UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

Influência do etileno e do ácido indol-3-acético na formação de compostos voláteis do aroma em morangos (Fragaria x ananassa Duch.)

Bruna Yumi Saiki Kiyota

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo.

Orientador(a):

Prof.(a). Dr(a) Eduardo Purgatto

São Paulo

2018

Dedico este trabalho a todos que

contribuíram direta ou indiretamente em

minha formação acadêmica.

SUMÁRIO

Pág.

Lista de Figuras ..................................................................................................................

Lista de Tabelas .................................................................................................................

Lista de Abreviaturas ..........................................................................................................

1

1

2

RESUMO ............................................................................................................................ 3

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 4

2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 6

3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................

3.1 Tratamento dos Frutos .................................................................................................

3.2 Análise de Cor ..............................................................................................................

3.3 Respiração e Produção de Etileno ...............................................................................

3.4 Análise de Perfil de Compostos Voláteis .....................................................................

3.5 Análise Estatística ........................................................................................................

6

6

7

8

9

10

4. RESULTADOS ...............................................................................................................

4.1 Análise de Cor ..............................................................................................................

4.2 Respiração e Produção de Etileno ...............................................................................

4.3 Análise do Perfil de Compostos Voláteis .....................................................................

11

11

14

16

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................. 23

6. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 26

7. REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 27

1

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Registro visual dos frutos de morangueiro no dia da colheira (dia zero) e ao

longo do amadurecimento, após os tratamentos com ácido indol-3-acético (AIA) ou

etileno. O grupo controle não foi submetido a tratamento

hormonal......................................................................................................................... 12

Figura 2 – Gráficos da produção de etileno e de gás carbônico comparando os grupos

controle, etileno e AIA. A imagem 2ª corresponde a produção de etileno e a imagem 2b

corresponde a produção de CO2 dos mesmos grupos tratados.................................... 15

Figura 3 – Gráficos ACP biplot construídos através dos dados de compostos voláteis

após normalização. As imagens 2a, 2b, 2c, 2d e 2e correspondem a influência dos

compostos detectados nos dias 1, 2, 3, 4 e 5, após tratamento.................................... 19

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Características físicas dos frutos ao decorrer do tempo estudado (quatro

dias para maturação)..................................................................................................... 14

Tabela 2 – Compostos voláteis detectados por SPME-CG-MS em morangos da cultivar

Fragaria x ananassa tratados com AIA.......................................................................... 17

Tabela 3 - Compostos voláteis detectados por SPME-CG-MS em morangos da cultivar

Fragaria x ananassa tratados com etileno..................................................................... 18

Tabela 4 – Legenda de cores dos compostos voláteis detectados................................ 22

2

LISTA DE ABREVIATURAS

ADH

AIA

ANOVA

CG

CP

EM

HPL

NaCl

PCA

SPME

Álcool desidrogenase

Ácido indol-3-acético

Análise de variância

Cromatografia a gás

Componentes principais

Espectrometria de massa

Enzima conversora hidroperóxido liase

Cloreto de sódio

Análise de Componentes Principais

Microextração em Fase Sólida

3

RESUMO

KIYOTA, B. Y. S. Influência do etileno e do ácido indol-3-acético na formação de compostos voláteis do aroma em morangos (Fragaria x ananassa Duch.). 2018. Projeto nº. 772-18-1º, USP 276162. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018. Palavras-chave: Amadurecimento, Compostos Voláteis, Etileno, Frutos não-climatéricos, Hormônios Vegetais

INTRODUÇÃO: O amadurecimento é um processo complexo e coordenado, envolvendo uma rede de hormônios vegetais, que inclui o etileno e o ácido indol-3-acético (AIA). Em morangos, há evidências de que o AIA, um hormônio da classe das auxinas, iniba o amadurecimento do receptáculo, enquanto a ação do etileno neste fruto não foi totalmente elucidada. Atualmente, não há um estudo detalhado sobre a função desses hormônios na produção de compostos voláteis formadores do aroma em frutos não-climatéricos, grupo no qual o morango é classificado.

OBJETIVO: O principal objetivo desse estudo é avaliar os efeitos do etileno e do AIA na produção de compostos voláteis em frutos não-climatéricos, tendo como modelo o morango.

MATERIAIS E MÉTODOS: Morangos foram coletados no ponto de maturação branco e divididos em três grupos, de acordo com seu tratamento: controle, etileno e AIA. Por meio da análise de colorimetria, Microextração em Fase Sólida, cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas e análise multivariada (PCA), parâmetros do amadurecimento, como cor e produção de compostos voláteis, foram analisados durante cinco dias.

RESULTADOS: No primeiro e no segundo dia, o grupo AIA apresentou um aumento de compostos C6, componentes característicos do fruto verde, sugerindo um atraso no desenvolvimento de aroma. No grupo etileno, os níveis de alguns compostos derivados C6 foram negativamente afetados (4-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila e 1-hexen-3-ol). A análise de cor também contribuiu para verificar a influência de AIA no processo de amadurecimento de morangos, uma vez que o hormônio atrasou o desenvolvimento da cor vermelha característica do fruto maduro.

CONCLUSÃO: O estudo mostra que há uma mudança significativa no perfil de compostos voláteis em frutos tratados com etileno e AIA, indicando que estes dois hormônios podem ser reguladores da formação do aroma no morango.

