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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E SENSIBILIDADE MICROBIANA DE BACTÉRIAS AERÓBICAS ISOLADAS DE PROCESSOS INFECCIOSOS DE

PACIENTES COM DOENÇAS HEMATOLÓGICAS DA FUNDAÇÃO HEMOAM.

CRISTINA MOTTA FERREIRA

MANAUS 2011

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CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E SENSIBILIDADE MICROBIANA DE BACTÉRIAS AERÓBICAS ISOLADAS DE PROCESSOS INFECCIOSOS DE

PACIENTES COM DOENÇAS HEMATOLÓGICAS DA FUNDAÇÃO HEMOAM

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador (a): Profª Dra. Maria das Graças do Vale Barbosa Co-orientador: Dr. Felipe Gomes Naveca

MANAUS 2011

Ficha Catalográfica

F383c Ferreira, Cristina Motta. Caracterização genética e sensibilidade microbiana das

bactérias aeróbicas isoladas de processos infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM / Cristina Motta Ferreira. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, 2011.

208 f. : il.

Tese de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em parceria com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas – UEA/FMT, 2011.

Orientadora: Profª. Dra. Maria das Graças do Vale Barbosa. 1. Bactérias aeróbicas. 2. ESBL. 3. Beta-lactamase. 4.

MRSA. 5. SCCmec. I. Título. CDU: 579.84

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FOLHA DE JULGAMENTO

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E SENSIBILIDADE MICROBIANA DE BACTÉRIAS AERÓBICAS ISOLADAS DE PROCESSOS

INFECCIOSOS DE PACIENTES COM DOENÇAS HEMATOLÓGICAS DA FUNDAÇÃO HEMOAM.


“Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.

Banca Julgadora:

___________________________________________ Profª. Maria das Graças Vale Barbosa, Dra.

Presidente

_________________________________________ Prof. Marcelo Cordeiro dos Santos, Dr.

Membro

________________________________________________ Prof. Henrique Manuel Condinho da Silveira, Dr.

Membro

____________________________________ Profª. Ivete de Araújo Rolland, Dra.

Membro

____________________________________

Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr. Membro

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DEDICATÓRIA

Dedico esta grande conquista primeiramente a DEUS Pai, por seu amor incondicional por mim. A Minha família: William, Guilherme e Gabriel. Aos meus pais: Cauby Braga Motta e Ana Leite Motta que sempre me incentivaram.

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AGRADECIMENTOS

Universidade do Estado do Amazonas e Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor

Vieira Dourado.

A SUFRAMA pelo suporte financeiro para custear as despesas do Programa de Pós-

Graduação.

A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas- FAPEAM.

A todos os pacientes que participaram desta pesquisa.

Aos servidores da Fundação HEMOAM.

Aos meus orientadores Maria das Graças Vale Barbosa e Felipe Gomes Naveca.

A Dra. Cíntia Mara Costa de Oliveira e equipe.

As minhas alunas do PAIC Mirela Andrade Neves e Andrea Laureano de Carvalho.

A minha equipe de plantão da Maternidade Moura Tapajós, por sua compreensão.

Aos servidores da Fundação de Dermatologia e Venereologia Alfredo da Matta.

A Dra. Leny Nascimento da Motta Passos, Dra. Nazaré Saunier, Dr. Rodrigo Leitão,

Fundação Sangue Nativo e todos os seus funcionários.

Aos meus coordenadores da Universidade Nilton Lins Maria das Graças da Costa

Alecrim e Raphael Borges.

A Conceição Tufic, Secretária do PPGMT, pelo seu carinho e paciência nesta longa

jornada.

A todos os professores e funcionários do curso de Doutorado em Doenças Tropicais

e Infecciosas. Obrigada pela paciência e esforço dedicado.

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EPÍGRAFE

“O grande barato da vida é olhar para trás e sentir orgulho da sua própria história”.

Carlos Drummond de Andrade

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RESUMO

Introdução: Espécies de estafilococos resistentes a meticilina, mundialmente disseminados tanto pelos hospitais como nas comunidades, e de bactérias gram-negativas resistentes aos beta-lactâmicos, ainda permanecem como um severo problema de saúde pública. Objetivo: Descrever a freqüência, sensibilidade a antibióticos e caracterização genética de bactérias patogênicas isoladas de processos infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM. Metodologia: Estudo transversal, descritivo, incluindo-se pacientes de ambos os sexos, qualquer faixa etária, admitidos na Fundação, dos quais foram coletadas amostras biológicas (urina, sangue, escarro, fezes, sangue de cateter, aspirado de medula, abscesso ocular, perianal, secreção de orofaringe, de nasofaringe, feridas e lesão de pele) no período de julho/2007 a agosto/2008. As espécies bacterianas foram identificadas através de testes bioquímicos padronizados de rotina, confirmadas pelo 16S rRNA e seqüenciamento. Nas bactérias gram-positivas a resistência a meticilina foi determinada pelos testes PBP2a e epsilométrico com cefoxitina e oxacilina. A detecção da presença do gene de resistência (MecA, SCCmec), origem dos isolados (comunitários ou hospitalares) e clones estafilocócicos foi realizada através de PCR e genotipagem. Nas bactérias gram-negativas, a determinação do fenótipo ESBL foi realizada através do teste epsilométrico. Os genes envolvidos na produção das ESBLs (TEM-, OXA-, SHV-, CTX-M-) foram identificados através de PCR. Resultados: De 146 amostras biológicas coletadas, foram isoladas 44 espécies bacterianas, sendo 17 gram-negativas e 27 gram-positivas. A doença hematológica mais freqüente foi leucemia linfocítica aguda e leucemia mielóide aguda. O protocolo molecular do 16S rRNA identificou como espécies bacterianas mais freqüentes Staphylococcus epidermidis, S. intermedius, S. aureus, Staphylococcus sp., E. coli, Serratia sp., Serratia liquefaciens e B. cepacia. Das 17 bactérias gram-negativas 12 foram produtoras da enzima ESBL e carrearam os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M and blaOXA. Das 27 bactérias gram-positivas, dez apresentaram perfil de resistência a meticilina, sendo nove estafilococos coagulase negativos e 01 S. aureus. Os cassetes cromossômicos mec (SCCmec) mais freqüentes foram os dos tipos I, III, e V . O MLST revelou a presença dos seguintes clones: S. aureus ST243 carreando o SCCmec tipo I, III, V; S. epidermidis ST2 carreando o SCCmec tipo II, III, V e de um novo clone de S. epidermidis ST365 carreando o SCCmec tipo I, III, V. Conclusão: A identificação dos clones de S.aureus ST243, S. epidermidis ST2 e ST365, nas espécies de estafilococos meticilina resistentes, e dos genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e blaOXA nos plasmídeos de cepas produtoras de ESBL, comprovam a presença de espécies bacterianas implicadas em processos infecciosos hospitalares. Estes achados servem como alerta para que sejam introduzidas ações para a redução da disseminação dessas linhagens clonais patogênicas, a fim de se evitar surtos de infecções hospitalares e óbitos, principalmente em pacientes imunodebilitados. Palavras-chave: ESBL, mecA, beta-lactamase, MRSA, SCCmec, ST365, ST243,S. epidermidis, S. aureus, infecção hospitalar.

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ABSTRACT

Introduction: Methicillin-resistant Staphylococci and Gram-negative bacteria, being spread worldwide, by both hospitals and in communities still remain as a severe public health problem. Objective: To describe the frequency, sensitivity to antibiotics and genetic characterization of pathogenic bacteria isolated from hematologic patients with infectious processes at the HEMOAM Foundation. Methods: We conducted a descriptive cross-sectional study including patients of both sexes at any age who had been admitted to the HEMOAM Foundation. A total of 146 biological samples such as of urine, blood, sputum, feces, catheter tip, bone marrow aspirate, and abscess fluid along with oropharyngeal, ocular, perianal, nasopharynx, open wound, and skin lesion secretions were collected in the period from July 2007 to August 2008. Bacterial strains identified by standard biochemical tests of laboratorial routine had their species confirmed by 16S rRNA protocols and sequencing. Resistance to methicillin for gram-positive strains was determined by PBP2a and epsolometric tests with cefoxitin/oxacillin. The presence of the resistance gene (mecA and SCCmec), origin of isolates (community/ hospital) and staphylococci clones was performed by molecular tests such as PCR and genotyping. The identification of the ESBL phenotype in gram-negative bacteria was performed by epsolometric test. The identification of the genes involved in the production of ESBLs (TEM-, OXA-, SHV-, and CTX-M-) was performed by molecular tests such as PCR. Bacterial resistance to antimicrobials used in routine therapy was performed using the E-test. Results: We isolated 44 bacterial strains from 146 biological samples of which, 17 were gram-negative and 27 gram-positive. The most frequent hematologic disease was acute lymphocytic leukemia and acute myeloid leukemia. Biochemical tests and 16S rRNA sequencing detected S. epidermidis, S. intermedius, S. aureus, Staphylococcus spp., E. coli, Serratia sp., Serratia liquefaciens and B. cepacia as the most frequent bacteria. 12 of the 17gram-negative bacteria were ESBL-producing and carried blaTEM, blaSHV, blaCTX-M and blaOXA genes. 10 of the 27 gram-positive bacteria were methicillin-resistant of which, nine were coagulase-negative staphylococci and one S. aureus. The most frequent cromossomal cassettes were SCCmec types I, III, V. MLST revealed the presence of the clones: S. aureus ST243 (SCCmec type I, III, V) , S. epidermidis ST2 (SCCmec tipo II, III, V) and new clone of the S. epidermidis ST365(SCCmec type I, III, V). Conclusion: The identification of S. aureus ST243 (SCCmec type I, III, V) clone, S. epidermidis ST2 (SCCmec type II, III, V), ST365 (SCCmec type I, III, V) clones and blaTEM, blaSHV, blaCTX-M , blaOXA genes in Gram-negative bacteria plasmids, proving the presence of pathogenic species implied in hospital infectious processes. These findings appear as an alert to introduce actions to reduce the spread of those pathogenic lineages of S. aureus and S. epidermidis to prevent hospital infection outbreaks as well as mortality risks, mainly for immune compromised patients. Keywords: ESBL, mecA, beta-lactamase, MRSA, SCCmec, ST365, ST243,S. epidermidis, S. aureus, nosocomial infection.

