UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO JOÃO OTÁVIO CAFFARENA...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

JOÃO OTÁVIO CAFFARENA FILIZZOLA

Síntese e caracterização de nanopartículas de Fe3O4, funcionalizadas com

polímeros catiônicos, e sua aplicação em ensaios de separação de microalgas

Chlorella minutissima via magnetoforese

Lorena 2015

JOÃO OTÁVIO CAFFARENA FILIZZOLA !

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Síntese e caracterização de nanopartículas de Fe3O4, funcionalizadas com

polímeros catiônicos, e sua aplicação em ensaios de separação de microalgas

Chlorella minutissima via magnetoforese

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Monografia apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Engenheiro Industrial Químico.

Orientadora: Profa. Dra. Simone de Fátima Medeiros

Versão Original

Lorena 2015

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIOCONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizadoda Escola de Engenharia de Lorena,

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Filizzola, João Otávio Caffarena Síntese e caracterização de nanopartículas de Fe3O4,funcionalizadas com polímeros catiônicos, e suaaplicação em ensaios de separação de microalgasChlorella minutissima via magnetoforese / JoãoOtávio Caffarena Filizzola; orientadorA Simone deFátima Medeiros. - Lorena, 2015. 80 p.

Monografia apresentada como requisito parcialpara a conclusão de Graduação do Curso de EngenhariaIndustrial Química - Escola de Engenharia de Lorenada Universidade de São Paulo. 2015OrientadorA: Simone de Fátima Medeiros

1. óxido de ferro. 2. Nanopartículas. 3. Polímeros.4. Microalgas. 5. Magnetoforese. I. Título. II.Medeiros, Simone de Fátima, orient.

À Deus que iluminou o meu caminho. À minha família por sempre estar ao meu lado e acreditar em mim.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por tudo em minha vida.

À Profa. Dra. Simone de Fátima Medeiros pela orientação e atenção durante este

projeto. Ao Prof. Dr. Amilton Martins dos Santos por sua atenção, pelas

sugestões, apoio a este trabalho e a disponibilização de seu laboratório e

equipamentos que possibilitaram a conclusão deste projeto. Ao Prof. Dr. Messias

Borges Silva pela colaboração e disponibilização de material para este trabalho.

Aos amigos e colegas Rodrigo, Graziele, Thaíssa e Jéssica pela colaboração nos

estudos e disponibilização de seus materiais que possibilitaram o sucesso deste

trabalho. Ao Prof. Dr. Sérgio Paulo Campana Filho e seus alunos também pela

disponibilização de materiais utilizados.

A todos os colegas e amigos membros do Laboratório de Polímeros por seu

apoio, amizade, auxílio e atenção, especialmente à Gizelda pelo carinho, atenção,

amizade e auxílio na realização dos trabalhos de pesquisa do laboratório.

À colega e amiga Carla Loures pelo auxílio e atenção a este projeto, e pela

disponibilidade para reuniões e importantes sugestões que possibilitaram o

sucesso deste trabalho.

A todos os professores que me auxiliaram com a disponibilização de seus

equipamentos. Aos técnicos e professores que me auxiliaram na operação dos

equipamentos.

À minha família, amigos e todos que me apoiaram e me desejaram sucesso nesta

e em todas as etapas de minha vida.

“Se, a princípio, a ideia não é absurda, então não há esperança para ela” Albert Einstein

RESUMO

FILIZZOLA, J. O. C. Síntese e caracterização de nanopartículas de Fe3O4,

funcionalizadas com polímeros catiônicos, e sua aplicação em ensaios de

separação de microalgas Chlorella minutissima via magnetoforese.

Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso em Engenharia Industrial Química)

– Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, 2015.

Atualmente, as microalgas vêm sendo exploradas como fontes de biomoléculas e

de matérias primas em processos de desenvolvimento de diversos bioprodutos,

como biodiesel, bioetanol, biogás, suplementos nutricionais, entre outros. Estes

micro-organismos apresentam alto acúmulo de biomoléculas em sua estrutura,

alta taxa de crescimento e fácil cultivo em diversos meios. As microalgas do

gênero Chlorella, por exemplo, apresentam elevado acúmulo de lipídeos, o que

tem sido explorado na produção de biodiesel. Apesar disso, o processamento das

microalgas apresenta algumas etapas complexas e demoradas, dificultando a

redução de seu custo a níveis competitivos. A separação da biomassa do meio

representa em média 20-30% do custo do processo, sendo o tempo total de

separação um dos principais responsáveis pelo custo elevado. O tempo longo de

separação representa, portanto, a principal desvantagem das técnicas

convencionais, como centrifugação, filtração e floculação. Dentro desse contexto,

a separação magnética vem ganhando destaque devido à sua alta eficiência e

curto tempo de separação. Neste trabalho, propôs-se a síntese e caracterização

de nanopartículas magnéticas revestidas com polímeros catiônicos e seu uso na

separação de biomassa de microalgas Chlorella minutíssima via magnetoforese.

Inicialmente, nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com poli(2-

(dimetilamino) metacrilato de etila-co-acrilato de butila)/P(qDMAEMA10-co-BA4)

quaternizado de baixa massa molar foram preparadas e caracterizadas e sua

influência na recuperação das microalgas foi avaliada. Em seguida, um

procedimento semelhante foi adotado para a síntese e caracterização de

nanopartículas de Fe3O4 funcionalizadas com quitosana (grau de desacetilação =

65%) e os resultados referentes à separação das algas foram comparados com

aqueles previamente obtidos com as nanopartículas revestidas com o copolímero

quaternizado. A separação das algas foi avaliada, ainda, na presença de

nanopartículas de Fe3O4 revestidas com poli(N-vinilcaprolactama) (PNVCL) de

baixa massa molar e de nanopartículas de Fe3O4 não funcionalizadas. Os

resultados mostraram que as nanopartículas de óxido de ferro revestidas com

P(qDMAEMA10-co-BA4) apresentaram maior eficiência de separação, chegando a

93%, com uma capacidade de recuperação de até 4,91 g-biomassa seca/g-

nanopartículas, em um intervalo de tempo muito menor do que os relatados na

literatura, empregando-se outras técnicas de separação.

Palavras-chave: polímeros catiônicos; óxido de ferro; nanopartículas; magnetoforese; funcionalização; microalgas; P(qDMAEMA10-co-BA4); quitosana; PNVCL.

ABSTRACT

FILIZZOLA, J. O. C. Synthesis and characterization of cationic polymer-coated magnetic nanoparticles and their application on Chlorella

minutissima harvesting via magnetophoresis. Monograph (Chemical Engineering Final Project) – School of Engineering of Lorena, University of São Paulo, 2015. Nowadays, microalgae have been explored as a source of biomolecules and raw

materials in process to obtain a diverse number of bio-products, such as biodiesel,

bioethanol, biogas, food supplements and others. These microorganisms can

accumulate a high content of biomolecules in their structure, also they present

elevated growth rates and they are easy to cultivate in various media. Chlorella

microalgae, for instance, accumulate high contents of lipids what has been

explored for biodiesel production. Nevertheless, processes involving microalgae

still present some complex and expensive steps, what difficults the production of

biofuels at competitive prices. Biomass harvesting represents 20-30% of the

process costs and the time to harvest the cells one of the main issues that

increases the price. Harvesting long time of processing represents, therefore, the

main disadvantage of the conventional techniques, such as centrifugation,

flocculation and filtration. For that matter, magnetic harvesting has turned up as an

interesting technique since it results in high efficiency harvesting and low

separation times. In the present work, synthesis and characterization of magnetic

cationic polymer-coated nanoparticles is proposed and their further application on

Chlorella minutissima biomass harvesting via magnetophoresis. Firstly, iron oxide

nanoparticles coated with low molar mass quaternized poly(2-dimethylaminoethyl

methacrylate-co-butyl acrylate)/ P(qDMAEMA10-co-BA4) were prepared and

characterized and their influence of the recovery of microalgae cells was

evaluated. Similarly, iron oxide nanoparticles were prepared and functionalized

with chitosan (degree of deacetylation = 65%) and the results of microalgae

harvesting were compared to those previously obtained with the quaternized

copolymer coated nanoparticles. Microalgae harvesting was as well evaluated in

the presence of low molar mass poly(N-vinylcaprolactam)/PNVCL functionalized

iron oxide nanoparticles and in the presence of non-functionalized iron oxide

nanoparticles. Results showed that P(qDMAEMA10-co-BA4)-coated nanoparticles

presented higher harvesting efficiency, reaching 93%, with recovery capacity up to

4,91 g-dry cell weight/g-nanoparticles in a much lower time than found in literature

for other harvesting techniques.

Key-words: cationic polymer; iron oxide; nanoparticles; magnetophoresis; functionalization; microalgae; P(qDMAEMA10-co-BA4); chitosan; PNVCL.

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 – Caráter anfiprótico do óxido de ferro................................................ 25 Figura 3.2 - Esquema de partículas revestidas por surfatantes: (a) camada simples; (b) camada dupla.................................................................................... 26 Figura 3.3 - Esquema representativo da repulsão estérica entre as partículas revestidas por um surfatante................................................................................. 28 Figura 3.4 – Representação da dupla camada (camada de Stern e camada difusa) na superfície de uma partícula de carga superficial líquida positiva..................... 29 Figura 3.5 - Esquema de repulsão eletrostática entre duas partículas revestidas por moléculas carregadas positivamente.............................................................. 30

Figura 3.6 - Estrutura química da quitosana......................................................... 31

Figura 3.7 - Estrutura química do copolímero P(qDMAEMA10-co-BA4)-CTPPA... 32 Figura 3.8 – Estrutura química do PNVCL com terminação hidroxila proveniente do mercaptoetanol..................................................................... 33 Figura 5.1 – Efeito do pH do meio sobre o diâmetro das nanopartículas magnéticas não funcionalizadas (NP-1) (a) e funcionalizadas com diferentes concentrações de P(qDMAEMA10-co-BA4) (NP-2 – NP-4) (b-d)..................... 49 Figura 5.2 – Efeito da variação do polímero catiônico utilizado sobre o diâmetro das nanopartículas em diferentes valores de pH: NP-4 (a), NP-5 (b) e NP-6 (c)........................................................................................................ 51 Figura 5.3 – Difratogramas de raios X das nanopartículas de óxido de ferro: não funcionalizadas (a), funcionalizadas com P(qDMAEMA10-co-BA4) (b-d), com quitosana (e) e com PNVCL (f).............................................................. 52 Figura 5.4 – Micrografias de MEV do óxido de ferro não funcionalizado (NP-1): magnificação 1000x (a) e 500x (b)................................................................ 53 Figura 5.5 – Micrografias de MEV das nanopartículas funcionalizadas com P(qDMAEMA10-co-BA4), obtidas nas reações NP-2: magnificação 1000x (a) e 3000x (b); NP-3: magnificação 1000x (c) e 3000x (d); NP-4: magnificação 1000x (e) e 3000x (f)..................................................................................... 54 Figura 5.6 – Micrografias de MEV das nanopartículas funcionalizadas com quitosana (reação NP-5): magnificação 1000x (a) e 3000x (b)............................ 55 Figura 5.7 – Micrografias de MEV das nanopartículas funcionalizadas com PNVCL (reação NP-6): magnificação 1000x (a) e 3000x (b)............................................. 56

Figura 5.8 – Relação entre a concentração de biomassa e a absorbância da suspensão das microalgas............................................................................ 57 Figura 5.9 – Efeito da variação do pH sobre a carga superficial das microalgas (potencial zeta)...................................................................................................... 58 Figura 5.10 – Relação entre a dosagem de nanopartículas nos ensaios de separação e a eficiência de separação obtida............................................... 59 Figura 5.11 – Esquema dos ensaios de separação magnética da Chlorella minutissima (a), microscopia ótica das suspensão de microalgas (b) e microscopia ótica da floculação das nanopartículas sobre as células microalgais (c).............................................................................................. 61 Figura 5.12 – Efeito da funcionalização do óxido de ferro e da concentração de copolímero empregada nas sínteses sobre a eficiência de separação das microalgas Chlorella em diferentes pH. NP-1 (a), NP-2 (b), NP-3 (c) e NP-4 (d)................................................................................................................. 62 Figura 5.13 - Efeito da funcionalização do óxido de ferro e da concentração de P(qDMAEMA10-co-BA4) empregada nas sínteses sobre a capacidade de recuperação das microalgas Chlorella em diferentes pHs. NP-1 (a), NP-2 (b), NP-3 (c) e NP-4 (d)..................................................................................................... 64 Figura 5.14 - Efeito da variação do polímero catiônico utilizado sobre a eficiência de separação das microalgas em diferentes valores de pH: NP-4 (a), NP-5 (b) e NP-6 (c)....................................................................................... 67 Figura 5.15 - Efeito da variação do polímero catiônico utilizado sobre a capacidade de recuperação das microalgas em diferentes valores de pH: NP-4 (a), NP-5 (b) e NP-6 (c)................................................................................. 68

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LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 3.1. Comparação entre os parâmetros e resultados obtidos por meio das principais rotas sintéticas por via química............................................................. 22 Tabela 3.1. Composição do meio f/2 sem sílica adaptado................................... 36 Tabela 5.1 – Efeito da concentração de copolímero no diâmetro (DP) e índice de polidispersidade (IPD) das nanopartículas revestidas com P(qDMAEMA10-co-BA4)....................................................................................................................... 47 Tabela 5.2 – Efeito da quitosana e da PNVCL no diâmetro (DP) e índice de polidispersidade (IPD) das nanopartículas de Fe3O4............................................ 48 Tabela 5.3 – Comparação dos resultados obtidos quanto ao aumento do volume nos ensaios de separação................................................................ 70

