UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE … · fornecido pelo Ministério da Saúde...

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS

FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

SEGURANÇA E EFICÁCIA DE UM SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE

LIOFILIZADO EM ACIDENTES OFÍDICOS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA: UM

ENSAIO CLÍNICO PROSPECTIVO, ABERTO, CONTROLADO, RANDOMIZADO

DE FASE IIb

IRAN MENDONÇA DA SILVA

MANAUS

2017

i



LIOFILIZADO EM ACIDENTES OFÍDICOS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA: UM

ENSAIO CLÍNICO PROSPECTIVO, ABERTO, CONTROLADO, RANDOMIZADO DE

FASE IIb

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Medicina Tropical da

Universidade do Estado do Amazonas em

Convênio com a Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para

obtenção grau de Doutor em Doenças

Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Prof. Dr.Wuelton Marcelo Monteiro

MANAUS

2017

ii

FICHA CATALOGRÁFICA

Ficha Catalográfica Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Sistema Integrado de Bibliotecas da Universidade do Estado do

Amazonas.

I65s Silva, Iran Mendonça da

Segurança e eficácia de um soro antiofídico trivalente

liofilizado em acidentes ofídicos na Região Amazônica:

um ensaio clínico prospectivo, aberto, controlado,

randomizado de fase IIb / Iran Mendonça da Silva.

Manaus : [s.n], 2017.

185 f.: il., color.; 30 cm.

Tese - Programa de Pós-Graduação em Medicina

Tropical - Universidade do Estado do Amazonas,

Manaus, 2017.

Inclui bibliografia

Orientador: Wuelton Marcelo Monteiro

1. Ofidismo. 2. Amazônia . 3. Soro antiofídico

liofilizado. 4. Segurança/eficácia. 5. Ensaio clínico. I.

Wuelton Marcelo Monteiro (Orient.). II. Universidade

do Estado do Amazonas. III. Segurança e eficácia de um

soro antiofídico trivalente liofilizado em acidentes

ofídicos na Região Amazônica: um ensaio clínico

prospectivo, aberto, controlado, randomizado de fase IIb

iii

FOLHA DE JULGAMENTO

TITULO DA TESE


LIOFILIZADO EM ACIDENTES OFÍDICOS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA: UM ENSAIO CLÍNICO PROSPECTIVO, ABERTO,

CONTROLADO, RANDOMIZADO DE FASE IIb


“Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.

Banca Julgadora:

______________________________________

Presidente

______________________________________

Membro

______________________________________

Membro

______________________________________

Membro

______________________________________

Membro

iv

DEDICATÓRIA

À minha amada filha Marselle Marmo do Nascimento Silva que, mesmo sem

perceber e distante, tem me estimulado ao crescimento e ao trabalho dignificante,

que tem compreendido a minha ausência fora de nossas origens na persistência

por uma causa humanitária.

Aos meus pais Domingos da Silva e Waldiria Mendonça da Silva, in memoriam, por

terem me dado a oportunidade de existir e ser produtivo.

Ao meu padrasto Alvary Ribeiro, in memoriam, que distante de mim, durante a

execução deste Projeto, partiu para outro plano tendo cumprido aqui sua missão e

me dando exemplo e força para prosseguir.

Ao meu sobrinho Anderson Carneiro Mendonça da Silva, in memoriam, que tão

jovem partiu para outro plano e me deixou a compreensão de manter a minha vida

produtiva por entender que estar vivo é uma dádiva divina.

v

AGRADECIMENTOS

Ao meu grande amigo e colega de trabalho, Dr. Antônio Magela Tavares, que

diuturnamente, até nos finais de semana, me apoiou nos trabalhos no hospital e no campo,

em distantes áreas rurais. Sua generosidade e a compreensão da importância deste

projeto fortaleceu uma grande amizade.

Aos pacientes que em mim depositaram confiança e permitiram a execução deste

trabalho.

À todas as vítimas de ofidismo na Região Amazônica, caboclo ribeirinho, indígena,

residentes de áreas rurais distantes, amazônidas esquecidos na Região Norte do país, que

me proporcionaram a oportunidade de servir ao próximo, me estimulando com suas

mazelas, na parceria em luta por melhores condições de sobrevivência.

Ao meu orientador Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro pela generosidade de

compartilhar seus conhecimentos e tempo com sábias orientações.

Aos ex-colegas de trabalho e amigos do Instituto de Biologia do Exército - RJ que me apoiaram na elaboração deste Projeto e que, mesmo distantes, torceram pelo sucesso deste trabalho.

Aos profissionais da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, do

Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento e do Hospital Municipal de Borba, que

na época me apoiaram, seja nas enfermarias, laboratórios e até no trabalho de campo, em

uma incansável luta execução das diversificadas tarefas.

vi

DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS

Este estudo foi apoiado pelo Instituto de Biologia do Exército – RJ, Fundação de

Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado –AM eHospital Geral de Roraima-RR

através do CONVÊNIO/EME Nr 0404400 de 01 de julho de 2004, publicado no DOU Nr

150 de 05 de agosto de 2004; do TERMO ADITIVO Nr 0404401 de 07 de outubro de

2005, publicado no DOU Nr 21 de 30 de junho de 2006; do TERMO ADITIVO Nr

0404400 de 01 de outubro de 2007, publicado no DOU Nr 27 de 11 de fevereiro de

2008; CONVÊNIO DO ACORDO DE COOPERAÇÃO/EME Nr 0710700 de 01 de

outubro de 2007, publicado no DOU Nr 10 de 11 de fevereiro de 2008. Os convênios

tiveram a abrangência de 4 anos na totalidade para a execução do Projeto.

.

vii

EPÍGRAFE

“An individual has not started living until he can rise above the narrow confines of his individualistic

concerns to the broader concerns of all humanity”.

The words of Martin Luther King, Jr Selected by Coretta Scott King

“O que me assusta não são as ações e os gritos das pessoas más, mas a indiferença e o silêncio das pessoas

boas”. Martin Luther King, Jr

viii

RESUMO

Em áreas tropicais, uma grande preocupação a respeito da eficácia do

tratamento antiofídico está relacionada a falha na distribuição do soro antiofídico

líquido devido à falta de uma adequada rede de frios nas áreas remotas. Para

diminuir este problema, a liofilização tem sido sugerida para melhorar a estabilidade

do soro antiofídico. Este estudo compara a segurança e eficácia de um soro

antiofídico trivalente liofilizado (SATL) e o soro antiofídico líquido padronizado e

fornecido pelo Ministério da Saúde (SAMBL) para tratar os acidentes botrópicos,

laquéticos e crotálicos. Este foi um estudo prospectivo, randomizado, aberto, de

fase IIb, conduzido de junho de 2005 a maio de 2008 na Amazônia Brasileira. Os

desfechos primários de eficácia foram a supressão das manifestações clínicas e

retorno da hemostasia e marcadores de função renal aos níveis normais dentro das

primeiras 24 horas de seguimento. O desfecho primário de segurança foi a

presença de reações adversas precoces (RAP) nas primeiras 24 horas após o

tratamento. A termoestabilidade do SATL foi determinada pela estimativa da

potência antiveneno ao longo de uma ano a 56oC. Dos pacientes recrutados, 65 e

51 foram selecionados para os grupos SATL e SAMBL, respectivamente. Não

houve diferença entre os grupos tratados com SATL e SAMBL da admissão do

paciente até as 24 horas pós-admissão, para os valores de fibrinogênio (p=0,911)

e tempo de coagulação (p=0,982), ambos atingindo valores normais no seguimento

em acidentes por Bothrops. O tempo de coagulação, o fibrinogênio e o INR

apresentaram valores normais 24 horas após a soroterapia, para os dois

antivenenos. Além disso, a creatinina, as transaminases hepáticas, a

creatinofosfoquinase e os outros marcadores laboratoriais foram normais 24 horas

após a admissão nos grupos tratados com SATL e SAMBL. Para os acidentes

laquéticos, o fibrinogênio, tempo de coagulação e INR apresentaram valores

normais 24 horas após a soroterapia para ambos os antivenenos. Em relação aos

acidentes crotálicos, o fibrinogênio, tempo de coagulação, INR e

creatinofosfoquinase apresentaram valores normais 24 horas após a soroterapia

para ambos os grupos. A análise físico-química de SATL mostrou uma

concentração total de proteína de 4,63 g%, com 80% das imunoglobulinas F(ab’)2,

ix

que foi estéril, atóxico e apirogênico. A concentração de fenol foi <3,500 ppm. A

potência do antiveneno liofilizado para neutralizar as atividades de Bothrops,

Lachesis e Crotalus não mostrou diminuição significativa, quando comparada com

a linha de base ao longo de um ano de avaliações de termoestabilidade a 56°C.

Nenhuma alteração visual, como turvação e formação de agregados foram

observados durante todo o tempo e antes da administração do SATL. Considerando

que os resultados observados para eficácia, segurança e estabilidade foram

promissores, nossos resultados indicam que o SATL é adequado para um ensaio

clínico mais ampliado de fase III.

PalavrasChaves: 1. Acidente ofídico. 2. Soro liofilizado. 3. Segurança. 4. Eficácia.

5. Ensaio clínico. 6. Amazônia Brasileira.

x

ABSTRACT

In tropical areas, a major concern regarding snakebites treatment effectiveness

relates to the failure in liquid antivenom (AV) distribution due to the lack of an

adequate cold chain in remote areas. To minimize this problem, freeze-drying has

been suggested to improve AV stability. This study compares the safety and efficacy

of a freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV) and the standard liquid AV provided

by the Brazilian Ministry of Health (SLAV) to treat Bothrops, Lachesis and Crotalus

snakebites. This was a prospective, randomized, open, phase IIb trial, carried out

from June 2005 to May 2008 in the Brazilian Amazon. Primary efficacy endpoints

were the suppression of clinical manifestations and return of hemostasis and renal

function markers to normal ranges within the first 24 hours of follow-up. Primary

safety endpoint was the presence of early adverse reactions (EAR) in the first 24

hours after treatment. FDTAV thermal stability was determined by estimating AV

potency over one year at 56oC. Of the patients recruited, 65 and 51 were assigned

to FDTAVand SLAV groups, respectively. There were no differences between

FDTAV and MoH AV treated groups in the time until patient admission for fibrinogen

(p=0.911) and clotting time (p = 0.982), both reaching normal values over follow-up

in patients bitten by Bothrops snakes. Clotting time, fibrinogen and INR presented

normal values 24 hours after AV therapy, for both antivenoms. Moreover, creatinine,

liver transaminases, creatine phosphokinase and the other laboratorial markers

were normal 24 hours after admission in FDTAV and SLAV treated groups. For

Lachesis snakebites, fibrinogen, clotting time and INR presented normal values 24

hours after AV therapy for both antivenoms. Regarding Crotalus snakebites,

fibrinogen, clotting time, INR, and creatine phosphokinase presented normal values

24 hours after AV therapy in FDTAV and SLAV treated groups. FDTAV

physicochemical analysis showed a total protein concentration of 4.63g%, with 80%

of F(ab’)2 immunoglobulins. FDTAV was sterile, atoxic and apyrogenic. Phenol

concentration was <3,500 ppm. Antivenom potency for neutralizing Bothrops,

Lachesis and Crotalus activities showed no significant decrease compared to

baseline potency over one year of thermostability evaluations at 56°C. No visual

xi

alterations in turbidity and no aggregates were observed over time and before AV

administration. Since promising results were observed for efficacy, safety and

thermal stability, our results indicate that FDTAVissuitablefor a larger phase III trial.

PalavrasChaves: 1. Snakebite. 2. Freeze-dried antivenom. 3. Safety. 4. Efficacy.

5. Clinical trial. 6. Brazilian Amazon.

xii

RESUMO LEIGO

Em regiões de florestas ou em municípios mais distantes onde não tem

energia elétrica, a população encontra-se mais exposta as picadas de

serpentes (cobras), principalmente em áreas rurais e ribeirinhas, nas atividades

de plantação, criação de gado, extração de madeira, caça e pesca. As picadas

de cobras podem ocorrer inclusive no trajeto de casa para a lavoura, na

lavoura, no trajeto da lavoura para casa, ao redor e até dentro da própria casa.

A picada de cobra mais comum é por jararaca ou surucucurana, uma cobra

marrom escura que pode causar inflamação no local, sangramentos e até risco

de morte se não tratadas adequadamente. O único tratamento eficaz e usado

na medicina para neutralizar o veneno é um soro específico aplicado nas

Unidades de Saúde, que necessita de permanecer na geladeira para sua

conservação. Nas regiões onde ocorrem mais picadas de cobras, muitas vezes

não tem energia elétrica com frequência e o soro não pode ser conservado

onde mais é necessário. Baseado nesta premissa, o soro já existente, foi

transformado de líquido para um pó que não necessita de geladeira para sua

conservação, que depois de adicionado ao soro fisiológico existente no

hospital, volta a ser líquido podendo ser usado normalmente, sem ter sido

conservado em baixa temperatura. Esse estudo foi feito de modo a verificar se

este soro em pó funciona com segurança nas vítimas de picada de cobra. Foi

feita a comparação entre os dois soros (líquido e em pó) em 65 pessoas

picadas por jararaca ou surucucu ou cascavel que receberam o soro em pó e,

em 51 pessoas também picadas por jararaca, surucucu ou cascavel, que

receberam o soro líquido existente e já usado no tratamento de rotina. Houve

acompanhamento por 15 dias após o uso dos soros, com exames médicos e

vários exames de sangue, ficando constatado que não houve diferenças entre

os dois soros. Todos os pacientes melhoraram e foram liberados, todos os

exames de sangue alterados ficaram normais até a liberação e todos os efeitos

de possíveis alergias com o uso dos dois soros foram semelhantes e

controlados no atendimento médico. Assim, se concluiu que o soro em pó é tão

xiii

seguro e eficaz quanto o líquido e tem a grande vantagem de não precisar de

geladeira para sua conservação. Novos estudos devem ser feitos, em grupos

maiores, para justificar sua produção e distribuição nas regiões onde se faz

necessário.

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribuição regional das estimativas de mortes no mundo devido a picadas de

serpentes..................................................................................................................................02

Figura 2. Distribuição espacial dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas no período de

2007 a 2012..............................................................................................................................04

Figura 3. Sazonalidade (número mensal de acidentes relacionados ao período de chuvas) dos

acidentes ofídicos registrados no Estado do Amazonas de 2007 a 2012 ..................................05

Figura 4. Bacia amazônica, maior bacia hidrográfica do mundo (Secretaria Executiva do

Ministério dos Transportes) ......................................................................................................06

Figura 5. Precária condição de navegabilidade.......................................................................06

Figura 6. Atividade de pesca comprometida pela seca...........................................................06

Figura 7. Período de cheia e diversidade de transporte ..........................................................07

Figura 8. Rio de fácil navegabilidade no período da cheia........................................................07

Figura 9. Rio com condições de navegabilidade dificultada pela sinuosidade no período da

seca..........................................................................................................................................08

Figura 10. Variação dos níveis hidrográficos no Rio Negro.....................................................08

Figura 11. Cachoeira do El Dourado – maior cachoeira do Brasil localizada no Parque

Estadual Serra do Aracá -município de Barcelos – AM.............................................................08

Figura 12. Helicóptero Black Hawk da FAB utilizado na missào de resgate..............................12

Figura 13. Operação de resgate na aldeia Nova Esperança.....................................................12

Figura 14. Atendimento dentro do helicóptero Black Hawk.......................................................12

Figura 15. Distribuição espacial dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas no período de

2007 a 2012 relacionada com atividade laborativa e sequelas................................................13

Figura 16. Serpentes envolvidas nos acidentes em humanos na Amazônia Brasileira ............14

Figura 17. Bothrops brazili........................................................................................................14

Figura 18. Bothrops atrox adulta...............................................................................................16

Figura 19. Bothrops atrox filhote...............................................................................................16

Figura 20. Crotalus durissus marajoensis.................................................................................17

xv

Figura 21. Crotalus durissus terrificus......................................................................................17

Figura 22. Crotalus durissus ruruima.......................................................................................17

Figura 23. Lachesis muta.........................................................................................................18

Figura 24. Ferimentos puntiformes causados pelas presas de Bothrops atrox.........................27

Figura 25. Sangramento espontaneo na região da picada por Bothrops atrox..........................27

Figura 26. Sangramento por corte realizado por leigo na região da picada por Bothrops atrox..........................................................................................................................................27

Figura 27. Coloração violácea por equimose na região da picada por Bothrops atrox

..................................................................................................................................................27

Figura 28. Extensa área de equimose à distância (região dorso-lombar) causada por acidente com filhote de Bothrops atrox em membro superior esquerdo...................................................27

Figura 29. Bolhacausada pelo uso de torniquete na região cubital em acidente causado por Bothrops atrox em membro superior direito...............................................................................27

Figura 30. Hemorragia conjuntival e gengivorragia em paciente vítima de acidente por filhote de Bothrops atrox.....................................................................................................................29

Figura 31. Acidente vascular cerebral hemorrágico fronto-parietal e cortical em paciente vítima de acidente botrópico por filhote de Bothrops atrox...................................................................29

Figura 32. Celulite por infecção secundária em acidente botrópico, apresentando edema flogótico em membro inferior direito..........................................................................................30

Figura 33. Celulite por infecção secundária em acidente botrópico, apresentando edema flogótico e brilho na pele em membro inferior esquerdo............................................................30

Figura 34. Abscesso secundário após acidente botrópico, apresentando edema flogótico e elevação na pele em tornozelo esquerdo..................................................................................30

Figura 35. Abscesso após acidente botrópico em tornozelo direito, em fase de drenagem ..................................................................................................................................................30

Figura 36. Necrose em quarto quirodáctilo da mão esquerda em acidente botrópico com mais de 24 horas de evolução até o atendimento em menino de 11 anos do município de Canutama (AM)..........................................................................................................................................31

Figura 37. Procedimento cirúrgico de amputação do quarto quirodáctilo da mão esquerda no paciente da figura 36.................................................................................................................31

Figura 38. Amputação do quarto quirodáctilo da mão direita por necrose em acidente botrópico

com mais de 24 horas de evolução até o atendimento..............................................................31

Figura 39. Perda tecidual por necrose em quarto quirodáctilo da mão direita em acidente

botrópico com mais de 6 horas até o atendimento.....................................................................31

xvi

Figura 40. Fasciotomia para tratamento cirúrgico de síndrome compartimental no braço direito

em acidente botrópico com mais de 24 horas até atendimento .................................................32

Figura 41. Evolução pós-cirúrgica em fasciotomia por síndrome compartimental na perna

direita .......................................................................................................................................32

Figura 42. Acidente crotálico grave apresentando fáscies miastênica com ptose palpebral

bilateral.....................................................................................................................................35

Figura 43. Madeireiro com acidente ofídico em mata primária..................................................37

Figura 44. Comparação do número de “DALYs” perdidos devido a cada doença negligenciada

e custo por “DALY” evitáveis por várias intervenções terapêuticas...........................................46

Figura 45. Liofilizador industrial – Benchmark 1101 (Virtus – USA) ........................................50

Figura 46. Princípio de funcionamento de um liofilizador industrial (Kemolo)..........................50

Figura 47. Processo de liofilização............................................................................................51

Figura 48. Apresentação do soro antiofídico trivalente liofilizado usado no projeto...................54

Figura 49. Apresentação do soro antiofídico trivalente liofilizado usado no projeto após

diluição............................................................................................................................. .........54

Figura 50. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.....................................55

Figura 51. Hospital Geral de Roraima Rubens Sousa Bento ..................................................55

Figura 52. Unidade Mista de Borba..........................................................................................55

xvii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Evacuação aeromédica em UTI móvel por acidentes ofídicos desde 2014 até

setembro de 2017.....................................................................................................................10

Tabela 2. Estimativa de custos com evacuação aeromédica de acordo com a procedência e o

destino.......................................................................................................................................11

xviii

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Atividade do veneno e patogenia.............................................................................35

Quadro 2. Classificação quanto à gravidade e tratamento no acidente botrópico.....................40

Quadro 3. Pré-soroterapia e tratamento das reações adversas..............................................41

Quadro 4. Número de ampolas de antiveneno indicadas para cada tipo de acidente de acordo

com a classificação da gravidade do envenenamento..............................................................43

Quadro 5. Sinais e sintomas da reação anafilática...................................................................44

xix

LISTA DE ANEXOS

ANEXO I. Laudo de Termoestabilidade do SATL..................................................................130

ANEXO II. Laudo de Análise Fisico-Química do SATL...........................................................131

ANEXO III. Protocolo de Registro de Caso............................................................................135

ANEXO IIIA. Formulário de Entrevista...................................................................................136

ANEXO IIIB. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido...................................................138

ANEXO IIIC. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Especial....................................139

ANEXO IIID. Ficha de Acompanhamento Clínico..................................................................140

ANEXO IIIE. Ficha de Acompanhamento para Coleta de Sangue.........................................147

ANEXO IIIF. Protocolo de Acompanhamento........................................................................149

ANEXO IIIG. Ficha de Investigação de Eventos Adversos....................................................152

ANEXO IV. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa..........................................................156

ANEXO V. Folha de rosto e envio ao CONEP......................................................................159

xx

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDAS

FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

HGR-RS Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento

HMB Hospital Municipal de Borba

IBEx Instituto de Biologia do Exército

RJ Rio de Janeiro

RR Roraima

EME Estado Maior do Exército

DOU Diário Oficial da União

SATL Soro Antiofídico Trivalente Liofilizado

SAMBL Soro Antiofídico Mono e Bivalente Líquido

p p-value (p-valor)

RAP Reação Adversa Precoce

AV Antivenom (Antiveneno)

FDTAV Freeze-drying Trivalent Antivenom

SLAV Standard Liquid Antivenom

EAR Early Adverse Reaction

IRA Insuficiência Reanal Aguda

OMS Organização Mundial da Saúde

WHO World Health Organization

St Saint

UK United Kingdom

GBD Global Burden Disease

CPK Creatinofosfoquinase

DHL Desidrogenase Láctica

LHF-I Lachesis Hemorrhagic Factor I

LHF-II Lachesis Hemorrhagic Factor II

Km2 Kilometro quadrado

xxi

L. m. m. Lachesis muta muta

UTI Unidade de Tratamento Intensivo

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FUNASA Fundação Nacional da Saúde

TFD Tratamento Fora do Domicílio CTA Companhia de Transporte Aéreo

FAB Força Aérea Brasileira

EB Exército Brasileiro

TC Tempo de Coagulação

Fig. Figura

B. Bothrops

LM-PLA2 Lachesis muta-Phospholipase A2

AST Aspartato Amino-Transferase

ALT Aspartato Alanino-Transferase

NASA National Aeronautics and Space Administration

SP São Paulo

F(ab7)2 Antigen-binding Fraction 2

EV Endovenoso

VO Via Oral

SC Subcutâneo

PDP Product Development Partnership

ml/Kg Mililitros por Kilograma

Km2 Quilômetro quadrado

PNI Programa Nacional de Imunização

SAB Soro Antibotrópico

SAC Soro Anticrotálico

SAL Soro Antilaquético

SABL Soro antibotrópico-laquético

SABC Soro antibrópico-crotálico

H1 Histamina 1

xxii

H2 Histamina 2

INCQS Instituto Nacional de Controle da Qualidade em Saúde

Fiocruz Fundação do Instituto Oswaldo Cruz

mg/mL Miligrama por mililitro

mg Miligrama

g Grama

mTorr milliTorr (unidade de pressão para medidas de elevado vácuo)

°C graus Celsius

FED Fundação Ezequiel Dias

IVB Instituto Vital Brasil

IB Instituto Butantan

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

PRC Protocolo de Registro de Caso

H4 Hora 4

H12 Hora 12

H24 Hora 24

D7 Dia 7

D15 Dia 15

TNF Fator de Necrose Tumoral

EAS Elementos Anormais e Sedimentoscopia

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1

1.1 ACIDENTES OFÍDICOS................................................................................... ...........1

1.1.1 EPIDEMIOLOGIA.......................................................................................... ...........1

1.1.2 TRANSPORTE DAS VÍTIMAS POR VIA FLUVIAL...................................................5

1.1.3 TRASNPORTE DAS VÍTIMAS POR VIA AÉREA......................................................8

1.1.4 ACIDENTE OFÍDICO COMO ACIDENTE OCUPACIONAL....................................12

1.1.5 GÊNEROS DOS OFÍDIOS RELACIONADOS AO PROJETO.................................13

1.1.5A GÊNERO BOTHROPS.........................................................................................14

1.1.5B GÊNERO CROTALUS.........................................................................................16

1.1.5C GÊNERO LACHESIS...........................................................................................17

1.1.6 CARACTERIZAÇÃO E AÇÃO DOS VENENOS......................................................18

1.1.6A BOTHROPS ATROX............................................................................................20

1.1.6B CROTALUS DURISSUS......................................................................................23

1.1.6C LACHESIS MUTA................................................................................................24

1.1.7 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS................................................................................25

1.1.7A ACIDENTE BOTRÓPICO.....................................................................................26

1.1.7A1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS...............................................................................26

1.1.7A2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS......................................................................28

1.1.7A3 COMPLICAÇÕES..............................................................................................29

1.1.7B ACIDENTE CROTÁLICO.....................................................................................33

1.1.7B1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS..............................................................................34

1.1.7B2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS.....................................................................34

1.1.7B3 COMPLICAÇÕES..............................................................................................35

1.1.7C ACIDENTE LAQUÉTICO.....................................................................................36

1.1.7C1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS..............................................................................36

1.1.7C2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS.....................................................................36

1.1.7C3 COMPLICAÇÕES..............................................................................................37

1.1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL..........................................................................38

1.1.9 TRATAMENTO............................................................................. ..........................39

1.1.10 SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE LIOFILIZADO..............................................44

1.1.10A HISTÓRICO.......................................................................................................44

1.1.10B LIOFILIZAÇÃO...................................................................................................47

2 - JUSTIFICATIVA.........................................................................................................51

3 - OBJETIVOS...............................................................................................................53

3.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................................53

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................53

4 - MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................... 53

4.1 OBTENÇÃO DO SATL.............................................................................................. 53

4.2 DESENHO DO ESTUDO E PARTICIPANTES.......................................................... 54

4.3 SELEÇÃO DE PACIENTES, INTERVENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA.......56

4.4 SEGUIMENTO DOS PACIENTES.............................................................................58

4.5 DESFECHO DA SEGURANÇA.................................................................................58

4.6 DESFECHO DA EFICÁCIA.......................................................................................58

4.7 CEGAMENTO............................................................................................................59

4.8 TESTE DE RECONSTITUIÇÃO................................................................................59

4.9 CONTROLE DE ESTABILIDADE E QUALIDADE.....................................................60

4.10 MÉTODOS ESTATÍSTICOS....................................................................................60

4.11 ÉTICA......................................................................................................................61

5 - RESULTADOS...........................................................................................................61

6 - DISCUSSÃO............................................................................................................109

6.1 ANÁLISE DA EFICÁCIA..........................................................................................109

6.2 ANÁLISE DA SEGURANÇA....................................................................................111

6.3 TESTE DE RECONSTITUIÇÃO..............................................................................112

6.4 RESULTADOS DA ESTABILIDADE........................................................................113

7 - CONCLUSÕES........................................................................................................113

8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................115

9 - ANEXOS...................................................................................................................130

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 ACIDENTES OFÍDICOS

1.1.1 EPIDEMIOLOGIA

O acidente ofídico é um relevante problema de saúde pública nos países

tropicais pela frequência com que ocorrem e complicações locais e sistêmicas

que produzem. No mundo, cerca de 2.5 milhões pessoas são envenenadas

por ano, metade das quais requerem atendimento médico, e provavelmente

mais que 100.000 indivíduos sofrem severas sequelas. A América Latina

ocupa o terceiro lugar (Fig. 1) no ranking de óbitos por acidentes ofídicos só

sendo superada pelo Leste Asiático e África Subsaariana (1-6).