4

1. INTRODUÇÃO

Frutos carnosos fazem parte integrante da dieta humana e servem como uma

importante fonte de vitaminas, minerais, antioxidantes, açúcares e teor de fibras. Os

atributos de qualidade nutricional dos frutos dependem, em grande parte, do estágio de

maturação e defende-se um amadurecimento ótimo para o consumo (Symons et al.,

2012).

O desenvolvimento de frutos pode ser dividido em três fases fisiológicas:

crescimento, maturação e senescência. A fase final da maturação corresponde ao

amadurecimento de frutos, um processo coordenado metabolicamente, que implica em

modificações fisiológicas e bioquímicas. Estas, por sua vez, levam a alterações

sensoriais relacionadas à aparência, aroma, textura e sabor, notadas em análises

químicas, físicas, bioquímicas ou sensoriais (CAVALINI, 2008). Nesse contexto, o

amadurecimento é determinado como um processo irreversível, tornando o fruto apto

para consumo e atrativo para animais e outros agentes dispersores de suas sementes

(RYALL; LIPTON, 1979).

O amadurecimento é um processo regulado hormonalmente, variando entre

frutos climatéricos e frutos não-climatéricos. Um dos exemplos de frutos não-

climatéricos mais recorrente em estudos é o morango. Este fruto é importante

mundialmente e os potenciais benefícios de seu consumo para prevenção de doenças

cardiovasculares e neurodegerativas, obesidade, câncer e envelhecimento estão sob

investigação (SEERAM, 2008; GIAMPIERI et al., 2012). Mesmo com uma quantidade

de informação significativa sobre o amadurecimento de morangos, pouco se sabe sobre

a regulação desses processos, incluindo o papel desempenhado por diferentes

fitohormônios (MERCHANTE et al., 2013). O morango é usualmente utilizado como

modelo de fruto não-climatérico, pois não exibe um pico na respiração e a aplicação

externa de etileno nesse fruto não afeta a taxa de maturação (GIVEN et al., 1988).

Dentre as alterações sensoriais exercidas durante o amadurecimento, este

estudo enfatiza a síntese de compostos voláteis, a qual é essencial para a

caracterização do aroma do fruto maduro. Os compostos voláteis em plantas derivam

de quatro principais classes precursoras: carboidratos, aminoácidos, ácidos graxos e

5

carotenoides (KADER, A., 2008). No decorrer do processo de maturação, há variação

na composição destes, que levam a alterações na qualidade sensorial do produto

permitindo sua comercialização. Ainda é escasso o conhecimento sobre os

mecanismos que controlam as vias de biossíntese de voláteis, e vários estudos sobre

regulação dessas vias visam a influência direta de sinais hormonais.

A concentração endógena de hormônios varia segundo a espécie do fruto e são

importantes para controle do processo de amadurecimento, existindo uma inter-relação

entre estes biorreguladores, que incluem as giberelinas, auxinas e citocininas etileno e

jasmonatos (KLUGE et al., 2002). Dessa forma, atualmente considera-se a existência

de um efeito cruzado (crosstalk) de diferentes hormônios, que juntos modulam rotas

metabólicas e bioquímicas nos frutos (PECH et al., 2013).

O etileno é um fitormônio regulador do amadurecimento de frutos, atuando

através da modificação de padrões de expressão gênica e sendo responsável por

processos de desenvolvimento vegetal, tais como: mudanças de aparência, sabor,

aroma e textura dos frutos, respiração e síntese autocatalítica de etileno, por exemplo

(KERBAUY, 2008; KLEE, 2002).

Em Fisiologia Pós-colheita, os frutos são classificados em climatéricos, nos quais

apresentam um grande aumento na produção do hormônio etileno, e não-climatéricos,

nos quais não se observa o aumento de etileno nem um papel claro desse hormônio no

desenvolvimento desses frutos. Entre algumas funções identificadas, o hormônio auxilia

a redução da acidez e a síntese de compostos antociânicos (PEREZ et al., 1996;

AHARONI et al.,2000). Além disso, estudos sugerem que o etileno possui pouco ou

nenhum efeito no desenvolvimento do receptáculo do fruto, porém sabe-se que este

hormônio promove o amolecimento de frutos maduros ou na senescência

(CASTILLEJO et al., 2004).

Outro hormônio detectado em frutos, o ácido-indol-3-acético (AIA) é um hormônio

da classe das auxinas, que influencia diversos aspectos do desenvolvimento e

crescimento vegetal, entre eles a divisão celular, expansão e alongamento celular,

diferenciação celular, abscisão foliar, desenvolvimento do eixo caulinar, formações dos

primórdios foliares e filotaxia, desenvolvimento radicular, desenvolvimento de flores e

frutos (KERBAUY, 2008). Estudos em bananas, peras, abacates, morangos, entre

6

outras frutas, sugerem a participação de AIA também no processo de amadurecimento,

através da influência na expressão de genes que codificam enzimas que catalizam

diversos passos relacionados a eventos a síntese de ácidos orgânicos, síntese e

degradação de pigmentos e metabolismo do amido (PURGATTO et al., 2001). Em

morangos, a aspersão de auxina sobre o fruto inibe o amadurecimento do receptáculo,

enquanto a remoção dos aquênios acelera o amadurecimento do mesmo, indicando

serem a fonte de auxina no fruto.

