela uma insolubilidade em água e na maioria de solventes orgânicos [11].

Figura 2 – Representação esquemática da molécula de celulose [12]

2.2.2 Hemicelulose

Diferente da celulose que se baseia em grupos monoméricos de D-glicose, a

hemicelulose apresenta em sua estrutura uma proporção variada de monômeros, como

manose, glucose, arabionse, galactose, ácidos galactouronico, glucoronico e

metilglucoronicos, além da xilose que é o material mais abundante na hemicelulose em

vegetais lenhosos, tendo suas ligações glicosídeas nas posições um e quatro. Com esta

diversidade em sua estrutura, a hemicelulose não tem uma formação cristalina como a

celulose, apresentando-se na forma amorfa, o que lhe proporciona maior solubilidade em

água e maior facilidade de degradação, comparada com a celulose [11].

Figura 3 – Representação esquemática da molécula de hemicelulose, com ênfase na xilose [12]

17

2.2.3 Lignina

Enquanto a celulose é formada por unidades de D-glicose e as hemiceluloses por

unidades predominantemente de açucares, a lignina tem como unidade formadora o

fenilpropano, que pode conter grupos hidroxilas e metoxilas como substituintes no grupo

fenil, podendo assim ser classificada como um polifenol. Este arranjo de unidades é feita

de forma não organizada, tridimensionalmente, onde há predominância de ligações ésteres,

apresentando um grande número de interligações. Este tipo de estrutura amorfa tem caráter

hidrofóbico. A presença de ligações covalentes entre as cadeias de lignina e os

constituintes da celulose e hemicelulose amplia a força de adesão entre estes compostos,

sendo que a lignina serve como um cimento entre as fibrilas e enrijece o interior das fibras.

Ainda há dificuldade na elaboração de uma estrutura da lignina, devida a dificuldade de

isola-la em sua forma nativa [11] [13].

Figura 4 – Representação esquemática da molécula de lignina [12]

18

2.3 Poplar híbrido

Os poplar híbridos (Populus spp.) estão entre as árvores de crescimento mais rápidas

na América do Norte e são adequados para a produção de bioenergia, fibras e outros

produtos de base biológica. Com exceção das regiões mais áridas, os poplars híbridos

podem ser produzidos na maior parte do continente norte americano [14].

Comparado com outros tipos de cultivos destinados a produção de energia, o poplar

tem como características maior resistência a seca, pragas, insetos, além da capacidade de

produzir altos rendimentos de biomassa em tipos diferentes de solo. Estas características

são potencializadas com o manejo genético de suas espécies, obtendo-se assim os poplar

híbridos[15].

Estima-se que as produções de primeira geração do poplar híbrido, plantado em terras

agrícolas na região de Lake States, nos EUA, estejam na faixa de 7,9-11,8 toneladas secas

por hectare anualmente. O rendimento relatado é um pouco menor em terras de milho de

Minnesota, com valores que variam 7,7-9,9 toneladas secas por hectare anualmente. O

rendimento nominal (incluindo teor de humidade na colheita) das espécies de poplar

híbrido na América do Norte é estimado em 14 Toneladas por hectare anualmente, similar

às gramíneas (14 Ton ha-1 ano-1) e muito maior do que a palha de milho (8,4 Ton ha-1 ano-

1) e a palha de trigo (seis Ton ha-1 ano-1). Em Quebec, rendimentos de 17,3 Ton ha-1 ano-1

foram obtidos sem a utilização de fertilizantes ou irrigação [15].

2.4 Conversão de biomassa em etanol

O processo para a obtenção de etanol, a partir de biomassa lignocelulosicas, se

baseia em: deslignificar o material para a liberação dos açúcares; quebrar os açúcares para

sua forma monomérica e por fim realizar a fermentação dos monômeros de glicose e

pentoses. [16], como descrito na figura 5.

19

Figura 5 -Fluxograma de obtenção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica

2.4.1 Pré-tratamento

Pelo fato de ter uma estrutura complexa, de difícil acesso a enzimas que convertem

açucares em etanol, o pré-tratamento da biomassa é necessário, a fim de remover lignina e

hemicelulose, além de reduzir a cristalinidade da celulose, aumentando a porosidade do

material. Para estes objetivos, os pré-tratamentos precisam obedecer aos seguintes

requisitos: melhorar a formação de açúcares fermentescíveis, ou melhorar a sua formação

com uma posterior etapa de hidrolise; evitar perda ou degradação dos carboidratos; evitar a

formação de substancias inibidora ao processo de fermentação; e ser economicamente

rentável. [17].

20

Figura 6 – Esquema da degradação da biomassa por pré-tratamento, adaptado de [18]

Com o conceito de biorrefinaria, onde toda a biomassa é aproveitada, o papel do pré-

tratamento teve uma modificação do que se tinha originalmente, que era a obtenção apenas

do material de interesse. Hoje ele é visto como um processo de separação e recuperação de

todos seus constituintes. Exemplos de pré-tratamentos são: explosão a vapor; tratamentos

hidrotérmicos, hidrólise alcalina, processo organosolv, entre outros [19] [17].

2.4.2 Hidrólise

Morfologicamente, a palavra hidrólise significa decomposição pela água. Mesmo a

hidrólise se baseando em uma reação de quebra realizada pela água, raramente os casos em

que uma hidrólise completa é obtida apenas com o uso da água, sem nenhuma ajuda

externa, como temperatura e pressão. Mecanismos aceleradores são indispensáveis para

uma eficiente hidrolise, como álcalis, ácidos ou enzimas[20].

A hidrólise no processo de obtenção de etanol tem o papel de quebra da cadeia

celulósica em monômeros de glicose, para serem posteriormente fermentados. Esta

hidrólise pode ser química (ácida, alcalina, etc.) ou pode ser realizada por enzimas,

conhecida como hidrólise enzimática.

21

Comparando as hidrólises ácidas e enzimáticas, temos que levar em consideração

alguns pontos: Os ácidos concentrados são agentes fortes para a hidrólise da celulose, mas

eles também são tóxicos, corrosivos e requerem reatores mais resistentes à corrosão, além

da necessidade de um processo de recuperação destes ácidos, o que pode ser

economicamente inviável. Este processo também proporciona uma maior perda de

açúcares oriundos da hemicelulose devido a rápida hidrolise da fração hemicelulósica em

relação à fração celulósica, deixando estes monômeros mais tempo no meio reacional.

Quando se utiliza ácidos diluídos, é necessário o uso de temperaturas mais elevadas, o que

ocasiona degradação de uma parte da lignina e de açucares solúveis, formando agentes

inibidores para o processo de fermentação. [17] [21].