Segundo dados mais recentes apresentados pela OMS no “Oxford

Simposia - Venoms 2017 –St. Hilda’s College, Oxford University - UK”, os

acidentes ofídicos foram recentemente adicionados à lista da OMS como uma

das Doenças Negligenciadas (7); afetam as vidas de cerca de 4.5 milhões de

pessoas todos os anos no mundo, causando injúrias em 2.7 milhões de

homens, mulheres e crianças, e causam cerca de 125.000 mortes a cada ano,

sendo a maioria de crianças e trabalhadores da agricultura no período mais

produtivo de suas vidas. Cerca de 400.000 vítimas sofrem de incapacidade de

longa duração, constantes cuidados da saúde, amputações e seguimento por

sequelas psicológicas. Para aqueles que conseguem tratamento, os familiares

são forçados a decidir entre a vida e os anos de dívidas pelo alto custo dos

antivenenos, que nem sempre são disponíveis. Globalmente os maiores

agravos ocorrem nas regiões tropicais, onde muitos países permanecem em

subdesenvolvimento ou sofrem pela pobreza de governos, problemas sociais

e/ou políticos, conflitos, escassez na pesquisa, alto nível de agravos ou ainda,

insegurança alimentar. Decididamente o acidente ofídico não é uma doença

sem tratamento, mas infelizmente muitas centenas de milhares de vítimas não

são tratadas todos os anos. Os soros antiofídicos que foram desenvolvidos

primeiro na década de 1890, oferecem o potencial de salvar muitas vidas mas,

o alto custo, pouca disponibilidade, e em alguns casos, baixa qualidade dos

soros produzidos por inescrupulosos fabricantes tem diminuído a confiança na

2

imunoterapia e, muitos governos, simplesmente colocam este problema como

de difícil solução (8).

No Brasil, o Ministério da Saúde tornou obrigatória, a partir de 1986, a

notificação dos acidentes ofídicos. No período de janeiro de 1987 a dezembro

de 1993 foram notificados 143.836 casos, o que representava uma média de

20.000 casos/ano no país. No ano de 2000, de junho a dezembro, 8.574 casos

foram notificados, no mesmo ano em que foram produzidos os primeiros lotes

do soro antiofídico trivalente liofilizado para estudo. Os dados foram obtidos

do Sistema de Vigilância Epidemiológica, implantado na unidades federadas

do país, apesar de que constatávamos ainda uma evidente subnotificação, na

maioria dos estados brasileiros. A maioria das notificações procediam das

Regiões Sudeste e Sul, as mais populosas do país e que contam com melhor

organização de serviços de saúde e sistema de informação. Contudo esta

realidade vem se modificando nos últimos anos e tanto as notificações têm

Figura 1. Distribuição regional das estimativas de mortes no mundo devido a picadas de serpentes (Fonte: 3)

3

tido um progressivo aumento como as diferenças regionais vem sendo

modificadas em função de uma maior conscientização dos profissionais em

relação ao registro de casos, embora as subnotificações ainda expressem

uma indesejável realidade. No período de 2001 a 2006, a mortalidade na

Região Norte foi de 49 por 100.000 habitantes para 14 por 100.000 habitantes

no país (9-18). A taxa de morbidade anual notificada dos acidentes é de 15

por 100.000 habitantes e a incidência global de envenenamento é cerca de

20.000 casos por ano. Em 2012, foram registrados no país 28.983 casos de

vítimas de ofidismo e os gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus são

os principais causadores de agravos de importância médica. O Ministério da

Saúde registrou no ano de 2013 o número de 27.181 acidentes ofídicos no

Brasil (19) com um cenário mais compatível com a realidade, pois a maior

incidência foi observada na Região Norte (52,6 casos/100.000 habitantes),

seguido pelo Centro-Oeste (16,4/100.000) (20).

O Estado do Amazonas é o maior estado da federação brasileira em

extensão territorial, possuindo uma área de 1.577.820,2 km2, coberto em

grande parte pela vegetação da floresta tropical úmida. Somente no Estado

do Amazonas cabem mais de quatro Reinos Unidos dada a dimensão

continental do Estado que contém a maior floresta tropical do mundo. Esse

Estado está dividido em 62 municípios, os quais possuem baixa densidade

demográfica, variando de 0,095 a 100,9 habitantes/km2 (21). No Estado do

Amazonas a ocorrência é pelo menos seis vezes maior do que os valores

notificados, onde têm os maiores índices de morbidade, mortalidade e

fatalidade pelas dificuldades de acesso ao atendimento nas sedes dos

municípios. Esses números podem ser maiores ainda na Amazônia Brasileira

e podem ser subestimados pela persistente subnotificação (15). As principais

atividade econômicas, da maioria dos municípios do Estado do Amazonas,

são o extrativismo vegetal, como borracha, madeira, gomas nãoelásticas, óleo

de copaíba, castanha, dentre outras e a agricultura, o que favorece o contato

dos habitantes com animais peçonhentos (22). Trabalhadores rurais do sexo

masculino, sobretudo os que exercem a agricultura, caça e silvicultura (11, 12)

são os mais afetados, correlacionando nestes casos os acidentes ofídicos ao

risco ocupacional. Uma “autópsia” verbal em comunidades com população

indígena e seringueiros revelou que 13% desses indivíduos tinham sido

4

picados por serpente pelo menos uma vez na vida (11). Há uma correlação

entre a incidência dos acidentes com serpentes e os índices pluviométricos

mais elevados nos período chuvoso (15, 23-25), havendo uma grande

influência da sazonalidade na incidência ao longo do ano pois no período de

novembro a maio (período de maior índice pluviométrico) há uma maior

vulnerabilidade das comunidades amazônicas, sobretudo nos que vivem em

áreas ribeirinhas (Fig. 2 e Fig. 3), onde observa-se uma extensa área de

elevada incidência que se extende do nordeste para a região central do estado

onde a incidência alcança aproximadamente 150 casos/100.000

habitantes/ano (20, 26).

Figura 2. Distribuição espacial dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas no período de 2007 a 2012. (Fonte: 20)

.

5

Figura 3. Sazonalidade (número mensal de acidentes relacionados ao período de chuvas) dos acidentes ofídicos registrados no Estado do Amazonas de 2007 a 2012. (Fonte: 26)

1.1.2 TRANSPORTE DAS VÍTIMAS POR VIA FLUVIAL

A distribuição sazonal dos casos para as Regiões Sul, Sudeste e CentroOeste,

mostra um incremento dos acidentes no período de março. Na Região Nordeste,

aumentam de janeiro a maio, enquanto que na Região Norte, principalmente no

estado do Amazonas, a ocorrência mostra-se maior no período das chuvas

(novembro a maio), particularmente na época de cheia dos rios em fevereiro. A Bacia

Amazônica é a maior bacia fluvial do mundo (Fig. 4) e os índices pluviométricos

variáveis fazem com que ocorram períodos de cheia e seca nos rios (Fig. 5, 8 e 10),

isto causa deslocamento dos trabalhadores das áreas ribeirinhas modificando o

cenário epidemiológico dos acidentes ofídicos.

6

Figura 4. Bacia Amazônica, maior bacia hidrográfica do mundo. (Fonte: Secretaria Executiva do Ministério dos Transportes).

No período de cheia, as serpentes, ao procurarem lugares mais secos, se

aproximam das comunidades rurais e ribeirinhas. No período de seca ocorre o

inverso pois os trabalhadores rurais e ribeirinhos se aproximam das serpentes para

o plantio, pescaria, pecuária e extrativismo nas áreas férteis. Estas variações

afetam sobretudo a navegabilidade dos rios e quando, no período de seca, o

transporte fluvial para socorro dos doentes fica inviável (Figs. 5 e 6).

Figura 5. Precária condição de navegabilidade ((Fonte: https://sandcarioca.wordpress.com/2010/10/26/seca-e -cheia-umfenomeno-natural-na-amazonia/).

Figura 6. Atividade de pesca comprometida pela seca (Fonte:https://sandcarioca.wordpress.com/2010/10/ 26/seca-e-cheia-umfenomeno-natural-na-amazonia/)

https://sandcarioca.wordpress.com/2010/10/26/seca-e

7

Figura 7. Período de cheia e diversidade de transporte. (Fonte:https://sandcarioca.wordpress.com/2010/10/26/ seca-e-cheia-umfenomeno-natural-na-amazonia/).

O percurso na navegação fluvial é extremamente variável assim como o

tempo no transporte das vítimas, dependendo diretamente da alternância de

período de cheia ou seca. (Figs. 7, 8 e 9). Assim, se em uma época esse

transporte é facilitado por caminhos mais curtos pelos braços do rios no

período de cheias, pode-se ter um caminho longo e dificultado pela

sinuosidade dos rios e obstáculos de troncos e árvores ao longo do trajeto.

Por vezes, a sinuosidade é tão grande que um longo trecho é percorrido ao

se fazero trajeto oposto ao já percorrido, o que demanda tempo e mais gasto

de combustível (Fig. 9). Por vezes os navegadores carregam a canoa pelo

interior da selva para ganharem tempo, denominando este encurtamento da

rota com o termo “furo”. Não raras as vezes, se utilizam de facas longas

popularmente conhecidas como “terçados” e até serra elétrica para abrirem

caminho cortando árvores e troncos ao longo dos próprios rios, desobstruindo

assim o caminho. É importante ressaltar que existem muitas cachoeiras na

Amazônia que dificultam a navegabilidade, tendo a maior cachoeira do Brasil

no Parque Estadual Serra do Aracá (com 18.187 km²), localizada no município

de Barcelos, segundo maior município do Brasil (com 122.475,728 km2), e

medindo 365 metros de altura (Fig. 11).

Figura 8. Rio de fácil navegabilidade em período de cheia. (Fonte: http://www1.folha.uol.com.br/ciencia /2017/09/ 1915243-seres-humanos-alteram-florestas-ha-45-mil-anos-mostra-estudo.shtml).

http://www1.folha.uol.com.br/ciencia%20/2017/09/%2019152

http://www1.folha.uol.com.br/ciencia%20/2017/09/%2019152

8

1.1.3 TRANSPORTE DAS VÍTIMAS POR VIA AÉREA

A evacuação aeromédica se torna necessária em virtude da urgência em

aplicar a soroterapia antiveneno e, além de ser perigosa com relatos de

quedas de aeronaves, é extremamente dependente das variações climáticas

e período do dia. Há regiões em que não se voa com instrumentos de controle

de tráfego aéreo e os vôos em sua maioria são realizado por controle visual

pelo próprio piloto. Isto causa uma grande interferência na navegação aérea

de emergência, pois em períodos de chuvas há uma determinante redução da

visibilidade, perdendo-se as referências do sobrevoo dos rios a noite. Deve se

considerar que muitos acidentes ofídicos são causados no fim do período

vespertino e noturno, em que as serpentes peçonhentas circulam em busca

Figura 9. Rio com condições de navegabilidade dificultada pela sinuosidade no período da seca (uma longa volta para retornar a uma posição paralela). Fonte: (http://www.oeco.org.br/oeco amazonia/majestosos-rios-amazonia/).

Figura 10. Variação dos níveis hidrográficos no rio Negro. (Fonte:http://d.emtempo.com.br/DIA-A-DIA/18121/nivel-das-aguas-do-rio-negro-permanece-estavel-nesta-sexta).

Figura 11. Cachoeira do El Dourado, a maior cachoeira do Brasil, localizada no Parque Estadual Serra do Aracá, município de Barcelos - AM. (Fonte: https://manauspramim.com.br/ 2011/09/21/amaior-cachoeira-do-brasil-araca-amazonas/).

http://www.oeco.org.br/oeco

https://manauspramim/

9

de alimentos e os nativos se dirigem a mata para caçar ou retornam de suas

atividades de agricultura ou pesca de subsistência. Os custos com o

transporte aéreo, nem sempre viáveis, são elevados e oneram bastante os

cofres públicos.Todavia, são necessários devido as condições do acidente e

necessidade do uso da soroterapia em curto prazo de tempo. Usam-se dois

tipos de transportes em dois momentos diferentes, sendo o primeiro das

aldeias e lugares sem campo de pouso adequado, havendo acesso muitas

vezes apenas para helicópteros após a abertura de clareiras. Este transporte

é feito do local do acidente nas comunidades até as Unidades de Saúde dos

municípios onde, havendo o soro (o que nem sempre acontece pelas crises

de desabastecimento), o paciente recebe a primeira abordagem terapêutica.

Das Unidades de Saúde Municipais, as vítimas são evacuadas para

Manaus chegando a FMT-HVD (hospital de referência para vítimas de animais

peçonhentos), isto se deve a evolução com gravidade nas vítimas,

considerando que a maioria recebe o soro após seis horas do acidente. O

soro antiveneno utilizado é apresentado na forma líquida e necessita de

refrigeração constante entre 2 e 8 graus Celsius. Nos locais dos acidentes,

quando existe energia, esta é fornecida por geradores que ficam ligados por

12 horas no período noturno, inviabilizando a conservação adequada do soro

na forma líquida. Segundo dados fornecidos pela Direção Aeromédica da

empresa Manaus Aerotáxi que é responsável pelo transporte em UTI aérea

do Estado do Amazonas, este transporte é feito por aeronaves modelo

Caravan terrestre e anfíbio tipo Bandeirantes bem como pequenos jatos. Este

transporte é feito pelo contrato 007/2011 entre a empresa e o Estado do

Amazonas. A Tabela 1 mostra dados de alguns transportes nos últimos três

anos. Há uma outra empresa denominada Heringer com contrato com a

FUNASA que faz também o transporte dos indígenas, ficando difícil

contabilizar os gastos totais nos transporte destes pacientes. Ainda existem

municípios que fretam suas próprias aeronaves para o transporte de pacientes

incluindo também as vítimas de acidentes ofídicos que não necessitam de

UTI, esta condição é denominada Tratamento Fora do Domicílio (TFD).

Após o primeiro atendimento no município de origem, havendo

necessidade devido a gravidade e/ou sequelas, o que geralmente acontece

pela demora no uso do soro antiveneno, o paciente é transportado para

10

Manaus através das diversas Companhias Aéreas como CTA, Rico, Two e

Amazon Naves. Os pacientes são aerotransportados para Manaus, onde

existe mais recursos nos centros de referência como a FMT-HVD, uma

instituição de atendimento em nível terciário que está destinada a

desempenhar três funções básicas: prestar assistência médica e prevenção

de doenças infecciosas e parasitárias; gerar, absorver e difundir

conhecimentos científicos e tecnológicos na área de doenças tropicais

infecciosas e parasitárias; e contribuir para a formação dos recursos humanos

nas áreas de doenças tropicais. Diante do exposto, percebe-se a magnitude

e variabilidade da evacuação aeromédica na região, sendo difícil dimensionar

os relevantes gastos com transporte de vítimas de acidentes ofídicos.

Algumas informações financeiras obtidas através da Direção Aeromédica da

empresa Manaus Aerotáxi (contrato 007/2011 entre a empresa e o governo

do Amazonas), são apresentadas na Tabela 2.

Tabela 1. Evacuação aeromédica de pacientes vítimas de acidentes ofídicos em Unidade de Terapia

Intensiva móvel, para Manaus, de 2014 a setembro de 2017.

Data Idade (anos) Sexo Origem do caso

25/09/2014 21 Feminino São Gabriel da Cachoeira

27/11/2014 38 Masculino Tabatinga

29/01/2015 20 Masculino Eirunepé

30/01/2015 26 Masculino São Gabriel da Cachoeira

24/03/2015 24 Masculino Eirunepé



28/03/2016 37 Masculino Apuí




12/09/2017 52 Masculino Tabatinga


Fonte: Direção Aeromédica da empresa Manaus Aerotáxi.

11

Tabela 2. Custos estimados de evacuação aeromédica de pacientes vítimas de acidentes ofídicos em

Unidade de Terapia Intensiva móvel, para Manaus, a partir de diferentes origens.

Origem Destino Custo estimado (R$)

São Gabriel da Cachoeira Manaus 34.476,00

Tabatinga Manaus 47.476,00

Eirunepé Manaus 49.335,00

Apuí Manaus 18.798,00

Tefé Manaus 16.000,00

Parintins Manaus 16.000,00

Ipixuna Manaus 44.000,00

Fonte: Direção Aeromédica da empresa Manaus Aerotáxi.

Existe ainda um custo operacional de resgate não repassado para os

municípios, que é suprido pelos recursos federais através de missões

humanitárias. Estes valores não foram computados neste trabalho, mas sem

dúvida são relevantes assim como a atuação das Forças Armadas (Exército

Brasileiro - EB e Força Aérea Brasileira - FAB) no atendimento às vítimas de

acidentes ofídicos. Um dos muitos exemplos é recente: uma criança indígena

de 5 anos, da tribo Mayuruna, resgatada pelo helicóptero Black Hawk, onde

não existe campo de pouso para aeronaves de asa fixa e a navegação nos

rios para efetuar o socorro ficaria inviável pelo tempo de navegação e

possíveis obstáculos. A criança foi picada por uma serpente do gênero

Bothrops como relatado pela FAB: “antes do amanhecer, o Esquadrão Harpia

decolou de São Gabriel da Cachoeira (856 km de Manaus) com direção à

aldeia Nova Esperança, localizada na região de Palmeira do Javari (1.437 km

da capital amazonense). Do local, o helicóptero H-60 Black Hawk voou para

Tabatinga (1.110 km de Manaus), para que o menino recebesse o

atendimento necessário” (27). O relato mostra a importância de um soro que

possa ser administrado mais próximo onde ocorrem os acidentes, os registros

fotográficos desta evacuação são apresentados abaixo (Fig.12, 13 e 14).

12

1.1.4 ACIDENTE OFÍDICO COMO ACIDENTE OCUPACIONAL

A ocorrência do acidente ofídico está geralmente relacionada à fatores

climáticos e ao aumento das atividades no setor agropecuário (preparo da

terra, plantio e colheita). Essas observações parecem reforçar a idéia de que

o acidente ofídico é um acidente de trabalho, uma vez que a sua incidência

coincide com o deslocamento do trabalhador rural para as suas atividades.

Além disso, esses indivíduos não utilizam de maneira adequada, a

indumentária protetora, como sapatos, botas, perneiras e luvas. Em cerca de

53% das notificações, a faixa etária acometida situa-se entre 15-49 anos, o

que corresponde ao grupo de idade onde mais concentra a força de trabalho.

Aproximadamente 70% dos pacientes acometidos são do sexo masculino, o

que é justificado pelo fato do homem desempenhar, com mais frequência,

atividades de trabalho fora da moradia, onde os acidentes ofídicos

habitualmente ocorrem. No Estado do Amazonas existe uma relação de

algumas atividades laborativas relacionadas a alguns municípios com mais

Figura 12. Helicóptero Black Hawk da FAB utilizado na missão de resgate. (Fonte:http:// www.fab.br/noticias/mostra/).

Figura 13. Operação de resgate na aldeia Nova Esperança. (Fonte: http://www.fab.mil.br /noticias/mostra/).

Figura 14. Atendimento dentro do helicóptero Black Hawk. (Fonte: http://www.fab.mil.br /noticias/mostra/).

http://www.fab.mil.br/

http://www.fab.mil.br/

13

elevada incidência de acidentes ofídicos, como por exemplo: plantio de

mandioca para a produção de farinha em Uarini, plantio do guaraná em

Maués, plantio da laranja e indústria madeireira em Rio Preto da Eva, e

ecoturismo em Noivo Airão (Fig. 15).

1.1.4 GÊNEROS DOS OFÍDIOS RELACIONADOS AO PROJETO

No Amazonas, de acordo com a distribuição geográfica, existem sete

viperídeos: Bothrops atrox (Fig.16A), Bothrops brazili (Fig. 17), Bothrops

bilineatus (Fig. 16B e 16C) Crotalus durissus (Fig. 16F), Lachesis muta (Fig.

16E) e Bothrocophias hyoprora (Fig. 16D). Existe ainda três gêneros da

família Colubridae que podem causar envenenamento em humanos que são:

Philodryas sp, Clelia clelia e Erythrolampus aesculapii e ainda o registro de

onze elapídeos como: Micrurus averyi, Micrurus collaris, Micrurus filiformis,

Micrurus hemprichii (Fig. 16G), Micrurus karlschimidti, Micrurus langsdorff,

ESTADO DO AMAZONAS – ACIDENTES RELACIONADOS À ATIVIDADE LABORATIVA

MANAUS

MUNICÍPIOS PERIFÉRICOS

31 - MAUÉS – guaraná 10 - RIO PRETO DA EVA - laranja e indústria madeireira 16 - UARINI - mandioca 6 - NOVO AIRÃO - ecoturismo

4

Figura 15. Distribuição espacial dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas no período de 2007 a 2012, relacionada com atividades laborativas e sequelas (Fonte: adaptado da referência bibliográfica 20).

14

Micrurus lemniscatus (Fig. 16H), Micrurus narducii, Micrurus putumayensis,

Micrurus spixii e Micrurus surinamensis (6, 21).

Figura 16. Serpentes e nvolvidas nos acidentes em humanos na Amazônia Brasileira. Imagens das oito principais espécies de serpentes responsáveis por envenenamentos são mostradas (A-H): Jararaca-do-norte (A) está implicado na maioria das picadas de serpentes em humanos registrados na região da Amazônia brasileira (80% -90%), seguido por Lachesis muta (E). (Fonte: 6).

Como o objetivo deste estudo envolve um soro antiofídico trivalente liofilizado

para os gêneros Bothrops, Lachesis e Crotalus, descreveremos sobre esses

principais gêneros a seguir.

1.1.5A GÊNERO BOTHROPS

Os acidentes pelo gênero Bothrops são os de maior importância

epidemiológica no país, responsável por mais de 90% dos acidentes por

ofídios peçonhentos. Existem cerca de 30 espécies, distribuídas por todo o

território nacional, tendo como habitat preferencial, ambientes úmidos das

matas e áreas cultivadas. Na Amazônia podem ser encontradas até 4

espécies diferentes do gênero Bothrops, porém no Estado do Amazonas

Figura 17. Bothrops brazili. (Foto: M. Martins).

15

podemos encontrar mais frequentemente a Bothrops atrox e a Bothrops

brazili, sendo a primeira a maior causa dos acidentes. Também podem ser

encontradas a Bothrops bilineatus e a Bothrops taeniatus, adicionalmente a

um outro viperídeo, reconhecido como uma quinta espécie de jararaca,

denominado Bothrocophias hyoprora (6, 21).

A Bothrops atrox (Fig. 18), espécie estudada neste trabalho, recebe

denominações populares como jararaca e jararaca do norte, na região

amazônica, principalmente nos interiores também é chamada de

surucucurana, o sufixo “rana” significa “parecida com”, portanto há que se ter

cuidado para que o profissional de saúde não entenda que a vítima possa

estar se referindo a “surucucu pico-de-jaca” ou “bico-de-jaca” que seria a

Lachesis. Muitas vezes os nativos dizem que foram picados pela surucucu

mas, quando observamos na anamnese dirigida, verificamos que pela

descrição da serpente e pelo local onde ocorreu o acidente, se trata de uma

Bothrops atrox. Trata-se de uma serpente ágil e ativa, que pode superar 1,5

metros de comprimento, de colorido muito variável, que frequenta as beiras

dos córregos e igarapés (28), quando filhote pode ter uma coloração mais

clara, embora isto seja extremamente variável podendo até ter um marrom

mais escuro, apresenta a cauda branca para simular uma larva e atrair os

predadores que se transformam em presas numa fração de segundos, esta

característica ardilosa é denominada de engodo caudal, por esta razão os

nativos a chamam de “jararaquinha do rabo branco” (Fig. 19). Embora seja

terrícola, pode ser encontrada nos galhos de árvores, principalmente no

período de cheias dos rios amazônicos, o que se considera uma adaptação

transitória e circunstancial para sobrevivência. A coloração marrom a faz se

camuflar entre as folhagens caídas no chão e em decomposição pela umidade

das matas amazônicas. Costuma causar acidentes em regiões rurais e

periurbanas, mas temos observado também em região urbana onde se

concentram roedores pelo lixo acumulado e sem destinação própria. Esta

serpente tem uma ampla capacidade de adaptação e nos sítios tem adentrado

aos domicílios causando também acidentes intradomiciliares.

16

1.1.5B GÊNERO CROTALUS

Os acidentes pelo gênero Crotalus, ocorrem em cerca de 8% entre

os acidentes no país, variando de acordo com a região. Há apenas uma

espécie (Crotalus durissus) encontrada em todo o país, à exceção de áreas

florestais e zona litorânea. São encontradas em campos, áreas secas,

arenosas e pedregosas. Na Amazônia são encontradas em algumas regiões

onde existem áreas de campos como na Ilha de Marajó, Santarém, norte do

Pará, Humaitá, norte do Amapá e Roraima, onde recebe o nome de

subespécie Crotalus durissus ruruima (descrita por Hoge em 1966) em alusão

as savanas de Roraima onde é encontrada com frequência. Popularmente

recebem a denominação de boicininga, maracambóia, boiçununga, boiquira,

maracá, cascavel-de-quatroventas ou simplesmente cascavel por que em seu

extremo caudal apresentam um chocalho, guizo ou cascavel, utilizado para

alertar os predadores e evitar o confronto, portanto fazem um ruído

característico quando em estresse antes do ataque. A espécie Crotalus

durissus tem ampla distribuição geográfica mas na Região Amazônica podem

ser encontradas as subespécies Crotalus durissus marajoensis (descrita por

Hoge em 1966) na Ilha de Marajó e no Pará (Fig. 20) e a Crotalus durissus

terrificus, descrita por Laurenti em 1768 (Fig. 21), mais divulgada e encontrada

no Mato Grosso, Rondônia, Amazonas e Pará (em campos abertos de

Humaitá, Serra do Cachimbo e Santarém). A Crotalus durissus ruruima (Fig.

22) possui uma peçonha com atividades farmacológicas próprias e,

aparentemente, seu veneno não é bem neutralizado pelo soro anticrotálico no

país (28).

Figura 18. Bothrops atrox adulta. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 19. Bothrops atrox filhote, nota-se a cauda com coloração branca para o engodo caudal. (Fonte: arquivo próprio)

17

1.1.5C GÊNERO LACHESIS

Os acidentes pelo gênero Lachesis (Fig. 23) ocorrem em torno de 1,5%

dos acidentes ofídicos no Brasil. Há uma única espécie habitando

principalmente áreas florestais da Amazônia, Mata Atlântica e alguns enclaves

de matas úmidas do Nordeste. A letalidade no Brasil está próxima de 0,5%,

sendo que a causa da maioria dos óbitos ocorre no grupo de pacientes

atendidos com seis horas ou mais do acidente. Portanto, o tempo entre o

acidente e a administração do soro, sobretudo neste gênero, é sem dúvida

alguma, o fator mais importante para o prognóstico do caso. Popularmente é

conhecida como surucucu, surucutinga, pico-de-jaca ou bico-de-jaca devido a

sua superfície tegumentar ser semelhante a casca da jaca. Há uma tendência

de classificá-la como monotípica, ou seja, como tendo uma única espécie

(Lachesis muta) sem subespécies, com base na análise filogenética e

estatística. São extremamente temidas, vista pelos caboclos como muito

agressivas apesar deste comportamento não ser observado em cativeiro.

Podem chegar até 3,5 metros de comprimento sendo considerada a maior

serpente peçonhenta das Américas (28). Habitam principalmente as florestas

Figura 20. Crotalus durissus marajoensis. (Fonte: http://www.studioe venaar.nl/dierenpark/abc/cascavel.php).

Figura 21. Crotalus durissus terrificus. (Fonte: http://www.serpentario.edu.uy/ expolaura/3.html).

Figura 22. Crotalus durissus ruruima. (Fonte:https://cobrasserpentes.blogspot.com.br/2012/09/cascavel.html).

http://www.studioe/

http://www.serpentario.edu.uy/

18

primárias da Região Amazônica, são umbrófilas e preferem as matas úmidas,

com pouca claridade gerada pela extensa copa de árvores frondosas e

seculares. Causam mais acidentes em indígenas, caçadores, lenhadores e

madeireiros, entre os quais é bastante temida. Seu bote é desferido após uma

retração da metade superior do corpo em um duplo “S” que, com a

compressão lateral desta parte do corpo, semelhante as serpentes

arborícolas, a faz atingir distâncias maiores para picar suas vítimas, se

lançando a uma distância de cerca de metade do comprimento de seu corpo.