Assim como o etileno, o papel da auxina não é muito bem definido em morangos,

não havendo estudos detalhados sobre a ação do hormônio nas vias metabólicas. Além

dos motivos apontados anteriormente, o morango também é muito utilizado em estudos

de amadurecimento devido a grande quantidade de compostos voláteis produzidos e a

sua importância econômica. A descoberta de fatores influentes na formação de

compostos voláteis nos morangos acarretaria na inovação de técnicas de conservação,

as quais auxiliariam na manutenção de características físicas e química pós-colheita,

aumentando o tempo para consumo do fruto mantendo sua qualidade sensorial.

2. OBJETIVO(S)

Ponderando a influência dos compostos voláteis nos frutos e a carência de

estudos sobre a ação de etileno e AIA nos frutos não-climatéricos, o projeto visa

analisar a produção de compostos voláteis em morangos tratados com hormônios

etileno e AIA, verificando se há efeito significativo no processo de amadurecimento.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Tratamento dos Frutos

A empresa Mape Frutas de Senador Amaral, Minas Gerais, forneceu os

morangos (Fragaria ananassa) da cv. Albion. Estes foram colhidos no ponto de

maturação branco e devidamente transportados em caixas de isopor com barras de gel

7

térmico até o Laboratório de Química, Bioquímica e Biologia Molecular de Alimentos da

FCF-USP.

Os frutos recém colhidos foram transportados até o laboratório, selecionados e

lavados para serem submetidos ao tratamento hormonal. Para não influenciar no

resultado dos tratamentos empregados, frutos com ferimentos e/ou em estágios de

maturação avançado foram descartados.

Após a secagem, dividiu-se as unidades entre os três grupos de tratamento:

controle, AIA e etileno. A aplicação dos hormônios teve como base protocolos

otimizados e testados anteriormente no laboratório por outros segmentos de pesquisa.

Para o tratamento com AIA, a concentração de hormônio utilizada foi 100 µM em água

em tratamento de 12h/12h por aspersão, enquanto para o tratamento com etileno,

empregou-se a exposição a 100 ppm de etileno gasoso por 12 horas de tratamento por

imersão gasosa. As amostras tratadas com os hormônios foram comparadas com um

grupo controle tratado somente com água por asperção.

Cada grupo foi armazenado em uma caixa de acrílico fechada, a temperatura

ambiente de 20ºC, com controle de luz branca para evitar formação de pigmentos pela

presença de luz, e a alta umidade do ambiente (75%), mantida pela adição de papel-

filtro embebido em água milli-Q. Assim, durante cinco dias, até o completo

amadurecimento dos frutos (estágio vermelho do fruto, correspondente ao fruto

maduro), amostras eram recolhidas em três replicatas biológicas. A partir das amostras,

o acompanhamento do processo de amadurecimento se deu por meio das análises da

taxa de respiração (CO2), dos níveis de produção de etileno e da cor antes do

congelamento. Cada amostra (10 frutos/grupo/dia) foi congelada em N2 líquido e

armazenada a -80ºC para análises de produção e perfil de compostos voláteis.

3.2 Análise de Cor

Para realização da análise de cor, emprega-se um instrumento de medição que

permite a quantificação desse atributo. O colorímetro possibilita a medição da luz

refletida no fruto em faixas específicas ou em cada comprimento de onda e, a partir da

8

quantificação dos dados espectrais, determina as coordenadas no espaço de cor L*a*b

e retorna em valores numéricos.

O colorímetro utilizado no experimento foi um aparelho Minolta Chromameter

410R, no qual as cores são expressas em relação ao valor de matiz (Hue), calculado

pela fórmula:

Onde a é relativo ao grau de variação entre vermelho e verde (define tonalidade

da cor) e b é relativo ao grau de variação entre amarelo e azul (define a intensidade ou

pureza da cor, sendo a saturação). Estes dados são fornecidos pelo aparelho, segundo

o plano de cores descrito no método Hunter.

Para a análise da cor, o colorímetro precisou ser calibrado no “branco total” para

depois ser utilizado na medição das amostras. Além de fornecer valores para a e b, há

a medição de L, referente ao grau de luminosidade das cores medidas. Durante todos

os dias de coleta, retirou-se três frutos de cada tratamento para medição da cor. Por

não se tratar de uma superfície homogênea, a medição foi realizada em três pontos

distintos do fruto.

3.3 Respiração e Produção de Etileno

As taxas de respiração e produção de etileno podem ser relacionados ao

processo de amadurecimento, já que ambas tendem a aumentar com o decorrer do

tempo. Dessa forma, é de extrema importância avaliar os efeitos do processo no fruto

por meio de experimentos baseados na respiração vegetal e produção de etileno.

A medida da respiração foi realizada em amostras de ar do interior de frascos de

200 mL contendo frutos do grupo tratado. Cada grupo tinha quatro frascos e cada

frasco continha cinco frutos, no mínimo. Os frutos permaneceram dentro do frasco

fechado por 30 minutos e o ar do headspace serviu de amostra, sendo retirado com

seringa de 10mL e injetado em um cromatógrafo a gás da Hewlett-Packard modelo GC-

6890 acoplado a um detector de condutividade térmica. O equipamento empregou uma

coluna HP-Plot Q (30 m, D.I. 0,53 mm).