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LISTA DE FIGURAS- TESE

Figura 1 Árvore filogenética da vida de organismos com destaque em azul para o grupo das bactérias.......................................................................................... 1

Figura 2 Desenho esquemático da parede celular de Bactéria Gram-positiva.............. 3 Figura 3 Desenho esquemático da parede celular de Bactéria Gram-negativa............. 3 Figura 4 Desenho esquemático de gene mecA............................................................. 16 Figura 5 Classificação dos principais tipos de cassetes................................................ 17 Figura 6 Fluxograma dos procedimentos executados na realização do estudo............ 33

Figura 7 Imagem das fitas de cefinase plus utilizadas na realização do teste da beta-lactamase......................................................................................................... 37

Figura 8 Desenho esquemático das fitas utilizadas na realização do Etest ESBL com os gradientes de concentrações dos antibióticos CT e TZ e em associação com o inibidor, o ácido clavulânico.................................................................. 38

Figura 9 Imagem de detecção do fenótipo ESBL pelo método E-teste Fita com os gradientes de concentrações dos antibióticos TZ e em associação com o inibidor, o ácido clavulânico............................................................................. 39

Figura 10 Imagem do resultado do teste de suscetibilidade método E-teste para a detecção da MIC (concentração inibitória mínima).......................................... 40

Figura 11 Protocolos laboratoriais- Figura1 e 2- Imagem da fita de E-teste para ESBL com a escala em MIC aplicadas no meio de cultura....................................... 167

Figura 12 Protocolos laboratoriais- Padrões de inibição do crescimento- Fig 4 –corte ESBL positiva................................................................................................... 172

Figura 13 Protocolos laboratoriais- Padrões de inibição do crescimento- Fig 5 –zona fantasma.......................................................................................................... 172

Figura 14 Protocolos laboratoriais- Padrões de inibição do crescimento- Fig 6 –de formação da inibição da elipse......................................................................... 172

Figura 15 Protocolos laboratoriais- Padrões de inibição do crescimento- Fig 7 –resultado não determinado.............................................................................. 172

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LISTA DE TABELAS-TESE

Tabela 1 Meios de culturas de triagem para semeadura primária........................... 105 Tabela 2 Divisão dos cocos Gram positivos pela prova da catalase....................... 119

Tabela 3 Provas bioquímicas para identificação dos gêneros de Cocos Gram-positivos.................................................................................................... 113

Tabela 4 Identificação das espécies de cocos Gram-positivos catalase positivos.. 113 Tabela 5 Esquema para diferenciação de espécies de Cocos Gram-positivos....... 114 Tabela 6 Identificação de gênero e espécie bacteriana.......................................... 120 Tabela 7 Diferenciação das enterobactérias pelo Enterokit C................................ 124 Tabela 8 Características dos enteropatógenos da família Enterobacteriaceae nos

meios EPM-MILi........................................................................................ 128 Tabela 9 Glicose O/F............................................................................................... 130 Tabela 10 Valores das provas de oxidase e motilidade............................................ 133 Tabela 11 Valores das provas de OF/MC e morfologia............................................ 133 Tabela 12 Valores dos testes.................................................................................... 134 Tabela 13 Identificação de isolados Não fermentadores........................................... 135 Tabela 14 Valores das provas bioquímicas............................................................... 137 Tabela 15 Leitura e interpretação dos resultados da PBP 2a................................... 144 Tabela 16 Tipos de reação de aglutinação................................................................ 144 Tabela 17 Resultados do teste com 201 isolados clínicos frescos de S aureus de

quatro laboratórios.................................................................................... 146 Tabela 18 Guia para interpretação do Eteste ESBL.................................................. 156

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LISTA DE TABELAS- ARTIGO 1

Tabela 1 Frequency of hematologic diseases diagnosed in this study…………………. 58 Tabela 2 Primer sequence and PCR conditions…………………………………………… 57 Tabela 3 Gram-negative strains, ESBL phenotypes and genes detected from patients

with infections………………………………………………………………………. 60 Tabela 4 Antimicrobial Susceptibility test (E-test) for 17Gram-negative bacteria

isolated from patients with bacterial infection…………………………………… 61 Tabela 5 Strains isolated from different specimen type detected from patients with

infections……………………………………………………………………………. 58

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LISTA DE TABELAS- ARTIGO 2

Tabela 1 Strains isolated from patients with hematologic disease……………………… 74

Tabela 2 Phenotypes and genotypes profiles of the Staphylococcal strains isolated from patients with hematologic diseases……………………………………… 75

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Mecanismo de ação das drogas antimicrobianas......................................... 10 Quadro 2 Características diferenciais entre HA-MRSA e CA-MRSA........................... 22

Quadro 3 Protocolo de interpretação do Etest® ESBL............................................ 38 Quadro 4 Iniciadores mecA e SCCmec utilizados na reação.............................. 44 Quadro 5 Iniciadores das toxinas bacterianas utilizados na reação................... 46 Quadro 6 Iniciadores das ESBLs ........................................................................ 46

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ABREVIATURAS ATCC American Type Culture Collection CA-MRSA Community acquired methicillin resistant Staphylococcus aureus CLSI Clinical and Laboratorial Standard Institute CVI Complexo violeta-iodo ET-A Esfoliatin Toxin A ET-B Esfoliatin Toxin B ESBL Extended spectrum beta –lactamase HA- MRSA Hospital acquired methicillin resistant Staphylococcus aureus HA- MR-SCoN Hospital acquired methicillin resistant Staphylococcus sp. LOS Lipooligossacarídeo LUKPV ou PVL Panton Valentine Leucocidin MHC II Complexo de histocompatibilidade tipo II MIC Minimal inhibitory concentration Meio de cultura MIO Motilidade, Indol, Ornitina MRSA Methicillin- or oxacillin-resistant S. aureus MR-SCoN Methicillin- or oxacillin-resistant Staphylococcus sp. MSSA Methicillin- or oxacillin-sensitive S. aureus PBP 2a ou PBP 2' Penicillin-binding protein 2a or 2’ PCR Polymerase Chain reaction PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Phantom zone Zona fantasma SCCmec Staphylococcal chromosomal cassette mec SCoN Coagulase negative Staphylococci TSI Tríplice Açúcar Ferro

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1 1.1 Histórico .............................................................................................................. 1 1.2 Morfologia bacteriana........................................................................................... 2 1.3 Parede celular de bactéria gram-positiva............................................................. 2 1.3.1 Parede celular de bactéria Gram-negativa.......................................................... 3 1.4 Relações microbiota normal/parasita/hospedeiro................................................ 4 1.5 Patogenicidade e virulência bacteriana............................................................... 5 1.5.1 Patogenicidade de cocos Gram-positivos............................................................ 6 1.5.2 Patogenicidade de bastonetes Gram-negativos.................................................. 7 1.6 Drogas antimicrobianas....................................................................................... 8 1.6.1 Mecanismo de ação das drogas antimicrobianas................................................ 9 1.7 Resistência bacteriana aos antimicrobianos........................................................ 9 1.7.1 Resistência dos S aureus e Staphylococcus spp aos ß-lactâmicos.................... 12 1.8 Gene mecA......................................................................................................... 14 1.8.1 Complexo genético mec....................................................................................... 15 1.8.2 Complexo genético ccr e principais tipos de SCCmec........................................ 15 1.9 Staphylococcus spp hospitalares e comunitários................................................ 17 1.9.1 Prevalência dos estafilococos resistentes a meticilina........................................ 18 1.9.2 Processos infecciosos ocasionados por estafilococos resistentes a meticilina... 18 1.9.3 Cassetes cromossômicos e clones estafilocócicos............................................. 19 1.9.4 Características diferenciais entre HA-MRSA e CA-MRSA................................... 20 1.10 Prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de ESBLs........................ 21 1.10.1 Enzima Beta-Lactamase...................................................................................... 23 1.10.2 Classificação das Enzimas Beta-Lactamases..................................................... 24 1.10.3 Beta-Lactamase de espectro estendido (ESBL).................................................. 25 1.10.4 Subtipos de enzimas (ESBL)............................................................................... 26 1.10.5 Importância Clínica das ESBL............................................................................. 27 1.10.6 Preocupações relativas às infecções bacterianas............................................... 28 2 OBJETIVOS......................................................................................................... 31 2.1 Geral..................................................................................................................... 31 2.2 Específicos........................................................................................................... 31 3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 32 3.1 Delineamentos...................................................................................................... 32 3.2 População de estudo............................................................................................ 32 3.3 Amostragem......................................................................................................... 32 3.4 Critérios de inclusão............................................................................................. 34 3.5 Critérios de exclusão............................................................................................ 34 3.6 Solicitação de exame bacteriológico.................................................................... 34 3.6.1 Pacientes hematológicos imunodeprimidos......................................................... 34 3.6.2 Fatores de baixo risco para complicação............................................................. 35 3.7 Coleta de amostra biológica................................................................................. 35 3.8 Cultura, isolamento e identificação de bactérias isoladas.................................... 35 3.9 Teste da beta-lactamase...................................................................................... 36 3.9.1 Teste da beta-lactamase de espectro estendido (ESBL)..................................... 36

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3.9.2 Teste de suscetibilidade antimicrobiana............................................................... 39 3.9.3 Teste da PBP 2a.................................................................................................. 40 3.9.4 Caracterizações moleculares............................................................................... 40 3.9.4.1 Extração do DNA Total Bacteriano e Quantificação........................................... 40 3.9.4.2 Extração do DNA plasmidial................................................................................ 41 3.9.4.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR)............................................................ 42 3.9.4.3.1 Para o gene 16S rRNA........................................................................................ 42 3.9.4.3.2 PCR em tempo real (q-PCR) para o gene mecA................................................ 44 3.9.4.3.3 Gene mecA........................................................................................................... 43 3.9.4.3.4 Tipos de SCCmec................................................................................................ 45 3.9.4.3.5 Genes seh, etd, arcA e LUKPV das toxinas bacterianas.................................... 45 3.9.4.3.6 Genes das Beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs)............................. 46 3.9.4.3.7 Genotipagem para identificação dos clones bacterianos..................................... 47 3.10 Purificação pré-sequenciamento.......................................................................... 48 3.11 Precipitação do DNA com Isopropanol/etanol...................................................... 48 3.12 Sequenciamento................................................................................................... 49 3.13 Controle de Qualidade.......................................................................................... 49 3.14 Armazenamentos de amostras............................................................................. 50 3.15 Análise de Dados................................................................................................. 50 3.16 Fontes de financiamento (Nacionais e/ou Internacionais)................................... 50 4. RESULTADOS..................................................................................................... 51 4.1 Artigo 1................................................................................................................. 52 4.2 Artigo 2................................................................................................................. 71 5. DISCUSSÃO........................................................................................................ 80 6 CONCLUSÃO...................................................................................................... 83 7 REFERÊNCIAS.................................................................................................... 85 8 ANEXOS............................................................................................................... 103 8.1 Anexo 1-TCLE...................................................................................................... 103 8.2 Anexo 2- Protocolo médico/laboratorial................................................................ 105 8.3 Anexo 3- Protocolos laboratoriais......................................................................... 107

1

1 INTRODUÇÃO 1.1 Histórico

As bactérias são os organismos mais antigos, procariontes, constituídos por

uma célula, sem organelas e núcleo celular, encontradas na forma isolada ou em

colônias, pertencentes ao Domínio homônimo Bactéria. Foram descobertas por

Antoni van Leeuwenhoek em 1683 após observar resíduos de seus próprios dentes

e de outros materiais ao microscópio (3 ,5 ,59, 122).