SUMÁRIO

!1.! INTRODUÇÃO!............................................................................................................................................!14!2.! OBJETIVOS!..................................................................................................................................................!17!2.1.!Objetivos!específicos!..............................................................................................................................!17!3.! REVISÃO!BIBLIOGRÁFICA!...................................................................................................................!18!3.1.!Ferrofluidos!...............................................................................................................................................!18!3.1.1.! Óxidos!de!ferro!e!ferritas!..........................................................................................................!20!3.1.2.! Magnetita!e!maghemita!–!estrutura!e!propriedades!magnéticas!............................!20!3.1.3.! Tamanho!de!partículas!e!polidispersidade!.......................................................................!21!3.1.4.! Métodos!de!obtenção!de!nanopartículas!de!óxido!de!ferro!.......................................!22!3.1.4.1.! Co[precipitação!.........................................................................................................................!23!3.1.5.! Modificação!de!superfície!e!estabilidade!coloidal!..........................................................!24!3.1.5.1.! Estabilização!estérica!.............................................................................................................!27!3.1.5.2.! Carga!de!superfície!..................................................................................................................!29!3.1.6.! Quitosana!.........................................................................................................................................!30!3.1.7.! Polímeros!de!massa!molar!controlada!................................................................................!31!3.1.8.! Poli(N[vinilcaprolactama)!........................................................................................................!32!3.2.!Microalgas!...................................................................................................................................................!33!3.2.1.! Métodos!de!cultivo!.......................................................................................................................!36!3.2.2.! Colheita!(separação)!...................................................................................................................!37!3.2.2.1.! Separação!magnética!(magnetoforese)!..........................................................................!37!3.2.3.! Aplicações!da!biomassa!produzida!por!microalgas!.......................................................!38!4.! MATERIAIS!E!MÉTODOS!......................................................................................................................!39!4.1.!Materiais!......................................................................................................................................................!39!4.2.!Síntese!das!nanopartículas!de!Fe3O4!funcionalizadas!com!P(qDMAEMA10[co[BA4)[CTPPA,!quitosana!e!PNVCL!..........................................................................................................................!39!4.3.1.! Espalhamento!dinâmico!de!luz!(DLS)!e!potencial!zeta!................................................!40!4.3.2.! Difratometria!de!raios!X!(DRX)!..............................................................................................!41!4.3.3.! Espectrometria!no!Infravermelho!(FTIR)!..........................................................................!41!4.3.4.! Microscopia!eletrônica!de!varredura!(MEV)!....................................................................!41!4.4.!Caracterização!da!biomassa!microalgal!de!Chlorella*minutissima!.....................................!42!4.4.1.! Análise!espectrofotométrica!de!densidade!ótica!............................................................!42!4.4.2.! Determinação!da!carga!superficial!das!microalgas!.......................................................!42!4.5.!Avaliação!da!eficiência!das!nanopartículas!de!óxido!de!ferro!na!separação!(colheita)!de!microalgas!Chlorella*minutissima!..................................................................................!43!4.5.1.! Determinação!da!concentração!de!nanopartículas!aplicada!nos!ensaios!(dosagem)!...........................................................................................................................................................!43!4.5.2.! Ensaios!de!separação!magnética!das!microalgas!...........................................................!43!4.5.3.! Eficiência!de!separação!e!capacidade!de!separação!......................................................!44!5.! RESULTADOS!E!DISCUSSÃO!...............................................................................................................!46!5.1.!Caracterização!das!nanopartículas!de!Fe3O4!funcionalizadas!com!P(qDMAEMA10[co[BA4),!quitosana,!PNVCL!e!não!funcionalizadas!.............................................................................!46!5.1.1.! Espalhamento!dinâmico!de!luz!(DLS)!das!nanopartículas!.........................................!46!5.1.2.! Efeito!do!pH!no!DP!das!nanopartículas!magnéticas!......................................................!48!5.1.3.! Difratometria!de!raios!X!............................................................................................................!52!5.1.4.! Morfologia!........................................................................................................................................!53!5.2.!Caracterização!da!biomassa!microalgal!de!Chlorella*minutissima!.....................................!56!5.2.1.! Análise!espectrofotométrica!de!densidade!ótica!............................................................!56!

5.2.2.! Carga!superficial!das!microalgas!...........................................................................................!57!5.3.!Ensaios!de!separação!das!algas!Chlorella*minutissima!utilizando!as!nanopartículas!magnéticas!..........................................................................................................................................................!58!5.3.1.! Interação!entre!as!nanopartículas!e!a!superfície!das!microalgas!(mecanismo!de!separação)!.....................................................................................................................................................!59!5.3.2.! Estudo!do!tipo!de!polímero!empregado!e!o!efeito!do!pH!............................................!66!5.3.3.! Efeito!do!volume!na!separação!magnética!........................................................................!69!6.! CONCLUSÃO!...............................................................................................................................................!71!7.! SUGESTÕES!DE!TRABALHOS!FUTUROS!........................................................................................!73!REFERÊNCIAS!....................................................................................................................................................!75!

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1. INTRODUÇÃO

!Ao longo dos últimos anos pesquisadores têm buscado fontes alternativas

aos combustíveis fósseis que sejam mais sustentáveis e, portanto, menos

agressivas ao meio ambiente. A utilização de combustíveis de fontes naturais

renováveis tem se mostrado como a principal alternativa para a redução da

dependência dos combustíveis fósseis. As fontes microbiológicas têm se

mostrado interessantes em diversos setores: químico, energético, farmacêutico,

biomédico, entre outros, devido, principalmente, ao seu potencial promissor como

fonte de biomoléculas e matérias primas substituintes de fontes não renováveis.

Devido à sua alta versatilidade e aplicabilidade, as microalgas vêm sendo

exploradas em pesquisas acadêmicas e na indústria como fontes de

biomoléculas, em destaque, pigmentos, biopolímeros, proteínas e lipídeos.

Algumas destas biomoléculas podem ser utilizadas como matéria prima para a

produção de biodiesel, bioetanol, gás de síntese, entre outros produtos (REIS et

al., 2014). Além disso, as microalgas vêm ganhando destaque devido às suas

vantagens em relação a outras fontes de matéria prima (plantas oleaginosas, por

exemplo) como a versatilidade quanto ao meio de cultivo, podendo ser cultivadas

até em resíduos agroindustriais e chorume, além de biorreatores fechados e

piscinas ou tanques abertos em terras não aráveis. Elas apresentam elevada taxa

de crescimento, sendo que a maior parte das espécies atinge seu máximo

acúmulo de lipídeos em 7-14 dias. Por fim, além de requererem menor quantidade

de água do que as culturas oleaginosas terrestres, elas podem acumular, em

massa, de 15-77% de lipídeos (CHISTI, 2007).

Alguns processos em escala industrial empregam esse tipo de

microorganismo, principalmente nas áreas de bioenergia, biorremediação e

nutrição (humana e animal). Algumas das aplicações de maior destaque das

microalgas e dos produtos gerados a partir delas estão na área energética, devido

a sua versatilidade e o caráter sustentável dos processos. Destacam-se nesta

área a produção de biodiesel, etanol, biogás, bio-hidrogênio, gás de síntese e o

carvão, produzido a partir da pirólise da biomassa microalgal (REIS et al., 2014) .

Os biocombustíveis de terceira geração já se mostram economicamente viáveis,

em alguns casos, e com produção que atinge a escala industrial (RAMARAJ et al.,

2015). Devido ao elevado acúmulo de lipídeos em diversas espécies, como

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Chlorella sp., destaca-se a produção de biodiesel a partir de triacilgliceróis

microalgais. O biodiesel de biomassa microalgal é obtido a partir de reações de

transesterificação dos lipídios extraídos de microalgas, ou seja, esses lipídios são

extraídos e reagidos com alcóois (metanol ou etanol) para a obtenção de ésteres

graxos de cadeia curta e glicerol (principal subproduto do processo).

Entretanto, algumas etapas de processos envolvendo microalgas ainda

tornam seus produtos combustíveis mais onerosos do que aqueles de outras

fontes, o que reduz sua competitividade. As etapas de cultivo e colheita

(separação) representam a maior porção dos custos processuais. Por essa

razão, o uso de microalgas em processos de produção como fonte de

biocombustíveis ainda não é considerado economicamente viável.

Ainda tomando-se a produção de biodiesel como exemplo, o processo

pode ser divido em 4 etapas: cultivo, colheita, extração de lipídios e

esterificação. A etapa de colheita representa pelo menos 20-30% do custo de

toda a produção do biocombustível (BARROS et al., 2015). Os desafios

relacionados a essa etapa são a baixa densidade celular no meio, a elevada

quantidade de água utilizada no processo, o tamanho reduzido das microalgas

e sua estabilidade em solução devido às cargas superficiais (MILLEDGE;

HEAVEN, 2013). Dessa forma, a utilização de técnicas eficientes de colheita

de biomassa torna-se essencial para a redução dos custos de produção de

biodiesel. Algumas das técnicas mais utilizadas ainda impossibilitam um

regime produtivo de biomassa de custo reduzido, seja devido ao gasto

energético para separação ou ao tempo necessário de processamento

(BARROS et al., 2015).

A utilização dos mais diversos tipos de moléculas na floculação, como

polímeros e nanopartículas, bem como de processos eletroquímicos, tem sido

uma das maneiras de aumentar a eficiência da separação celular e reduzir o

custo do processo. Tem-se também aplicado a combinação de técnicas para o

aumento da eficiência. Dentre os processos que têm sido foco de estudos de

separação de microalgas, o uso de partículas magnéticas, como as de óxido

de ferro, para a separação magnética, representa uma alternativa muito

eficiente e com curto tempo de processamento, o que tem tornado-a foco de

estudos recentes (REIS et al., 2014; BARROS et al., 2015).

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Trabalhos recentes revelam que o uso de nanopartículas de óxido de

ferro na separação magnética de biomassa de microalgas, via magnetoforese,

tem mostrado resultados eficientes, em termos de eficiência e tempo de

separação (TOH et al., 2014; HU et al., 2014). No entanto, um fator limitante

das nanopartículas magnéticas de óxido de ferro é a tendência a aglomeração

quando dispersas em um solvente, principalmente água. Tal aglomeração,

prejudica algumas de suas propriedades, como a área superficial das

partículas, por exemplo (MAHMOUDI et al., 2011; HAMLEY, 2003). Assim,

estas são comumente revestidas ou modificadas por agentes ligantes, tais

como surfatantes, quelantes, polímeros, etc (HORÁK et al., 2007; BORLIDO et

al., 2013).

Neste trabalho, propõe-se, portanto, a utilização de nanopartículas

magnéticas, funcionalizadas com um copolímero catiônico, como agentes de

floculação de microalgas do gênero Chlorella e a obtenção de resultados

quantitativos quanto a eficiência destas nanopartículas na separação de

microalgas.

As nanopartículas magnéticas de óxido de ferro revestidas com um

copolímero quaternizado de baixa massa molar de poli(2-(dimetilamino)

metacrilato de etila-co-acrilato de butila)/P(qDMAEMA10-co-BA4) obtido via

polimerização controlada RAFT foram caracterizadas e empregadas em

ensaios de magnetoforese. Para um estudo comparativo, nanopartículas de

óxido de ferro funcionalizadas com outros polímeros catiônicos (quitosana e

poli(N-vinilcaprolactama)) e não funcionalizadas, também foram submetidas a

ensaios de magnetoforese.

Todos as nanopartículas sintetizadas foram caracterizadas em termos

de composição química, cristalinidade, morfologia, diâmetro médio e índice de

polidispersidade – IPD.

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2. OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho consistiu na avaliação do efeito do

uso de nanopartículas magnéticas de Fe3O4 funcionalizadas com diferentes

polímeros em ensaios de separação magnética de microalgas Chlorella

minutissima. Empregou-se três polímeros diferentes como agentes de

revestimento e funcionalização das nanopartículas magnéticas. Os resultados

foram comparados com aqueles obtidos utilizando-se nanopartículas de Fe3O4

não funcionalizadas.

2.1. Objetivos específicos

Para que o objetivo principal fosse atingido, os objetivos específicos

tiveram que ser alcançados:

• Síntese de nanopartículas magnéticas com os três polímeros propostos

e nanopartículas não funcionalizadas e sua caracterização quanto ao

diâmetro, índice de polidispersidade, cristalinidade e morfologia;

• Emprego das nanopartículas em ensaios de separação magnética de

microalgas Chlorella minutissima;

• Estudo dos mecanismos de interação entre as nanopartículas e as

microalgas;

• Estudo do efeito da funcionalização das nanopartículas em comparação

a não funcionalização; estudo da influência do tipo de polímero

empregado; estudo do efeito do pH do meio no tamanho e também na

separação; estudo do efeito do volume na eficiência de separação e

capacidade de recuperação.

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3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

!3.1. Ferrofluidos

!Colóides magnéticos, também chamados de ferrofluidos, são suspensões

coloidais de nanopartículas magnéticas, com diâmetro aproximado de 10 nm, com

apenas um domínio magnético, em um solvente adequado, que pode ser polar ou

apolar (SCHERER; FIGUEIREDO NETO, 2005).

O uso de ferrofluidos em diversas aplicações vem ganhando destaque,

desde os anos 60, devido, principalmente, aos resultados obtidos por Stephen

Papell na National Aeronautics and Space Administration (NASA). Papell (1965)

utilizou um moinho de bolas para a redução do tamanho das partículas metálicas

e de óxidos, tendo Fe3O4 como a mais satisfatória, com adição de um solvente

(heptano) e um surfatante (ácido oléico) para estabilizar as partículas sub-

micrométricas. A estabilização das nanopartículas no meio, tendo-se a superfície

do óxido de ferro recoberta com ácido oleico, deve-se às fortes interações com o

solvente. Devido à grande área superficial em relação à sua massa, as partículas

atraem moléculas do solvente por tensão superficial ou adsorção, o que faz com

que elas não precipitem (PAPELL, 1965).

Massart (1981) relatou um método para produzir ferrofluidos em meio

alcalino ou ácido. Nanopartículas de magnetita (<20 nm) foram sintetizadas por

meio da adição de uma base em uma solução aquosa de sais férrico (Fe+3) e

ferroso (Fe+2) em proporção estequiométrica (2:1), sob agitação, em atmosfera

livre de oxigênio, e temperatura ambiente, para obter um precipitado constituído

de nanopartículas esféricas (Fe3O4). A estabilidade coloidal foi atingida em pH

extremo. As partículas foram peptizadas (estabilizadas elestrostaticamente por

íons de cargas opostas àquelas na superfície do óxido, formando-se uma camada

difusa) pela adição de hidróxido de tetrametilamônio (a superfície do óxido

apresenta grupos hidroxila desprotonados que atraem os cátions

tetrametilamônio, o que leva a repulsão das cargas superficiais positivas das

partículas, ferrofluido alcalino) ou ácido perclórico (a superfície do óxido apresenta

grupos hidroxila protonados que atraem os ânions perclorato, o que leva a

repulsão entre cargas superficiais negativas das partículas, ferrofluido ácido).

!

!

19

A estabilidade coloidal depende da contribuição térmica e do balanço entre

interações repulsivas (estéricas e eletrostáticas) e atrativas (van der Waals e

dipolo-dipolo) (SCHERER; FIGUEIREDO NETO, 2005). Na ausência de alguma

molécula na superfície, as nanopartículas de óxido de ferro se aglomeram devido

às interações hidrofóbicas de van der Waals, causando a desestabilização do

colóide (GUPTA; GUPTA, 2005). Isso porque elas tendem a diminuir sua

superfície total, ou energia interfacial (MAHMOUDI et al., 2011). Estes

aglomerados exibem forte interação dipólo-dipólo magnético e comportamento

ferromagnético, o que faz com que eles magnetizem partículas vizinhas e

aumentem mais ainda o próprio diâmetro, bem como de outras partículas

(HAMLEY, 2003).

Estas interações e sua contribuição à estabilidade coloidal do sistema

dependem do tipo de molécula empregada na modificação de superfície. Os

ligantes podem ser moléculas carregadas (por exemplo, citratos e sais

quaternários de amônio), surfatantes (por exemplo, ácidos graxos de cadeia

longa) ou polímeros naturais e sintéticos (por exemplo, poli(ácido acrílico) (PAA),

poli(álcool vinílico) (PVA), dextrana e quitosana) (BOURGEAT-LAMI; LANSALOT,

2010).

