UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO … · mim. Nunca vou me esquecer de nós...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS

THALITA VERÔNICA CALHEIROS ROLIM

SÍNTESE E FUNCIONALIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS COM

OLIGONUCLEOTÍDEO PARA APLICAÇÃO EM GENOSSENSORES

NO DIAGNÓSTICO AVANÇADO DE PREDISPOSIÇÃO À

HIPERTENSÃO ARTERIAL

São Carlos

2013

THALITA VERÔNICA CALHEIROS ROLIM

SÍNTESE E FUNCIONALIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS COM

OLIGONUCLEOTÍDEO PARA APLICAÇÃO EM GENOSSENSORES NO

DIAGNÓSTICO AVANÇADO DE PREDISPOSIÇÃO À HIPERTENSÃO

ARTERIAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Física do Instituto de Física de

São Carlos da Universidade de São Paulo, para

obtenção do título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Física Aplicada

Opção: Física Biomolecular

Orientador: Prof. Dr. Valtencir Zucolotto

Versão Corrigida

(Versão original disponível na Unidade que aloja o Programa)

São Carlos

2013

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço de Biblioteca e Informação do IFSC,

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

A Deus, pelo amor incondicional

e presença constante na minha vida.

AGRADECIMENTOS

Por ser a minha força e a minha coragem nos momentos difíceis, minha alegria e a minha

felicidade nos momentos maravilhosos, por ser Tudo e Todo na minha vida, Agradeço a

Deus!

Ao Profº Dr. Valtencir Zucolotto minha mais sincera gratidão pela grande oportunidade e

confiança, pela agradável convivência e pelo seu lado humano. Xuxa, Muito Obrigada!

Aos meus Pais, Vera e Walter, e ao meu Irmão, Michel, que são a base da minha formação

pessoal, pelo exemplo incontestável de dignidade e simplicidade, pelo apoio, pela paciência e,

principalmente, pelo amor, que fundamentalmente fazem da minha vida especial. Orgulho de

vocês. Obrigada Família Querida!

Á minha querida Vó, Dalva, pelo amor, pela amizade, pela verdade e pela vida. Obrigada por

tudo Vó, uma vida toda seria pouco para te agradecer, para te amar e para te ter. Além do

amor!

Ao meu Vô, Milton, que junto ao Pai está “olhando por mim”, pelo exemplo singular de

simplicidade e doçura, obrigada Vô!

Á toda minha família, Obrigada!

Ao Bruno, por todos os momentos ao seu lado, pelo apoio, pela paciência, pelo nosso

relacionamento, que me transforma em uma pessoa melhor a cada dia. Pela esperança, pelos

sonhos, pelo sorriso que sempre me espera, pelo brilho que me ilumina, pela bondade, pela

amizade e pelo amor. Sua existência na minha vida é um verdadeiro presente de Deus. Espero

que esse seja só mais um dos tantos momentos ao seu lado. Meu amor, muito obrigada! Eu

Amo Você.

Á Fapesp pela bolsa de mestrado outorgada e todo apoio financeiro necessário para a

realização deste trabalho.

Ao CNPq e a Capes pelo apoio financeiro.

Ao Instituto de Física de São Carlos e a Universidade de São Paulo pelo apoio, estrutura,

corpo de docente e funcionários, que juntos foram essenciais para a realização deste trabalho.

Aos docentes e funcionários do Grupo de Biofísica Molecular "Sérgio Mascarenhas", em

especial, as técnicas Bel e Andressa, e as secretárias Ester e Julielle, que além de nos auxiliar

muito, mantém o ambiente de trabalho sempre organizado e agradável.

Ao Profº Dr. Francisco Eduardo Contijo Guimarães pela ajuda na realização das imagens de

Microscopia Confocal de Fluorescência, pela humildade e simplicidade!

Ao Centro Universitário Hermínio Ometto pela base profissional, estrutura, apoio, corpo de

docentes e funcionários. Em especial, as Professoras Maria Esméria e Camila. Não tenho

palavras para agradecer todo apoio e toda confiança depositada em mim durante todos esses

anos. Obrigada por tudo!

Á Lari e a Vê, os meus pontinhos fora da reta mais queridos (risos), por todos os momentos

de descontração, de alegria, de esperança e por toda amizade incontestável. Obrigada

meninas!

Á Ju pela sincera amizade, pelas conversas e conselhos diários, pelos incontáveis desabafos

(risos), pela confiança, pelos experimentos e pelos nossos happy hour, Obrigada Ju!

Á Valerinha pela extrema humildade e doçura, pela amizade e confiança, pela colaboração

nas imagens de Microscopia Eletrônica de Transmissão e pela grande ajuda no laboratório.

Obrigada Val!!

Ás minhas anjinhas Vivis, Lets e Blubis. Não tenho palavras para descrever a presença e

amizade de vocês na minha vida! Vivis, presente em todas as fases acadêmicas (risos),

primeiramente, obrigada pela eterna amizade durante o cursinho, nos tempos da faculdade, e

pela ajuda e abrigo no meu início em São Carlos, todos os momentos foram especiais para

mim. Nunca vou me esquecer de nós naquela festa matine do Biju, lembra?! (risos) sem

comentários, nem da gente procurando naquele mapa gigante as cidades de Araras e São

Carlos, lembra? Quem diria que a gente estaria um dia na mesma cidade, na mesma casa...

Lets, um verdadeiro presente de Deus na minha vida, obrigada pelas sábias palavras, e por

fazer Deus tão presente e tão emocionante em nossas vidas! Blubis, ah Blubis, dindinha, que

alegria, que gordices (risos), que beleza, obrigada pela paz e felicidade que a sua amizade me

traz. Obrigada anjinhas! Feliz por ter vocês na minha história.

Aos amigos de Arujá, á Suelen que desde o colégio me faz ver que a vida pode ser alegre na

dificuldade, forte nas desilusões e sustentável com as amizades. Á Cintia, pela alegria e força,

pelas palavras e pelo carinho. Á Carol, que desde “pequenininha” me inspira e me motiva

sempre. Ao Jacques pela amizade. “Verdadeiras amizades continuam a crescer mesmo a

longas distâncias, e o que importa não é o que você tem na vida, mas que você tem na vida”.

Obrigada meus amigos!

Aos amigos do LNN e do Grupo de Biofísica: Fabrício, Edson, Nirton, Camilo, Wagner,

Felipe, Bruno, Rodrigo, Charles, Luís, Leandro, Débora, Sumária, Lilian, Karina, Laís,

Denise, Iêda, Letícia, Patrícia, Monique. Obrigada por compartilharem comigo suas

conquistas e tristezas, seus sonhos e realizações.

A todos que passaram pela minha vida, mas deixaram um pouco de si e levaram um pouco de

mim. E a todos que contribuíram direta e indiretamente para a realização deste trabalho.

Muito Obrigada! Que Deus abençoe todos!

“E a doçura é tanta...

Que faz insuportável cócega na alma.

Viver é mágico,

E inteiramente inexplicável.”

Clarice Lispector

RESUMO

ROLIM, T. V. C. Síntese e funcionalização de nanopartículas com oligonucleotídeo para

aplicação em genossensores no diagnóstico avançado de predisposição à hipertensão

arterial. 2013. 129 p. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Instituto de Física de São Carlos,

Universidade de São Paulo, São Carlos, 2013.

A crescente prevalência de hipertensão arterial na população mundial e os riscos por ela

apresentados nas doenças coronarianas eleva a importância de seu controle. Sendo sua causa,

frequentemente multifatorial, o tratamento da patologia é dificultado. Fatores ambientais

associados à predisposição genética levam o indivíduo a apresentar índices pressóricos

elevados de pressão arterial quando comparados a indivíduos que não apresentam tal

predisposição. Identificar a predisposição genética seria ideal para amenizar ou, até mesmo,

evitar o desenvolvimento da patologia. As nanopartículas estão cada vez mais associadas com

biomoléculas, uma vez que suas propriedades associadas às questões médicas podem criar

novos métodos potencialmente eficientes, tanto no diagnóstico como na terapêutica. O

presente trabalho teve como objetivo a conjugação de nanopartículas de ouro, estabilizadas

com dendrímero poli(amidoamina) de geração 4, com oligonucleotídeo para obtenção de

genossensores capazes de detectar o polimorfismo de inserção e deleção do gene da enzima

conversora de angiotensina I, o qual está intimamente relacionado com a predisposição à

hipertensão arterial sistêmica. As nanopartículas foram caracterizadas por Microscopia

Eletrônica de Transmissão (TEM), potencial zeta e Espectroscopia no Ultravioleta-Visível

(UV-VIS). A formação do conjugado entre a nanopartícula e o oligonucleotídeo foi

confirmada por UV-VIS, Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e Espectroscopia no

Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR). Foram construídos três sistemas de

detecção diferentes, nos quais as técnicas empregadas foram Espectroscopia de Impedância

Elétrica, Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e Transistor de Efeito de Campo de

Porta Estendida e Separada (SEGFET). O polimorfismo foi detectado em concentrações da

ordem de 1 nM. Com destaque para aqueles em que o emprego do conjugado amplificou o

sinal pelas propriedades das nanopartículas de ouro. Os genossensores propostos são

promissores e futuramente poderão contribuir com a medicina preventiva.

Palavras-chave: Hipertensão Arterial. Polimorfismo I/D. Nanopartículas. Nanoconjugado.

Genossensores.

ABSTRACT

ROLIM, T. V. C. Synthesis and functionalization of nanoparticles with oligonucleotide

for application in genosensors as advanced diagnostic tools for arterial hypertension.

2013. 129 p. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Instituto de Física de São Carlos,

Universidade de São Paulo, São Carlos, 2013.

The increasing prevalence of hypertension in the world population and the risks presented by

it in coronary heart disease reveals the importance of their control. Due to its multifactorial

causes, the treatment of this disease is difficult. Environmental factors associated with genetic

predisposition lead the individual to present high indexes of blood pressure when compared to

individuals who do not have a predisposition. To identify the genetic predisposition would be

ideal to minimize or even to prevent the pathology development. Nanoparticles are

increasingly associated with biomolecules, their properties added with medical questions, can

create new methods potentially efficient, both in diagnosis and therapy. This study aims at

developing of poly(amidoamine) dendrimer-stabilized gold nanoparticles, conjugated with

oligonucleotides to obtain genosensors able to detect the polymorphism of insertion and

deletion of angiotensin I converting enzyme (ACE) gene, which is closely related with the

predisposition to systemic blood hypertension. The nanoparticles were characterized by

Transmission Electronic Microscopy (TEM), Zeta potential and Ultraviolet-Visible

Spectroscopy (UV-VIS). The formation of the conjugate formed by the nanoparticle and the

oligonucleotide was confirmed by UV-VIS, Dynamic Light Scattering (DLS) and Fourier

Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). Three different detection systems were built, in

which the following techniques were applied: Electrical Impedance Spectroscopy,

Electrochemical Impedance Spectroscopy and Separative Extended Gate Field Effect

Transitor (SEGFET). For all systems polymorphism – related sequences were detected at

concentrations down to nanomolar. The use of the conjugate amplified the signal of the

genosensor due to the nanoparticles. The proposed genosensors may contribute to

preventative medicine.

Keywords: Blood Hypertension. Polymorphism I/D. Nanoparticles. Nanoconjugate.

Genosensors.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Esquema de funcionamento de um biossensor. ................................................................................... 34

Figura 2 – Esquema de um sensor de DNA. Imobilização das sequências de DNA, onde um linker (spacer)

bifuncional é utilizado para ancorar o DNA na plataforma (a). Funcionamento de um sensor de DNA:

sequências imobilizadas → hibridização → captura do sinal (b). ....................................................................... 38

Figura 3 – Esquema da molécula de DNA em conformação de dupla hélice. Estruturada pelo grupo fosfato

ligado na pentose, ligação fosfodiéster, juntos representam o “esqueleto” molecular do DNA. A hibridização

com a sequência complementar ocorre pelas bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina ou guanina). As

purinas (adenina e guanina) hibridizam apenas com as pirimidinas (timina e citosina) e sempre de maneira a

manter a mesma distância entre as duas fitas na sequência toda. Assim, a guanina apenas se liga na citosina e a

timina apenas na adenina42

. .................................................................................................................................. 39

Figura 4 – Estratégia para detectar sequências complementares de DNA alvo em genossensores com formato de

hibridização tipo sanduíche. I) Ancoragem da sequência de captura; II) Imobilização da sequência alvo

complementar (1ª hibridização); III) Hibridização da sequência repórter, contendo um marcador na parte

superior, com a sequência alvo (2ª hibridização). ................................................................................................ 41


hibridização direta. I) Ancoragem da sequência de captura; II) Hibridização com a sequencia alvo

complementar e captura do sinal. ......................................................................................................................... 42

Figura 6 – Diagrama esquemático de um MOSFET (a) e de um ISFET (b)52

. ..................................................... 43

Figura 7 – Diagrama esquemático de um SEGFET. P, F e D representam, respectivamente, os eletrodos porta,

fonte e dreno, de um MOSFET comercial. ............................................................................................................ 44

Figura 8 – Esquema de funcionamento da homeostase de pressão arterial sistêmica, realizado pelo Sistema

Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA). Adaptado de Aria Rad – 200667

. ....................................................... 46

Figura 9 – Estrutura molecular do dendrímero poli(amidoamina) de geração 4 – PAMAM G478

. ..................... 55

Figura 10 – Imagem das soluções na etapa inicial e final da síntese das nanopartículas de ouro, a) o sistema

ainda na coloração amarela clara, permaneceu em agitação vigorosa constante em um agitador magnético e b)

após 2,5 horas de agitação constante e protegido da luz a suspensão das nanopartículas de ouro está concluída,

e apresenta uma coloração vermelha acastanhada, indicando a redução do ouro. ............................................. 56

Figura 11 – Estrutura química de um fosfodiester e um fosforotioato. A alteração entre eles é a troca de um

oxigênio (-O) do grupo fosfato por um enxofre (-S)80

. ........................................................................................... 58

Figura 12 – Imagem dos microeletrodos interdigitados recobertos com ouro utilizados como plataforma do

genossensor elétrico. ............................................................................................................................................. 59

Figura 13 – Esquema de plataformas com a molécula imobilizada pura e com SAMmix: (a) apenas sequências de

DNA modificadas com tiol imobilizadas em superfície de ouro e (b) SAMmix de sequências de DNA modificadas

com tiol e 6-hidroxi-1-hexanotiol imobilizadas em superfície de ouro.79

. ............................................................. 60

Figura 14 – Uma representação esquemática: a) eletrodo interdigitado utilizado em medidas de impedância

elétrica, uma plataforma de vidro é separada por dois condutores criando uma região de isolamento entre eles,

as moléculas podem se ancorar na região da plataforma ou nos condutores, quando o sinal é aplicado a

resistência da transferência de cargas pode aumentar ou diminuir dependendo da molécula imobilizada e b) um

típico diagrama de Nyquist representando a impedância complexa e os parâmetros relacionados, descritos

acima. Adaptado de Katz et al. – 2010101. .............................................................................................................. 69

Figura 15 – Imagem do sistema utilizado nas medidas AC. Onde aparecem o notebook usado para aquisição de

dados, o eppendorf® de medida e o impedanciômetro Solartron. ....................................................................... 71

Figura 16 – Representação esquemática do sistema de medida eletroquímico: onde um potenciostato é

associado a uma célula eletroquímica convencional de três eletrodos. ................................................................ 72

Figura 17 – Imagem do sistema utilizado na caracterização eletroquímica. Onde aparecem o computador usado

para aquisição de dados, a célula eletroquímica, o potenciostato PGSTAT40 Autolab utilizados nas detecções e

o eletrodo de ouro com a área delimitada utilizado na construção do genossensor. ............................................ 73

Figura 18 – a) Diagrama esquemático do dispositivo SEGFET utilizado no genossensor e b) O diagrama

eletrônico do mesmo. ............................................................................................................................................. 74

Figura 19 – a) Imagem de Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) das nanopartículas de ouro (AuNP-

PAMAM G4) e b) Histograma de tamanhos das AuNP-PAMAM G4. ................................................................... 75

Figura 20 – a) Espectro de absorbância das AuNP-PAMAM G4 em várias concentrações e b) Gráficos dos

valores de absorção máxima na banda de ressonância plasmonica de superfície (524 nm) em função das

concentrações, ajustadas linearmente. .................................................................................................................. 77

Figura 21 – Espectro de absorbância no UV-VIS das AuNP-PAMAM G4, do oligonucleotídeo e do conjugado

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. ................................................................................................................... 78

Figura 22 – Espectro de absorbância no UV-VIS da solução de síntese, do sobrenadante e do precipitado

ressuspendido (conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo). ....................................................................... 79

Figura 23 – Histogramas da distribuição de tamanhos obtidos por DLS para as amostras a) AuNP-PAMAM G4

e b) AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. As análises foram realizadas em água ultrapura, pH entre 6,8 e 7,0.

............................................................................................................................................................................... 80

Figura 24 – Espectros de FTIR das amostras AuNP-PAMAM G4, Oligonucleotídeo livre e AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo. ............................................................................................................................................ 82

Figura 25 – Espectros de fluorescência da PCR em tempo real. Unidades de fluorescência (RFU) em função do

número de ciclos de amplificação. Primer controle concentração de 0,3 µmol L-1

, variando a concentração de

DNA molde, linha cinza 0,15 µmol L-1

e linha azul 0,30 µmol L-1

. AuNP-PAMAM/Oligonucleotídeo, linha

vermelha 0,15 µmol L-1

DNA molde e 0,30 µmol L-1

de conjugado e linha rosa 0,30 µmol L-1

DNA molde e 0,60

µmol L-1

de conjugado. ......................................................................................................................................... 84

Figura 26 – a) Diagrama de Nyquist representando a impedância complexa de concentrações diferentes de

tampão TE e b) Diagrama de Nyquist com zoom na região de 0 a 4 KΩ cm2 da componente real da impedância.

As análises foram realizadas em tampão TE 0,05 mol L-1

pH = 7,4. .................................................................... 86

Figura 27 – a) Diagrama de Nyquist representando a impedância complexa das etapas de construção e

detecção do genossensor e b) Diagrama de Nyquist com zoom na região de 0 a 3,5 KΩ cm

2 da componente real

da impedância. As análises foram realizadas em tampão TE 0,05 mol L-1

pH = 7,4............................................ 86

Figura 28 – Etapas de detecção e construção do genossensor em modelo de hibridização sanduíche.

Imobilização por meio de SAMmix (sequência de captura + 2-ME), primeira hibridização com a sequência alvo e

segunda hibridização com o AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. ..................................................................... 87

Figura 29 – a) Diagrama de Nyquist representando a impedância complexa do ensaio sem a utilização dos

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo no genossensor e b) Diagrama de Nyquist representando a impedância

complexa das etapas de construção do genossensor e detecção do AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. As

análises foram realizadas em tampão PBS, pH = 7,4 contendo 5 mM [Fe(CN)6]3−/4−

. ........................................ 88

Figura 30 – Diagrama de Nyquist representando as impedâncias complexas para diferentes concentrações de

sequência alvo (1, 10, 20, 30 e 40 nmol L-1

) após a primeira hibridização nos eletrodos modificados com SAMmix

(DNA captura + 2-ME). A linha em vermelho representa a impedância dessa modificação. As análises foram

realizadas em tampão PBS, pH = 7,4 contendo 5 mM [Fe(CN)6]3−/4−

. ................................................................ 90


AuNP-PAMAM G4 presente nos AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo após hibridização com sequência alvo

ancorada (0,26 nmol L-1

) no eletrodo modificado com SAMmix (DNA + 2-ME). As análises foram realizadas em

tampão PBS, pH = 7,4 contendo 5 mM [Fe(CN)6]3−/4−

. ........................................................................................ 91

Figura 32 – Imagens de microcopia confocal de fluorescência das etapas de construção e detecção do

genossensor: a) Imobilização por meio de SAMmix (sequência de captura + 2-ME), b) Primeira hibridização

com a sequência alvo e c) Segunda hibridização com o AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. Posteriormente

cada etapa os eletrodos foram submetidos a um banho em uma solução 0,1µg mL-1

de brometo de etídio e

lavados em água ultrapura abundantemente. Escala em amarelo (5µm). ............................................................ 92

Figura 33 – Microscopia confocal de fluorescência em 3D. Todos os eletrodos de ouro foram submetidos ao

banho de brometo de etídio posterior a modificação com um SAMmix contendo sequências de captura e de 2-

mercaptoetanol (2-ME). a) imagem obtida após a primeira hibridização com sequência alvo e b) após a segunda

hibridização com o AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. ................................................................................... 93

Figura 34 – Curva de IDS tomada ao longo do tempo com sequência de captura (SAMmix) e depois de hibridizar

com a sequência alvo. ............................................................................................................................................ 94

Figura 35 – Curvas características IDS x VDS do dispositivo SEGFET tomada da sequência de captura e depois

da hibridização com a sequência alvo. .................................................................................................................. 95

Figura 36 – Curvas características IDS x VGS para um pequeno valor de VDS (VDS = 0,2 V) do dispositivo

SEGFET tomada da sequência de captura e depois da hibridização com a sequência alvo. O Inset com zoom na

região de 14 a 21 µA da corrente IDS..................................................................................................................... 96

Figura 37 – a) Curva de IDS tomada ao longo do tempo com a sequência de captura, sequência não

complementar e depois da hibridização com a sequência alvo, b) Curvas características IDS x VDS do dispositivo

SEGFET tomada da sequência de captura, sequência não complementar e depois da hibridização com a

sequência alvo e c) Curvas características IDS x VGS para um pequeno valor de VDS (VDS = 0,2 V) tomada da

sequência de captura, sequência não complementar e depois da hibridização com a sequência alvo. O Inset (c)

com zoom na região de 11 a 21 µA da corrente IDS. .............................................................................................. 98

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Classificação diagnóstica da hipertensão arterial (> 18 anos de idade). .......................................... 48

Tabela 2 – Sequências utilizadas na construção do genossensor com detecção elétrica. .................................... 53

Tabela 3 – Sequências utilizadas na construção do genossensor com detecção eletroquímica. .......................... 53

Tabela 4 – Sequências utilizadas na construção do genossensor com detecção SEGFET. .................................. 54

Tabela 5 – Descrição dos reagentes utilizados na Real-Time PCR...................................................................... 66

Tabela 6 – Potencial Zeta obtido para as amostras: AuNP-PAMAM G4, Oligonucleotídeo livre e AuNP-

PAMAM G4/Oligonucleotídeo, em água ultrapura pH = 7,0. .............................................................................. 81

Tabela 7 – Principais atribuições propostas para as bandas encontradas na análise por espectroscopia no

infravermelho (FTIR). ........................................................................................................................................... 83

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A Absorbância

ADH Hormônio antidiurético

Alelo D Alelo com deleção

AuNPs Nanopartículas de ouro

DD Alelo de Deleção/ Alelo de Deleção

DI Alelo de Deleção/Alelo de Inserção

DLS Espalhamento Dinâmico de Luz

DNA Ácido desoxirribose

Coeficiente de absortividade molar

ECA Enzima Conversora de Angiotensina I

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier

HAS Hipertensão Arterial Sistêmica

II Alelo de Inserção/ Alelo de Inserção

Caminho óptico

PAMAM G4 Dendrímero poli(amidoamina) Geração 4

PBS Tampão Fosfato Salino

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PCR em tempo real Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real

Potencial (ζ) Potencial Zeta

SEGFET Transistor de Efeito de Campo de Porta Estendida e Separada

SRAA Sistema Renina Angiotensina Aldosterona

TE Tris EDTA

TEM Microscopia Eletrônica de Transmissão

Tris Tris(hidroximetil)aminometano

UV-VIS Espectroscopia no Ultravioleta-Visível

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 29

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................... 31

2.1 Nanotecnologia e Nanociência .................................................................................................... 31

2.2 Nanomateriais e Nanomedicina .................................................................................................. 32

2.3 Biossensores ................................................................................................................................ 33

2.3.1 Sistemas de detecção – Trandutores .................................................................................... 35

2.3.1.1 Eletroquímicos .................................................................................................................. 35

2.3.1.1.1 Amperométricos ............................................................................................................. 35

2.3.1.1.2 Potenciométricos ............................................................................................................ 36

2.3.1.1.3 Condutimétricos ............................................................................................................. 36

2.3.1.2 Ópticos .............................................................................................................................. 36

2.3.1.3 Piezelétricos ...................................................................................................................... 37

2.3.1.4 Calorimétricos ................................................................................................................... 37

2.4 Genossensores ............................................................................................................................. 38

2.4.1 Hibridização em modelo sanduíche ..................................................................................... 40

2.4.2 Hibridização em modelo direto ............................................................................................ 41

2.5 Dispositivos de efeito de campo .................................................................................................. 42

2.6 Hipertensão Arterial Sistêmica .................................................................................................... 44

2.6.1 Sistema Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA) .............................................................. 45

2.6.2 Enzima conversora de angiotensina I – ECA ....................................................................... 46

2.6.3 Diagnóstico para hipertensão arterial sistêmica ................................................................. 47

3. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 51

3.1 Objetivo geral .............................................................................................................................. 51

3.2 Objetivos específicos................................................................................................................... 51

4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................... 53

4.1 Materiais ...................................................................................................................................... 53

4.2 Estudo do conjugado AuNP-PAMAM/Oligonucleotídeo ........................................................... 54

4.2.1 Síntese das nanopartículas de ouro estabilizadas em PAMAM-G4 ..................................... 54

4.2.2 Conjugação do oligonucleotídeo com as AuNP-PAMAM G4 .............................................. 56

4.3 Construção do genossensor em modelo sanduíche ..................................................................... 58

4.3.1 Imobilização do DNA na plataforma do genossensor elétrico ............................................ 59

4.3.2 Imobilização do DNA na plataforma do genossensor eletroquímico ................................... 60

4.4 Construção do genossensor para caracterização em Transistor de Efeito de Campo de Porta

Estendida e Separada (SEGFET) ....................................................................................................... 61

4.4.1 Imobilização do DNA na plataforma do genossensor para caracterização em SEGFET ..... 61

4.5 Técnicas de caracterização .......................................................................................................... 62

4.5.1 Espectroscopia no Ultravioleta-Visível (UV-VIS) ................................................................ 62

4.5.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) ................................................................................ 63

4.5.3 Potencial Zeta (ζ) ................................................................................................................. 64

4.5.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) .................................................................. 65

4.5.5 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real .............................................................. 65

4.5.6 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR) ............................................................................. 67

4.5.7 Microscopia Confocal de Fluorescência .............................................................................. 67

4. 5. 8 Espectroscopia de Impedância ........................................................................................... 68

4.5.8.1 Espectroscopia de Impedância Elétrica ............................................................................ 68

4.5.8.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica .................................................................. 71

4.5.9 Detecção em Transistor de Efeito de Campo de Porta Estendida e Separada (SEGFET) .. 73

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................................... 75

5.1 Síntese e caracterização das Nanopartículas de Ouro .................................................................. 75

5.2 Síntese e caracterização do conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo .......................... 77

5.2.1 Espectroscopia no Ultravioleta-Visível (UV-VIS) ................................................................ 77

5.2.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) ................................................................................ 80

5.2.3 Potencial Zeta ....................................................................................................................... 81

5.2.4 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR) ............................................................................. 81

5.2.5 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real .............................................................. 83

5.3 Desenvolvimento e caracterização do genossensor utilizando o AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo ......................................................................................................................... 85

5.3.1 Espectroscopia de Impedância Elétrica ............................................................................... 85

5.3.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica ..................................................................... 87

5.3.3 Microscopia Confocal de Fluorescência .............................................................................. 91

5.4 Desenvolvimento e caracterização do genossensor sem a utilização do AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo ......................................................................................................................... 94

5.4.1 Detecção em Transistor de Efeito de Campo de Porta Estendida e Separada (SEGFET) .. 94

6. CONCLUSÕES ............................................................................................................................ 99

7. PERSPECTIVAS ....................................................................................................................... 101

REFERÊNCIAS ................................................................................................................................ 103

APÊNDICES ...................................................................................................................................... 115

Apêndice A - Divulgação Científica e Tecnológica ........................................................................ 115

Apresentações do trabalho .......................................................................................................... 115

Resumos publicados em anais de congressos ............................................................................. 115

Apresentações Orais ................................................................................................................... 116

Artigos ......................................................................................................................................... 116

ANEXOS ............................................................................................................................................ 117

Anexo A - Mapa gênico .................................................................................................................. 117

29

1 INTRODUÇÃO

A nanotecnologia e nanociência têm despertado grande interesse devido aos avanços

que possibilitam à manipulação e caracterização dos materiais em escala nanométrica e, dessa

maneira, permitem o domínio de propriedades específicas dos materiais. Do ponto de vista da

medicina, em particular, a funcionalização de nanomateriais com biomoléculas tem sido

amplamente utilizada na terapêutica e no diagnóstico de muitas patologias1-2

. Destacando-se

as nanopartículas, os nanofios e os nanotubos, que são empregados no melhoramento e

otimização de biodispositivos convencionais. Esses nanomateriais aumentam a sensibilidade

de biossensores, a estabilidade, a relação sinal/ruído, reduzindo o tempo de resposta, entre

outros3-4

. Além disso, esses nanomateriais permitem um estudo em tempo real de interações

celulares e moleculares em biossensores eletroquímicos5-6

.