No final do século XIX, as bactérias passaram a despertar o interesse de

muitos cientistas após Louis Pasteur e Robert Koch descreverem o seu papel como

vetores de várias doenças e a demonstração da origem bacteriana de diversas

doenças como o tifo, lepra e gonorréia (3 ,5 ,98, 122).

Atualmente as bactérias compõem um dos três domínios do sistema de

classificação cladístico. Inicialmente foram classificadas entre as plantas por Lineu e

agrupadas como fungos. Em 1866, Ernst Haeckel as inseriu no reino Protista (Figura

1). Em 1969 foram incluídas entre os procariotas no reino Monera por Whittaker. Em

1977, Carl Woese dividiu os procariotas em dois grupos, com base nas seqüências

“16S” do rRNA, que denominou de Eubacteria e Archaebacteria, e mais tarde,

renomeados pelo mesmo para Bacteria e Archaea devido as mesmas formarem

domínios separados com origem e evolução separadas a partir de um organismo

primordial (3 ,5 ,59, 122, 132,143).

Fonte: http://nai.arc.nasa.gov/news_stories/news_detail.cfm?ID=274.

Figura 1 – Árvore filogenética da vida de organismos, com destaque em azul para o

grupo das bactérias

http://nai.arc.nasa.gov/news_stories/news_detail.cfm?ID=274

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1.2 Morfologia Bacteriana Morfologicamente as bactérias estão classificadas de acordo com a forma da

célula em cocos, bacilos, vibriões, espirilos, espiroquetas e, quanto ao grau de

agregação, os cocos podem se apresentar de forma isolada, aos pares (diplococos),

ligados em cadeias (colar), forma de cachos, cúbica (sarcina), bacilos aos pares e

alinhados em cadeia. Já os bacilos podem se dividr ao longo de seu eixo curto;

assim, existem menos grupamento de bacilos que de cocos. A maioria deles se

apresenta isolados. Os diplobacilos aparecem após a divisão e os estreptobacilos

ocorrem em cadeias (127,142).

1.3 Parede celular de Bactéria Gram-positiva Na maioria das bactérias Gram-positivas a parede celular é constituída por uma

espessa camada de peptideoglicano, ácido teicóico que se divide em ácido

lipoteicóico, atravessa a camada de peptideoglicano e se liga a membrana

plasmática, e o ácido teicóico da parede celular, ligado à camada de peptideoglicano

(Figura 2) (18, 129,142).

O principal componente da parede é o peptideoglicano, um polímero de longas

cadeias de glicídio com ligações cruzadas flexíveis de peptídeos formando uma

estrutura forte, em forma de rede ao redor da bactéria. Esta rede é formada por

dissacarídeo denominado de N-acetilglucosamina e ácido N-acetil murâmico, ligado

ao peptídeo L-lisina,D-alanina, L-alanina, D-glutamina, que permite a ligação

cruzada com um grupamento de pentaciclinas. Reação de transpeptidação une os

peptídeos enquanto que os dissacarídeos são polimerizados ao longo da cadeia de

glicano por meio de reação de transglicolização. O processo da ligação cruzada é

catalisado pelas enzimas transpeptidases, as proteínas ligadoras de penicilina

PBPs(18, 129, 142).

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Fonte: http://vsites.unb.br/ib/cel/microbiologia/morfologia1/pcgpos.gif

Figura 2 – Desenho esquemático da parede celular de Bactéria Gram-positiva

1.3.1 Parede celular de Bactéria Gram-negativa

Consiste de uma fina camada de peptideoglicano e membrana externa. O

peptideoglicano está ligado a lipoproteínas e fosfolipídeos na membrana externa e

localiza-se no periplasma, um espaço fluido entre a membrana externa e membrana

plasmática (Figura 3) (129, 142).

A membrana externa possui o lipopolissacarídeo (LPS) formado por uma porção

lipídica denominada de lipídeo A (endotoxina) e pelo açúcar polissacarídeo “0” que

atua como antígeno (121,142). Algumas bactérias Gram-negativas possuem lipo-

oligossacarídeos (LOS) e não LPS em suas paredes celulares (46, 147). O LOS contêm

lipídeo A e um oligossacarídeo central sem antígeno O, polissacarídeo de cadeia

longa como o encontrado no LPS de bactérias entéricas (22).

Figura 3 – Desenho esquemático da parede celular de bactéria Gram-negativa

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A técnica de coloração do Gram desenvolvida por Hans Christian Joacquin Gram

em 1884, beneficiou a microbiologia, pois classificou as bactérias em dois grandes

grupos: Gram-positivas e Gram-negativas (78,142). Esta técnica baseia-se na

composição química e integridade da parede celular das duas bactérias e,

dependendo da cor que adquirirem, são classificadas em Gram-positivas (coradas

em roxo) e Gram-negativas (vermelho) (78,142).

As características estruturais da parede bacteriana compõem a base da técnica

que funciona da seguinte forma: Ao se adicionar o corante primário cristal violeta e o

mordente lugol, ambos se combinam no citoplasma de cada bactéria e as coram de

violeta escura ou púrpura, formando um complexo grande denominado de complexo

violeta-iodo (CV-I) ou iodopararrosanilina (78, 127, 142).

Ao se proceder a descoloração com álcool-acetona, devido ao fato de a parede

celular das Gram-positivas possuírem uma espessa camada de peptideoglicano, o

complexo CV-I não é arrastado e permanece intacto na mesma. Já nas Gram-

negativas, devido o peptideoglicano ser constituído por apenas uma fina camada, o

complexo CV-I é arrastado tornando a bactéria incolor (78,127,142).

Procede-se então a coloração de fundo com o contracorante safranina para que

possa tingir as estruturas incolores, permanecendo as já coradas da mesma cor. As

bactérias descoradas absorvem a safranina tornando-se assim vermelhas. Por isso,

as bactérias Gram-negativas coram-se em vermelho e as Gram-positivas em azuis (78,127,142).

1.4 Relações microbiota normal/parasita/hospedeiro

Os agentes etiológicos de doenças infecciosas humanas pertencem a cinco

grupos principais de organismos: bactérias, fungos, protozoários, helmintos e vírus,

os quais possuem características fenotípicas e genotípicas essenciais que facilitam

sua identificação (21, 36, 110, 127, 132). Esses agentes podem co-existir em conjunto com

o hospedeiro (127) beneficiando-o, impedindo assim o crescimento de microrganismos

nocivos. Tal relação é denominada de antagonismo microbiano, pois envolve uma

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competição entre as bactérias da microbiota normal do corpo humano e os

microrganismos nocivos (138, 142).

A microbiota normal, cuja função é a manutenção da saúde corporal do

hospedeiro, compete com tais microrganismos por nutrientes, produzindo

substâncias nocivas aos mesmos, afetando o pH da pele, produzindo bacteriocinas

e alterando, até mesmo o oxigênio disponível, objetivando assim evitar a

colonização por agentes patogênicos. A microbiota normal do hospedeiro coloniza

os olhos, pele, trato gastrointestinal, trato genito-urinário e nariz de ambos os sexos.

Isto pode ocorrer de forma saprofítica, comensal, mutualística ou parasitária,

podendo haver uma relação de cooperação entre os microrganismos ( 78, 127, 142).

Em algumas situações esta cooperação pode ocasionar doenças ao hospedeiro.

Certas espécies de estreptococos patogênicos utilizam os seus receptores de

adesão não para se fixar aos dentes, mas sim em outros estreptococos orais,

ocasionado assim processos infecciosos como gengivites e doenças periodônticas

ao hospedeiro (78, 142).

1.5 Patogenicidade e virulência bacteriana

A virulência dos microrganismos não é atribuída somente a um fator único,

mas sim a vários fatores que estão relacionados ao organismo, hospedeiro e

interação entre os mesmos. A virulência envolve a infectividade do microrganismo e

a gravidade da condição produzida. A capacidade de virulência entre as cepas pode

ocorrer numa mesma espécie ou em um determinado grupo de microrganismos

considerados patogênicos. A capacidade de um microrganismo de causar doença

envolve tanto fatores microbianos como do hospedeiro. Os microrganismos

desenvolvem respostas adaptativas geneticamente modificadas a fim de lhes

proporcionar versatilidade, sobrevivência e desenvolvimento em ambientes hostis (127).

As bactérias desenvolveram métodos que as auxiliaram a captar alterações

no ambiente externo e a expressar seus genes envolvidos nas respostas

adaptativas. Quando a população atinge um determinado limiar, há um auto-indutor

6

suficiente que ativa os fatores de transcrição na célula e expressam os genes de

fatores de virulência, mecanismo este denominado de “sensores em quórum” (47,

127, 100).

Os fatores de virulência possibilitam as bactérias causar danos ao

hospedeiro. Alguns deles estão associados a células ou podem ser extracelulares,

ou então, fazerem parte da composição anatômica ou fisiológica da célula. Dentre os

diversos fatores de virulência das bactérias podem-se citar as adesinas (auxiliam na

adesão às células do hospedeiro como as proteínas ligadoras de colágeno, de

aderência extracelular, de ligação a fibronectina e fator de aglutinação), agressinas

(incluem cápsulas, substâncias viscosas extracelulares, proteínas, carboidratos de

superfície e outras pequenas moléculas) (78,127,142), toxinas (síndrome do choque

tóxico estafilocócico-TSST-1(19,20), enterotoxina, toxina da síndrome da pele

escaldada (125), endotoxinas, exotoxinas (78,127,142) e enzimas (hialuronidase,

estafiloquinase, estreptoquinase(109), coagulase (54,133), lipase, hemolisinas (40),

proteases, leucocidinas como a Panton Valentine(71), determinantes de superfícies e

de resistência, responsáveis pela patologia ocasionada pelas mesmas.

1.5.1 Patogenicidade de Cocos Gram-positivos

O gênero Staphylococcus é composto por diversas espécies, muitas das

quais podem ser encontradas em amostras biológicas humanas. Dentre elas a mais

importante é o Staphylococcus aureus. Apesar de fazerem parte da microbiota

normal humana, as espécies de estafilococos podem produzir infecções oportunistas

significativas em condições apropriadas (78,127,142). Estas espécies possuem vários

fatores de virulência como polissacarídeos capsulares, peptideoglicano, ácidos

teicóicos, proteína A, hemolisinas como a Panton Valentine (71), toxinas (esfoliatina

(ET-A e ET-B) (136), enterotoxinas (A, até E, H e I) (69) e superantígenos bacterianos

(enterotoxinas estafilocócicas, TSST-1,exotoxinas pirogênicas estafilocócicas (SPE

A, B, C, F, G, H e J) e principalmente biofilmes (19, 78,142).