Associado a esse controle de tamanho, está o tipo de propriedades

magnéticas observadas para o material. Quando as partículas exibem

propriedades superparamagnéticas, observa-se um comportamento magnético

uniforme no fluido, como se houvesse uma única fase, quando um campo

magnético externo é aplicado (BOURGEAT-LAMI; LANSALOT, 2010).

Hu et al. (2013) utilizaram nanopartículas de Fe3O4 sem modificação de

superfície em ensaios de colheita de microalgas Nannochloropsis maritima em

comparação a outras técnicas de separação físicas e químicas, como floculação,

coagulação e associações entre duas técnicas distintas (floculação e

microfiltração). Em seu trabalho, eles demonstram a elevada eficiência de colheita

(97,5%) da separação magnética e o baixo tempo de processamento requerido

por esta técnica, além da possibilidade de reciclo das nanopartículas. Toh et al.

(2014) também realizaram ensaios de colheita de microalgas, utilizando-se

Chlorella sp., e mostraram uma comparação entre nanopartículas de óxido de

ferro sem modificação com aquelas modificadas, separadamente, por dois

polímeros: quitosana e cloreto de poli(dialildimetilamônio) (PDDA). Apenas em pH

!

!

20

bastante ácido (pH 2), as partículas não modificadas apresentaram elevada

eficiência de separação (93.1%), entretanto esta faixa de pH pode levar à lise

celular. Partículas modificadas com PDDA apresentaram maior potencial para

aplicações deste gênero, por apresentarem cargas positivas de superfície

independentes do pH do meio.

3.1.1. Óxidos de ferro e ferritas

Segundo definição, os óxidos de ferro são estruturas de fórmula química

FexOyHz, com z = 0, na maioria dos casos. As ferritas abrangem uma família de

fórmula MO . Fe2O3. Os átomos M podem ser metais de transição como Mn, Co,

Zn, Cu e Ni, que são os mais típicos de estruturas de ferritas. No caso da

magnetita o átomo M é o próprio Fe, na forma de seu cátion bivalente (Fe+2),

sendo esta também da família das ferritas (HORÁK et al., 2007). As ferritas de

Co, Cu, Ni, Zn e Mn, apesar de apresentarem elevada magnetização de

saturação (Ms), não apresentam biocompatibilidade (BORLIDO et al., 2013).

Nas últimas décadas, diferentes tipos de óxidos de ferro vêm sendo

investigados devido a algumas de suas características, como a elevada saturação

de magnetização e a biocompatibilidade. No campo das nanopartículas a

maghemita, γ-Fe2O3, e a magnetita, Fe3O4, são os tipos mais promissores em

suas estruturas de domínio único, em faixas de 5-20 nm de diâmetro

(SCHWERTMANN; CORNELL, 1991). Esses dois tipos são os únicos que

apresentam elevada saturação magnética, estabilidade química em condições

fisiológicas e baixa toxicidade, além de fácil e economicamente viável

reprodutibilidade de síntese (FIGUEROLA et al., 2010). A magnetita e a

maghemita podem apresentar, por exemplo, saturação magnética até duas

ordens mais elevada do que outros óxidos de ferro (80-100 A.m2/kg) (CORNELL;

SCHWERTMANN, 1997).

3.1.2. Magnetita e maghemita – estrutura e propriedades magnéticas

A magnetita, Fe3O4 (FeO.Fe2O3), é um óxido preto ferrimagnético com

estrutura cristalina de espinélio invertido, contendo ambos os íons Fe+3 e Fe+2. A

maghemita, γ-Fe2O3, um óxido de propriedades bastante semelhantes as da

magnetita (proveniente da oxidação da magnetita), é um óxido marrom

!

!

21

avermelhado, também ferrimagnético, porém com zonas de deficiência de cátions

(CORNELL; SCHWERTMANN, 1997; HORÁK et al., 2007).

O arranjo dos átomos na célula unitária é o fator responsável pelas

propriedades magnéticas. Os íons trivalentes (Fe+3) estão situados metade nas

posições octaédricas e metade nas posições tetraédricas, enquanto os bivalentes

(Fe+2) estão todos nas posições octaédricas. Os momentos de spin magnéticos

do Fe+3 estão alinhados, porém dispostos em direções opostas nas duas posições

que ocupam (octaédrica e tetraédrica), por isso seu momento magnético líquido é

zero. Portanto, o momento total dos íons Fe+2, que também estão alinhados na

mesma direção, é responsável pelo magnetismo líquido do material. Por

conseguinte, a saturação magnética de um material ferrimagnético pode ser

calculada pelo produto entre cada momento magnético de spin dos íons Fe+2 pelo

número de íons Fe+2 no material (CALLISTER; RETHWISCH, 2010).

Tanto Fe3O4, quanto γ-Fe2O3, apresentam comportamento

superparamagnético em diâmetros inferiores a 30 nm, tipicamente por volta de 10

nm. Tal comportamento está relacionado à presença de um único domínio

magnético nos aglomerados que se alinha ao campo externo aplicado,

comportando-se similarmente a um material ferromagnético (apresenta elevada

saturação magnética, Ms), porém ao retirar o campo magnético externo a

saturação magnética volta a zero sem apresentar remanência (PAPELL, 1965;

ROSENSWEIG, 1985, 1997). Estes materiais são comumente chamados de

Nanopartículas Superparamagnéticas de Óxido de Ferro (SPIONs -

Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles). Eles apresentam saturação

magnética inferior (em torno de 20-50%) aos aglomerados de tamanhos

micrométricos (bulk), entretanto as nanopartículas (<30 nm) apresentam

remanência diferente de zero, o que facilita os processos de separação e

transporte (HORÁK et al., 2007). A biocompatibilidade já comprovada das

nanopartículas é revista por Mornet et al. (2004). Ademais, a obtenção de SPIONs

é considerada simples e não onerosa.

!

3.1.3. Tamanho de partículas e polidispersidade

O tamanho e a distribuição de tamanho das partículas de óxido de ferro

são parâmetros muito importantes para estes materiais. A intensidade da

magnetização das partículas, por exemplo, é diretamente proporcional ao seu

!

!

22

tamanho. A distribuição de tamanhos, se estreita, garante propriedades fisico-

químicas e magnéticas mais definidas. A força magnética (Fm) exercida por

um campo externo sobre as partículas é dada pela Equação 1:

!! = !!!.!!

!!! ! ∙ ∇ ! (1)

Sendo !0 a permeabilidade magnética do vácuo (4π x 10-7 N/A2), VP o

volume da partícula (m3), Δχ! a diferença de suscetibilidade magnética entre a

partícula e o meio (adimensional) e B'a indução magnética ou campo magnético

aplicado (T). Duas vantagens no uso das partículas menores que 100 nm são

suas maiores áreas superficiais específicas (maior facilidade na modificação de

superfície e adição de funcionalidades específicas) e menores taxas de

sedimentação (maior estabilidade coloidal).

3.1.4. Métodos de obtenção de nanopartículas de óxido de ferro

Ao longo dos últimos anos, diversos métodos foram desenvolvidos para a

síntese de nanopartículas magnéticas. Estes métodos apresentam diferentes

resultados quanto a forma, tamanho de partículas, polidispersidade e

propriedades magnéticas. Existem vias químicas, físicas e microbiológicas para a

produção deste tipo de nanopartículas. Dentre estes métodos, as rotas químicas

são as mais utilizadas. Essas rotas incluem, entre outras, a co-precipitação,

decomposição térmica de organometálicos, síntese hidrotérmica e

micro/nanoemulsões (HORÁK et al., 2007; BORLIDO et al., 2013). A Tabela 1.1

mostra uma comparação entre algumas condições e parâmetros das quatro rotas

químicas.

Quadro 3.1. Comparação entre os parâmetros e resultados obtidos por meio das principais

rotas sintéticas por via química.

Rota sintética Co-precipitação Decomposição

térmica Microemulsão

Síntese

hidrotérmica

Síntese Muito simples Complicada Complicada Simples

Temperatura de

reação (˚C) 20-90 100-320 20-50 220

Período de

reação Minutos Horas-dias Horas Horas-dias

!

!

23

Distribuição de

tamanho

Relativamente

estreita Muito estreita

Relativamente

estreita Muito estreita

Controle da

morfologia Ruim Muito bom Bom Muito bom

Rendimento Alto Alto Baixo Médio

Fonte: Adaptado de Lu, Salabas e Schuth (2007).

Apesar de não ser o método com melhor controle de tamanho e forma das

partículas, a co-precipitação é o método mais empregado por ser simples e

possibilitar a síntese de elevada quantidade de partículas (BORLIDO et al., 2013).

A decomposição térmica, também uma das rotas mais utilizadas, apresenta

melhor controle morfológico, entretanto demanda experimentos muito mais

complexos (BOURGEAT-LAMI; LANSALOT, 2010). Desta forma, diversos autores

ainda utilizam o método da co-precipitação para a síntese de óxido de ferro

(HAMOUDEH; FESSI, 2006; CASTELLÓ et al., 2015; CHEN et al., 2011; WU et

al., 2012).

3.1.4.1. Co-precipitação

A co-precipitação é um método bastante conveniente para produzir

diversos tipos de ferritas, sejam elas de íons de Fe+2 ou outros íons divalentes

(por exemplo, Co+2, Cu+2, Ni+2, Zn+2, Mn+2). O processo se baseia na co-

precipitação de Fe+3 e íons divalentes em solução aquosa por adição de uma

base. Massart (1981) relatou o método para a síntese de nanopartículas de

magnetita (<20 nm) por meio da adição de uma base em uma solução aquosa de

sais férrico (Fe+3) e ferroso (Fe+2) em proporção estequiométrica (2:1), sob

agitação, em atmosfera livre de oxigênio, e temperatura ambiente, para obter um

precipitado preto de nanopartículas esféricas (Fe3O4). Para atingir a estabilidade

coloidal, as partículas foram peptizadas (estabilizadas elestrostaticamente por

íons de cargas opostas àquelas na superfície do óxido, formando-se uma camada

difusa) pela adição de hidróxido de tetrametilamônio (a superfície do óxido

apresenta grupos hidroxila desprotonados que atraem os cátions

tetrametilamônio, o que leva a repulsão das cargas superficiais positivas das

partículas, ferrofluido alcalino) ou ácido perclórico (a superfície do óxido apresenta

grupos hidroxila protonados que atraem os ânions perclorato, o que leva a

!

!

24

repulsão entre cargas superficiais negativas das partículas, ferrofluido ácido).

Nanopartículas de maghemita podem ser produzidas pelo mesmo método,

adicionando-se um agente oxidante à magnetita sintetizada, tipicamente o nitrato

férrico (BEE; MASSART; NEVEU, 1995).

As características das nanopartículas formadas dependem fortemente dos

parâmetros experimentais empregados. Dentre estes parâmetros, destacam-se:

concentração e tipo de sal e base utilizados, pH, força iônica do meio, taxa e

ordem de adição dos reagentes, presença de quelantes e surfatantes (BORLIDO

et al., 2013; LU et al., 2007; HORÁK et al., 2007; MASSART, 1981). Por exemplo,

o rápido aumento do pH para uma faixa de 8,5-10 é essencial, do contrário haverá

formação de um precipitado marrom não magnético, provavelmente de hidróxidos.

Além disso, faixas de temperatura de 25-80 ˚C são apropriadas para a obtenção

de nanopartículas menores que 10 nm (HORÁK et al., 2007).

Em geral, a síntese pode ser expressa pela Equação 2:

2 Fe+3 + Fe+2 + 8 -OH ! Fe3O4 + 4 H2O (2)

!3.1.5. Modificação de superfície e estabilidade coloidal

Apesar do grande progresso observado, nos últimos anos, em relação à

síntese de nanopartículas magnéticas, mantê-las estáveis por longos períodos de

tempo, sem aglomeração, ainda é considerado um desafio. Sabe-se que durante

a síntese via co-precipitação, são formados grupos hidroxila na superfície das

partículas (Fe-OH) e estes são responsáveis pelo caráter anfotérico das mesmas.

Estes grupos podem assumir cargas positivas (Fe-OH2+) e negativas (Fe-O-)

dependendo do pH e força iônica do meio (BORLIDO et al., 2013). Os valores de

pKa para a magnetita foram relatados por Sun e colaboradores (1998) como

sendo 4,4 (pKa1) e 9,0 (pKa2). As características da superfície do óxido de ferro

são mostradas na figura 3.1.

!

!

25

Figura 3.1 – Caráter anfiprótico do óxido de ferro.

Fonte: próprio autor.

Por este motivo, as nanopartículas magnéticas de óxido de ferro apenas

apresentam estabilidade por repulsão eletrostática em valores de pH extremos e

baixa força iônica. Assim, elas são, geralmente, revestidas ou modificadas por

outras moléculas, como surfatantes, quelantes, polímeros, inorgânicos, entre

outros. A modificação de superfície das nanopartículas magnéticas é necessária

por diversas razões: (a) estabilidade coloidal; (b) estabilidade química; (c)

possibilidade de funcionalização com grupos funcionais específicos (-COOH, -

NH2, -SH, -SO3H e etc); (d) redução ou impedimento da lixiviação de íons

metálicos (Co+2, Ni+2) e redução de sua toxicidade (HORÁK et al., 2007;

BORLIDO et al., 2013). A Figura 3.2. mostra um exemplo de partículas,

estabilizadas por um surfatante por camada simples (a) e camada dupla (b).

A estabilidade coloidal das partículas depende da contribuição térmica e do

balanço entre interações repulsivas (estéricas e eletrostáticas) e atrativas (van der

Waals e dipolo-dipolo) (SCHERER; FIGUEIREDO NETO, 2005). As

nanopartículas magnéticas (NPMs) tendem a aglomerar devido à maturação de

Ostwald, onde os cristais maiores são formados por meio da dissolução de

cristais menores, e também por coalescência, onde cristais maiores são formados

por meio da aglomeração de cristais menores (MAHMOUDI et al., 2011). Ambos

os fenômenos são termodinamicamente favoráveis, de modo que o aumento do

tamanho das partículas diminui a superfície específica total de cada partícula

(reduz-se a razão entre a área superficial e o volume), consequentemente,

reduzindo a energia interfacial. Estes aglomerados, a partir de certo tamanho,

deixam de se comportar como materiais superparamagnéticos e continuam

!

!

26

crescendo, devido às interações magnéticas dipolo-dipolo, tornando-se

magnetizados pelos aglomerados vizinhos (comportamento ferrimagnético). Na

presença de um campo magnético externo, a magnetização destes aglomerados

aumenta, aumentando ainda mais seu tamanho. Tal aglomeração, além de

prejudicar a estabilidade coloidal, também resulta na diminuição da área

superficial específica das partículas constituintes do ferrofluido (MAHMOUDI et

al., 2011; HAMLEY, 2003), o que reduz sua aplicabilidade no transporte e

liberação controlada de princípios ativos (BARDAJEE; HOOSHYAR, 2014), bio-

separação de proteínas e ácidos nucléicos (BORLIDO et al., 2013) e imagem por

ressonância magnética (IRM) (CHATTERJEE et al., 2014), por exemplo.