São extremamente ágeis em seu deslocamento, principalmente no

crepúsculo, se diferenciando de outros viperídeos. Outra diferença deste

gênero e os outros viperídeos consiste no fato da Lachesis ser ovípara, ou

seja, se reproduz por deposição de ovos em ninhadas, enquanto os outros

são vivíparos, se reproduzindo com geração de placenta (28).

1.1.6 CARACTERIZAÇÃO E AÇÃO DOS VENENOS

As peçonhas de serpentes contêm vinte ou mais componentes diferentes,

mais de 90% do peso seco do veneno é constituído por proteínas,

compreendendo grande variedade de enzimas, toxinas não-enzimáticas e

proteínas não tóxicas. Uma única fração do veneno pode liberar várias

substâncias com ação inflamatória e o estudo dos venenos de serpentes tem

propiciado a elucidação do mecanismo do processo inflamatório. As

serpentes peçonhentas da família viperidae secretam peçonhas que são

misturas complexas de substâncias orgânicas e inorgânicas. Entre os

componentes orgânicos, destacam-se as proteínas (algumas biologicamente

ativas), nucleotídeos, aminoácidos e peptídeos que também podem ser

Figura 23. Lachesis muta. (Fonte: arquivo próprio).

19

encontrados. Já entre os componentes inorgânicos, os mais frequentemente

encontrados são cálcio, cobre, ferro, potássio, magnésio, sódio, fósforo,

cobalto e zinco. Alguns exercem a função de manter a estabilidade estrutural

das metaloproteínas, tais como nos fatores hemorrágicos. Outros

componentes inorgânicos exercem funções catalisadoras, em determinadas

reações enzimáticas.

O veneno de Bothriopsis taeniata (jararaca estrela) (Fig. 16D),

experimentalmente em camundongos, possui atividade anticoagulante, forte

atividade hemorrágica e fraca atividade proteolítica. A atividade

anticoagulante se manifesta impedindo a ativação do fator X ou inibindo o fator

X ativado ou, ainda, agindo diretamente sobre a trombina. Com relação à

sintomatologia e aos sinais observados em humanos, nada foi encontrado na

literatura. Quanto ao veneno de bilineata bilineata (jararaca verde) e Bothrops

bilineata smaragdina (Fig. 16B e Fig. 16C), não foram encontrados dados na

literatura.

Os venenos botrópicos já estudados apresentam variações ontogênicas

(que ocorrem durante o desenvolvimento do indivíduo) e interpopulacionais.

O veneno dos filhotes possui perfil eletroforético diferente e maiores

concentrações de proteínas quando comparado o veneno da serpente adulta.

Essa diferença tem efeito nos sintomas e sinais apresentados por pacientes

picados por serpentes jovens de B. jararaca e B. moojeni, nos quais a

incoagulabilidade sangüínea se manifesta com maior frequência que nos

acidentes causados por serpentes adultas. Variação interpopulacional foi

observada para o veneno de B. atrox (Fig. 16A) no qual a toxicidade variou

entre os venenos das serpentes coletadas no Estado de Tocantins, em

Manaus - AM e em Balbina - AM (39, 42), há também variações no hábito

alimentar pois os filhotes de Bothrops (Fig. 19) têm preferência por anfíbios e

lagartos. Com relação à composição química dos venenos botrópicos,

algumas proteínas já foram isoladas e caracterizadas quanto às atividades

farmacológicas. Do veneno de Bothrops atrox, de exemplares procedentes do

Maranhão, foi isolada uma enzima denominada Batroxobin, que atua sobre o

fibrinogênio transformando-o em fibrina (ação trombina símile), e uma

proteína ativadora da protrombina. Referente ao mesmo assunto, nada foi

20

encontrado na literatura para o veneno de B.brazili (Fig. 17). É importante

lembrar que até 1978 diferentes espécies de Bothrops eram classificadas

como B. atrox e consideradas como raças (ou subespécies) desta. Por este

motivo, quando se encontrar na literatura referência a outras proteínas

isoladas do veneno de B. atrox, a data da publicação deve ser verificada, pois

pode tratar-se de outra espécie (29, 30).

1.1.6A BOTHROPS ATROX

São descritas três atividades fisiopatológicas do veneno botrópico:

proteolítica (inflamatória aguda), coagulante e hemorrágica (13, 32-36). Os

venenos de Bothrops são caracterizados como pertencentes ao grupo das

enzimas e mostram atividade biológica letal, porém há diferenças de acordo

com a espécie e o veneno da Bothrops atrox (16A), apesar de considerado

um dos menos tóxicos para atividade letal, foi um dos mais ativos para a ação

coagulante tipo trombina e com intensa atividade iniciadora de lesões locais.

Isto tem sido observado nas apresentações clínicas desses acidentes pela

intensa e progressiva reação inflamatória local (15, 31, 37, 38).

Apesar do veneno de Bothrops atrox não estar incluído no pool de

venenos utilizados para a produção nacional do soro antibotrópico

poliespecífico, há variações na composição do veneno e as atividades

biológicas dos venenos de uma mesma espécie de serpente, apresentando

variações ontogenética, sexual ou geográfica. Apesar dos achados

demonstrarem que a variação geográfica constitui um fator importante a ser

considerado no veneno de B. atrox não tem sido observado ineficácia

terapêutica do soro padronizado em acidentes de Bothrops atrox no

Amazonas, em particular na FMT-HVD. No mesmo estudo foram

caracterizados o perfil eletroforético e as atividades coagulante, fosfolipásica,

fibrino(geno)lítica, agregante plaquetária, desfibrinogenante, edematogênica

e hemorrágica do veneno de Bothrops atrox. Ficaram caracterizadas as

atividades desfibrinogenante, edematogênica e hemorrágica com capacidade

de induzir migração celular. O soro antibotrópico padronizado pelo Ministério

da Saúde neutralizou as atividades coagulante e desfibrinogenante do veneno

e ficou sugerido que a elevada atividade coagulante do veneno de B. atrox

21

sobre o plasma parece estar relacionada à sua capacidade de causar hidrólise

do fibrinogênio (atividade trombina-símile) e ativar os fatores II e X da

coagulação (atividade procoagulante) (43, 44).

O veneno de Bothrops tem basicamente três atividades em função de

sua composição:

1. Atividade inflamatória aguda causada por um conjunto de frações

bioquimicamente heterogêneas e com especificidades diversas causando os

fenômenos locais. Essas frações são aminas biogênicas pré-formadas do

tipo histamina, pequenos peptídeos ou proteínas como a fosfolipase A2,

estearases, proteases, as calicreínas e cininogenases que são enzimas

liberadoras de cininas e, as lectinas. As frações do veneno, frequentemente,

têm atividade indireta, induzindo ou liberando potentes autacóides como:

bradicina, prostaglandinas, leucotrienos e prostaciclinas, que atuam de

forma complexa e inter-relacionada. Uma única fração pode liberar várias

substâncias com atividade inflamatória, porém esta mesma atividade

inflamatória ao mesmo tempo é multifatorial (45). O processo inflamatório é

multifatorial e os sinais locais como rubor, edema, bolhas e necrose,

provocados pelo veneno das serpentes, não são atribuídos exclusivamente

à sua ação proteolítica inespecífica. Estudos recentes mostram que os

efeitos locais são decorrentes das ações específicas de determinadas

enzimas (hialuronidase, fosfolipases, colagenases etc.) sobre o seu

substrato. O termo "atividade proteolítica" não constitui, a forma adequada

para denominar as reações que ocorrem para a formação do quadro local.

Além das reações enzimáticas específicas, as alterações locais também

podem ser induzidas por infecções secundárias (46). Na indução do

processo inflamatório local agudo há participação da atividade coagulante

desencadeando a formação de trombo na microvasculatura, com

consequente hipóxia, agravamento do edema e necrose tecidual; e que a

atividade hemorrágica, determinada por hemorraginas, pode ampliar o

quadro inflamatório, através de sua atividade sobre o TNF pré-formado,

liberando a citocina ativa que tem potente atividade inflamatória (47).

2. Atividade coagulante sobre o fibrinogênio em que, qualquer que seja o

mecanismo (direto ou indireto) de ativação da cascata de coagulação, o

22

efeito resultante será, principalmente, a transformação do fibrinogênio

circulante em fibrina, resultando na incoagulabilidade do sangue. O termo

"coagulante" está relacionado à clivagem do fibrinogênio, indiretamente,

pelas proteases séricas, ativadas por componentes dos venenos, ou

diretamente por enzimas presentes nos venenos. A incoagulabilidade

sanguínea ocorre por atividade coagulante direta e atividade coagulante

indireta. A atividade direta ocorre devido à presença de enzimas que atuam

diretamente sobre o fibrinogênio, transformando-o em fibrina (ação trombina

símile). A composição química dos sítios ativos dessas enzimas pode variar,

dependendo do veneno do qual foram isoladas. Essas enzimas atuam em

diferentes posições das cadeias da molécula de fibrinogênio, levando à

formação de coágulos de consistências variadas (coágulo frouxo, coágulo

denso, etc.). A atividade coagulante indireta ocorre pela presença de

enzimas que atuam sobre o fator X ou o fator II da cascata de coagulação,

levando ao consumo de fibrinogênio (fator I). Nos venenos botrópicos, que

possuem componentes ativadores do fator X, ocorre também o consumo de

plaquetas e dos fatores V e VIII, que leva à produção de um quadro de

coagulação intravascular disseminada, com a formação e a deposição de

microtrombos na rede capilar, o que pode contribuir para a instalação de um

quadro de insuficiência renal aguda (46). Ocorre ativação dos fatores de

coagulação sanguínea, ocasionando consumo de fibrinogênio e formação de

fibrina intravascular, induzindo frequentemente, incoagulabilidade

sanguínea. A maioria das serpentes do gênero Bothrops possui, isolada ou

simultaneamente, substâncias capazes de ativar complemento, protrombina

e fator X. Há variações na intensidade da atividade coagulante em diferentes

espécies e subespécies(48).

3. Atividade hemorrágica que se deve à presença de metaloproteínas, como

fatores hemorrágicos ou hemorraginas, que atuam sobre a membrana basal

dos vasos sanguíneos, causando sua ruptura. Este fenômeno promove a

necrose de fibras musculares (miotoxidade indireta) em torno de duas horas

após o acidente, devido a lesões na microcirculação. Obviamente as ações

dos venenos sobre a cascata de coagulação podem agravar a ação

hemorrágica final (46). A atividade hemorrágica é atribuída

fundamentalmente às hemorraginas, metaloproteinases que contem zinco,

que podem romper a integridade do endotélio vascular e têm atividade

23

desintegrina que degradam vários componentes da matriz extracelular,

como o colágeno tipo 4, fibronectina e laminina, sendo ainda potentes

inibidoras da agregação plaquetária, ocorrendo ainda potente inibição da

agregação plaquetária (49). São possíveis mecanismos de ação, a digestão

enzimática da lâmina basal da microvasculatura e a ruptura completa das

células endoteliais com formação de gaps, clivagens específicas em pontos-

chave poderiam desencadear mecanismos endógenos amplificadores,

sendo que, atualmente, há clara evidência de ataque proteolítico à lâmina

basal vascular (50-53).

4. Atividade edematogênica que se origina das ações combinadas de toxinas

que atuam diretamente sobre os vasos sanguíneos com outras que liberam

autacóides, tais como prostaglandinas, histamina e bradicinina. As enzimas

como fosfolipase A2, presente na maioria dos venenos, e outras proteases

podem estar envolvidas na formação do edema, por ação direta sobre

células endoteliais ou por ativar a cascata do complemento (46).

1.1.6B CROTALUS DURISSUS

A atividade miotóxica é uma das principais ações dos venenos de

serpentes do gênero Crotalus encontradas no Brasil. A mionecrose resulta da

ação direta de miotoxinas sobre as fibras musculares ou, indiretamente, da

isquemia que se desenvolve no músculo, devido possivelmenmte às

alterações vasculares (46). A ação miotóxica tem sido atribuída à crotamina e

a crotoxina com capacidade de produzir lesões no tecido muscular

esquelético, porém os estudos se referem a Crotalus durissus terrificus e a

Crotalus durissus collilineatus e não à Crotalus durissus ruruima (67).

A atividade coagulante é do tipo trombina e semelhante ao que ocorre

nos acidentes botrópicos e laquéticos em que o tempo de coagulação se

prolonga tornando o sangue incoagulável pelo consumo de fibrinogênio

transformando-o em fibrina e podendo levar a afibrinogenemia (68).

Em Crotalus durissus terrificus já foram isoladas as seguintes proteínas:

girotoxina, crotoxina, proteases coagulantes de fibrinogênio, convulxina e

crotamina. A crotoxina é responsável pelas atividades neurotóxica e

miotóxica, tratando-se de um complexo proteico iônico composto por uma

24

unidade básica denominada fosfolipase A2 e outra ácida denominada

crotapotina, havendo um efeito sinérgico e letal quando injetadas em conjunto.

A crotapotina age como um carreador evitando a adsorção inespecífica da

fosfolipase A2. Já a crotoxina foi isolada tanto de Crotalus durissus terrificus

quanto da Crotalus durissus ruruima e, em camundongos, induz necrose

coagulativa, homogeneização e acidofilia, perda das estriações transversais,

miólise, edema intersticial, congestão e infiltrado leucocitário de

polimorfonucleraes neutrófilos. A crotamina age sobre as estruturas do canal

de sódio da musculatura esquelética alterando a permeabilidade celular aos

íons de sódio. Na Crotalus durissus ruruima com veneno de coloração

amarela, foi demonstrada algumas características diferenciadas como uma

proteína semelhante à crotamina no veneno de coloração amarela, sendo

denominada crotamina IIe-19 que, quando injetada em altas doses na

musculatura esquelética induz vacuolização citoplasmática intensa,

favorecendo maior retenção de água na célula possivelmente pelo aumento

da concentração intracelular de íons sódio e uma outra proteína denominada

fator hemorrágico. A Crotalus durissus terrificus e a Crotalus durissus ruruima

(com veneno de coloração branca) apresentam atividades miotóxica,

neurotóxica e coagulante. O veneno de Crotalus durissus ruruima também

apresenta ações hemorrágica e proteolítica com atividade caseinolítica

(testada sobre a caseína). Embora experimentalmente o veneno de Crotalus

durissus terrificus apresente atividade coagulante de pequena intensidade,

em humanos esta atividade só é observada em torno de 30% dos acidentes

e é atribuída a proteína trombina-símile (protease coagulante de fibrinogênio)

que hidrolisa a cadeia alfa do hidrogênio (46, 50).

1.1.3C LACHESIS MUTA

Algumas das proteínas do veneno de Lachesis muta muta já foram

isoladas e caracterizadas quanto à atividade biológica, dentre as quais

podemos destacar: a "trombina-símile" ("protease coagulante de

fibrinogênio"), dois fatores hemorrágicos (LHF-I e LHF-II), a giroxina, L-

aminoácido oxidase e a cininogenina. Dos venenos das serpentes da região

amazônica, este foi o mais estudado quanto à composição química. O veneno

de L. m. muta apresenta as seguintes atividades biológicas semelhantes às

25

dos venenos das serpentes do gênero Bothrops, ou seja, proteolítica,

coagulante, hemorrágica e ainda uma atividade neurotóxica (vagomimética).

Difere também quanto à ação coagulante, sendo esta atividade bem mais

intensa. Os sintomas e sinais são pouco conhecidos devido à escassez de

casos relatados, mas no geral apresentam dor intensa, edema e hemorragia

de pequeno volume no local, lipotímia, bradicardia, hipotensão arterial e

taquipnéia. Os efeitos hipotensivos induzidos pelo veneno de L. m. muta

provavelmente estão relacionados à ação da cininogenina, que atua sobre a

cascata das cininas, especificamente sobre o cininogênio (46).Tem sido

relatadas várias atividades do veneno de Lachesis como: atividade

inflamatória, coagulante e hemorrágica, uma atividade cininogenase que

explica em parte as alterações neurotóxicas, uma atividade tipo trombina com

similaridade com a giroxina crotálica e ainda uma ação de ativar

plasminogênio (54-59). Foram isoladas várias substâncias como: fosfolipase

A2 (LM-PLA2) com atividade inibidora de ativação plaquetária e atividade

miocárdica, duas metaloproteinases (LHF-I e LHF-II) com atividade

hemorrágica, as quais se atribuem ainda atividade inflamatória local (a LHF-II

teria atividade formadora de e dema e degradação de componentes da matrix

extracelular) quando se trata da Lachesis muta muta, todavia na Lachesis

muta rhombeata o edema também pode ser aparentemente provocado por

histamina, serotonina, metabólitos do aracdônico e óxido nítrico (60-66).

1.1.7 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

O edema do acidente botrópico e laquético é precoce, inicialmente

circunscrito, tenso (ou firme), muitas vezes de tonalidade violácea em

decorrência de sangramento subcutâneo. A equimose pode acometer porção

extensa do membro e o quadro doloroso acompanha, muitas vezes, a região

ou membro acometido, sendo proporcional ao edema. Ocorre eritema,

hemorragia local, flictena, equimose e podem ocorrer manifestações

sistêmicas como gengivorragia, epistaxe, hematêmese e hematúria, e ainda

insuficiência renal, infecção secundária, necrose e síndrome compartimental

como complicações. O veneno laquético apresenta atividade coagulante,

hemorrágica, inflamatória aguda e ainda uma atividade cininogenase que

26

poderia explicar, em parte, algumas das alterações clínicas denominadas de

“neurotóxicas”, como a síndrome vagal (2, 13, 15, 53, 69-77).

No acidente crotálico, os sinais e sintomas geralmente relatados se

referem a Crotalus durissus terrificus por ser o gênero mais comum no país

enquanto que não temos encontrado relatos clínicos em acidentes de número

suficiente na Crotalus durissus ruruima, embora haja um índice de 14% de

acidentes. Outro fator importante é a descrição de dois tipos de venenos,

amarelo e branco, possivelmente com composições e repercursões clínicas

que podem ser diferentes (46).

1.1.7A ACIDENTE BOTRÓPICO

As manifestações clínicas dos acidentes por Bothrops podem ser

didaticamente divididas em locais e sistêmicas e dentro do contexto de que o

acidente pode ser evidenciado por dados clínicos e epidemiológicos que

devem ser sempre individualizados. Apesar de ser o acidente botrópico mais

comum dentre todos, cada paciente deve ser abordado com a observância de

características particularizadas para o acidente do momento, que dependem

das circunstâncias de sua ocorrência e peculiaridades do agravo na vítima.

1.1.7A1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS

Deve-se observar se há marcas de presas, no local da picada, que

geralmente são puntiformes (Fig. 24) e apresentam ou não sangramento local

que, quando no início, tem como causa o trauma vascular por sangramento

espontâneo (Fig. 25) causado pelas presas do ofídio ou manipulação como

incisões domésticas (Fig. 26) causadas pelo paciente ou atendentes leigos,

mas com o passar do tempo pode refletir alterações na coagulação

sanguínea. O edema se desenvolve de forma rápida e progressivamente

ascendente o que ajuda na classificação de gravidade. O edema é tenso se

diferenciando um pouco dos sinais flogísticos de processos puramente

infecciosos, pois sua coloração pode ser violácea pelo hematoma e cianose

local (Fig. 27). A equimose pode acometer todo o membro acometido e não

raras vezes se extende até regiões distantes do local da picada (Fig. 28),

27

temos observado isto principalmente com acidentes por filhotes de Bothrops

atrox, observação que carece de mais estudos. A dor e o edema podem ser

intensos e causar limitação de movimentos nas articulações mais próximas

ao local da picada.

Figura 24. Ferimentos puntiformes causados pelas presas de Bothrops atrox (sinalizados pela seta vermelha). (Fonte: arquivo próprio).

Figura 25. Sangramento por lesão causada pelas presas de Bothrops atrox. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 26. Sangramento causado por corte realizado por leigo na região da picada por Bothrops atrox. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 27. Coloração violácea por equimose na região da picada por Bothrops atrox. Fonte: arquivo próprio).

Figura 28. Extensa área de equimose à distância (região dorso-lombar) causada no acidente por filhote de Bothrops atrox em membro superior esquerdo. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 29. Bolha causada pelo uso de torniquete na região cubital, em acidente causado por Bothrops atrox no membro superior direito. (Fonte: arquivo próprio).

28

O edema se extende progressivamente por todo o membro acometido

determinando inclusive classificação de gravidade para decisão sobre a

quantidade de veneno a ser neutralizado. Com a evolução podem ocorrer

linfoadenomegalias regionais que são dolorosas à palpação e ainda, com o

passar das horas, podem surgir bolhas com conteúdo seroso, hemorrágico ou

necrótico. Quando o uso do torniquete é usado indevidamente, o veneno se

concentra em uma área muito estrita do segmento acometido e o resultado

pode ser também a evolução com bolhas, síndrome compartimental e extensa

necrose (Fig. 29).

1.1.7A2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS

Os acidentes botrópicos tanto podem se apresentar com

comprometimento sistêmico no início de sua evolução como podem, durante

o seguimento, evoluir com maior gravidade, sendo assim necessário o

conhecimento dos sinais e sintomas de gravidade para a adequada

administração da quantidade de soro antiveneneno. Podem ocorrer

sangramentos de pequena quantidade como gengivorragia, epistaxes,

hematúria microscópica, púrpuras à distância e sangramentos em feridas pre-

existentes e recentes. Pode ainda ocorrer hematúria macroscópica, epistaxes,

hematêmese, melena, otorragia, hemorragia conjuntival (Fig. 30),

hipermetrorragia e sangramento do sistema nervoso central (Fig. 31).

Pode haver sangramentos em qualquer área do corpo como aparelho

digestivo, rins e principalmente do sistema nervoso central, podendo deixar

Figura 30. Hemorragia conjuntival e gengivorragia em paciente vítima de acidente por filhote de Bothrops atrox. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 31. Acidente vascular hemorrágico fronto-parietal e cortical em vítima de acidente por filhote de Bothrops atrox (assinalado com seta vermelha). (Fonte: arquivo próprio).

29

ou não sequelas de gravidade variável, há relatos de insuficiência hipofisária

crônica (semelhante à síndrome de Sheehan) em paciente com possível

sangramento da hipófise (78-80). Os sangramentos parecem ser atribuídos

às hemorraginas mas o estado de incoagulabilidade sanguínea pode

prolongar e/ou intensificar as manifestações hemorrágicas (81, 82). Ocorre

hemólise pela ação mecânica do coágulo sobre as hemácias, pela hidrólise

de fosfolipídeos da membrana, ou indiretamente, através da liberação de

lisolectina da lecitina plasmática. O choque, embora raro e de instalação

precoce, parece estar relacionado com a quantidade de veneno inoculado na

vítima além de fatores como: liberação de mediadores inflamatórios e/ou

substâncias vasoativas, sangramento sistêmico abundante e/ou sequestração

de líquidos para o compartimento acometido (44).

1.1.7A3 COMPLICAÇÕES

As complicações locais geralmente são definidas como Infecção

Secundária (celulite, abscesso), Necrose, Síndrome Compartimental e Déficit

Funcional. As infecções secundárias devem ser criteriosamente identificadas

e tratadas adequadamente com antibioticoterapia, todavia o diagnóstico

muitas vezes se encontra dificultado porque os sinais flogísticos tais como

eritema, edema, dor, rubor, calor local e limitação de movimento podem

ocorrer tanto na atividade inflamatória aguda causada pelo veneno da

Bothrops como também pela infecção no local da picada e, por este motivo,

devem ser avaliados em função do tempo entre a picada e o exame clínico.

Algumas características, entretanto, podem orientar o diagnóstico de uma

infecção secundária incipiente: reativação dos sinais inflamatórios em

paciente com quadro local estabilizado ou em regressão, com ressurgimento

ou acentuação da dor; início súbito de picos febris ou presença de febre alta;

acentuação do infartamento ganglionar regional e presença de sinais de

flutuação à palpação local (44). A infecção secundária em acidente ofídico tem

sido relatada em até 38,5% como infecção local em estudos na Colômbia (83).

A celulite, por vezes, é de difícil identificação na fase inicial em indivíduos

de pele mais escurecida, todavia nestes casos, além dos sinais flogísticos, já

definidos em extensa literatura, podemos verificar um brilho na pele do

30

membro acometido que se apresenta diferente do membro contralateral não

acometido (Fig. 32 e Fig. 33).

Os abscessos também são muito frequentes, sendo necessária a

intervenção cirúrgica (drenagem) além de adequada antibioticoterapia. É

importante ressaltar que as infecções secundárias dos acidentes botrópicos

tem como etiologia, na maioria das vezes, os microrganismos anaeróbios e

gram negativos sendo descritos os seguintes microrganismos: Morganella

morganii, Escherichia coli, Providencia sp e Streptococo do grupo D (Fig. 34

e Fig. 35).

Outra complicação não menos comum, que pode evoluir com

sequelas mutilantes, é a necrose tecidual que pode levar ao Déficit Funcional.

Esta complicação quase sempre necessita de procedimento cirúrgico tanto

para retirada dos tecidos necróticos e desvitalizados como para reparação ou

Figura 32. Celulite por infecção secundária em acidente por Bothrops atrox apresentando edema flogótico em membro inferior direito. (Fonte:arquivo próprio).

Figura 33. Celulite por infecção secundária em acidente por Bothrops atrox apresentando edema flogótico com brilho na pele em em membro inferior esquerdo. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 34. Abscesso secundário após acidente por Bothrops atrox, apresentando edema e tumoração em tornozelo esquerdo. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 35. Abscesso secundário após acidente por Bothrops atrox, em fase de drenagem no tornozelo direito. (Fonte: arquivo próprio).

31

reconstituição tecidual (Figs. 36, 37, 38 e 39). Outra grave complicação é a

Síndrome Compartimental que via de regra leva o paciente ao procedimento

cirúrgico de Fasciotomia (Fig. 40 e Fig. 41). Caso a soroterapia seja

administrada muito tempo depois do acidente pode haver o caso de extensas

amputações gerando incapacidades físicas e psicológicas diversas e, também

incompatibilidade com a sobrevivência da vítima. Quando o tempo entre o

acidente botrópico e a soroterapia específica ultrapassa o tempo de 6 horas,

há uma probabilidade elevada de complicações e entre e elas, a mais comum

é a necrose progressiva.

Figura 36. Necrose em quarto quirodáctilo da mão esquerda em acidente por Bothrops atrox com mais de 24 horas de evolução até o atendimento em menino de 11 anos do município de Canutama - AM. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 37. Procedimento cirúrgico de amputação do quarto quirodáctilo da mão esquerda no paciente da figura 35. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 38. Amputação do quarto quirodáctilo da mão esquerda do paciente da figura 35. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 39. Perda tecidual por necrose em quarto quirodáctilo da mão direita em acidente por Bothrops atrox com mais de 6 horas entre o acidente e o atendimento. (Fonte: arquivo próprio).

32

As complicações sistêmicas são menos frequentes que as locais, porém

com o atraso na administração do soro elas são mais observadas e muitas

vezes podem levar a vítima ao tratamento intensivo ou ao tratamento dialítico.

Isto se torna difícil porque os acidentes que mais demoram para o tratamento

antiveneno específico são os mais distantes dos grandes centros de

atendimento hospitalar onde se concentram tais recursos.

Dentre as complicações sistêmicas pode ocorrer a Insuficiência Renal

Aguda (IRA), que muitas vezes leva o paciente à diálise ou pode ainda, ocorrer

choque ou estado de coma por motivos variados. A insuficiência renal aguda

tem sido descrita em 0,5 a 13,8% nos acidentes botrópicos e tem causas

multifatoriais que podem ser descritas a seguir: coagulação intravascular

disseminada com depósito intraglomerular de fibrina pode contribuir para a

necrose tubular aguda por interrupção do suprimento sanguíneo tubular;

alterações hemodinâmicas por sequestramento de fluidos na região da

picada, hemorragias, liberação de substâncias vasoativas, vômitos intensos e

repetidos e até hidratação inadequada podem levar a hipotensão com

consequente hipoperfusão renal. Um outro fator seria a administração do

próprio soro antiveneno que pode precipitar a hipotensão e o choque por

reação de hiperesensinilidade imediata, ou seja, o choque anafilático. A ação

nefrotóxica direta do veneno de Bothrops ainda é controversa, não havendo

estudos determinantes sobre isto. A hemólise pode ocorrer com mais

frequência e intensidade nos casos de IRA. Eventualmente outros fatores

podem contribuir para a IRA, são eles: consumo de complemento,

Figura 40. Fasciotomia em Síndrome Compartimental no paciente da figura 35. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 41. Evolução pós-cirúrgica em Fasciotomia por Síndrome Compartimental na perna direita (acidente por Bothrops atrox com mais de 6 horas entre o acidente e uso do soro antiofídico. (Fonte: arquivo próprio).