9

Para análise, o equipamento foi programado segundo as seguintes condições

cromatográficas: volume de injeção 1,0 mL; injeção com divisor de amostra (split) em

taxa de 50:1 e temperatura de 250ºC; temperatura do detector em 250ºC utilizando

como referência fluxo de hélio a 7mL/min; corrida isotérmica a 30ºC empregando hélio

como gás carregador em fluxo constante de 4mL/min. Realizou-se a estimativa da

quantidade de CO2 de acordo com a injeção de 1 mL de padrão de CO2 326 μL/L em ar

sintético da Air Liquid.

A produção de etileno empregou as mesmas amostras coletadas nas seringas e

o mesmo aparelho e coluna cromatográfica. Contudo o detector operava por ionização

de chama. Utilizou-se o modo de injeção pulsed splitless, desenvolvido pela Hewlett-

Packard, opcional das válvulas de injeção com EPC utilizadas nos modelos de

cromatógrafo a gás desta empresa.

Para análise, o equipamento foi programado segundo as seguintes condições de

injeção: volume de injeção 1,0 mL; fluxo de ventilação de 5 mL/min após 30 segundos

de injeção; pressão de 138 psi por 3 minutos e temperatura do injetor em 200ºC. Além

disso, adotou-se também as seguintes condições cromatográficas: corrida isotérmica a

30ºC empregando hélio como gás carregador em fluxo constante de 1 mL/min;

temperatura do detector em 250ºC, fluxo de ar e hidrogênio no detector em 400 mL/min

e 40 mL/min, respectivamente. A estimativa da quantidade de etileno produzida pelos

frutos será feita em relação à injeção de um padrão de 0,1 μL/L de etileno em ar

sintético da Air Liquid.

3.4 Análise de Perfil de Compostos Voláteis

O aroma e o sabor característico dos frutos são fornecidos pela presença e

formação de compostos voláteis, uma vez que acionam receptores olfativos nas narinas

(aroma) e são sentidos na cavidade retronasal (sabor) ao serem degustados. A

formação de compostos voláteis específicos está diretamente ligado ao estágio de

amadurecimento em que o fruto se encontra e a partir dessas análises, podemos

caracterizar a fase de maturação de acordo com o perfil de compostos voláteis

produzidos.

10

Com a finalidade de coletar amostras dos cinco dias após tratamento, algumas

unidades de morangos de cada tratamento foram picados e pesados a 5g em vials

âmbar de 20mL com tampa magnetizada e septo de silicone. Ao mesmo vial, adicionou-

se 7mL de solução de NaCl 30% e todos os vials foram congelados a -20ºC para

melhor armazenamento até o momento da análise.

Para análise dos compostos voláteis, empregou-se o método de extração de

voláteis por SPME. Os vials foram descongelados em banho-maria a 30ºC por 1 hora e

permaneceram por mais 15 minutos a temperatura ambiente em agitação. A exposição

da fibra se deu por mais 30 minutos para adsorção e para dessorção, 3 minutos no

injetor do CG-EM. O equipamento utilizado foi um cromatógrafo Hewlett-Packard

modelo 6890 acoplado a um detector seletivo de massas da mesma empresa modelo

5973. O método de extração de voláteis por SPME empregou uma resina de

carboxeno, divinilbenzeno de 50/30 µm de espessura em polidimetilsiloxano da

Supelco® (CAR/DVB/PDMS).

O programa de temperatura utilizado foi: 35ºC por 0,5 minuto, rampa de

temperatura de 5ºC/min até 250ºC, permanecendo por 1 minuto, seguida de nova

rampa a 20ºC/min até 310ºC e permanecendo por 2 minutos. A temperatura da

interface entre o cromatógrafo e o detector seletivo de massas será de 200ºC e a

ionização foi feita por impacto de elétrons (70 eV) com a fonte de íons mantida a 150ºC.

As análises foram realizadas em triplicata para cada uma das amostras. Os espectros

de massas obtidos foram comparados com os da biblioteca NIST versão 2011 e

considerado com identificação aceitável aqueles com índice de similaridade acima de

70%.

3.5 Análise Estatística

Para os resultados derivados das análises de respiração, etileno, cor e níveis de

etileno e AIA foram realizados testes de ANOVA, comparando as médias em cada

ponto e, quando houve diferenças significativas (p<0,05) entre os tratamentos e o grupo

controle, realizou-se o teste de Tukey, ambos utilizando o programa Statistica 6.0. Para

a comparação entre as amostras e os efeitos dos tratamentos sobre os perfis globais de

11

voláteis, empregou-se a Análise de Componentes Principais (PCA), além das de

agrupamento hierárquico e visualizados na forma de Heat-maps, utilizando o programa

Statistica 6.0 e MetaboAnalyst 2.0.

4. RESULTADOS

4.1 Análise de Cor

A fim de melhor acompanhar o amadurecimento dos frutos, amostras de

morangos foram estudadas por meio de um registro visual da aparência dos frutos

(Figura 1). Na Figura 1a, observa-se o ponto de maturação branco em que os

morangos foram colhidos. As demais imagens (Figuras 1b, 1c e 1d) exemplificam o

amadurecimento dos frutos segundo o tratamento empregado em cada grupo: controle,

AIA e etileno, respectivamente.