Um biossensor eletroquímico, de maneira geral, consiste de um eletrodo contendo uma

espécie de reconhecimento, que podem ser espécies biológicas (anticorpos, enzimas,

proteínas, receptores biológicos, DNA, entre outras), capazes de interagir com um meio

complexo e de forma seletiva e específica, reagirem com seus respectivos alvos. O transdutor

converte o sinal bioquímico em sinal de medida correspondente, de acordo com o princípio

físico-químico de transdução7. Uma subcategoria dos biossensores muito analisada

atualmente é o genossensor. Nos genossensores a espécie biológica imobilizada pode ser uma

sequência pequena de DNA sintético ou genômico8. O biorreconhecimento ocorre por meio

da hibridização com a sequência complementar no sentido antiparalelo (5’ → 3’ e 3’ → 5’). A

arquitetura desse biodispositivo pode ser baseada em hibridização direta ou hibridização em

modelo “sanduíche”, na qual o produto final são três sequências de DNA hibridizadas, e o

sinal de detecção é reportado de acordo com um marcador9.

A Hipertensão Arterial Sistêmica10

(HAS) é uma doença definida pela permanência de

níveis de pressão arterial sanguínea acima de valores arbitrariamente definidos como

normalidade. Em particular, representa sério problema de saúde pública, pela sua elevada

prevalência, de 15% a 20% na população adulta e mais de 50% nos idosos. Além disso, junto

com o tabagismo, diabetes e dislipidemia, constituem importante fator de risco para as

doenças cardiovasculares, responsáveis por cerca de 30% das mortes11

. O tratamento anti-

hipertensivo tem como principal objetivo reduzir a morbidade e mortalidade

cardiovasculares11

. No entanto, essa política de saúde tende a mudar com a aplicação da

30

medicina preventiva, reduzindo não só os gastos com os tratamentos dos hipertensos, como

também a prevalência dessa patologia na população. Saber se o individuo apresenta uma

predisposição genética, para desenvolver hipertensão arterial sistêmica, ajudaria a protegê-lo

de fatores ambientais que, associados aos genéticos, poderiam desencadear essa doença. A

enzima conversora de angiotensina I - ECA - é uma metalopeptidase zinco-dependente cuja

principal função é a homeostase da pressão arterial por meio da conversão da angiotensina I

em angiotensina II12

. O polimorfismo de inserção e deleção - I/D, do gene ECA está associado

a 47% da variabilidade fenotípica das concentrações da ECA sérica, sendo as concentrações

mais elevadas associadas à presença do alelo D13

. A concentração de ECA elevada que o alelo

D origina, leva a um quadro de predisposição à hipertensão arterial sistêmica. No entanto, os

mecanismos moleculares não são totalmente conhecidos. Um dos eventos responsáveis é a

constrição continua dos vasos sistêmicos e teciduais, que, a longo prazo, também favorece

com o quadro de hipertensão arterial sistêmica crônica.

Nesse trabalho, apresentamos o desenvolvimento e estudo de um genossensor

contendo nanopartículas de ouro estabilizadas com o dendrímero poli(amidoamina) geração 4,

PAMAM G4, e funcionalizadas com o oligonucleotídeo desenhado especificamente para o

polimorfismo I/D localizado no intron 16 do gene ECA. Os nanocompósitos foram

caracterizados e aplicados no genossensor arquitetado em modelo sanduíche. As detecções

foram realizadas pelas técnicas de espectroscopia de impedância elétrica e eletroquímica.

Paralelamente a esse trabalho, foi desenvolvido outro genossensor estruturado com

hibridização direta, no qual não foi aplicado o conjugado marcador, e nas etapas de detecção

foi utilizado um transistor de efeito de campo de porta estendida e separada – SEGFET.

31

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Nanotecnologia e Nanociência

As teorias iniciais da nanotecnologia e nanociência foram propostas em 1959, em uma

conferência na American Physical Society, no Instituto de Tecnologia da Califórnia, onde a

palestra intitulada “There’s plenty of room at the bottom” foi proferida pelo físico norte-

americano Richard Feynman. Feynman sugeriu que os átomos poderiam ser organizados e

rearranjados conforme a necessidade, desde que as leis da natureza não fossem violadas.

Assim, materiais com propriedades inteiramente novas poderiam ser criados, visto que,

apenas a escala de tamanho dos materiais já é capaz de alterar completamente suas

propriedades. No entanto, hoje sabemos que não menos importante que o tamanho, mas

também a forma, o arranjo, a orientação e as funcionalizações são de extrema importância na

obtenção de novos materiais na escala nanométrica com outras utilidades e aplicações. Ainda,

para que fosse possível a “visualização” de sua teoria, Feynman exemplificou dizendo que a

enciclopédia britânica, com 24 volumes, caberia inteiramente escrita na cabeça de um alfinete.

Pelo exposto, Richard Feynman propôs a construção de novos materiais e dispositivos átomo

a átomo, molécula a molécula.

Entretanto, a aceitação na comunidade científica e os avanços reais em nanotecnologia

só foram iniciados décadas depois, quando o microscópio de varredura por tunelamento

(STM, do inglês Scanning Tunneling Microscope) e o microscópio de força atômica (AFM,

do inglês Atomic Force Microscope) foram desenvolvidos14

. Com esses microscópios a

manipulação dos átomos e moléculas começou a ser possível. O primeiro nanomaterial, o

fulereno, foi descoberto por Richard Smalley14

e o primeiro artigo científico relacionado com

nanotecnologia foi publicado pelo autor Eric Drexler15

, pesquisador do Instituto de

Tecnologia de Massachusetts. Atualmente, existem vários equipamentos que possibilitam,

além da manipulação e visualização de nanomateriais, a fina caracterização e o estudo

detalhado das propriedades de superfície. A nanotecnologia e nanociência conquistaram

pesquisadores em todo o mundo e um espaço generoso na comunidade científica com

milhares de artigos científicos, patentes, projetos e bilhões em investimentos todos os anos.

32

2.2 Nanomateriais e Nanomedicina

A mais recente definição para nanomateriais, proposta pela Comissão Europeia,

abrange a normalização e padronização do termo e visa, em princípio, os riscos potenciais

para a saúde, a segurança e os ambientes relacionados com os nanomateriais, dessa maneira16:

“Por nanomaterial entende-se um material natural, incidental ou fabricado, que contém

partículas num estado desagregado ou na forma de um agregado ou de um aglomerado, e em cuja

distribuição número-tamanho 50 % ou mais das partículas têm uma ou mais dimensões externas

na gama de tamanhos compreendidos entre 1 nm e 100 nm”.

Com a mesma composição dos materiais em bulk e um tamanho extremamente

reduzido, esses nanomateriais diferem por apresentarem a razão superfície/volume muitas

ordens de grandeza maior, aumentando ou modificando dessa forma os efeitos que ocorrem

na superfície, em relação às estruturas na escala maior. Assim, apresentam características

como condutibilidade, reatividade e sensibilidade óptica, excepcionais, particulares à escala

nanométrica17-18

.

Quando conjugados a moléculas biológicas como proteínas e DNA, os nanomateriais,

em especial as nanopartículas, têm um grande potencial em medicina, em uma nova e

promissora área denominada de nanomedicina. A nanomedicina contempla a utilização e o

estudo de nanomateriais nas áreas da saúde, principalmente para diagnóstico e terapêutica,

com aplicações desde nanocompostos capazes de liberar drogas de forma controlada, drug

delivery, em células específicas, até cosméticos revitalizantes com nanopartículas, que tornam

o acesso a derme muito mais fácil, passando também por nanoconjugados fotossensíveis que

estão reescrevendo os diagnósticos por imagem ou tratamento de câncer19-20

. As

nanopartículas de ouro (AuNPs) e de óxido de ferro superparamagnéticas (Fe3O4) apresentam

uma ótima estabilidade, são de fácil preparo e funcionalização química, sendo assim as mais

estudas e utilizadas. Além disso, se encontram entre as mais promissoras para diagnosticar e

tratar o câncer, sendo o uso do ouro aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration)21

para algumas aplicações terapêuticas. Estas nanopartículas já são usadas para fins

diagnósticos, na detecção de imagens de tumores por tomografia22-23

. Por exemplo,

nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (Fe3O4) estão sendo utilizadas para

manipular a maquinaria celular de neurônios. Com o aquecimento local gerado pela aplicação

de um campo magnético nessas nanopartículas, os canais de íons localizados nas membranas

das células são capazes de aumentar seus potenciais elétricos, ativando desta forma funções

celulares essenciais20

.

33

As nanopartículas de ouro apresentam propriedades ópticas excepcionais. Quando

essas partículas são submetidas a luz, pode ocorrer acoplamento de forma ressonante, com os

elétrons livres do metal, e seus elétrons condutores produzem coletivamente uma oscilação.

Essas oscilações são denominadas de “plasma de superfície” e são dependentes do tamanho e

forma da nanopartícula, da constante dielétrica do meio, e da distância entre as partículas5,24

.

Além do uso destas nanopartículas para o diagnóstico e terapia do câncer, nanopartículas de

ouro, quando conjugadas com DNA, são utilizadas em dispositivos como marcadores ativos

na detecção de mutações e polimorfismos, caracterizando avançados diagnósticos moleculares

para muitas patologias com carga genética2. Além da manipulação e imobilização na forma de

filmes finos, que são essenciais para sua utilização em dispositivos biotecnológicos. Sendo

esses de extrema importância para aplicações em biomedicina.

Em oncologia, os nanobioconjugados possuem ampla aplicação em processos e

sistemas biotecnológicos para otimizar a procura de novos biomarcadores, diagnóstico

molecular, e melhorar a biodisponibilidade de medicamentos25

. A investigação dos

mecanismos de interação de nanopartículas com biomoléculas se tornou essencial para a

criação de novos nanobiocompostos que possam ser aplicados à problemática em saúde de

várias patologias, dentre elas, o câncer, doenças infecciosas, cardiovasculares, hipertensão

arterial, entre outras2,26-28

. Estas doenças afetam grande parte da população mundial e

brasileira, representando grandes gastos públicos no setor de saúde. Com os nanomateriais a

medicina poderá implantar sua base preventiva, e, dessa forma, além de aumentar a qualidade

e a expectativas de vida, diminuir os gastos no setor de saúde.

2.3 Biossensores

A International Union of Pure and Apllied Chemistry – IUPAC propôs uma definição

para biossensor32

:

“Um biossensor é um instrumento integrado que é capaz de fornecer uma informação analítica

específica quantitativa ou semi-quantitativa através do uso de um elemento de reconhecimento biológico

(receptor bioquímico) que esta em contato direto com o elemento transdutor.”

Os biossensores podem ser definidos como dispositivos analíticos que apresentam

espécies moleculares biológicas imobilizadas em um transdutor. Essas espécies moleculares

são denominadas de biorreceptores e utilizam um mecanismo bioquímico para

34

reconhecimento. O biorreconhecimento ocorre por meio de interações antígeno-anticorpo,

interações enzimáticas, molécula–alvo e seu receptor, ou aquelas entre ácidos nucleicos, como

é o caso de sequências complementares no sentido antiparalelo (5’ → 3’ e 3’ → 5’). O

funcionamento de um biossensor ocorre pela parte ativa do sensor, ou seja, pelo elemento de

reconhecimento biológico imobilizado e o transdutor, esquematizado na Figura 1. A interação

que ocorre entre o elemento imobilizado e o analito pode promover uma reação, entre outros

fatores, que causa uma variação na concentração de prótons, liberação de gases, emissão ou

absorção de luz, emissão de calor, variação de massa, mudança de estado de oxidação, entre

outras. Posteriormente a alteração no sistema, o transdutor converte a variação em uma

resposta mensurável podendo ser: corrente, potencial, variação de temperatura, entre outras29

.

Figura 1 – Esquema de funcionamento de um biossensor.

Os bissensores podem ser classificados de acordo com o elemento molecular

imobilizado como: enzimáticos, microbiológicos, imunossensores, genossensores, entre

outros. Outra forma de classificação dos biossensores é representada pelo sistema de

transdução utilizado. Desta forma, os biossensores podem ser classificados em:

eletroquímicos (amperométricos, potenciométricos e condutimétricos), ópticos, piezelétricos

ou calorimétricos30

.

35

2.3.1 Sistemas de detecção – Trandutores

2.3.1.1 Eletroquímicos

Os transdutores eletroquímicos são baseados no movimento de íons e na difusão de

espécies eletroativas31

. Os biossensores que utilizam esses transdutores são mais utilizados,

quando comparados aos biossensores ópticos e calorimétricos, pois são estáveis, apresentam

screening rápido, alta sensibilidade, possuem a grande vantagem de serem econômicos e a

possibilidade de automação, permitindo sua aplicação em um grande número de amostras30,32

.

São utilizados também em análises clínicas e testes de monitoramento33-35

. No entanto, é

necessário cautela para a utilização, pois são sensíveis a alterações de temperatura, força

iônica e pH. Além disso, são vulneráveis a ruído elétrico, necessitam de eletrodos de

referência estáveis, podem apresentar adsorção de forma não seletiva e bloqueio da superfície

do sensor. Eles podem ser classificados de acordo com os parâmetros aplicados, sendo:

amperométricos, potenciométricos ou condutimétrico33-34

.

2.3.1.1.1 Amperométricos

O princípio de funcionamento de um transdutor amperométrico é baseado na medida

da corrente produzida por uma reação química entre espécies eletroativas, susceptíveis a

oxidação ou redução no eletrodo. Esse eletrodo é colocado em um potencial fixo em relação a

um eletrodo de referência. Assim, mede-se a transferência de elétrons do analito para o

eletrodo ou do eletrodo para o analito. A medida ocorre de acordo com a corrente elétrica

resultante das variações de oxidação ou redução eletroquímica por meio da espécie eletroativa

presente na solução. A direção do fluxo de elétrons é dependente das características do

analito.36-37

. É possível estimar a concentração do analito e do produto por meio da corrente

produzida pela reação redox, visto que, elas são linearmente proporcionais.

36

2.3.1.1.2 Potenciométricos

Os transdutores potenciométricos são baseados na determinação da diferença de

potencial entre o eletrodo e um eletrodo de referência. Normalmente são utilizados eletrodos

de gases ou eletrodos íons seletivos. Ainda existem sistemas com dois eletrodos de referência

separados por uma membrana permeável seletiva, em que não há fluxo de corrente

significativa entre eles. Os eletrodos ficam em contato direto com a amostra e a diferença de

potencial acontece por um aumento das cargas na superfície do eletrólito. Os eletrodos de íons

seletivos são capazes de detectar tais alterações e transformá-las em sinal mensurável37

.

2.3.1.1.3 Condutimétricos

Os transdutores condutimétricos são fundamentados nas medidas de alterações da

condutância. Biossensores que utilizam esses transdutores associam enzimas catalíticas que

durante as reações consomem ou produzem espécies iônicas, dessa forma, alteram a

condutividade da solução. É possível estimar a concentração iônica por meio da

condutividade, porém, não é possível saber qual o elemento iônico presente36,38

. O

funcionamento é baseado em um par de microeletrodos imersos em uma solução eletrolítica,

que contem uma enzima. Na presença do analito é aplicado um potencial nos microeletrodos,

e a análise é baseada nas variação da concentração de espécies polarizadas38

.

2.3.1.2 Ópticos

O princípio de funcionamento de um transdutor óptico é a interação entre espécies

biológicas imobilizadas ou reações químicas que promovam alteração nas propriedades

ópticas. Essas alterações em determinadas substâncias modificam a luz observada, ou a

resposta quando iluminada, e podem ser transmitidas por meio de fibras ópticas que

conduzem as ondas de luz a detectores apropriados em equipamentos ópticos37

. Os métodos

ópticos com transdução física são muito utilizados em análises bioquímicas por serem

37

bastante confiáveis e variados, tais como, absorção, fluorescência, fosforescência, polarização

e interferência. Além disso, podem ser utilizados em sensores de estados sólidos, associados a

uma espécie biológica imobilizada, com um indicador ou não37

.

2.3.1.3 Piezelétricos

Os transdutores piezelétricos são fundamentados nas análises de alterações de massa

ou microviscosidade, de onda de cisalhamento, ou de superfície acústica31,37

. Na superfície do

biossensor é imobilizada uma molécula biologicamente ativa e, posteriormente, aplicada em

uma solução contendo o alvo, que interage com a molécula imobilizada aumentando a massa

do cristal e diminuindo proporcionalmente a frequência de ressonância das oscilações 33-34

. Os

cristais de quartzo são muito sensíveis às variações de massa e sua frequência de trabalho é na

faixa megahertz. Dessa maneira, são muito usados em sistemas de transdução piezelétricos. O

sensor denominado microbalança de cristal de quartzo (QCM, do inglês Quartz Crystal

Microbalance) exibe alta sensibilidade e detecta todas as alterações de nanogramas que

podem ocorrer, quando o alvo interage com a molécula no transdutor39

.

2.3.1.4 Calorimétricos

Os transdutores calorimétricos também podem ser chamados de termistores37

, e são

fundamentados na variação de entalpia do sistema. É possível detectar substâncias baseadas

apenas no calor envolvido nas reações químicas do analito com a sua substância biológica

ativa. As substâncias são imobilizadas diretamente no sensor, que detecta o calor envolvido na

reação química, sendo possível quantificar o substrato consumido ou o produto formado pela

reação38

. No entanto, parte do calor é trocado com o ambiente, na reação de mistura e no

efeito de solvatação, assim, inevitavelmente, erros de análise podem ocorrer diminuindo a

sensibilidade dos biossensores calorimétricos33-34

.

38

2.4 Genossensores

Os genossensores são dispositivos analíticos avançados, que exibem a promessa de

diagnósticos com elevada especificidade e sensibilidade, são de baixo custo e podem ser

utilizados para a detecção precoce de muitas patologias genéticas40

. De maneira geral, são

sensores de DNA e podem ser arquitetados para detectar qualquer sequência de DNA. Um

sensor de DNA apresenta uma ou mais sequências pequenas de DNA, entre 20 a 40 pares de

bases, imobilizadas em uma plataforma apropriada. A imobilização das sequências de DNA

na plataforma pode ser realizada promovendo uma modificação específica em uma das

extremidades da sequência (5’ ou 3’), ou com a ligação de um linker bifuncional, que se liga

na plataforma e na extremidade da sequência do DNA, que apresenta a modificação,

simultaneamente41

. O biorreconhecimento acontece pela hibridização com o DNA alvo

(complementar) nas etapas de detecção. O sinal detectado pode ser elétrico, fluorescente,

eletroquímico, calorimétrico, entre outros, (Figura 2).

Figura 2 – Esquema de um sensor de DNA. Imobilização das sequências de DNA, onde um linker (spacer)

bifuncional é utilizado para ancorar o DNA na plataforma (a). Funcionamento de um sensor de DNA:

sequências imobilizadas → hibridização → captura do sinal (b).

O ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid) é um

biopolímero composto por monômeros, nucleotídeos, formados por um grupo fosfato, uma

39

pentose (desoxirribose) unidos por ligações fosfodiéster e associados a uma das quarto bases

nitrogenadas (adenina, timina, citosina ou guanina). Em sequência, representam em formato

de código, a informação genética (Figura 3)42

. Essa informação pode conter mutações ou

polimorfismos genéticos. As mutações são erros permanentes na sequência de DNA, que

quando codificada expressa alguma proteína não funcional, ou com função alterada, ou ainda,

não expressa nenhuma proteína. Os polimorfismos são a ocorrência simultânea em uma

mesma população, de formas diferentes de um mesmo gene, ou sequência não codificadora de

DNA, e estão presentes em mais de 1% na população127

.

Figura 3 – Esquema da molécula de DNA em conformação de dupla hélice. Estruturada pelo grupo fosfato

ligado na pentose, ligação fosfodiéster, juntos representam o “esqueleto” molecular do DNA. A

hibridização com a sequência complementar ocorre pelas bases nitrogenadas (adenina, timina,

citosina ou guanina). As purinas (adenina e guanina) hibridizam apenas com as pirimidinas (timina e

citosina) e sempre de maneira a manter a mesma distância entre as duas fitas na sequência toda.

Assim, a guanina apenas se liga na citosina e a timina apenas na adenina42

.

Alguns trabalhos recentes com genossensores têm reportado a detecção de uma única

base não complementar em pequenas sequências de DNA, como detalhado por Chatelain et

al.43

. Podemos citar também, a criação de um genossensor para detecção do patógeno

Aeromonas hydrophila com hibridização de DNA utilizando voltametria cíclica44

. Bonanni et

al. relatam a detecção de um polimorfismo do DNA relacionada com fibrose cística em

eletrodos de carbono modificado, utilizando um dispositivo eletroquímico45

. Em um estudo

recente, Civit et al. mostraram a detecção simultânea de múltiplos vírus do papiloma humano

(HPV) com sequências de DNA. Este sensor apresentou alta eficiência na detecção46

. Ainda,

pesquisadores desenvolveram um genossensor utilizando hibridização direta para detectar

mutações do gene BRCA1 (do inglês, Breast Cancer 1) que estão relacionadas com o câncer

de mama, por ser um gene supressor de tumores que controla o ciclo celular e a proliferação

celular descontrolada47

. Ali et al., estudaram um genossensor baseado em espectroscopia de

40

impedância eletroquímica para leucemia linfocítica crônica, e utilizaram como plataforma

eletrodos de ouro modificados com nanopartículas de ouro. Esse nanossensor foi capaz de

diferenciar uma única base diferente na sequência, ou mismatch48

. So-Jung et al. reportaram

um sensor de DNA que utiliza recobrimento das nanopartículas de ouro por prata. Estes

nanoconjugados preenchem a distância entre as trilhas de ouro do eletrodo, alterando a

condutividade elétrica. Usando este método, os autores conseguiram detectar DNA alvo em

concentrações muito baixas como 500 fM com uma seletividade de mutação de ponto, com

um fator de, aproximadamente, 100.000:149

. Pesquisadores analizaram um teste baseado

também em sequências de DNA para detectar por meio de técnicas eletroquímicas sequências

do vírus que causa a Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS, do inglês Severe Acute

Respiratory Syndrome) que pode levar a óbito em poucos dias50

.