Quando tratamos de hidrólise enzimática, há a necessidade de um pré-tratamento da

biomassa, para que a acessibilidade ao substrato da enzima seja facilitada. Como esta

hidrólise é realizada pela enzima celulase, com alta especificidade, não há formação de

subprodutos, resultando em um alto rendimento de açucares fermentescíveis. Mas para

atingir uma alta conversão da celulose em glicose necessita uma alta concentração de

enzimas, o que pode ocasionar em um aumento do custo de produção. [17] [22].

2.4.3 Fermentação

Tipicamente, fermentação se refere à conversão de açúcar em compostos

bioquímicos utilizando micro-organismos. Em bioconversão, o objetivo é converter todos

os açúcares fermentáveis (por exemplo, glicose, xilose) da biomassa lignocelulósica em

bioprodutos (por exemplo, etanol, xilitol). Bactérias e leveduras são utilizadas para realizar

esta bioconversão, entretanto as leveduras exigem menor tempo e alcançam um

rendimento maior para produzir etanol, além de melhor tolerância ao etanol formado.

Portanto, a levedura é mais popularmente utilizada na fermentação do que as bactérias.

[23] [24].

22

3 MATERIAIS E MÉTODOS

A figura 7 retrata de forma esquemática os procedimentos realizados.

Figura 7 Fluxograma do roteiro esquemático dos procedimentos realizados.

O trabalho experimental foi desenvolvido no laboratório da “School of

Environmental and Forest Sciences”, na “University of Washington”, na cidade de Seattle

– EUA.

Foi utilizado o poplar híbrido como matéria-prima de estudo. Como o objetivo do

trabalho é analisar a utilização de poplar híbrido de rápido crescimento, com Dois anos

23

para o corte, foram realizados todos os procedimentos utilizando esta matéria prima e, para

fins comparativos, realizou-se todo o procedimento utilizando cavaco de poplar híbrido

com corte em 12 anos, o qual é atualmente comercializado na região Noroeste dos Estados

Unidos como tábuas de medidas 50x40x10 mm*.

Durante todo o processo, em cada etapa, foi realizado o controle do peso da fração

líquida e sólida, a fim de se obter o balanço de massa final. A biomassa foi inicialmente

tratada com SO2 e submetida a um pré-tratamento de explosão a vapor, com condições de

3 % de SO2, a 195 ⁰C, por 5 min. O material obtido foi filtrado e foi separada a fração

liquida (hidrolisado hemicelulósico) e a fração sólida (celulignina). A celulignina foi

lavada com água destilada com quantidade de 25 vezes seu peso seco com a finalidade de

remover todos os resíduos solúveis. A fração sólida foi submetida a hidrolise enzimática,

nas condições de cinco FPU de celulase e 10 CBU de β-Glucosidase, a 50⁰C por 96 horas.

Como o tempo para a realização dos experimentos e análise de dados foi curto, a

fermentação foi considerada como parte teórica.

A quantificação de açúcares contida tanto na fração sólida quanto na fração líquida

(extrato celulósico e hemicelulósico), hidrólise enzimática, inorgânicos e extrativos foi

realizada segundo protocolos do “National Renewable Energy Laboratory” (NREL, 2014)

que se encontra em anexo. Os dados obtidos foram tratados na plataforma do EXCEL

(pacote Office do Windows).

* Informação obtida em palestra realizada na Universidade de Washington – Seattle – Estados Unidos.

24

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Composição do poplar híbrido

4.1.1 Caracterização física

Os componentes do poplar híbridos são separados em suas principais frações, como

mostrado na figura 8. Basicamente, o poplar híbrido é composto por folha, casca, galho e

cavaco.

Figura 8- Composição física do poplar híbrido

25

As proporções de cada um destes componentes, assim como suas humidades

relativas, apresentadas na tabela 1.

Tabela 1 Composição física do poplar híbrido e sua humidade relativa

Componentes Composição

seca

Composição

húmida

Humidade

relativa

Folha 36.86% 42.75% 69.69%

Galho 11.52% 11.65% 65.22%

Casca 9.20% 10.78% 69.98%

Cavaco 42.42% 34.82% 57.06%

Considerando o poplar tirado diretamente do campo, se observa um alto grau de

humidade, cerca de 65 %. O maior responsável por esta alta humidade é a fração de folhas,

que apresenta maior humidade relativa. Sendo o segundo principal composto do poplar

hibrido seco, ela se destaca como maior composto quando se trata da biomassa úmida.

Além de aumentar o custo de transporte devido ao peso da água, a alta umidade

proporciona um grande potencial de perda de biomassa no processo de estocagem, já que a

humidade proporciona maiores possibilidades para que fungos ajam sobre a biomassa,

degradando-a.

4.1.2 Caracterização química

4.1.2.1 Poplar híbrido de rápido crescimento

Para oferecer um melhor entendimento da biomassa em estudo, foi realizada a

caracterização química de cada um dos compostos que formam o poplar híbrido, sendo a

folha, galho, casca e cavaco, conforme é apresentado na tabela 2.

26

Tabela 2 Composição química de cada componente da mistura de poplar híbrido

Como a folha e cavaco representam cerca de quatro vezes mais massa na composição

da mistura de poplar do que os outros compostos, a sua caracterização é mais relevante que

a do galho e casca.

Ao analisarmos a folha, podemos notar que é o composto que menos apresenta

celulose e outros açúcares em sua composição, o que é uma desvantagem para o processo

fermentativo utilizando a levedura Saccharomyces Cerevisiae, que tem como seu principal

substrato a glicose, proveniente a quebra da celulose. A folha também apresenta altos

níveis de lignina, o que dificulta o acesso aos seus açúcares durante o processo de hidrólise

enzimática e fermentação. O alto teor de cinzas é uma desvantagem para o processo, pois

as mesmas, em alto volume, podem encrostar nas paredes de reatores e tubulações.

O cavaco apresenta o maior índice de celulose entre os compostos, o que é

totalmente favorável ao processo fermentativo, além de apresentar os menores índices de

lignina e cinzas. Nota-se que cavaco e folha são componentes opostos quando nos

referimos a sua caraterização química, embora sejam os dois componentes mais

abundantes na formação do poplar híbrido in natura.

Para uma melhor análise do impacto da composição química de cada composto no

processo, leva-se em conta sua proporção na composição da mistura da biomassa in

natura. A tabela 3 informa a parcela de colaboração de cada componente para a

composição química final da mistura, considerando a proporção de cada um no conjunto

final da mistura.