Avaliando a aparência física, o experimento evidenciou o efeito da auxina (Figura

1c) com o grupo controle (Figura 1b). A aplicação do hormôno AIA nos morangos inibe

o amadurecimento do receptáculo, fazendo com que o processo de maturação seja

retardado. Ao contrário do que se observou para o grupo AIA, o resultado obtido para o

grupo etileno não nos permite concluir o efeito desse hormônio no morango, já que há

semelhança entre o tratamento com etileno (Figura 1d) e o grupo controle tratado

somente com água (Figura 1b).

12

Figura 1: Registro visual dos frutos de morangueiro no dia da colheira (dia zero) e ao longo do amadurecimento, após os tratamentos com ácido indol-3-acético (AIA) ou etileno. O grupo controle não foi submetido a tratamento hormonal.

a) Dia Zero

b) Controle

Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

c) AIA

Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

13

d) Etileno

Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Além do registro visual, a comparação entre a aparência dos frutos de cada

tratamento foi possível através do plano de cores do método Hunter. Os valores obtidos

de a e b para cada medição foram usados para calcular o Ângulo de Matiz (Hue.ºH)

segundo a fórmula apresentada anteriormente. O ºH está diretamente relacionado com

a cor da superfície dos frutos (Tabela 1).

De um modo geral, houve uma redução nos valores de ºH com o progresso da

maturação, porque os valores fornecidos pelo colorímetro de b se apresentaram

numericamente inferiores aos valores de a. Tal fato indica mais coloração vermelha do

que coloração amarela, evidenciando a mudança de cor do fruto para vermelho (estado

maduro).

14

Tabela 1: Características físicas dos frutos ao decorrer do tempo estudado (quatro dias para maturação).

Característica Tratamento Dia

1 2 3 4

Luminosidade

(L)

Controle 81,32±4,95 57,94±9,21 47,81±6,76 37,09±4,03

73,53±6,78 73,29±7,45 51,57±15,68 45,60±5,21

70,77±8,07 68,34±8,11 38,89±11,01 39,51±6,64

AIA 72,27±4,90 76,97±10,58 73,43±26,33 69,70±18,68

61,49±13,30 71,92±16,91 86,93±9,37 50,53±7,26

71,12±13,97 72,87±23,61 93,40±9,85 50,91±10,59

Etileno 83,81±3,89 56,74±16,21 50,06±2,73 45,28±5,64

66,56±21,60 53,53±10,57 59,94±16,15 43,57±9,33

77,64±13,37 79,90±23,77 67,99±15,14 50,37±4,26

Ângulo Hue

(ºH)

Controle 97,53±6,99 26,58±24,27 27,49±5,57 16,64±4,76

92,17±4,89 58,13±14,85 55,05±31,77 15,80±18,65

75,53±20,40 55,21±42,01 29,42±11,20 11,29±15,44

AIA 102,09±4,99 90,51±10,81 60,12±40,87 37,30±20,85

46,08±20,97 49,56±18,75 75,12±27,25 19,68±1,82

61,09±26,29 60,36±36,34 94,48±2,78 24,06±6,68

Etileno 81,51±18,77 32,75±21,22 22,84±2,09 19,36±3,51

50,02±29,23 25,86±9,08 31,51±16,09 20,51±3,86

53,04±25,71 56,84±33,27 43,06±23,51 24,36±6,77

4.2 Respiração e Produção de Etileno

O cromatógrafo a gás detectou as amostras injetadas e, a partir da curva

traçada, as áreas de pico obtidas permitiram o cálculo da respiração e da produção de

etileno. A massa de cada amostra e o tempo de produção de etileno, a área padrão de

etileno e o volume do frasco, são variáveis necessárias para o cálculo desejado.

Para comparar os valores obtidos na produção de etileno e na produção de gás

carbônico entre os cinco dias pós-tratamento, pode-se verificar a mudança hormonal e

a taxa de respiração (Figura 2). A produção de etileno, independente do tratamento

utilizado, foi maior no quarto dia (Figuras 2a), enquanto a respiração dos frutos variou

de acordo com o tratamento empregado (Figuras 2b).

15

Figura 2: Gráficos da produção de etileno e de gás carbônico comparando os grupos controle, etileno e AIA. A imagem 2a corresponde a produção de etileno e a imagem 2b corresponde a produção de CO2 dos mesmos grupos tratados.

2a

2b

16

Nota-se que os valores para produção de etileno e gás carbônico oscilam

durante os dias e a concentração encontrada é alta demais para validar os resultados

obtidos.

4.3 Análise do Perfil de Compostos Voláteis

A partir da técnica SPME, nota-se o efeito dos tratamentos hormonais (AIA e

etileno) na formação dos compostos voláteis formadores de aroma. No tratamento com

auxina, 22 substâncias foram identificadas (Tabela 2) , enquanto no tratamento com

etileno, 25 substâncias (Tabela 3). A classificação dessas substâncias mostra a

diversidade de odores encontrados na composição do aroma do fruto, sendo que a

maioria dos compostos identificados em ambos tratamentos tem como precursores

ácidos graxos (sintetizados pelas vias da lipoxigenase e da beta oxidação).