A superantigenicidade se refere à capacidade das toxinas de estimularem a

proliferação maciça de células T, sem relação com a especificidade antigênica das

mesmas. Ocorre uma indução da proliferação de células T policlonais após a ligação

7

do MHC II de uma célula apresentadora de antígeno com os receptores de células T

e a porção variável da cadeia ß (beta) do receptor de antígenos das células T.

Ocorre então uma liberação maciça de citocinas produzindo os sintomas da TSST-1

que incluem febre, exantema, descamação, hipotensão, comprometimento

gastrintestinal, muscular, das mucosas, renal, hepático, hematológico e sistema

nervoso central. Algumas toxinas como a Panton-Valentine e a TSST-1 também

podem ser produzidas pelos estafilococos coagulase negativos (127,142).

A ação da Panton-Valentine, leucotoxina formadora de poro de membrana,

inicialmente conhecida como substância leucocidina por Van deVelde em 1894, por

sua capacidade de lisar leucócitos, ocorre através da liberação de dois componentes

pertencentes as classes proteína S (LukS-PV) e proteína F (LukF-PV); antes de se

tornarem um heptâmero formador de poros de membrana nos leucócitos

polimorfonucleares (PMNs). Quando o LukS-PV se liga aos PMNs sofre fosforilação

pela proteína quinase do hospedeiro (A ou C) através da indução dos canais de íons

cálcio. Ocorre a indução do sinal de eventos de transdução que levam a liberação de

interleucinas e mediadores inflamatórios. Dependendo da concentração da PVL,

pode ocorrer lise dos PMNs ou apoptose, sendo que esta última pode envolver a

formação de poros na membrana mitocondrial (21).

Tanto os Staphylococcus aureus quanto os Staphylococcus spp. podem

ocasionar uma variedade de processos patogênicos como furúnculos, carbúnculos,

impetigo, mastite, hidradenite supurativa, infecções de feridas, meningite,

pericardite, osteomielite, piomiosite, intoxicação alimentar, síndrome da pele

escaldada, síndrome do choque tóxico, bacteremia, endocardite, infecções

pulmonares e artrite séptica (127,142).

1.5.2 Patogenicidade de Bastonetes Gram-negativos

As bactérias Gram-negativas pertencentes às Enterobacteriaceae estão

amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas no solo, na água, em

vegetais e no trato intestinal humano. Os membros da família Enterobacteriaceae

podem ser agentes patológicos de qualquer tipo de doença infecciosa e isolados de

8

qualquer tipo de amostra recebida no laboratório. Os pacientes debilitados ou

imunocomprometidos são altamente suscetíveis às infecções hospitalares após

serem colonizados por cepas ambientais, ou por processos invasivos como

cateterismo ou biópsias cirúrgicas após as mucosas serem traumatizadas (128,142).

Quando os mecanismos de defesa do hospedeiro são anulados devido a

causas não-infecciosas subjacentes ou então devido a intervenções diversas como

neoplasisas, terapia imunossupressora ou diabetes, os microrganismos da própria

flora (endógenos) podem ocasionar processos patológicos como uma nova resposta

adaptativa ao seu hospedeiro (127,142).

Estas espécies podem produzir vários fatores de virulência como as

endotoxinas (lipopolissacarídeo-LPS e lipooligossacarídeos-LOS), exotoxinas

(exotoxina A), toxinas (enterotoxinas termolábel ou termoestável), viscosidade

extracelular, leucocidina, proteases (IgA), fosfolipases, enzimas, fímbrias (Pili) (1),

PorI-PorA/PorB, proteínas Opa (proteína II) (53), proteína Rmp, cápsulas, plasmídeos (6), hemaglutininas (127, 94).

As bactérias Gram-negativas podem ocasionar uma série de doenças

dependendo do tipo de tecido que podem infectar como feridas, infecções urinárias,

infecções de garganta, meninigite, infecções de ouvido, septicemias, disenterias,

gastrenterites, síndrome similar ao choque tóxico estafilocócico e bacteremias (127,142).

1.6 Drogas antimicrobianas Os antimicrobianos conhecidos como antibióticos, são produtos químicos

produzidos por microrganismos ou sinteticamente, podendo ter diferentes espectros

de ação. Os antibióticos de estreito espectro, são aqueles que agem somente

contra determinados tipos de bactérias (penicilina G, glicopeptídeos, macrolídeos,

nitrofurantoína, metronidazol, aztreonam, ácido nalidíxico e fosfomicina), enquanto

que os de largo espectro, afetam amplo número de bactérias como as Gram-

positivas e Gram-negativas (carbapenêmicos,cefalosporinas,ß-lactâmicos e

9

combinações de inibidores de ß-lactâmicos e fluoroquinolonas). Estes antibióticos

geralmente são utilizados num processo infeccioso no qual o patógeno não é

imediatamente conhecido. Os antibióticos também podem se classificar como

bactericidas (destroem os patógenos) ou bacteriostáticos (inibem o crescimento

do patógeno) (95, 109, 127,142).

1.6.1 Mecanismo de ação das drogas antimicrobianas

As drogas antimicrobianas agem através de diferentes mecanismos de ação:

inibição da síntese da parede celular, inibição das β-lactamases bacterianas, dano

a membrana citoplasmática, inibição da síntese protéica, inibição da síntese de

ácido nucléico e inibição da síntese de metabólitos essenciais (quadro 1) (95, 96, 126,

142).

1.7 Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos

As bactérias existem há milhões de anos e os mecanismos de defesa

desenvolvidos pelas mesmas, contra o ataque de outras bactérias, também são

utilizados para os antibióticos. Os mecanismos de resistência microbiana são

complexos, variados, não completamente conhecidos, que existem antes mesmo da

introdução dos antibióticos. Surgiram devido a mutações dos genes microbianos e

pela aquisição de genes oriundos de fontes externas. O surgimento de múltiplas

espécies bacterianas resistentes aos agentes antimicrobianos ainda constitui um

sério problema para os clínicos. Muitos fatores contribuíram para o aparecimento de

isolados multiresistentes, dentre eles o uso indiscriminado de antibióticos, elevação

da população de risco, pacientes imunodebilitados, tempo de internação prolongado

de pacientes portadores de doenças crônicas debilitantes nos hospitais, enfermarias,

Unidade de Terapia Intensiva (UTI), falhas nas práticas de controle de infecção e

creches (34, 44).

10

Quadro1. Mecanismo de ação das drogas antimicrobianas

Agente antimicrobiano Mecanismo de ação

β-lactâmicos (penicilinas) e β-lactâmicos

semi-sintéticos (meticilina,nafcilina,

oxacilina), cefalosporinas, imipenem,

aztreonam, vancomicina,bacitracina.

Ácido clavulânico (adicionado ao β-

lactâmico amoxacilina)

Inibição da síntese da parede celular Inibe na parede celular a síntese

do peptideoglicano e mureína.

Inibição das β-lactamases (penicilinases) Inibe as enzimas β-lactamases bacterianas

cloranfenicol, clindamicina, eritromicina

aminoglicosídeos e tetraciclinas

Inibição da síntese protéica Age na subunidade ribosomal 50S

Age na subunidade ribosomal 30S

Quinolona, ciprofloxacina, rifampicina Inibição da síntese de ácidos nucléicos Inibe a síntese de DNA

Inibe a síntese de mRNA

Análogo ao fator de crescimento

(sulfanilamida, acetil sulfisoxazol,

trimetoprima

Inibição da síntese de metabólitos essenciais Inibe o metabolismo do ácido fólico (anti-

folato)

Polimixina Dano a membrana citoplasmática Fonte: (Tenover 2006 (126), Winn et al. 2008 (142))

A resistência bacteriana pode se expressar de forma constitutiva, quando é

produzida pela bactéria independentemente da presença da droga, ou ser induzida,

quando é produzida após a exposição da bactéria a droga, como por exemplo, a

enzima beta-lactamase que hidrolisa o antibiótico. A resistência também pode ser

adquirida. Neste caso podem ocorrer alterações mutacionais no genoma bacteriano

ou serem adquiridos materiais genéticos codificados transferidos por conjugação

como plasmídeo, transposon ou seqüências de inserção (31, 44, 127).

Os plasmídeos contêm genes de resistência a uma ampla variedade de

antibióticos, portanto, a sua transferência horizontal (ou lateral) entre bactérias não

importando a espécie, pode acarretar na aquisição de vários determinantes de

11

resistência tornando a espécie resistente a vários tipos de antimicrobianos. A

transferência horizontal é responsável pela disseminação de numerosos

determinantes de resistência antimicrobiana entre as bactérias, o que justifica a

rápida disseminação dos genes de resistência (31, 44). Ela pode ocorrer por:

a) conjugação- requer contato entre as células, sendo um processo no qual

os plasmídeos ou transposons são trasnferidos do doador para o receptor.

b) Transformação- envolve a captura e incorporação do DNA nú.

c) Transdução- quando o DNA do hospedeiro é transferido via bacteriófago,

que age como vetor para sua injeção na célula receptora. A transdução é

um mecanismo extremamente importante de transferência genética entre

as bactérias resistentes aos antibióticos (142).

Os mecanismos de resistência residem em três categorias: a) inativação

enzimática (beta-lactamases); b) receptores alterados (alterações nos ribossomas,

na DNA girase ou enzimas bacterianas alteradas); c) alteração do transporte de

antibióticos (diminuição da força motriz da proteína, alterações nas proteínas da

membrana externa (porinas) e o transporte ativo por células bacterianas) (31,143).

Dentre os citados, o mecanismo de modificação do alvo é utilizado por um grande

número de espécies bacterianas contra uma ampla variedade de antibióticos, sendo

o de indução ou inativação enzimática o mais predominante (31).

Como as drogas β-lactâmicas são amplamente utilizadas devido a sua

elevada efetividade, baixo custo e mínimo efeito colateral, o alvo dos antibióticos β-

lactâmicos nas espécies de estafilococos reside nas quatro proteínas nativas PBP,

envolvidas na síntese da parede celular bacteriana. As bactérias resistentes inativam

os β-lactâmicos por três mecanismos primários (16, 126, 141):

1˚ Pelas β-lactamases, que são enzimas produzidas por um largo grupo de

bactérias Gram-positivas e negativas, que inativam os β-lactâmicos pela

hidrólise do anel β-lactâmico.

2˚ Pela aquisição da proteína ligadora de penicilina 2a (PBP2a) de baixa

afinidade ou alteração do alvo do antibiótico.

3˚ Evitando o acesso do antibiótico ao seu alvo pela alteração da

permeabilidade da parede ou por efluxo.

12

Os mecanismos 1 e 2 estão relacionados entre si e podem co-existir na

mesma célula (16, 80).