O conceito dos genossensores pode revolucionar os estudos genéticos e os

diagnósticos biomoleculares, tornando-os mais acessíveis, mais específicos, e com detecção

quase instantânea. Assim, apresentam um grande potencial na medicina preventiva e podem

ser utilizados em muitas patologias evitando a cronicidade e até mesmo o seu

desenvolvimento. Uma forma de classificação dos genossensores é o modelo de hibridização

utilizado na arquitetura do sensor. Dessa maneira geral, eles podem ser classificados em

modelo de sanduíche ou em modelo de hibridização direta.

2.4.1 Hibridização em modelo sanduíche

A hibridização é a ligação de dois fragmentos de DNA em condições específicas e

adequadas para cada sequência, e essas condições são baseadas na composição das bases

nitrogenadas que a sequência apresenta. As condições essenciais para que ocorra hibridização

específica são a complementaridade no sentido antiparalelo (5’ → 3’ e 3’ → 5’). Além disso,

os tipos de sais e as suas concentrações no tampão que será utilizado na reação também são

parâmetros para o sucesso no processo de hibridização. O modelo de hibridização sanduíche40

consiste em duas hibridizações consecutivas, na qual o produto final será a sequência

analisada de DNA proveniente da amostra, entre duas sondas de DNA, uma imobilizada na

plataforma (eletrodo), e a outra com um marcador na extremidade (5’ ou 3’) da sequência,

semelhante à estrutura de um sanduíche (Figura 4)9. O sinal de detecção deriva da segunda

41

hibridização, realizada ou não por temperatura específica, que pode provocar alguma

alteração no sistema e no marcador presente.


hibridização tipo sanduíche. I) Ancoragem da sequência de captura; II) Imobilização da sequência

alvo complementar (1ª hibridização); III) Hibridização da sequência repórter, contendo um marcador

na parte superior, com a sequência alvo (2ª hibridização).

2.4.2 Hibridização em modelo direto

O modelo de hibridização em formato direto, também empregado em genossensores, é

simples e como o próprio nome sugere, é direto, sem a presença de uma terceira sonda no

sistema, como ocorre no modelo em formato tipo sanduíche. No modelo de hibridização

direta uma sonda de DNA é imobilizada na plataforma e acontece apenas uma hibridização

direta com o DNA alvo, podendo esse apresentar um marcador ou não (Figura 5)8-9

. O sinal

de detecção deriva dessa única hibridização, que pode provocar alguma alteração no sistema,

ou no marcador, quando presente.

42


hibridização direta. I) Ancoragem da sequência de captura; II) Hibridização com a sequencia alvo

complementar e captura do sinal.

2.5 Dispositivos de efeito de campo

Como abordado anteriormente, em genossensores convencionais, sequências

espécíficas de DNA são imobilizadas em um suporte sólido, hibridizadas com o DNA alvo e o

sinal de detecção é originário de uma terceira sequência geralmente conjugada com um

marcador9. Entretanto, existe a possibilidade de detectar de forma direta o processo de

hibridização de sequências DNA (sem necessidade de uma terceira fita contendo

nanopartículas ou marcadores, utilizando, por exemplo, dispositivos de efeito de campo

(FEDs, do inglês Field-Effect Devices)51

.

Existem vários tipos de dispositivos FED para diversas aplicações, incluindo o

transistor de efeito de campo sensível a íons (ISFET)52

, o sensor capacitivo eletrólito-isolante-

semicondutor (EIS)53

, o sensor potenciométrico ativado por luz (LAPS)54

, o transistor de

efeito de campo de porta estendida (EGFET)55

ou de porta estendida e separada (SEGFET)56

.

Todos esses dispositivos operam modulando o sinal de saída (corrente ou tensão), devido a

uma alteração do campo elétrico na membrana sensível em virtude da alteração da

concentração iônica de uma solução51

.

O ISFET é o tipo mais comum de FED utilizado como sensor iônico, porque pode ser

miniaturizado e fabricado em larga escala. A Figura 6 mostra o diagrama esquemático de um

ISFET que na verdade é um MOSFET (transistor de efeito de campo metal-óxido

semicondutor) modificado. A diferença entre os dispositivos se refere à inexistência do

43

eletrodo metálico de porta no ISFET, sendo este substituído por um eletrodo de referência e

uma solução eletrolítica em contato com o óxido da região de porta (membrana sensível).

Figura 6 – Diagrama esquemático de um MOSFET (a) e de um ISFET (b)52

.

As aplicações no campo biomédico se dão pela imobilização de materiais de origem

biológica na porta de um ISFET. Os chamados ENFETs (FETs enzimáticos) utilizam uma

enzima imobilizada na porta do dispositivo, atuando portanto como biossensores57

. Por outro

lado, os imunoFETs são construídos por meio da imobilização de antígenos ou anticorpos na

porta de um ISFET58

, e a alteração de carga na porta devido a interação antígeno-anticorpo

permite a aplicação desse dispositivo no campo imunológico58

. Quando o material

imobilizado é uma sequência de DNA, o ISFET pode ser aplicado para a detecção da sonda de

DNA complementar51

. O princípio de detecção de DNA utilizando o ISFETs baseia-se no

aumento da densidade de carga quando a sonda de DNA imobilizado se hibridiza com o

respectivo DNA alvo, formando uma dupla fita51

.

Como pode ser observado na Figura 6, no ISFET, a parte transdutora está em contato

direto com a solução, o que pode comprometer a análise e dificultar o setup experimental.

Além disso, a imobilização de biomoléculas em um supote de dimensões pequenas pode ser

outro inconveniente. Portanto, neste trabalho, optamos por utilizar uma variação do ISFET,

nesse caso, o dispositivo é formado por uma membrana sensível ligada ao eletrodo de porta de

um MOSFET 55,59

comercial e recebe o nome de transistor de efeito de campo de porta

estendida e separada (SEGFET, do inglês separative extended gate field effect transitor)

(Figura 7). De forma análoga a um ISFET, uma alteração do potencial de superfície modula a

corrente dreno-fonte do MOSFET55,59

. Quando comparado ao ISFET, o processo de medida

de um SEGFET é mais simples, a imobilização de biomoléculas é facilitada e as etapas de

fabricação do dispositivo se restringe a simples manipulação da porta estendida. O MOSFET

44

comercial pode ser reaproveitado para novas aplicações e a parte sensível pode se utilizada de

forma descartável, o que é desejado em aplicações biomédicas.

Figura 7 – Diagrama esquemático de um SEGFET. P, F e D representam, respectivamente, os eletrodos porta,

fonte e dreno, de um MOSFET comercial.

2.6 Hipertensão Arterial Sistêmica

A Hipertensão Arterial Sistêmica10

(HAS) é uma doença definida pela persistência de

níveis de pressão arterial acima de valores arbitrariamente definidos como limites de

normalidade. Pelas atuais diretrizes, a HAS consiste em um fator independente de risco a

muitas outras patologias. Dessa forma, a HAS pode ser considerada como uma síndrome, pois

promove alterações hemodinâmicas, tróficas e metabólicas, envolvendo dislipidemias,

resistência insulínica, obesidade centrípeta, microalbuminúrica, atividade desregulada dos

fatores de coagulação, entre outras. A hipertensão está intimamente relacionada a diversas

doenças cardíacas, coronarianas, cerebrovasculares, renais e vasculares, o que aumenta muito

a sua morbimortalidade. Assim, há um aumento considerável nos custos humanos e médicos

decorrentes dessas consequências10

. A hipertensão arterial e as doenças relacionadas são

responsáveis por alta frequência de internações, sendo a insuficiência cardíaca a principal

causa de hospitalização entre as doenças cardiovasculares, sendo ainda responsável pelo

dobro de internações em relação ao acidente vascular cerebral12

.

Sendo a HAS uma doença poligênica e de causa multifatorial, constitui um grave

problema de saúde pública, afetando 30 milhões de indivíduos, somente no Brasil60

. Estudos

indicam que, em 2025, quase 30% da população mundial poderá apresentar essa doença61

. No

45

ano 2000, 15% das internações no sistema único de saúde (SUS), em indivíduos entre 30 e 69

anos, ocorreram por doenças cardiovasculares no Brasil, destes, aproximadamente 110 mil

casos foram relacionados ao acidente vascular cerebral e ao infarto agudo do miocárdio,

doenças em que a hipertensão arterial desempenha um papel agravante como fator de risco62

.

Em 2003, 27,4% de todos os óbitos ocorreram por doença cardiovascular e, excluindo-se as

mortes violentas e de origem não definida, este índice sobe para 37%. A HAS está envolvida

em 40% das mortes por doença cerebrovascular e em 25% das mortes por doença coronariana.

Em 2005, ocorreram mais de 1.180.000 internações por doenças cardiovasculares, com custo

global de mais de um bilhão e trezentos milhões de reais63

.

A importância da HAS como relevante fator de risco cardiovascular, alta prevalência

mundial e aumento da probabilidade de desfechos circulatórios, fatais ou não-fatais, quando a

ela estão associados outros fatores de risco, tornam muito importante o conhecimento da sua

possível ocorrência na população64

. Idade, etnia, consumo excessivo de sal, obesidade,

sedentarismo, estresse, resistência à insulina, ingestão aumentada de álcool, entre outros, são

alguns dos fatores relacionados ao aparecimento e à cronicidade da HAS10

.

2.6.1 Sistema Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA)

O Sistema Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA) é um sistema neuroendócrino

conjugado, responsável pela modulação do equilíbrio hidroeletrolítico e regulação da pressão

arterial sistêmica pelo seu processo de homeostase. Os eventos promovidos por meio desse

sistema resultam em um efeito protetor ao tecido endotelial, cardíaco, cerebral e renal65

.

Esse sistema funciona por meio de uma cascata de eventos os quais levam a um

equilíbrio hidroeletrolítico controlando a pressão arterial sistêmica (Figura 8). Quando o

individuo se encontra com uma hipotensão, a perfusão tecidual diminui, assim a perfusão dos

rins também é afetada, e, por meio de um feedback negativo, os rins liberam e começam a

sintetizar a renina, enzima que cliva o angiotensinogênio em angiotensina I. Nos pulmões e

nos rins, a angiotensina I é clivada em angiotensina II pela enzima conversora de angiotensina

I – ECA66

. A angiotensina II é um potente vasoconstritor, ela ativa a liberação de ADH,

hormônio antidiurético, pela hipófise, e de aldosterona, pelo córtex da adrenal. Dessa forma,

ocorre absorção e retenção de água pelos túbulos distais nos rins e simultaneamente

46

reabsorção de sódio e cloreto. A angiotensina II também aumenta a atividade simpática e

promove a vasoconstrição de arteríolas. Assim, com o aumento da volemia e a diminuição no

calibre dos vasos sanguíneos a perfusão tecidual aumenta e a pressão arterial sistêmica se

normaliza, inibindo os rins na liberação da renina.

Figura 8 – Esquema de funcionamento da homeostase de pressão arterial sistêmica, realizado pelo Sistema

Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA). Adaptado de Aria Rad – 200667

.

2.6.2 Enzima conversora de angiotensina I – ECA

A enzima conversora de angiotensina (ECA), descrita em 1956, é uma dipeptidil-

carboxilase que ativa um vasoconstritor potente quando converte angiotensina I (10

aminoácidos) em angiotensina II (8 aminoácidos)65

. Exerce ainda um efeito antivasodilatador

ao inativar o sistema das cininas (bradicinina, substância P)65, 68

. A ECA que está presente em

todo endotélio vascular sistêmico (60%), sendo mais abundante no endotélio vascular

pulmonar (40%), e também é classificada como uma metalopeptidase zinco-dependente, cuja

principal função é a conversão da angiotensina I em angiotensina II68

. O gene responsável

pela expressão da ECA está localizado no cromossomo 17, e o polimorfismo mais conhecido

e estudado desse gene foi descrito há duas décadas e consiste na presença (alelo I) ou ausência

(alelo D) de um fragmento Alu, de 287 pares de bases, próximo à extremidade 3’ do intron

16. Essa variação polimórfica expressa três genótipos: II, ID e DD. O polimorfismo I/D da

47

ECA está associado a 47% da variabilidade fenotípica das concentrações da ECA sérica,

sendo as concentrações mais elevadas associadas à presença do alelo D13

. A concentração de

ECA elevada que o alelo D origina, leva a um quadro de predisposição à hipertensão arterial

sistêmica. No entanto, os mecanismos moleculares não são totalmente conhecidos. Um dos

eventos responsáveis é a constrição continua dos vasos sistêmicos e teciduais, que, a longo

prazo, também favorece com o quadro de hipertensão arterial sistêmica crônica.

Os polimorfismos genéticos do sistema renina angiotensina são correlacionados com

doença renal em estado terminal69

. Em estudo realizado durante 7 anos, a hipertensão arterial

sistêmica e a hipertrofia ventricular esquerda foram analisadas em relação ao polimorfismo

I/D do gene da ECA e confirmada a associação entre essas patologias e o polimorfismo em

questão70

. Estudos in vivo indicam que o polimorfismo inserção/deleção da ECA também

modula o metabolismo humano da bradicinina (potente vasodilatador) 68

. O polimorfismo I/D

do gene ECA também está associado à sobrevida de pacientes com leucemia71

. Além disso,

um estudo recente realizado por CAM et. al associa o polimorfismo I/D do gene ECA e o

polimorfismo eNOS G894T com disfunção erétil72

. Alguns Kits para detectar polimorfismos

associados com hipertensão já foram descritos. Por exemplo, Jiang L. e Pan J., desenvolveram

um kit para a detecção de 4 polimorfismos diferentes relacionados com hipertensão arterial

para a triagem de mulheres grávidas, em risco de desenvolver hipertensão arterial. O kit

contém pares de primers específicos para a detecção de polimorfismos associados com

hipertensão arterial, dentre eles o polimorfismo de deleção e inserção do gene da ECA73

.

Outro Kit descrito por Feng Z. e Zou Z. associam a detecção de 3 polimorfismos localizados

no gene ECA, AGTR1 e NOS3 em um teste de PCR com sondas fluorescentes para detectar a

suscetibilidade a hipertensão74

.

2.6.3 Diagnóstico para hipertensão arterial sistêmica

O diagnóstico da hipertensão arterial sistêmica é clínico, estabelecido pela frequência

de níveis tensionais permanentemente elevados acima dos limites considerados para a

normalidade, quando a pressão arterial é determinada por meio de métodos e condições

apropriados. Dessa maneira, a medida da pressão arterial é o elemento-chave para o

estabelecimento do diagnóstico de hipertensão arterial sistêmica75

. Os métodos para a

avaliação são: medida indireta, medida domiciliar, automedida e medida ambulatorial. O

48

diagnóstico clínico laboratorial só é realizado e indicado para investigação da etiologia da

hipertensão arterial, identificação dos fatores de risco para doenças cardiovasculares, e

avaliação de lesões em órgãos-alvo. Além disso, o diagnóstico clínico laboratorial engloba a

história clínica da patologia, exames físicos e exames laboratoriais como eletrocardiograma e

colesterol total75

. No entanto, nenhuma triagem biomolecular genética é realizada antes do

indivíduo apresentar índices fora dos padrões para normalidade permanentemente.

A necessidade de sistematização obriga uma definição operacional para separar

indivíduos sadios dos doentes. Contudo, na realidade, podemos ter maior ou menor risco

cardiovascular, tanto acima, como abaixo do número limítrofe, quando o paciente é

considerado individualmente, já que a hipertensão arterial sistêmica não é um fator único e

exclusivo para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Além disso, os números são

arbitrários e qualquer classificação é insuficiente. Assim, enfatiza-se a necessidade de extrema

prudência antes de classificar um indivíduo como hipertenso, tanto pelo risco de falso-

positivo como pela repercussão na própria saúde do indivíduo e o custo social resultante. Os

limites normais para indivíduos adultos (com mais de 18 anos de idade) são inferiores a 85

mmHg de pressão diastólica, e inferiores a 130 mmHg de pressão sistólica (Tabela 1).

Indivíduos com valores tensionais 130-139 mmHg/85-89 mmHg são classificados em normal

limítrofe e ainda podem se beneficiar com as medidas preventivas75

.

Tabela 1 – Classificação diagnóstica da hipertensão arterial (> 18 anos de idade).

O tratamento da hipertensão arterial pode ser medicamentoso ou não medicamentoso, com

medidas preventivas. No entanto, mesmo a prevenção de hipertensão arterial envolve,

fundamentalmente, ensinamentos para que se ocorram mudanças dos hábitos de vida, tanto no

que se refere ao tratamento não medicamentoso, quanto ao tratamento com agentes anti-

hipertensivos. A consecução dessas mudanças é lenta e, na maioria das vezes, inatingível, e

por serem medidas educativas, necessitam de continuidade em sua implementação. O

tratamento não medicamentoso tem como principal objetivo diminuir a morbidade e a

PAD mmHg PAS mmHg Classificação

< 85 <130 Normal

85-89 130-139 Normal limítrofe

90-99 140-159 Hipertensão leve (estágio 1)

100-109 160-179 Hipertensão moderada (estagio 2)

> ou igual 110 > ou igual 180 Hipertensão grave (estágio 3)

< 90 > ou igual 140 Hipertensão sistólica isolada

49

mortalidade cardiovasculares, por meio de modificações do estilo de vida que favoreçam a

redução da pressão arterial. Esse tratamento apresenta vantagens como o baixo custo e risco

mínimo, além de aumentar a eficácia do tratamento medicamentoso. Ele é indicado a todos os

hipertensos e aos indivíduos mesmo que normotensos, mas de alto risco para doenças

cardiovasculares. Dentre essas modificações do estilo de vida, as que comprovadamente

reduzem a pressão arterial são: redução do peso corporal, redução da ingestão do sal e do

consumo de bebidas alcoólicas, prática de exercícios físicos com regularidade, e a não

utilização de drogas que elevam a pressão arterial75

. Essas modificações fazem parte de uma

nova filosofia no tratamento, que sustenta a base da medicina preventiva, mas ainda muito

distante do sucesso de implementação. A dificuldade de aplicar medidas preventivas na

população é de nível cultural e universal. Assim, é necessária a busca por diagnósticos

avançados, que sejam capazes de apresentar no mínimo a predisposição à determinadas

patologias, para corroborar o processo de convencimento a adesão das medidas preventiva.

51

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

O presente trabalho teve como objetivo desenvolver sistemas para detecção do

polimorfismo de inserção e deleção do gene da enzima conversora de angiotensina I, para

serem empregados como diagnósticos avançados da predisposição à hipertensão arterial

sistêmica, e, dessa forma, contribuir com a base preventiva da medicina. Alem disso, expandir

o campo de genossensores nanoestruturados visando o entendimento e a caracterização das

interações entre nanopartículas de ouro com oligonucleotídeos.

3.2 Objetivos específicos

- Sintetizar e caracterizar nanopartículas de ouro estabilizadas com dendrímero

poli(amidoamina) de geração 4 (PAMAM G4);

- Complexar nanopartículas de ouro com oligonucleotídeo (pequena sequência de DNA)

específico para a deleção de um fragmento Alu de 287 pb, no intron 16 do gene ECA, que

leva à predisposição para hipertensão arterial sistêmica;

- Caracterizar o conjugado, AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo, e averiguar a interação do

DNA com a nanopartícula;

- Investigar o processo de imobilização da região modificada do DNA, região 5’ tiolada;

- Avaliar a reposta DNA/DNA alvo/AuNP-PAMAM G4-Oligonucleotídeo por meio de

espectroscopia de impedância elétrica e eletroquímica, utilizando eletrodos interdigitados e

eletrodos recobertos de ouro;

- Avaliar a reposta DNA/DNA alvo por meio de espectroscopia em transistor de efeito de

campo de porta estendida e separada (SEGFET), utilizando eletrodos recobertos de ouro.

53

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais

Todos os reagentes foram adquiridos comercialmente. Para a síntese das

nanopartículas de ouro foram utilizados Ácido tetracloáurico HAuCl4, Ácido fórmico,

adquiridos da Sigma-Aldrich, e Dendrimero poli(amidoamina) geração 4.0 (PAMAM G4)

adquirido da Dendritech. As sequências utilizadas na construção dos genossensores e na

conjugação com as nanopartículas de ouro estão descritas nas Tabelas 2, 3 e 4. Todas as

sequências foram adquiridas liofilizadas da Invitrogen (Life Technologies) e eluídas em

tampão TE 1X (Tris-HCl e EDTA).

Tabela 2 – Sequências utilizadas na construção do genossensor com detecção elétrica.

Sequência

Sequência de captura 5’Tiol-GAGAGCCACTCCCATCCTTTCTC3’

Sequência não complementar 5’ACACCACACAACCCACCCACCCACA3’

Sequência alvo 5’TTCAGAGCTGGAATAAAATTGGCGAAACCACATAAAAGTGA

CTGTATAGGCAGCAGGTCTAGAGAAATGGGAGAAAGGATGG

GAGTGGCTCTCCAG3’

Conjugado AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo 5’•Tiol-ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’

Tabela 3 – Sequências utilizadas na construção do genossensor com detecção eletroquímica.

Sequência

Sequência de captura 5’Tiol-GAGAGCCACTCCCATCCTTTCTC3’

Sequência alvo

5’TTCAGAGCTGGAATAAAATTGGCGAAACCACATAAAAGT

GACTGTATAGGCAGCAGGTCTAGAGAAATGGGAGAAAGG

ATGGGAGTGGCTCTCCAG3’

Conjugado AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo 5’• Tiol-ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’

54

Tabela 4 – Sequências utilizadas na construção do genossensor com detecção SEGFET.

Sequência

Sequência de captura 5’Tiol-ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’

Sequência não complementar 5’ACACCACACAACCCACCCACCCACA3’

Sequência alvo 5’GGCGAAACCACATAAAAGTGACTGT3’

No preparo do tampão TE

(1X), usado para a eluição das sequências de

oligonucleotídeos e no processo de imobilização nas plataformas, foram utilizados

Tris(hidroximetil)aminometano hidrocloreto (0,01 mol L-1

) e Ácido etilenodiamino tetra-

acético (0,1 mmol L-1

) adquiridos da Sigma-Aldrich. O tampão PBS (do inglês, Phosphate

Buffer Saline) 0,1 mol L-1

pH 7,4, foi preparado utilizando Fosfato de potássio monobásico,

Fosfato de sódio dibásico 99% e Hidróxido de sódio NaOH, adquiridos da Sigma-Aldrich.

Nos processos de imobilização e caracterização eletroquímica também foram

utilizados 2-Mercaptoetanol (2-ME), uma solução de Hexacianoferrato III de potássio

(K3[Fe(CN)6]) 5 mmol L-1

e Brometo de etídeo, adquiridos da Sigma-Aldrich. Além desses

reagentes, Acetona, Etanol, Hidróxido de potássio e solução Sulfonítrica (Dicromato de

potássio e Ácido sulfúrico) foram usados para a limpeza das plataformas (eletrodos e

microeletrodos interdigitados) utilizadas e foram obtidos da Sigma-Aldrich e da J.T.Baker.

Todas as soluções descritas e utilizadas nesse trabalho foram preparadas utilizando água

ultrapura produzida pelo sistema Milli-Q com resistividade de 18,2 MΩ cm.

4.2 Estudo do conjugado AuNP-PAMAM/Oligonucleotídeo

4.2.1 Síntese das nanopartículas de ouro estabilizadas em PAMAM-G4

As Nanopartículas de Ouro (AuNPs) foram fabricadas pelo método de precipitação, no

qual um agente redutor é adicionado a uma solução de ácido cloroáurico na presença de um

polieletrólito estabilizante76

. Nessa síntese, foi escolhido o dendrímero poli(amidoamina) de

geração 4 (PAMAM G4), ilustrado na Figura 9, com estabilizante, com o intuito de sintetizar

55

nanopartículas de tamanhos reduzidos e mais estáveis em meio aquoso77

. Além disso, íons

metais reduzidos na presença de dendrímeros podem levar à formação de nanopartículas

retidas na cavidade do dendrímero, permitindo um melhor controle da forma e da dispersão de

tamanhos das nanopartículas26

.

Figura 9 – Estrutura molecular do dendrímero poli(amidoamina) de geração 4 – PAMAM G478

.

A metodologia para obtenção das nanopartículas de ouro estabilizadas com PAMAM

G4 (AuNP-PAMAM G4) consistiu basicamente na adição sob agitação constante de soluções

aquosa com volumes iguais de HAuCl4 (ácido tetracloáurico) de 1,0 mmol L-1

e PAMAM G4

0,07 mmol L-1

e, em seguida, uma solução de ácido fórmico 10% (v/v)76

. O sistema

permaneceu aproximadamente 2,5 horas em agitação lenta e constante protegido da luz. Após

a total redução do ouro e formação da suspensão de nanopartículas, a solução inicial de cor

amarela clara tornou-se vermelha acastanhada como é mostrado na Figura 10.

56

Figura 10 – Imagem das soluções na etapa inicial e final da síntese das nanopartículas de ouro, a) o sistema ainda

na coloração amarela clara, permaneceu em agitação vigorosa constante em um agitador magnético

e b) após 2,5 horas de agitação constante e protegido da luz a suspensão das nanopartículas de ouro

está concluída, e apresenta uma coloração vermelha acastanhada, indicando a redução do ouro.

4.2.2 Conjugação do oligonucleotídeo com as AuNP-PAMAM G4

A sequência de oligonucleotídeo, 5’Tiol-ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’,

utilizada e adquirida para a conjugação com as nanopartículas de ouro foi desenhada e

estudada, de acordo com o mapa gênico (disponível no anexo A), especificamente para o

polimorfismo de inserção e deleção (I/D), localizado no cromossomo 17, na extremidade do

Intron 16 do gene da enzima conversora de angiotensina I – ECA. Como já exposto

anteriormente, esse polimorfismo está intimamente relacionado com a predisposição à

hipertensão arterial13, 68-69

.