17

Tabela 2: Compostos voláteis detectados por SPME-CG-MS em morangos da cultivar Fragaria x ananassa tratados com AIA

Nº Substância

Detectada

Descrição

do Odor*

Precursor Nº Substância

Detectada

Descrição

do Odor*

Precursor

1 Ciclohexanol Cânfora Aminoácidos 12 1-Hexen-3-ol Nota verde Ácidos

Graxos

2 Acetato de

hexila

Nota verde,

frutado

Ácidos

Graxos

13 (E) óxido-

linalool

(furanoid)

Floral Isoprenoides

3 Propionato de

2-hexen-1-ila

Nota verde

Ácidos

Graxos

14 Butirato de

metila

Frutado Ácidos

Graxos

4 Propionato de

3-hexen-1-ila

Nota verde,

frutado

Ácidos

Graxos

15 Acetato de 2-

hexen-1-ila

Nota verde Ácidos

Graxos

5 Linalool Cítrico,

floral

Isoprenoides 16 Propionato

de isobutila

Frutado Ácidos

Graxos

6 3-Pentanona Etéreo Ácidos

Graxos

17 2-Etil-1-

hexanol

(furanoid)

Cítrico Ácidos

Graxos

7 Tolueno Adocicado Aminoácidos 18 Benzaldeído Frutado,

amendoado

Isoprenoides

8 2-Hexenal Nota verde Ácidos

Graxos

19 α-terpineol Amadeirado Isoprenoides

9 Heptanoato de

metila

Frutado Ácidos

Graxos

20 Butenoato de

2-metila

- Ácidos

Graxos

10 (Z) óxido-

linalool

(furanoid)

Terroso Isoprenoides 21 Valerato de

4-metila

Frutado Ácidos

Graxos

11 Acetato de 3-

hexen-1-ila

Nota verde Ácidos

Graxos

22 1-Penten-3-

ona

Picante Ácidos

Graxos

* Fonte: http://www.thegoodscentscompany.com/; http://www.flavornet.org/flavornet.html;

http://www.pherobase.com/

18

Tabela 3: Compostos voláteis detectados por SPME-CG-MS em morangos da cultivar Fragaria x ananassa tratados com etileno

Nº Substância

Detectada

Descrição

do Odor*

Precursor Nº Substância

Detectada

Descrição

do Odor*

Precursor

1 Ciclohexanol Cânfora Aminoácidos 14 (E) óxido-

linalool

(furanoid)

Floral Isoprenoides

2 Acetato de

hexila

Nota verde,

frutado

Ácidos

Graxos

15 Butirato de

metila

Frutado Ácidos

Graxos

3 Propionato de

2-hexen-1-ila

Nota verde

Ácidos

Graxos

16 Acetato de 2-

hexen-1-ila

Nota verde Ácidos

Graxos

4 Propionato de

3-hexen-1-ila

Nota verde,

frutado

Ácidos

Graxos

17 Propionato

de isobutila

Frutado Ácidos

Graxos

5 Linalool Cítrico,

floral

Isoprenoides 18 2-Etil-1-

hexanol

(furanoid)

Cítrico Ácidos

Graxos

6 3-Pentanona Etéreo Ácidos

Graxos

19 α-terpineol Amadeirado Isoprenoides

7 Tolueno Adocicado Aminoácidos 20 Hexanoato

de metila

Frutado Ácidos

Graxos

8 Heptanoato de

metila

Frutado Ácidos

Graxos

21 Butirato de

(Z)-3-hexen-

1-ila

Nota verde Ácidos

Graxos

9 Formiato de

linalool

Herbal Isoprenoides 22 Acetato de

benzila

Floral Aminoácidos

10 (Z) óxido-

linalool

(furanoid)

Terroso Isoprenoides 23 γ-

decalactona

Frutado Ácidos

Graxos

11 4-Hexen-1-ol Nota verde Ácidos

Graxos

24 Butenoato de

2-metila

- Ácidos

Graxos

12 Acetato de 3-

hexen-1-ila

Nota verde Ácidos

Graxos

25 Valerato de

4-metila

Frutado Ácidos

Graxos

13 1-Hexen-3-ol Nota verde Ácidos

Graxos

* Fonte: thegoodscentscompany.com; flavornet.org/flavornet.html; pherobase.com

19

Empregando o software XLSTAT, a Análise de Componentes Principais (PCA)

permitiu uma visão geral das influências dos compostos voláteis detectados nas

amostras submetidas em cada tratamento. A PCA é uma técnica de análise

multivariada, que correlaciona variáveis e fornece combinações lineares destas,

nomeadas componentes principais (CPs). A PCA possibilita observar a relação entre

variáveis e diferenças entre as amostras, já que o resultado diverge entre os frutos

tratados com diferentes hormônios.

Tratando cada composto volátil detectado como uma variável, os CPs são

obtidos após a normalização dos dados. No caso, somente dos componentes 1 e 2

foram selecionados, por apresentaram a maior variabilidade entre as amostras ao

decorrer dos cinco dias estudados (Figura 3). A fim de melhor visualizar os compostos

voláteis envolvidos na análise, uma legenda de cores e letras foi criada de acordo com

sua classificação (Tabela 4).

Figura 3: Gráficos ACP biplot construídos através dos dados de compostos voláteis após normalização. As imagens 3a, 3b, 3c, 3d e 3e correspondem a influência dos compostos detectados nos dias 1, 2, 3, 4 e 5, após tratamento.