Composição

(% m/m) Celulose

Outros

açúcares Lignina Cinzas Extrativo Total

Folha 11.03 9.01 43.28 11.06 18.09 92.47

Galho 23.68 12.16 29.47 5.99 21.89 93.20

Casca 20.92 10.00 31.30 7.59 27.70 97.50

Cavaco 32.43 15.52 26.75 1.58 12.30 88.57

27

Tabela 3 Contribuição de cada componente para a composição do poplar híbrido

Mesmo a folha tendo 36 % de participação na caracterização física da mistura, ela

contribui com aproximadamente apenas um quarto da quantidade de açúcar final da

mistura do poplar híbrido. O cavaco contribui com mais de 50 % desta composição final

de celulose, sendo o componente mais importante para este processo.

A folha contribui para elevar consideravelmente o nível de lignina (mais de 50 %),

cinzas (70 %) e extrativo (45 %) na composição final da mistura de poplar. Estes

compostos são desfavoráveis ao processo.

Por outro lado temos o cavaco, que contribui em menor escala o nível de lignina

(menos de 25 %), cinza (menos de 10 %) e extrativo (25 %).

Estes dados ilustram que uma mistura sem a presença de folha seria mais adequada

para o processo, mas isto também adicionaria uma etapa de separação, o que provocaria

um aumento de custo do processo no total.

Caso fosse utilizado apenas o cavaco do poplar de rápido crescimento, dois anos de

corte, haveria uma perda de cerca de 40 % do cavaco total no processo de separação,

devido à grande parte do cavaco ficar preso entre galhos e folhas. Uma alternativa

estudada é a colheita deste material em época de outono†, onde há queda das folhas e uma

maior eficiência na separação dos materiais.

† A época de outono nos Estados Unidos é entre setembro e novembro.

Componentes

( g/100g) Celulose

Outros

açúcares

Grupos

Acetil Lignina Cinzas Extrativo Total

Folha 4.71 3.85 1.11

18.50 4.73 7.73

Galho 2.76 1.42 0.47 3.43 0.70 2.55

Casca 2.25 1.08 0.32 3.37 0.82 2.99

Cavaco 11.29 5.40 2.01 9.31 0.55 4.28

Mistura 21.02 11.75 3.92 34.62 6.79 17.55 95.65

28

4.1.2.2 Cavaco com 12 anos de crescimento

A tabela 4 mostra a composição química do cavaco de poplar híbrido com corte de

12 anos.

Tabela 4 Composição química do cavaco com corte de 12 anos

Composição

(% m/m) Celulose

Outros

açucares

Grupo

Acetil Lignina Cinzas extrativo Total

Cavaco

12 anos 46.5 16.5 0.1 22.7 0.61 4.7 91.11

O cavaco após 12 anos de cultivo apresenta uma composição maior de celulose e

outros açúcares comparados ao cavaco de dois anos de cultivo e uma menor quantidade de

grupos acetil, lignina, cinzas e extrativo. O fato de se precisar de 12 anos para o cultivo o

faz desfavorável para a produção de etanol celulósico, mas serve de base para comparação

de rendimentos.

4.1.3 Comparação da composição química com outras biomassas

Com base na composição química de cada biomassa, se é possível fazer uma

estimativa de sua capacidade de servir como matéria-prima para a produção de etanol 2G.

A tabela 5 confronta a caracterização química do poplar híbrido de rápido crescimento e

do cavaco com 12 anos de corte com as outras fontes de biomassa lignocelulósica, bagaço

de cana-de-açúcar e da palha do milho, que tem seus dados encontrados na literatura. [25]

[26].

29

Tabela 5 Composição química de diferentes biomassas in natura

Composição

(% m/m)

Poplar híbrido Bagaço de

Cana-de-açúcar [25]

Palha de

milho [26] Mistura

2 anos

Cavaco

12 anos

Celulose 21.02 46.5 42.3 36.8

Outros açúcares 11.75 16.5 25.1 28.5

Grupo Acetil 3.92 0.1 3.7 2.5

Lignina total 34.62 22.7 24.7 14.9

Cinzas 6.79 0.61 3.5 4.6

extrativo 17.55 4.7 - 10.6

Totais 95.65 91.11 99.3 97.9

O poplar híbrido de rápido crescimento apresenta números inferiores aos seus

concorrentes para a obtenção de celulose e outros açúcares para a fermentação, além de

apresentar um elevado grau de lignina, dificultando a acessibilidade aos seus açúcares.

Um processo de pré-tratamento e hidrólise mais rigorosos, a fim de se obter açucares

fermentescíveis livre, é necessário, aumentando o custo do processo.

4.2 Recuperação de açúcares após pré-tratamento e hidrólise enzimática e

produção teórica de etanol

A recuperação de açúcares após os processos de pré-tratamento e hidrólise

enzimática consiste em quantificar os açúcares livres em solução disponíveis para ser

fermentados. Os dados apresentados na tabela 6 são referentes a massa dos

monossacarídeos recuperados após o processo de pré-tratamento e hidrólise em

comparação a massa seca original de biomassa, isto é, quantas gramas de monossacarídeo

para cada 100 gramas de biomassa seca.

30

Tabela 6 açúcares recuperados após processo de pré-tratamento e hidrólise enzimática. (a) rendimento em

comparação a celulose inicial; (b) rendimento em comparação a outros açúcares iniciais.

Recuperação

( % m/m) Glicose Rendimento a Outros açucares Rendimentob

mistura 2

anos 13.3 63.27 % 4.4 37.4 %

cavaco 12

anos 44.2 95.05 % 12.8 77.6 %

A mistura apresentou um rendimento cerca de 30 % inferior ao do cavaco. Este

resultado já era esperado e é explicado pelo maior teor de lignina encontrado na mistura.

Mesmo com um pré-tratamento, a lignina dificulta o acesso às cadeias de polissacarídeos

durante a hidrólise enzimática, o que proporciona menor teor de monossacarídeos ao meio.

Nota-se que praticamente toda celulose contida no cavaco foi recuperada, onde o nível de

lignina é bem inferior ao da mistura (65 %).

Pelo pouco espaço de tempo para realização dos experimentos e análise dos dados,

optou-se por fazer uma fermentação teórica, levando em consideração os açúcares

fermentescíveis obtidos no final do processo.

A taxa de conversão teórica de glicose para etanol é de 0.51 gramas de etanol para

um grama de glicose (0.51 g/g) e a densidade do etanol é de 0.789 g/ml.