1.7.1 Resistência dos S. aureus e Staphylococcus spp. aos ß-lactâmicos A resistência bacteriana dos estafilococos aos antibióticos ainda continua

sendo um desafio para a terapia, tanto em infecções nosocomiais quanto as

adquiridas na comunidade. Nos Estados Unidos, dois milhões de pessoas são

acometidas por infecções e 60% delas, são ocasionadas por bactérias resistentes a

antibióticos. A resistência dos estafilococos a oxacilina, antibiótico atualmente

utilizado como representante da classe PPR (oxacilina, meticilina, nafcilina,

cloxacilina, dicloxacilina), deve-se a expressão da proteína PBP 2a ou PBP 2’,

ausente nos Staphylococcus spp. sensíveis a oxacilina. O outro mecanismo de

resistência é pela produção da enzima beta-lactamase (β-lactamase) que hidrolisa o

antibiótico (108, 115).

Os Staphylococcus spp. sensíveis a meticilina, possuem cinco PBPs, que são

enzimas que se localizam na parede celular bacteriana e catalisam a etapa final de

formação da mesma. As proteínas ligadoras de penicilina 1, 2, 3, 3’,4 tem afinidade

por antibióticos β-lactâmicos. A resistência a meticilina é derivada da produção de

uma PBP adicional denominada de PBP 2a ou PBP 2’, que possui baixa afinidade

por drogas β-lactâmicas, sendo codificada pelo gene mecA (115).

Além da alteração na PBP 2a, os Staphylococcus spp podem apresentar mais

dois mecanismos interagindo entre si, como a hiperprodução de β-lactamases

(BORSA) e modificações na capacidade de ligação das PBPs (MODSA). Entretanto,

o fato de portar o gene não significa que a bactéria seja resistente, pois ele pode ter

um baixo nível de expressão e assim, o desenvolvimento da resistência bacteriana,

fica dependente do modo e do nível de expressão desse gene (42, 81, 105, 108, 115).

As β-lactamases dos estafilococos são enzimas codificadas por plasmídeos

extracelulares, que podem ser dividas em quatro tipos, de A até D. Diferem das β-

lactamases das bactérias Gram-negativas por serem expressas em altos níveis na

13

presença dos indutores, exceto o tipo D, como penicilina ou seus análogos. A

expressão do gene blaZ das β-lactamases está sob o controle de dois genes

regulatórios adjacentes, o indutor blaRI e o gene repressor blaI. A inibição ocorre

quando o produto do gene blaI liga-se ao operador do gene estrutural blaZ,

ocorrendo então o bloqueio da transcrição do gene. A transcrição ocorre quando o

produto de clivagem do BLAR1 cliva a proteína blaI permitindo que o gene seja

transcrito (112, 113).

Alguns genes independentes do lócus mec, denominados de fem (fatores

essenciais para a expressão de resistência) contribuem para a resistência aos β-

lactâmicos. Estão presentes no cromossomo dos Staphylococcus spp. resistentes a

meticilina. Dois genes, femA e femB, estão envolvidos na formação da ligação

cruzada dos precursores da cadeia de petideoglicano. A disfunção de um dos dois

diminui o conteúdo de glicina nos precursores do peptideoglicano e confere

suscetibilidade a é necessária para elevar a atividade autolítica nos isolados que

possuem o gene mecA (57, 67, 130). meticilina. A presença do femA

Os Staphylococcus spp muitas vezes expressam resistência heterogênea,

significando que seu crescimento em presença dos antibióticos β-lactâmicos,

seleciona subclones altamente resistentes em uma população com MICs baixos

para meticilina. A causa da heteroresistência são fatores cromossômicos cuja

atividade afeta o nível da resistência. Isto pode ocasionar erros laboratoriais nos

testes convencionais de cultura, podendo as mesmas serem diagnosticadas como

isolados MSSA e assim, tornarem-se um reservatório nos ambientes hospitalares (39,

42, 107, 115, 117).

Nos S. aureus e Staphylococus coagulase negativa (SCoN), o gene de

resistência a meticilina denominado de mecA, localiza-se em um elemento genético

móvel denominado de cassete cromossômico estafilocócico mec (SCCmec) (42, 91, 93,

99, 106, 111), e nos S. aureus, está integrado em seu cromossomo em um único sítio

(attBscc) próximo a origem de replicação (55), possuindo baixa afinidade por β-

lactâmicos e sem relação com as β-lactamases (81).

14

1.8 Gene mecA O gene mecA é altamente preservado entre as espécies de estafilococos. O

mecanismo responsável pela sua transferência horizontal do S. epidermidis para o

S. aureus ou entre as espécies Gram-positivas ainda é desconhecido (55). O mesmo

pode ter se originado do Staphylococcus sciuri, possivelmente uma espécie

ancestral, e posteriormente ter sido transferido para as outras espécies (S.

epidermidis e S. aureus). O gene mecA pode ser um gene nativo no S.sciuri que

possivelmente originou o mecA no S. aureus. Evidências genéticas demonstram que

a pbpD do S.sciuri foi o precursor evolucionário do gene mecA do S.aureus. A

proteína codificada pela pbpD tornou-se conhecida como PBP4, uma das seis PBP’s

detectadas no S.sciuri. Esta proteína possui algumas propriedades bioquímicas

semelhantes a PBP2a do S. aureus relacionada com a resistência aos antibióticos ß-

lactâmicos (7, 33,146).

A expressão gênica do mecA pode ter dois fenótipos: induzível ou

constitutivo. O fenótipo induzível possui um lócus regulatório com os genes mecI e

mecRI, homólogos aos genes reguladores blaI e blaRI que regula a produção das β-

lactamases. Os genes reguladores bla ou mec regulam a produção da PBP 2a e β-

lactamase devido ao alto grau de homologia dos dois sistemas (28,85).

Os isolados com disfunção na região regulatória dos genes mecI e mecRI ,

expressam o mecA constitutivamente, pois o BlaR1 é um forte indutor do mecA e

BlaI fraco repressor. Entretanto, nos isolados clínicos a regulação é feita pelo gene

bla devido a deleções e mutações que ocorrem no gene mecI responsável pela

repressão. Cepas com estas características são muito importantes porque são

desreprimidas lentamente dificultando a detecção da resistência, necessitando até

de 48hs para se expressar totalmente. O BlaR1 e o BlaI são capazes de controlar a

expressão da PBP2a quando os genes mecR1 e o mecI estão desativados. As

classes mec são definidas pelo rearranjo dos genes adjacentes ao mecA (16,59, 78).

Igualmente ao S. aureus, a resistência a oxacilina no S.epidermidis é derivada

da produção de uma PBP 2a alternativa, codificada pelo gene mecA (120), que possui

15

homologia entre os MRSA e MR-SCoN, indicando que o mesmo pode ser

proveniente dos Staphylococcus sp. (28, 65). O gene mecI reprime o mecA e auto-

reprime a transcrição do mecR1 e mecI, através da ligação do promotor-operador

(OP). A repressão da transcrição do mecA pelo mecI, faz com que a cepa torne-se

suscetível a drogas ß-lactâmicas, devido a ausência da produção de PBP 2a. A

inativação por deleção, faz com que a mesma expresse altos níveis de resistência

(65, 140).

1.8.1 Complexo genético mec Três classes principais do complexo genético mec foram identificadas. O

protótipo mec (classe A) é composto pelo mecA, seus genes reguladores

mecR1(gene do sinal transdutor), mecI (gene repressor) (120) intactos e a seqüência

de inserção IS431: classe A- IS431- mecI- mecR1- mecA- IS431. No complexo

classe B o domínio PB do mecR1 e o gene completo mecI estão truncados por uma

cópia parcial de IS272: classe B- IS272- ΔmecR1- mecA- IS431. Já o complexo C

possui duas variantes, C1 e C2. Na classe C1 o domínio PB do mecR1 e todo o

mecI estão truncados pelo IS431, e na classe C2, os domínios MS e PB do mecR1

e do mecI estão truncados por IS431: classe C- IS431- ΔmecR1- mecA-IS431. Na

classe D o mecI está deletado e o domínio PB do mecR1 truncado:Classe D- ΔmecR1- mecA- IS431 (65, 78). O complexo mec mais prevalente e disseminado

possui a estrutura mecI-mecR1-mecA-IS431R (IS431mec) (68, 140).

1.8.2 Complexo genético ccr e principais tipos de SCCmec O complexo genético ccr é composto por um ou dois genes recombinases

sítios-específicos, responsáveis pela mobilidade do SCCmec. O SCCmec é

integrado no sítio genômico attBscc localizado na sequência aberta de leitura orfX

(open reading frame) com função desconhecida (17). O gene ccr catalisa a excisão e

integração do elemento SCCmec. Atualmente três foram identificados: ccrA, ccrB,

ccrC (Figura 4) (17, 64).

16

Fonte: Hussain et al. 2001.

Figura 4 – Desenho esquemático de gene mecA

As enzimas ccrA, ccrB estão classificadas em quatro alótipos: ccrA1 e ccrB1

(carreados pelo SCCmec tipo-I), ccrA2 e ccrB2 (carreado pelo SCCmec tipo-II e

SCCmec tipo-IV), ccrA3 e ccrB3 (carreados pelo SCCmec tipo-III), ccrA4 e ccrB4

(carreado pelo SCCmec tipo-VI). O gene ccrC foi identificado pelo SCCmec tipo-V

ou elemento SCC (17, 64).

O cassete estafilocócico cromossômico (SCCmec) classifica-se conforme a

combinação do complexo genético mecA e as recombinases do cassete

cromossômico ccr (17, 29, 83). O complexo genético ccr codifica as recombinases

responsáveis pela mobilidade do SCCmec (17, 98).

As partes remanescentes do SCCmec são denominadas de região J (região

J1, J2, J3), componentes não essenciais do cassete que podem carrear

determinantes de resistência aos antibióticos. Variações nessas cadeias são

utilizadas para definir os subtipos de SCCmec (17, 87). A estrutura do SCCmec pode

ser resumida em: J1-ccr-J2-mec-J3 (87). Até o presente momento seis tipos de

SCCmec foram descritos (Figura 5).

Isolados sensíveis a meticilina (MSSA) tornam-se resistentes (MRSA ou MR-

SCoN) através da aquisição do SCCmec, elemento genético móvel que carreia o

gene mecA encontrado nas espécies de estafilococos (23, 29, 64). O mesmo é um

veículo de troca de genes de resistência a meticilina e está amplamente distribuído

entre os S.aureus e Staphylococcus sp. (83).

17

Figura 5. Classificação dos principais tipos de Cassetes

1.9 Staphylococcus spp. hospitalares e comunitários

Com o advento da penicilina na década de quarenta, houve redução na taxa

de mortalidade dos pacientes portadores de infecções ocasionadas por tais

espécies. Porém, surgiram isolados produtores de enzima beta-lactamase que se

disseminaram pelos hospitais. Nos anos 50, surgiu uma nova droga β-lactâmica anti-

estafilocócica (meticilina), resistente a ação de β-lactamases produzidas pelas

bactérias, para fins de tratamento de infecções ocasionadas por espécies de

estafilococos resistentes à penicilina (21,132). Novamente os estafilococos

desenvolveram resistência cromossômica a meticilina, a partir de um mecanismo

que altera as proteínas ligadoras de penicilina (PBP) e confere resistência cruzada a

todos os β-lactâmicos (21,132).