3a

20

3b

3c

21

3d

3e

22

Tabela 4: Legenda de cores dos compostos voláteis detectados

Letra Substância detectada Via

metabólica Letra Substância detectada Precursor

A Ciclohexanol Aminoácidos P (E) óxido-linalool

(furanoid)

Terpenoides

B Acetato de hexila Lipoxigenase Q Butirato de metila Β-oxidação

C Propionato de 2-hexen-

1-ila

Lipoxigenase R Acetato de 2-hexen-1-ila Lipoxigenase

D Propionato de 3-hexen-

1-ila

Lipoxigenase S Propionato de isobutila Β-oxidação

E (Z) óxido-linalool (furanoid)

Terpenoides T 2-Etil-1-hexanol

(furanoid)

Lipoxigenase

F Linalool Terpenoides U Benzaldeído Terpenoides

G 3-Pentanona Β-oxidação V α-terpineol Terpenoides

H Tolueno Aminoácidos W Hexanoato de metila Lipoxigenase

I 2-Hexenal Lipoxigenase X Butirato de (Z)-3-hexen-

1-ila

Lipoxigenase

J Heptanoato de metila Β-oxidação Y Acetato de benzila Aminoácidos

K Formiato de linalool Terpenoides Z γ-decalactona Β-oxidação

L (Z) óxido-linalool

(furanoid)

Terpenoides A1 Butenoato de 2-metila Β-oxidação

M 4-Hexen-1-ol Lipoxigenase B1 Valerato de 4-metila Β-oxidação

N Acetato de 3-hexen-1-ila Lipoxigenase C1 1-Penten-3-ona Β-oxidação

O 1-Hexen-3-ol Lipoxigenase

A interpretação do gráfico se dá pela observação da distribuição dos vetores no

plano xy, em que x corresponde ao CP1 ou F1, e y ao CP2 ou F2. Quando mais

distante do centro, ou seja, mais negativo ou positivo o vetor, maior a influência deste

na formação do aroma do grupo tratado mais próximo, sendo significativo para

diferenciar os grupos tratados e caracterizá-los.

Para exemplificar a análise realizada para cada grupo tratado, observa-se que no

dia 1 (Figura 3a), as três replicatas biológicas obtidas nos frutos tratados com AIA

encontram-se no primeiro quadrante do gráfico. Consequentemente, os compostos

voláteis (D, F, I) detectados no mesmo quadrante possuem maior influência na

formação do aroma desse grupo no dia 1. Ao mesmo tempo, os compostos voláteis (K,

23

M, N, O) detectados no quarto quadrante do gráfico apresentam menor ou escassa

influência na formação do aroma desse mesmo grupo. Além disso, ressalta-se que

quanto maior o vetor, maior ainda essa influência.

Para verificar a influência dos tratamentos na produção de compostos voláteis,

observa-se a distribuição das variáveis nos gráficos de cada um dos cinco dias. Na

Figura 3a, correspondente ao primeiro dia após tratamento, nota-se que propionato de

3-hexen-1-ila (D), linalool (F) e 2-hexanal (I) são os principais metabólitos que

compreendem a diferenciação do grupo tratado com AIA, enquanto formiato de linalool

(K), 4-hexen-1-ol (M), acetato de 3-hexen-1-ila (N) e 1-hexen-3-ol (O) são os

metabólitos que melhor caracterizam o grupo etileno.

Na Figura 3b, equivalente ao segundo dia, os principais metabólitos encontrados

no tratamento com AIA foram: ciclohexanol (A) e acetato de 3-hexen-1-ila (N), enquanto

no tratamento com etileno foram: acetato de hexila (B) e propionato de 2-hexen-1-ila

(C). Já na Figura 3c, do terceiro dia, temos para o grupo AIA a influência de: 3-

pentanona (G), tolueno (H) e heptanoato de metila (J), enquanto para o grupo etileno:

linalool (F) e acetato de 2-hexen-1-ila (R). No quarto dia (Figura 3d), os compostos mais

influentes no tratamento com AIA foram: ciclohexanol (A), 2-hexenal (I) e acetato de 2-

hexen-1-ila (R), enquanto no tratamento com etileno foram: heptanoato de metila (J),

butirato de metila (Q) e propionato de isobutila (S). Por fim, no quinto e último dia

(Figura 3e), houve grande influência dos compostos propanoato de trans-hex-2-enila

(C), (Z) óxido-linalool furanoid (L) e butanoato de metila (Q) no tratamento com AIA e no

tratamento com etileno não se pode afirmar, visto que as triplicatas biológicas se

encontram em quadrantes diferentes e houve grande variação em relação a CP2 ou F2.

5. DISCUSSÃO

Mesmo que a diferenciação entre frutos climatéricos e não-climatéricos foi

estabelecida há anos, a ciência pós colheita ainda contém pouco conhecimento sobre

os frutos não-climatéricos. O papel de hormônios vegetais nessa classe está sendo

estudada pouco a pouco, a fim de agregar mais conteúdo sobre o processo de

amadurecimento das espécies envolvidas (CHERIAN et al., 2014).

24

Explicitamente, foi demonstrado que as auxinas estimulam a expansão do

receptáculo durante o desenvolvimento do morango e, posteriormente, inibem o

amadurecimento do fruto (GIVEN et al., 1988). À auxina, também vincula-se o papel de

repressor do amadurecimeto, a partir da descoberta de que a aplicação exógena da

auxina diminui a expressão de diversos genes modificadores da parede celular

(FIGUEROA et al., 2009; VILLARREAL et al., 2009).