A tabela 7 ilustra a quantidade teórica de etanol obtido para cada tonelada de

biomassa processada, considerando o uso da levedura Saccharomyces cerevisiae, que tem

como substrato principal a glicose.

Tabela 7 Produção teórica de etanol por tonelada de biomassa processada

Biomassas Etanol (L Ton-1)

mistura 2 anos 85.88

cavaco 12 anos 285.92

31

A produção de etanol por tonelada de poplar híbrido in natura, sem nenhum

processo de separação de seus componentes, resulta em uma quantia aproximadamente 30

% da produção obtida no cavaco de 12 anos.

Este baixo rendimento comparado ao cavaco já era esperado, tanto pelos fatores

acima citados que resultaram em um baixo rendimento na recuperação dos açúcares, como

no fato da mistura conter menor porcentagem de açúcar comparado com as outras fontes

de biomassa.

32

CONCLUSÃO

O rendimento de produção de etanol a partir de poplar de rápido crescimento foi

cerca de 30 % do valor obtido quando se utilizou cavaco de 12 anos de cultivo.

A presença de folha no processo da biomassa in natura traz diversas desvantagens

para a produção de etanol a partir de poplar híbrido de rápido crescimento. Estas

desvantagens começam desde o aumento no custo de transporte e risco de perda de

biomassa durante estocagem até interferir no processo em si, diminuindo a eficiência do

pré-tratamento e da hidrólise enzimática. Uma colheita em época de outono é uma

alternativa a ser estudada para diminuir a quantidade de folhas ao processo.

A composição química do poplar de rápido crescimento se mostrou bem inferior nos

níveis de açúcares, comparados com os resíduos da produção atual de etanol, bagaço de

cana-de-açúcar e palha de milho, o que o inviabiliza como fonte de biomassa para etanol 2

G.

33

REFERÊNCIAS

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unmanaged fields in comparison to corn stover,” Biomass and Bioenergy, vol. 37,

pp. 49–59, Feb. 2012.

36

ANEXOS

ANEXO I - Steam gun SOP - DRAFT

1. Startup boiler according to boiler SOP

1.1. Set the boiler output on the control panel to at least 10% higher than the

pressure required at the steam gun.

1.2. For example, if running the gun at 200°C, the steam pressure is 211 psi. Set the

boiler to at least 232 psi to ensure there is a sufficient supply of steam.

2. Check the valves on the upper reactor

2.1. Ensure that one or both of the upper and lower steam valves are open on the

reaction vessel.

2.2. Ensure the valve between the vent tank and the reaction vessel is open and the

safety interlock is not engaged.

3. Prepare the catch tank

3.1. Clamp the catch tank to the reactor

3.2. Clamp the catch tank lid to the catch tank, evenly spacing the clamps

3.3. Ensure the vise-grip clamps with safety interlocks are clamped shut

3.4. Ensure that the drain hose from the catch tank is in the drain

3.5. Connect the hose to the catch tank water jacket, open the valve and turn on the

water at the wall tap

3.6. Ensure the drain valve on the bottom of the catch tank is closed

4. Open the computer and log in

4.1. Open “Aurora digester” software on desktop

4.2. Before starting any batches with biomass, heat the gun by running a number of

clean cycles until the temperature is stable (approximately 30 minutes)

4.2.1. Check “clean cycle” and fill in the time and temperature – set the pressure

to the desired batch pressure according to the steam table and the time to

37

5 minutes. Log interval can be set to 10 seconds. All other fields should

be set to “0” or be blank.

4.3. Check that the catch tank is fully clamped, and press “Start”

4.4. After the clean cycle, repeat as necessary until the gun is clean and heated to

temperature. Drain the catch tank periodically.

5. After the gun is preheated, add the biomass to the reactor

5.1. At the top of the stairs, press the button to open the fill valve

5.1.1. The valve will only open when the light above the fill valve button is

green. If the light is red, it may not be safe to open the fill valve. Check

the computer.

5.1.2. If there is pressure in the reactor, the manual vent valve needs to be

opened to relieve the pressure before a run can start. Open it for a few

seconds and then close it. This should allow the fill valve to be opened.

5.2. Place the funnel in the fill valve.

5.3. Carefully add biomass to the reactor,

5.4. Remove the funnel and gently tamp down the biomass with the wooden tamper

if necessary. Ensure the funnel makes contact with the magnetic interlock

or the valve will not close.

5.5. Using the flashlight, ensure the biomass is below the level of the ball valve.

5.6. Check that the wooden tamper has been removed, and press the button to close

the fill valve

6. At the computer, fill in the fields as appropriate.

6.1. Fill in the batch name, user, biomass weight and type, temperature and time,

and any additional parameters such as steam purge or temperature ramping.

6.2. Check that the catch tank is fully clamped, and press “Start”

6.3. Repeat as necessary until the desired number of batches has been dispatched to

the catch tank.

7. After the desired number of runs have been sent to the catch

tank, drain and clean the tank

38

7.1. After the last run, carefully remove the 6 clamps from the lid

7.2. Attach the lid hoist to the lid and switch the hoist switch to “UP” to lift the lid

7.3. Scrape down the sides of the catch tank

7.4. Place a clean, tared bucket under the tank

7.4.1. Open the drain valve and scrape the substrate from the tank into the drain

7.4.2. **This is the “undiluted” sample. Do not add any additional water**

7.5. Place another tared bucket under the drain

7.5.1. Use a minimal amount of water to wash as much of the solids as possible

into the bucket

7.5.2. If desired, collect the next “cleaning” shot of steam in the same bucket

7.5.3. **This is the “wash” sample and is used for the mass balance**

8. Repeat steps 4 to 7 for each new type of biomass or set of

conditions.