33

hipersensibilidade a proteínas do antiveneno, septicemia e antibioticoterapia.

O que se observa é que quando ocorre IRA geralmente é por necrose tubular

aguda e menos frequentemente por necrose cortical e nefrite instersticial

(29,44).

Outra complicação sistêmica importante é quando a hemorragia à

distância acomete órgãos vitais como sistema nervoso central, coração,

pulmões e rins. Têm sido descritos óbitos por hemorragia intracraniana

levando o paciente ao coma, quando sobrevive tem grande possibilidade de

sequela limitante que o torna incapaz. É importante ressaltar que pode ocorrer

tanto trombose com posterior isquemia como também hemorragia

intracraniana, como no caso de uma paciente que procedeu de uma

comunidade próxima ao Rio Xié e Alto Rio Negro, resgatada de helicóptero

para o Hospital de São Gabriel da Cachoeira, que recebeu o soro antiveneno

depois de 12 horas do acidente. Estes acidentes ofídicos ocorrem muitas

vezes no período noturno sendo inviável a evacuação aeromédica durante a

noite (Figs. 12, 13 e 14).

1.1.7B ACIDENTE CROTÁLICO

No local da picada observam-se edema discreto e parestesia persistente,

enquanto sistemicamente há sintomas de envolvimento de ações

neurológicas e miotóxicas como "fácies miastênica" (ptose palpebral uni- ou

bilateral e paralisia da musculatura facial), oftalmoplegia, dificuldade de

acomodação visual, dores musculares (mialgias), mioglobinúria (que pode ser

avaliada pela tonalidade da urina do avermelhado ao marrom e é

manifestação evidente da intensidade da rabdomiólise) e elevação dos níveis

séricos de creatinofosfoquinase (CPK) e da desidrogenase lática (DHL).

Além dos sintomas e sinais descritos acima, os pacientes também podem

apresentar manifestações sistêmicas gerais, como prostração, sudorese,

náuseas, vômitos, mal-estar, sonolência ou inquietação. Os sinais menos

freqüentes nos acidentes crotálicos são: paralisia da musculatura dos

membros; paralisia da musculatura respiratória, com possibilidade de

insuficiência respiratória aguda e, paralisia velopalatina (19).

34

1.1.7B1MANIFESTAÇÕES LOCAIS

São pouco importantes, diferindo dos acidentes botrópico e laquético. Não

há dor, ou esta pode ser de pequena intensidade. Há parestesia local ou

regional, que pode persistir por tempo variável, podendo ser acompanhada de

edema discreto ou eritema no ponto da picada.

1.1.7B2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS

Manifestações gerais como mal-estar, prostração, sudorese, náuseas,

vômitos, sonolência ou inquietação e secura da boca podem aparecer

precocemente e estar relacionadas a estímulos de origem diversas, nos quais

devem atuar o medo e a tensão emocional desencadeados pelo acidente.

Manifestações neurológicas decorrentes da ação neurotóxica do veneno,

surgem nas primeiras horas após a picada, e caracterizam o fácies miastênica

(fácies neurotóxica de Rosenfeld) evidenciadas por ptose palpebral uni ou

bilateral, flacidez da musculatura da face, alteração do diâmetro pupilar,

incapacidade de movimentação do globo ocular (oftalmoplegia), podendo

existir dificuldade de acomodação (visão turva) e/ou visão dupla (diplopia)

(Fig. 42). Como manifestações menos freqüentes, pode-se encontrar paralisia

venopalatina, com dificuldade à deglutição, diminuição do reflexo do vômito,

alterações do paladar e olfato.

Manifestações musculares com a ação miotóxica provocando dores

musculares generalizadas (mialgias) que podem aparecer precocemente. A

fibra muscular esquelética lesada libera quantidades variáveis de mioglobina

que é excretada pela urina (mioglobinúria), conferindo-lhe uma cor

avermelhada ou de tonalidade mais escura, até o marrom. A mioglobinúria

constitui a manifestação clínica mais evidente da necrose da musculatura

esquelética (rabdomiólise).

Manifestações hematológicas podendo haver incoagulabilidade

sangüínea ou aumento do Tempo de Coagulação (TC), em aproximadamente

40% dos pacientes, observando-se raramente sangramentos restritos às

gengivas (gengivorragia). Outras manifestações clínicas pouco frequentes

como insuficiência respiratória aguda, fasciculações e paralisia de grupos

35

musculares têm sido relatadas. Tais fenômenos são interpretados como

decorrentes da atividade neurotóxica e/ou da ação miotóxica do veneno (19).

1.1.7B3 COMPLICAÇÕES

Podem ser locais com raros pacientes evoluindo com parestesias locais

duradouras, porém reversíveis após algumas semanas, e sistêmicas sendo a

principal complicação do acidente crotálico, em nosso meio, é a insuficiência

renal aguda (IRA), com necrose tubular geralmente de instalação nas

primeiras 48 horas. Um quadro resumido das manifestações clínicas

relacionadas com os principais gêneros de importância médica é apresentado

abaixo (Quadro 1).

Quadro 1. Atividade do veneno e patogenia (6)

Fonte: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_vigilancia_epidemiologica_7ed.pdf

Figura 42. Acidente crotálico grave apresentando fácies miastênica com ptose palpebral bilateral. (Fonte: F Bucaretchi).

36

1.1.7C ACIDENTE LAQUÉTICO

Por se tratar de serpentes encontradas em áreas florestais, onde a

densidade populacional é baixa e o sistema de notificação não é tão eficiente,

as informações disponíveis sobre esses acidentes são escassas. Estudos

preliminares realizados com imunodiagnóstico (ELISA) sugerem que os

acidentes por Lachesis são raros, mesmo na região Amazônica (29). As

manifestações clínicas dos acidentes laquéticos são bastante semelhantes

aos dos acidentes botrópicos, sendo acrescidas apenas das manifestações

neurológicas próprias destes acidentes.

1.1.7C1 MANIFESTAÇÕES LOCAIS

Ocorre dor e edema local de progressiva intensidade, podendo evoluir

com vesículas e bolhas de conteúdo seroso ou sero-hemorrágico. Em alguns

casos os sinais e sintomas parecem ser mais intensos que nos acidentes

botrópicos, talvez por serem serpentes maiores e produzirem maior

quantidade de veneno e por isto também injetarem maior quantidade em cada

picada. Os sangramentos, embora mais frequentes no local da picada, em

ferimentos pre-existentes e nos locais de venopunção, ocorrem também,

como nos acidentes botrópicos, em qualquer região do corpo (29). Podem

surgir vesículas e bolhas de conteúdo seroso ou sero-hemorrágico nas

primeiras horas após o acidente. As manifestações hemorrágicas limitam-se

ao local da picada na maioria dos casos e a gravidade é avaliada segundo os

sinais locais e pela intensidade das manifestações sistêmicas (19).

1.1.7C2 MANIFESTAÇÕES SISTÊMICAS

Dentre as manifestações sistêmicas, as de origem neurotóxica

caracterizam e ajudam na diferenciação entre os acidentes laquéticos e

botrópicos. São elas geradas pela ativação do sistema nervoso autônomo

parassimpático, caracterizadas principalmente pela hipotensão arterial grave

e precoce nos primeiros minutos do acidente, ocorrendo também ao mesmo

37

tempo náuseas, sudorese, vômitos, cólicas abdominais, diarréia e bradicardia.

Com o agravamento destas alterações ocorre choque, bradicardia de intensa

gravidade e óbito. A bradicardia é um importante sinal que ajuda na

diferenciação entre os acidentes botrópicos e laquéticos, o que se espera na

vítima de envenenamento pela maioria dos animais peçonhentos é a

taquicardia pela descarga adrenérgica sendo também assim no acidente

botrópico e, portanto, quando ocorre a bradicardia sem nenhuma arritmia

prévia, a suspeita se direciona para o acidente laquético (44). Os acidentes

botrópicos e laquéticos são muito semelhantes do ponto de vista clínico,

sendo, na maioria das vezes, difícil o diagnóstico diferencial. As

manifestações da “síndrome vagal” poderiam auxiliar na distinção entre o

acidente laquético e o botrópico (19).

Segundo relato deste autor, um madeireiro após acidente ofídico na mata

primária e tratamento com soro antibotrópico para acidente grave, teve piora

do quadro e só evoluiu satisfatoriamente com o soro antibotrópico-laquético.

Chama a atenção a grande extensão da equimose e a hipotensão arterial

apresentada, como não foi apresentado o ofídio, pode ter sido uma serpente

do gênero Lachesis, considerando as características epidemiológicas, clínicas

e de resposta terapêutica (Fig. 43).

1.1.7C3 COMPLICAÇÕES

Figura 43. Madeireiro vítima de acidente ofídico em mata primária, com grande área de equimose em membro inferior direito, hipotensão e evolução favorável após o uso de soro antibotrópico-laquético. (Fonte: arquivo próprio).

38

As complicações locais descritas no acidente botrópico (síndrome

compartimental, necrose, infecção secundária, abscesso, déficit funcional)

também podem estar presentes no acidente laquético.

1.1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

O diagnóstico de acidente ofídico é basicamente epidemiológico e clínico,

ou seja, diante da história e exame físico, conhecendo-se previamente a

distribuição e hábitos da serpente e o efeito de sua peçonha no organismo

humano, é possível deduzir com grande margem de acerto sobre o gênero e

até espécie da serpente. Apesar disto, é possível a utilização dos exames

laboratoriais para, de forma indireta, ajudar na identificação do gênero do

ofídio causador, avaliando a gravidade do acidente e procedendo com a

identificação e seguimento de complicações, como veremos a seguir.

No acidente botrópico, o tempo de coagulação (TC) é de fácil execução,

sua determinação é importante para elucidação diagnóstica e para o

acompanhamento dos casos. O hemograma geralmente revela leucocitose

com neutrofilia e desvio à esquerda, hemossedimentação elevada nas

primeiras horas do acidente e plaquetopenia de intensidade variável. No EAS

(sumário de urina) pode haver proteinúria, hematúria e leucocitúria. Outros

exames laboratoriais poderão ser solicitados, dependendo da evolução clínica

do paciente, com especial atenção aos eletrólitos, uréia e creatinina, visando

à possibilidade de detecção da insuficiência renal aguda. Os métodos de

imunodiagnóstico, em que antígenos do veneno botrópico podem ser

detectados no sangue ou outros líquidos corporais, podem ser realizados por

meio da técnica de ELISA (19).

No acidente laquético, também a determinação do Tempo de Coagulação

(TC) é importante medida auxiliar no diagnóstico do envenenamento e

acompanhamento dos casos. Dependendo da evolução, outros exames

laboratoriais podem estar indicados (hemograma, dosagens de uréia,

creatinina e eletrólitos). O imunodiagnóstico vem sendo utilizado em caráter

experimental, não estando disponível na rotina dos atendimentos (19).

39

No acidente crotálico, como resultado da miólise, há liberação de

mioglobina e enzimas, podendo-se observar valores séricos elevados de

creatinofosfoquinase (CPK), desidrogenase lática (DHL), aspartase-

aminotransferase (AST), aspartase-alanino-transferase (ALT) e aldolase. O

aumento da CPK é precoce, com pico de máxima elevação dentro das

primeiras 24 horas após o acidente. O aumento da DHL é mais lento e gradual,

constituindo-se, pois, em exame laboratorial complementar para diagnóstico

tardio do envenenamento crotálico. Na fase oligúrica da IRA, são observadas

elevação dos níveis de uréia, creatinina, ácido úrico, fósforo, potássio e

diminuição da calcemia. O Tempo de Coagulação (TC) freqüentemente está

prolongado. O hemograma pode mostrar leucocitose, com neutrofilia e desvio

à esquerda, às vezes com presença de granulações tóxicas. O exame do

sedimento urinário geralmente é normal quando não há IRA. Pode haver

proteinúria discreta, com ausência de hematúria. Há presença de mioglobina,

que pode ser detectável pelo teste de benzidina ou pelas tiras reagentes para

uroanálise ou por métodos específicos imunoquímicos como

imunoeletroforese, imunodifusão e o teste de aglutinação de mioglobina em

látex (19).

1.1.9 TRATAMENTO

É possível classificar a gravidade do acidente e consequentemente optar

pelo número de frascos ou ampolas a ser administrado. Como medidas gerais

no acidente botrópico é importante manter a vítima em repouso e tranquila

pois a sensação de envenenamento é estressante pela possibilidade do risco

de morte. O garroteamento (torniquete) do membro afetado é contraindicado

pelo risco de gangrena, assim também como estão contraindicados a sucção

labial e incisão local. Deve-se apenas limpar e lavar cuidadosamente o local

com água e sabão, monitorar os sinais vitais e volume urinário e, remover a

vítima para onde haja o soro antiofídico.

No tratamento geral é importante manter o paciente hidratado, deve-se

evitar o uso de drogas depressoras do sistema nervoso central, sendo muitas

vezes necessário o uso de analgésicos para o controle da dor. O membro

acometido deve ser mantido em elevação, evitando-se a deambulação e os

40

cuidados com o ferimento devem ser realizados de acordo com sua

característica.

No tratamento específico do acidente botrópico, o soro antiofídico é

utilizado de acordo com o Quadro 2 apresentado abaixo, onde a quantificação

da segmentação do membro acometido é usada para definir a classificação e

a quantidade de soro antiofídico a ser utilizada (45).

Na terapia específica com o soro antiofídico tem sido utilizada uma pre-

soroterapia com inibidores de receptores H1 e H2 e corticoide antecedendo

o soro específico em 30 a 45 minutos na tentativa de evitar ou minorar as

reações adversas. O soro antiofídico é feito de acordo com o Quadro 3 e,

durante o tempo de 30 a 45 minutos diluído ou não em soro fisiológico 0,9%

ou glicosado 5%. Na FMT-HVD o soro não tem sido diluído pois há o

entendimento que o efeito benéfico não deve ser retardado em hipótese

alguma e considerando que os pacientes chegam ao hospital depois de um

tempo muito longo após o acidente ofídico.

Quadro 2 . Classificação quanto à gravidade e tratamento no acidente botrópico(45)

41

Quadro 3. Pré-soroterapia e tratamento das reações adversas.

Medicamentos na Pré-soroterapia Medicamentos nas Reações Adversas (na

dependência da reação apresentada) Hidrocortisona EV 500 mg (adultos) Para crianças – de acordo com o peso e/ou

idade.

Adrenalina 1:1000 SC, se choque anafilático (adultos)

Ranitidina EV 50 mg (adultos)

OU Cimetidina EV 300 mg (adultos) Para crianças – de acordo com o peso e/ou

idade.

Aminofilina EV 1 ampola diluído, gota a gota, se dispnéia. Para crianças – de acordo com o peso e/ou idade.

Dexclorfeniramina VO 2 mg (adultos) Para crianças – de acordo com o peso e/ou idade.

Prometazina EV 1 ampola, se reação alérgica intensa, observar limite de dose com a dexclorfeniramina para evitar overdose Para crianças – de acordo com o peso e/ou idade.

Intubação ou traqueostomia, se necessárias. Elevação de decúbito

Obs1. Sempre utilizar equipo em Y (duas vias Obs2. Paciente sempre em dieta zero antes

da pré-soroterapia até o término da

soroterapia específica

Oxigenioterapia sob máscara, intubação ou

traqueostomia, se necessário e de acordo com a

evolução e gravidade de cada caso.

Obs3. Iniciar o gotejamento do Soro

Especifico 30 a 45 minutos após o término da

Pré-soroterapia e correr em 30 a 45 minutos.

Obs1. Sempre interromper a administração do SAV fechando a sua via de administração e aplicar o medicamento necessário.

No tratamento geral do acidente laquético, além dos cuidados gerais

semelhantes ao acidente botrópico, na presença de bradicardia com

instabilidade hemodinâmica está indicado o uso de sulfato de atropina, em

caso de hipotensão e/ou choque estão indicados hidratação vigorosa e

drogas vasoativas (quando necessário). O tratamento das complicações

são os mesmos do acidente botrópico, ou seja, antibioticoterapia em caso

de celulite, drenagem cirúrgica e antibioticoterapia em caso de abscesso,

42

debridamento cirúrgico ou químico em caso de necrose e diálise em caso

de IRA (quando necessário) (44).

No tratamento específico do acidente laquético deve-se avaliar as

alterações locais na região da picada e a intensidade das manifestações

vagais. Após a correta classificação e a pre-soroterapia, o soro antilaquético

(SAL) ou antibotrópico laquético (SABL) deve ser usado de acordo com o

Quadro 4, aconselhando-se a usar a mesma classificação das

manifestações locais em segmentação utilizada no acidente botrópico

(Quadro 2)

No tratamento geral do acidente crotálico, a hidratação adequada é de

fundamental importância na prevenção da IRA e será satisfatória se o

paciente mantiver o fluxo urinário de 1 ml a 2 ml/kg/hora na criança e 30 a

40 ml/hora no adulto. A diurese osmótica pode ser induzida com o emprego

de solução de manitol a 20% (5 ml/kg na criança e 100 ml no adulto). Caso

persista a oligúria, indica-se o uso de diuréticos de alça tipo furosemida por

via intravenosa (1 mg/kg/ dose na criança e 40mg/dose no adulto). O pH

urinário deve ser mantido acima de 6,5 pois a urina ácida propicia a

precipitação intratubular de mioglobina. Assim, a alcalinação da urina deve

ser feita pela administração parenteral de bicarbonato de sódio,

monitorizada por controle gasométrico (29).

No tratamento específico, o soro anticrotálico (SAC) deve ser

administrado intravenosamente, segundo as especificações incluídas no

capítulo Soroterapia. A dose varia de acordo com a gravidade do caso,

devendo-se ressaltar que a quantidade a ser ministrada à criança é a

mesma do adulto. Poderá ser utilizado o soro antibotrópico-crotálico

(SABC). Com base nas manifestações clínicas, o envenenamento crotálico

pode ser classificado em: a) Leve: caracteriza-se pela presença de sinais e

sintomas neurotóxicos discretos, de aparecimento tardio, sem mialgia ou

alteração da cor da urina ou mialgia discreta. b) Moderado: caracteriza-se

pela presença de sinais e sintomas neurotóxicos discretos, de instalação

precoce, mialgia discreta e a urina pode apresentar coloração alterada. c)

Grave: os sinais e sintomas neurotóxicos são evidentes e intensos (fácies

43

miastênica, fraqueza muscular), a mialgia é intensa e generalizada, a urina

é escura, podendo haver oligúria ou anúria (29, 44).

De acordo com a classificação de gravidade, se faz necessária a

administração da soroterapia específica como resumido no Quadro 4,

pertinente aos principais gêneros de importância médica no Brasil.

Quadro 4.Número de ampolas de antiveneno por tipo de acidente e gravidade.

Há que se observar a possibilidade de reações adversas como reação

anafilática (85), com sinais e sintomas descritos a seguir por ordem de

frequência, podendo levar ao choque e ainda podem ocorrer reações

anafilactóides e doença do soro. Todas estas reações devem ser

identificadas e tratadas adequadamente (Quadro 5). As condutas diante

destas situações de anafilaxia estão também descritas junto com a pre-

soroterapia no Quadro 4.

44

Quadro 5.Sinais e sintomas da reação anafilática.

Urticária, prurido, angioedema 88%

Edema de vias aéreas superiores 56%

Dispnéia, chiado e tosse 47%

“Rush cutâneo” 46%

Tontura, síncope, hipotensão, taquicardia 33%

Náuseas, vômitos, diarréia, cólica 30%

Rinite 16%

Cefaléia 15%

Dor subesternal 6%

Prurido cutâneo sem “rush” 4,5%

Convulsão 1,5%

Fonte: Handout of American Academy of Allergy and Immunology 2006 Annual Meeting.

1.1.10 SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE LIOFILIZADO

1.1.10A HISTÓRICO

As pesquisas de Sewal, de Kaufmann, de Physalix, de Bertrand e

principalmente as de Calmette estabeleceram em bases científicas a noção

de imunidade, em relação ao veneno ofídico. Mais do que isto, estes últimos

pesquisadores, trabalhando em 1894, quando já eram conhecidos os

trabalhos de Behring e Kitasato que firmaram as bases da soroterapia em

relação à difteria e ao tétano, provaram que o soro dos animais vacinados

contra a peçonha possuía também uma substância antitóxica capaz de

neutralizar os efeitos do veneno e de transmitir imunidade passiva aos animais

não preparados. Calmette conseguiu hiperimunizar grandes animais para o

preparo do soro antiofídico, servindo-se principalmente do veneno de cobra

indiana (Naja tripudians). Vital Brazil foi o primeiro a demonstrar a

especificidade dos antivenenos. A partir desta descoberta, Vital Brazil iniciou

em 1901, no Instituto Butantan, o preparo de antivenenos mono e

poliespecíficos, os soros anticrotálico e antibotrópico para uso no Brasil. Esta

sua orientação de preparação dos soros mono e poliespecíficos, para uso em

uma determinada região, é adotada no mundo inteiro nos dias atuais.

45

Embora a metodologia do preparo dos soros antiofídicos não tenha

avançado muito desde a sua descoberta, procedimentos de purificação e

modos de utilização foram modificados consideravelmente. Os soros

heterólogos são concentrações de imunoglobulinas obtidas através de soros

de cavalos imunizados com o veneno. Os antivenenos são utilizados com o

objetivo de neutralizar as atividades sistêmicas e locais dos venenos. A

soroterapia antiveneno é a única medida específica para o tratamento

adequado dos pacientes picados pela maioria dos animais peçonhentos.

Quanto a mistura de diversos gêneros de ofídios para a confecção de um soro

polivalente liofilizado, há um entendimento de que isto reduz o custo-

efetividade considerando que trata-se um produto nobre que deve ter o

máximo de aproveitamento após a sua produção.

O soro antiveneno é produzido através da inoculação dos venenos em

equinos, situação que traz um sofrimento necessário aos animais de

produção. Diante desta condição, atualmente se concebe um soro para as

condições de precariedade de recursos na África, o mesmo processo de

produção e distribuição pode ser aplicado para os impasses de conservação

e logística no Brasil. A população pobre da África sofre as consequências dos

acidentes ofídicos, mas a pobreza nega o acesso ao tratamento e esperança

de um bom desfecho para as vítimas. Um novo antiveneno polivalente

denominado “Antivenom AID Product Development Partnership–

AntivenomAID PDP)” reduzirá substancialmente a atual mortalidade

(atualmente acima de 32.473 mortes/ano) e a incapacidade física de longa

duração (incluindo cerca de 8.000 amputações/ano) e as incapacidades

psicológicas sofridas por muitas vítimas de acidentes ofídico. Essa medida,

nas comunidades pobres, melhorará a qualidade de vida e aumentará a

produtividade para os agricultores de subsistência. Na África, quando se

avalia o benefício do soro antiofídico em comparação com o tratamento de

outras doenças negligenciadas, torna-se visível a melhora dos índices de

complicações atribuídas a perda da qualidade de vida das vítimas (Fig. 44). O

novo soro polivante panafricano a ser desenvolvido com o agrupamento

“Antivenom AID PDP” será uma intervenção muito custo-efetiva comparada

com outras doenças negligenciadas (85).

46

Atualmente o soro antiofídico brasileiro é distribuído no país inteiro pelo

Programa Nacional de Imunizações (PNI) do Ministério da Saúde, após as

notificações geradas por um processo alimentado pelos Serviços de

Epidemiologia de Unidades de Atendimento de Referência. Com base nestas

notificações o Ministério da Saúde fornece o soro antiofídico líquido através

de uma cadeia de suprimento descentralizada até chegar o mais próximo

possível onde ocorrem os acidentes e onde os pacientes são atendidos.

Contudo há que se considerar que o atual soro líquido utilizado necessita de

refrigeração entre 2 a 8 oC, sendo desta maneira, necessário o uso de

refrigeradores que por sua vez necessitam de eletricidade para o

funcionamento. Baseado neste impasse o Instituto de Biologia do Exército

(IBEx-RJ), que já fornece plasma hiperimune para a industrialização no

Instituto Butantan, fez um acordo com aquele Instituto para que produzissem

o soro na forma liofilizada e trivalente, o primeiro de produção nacional,

assumindo assim a realização de um ensaio clínico para análise de viabilidade

de produção em uma escala maior que viesse a atender às regiões mais

Figura 44. Comparação do número de "DALYs" perdidos devido a cada doença negligenciada e custo por "DALYs" evitáveis por várias intervenções terapêuticas. (Fonte: 85).

47

distantes e desprovidas de recursos no país. Os municípios mais distantes na

Amazônia passaram a ser o alvo deste estratégico estudo, o que passa a ter

seus resultados agora apresentados neste trabalho descrito a seguir. Questão

científica que precisa ser elucidada é a impressão de que “quanto mais

complexo o soro em termos de mistura de imunoglobulinas, mais eventos

adversos poderiam ocorrer”. Agregando valor ao presente estudo, deixamos

também uma impressão inicial sobre esta questão que tecnicamente dentro

de parâmetros científicos de análise, é apresentada neste trabalho. Assim de

forma didática separamos a análise em avaliação comparativa da segurança

e eficácia de ambos os soros (líquido e liofilizado), considerando

separadamente cada um dos três principais gêneros de ofídios. Para um

melhor entendimento deste trabalho, usamos o termo mono e bivalente em

referência ao gênero do ofídio e não a espécie, o que consideramos como

mono e poliespecífico.

1.1.10B LIOFILIZAÇÃO

Em uma pesquisa histórica verifica-se que o primeiro produto liofilizado

surgiu em 1911, com o vírus da raiva (86). O produto só atingiu a escala

industrial durante a Segunda Guerra Mundial (1939-1945), devido à

demanda por plasma sanguíneo em ferimentos de guerra. Nesta época já

havia a comercialização de café em pó, surgindo em 1938, através da

companhia Nestlé (87). Como havia uma grande demanda por sangue

durante a Segunda Guerra Mundial, os Estados Unidos da América

investiram centenas de milhões de dólares em inúmeras novas

possibilidades de desenvolvimento de substitutos do sangue e de plasma

sanguíneo, para o tratamento dos soldados feridos nos campos de batalha

e que requeriam transfusões de sangue, pois não havia quantidade

suficiente de sangue fresco disponível (88). A primeira tentativa da

preservação do plasma sanguíneo foi relatada e realizada por Greaves em

1944 (89). A aplicação do processo de liofilização focou-se, posteriormente,

no campo da indústria farmacêutica, ocorrendo durante a década de 1950 o

surgimento de medicamentos liofilizados como antibióticos à base de

penicilina (89). Paralelo ao surgimento das penicilinas liofilizadas, pesquisas

acerca da liofilização de peptídeos, proteínas, anticorpos, enzimas e

48

hormônios foram sendo aprofundadas, e posteriormente comercializadas

com fins terapêuticos. A partir disso, surgiram as vacinas liofilizadas, os

antibióticos e também as vitaminas (86).

Na década de 1960, passaram a surgir vários alimentos liofilizados no

mercado, inclusive alimentos fornecidos aos astronautas em missão no

espaço, ganhando grande destaque durante o programa Apollo da NASA. O

primeiro alimento liofilizado a ser comercializado foi o Nescafe®, em 1938.