Sabendo da forte interação entre o ouro e o enxofre, os primeiros oligonucleotídeos

adquiridos comercialmente tinham um grupo fosforotioato (Figura 11). Esse tipo de

modificação1 nos oligonucleotídeos troca um oxigênio do grupo fosfato por um enxofre (-S)

e, dessa forma, a funcionalização ocorreria de forma mais estável por ligação covalente. No

entanto, essa modificação do grupo fosforotioato estava presente em todos os nucleotídeos da

sequência. Assim, a interação com as nanopartículas poderia ocorrer em forma de core/shell,

recobrindo e contornando toda a nanopartícula, podendo inutilizar o conjugado na fase de

hibridização, porque dessa maneira a molécula poderia diminuir a flexibilidade das bases

nitrogenadas no momento da ligação com as bases complementares.

57

Outra possível modificação nos oligonucleotídeos é a adição de um grupo tiol (-SH)79

na extremidade 5’ da sequência do oligonucleotídeo, da mesma forma como na modificação

com o grupo fosforotioato, ocorre também uma forte interação entre o ouro e o enxofre do

oligonucleotídeo23

. No entanto, essa modificação com o grupo tiol é realizada apenas no

grupo fosfato inicial da sequência, mais precisamente, na extremidade 5’. Dessa maneira, a

conjugação entre as nanopartículas é mais uniforme e não prejudica a aplicação do conjugado

na fase de hibridização, visto que, as de bases nitrogenadas ficam mais livres e, com isso,

mais flexíveis para se ligarem em suas sequências complementares. Dessa maneira, o

oligonucleotídeo utilizado foi adquirido com a adição de um grupo tiol linker C6 de fórmula

OH-C6-S-S-C6-PO3 na extremidade 5’.

A metodologia para a conjugação do oligonucleotídeo com as nanopartículas de ouro,

AuNP-PAMAM/Oligonucleotídeo, consistiu primeiro na separação de uma alíquota de

nanopartículas lavadas por meio de centrifugações sucessivas. Essas lavagens foram

realizadas para aumentar o pH e deixá-lo mais próximo do pH fisiológico, visto que, as

nanopartículas de ouro reduzidas com ácido fórmico apresentam pH muito baixo,

aproximadamente 4,0, o que poderia ser desfavorável para as moléculas de DNA. Dessa

maneira, 1,5 mL das AuNP-PAMAM G4, foram centrifugadas a 13.000 rpm por 5 minutos, e

posteriormente, o precipitado ressuspendendido com 1 mL de água ultra pura e centrifugado

novamente. Esse ciclo de lavagem foi repetido por mais duas vezes. Um mL de AuNP-

PAMAM G4 lavadas foram adicionadas a 40µL de uma solução contendo 151,5 pmol µL-1

de

oligonucleotídeo tiolado em tampão TE 1X. O sistema permaneceu por 12 horas sob agitação

lenta e constante a 4 ºC protegido da luz. Posteriormente, o excesso de oligonucleotídeo que

não estava eficientemente complexado foi removido por centrifugação. O sistema foi

centrifugado a 13.000 rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado

ressuspendido em água Milli-Q. Esse processo de lavagem foi repetido mais duas vezes para

eliminar ao máximo do excesso de oligonucleotídeo. A separação por Cromatografia de

Exclusão Molecular também foi realizada, porém sem resultados satisfatórios (não

apresentados), visto que, o conjugado AuNP-PAMAM/Oligonucleotídeo interagia fortemente

com a coluna de exclusão molecular e permanecia até a eluição da coluna com hipoclorito de

sódio. Dessa forma, não é possível utilizar, pois degrada o conjugado e anula a funcionalidade

do mesmo.

58

Figura 11 – Estrutura química de um fosfodiester e um fosforotioato. A alteração entre eles é a troca de um

oxigênio (-O) do grupo fosfato por um enxofre (-S)80

.

4.3 Construção do genossensor em modelo sanduíche

O genossensor utilizado nas análises de espectroscopia de impedância elétrica e

eletroquímica foi baseado na técnica de hibridização em modelo sanduíche. As sequências

específicas para o polimorfismo estudado foram desenhadas utilizando o mapa gênico81

do

gene da ECA.

A arquitetura para detecção do polimorfismo utilizada nesse trabalho consiste em

imobilizar a sequência de oligonucleotídeo, chamada de sequência de captura, sobre eletrodos

condutores. Esta sequência deve ser próxima da região que se quer analisar. Em seguida

colocar o eletrodo em contato com a amostra a ser analisada, sequência alvo, e aquecer até a

temperatura de annealing da sequência, para imobilizá-la ao eletrodo (por meio da

hibridização com a sequência de captura). Após a lavagem, as sequências ancoradas

fracamente são removidas. Uma parte do material a ser detectado hibridiza com a sequência

de captura. A sequência de captura é desenhada para reagir com apenas parte da sequência

alvo, de maneira que uma parte desta última ainda permaneça como fita simples após o

ancoragem com a sequência de captura. Após hibridizar com apenas uma parte da sequência

desejada, o sistema é colocado com uma terceira sequência conjugada com nanopartículas de

ouro (AuNP-PAMAM/Oligonucleotídeo) complementar à parte da sequência alvo que não

hibridizou. Essa sequência é composta por uma sequência de DNA conjugada com a

nanopartícula de ouro e complementar ao polimorfismo da sequência alvo. Dessa forma,

ocorrerá a hibridização do conjugado com oligonucleotídeo e nanopartículas, apenas se

houver complementaridade na amostra analisada. A variação da resistividade do sistema é

59

monitorada por meio de espectroscopia de impedância elétrica e espectroscopia de

impedância eletroquímica, uma vez que, com as nanopartículas de ouro o sistema é menos

resistivo. Uma ilustração da arquitetura desse dispositivo é representada na Figura 4.

4.3.1 Imobilização do DNA na plataforma do genossensor elétrico

As medidas de detecção elétrica foram realizadas utilizando-se eletrodos

interdigitados, com trilhas de Cr/Au depositadas sobre vidro. Uma ilustração esquemática dos

eletrodos é mostrada na Figura 12. O eletrodo contém 24 pares de trilhas com distância de 40

μm entre elas. A metodologia para construção do genossensor consistiu primeiramente na

imobilização da sequência de captura modificada com um grupo tiol, 5’Tiol-

GAGAGCCACTCCCATCCTTTCTC3’, nos microeletrodos interdigitados. Os

microeletrodos foram imersos em uma solução contendo 3,16 µmol L-1

de oligonucleotídeo

de captura, em tampão TE 1X por 12 horas. Após esse período os microeletrodos foram

enxaguados em água ultrapura para a remoção dos oligonucleotídeos que não ancoraram

fortemente nas trilhas de ouro. A secagem foi realizada sob fluxo brando de N2.

Figura 12 – Imagem dos microeletrodos interdigitados recobertos com ouro utilizados como plataforma do

genossensor elétrico.

60

4.3.2 Imobilização do DNA na plataforma do genossensor eletroquímico

Em plataformas de genossensoriamento eletroquímico, o sucesso da detecção do DNA

alvo depende de fatores como o grau de organização das moléculas, e a modificação

apropriada da superfície79,82

. Um alto grau de organização das moléculas de DNA

imobilizadas pode ser adquirido utilizando a técnica de monocamada auto-organizada mista

(SAMmix, do inglês Self-Assembled Mix Monolayer)83

. A SAMmix promove uma auto-

organização entre as moléculas de DNA e as outras moléculas da mistura na superfície. Dessa

forma, facilitando a formação de ilhas de moléculas e possibilitando que as sequências de

DNA sejam adsorvidas especificamente, e com uma tendência a mesma orientação, resultando

em uma interface com moléculas bem orientadas e regiões de alta concentração de moléculas

(Figura 13) 79,83

.

Figura 13 – Esquema de plataformas com a molécula imobilizada pura e com SAMmix: (a) apenas sequências de

DNA modificadas com tiol imobilizadas em superfície de ouro e (b) SAMmix de sequências de DNA

modificadas com tiol e 6-hidroxi-1-hexanotiol imobilizadas em superfície de ouro.79

.

A metodologia para construção do genossensor utilizado na detecção eletroquímica foi

baseada em SAMmix. A SAMmix de tiol e oligonucleotídeo foi obtida por imersão dos

eletrodos de ouro em uma solução contendo 0,12 mmol L-1

de 2-mercapto1-etanol e 2 µmol L-

1 de sequência de captura, 5’ Tiol -GAGAGCCACTCCCATCCTTTCTC3’, em tampão TE

1X. O sistema permaneceu por 12 horas a 22 ºC. Em seguida, os eletrodos foram enxaguados

em água ultrapura, para remover as moléculas adsorvidas fracamente, e o excesso. A secagem

foi realizada sob fluxo brando de N2.

61

4.4 Construção do genossensor para caracterização em Transistor de Efeito de Campo

de Porta Estendida e Separada (SEGFET)

4.4.1 Imobilização do DNA na plataforma do genossensor para caracterização em

SEGFET

Existe a possibilidade de detectar de forma direta o processo de hibridização de

sequências DNA (sem necessidade de uma terceira fita contendo nanopartículas ou

marcadores utilizando dispositivos de efeito de campo (FEDs, do inglês Field-Effect

Devices)51

. Portanto, testamos também uma variação do ISFET (Figura 7) associado ao

modelo de hibridização direta. Além disso, foram testadas duas formas de imobilização

visando uma boa orientação e organização molecular, além de uma maior especificidade.

Uma das metodologias para construção do genossensor utilizado na detecção SEGFET foi

baseada em SAMmix. A SAMmix de tiol e oligonucleotídeo foi obtida por imersão dos

eletrodos de ouro em uma solução contendo 0,12 mmol L-1

de 2-mercapto1-etanol e 2 µmol L-

1 de sequência de captura, 5’Tiol-ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’em tampão TE

1X. O sistema permaneceu por 12 horas a 22 ºC. Em seguida, os eletrodos foram enxaguados

em água ultrapura, para remover as moléculas adsorvidas ineficientemente, e o excesso. A

secagem foi realizada sob fluxo brando de N2. Outra imobilização estudada foi a imobilização

direta sem a SAMmix, na qual consistiu na imobilização apenas da sequência de captura

modificada com um grupo tiol, 5’Tiol-ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’ nos

eletrodos de ouro. Os eletrodos foram imersos em uma solução contendo 2 µmol L-1

de

oligonucleotídeo de captura, em tampão TE 1X. O sistema também permaneceu por 12 horas

a 22 ºC. Em seguida, os eletrodos foram enxaguados em água ultrapura, para remover as

moléculas adsorvidas ineficientemente, e o excesso. A secagem foi realizada sob fluxo brando

de N2.

62

4.5 Técnicas de caracterização

4.5.1 Espectroscopia no Ultravioleta-Visível (UV-VIS)

As técnicas espectroscópicas de absorção são muito utilizadas. Em particular, as

espectroscopias no UV-VIS podem ser usadas com vários objetivos, desde a determinação de

concentrações até a resolução de questões estruturais complexas.

Espectroscopia no UV-VIS é uma técnica amplamente utilizada para análises de

moléculas biológicas. No DNA os principais elementos que apresentam transições eletrônicas

na região do ultravioleta são os anéis das purinas e pirimidinas presentes nas bases

nitrogenadas (adenina, guanina, timina e citosina) com fortes absorções entre 240 e 275 nm84

.

Nessa técnica, a quantificação de moléculas biológicas pode ser determinada por meio da

absorção que é diretamente proporcional a concentração, de acordo com a lei de Beer-

Lambert85

(Equação 1).

(1)

Onde é a absorbância, é o coeficiente de absortividade molar, é a concentração e

o caminho óptico. Além das moléculas biológicas, também é possível estimar a

concentração de nanopartículas metálicas esféricas por meio da teoria de Mie86

, que, de forma

geral, correlaciona a radiação absorvida pela nanopartícula com a radiação espalhada, sendo a

absorbância total relacionada com a secção transversal das nanopartículas, é possível calcular

a radiação total em função do tamanho das nanopartículas analisadas.

A espectroscopia de absorção no ultravioleta visível foi empregada no estudo das

nanopartículas de ouro AuNP-PAMAM G4 e dos conjugados AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo com o propósito de quantificar e avaliar a existência da conjugação das

nanopartículas aos oligonucleotídeos, visto que, a interação entre moléculas podem provocar

alterações no espectro de absorção ou alargamento de picos87

. Foi utilizado o espectrômetro

de modelo U-2900 da empresa Hitachi, pertencente ao Grupo de Biofísica - IFSC/USP. As

cubetas para as medidas eram de quartzo com volumes de 0,5 mL e o caminho óptico de 1

cm. Foram analisadas a solução de AuNP-PAMAM G4, diluída da síntese inicial em 10

vezes, uma solução do oligonucleotídeo livre eluído em tampão TE 1X , a solução do

63

conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo, o precipitado da solução do conjugado após

centrifugação, e o sobrenadante da solução.

4.5.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)

O Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS, do inglês Dynamic Light Scattering) é uma

técnica amplamente utilizada no estudo de partículas em solução e suspensão, como proteínas,

polímeros, micelas, carboidratos, nanopartículas, dispersões coloidais, emulsões,

microemulsões, vesículas lipídicas e várias outras moléculas, sendo a maioria de interesse

biológico88

. O DLS é uma técnica não-invasiva, de fácil utilização com medidas rápidas e

precisas para distribuições monodispersas e com distribuição de tamanhos pequenos. Além

disso, pode-se medir ao mesmo tempo a carga superficial das partículas. Baseado no

espalhamento de luz mediante o tamanho das partículas, as detecções medem as flutuações da

intensidade do espalhamento em função do tempo87

.

As partículas dispersas em um meio líquido movem-se pelo movimento Browniano.

Partículas menores movem-se mais rapidamente que partículas grandes, assim possuem

coeficiente de difusão (D) maior. Para uma dispersão de partículas esféricas, com viscosidade

η, sob temperatura constante T, a k que é a constante de Boltzmann, o coeficiente de difusão

D é inversamente proporcional ao diâmetro hidrodinâmico dh das partículas, essa relação está

apresentada na Equação 2 de Stokes- Einstein87

:

(2)

O espalhamento dinâmico de luz foi utilizado na caracterização das distribuições de

tamanhos da AuNP-PAMAM G4, do oligonucleotídeo, e do AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo. O equipamento utilizado nas análises de DLS foi um Zetatrac

(Microtrac Inc.) pertencente ao Grupo de Polímeros – IFSC/USP, algumas medidas também

foram realizadas em um equipamento Malvern Spectrometer Nano-ZS (Malvern Instruments

UK) pertencente a Embrapa, São Carlos. As medidas foram realizadas em triplicatas, em

temperatura ambiente. As amostras AuNP-PAMAM G4 e AuNP-PAMAM

64

G4/Oligonucleotídeo foram dispersas em água ultrapura, e o oligonucleotídeo livre em

tampão TE 1X .

4.5.3 Potencial Zeta (ζ)

O termo potencial Zeta (ζ), segundo a teoria de DVLO (inicial dos nomes dos

pesquisadores Derjaguin, Verwey, Landau e Overbeek)89

, envolve a somatória do potencial

relacionado ao solvente, do potencial atrativo e do potencial repulsivo do material. A técnica

que avalia o potencial Zeta (ζ) é baseada também no espalhamento dinâmico de luz. No

entanto, neste caso a cubeta na qual se encontra a suspensão a ser analisada contém dois

eletrodos, nos quais uma diferença de potencial (ddp) é aplicada, gerando a movimentação das

partículas em suspensão. Quando as partículas se movimentam os íons contidos em sua

camada de Stern e em sua camada mais difusa movimentam-se com ela, assim, o

espalhamento de luz é gerado. De maneira geral, a velocidade das partículas é determinada

em função da diferença de potencial, e sabendo a viscosidade e a constante dielétrica da

amostra é possível calcular o valor do potencial Zeta da suspensão90

.

As partículas em suspensão apresentam uma carga eletrostática superficial, e com a

quantificação das cargas eletrostáticas da superfície, é possível saber se uma partícula é

estável em determinado meio ou não. A estabilidade de uma suspensão depende de seu

potencial total, e quanto maior esse potencial em módulo, mais estável as partículas estarão no

meio90

. O potencial ζ foi utilizado na caracterização da AuNP-PAMAM G4, do

oligonucleotídeo, e do AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo, com o intuito de conhecer a

estabilidade desses compostos e confirmar a formação do conjugado.

O equipamento utilizado nas análises do potencial Zeta é o mesmo do DLS, Zetatrac

(Microtrac Inc.) pertencente ao Grupo de Polímeros – IFSC/USP, algumas medidas também

foram realizadas em um equipamento Malvern Spectrometer Nano-ZS (Malvern Instruments

UK) pertencente a Embrapa São Carlos. O potencial ζ das suspensões foi analisado a 25 ºC

em triplicata para cada amostra. As amostras AuNP-PAMAM G4 e AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo foram dispersas em água ultra pura e o oligonucleotídeo livre em

tampão TE 1X .

65

4.5.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM, do inglês Transmission Electron

Microscopy) é uma técnica de alta resolução que permite a visualização de estrutura muito

pequenas, da ordem de nanômetros. Sucintamente, a técnica é baseada na aceleração de um

feixe de elétrons emitido em direção a uma amostra ultrafina, esses elétrons interagem com a

amostra enquanto a cruzam formando a imagem. A TEM é capaz de promover imagens a uma

resolução excepcional e muito maior em comparação aos microscópios ópticos, e isso se deve

ao pequeno comprimento da onda dos elétrons. Desta forma, a técnica é empregada em vários

estudos morfológicos na área de virologia, no câncer e na ciência de materiais, se destacando

na caracterização de nanomateriais e nanocompósitos. Além disso, recentemente, a técnica

vem sendo utilizada para resolver a estrutura tridimensional de proteínas.

TEM foi empregada para visualizar, quando possível, a conjugação das nanopartículas

com o DNA. As imagens foram obtidas em um microscópio eletrônico JEOL JEM-2100

operando a 200 kV, pertencente ao Laboratório de Microscopia Eletrônica no Laboratório

Nacional de Luz Síncrotron em Campinas, e foram realizadas em colaboração, pela aluna

Valéria Spolon estudante de doutorado do nosso grupo, a qual apresenta o treinamento

específico e indispensável para manusear esse microscópio. O sistema foi preparado

depositando uma gota da suspensão aquosa da nanopartícula sobre uma grade de cobre

recoberta por um filme fino de carbono 300 mesh (Ted Pella, Inc.) Após a deposição da gota

sobre o suporte, a água foi lentamente evaporada a temperatura ambiente. As análises

estatísticas do diâmetro médio e desvio padrão das nanopartículas foram realizadas pela

contagem de 100 a 250 partículas usando o software de domínio publico ImageJ desenvolvido

pelo National Institute of Health, NIH, Estados Unidos.

4.5.5 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

A reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real-Time, do inglês Real-

Time Polymerase Chain Reaction) é utilizada para amplificar material genético. Como o

nome indica, é possível acompanhar essa reação no momento em que ela está ocorrendo, em

tempo real. A técnica utiliza um fator fluorescente, que se intercala nas bases nitrogenadas do

66

DNA em fita dupla. Assim, conforme as novas fitas vão se formando, o fator vai se

intercalando, aumentando dessa forma a fluorescência detectada. Essa técnica foi utilizada

para analisar a funcionalidade do oligonucleotídeo após a conjugação com as nanopartículas e

validar as etapas de detecções, hibridização com a sequência complementar, no genossensor.

Os testes foram realizados em um termociclador modelo CFX96 BIO-RAD pertencente ao

Laboratório de Genética e Evolução durante um treinamento de Real-Time PCR, ministrado

pela BIO-RAD na Universidade Federal de São Carlos – UFSCar. Nas reações testadas foram

utilizadas a sequência que seria amplificada, denominada de “DNA molde”,

5'TTCAGAGCTGGAATAAAATTGGCGAAACCACATAAAAGTGACTGTATAGGCA

CAGGTCTAGAGAAATGGGAGAAAGGATGGGAGTGGCTCTCCAG3’, com o primer

controle, sem nanopartícula, 5’Tiol-ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’, ou com o

primer testado complexado com a nanopartícula, AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo,

5’●Au-Tiol-ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’, descritos na Tabela 5. As

amplificações foram realizadas em uma placa específica do equipamento com o kit SYBR

Green supermix da BIO-RAD em um volume de 20µL, todas as reações foram testadas em

duplicata. Os 39 ciclos aplicados depois da desnaturação (98 ºC por 2 minutos) respeitaram 98

ºC por 10 segundos → annealing 68 ºC por 30 segundos → e ciclo de extensão. As

amplificações foram analisadas pelo software CFX Manager™ da BIO-RAD.

Tabela 5 – Descrição dos reagentes utilizados na Real-Time PCR.

Localização

Placa

[DNA molde]

µmol L-1

[Primer controle]

µmol L-1

KitSYBR

volume µL

ÁguaMilli-Q

volume µL

A1 0,15 0,30 10 7,0

A2 0,15 0,30 10 7,0

B1 0,30 0,30 10 6,0

B2 0,30 0,30 10 6,0

Localização

Placa

[DNA molde]

µmol L-1

[Primer conjugado]

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo

µmol L-1

KitSYBR

volume µL

ÁguaMilli-Q

volume µL

C1 0,15 0,30 10 7,0

C2 0,15 0,30 10 7,0

D1 0,30 0,60 10 7,0

D2 0,30 0,60 10 7,0

67

4.5.6 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR)

A técnica de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR, do

inglês Fourier Transform Infrared Spectroscopy) é uma técnica de absorção na região do

infravermelho do espectro eletromagnético. Praticamente qualquer composto com ligações

covalentes absorve várias frequências de radiação eletromagnética na região do infravermelho

(IV), com variações de energia da ordem de 8 – 40 kJ/mol correspondentes aos alongamentos

e distorções angulares da molécula91

.

A espectroscopia no Infravermelho tem sido utilizada no estudo das interações de

nanomateriais conjugados a DNA92-95

. Portanto, o objetivo de usar a FTIR na caracterização

dos conjugados foi justamente o de analisar por quais grupos as nanopartículas, AuNP-

PAMAM G4, estavam ligadas com o oligonucleotídeo, e confirmar a formação do conjugado

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. Para isso, as amostras foram depositadas em casting

sobre lâminas de silício previamente limpas, visto que, o Si é transparente no Infravermelho

permitindo a sua utilização em análises de FTIR. Posteriormente, as lâminas foram secadas

em um dessecador à vácuo com sílica gel, até que a água fosse evaporada e a umidade

eliminada. Após secagem, as lâminas foram imediatamente analisadas. O equipamento

utilizado para essas medidas foi um espectrofotômetro Thermo Nicolet 6700 FT-IR (TQ

Analyst) o qual pertence ao Grupo de Cristalografia - IFSC/USP. Os espectros foram obtidos

por meio de 200 medidas com resolução de 4 cm-1

, em modo de transmitância, no intervalo de

400 a 4000 cm-1

.

4.5.7 Microscopia Confocal de Fluorescência

A microscopia confocal de fluorescência utiliza compostos químicos denominados

fluoróforos que são excitados por uma fonte de LASER, e, por meio de um conjuntos de

lentes o sistema é capaz de focar um cone de luz LASER em uma profundidade

predeterminada da amostra. A profundidade pode ser mantida enquanto se muda o ponto focal

e, dessa forma, é possível visualizar o plano amostral por inteiro e ponto a ponto. Além disso,

essa técnica tem um sistema capaz de filtrar as luzes emitidas pela amostra toda e captar

apenas a luz do ponto focado, eliminado a emissão de luz dos pontos que estão fora do foco, e

68

dessa forma é possível construir imagens bidimensionais com vários fluoróforos diferentes e

com resoluções extremamente precisas. A microscopia confocal, além de ter proporcionado

um notável avanço em estudos de organismos vivos, é fundamental para análises de células,

eventos biológicos e interações físico-químicas e, dessa maneira, permite ampliar os

conhecimentos em várias áreas da biologia. Essa técnica é muito empregada em estudos de

nanotoxicidade, por meio da análise em tempo real da interação dos nanomateriais com

sistemas biológicos96-99

. A microscopia confocal foi empregada neste trabalho para investigar

a presença de DNA no genossensor e a organização das moléculas sobre o eletrodo de ouro.

Foi utilizado um microscópio confocal de fluorescência modelo LSM 780 (ZEISS)

pertencente ao IFSC/USP. Todas as imagens foram realizadas com a supervisão de indivíduos

treinados para o manuseio do equipamento, devido à quantidade e complexidade de recursos

que o equipamento oferece. Foram analisados os eletrodos nas três etapas separadas de

construção do genossensor (Figura 28). O fluoróforo utilizado foi o Brometo de etídeo

(C21H20BrN3) o qual se intercala nas bases nitrogenadas do DNA, e é excitado no

comprimento de onda 535 nm (azul-verde) com emissão no comprimento de onda de 602 nm

(vermelho)100

. Após cada etapa de construção do genossensor para detecção eletroquímica, os

eletrodos foram incubados por 10 minutos em uma solução contendo 0,1µg mL-1

de Brometo

de etídeo e, posteriormente, os eletrodos foram lavados várias vezes em água ultrapura para

retirar o excesso de marcador não intercalado. Foi realizada a varredura por todo o eletrodo e

o experimento foi repetido em duplicata.