Figura 3.2 - Esquema de partículas revestidas por surfatantes: (a) camada simples; (b) camada dupla.

Fonte: o próprio autor.

A modificação de superfície pode ocorrer durante (in situ) ou após a

síntese das SPIONs. No intuito de melhorar sua estabilidade, diversos métodos

modificados envolvendo a co-precipitação vêm sendo estudados. A utilização de

polímeros e polieletrólitos tem tornado possível o ajuste de tamanhos bastante

reduzidos, até menores que 10 nm (GUPTA; GUPTA, 2005). Uma das técnicas

que tem apresentado melhor empregabilidade na produção de ferrofluidos

bastante estáveis é a polimerização in situ, utilizando-se técnicas de

polimerização radicalar controlada, como as polimerizações mediadas por

nitróxidos (NMP - Nitroxide-Mediated Polymerization), as polimerizações

!

!

27

radicalares por transferência de átomo (ATRP - Atom Transfer Radical

Polymerization) e as polimerizações mediadas por agentes de transferência de

cadeia, via mecanismo reversível de adição-fragmentação (RAFT - Reversible

Addition Fagmentation Chain Transfer). Jain et al. (2010) foram os primeiros,

segundo os próprios autores, a obter um tipo de ferrofluido, o qual chamaram de

verdadeiro (>1017 partículas/mL) utilizando o macroagente RAFT poli(ácido

acrílico-b-acrilamida) como revestimento de nanopartículas de maghemita. Seus

resultados mostram que uma fina camada de polímero (~1 nm) recobria as

nanopartículas de maghemita, que apresentaram comportamento

superparamagnético. As partículas de tamanho bastante reduzido (7 nm)

apresentaram estabilidade coloidal em uma larga faixa de pH (2-12), elevado

percentual mássico de óxido de ferro nas partículas (65%) e até mesmo

estabilidade em meios de elevada força iônica (soluções aquosas de 0-60 %m/m

de nitrato de amônio).

3.1.5.1. Estabilização estérica

Ferrofluidos estabilizados por surfatantes ou polímeros contam com a

repulsão estérica como um dos fatores para prevenir aglomeração e precipitação

de partículas. Os surfatantes, ou polímeros, têm parte de sua cadeia em contato

com o núcleo magnético e a outra parte em contato com o fluido. Quando duas ou

mais partículas se aproximam, uma força de repulsão é criada à medida que as

cadeias se interpenetram (HAMLEY, 2003), como ilustrado na Figura 3.3. A

repulsão estérica interparticular age como uma barreira física que mantém as

partículas em solução e estabiliza o colóide (CHARLES; POPPLEWELL, 1980).

!

!

28

Figura 3.3. Esquema representativo da repulsão estérica entre as partículas revestidas por um surfatante.


As moléculas de cadeia longa utilizadas podem estar ligadas às

nanopartículas por quimissorção, no caso de ácidos graxos de cadeia longa, ou

mais comumente por adsorção física (relacionada às interações de van der

Waals) no caso de polímeros (HAMLEY, 2003).

Em relação ao meio em que as partículas estão dispersas, se este for um

meio apolar, uma camada simples de surfatante é necessária para a estabilização

do colóide, visto que a cadeia hidrofóbica estará em contato com o fluido e a

cabeça hidrofílica estará adsorvida na superfície das partículas inorgânicas.

Contudo, quando se trata de um meio polar, como a água, uma segunda camada

de surfatante é formada de modo que as cabeças polares estejam em contato

com o fluido (SCHERER; FIGUEIREDO NETO, 2005). Um esquema

representativo foi mostrado anteriormente na Figura 3.2. As cabeças polares das

moléculas de surfatante podem ser iônicas (catiônicas, aniônicas ou

zwitteriônicas) ou não-iônicas.

!

!

29

3.1.5.2. Carga de superfície

Além das repulsões estéricas, as interações eletrostáticas desempenham

um importante papel na estabilização de certos tipos de colóides. Para partículas

coloidais carregadas em um meio eletrolítico, tanto a repulsão eletrostática quanto

as interações atrativas de van der Waals contribuem para a energia potencial

total. O equilíbrio entre elas pode ser ajustado para que uma barreira à agregação

seja criada (HAMLEY, 2003).

A carga superficial das partículas pode ser medida por potencial zeta, de

acordo com a mobilidade das partículas carregadas num campo elétrico. A

superfície das partículas é composta por uma camada de contra-íons (camada de

Stern) atraidos pelas cargas opostas às da partícula e uma camada difusa

(SCHERER; FIGUEIREDO NETO, 2005; ISRAELACHVILI, 1991). A figura 3.4

representa esta formação da dupla camada na superfície de uma partícula de

carga superficial líquida positiva.

Figura 3.4 – Representação da dupla camada (camada de Stern e camada difusa) na

superfície de uma partícula de carga superficial líquida positiva.

Fonte: próprio autor.

Os cálculos da repulsão eletrostática interparticular levam em conta a

complexa distribuição de contra-íons na superfície das partículas. Todavia, não é

o intuito deste trabalho entrar em conceitos mais aprofundados de potencial

!

!

30

eletrostático de repulsão entre partículas. Um alto valor de potencial zeta (positivo

ou negativo) é uma indicação de que as interações eletrostáticas desempenham

um papel importante na estabilidade da dispersão das nanopartículas magnéticas

(MAHMOUDI et al., 2011). A figura 3.5. mostra um esquema de repulsão

eletrostática entre duas partículas carregadas positivamente.

Figura 3.5 - Esquema de repulsão eletrostática entre duas partículas revestidas por moléculas carregadas positivamente.


3.1.6. Quitosana

O estudo da quitosana tem sido de grande interesse por vários grupos de

pesquisa, devido à sua disponibilidade e propriedades físico-químicas. A

quitosana é um polissacarídeo de cadeia longa e linear, composto de unidades de

N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina com ligações do tipo β(1→4), como

mostrado na Figura 3.5. (RAVI KUMAR, 2000). A proporção de D-glucosamina e

N-acetil-D-glucosamina determina se o biopolímero é considerado uma quitina ou

quitosana.

Quando a quantidade da primeira unidade (D-glucosamina) supera a

segunda (>50%), o biopolímero é denominado quitosana. Do contrário, denomina-

se quitina (KHOR; LIM, 2003). Este polímero pode ser encontrado na parede

celular de alguns tipos de fungos. Entretanto, a quitosana é mais comumente

obtida a partir da quitina, um composto extraído da carapaça de insetos,

!

!

31

aracnídeos e crustáceos (MERZENDORFER, 2011). Este tipo de quitosana é

proveniente da desacetilação parcial da quitina por via alcalina ou enzimática.

Tanto a fonte quanto o método de preparação da quitosana influenciarão

em suas propriedades físicas e químicas. A massa molar e o grau de

desacetilação são os principais fatores que distinguem a quitosana para cada

aplicação. Ela pode apresentar massa molar entre 50 e 2000 kDa e grau de

desacetilação entre 40 e 98% (RAVI KUMAR, 2000). A figura 3.6 mostra a

estrutura da quitosana.

Figura 3.6 - Estrutura química da quitosana.

Fonte: Adaptado de Ravi Kumar, 2000

3.1.7. Polímeros de massa molar controlada

Durante os últimos anos, o desenvolvimento de técnicas mais avançadas

de polimerização radicalar permitiu superar muitos dos obstáculos e limitações da

polimerização radicalar livre. As chamadas polimerizações radicalares controladas

apresentam a versatilidade das radicalares livres, todavia com um melhor controle

das características do material obtido. Dentre estas técnicas, destacam-se na

literatura: a NMP (Nitroxide-Mediated Polymerization), ATRP (Atom Transfer

Radical Polymerization) e RAFT (Reversible Addition Fagmentation Chain

Transfer).

Os macro-agentes RAFT são polímeros ou copolímeros obtidos por

polimerização radicalar controlada via RAFT (Reversible Addition Fagmentation

Chain Transfer). Estes apresentam um agente de transferência de cadeia em sua

extremidade, como mostrado na Figura 3.7.

!

!

32

Figura 3.7 - Estrutura química do copolímero P(qDMAEMA10-co-BA4)-CTPPA.


Um grande avanço da polimerização controlada via RAFT é o emprego

desses agentes de transferência de cadeia, que, em geral são ditiocarbamatos,

ditioésteres, tritiocarbonatos e outros. Os polímeros obtidos a partir desse

mecanismo de polimerização mantêm o agente de transferência de cadeia em

suas extremidades permitindo sua reinicialização (FRANCO, 2010).

No presente trabalho, destaca-se a utilização de um copolímero aleatório

quaternizado de 2-(dimetilamino) metacrilato de etila e acrilato de butila (figura

3.7). Este material apresenta em suas cadeias grupos laterais com uma função

amino quaternizada, o que o torna interessante para o objetivo proposto para este

trabalho. A presença da carga positiva torna sua utilização na funcionalização das

nanopartículas de óxido de ferro mais atrativa, uma vez que a atração

eletrostática é o principal mecanismo de interação na separação magnética de

microalgas.

3.1.8. Poli(N-vinilcaprolactama)

A poli(N-vinilcaprolactama) (PNVCL) é um polímero biocompatível com

diversas aplicações in vivo devido a sua sensibilidade a temperatura. Este

polímero é proveniente do monômero N-vinilcaprolactama que apresenta um

grupo amida cíclica (lactama) responsável pela hidrofilicidade das cadeias

formadas na polimerização (MEDEIROS et al., 2011). A figura 3.8 apresenta a

estrutura química do PNVCL utilizado neste trabalho.

!

!

33

Figura 3.8 – Estrutura química do PNVCL com terminação hidroxila proveniente do

mercaptoetanol.


Neste trabalho, empregou-se PNVCL com terminação hidroxila

proveniente do mercaptoetanol para a obtenção de materiais aplicados na

separação de microalgas. O mercaptoetanol é um agente de transferência de

cadeia utilizado para o controle da massa molar das cadeias devido as altas

taxas de terminação obtidas quando se emprega este composto em

polimerizações.

O homopolímero de PNVCL foi escolhido devido a presença do grupo

lactama passível de protononação. Este grupo é, portanto, responsável pela

interação eletrostática com a superfície das microalgas.

3.2. Microalgas

!Os biocombustíveis de terceira geração têm se mostrado sustentáveis e

com produção que já atinge a escala industrial (CHAUTON et al., 2015). As

microalgas são interessantes fontes de biocombustíveis que podem gerar uma

produção sustentável em larga escala. Elas apresentam elevada concentração

de triacilgliceróis, como reserva energética de seu metabolismo, que podem

ser convertidos em biodiesel, por exemplo (REIS et al., 2014).

Microalgas podem produzir dez vezes mais óleo do que plantas

oleaginosas em um curto período de tempo. Desta forma, a utilização de

cultivos de microalgas como fonte de matéria prima para biocombustíveis tem

se caracterizado como a geração mais recente de pesquisas científicas na

área (CHISTI, 2007). O principal aspecto em relação a elas é seu

!

!

34

metabolismo. Grande parte das microalgas apresenta regime fotoautotrófico,

ou seja, seu crescimento celular se dá em presença de CO2 e luz, utilizados

na fotossíntese, não sendo necessária a adição de carga orgânica ao meio.

Algumas espécies, entretanto, apresentam outros regimes metabólicos (obtêm

energia a partir de outras rotas), como o mixotrófico, no qual elas utilizam

ambos o CO2 (e luz na fotossíntese) e a carga orgânica, fontes de carbono,

como os açúcares, do meio como matérias primas energéticas para

crescimento, apresentando uma maior produtividade do que microalgas de

regime apenas fotoautotrófico. O interesse em microalgas mixotróficas na área

de biocombustíveis está ligado ao cultivo em meios que apresentem carga

orgânica e possuam custo zero, como o lixiviado e outros meios residuais

(REIS et al., 2014).

As microalgas são de fácil cultivo em meio aquoso e necessitam de

menos água do que culturas oleaginosas terrestres. Elas apresentam

versatilidade quanto ao meio de cultivo, além de elevada taxa de crescimento

(CHISTI, 2007). Estudos apontam que as espécies do gênero Chlorella são

consideradas candidatas promissoras para a produção de lipídios devido ao

seu rápido crescimento e fácil cultivo (HUNTLEY; REDALJE, 2007).

Apesar de ser uma alternativa sustentável, o biodiesel ainda é

considerado um biocombustível de alto custo. Seu processo produtivo pode

ser dividido em quatro etapas: cultivo, colheita, extração dos lipídios e

esterificação; sendo que as três últimas etapas equivalem a 60-70% do custo

total de produção (KIM et al., 2013). A produção de outros bio-produtos e

biocombustíveis a partir de microalgas também possui algumas etapas em

comum com esse processo e, portanto, o cultivo e a colheita são alvos de

estudo constante para aumento de eficiência e redução de custo.

A etapa de colheita ainda representa pelo menos 20-30% do custo de

toda a produção do biocombustível (BARROS et al., 2015). Os desafios

relacionados a essa etapa são a baixa densidade celular no meio, a elevada

quantidade de água utilizada no processo, o tamanho reduzido das microalgas

e sua estabilidade em solução devido às cargas superficiais (MILLEDGE;

HEAVEN, 2013). A utilização de técnicas eficientes de colheita de biomassa é

essencial para a redução dos custos de produção de biodiesel. Algumas das

técnicas mais utilizadas ainda impossibilitam um regime produtivo de

!

!

35

biomassa de custo reduzido. A centrifugação possui uma demanda energética

elevada, apesar de apresentar elevada eficiência de separação. A filtração,

que também apresenta elevada eficiência, requer troca de membranas e

utilização de bombas hidráulicas, o que eleva seu custo. A sedimentação,

apesar de ser uma técnica simples e não diretamente onerosa, apresenta um

dispêndio de tempo muito elevado para aplicação em larga escala, o que pode

também ser convertido em alto custo (BARROS et al., 2015).

As limitações industriais para a produção de biomassa microalgal estão

diretamente relacionadas com o regime de cultivo ao qual são submetidas.

Industrialmente, a produção microalgal é feita por regimes fotoautotróficos,

mixotróficos e heterotróficos. O modo de produção utilizando-se apenas de

gás carbônico como fonte de carbono, i.e., autotrófico, reduz drasticamente o

custo de nutrientes no meio; no entanto, para que a fotossíntese seja

eficiente, a difusão luminosa deve ser eficiente no meio, requerendo, pois,

sistemas rasos, que facilitam a penetração luminosa. Além disso, é sabido que

os regimes autotróficos geram concentração celular reduzida, o que traz

esforços adicionais nas etapas de separação e colheita celular. Quanto aos

regimes mixotróficos e heterotróficos, a etapa de colheita pode ser realizada

de maneira mais branda, visto a maior concentração celular em ambos os

casos. No entanto, a necessidade de haver carbono orgânico no meio,

geralmente presente na forma de açúcares simples, amplia a possibilidade de

contaminação microbiana, especialmente por fungos e outras espécies de

microalgas. Tal efeito é mais pronunciado nas microalgas de água doce em

relação as de ambiente marinho (REIS et al., 2014).