9. Shutdown

9.1. Ensure the gun is clean inside and out

9.2. Turn off the catch tank cooling water at the wall tap and close the valve on the

catch tank

9.3. Close the computer screen and push the computer into the cabinet

Mass Balance

For both undiluted and wash fractions:

1. Measure weight of slurry (S)

2. Filter and weigh the liquid filtrate (A)

o Slurry weight (S) – filtrate weight = solids weight (B)

3. Measure the moisture content (mc) of the solids

o Solids weight (B) x mc = filtrate mass in solids (C)

o Solids weight (B) x (1-mc) = mass of dry solids (D)

4. Liquid mass = A + C

5. Solids mass = D

39

Analysis:

Undiluted Wash

Total weight (S)

Weight of filtrate (A)

Moisture content of solids (B) after liquid/solid separation

Measure sugar concentration in liquid fraction (A)

Measure composition of solid fraction* (B)

*

*assume the solids in the wash fraction are the same composition as in the undiluted

fraction

Calculations (for each individual sugar):

(sugar concentration)wash x (volume)wash= (sugar weight)wash

(sugar concentration)undilluted x (volume)undiluted= (sugar weight)undiluted

(sugar weight)wash + (sugar weight)undiluted = (sugar weight)total liquid

(sugar %)solids x (weight)solids* = (sugar weight)solids

(sugar weight)solids + (sugar weight)total liquid = (sugar weight)pretreated total

(sugar %)raw biomass x (weight)raw biomass = (sugar weight)raw biomass

(sugar weight)pretreated total / (sugar weight)raw biomass x 100 = % sugar recovery

*(weight)solids = dry weight of solids calculated using moisture content and added

together

40

ANEXO II - Klason protocol

1. Sample preparation

All samples to be analyzed need to be ground to pass through a 40-mesh screen

1.1. Raw feedstocks with particle size larger than 2 x 2 x 2 mm:

1.1.1. Oven dry ~10 g of the raw feedstock before milling

1.1.2. Pre-grind using a large Wiley mill to pass a 2 mm screen

1.1.3. Pre-grind again using the small Wiley mill fitted with a 20-mesh screen and

collect the ground sample.

1.1.4. Attach a 40-mesh screen to the mill and pass the pre-ground sample through

the mill again.

1.1.5. Collect the ground sample in an airtight container such as a plastic bag.

1.1.6. Clean the mill with a vacuum after each use

1.2. Pretreated substrates:

1.2.1. Dry ~5 g of pulp in the oven

1.2.2. Pre-grind using the small Wiley mill fitted with a 20-mesh screen and collect

the ground sample.

1.2.3. Grind again using the small Wiley mill fitted with a 40-mesh screen and

collect the ground sample in an airtight container such as a plastic bag.

1.2.4. Clean the mill with a vacuum after each use

2. Acid preparation

2.1. 72% (w/w) sulfuric acid

2.1.1. Add 665 ml concentrated sulfuric acid to 300 ml of distilled water

2.1.2. Allow the solution to cool and make the volume up to 1L with distilled

water

41


2.2.1. Dilute 18-fold the 72% acid. For example, add 5.55 ml of 72% acid to 94.44

ml distilled water

3. Acid hydrolysis

3.1. Oven-dry ~1 g of the ground sample to be analyzed and transfer it to a dessicator

to cool.

3.2. Accurately weigh 0.2 g of the dry material into labeled clean, dry Klason cups and

record the weight. Each sample should measured in duplicate or triplicate

3.3. After all of the pulp samples have been weighed out, add 3 ml of 72% (w/w)

sulfuric acid to each cup at 2-minute intervals and stir the mixture carefully with a

glass rod

3.4. The reaction must proceed for 2 hours in total with mixing of each solution every

10 minutes

3.5. While the reaction is proceeding, prepare the water to be used to transfer the acid-

substrate mixture into a bottle for autoclaving:

3.5.1. The total solution volume to be autoclaved is 115 ml, so 112 ml of water

needs to be added to each 3 ml of reaction mixture

3.5.2. Weigh 112 ml into beakers or flasks. There should be the same number of

weighed waters as there are samples.

3.5.3. Label a clean, dry 150 ml septa bottle for each sample

3.6. After the 2 hours are completed (2:00) for the first sample (#1), put a funnel in

empty septa bottle #1. Pour some of the pre-weighed water into the Klason cup

until it is ¾ full and pour the contents into septa bottle #1. Repeat this until Klason

cup #1 is clean, scraping the sides with the glass rod to remove any reside if

necessary. Pour any remaining water from the beaker/flask into bottle #1.

42

3.7. After 2 minutes have elapsed (at 2:02), transfer the funnel to bottle #2 and repeat

the above process.

3.8. Repeat every 2 minutes for the remaining samples

3.9. The time between adding acid to the samples can be increased if more time for the

sample transfer is desired

3.10. Once all of the samples have been transferred, tightly stopper each bottle with a

septa and use a crimper to add an aluminum crimp-top

3.11. Autoclave for 60 min at 121°C along with the standards (see below)

4. Standard stock preparation

4.1. The ratio of sugars in the standards depends on the type of material being

analyzed.

4.2. Weigh approximately the following amounts of sugar standards into a 50 ml

falcon tube and record the exact weight of each:

Hardwoods/Ag. Residues Softwoods

Arabinose 20 mg 20 mg

Galactose 20 mg 20 mg

Glucose 400 mg 400 mg

Xylose 400 mg 200 mg

Mannose 20 mg 100 mg

4.3. Weigh 50 ml of nanopure water into the tube and record the exact weight

4.4. Mix the stock thoroughly.

43

5. Standard preparation

5.1. To determine the amount of sugar degradation occurring during autoclaving under

acidic conditions, a set of sugar standards will be prepared in the same way as the

samples:

Vol sugar stock Vol 72% H2SO4 Vol water

S1 20 ml 3 ml 92 ml

S2 10 ml 3 ml 102 ml

S3 5 ml 3 ml 107 ml

S4 2.5 ml 3 ml 109.5 ml

S5 1 ml 3 ml 111 ml

5.2. Mix in septa bottles

5.3. Before sealing and autoclaving, remove a 1 ml sample of each standard. This

will be analyzed to determine the amount of sugar degradation

5.4. Tightly stopper each bottle with a septa and use a crimper to add an aluminum

crimp-top

5.5. Autoclave for 60 min at 121°C at the same time as the samples

6. Crucible preparation

6.1.1. Use medium-porosity, 30 ml fritted glass crucibles

6.1.2. These should be cleaned after each use in an NoChromix acid bath

overnight.

6.1.3. After removing from the acid bath, wash thoroughly with water. Filter

approximately 50 ml of water through each filter and oven dry for at least 2

hours

6.1.4. Remove from the oven and allow to cool in a desiccator

6.1.5. Label each crucible (one for each sample) and accurately weigh on an

analytical balance, recording the weight to four decimal places.