Este projeto da Nestlé surgiu em meio a crise que o mercado do café vinha

enfrentando, e devido à necessidade de suprir a grande demanda mundial

de café da época. O produto Nescafe® foi inicialmente comercializado na

Suíça, mas logo expandiu seu mercado para o mundo (90). Atualmente, além

de café, há muitos produtos liofilizados sendo comercializados, como ervas,

frutas, produtos lácteos (91). A revolução da biotecnologia, na década de

1990, levou ao aumento da demanda por produtos liofilizados, bem como de

pesquisas mais especializadas no campo da liofilização (89). E a partir desta

época, a técnica foi se expandindo para outros campos de pesquisa, como

o da reprodução. Designa-se por liofilização uma técnica especial de

dessecação, que permite a secagem de um corpo após prévio

congelamento, removendo-se a água congelada por sublimação à custa de

vácuo, de modo a dar-se, diretamente, a passagem do estado sólido ao

gasoso, sem que em qualquer momento da operação o gelo formado retome

o estado líquido (92). O princípio da liofilização consiste na remoção de água

de uma amostra congelada por sublimação e dessorção sob vácuo. Esse

processo é dividido em três etapas: primeiro ocorre o congelamento da

amostra, depois faz-se a sublimação e, finalmente, faz-se a dessorção da

água não congelada (92).

Essa técnica permitiu a secagem de substâncias alteráveis,

principalmente os produtos de origem biológica, os quais, na sua maioria,

são destruídos em sua totalidade ou parcialmente quando submetidos aos

processos convencionais de dessecação. Atualmente, a liofilização é

considerada como sendo o método ideal para secagem de produtos

termolábeis ou de natureza complexa em que figurem constituintes

excessivamente sujeitos a alterações por vários agentes, como o calor, o

oxigênio, a umidade e tantos outros. A congelação brusca e intensa a que

49

as substâncias (ou corpo), a liofilizar são submetidas, permite conservar

todas as propriedades que possuíam no momento da congelação,

mantendo-as integralmente uma vez secas por sublimação do gelo formado

(92).

A conservação de nanopartículas tem sido um dos exemplos de

vantagens da liofilização. (93, 94). Um dos exemplos mais demonstrativo do

que é possível conseguirse com a liofilização quanto à preservação das

características de um corpo é a conservação dos microorganismos. Neste

caso, além de mantê-los vivos, após a reconstituição, são mantidos os

mesmos caracteres morfológicos, culturais, bioquímicos e biológicos (92).

Podemos citar uma lista de vantagens em relação ao processo de liofilização

(91):

1 - A baixa temperatura a que se opera evita qualquer alteração química

das substâncias decomponíveis pelo calor. Por isso, um produto seco por esta

técnica mantém inalterável a sua composição química original, a sua atividade

terapêutica e outras propriedades características. Se for acondicionado e

armazenado convenientemente, poderá manter-se sem alteração durante um

longo período.

2 - A perda de constituintes voláteis está reduzida ao mínimo.

3 - Os produtos liofilizados apresentam uma estrutura que contribui para

sua rápida dissolução, assegurando-se, assim, a reprodução fiel do produto

original uma vez posto o liofilizado em contato com a fase líquida primitiva.

4 - Durante a secagem o desenvolvimento de microrganismos e as

reações enzimáticas são inibidos pelas baixas temperaturas a que se opera,

o mesmo acontecendo nos produtos secos, pois seu teor de água mínimo

impossibilita qualquer manifestação vital.

5 - A tendência de certos produtos coagularem quando dessecados por

outras técnicas está reduzida quando utilizado este processo.

A biotecnologia resultou na produção de várias proteínas para propósitos

farmacêuticos. Porém, proteínas são quimicamente instáveis, o que causa

problemas durante sua purificação, formulação e armazenamento. A

liofilização é frequentemente utilizada para que formulações de proteínas

alcancem uma estabilidade desejada a longo prazo (95, 97, 98, 99, 100).

50

Com estas vantagens, não é de se estranhar, que os produtos submetidos

à liofilização estejam aumentando a cada dia. Entre eles, podemos citar, por

exemplo: certos antibióticos (penicilina), substâncias contendo proteínas

termolábeis, bactérias, vírus, tecidos humanos para enxertos, alimentos,

plasma sanguíneo, soros, vacinas, hormônios, etc. No mercado temos vários

modelos de liofilizadores industriais e neste projeto foi utilizado o liofilizador

Benchmark 1100, Virtis – USA (Fig. 45). Abaixo é apresentado o princípio de

funcionamento de um liofilizador e processo de liofilização (Fig. 46 e Fig. 47).

Figura 45. Liofilizador - Benchmark 1100 (Virtis, USA). (Fonte: http://www.tsaohsin. com.tw/html/ProductPage/virtis/virtis1.1.htm)

Figura 46. Princípio de funcionamento de um liofilizador. (Fonte: http://www.liofilizador.com/ products/showproduct.php?lang=es&id=37)

http://www.tsaohsin/

51

2. JUSTIFICATIVA

No Brasil, os laboratórios que produzem esses imunoderivados são o

Instituto Butantan (São Paulo), Fundação Ezequiel Dias (Minas Gerais),

Instituto Vital Brazil (Rio de Janeiro) e o Centro de Produção e Pesquisa de

Imunobiológicos (Paraná). Os soros são produzidos em formulação líquida,

envasadas em ampolas, com apresentações mono- ou bivalentes, devendo

ser armazenados à temperatura de 2 a 8 graus Celsius positivos, sendo sua

validade em geral, de 2 a 3 anos. Entretanto para os países tropicais, a

Organização Mundial de Saúde recomenda que os soros sejam apresentados

na forma liofilizada. O soro liofilizado torna-se extremamente útil e prático para

aplicação em pontos estratégicos do território nacional, principalmente na

Região Amazônica, atendendo às tropas militares operacionais que realizam

manobras, exercícios no terreno e acampamentos, bem como populações

indígenas, ribeirinhas e trabalhadores rurais, distantes dos centros de

atendimento médico.

Como amplamente explanado na Introdução deste estudo, o atendimento

de vítimas em lugares distantes do recurso de energia elétrica, ocorre depois

de muitas horas após o acidente, ficando a vítima exposta à complicações que

Figura 47. Processo de liofilização. (Fonte: http://www. liofilizador.com/products/ showproduct.php?lang=es&id=37).

52

a levam a incapacidade pelas inúmeras sequelas, onerando o Estado com

aposentadorias e sobretudo causando sofrimento nas comunidades mais

pobres da Região Amazônica. Há que se ressaltar que estes atendimentos

requerem evacuação aeromédica gerando despesas imprevisíveis para os

governos municipais, estadual e até federal, através das Forças Armadas,

como exemplificado na Introdução deste estudo. Outro fator de extrema

relevância são as despesas nas Unidades de Tratamento Intensivo da capital,

causadas pela gravidade destes casos que demoram para terem acesso ao

soro antiofídico líquido atual.

Baseado neste contexto, o Instituto Butantan em parceria com o Instituto

de Biologia do Exército iniciou a produção no ano de 2000, dos primeiros lotes

de soro antiofídico liofilizado trivalente (botrópico-laquético-crotálico),

apresentados em caixas com 5 frascos contendo cada um, duas doses,

suficientes para neutralizar no mínimo, 100 mg, 60 mg, e 30 mg dos venenos

de referência de Bothrops jararaca, Lachesis muta e Crotalus durissus

terrificus, respectivamente (soroneutralização em camundongos).

Acompanhando o produto, 5 ampolas de 20 ml de diluente para soro (Fig. 38).

De acordo com experimentos realizados pelo Instituto Butantan o produto

liofilizado possui excelente termoestabilidade em ambientes de elevadas

temperaturas (56 graus Celsius), por um período de 12 meses (Anexo I),

sendo assim dispensada a necessidade de cuidados com refrigeração, tal

como ocorre com o soro líquido convencional.

Após a liofilização do produto foram realizados testes de controle interno

de qualidade (esterilidade, pirogênico, inocuidade, potência e de

características físico-químicas) e externo no INCQS/Fiocruz, ambos com

resultados satisfatórios (Anexo II). Em uma segunda etapa foram realizados

testes em humanos, propósito deste estudo, atendendo as normas da

Resolução nº196, de 10 de outubro de 1996 e da Resolução nº 251, de 07 de

agosto de 1997, ambas do Conselho Nacional de Saúde, por se tratar de nova

associação de substâncias (trivalente) e forma farmacêutica (liofilizada),

diferentes daquelas estabelecidas quando da autorização do registro.

53

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

• Avaliar a segurança e eficácia de um soro antiofídico trivalente liofilizado.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estimar a incidência de eventos adversos da administração do soro

antiofídico trivalente liofilizado;

Determinar a eficácia do soro antiofídico trivalente liofilizado em neutralizar os

principais efeitos tóxicos dos acidentes;

Determinar a estabilidade térmica do soro antiofídico trivalente liofilizado.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.2 OBTENÇÃO DO SATL

A partir da imunização de cavalos com veneno botrópico, laquético e

veneno crotálico, foram obtidos os respectivos plasmas que, após processos

físicos e químicos, deram origem aos soros purificados e concentrados.

Considerando a necessidade de um produto trivalente e liofilizado as

respectivas frações dos soros concentrados foram misturados conforme

formulação, obedecendo a normatização de liberação dos soros com as

respectivas potências:

• Fração botrópica - 5,0 mg/mL

• Fração laquética - 3,0 mg/ml

• Fração crotálica - 1,5 mg/mL

Este produto então foi testado como produto final e aprovado, sendo então

envasado em frascos de 10,0 ml e 20,0 mL, e submetido ao processo de

liofilização, também testado e aprovado para uso. O soro foi produzido em

parceria entre o Instituto de Biologia do Exército (RJ) e Instituto Butantan (SP).

O soro é apresentado em frascos-ampola contendo fração F(ab7)2 de

imunoglobulinas, purificadas e liofilizadas, obtidas de plasma de eqüinos

hiperimunizados com venenos de serpentes dos gêneros Bothrops, Lachesis

54

e Crotalus. O produto acompanha 5 ampolas de 20 ml de diluente para soro

(Fig. 48 e Fig. 50). O soro tem a seguinte composição química:

4.2.1 Fração F(ab7)2 de imunoglobulinas que neutralizam, no mínimo 100

mg, 60 mg e 30 mg dos venenos de referência de Bothrops jararaca,

Lachesis muta e Crotalus durissus terrificus, respectivamente

(soroneutralização em camundongo)

4.2.2 Fenol............................... 35mg (máximo)

4.2.3 Sacarose.......................... 1g

4.2.4 Cloreto de Sódio............. 0,17g

Cada ampola de diluente contém 20ml de água purificada para injetáveis.

4.2 DESENHO DO ESTUDO E PARTICIPANTES

Trata-se de um ensaio clinico prospectivo, aberto, randomizado, de fase IIb,

conduzido de junho de 2005 a maio de 2008. Foram incluídos os acidentes

botrópicos atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

(FMT-HVD), Manaus, Estado do Amazonas, Brasil (Fig. 50).

Figura 47. Soro antiofídico trivalente liofilizado utilizado no Projeto. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 48. Soro antiofídico trivalente liofilizado após reconstituição. (Fonte: arquivo próprio).

55

Para os acidentes laquéticos, foram incluídos pacientes do município de

Borba, atendidos na Unidade Mista de Borba, Estado do Amazonas, Brasil

(Fig. 52), municípios de Normandia e Pacaraima (Estado de Roraima, Brasil)

atendidos no Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento – Boa Vista

(Fig. 51). Para os acidentes crotálicos, foram incluídos pacientes dos

municípios de Boa Vista e Cantá (Estado de Roraima, Brasil), também

atendidos no Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento – Boa Vista.

Homens e mulheres entre 12 e 70 anos de idade eram elegíveis para o

estudo. Os acidentes botrópicos, laquéticos e crotálicos foram diagnosticados

com avaliações epidemiológicas, clínicas e laboratoriais. Os critérios de

exclusão foram gravidez, amamentação, doenças hematológicas prévias,

estado de imunodeficiência conhecida (infecção pelo HIV, neoplasias,

quimioterapia, terapia com corticoesteróides ou outros estados de

imunossupressão), tratamento prévio com soros antiofídicos e história de

reações alérgicas moderadas ou graves. Além disso, não foram incluídos os

pacientes apresentando gravidade, definidos como acidentes botrópicos e

Figura 50. Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado – Manaus- AM. (Fonte: Seção Técnica da FMT-HVD).

Figura 51. Hospital Geral de Roraima Rubens de Sousa Bento - Boa vista - Roraima. (Fonte: arquivo próprio).

Figura 52. Unidade Mista de Borba – AM. (Fonte: arquivo próprio).

56

laquéticos graves, os casos com grande hemorragia, hipotensão, choque e

insuficiência renal aguda, e os acidentes crotálicos com intensa rabdomiólise

e insuficiência renal aguda grave (100).

4.3 SELEÇÃO DE PACIENTES, INTERVENÇÕES E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA

Após o diagnóstico de acidente com envenenamento, os pacientes que

preencheram os critérios de inclusão eram selecionados randomicamente

com alocação 1:1 para um dos seguintes grupos:

• Grupo A: Soro Antiofídico Trivalente Liofilizado (SATL), produzido de acordo

com as Boas Práticas de Produção pelo Instituto Butantan (São Paulo,

Brasil) em parceria com o Instituto de Biologia do Exército (Rio de

Janeiro, Brasil). Neste estudo, a liofilização foi realizada no Instituto

Butantan. Rapidamente, ampolas de 20 ml foram adicionadas com 5 ml de

cada formulação e inseridas em um Liofilizador Benchmark 1100 (Virtis,

USA). As amostras foram congeladas a -40oC e aneladas a -10oC por 4

horas. A primeira secagem foi conduzida a -20oC por 64 horas, e a secagem

secundária a 30oC por 4 horas e 200 mTorr.

• Grupo B: Os antivenenos avaliados foram o Soro Antibotrópico Líquido, o

Soro Antibotrópico-Laquético Líquido e o Soro Anticrotálico Líquido

disponibilizados pelo Ministério da Saúde. No Brasil, a produção do soro

antiofídico é padronizada e toda a produção de antiveneno dos três

laboratórios nacionais (IB, FED e IVB) é adquirida pelo Ministério da Saúde

para distribuição nacional gratuita.

A lista de randomização foi gerada por computador. Quando um

paciente era considerado condizente aos critérios de inclusão e dava seu

consentimento informado e esclarecido por meio de Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo IIIB) e do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido Especial para os menores de idade

(Anexo IIIC), ele era formalmente recrutado e alocado em um Protocolo de

Registro de Caso (PRC) (Anexo III) constituído de formulários, que se

iniciava com um Formulário de Entrevista (Anexo IIIA).

57

Após admissão, o PRC era preenchido com um único número de

identificação do paciente, sexo, área de ocorrência do acidente ofídico (rural

ou urbana), idade (em anos), etnia, educação (em anos), região anatômica

da picada e tempo entre a picada e a assistência médica (em horas). O

exame clínico se deu pela observação de manifestações locais e sistêmicas,

com o preenchimento do Formulário de Acompanhamento de Exame Clínico

(Anexo IIID) e encaminhamento para exames laboratoriais (Anexo IIIE).

Para o acidente botrópico, a caracterização laboratorial incluía as avaliações

de tempo de coagulação (TC), velocidade de hemossedimentação (VHS),

índice internacional normatizado (INR), hemoglobina, contagem de

leucócitos e plaquetas, níveis plasmáticos de fibrinogênio, creatinina, uréia,

desidrogenase láctica (DHL), aspartato aminotransferase (AST), alanino

aminotransferase (ALT) e creatinofosfoquinase (CPK) no plasma. Para

acidentes laquéticos e crotálicos, a caracterização laboratorial incluía TC,

INR e níveis plasmáticos de fibrinogênio, creatinina, uréia, e atividades de

AST, ALT e CPK no plasma.

Após a classificação do acidente em leve, moderado e grave (Anexo

IIIG), excluindo-se os acidentes graves, iniciava-se a soroterapia precedida

de randomização e pré-medicação. Vinte minutos após a pré-medicação

com hidrocortisona (500 mg) IV, cimetidina (300 mg) IV e dexclorfeniramina

(5 mg) VO (padronizado de acordo com o “guideline” local), a soroterapia

antiveneno era feita em todos os pacientes de ambos os grupos em uma

dose correspondente para acidente leve e moderado. Para informação

detalhada sobre a alocação de grupos e intervenções, verificar Tabela 3.

Antes da administração, cada ampola de SATL era reconstituída em 20 ml

de água destilada com posterior diluição em 100 ml de soro fisiológico. O

tempo de administração do soro antiofídico era de 30 a 45 minutos.

Paracetamol ou dipirona era administrado em caso de dor. O membro

acometido pela picada da serpente era elevado em posição confortável para

redução do edema, as bolhas eram aspiradas, os tecidos necrosados eram

debridados, os abscessos eram drenados, e a antibioticoterapia era usada

de acordo com a infecção.

58

4.4 SEGUIMENTO DOS PACIENTES

Após a soroterapia antiofídica, os pacientes permaneciam internados

durante 24 horas, no mínimo, para seguimento da evolução do caso. Os

mesmos testes laboratoriais referidos acima eram repetidos 4 horas (H4),

12 horas (H12) e 24 horas (H24) após o soro antiofídico. Os pacientes eram

solicitados a voltar ao hospital para avaliação com 7 dias (D7) e 15 dias

(D15) após a alta hospitalar. Nas consultas de seguimento, os exames

clínicos eram realizados e os exames laboratoriais acima mencionados

eram realizados para avaliar a evolução clínica dos acidentes ofídicos e a

ocorrência de reações adversas ao soro antiofídico. Se o paciente não

comparecesse na consulta de seguimento, o investigador planejava uma

consulta domiciliar para o dia seguinte. Pacientes que não compareciam à

consulta e nem eram encontrados na visita domiciliar eram considerados

como perda de seguimento.

4.5 DESFECHO DA SEGURANÇA

O desfecho de segurança primária foi definido como a presença de

sinais e sintomas de reações adversas precoces do soro antiofídico

representada por urticária, crise asmatiforme, edema de laringe e choque,

durante e após a infusão até 24 horas após o tratamento. Reações adversas

precoces foram tratadas com adrenalina subcutânea solução milesimal

(1:1000) 0,3 a 0,5 ml, e repetida após 10 minutos, se necessário. Após

remissão dos sinais e sintomas, a soroterapia antiofídica foi restabelecida.

O desfecho de segurança secundário foi definido como a presença de

sinais e sintomas de reações adversas tardias, como febre, urticária,

artralgia, adenomegalia, complicações neurológicas e renais, até o D15.

Após o D15, os pacientes eram avisados para retornarem para o hospital ou

fazerem contato por telefone com o médico do estudo, em caso de qualquer

sinal de complicações. Em caso de reações tardias, o tratamento consistia

de analgésicos, antihistamínicos e corticoterapia.

4.6 DESFECHO DA EFICÁCIA

59

Para os acidentes laquéticos e botrópicos, o desfecho de eficácia

primária foi definido como a recuperação de parâmetros de hemostasia aos

níveis normais dentro das primeiras 24 horas de seguimento. Para os

acidentes crotálicos, o desfecho de eficácia primária foi definido como a

supressão da coagulopatia e restabelecimento de creatinofosfoquinase

dentro das primeiras 24 horas de seguimento. O desfecho de eficácia

secundária foi definido como a supressão das manifestações neurológicas

e recuperação de outros parâmetros laboratoriais para níveis normais dentro

das primeiras 24 horas de seguimento como estimado em ambos os grupos.

Uma segunda dose equivalente a 4 ampolas de soro antiofídico foi

planejada para ser aplicada o sangue dos pacientes permanecesse

totalmente incoagulável 12 horas após a dose inicial, ou em caso de

recorrência da coagulopatia, novamente seguindo o guideline do Ministério

da Saúde (101). Os pacientes de acidentes laquéticos e crotálicos foram

recrutados em áreas remotas fora da cidade, sem resultados para algumas

análises laboratoriais usadas como desfechos secundários.

4.7 CEGAMENTO

Este foi um estudo aberto que se baseou exclusivamente em valores

laboratoriais para o estabelecimento de desfecho de eficácia primária.

Portanto, o cegamento do grupo do laboratório foi assegurado. A equipe de

laboratório não teve contato direto com os investigadores e nenhuma

informação relacionada à droga administrada ao paciente.

4.8 TESTE DE RECONSTITUIÇÃO

Antes da administração do soro antiofídico, a reconstituição do soro

liofilizado em 20 ml de água destilada estéril foi observada visualmente

quando os frascos do SATL foram levemente agitados de forma manual por

um minuto. A reconstituição bem sucedida foi considerada quando o soro

antiofídico liofilizado era dissolvido e se apresentava como uma solução

homogênea.

60

4.9 CONTROLE DE ESTABILIDADE E QUALIDADE

As amostras de SATL foram enviadas para o Instituto nacional de

Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), Fundação Oswaldo Cruz, Rio

de Janeiro, Brasil, para controle de qualidade e avaliação de estabilidade

(Anexo II). A concentração total de proteínas e proporcional de

imunoglobulina, toxicidade não específica, níveis de pirógenos,

parâmetros biológicos e concentração de fenóis foram avaliados usando

métodos padronizados (Anexo II). As potências antibotrópica, antilaquética

e anticrotálica (mg/ml) foram estimadas através do cálculo do volume de

SATL que neutraliza 1 mg de veneno em camundongo. A estabilidade

térmica do SATL foi determinada pela estimativa da potência do soro

estocado por 15 dias, 1 mês, 3 meses e 1 ano na temperatura de 560C,

comparada com uma linha de base de potência. Os métodos empregados

para estimar a potência do soro antiofídico (102) são apresentados no

arquivo S1 do artigo publicado. A turbidez e a presença de agregados

foram observadas pelo exame visual para o controle de qualidade sobre o

tempo em paralelo com a potência e antes da administração do soro

antiofídico.

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os pacientes foram distribuídos em dois grupos de acordo o tipo de

soro antiofídico recebido. As características de base epidemiológica,

laboratorial e clínica dos pacientes acidentados por Bothrops foram

comparadas pelo teste de Fisher ou Q-quadrado, usando 5% de nível de

significância. O teste de t de student foi usado para comparação de

médias. Para pacientes acidentados por Lachesis e Crotalus, somente

análise descritiva foi conduzida por causa do pequeno número de casos.

A análise da eficácia primária foi feita de todos os pacientes

randomicamente selecionados terminando o seguimento (por protocolo

populacional). O desfecho de eficácia primária para acidentes botrópicos

(ausência de coagulopatia em 48 horas), foi analisado usando curvas de

sobrevivência de Kaplan-Meier. O teste de Log-rank bicaudal foi feito sobre

61

o período de tempo usando o nível de significância de 5%. Todos os

outros desfechos de eficácia foram analisados com estatística

descritiva. As frequências de desfecho de segurança primária entre os

grupos de intervenção e controle foram testadas pelo teste de Fisher

ou teste do Q-quadrado, usando o intervalo de confiança de 95%,

conjugando todos os tipos de acidentes ofídicos. Onde os zeros

causaram problemas com computação de p-valor, 0.5 foi adicionado

para todas as células (103, 104). As análises estatísticas foram

realizadas usando o pacote estatístico STATA versão 13 (Stata Corp,

College Station, Estados Unidos).

4.11. ÉTICA

Pacientes elegíveis participavam de uma entrevista com o

investigador, que dava uma explanação detalhada do protocolo de

tratamento para o paciente de acordo com as informações contidas no

TCLE. O consentimento escrito através do TCLE (Anexos IIIB e IIIC)

era solicitado do paciente e/ou de seu parente/guardião para menores.

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

do Instituto de Biologia do Exército (IBEX), Rio de Janeiro, e do

Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (aprovação número 001-

03/2003) (Anexos IV e V).

5. RESULTADOS

Os resultados da presente tese são apresentados conforme a versão

final do manuscrito publicado na revista Plos Neglected Tropical

Diseases.

Safety and efficacy of a freeze-dried trivalent antivenom

for snakebites in the Brazilian Amazon: an open

randomized controlled phase IIb clinical trial

Efficacy and safety of freeze-dried trivalent antivenom

62

Iran Mendonça-da-Silva1,2,3, Antônio Magela Tavares2, Jacqueline

Sachett1,2, José Felipe Sardinha2, Lilian Zaparolli3, Maria Fátima Gomes

Santos4, Marcus Lacerda1,2,5, Wuelton Marcelo Monteiro1,2,*

1. Escola Superior de Saúde, Universidade do Estado do Amazonas,

Manaus, Amazonas, Brazil

2. Departamento de Ensino e Pesquisa, Fundação de Medicina Tropical

Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas, Brazil

3. Instituto de Biologia do Exército, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

4. Laboratório Químico e Farmacêutico do Exército, Rio de Janeiro, Rio

de Janeiro, Brazil

5. Instituto Leônidas & Maria Deane, Fundação Oswaldo Cruz, Manaus,

Amazonas, Brazil

* [email protected]

Abstract

Background

In tropical areas, a major concern regarding snakebites treatment

effectiveness relates to the failure in liquid antivenom (AV) distribution due

to the lack of an adequate cold chain in remote areas. To minimize this

problem, freeze-drying has been sugested to improve AV stability.

Methods and findings

This study compares the safety and efficacy of a freeze-dried trivalent

antivenom (FDTAV) and the standard liquid AV provided by the Brazilian

Ministry of Health (SLAV) to treat Bothrops, Lachesis and Crotalus

snakebites. This was a prospective, randomized, open, phase IIb trial,

63

carried out from June 2005 to May 2008 in the Brazilian Amazon. Primary

efficacy endpoints were the suppression of clinical manifestations, return of

hemostasis and renal function markers to normal ranges within the first 24

hours of follow-up. Primary safety endpoint was the presence of early

adverse reactions (EAR) in the first 24 hours after treatment. FDTAV

thermal stability was determined by estimating AV potency over one year at

56oC. Of the patients recruited, 65 and 51 were assigned to FDTAV and

SLAV groups, respectively. Only mild EARs were reported, and they were

not different between groups.There were no differences in fibrinogen

(p=0.911) and clotting time (p=0.982) recovery between FDTAV and SLAV

treated groups for Bothrops snakebites. For Lachesis and Crotalus

snakebites, coagulation parameters and creatine phosphokinase presented

normal values 24 hours after AV therapy for both antivenoms.

Conclusions/Significance

Since promising results were observed for efficacy, safety and thermal

stability, our results indicate that FDTAV is suitablefor a larger phase III trial.

Trial registration

ISRCTNregistry: ISRCTN12845255; DOI: 10.1186/ISRCTN12845255

(http://www.isrctn.com/ISRCTN12845255).

Author summary

Antivenoms (AV) are included in the WHO List of Essential Medicines, being

the only treatment available for snakebites envenomings. In Brazil, five

types of liquid snake AVs are distributed by the Ministry of Health for

national use free of charge to patients. In remote areas, lack of an adequate

cold chain impairs AV distribution to health facilities resulting in delay in

patient care and, ultimately, in higher complication and case fatality rate. To

minimize this problem, a freeze-drying process has been suggested to

improve the stability of AVs, but freeze-dried AVs efficacy and safety

64

evidence obtained from clinical trials is still verylimited. Freezedrying is a

process by which water is removed from a sample without the need to apply

heat. Benefits of lyophilization are: a) Samples are processed in aseptic

conditions; b) Process does not use heat, ensuring formulation stability; c)

Increases shelf life; d) Samples can be stored at room temperature for a

long time; and e) Reduces weight and volume of samples, which is ideal for

distribution. In this study, a freeze-dryed formulation is presented as a good

alternative for a more stable trivalent antivenom in regions of the Amazon

where high temperaturesare common and the cold chain is poor. Our results

suggest that such a product is adequate for a phase III trial.

Introduction

Snakebites are a serious public health problem in tropical countries, with

higher morbidity and case fatality rates in poor, underdeveloped, rural and

remote rainforest areas. At least 421,000 envenomings and 20,000 deaths

occur each year due to snakebites globally, but these figures may be as

high as 1,841,000 envenomings and 94,000 deaths [1]. Additionally,

400,000 amputations and other severe health consequences such as

infection, tetanus, scarring, contractures, and psychological sequelae have

been recorded [2]. In Brazil, from 2000 to 2015, a total of 416,109

snakebites were recorded by the Brazilian official surveillance system, with

26,000 cases on average per year. Snakebites incidence is higher in the

Brazilian Amazon states, with a rate of 55.4 cases/100,000 inhabitants in

2015 and, it is considered an occupational health problem of rural and

riverine populations [3]. However, the true burden of snakebites is probably

higher and difficult to estimate since only a few countries have a reliable

system for epidemiological surveillance of these events [4]. In the Brazilian

Amazon, the case fatality rate has been estimated to be 0.6% and

associated with older age and delayed medical assistance [5].