4. 5. 8 Espectroscopia de Impedância

4.5.8.1 Espectroscopia de Impedância Elétrica

A espectroscopia de impedância elétrica é baseada na análise da impedância em

função da frequência de um sinal aplicado em potenciais alternados (AC). Essa técnica

permite a análise dos processos de condução elétrica em materiais sólidos e líquidos que

apresentem algum grau de resistividade elétrica. Em uma medida de espectroscopia de

impedância promove-se uma varredura de frequência, partindo de uma frequência inicial da

http://pt.wikipedia.org/wiki/Carbono

http://pt.wikipedia.org/wiki/Hidrog%C3%A9nio

http://pt.wikipedia.org/wiki/Bromo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Bromo

69

ordem de 0,1 Hz até frequências da ordem de 107 Hz. O espectro de impedância apresenta os

principais processos de transporte eletrônicos, iônicos, injeção de portadores de carga e

diferenças nas fases estruturais do material. Por meio da impedância complexa pode-se obter

seu recíproco, a admitância complexa, além da resistividade elétrica e a condutividade. Uma

forma de representação da impedância é mostrada na Figura 14b, na qual a impedância

complexa é apresentada na forma de um diagrama de Nyquist. O diagrama de Nyquist,

normalmente, inclui uma região de semicírculo seguido de uma linha reta (curva a), a região

do semicírculo, observada em frequências mais altas, corresponde ao processo de

transferência eletrônica, já a região linear do espectro é característica de frequências mais

baixas e abrange o processo eletroquímico limitado pela difusão. Quando o processo de

transferência de elétrons é muito rápido, o espectro de impedância pode apresentar apenas a

região linear (curva b), enquanto no processo de transferências muito lento o resultado é uma

grande região de semicírculo que não é acompanhada pela região linear (curva c). Assim, a

cinética de transferência de elétrons e as características difusionais podem ser extraídas a

partir desses espectros. O diâmetro do semicírculo corresponde à resistência da transferência

dos elétrons Ret. A intersecção do semicírculo com o eixo Zre, em altas frequências ( ) é

igual à resistência da solução RS. Uma extrapolação no círculo, em baixa frequência, origina

uma interceptação correspondente a RS + Ret101

.

Figura 14 – Uma representação esquemática: a) eletrodo interdigitado utilizado em medidas de impedância

elétrica, uma plataforma de vidro é separada por dois condutores criando uma região de isolamento

entre eles, as moléculas podem se ancorar na região da plataforma ou nos condutores, quando o sinal

é aplicado a resistência da transferência de cargas pode aumentar ou diminuir dependendo da

molécula imobilizada e b) um típico diagrama de Nyquist representando a impedância complexa e

os parâmetros relacionados, descritos acima. Adaptado de Katz et al. – 2010101.

Esses parâmetros são essenciais no estudo de dispositivos para sensoriamento a base

de detecção elétrica. Além disso, a espectroscopia de impedância elétrica tem sido empregada

em etapas de detecção de genossensores101

. A técnica de espectroscopia de impedância

elétrica, em regime AC, foi empregada como uma das técnicas de caracterização da

70

construção do genossensor e na etapa de detecção da sequência alvo com o conjugado, AuNP-

PAMAM G4/Oligonucleotídeo, uma ilustração do sistema de medida é mostrado na Figura

15.

O impedanciômetro utilizado nas análises foi um Solartron S/1260, pertencente ao

Grupo de Biofísica - IFSC/USP. Os espectros de impedância foram obtidos a temperatura de

22 °C em todas as etapas de construção do genossensor, após cada etapa de lavagem com

água ultrapura, o mesmo foi submetido à caracterização elétrica por meio da espectroscopia

de impedância elétrica em potenciais alternados. As análises foram obtidas em intervalo de

frequência de 1 Hz a 1 MHz. A amplitude do potencial alternado foi de 100 mV. As medidas

foram realizadas em triplicata dentro de um eppendorf® em uma solução de tampão TE (Tris

HCl EDTA) 0,05 mol L-1

. Essa concentração do tampão foi escolhida mediante prévio estudo.

Os eletrodos interdigitados (Figura 12) com a sequência de captura ancorada foram

imersos em uma solução com 1,41 nmol L-1

de sequência alvo,

5'TTCAGAGCTGGAATAAAATTGGCGAAACCACATAAAAGTGACTGTATAGGCAG

CAGGTCTAGAGAAATGGGAGAAAGGATGGGAGTGGCTCTCCAG3’. Essa solução foi

aquecida a 54º C, temperatura de annealing, por 10 minuto, para que ocorresse a 1ª

hibridização. Depois de esfriar e atingir a temperatura ambiente, os microeletrodos foram

lavados novamente com água Milli-Q, e, incubados em uma solução com a sequência não

complementar, 5’ ACACCACACAACCCACCCACCCACA 3’. A solução foi aquecida a 54º

C, temperatura de annealing, por 10 minuto, para manter as mesmas condições de

hibridização. Depois de esfriar e atingir a temperatura ambiente, os microeletrodos foram

lavados novamente com água Milli-Q, e, posteriormente, imersos na solução contendo na 2,21

nmol L-1

do conjugado, AuNP-PAMAMG4/Oligonucleotídeo, 5’AuNP-PAMAM G4/Tiol-

ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC3’. A solução foi aquecida novamente a 54 ºC, por

10 minuto (2ª hibridização), e esfriada naturalmente até atingir a temperatura ambiente.

Finalmente, o genossensor foi lavado pela última vez com água ultrapura para retirada do

excesso do conjugado.

71

Figura 15 – Imagem do sistema utilizado nas medidas AC. Onde aparecem o notebook usado para aquisição de

dados, o eppendorf® de medida e o impedanciômetro Solartron.

4.5.8.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica

A espectroscopia de impedância eletroquímica consiste basicamente em analisar a

impedância complexa de um sistema eletroquímico, fundamentado na aplicação de um

potencial elétrico variável, por meio de um potenciostato em uma célula eletroquímica, no

caso, convencional, que contém três eletrodos: eletrodo de referência (RE), contra eletrodo

(CE) e eletrodo de trabalho (WE), esse sistema é ilustrado na Figura 16. Essa técnica

apresenta várias vantagens como: baixo custo, rapidez na análise, facilidade de

instrumentação, entre outras. Além disso, tem sido bastante utilizada em genossensores8-9

.

Portanto, foi empregada como uma das técnicas de caracterização da construção do

genossensor e na etapa de detecção da sequência alvo com os conjugados, AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo.

72

Figura 16 – Representação esquemática do sistema de medida eletroquímico: onde um potenciostato é associado

a uma célula eletroquímica convencional de três eletrodos.

Os eletrodos de ouro modificados com SAMmix descritos anteriormente foram

analisados por espectroscopia de impedância eletroquímica e voltametria cíclica (resultado

não mostrado), durante todas as etapas do processo de construção e detecção do genossensor,

e foi utilizado hexacianoferrato de potássio (III) (K3 [Fe (CN) 6]) como sonda eletroquímica.

A primeira hibridização foi realizada por imersão dos eletrodos modificados, de SAMmix, em

uma solução de 0,26 nmol L-1

com a sequência alvo,

5'TTCAGAGCTGGAATAAAATTGGCGAAACCACATAAAAGTGACTGTATAGGCAG

CAGGTCTAGAGAAATGGGAGAAAGGATGGGAGTGGCTCTCCAG3’, que foi

aquecida a 54 º C durante 10 minutos. Posteriormente, os eletrodos foram esfriados até à

temperatura ambiente e lavados com água ultrapura para remover o excesso de moléculas não

adsorvidas e analisados. Posteriormente, os eletrodos foram submetidos à segunda

hibridização em uma solução de 2,21 nmol L-1

do conjugado, AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo, 5’AuNP-PAMAM GA/Tiol- ACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC

3’, e aquecida a 54 º C durante 10 minutos. Em seguida, os eletrodos foram novamente

resfriados a temperatura ambiente, lavados com água ultrapura para remover as moléculas

adsorvidas fracamente, e, secos sob fluxo brando de N2.

Os experimentos eletroquímicos foram realizados utilizando um potenciostato

eletroquímico de modelo PGSTAT40 Autolab (Eco Chemie, Utrecht, Holanda), equipado

com PGSTAT-12 e GPES / FRA 4,9 software (Eco Chemie, Utrecht, Holanda) todos

pertencentes ao Grupo de Biofísica - IFSC/USP. As medidas de espectroscopia de impedância

eletroquímica foram realizadas em triplicata em tampão PBS 0,1 mol L-1

pH 7,4, contendo 5

mmol L-1

de hexacianoferrato de potássio (III). As medidas de impedância eletroquímica

foram realizadas em uma faixa de frequência de 10 KHz a 0,1 Hz, com uma amplitude de

73

0,01 V. Os espectros foram representados como diagramas de Nyquist (-Zimag vs Zreal).

Uma imagem do sistema de detecção é mostrada na Figura 17.

Figura 17 – Imagem do sistema utilizado na caracterização eletroquímica. Onde aparecem o computador usado

para aquisição de dados, a célula eletroquímica, o potenciostato PGSTAT40 Autolab utilizados nas

detecções e o eletrodo de ouro com a área delimitada utilizado na construção do genossensor.

4.5.9 Detecção em Transistor de Efeito de Campo de Porta Estendida e Separada

(SEGFET)

A configuração do SEGFET para a detecção de DNA é composta de duas partes: um

MOSFET comercial utilizado como transdutor de sinal e um eletrodo de ouro contendo a

sequência de captura imobilizada atuando como porta estendida. A Figura 18 ilustra a

configuração desse dispositivo e seu correspondente diagrama eletrônico.

74

Figura 18 – a) Diagrama esquemático do dispositivo SEGFET utilizado no genossensor e b) O diagrama

eletrônico do mesmo.

Nas medidas de detecção, o MOSFET foi devidamente polarizado com uma tensão

dreno-fonte VDS = 1,5 V e uma tensão porta-fonte VGS = 1,5 V. A corrente entre os

eletrodos dreno-fonte (IDS) do MOSFET é modulada pelo potencial na superfície do filme de

ouro. O SEGFET operava na região de saturação e a detecção de hibridização de DNA

ocorreu mediante a medida da corrente de dreno (ID) ao longo do tempo, antes e após a

incubação da porta estendida em soluções 5µM de DNA alvo, 5’

GGCGAAACCACATAAAAGTGACTGT 3’, por 30 minutos em temperatura ambiente para

hibridização. Foram testados outros tempos de hibridização, mas para as concentrações

propostas 30 minutos foi suficiente. O genossensor também foi testado em uma sequência de

DNA não complementar. Todas as medidas foram realizadas em força iônica baixa (em

tampão PBS 0,01 mol L-1) para atingir um comprimento de Debye (λD) de 7,3 nm, esse

comprimento está associado com o limite de detecção da técnica empregada102

.

75

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Síntese e caracterização das Nanopartículas de Ouro

Para a conjugação com oligonucleotídeo, as nanopartículas de ouro foram sintetizadas

na presença do PAMAM G4, visando um maior controle da forma e do tamanho, uma vez que

as propriedades desse nanomaterial são fortemente associadas com as suas características

morfológicas. As AuNP-PAMAM G4 antes de serem conjugadas, e sem nenhum tratamento

prévio foram analisadas por TEM (Figura 19a), com o objetivo de verificarmos o tamanho e

forma das AuNPs.

4 6 8 10 12 14 16 18 200

10

20

30

40

50

Nú

me

ro d

e p

art

ícu

las

Diamêtro médio /nm

b) Ajuste Gaussiano

Figura 19 – a) Imagem de Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) das nanopartículas de ouro (AuNP-

PAMAM G4) e b) Histograma de tamanhos das AuNP-PAMAM G4.

Como é possível observar na imagem de TEM (Figura 19a) foi verificado o formato

esférico das partículas com uma boa homogeneidade. O tamanho médio das partículas e a

distribuição de tamanhos foram analisados estatisticamente pela contagem de 215 partículas

por meio do software de domínio publico ImageJ. O resultado dessa análise está representado

na Figura 19b, que apresenta o histograma de tamanhos com o ajuste Gaussiano nos dados.

De acordo com o ajuste Gaussiano, o diâmetro médio das AuNP-PAMAM G4 foi de

6,1 nm e desvio médio de ± 0,43, indicando que as nanopartículas também foram formadas

fora da cavidade do dendrímero. Esse resultado foi esperado e em concordância com a rota de

76

síntese, onde a redução ocorreu de forma lenta, visto que quando a redução é realizada de

forma extremamente rápida as partículas são menores e ficam retidas na cavidade do

dendrímero103

.

A ampla distribuição de tamanhos que as sínteses de nanomaterias apresentam é um

problema para determinar a concentração exata que eles se encontram após a síntese. No

entanto, uma estratégia plausível que utiliza a espectroscopia de UV-VIS para determinar a

concentração de nanopartículas tem sido desenvolvida104

.

Outra estratégia para determinar a concentração molar de suspensões de

nanopartículas de ouro utiliza a razão entre número de átomos total pelo número de átomos

que constitui cada nanopartícula de ouro105

. O número médio de átomos que constitui cada

nanopartícula de ouro pode ser estimado pela determinação do diâmetro médio (D) das

nanopartículas, obtido por TEM. Com uma forma esférica e estrutura cúbica de face centrada

(fcc) o número médio de átomos de ouro (N) contidos em cada nanopartícula pode ser

estimado pela Equação 3105

.

(3)

Onde é a densidade para o ouro fcc (19,3 g cm3), é a constante de Avogadro e M

é a massa atômica do ouro (197 g mol-1

). A concentração molar (C) da suspensão de

nanopartículas de ouro pode então ser calculada (Equação 4) pela divisão do número total de

átomos (NTotal) de ouro, referente à quantidade de ouro adicionada na síntese, pelo número de

átomos de cada nanopartícula (N) estimado anteriormente, onde V é o volume da solução, e

considera-se que a redução de íons de ouro (III) tenha ocorrido completamente.

(4)

Assim a concentração inicial da suspensão de nanopartículas de ouro pode ser

calculada. Como as nanopartículas de ouro são lavadas por centrifugação antes da

conjugação, é importante fazer uma curva de calibração com diferentes concentrações. É

importante ressaltar que essas concentrações são apenas uma estimativa. No entanto, conhecer

a concentração é de extrema importância para uma padronização experimental. Essa

calibração (Figura 20b) foi obtida por meio da absorbância referente ao máximo da banda

plasmônica em várias concentrações da suspensão de nanopartículas (Figura 20a). Os dados

77

apresentados na Figura 20b foram ajustados linearmente, mostrando um coeficiente de

correlação de 0,9921, indicando que nessa faixa de concentração a absorção da banda de

ressonância plasmônica se comporta de forma linear com a concentração. A equação da reta

que relaciona esses dados está apresentada na Figura 20b.

400 500 600 700 800

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

Absorb

ância

Comprimento de onda / nm

4,10 nmol L-1

3,12 nmol L-1

1,56 nmol L-1

1,36 nmol L-1

0,33 nmol L-1

0,15 nmol L-1

Concentração

a)

Figura 20 – a) Espectro de absorbância das AuNP-PAMAM G4 em várias concentrações e b) Gráficos dos

valores de absorção máxima na banda de ressonância plasmônica de superfície (524 nm) em

função das concentrações, ajustadas linearmente.

5.2 Síntese e caracterização do conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo

5.2.1 Espectroscopia no Ultravioleta-Visível (UV-VIS)

As AuNP-PAMAM G4 foram conjugadas com o oligonucleotídeo específico para o

polimorfismo I/D do gene da ECA, como descrito anteriormente na metodologia. O

conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo livre, e as AuNP-

PAMAM G4 foram caracterizados por espectroscopia no UV-VIS (Figura 21).

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Ab

so

rbâ

ncia

Concentração / nmol L-1

Ajuste Linear

= 0,014 ( 0,013) + 0,153 ( 0,006)X

R2 = 0,9921

b)

78

255 340 425 510 595 680 765 850

0,0

0,5

1,0

1,5 AuNP-PAMAM G4

Oligonucleotídeo

AuNP-PAMAM G4/OligonucleotídeoA

bsorb

ância


Figura 21 – Espectro de absorbância no UV-VIS das AuNP-PAMAM G4, do oligonucleotídeo e do conjugado

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo.

Na Figura 21, o espectro de absorção no UV-VIS correspondente às AuNP-PAMAM

G4 (linha preta) mostra um máximo de absorção em aproximadamente 524 nm referente à

ressonância plasmônica da superfície, que é depende do tamanho e da forma da

nanopartícula106

. As nanopartículas de ouro esféricas (3 - 100 nm) apresentam a absorbância

máxima no UV-VIS na faixa de 510 a 570 nm2. Absorções na região de 520 nm estão

associadas com um diâmetro entre 10 a 15 nm, o que foi verificado nesse trabalho, por TEM e

DLS104

. Os ácidos nucleicos, DNA e RNA apresentam uma absorbância intensa na região

entre 240 e 275 nm, referentes aos anéis de pirimidina e purina das bases nitrogenadas107

. O

espectro de UV-VIS do oligonucleotídeo (Figura 21, linha vermelha) apresentou uma intensa

absorção em 260 nm, referente às bases nitrogenadas. Ainda na Figura 21, o espectro do

conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo apresentou de maneira intensa e bem

definidas, as duas bandas de absorção, aproximadamente em 260 nm e 524 nm, convenientes

com a banda de absorção das AuNP-PAMAM G4 e do oligonucleotídeo, sugerindo o sucesso

da conjugação.

79

200 300 400 500 600 700 800

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8 AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo

Solução

Sobrenadante

Ab

so

rbâ

ncia


Figura 22– Espectro de absorbância no UV-VIS da solução de síntese, do sobrenadante e do precipitado

ressuspendido (conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo).

Na Figura 22 são mostrados os espectros da solução de síntese após sua finalização, o

precipitado ressuspendido e o sobrenadante. Após a centrifugação, o espectro do precipitado

(linha preta) continuou exibindo a banda de absorção das AuNP-PAMAM G4 com um

pequeno deslocamento de aproximadamente 7 nm (de 524 para 531 nm ) e uma banda bem

definida do oligonucleotídeo em 260 nm, indicando a formação do conjugado AuNP-

PAMAM G4/Oligonucleotídeo. Esse deslocamento na banda de absorção das nanopartículas

está associado com alterações em sua superfície, e possíveis conjugações. Além disso, o

espectro do sobrenadante (Figura 22, linha azul) mostrou bandas de absorção com

intensidades mais baixas, quando comparadas com as bandas no espectro do precipitado

ressuspendido, o que indica que uma boa quantidade de oligonucleotídeo conjugou com as

AuNPs, de acordo com o espectro de solução (linha vermelha) que mostra a quantidade

excessiva colocada na síntese para a conjugação. No entanto, outros experimentos de

caracterização com DLS e FTIR foram realizados para corroborar esses resultados e agregar

um entendimento melhor da interação entre as AuNP-PAMAM G4 e o oligonucleotídeo.

80

5.2.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)

As medidas de DLS foram realizadas para analisar principalmente a distribuição de

tamanho de nanopartículas e conjugados envolvendo nanopartículas e biomoléculas, sendo

também uma técnica para investigar a interação entre as moléculas. Na Figura 23 são

mostradas as distribuições de tamanho obtidas por DLS das AuNP-PAMAM G4 e do

conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo livre não foi analisado

porque seu tamanho não se encontra no limite de detecção do equipamento. O diâmetro médio

das AuNP-PAMAM G4 (Figura 23a) foi de 10,4 ± 0,71, esse diâmetro foi superior ao

encontrado por TEM, como mencionado anteriormente, pelo fato do DLS ser baseado no

diâmetro hidrodinâmico das partículas88

. O conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo

(Figura 23b) apresentou um diâmetro médio de 17,44 nm ± 0,93, valor que sugere a

ocorrência de conjugação. Além disso, esse diâmetro médio era esperado, uma vez que a

sequência de oligonucleotídeo conjugada com as nanopartículas tem 25 bases, e entre cada

base existe um espaço aproximado de 0,34 nm. Portanto, com 25 bases a sequência

apresentaria, aproximadamente, 8,50 nm de comprimento linear. No entanto, o tamanho real é

atribuído à natureza do DNA, e é conhecido que DNAs sintéticos apresentam uma leve torção

ficando em formato Z, com redução dos espaços entre os giros e as bases do DNA108

.

Portanto, o seu tamanho real é menor do que o seu tamanho teórico.

Figura 23 – Histogramas da distribuição de tamanhos obtidos por DLS para as amostras a) AuNP-PAMAM G4 e

b) AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. As medidas foram realizadas em água ultrapura, pH entre

6,8 e 7,0.

6 9 12 15 18 21 24 27 300

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30

Núm

ero

de p

art

ícula

s


Ajuste Gaussiano

a)

15 30 45 600

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Núm

ero

de p

art

ícula

s


Ajuste Gaussiano

b)

81

5.2.3 Potencial Zeta

O potencial zeta das amostras AuNP-PAMAM G4, Oligonucleotídeo livre e AuNP-

PAMAM G4/Oligonucleotídeo estão apresentados na Tabela 6. Com descrito na metodologia

de síntese do conjugado no tópico 4.2.2, as nanopartículas de ouro foram lavadas duas vezes e

ressuspendidas em água ultrapura antes de serem submetidas à conjugação. Esse processo

torna as nanopartículas muito instáveis e aumenta a velocidade de agregação, diminuindo os

grupamentos aminas do PAMAM G4 que estavam protonados. Esse fato é evidenciado pelo

baixo valor de potencial ζ das AuNP-PAMAM G4. O potencial zeta do oligonucleotídeo livre

se mostrou altamente negativo, indicando estabilidade. Contudo, o potencial ζ do conjugado

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo indica que ocorreu um equilíbrio entre as cargas

superficiais dos compostos perto da faixa de estabilidade, pois potenciais acima de ± 30 mV

já acrescentam uma ótima estabilidade aos compostos109

.

Tabela 6 – Potencial Zeta obtido para as amostras: AuNP-PAMAM G4, Oligonucleotídeo livre e AuNP-

PAMAM G4/Oligonucleotídeo, em água ultrapura pH = 7,0.

Amostra Potencial ζ / mV

AuNP-PAMAM G4 + 2,88

Oligonucleotídeo livre - 41,00

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo -24,50

5.2.4 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR)

Com a finalidade de conhecer melhor a interação entre a nanopartícula e o

oligonucleotídeo, os espectros de FTIR (Figura 24) foram obtidos das amostras AuNP-

PAMAM G4, Oligonucleotídeo livre e AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. Os espectros

foram normalizados com a mesma linha de base e pela concentração.

82

Figura 24 – Espectros de FTIR das amostras AuNP-PAMAM G4, Oligonucleotídeo livre e AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo.

No espectro das AuNP-PAMAM G4 (linha preta) as bandas são referentes ao

estabilizante PAMAM G4. A transmissão em 3273 cm-1

é relacionada com estiramento

simétrico e assimétrico do grupo NH2. As duas bandas em formato dublete 1565 e 1652 cm-1

são referentes ao estiramento C = O e a deformação N-H/estiramento C/N das amidas

presentes na cavidade do PAMAM G4110

. No espectro do oligonucleotídeo livre (linha azul) a

banda em 1630 cm-1

corresponde aos grupos aminas110, 111

presentes nas bases nitrogenadas

do DNA (1700 a 1500 cm-1

). As bandas em 1059 e 1038 cm-1

são tipicamente atribuídas a

vibrações de ribose (C-C açúcar)111

presente na molécula de DNA e associadas com grupos

sulfitos 110

que estão na modificação no grupo fosfato do oligonucleotídeo (-S=P). Ainda no

espectro do oligonucleotídeo livre, a banda em 1223 cm-1

é relacionada com vibrações do

estiramento assimétrico do grupo fosfato (PO2-

)111

. A baixa intensidade é também um

indicador da modificação, que esse grupo apresenta devido às interações entre os três

elementos, S = P = O, uma vez que as duplas ligações oscilam entre o compostos30

. No

espectro do conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo (linha vermelha) a vibração

assimétrica do grupo fosfato PO2-

apresenta uma grande alteração, tanto na intensidade

quanto no deslocamento de 8 cm-1

(de 1223 para 1231 cm-1

). Essas alterações corroboram

com a proposta de interação nesse grupo. A banda em 1065 cm-1

no espectro do conjugado

corresponde à junção das duas bandas do oligonucleotídeo livre referentes à vibração da

83

ribose e grupos sulfitos em 1059 and 1038 cm-1

, que também indicam uma nova interação

nesses grupos110-111

. A absorção em 963 cm-1

é uma indicação da presença de DNA111

e a

banda em 1650 cm-1

é uma sobreposição das bandas da AuNP-PAMAM G4 em 1652 e 1565

cm-1

com a banda do oligonucleotídeo em 1630 cm-1

. As principais atribuições descritas estão

sumarizadas na Tabela 7. Pela análise dos espectros de FTIR das amostras é possível concluir

que a conjugação das nanopartículas de ouro com o oligonucleotídeo foi alcançada. Essa

interação ocorreu pelas amidas no interior do dendrímero das nanopartículas com o grupo

fosfato modificado do oligonucleotídeo. No entanto, com o intuito de investigar a

funcionalidade do conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo e saber se os

oligonucleotídeos estavam funcionais, mesmo depois de terem sido complexados com as

nanopartículas, esses conjugados foram utilizados em PCR em tempo real.

Tabela 7 – Principais atribuições propostas para as bandas encontradas na análise por espectroscopia no

infravermelho (FTIR).

AuNP-PAMAM

G4 Atribuições

Oligonucleotídeo

Livre Atribuições

AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo Atribuições

3273 cm-1

Amina NH2 1223 cm-1

Fosfato PO2 1231 cm-1

Fosfato PO2

1652 cm-1

Amida secundária 1630 cm-1

Aminas 1650 cm-1

Amidas e Aminas

1565 cm-1

Amida primária 1059 e1038 cm-1

Ribose (C-C) 1065 cm-1

Ribose (C-C)

5.2.5 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

A Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real é uma técnica frequentemente

utilizada para amplificar fragmentos de DNA, basicamente utilizando uma DNA polimerase e

sondas fluorescentes que se intercalam na dupla fita de DNA, e o resultado da amplificação é

simultâneo com a reação. Esta técnica é aplicada no sequenciamento de material genético para

diagnósticos112-114

. Pesquisadores desenvolveram uma combinação de sequenciamento capilar

e PCR em tempo real utilizando nanopartículas de ouro, que foram capazes de identificar

diversas alterações do DNA em regiões significativas de DNA genômico humano, essas

alterações são associadas com doenças relacionada a idade114

.