44

7. Filtration

7.1. The standards do not need to be filtered

7.2. After autoclaving and allowing the bottles to cool to room temperature, filter the

contents to separate the acid-insoluble lignin from the soluble lignin and sugars

7.3. Fit a filter flask with a vacuum adaptor and attach the crucible and vacuum line

7.4. Open the septa bottles and pour the solution through the corresponding filter

(bottle #1 into crucible #1)

7.4.1. Ensure the filtrate is clear. If it is cloudy, pour it back through the crucible

7.4.2. After the entire contents of the bottle have been filtered, remove the filter

adaptor and crucible and pour ~10 ml of filtrate into a labeled 15-ml falcon

tube for sugar and soluble lignin analysis

7.4.3. Re-attach the adaptor and filter and rinse the septa bottle with 30-50 ml of

water to transfer any remaining lignin solids to the crucible

7.4.4. Remove the crucible and dry it in the oven for at least 2 hours

7.4.5. Remove from the oven and allow to cool in a desiccator, then weigh to get

the mass of insoluble lignin in the sample

8. Acid soluble lignin analysis

8.1. To measure the acid-soluble lignin (ASL) content of each solution, measure the

absorbance at 205 nm in a quartz cuvette. Typically the solution needs to be

diluted 2 - 20 fold to obtain an absorbance reading between 0.1 and 1.

8.1.1. Use 4% (w/w) H2SO4 or water to zero the spectrophotometer and dilute the

samples

8.1.2. Record the absorbance readings

8.2. [ASL] = A205 x DF x 0.00909 g/L

9. Sugar analysis

45

9.1. Prepare the standards and sample filtrates for HPLC sugar analysis

9.2. Use fucose as an internal standard

9.2.1. Prepare a stock solution:

9.2.2. Weigh ~75 mg of fucose and mix with ~15 ml water

9.3. Standards:

9.3.1. Mix 950 µl of each standard solution with 50 µl of the fucose stock solution

9.3.2. Filter through a 0.45 µm syringe filter into labeled screw-top vials

9.3.3. Cover each vial with a black screw cap containing a new Teflon septa with

the white side facing the outside of the cap

9.4. Samples:

9.4.1. Mix 950 µl of each standard solution with 50 µl of the fucose stock solution




9.5. Run the samples on the Dionex HPLC

10. Data analysis

10.1. Input the following data into a spreadsheet:

Sample weights

Crucible weights

Crucible + lignin weights

A205 readings and dilution

HPLC sugar data

10.2. If desired, input extractive and ash content for each sample to obtain a

complete mass balance

46

ANEXO III - Monomer/oligomer analysis protocol

1. Sample preparation notes

1.1. Only liquid samples can be analyzed. For solid samples refer to the Klason

protocol

1.2. If samples are highly acidic (<2.5) the amount of acid added will need to be

decreased. See step 9 for calculation information.

1.3. The amount of acid added to the standards in step 7 is always 0.697 ml.

1.4. The HPLC system can measure only monomeric sugars. By adding acid and

autoclaving the sample, oligomers are cleaved to their monomeric components

which can be measured.

1.5. The amount of oligomeric sugar in each solution can be calculated by subtracting

the monomeric sugar measured in the non-autoclaved native solution from the

total sugars in the autoclaved samples.

2. Acid preparation


2.1.1. Add 665 ml concentrated sulfuric acid to 300 ml of distilled water

2.1.2. Allow the solution to cool and make the volume up to 1L with distilled

water

3. Sugar standard stock preparation (used for monomeric and oligomeric/total

sugar determination)

3.1. Weigh approximately the following amounts of sugar standards into a 50 ml

falcon tube and record the exact weights. If the sample is known to have very low

amounts of certain sugars, adjust the standard concentrations accordingly.

Arabinose 50 mg

Galactose 50 mg

47

Glucose 200 mg

Xylose 200 mg

Mannose 50 mg

3.2. Weigh 50 ml of nanopure water into the tube and record the exact weight

3.3. Mix thoroughly

4. Monomeric sugar determination

4.1. Samples:

4.1.1. Use fucose as an internal standard. Prepare a fucose stock solution by

weighing ~100 mg of fucose and mixing with ~25 ml water

4.1.2. Mix the desired amount of liquid sample (typically 50 µl for concentrated

samples, 950 µl for dilute) with 50 µl of fucose stock and enough nanopure

water to make the total volume 1000 µl


4.1.4. Cover each vial with a black screw cap containing a new septa

4.2. Analyze the samples on the HPLC

5. Monomeric sugar determination: standards:

5.1. Prepare standard solutions in microcentrifuge tubes as follows:

Vol sugar stock Vol fucose stock Vol water

S1-M 300 µl 50 µl 750 µl

S2-M 100 µl 50 µl 850 µl

S3-M 50 µl 50 µl 900 µl

S4-M 20 µl 50 µl 930 µl

S5-M 10 µl 50 µl 940 µl

5.1.1.

48

5.1.2. Mix each standard well



5.2. Analyze the samples on the HPLC

6. Oliogomeric/Total sugar determination (oligomers and monomers): Acid

hydrolysis

6.1. The reaction volume is 20 ml in 150 ml septa bottles and is typically done in

duplicate

6.2. To each bottle add:

72% H2SO4 0.697 ml

Sample 15 ml (or less if sample is highly concentrated)

diH2O 4.303 ml (or such that the total volume is 20 ml)


crimp-top

6.4. Autoclave for 60 min at 121°C along with the standards (see below)

7. Oliogomeric/Total sugar determination: Standard preparation

7.1. To determine the amount of sugar degradation occurring during autoclaving under

acidic conditions, a set of sugar standards will be prepared in septa bottles in the

same way as the samples:

Vol sugar stock Vol 72% H2SO4 Vol water

S1-O 4 ml 0.697 ml 15.303 ml

S2-O 2 ml 0.697 ml 17.303 ml

S3-O 1 ml 0.697 ml 18.303 ml

49

S4-O 0.4 ml 0.697 ml 18.903 ml

S5-O 0.1 ml 0.697 ml 19.203 ml

7.2. Mix in septa bottles


crimp-top

7.4. Autoclave for 60 min at 121°C at the same time as the samples

8. Oliogomeric/Total sugar determination: analysis

8.1. Allow the autoclaved samples to cool before opening the bottles

8.2. Samples:

8.2.1. Mix the desired amount of hydrolysate (typically 50 µl for concentrated

samples, 950 µl for dilute) with 50 µl of fucose stock (see step 4.1.1 for

preparation) and enough nanopure water to make the total volume 1000 µl



8.3. Standards:

8.3.1. Mix 950 µl of the autoclaved standard with 50 µl of fucose stock




8.4. Run the samples on the Dionex HPLC using a 10μL injection volume.

9. Determination of acid volume (only if the solution pH is less than 2.5)

9.1. For each sample and standard, calculate the volume of 72% sulfuric acid required

to bring the acid concentration to a 4% final acid concentration. The molar

concentration of hydrogen ions, [H+], in a sample, can be calculated from the pH

as follows,

pH = -log[H+], therefore, [H+] = antilog(-pH)

50

9.2. The volume of 72% sulfuric acid needed is then calculated from the following

equation:

V72% = [(C4% x Vs) - (Vs x [H+] x 98.08g H2SO4/2 moles H+)]

C72%

Where:

V72% is the volume of 72% acid to be added, in mL

Vs is the initial volume of sample or standard, in mL,

C4% is the concentration of 4% w/w H2SO4, 41.0 g/L

C72% is the concentration of 72% w/w H2SO4, 1176.3 g/L

[H+] is the concentration of hydrogen ions, in moles/L

9.3. Example: Calculate the amount of 72% H2SO4 needed to prepare a sample with a

pH of 2.41 for 4% acid hydrolysis. If the pH is 2.41, then [H+]=0.00389 M.