The Bothrops genus is responsible for 80-90% of snakebites in the

Brazilian Amazon [5,6,7]. In this region, Bothrops envenoming results in

pain, swelling, regional lymphadenopathy, ecchymosis, blistering, and

65

necrosis as the most common local manifestations [6,8,9]. Systemic

bleeding and acute renal failure are common systemic complications after

Bothrops envenomings [6,9]. Clinical manifestations at the Bothrops and

Lachesisbite sites are similar, with an intense tissue damage evidenced by

pain, edema, blisters, bleeding, and ecchymosis [10]. Bothrops and

Lachesis venoms are characterized by three main pathophysiological

activities: coagulant, hemorrhagic, and proteolytic or acute inflammatory

effects [11-14]. Signs and symptoms of vagal stimulation, such as dizziness,

blurred vision, diarrhea, abdominal cramps, sinus bradycardia, severe

hypotension and shock, may occur after Lachesis bites [10,15].Crotalus

venom has neurotoxic, myotoxic and coagulant activities and its systemic

manifestations include drowsiness, ptosis, ophthalmoplegia, sagging face

muscles, blurred vision, diplopia, myalgia, arthralgia and myoglobinuria,

with mild clinical manifestations at the bite site generally [12].

Currently, antivenom (AV) immunoglobulins, included in the WHO List

of Essential Medicines, are the only treatment available for snakebites

envenomings [16]. In Brazil, the Ministry of Health implemented the National

Program for Snakebites Control in 1986 [17]. Since then, AV production has

been carried out by national laboratories and distributed by the Ministry of

Health for national use free of charge to patients. Five types of snake liquid

AVs are currently available: Bothrops AV, Crotalus AV, Bothrops-Crotalus

AV, Bothrops-Lachesis AV, and Micrurus AV [4]. In the Amazon and other

tropical areas, a major concern regarding snakebites treatment

effectiveness relates to the impossibility of wide and timely liquid AV

distribution. The lack of an adequate cold chain impairs AV distribution to

health facilities available in remote areas and may result in delayed patient

care and, ultimately, in higher complications and case fatality rates [5]. In

additon, inadequate storage and transportation may result in loss of material

[4]. To minimize this problem, it has been suggested freeze-drying to

improve the stability of AV immunoglobulins. This additional step and

addition of different stabilizers lead to AVs with a higher stability compared

to liquid formulations, especially in tropical regions where high temperatures

could affect the activity of immunoglobulins [18-20]. Physicochemical

66

characterization studies of commercial freeze-dried AVs from India, Mexico,

Thailand and Costa Rica showing good quality standards are available in

the literature [18,20]. However, knowledge about freeze-dried AVs efficacy

and safety obtained from clinical trials is still very limited.

This study was performed to compare the safety and efficacy of a

freeze-dried trivalent antivenom with those of the available AV provided by

the Brazilian Ministry of Health (MoH), to treat Bothrops, Lachesis and

Crotalus snakebites in the Brazilian Amazon.

Material and Methods

Study design and participants

This was a prospective, randomized, open, phase IIb trial, carried out

from June 2005 to May 2008. Bothrops snakebites from the Tropical

Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus,

Amazonas state, Brazil were included. Lachesis snakebites included were

from the local hospitals at Borba (Amazonas state, Brazil), Normandia and

Pacaraima (Roraima state, Brazil). Crotalus snakebites were included from

the local hospitals of Boa Vista and Cantá (Roraima state, Brazil). Eligible

patients were male and female subjects aged between 12 and 70 years old.

Bothrops, Lachesis and Crotalus snakebites were diagnosed using clinical,

epidemiological and laboratorial evaluations. Exclusion criteria were

pregnancy or breastfeeding, previous hematological disorders, known

immunodeficiencies (HIV, malignancies, chemotherapy or other

immunosuppressive treatments), previous treatment with snake AVs and

history of any moderate/severe allergic reactions. Moreover, patients

presenting with severe snake envenomings, defined for Bothrops and

Lachesis as life-threatening snakebites with severe bleeding, hypotension,

shock and acute renal failure, and for Crotalus as intense rhabdomyolisis

and severe acute renal failure [21], were not included.

67

Patients’ selection, interventions and baseline clinical

characterization

After snakebite envenoming diagnosis, patients that fulfilled all inclusion

criteria were randomly assigned with allocation ratio 1:1 to one of the

following groups:

i) Group A: Freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV), produced under

GMP conditions by Butantan Institute (São Paulo, Brazil) in partnership with

Instituto de Biologia do Exército (Rio de Janeiro, Brazil). In this study,

freeze-drying was performed at the Butantan Institute. Briefly, 20 mL vials

were filled with 5 mL of each formulation and loaded on a freeze-dryer

Benchmark 1100 (Virtis, USA). The samples were frozen at -40oC and

annealed at -10oC for 4 h. The primary drying was conducted at -20oC for

64 h, and the secondary drying at 30oC for 4 h and 200 mTorr.

ii) Group B: available Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-

Crotalus AVs provided by the MoH (SLAV). In Brazil, snake AV production

is standardized and all the AV production from the three national

laboratories (Butantan Institute, Ezequiel Dias Foundation and Vital Brazil

Institute) is acquired by the MoH for national distribution free of charge.

A randomization list was computer-generated. When a patient was

considered to meet the inclusion criteria and had given her/his informed

consent, he/she was formally recruited and a unique ID number was

allocated in the Case Report Form (CRF). After admission, a CRF was filled

with the patient's unique ID number, gender, area of occurrence of the

snakebite (rural or urban), age (in years), ethnicity, education (in years),

anatomical region of the bite, and time from bite to medical assistance (in

hours). Clinical examination included the observation of local and systemic

manifestations. For Bothrops snakebites, laboratorial characterization

included clotting time, erythrocyte sedimentation rate,International

Normalized Ratio (INR), hemoglobin, leucocyte and platelet counts and

plasma levels of fibrinogen, creatinine, urea, lactate dehydrogenase,

68

aspartate transaminase, alanine transaminase and creatine phosphokinase

in the plasma. For Lachesis and Crotalus snakebites, laboratorial

characterization included clotting time, INR and plasma levels of fibrinogen,

creatinine, urea, and activities of aspartate transaminase, alanine

transaminase and creatine phosphokinase in the plasma.

Twenty minutes after pre-medication with IV hydrocortisone (500 mg),

IV cimetidine (300 mg) and oral dexchlorpheniramine (5 mg) (standardized

according to local guidelines), AV therapy was given to all patients from both

groups in a dosage corresponding to mild or moderate envenomation. For

detailed information about the allocation groups and interventions, see

Table 1. Before administration, each FDTAV vial was reconstituted in 20 mL

of sterile saline solution (0.9%) with a further dilution in 100 mL before

administration. Each SLAV vial was diluted in 100 mL of saline solution

0.9%. Antivenom administration time ranged from 30 to 45 minutes.

Intravenous paracetamol was given on demand for pain. The bitten limb

was nursed in the most comfortable position, blisters were aspirated,

necrotic tissue was surgically debrided, abscesses were drained, and

antibiotic treatment was given accordingly.

Patients’ follow-up

After AV therapy, patients were admitted to the hospital ward for close

monitoring during 24 hours. The same laboratorial tests referred above

were repeated 4 hours (H4), 12 hours (H12) and 24 hours (H24) after AV

therapy. Patients were asked to attend the hospital seven (D7) and fifteen

days (D15) after discharge. At follow-up visits, clinical examination was

carried out and the above mentioned laboratorial tests were performed in

order to investigate clinical evolution of the envenomations and occurrence

of late adverse reactions to AV therapy. If the patient did not present for the

follow-up visits, the investigator planned a domiciliary visit the following day.

69

Patients who did not present to hospital visits and were not found at

domiciliary visits were considered lost to follow-up.

Safety endpoints

Primary safety outcome was defined as the presence of signs and

symptoms of early adverse reactions of AV therapy represented by urticaria,

asthma-like crisis, laryngeal edema and shock, shortly after infusionuntil the

first 24 hours after treatment. Early reactions were treated with

intramuscular or subcutaneous adrenaline (1:1000, 0.3-0.5 mL), and

repeated after 10 minutes if needed. After the symptoms ofreaction had

subsided, AV therapy was restarted.

Secondary safety outcome was defined as the presence of late adverse

events, namely fever, urticarial, arthralgia, adenomegaly, neurological and

renal complications, until D15. After D15, patients were advised to return to

the hospital or to contact the study physician by phone in case of any signs

of complications. In case of late reactions, treatment consisted of

analgesics, anti-histamines and corticotherapy.

Efficacy endpoints

For Bothrops and Lachesis snakebites, primary efficacy outcome was

defined as the recovery of hemostasis parameters to normal ranges within

the first 24 hours of follow-up. For Crotalus snakebites, primary efficacy

outcome was defined as the suppression of coagulopathy and improvement

of creatine phosphokinase activity within the first 24 hours of follow-up.

Secondarily, suppression of neurological manifestations and recovery of

other laboratorial parameters to normal ranges within the first 24 hours of

follow-up was estimated in both groups. A second dose of four vials of AV

was planned to be given if the patient’s blood remained totally incoagulable

12 hours after the initial dose, or in case of coagulopathy recurrence, again

following the Brazilian Ministry of Health’sguidelines [21]. Lachesis and

70

Crotalus patients were recruited in remote countryside areas, unfortunately

with no availability to some laboratorial analysis used as secondary

endpoints.

Blinding

This was an open label trial that exclusively relied on laboratorial values

for theassessment of the primary efficacy outcome, therefore blinding of

laboratorystaff was ensured. The laboratory personnel performing the

analyses had nodirect contact with the investigators and no information

regarding the drugadministered to the patient.

Reconstitution test

Before administration, AV dissolution in 20 mL of sterile saline solution

(0.9%) was observed visually as the FDTAV vials were gently agitated by

hand for one minute. Successful reconstitution was considered when the

dry AV was dissolved into a homogeneous solution.

Quality control and stability

Samples of the FDTAV were sent to the Instituto Nacional de Controle de

Qualidade em Saúde (INCQS), Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro,

Brazil, for quality control and stability evaluation. Total protein concentration

and proportion of immunoglobulins, nonspecific toxicity, pyrogen levels,

microbiological parameters and phenol concentrations were evaluated using

standard methods. Anti-Bothrops, Lachesis and Crotaluspotencies (mg/mL)

were estimated by calculating the volume of FDTAV that neutralizes 1 mg of

venom in mice. The FDTAV thermal stability was determined by estimating

AV potency kept 15 days, one month, three months and one year at 56oC,

compared to baseline potency. Methods employed for estimating AV potency

[22] are presented in S1 File. Turbidity and presence of aggregates were

71

observed by visual examination for quality control over time in parallel with

potency and before AV administration.

Statistical methods

Patients were distributed in two groups according the type of AV received.

Baseline epidemiological, laboratorial and clinical characteristics of patients

bitten by Bothrops were compared by Fisher test or chi-square test, using a

5% significance level. Student's t-test was used for comparison of means.

For Lachesis and Crotalus patients, only a descriptive analysis was

conducted because of the small number of cases. The primary efficacy

analysis was done on all randomly selected patients finishing the follow-up

(per protocol population). The primary efficacy endpoint for Bothrops bites,

coagulopathy-free efficacy at 48 hours, was analysed using Kaplan-Meier

estimates. A two-sided log-rank test was done over the time period using a

5% significance level. All other efficacy endpointswere analyzed with

descriptive statistics.Primary safety endpoint frequencies between

intervention and control groups were tested by Fisher test or chi-square test,

using a 5% significance level, pooling all types of snakebites. Where zeros

caused problems with computation of p values, 0.5 was added to all cells

[23,24]. Statistical analyses were performed using the STATA statistical

package version 13 (Stata Corp. 2013).

Ethics

Eligible patients were asked to meet the study investigator, who gave

detailed explanation of the study protocol according to the patient information

sheet. Written consent was requested from the patient or from their

parents/guardians for minors. The study protocol was approved by the

Research Ethics Committee of the Instituto de Biologia do Exército (IBEx),

Rio de Janeiro, Brazil, and by the National Ethical Committee (approval

number 001-03/2003).

Results

72

Patients inclusion

The assessment and enrollment of ptients in this study is shown in a flow

diagram (Fig 1). Briefly, out of 244 patients initially screened, 116 were

eligible for inclusion: 102 cases of Bothrops, 6 cases of Lachesis and 8 cases

of Crotalus snakebites. Of the patients recruited, 65 were assigned to Group

A (FDTAV) (58 Bothrops, three Lachesis and four Crotalus bites) and 51 to

the Group B (SLAV) (44 Bothrops, three Lachesis and four Crotalus bites).

No patient was lost to follow-up.

Baseline characterization

Bothrops snakebites were more frequent in males (88.2%), and mostly

occurred in rural areas (68.6%). The most affected age group was the 16-30

years old (43.1%) followed by the 31-60 years old (42.2%). Admixed ethnicity

was recorded for 95.1% of the included patients. A total of 50.0% of the

patients presented 1-4 years of education. The most affected anatomical

sites were the lower limbs (93.1%). Time elapsed from bite to medical

assistance was higher than 6 hours in 34.3% of the cases. Lachesis and

Crotalus bites showed the same general epidemiological characteristics

(Table 2). Baseline laboratorial characteristics were similar in both groups

(Table 3 and S2 File).The most frequent manifestations observed at

admission in Bothrops snakebites were pain (96.1%), edema (96.1%) and

local bleeding (30.4%). The most frequent systemic manifestations were

nausea (11.8%), acute renal failure (6.9%) and bleeding (6.9%). Vagal

manifestations, such as vomiting, bradycardia, hypotension, abdominal pain

and blurred vision, were observed in Lachesis bites. Myalgia and neurological

manifestations, namely palpebral ptosis, diplopia, ophtalmoplegia and

dizziness, were recorded for Crotalus bite cases (Table 4). There were no

deaths or permanent sequelae in the study.

73

In general, epidemiological, clinical and laboratorial characteristics were

similarly distributed in the two study groups within Bothrops, Lachesis and

Crotalus bitten groups.

Efficacy endpoints analysis

There were no differences between FDTAV and MoH AV treated groups

in the time until patient admission for fibrinogen (p=0.911) and clotting time

(p=0.982), both reaching normal values over follow-up in patients bitten by

Bothrops snakes (Fig 2). Clotting time, fibrinogen and INR presented normal

values 24 hours after AV therapy, for both antivenoms (Fig 3). Moreover,

creatinine, liver transaminases, creatine phosphokinase and the other

laboratorial markers were normal 24 hours after admission in FDTAV and

SLAV treated groups.

For Lachesis snakebites, fibrinogen, clotting time and INR presented

normal values 24 hours after AV therapy for both antivenoms (S3 File).

Regarding Crotalus snakebites, fibrinogen, clotting time, INR, and

creatine phosphokinase presented normal values 24 hours after AV therapy

in FDTAV and SLAV treated groups (S4 File). Signs and symptoms such as

blurred vision, palpebral ptosis, diplopia and ophtalmoplegia disappeared

within the first 24 hours of follow-up. The other laboratorial parameters also

returned to normal ranges within the first 24 hours of follow-up for both

groups. Renal failure was not seen in this group of patients.

No patient required a second AV dose afterthe initial dose because of

persistent coagulopathy and no local or coagulopathy recurrence was

recorded among the patients. All clinical, both locally and systemically, and

laboratorial evaluations remained normal at D7 and D15 in both treatment

groups.

Safety endpoint analysis

74

A total of 23 patients presented early adverse events after AV therapy

(19.8%). The most common were urticaria (13.8%), pruritus (11.2%), facial

flushing (3.4%) and vomiting (3.4%). There was no significant difference in

the frequency of early adverse events between patients treated with FDTAV

and SLAV (Table 5). All adverse events were mild and all signs and

symptoms of early adverse reactions ceased within 48 hours from

management. Late adverse events were not observed at D7 and D15 clinical

evaluations. Patients were advised to report these after D15, however no

patient returned to the hospital or contacted the study physician by phone

complaining about possible late adverse events after that day.

Quality control and stability results

FDTAV physicochemical analysis showed a total protein concentration

of 4.63g%, with 80% of F(ab’)2 immunoglobulins. FDTAV was sterile, atoxic

and apyrogenic. Phenol concentration was <3,500 ppm.Antivenom potency

for neutralizing Bothrops, Lachesis and Crotalus activities showed no

significant decrease compared to baseline potency over one year of

thermostability evaluations at 56oC (Fig 4). No visual alterations in turbidity

and no aggregates were observed over time and before AV administration.

Discussion

Antivenoms are the only specific treatment for treating most of the

snakebite envenomings effects, and play a crucial role in minimizing mortality

and morbidity. However, to be part of the primary health care package where

snakebites occur, there is an urgent need to ensure availability of safe,

effective and affordable AVs, namely in developing countries [16]. Moreover,

innovation in the logistics of AV distribution is also a priority. In Brazil, for

instance, current AVs require conservation in adequate facilities (2° to 8°C),

which are not always available in remote settings [4]. Although freeze-dried

formulations maybecome a good alternative for the production of more stable

AVs in regions of theworldwhere high temperaturesare common and the cold

75

chain is poor, such in the Brazilian Amazon, there is a verylimited body of

published literature on stability, clinical efficacy and safety for freeze-dried

AVs. A main concern is the conservation of the freeze-dried AV

pharmacokinetic propertiesand further neutralizing potency of the antibodies

submitted to lyophilization [25]. Although positive results from thermal

characterization of the effect of freeze-drying on equine antibodies and

theeffectiveness of stabilizers in freeze-dried AVs have been reported

[18,19], to the best of our knowledge this is the first clinical trial aiming to

compare the safety and efficacy of a freeze-dried AV with a liquid formulation.

This study did not include data on the possible increase in the cost of AV

production due to the freeze-drying process. Future cost studies to address

thiswill be essential.

Efficacy analysis

Our results showed that in both groups neutralization of venom-induced

bleeding and coagulopathy invariably ceased, and blood coagulability was

restoredover 24 hours of follow-up of all patients. Since hemostasis disorders

have been related to severity and deaths in viperid envenomations,

restoration of blood coagulability has been proposed as a relevant target

endpoint in snakebite clinical trials [26,27]. Actually, systemic manifestations

of viperid snakebites are characterized by bleeding, coagulopathy associated

with defibrinogenation and incoagulability, with the potential of evolving to

hypovolemia and further potentially life-threatening conditions such as

hypotension, cardiovascular shock and acute kidney injury in severe cases

[5, 28-30]. Our results indicate that an improvement in coagulation status

might be expected within 6-12 hours in most patients and within 24 hours in

nearly all patients receiving a single dose of AV [6,31-33]. Blood coagulability

should be monitored after the initial AV dose and further doses of AV should

be administered, if necessary, until coagulability is restored [31,33,34].

Abnormal renal function is also fairly common in viperid envenomings

[5,35,36]. Both study groups presented serum creatinine concentrations that

restored to normal values within the first 24 hours of follow-up of Bothrops

snakebites. However, some patients admitted with renal failure may evolve

76

without improvement of kidney injury even after AV administration, as injury

was triggered before AV administration [35, 36]. This needs to be taken in

consideration in the interpretation of renal failure as an endpoint in Bothrops

bites.

Crotalus venom may cause systemic myotoxicity, increasing serum levels

of creatine kinase [12]. In addition, the levels of muscle enzymes increase

even after proper AV therapy [12, 37, 38]. Likewise, even patients who

receive proper amounts of antivenom can progress with renal damage

because the mechanisms of injury are triggered after snakebite and before

the antivenom administration. In this study, however, no patient presented

renal failure at admission and normal creatine kinase levels were seen at 24

hours of follow-up of Crotalus snakebites. All patients recovered from

coagulopathy within 24 hours after therapy with FDTAV or SLAV. Although

some neurological manifestations observed in Crotalus envenomation do not

usually improve rapidly after AV administration [12], in this trial signs and

symptoms such as blurred vision, palpebral ptosis, diplopia and

ophtalmoplegia were suppressed within the first 24 hours of follow-up.

In this study, a second dose of AV was not necessary, since no patient

presented the blood totally incoagulable 12 hours after the initial dose or

coagulopathy recurrences. Indeed, persistent or recurrent venom

antigenemia and even recurrent coagulopathy may be present within 12-48

hours in severe envenoming [39, 40], but severe cases were not included in

this trial. Moreover, differences in the efficacy of the available antivenom also

explain dissimilar rates of resolution of venom-induced coagulopathy, as

observed using AVs from different Latin American countries [41-44].

Furthermore, venom composition is known to vary significantly among

snakes of different species further reflecting in AV efficacy [14, 45]. Data

concerning Lachesis and Crotalus species have limitations in terms of

efficacy because of the small number due to the rarity of these cases in the

Amazon.

Safety analysis

77

Although the literature suggests that the amount of heterologous proteins

is related to the frequency and intensity of adverse reactions [46], we did not

observe a significant increase in the incidence of adverse events in FDTAV

compared to SLAV. Although both AVs were manufactured from the same

pool of hyperimmune plasma, one concern of this study is the possible

formation of insoluble aggregates during the freeze-drying process with

further incomplete reconstitution, which has been associated with the

development of adverse events during administration [47]. One hypothesis

for the negligible insoluble aggregates formation in the FDTAV is the use of

sucrosein the stabilization of the lyophilized AV.The protective effect of

polyols like sorbitol andmannitol in the development of turbidity in liquid AVs

has already been reported [48-50]. More recently, the use of sucrosein the

stabilization of liquid or freeze-dried AVs has been described as a better

stabilizer than mannitol and sorbitol in the FDTAV formulation [18,19].

Early AV reactions were mild and were promptly reversed by treatment

with adrenaline and antihistamines.The incidence of early adverse reactions,

all mild and not life-threatening, was similar to two other trials from Brazil and

Colombia [6,39]. However, generally this frequency was lower than the

results from other trials carried out in South America with Bothrops bitten

patients, which reported incidences ranging from 25 to 87% [31-33, 40, 43,

51]. Although antihistamines appear to be of no obvious benefit in preventing

acute reactions from antivenoms [52-54], the pre-sorotherapy regimen used

in this study (IV hydrocortisone, IV cimetidine and oral dexchlorpheniramine)

may have also contributed to the low incidence of early adverse reactions.

Late adverse events were not observed in this trial, in agreement with

previous studies showing their absence [8, 31, 33, 40, 43, 51] or low

incidence [55]. Although no patient returned to the hospital or contacted the

study physician complaining about possible late adverse events after D15,

patients treated with snake AVs may present adverse reactions after this day.

On-site follow-up completion on this day may represent a limitation of this

study that may underestimate the frequency of reactions. A concern for the

use of AVs formulated with sucrose has been the possibility of complicating

or producing some renal damage [56], but renal function was normal for all

78

patients after 24 hours of follow-up, indicating that the dosage employed was

safe.

Reconstitution test

Previous studies reported prolonged reconstitution times of 30 and 90

minutes for some lyophilized AVs [57,58], delaying the time of AV

administration, wich is a factor related to poor prognosis of snakebites

envenomation [5].In this study, however, a complete dissolution was

observed visually as the FDTAV vials were gently agitated by hand for one

minute, in agreement with previous studies where other freeze-dried proteins

showed short reconstitution times (lower than 5 minutes) [18,59,60],

suggesting maintenance of the stability and neutralizing activity [60,61].

Stability results

Successful freeze-drying of AVsalready used routinely in some

continents (despite the lack of published clinical trials) requires the

conservation of the physicochemical stability and neutralizing potency of the

antibodies over time at room temperature [18]. In this study, AV potency for

neutralizing Bothrops, Lachesis and Crotalus venom activities showed no

significant decrease comparing to baseline over one year of thermostability

evaluations at 56oC. Osmolytes such as sucrose or sorbitol are capable of

stabilizing antibodies at high temperatures with no significant perturbation in

their secondary structure or in their affinity to snake venoms [48,49]. Liquid

AVs with sorbitol prevent the appearance of turbidity after one year storage

at 37oC, but show a partial loss in neutralizing potency in these conditions

[50]. When tested, anti-α-cobratoxin single domain antibodies added with

disulfide bonds at 1 mg/mL at a range of elevated temperatures for an hour

retainednearly 100% of their initial binding activity [62].

Final remarks

In this study, FDTAV and SLAVs presented the same efficacy based

on clinically relevant outcomes in Bothrops, Lachesis and Crotalus bites.

79

Furthermore, there was no significant difference in the incidence of early

adverse reactions between patients treated with FDTAV and SLAVs. Only

mild early adverse reactions were reported. This freeze-dryed formulation

may become a good alternative for the production of more stable AVs in

regions of the Amazon where high temperatures are common and the cold

chain is poor. Our results indicate such a product should be attainable for a

phase III trial.

Acknowledgements

We acknowledge all those individuals from the Army Institute of Biology

and Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado, who provided

help during the research. We acknowledge the Butantan Institute staff

involved in the freezedried trivalent antivenom production, as well as the staff

from the hospitals at Borba, Normandia, Pacaraima, Boa Vista and Cantá

municipalities for the help during the research.

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Figures

Fig 1. Flow chart of inclusion in the clinical trial.

89

Fig 2. Survival analysis of the primary efficacy endpoint.Time until fibrinogen

and clotting time reaching normal values over follow-up of patients bitten by

Bothrops snakes presented no significant difference between freeze-dried

trivalent antivenom (FDTAV) and Ministry of Health standard liquid antivenoms

(SLAVs) treated groups.

90

Fig 3. Primary efficacy endpoint analysis in Bothrops snakebites. Clotting time,

fibrinogen and INR levels 24 hours after AV therapy infreeze-dried trivalent

antivenom (FDTAV) and Ministry of Health standard liquid antivenoms (SLAVs)

treated groups.

91

Fig 4. Thermostability evaluations of the freeze-dried trivalent antivenom

(FDTAV) at 56oC over one year. Antivenom potency for neutralizing Bothrops,

Lachesis and Crotalus activities showed no significant decrease compared to

baseline over one year of thermostability evaluations at 56oC.

92

Table 1. Description of the study allocation groups.

Study group Intervention Description of the interventional product Venoms used for production Dosage

Group A Freeze-dried trivalent antivenom (AV) (FDTAV)

Each vial of FDTAV contains heterologous horse F(ab’)2, neutralizing at least 100 mg, 60 mg and 30 mg of the reference venoms of Bothrops jararaca, Lachesis muta and Crotalus durissus terrificus, respectively, in mice, sucrose (1 g), NaCl (0.17 g) and phenol (35 mg maximum). Each vial is accompanied by an ampoule containing 20 mL of sterile saline solution (0.9%)

Bothrops genus (B. jararaca 50.0%, B. alternatus 12.5%, B. jararacuçu 12.5%, B. moojeni 12.5% and B. neuweidi 12.5%), Lachesis genus (L. muta 100.0%), Crotalus genus (C. durissus terrificus 50.0% and C. d. collilineatus 50.0%)

Bothrops bites: 2 vials to mild cases and 4 vials to moderate cases Lachesis bites: 5 vials to non-severe cases Crotalus bites: 2,5 vials to mild cases and 5 vials to moderate cases

Group B [1]

Bothrops bites Bothrops AV provided by the MoH (SLAV)

Each vial contains heterologous horse F(ab’)2, neutralizing at least 50 mg of the reference venom of Bothrops jararaca in mice, phenol (35 mg maximum) and physiological solution 0.85% q.s. 10 mL

Bothrops jararaca (50.0%), B. alternatus (12.5%), B. jararacuçu (12.5%), B. moojeni (12.5%) and B. neuweidi (12.5%)

4 vials to mild cases and 8 vials to moderate cases

Lachesis bites Bothrops-Lachesis AV provided by the MoH (BLMoHA)

Each vial contains heterologous horse F(ab’)2, neutralizing at least 50 mg and 30 mg of the reference venoms of Bothrops jararaca and Lachesis muta, respectively, in mice, phenol (35 mg maximum) and physiological solution 0.85% q.s. 10 mL

Bothrops genus (B. jararaca 50.0%, B. alternatus 12.5%, B. jararacuçu 12.5%, B. moojeni 12.5% and B. neuweidi 12.5%), Lachesis genus (L. muta 100.0%)

10 vials to non-severe cases

Crotalus bites Bothrops-Crotalus AV provided by the MoH (BCMoHA)

Each vial contains heterologous horse F(ab’)2, neutralizing at least 50 mg and 15 mg of the reference venoms of Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus, respectively, in mice, phenol (35 mg maximum) and physiological solution 0.85% q.s. 10 mL

Bothrops genus (B. jararaca 50.0%, B. alternatus 12.5%, B. jararacuçu 12.5%, B. moojeni 12.5% and B. neuweidi 12.5%), Crotalus genus (C. durissus terrificus 50.0% and C. d. collilineatus 50.0%)

5 vials to mild cases and 10 vials to moderate cases

[1] Brazilian Ministry of Health (2001). Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília: Brazilian Ministry of Health. 120 p.