A PCR em tempo real foi realizada com o AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo e

com primer controle, oligonucleotídeo sem nanopartícula, que foram utilizados em

84

concentrações equivalentes para posterior análise, conforme a Tabela 5. Observamos na

Figura 25 os espectros de fluorescência, que correlacionam as unidades de fluorescência com

o número de ciclos da amplificação. As análises foram realizadas pelo software CFX

Manager™ da BIO-RAD. A curva do SYBR (linha preta) é a linha de base do fator

fluorescente utilizado na reação. Quando cada curva da amostra intersecciona essa linha e

continua aumentando proporcionalmente aos ciclos, é indicativo de que esteja ocorrendo

amplificação do DNA molde. As quatro reações mostradas na Figura 25 foram realizadas em

duplicata e foram amplificadas com sucesso pelos primers controles e também pelos

conjugados. Em particular, o conjugado na concentração de 0,30 µmol L-1

foram os mais

eficientes, comparados até mesmo com os primers controles. Os conjugados amplificaram

primeiro, a partir do ciclo 25,61, e os controles amplificaram a partir dos ciclos 27,69 e 29,50.

O AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo além de amplificar o DNA, apresentou um

desempenho melhor quando comparados aos primers controles, os quais estavam sem as

nanopartículas. Esses resultados indicam que o oligonucleotídeo, após a conjugação com as

nanopartículas de ouro, permaneceu estável e funcional. Dessa maneira, o conjugado AuNP-

PAMAM G4/Oligonucleotídeo foi empregado na construção do genossensor.

Primer 30 µmol L-1

Primer 30 µmol L-1

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo 30 µmol L-1

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo 60 µmol L-1

SYBR

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45-1000

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

RF

U

Número de Ciclos

Figura 25 – Espectros de fluorescência da PCR em tempo real. Unidades de fluorescência (RFU) em função do

número de ciclos de amplificação. Primer controle concentração de 0,3 µmol L-1

, variando a

concentração de DNA molde, linha cinza 0,15 µmol L-1

e linha azul 0,30 µmol L-1

. AuNP-

PAMAM/Oligonucleotídeo, linha vermelha 0,15 µmol L-1


de

conjugado e linha rosa 0,30 µmol L-1


de conjugado.

85

5.3 Desenvolvimento e caracterização do genossensor utilizando o AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo

5.3.1 Espectroscopia de Impedância Elétrica

A caracterização por espectroscopia de impedância elétrica foi empregada na etapa de

genossensoriamento do dispositivo construído em modelo de hibridização sanduíche,

utilizando com sonda marcada o conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. A escolha

da caracterização de perfil elétrico nas detecções do polimorfismo foi aplicada com o

propósito de estudar uma nova técnica de detecção, visto que, existe um interesse saturado em

genossensores com detecção eletroquímica50,115-118

. Assim, a caracterização elétrica na etapa

de detecção é de caráter inovador.

Os espectros de impedância estão em diagramas de Nyquist e representam a

componente real (Z’) e a componente imaginária (Z”) da impedância complexa. Neste

diagrama podemos visualizar a forma polar da impedância complexa119

. O semicírculo

formado representa um processo de condução. A região próxima de Z’ = Z’’= 0 é relativa a

altas frequências e quanto mais distante desta região menor será a frequência associada119

. No

limite ω → 0 temos Z’→ R, o efeito resistivo, e Z’’→ 0. Previamente, foi realizado um estudo

da resistência elétrica do eletrodo interdigitado (utilizado na construção do genossensor) em

concentrações diferentes do tampão TE, uma vez que o mesmo é utilizado nas medidas. Esses

resultados estão mostrados na Figura 26 e observa-se que aumentando a concentração, a

resistividade do sistema diminui. Para não influenciar nos resultados, foi utilizada a

concentração de 0,05 mol L-1

do tampão em todas as medidas, visando uma análise adequada

do sistema.

Nos espectros de impedância do genossensor, Figura 27, a resistência do genossensor

diminui de acordo com as etapas de hibridização, o que é atribuído às cargas superficiais do

DNA que facilitaram a permissividade da corrente. Observando a resistência do genossensor

após o mesmo ser colocado para hibridizar com uma sequência que não é complementar

(sequência negativa) com a sua sequência imobilizada e, portanto não hibridizando, a

resistência não alterou significativamente. Esse fato é importante no genossensoriamento para

evitar o risco de falso-positivo. Na etapa de detecção da sequência que apresentava a região

do polimorfismo com a nanopartícula, a resistência do dispositivo diminuiu pela metade,

86

indicando que o conjugado, AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo, hibridizou na sequência

alvo, a qual já estava ancorada no eletrodo. Assim, o uso do conjugado AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo na fase de detecção do genossensor amplificou o sinal elétrico,

diminuindo a resistência do dispositivo.

1 2 3 4

0,0

0,8

1,6

2,4

- Z

ima

g (

cm

2)

Zreal

( cm2)

b)

Figura 26 – a) Diagrama de Nyquist representando a impedância complexa de concentrações diferentes de

tampão TE e b) Diagrama de Nyquist com zoom na região de 0 a 4 KΩ cm2 da componente real da

impedância. As análises foram realizadas em tampão TE 0,05 mol L-1

pH = 7,4.

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

0,5

1,0

1,5

- Z

ima

g (

cm

2)

Zreal

( cm2)

b)

Figura 27 – a) Diagrama de Nyquist representando a impedância complexa das etapas de construção e detecção

do genossensor e b) Diagrama de Nyquist com zoom na região de 0 a 3,5 KΩ cm

2 da componente

real da impedância. As análises foram realizadas em tampão TE 0,05 mol L-1

pH = 7,4.

0 100 200 300

0

200

400

600

800

0,80 mol L-1

0,40 mol L-1

0,20 mol L-1

0,10 mol L-1

0,05 mol L-1

0,02 mol L-1

- Z

ima

g (

cm

2)

Zreal

( cm2)

a)

0 100 200 300 400 500

0

200

400

600

800

1000

1200 AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo

DNA Alvo

Sequência não complementar

Sequência de captura

Tampão TE 1X 0,05 mol L-1

- Z

ima

g (

cm

2)

Zreal

( cm2)

a)

87

5.3.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica

Espectroscopia de impedância eletroquímica tem sido usada em genossensores para

monitorar a transferência de elétrons que ocorre durante o processo de hibridização do

DNA120

. Essa detecção só é possível porque as moléculas que formam uma película sobre a

superfície do eletrodo, modulam o ambiente elétrico e eletroquímico da interface, que pode

ser detectado sob a forma de alterações nas capacitâncias ou nas taxas de transferência de

eletrônica121

. Além disso, a repulsão eletrostática e o impedimento estérico interfacial entre

uma carga de livre difusão de espécies redox e as cargas do grupo fosfato do DNA são

capazes de mudar a interface do eletrodo e, consequentemente, alterar as resistências e a

capacitância durante a detecção122-123

.

Os espectros de impedância eletroquímica de cada etapa do genossensor (Figura 28)

foram obtidos antes e depois de cada hibridização. Na etapa final (segunda hibridização)

foram avaliadas duas situações, no primeiro caso foi utilizado o conjugado AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo, e no outro o genossensor apenas com a sequência complementar sem a

nanopartícula. Os resultados estão apresentados na Figura 29 como diagramas de Nyquist. As

medidas foram realizadas com potencial 0,40 V em regime AC e potencial de 0,01 V e na

faixa de frequência de 0.1 Hz a 10 kHz em tampão PBS, pH 7,4 contendo 5 mM

[Fe(CN)6]3−/4−

.

Figura 28 – Etapas de detecção e construção do genossensor em modelo de hibridização sanduíche. Imobilização

por meio de SAMmix (sequência de captura + 2-ME), primeira hibridização com a sequência alvo e

segunda hibridização com o AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo.

88

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0

100

200

300

400

500

600 SAM

mix (DNA + 2-ME)

DNA Alvo

Sequência sem

AuNP-PAMAM G4

- Z

ima

g (

cm

2)

Zreal

( cm2)

a)

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0

100

200

300

400

500

600 SAM

mix (DNA + C

2OH)

DNA Alvo

AuNP-PAMAM G4 -

Oligonucleotideo

- Z

ima

g (

cm

2)

Zreal

( cm2)

b)

Figura 29 – a) Diagrama de Nyquist representando a impedância complexa do ensaio sem a utilização dos

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo no genossensor e b) Diagrama de Nyquist representando a

impedância complexa das etapas de construção do genossensor e detecção do AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo. As análises foram realizadas em tampão PBS, pH = 7,4 contendo 5 mM

[Fe(CN)6]3−/4−

.

Os espectros de impedância da Figura 29 mostram os diagramas de Nyquist para cada

etapa da construção e hibridização do genossensor. Os espectros referentes às sequências de

captura (SAMmix: DNA + 2-ME) em vermelho, e a primeira hibridização com a sequência

alvo em azul, mostram um aumento no semicírculo na região de alta frequência, o que indica

que o processo de transferência de elétrons foi dificultado devido a primeira hibridização,

ocasionando um aumento da resistência de transferência de carga83,124

. No entanto, a maior

diferença foi observada após a segunda hibridização com e sem a utilização do AuNP-

PAMAM G4/Oligonucleotídeo na etapa de detecção do polimorfismo, como mostra os

espectros em verde. Os espectros em verde da Figura 29 evidenciam uma diferença

significativa entre as resistências de transferência de cargas do genossensor com e sem o

AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. A Figura 29a mostra um semicírculo na região de alta

frequência do diagrama de impedância, indicando um comportamento de bloqueio para a

sonda [Fe(CN)6]3−/4−

, em comparação com a Figura 29b, no mesmo processo, quando utilizou-

se o conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo. Neste caso, a nanopartícula de ouro

presente no conjugado mostrou-se capaz de melhorar a transferência de carga da sonda

eletroquímica do seio da solução à superfície do eletrodo, o que resultou em menor resistência

de transferência de carga no genossensor.

As etapas de construção do genossensor combinadas com a técnica de impedância

eletroquímica e as mudanças observadas na Rct representam uma alternativa simples para a

89

análise da hibridização de sequências pequenas de DNA. No entanto, a confirmação da

formação secundária da sequência de DNA complementar é muito importante, especialmente

quando duas outras hibridizações estão envolvidas. Quando a sequência alvo foi ancorada

sobre a sequência de captura (SAMmix DNA + 2-ME) na superfície do eletrodo, uma segunda

camada foi formada, e os grupos fosfato carregados negativamente sobre a estrutura do DNA

alvo geraram repulsão elétrica no marcador de carga negativa redox, inibindo o processo de

transferência de carga interfacial e resultando em aumento de Rct. Neste caso, a repulsão

elétrica entre os grupos fosfato carregados da estrutura do DNA alvo e da sonda eletroquímica

([Fe(CN)6]3−/4−

) ocasionou o aumento da resistência de transferência de carga de 142 Ω para

259 Ω após a primeira hibridização (Figura 29a), e de 159 Ω a 203 Ω no genossensor (Figura

29b) na mesma etapa.

Com o intuito de observar a melhor concentração de sequência alvo para fazer a

detecção no genossensor, foi realizado um estudo em concentrações diferentes de sequência

alvo, como mostra os espectros da Figura 30. Os resultados foram observados em termos de

transferência de cargas da sonda [Fe(CN)6]3−/4−

, de acordo com a quantidade de sequências

alvo hibridizadas. A resistência à transferência de carga aumenta proporcionalmente ao

aumento da concentração de sequência alvo. As concentrações de sequência alvo de 30 e 40

nmol L-1

apresentaram a maior resistência de transferência de carga quando comparadas com

as outras concentrações. Neste caso, o valor máximo da parte imaginária da impedância, -

Zimag do genossensor foi de 445 Ω. Provavelmente nessas concentrações há uma saturação

entre as ligações das duas sequências complementares, isto é, todas as sequências de captura

disponíveis na superfície do eletrodo foram hibridizadas pela sequência alvo deixando

constante o valor de resistência de carga. No entanto, a concentração mínima que pode

promover uma modificação na transferência de elétrons foi de 10 nmol L-1

a qual apresentou

um valor de transferência de carga de 208 Ω sendo duas vezes menor que a observada para

uma concentração elevada. Esses resultados indicam que provavelmente uma interação

eletrostática, entre a sequência de captura e a sequência alvo, promove a neutralização da

carga significativa.

90

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0

100

200

300

400

500 SAM

mix (DNA + 2-ME)

1 nmol L -1

10 nmol L -1

20 nmol L -1

30 nmol L -1

40 nmol L -1

-

Zim

ag (

cm

2)

Zreal

( cm2)


sequência alvo (1, 10, 20, 30 e 40 nmol L-1

) após a primeira hibridização nos eletrodos modificados

com SAMmix (DNA captura + 2-ME). A linha em vermelho representa a impedância dessa

modificação. As análises foram realizadas em tampão PBS, pH = 7,4 contendo 5 mM [Fe(CN)6]3−/4−

.

Uma vantagem particular da utilização do AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo foi

demonstrado na impedância da segunda hibridização. Comparando os resultados para o ensaio

com e sem o conjugado, observou-se que o valor máximo da impedância real, Zreal, Figura

29b, foi de 298 Ω. O processo de transferência de carga e a resistência foram

significativamente reduzidos em comparação com o mesmo processo para o eletrodo normal

sem o conjugado, em que foi observado uma resistência de transferência de carga de 576 Ω.

Posteriormente, foi realizada uma análise de diferentes concentrações do conjugado, para

investigar a partir de qual concentração (de AuNP-PAMAM G4) é alcançada a propriedade de

facilitar a transferência de cargas no genossensor. Esses resultados são mostrados na Figura

31 em diagrama de Nyquist para concentrações entre 0,22 nmol L-1

e 2,21 nmol L-1

da

AuNP-PAMAM G4 presentes nos AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo utilizados na

segunda hibridização.

91

0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400

0

300

600

900

[AuNP-PAMAM G4](conjugado)

0,22 nmol L-1

0,87 nmol L-1

1,09 nmol L-1

1,31 nmol L-1

1,72 nmol L-1

2,21 nmol L-1

-Zim

ag (

)

Zreal

()


AuNP-PAMAM G4 presente nos AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo após hibridização com

sequência alvo ancorada (0,26 nmol L-1

) no eletrodo modificado com SAMmix (DNA + 2-ME). As

análises foram realizadas em tampão PBS, pH = 7,4 contendo 5 mM [Fe(CN)6]3−/4−

.

Como mostrado na Figura 31, o genossensor com o conjugado exibiu dois

comportamentos diferentes. No intervalo de concentração baixa, de 0,22 nmol L-1

a 1,31 nmol

L-1

, a resistência da transferência de elétrons aumentou. Isso era esperado porque a

concentração AuNP-PAMAM G4 é baixa, o que significa que as AuNPs nessa faixa de

concentração não influenciam na resistência de transferência de cargas do sistema. Com a

aplicação de uma concentração mais elevada (superior a 1,72 nmol L-1

) de AuNP-PAMAM

G4 no genossensor, resultou em um aumento na transferência de elétrons (menor Rct), o que

significa menos inibição das espécies redox e uma elevada sensibilidade.

Com o intuito de confirmar a presença de sequências de DNA imobilizadas nos

eletrodos, confirmando os resultados e para analisar a organização molecular, a microscopia

confocal de fluorescência foi realizada.

5.3.3 Microscopia Confocal de Fluorescência

A microscopia confocal de fluorescência foi realizada em cada etapa de construção do

genossensor (Figura 28). Cada etapa foi realizada em um eletrodo. Os eletrodos foram

92

submetidos a um banho de brometo de etídio, conforme descrito no tópico 4.5.7. As imagens

de cada etapa estão apresentadas na Figura 32. Como é possível visualizar, existe a presença

de DNA nos eletrodos. Além disso, em cada etapa ocorre um aumento na fluorescência,

indicando um aumento na quantidade de moléculas de DNA. A maior intensidade de

fluorescência ocorre na última etapa, na qual o modelo de hibridização sanduíche já está

concluído pela hibridização do AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo.

Figura 32 – Imagens de microcopia confocal de fluorescência das etapas de construção e detecção do

genossensor: a) Imobilização por meio de SAMmix (sequência de captura + 2-ME), b) Primeira

hibridização com a sequência alvo e c) Segunda hibridização com o AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo. Posteriormente cada etapa os eletrodos foram submetidos a um banho em

uma solução 0,1µg mL-1

de brometo de etídio e lavados em água ultrapura abundantemente. Escala

em amarelo (5µm).

Foram obtidas imagens de microscopia confocal de fluorescência em 3D, que estão

mostradas na Figura 33. Algumas diferenças estruturais interessantes foram observadas. A

sequência alvo é detectada por hibridização em modelo sanduíche com a sequência de captura

e a sequência presente no conjugado (AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo). O processo de

hibridização ocorreu em duas etapas. Na Figura 33a é observado a imagem de fluorescência

após a primeira etapa com a hibridização da sequência alvo, e nessa imagem é possível ver

que as moléculas de DNA estão bem distribuídas, e que ocorreu a primeira hibridização.

Além disso, a sequência imobilizada após a hibridização exibe um formato de “pilares”

(Figura 33a) com a base bem definida. Esse formato é devido a maior intensidade de

93

fluorescência emitida pela dupla fita de DNA formada na base do genossensor conforme o

esperado (Figura 28). A eficácia do sistema é mostrada na Figura 33b, após a segunda

hibridização com o conjugado específico para a região do polimorfismo estudado. Após a

hibridização, o sistema adquiriu um formato de “pinos de boliche” (Figura 33b)

correspondente ao formato de sanduíche empregado. Além disso, é possível observar uma

descontinuidade e a redução da emissão na região central das fitas, esse fato pode ser

atribuído a conformação do DNA, que se encontra em simples fita nessa região. Com isso, a

emissão do brometo de etídio é na faixa de 20 vezes menor, quando comparada a emissão da

conformação de dupla fita.

A distribuição das sequências de DNA foi homogênea com uma boa organização e orientação

das moléculas sobre a superfície do eletrodo, confirmando a proposta de moléculas de DNA

distribuídas sobre a superfície do eletrodo em torno das moléculas de 2-ME, formando um

sistema de organização com ilhas de material83

. Este padrão faz com que o genossensor seja

mais sensível, e apresente um comportamento bem definido na resistência de transferência de

carga.

Figura 33 – Microscopia confocal de fluorescência em 3D. Todos os eletrodos de ouro foram submetidos ao

banho de brometo de etídio posterior a modificação com um SAMmix contendo sequências de

captura e de 2-mercaptoetanol (2-ME). a) imagem obtida após a primeira hibridização com

sequência alvo e b) após a segunda hibridização com o AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo.

94

5.4 Desenvolvimento e caracterização do genossensor sem a utilização do AuNP-

PAMAM G4/Oligonucleotídeo

5.4.1 Detecção em Transistor de Efeito de Campo de Porta Estendida e Separada

(SEGFET)

A técnica de SEGFET vem sendo muito utilizada na detecção de sequências

complementares em dispositivos genéticos125

. A Figura 34 mostra como varia ID ao longo do

tempo antes e depois da imersão do eletrodo de Au modificado com SAMmix (sequência de

captura + 2-ME) por 30 minutos em uma solução contendo 5 µmol L-1

da sequência

complementar de DNA 5’GGCGAAACCACATAAAAGTGACTGT 3’. Ocorre um

decaimento do valor de IDS (aproximadamente 4,40 µA) em virtude do aumento das cargas

negativas após a hibridização126

. Ou seja, com ao aumento das cargas negativas, ocorre uma

repulsão de elétrons no canal do transistor e consequentemente, uma diminuição de IDS.

0 600 1200 1800 2400 3000

60

66

72

78

84

90

96 Sequência captura

Sequência alvo

I DS (

)

Tempo (s)

4,40 µA

Figura 34 – Curva de IDS tomada ao longo do tempo com sequência de captura (SAMmix) e depois de hibridizar

com a sequência alvo.

Outra maneira de caracterizar o processo de hibridização é por meio da medida das

curvas I x V características de um MOSFET antes e após ocorrer o processo de hibridização.

95

As Figuras 35 e 36 mostram como variam as curvas I x V (IDS x VDS, Figura 35 e IDS x VGS

Figura 36) antes e depois a imersão do eletrodo modificado na solução contendo 5µmol L-1

de

sequência complementar. O mesmo decaimento da corrente (~ 4,4 µA) é observado na Figura

36, corroborando os resultados da medida dinâmica. Entretanto, em termos de VGS, Figura 36,

ocorre um deslocamento da curva no sentido positivo de tensão, indicando uma tendência ao

aumento da voltagem de limiar do transistor. Em outras palavras, o aumento da carga negativa

após a hibridização tende a aumentar o valor da tensão mínima necessária para que o

transistor comece a operar.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,60

10

20

30

40

50

60

70


Sequência alvo

I DF (

uA

)

VDS

(V)

VGS

= 1,5 V

Figura 35 – Curvas características IDS x VDS do dispositivo SEGFET tomada da sequência de captura e depois da

hibridização com a sequência alvo.

96

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,60

5

10

15

20

25

30

35I D

S (A

)


Sequência alvo

VGS

(V)

VDS

= 0,2 V

Figura 36 – Curvas características IDS x VGS para um pequeno valor de VDS (VDS = 0,2 V) do dispositivo

SEGFET tomada da sequência de captura e depois da hibridização com a sequência alvo. O Inset

com zoom na região de 14 a 21 µA da corrente IDS.

Apesar dos bons resultados do genossensor com a imobilização SAMmix, passamos a

observar no decorrer dos experimentos que quando se usa uma sequência de DNA não

complementar, existe um sinal falso-positivo (resultado não mostrado), o que é indesejado em

sensores para aplicações clínicas. Esse resultado inesperado pode estar associado a alguma

reação entre o tiol imobilizado e a sequência não complementar, levando a um sinal elevado

da sequência negativa. Por isso, os mesmos experimentos anteriores foram repetidos para a

imobilização direta do DNA alvo no eletrodo de ouro sem a presença de tiol.

A Figura 37 mostra como varia ID ao longo da construção do genossensor: (1)

sequência imobilizada de captura + 5 µmol L-1

de tampão TE 1X, (2) solução contendo 5

µmol L-1

da sequência de DNA não complementar e (3) Finalmente em uma solução

contendo 5 µmol L-1

da sequencia complementar de DNA 5’

GGCGAAACCACATAAAAGTGACTGT 3’. Observa-se pela Figura 37a que não ocorre

mudança significativa na corrente durante as etapas 1 e 2. Por outro lado, na etapa 3

(hibridização), ocorre um decaimento de aproximadamente 2,60 µA. Apesar do sinal menor

em comparação com o sistema de imobilização utilizando SAMmix, o sistema não apresenta

um sinal significativo para a sequência negativa. Dessa forma, podemos concluir que de fato

pode ocorrer algum rearranjo de carga quando se utiliza tiol na imobilização. Os mesmos

1,29 1,32 1,35

14

16

18

20

I DS (A

)

VGS

(V)

97

resultados foram obtidos em termos das características I x V e são mostrados nas Figuras 37b

e 37c. Ou seja, uma diminuição do valor da corrente na curva IDS x VDS, e um deslocamento

da tensão no sentido positivo na curva IDS x VGS.

0 300 600 900

74

76

78

80

82

84a)

Tempo (s)

I DS (

) Sequência não complementar

Sequência de captura + TE 1X

Sequência alvo

2,60 µA

continua

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

0

20

40

60

80


Sequência alvo


I DS (A

)

VDS

(V)

b)

98

continuação

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

VDS

= 0,2 V

C)I D

S (A

)

VGS

(V)


Sequência alvo


Figura 37– a) Curva de IDS tomada ao longo do tempo com a sequência de captura, sequência não complementar

e depois da hibridização com a sequência alvo, b) Curvas características IDS x VDS do dispositivo

SEGFET tomada da sequência de captura, sequência não complementar e depois da hibridização

com a sequência alvo e c) Curvas características IDS x VGS para um pequeno valor de VDS (VDS = 0,2

V) tomada da sequência de captura, sequência não complementar e depois da hibridização com a

sequência alvo. O Inset (c) com zoom na região de 11 a 21 µA da corrente IDS.

Nesse sistema a detecção da deleção (fragmento Alu = 287 pb), que caracteriza uma

predisposição à hipertensão arterial foi obtida de forma direta utilizando o sensor SEGFET.

Esse sistema apresentou reprodutividade e especificidade, além de um ótimo perfil nas etapas

de detecção.

1,23 1,26 1,29

12

15

18

21a)

I DS (A

)

VGS

(V)

99

6 CONCLUSÕES

Os resultados desse trabalho mostram a importância de estudos com conjugados

envolvendo nanomateriais e biomoléculas, uma vez que suas propriedades associadas às

questões médicas podem criar novos métodos potencialmente eficientes, tanto no diagnóstico

como na terapêutica. Nesse caso, esses materiais foram empregados para o desenvolvimento

de um novo sistema de detecção da deleção do polimorfismo de inserção e deleção do gene da

ECA com potencialidade para diagnóstico avançado de predisposição à hipertensão arterial

sistêmica.