Therefore:

[(41.0 g/L)x(20 mL) - (20 mL)x(0.00389 moles/L)x(98.08 g/2 moles)]1176.3 g/L= 0.694

mL

9.4. See Table 1 for a quick reference to the amount of acid necessary for a given pH.

51

Table 1. Quick reference table for calculation 9.2.

52

ANEXO IV – Enzymatic hydrolysys (Adapted from protocol)

Enzymatic hydrolysis of washed solids was carried out in 5 % (w/v) consistency

with a total volume of 50 ml in 125 ml Erlenmeyer flasks. 50 mM citric acid buffer was

used to maintain the pH at 4.8 and the flasks were incubated at 50 °C and 175 rpm in an

orbital shaker (New Brunswick). Cellulase (Celluclast 1.5 L from Novozym) at 5 FPU/g

cellulose and β-glucosidase (Novozym 188) at 10 CBU/g cellulose were loaded into each

flask. 1 ml samples were taken periodically over 96 hours, boiled for 10 min to denature

enzymes, and stored at -20 °C for HPLC analysis.

53

ANEXO V -Fermentation in Erlenmeyer flasks

4.3 General Steps

1. Determine amount of cells needed for experiment – typically 5 g/L in each flask

2. Sterilize media and grow yeast

3. Harvest yeast cells and calculate cell concentration

4. Obtain hydrolysate and prepare flasks

5. Fermentation

6. Sample preparation for HPLC

7. Data analysis

4.4 Experimental procedure:

CELL GROWTH DAY 1

1. Prepare media to grow yeast

***500 mL of media will produce approximately 2.2 g of cells. Calculate the

volume of media required to grow the amount of cells required.

1.1. To prepare 1 L of media (1% w/v solution of glucose, peptone, and yeast extract)

1.1.1. Weigh out 10 g each of glucose, peptone, and yeast extract and mix with 1 L

deionized water

1.1.2. Mix in beaker with stir bar on stir plate until completely dissolved

1.1.3. Split the media into two 1 L Erlenmeyer flasks

1.1.4. Place a foam stopper in each flask and cover with a square of foil and a

small piece of autoclave indicator tape

1.2. Prepare 500 ml of 0.9% w/v sodium chloride in a 1 L glass bottle with loosened

lid

1.3. Also prepare 500 ml of nanopure water in a 1 L glass bottle with loosened lid

1.4. Autoclave (15 minute, 121 °C liquid cycle)

CELL GROWTH DAY 2

54

2. Inoculation of media with yeast colony

In sterile hood:

2.1. Spray down hood

2.2. Using sterile wooden stick or flamed loop, pick off one colony from plate and

carefully place into media in ONE flask without touching walls or neck of flask.

2.3. Cover mouth of flask with stopper and foil

2.4. Place flask in incubator at 30 degrees, 200 rpm

CELL GROWTH DAY 3

3. Washing

3.1. After 24 hours, remove flask from incubator and place in sterile hood

3.2. In hood, pour cell suspension into a sterile 500ml centrifuge bottle. Fill another

bottle with water to balance the centrifuge and use the balance to adjust the weight

of the bottle filled with water so it is exactly the same as the bottle filled with

media. DO NOT open the bottle of media outside of the hood.

3.3. Spin down both bottles for 5 min at 4000 rpm in the centrifuge.

3.4. In hood, carefully pour off the supernatant from the bottle of media and replace

with equal amount of fresh media from the second unopened autoclaved flask

3.5. Resuspend the cells in the fresh media by gently shaking the bottle and pour the

suspension into the clean flask

3.6. Cover and return the flask to the incubator for another 24 hours

CELL GROWTH DAY 4

4. Cell harvest

4.1. Spin down cells as before in a sterile 500 ml bottle

4.2. In hood, discard supernatant

4.3. Resuspend the cells in ~200 ml of sterile water and shake gently

4.4. Spin down for 5 minutes at 4000 rpm and pour off the supernatant.

55

4.5. In hood, resuspend the cells in a small volume (~30 ml) of sterile 0.9% NaCl and

transfer into a 50 ml conical tube.

4.6. Label and store in fridge

4.7. Use within 1-2 days

5. Yeast concentration determination

5.1. To calculate the slope of a curve of cell dry weight vs OD600 , oven dry known

volumes of cell suspension after measuring the OD during different points in the

growth process.

5.1.1. For Saccharomyces cerevisiae ATCC 96581, this slope is 2.5 L/g

5.2. To calculate the concentration of the cells, measure the optical density of the

concentrated, washed cells as follows.

5.2.1. Shake the cell concentrate in the conical tube and quickly remove ~0.5 ml

using a sterile pipette tip

5.2.1.1.Dilute the cells 1000x by making three 10x dilutions (serial dilutions):

Pipette 900 ul of water into three 1.5ml tubes. Pipette 100 ul of the cell

concentrate into the first tube and mix thoroughly. This is 10x diluted.

Pipette 100 ul of the 10x diluted solution into the second tube of water

and mix. This tube is 100x diluted.Finally, pipette 100 ul of the 100x

diluted solution into the third tube of water and mix. This solution is

1000x diluted and can now be read on the spectrophotometer.

5.3. Turn on the spectrophotometer and allow to warm up. Set the wavelength to 600

nm.

5.4. Zero the instrument with pure water in an acrylic cuvette

5.5. Transfer the 1000x diluted cell sample to a clean, dry cuvette and note the reading

56

5.5.1. For example, if the OD600 reading was 0.180, the yeast concentration would

be

5.6. Calculate how much yeast to add to each flask to provide a cell concentration of 5

g/L or 5 mg/ml in 50 ml.