18

1.9.1 Prevalência de estafilococos resistentes a meticilina

A prevalência de isolados MRSA varia em diferentes regiões do planeta. Na

Suíça, o percentual é de 85,7% de HA-MRSA e 14,3% de CA-MRSA (124). Na

Finlândia, 80% de HA-MRSA(63) e nos EUA 55% de HA-MRSA (73). No Japão 67% e

na Austrália 23%(26). Na Argentina a prevalência de HA-MRSA é de 51%, enquanto

que na Bolívia é de 55%, no Paraguai 30%, Uruguai 24% e Venezuela 27%(13). Para

o Brasil, em 2006, a Associação Pan-Americana de Doenças Infecciosas registrou

que 54% das infecções comunitárias e hospitalares eram ocasionadas por isolados

MRSA(13). Especificamente no Rio de Janeiro, a taxa foi de 56% (27), em Porto Alegre

100% de estafilococos coagulase negativos (83) e 40,5% de S.aureus resistentes a

meticilina (104) , enquanto que na cidade de Manaus, no ano de 2003, Egido et al.

detectaram 90% de S. aureus sensíveis a meticilina (MSSA). No de 2009, na mesma

cidade, Ferreira et al. detectaram 15% de MRSA em um estudo realizado na

Fundação Afredo da Matta sem identificar a origem dos isolados (44).

1.9.2 Processos infecciosos ocasionados por estafilococos resistentes a meticilina

Devido a sua ampla disseminação nos hospitais em todo o mundo, o S.aureus

(HA-MRSA) continua sendo o agente responsável por inúmeros processos

infecciosos nosocomiais (138), como infecções de pele e tecido mole (123), pneumonia,

artrite séptica, endocardite, osteomielite, septicemias e infecções intravasculares (138). Com o surgimento de casos na comunidade (CA-MRSA), passou a afetar

também indivíduos saudáveis (atletas, presidiários, soldados em treinamento nas

bases) sem fatores de risco associados (contato direto, compartilhamento de itens

pessoais sem higiene freqüente, colonização nasal) (124,138). Assim como os

S.aureus, os coagulase negativos podem também causar diferentes processos

patológicos, principalmente em pacientes imunodebilitados, como bacteremia,

endocardite, infecções urinárias e relacionadas com cateteres e próteses. Portanto,

a importância deles, baseia-se no fato de estarem se tornando prevalentes e

associados a processos infecciosos de elevada morbidade e taxas de mortalidade

que podem atingir até 14% das infecções hospitalares (41, 135).

19

1.9.3 Cassetes cromossômicos e Clones estafilocócicos

Apesar dos estafilococos resistentes a meticilina possuirem o gene mecA

localizado no SCCmec (63, 124) apresentarem resistência aos antibióticos beta-

lactâmicos, possuem outros determinantes comuns de resistência que contribuem

para caracterizar os diferentes tipos de SCCmec, além dos complexos essenciais

mec e ccr (54, 63, 97, 104), resultando assim na identificação de diferentes tipos de

cassetes cromossômicos (tipo I até V) (63, 85, 97) relatados em vários países (80), cada

qual possuindo tamanho e características diferentes, dispersos em vários

continentes, constituindo clones de estafilococos responsáveis por infecção

comunitárias (CA-MRSA) e hospitalares (HA-MRSA), como o ST8 (spa tipo t008,

USA 300),ST1 (spa tipo t127, USA400) (110) e tipo 80 (ST80; spa tipo t044, clone

europeu) (110), sendo altamente virulentos para os pacientes internados em hospitais,

e se tornando um veículo de troca de genes de resistência entre os estafilococos (63).

Esses clones estafilocócicos diferem entre si devido a organização genômica

e estrutural, sendo esta refletida pela distribuição no SCCmec, nos determinantes de

toxinas estafilocócicas como a enterotoxina, exfoliatina D, e leucocidina Panton

Valentine (LuKPV), que ocorrem também em isolados de estafilococos coagulase

negativa, demonstrando que podem ser passíveis de transferência horizontal,

apesar do mecanismo ainda não ser bem conhecido (54, 82, 110). Sabe-se atualmente,

que cepas identificadas como sensíveis (MSSA) LuKPV negativas, podem ser

reservatórios comunitários aguardando apenas a aquisição do SCCmec, LuKPV e

outros determinantes de virulência e resistência para se tornarem clones CA-MRSA

virulentos (63, 82, 110). Portanto, a LuKPV é utilizada mundialmente nos testes

laboratoriais como marcador para determinação de isolados comunitários (CA-

MRSA), por estar envolvida em infecções invasivas como pneumonia necrotizante (24, 38, 82), pois geralmente os estafilococos pvl-positivos, estão associados com

infecções cutâneas piogênicas necrotizantes (abcessos e furúnculos) e menos

frequentemente com celulite e necrose tecidual (103), apesar de já existirem relatos

de S. aureus pvl-positivos isolados de pacientes portadores de artrite, bacteremia (71)

e pneumonia necrotizante (49, 74).

20

Atualmente a nomenclatura dos estafilococos meticilina resistentes baseia-se

na sequência de tipagem multilocus (ST) dos fragmentos de sete genes

denominados “housekeeping”, que referem a linhagem da bactéria, no caso S.

aureus e S. epidermidis, resultando em um perfil alélico designado de ST e o tipo do

elemento SCCmec. A detecção de linhagens divergentes através de técnicas

moleculares como o MLST, sugere que o estafilococo resistente a meticilina surgiu

pela introdução do SCCmec em uma linhagem de cepa sensível a essa droga(26).

Atualmente existe uma diversidade de clones de S. aureus e de S.

epidermidis dispersos pelo mundo. Na China os clones mais prevalentes são o

ST239 e ST1018(138). Na Oceania, o ST30 (11). No continente europeu, a Romênia

apresenta os clones ST239,ST5,ST80,ST1,ST254 (75) como os mais prevalentes,

enquanto que nos demais países prevalece o ST80(11). No Kuwait prevalece o ST80 (131a,131b). Nos Estados Unidos os clones prevalentes são USA300 (ST8) e USA 400

(ST1)(11,131a,131b), enquanto que no Brasil, especificamente nas cidades de Porto

Alegre e Rio de Janeiro, foram identificados três complexos clonais de S. aureus

como ST8,ST30 e ST1, correspondendo aos clones USA300, clone do Oceano

Pacífico Sul e USA400 (26, 116). Em relação ao S. epidermidis, dados publicados

demonstram a prevalência dos clones ST2 e ST22 na Grécia (76), ST2 na Suiça,

Finlândia e China (61, 77, 139), e nos Estados Unidos, os clones ST2, ST5,ST6, ST22,

ST23, ST87, ST185,ST186 (88,145). No Brasil os clones conhecidos são os

ST2,ST231 e o ST263 (www.mlst.net).

1.9.4 Características diferenciais entre HA-MRSA e CA-MRSA

Vários fatores de risco dentre eles hospitalização, antibióticoterapia,

internação em enfermarias, contato direto com o corpo clínico, contribuem para

infecção ou colonização dos pacientes por isolados de estafilococos coagulase

negativos e S.aureus resistentes a meticilina. Entretanto, deve-se ressaltar que os

CA-MRSA e HA-MRSA são tanto genética como fenotipicamente distintos (110).

Isolados HA-MRSA apresentam resistência a múltiplos antibióticos beta-

lactâmicos (penicilinas lábeis, estáveis, penicilina G, amoxacilina, carbapenêmicos,

21

cefalosporinas de 1º, 2º, 3º e 4º geração) e, em especial, a fluoroquinolona. Não

estão associados ao gene codificador da Leucocidina Panton-Valentine (PVL) e

carreiam um cassete SCCmec largo do tipo I, II, III, raramente o IV (21, 24, 45, 47, 63). Os

CA-MRSA carreiam um cassete SCCmec menor tipo IV, V ou VI, que os torna

suscetíveis a antibióticos não beta-lactâmicos como clindamicina, tetraciclina, e

também a quinolona, sulfametoxazol/trimetoprima e doxiciclina. Freqüentemente

estão associados com a presença da toxina Leucocidina Panton Valentine (PVL),

localizada no interior do bacteriófago phiSLT, e apresentam múltiplas características

no pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (21, 24, 45, 47, 63). São também mais

virulentos e ocasionam doenças altamente invasivas e progressivas (pneumonia

necrotizante), geralmente em indivíduos saudáveis, jovens, e sem exposição a

fatores de risco hospitalar (124), devendo-se verificar se o tipo do SCCmec possui ou

não importância nessas infecções (Quadro 2) (21, 49, 124).

1.10 Prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de ESBLs

Os processos patológicos que acometem pacientes infectados por bactérias

Gram-positivas, também podem ocorrer em bactérias Gram-negativas, e a grande

preocupação clínica está relacionada com sua capacidade de adquirir resistência

aos antibióticos, que as torna capazes de produzir a enzima beta-lactamase de

espectro estendido (ESBL), que hidrolisa as oxiamino-cefalosporinas e aztreonam

dificultando assim a escolha terapêutica, o que afeta os pacientes, principalmente

idosos, imunocomprometidos e debilitados, já que esses antibióticos são utilizados

diariamente na rotina hospitalar e comunitária (48, 109, 130, 134) .

Dentre as bactérias não-fermentadoras, a Pseudomonas aeruginosa é a que

apresenta índice de mortalidade mais elevado (5%) (32), tendo sido isolada de 10,7% (32) das amostras biológicas coletadas de pacientes sob antibióticoterapia profilática,

seguida posteriormente por outras espécies bacterianas como E. coli e Salmonella

sp.(46, 48). Já nos pacientes internados portadores de doenças hematológicas, como

lúpus, anemia hemolítica, aplasia de medula, linfoma, doença maligna dentre outras,

a imunodeficiência ocasionada pela doença de base os torna muito mais vulneráveis

a infecções bacterianas por espécies Gram-negativas (32), principalmente se

22

estiverem utilizando acesso venoso central como cateteres (136). Relatos de

bacteremia nesses pacientes assim como infecções hospitalares ocasionadas por

E.coli, principalmente em pacientes imunocomprometidos, já foram registrados na

literatura (79, 136).

Quadro 2. Características diferenciais entre HA-MRSA e CA-MRSA

Aquisição HA-MRSA CA-MRSA

Hospitalar Comunitário

Infecções clínicas Pacientes imunodebilitados, contato

direto e.

Indivíduos jovens, saudáveis, sem

fatores de risco associados e.