93

Table 2. Epidemiological characteristics of the patients and comparison between experimental groups.

Variable Bothrops bites (number, %) Lachesis bites (number, %) Crotalus bites (number, %)

Total Group A Group B p Total Group A Group B Total Group A Group B

Sex Male 90 (88.2) 53 (91.4) 37 (84.0) 0.258 5 (83.3) 3 (100.0) 2 (66.7) 7 (87.5) 3 (75.0) 4 (100.0) Female 12 (11.8) 5 (8.6) 7 (16.0) 1 (16.7) 0 (0.0) 1 (33.3) 1 (12.5) 1 (25.0) 0 (0.0) Area of occurrence Rural 70 (68.6) 42 (72.4) 28 (63.6) 0.344 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 4 (50.0) 3 (75.0) 1 (25.0) Urban/Periurban 32 (31.4) 16 (27.6) 16 (36.4) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (50.0) 1 (25.0) 3 (75.0) Age group (in years) 0-15 12 (11.8) 4 (6.9) 8 (18.2) 1 2 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 16-30 44 (43.1) 24 (41.4) 20 (45.4) 0.193 3 (50.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 5 (62.5) 3 (75.0) 2 (50.0) 31-60 43 (42.2) 28 (48.3) 15 (34.1) 0.051 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (25.0) 0 (0.0) 2 (50.0) ≥61 3 (2.9) 2 (3.4) 1 (2.3) 0.292 1 (16.7) 1 (33.3) 0 (0.0) 1 (12.5) 1 (25.0) 0 (0.0) Ethnicity Admixed 97 (95.1) 53 (91.4) 43 (97.7) 0.210 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) Others 5 (4.9) 5 (8.6) 1 (2.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Education (in years) Illiterate 12 (12.8) 7 (13.5) 5 (11.9) 1 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1-4 47 (50.0) 28 (53.8) 19 (45.2) 0.938 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 7 (87.5) 3 (75.0) 4 (100.0) 5-8 13 (13.8) 6 (11.5) 7 (16.7) 0.543 4 (66.7) 2 (66.7) 2 (66.7) 1 (12.5) 1 (25.0) 0 (0.0) ≥8 22 (23.4) 11 (21.2) 11 (26.2) 0.642 2 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Anatomical region of the bite Upper limbs 7 (6.9) 3 (5.2) 4 (9.1) 0.438 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Lower limbs 95 (93.1) 55 (94.8) 40 (90.9) 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) Time from bite to medical assistance (in hours)

≤1 8 (11.4) 3 (6.8) 5 (19.2) 1 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

94

1-6 38 (54.3) 23 (52.3) 15 (57.7) 0.268 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) >6 24 (34.3) 18 (18.2) 6 (19.2) 0.078 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Legend: Group A is the freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV); Group B is available Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-Crotalus AVs provided by the MoH

(MoHA).

Table 3. Baseline laboratorial features of the included patients and comparison between experimental groups.

Variable Bothrops bites (number, %) Lachesis bites (number, %) Crotalus bites (number, %) Total Group A Group B p Total Group A Group B Total Group A Group B

Clotting time Normal (0-10 min) 36 (35.3) 17 (29.3) 19 (43.2) 0.146 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (37.5) 2 (50.0) 1 (25.0) Abnormal (>10 min) 66 (64.7) 41 (70.7) 25 (56.8) 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 5 (62.5) 2 (50.0) 3 (75.0) Urea Normal (15-40 mg/dL) 56 (54.9) 29 (50.0) 27 (61.4) 0.253 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 5 (62.5) 2 (50.0) 3 (75.0) High (>40 mg/dL) 46 (45.1) 29 (50.0) 17 (38.6) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (37.5) 2 (50.0) 1 (25.0) Creatinine Normal (0.5-1.2 mg/dL) 95 (93.1) 54 (91.4) 41 (95.5) 0.682 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) High (>1.2 mg/dL) 7 (6.9) 5 (8.6) 2 (4.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) K+ Normal (3.6-5.2 mmol/L) 83 (81.4) 48 (82.8) 35 (79.6) 0.700 …/* …/* …/* …/* …/* …/* Low (<3.6 mmol/L) 19 (18.6) 10 (17.2) 9 (20.4) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Na2+ Normal (135-145 mmol/L) 81 (79.4) 45 (77.6) 36 (81.8) 0.609 …/* …/* …/* …/* …/* …/* High (>145 mmol/L) 21 (20.6) 13 (22.4) 8 (18.2) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Lactate dehydrogenase Normal (211-423 mg/dL) 3 (2.9) 2 (3.4) 1 (2.3) 0.728 …/* …/* …/* …/* …/* …/* High (>423 mg/dL) 99 (97.1) 56 (96.6) 43 (97.7) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Leucocytes

95

Normal (4,000-10,000 mm3) 48 (47.0) 13 (22.4) 35 (79.5) <0.001 …/* …/* …/* …/* …/* …/* High (>10,000 mm3) 54 (53.0) 45 (77.6) 9 (20.5) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Hemoglobin Normal (female: 12-16 g/dL; male: 13-18 g/dL)

43 (42.2) 26 (44.8) 17 (38.6) 0.511 …/* …/* …/* …/* …/* …/*

Low (female: <12 g/dL; male: <13 g/dL) 59 (57.8) 32 (55.2) 27 (61.4) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Aspartate transaminase Normal (2-38 mg/dL) 53 (52.0) 25 (43.1) 27 (61.4) 0.073 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 6 (75.0) 3 (75.0) 3 (75.0) High (>38 mg/dL) 49 (48.0) 33 (56.9) 17 (39.6) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (25.0) 1 (25.0) 1 (25.0) Alanine transaminase Normal (2-44 mg/dL) 56 (54.9) 29 (50.0) 27 (61.4) 0.253 …/* …/* …/* …/* …/* …/* High (>44 mg/dL) 46 (45.1) 29 (50.0) 17 (38.6) …/* …/* …/* …/* …/* …/* Creatine phosphokinase Normal (24-190 U/L) 49 (48.0) 28 (48.3) 21 (47.7) 0.956 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 5 (62.5) 2 (50.0) 3 (75.0) High (>190 U/L) 53 (52.0) 30 (51.7) 23 (52.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (37.5) 2 (50.0) 1 (25.0) Fibrinogen Normal (150-370 mg/dL) 25 (24.5) 14 (24.1) 11 (25.0) 0.920 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (50.0) 3 (75.0) 1 (25.0) Low (<150 mg/dL) 77 (75.5) 44 (75.9) 33 (75.0) 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 4 (50.0) 1 (25.0) 3 (75.0) Platelets Normal (150.000-450.000/mm3) 85 (83.3) 49 (84.5) 36 (81.8) 0.721 …/* …/* …/* …/* …/* …/* Low (<150.000 mm3) 17 (16.7) 9 (15.5) 8 (18.2) …/* …/* …/* …/* …/* …/* International Normalized Ratio Normal (1) 35 (34.3) 22 (37.9) 13 (29.5) 0.377 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (50.0) 3 (75.0) 1 (25.0) High (>1) 67 (65.7) 36 (62.1) 31 (70.5) 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 4 (50.0) 1 (25.0) 3 (75.0) Erythrocyte sedimentation rate Normal (≤6 mm in the first hour) 2 (2.0) 0 (0.0) 2 (4.5) 0.109 …/* …/* …/* …/* …/* …/* Abnormal (>6 mm in the first hour) 100 (98.0) 58 (100.0) 42 (95.5) …/* …/* …/* …/* …/* …/*


(SLAV); …/*: Test not performed.

96

Table 4. Baseline clinical features of the included patients and comparison between experimental groups.

Variable Bothrops bites (number, %) Lachesis bites (number, %) Crotalus bites (number, %) Total Group A Group B p Total Group A Group B Total Group A Group B

Local manifestations Local pain 98 (96.1) 56 (96.6) 42 (95.5) 0.777 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) Edema 98 (96.1) 54 (93.1) 44 (100.0) 0.076 6 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 8 (100.0) 4 (100.0) 4 (100.0) Local bleeding 31 (30.4) 16 (27.6) 15 (34.1) 0.479 2 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Erythema 38 (37.3) 25 (43.1) 13 (29.5) 0.161 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Necrosis 2 (1.9) 2 (3.4) 0 (0.0) 0.213 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Secondary infection 37 (36.3) 20 (34.5) 17 (38.6) 0.665 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Blistering 3 (2.9) 2 (3.4) 1 (2.3) 0.728 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Paresthesia 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) ... 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Systemic manifestations Bleeding 7 (6.9) 3 (5.2) 4 (9.1) 0.438 1 (16.7) 0 (0.0) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Vomiting 2 (2.0) 1 (1.7) 1 (2.3) 0.843 3 (50.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Myalgia 6 (5.9) 1 (1.7) 5 (11.4) 0.040 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (25.0) 1 (25.0) 1 (25.0) Nausea 12 (11.8) 6 (10.3) 6 (13.6) 0.609 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Acute renal failure 7 (6.9) 5 (8.6) 2 (4.5) 0.420 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Oliguria 4 (3.9) 3 (5.2) 1 (2.3) 0.455 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Hematuria 4 (3.9) 2 (3.4) 2 (4.5) 0.777 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Headache 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 3 (50.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 1 (12.5) 1 (25.0) 0 (0.0) Bradycardia 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 3 (50.0) 2 (66.7) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Hypotension 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 4 (66.7) 2 (66.7) 2 (66.7) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Abdominal pain 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 2 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Blurred vision 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 2 (33.3) 0 (0.0) 2 (66.7) 5 (62.5) 1 (25.0) 4 (100.0) Palpebral ptosis 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (50.0) 2 (50.0) 2 (50.0) Diplopia 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6 (75.0) 3 (75.0) 3 (75.0) Ophtalmoplegia 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0) Dizziness 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) … 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 1 (25.0)


(SLAV).

97

Table 5. Adverse events reported in the safety study and comparison between the experimental groups.

Adverse event Total (n=116) Group A (n=65) Group B (n=51) p Number % Number % Number %

Any adverse event 23 19.8 11 16.9 12 23.5 0.388 Urticaria 16 13.8 11 16.9 5 9.8 0.286 Pruritus 13 11.2 8 12.3 5 9.8 0.691 Facial flushing 4 3.4 3 4.6 1 2.0 0.811 Vomiting 4 3.4 2 3.1 2 3.9 >0.999 Headache 2 1.7 0 0.0 2 3.9 0.821 Dyspnea 2 1.7 1 1.5 1 2.0 >0.999 Chills 2 1.7 1 1.5 1 2.0 >0.999 Nasal congestion 2 1.7 1 1.5 1 2.0 >0.999 Nausea 1 0.9 1 1.5 0 0.0 0.632 Conjunctival hyperemia 1 0.9 1 1.5 0 0.0 0.632 Pharyngeal irritation 1 0.9 1 1.5 0 0.0 0.632


(SLAV).

98

Supporting information legends

S1 Checklist. CONSORT Checklist.

100

S1 Dataset. Study database.

Apresentado apenas na versão online do manuscrito.

101

S1 Appendix. Ethics Approval Document.

Vide Anexos.

102

S2 Appendix. Original study protocol.

Vide Anexo.

103

S1 File. Methods employed for estimating AV potency.

Determination of anti-Bothrops, Lachesis and Crotalus

antivenom potencies

Determination of antivenom potencies used official standard methods

recommended by the Brazilian Pharmacopeia [1].

1. Bothrops antivenom potency assay

The potency assay aims at determining the required neutralizing dose (Effective

Dose 50%) to protect susceptible animals against the lethal effects of a fixed

dose of a reference venom.

The reference venom is a homogeneous mixture of venoms that represent the

geographical distribution of B. jararaca species. It should be lyophilized and

maintained at -20°C. The venom is standardized by the determination of the 50%

Lethal Dose (LD50).

Determination of the LD50 of the venom: Firstly, reconstitute the lyophilized

venom at a determined concentration by volume with 0.85% saline(w/v). Make

dilutions in geometric progression with the same diluent, using a constant dilution

factor of not more than 1.5 and equalize the final volumes. Inoculate, by

intraperitoneal route, a volume of 0.5 ml per mouse of each dilution in groups of

at least 10 Swiss albino mice from 18 g to 22 g. Observe the animals up to 48

hours after inoculation and record the number of deaths at each dilution.

Calculate the LD50 using a proven statistical method. In this study a Probit

analysis was used [2]. The response range (percentage of deaths) should be

between the highest and the lowest dilution used, forming the regression curve

that must present a linear correlation. Confidence intervals should not be large,

indicating better accuracy of the test, the smaller the limits. Express the result in

micrograms of venom per 0.5 mL.

Determination of antivenom potency: Carry out progressive dilutions of the

sample in saline at 0.85% (w/v) using a constant dilution factor of not more than

1.5, so that the final volume after mixing with the challenge dose is identical

across all test tubes. Reconstitute and dilute the reference venom with 0.85%

(w/v) saline solution and add constant volume to each tube so that each dose to

be inoculated per animal contains 5xLD50. Homogenize and incubate the

104

mixture at 37°C for 60 minutes. Inoculate intraperitoneally with a volume of 0.5

ml per mouse of each mixture in groups of at least eight Swiss albino mice of 18

g to 22 g. Observe the animals up to 48 hours after inoculation and record the

number of live in each mixture. Calculate the 50% Effective Dose (ED50) in

microliters, using a proven statistical method.In this study a Probit analysis was

used [2]. The response range produced (percentage of survival) should be

between the highest and the lowest dilution used, forming the regression curve

that should present a linear correlation. Confidence intervals should not be large,

indicating better accuracy of the test, the smaller the limits. Calculate the power

in milligrams per milliliter, according to the expression:

Antivenom Potency (mg/ml): (Tv-1/ED50) x venom DL50

on what

Tv=number of LD50 used per mouse in the venom test dose.

Antivenom potency was expressed in milligrams of venom neutralized by 1 mL

of the sample. It is accepted a 10% coefficient of variation.

The minimum Bothrops antivenom potencycan vary up to 4.5 mg/mL.

2. Lachesis antivenom potency assay


geographical distribution of L. muta species. It should be lyophilized and

maintained at -20°C. The venom is standardized by the determination of the 50%

Lethal Dose (LD50).

Determination of the LD50 of the venom: Use the same procedures presented

for Bothrops venom.

Determination of antivenom potency:Use the same procedures presented for

Bothrops antivenom.

The minimum Lachesisantivenom potencycan vary up to 2.7 mg/mL.

3. Crotalus antivenom potency assay

105


geographical distribution of C. durissus species. It should be lyophilized and

maintained at -20°C. The venom is standardized by the determination of the

50% Lethal Dose (LD50).

Determination of the LD50 of the venom: Use the same procedures

presented for Bothrops venom.

Determination of antivenom potency:Use the same procedures presented

for Bothrops antivenom.

The minimum Crotalusantivenom potencycan vary up to 1.35 mg/mL.

Reference

1. Brazilian Ministry of Health (2000) Farmacopeia Brasileira, 4th ed.

Anvisa, Brasília.

2. Finney DJ (1971) Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press,

Cambridge.

106

S2 File. Baseline laboratorial features of the included patients and comparison of

means between experimental groups in Bothrops snakebites.

Variable BothropsGroup A bites (Mean (SD)/n (%))Group B p

rate(mm/hour) Legend: Group A is the freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV); Group B is available

Bothrops, Bothrops-Lachesis and Bothrops-Crotalus AVs provided by the MoH

(SLAV).

Reference values: Urea (High: >40 mg/dL), Creatinine (High: >1.2 mg/dL), K+ (Low:

<3.6 mmol/L), Na2+ (High: >145 mmol/L), Lactate dehydrogenase (High: >423

mg/dL), Leucocytes (High: >10,000 mm3), Hemoglobin (Low (female: <12 g/dL;

male: <13 g/dL), Aspartate transaminase (High: >38 mg/dL), Alanine transaminase

(High: >44 mg/dL), Creatine phosphokinase (High: >190 U/L), Fibrinogen (Low:

<150 mg/dL), Platelets (Low: <150.000 mm3), International Normalized Ratio (High:

>1), Erythrocyte sedimentation rate (High: >6 mm in the first hour).

Urea (mg/dL) 33.8 (11.1) 32.5 (10.6) 0.213

Creatinine (mg/dL) K+ (mmol/L) Na2+(mmol/L)

1.1 (0.3) 4.5 (1.4) 140 (3.2)

1.0 (0.2) 4.3 (1.3) 138 (2.0)

0.602 0.677 0.741

Lactate dehydrogenase (mg/dL) Leucocytes (mm3)

438 (50.8)

11.700 (4,900)

431 (40.2)

8.700 (3,700)

0.678

0.093

Hemoglobin (g/dL) 11.5 (1.3) 10.6 (1.5) 0.452

Aspartate transaminase (mg/dL) 35.2 (13.5) 34.0 (15.1) 0.096

Alanine transaminase (mg/dL) 32.2 (16.4) 29.2 (19.9) 0.188

Creatine phosphokinase (IU/L)

187.8 (59.4) 179.2 (89.4) 0.852

Fibrinogen (mg/dL) Platelets

(mm3)

134.0 (64.2) 249,500 (72,400)

128.4 (54.3) 235,300 (75,200)

0.956 0.723

International Normalized Ratio 0.9 (0.3) 0.8 (0.2) 0.255

Erythrocyte sedimentation 14.6 (10.1) 15.6 (10.9) 0.146

107

S3 File. Primary efficacy endpoint analysis in Lachesis snakebites. For Lachesis

snakebites, fibrinogen, clotting time and INR presented normal values 24 hours after

AV therapy, for freeze-dried trivalent antivenom (FDTAV) and Ministry of Health

standard liquid antivenoms (SLAV) treated groups. Creatinine levels were normal since

the admission.

108

S4 file. Primary efficacy endpoint analysis in Crotalus snakebites. For Crotalus

snakebites, fibrinogen, clotting time, INR, and creatine phosphokinase presented

normal values 24 hours after AV therapy in FDTAV and Ministry of Health standard

liquid antivenoms (SLAV) treated groups.

109

6. DISCUSSÃO

O soro antiofídico é o único tratamento específico para tratar a maioria

dos efeitos de envenenamento dos acidentes ofídicos, e tem um papel

crucial em minimizar a mortalidade e a morbidade. Contudo, para ser parte

de um conjunto de cuidados primários da saúde onde os acidentes ofídicos

ocorrem há uma urgente necessidade de assegurar a disponibilidade de

segurança, eficácia e soros antiofídicos acessíveis, principalmente em

países em desenvolvimento (105). Além disso, inovação na logística de

distribuição do soro antiofídico é também uma prioridade. No Brasil, no

momento, os soros antiofídicos usados requerem equipamentos para

conservação sob refrigeração (20 a 80C), os quais não são possíveis em

áreas remotas sem eletricidade (5). Portanto as formulações liofilizadas

podem transformar-se em uma boa alternativa para a produção de soros

antivenenos mais estáveis em regiões do mundo onde altas temperaturas

são comuns e a cadeia de refrigeração é deficiente, tal como na Amazônia

Brasileira. Há uma limitada quantidade de publicações sobre estabilidade,

eficácia clínica e segurança dos soros antivenenos liofilizados. Uma

principal preocupação é a conservação das propriedades farmacocinéticas

dos soros liofilizados e da potência de neutralização dos anticorpos

submetidos à liofilização (106). Portanto resultados positivos de

caracterização térmica do efeito da liofilização em anticorpos equinos e

eficácia de estabilizadores em soros antivenenos liofilizados tem sido

reportados (107,108). Para melhorar o nosso conhecimento este é o

primeiro ensaio clínico objetivando comparar a segurança e eficácia de um

soro antiveneno liofilizado com uma formulação líquida. Este estudo não

incluiu dados do possível aumento de custo da produção do soro antiofídico

devido ao processo de liofilização. Estudos futuros para avaliar custos

serão essenciais.

6.1 ANÁLISE DA EFICÁCIA

Nossos resultados mostraram que em ambos os grupos, o

sangramento induzido pelo veneno e a coagulopatia invariavelmente

cessaram, e a coagulabilidade sanguínea foi restabelecida dentro de 24

110

horas de seguimento de todos os pacientes. Como as alterações

hemostáticas têm sido relacionadas à gravidade e óbitos em acidentes por

viperídeos, a resolução da coagulabilidade sanguínea tem sido proposta

como um relevante alvo em ensaios clínicos em acidentes ofídicos (109,

110). Atualmente, as manifestações sistêmicas de acidentes por viperídeos

são caracterizadas por sangramentos, coagulopatia associada com

desfibrinogênese e incoagulabilidade, com a potencial evolução para

hipovolemia, choque cardiovascular e insuficiência renal aguda em casos

graves (12,19,110). Nossos resultados indicam que uma melhora no estado

de coagulação foi observada dentro de 6-12 horas na maioria dos pacientes

e dentro de 24 horas em manter todos os pacientes recebendo uma única

dose de soro antiofídico (111, 112, 113). A coagulabilidade sanguínea

deveria ser monitorada após a dose inicial do soro antiofídico e doses

posteriores deveriam ser administradas, se necessário, até a

coagulabilidade ser restabelecida (112, 113, 114). A função renal anormal

é bastante comum em envenenamentos por viperídeos (19, 79,116).

Ambos os grupos de estudo apresentaram concentrações de creatinina

sérica que retornaram para valores normais dentro das primeiras 24 horas

de seguimento dos acidentes botrópicos. Contudo, alguns pacientes

admitidos com insuficiência renal podem evoluir sem melhora da lesão

renal mesmo após a administração do soro antiofídico, quando a lesão foi

iniciada antes da administração do soro antiofídico (78, 115). Isto precisa

ser levado em consideração na interpretação de insuficiência renal em

acidentes botrópicos.

O veneno de Crotalus pode causar miotoxicidade sistêmica,

aumentando os níveis séricos de cretinofosfoquinase (24). Além disso, os

níveis de enzimas musculares aumentam mesmo após a soroterapia

antiofídica adequada (116, 117, 118). Do mesmo modo, mesmo os

pacientes que receberam quantidades próprias de antiveneno podem

progredir com danos renais porque os mecanismos de lesão são iniciados

após o acidente ofídico e antes da administração do antiveneno. Neste

estudo, contudo, nenhum paciente apresentou insuficiência renal na

admissão e níveis de CPK normais foram vistos até 24 horas de seguimento

dos acidentes crotálicos. Todos os pacientes se recuperaram da

111

coagulopatia dentro de 24 horas após a terapia com SATL e SAMBL.

Embora algumas manifestações neurológicas observadas nos acidentes

crotálicos usualmente não melhorem rapidamente após a administração do

soro antiofídico (116), neste estudo os sinais e sintomas tais como turvação

da visão, ptose palpebral, diplopia e oftalmoplegia foram suprimidos dentro

de 24 horas de seguimento.

Neste estudo, uma segunda dose de antiveneno não foi necessária,

devido ao fato de que nenhum paciente apresentou sangue totalmente

incoagulável 12 horas após a dose inicial ou recorrências de coagulopatias.

De fato, a persistência ou recorrência de antigenemia do veneno e mesmo

a coagulopatia recorrente podem estar presentes dentro de 12-48 horas em

casos graves (119, 120), que não foram incluídos neste estudo. Além disso,

diferenças na eficácia do soro avaliado pode explicar níveis desiguais de

resolução na coagulopatia induzida pelo veneno, como observado no uso

de antivenenos de diferentes países da América Latina (121,122). Mesmo

ainda porque, a composição do veneno pode variar significativamente entre

serpentes de diferentes espécies refletindo na eficácia do soro (32, 123).

Os dados computados para as espécies de Lachesis e Crotalus tem

limitações em termos de eficácia por causa do pequeno número incluído no

estudo devido a raridade de casos na Amazônia.

6.2 ANÁLISE DA SEGURANÇA

Embora a literatura sugira que a quantidade de proteínas heterólogas

está relacionada com a frequência e intensidade de reações adversas (124),

nós não observamos um significante aumento na incidência de reações

adversas no SATL comparado com os SAMBL. Apesar de ambos os soros

terem sido produzidos do mesmo pool de plasma hiperimune, um conceito

deste estudo é a possível formação de agregados insolúveis durante o

processo de liofilização com posterior reconstituição incompleta, a qual tem

sido associado com o desenvolvimento de reações adversas durante a sua

administração (125). Uma hipótese para a indesejável formação de

agregados insolúveis no SATL é o uso de sucrose na estabilização do soro

liofilizado. O efeito protetor de polióis como sorbitol e manitol no

desenvolvimento de turbidez nos soros líquidos tem sido reportado

112

(126,127). Mais recentemente, o uso de sucrose na estabilização de

antiveneno líquido ou liofilizado tem sido descrito como melhor estabilizador

do que o manitol e o sorbitol na formulação do SATL (107,108).

As reações adversas precoces foram leves e foram prontamente

revertidas pelo tratamento com adrenalina e anti-histamínicos. A incidência de

reações adversas precoces, todas leves e sem fatalidades, foram similares

para os dois estudos do Brasil e Colômbia (6,83). Embora a frequência fosse

menor do que os resultados de outros estudos conduzidos na América do Sul

com vítimas de acidentes botrópicos, os quais reportaram níveis de incidência

de 25% a 87% (113, 128, 114, 120, 129, 130). Apesar dos anti-histamínicos

aparentarem não ser de óbvio benefício em prevenir reações agudas dos

antivenenos (131-133), o regime de pré-soroterapia usado neste estudo

(hidrocortisona IV, cimetidina IV e dexclorfeniramina VO) pode também ter

contribuído para a baixa incidência de reações adversas precoces. Eventos

adversos tardios não foram observados neste estudo, em acordo com estudos

prévios mostrando sua ausência (24,113,114,128130,134) ou baixa incidência

(135). Apesar de nenhum paciente ter retornado ao hospital ou ter feito contato

com o médico do estudo queixando-se de possíveis efeitos adversos tardios

após o D15, pacientes tratados com soro antiveneno podem apresentar

reações adversas após este tempo. O não seguimento dos pacientes após

este dia configura uma limitação deste estudo que pode subestimar a

frequência das reações tardias. Uma preocupação com os soros antivenenos

formulados com sucrose tem sido a possibilidade de complicação ou produção

de algum dano renal (136). Entretanto a função renal estava normal para todos

os pacientes após 24 horas de seguimento, indicando que a dose empregada

foi segura.

6.3 TESTE DE RECONSTITUIÇÃO

Estudos prévios reportaram prolongados tempos de reconstituição de 30

a 90 minutos para alguns soros liofilizados (137, 138), adiando o tempo de

administração do antiveneno, o que é um fator relacionado ao precário

prognóstico dos acidentes ofídicos (20). Neste estudo, contudo, uma completa

dissolução foi observada visualmente quando os frascos de SATL foram

113

delicadamente agitados de forma manual por um minuto, de acordo com

estudos prévios onde outras proteínas liofilizadas mostraram tempos curtos

de reconstituição (menos que 5 minutos) (107, 139,140), sugerindo

manutenção da estabilidade e atividade neutralizante (140,141).

6.4 RESULTADOS DE ESTABILIDADE

O êxito dos soros antivenenos liofilizados já utilizados na rotina em alguns

continentes (apesar da falta de estudos clínicos publicados) requer a

conservação da estabilidade fisicoquímica e potência de neutralização dos

anticorpos ao longo do tempo em temperatura ambiente (107). Neste estudo,

a potência do soro em neutralizar as atividades dos venenos de Bothrops,

Lachesis e Crotalus não mostrou significativa diminuição comparada com

linha de base para referência ao longo de um ano de avaliações de

termoestabilidade a 560C. Osmolitos como a sucrose e o sorbitol são capazes

de estabilizar anticorpos em altas temperaturas sem significante perturbação

em suas estruturas secundárias ou em sua afinidade com o veneno de

serpentes (126,142). Os antivenenos líquidos com sorbitol previnem o

aparecimento de turbidez após estocagem por um ano a 370C, mas mostra

uma parcial perda da potência de neutralização nestas condições (127).