Sabe-se que cada espécie de microalga apresenta características

específicas que auxiliam na diferenciação taxonômica, e que, dentre cada

espécie catalogada, as microalgas podem variar de maneira significativa com

devido aos efeitos mutagênicos do meio. Sendo assim, cada estudo com uma

diferente linhagem é uma oportunidade inovadora no meio acadêmico.

Embora algumas macro-características fisio-morfológicas da composição

celular sejam mantidas entre os indivíduos da mesma espécie, a forma com a

qual certa linhagem responderá a algum estímulo, neste caso, a

magnetoforese, é diferenciada, uma vez que certas características celulares,

como a espessura e a composição da parede celular, variam de acordo com

!

!

36

as condições de cultivo e a capacidade de mutação celular (ZHANG et al.,

2014).

!3.2.1. Métodos de cultivo

O cultivo das microalgas tem por objetivo o aumento da biomassa

celular para obter concentrações mais elevadas do produto desejado por

unidade de volume. Diversos estudos são reportados na literatura em relação

aos meios de cultivo de microalgas. De maneira geral, o meio deve ser

composto por macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg, Si e Fe) e

micronutrientes (Mn, Mo, Co, B, V, Zn, Cu, Se, Br e I) (LOBBAN, 1994), assim

como de água e luz. As microalgas podem ser cultivadas tanto em sistemas

abertos quanto em sistemas fechados. Um fator chave para o cultivo é a

iluminação, por se tratarem de seres com regime foto-autotrófico. Em sistemas

abertos elas contam, principalmente, com a luz solar como fonte de energia,

uma vez que em sistemas fechados a iluminação é proveniente de fontes

artificiais (REIS et al., 2014). A Tabela 3.2 mostra a composição de um meio

Guillard f/2 sem sílica adaptado (GUILLARD, 1975).

Tabela 3.1. Composição do meio f/2 sem sílica adaptado

Componentes Concentração Sal marinho 1 g/L

NaNO3 75 g/L NaH2PO4

.H2O 5 g/L FeCl3

.6H2O 3,15 g/L Na2EDTA 4,3 g/L

ZnSO4.7H2O 22,2 mg/L

MnCl2.4H2O 180 mg/L

Na2MoO4.2H2O 6,3 mg/L

CoCl2.6H2O 10 mg/L

CuSO4.5H2O 9,8 mg/L

Tiamina 100 mg/L Cianocobalamina 0,5 mg/L

Biotina 0,5 mg/L Fonte: Guillard, 1975.

Cultivos em sistemas abertos são usualmente conduzidos em piscinas

ou tanques diretamente expostos ao meio ambiente, enquanto cultivos em

sistemas fechados são conduzidos em biorreatores, que podem ser divididos

!

!

37

em algumas categorias, dentre as quais se encaixam biorreatores tubulares e

de tipo coluna, por exemplo (LOURENÇO, 2006).

!3.2.2. Colheita (separação)

Os processos de colheita (separação) de microalgas têm por intuito a

recuperação de sua biomassa. Tais processos consistem em separações de

sólido-líquido, dentre os quais se destacam os processos físicos e químicos. O

processo de separação da biomassa, ou colheita, pode chegar a 30% do custo de

produção de biomassa a partir de microalgas (GRIMA et al., 2003). Dentre estes

processos, os mais utilizados, atualmente, são: coagulação e floculação química,

centrifugação, sedimentação, filtração. Outros processos menos disseminados

são os elétricos (eletroforese e eletro-floculação) e magnéticos (magnetoforese).

Estes processos envolvem a aplicação de campos elétricos e magnéticos,

respectivamente, para separação da biomassa devido à natureza carregada das

células microalgais (BARROS et al., 2015).

3.2.2.1. Separação magnética (magnetoforese)

Uma das técnicas que mais tem recebido atenção de pesquisadores

para a separação de biomassa a partir de microalgas é a magnetoforese (LEE;

LEE; OH, 2014; TOH et al., 2014; HU et al., 2014). Esta técnica se baseia na

interação eletrostática de partículas magnéticas com a superfície das

microalgas e posterior colheita da biomassa sob um campo magnético

externo. Toh et al. (2014) mostraram a utilização de polímeros catiônicos e

sua influência na eficiência de colheita de microalgas Chlorella sp. em

diversos pH. Nesse estudo, eles mostram que o uso de nanopartículas

magnéticas de óxido de ferro puras é mais restrito, devido ao seu ponto

isoelétrico em pH 5,4. Ademais, eles fazem uma comparação entre o óxido de

ferro encapsulado com quitosana (75-85% desacetilada) e com cloreto de

poli(dialildimetilamônio) (PDDA). As partículas com quitosana apresentaram

elevada eficiência até pH próximo de 8, porém, acima deste, elas se

aproximam de seu ponto isoelétrico, observando-se então uma queda

significativa em sua eficiência. As partículas com PDDA mostraram-se

independentes do pH do meio em relação à eficiência de colheita. Este estudo

!

!

38

não menciona a capacidade de colheita (g-célula seca/g-nanocompósito) das

partículas. Hu et al. (2013) utilizaram nanopartículas de Fe3O4 puras em

ensaios de colheita de microalgas Nannochloropsis maritima em comparação

a outras técnicas de separação físicas e químicas, como floculação,

coagulação e associações entre duas técnicas distintas (floculação e

microfiltração). Eles demonstram a elevada eficiência de colheita (97,5%) da

separação magnética e o baixo tempo de processamento requerido por esta

técnica, além da possibilidade de reciclo das nanopartículas. Em outro estudo,

realizado por Hu et al. (2014), utilizou-se um polímero catiônico e microalgas

Chlorella ellipsoidea. Os autores utilizaram a polietilenoimina (PEI) para

modificar a superfície das nanopartículas de óxido de ferro e obtiveram

elevada eficiência (97%) e capacidade de recuperação (32,61 g-célula seca/g-

nanocompósito), utilizando-se concentração reduzida de partículas no meio de

colheita (20 mg/L).

!

3.2.3. Aplicações da biomassa produzida por microalgas

As aplicações mais simples da biomassa produzida por microalgas

consistem na alimentação humana e animal. Algumas outras aplicações são:

utilização em reservas energéticas (lipídios e carboidratos) como matéria prima de

biocombustíveis, extração de produtos específicos para o desenvolvimento de

cosméticos, na indústria farmacêutica, de pigmentos, corantes naturais, etc.

A utilização eficiente de matéria orgânica abre espaço para aplicações

biotecnológicas, como na bioconservação da energia solar (estocagem de

energia), fermentação para a produção de metano ou de etanol, por exemplo

(LOURENÇO, 2006) e também no tratamento de resíduos, como o estrume,

hidrolisados e o lixiviado (REIS et al., 2014).

!

!

!

39

4. MATERIAIS E MÉTODOS

!4.1. Materiais

Cloreto férrico hexahidratado (FeCl3.6H2O, 98%, Sigma-Aldrich), cloreto

ferroso tetrahidratado (FeCl2.4H2O, 99%, Sigma-Aldrich), hidróxido de amônio

P.A. (27%, Synth), ácido acético glacial P.A. (100%, Merck) foram utilizados como

recebidos.! Quitosana (Mn=1.200.000 g/mol e grau de desacetilação = 65%)

(Figura 3.5) foi gentilmente fornecida pelo Prof. Dr. Sérgio Campana Filho do

Instituto De Química de São Carlos (USP). O copolímero aleatório

P(qDMAEMA10-co-BA4)-CTPPA quaternizado (Mn=2460 g/mol) (Figura 3.6) e o

homopolímero poli(N-vinilcaprolactama) (PNVCL) (Mn= 1863 g/mol) (Figura 3.7)

foram previamente sintetizados pelo grupo de pesquisa do Laboratório de

Polímeros da Escola de Engenharia de Lorena (USP). O copolímero

P(qDMAEMA10-co-BA4)-CTPPA contém um ácido 4-ciano-

4(propilsulfaniltiocarbonil)sulfanil pentanóico (CTPPA) na extremidade do

copolímero quaternizado de poli(2-(dimetilamino) metacrilato de etila-co-acrilato

de butila). Os índices subescritos 10 e 4 representam o número de meros

provenientes de seus respectivos monômeros em cada cadeia polimérica. As

microalgas Chlorella minutissima foram cultivadas e gentilmente cedidas pelo

grupo de pesquisa do Laboratório de Microalgas da Escola de Engenharia de

Lorena (USP). Toda a água utilizada foi destilada e deionizada.

4.2. Síntese das nanopartículas de Fe3O4 funcionalizadas com

P(qDMAEMA10-co-BA4)-CTPPA, quitosana e PNVCL

As nanopartículas foram sintetizadas via co-precipitação em meio aquoso

sob sonicação em um processador ultrassônico VCX 750, Sonics Vibra Cell.

Primeiramente, 1,4061 g de FeCl3.6H2O e 0,5175 g de FeCl2.4H2O foram

dissolvidos em 20 mL de água e a solução foi mantida sob agitação magnética

por 10 minutos. A solução dos sais foi misturada a 55 mL de uma solução aquosa

contendo uma quantidade apropriada de P(qDMAEMA10-co-BA4)-CTPPA (10, 20,

45, 60, 80 ou 100 mg). A mistura foi, então, colocada sob agitação magnética

durante 5 minutos e, em seguida, sonicada em um processador ultrassônico.

!

!

40

Logo no início do processo de sonicação, 5 mL de uma solução concentrada de

NH4OH (27%m/m) foram adicionados. A agitação seguiu por 10 minutos sob

potência de 75 W e posteriormente sob 25 W durante mais 10 minutos. A mistura

manteve-se resfriada por um banho de gelo e etanol, com temperatura inferior a 0

°C.

O produto de cada reação foi purificado por decantação das partículas

magnéticas com o auxílio de um imã (NdBFe) e lavagem com água, repetidas

vezes, para a remoção do excesso de copolímero. Finalmente, as nanopartículas

foram redispersas em 80 mL de água sob sonicação (75 W) durante 10 minutos.

A mesma rota sintética foi utilizada para a síntese das nanopartículas de

Fe3O4 funcionalizadas com quitosana, exceto pela solubilização do polímero.

Primeiramente, 1,4061 g de FeCl3.6H2O e 0,5175 g de FeCl2.4H2O foram

dissolvidos em 20 mL de água e a solução foi agitada numa placa de agitação

magnética com auxílio de uma barra magnética. Separadamente, 45 mg de

quitosana foram solubilizados em 55 mL de solução aquosa 1%v/v de ácido

acético e colocados sob forte agitação magnética 24 horas antes da realização da

síntese para garantir a completa solubilização do polímero. Os demais

procedimentos de síntese e purificação foram os mesmos.

Para a síntese das nanopartículas de Fe3O4, funcionalizadas com

PNVCL, utilizou-se 45 mg de homopolímero.

Para realizar um estudo comparativo, nanopartículas de óxido de ferro

não funcionalizadas (puras) também foram preparadas segundo a mesma

metodologia.

4.3. Caracterização das nanopartículas de Fe3O4 funcionalizados com

P(qDMAEMA10-co-BA4), quitosana, PNVCL e não funcionalizadas

4.3.1. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta

O diâmetro das partículas (DP) e o índice de polidispersidade foram

determinados por espalhamento de luz em um equipamento da marca

Malvern, modelo Nano ZS – Zen3601, locado no Laboratório de Polímeros da

EEL/USP. As medidas foram realizadas após lavagem e redispersão das

!

!

41

nanopartículas em água. A estabilidade coloidal e a interação óxido-polímero

foram estudadas através de medidas de DP em função do pH.

4.3.2. Difratometria de raios X (DRX)

Análises de difratometria de raios X foram realizadas para as amostras

secas das nanopartículas (puras e funcionalizadas). Os parâmetros de análise

utilizados foram: passo de 0,02°, 2θ variando entre 20 e 80°, e tempo por passo

de 10 segundos. O difratômetro utilizado foi da marca Panalytical modelo

Empyrean, locado no Laboratório de Difratometria de raios X, do Departamento

de Engenharia de Materiais da EEL/USP.

4.3.3. Espectrometria no Infravermelho (FTIR)

Uma avaliação qualitativa da composição química das nanopartículas

de óxido de ferro foi obtida por meio de análises de FTIR. Nos espectros,

avaliou-se a intensidade dos picos característicos das ligações Fe-O e das

principais ligações presentes nos polímeros. O material foi analisado na forma

sólida (pó) e livre de umidade numa faixa de número de onda compreendida

entre 400 a 4000 cm-1. Utilizou-se pastilhas de KBr em um equipamento da

marca Perkin Elmer modelo Spectrum GX, locado no Departamento de

Biotecnologia da EEL/USP.

4.3.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

A morfologia das partículas foi avaliada por microscopia eletrônica de

varredura (MEV) em um equipamento da marca LEO modelo 1450VP, locado

no Departamento de Materiais da EEL/USP. Analisou-se amostras das

nanopartículas de óxido de ferro puras e funcionalizadas.

!

!

42

4.4. Caracterização da biomassa microalgal de Chlorella minutissima

4.4.1. Análise espectrofotométrica de densidade ótica

Utilizando-se um espectrofotômetro de UV/visível realizou-se uma

varredura entre os comprimentos de onda 400 e 850 nm, do cultivo das

microalgas Chlorella minutíssima para a determinação do pico máximo de

absorbância para as medições. A varredura foi realizada com um passo de 2

nm. O pico corresponde a absorção da clorofila-a, que se encontra próximo a

690 nm, segundo Lourenço (2006).

A determinação das concentrações de célula seca por volume (g/L) foi

realizada por medidas de absorbância. Medidas foram obtidas em um

espectrofotômetro UV-Vis Genesis 10UV, localizado no Laboratório de

Polímeros da EEL/USP. Determinou-se a relação da concentração de células

em função da absorbância por meio de uma curva de calibração.

Para determinar a biomassa seca das amostras em relação a sua

densidade ótica, amostras da suspensão de microalgas foram diluídas a

várias concentrações e tiveram suas respectivas absobâncias determinadas.

Feito isso, as amostras foram centrifugadas (8000 rpm e 10 min) e lavadas

com água, repetiu-se o procedimento três vezes. Por fim, as amostras foram

secas a 105 °C durante 24 h e pesadas em balança analítica.

4.4.2. Determinação da carga superficial das microalgas

Medidas de potencial zeta das microalgas foram obtidas na mesma

faixa de pH em que os ensaios de separação foram realizados (pH 4-10). As

medidas foram feitas em um equipamento da marca Malvern, modelo Nano ZS

– Zen3601, locado no Laboratório de Polímeros da EEL/USP.