Fatores de risco

Internação prolongada, uso prolongado

de antibióticos, enfermarias, diabetes,

dispositivos intravasculares, doença

pulmonar crônica b.

Contato físico, compartilhamento de

itens pessoais, lesões de pele, uso

de drogas, prisão, atletas b

Fenótipo Resistência a múltiplos antibióticos beta-

lactâmicos e em especial a

fluoroquinolona a, f.

Suscetíveis a antibióticos não beta-

lactâmicos como clindamicina,

tetraciclina,quinolona,sulfametoxazol

/trimetoprima e doxiciclina

(multidroga) a, f.

Marcadores genéticos

Negativo para o gene codificador da

Leucocidina Panton-Valentine (PVL).

Carreiam um cassete SCCmec largo,

do tipo I,II, III, e raramente o IV d, f.

Gene codificador da (PVL) c

Carreiam um cassete SCCmec

menor, tipo IV ou V. Múltiplas

características no PFGE d, f.

Fonte: Fey et al. 2003 a (45); Huang et al. 2006b (60); Ma et al. 2008c (82), Bouchami et al. 2009d (23) , Strandén et al. 2009e (124),

Boyle-Vavra et al. 2007f (21).

A prevalência de bactérias produtoras de ESBLs oscila entre as instituições

de saúde e países. Na Suíça é de 8%, Portugal 34%, Ásia 20% (92), Turquia 58% (105)

e África do Sul 20% (93). Nos EUA a média anual é de 3% (14), e nas regiões da

América Latina 60%. No Brasil, a prevalência registrada para espécies como a

Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) é de 45,4% enquanto que para a

Escherichia coli (E. coli) 6% (10). Na região Norte, e especificamente no Amazonas,

ainda não há registros publicados sobre infecções ocasionadas por bactérias

produtoras de ESBL.

23

1.10.1 Enzima Beta-Lactamase As ß-lactamases são enzimas que se localizam no espaço periplasmático nas

bactérias Gram-negativas ou extracelularmente nas Gram-positivas. A informação

genética para sua síntese pode estar contida no plasmídeo ou cromossomo

bacteriano (25). No caso do plasmídeo, o mesmo também pode ser incorporado no

cromossomo bacteriano (25) desenvolvendo-se assim a resistência cromossômica.

Esta resistência muitas vezes não é detectada em condições normais de

crescimento do isolado, surgindo apenas quando na presença de antibióticos

indutores como os ß-lactâmicos (25).

Os plasmídeos ou transposons contém os genes da ß-lactamase que são

transferíveis entre as bactérias não importando a espécie (109), e que atualmente

estão disseminados no mundo inteiro, sendo encontrados em diferentes espécies

das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae

e Neisseria gonorrhoeae (14, 103).

A beta-lactamase SHV-1 (variável sulfidril), codificada cromossomicamente na

maioria dos isolados de K. pneumoniae, é freqüentemente mediada por plasmídeo

em E. coli. Assim, devido a essa forma de disseminação dos genes, nos últimos 20

anos, novos antibióticos surgiram e com eles também novas beta-lactamases, que

induziram o surgimento de cepas resistentes (14).

As ß-lactamases destroem os antibióticos ß-lactâmicos como penicilinas e

cefalosporinas através da hidrólise do anel beta-lactâmico (25), mas podem ser

inibidas por inibidores de beta-lactamases como o clavulanato, sulbactam e

tazobactam, ineficazes contra a classe “C” destas enzimas (36).

Mais de 340 ß-lactamases já foram identificadas estando classificadas em

quatro classes de A à D conforme sua estrutura primária e características funcionais

e bioquímicas (grupo I à IV) (37, 43). As ESBLs clássicas são comumente

transmitidas/codificadas por plasmídeo como o da família TEM-, SHV- e OXA-. No

decorrer dos anos, dentro de cada família, ocorreram mutações e novas variantes

24

surgiram como por exemplo, TEM-6, CTX-M-8, CTX-M-2, PER, VEB, GES, e TLA (36,

89, 102, 108, 134).

A complexidade das ß-lactamases é acentuada por vários fatores dentre eles

o fato de uma mesma cepa de bactéria expressar múltiplas ß-lactamases de tipos

variados, podendo ocasionar diferentes implicações clínicas e dificultar a análise

laboratorial de seu perfil enzimático. Outro fator relacionado é o “efeito do inóculo”

que dificulta a detecção de resistência clinicamente relevante. As bactérias

produtoras de ESBLs, demonstram resistência cada vez mais elevada as

cefalosporinas de terceira geração com o aumento do inóculo bacteriano (efeito do

inóculo), fenômeno ocasionado pela incapacidade dos antibióticos de destruírem

ou inbirem as bactérias(142).

Outro exemplo importante relacionado a essa complexidade, é o fato dessas

enzimas apresentarem afinidade por diferentes antibióticos ß-lactâmicos. Porém,

sua hiperprodução pode inativar a eficácia desses antibióticos, apesar de terem sido

classificadas como ativas contra todo o antibiótico ß-lactâmico. Não é raro também,

a presença de mecanismos redundantes de resistência na mesma cepa bacteriana,

a qual pode albergar uma ß-lactamase combinada com uma mutação na porina,

tornando-a multiressitente, ou então portar transposons contendo genes de

resistência a múltiplos antibióticos além dos ß-lactâmicos, como fluoroquinolonas,

aminoglicosídeos, trimetoprim-sulfametoxazol(142).

1.10.2 Classificação das Enzimas Beta-Lactamases

As enzimas da classe A ou grupo II incluem as famílias blaTEM e blaSHV (110)

que hidrolisam as penicilinas e cefalosporinas; classe B ou grupo III,

carbapenêmicos; classe C ou grupo I, cefalosporinas; classe D, penicilinas e

cloxacilina; e grupo IV (peniclinases) penicilina(36). As enzimas pertencentes à classe

A, geralmente são encontradas em plasmídeo ou transposon sendo consideradas as

mais importantes. A SHV, por exemplo, é freqüentemente encontrada em isolados

clínicos (36, 43).

25

Posteriormente Ambler classificou as ESBLs em 4 classes evolucionárias (A,

B, C, D). As enzimas SHV- e TEM- pertencem à classe A e possuem a serina como

seu principal resíduo catalítico, enquanto que as OXA- pertencem à classe D

(oxacilinases). O esquema de Bush classifica as ESBLs de acordo com o perfil do

substrato e características físicas como ponto isoelétrico e peso molecular. Neste

esquema as ESBLs estão divididas em dois subgrupos: 2be (TEM- e SHV-) e 2d

(OXA-) inibidos pelo clavulanato. Em 1995 Bush-Jacoby-Medeiros apresentaram um

novo esquema no qual as enzimas foram divididas em quatro grupos (1-4) e

subgrupos (a-f) (36).

O grupo 1 é formado por cefalosporinases que não são inibidas pelo ácido

clavulânico e pertencem a classe molecular C. O grupo 2 são penicilinases,

cefalosporinases ou ambas, que são inibidas pelo ácido clavulânico e pertencem a

classe molecular A e D. Devido ao surgimento de vários mutantes ESBLs foi criada

duas subclasses 2a (penicilinases) e 2b (ESBLs de amplo espectro).

Posteriormente foram criados subgrupos 2be (inativam cefalosporinas de terceira

geração), 2br (ESBLs resistentes aos inibidores de beta-lactamases), 2c (inativam a

carbenicilina), 2d (inativam a cloxacilina e são fracamente inibidas pelos inibidores

de ß-lactamases) e 2f (serina-beta-lactamases). O grupo 3 possuem enzimas que

necessitam de zinco para para exercerem seu efeito sendo denominadas de zinco-

beta-lactamases ou metallo-beta-lactamases e correspondem a classe molecular B.

No grupo 4 estão as penicilinases não inibidas pelo ácido clavulânico (36).

1.10.3 Beta-Lactamase de espectro estendido (ESBL)

A primeira descrição de ESBL mediada por plasmídeo denominado TEM-1, foi

feita em 1960. Esta enzima foi encontrada em cepa de E. coli isolada da

hemocultura de uma paciente denominada Temoniera, na Grécia, daí a origem do

nome (14, 35, 43). Em 1983 foi identificado um novo grupo de enzima beta-lactamase

em isolados clínicos de Serratia marcescens e Klebsiella pneumoniae. Esta enzima

passou a denominar-se de Beta-lactamase de espectro estendido ou ampliado

(ESBLs) (2, 35).

26

Posteriormente, as ESBLs foram classificadas em dois grandes grupos sem

relação entre si, apesar de algumas enzimas agirem sobre o mesmo substrato (ß-

lactâmicos) ligando-se a sítios diferentes (35). Assim sua ação ampliou-se também

sobre as oxiamino-cefalosporinas e monobactans, reduzindo as opções terapêuticas

da classe dos ß-lactâmicos para os carbapenêmicos, elevando os custos do

tratamento e risco para os pacientes devido a longos períodos de hospitalização e

antibióticoterapia (2, 35, 102). No caso dos pacientes portadores de doenças

hematológicas, os mesmos são frequentemente submetidos à quimioterapia, o que

ocasiona imunodeficiência deixando-os susceptíveis a uma ampla variedade de

infecções, principalmente as hospitalares, e especialmente aquelas ocasionadas por

bactérias produtoras de ESBL, contribuindo assim para a elevação do risco de

morbi-mortalidade (113, 117).

As ESBLs são produtos derivados de mutações pontuais no sítio ativo da

enzima TEM e SHV (104), codificadas por plasmídeos conjugativos transferíveis entre

as bactérias Gram-negativas (9, 128), que freqüentemente produzem determinantes de

resistência a outras classes de antibióticos (65). As bactérias que comumente

produzem esse tipo de enzima são E. coli e K. pneumoniae (2, 10, 65, 69, 102, 108),

podendo também ser elaboradas por outras espécies como Enterobacter,

Salmonella, Proteus, Citrobacter, Morganella morganii, Serratia marcescens,

Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia (4, 10, 69).

1.10.4 Subtipos das enzimas Beta-Lactamases de espectro estendido (ESBLs)

Vários são os subtipos de ESBL. Em E. coli a maioria das ß-lactamases

pertencem a classe A de Ambler e podem ser divididas em ß-lactamases de

pequeno espectro como a TEM-1,TEM-2 e SHV, e as de amplo espectro, como

TEM-3, SHV-5 e CTX-M-like. As do tipo CTX-M são de largo espectro e derivadas

das ß-lactamases codificadas cromossomicamente pelo gênero Kluyvera. Foram

isolados mais de 70 tipos, divididos em cinco clones, que possuem similaridades em

sua sequência de aminoácidos conhecidos como CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8,

CTX-M-9, e CTX-M-25 (89,109). Estudos realizados nos genes codificadores de ESBL

27

revelaram que a maioria dos isolados produtores carreiam os genes TEM-1 (88%),

CTX-M (20%), SHV (8%), e OXA (5%), sendo o CTX-M o mais prevalente e disperso

pelo mundo (79, 110). Nas espécies de E. coli, os subtipos SHV, TEM e CTX-M-15 são

os mais prevalentes (108), já em Pseudomonas aeruginosa, é o GES- 1 e GES-5 (86).