Quando testados, os anticorpos de único domínio anti-alfa-cobratoxina

adicionados com ligações de dissulfeto em 1 mg/ml em elevadas

temperaturas por uma hora reteve próximo de 100% de sua atividade ligante

inicial (143).

7. CONCLUSÕES

• Neste estudo, o SATL e os SAMBL apresentaram a mesma eficácia

baseada em desfechos clínicos relevantes em acidentes botrópicos,

laquéticos e crotálicos.

• Não houve diferenças significativas na incidência de reações adversas

agudas entre pacientes combinados com SATL e os SAMBL.

114

• Só foram observadas reações adversas leves e com o uso de ambos os

soros.

• Comprovou-se a estabilidade térmica do SATL, sugerindo que a formulação

é uma boa alternativa para a produção de soros antivenenos mais estáveis

em regiões da Amazônia onde altas temperaturas são comuns e a cadeia

de refrigeração é precária.

• Nossos resultados indicam que o produto liofilizado poderia ser viabilizado

para um estudo de Fase III.

115

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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76: 515524, 1998.

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Pathmeswaran A, Premaratna R, et al. The global burden of snakebite: A

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envenoming and deaths. PLoS Med. 2008; 5(11):1591– 604.

4. Gutiérrez JM, Theakston RDG, Warrell DA. Confronting the neglected

problem of snakebite envenoming: the need for a global partnership. PLoS

Med. 2006; 3:e150.

5. Chippaux JP. Epidemiology of envenomations by terrestrial venomous

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contingencies. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical

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7. VENOMS 2017. St Hilda’s College, Oxford University – UK.

http://lpmhealthcare.com/venoms-2017.Available: http://jvenomres.co.uk.

8. The Global Burden of Snakebite from Lillian Lincoln Foundation on

Vimeo. http://www. snakebiteinitiative.org/?page_id=287).

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128. Wen FH, Marcopito L, Cardoso J, França F, Málaque C, Ferrari R, et

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129. Bucaretchi F, Douglas JL, Fonseca MRCC, Zambrone FAD, Vieira RJ.

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130. Habib AG. Effect of pre-medication on early adverse reactions

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131. Thomas L, Tyburn B, Bucher B, Pecout F, Ketterle J, Rieux D, et al.

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envenoming in Martinique: failure of anticoagulants and efficacy of a

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142. Brasil. Caderno 14_ Acidentes por Animais Peçonhentos. In: Saude

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Ministério da Saúde; 2009. P23. Available from:

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_vigilancia_epidemiologica

_7ed.pdf

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_vigilancia_epidemiologica_7ed.pdf

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_vigilancia_epidemiologica_7ed.pdf

130

9. ANEXOS ANEXO I

LAUDO DE TERMOESTABILIDADE DO SATL

131

ANEXO II

LAUDO DE ANÁLISE FÍSICO - QUÍMIC A DO SATL

135

ANEXO III

PROTOCOLO DE REGISTRO DE CASO

136

ANEXO IIIA

FORMULÁRIO DE ENTREVISTA (DADOS GERAIS)

1 - IDENTIFICAÇÃO

1.1 Nº PROTOCOLO: 1.2 DATA: ______/______/_______

1.3 NOME: 1.4 SEXO:( ) Masc ( ) Fem

1.5 DATA NASC: _____/_____/_____ 1.6 NATURALIDADE:

1.7 END RES: 1.8 TEL RES:

1.9 BAIRRO: 1.10 CIDADE: 1.11 ESTADO:

1.12 END TRAB: 1.13 TEL TRAB:

1.14 OCUPAÇÃO:

1.15 ESCOLARIDADE:

[ ] 1. Analfabeto 2. 1º Grau 3. 2º Grau 4. Superior 5. Ignorado

Especifique:[ ] 1. Completo

2. Incompleto

2. OUTRAS INFORMAÇÕES

2.1 Preenchido ( ) antes ( ) durante ( ) depois da soroterapia

Responsável:

Data: Unidade:

137

MANUAL PARA APLICAÇÃO – ANEXO IIIA

O formulário deverá ser preenchido após a confirmação do paciente como voluntário para

o trabalho. Os dados poderão ser coletados diretamente com o voluntário ou

acompanhante, ou ainda, através do prontuário (ficha de entrada / cadastro, etc) do

paciente.

O preenchimento segue os seguintes passos:

1º Passo: Preenchimento do campo “1 – IDENTIFICAÇÃO”.

1– IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE: Preencher nº do protocolo do paciente na pesquisa,

data de atendimento, seu nome completo, sexo, data de nascimento (DD/MM/AAAA),

naturalidade, endereço residencial, bairro, cidade, estado, telefone da residência,

endereço do trabalho, telefone do trabalho, ocupação e escolaridade.

Após preencher a identificação do paciente realizar a avaliação clínica.

É muito importante que não ocorre um risco maior para o paciente que está participando

da pesquisa, logo o médico deve avaliar como e quando vai realizar a entrevista com o

paciente (ou responsável). O entrevistador deve preencher todas as lacunas do formulário.

2º Passo: Preenchimento do campo “2 – OUTRAS INFORMAÇÕES”.

Informar o momento do preenchimento da ficha: antes, durante ou depois da soroterapia.

3º Passo: Identificação do responsável pelo preenchimento (nome completo), data do preenchimento ou coleta dos dados e unidade (local do trabalho).

4º Passo: Após preenchimento enviar uma cópia legível para o IBEx.

138

ANEXO IIIB

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Instituto de Biologia do Exército (RJ) – Instituto Butantan (SP) – Fundação de

Medicina Tropical do Amazonas

AVALIAÇÃO CLÍNICO-TERAPÊUTICA DO SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE ( BOTRÓPICO- LAQUÉTICO- CROTÁLICO ) LIOFILIZADO

Este documento visa dar ao senhor informações e pedir sua participação neste

trabalho, realizado em conjunto pelo Instituto de Biologia do Exército, Instituto

Butantan e Fundação de Medicina Tropical, cujo objetivo é analisar a eficácia e a

possível presença de eventos adversos ao tratamento com uma nova formulação do

soro antiofídico.

A nova formulação do soro antiofídico consiste em uma forma liofilizada (em pó) que

fornece maior estabilidade em ambientes quentes e é capaz de neutralizar três tipos

de venenos (antibotrópico-laquético-crotálico), isto é, atua nas picadas das serpentes:

jararaca, surucucu e cascavel.

Os testes em laboratório realizados com o novo soro apresentaram resultados

similares aos soros já produzidos pelo Instituto Butantan.

A participação na pesquisa consiste em: (1) utilizar o soro liofilizado trivalente ou o

soro líquido no tratamento; (2) realizar exames laboratoriais através da colheita de

urina e da retirada de sangue venoso por venopunção; (3) responder as perguntas

realizadas pelos pesquisadores.

Sua participação nesta pesquisa é muito importante, mas é uma escolha somente

sua. O senhor pode se recusar a participar, sem que isso o prejudique no tratamento.

Todas as informações sobre os participantes neste estudo são confidenciais. Não

serão divulgados nomes dos participantes em nenhuma hipótese. Os resultados dos

exames realizados serão disponibilizados ao senhor, permanecendo uma cópia com o

pesquisador para análise.

Declaro estar ciente das informações deste Termo de Consentimento, entendendo

que poderei pedir esclarecimentos a qualquer tempo. Declaro dar meu consentimento

para a participação nesta pesquisa, estando ciente de que uma outra cópia deste

termo permanecerá arquivada pelos organizadores da pesquisa. Participante:

___________________________________________________________________

Local e data: __________________,______/__________/ 200 .

________________________________________________________________

Assinatura do participante

________________________________________________________________

Assinatura do responsável pela pesquisa no local do Tratamento

Contato OMS / Hosp: _____________________________________ Tel:_____________________ Contatos (RJ): Cap Iran

Tel: 021 XX 3860-0442 ramal 228 (Instituto de Biologia do Exército)

139

ANEXO IIIC Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Especial

Instituto de Biologia do Exército (RJ) – Instituto Butantan (SP) – Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

AVALIAÇÃO CLÍNICO-TERAPÊUTICA DO SORO ANTIOFÍDICO TRIVALENTE ( BOTRÓPICO- LAQUÉTICO- CROTÁLICO )

LIOFILIZADO

Este documento visa dar ao Senhor, informações e pedir participação do menor acidentado,

através de sua autorização e do menor neste trabalho, realizado em conjunto pelo Instituto de

Biologia do Exército, Instituto Butantan e Fundação de Medicina Tropical, cujo objetivo é analisar a

eficácia e a possível presença de eventos adversos ao tratamento com uma nova formulação do

soro antiofídico.

A nova formulação do soro antiofídico consiste em uma forma liofilizada (em pó) que fornece

maior estabilidade em ambientes quentes e é capaz de neutralizar três tipos de venenos

(antibotrópico-laquéticocrotálico), isto é, atua nas picadas das serpentes: jararaca, surucucu e

cascavel.

Os testes em laboratório realizados com o novo soro apresentaram resultados similares aos

soros já produzidos pelo Instituto Butantan.

A participação na pesquisa consiste em: (1) utilizar o soro liofilizado trivalente ou o soro líquido

no tratamento; (2) realizar exames laboratoriais através da colheita de urina e da retirada de sangue

venoso por venopunção; (3) responder as perguntas realizadas pelos pesquisadores.

Sua participação e do acidentado nesta pesquisa é muito importante, mas é uma escolha

somente de ambos. Os senhores podem se recusar a participar, sem que isso prejudique o

tratamento. Todas as informações sobre os participantes neste estudo são confidenciais. Não serão

divulgados nomes dos participantes em nenhuma hipótese. Os resultados exames realizados serão

disponibilizados ao senhor e ao acidentado, permanecendo uma cópia com o pesquisador para

análise.

Declaro estar ciente das informações deste Termo de Consentimento, entendendo que poderei

pedir esclarecimentos a qualquer tempo. Declaro dar meu consentimento para a participação do

menor nesta pesquisa, estando ciente de que uma outra cópia deste termo permanecerá arquivada

pelos organizadores da pesquisa.

Participante:

___________________________________________________________________ Local e

data: __________________,_______/__________/ 200 .

________________________________________________________________

Assinatura do responsável pelo acidentado

________________________________________________________________

Assinatura do responsável pela pesquisa no local do Tratamento

Contato OMS / Hosp: ____________________________________ Tel:_____________________

Contatos (RJ): Cap Iran Tel: 021 XX 3860-0442 ramal 228 (Instituto de Biologia do Exército)

140

ANEXO IIID

FICHA DE ACOMPANHAMENTO CLÍNICO 1- IDENTIFICAÇÃO

1.1 Nº PROTOCOLO: 1.2 PRONTUÁRIO:

1.3 NOME: 1.4 DATA: _____/______/_______

2. AVALIAÇÃO CLÍNICA

2.1 Queixa Principal:

2.2 História do acidente:

2.2.a: Data do acidente:

2.2.b: Local de ocorrência do acidente:

2.2.c: Horário do acidente:

2.2.d: Identificação do ofídio:

2.2.e:Tamanho aproximado do ofídio (centímetros):

2.2.f: Região corporal picada pelo ofídio:

2.2.g. Descrição das alterações locais:

2.2.h: Descrição das alterações sistêmicas:

2.2.i: Outras informações:

2.3. História Patológica Pregressa:

2.3.a: Outros acidentes com ofídios? ( ) não ( ) sim Descrever (ofídio, data, tratamento, alergia, reações adversas) _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

2.3.b: Uso de soro heterólogo anteriormente: ( ) sim ( ) não

2.3.c: Motivo do uso (2.3.d)/qual soro?

2.3.e: A quanto tempo?

2.3.f: Alergias (soro): ( ) não ( ) sim quais ?

_______________________________________________________________________

______________

2.3.f: Alergias (outras): ( ) não ( ) sim quais ?

141

3. EXAMES REALIZADOS E RESULTADOS Data: / / . ( )Admissão ( )4 horas ( )12 horas ( )24 horas ( )7 dias ( )15 dias

3.1 Material colhido antes da soroterapia: ( ) urina ( ) sangue

3.2 Exames realizados antes da soroterapia:

3.2.a Urina (EAS) pH:________________________________ Proteínas:___________________________ Hemoglobina:________________________ Piócitos:____________________________

Hemácias:___________________________

Cilindros:____________________________

Cristais:___________________________ Pigmentos biliares:__________________ Nitritos:____________________________Corpos cetônicos:___________________ Urobilinogênio:______________________ Glicose:___________________________ Bactérias:_________________________

_

3.2.b Sangue Hemograma Completo Hemácias:____________________________ Hemoglobina:_________________________ Hematócrito:___________________________Leucócitos totais:_______________________ Basófilos:_____________________________ Eosinófilos:____________________________ Mielócitos:_____________________________ Metamielócitos:_________________________ Bastonetes:____________________________ Segmentados:_________________________ Linfócitos:_____________________________ Monócitos:____________________________ Promielócitos:__________________________ Contagem de plaquetas:_________________

Provas de Função Hepática Alaninoaminotransferase (ALT):________ Aspartatoaminotransferase (AST):______ Fosfatase alcalina (FA):_____________ Desidrogenase láctica (DHL):__________ Bilirrubina total (Bt):_________________ Bilirrubina direta (Bd):______________ Bilirrubina indireta (Bi):______________ Provas de Função Renal Uréia:____________________________ Creatinina:________________________ Potássio:__________________________ Sódio:____________________________ Provas de Coagulação Sangüínea Tempo de Coagulação (TC):__________________ Tempo de Atividade da Protrombina (TAP):______ ________________________________ Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA): _____________ Fibrinogênio:______________________

Outros exames: _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________ ______________________________________

Creatinoquinase (CK):_______________

Cálcio:____________________________

Velocidade de hemossedimentação (VHS): ________________

3.3 Sorologia pela técnica ELISA (material colhido antes e depois da soroterapia -1

hora após), para avaliar a venenemia – neutralização: 1a colheita em / / .

2a colheita em / / .

142

3.4 Exames realizados durante a soroterapia 3.4.a Urina (caso não realizado colheita antes da soroterapia): colhido em / / . 3.4.b Sangue: colhido em / / . Descrever quais

exames:____________________________________________________________

3.5 Exames realizados depois da soroterapia 3.5.a Urina: colhido em / / .

3.5.b Sangue: colhido em / / . Descrever quais

exames:____________________________________________________________

Responsável:

Data: Unidade:

2.4. Manifestações Clínicas ( ) Dor ( ) Edema ( ) Eritema ( ) Bolhas ( ) Úlceras ( ) Abscesso ( ) Hemorragia local ( ) Gengivorragia ( ) Epistaxe ( ) Hemoptise ( ) Hemorragia digestiva ( ) Hematúria ( ) Hemorragia da pele ( ) Oligúria ( ) Anúria ( ) Náuseas ( ) Dor abdominal ( ) Vômitos ( ) Diarréia ( ) Lipotímia ( ) Visão turva ( ) Choque ( ) Ptose palpebral ( ) Insuficiência respiratória ( ) Diplopia ( ) Sialorréia ( ) Icterícia ( ) Paralisia dos membros superiores ( ) Disfagia ( ) Mialgias ( ) Oftalmoplegia ( ) Paralisia dos membros inferiores ( ) Outras 2.4a: Outras informações relevantes: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.5. Exame Físico 2.5a: Ectoscopia: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________ 2.5b: Aparelho Respiratório: ________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________ 2.5c: Aparelho Cardiovascular:

143

________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.5d: Aparelho Digestivo: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.5e: Aparelho Geniturinário: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.5f: Exame dos Membros: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ 2.6. Outras informações relevantes: ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________ OBS1: A avaliação laboratorial seguirá o seguinte cronograma:

Distribuição Temporal

Coagulograma (inclui TAP e

PTTa)

Fibrinogênio

Bioquímica

Hemograma e Plaquetas

Urina (EAS)

Admissão X X X X X 4 horas X X X X X 12 horas X X X X X 24 horas X X X X X 7 dias X X X

15 dias X X X

OBS2: Os resultados dos exames serão transcritos para a folha nº 2 deste anexo, para

isto serão fornecidas 6 cópias destas folhas.

OBS3: Deverá ser aposto no início de cada folha nº 2, a data e a hora de cada colheita de

material para o exame.

144

MANUAL PARA APLICAÇÃO – ANEXO IIID

O formulário deverá ser preenchido pelo médico responsável pelo tratamento ou

profissional de saúde indicado por ele. Os dados serão coletados dos pacientes

voluntários.

Os dados serão registrados durante o tratamento até o 25 º dia após o início da soroterapia.

O preenchimento segue os seguintes passos:

1º Passo: O paciente se enquadra nos quesitos de elegibilidade.

IMPORTANTE:

a) Critérios de elegibilidade: Ter sido indicado para o uso do soro heterólogo por

ocasião de acidente ofídico; Ter idade entre 12 e 70 anos de idade; Indivíduos do sexo

feminino fora do estado de gravidez; Não ser classificado na avaliação médica como caso

grave; Não ter usado soro antiofídico antes da chegada ao hospital que realiza o estudo e

Ler e assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, o que poderá ser feito por

um responsável no caso de impedimento da vítima.

b) Critérios de exclusão: Gravidez no momento da aplicação da soroterapia; Ter

menos do que 12 e mais de 70 anos de idade; Ser classificado na avaliação médica como

caso grave ou Ter iniciado tratamento antiofídico antes da chegada ao hospital que realiza

o estudo.

2º Passo: Oferecer a opção do soro trivalente explicitando as vantagens (três espécies) e

informando sobre os possíveis eventos adversos (semelhantes ao utilizado na rotina de

tratamento). Esclarecer possíveis dúvidas e perguntar se poderia participar do projeto.

Caso a resposta seja negativa, agradecer e, continuar o tratamento de rotina. Sendo a

resposta positiva, realizar sorteio e iniciar tratamento.

O paciente não deverá saber se está utilizando o soro liofilizado.

3º Passo: Preenchimento da Ficha de Acompanhamento:

1– IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE: Preencher nº do protocolo do paciente na pesquisa,

nº do prontuário na Unidade que está atendendo, seu nome completo e a data de entrada

para o tratamento.

145

Após preencher a identificação do paciente realizar a avaliação clínica.

É muito importante que não ocorra um risco maior para o paciente que está participando

da pesquisa, logo o médico deve avaliar como e quando vai realizar a entrevista com o

paciente (ou responsável). O entrevistador deve preencher todas as lacunas do formulário.

2– AVALIAÇÃO CLÍNICA:

4º Passo:item “2.1”: Queixa principal: Descrever os sinais e sintomas apresentados

pelo acidentado no momento do atendimento médico.

5º Passo:item “2.2”: Relatar a história do acidente, para isso preencher os subitens:

2.2.a: Data do acidente: dia, mês, ano. Exemplo: 2/07/04 (dois de julho de dois mil e quatro).

2.2.b: Local de ocorrência do acidente: Descrever o local com suas características.

Ex.: residência, mata, lavoura, perto de rios, pedras, etc.

2.2.c: Horário do acidente: hora aproximada (utilizar escala de “0” a 23 horas) . Exemplo: 8h/20h, 12h/0h.

2.2.d: Identificação do ofídio: quando possível identificar o ofídio, para isso perguntar

ao acidentado ou acompanhante. Pode se utilizar a identificação local.

2.2.e: Tamanho aproximado do ofídio (centímetros): quando possível. Exemplo +/- 45 cm.

2.2.f: Região corporal picada pelo ofídio: Descrever por exemplo: região posterior da

perna direita, região lateral do tornozelo esquerdo, etc.

2.2g: Descrição das alterações locais: Descrever os sinais da picada e alterações

como: edema, sangramento local, etc.

2.2h: Descrição das alterações sistêmicas: Descrever os sinais e sintomas como:

hematúria, sangramento gengival, alterações pressóricas, alterações sensoriais, etc.

2.2i: Outras informações: Espaço reservado para qualquer informação que o

entrevistador ou médico ache relevante.

6º Passo: item “2.3” deverá ser descrito a história patológica pregressa, conforme os subitens descritos:

2.3.a: Outros acidentes com ofídios? ( ) não ( ) sim Descrever (ofídio, data,

tratamento, alergia, reações adversas).

2.3.b: Uso de soro heterólogo anteriormente: ( ) sim ( ) não.

2.3.c: Motivo do uso (2.3.b)/qual soro?

2.3.d: Anotar a data ou período. Exemplos: fevereiro de 2001, 1999, dois anos atrás, etc.

2.3.e: Anotar as manifestações alérgicas, possivelmente relacionadas ao uso do soro.

2.3.f: Anotar outras alergias relatadas pelo paciente.

146

7º Passo: Transcrever os exames realizados no paciente. Todos os exames listados

são importantes para a pesquisa. Não esquecer de preencher a data da realização

dos exames assim como assinalar o período de realização do exame na admissão e

em relação ao início da soroterapia (no início da folha 2 deste anexo).

8º Passo: Após preenchimento, enviar para o IBE

147

ANEXO IIIE

FICHA DE ACOMPANHAMENTO PARA COLETA DE SANGUE

IBEx – IB – FMTAM

Nº do Protocolo (Pesquisa) ______________

Nome: _________________________________________________________________

Idt nº : ___________________________

Data da entrada: ( / /200 ). Responsável: _____________________________

1a Coleta de sangue: ( / /200 ). Na admissão – Responsável: ________________

2a Coleta de sangue: ( / /200 ). 4 hs pós-soroterapia – Responsável: __________

3a Coleta de sangue: ( / /200 ). 12 hs pós-soroterapia – Responsável: _________

4a Coleta de sangue: ( / /200 ). 24 hs pós-soroterapia – Responsável: _________

5a Coleta de sangue: ( / /200 ). 7 dias pós-soroterapia – Responsável: _________

6a Coleta de sangue: ( / /200 ). 15 dias pós-soroterapia – Responsável: ________

148

MANUAL PARA APLICAÇÃO - ANEXO IIIE

Esta ficha deverá ser preenchida após a confirmação do paciente como voluntário para o trabalho.

Nesta ficha serão informadas as datas das coletas de sangue para avaliação

bioquímica e sorológica. O preenchimento segue os seguintes passos:

1º Passo: Anotar o número do protocolo de participação na pesquisa, o nome

completo e o número de identidade.

2º Passo: Anotar no campo “data de entrada” a data que o paciente iniciou o

tratamento (aplicação do soro antiofídico trivalente liofilizado).

3º Passo: Anotar a data AGENDADA para cada coleta de sangue.

4º Passo: Colocar entre parênteses a data REAL da coleta. Não esquecer de anotar

o nome do responsável pela coleta.

5º Passo: Após preenchimento enviar uma cópia legível para o IBEx.

149

ANEXO IIIF

152

ANEXO IIIG

FICHA DE INVESTIGAÇÃO DOS EVENTOS ADVERSOS PÓS-SOROTERAPIA (SATL-SAMBL)

IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE

1-NOME DO PACIENTE 2-DATA DO NASCIMENTO:

______/_________/_______

3-ENDEREÇO (Rua,Avenida, nº Aptº.)

4-BAIRRO OU LOCALIDADE: 5- MUNICÍPIO: 6-UF

7- TELEFONE PARA CONTATO: ( ) 8- PROFISSÃO:

DADOS COMPLEMENTARES DO CASO

9- Nº DE FRASCOS ADMINISTRADOS: _______ 10- VIA DE APLICAÇÃO: ______________________

11- DATA DA APLICAÇÃO: _____/____/_____ 12- LAB.PRODUTOR: IB-IBEx

13- Nº DO LOTE: 14- VALIDADE:

EVENTOS ADVERSOS – REAÇÕES PRECOCES (24 horas) E TARDIAS

15 - MARCAR COM UM “x””

MANIFESTAÇÕES: 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º 13º 14º 15º 16º 17º 18º 19º 20º 21º 22º 23º 24º 25º URTICÁRIA

PRURIDO

RUBOR FACIAL

DISPNÉIA

SIBILOS

TOSSE

FEBRE (indicar T ºC)

TREMORES

NÁUSEAS

DOR ABDOMINAL

ANGIOEDEMA

EDEMA DE GLOTE

ARRITMIA CARDÍACA

HIPOTENSÃO

ARTERIAL

LINFOADENOMEGALIA

MIALGIA

153

NEFRITE

MONONEURITE

CEFALÉIA

VÔMITOS

OUTROS (especificar *):




* Especificar: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 16 - Observações: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

ATENDIMENTO HOSPITALAR DO EVENTO ADVERSO 17- SIM 2- NÃO

18- DATA: ENTRADA: ____/____/_____ SAÍDA: _____/______/_____

19-

EMERGÊNCIA ENFERMARIA

20- HOSPITAL DE ATENDIMENTO:

EVOLUÇÃO DO CASO

21- ÓBITO 22- CURA SEM SEQÜELAS 23- CURA SEM SEQUELAS 24- IGNORADO

SINAIS E SINTOMAS ANTERIORES À SOROTERAPIA (ÚLTIMAS 72 HORAS)

25- FEBRE Tº C: ________

1-SIM 2-NÃO

26- OUTROS (especificar):

27- HÁ QUANTO TEMPO? _____dias ______horas ____ min.

ANTECEDENTES PESSOAIS

154

28- ALERGIAS (medicamentos, etc): SIM NÃO Descrever:_____________________________________________________________________________________________________________

29- IMUNODEFICIÊNCIAS (neoplasias, Aids, etc.):

30- USO CONCOMITANTE DE MEDICAMENTOS (corticóides, etc.):

31- APRESENTOU EVENTOS ADVERSOS EM SOROTERAPIA ANTERIOR ?: SIM NÃO

32 – ESPECIFICAR: ______________________________________________________________________________________________________________________

DADOS DO INVESTIGADOR

34- DATA: 33- INVESTIGADOR:______________________________________________________ ______/______/_______

____________________________________________________ ASSINATURA DO INVESTIGADOR/CARIMBO

Tel p/ contato:_________________________________ E-mail: ______________________________________

155

MANUAL PARA APLICAÇÃO – ANEXO IIIG

O formulário deverá ser preenchido pelo médico responsável pelo acompanhamento ou

profissional de saúde indicado por ele. Os dados serão coletados dos pacientes

voluntários.

Os dados serão coletados durante o tratamento até o 25 º dia após o início da soroterapia. O preenchimento segue os seguintes passos:

1º Passo: Preencher o quadro superior direito com o número de protocolo na pesquisa e

número de prontuário do paciente.

2º Passo: Preencher o módulo de Identificação do Paciente (itens 1 a 8). 3º Passo: Preencher o módulo correspondente aos “Dados Complementares do Caso” (itens 9 a 14). Item “9”: anotar o número total de frascos de soro utilizados no

tratamento. Item “10”: data do início do tratamento.

4º Passo: Preencher o módulo “Eventos Adversos – Reações Precoces (24 horas) e

Tardias” (itens 15 e 16). Marcar com um “X” a interseção da coluna (dia) e linha

(manifestações relatadas). O período de observação vai do 1º ao 25º dia de tratamento,

aplicação do soro liofilizado.

Se necessário relatar outra manifestação encontrada nos espaços “Especificar” e “Observações”. 5º Passo: Preencher o módulo “Atendimento Hospitalar do Evento Adverso” (itens 17 a 20). 6º Passo: Preencher o módulo “Evolução do Caso” (itens 21

a 24). Marcar com um “X” como o caso evoluiu.

7º Passo: Preencher o módulo “Sinais e Sintomas Anteriores à Soroterapia (últimas 72 horas)” (itens 25 a 27). 8º Passo: Preencher o módulo “Antecedentes Pessoais” (itens 28 a 32). 9º Passo: Preencher o módulo “Dados do Investigador” (itens 33 e 34). 10º Passo: Após preenchimento encaminhar para o IBEx

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ANEXO IV

159

ANEXO V

FOLHA DE ROSTO - CONEP

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE … · fornecido pelo Ministério da Saúde...

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