!

!

43

4.5. Avaliação da eficiência das nanopartículas de óxido de ferro na

separação (colheita) de microalgas Chlorella minutissima

4.5.1. Determinação da concentração de nanopartículas aplicada nos

ensaios (dosagem)

Para determinar a concentração utilizada de nanopartículas nos ensaios

de separação, estudou-se a eficiência de separação em função da

concentração de NPs (dosagem). Primeiramente, adicionou-se 1,5 mL de

suspensão de nanopartículas magnéticas, em diversas concentrações (0-500

mg/L), a 20 mL de suspensão de microalgas para obter a floculação destas

células. Após agitação por 1 minuto, a mistura foi posicionada sobre o imã

para sedimentação dos flocos formados. Amostras foram coletadas após 5

minutos de sedimentação e as absorbâncias do sobrenadante do meio foram

medidas.

Por fim, determinou-se uma curva com os pontos de eficiência de

separação (de acordo com as absorbâncias medidas) em função da

concentração de nanopartículas empregadas nos respectivos ensaios. Deste

modo, pode-se determinar a concentração de nanopartículas utilizadas nas

etapas seguintes do trabalho.

4.5.2. Ensaios de separação magnética das microalgas

Os ensaios de separação foram realizados a partir de uma suspensão

de 20 mL de microalgas cuja absorbância inicial foi medida para determinar a

concentração inicial de biomassa. A esta suspensão, 1,5 mL da suspensão

das nanopartículas foi adicionado, na concentração previamente determinada,

e agitou-se a mistura por cerca de 1 minuto para que ocorresse a floculação

das células. Em seguida, a separação magnética dos flocos formados foi

realizada sob efeito do campo magnético de um imã de NdFeB durante 5

minutos. Dada a separação, amostras do sobrenadante foram coletadas e sua

absorbância foi avaliada. Todos os valores de absorbância foram

determinados em um espectrofotômetro UV/visível. Imagens das células e

bem como das nanopartículas floculadas sobre as células microalgais foram

!

!

44

obtidas em um microscópio ótico da marca Motic, modelo B3-223 numa

magnificação de 40 vezes.

Para cada material sintetizado foram realizados ensaios de separação em

valores de pH 4, 5, 6, 8 e 10, a temperatura ambiente, para determinar o efeito do

pH do meio na eficiência de separação dos mesmos. Para tanto, ajustou-se o pH

do meio com solução de HCl 0,1 mol/L e NH4OH 0,1 mol/L.

4.5.3. Eficiência de separação e capacidade de separação

A eficiência de separação (%) foi determinada a partir da metodologia

adaptada de Toh et al. (2014). A eficiência de separação de microalgas foi

obtida pela relação entre a quantidade de biomassa separada por

magnetoforese e a quantidade de biomassa inicial. A quantidade de

microalgas colhida por separação magnética foi determinada pela diferença

entre a absorbância inicial da suspensão de microalgas e a absorbância do

sobrenadante após ensaio de separação com as nanopartículas. Determinou-

se a eficiência de acordo com a Equação 3:

Eficiência! % = !!!!!!

!!

!x!100 (3)

onde A0 é a absorbância inicial da suspensão de células, A5 a absorbância do

sobrenadante após 5 minutos de separação magnética.

A capacidade de recuperação se refere a massa de células (biomassa

seca) separadas a partir do ensaio de separação magnética em relação à

massa de nanopartículas adicionada ao ensaio. As concentrações foram

determinadas a partir de medidas de absorbância das amostras. Calculou-se

os valores de concentração a partir da curva analítica construída

anteriormente. A equação 4 refere-se ao cálculo da capacidade de separação:

CR =!!!!!!!!!

!!"

(4)

onde CR é a capacidade de recuperação de biomassa (g-biomassa seca/g-

nanopartícula), C0 é a concentração inicial de célula seca (g-biomassa

!

!

45

seca/L), V0 o volume inicial da suspensão de microalgas (L), C5 a

concentração de célula seca após a separação (g-biomassa seca/L), V5 o

volume final do ensaio de separação (L) e mNP a massa de nanopartículas

utilizada no ensaio de separação (g-nanopartícula). A massa de

nanopartículas (mNP) é obtida a partir da dosagem de nanopartículas e do

volume do meio de separação.

!

!

46

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Caracterização das nanopartículas de Fe3O4 funcionalizadas com

P(qDMAEMA10-co-BA4), quitosana, PNVCL e não funcionalizadas

A primeira etapa deste trabalho consistiu na síntese e funcionalização de

nanopartículas de óxido de ferro utilizando-se diferentes polímeros como

materiais de revestimento, o que diminuiu sua tendência a aglomeração.

Empregou-se três polímeros diferentes: P(qDMAEMA10-co-BA4), quitosana e

PNVCL, como agentes de revestimento de nanopartículas de Fe3O4 e comparou-

se os resultados com aqueles obtidos para nanopartículas magnéticas puras (não

funcionalizadas), verificando-se que as nanopartículas revestidas apresentaram

estabilidade coloidal e baixa variação de diâmetro de partícula durante alguns

dias.

Esta melhora na estabilidade se deve à presença do copolímero na

superfície do óxido de ferro. A presença de um copolímero de baixa massa molar

pode ter levado à formação de uma camada fina na superfície das nanopartículas,

que contribuiu para a sua estabilização, mantendo-as em suspensão por um

período de tempo mais longo. De maneira geral, o copolímero reduziu o DP das

partículas em suspensão e também contribuiu para a melhoria da estabilidade em

uma larga faixa de pH, como será mostrado.

Além da contribuição do efeito estérico para a estabilização da suspensão,

o P(qDMAEMA10-co-BA4) também contribuiu com a repulsão eletrostática entre as

partículas devido à presença de um grupo amino metilado (quaternizado) em suas

cadeias. A presença de cargas positivas na superfície das nanopartículas foi

crucial nas etapas seguintes deste trabalho.

5.1.1. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) das nanopartículas

A tabela 5.1 apresenta o efeito da concentração de P(qDMAEMA10-co-BA4)

no diâmetro (DP) e índice de polidispersidade (IPD) das nanopartículas

magnéticas. Para efeito de comparação, NP-1 representa as nanopartículas de

óxido de ferro sintetizadas na ausência de P(qDMAEMA10-co-BA4). Em geral, os

resultados obtidos não apresentam variação significativa de DP para as

!

!

47

concentrações escolhidas no presente estudo. É provável que o aumento da

concentração de copolímero em solução durante a síntese tenha levado à

formação de camadas mais grossas sobre a superfície do óxido de ferro e

também à formação de pontes entre as cadeias de partículas diferentes. Desta

forma, tem-se uma formação de aglomerados maiores, os quais levam à obtenção

de maiores valores de DP por espalhamento de luz. Os altos valores de IPD

indicam uma larga distribuição de tamanhos de partículas o que implica nas

variações observadas nos diâmetros médios obtidos, de modo que estes não

seguiram um padrão diretamente relacionado à concentração de copolímero na

síntese.

Tabela 5.1 – Efeito da concentração de copolímero no diâmetro (DP) e índice de

polidispersidade (IPD) das nanopartículas revestidas com P(qDMAEMA10-co-BA4).


Após estes primeiros testes, decidiu-se fixar a concentração de polímero

para as demais sínteses em 0,56 mg/mL. A tabela 5.2 apresenta, os resultados de

DP e IDP obtidos para as nanopartículas funcionalizadas com quitosana e

PNVCL.

Material Concentração de

P(qDMAEMA10-co-

BA4) (mg/mL)

DP (nm) IPD

NP-1 0 345,1 0,249

NP-2 0,125 109,5 0,144

NP-3 0,25 87,95 0,161

NP-4 0,56 101,8 0,15

!

!

48

Tabela 5.2 – Efeito da quitosana e da PNVCL no diâmetro (DP) e índice de

polidispersidade (IPD) das nanopartículas de Fe3O4.


As nanopartículas funcionalizadas com quitosana (NP-5) apresentaram

diâmetro reduzido, o que pode ser visto como uma característica interessante

para a adsorção na superfície das microalgas devido a elevada área

superficial específica. As nanopartículas funcionalizadas com PNVCL

apresentaram elevado DP e IPD, o que pode estar relacionado não somente

ao tipo de síntese empregada, neste trabalho, mas também a ausência de

cargas no grupo lateral em pH elevado (excesso de base durante a síntese).

O material NP-5 apresentou estabilidade em suspensão apenas por

alguns minutos devido a ausência de cargas. O DP reduzido pode ter

auxiliado nesta estabilidade em um curto período de tempo por efeito estérico.

O material NP-6 não apresentou estabilidade em suspensão após a síntese, o

que também está relacionado a ausência de cargas nas cadeias, entretanto o

DP é mais elevado do que das outras NPs e não foi suficiente para mantê-lo

em suspensão.

5.1.2. Efeito do pH no DP das nanopartículas magnéticas

A figura 5.1, apresenta o efeito do aumento do pH do meio no diâmetro

(DP) das nanopartículas magnéticas não funcionalizadas (NP-1) e

funcionalizadas com diferentes concentrações de P(qDMAEMA10-co-BA4) (NP-

2 – NP-4).

Material Polímero Concentração

de polímero

(mg/mL)

Diâmetro das

partículas

(nm)

IPD

NP-5 Quitosana 0,56 176,6 0,137

NP-6 PNVCL 0,56 894,0 0,334

!

!

49

Figura 5.1 – Efeito do pH do meio sobre o diâmetro das nanopartículas magnéticas

não funcionalizadas (NP-1) (a) e funcionalizadas com diferentes concentrações de

P(qDMAEMA10-co-BA4) (NP-2 – NP-4) (b-d).


Pode-se observar que a dependência do diâmetro de partículas (DP) do

óxido de ferro não funcionalizado está relacionada a sua característica

anfiprótica. O Fe3O4 pode ser encontrado na forma protonada (OF-OH2+),

neutra (OF-OH) ou desprotonada (OF-O-) dependendo do pH do meio. Sun et

al. (1998) encontraram dois valores de pKa para o Fe3O4 (pKa1 = 4,4 e pKa2 =

9,0). Para tanto, pode-se observar na figura 5.1 que o óxido de ferro não

funcionalizado em pH 4 apresenta uma certa quantidade de cargas

superficiais positivas (protonado) que foram suficientes para fornecer um DP

nanométrico reduzido (314,7 nm) e estabilidade em solução por um certo

tempo devido a repulsão eletrostática entre as nanopartículas. Já em pH 5,0,

o material apresentou uma elevação significativa no DP devido a diminuição

da protonação de sua superfície, o que reduziu a repulsão eletrostática e

levou a formação de aglomerados maiores devidos as interações dipolo-dipolo

do material magnético. Aumentando-se o pH o material apresentou um padrão

de redução de DP que está diretamente relacionado a desprotonação da

superfície (OF-O-) o que reduz a formação de aglomerados devido a repulsão

entre cargas negativas cada vez mais predominantes e aumenta a

!

!

50

estabilidade do material NP-1 em solução chegando a um DP mínimo de 92,3

nm em pH 10.

Como visto na figura 5.1, os materiais que foram funcionalizados com

P(qDMAEMA10-co-BA4) apresentaram baixa dependência de DP em relação

ao pH do meio. Esta característica está relacionada ao recobrimento da

superfície do óxido de ferro com as cadeias copoliméricas e as propriedades

do P(qDMAEMA10-co-BA4).

A funcionalização da superfície do óxido de ferro, além de reduzir a

formação de aglomerados devido ao impedimento estérico entre cadeias

poliméricas e aumentar a estabilidade em suspensão das NPs ainda reduziu a

dependência do tamanho das NPs em relação ao pH do meio, não havendo

variações significativas em DP para os materiais funcionalizados. Ademais,

devido a presença de um grupo amino carregado no P(qDMAEMA10-co-BA4)

as nanopartículas formadas em NP-2, NP-3 e NP-4 apresentaram cargas

positivas que contribuíram para a repulsão eletrostática entre as partículas, o

que reduziu ainda mais a formação de aglomerados.

A figura 5.2 presenta os resultados de DP obtidos por medidas de

espalhamento de luz em diferentes valores de pH do meio. Com relação as

partículas obtidas, pode-se dizer que, utilizando-se a mesma rota sintética e

uma mesma concentração de polímero para os três materiais estudados (0,56

mg/mL), resultados mais promissores foram obtidos no emprego do

copolímero P(qDMAEMA10-co-BA4) (NP-4).

!

!

51

Figura 5.2 – Efeito da variação do polímero catiônico utilizado sobre o diâmetro das

nanopartículas em diferentes valores de pH: NP-4 (a), NP-5 (b) e NP-6 (c).


As nanopartículas funcionalizadas com quitosana (NP-5) apresentaram

DPs reduzidos e pouca variação destes DPs em função do pH do meio. Esta

característica está mais relacionada a uma baixa presença de grupos amino

nas cadeias devido a grau de desacetilação reduzido (65%). Com isso, as

cadeias em pH ácido (4 e 5), apesar de haver protonação dos grupos amino,

apresentaram DP pouco mais elevado do que em pH mais alto,

diferentemente do que se esperaria. Pode-se considerar que em pH ácido os

grupos amino estão protonados e que causem repulsão na própria casca da

partículas, aumentando o DP. É possível que a alta massa molar das cadeias

e o baixo grau de desacetilação tenham resultado em nanopartículas

estabilizadas quase que exclusivamente por efeito estérico. A redução do DP

em pH básico seria, então, devido ao desaparecimento das cargas

(desprotonação dos grupos amino), o que levaria as cadeias poliméricas a se

aproximarem mais do núcleo da partícula.

O material NP-6 se mostrou dependente do pH do meio para os

diâmetros de partícula. As nanopartículas funcionalizadas com PNVCL

apresentaram redução do DP em pH 4 devido a protonação do grupo lateral

lactama em suas cadeias o que resultou em repulsão eletrostática entre as

!

!

52

partículas diminuindo a formação de aglomerados. A partir dai, com o

aumento do pH, há uma redução de cargas por desprotonação do grupo

lactama que torna mais acentuada a aglomeração por interações físicas entre

as cadeias de polímero na superfície do óxido de ferro. Assim, em pH básico

as cadeias não mais se apresentam carregadas e as NPs passam a

apresentar DP mais elevado.

5.1.3. Difratometria de raios X

A figura 5.3 apresenta os difratogramas de raios X obtidos para o óxido

de ferro não funcionalizado (a) e para as nanopartículas funcionalizadas com

P(qDMAEMA10-co-BA4) (reações NP-2 – NP-4) (b-d), quitosana (reação NP-5)

(e) e PNVCL (reação NP-6) (f).

Figura 5.3 – Difratogramas de raios X das nanopartículas de óxido de ferro: não

funcionalizadas (a), funcionalizadas com P(qDMAEMA10-co-BA4) (b-d), com quitosana (e) e

com PNVCL (f).