Ao contrário das auxinas, pouco se sabe sobre o papel do etileno em frutos não-

climatéricos. Apesar de produzirem concentrações baixas desse hormônio, um padrão

característico de produção de etileno foi relatado em diferentes estágios de

amadurecimento de morangos, contendo uma produção elevada em frutos verdes,

diminuida em frutos brancos e novamente elevada em frutos vermelhos (maduros)

(PERKINS-VEAZIE et al., 1996; IANNETTA et al., 2006). Ainda, alguns genes foram

relacionados a sua produção e foram estudados em morangueiros: genes ACO

(FaACO1 e FaACO2), genes ETR do tipo I (FaEtr1 e FaErs1) e tipo II (FaEtr2)

(TRAINOTTI, et al., 2005). Diferentemente dos estudos acima, uma parcela dos poucos

estudos encontrados na literatura sobre o tema buscam justificar ou relacionar a ação

de etileno em frutos não-climatéricos de modo semelhante aos frutos climatéricos. Uma

das descobertas mais recentes sustenta a ideia de que ambas as classes

possivelmente compartilham uma via regulatória comum modulada pelo etileno

(MERCHANTE et al., 2013).

Assim, com base nos resultados, podemos comprovar que, visualmente,

somente o efeito do AIA sobre os frutos é percebido (Figura 1). Há um aparente retardo

no processo de transição entre fruto branco e fruto vermelho nos frutos tratados com

AIA, ou seja, há maior tempo para se atingir o ponto maduro (coloração vermelha) do

fruto. Tal fato também é evidenciado na Tabela 1, uma vez que os valores para Ângulo

Hue (ºH) do tratamento com AIA, em sua maioria, são maiores que os demais,

indicando que a coloração dos frutos é mais distante da coloração vermelha. O

amadurecimento retardado também foi observado por Purgatto et al. ao analisar fatias

de bananas infiltradas com auxina. Por outro lado, ao contrário do grupo AIA,

observando somente a tabela não se pode concluir o efeito do etileno nos frutos, já que

25

os valores encontrados para os parâmetros são próximos aos valores do grupo

controle.

Discorrendo sobre a análise de compostos voláteis, o estudo estatístico para

construção dos gráficos da PCA (Figura 3) foi fundamental para relacionar as

substâncias mais influentes com o tratamento empregado. O retardo no processo de

amadurecimento exercido com a asperção da auxina, além de ser notável na análise de

cor, também pode ser explicado pela emissão de substâncias voláteis formadoras do

aroma.

Ao decorrer dos cinco dias pós-tratamento, percebe-se que há um predomínio na

emissão de compostos C6 no primeiro e no segundo dia (Figuras 3a e 3b) dos frutos do

grupo AIA, implicando na maior atuação de aromas com notas verdes, os quais são

importantes para a caracterização do fruto imaturo. A formação de metabólitos C6

derivados das funções orgânicas aldeído e álcool podem ser melhor caraxterizadas em

cada dia, avaliando as alterações na expressão das enzimas conversoras hidroperóxido

liase (HPL) e álcool desidrogenase (ADH), respectivamente. Assim como o grupo AIA,

percebe-se um comportamento distinto dos frutos do grupo etileno, evidenciado pela

diferente localização em relação ao grupo controle no plano xy dos gráficos da PCA. No

terceiro e no quarto dia (Figuras 3c e 3d), o grupo etileno expressou maiores

concentrações de substâncias derivadas de isoprenoides e ácidos graxos, que podem

estar relacionadas com a resposta ao amadurecimento de modo distinto.

Não foi observado um efeito pronunciado dos tratamentos hormonais sobre os

níveis de etileno e os níveis respiratórios, quando os perfis são comparados aos do

grupo controle. Os resultados estão em acordo com a literatura (KLUGE et al. 2002) e

sugerem que ambos hormônios não influem nestes parâmetros do amadurecimento, o

que pode ser considerado interessante do ponto de vista do uso de ambos os

hormônios para a modulação de outros parâmetros do amadurecimento.

Assim, os resultados mostram claramente que tanto o AIA quanto etileno são

capazes de modular a síntese de compostos voláteis no morango. Como citado

anteriormente, há pouca informação a respeito do papel do etileno no amadurecimento

de frutos não-climatéricos como o morango, tanto que, por muito tempo, este hormônio

26

foi até mesmo reconhecido como pouco relevante para o amadurecimento de frutos

não-climatéricos (KLEE 2002).

6. CONCLUSÃO

As análises realizadas permitem concluir que ambos os hormônios estudados

(AIA e etileno) contribuem para o processo de amadurecimento do morango, seja

influenciando na síntese de compostos voláteis ou na alteração da coloração dos frutos.

Diferentemente do AIA, o etileno não possui um papel muito bem elucidado, porém os

resultados obtidos indicam que o etileno exerce influência na formação do aroma no

morango. Os compostos que foram mais afetados foram os ésteres, particularmente os

derivados da via de lipoxigenase (C6 voláteis). Compostos importantes como o acetato

de hexila, descrito como um composto de impacto no aroma do morango, foram

bastante afetados por ambos os tratamentos.

A fim de complementar e aprofundar o tema do processo de amadurecimento de

frutos não-climatéricos, estudos sobre os níveis de expressão gênica de enzimas

ligadas a formação de compostos voláteis podem auxiliar em uma melhor especificação

dos resultados, assim como estudos que empregam outras ferramentas de alto

rendimento (proteômica, transcriptômica e metabolômica, por exemplo).

27

7. BIBLIOGRAFIA

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