5.7. For example:

FERMENTATION

6. Fermentation Preparation

6.1. Autoclave the desired number of 125 ml flasks (with foam stoppers and foil

covers) and include 2 extra for controls

Fermenting flasks hydrolysate + yeast

Substrate control hydrolysate + water (no yeast, add water instead)

Yeast control water + yeast (no hydrolysate)

6.2. Adjust the pH of hydrolysate to be fermented to pH 6 using 10% NaOH and HCl.

6.3. Calculate how much hydrolysate needs to be added to each flask for a total volume

of 50 ml (or desired volume) including the volume of yeast.

6.4. Add the correct amount of hydrolysate or water to each flask

57

6.4.1. Store flasks in fridge until ready to use

7. Fermentation Start

7.1. Pre-heat all flasks to 30 °C by placing them in the shaker for 30 min

7.2. Suspend yeast in tube by gently shaking

7.3. Add the calculated amount of yeast to all flasks

7.4. Swirl and take a 1 ml sample for T=0

7.5. Sample every 2 hours for the first 8-10 hours, and every 12 hours thereafter (see

below for details)

7.6. Note the exact time that each sample was taken.

8. Sampling

8.1. At each timepoint, use a 1 ml micropipettor to remove 1 ml of sample from each

flask (use a new tip for each flask). Pipette the samples into labeled 1.5 ml

microcentrifuge tubes.

8.2. Immediately place each tube in a heating block heated to 100°C. This will boil the

sample and kill the yeast, ending the reaction. Be sure that the lid is securely

snapped closed.

8.3. Each sample should be boiled for 10 min, after which they should be carefully

removed from the heating block and cooled.

8.4. Samples can then be stored in the freezer until ready to prepare for HPLC analysis.

9. HPLC sample preparation: Filtration

9.1. To determine the amount of glucose, ethanol and glycerol present over the course

of fermentation, the raw samples taken at each timepoint will be filtered, diluted

and run on the Shimadzu HPLC. The raw samples must be well filtered before

they are injected on the HPLC as ANY SOLIDS will clog and damage the system.

58

Any samples being run on the HPLC must be filtered through 0.22 m syringe

filters.

9.2. Prepare a set of labeled 1.5 ml microcentrifuge tubes labeled in the same way as

the tubes containing the raw samples. The raw samples will be filtered into the

empty tubes.

9.3. Since cell solids are still present in the raw samples, they must be centrifuged

before filtration. Spin down all of the tubes at 10,000 rpm for 5 minutes. Be sure

the rotor is balanced.

9.4. If allowed to sit, the pelleted solids will start to diffuse back into the liquid.

Immediately after centrifugation:

9.4.1. Remove the supernatant with a 1 ml syringe, taking care not to disturb the

pellet. It’s OK to leave a few drops of liquid on top of the pellet.

9.4.2. Attach a 0.22 m syringe filter to the end of the syringe. Push it firmly onto

the tip of the syringe.

9.4.3. Slowly push the contents of the syringe through the filter into the empty

labeled tube. If there is any leakage, check the connection between the

syringe and filter. If the filter itself is leaking, switch it for a new filter.

10. HPLC sample preparation: Dilution

10.1. If the filtered samples are run directly without dilution, they will not be

measured properly because they are too concentrated. All of the filtered samples

must now be diluted.

10.2. Label a set of 2 ml glass HPLC vials, one for each of the filtered samples

10.3. Dilute the samples as shown in the table below:

10.3.1. Pipette the appropriate amount of deionized water into the glass vials

10.3.2. Finally, pipette the appropriate amount of filtered sample into the vials

59

Timepoint Water (L) Filtered sample (L)

First 12 hours 950 50

After 12 hours 950 100

10.4. Cap each vial with a black screw cap containing a new Teflon septa with the

red side facing the outside of the cap

10.5. Mix the vials by inversion

11. HPLC sample preparation: Standards

11.1. Every time samples are run on the HPLC, standards must be run at the same

time. We are interested in glucose, ethanol, acetic acid and glycerol so we will

prepare a standard solution containing all of these.

.

Sugar Approx amount (mg) Actual amount (mg)

Glucose 400 mg

Ethanol 200

Glycerol 100

Acetic acid 100

Water 50,000 (50 ml)

11.1.1. Weigh ~400 mg of glucose into a weigh boat and record the exact weight

to 0.0001g.

11.1.2. Weigh ~200 mg of ethanol into a weigh boat and record the exact weight

to 0.0001g.

11.1.3. Weigh ~100 mg of glycerol into a weigh boat and record the exact

weight to 0.0001g.

11.1.4. Place a 50 ml conical tube on the balance and tare the balance. Add the

three pre-weighed components to the tube and use water to make a

quantitative transfer. Top up the volume of the tube to 50 ml and record the

exact weight.

60

11.1.5. Calculate the glucose, ethanol, acetic acid and glycerol concentrations in

mg/mL, assuming that the water has a density of 1 g/ml.

11.2. Use the table below to prepare 5 standards from the standard stock.

Water (L) Standard stock (L)

S1 550 400

S2 750 200

S3 850 100

S4 900 50

S5 930 20

12. HPLC analysis

12.1. Place unknowns and standards in the HPLC autosampler

12.2. Input the sample names into the sequence on the computer

12.3. Each sample takes 30 min to run on the Shimadzu HPLC – calculate the total

time to analyze the samples

DAY 8

1. HPLC data analysis

1.1. For every sample that was run on the HPLC, get the peak areas for glucose,

ethanol and glycerol

1.2. Standards:

1.2.1. Use the peak areas for glucose, ethanol and glycerol in the standards to plot

three standard curves of peak area vs concentration. Determine the slope of

this curve and use it to calculate the concentrations of glucose, ethanol and

glycerol in the unknown samples.

1.3. Unknown samples:

61

1.3.1. Use the peak areas for glucose, ethanol and glycerol to calculate the glucose

concentration at each timepoint, being sure to multiply by the dilution factor.

1.3.2. For each analyte, take an average of all 3 flasks at each timepoint.

1.3.3. With one data point per timepoint, now curves can be plotted of glucose,

ethanol and glycerol concentration vs time.

2. Final data analysis

2.1. Plot a curve of % of theoretical ethanol yield vs time. 100% of theoretical ethanol

yield is 0.51 g ethanol/g glucose.

2.1.1. Calculate the amount of glucose in the starting liquid in grams

2.1.2. Calculate the theoretical maximum amount of ethanol that could be

produced from this much glucose, in grams

2.1.3. Calculate the amount of ethanol at each timepoint in the reaction in grams

(multiply the concentration by the volume - be sure to correct the volume for

the amount of liquid removed during sampling)

2.1.4. Calculate the % of theoretical yield at each timepoint by dividing the actual

ethanol by the theoretical maximum amount

2.1.5. Plot a curve of % theoretical ethanol yield vs time.

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