Observa-se que os picos característicos do Fe3O4 também estão

presentes nos difratogramas das nanopartículas magnéticas revestidas com

os polímeros. Os picos próximos de ângulos (2θ) de 30, 35, 43, 53, 57 e 62°

!

!

53

são referentes ao Fe3O4 (RAHMAN et al., 2011). A presença dos picos é

assinalada por seus respectivos índices de Miller (220), (311), (400), (422),

(440) e (511). Os padrões cristalinos dos materiais se apresentam bastante

coincidentes, o que indica que a presença dos polímeros na superfície não

alterou o estado oxidativo do óxido de ferro ou mesmo o padrão de seu

difratograma.

5.1.4. Morfologia

As figuras 5.4-7 apresentam a morfologia das nanopartículas obtidas por meio

de micrografias de MEV.

Figura 5.4 – Micrografias de MEV do óxido de ferro não funcionalizado (NP-1):

magnificação 1000x (a) e 500x (b).


A figura 5.4 mostra que as nanopartículas de óxido de ferro não

funcionalizadas (NP-1), apresentam grandes aglomerados, como esperado,

devido às interações hidrofóbicas e dipolo-dipolo entre as partículas, que

favorecem a aglomeração dos materiais na ausência de um agente de

revestimento. Alguns aglomerados menores podem ser vistos na micrografia

indicando a presença de algumas partículas em escala nanométrica de

tamanho. Em todas as micrografias, ficam evidentes os altos valores de

índices de polidispersidade (IPD) obtidos por DLS e relatados no início desta

!

!

54

seção. Pode-se observar que, de maneira geral, a magnetita, funcionalizada

ou não, apresenta-se na forma de aglomerados de tamanhos variados. As

figuras 5.5 (a-f), referentes às nanopartículas funcionalizadas com

P(qDMAEMA10-co-BA4), apresentam uma menor quantidade de placas

(aglomerados) de óxido de ferro nas amostras, o que indica uma melhor

funcionalização de suas superfícies. Essa funcionalização se mostrou

responsável pela redução dos tamanhos e aumento da homogeneidade do

material.

Figura 5.5 – Micrografias de MEV das nanopartículas funcionalizadas com

P(qDMAEMA10-co-BA4), obtidas nas reações NP-2: magnificação 1000x (a) e 3000x (b); NP-

3: magnificação 1000x (c) e 3000x (d); NP-4: magnificação 1000x (e) e 3000x (f).

!

!

55


Os materiais mostrados nas figuras 5.6 e 5.7, referentes às

nanopartículas funcionalizadas com quitosana e PNVCL, apresentaram maior

quantidade de óxido livre, na forma de placas, o que indica uma menor

eficácia na rota sintética para o revestimento do óxido de ferro com estes tipos

de polímeros. Ademais, estes materiais apresentaram maiores DP nos

estudos realizados, o que será mostrado no estudo do efeito do pH sobre o

DP.

Figura 5.6 – Micrografias de MEV das nanopartículas funcionalizadas com quitosana

(reação NP-5): magnificação 1000x (a) e 3000x (b).


!

!

56

Figura 5.7 – Micrografias de MEV das nanopartículas funcionalizadas com PNVCL (reação

NP-6): magnificação 1000x (a) e 3000x (b).


5.2. Caracterização da biomassa microalgal de Chlorella minutissima

5.2.1. Análise espectrofotométrica de densidade ótica

Observou-se um pico máximo em 685 nm, o que está de acordo com o

esperado (LOURENÇO, 2006). Além disso, uma varredura com o óxido de

ferro diluído na mesma faixa também foi realizada. Não foram observados

picos ou bandas próximos a 685nm. Portanto, as medições neste trabalho

foram realizadas neste valor.

De acordo com o método descrito anteriormente, foi possível obter uma

relação linear entre a concentração de células secas e a absorbância medida

no comprimento de onda determinado (685 nm). A curva analítica é

apresentada na figura 5.8.

!

!

57

Figura 5.8 – Relação entre a concentração de biomassa e a absorbância da suspensão das microalgas.!!!!

!Fonte: próprio autor.

Pode-se observar um bom coeficiente de correlação (R2=0,99975).

Portanto, os valores de concentração determinados nos experimentos

puderam ser calculados a partir desta relação.

.

5.2.2. Carga superficial das microalgas

A figura 5.9 apresenta a variação do potencial zeta das microalgas em

função do pH do meio. Pode-se observar que numa faixa de pH entre 4 e 10 a

carga superficial das microalgas é negativa. Tais resultados corroboram com a

escolha dos polímeros catiônicos empregados neste trabalho, em especial o

P(qDMAEMA10-co-BA4)-CTPPA, considerando-se que a interação eletrostática

entre as nanopartículas e as microalgas é um dos mecanismos de interação entre

elas.

!

!

58

Figura 5.9 – Efeito da variação do pH sobre a carga superficial das microalgas (potencial

zeta).


De acordo com o esperado, a interação eletrostática se mostrou um

fator muito importante na adsorção das nanopartículas nas células

microalgais, como será demonstrado nos itens seguintes.

5.3. Ensaios de separação das algas Chlorella minutissima utilizando

as nanopartículas magnéticas

A figura 5.10 mostra a variação da eficiência de separação,

determinada conforme descrito no item 3.5.3. Primeiramente, diferentes

concentrações de nanopartículas magnéticas foram utilizadas nos ensaios

para determinar uma concentração ótima de nanopartículas. Assim, essa

concentração foi fixada e outros parâmetros, tais como o pH e concentração

de polímero empregada na síntese, foram posteriormente avaliados em função

da eficiência de separação.

!

!

59

Figura 5.10 – Relação entre a dosagem de nanopartículas nos ensaios de separação

e a eficiência de separação obtida.


Devido ao comportamento logarítmico da função optou-se por trabalhar

em dosagens próximas de 250 mg/L onde observa-se uma mudança de

tendência da curva e sua aproximação de um platô. Assim sendo, para

concentrações superiores a 250 mg/L não se observam variações

significativas na eficiência de separação. Utilizou-se, portanto, nos ensaios

posteriores dosagens de nanopartículas equivalentes a 230 mg/L.

5.3.1. Interação entre as nanopartículas e a superfície das microalgas

(mecanismo de separação)

A floculação de suspensões está relacionada a diversos mecanismos,

que podem atuar combinados ou isolados, de acordo com o meio e o tipo de

material floculante. No presente trabalho, os mecanismos propostos são a

combinação de neutralização de cargas e a formação de pontes poliméricas

entre as microalgas. O primeiro está relacionado com a atração eletrostática

entre cargas opostas de modo que elas sejam neutralizadas. Neste caso, as

nanopartículas positivas adsorveriam sobre as microalgas negativas

eliminando o efeito de estabilização por repulsão eletrostática em suspensão

!

!

60

das mesmas. Outro mecanismo proposto, atrelado a este, é a formação de

pontes entre as microalgas devido à presença de cadeias poliméricas de

cargas opostas a elas (VANDAMME; FOUBERT; MUYLAERT, 2013). Este

mecanismo é observado devido ao tipo de nanopartículas formadas, ou seja,

núcleo-casca. As partículas estão funcionalizadas por copolímeros catiônicos

que podem adsorver em mais de uma célula, formando pontes e resultando na

obtenção de grandes flocos a partir destas pontes.

Nos ensaios de separação realizados, estudou-se o efeito do pH do

meio sobre a eficiência de separação e capacidade de recuperação das

microalgas, além do tipo de nanopartícula empregada nos ensaios. Diferenças

quantitativas acentuadas foram observadas entre as nanopartículas

funcionalizadas e aquelas que não sofreram modificação de sua superfície

(óxido de ferro puro). Além disso, os resultados também variaram em função

do tipo de polímero utilizado como agente de funcionalização das

nanopartículas magnéticas. A separação magnética é esquematizada por

meio de imagens, como mostrado na figura 5.11a. As figuras 5.11b e 5.11c

apresentam as imagens de microscopia ótica das microalgas em suspensão e

as nanopartículas floculadas sobre as microalgas durante os ensaios,

respectivamente. Como pode ser observado, o meio em que as microalgas

estão (figura 5.11b) é um meio diluído, o que representa uma das dificuldades

em trabalhar com microalgas como fonte de matérias primas, conforme

discutido por Milledge e Heaven (2013).

!

!

61

Figura 5.11 – Esquema dos ensaios de separação magnética da Chlorella

minutissima (a), microscopia ótica das suspensão de microalgas (b) e microscopia ótica da

floculação das nanopartículas sobre as células microalgais (c).


Entretanto, os resultados obtidos nos ensaios de magnetoforese

mostraram-se eficazes, com rápida floculação e alta taxa de sedimentação.

Como visto, as células de Chlorella minutissima apresentam superfície

negativa em toda a faixa de pH estudada neste trabalho (figura 5.9), enquanto

que o Fe3O4 puro é um composto anfiprótico, cuja carga superficial depende

do pH. Esta característica se mostrou não somente relacionada ao DP, mas

também a eficiência de separação das microalgas.

Assim, as nanopartículas de Fe3O4 apresentaram atração mais

acentuada à superfície das microalgas em pH mais ácido (pH 4) devido à

interação eletrostática mais forte. Com o aumento do pH a intensidade desta

interação diminui até o ponto em que há uma inversão de carga superficial

líquida (pH>PIE), como pode ser observado na figura 5.1 pelo efeito de

variação de DP. Entretanto, acima do valor teórico do PIE ainda existe uma

considerável separação magnética das microalgas, o que indica que o

mecanismo de adsorção das nanopartículas às células não se restringe

apenas à atração eletrostática. A figura 5.12 apresenta o efeito da

!

!

62

funcionalização do óxido de ferro, empregando-se o copolímero quaternizado,

na eficiência de separação em uma faixa de pH entre 4 e 10.

Figura 5.12 – Efeito da funcionalização do óxido de ferro e da concentração de

copolímero empregada nas sínteses sobre a eficiência de separação das microalgas

Chlorella em diferentes pH. NP-1 (a), NP-2 (b), NP-3 (c) e NP-4 (d).


Devido ao tamanho bastante reduzido das nanopartículas, estas

apresentam uma área e energia superficial específica muito elevada, o que

torna a sua adsorção na superfície das microalgas ainda mais forte. Li et al.

(2009) demonstraram que mesmo aplicando-se óxido de ferro revestido por

uma dupla camada de ácido oleico, onde grupos carboxílicos (protonados ou

desprotonados) estariam em contato com o meio aquoso, existe uma forte

adsorção e separação magnética na separação magnética de células. Eles

consideram que, devido à complexa composição da membrana de uma célula

(proteínas, carboidratos, lipo-polissacarídeos, entre outros), a matriz externa

da membrana pode formar interações hidrofóbicas com as nanopartículas

aplicadas nos ensaios e, portanto, haverá adsorção e separação magnética

das células. Além das interações hidrofóbicas, os autores se referem à grande

diferença de tamanho entre as nanopartículas e as células, o que também

!

!

63

contribui com o mecanismo de adsorção e é chamado de efeito de tamanho

nanométrico.

Assim, considera-se que a interação hidrofóbica e o efeito do tamanho

foram suficientemente fortes, acima (ou próximo) do PIE do óxido de ferro,

para fornecer uma eficiência de separação das microalgas acima de 60%

(figura 5.12). Em pH 5, o DP é muito mais elevado do que em outros valores

de pH, conforme mostrado da figura 5.1 devido à baixa concentração de

cargas na superfície, o que favorece a aglomeração. Entretanto, durante os

ensaios de separação das microalgas, os aglomerados podem ter se desfeito

devido à presença das cargas negativas das microalgas e, portanto, a

eficiência e capacidade de recuperação ainda seguem o padrão esperado.

Em pH básico (8 e 10) observou-se um aumento da eficiência de

separação, em comparação com o pH 6 (figura 5.12). Isto pode estar

relacionado ao efeito da redução do tamanho das partículas devido a

desprotonação da superfície e a autofloculação das microalgas. Na figura 5.1

observa-se um tamanho mais reduzido de partículas para o óxido de ferro

(NP-1) nos valores de pH 8 e 10. Este efeito também pode ser observado na

figura 5.13, onde se observa um aumento da capacidade de recuperação de

células durantes os ensaios nestes mesmos valores de pH. Ademais, este

aumento é devido a auto-floculação das microalgas em meio alcalino, como

demonstrado por Wu et al. (2012). Os autores realizaram experimentos de

auto-floculação de microalgas em função do pH do meio com diversos

gêneros de microalgas, incluindo uma espécie de Chlorella, e obtiveram

resultados quanto à auto-floculação em meios alcalinos. Apesar de cada

espécie ter demonstrado comportamento quantitativo diferente, de maneira

geral, todas apresentaram auto-floculação mais acentuada a partir de pH 8. A

partir de 8, o aumento no pH aumentou ainda mais a auto-floculação.

Com relação às nanopartículas funcionalizadas pelo P(qDMAEMA10-co-

BA4) (reações NP-2, NP-3 e NP-4), pode-se observar uma melhoria tanto no

diâmetro (redução) e estabilidade coloidal, quanto nos resultados dos ensaios

de separação. Estas mudanças estão relacionadas ao recobrimento da

superfície do óxido de ferro com cadeias poliméricas que apresentam carga

oposta àquela observada na superfície das microalgas. Além disso, existe o

efeito de pontes formadas pelos polímeros com a superfície de duas ou mais

!

!

64

células de microalga, o que resulta em grandes flocos, aumentando ainda

mais a floculação (VANDAMME et al., 2013).

Figura 5.13 - Efeito da funcionalização do óxido de ferro e da concentração de

P(qDMAEMA10-co-BA4) empregada nas sínteses sobre a capacidade de recuperação das

microalgas Chlorella em diferentes pHs. NP-1 (a), NP-2 (b), NP-3 (c) e NP-4 (d).


Uma das diferenças mais acentuadas entre as nanopartículas

funcionalizadas e as não funcionalizadas foi o efeito do pH sobre seu

tamanho. Enquanto o óxido de ferro não modificado (NP-1) apresentou

variações de DP para diferentes valores de pH do meio, as nanopartículas

recobertas pelo P(qDMAEMA10-co-BA4) se mostraram quase que

independentes do efeito do pH. Estas variações de DP devido ao efeito do pH

e à presença do P(qDMAEMA10-co-BA4) se mostraram diretamente

relacionadas à interação com as microalgas.

Pode-se observar na figura 4.1 que para NP-2, NP-3 e NP-4 não houve

variação significativa de DP em função do pH do meio, o que está relacionado

à estabilização, devido a adsorção do copolímero na superfície do óxido de

ferro. O efeito das cadeias na superfície das NPs, como descrito

anteriormente, está relacionado à repulsão estérica entre cadeias poliméricas,

o que evita sua aglomeração e aumenta a sua estabilidade em suspensão.

Além disso, a presença do grupo amino carregado também contribuiu para a

!

!

65

repulsão eletrostática entre as partículas, diminuindo ainda mais a formação

de aglomerados.