Na etapa de síntese e caracterização do conjugado AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo concluímos por meio das técnicas de TEM, UV-VIS e DLS que a rota

de síntese empregada, tanto para as nanopartículas de ouro, quanto para a conjugação com o

oligonucleotídeo foi eficiente. A conjugação das nanopartículas de ouro com a sequência de

DNA foi alcançada com sucesso. Essa conjugação ocorreu por meio de interações covalentes

entre os compostos, confirmadas pela espectroscopia no infravermelho (FTIR). Além disso,

por meio das técnicas de caracterização como potencial zeta, PCR em tempo real e UV-VIS,

observou-se que esse conjugado apresentou estabilidade e a sequência de DNA conjugada

permaneceu funcional, podendo o mesmo ser utilizado na construção de sistemas de detecção.

Foram analisados três sistemas de detecção, com arquiteturas e metodologias

diferentes: genossensor elétrico em modelo de hibridização sanduíche, genossensor

eletroquímico com SAMmix em modelo de hibridização sanduíche e genossensor em modelo

de hibridização direta. No primeiro sistema, os eventos de detecção elétrica do genossensor,

realizados por espectroscopia de impedância elétrica, se mostram específicos para a sequência

complementar, não hibridizando com sequências não complementares. Além disso, o

conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo amplificou o sinal diminuindo a resistência

de transferência de cargas, tornando o sistema menos resistivo.

No segundo sistema, os eventos de detecção foram realizados por espectroscopia de

impedância eletroquímica, a SAMmix empregada na imobilização da sequência de captura se

mostrou uma estratégia eficiente para a organização e orientação molecular, permitindo que as

sequências de DNA fossem ancoradas em torno da molécula de 2-ME. Esses resultados foram

evidenciados pelas imagens de microscopia confocal de fluorescência. Nas análises de

detecção utilizando a espectroscopia de impedância eletroquímica o genossensor teve o

100

mesmo comportamento que o primeiro sistema (elétrico), durante as etapas de detecção do

conjugado, diminuindo a resistência de transferência de cargas indicando a ocorrência na

hibridização.

No terceiro sistema (com detecção SEGFET), não foi empregado o conjugado, e,

portanto, o modelo utilizado foi de hibridização direta. Este sistema também foi eficiente para

detectar a sequência complementar ocorrendo um decaimento do valor de IDS em virtude do

aumento das cargas negativas do grupo fosfato, após a hibridização. Esse fenômeno foi

observado tanto no sistema com SAMmix, quanto na imobilização direta da sequência de

captura, com ótima reprodutibilidade. No entanto, não pode ser comparado com os outros dois

sistemas em que houve a utilização do conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo.

Pelo exposto, todas as etapas propostas nesse trabalho foram realizadas e os resultados

evidenciam o potencial de aplicabilidade, tanto do conjugado AuNP-PAMAM

G4/Oligonucleotídeo, quanto dos sistemas de detecção que podem ser utilizados como novas

plataformas de diagnósticos biomoleculares. Os genossensores apresentados nesse trabalho

foram construídos e otimizados para o polimorfismo de inserção e deleção do gene da ECA,

associado à predisposição à hipertensão arterial. No entanto, podem ser empregados para

qualquer patologia que apresente uma carga genética e/ou uma sequência estabelecida.

101

7 PERSPECTIVAS

Os conjugado AuNP-PAMAM G4/Oligonucleotídeo e as plataformas de detecções do

genossensor podem ser analisadas por microscopia de força atômica (AFM) e por

espectroscopia Ramam, para um estudo mais detalhado do arranjo superficial desses sistemas.

Os genossensores devem ser testados com os mesmos sistemas de detecção

diretamente em DNA genômico, mediante aprovação do comitê de ética em pesquisa

envolvendo seres humanos. O pedido ao comitê de ética já foi solicitado e está em andamento.

As análises em DNA genômico deverão ser realizadas após o tratamento de extração, no

entanto, sem a amplificação do gene, excluindo a etapa de amplificação por PCR. Dessa

forma, esperamos otimizar a utilização do genossensor, e, assim, aumentar o seu caráter social

e econômico. Após essas etapas o genossensor poderá ser proposto comercialmente.

103

REFERÊNCIAS

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116 ABAD-VALLE, P.; FERNÁNDEZ-ABEDUL, M. T.; COSTA-GARCÍA, A. DNA single-base mismatch study with an electrochemical enzymatic genossensor. Biosensors and Bioelectronics, v. 22, n. 8, p. 1642–1650, 2007. 117 LA-SCALEA, M. A.; SERRANO, S. H. P.; GUTZ, I. G. R. Eletrodos modificados com DNA: uma nova alternativa em eletroanálise. Química Nova, v. 22, n. 3, p. 417-424, 1999. 118 CHEONG, S.-K.; JONES, B. L.; SIDDIQI, A. K.; LIU, F.; MANOHAR, N.; CHO, S. H. X-ray fluorescence computed tomography (XFCT) imaging of gold nanoparticle-loaded objects using 110 kVp x-rays. Physics in Medicine and Biology, v. 55, n. 3, p. 647, 2010. 119 MACIEL, A. C. Propriedades elétricas de sólidos desordenados: aplicação em estruturas metal/polímero/metal. 2006. 56 p. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Física) - Universidade Federal do Piauí – UFPI, Departamento de Física, Teresina, 2006. 120 LISDAT, F.; SCHAEFER, D. The use of electrochemical impedance spectroscopy for biosensing. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 391, n. 5, p. 1555-1567, 2008. 121 CHANG, B.-Y.; PARK, S.-M. Electrochemical impedance spectroscopy.Annual Review of Analytical Chemistry, v. 3, n. 1, p. 207-229, 2010. 122 BONANNI, A.; ISABEL PIVIDORI, M.; CAMPOY, S.; BARBE, J.; DEL VALLE, M. Impedimetric detection of double-tagged PCR products using novel amplification procedures based on gold nanoparticles and Protein G. Analyst, v. 134, n. 3, p. 602-608, 2009. 123 GEBALA, M.; STOICA, L.; NEUGEBAUER, S.; SCHUHMANN, W. Label-free detection of DNA hybridization in presence of intercalators using electrochemical impedance spectroscopy. Electroanalysis, v. 21, n. 3-5, p. 325-331, 2009. 124 CANCINO, J.; MACHADO, S. A. S. Microelectrodes array in mixed alkanethiol self-assembled monolayers: electrochemical studies. Electrochimica Acta, v. 72, n. 1, p. 108-113, 2012. 125 POGHOSSIAN, A.; CHERSTVY, A.; INGEBRANDT, S.; OFFENHÄUSSER, A.; SCHÖNING, M. J. Possibilities and limitations of label-free detection of DNA hybridization with field-effect-based devices. Sensors and Actuators B: chemical, v. 111–112, p. 470-480, 2005. DOi:10.1016/j.snb.2005.03.083 126 STINE, R.; ROBINSON, J. T.; SHEEHAN, P. E.; TAMANAHA, C. R. Real-time DNA detection using reduced graphene oxide field effect transistors. Advanced Materials. v. 22, n. 46, p. 5297-5300, 2010.

127 WIRTH, J. Color Atlas of Genetics. San diego: George Thieme Verlag, 2001.

115

APÊNDICES

Apêndice A - Divulgação Científica e Tecnológica

Apresentações do trabalho

O trabalho foi apresentado na forma de pôster no X e XI Brazilian MRS Meeting da

Sociedade Brasileira de Pesquisa em Materiais - SBPMat, no Workshop anual do Instituto

Nacional de Eletrônica Orgânica - INEO, no 2º encontro da Rede Nanobiomed, na I e II

Semana Integrada da Física - SIFSC, na II USP Conference on Nanotechnology e na I Feira

de Inovação e Empreendedorismo - USPiTec. O trabalho também foi divulgado na forma de

palestra no 4º Café da Biotec Farma, evento realizado pela Interfarma e a Biominas, que visa

promover a interação e o diálogo entre indústrias farmacêuticas e empresas de biociências.

Além de apresentação em formato de palestra no 7º Congresso Internacional Científico

UNIARARAS, a convite da Fundação. É importante ressaltar que eventos como esse são

essenciais para a divulgação do nosso trabalho, e em especial dessa nossa nova linha de

pesquisa em genossensores. Além é claro de possíveis colaborações de sucesso.

Resumos publicados em anais de congressos

ROLIM, Thalita; Zucolotto, Valtencir. Gold nanoparticles functionalized with

oligonucleotides for application as genosensors in the advanced diagnosis of blood

hypertension. In: SOCIEDADE BRASILEIRA DE PESQUISA EM MATERIAIS,

SBPMat.; BRAZILIAN MRS MEETING, 10., 2011. Gramado. Resumos… Gramado:

SBPMat, 2011.

ROLIM, Thalita; ZUCOLOTTO, Valtencir. Synthesis and functionalization of

nanoparticles with oligonucleotides for application as genosensors in the early

diagnosis of blood hypertension. In: INSTITUTO NACIONAL DE ELETRÔNICA

ORGÂNICA, INEO, Workshop Anual, 2011. Atibaia. Resumos... Atibaia: INEO,

2011.

116

ROLIM, Thalita; ZUCOLOTTO, Valtencir. Utilização de nanopartículas

funcionalizadas com DNA na construção de genossensores. In: Rede

NANOBIOMED, encontro, 2., 2001. Águas de São Pedro. Resumos... Águas de São

Pedro: Rede NANOBIOMED, 2011.

ROLIM, Thalita; ZUCOLOTTO,Valtencir. Development of genosensors containing

functionalized oligonucleotides and AuNPs for early diagnosis of blood hypertension.

In: SIFSC, Semana Integrada da Física, 1., 2011. São Carlos. Resumos... São Carlos:

SIFSC, 2011.

ROLIM, Thalita; CANCINO, Juliana; ZUCOLOTTO, Valtencir. DNA detection using

AuNPs/oligonucleotides nanocomplexes. In: SOCIEDADE BRASILEIRA DE

PESQUISA EM MATERIAIS, SBPMat.; BRAZILIAN MRS MEETING, 11., 2012.

Florianópolis. Resumos... Florianópolis: SBPMat, 2012.

ROLIM, Thalita; CANCINO, Juliana; ZUCOLOTTO, Valtencir. DNA Detection

using AuNPs-oligonucleotide nanocomplexes in a genosensor device. In: SIFSC,

Semana Integrada da Física, 2., 2012. São Carlos. Resumos... São Carlos: SIFSC,

2012.

ROLIM, Thalita; CANCINO, Juliana; ZUCOLOTTO, Valtencir. Developing a

Nanostructured Genosensor for Early Diagnosis of Systemic Arterial Hypertension.

In: Conference on Nanotechnology, 2. 2012. Itirapina. Resumos... Itirapina:

Conference on Nanotechnology, 2012.

Apresentações Orais

ROLIM, Thalita; ZUCOLOTTO,Valtencir. Genossensor para diagnóstico avançado da

hipertensão arterial utilizando conjugados contendo nanopartículas e DNA. In: Biotec

Farma, 4. 2011. São Carlos. Palestra... São Carlos: Biotec Farma 2011.

ROLIM, Thalita; ZUCOLOTTO,Valtencir. In: 7º Congresso Internacional Científico

UNIARARAS. Araras, São Paulo, 14 de Junho de 2012. Palestra... Araras: 7º

Congresso Internacional Científico UNIARARAS 2012.

Artigos

ROLIM, Thalita; CANCINO, Juliana; ZUCOLOTTO, Valtencir. A Nanostructured

genosensor for the early diagnosis of systemic arterial hypertension. Analytical Chemistry

(submetido).

117

ANEXOS

Anexo A - Mapa gênico

Gene enzima conversora de angiotensina 1 (ECA) ID: 1636

HOMO SAPIENS ANGIOTENSIN I CONVERTING ENZYME (PEPTIDYL-

DIPEPTIDASE A) 1 (ACE), REFSEQGENE ON CHROMOSOME 17

NCBI Reference Sequence: NG_011648.1

FASTA Graphics

Go to:

LOCUS NG_011648 21320 bp DNA linear PRI 11-MAR-2011

DEFINITION Homo sapiens angiotensin I converting enzyme (peptidyl-dipeptidase

A) 1 (ACE), RefSeqGene on chromosome 17.

ACCESSION NG_011648 REGION: 4989..26308

VERSION NG_011648.1 GI:225543278

KEYWORDS RefSeqGene.

SOURCE Homo sapiens (human)

ORGANISM Homo sapiens

Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;

Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;

Catarrhini; Hominidae; Homo.

COMMENT REVIEWED REFSEQ: This record has been curated by NCBI staff. The

reference sequence was derived from AC113554.9.

This sequence is a reference standard in the RefSeqGene project.

Summary: This gene encodes an enzyme involved in catalyzing the

conversion of angiotensin I into a physiologically active peptide

angiotensin II. Angiotensin II is a potent vasopressor and

aldosterone-stimulating peptide that controls blood pressure and

fluid-electrolyte balance. This enzyme plays a key role in the

renin-angiotensin system. Many studies have associated the presence

or absence of a 287 bp Alu repeat element in this gene with the

levels of circulating enzyme or cardiovascular pathophysiologies.

Multiple alternatively spliced transcript variants encoding

different isoforms have been identified, and two most abundant

spliced variants encode the somatic form and the testicular form,

respectively, that are equally active. [provided by RefSeq].

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/225543278?report=fasta

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/225543278?report=graph

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_011648.1?from=4989&to=26308&report=genbank#goto225543278_0

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_011648

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=9606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/24414535

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/RSG

118

PRIMARY REFSEQ_SPAN PRIMARY_IDENTIFIER PRIMARY_SPAN COMP

1-27546 AC113554.9 106127-133672 c

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..21320

/organism="Homo sapiens"

/mol_type="genomic DNA"

/db_xref="taxon:9606"

/chromosome="17"

/map="17q23.3"

gene 1..21320

/gene="ACE"

/gene_synonym="ACE1; CD143; DCP; DCP1; MGC26566; MVCD3"

/note="angiotensin I converting enzyme

(peptidyl-dipeptidase A) 1"

/db_xref="GeneID:1636"

/db_xref="HGNC:2707"

/db_xref="MIM:106180"

mRNA join(1..283,871..1038,1947..2040,2709..2852,3277..3468,

4031..4128,4506..4678,5406..5629,5969..6113,6400..6498,

6789..6911,7270..7481,8176..8312,9497..9655,9926..10013,

11588..11731,11881..12072,13894..13991,14149..14321,

16376..16599,16862..17006,17312..17410,19334..19456,

19738..19925,20077..21320)

/gene="ACE"


/product="angiotensin I converting enzyme

(peptidyl-dipeptidase A) 1, transcript variant 1"

/transcript_id="NM_000789.3"

/db_xref="GI:307691163"




exon 1..283

/gene="ACE"


/inference="alignment:Splign:1.39.8"

/number=1

CDS join(35..283,871..1038,1947..2040,2709..2852,3277..3468,

4031..4128,4506..4678,5406..5629,5969..6113,6400..6498,

6789..6911,7270..7481,8176..8312,9497..9655,9926..10013,

11588..11731,11881..12072,13894..13991,14149..14321,

16376..16599,16862..17006,17312..17410,19334..19456,

19738..19925,20077..20306)

/gene="ACE"

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=9606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=1636

http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?hgnc_id=2707

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/106180

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/307691163




119


/EC_number="3.4.15.1"

/note="isoform 1 precursor is encoded by transcript

variant 1; kininase II; CD143 antigen; angiotensin

converting enzyme, somatic isoform; peptidase P;

carboxycathepsin; dipeptidyl carboxypeptidase 1;

testicular ECA; dipeptidyl carboxypeptidase I"

/codon_start=1

/product="angiotensin-converting enzyme isoform 1

precursor"

/protein_id="NP_000780.1"

/db_xref="GI:4503273"

/db_xref="CCDS:CCDS11637.1"




exon 871..1038

/gene="ACE"



/number=2

exon 1947..2040

/gene="ACE"



/number=3

exon 2709..2852

/gene="ACE"



/number=4

exon 3277..3468

/gene="ACE"



/number=5

exon 4031..4128

/gene="ACE"



/number=6

exon 4506..4678

/gene="ACE"


http://www.expasy.org/enzyme/3.4.15.1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4503273

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi?REQUEST=CCDS&DATA=CCDS11637.1




120


/number=7

exon 5406..5629

/gene="ACE"



/number=8

STS 5406..5541

/gene="ACE"


/standard_name="GDB:631894"

/db_xref="UniSTS:158439"

STS 5462..5596

/gene="ACE"


/standard_name="G59596"


exon 5969..6113

/gene="ACE"



/number=9

exon 6400..6498

/gene="ACE"



/number=10

exon 6789..6911

/gene="ACE"



/number=11

exon 7270..7481

/gene="ACE"



/number=12

exon 7757..8006

/gene="ACE"



/number=13

exon 8176..8312

/gene="ACE"

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/sts.cgi?uid=158439


121



/number=14

exon 9497..9655

/gene="ACE"



/number=15

STS 9548..9690

/gene="ACE"


/standard_name="PMC310924P2"


exon 9926..10013

/gene="ACE"



/number=16

STS 11422..11612

/gene="ACE"


/standard_name="GDB:186915"


exon 11588..11731

/gene="ACE"



/number=17

exon 11881..12072

/gene="ACE"



/number=18

exon 13894..13991

/gene="ACE"



/number=19

exon 14149..14321

/gene="ACE"



/number=20

STS 14157..14313



122

/gene="ACE"


/standard_name="ACE"


exon 16376..16599

/gene="ACE"



/number=21

exon 16862..17006

/gene="ACE"



/number=22

exon 17312..17410

/gene="ACE"



/number=23

STS 19319..19441

/gene="ACE"


/standard_name="PMC310924P3"


exon 19334..19456

/gene="ACE"



/number=24

exon 19738..19925

/gene="ACE"



/number=25

STS 19755..19879

/gene="ACE"


/standard_name="RH17589"


exon 20077..21320

/gene="ACE"



/number=26




123

STS 21096..21197

/gene="ACE"


/standard_name="SHGC-57821"