A variação da concentração de P(qDMAEMA10-co-BA4) na etapa da

síntese resultou em diferentes tamanhos de partículas e, provavelmente em

diferentes arranjos de partículas, o que afetou o mecanismo de interação

entre as NPs e as microalgas.

Dentre os três materiais obtidos (NP-2/3/4), NP-2 apresentou os

menores valores de DP na faixa de pH estudada, observando-se um DP tão

reduzido quanto 64,8 nm em pH 8, por exemplo. Supõe-se que as

nanopartículas obtidas (NP-2) apresentam uma fina camada de copolímero

em sua superfície e que tenha havido uma menor formação de aglomerados

do tipo cacho (cluster), o que resultaria em uma diminuição de DP. Com isto,

este seria o material com maior superfície específica. Por outro lado, NP-3

apresentou maiores DPs do que NP-4. Isto indica que a concentração de

P(qDMAEMA10-co-BA4) pode ter influenciado na formação de partículas com

um único núcleo de partículas de óxido de ferro com uma casca de polímero

(core-shell) para baixas concentrações (NP-2) e a formação de partículas

maiores na forma de aglomerados com múltiplos núcleos de óxido de ferro

(cluster) para maiores concentrações (BORLIDO et al, 2013). Aparentemente,

existem outros fatores regendo esta formação dos núcleos de óxido de ferro,

ou seja, fatores que influenciaram na nucleação e crescimento de cristais e

também no tipo de revestimento das partículas. Assim sendo, as diferenças no

DP entre NP-3 (137,5-188,9 nm) e NP-4 (90,3-140,3 nm) mostraram-se como

um dos principais fatores a afetar a eficiência de separação das microalgas. O

recobrimento da superfície do óxido de ferro afeta o diâmetro das partículas e,

portanto, pode ser considerado como um importante fator que afeta a

eficiência de separação das microalgas.

Hu et al. (2014) estudaram o efeito da concentração do homopolímero

polietilenoimina (PEI) na funcionalização de óxido de ferro e sugeriram que

variações na separação magnética seriam devido ao recobrimento parcial da

superfície do óxido de ferro, havendo, portanto, uma variação das

características das partículas em função da variação da concentração de

polímero, existindo um limite máximo a partir do qual a concentração de

polímero não influenciaria mais a separação magnética.

!

!

66

Portanto, pode-se afirmar que existe um balanço entre os mecanismos

de interação entre as nanopartículas e as microalgas (interação eletrostática,

efeito nanométrico e interações hidrofóbicas). No caso de NP-2, tomando-se o

pH 6 como exemplo (DP = 67 nm), considera-se que o efeito do tamanho

reduzido tenha prevalecido sobre uma maior concentração de copolímero

catiônico (responsável pela interação eletrostática) empregada em NP-3 (DP =

156.3 nm). NP-4, mesmo tendo apresentado maior DP (119,6 nm) que NP-2

(figura 5.1), o que resulta em uma menor área superficial específica,

apresentou os resultados mais relevantes quanto a magnetoforese (figura

5.12). É possível que NP-4 apresente aglomerados com múltiplos núcleos e

uma camada mais grossa de copolímero o que aumentaria a carga e a

quantidade de pontes de polímero entre NPs e células, levando a uma melhor

floculação. Isto fica claro quando se observa a capacidade de recuperação

das microalgas e sua eficiência de separação, apresentada na figura 5.12. Em

pH 8 e 10 pode ter havido auto-floculação das microalgas, o que resultou na

melhoria da separação.

De maneira geral, pode-se dizer que não se obteve 100% de

funcionalização das nanopartículas, como mostrado nas micrografias obtidas

por MEV. Dessa forma, o efeito do pH sobre o DP das nanopartículas obtidas

em NP-2 – NP-4 está atrelado a quaisquer partículas de óxido de ferro não

funcionalizadas que estejam sujeitas ao efeito do pH. Isto fica mais claro em

pH 6 para todos os materiais (figuras 5.12 e 5.13) onde o óxido puro estaria

mais próximo da neutralidade de carga e apresentaria menor interação com as

microalgas.

5.3.2. Estudo do tipo de polímero empregado e o efeito do pH

Além do copolímero P(qDMAEMA10-co-BA4), estudou-se o efeito de

outros polímeros (quitosana e PNVCL) na separação magnética da Chlorella

sp. A escolha dos polímeros, assim como feito com o copolímero, deu-se de

acordo com suas estruturas químicas, objetivando-se a interação eletrostática

entre as nanopartículas e as microalgas, e um tamanho reduzido de

partículas.

!

!

67

Um dos polímeros utilizados para a funcionalização do óxido de ferro foi

a quitosana (NP-5), um polímero natural que apresenta grupos amino em suas

cadeias em quantidades variáveis de acordo com seu grau de desacetilação.

A quitosana utilizada apresenta 65% de desacetilação, o que significa que

65% dos grupos acetil foram substituídos por grupos amino, o que torna este

polímero sujeito a protonação e interação com a superfície das microalgas.

O outro polímero empregado na funcionalização para os ensaios de

separação magnética foi um homopolímero de poli(N-vinilcaprolactama)

(PNVCL) (NP-6), devido à presença do heteroátomo nitrogênio na função

lactama no grupo lateral das cadeias.

Apesar das nanopartículas funcionalizadas com quitosana

apresentarem variação de tamanho em função do aumento do pH bastante

similar àquelas funcionalizadas pelo P(qDMAEMA10-co-BA4) (Figura 5.2), sua

eficiência nos ensaios de magnetoforese demonstrou que houve menor

interação com as células, como mostram as figuras 5.14 e 5.15.

Figura 5.14 - Efeito da variação do polímero catiônico utilizado sobre a eficiência de

separação das microalgas em diferentes valores de pH: NP-4 (a), NP-5 (b) e NP-6 (c).


Os resultados estão relacionados diretamente ao grau de desacetilação

do polímero. Para tal aplicação, um grau de desacetilação de 65% pode não

!

!

68

ter sido suficientemente alto, devido à baixa quantidade de grupos amino nas

cadeias. Mesmo em pH ácido, onde os grupos estariam protonados, o grau de

desacetilação limitou a interação eletrostática entre as células e as

nanopartículas. Segundo observado nas figuras 5.14 e 5.15, em pH ácido,

quando os grupos das cadeias de quitosana estariam protonados, a atração

eletrostática com as microalgas seria mais forte. A medida que o pH aumenta,

os grupos –NH3+ são desprotonados e as partículas deixam de apresentar

carga positiva em sua superfície. O ligeiro aumento na separação em pH 8 e

10 pode estar relacionado com a auto-floculação das microalgas em meio

alcalino, como citado.

Figura 5.15 - Efeito da variação do polímero catiônico utilizado sobre a capacidade de

recuperação das microalgas em diferentes valores de pH: NP-4 (a), NP-5 (b) e NP-6 (c).


Apesar dos experimentos de Wu e colaboradores (2012) terem

considerado um tempo mais longo para a auto-floculação do que o tempo

utilizado nos ensaios de separação deste trabalho, pode-se dizer que houve

influência da alcalinidade do meio nos resultados obtidos. Assim, mesmo que

as nanopartículas tenham apresentado menor, ou nenhuma, carga positiva

superficial, os resultados foram superiores aos obtidos em pH 6, mesmo com

a diminuição de DP para os produtos de NP-4 e NP-5.

!

!

69

Em relação às nanopartículas onde empregou-se a PNVCL como

agente de revestimento e funcionalização (reação NP-6), observou-se um DP

muito elevado em comparação aos outros polímeros, bem como baixa

estabilidade coloidal. A princípio, considerou-se que as nanopartículas de

óxido de ferro não teriam sido funcionalizadas e que portanto teriam formado

grandes aglomerados. Entretanto, a figura 5.2 (pg. 47) mostra que a variação

do diâmetro de partículas em função do aumento do pH apresentou o mesmo

comportamento, quando comparado àquele para o óxido de ferro não

funcionalizado. Dessa forma, uma explicação mais cabível seria de que houve

funcionalização da superfície do óxido de ferro, entretanto pode-se ter

formado grandes aglomerados com múltiplos núcleos e uma grande

quantidade de polímero formando pontes. Em pH ácido, supõe-se que o grupo

lactama do homopolímero estaria protonado, levando a menores valores de

DP, devido à repulsão entre as cadeias de polímero e, portanto, maior

eficiência de separação, assim como maior capacidade de recuperação.

Entretanto, em pH básico não se observaria nenhum grupo carregado de

modo que as interações hidrofóbicas entre as cadeias prevaleceriam e as

partículas aglomerariam. Assim, aumentar-se-ia DP e a ausência de cargas,

atrelada a uma menor área superficial, diminuiria a separação das microalgas.

Pode-se afirmar que em pH 10 houve uma certa taxa de auto-floculação das

microalgas e portanto os resultados são superiores àqueles em outros valores

de pH.

5.3.3. Efeito do volume na separação magnética

Visando-se avaliar o efeito do volume sobre a separação das

microalgas, realizou-se um ensaio em um volume dez vezes maior (200 mL)

do que aquele empregado nos demais testes de separação. Ambos os ensaios

foram efetuados com as nanopartículas funcionalizadas com maior

concentração de P(qDMAEMA-co-BA) (NP-4) em pH 4. A tabela 5.3 apresenta

a diferença entre os resultados obtidos em cada um dos ensaios.

!

!

70

Tabela 5.3 – Comparação dos resultados obtidos quanto ao aumento do volume nos

ensaios de separação.

Material Volume do

meio (mL)

Massa de

NP (mg)

Eficiência de

separação (%)

Capacidade de

recuperação (g-

biomassa seca/g-NP)

NP-4 20 5 93,67 4,923

NP-4 200 50 70,06 2,442


Apesar de ter havido uma redução de mais de 20% na eficiência de

separação e a capacidade de separação ter sido reduzida à metade, não se

pode afirmar que o aumento do volume seria prejudicial ao processo

utilizando-se as nanopartículas NP-4. Seria necessário realizar um estudo de

custos de processo, principalmente em relação ao tempo de separação e ao

volume em função da massa de nanopartículas, para verificar quais seriam os

pontos ótimos no processo. Desta forma, obter-se-ia os valores mais

economicamente viáveis para a separação magnética, que provavelmente não

seriam altos valores de eficiência, ou mesmo volumes pequenos. Além destes

fatores, diversos outros deveriam ser considerados, como o formato e o tipo

de imã empregado no processo, agitação e concentração inicial do meio, entre

outros.

!

!

71

6. CONCLUSÃO

O objetivo principal deste trabalho consistiu na avaliação do efeito do

uso de nanopartículas magnéticas de Fe3O4 funcionalizadas com diferentes

polímeros em ensaios de separação magnética de microalgas Chlorella

minutissima. Empregou-se três polímeros diferentes como agentes de

revestimento e funcionalização das nanopartículas magnéticas. Os resultados

foram comparados com aqueles obtidos utilizando nanopartículas de Fe3O4

não funcionalizadas.

Primeiramente, as nanopartículas magnéticas sintetizadas foram

caracterizadas quanto ao seu diâmetro e índice de polidispersidade,

cristalinidade e morfologia. Em seguida, a eficiência de separação e a

capacidade de recuperação das microalgas, utilizando-se estas

nanopartículas, foram medidas em ensaios de magnetoforese. A partir dos

resultados obtidos neste trabalho, observou-se que certas características das

nanopartículas de óxido de ferro, como tamanho, por exemplo, influenciaram

na eficiência da separação magnética de microalgas Chlorella minutissima.

Além disso, o pH do meio também exerceu uma influência significativa para as

nanopartículas de óxido de ferro puro e óxido de ferro funcionalizado com

quitosana e PNVCL na eficiência de separação das microalgas. O mesmo não

foi observado para as NPs funcionalizadas com P(qDMAEMA-co-BA).

Os resultados obtidos foram promissores em comparação com

trabalhos encontrados na literatura. Utilizando-se baixa concentração de

copolímero e uma baixa dosagem de nanopartículas nos ensaios pode-se

obter eficiência de separação de até 93%, com apenas cinco minutos de

ensaio, e capacidade de recuperação de 4,91 g-biomassa seca/g-

nanopartícula).

A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir, ainda, que:

• As nanopartículas obtidas a partir da funcionalização do óxido de ferro

com diferentes concentrações de P(qDMAEMA10-co-BA4) não

apresentaram variação significativa de diâmetro de partícula. Além

disso, estas nanopartículas apresentaram variação pouco significativa

em relação à variação do pH do meio;

!

!

72

• Difratogramas de raios X mostraram a presença de picos característicos

de Fe3O4 em todos os materiais;

•

• Micrografias de MEV mostraram a presença de aglomerados de

nanopartículas;

• As nanopartículas sintetizadas com a maior concentração de

P(qDMAEMA10-co-BA4) (0,56 mg/mL) apresentaram os melhores

resultados nos ensaios de separação devido à interação eletrostática

mais forte com a superfície das microalgas, além da influência dos

outros mecanismos de separação propostos;

• Em relação aos polímeros empregados na funcionalização, as

nanopartículas funcionalizadas pelo copolímero P(qDMAEMA10-co-BA4)

mostraram-se mais eficazes na separação magnética das microalgas,

devido ao seu menor DP, à presença de cargas positivas nas cadeias e

à fraca dependência do pH do meio.

!

!

73

7. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS

De acordo com os resultados obtidos sugere-se os seguintes estudos:

• Efeito da temperatura sobre os ensaios de separação das microalgas,

que seria realizado por meio de isotermas de adsorção utilizando-se as

mesmas nanopartículas obtidas neste trabalho. Além disso, seria muito

interessante o estudo do tipo de adsorção nos ensaios de separação

(camada simples, múltipla, heterogênea ou outro tipo) das microalgas

Chlorella minutissima, especificamente. Os resultados de síntese e

parâmetros dos ensaios de separação são essenciais para este estudo

sugerido;

• Carga superficial das nanopartículas (potencial zeta), de maneira

quantitativa para um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos

na separação magnética das microalgas. Além disso, a determinação

da magnetização de saturação das nanopartículas obtidas. Neste

trabalho, estudou-se os efeitos das nanopartículas e os mecanismos de

separação apenas de maneira qualitativa;

• Proporção mássica entre óxido de ferro e polímero nas nanopartículas

e sua composição química. É fundamental manter uma proporção

adequada entre os materiais, de modo que uma baixa quantidade de

óxido de ferro diminua a magnetização de saturação das

nanopartículas, assim como uma baixa quantidade de cadeias

poliméricas na superfície diminuiria a carga de superfície, o que

prejudicaria o mecanismo de separação;

• Recuperação e capacidade de reciclo das nanopartículas nos ensaios

de separação, para avaliar a perda de nanopartículas, no reciclo, a

diminuição da eficiência de separação e a capacidade de recuperação

das microalgas, determinando-se um número máximo de reciclos, que

ainda permita uma separação adequada;

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!

74

• Custos envolvidos neste processo, assim como o aumento de escala e

otimização da dosagem de nanopartículas envolvidas nos ensaios.

!

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75

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