ORIGIN

1 agaaggggca gagccgagca ccgcgcaccg cgtcatgggg gccgcctcgg gccgccgggg

61 gccggggctg ctgctgccgc tgccgctgct gttgctgctg ccgccgcagc ccgccctggc

121 gttggacccc gggctgcagc ccggcaactt ttctgctgac gaggccgggg cgcagctctt

181 cgcgcagagc tacaactcca gcgccgaaca ggtgctgttc cagagcgtgg ccgccagctg

241 ggcgcacgac accaacatca ccgcggagaa tgcaaggcgc caggtgggcg cccgggcccg

301 ggcgggggcg gggcggggcc gcggcggcca atcacagcac gcggccggct tgtggggcgg

361 gcaggctggc gcccccgacc cgaaccccac cccgaccccg gaccctcgcc ccgacagtca

421 gccgcggggc ccgagcgccg ggctgcgcgc acggcctgcg ctcccagcat gcacgagttg

481 gatggatgag ggtggctgct cccaggccgc gcccgccttc gccgaaggtg ctgggcttgg

541 ctctggggcc cccgcgctct cgggcagctg ccttctcacc tccggacgct gtcgctgtca

601 ccgtcaccgc actgcactgt ccatccaccc tccactcgcc cggcctcttt tctggtccca

661 atttctgctc caccattccc atgaggcaga ttccctccag aaggaggaag cgcggcttcc

721 gcaaactaag gtctcccgca gggatctccc cagggcccgg gctctggaag cccttggcct

781 tcctcccctc ccccagcacc gtggcttctc ctttatggcc tgcatctaag cagggtccta

841 caccctccct gccctcctgg tgcccaatag gaggaagcag ccctgctcag ccaggagttt

901 gcggaggcct ggggccagaa ggccaaggag ctgtatgaac cgatctggca gaacttcacg

961 gacccgcagc tgcgcaggat catcggagct gtgcgcaccc tgggctctgc caacctgccc

1021 ctggctaagc ggcagcaggt gggctgaggg ctgaggcaga gctcgggggc ggcctcctag

1081 tgccccatcg tgggggtcgg gggagagcag cccatcaggg agggaggaac cctgggatcc

1141 acatgggccc tgacagaagg gaaagcccag gtaagcacag aatggctttc tgagcattga

1201 tttttcttgg agatggggtg gggagttact ttctgttaaa ggaagcattc tggagtagga

1261 agccaaattc aaatacactt ctccctaggc tggtttatga gcttctttgg aagagttgag

1321 aagggctggg cgtggtggct caagcctgta atcccagcac tttgggaggc tgaggtgggc

1381 gcatcgcttg agcccaggag ttcaagacca gcctggccaa catggcaaaa cctcgtctct

1441 acaaaaaaaa aatagctggg cttggtggtg cgtgcaccta cagtcccagc tactcttgaa

1501 actgaggggg aaggatcacc tgagcccagg aggtcaaggc tacagtgagc tgtgattgca

1561 ctactgcacc ccagcctgcg tgacagagtg agacctcccc ccaaaaaaaa gagagagaga

1621 aaaggttgag aaagactggg aagtcaccaa agccagagaa tgggagggat ctgccctcac

1681 tgcagggtgg tgccaagctg ggacttgacc ctgaccctga ctttcaggac tcctgtcccc

1741 cactccacag gctgcctcca ctggcagggg actcagaagt gatccggtca cactaagtga

1801 cacttagtga tcagaagtgc cccggtgcca ctgagtggcc ttgtccaagc tacatccact

1861 ctgtgggctc ctccttctag cagcgagggg agggcagatg tcccaggggc tggtcactgg

1921 agcattcctc ccctctgact ccccagtaca acgccctgct aagcaacatg agcaggatct

1981 actccaccgc caaggtctgc ctccccaaca agactgccac ctgctggtcc ctggacccag

2041 gtacggccct tgcagctccc ctctcggcgg tgccctagtg ttcccacatt gccctgctgc

2101 actccagacc atgcagttgt gtagggtctg tggagacagc aggtaaaccc aaaggtgttg

2161 ccctccaact ggggctggac ggtgcagata cccccacgcc ctgcttctct tggcaagtgg

2221 acttccggaa tctccagctg cagcccccac ttctgtgtgt acctcggcct ctcccatcac


124

2281 ccctaggcct tcctcctggc tgcctggttt cccctttcgt gggtcctctc atgttcccca

2341 agagccctca ggccagggac ccctcgtggc ttccccttaa accccgctcc agcccccttt

2401 atgagcagct tcgaggaagg cactccatcc aataggccgc taagtgtctg tctgggtttt

2461 ggcctttggg tgtccccttg gtgtcagcca ccttaggtgg tcatgtctct ggggcagggg

2521 ccctgcctgg gtgtttctgt agctcccagc cccctcccac caggcctgta ggtggcccct

2581 gtctctgggg gcaccgtgat gttcaggaag ctggtgggag cagtaaggac tggtgcaggc

2641 tctggtgaag gccgttgaag acttcaacgt ggaggcctcc tcaccgaccc tgcctgcctg

2701 tgtctcagat ctcaccaaca tcctggcttc ctcgcgaagc tacgccatgc tcctgtttgc

2761 ctgggagggc tggcacaacg ctgcgggcat cccgctgaaa ccgctgtacg aggatttcac

2821 tgccctcagc aatgaagcct acaagcagga cggtgagcag gcctctccct gtccaggaac

2881 cacgccaggt gtcctctctc agctgtctcc ccagagtccc agcccagagt caggcagagc

2941 agctggtatg acaattccag caggccctga gtttcccaga aagtggaggt gggaccggcc

3001 tgcacccagt gtgcctggac tttgctgctg gcctgcccca cgtggccatc ctgctgtcac

3061 tcctggccct gatgctcctc tttgcctctg ggaacctcca ggatctgttt agctggctgt

3121 agctaattag aaattgtaga gtggcaaccc ccaagccaat tttccagcta gctgcagatc

3181 cacgggcctc gagccagtgg aagagccgac ttacagctga gaggctgagg tccgagcctt

3241 tggcctgagc tacatacctc acccccacgc ccccaggctt cacagacacg ggggcctact

3301 ggcgctcctg gtacaactcc cccaccttcg aggacgatct ggaacacctc taccaacagc

3361 tagagcccct ctacctgaac ctccatgcct tcgtccgccg cgcactgcat cgccgatacg

3421 gagacagata catcaacctc aggggaccca tccctgctca tctgctgggt aaggacctgg

3481 cctcgcctcc acatgagtcc cacggaagtg tgggtcccga ggtaggggtg ggggatgtcc

3541 agggtaaggg aaggtgggtt gtgaccctca catctcacat gtgtggggca tcatactgtt

3601 tgcttcacat gcaggagacc attcgtgttc ccactttaca ggtggggacc ctgaggctta

3661 gggtcgtgag ggacttagtg gtcagagagc taggggccaa accaaaggct ctggccctgg

3721 gtccagtggg ggagccatca gcctagctca tgcccaagga aacaagcact gtggccctgc

3781 ctcaggattg agtggctggg gcctggcaca gccagaaatg acagtggcag catcttgcag

3841 ccccaggaca tgtggccctc ggaggagtgt gggtgggact gatgtgtgag atttctggcc

3901 ctaagccagg cctgcagccc ttgagggccc cagggtacag gtgccggccc cagggtgcca

3961 ctcagcgatg catgaagaag caggcacagc caggcaggga gccaagctgt ccccttcctt

4021 ccttatctag gagacatgtg ggcccagagc tgggaaaaca tctacgacat ggtggtgcct

4081 ttcccagaca agcccaacct cgatgtcacc agtactatgc tgcagcaggt aagctctggg

4141 ctcaagcctg gggtggtggg ggtcgggggt ggggcgcaaa aaaagggagt cacagatggg

4201 cacaggggcg ggaaggtttc gggtactgag cagcagcctg gtgtgtctgt aggagcagtg

4261 agctggggtc ggccccctca gtgaggtgcc agctcctccc tccaggctcc acagtggcag

4321 gatgagagca acaacgcact ttcactcatc tgctgtggga gtgagggccc tgcctctggg

4381 aatggtggcc acagagcaga gaagctttca tgcacaggga gttgacccga gatggggacc

4441 ccagccctgt ccccaggcca gccagagtgg gctccccctg acctggctcc acacccctcc

4501 tccagggctg gaacgccacg cacatgttcc gggtggcaga ggagttcttc acctccctgg

4561 agctctcccc catgcctccc gagttctggg aagggtcgat gctggagaag ccggccgacg

4621 ggcgggaagt ggtgtgccac gcctcggctt gggacttcta caacaggaaa gacttcaggt

4681 tcagacatgg gaagagcacg ttctggggtt ccccggttct ggggcccggg gaaaggcagg

4741 cagcccaggc gcagggaagc tggttcccag gcctgcctct accctacccc agcactggtt

4801 ggaggctggg tctgttccag ggctaggggg tataggaggc ctattagtcc accttctctg

4861 gcagctttga caaatagtca cttctatacc ttggaatgga ggaagaaggc ccaagtggtg

125

4921 gtgagccagg gcagggtaaa gaatttgctt gtttctgcca ggcacggtgg tcacacctgt

4981 aatcccagca ctttgggagg tcaaggcggg tggatcacct gaggccagga gttcgagacc

5041 agcctggcca acatggcgaa accccgtctc tactaaaaat acaaaaataa attagccagg

5101 ggtgatggcg ggcgcctgta atcccagcta ctcaggaggc tgaggcagga gaatctcttg

5161 aacccgggag gcggaggttg cagtgagctg agattgtgcc actacaggcc agcctgtgca

5221 aaagagtgag acgctgtctc aaaaaaaaaa aagaaaaaaa gaagttactt gtttctactg

5281 cggcttcatg ccccagggca gctccctcct cattcctgtc tttcaggtgc caatctgccc

5341 tgtgccctgg ccctgccctg ttctgtccat ccgtcactct caccctcgcc ctctctacgc

5401 cccaggatca agcagtgcac acgggtcacg atggaccagc tctccacagt gcaccatgag

5461 atgggccata tacagtacta cctgcagtac aaggatctgc ccgtctccct gcgtcggggg

5521 gccaaccccg gcttccatga ggccattggg gacgtgctgg cgctctcggt ctccactcct

5581 gaacatctgc acaaaatcgg cctgctggac cgtgtcacca atgacacggg tatgggaggg

5641 ctgagaggcc cccacccagc ctcacctaaa ccccgctcca ccccacagca ggacctcact

5701 tgccccactc agctctgccc ttctttctgc ctcccggccc caggtcaggc agggttcggg

5761 atcctcctag agcctcacgg tgcacactgc gcccagctca gcacacctgg gggtcctctt

5821 ccaagcaggg cccagggtct cgagggccag ccataccttc tctgcatctc cctggcctca

5881 ctttctgctg ccccgccagc ccacactctt aggggaccct cttctccctc tgacctcttc

5941 cctctccttt catctcatct cccaacagaa agtgacatca attacttgct aaaaatggca

6001 ctggaaaaaa ttgccttcct gccctttggc tacttggtgg accagtggcg ctggggggtc

6061 tttagtgggc gtaccccccc ttcccgctac aacttcgact ggtggtatct tcggtgagag

6121 gagggataga aaagccttcg ccccagctag ccctccccag cctcctggac agccaggcgc

6181 ctcctgcccc agccagttct agcctctcct ctctaatgat gtcccccgct gtgacccacc

6241 gccttctcct ttcctgcctg aaactccctc ttccaggaag tcttccccag ttcctcagga

6301 tggggaaggg ttgccgggtg gaaatgcctt ttctacaaaa gttaaatcca tctgtttgca

6361 acctctaggc cctaagacaa tttaaccatc cttttccaga accaagtatc aggggatctg

6421 tcctcctgtt acccgaaacg aaacccactt tgatgctgga gctaagtttc atgttccaaa

6481 tgtgacacca tacatcaggt attagcgccc ccaccccacc cacccccagt actgtcacac

6541 cctcaatcca cttctcctcc tgtgatccta gctgcctcat ccccagggct tgtccccatg

6601 ctcctccaga cctcaaaggc ctggagttag agtggcccac tctcctgagc ctgtcttggg

6661 tctcccttct cccccaagat agcttctggt ccagcctctg ccctgcagga agctggatgg

6721 tgcctgggta aggaacccct gttcctggcc ccccatgatc ttccctgact cccaccctgt

6781 gcctgcaggt actttgtgag ttttgtcctg cagttccagt tccatgaagc cctgtgcaag

6841 gaggcaggct atgagggccc actgcaccag tgtgacatct accggtccac caaggcaggg

6901 gccaagctcc ggtgtgtggt gggaagccgg gggaagtggg aggcagagag gagcggctgg

6961 caaagggtgt ggcaggaggt gtctggctgc tctgatgggg tggggggcac caaccacaga

7021 gctggactga tgtggatgcc tgtctcctcg ctatgtcatc aaatatttat tgagtgggcc

7081 ttctggctgg catggggcga cacaaatgcc ccctgccacc atcagagaga tcccaggccc

7141 cagggtctta ttgccacagt ttctgcagtc cattgggggg cggaagtggc caggggcatg

7201 tgggccgggg tccaggagca gactccagcc tgagtcccct gtgcccatgg tacccactct

7261 gcccaccagg aaggtgctgc aggctggctc ctccaggccc tggcaggagg tgctgaagga

7321 catggtcggc ttagatgccc tggatgccca gccgctgctc aagtacttcc agccagtcac

7381 ccagtggctg caggagcaga accagcagaa cggcgaggtc ctgggctggc ccgagtacca

7441 gtggcacccg ccgttgcctg acaactaccc ggagggcata ggtaaagccc tgagtgagga

7501 tggtgtgggg ctaaggtggg tcctcaactc tgggcttggc ccaggcccca ggttcctggt

126

7561 cagctcctac cagctgagcc ctggtaccct gtcctggagg gccaggcagc cccccaagct

7621 catcagcagg gcctgcgagt ggggacaggc atgtctttcc cccagcatcc tagagagggt

7681 gtgctcagac ctgagggccc ctccccttcc agaggaagcc agacacaagg ctctgtgagg

7741 tcacactgcg ggctccgctc ttattggcca ggggacggta gctgcaggac tctgctctcc

7801 tgcggccatg ggccagggtt gggctactgc aggacttccc agcctcctct tcctgctgct

7861 ctgctacggg caccctctgc tggtccccag ccaggaggca tcccaacagg tgacagtcac

7921 ccatgggaca agcagccagg caacaaccag cagccagaca accacccacc aggcgacggc

7981 ccaccagaca tcagcccaga gcccaagtgg gaccatgcag gggaggggca gggtgccagg

8041 ggtgggagag gcggggccgg gtagggacag ggcagggtac aagggagtgc gagagggata

8101 atggcttctg gtgagaccac aaacctggag aggggaggca gaggtttgtc tgtttccctg

8161 cactctgtcc cacagacctg gtgactgatg aggctgaggc cagcaagttt gtggaggaat

8221 atgaccggac atcccaggtg gtgtggaacg agtatgccga ggccaactgg aactacaaca

8281 ccaacatcac cacagagacc agcaagattc tggtgggagc cacctcccca cccccaaacc

8341 tgagcatgtg catacacaca gagatgctgt cccgctcacc acacagtggg gctgccacca

8401 cattttaaat tgaatattta aaacaatact caatttcggg ccgggcgcgg tggctcacgc

8461 ctgtaatccc agcactttgg gagggggagg cgggcggatc acgaggtcag atcaagacca

8521 tcctggctaa cacggtgaaa ccccatctct agtaaaaata caaaaattag ccgggtgtgg

8581 tggcgagcac ctgtagtccc agtactcagg aggctgaggc aggagaatgg catgaacccg

8641 ggaggcagag cttgcagtga gccgagatgg caccactgca ctccagcctg ggcgacagag

8701 cgagactcca tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aactcaattt cagattttga tgaacattta

8761 ctcaatgcct gagcaattct tctttcctta aaaatcagtc tctgggaggc ctaggtggga

8821 ggatcacttg aagccaggag ttggagacta gcctgggcaa catagcaaga tcccatctct

8881 attcaaacaa acaaataaac aaaaatcaat ctctagtaac agaataattt gtacataaat

8941 aagtggtgct caagtcgttt tttaaaagat tgaaagcctc tgtttgtctc ctctacaaaa

9001 ggggctacac ttcctcttta ccctcattcc ctgcctattt ggctgagcac aaattatgcc

9061 actgagccac acactgttac tgttccttgg cactttgatc tgttgcctca tctttttctc

9121 aacagccttg caaaattggt gagcttattc ccattttaca gatgggattt gatattaact

9181 ctgaggttca gaaaggccac agagctaata ccaagctggc tccttcctaa gggcctttac

9241 gacacttggg ggtcttctct tctctgcccc tgcctggata tgtgttgctt gaccgcaggc

9301 atccagggag ggtgagtact gcatccagga cgttatcagc gtccagcttg cagagagtct

9361 tataggcaaa ggttgcaact taattccact gccccctcac caccacctcc agccctcagc

9421 tcccacttgg ggcctcccgc tcagaggctg ctctggagct cctgggccct gtgacaccat

9481 ccccctgtgc cctcagctgc agaagaacat gcaaatagcc aaccacaccc tgaagtacgg

9541 cacccaggcc aggaagtttg atgtgaacca gttgcagaac accactatca agcggatcat

9601 aaagaaggtt caggacctag aacgggcagc actgcctgcc caggagctgg aggaggtgtg

9661 tggctcgcaa ggtacaggga gaggggaatc ctggggcagt gagcccaaca cagggtctgg

9721 cctggccttc acgctgcttc ctcttcctcg ttgtatcaag tcatggcatc tgccatgcga

9781 tgtgcacctc agaactgctg agagggcagc gctccccagc tccctggctc cccacctgcc

9841 agcccatggg gcctgggggt agtgcaggcc ccagagagac caagtgcaaa ggagtacagc

9901 tcattgcctc tccttcctcc tgcagtacaa caagatcctg ttggatatgg aaaccaccta

9961 cagcgtggcc actgtgtgcc acccgaatgg cagctgcctg cagctcgagc caggtgagag

10021 ctcatgtgca ggctgagtga gaggcgaggg ctgggactgg catggggccc gggggtgctg

10081 ggtgagagca cagagttggg ttcccctcgc tcttggggtc agcgtgccca ggaaatgccc

10141 tttcttgttt tccacgaggg gggcttctct gccccactga gagccggcac ctacttcata

127

10201 ccatgccccg atcagctgcc cctccctcag aaccgccctc tgcttaaggg tgtccactct

10261 ctcctgtcct ctctgcatgc cgcccctcag agcagcggga tctcaaagtt atatttcatg

10321 ggcttggact ccaaatgggg ggaactcggg gacactagct ccccccggcc tcctttcgtg

10381 accctgccct tgacttcctc accttctctg tctttcctga gcccctctcc cagcatgtga

10441 ctgataagga aattgagtca cacagcccct gaaagcgcca gactagaacc tgagcctctg

10501 attcctctca cttccctcac ctaccctgcc acttcctact ggatagaagt agacagctct

10561 tgactgtcct cttttctccc cactggctgg tccttcttac cccggcccgt ttgaaagagc

10621 tcacccccga cacaaggacc cgcacacaga tacctcccag ctccctctca acccaccctt

10681 tccagggttg gagaacttga ggcataaact tgcttccatg aggaatctcc acccagaaat

10741 gggtctttct ggcccccagc ccagctccca cattagaaca atgacaaata gaaggggaaa

10801 tggaaaataa acaggagaaa cggttttccc aggacagggt ttggcctaca agttgtggat

10861 gtgggtaccc atgccaagtg tgaggggagg ctggccgggt gtggtggctc atgcctctaa

10921 tcccagcact ttgggaggcc aaggtgagta gatcacttga ggccgggagt ttgagaccag

10981 cctggccaac atggtgaaac cccatctgta ctaaaaatac aaaagttagc tgggcgtggt

11041 ggtagatgcc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc atgagaatcg cttgagccca

11101 gcctgggcaa tacagcaaga ccccgtctct acaaataaaa tacaaaaaat tagttggatg

11161 tggtggtgca tgcctgtagt cctagctgct agggaggctg agatggaagg attgcttgag

11221 cctgggaggt caaggctgca gtgagccgag atggcgccac tgcactccag cctgggcaac

11281 agagtgagac cctgtctcag aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aggagaggag agagactcaa

11341 gcacgcccct cacaggactg ctgaggccct gcaggtgtct gcagcatgtg gccccaggcc

11401 ggggactctg taagccactg ctggagagcc actcccatcc tttctcccat ttctctagac

11461 ctgctgccta tacagtcact tttatgtggt ttcgccaatt ttattccagc tctgaaattc

11521 tctgagctcc ccttacaagc agaggtgagc taagggctgg agctcaaggc attcaaaccc

11581 ctaccagatc tgacgaatgt gatggccacg tcccggaaat atgaagacct gttatgggca

11641 tgggagggct ggcgagacaa ggcggggaga gccatcctcc agttttaccc gaaatacgtg

11701 gaactcatca accaggctgc ccggctcaat ggtgagtccc tgctgccaac atcactggca

11761 cttgggtccc ttcattttcc tcaaagaggt gctgtgaaac cccaagccta ggaaaaggta …

Legenda

gt começo de Intron

ag final de Intron

região onde ocorre a deleção ou

inserção do fragmento Alu (287 pb)

Sequência ancorada nas plataformas gagagcc actcccatcc tttctc

Sequência conjugada com a nanopartícula acagtcact tttatgtggt ttcgcc

... 11881 gctatgtaga tgcaggggac tcgtggaggt ctatgtacga gacaccatcc ctggagcaag

11941 acctggagcg gctcttccag gagctgcagc cactctacct caacctgcat gcctacgtgc

12001 gccgggccct gcaccgtcac tacggggccc agcacatcaa cctggagggg cccattcctg

12061 ctcacctgct gggtaagggc acatgtcggg ccttgaggag ggtaaagacg gaccacagtg

12121 tgagtgaggg ttgggacagg gctgactaga gggtagggag caggctgggg actgagagac

12181 tccagccctg tgggggatgg ttgcccaggc tggagggggg tgggcgctgg gagtggggag

Intron 16

Exon 17

128

12241 ccccccactt gcatctggtg ccacattcac tgcagatcta tgtcgggcaa gtcaccatgg

12301 atgggggaag aagttaataa tcttgtccag gagaccacgg cacccatcac aacattgtgt

12361 gatcttagag ggcgaggaag aggctgtgag tgggagctgg ggaggctttg ccaagaggtg

12421 gcctgtgagc agggcctcgg aagatgacag ggtttgacag atgggaagtg ggggatgaga

12481 ggacagacgc agtgttcagg ccaagggaac tggaacaaag aagaacctga gaatgtaaat

12541 ctacttcaac cctggaccct cctttgccaa gggctgcaat ctcagatgcc ctgaatgtgt

12601 gaagtaggcg gtgaggacag taagggatgg tagggagtaa ggcaaagcag aggctactgg

12661 ttctctgtcc ctgatgggct gttaggaaca ctttcctgga gcagagagac cagacaggcc

12721 ctcagaccat ttagaaacta taagggaggc cccagaggac ggcctggctg tgggtctagc

12781 tcccacacag gctgggagtc cagccctctt cagcccctct ctggtgagac caaagaacat

12841 ctggtgatgt cacagtggac gtcagttcac caactgggag acacaggccc cgggaagaaa

12901 agcaacatgc ccagcgtggc ctgggagctg gggcagagct ggccttagaa ctcagcccct

12961 gacaattggt aaaaggggaa aggggagcaa cctaacactg atgcgctctc tgtctctctc

13021 tctggctctc tccctggctc tctccctctt ctctctcatg ttctctccat cactcatcgc

13081 tctaaccctc tctcactggt ttgcacttta gacttcatct gatgtcagcc gaagcttcac

13141 ctcacttggc taggaaagag ccttgagtcc aaatctgttt ctgagccttc cattcatcct

13201 gagtttcttc cttttcctct gtcgtggaga actaggctct tttcttacac taaactcaga

13261 ggcatcagcc tctcctgaag gagacggctg gttcctgtca gagttgctga gctgcagaca

13321 ccgacctcag gtggtgcgga ggggacatgg cagagtggct ggtgaagaga gcagcctgcc

13381 agcctttcaa tcccagccct gccacttagg agccgtgggc ccccggcgag gggggcggtc

13441 acttaactct ccagcctgtt tcctttacta gccaatggga atcgtgacag tacctgggtg

13501 cagacaggat tgaaagtgaa ttcacacaat gttcttggtg cagagccaat aagaggtggc

13561 caccggggtg taggtgttct ggggacctgt aatgtcctca catgtcagca gttgctagtc

13621 acattggtct ccactgctca cggacagtga agaccacctg gattccctga taaccagcaa

13681 ggcccccacc tagagccagg cagtaatgac ctactgggct ggatatgcac accaaagatg

13741 atgtgtgcct caaagcttgc aaacagtagg tgctcaagaa atgccactat gattagcagg

13801 actgggatct ggagcgctct tcctgcagga gggcattgag cctaagtaac atttgtcttt

13861 cctctctctg ccgtccccca cactcgcctc cagggaacat gtgggcgcag acctggtcca

13921 acatctatga cttggtggtg cccttccctt cagccccctc gatggacacc acagaggcta

13981 tgctaaagca ggtccgcacc agcccagggg cagggaggcc ccgccgggat gggagggacc

14041 ctctgattca ggagttccct ccagtttagc cctcccccgg gatccccacg gcagcacgca

14101 gtctgtcccc ggaaccccca gtttgggcag aactccctct gcttgcaggg ctggacgccc

14161 aggaggatgt ttaaggaggc tgatgatttc ttcacctccc tggggctgct gcccgtgcct

14221 cctgagttct ggaacaagtc gatgctggag aagccaaccg acgggcggga ggtggtctgc

14281 cacgcctcgg cctgggactt ctacaacggc aaggacttcc ggtacatcca gctagggctc

14341 aggtctcgtt cctgagcccc acgggcaagg gaaatgaacc aagcaaaggg tccactactg

14401 tcccccagct ggagccagca gggcaggatg gggacagggc cagagtttgg gactgagtgt

14461 ctagagaggt gttggcttct ggcaggaaaa ccccatccgc ctgatgggga cttctgaagc

14521 acgcaacagc tctgtcagcc tggccgctgg gaagtgctca aggtcccagt cctgggtttg

14581 agcatggtag gctgccccgc gtccctcctt gggagcagcc cctgcatgga gctggcctct

14641 ccctgggggc acatgctgtg acacagggag gcacacgagg atgttgggtg ctctgtacag

14701 atccactctc acccctgaca ggctcagaag ctgccttcct tggaggatgg cgttttagtt

14761 acctattgct gtgcaaccaa gcaccccaga gcttagcctt acgaaacaac cagttgattt

14821 tgcttatgat tttatgtgcc aggaattcag gcagtacaca gtggaaatgg cctttctcta

129

14881 cagggccccc tctgttgggg gcagctctca cagccgggat ggctcaatgg gggccatacg

14941 tccagagccc cagttctggc tgtcggttga ggtcctcggt ttttcccatg tggcagatgc

15001 tggggcacat gttcccagtg gcctcttggc tcacatgttg ggtgcttggg gtgagatggc

15061 tggaacggct ggaggtgggt caggcatctc tccaggctag ctcgggcgcc ctcccagcgt

15121 ggaatctgag gtgggcagat ttacctggca gccagcatcc cccacagcaa ctactgacgc

15181 agccagttct caaggctagg tccaaaactg gcccagagtc acttctgcca tgttttattg

15241 gctagaacaa gtcacaagtt cacccagatt caagagaaga gaaaaaagtc cctcccactt

15301 gggagaagtg gcaaagacca tctgtcacag ctgaagaagt gtctcttaca aggagaacag

15361 acacggggag cctgaaacaa aacccgatgg gattccctgg gctgtgcagg cccttccagg

15421 catgaggact cagccacagg gctgagagga gacaggatct gggggatgag agcccttgtg

15481 gggtcttccc ttttatgggg agtcagagga gaagctggat agatccccag ccttgtggcc

15541 aggatgctgg gcagctcttc cttccccctc cccgatgaga atgacagaaa aacaggattc

15601 acctgagcca aaaggcttcc agttagatcc aagagagaat ttcccgcagt ttgaattggt

15661 ttgctaaaca acaaggaagg gctgggtgcg gtggctcaca cctgtaatct cagcactttg

15721 ggaagccgag gcaggaggtc tgcttgagct caggggttcg agaccatcct gggcaacata

15781 gcgagacccc atttcataaa aaataaataa gtaaatgaga acaaggaagg actgacgaga

15841 gacggtagaa ccttctggtt tgggcagctc tgcagctgcc attcatcctg gccataagaa

15901 ttcttggggt gaataagttt gtcgctgttg ggccgcatga gatgcagaat cgcccactct

15961 cacccctgac agaaacagtt gtttccttca gggagcctcc atcttgggag ataaagcatg

16021 tgtacatggg aacccactgg ccacacattc tctagaaagt acacaatgtc ccagtgcctc

16081 tagagcaagc actttgtaca gtcagaaagc aacaggtggt gggggctgga gtcattcagg

16141 aaaatgggag gcagaggaat ggcctgaacg gcccgatgct aggggcttct gcccccagat

16201 tccctcttac gcacactcag tggttgccct tcccctccct ccccacagtg ctgtgtcccc

16261 tgcatgctgc agtgctgggg tctgccctgg gtatagcaag gcccactgtt cccttatgcc

16321 cagggcttct cactgtcctc tcccaacacc ctctccccca ctccactatt cctaggatca

16381 agcagtgcac caccgtgaac ttggaggacc tggtggtggc ccaccacgaa atgggccaca

16441 tccagtattt catgcagtac aaagacttac ctgtggcctt gagggagggt gccaaccccg

16501 gcttccatga ggccattggg gacgtgctag ccctctcagt gtctacgccc aagcacctgc

16561 acagtctcaa cctgctgagc agtgagggtg gcagcgacgg tgagagagaa gcgggaggcc

16621 ctggtgggct gaggaccaag aaagggtggt gagcttggga ggtgggaaag gggcacttag

16681 tggcccatgg gcagaggtgt ggggcagagc aatcggaagg aagggagcca cccagaccat

16741 cccaggaggc aggtcacagg gcccaaaagg tacagcaccc ccacccctcc accatcacag

16801 gcacaccagg gccaagccgc taggaccctg ggtctgacag ctgggctccc ttcccttgca

16861 gagcatgaca tcaactttct gatgaagatg gcccttgaca agatcgcctt tatccccttc

16921 agctacctcg tcgatcagtg gcgctggagg gtatttgatg gaagcatcac caaggagaac

16981 tataaccagg agtggtggag cctcaggttc tggaacactc ccacgggatg cgggctgggg

17041 gatctctgcg agtgtctgca tgtgcctggg tgtctggatg ggccagggta ggggagtgtg

17101 tgtgtgtgtg tacactattg tgtctgtgca tatgatgtgt gtggtgtaag tgatggggaa

17161 aacggggtga ttgtgcacag aggcccagca cgcaggagaa tggggtgccc agtatagccc

17221 caagtgcagg gaccctccct caagtcaaaa atgccacccc cagcctggtt ctccccaaac

17281 tcatcttcca acatatattc ccactcgaca ggctgaagta ccagggcctc tgccccccag

17341 tgcccaggac tcaaggtgac tttgacccag gggccaagtt ccacattcct tctagcgtgc

17401 cttacatcag gtaacgggaa aggcaggagg gcacattgtg aggggcagta cccacagctt

17461 tgtgtttcaa ctgcggccac tgcccggtcc acaagctctg tcagtcaggg cagacccggg

130

17521 ggagccggcc gcacggtgca ggtgcctggg cccactcaca ctgccaaggc tgatgggttt

17581 tttcttgaac attcttttga tgagagtctg taccatccaa acagttgaac acagaaactc

17641 aacctaataa ttggctaatg gttaccagac cttggttaag tagttaacat taaccacgac

17701 tcatggctgg atcatgagct ctgcactgtt ttgttttgct tttaaaacaa gactgtgatt

17761 cttttactat tattgaacat tgtctgcgat acaatttgaa ttgtacctgg aagcccttct

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17881 ttacagtcac aggctggggt cagacagaac tgggttcaaa ctccgtctcc attactttgt

17941 ttccttgaga aaattcctca atttctgtga gcttccattt cctgacctgt gaaccccatt

18001 tcacaggatg cacgatggct aacttcttag cattctgtct catacacagc ctcctcaggg

18061 aggggtggcc aggaccccac tattcatcac tctctagtgg aatgtagctg cacactaggt

18121 ctgcaggtca catggccaca gatgagtgtg cccaatgcag cccctctcct tctgtgtgcc

18181 ccgggagagc acttgctgag ggctagcaag gctgtttgtg atccgggagg ctccctggga

18241 ggctgggggc tagagagacc tcaggctgga gttccaggtg cccccgggct acaggtagcc

18301 caggccaccc ccagagggct gtggctgcct ctggccctgg cctcccgtgg ttcctggaag

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18541 ttaggacagg gctcccgcct gcctgctgga gtggtccctg gggttcccag ccggcgctgg

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19201 ttggggggcc ttggctctgc tgtgcgcatg tgacttagca cacatcacat gtgatgtgca

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21001 ttaccttggc tcctgcctgt accagctcca tgactctgct cgggtgaaca gccttggctc

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21241 tgtatgttta tgtagaaatt tggaaaatac agaaaactgt aaagaaaata aaagcccttt

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO … · mim. Nunca vou me esquecer de nós...

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