Bactérias produtoras de enzimas mediadoras de resistência aos

carbapenêmicos estão descritas mundialmente. As carbapenamases são

representadas por 3 classes moleculares de ß-lactamases: A,B e D. A mais

conhecida é a K. pneumoniae (KPC); enterobactéria produtora de carbapenamase,

responsável por vários surtos hospitalares. A classe B são as metalo-

betalactamases (MBL) que apresentam um amplo espectro de substrato. As

carbapenamases da classe D tipo OXA, são mais frequentemente detectadas nas

bactérias não fermentadoras, exceto a OXA-48, detectada somente em

enterobactérias e que possui uma notável atividade de hidrolisar os carbapenêmicos (35, 90).

1.10.5 Importância Clínica das ESBL

As mutações genéticas pontuais que ocorrem nos isolados produtores de

ESBL, torna-os capazes de sintetizar as ESBLs que atuam hidrolisando antibióticos

de amplo espectro como as cefalosporinas (ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima),

monobactans (aztreonam) (4, 36, 43, 66, 105), e, como os plasmídeos muitas vezes

albergam genes codificam as ESBLs e outros que codificam resistência aos

antibióticos não beta-lactâmicos, quando a bactéria é estimulada para um gene de

determinado antibiótico, pode-se tornar concomitantemente, resistente aos outros

antibióticos também, podendo ampliar assim sua resistência contra outros

antimicrobianos não ß-lactâmicos como aminoglicosídeos, fluoroquinolonas,

tetraciclina, cloranfenicol e sulfonamidas (36, 93).

Outro aspecto importante é que esses genes, localizados no mesmo

plasmídeo conjugativo, podem ser transmitidos conjuntamente de um isolado para

outro não importando o gênero bacteriano, ou então serem estimulados

separadamente por pressão seletiva, tornando assim mais difícil a escolha

28

terapêutica nesses casos, principalmente, quando da ausência do diagnóstico

laboratorial desse fenótipo (84, 102)

Portanto, torna-se importante a realização dos testes de suscetibilidade de

acordo com os critérios determinados pelo CLSI 2010, pois até 2009 a

recomendação era de se realizar a detecção de cepas produtoras de ESBL em duas

etapas, screening e testes confirmatórios. Entretanto, em 2010 (manual M100-S20)

esta orientação deixou de existir como condição única, sendo incluídas as

orientações posológicas mínimas além dos pontos de corte modificados para

interpretar os resultados obtidos (halo de inibição e concentração inibitória

mínima)(30).

1.10.6 Preocupações relativas às infecções bacterianas

Isolados resistentes a antimicrobianos como os HA-MRSA, CA-MRSA e

ESBLs, ocasionam quadros graves de infecções muitas vezes difíceis de tratar

devido à limitada opção terapêutica, elevando assim o percentual de morbi-

mortalidade e os custos do tratamento decorrentes da internação prolongada nos

hospitais. (85, 93). Outro fator importante é a dificuldade para detecção desses

isolados nos testes laboratoriais de suscetibilidade a antimicrobianos que, apesar

das normas do CLSI 2010 (manual M100-S20), para algumas espécies ainda é

necessário teste confirmatório para este tipo de fenótipo, devido ao surgimento de

novos mutantes bacterianos produtores de ESBL e novas espécies de estafilococos

coagulase negativos resistentes a meticilina, para as quais o CLSI ainda não possui

padronização da concentração inibitória mínima (MIC) aos antimicrobianos utilizados

na rotina hospitalar (85).

A importância desses patógenos é tão relevante para a saúde pública, que

relatos de doenças causadas por bactérias Gram-positivas resistentes a meticilina

(MRSA), Gram-negativas produtoras de beta lactamase de espectro estendido

(ESBL) incluindo aquelas que ampliaram seu espectro de resistência aos

carbapenêmicos (ampC), estão amplamente descritos e discutidos na literatura

científica nacional e internacional (115,117,138,139). Portanto, a resistência microbiana

29

aos antimicrobianios utilizados no tratamento, ainda é um grande desafio tanto nas

infecções comprovadamente hospitalares, quanto nas adquiridas na comunidade,

em todo o mundo. Em razão dos pacientes internados nos hospitais estarem mais

expostos aos antimicrobianos de largo espectro (que muitas vezes debilitam a

barreira química natural do organismo ou ocasionam alteração da resposta imune),

ao contato freqüente entre profissional da saúde-paciente (possibilitando a

transmissão cruzada de patógenos), a ruptura da barreira tecidual por processos

invasivos, como cirurgia, inserção de sondas, cateteres, e ao déficit nutricional

devido à dificuldade de ingestão, a probabilidade de ocorrerem processos

infecciosos graves e até mesmo fatais nos mesmos, ocasionados por bactérias

resistentes presentes no ambiente hospitalar, é elevadíssima(114,115,117).

Atualmente observa-se que os fatores de risco para que um paciente

desenvolva algum processo infeccioso bacteriano, de origem hospitalar ou

comunitária, tanto em hospitais como em ambulatórios já é uma realidade, e a

Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (FHEMOAM), como um

centro que promove assistência ambulatorial e internações a pacientes com doenças

hematológicas (hemofilia, talassemia, anemia hemolítica, leucemia,etc) muitas vezes

graves, não é uma exceção no processo. Muitos dos usuários assistidos requerem

tratamentos que incluem seções de quimioterapia que, às vezes, causam efeitos

colaterais como imunodeficiência, deixando-os mais suscetíveis a infecções

bacterianas graves que, quando tratadas de modo ineficaz, podem levar a estado de

morbidez prolongado podendo ocasionar a morte. Nestes casos, a resistência

microbiana aos antibióticos utilizados no tratamento, ainda é um desafio tanto nas

infecções comprovadamente hospitalares, quanto nas adquiridas na comunidade.

Pesquisas científicas nesse campo são fundamentais para a saúde pública e

bem estar dos indivíduos e das comunidades, pois as questões que envolvem a

saúde pública são complexas e seus problemas devem ser confrontados em todos

os aspectos, dos mais abrangentes aos mais localizados, e o estudo científico pode

contribuir sobremaneira para o equacionamento e solução dos mesmos.

30

Pesquisas direcionadas para os mecanismos de resistência bacteriana aos

antibióticos, utilizando-se protocolos moleculares(110,130) que possibilitem visualizar

se os genes específicos e suas possíveis mutações são comuns ou exclusivas,

como as descritas por pesquisadores em outras regiões(132,135), auxiliarão

diretamente no desenvolvimento de novos projetos envolvendo outras instituições de

saúde ligadas ao SUS, de diferentes níveis de complexidade, o que ampliará a visão

epidemiológica sobre a fisiopatogenia das doenças ocasionadas por esses agentes,

o monitoramento dos mecanismos de resistência dos mesmos, a importância da

pressão seletiva relacionada ao uso de antimicrobianos, os mecanismos de infecção

cruzada bem como os de disseminação, auxiliando sobremaneira no controle das

infecções, das decisões sobre a terapia antimicrobiana e das políticas de saúde a

serem adotadas para a prevenção de surtos hospitalares ou comunitários.

31

2 OBJETIVOS 2.1 Geral

Descrever a freqüência, sensibilidade aos antimicrobianos e caracterizar as

alterações genético-moleculares das bactérias patogênicas isoladas de processos

infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM 2.2 Específicos

Identificar a freqüência dos gêneros e espécies bacterianas.

Identificar os fenótipos de sensibilidade, sensibilidade reduzida e a resistência

dessas bactérias aos antibióticos indicados no tratamento.

Identificar as alterações genético-moleculares de resistência envolvidas.

32

3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Delineamento Estudo transversal, descritivo, com componentes analíticos, realizado a a

partir da demanda espontânea de pacientes atendidos na Fundação de Hematologia

e Hemoterapia do Amazonas/FHEMOAM, autarquia do governo do Estado do

Amazonas, localizada na zona centro oeste de Manaus, onde são atendidos

anualmente 6.820 pacientes com 49.333 doações de sangue entre Capital e Interior

do Estado. 3.2 População de estudo Pacientes de ambos os sexos, de qualquer faixa etária, portadores de

doenças hematológicas, com suspeita clínica de processo infeccioso

bacteriano, internados na FHEMOAM.

3.3 Amostragem Foram incluídos todos os casos de pacientes com doença hematológica

apresentando quadro de infecção bacteriana durante o período de julho/2007 a

agosto/2008. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da FHEMOAM sob número

170 CAAE- 0005.0.112.000-06- versão 003/06.

A abordagem do paciente foi realizada após consulta médica na qual foi

detectada provável infecção. Foram realizados esclarecimentos quanto aos objetivos

e métodos a serem utilizados, apresentando ao sujeito da pesquisa o Termo de

Consentimento Livre Esclarecido adequado para adultos e crianças (anexo 1).

Aqueles que não concordaram em participar do estudo não tiveram nenhum tipo de

prejuízo no atendimento e receberam o mesmo tratamento oferecido pela

FHEMOAM aos demais pacientes. Após esclarecimento e aceite dos pacientes, as

amostras foram coletadas, as informações referentes ao cadastro e resultado dos

testes foram incluídas no anexo 2, e os testes foram realizados conforme protocolos

33

do estudo (Anexo 3). Todos os resultados dos exames de cultura e antibiograma

foram enviados para os médicos dos pacientes internados a fim de orientar a

escolha terapêutica. Os procedimentos realizados na pesquisa encontram-se

descritos no fluxograma da figura 6 e os protocolos laboratoriais no anexo 3.

Figura 6 – Fluxograma dos procedimentos executados na realização do estudo

34

3.4 Critérios de inclusão

a) Pacientes com diagnóstico prévio de doença hematológica

b) Pacientes atendidos no ambulatório ou internado na FHEMOAM

c) Pacientes apresentando sinais e sintomas clínicos de processo infeccioso

bacteriano

d) Pacientes utilizando ou não antibióticos de amplo espectro a partir de

qualquer via de administração

e) Pacientes neutropênicos (número de neutrófilos inferior a 1000 mm3 de

sangue) ou que apresentarem quadro febril durante o período de

internação.

3.5 Critérios de exclusão a) Pacientes cujas culturas apresentaram contaminação por outras

bactérias durante o processo de manipulação

b) Pacientes portadores de outras doenças que não as hematológicas.

c) Culturas que apresentaram crescimento microbiano de Micrococcus sp.

3.6 Solicitações do Exame Bacteriológico O exame laboratorial foi realizado após solicitação médica seguindo o

protocolo interno padronizado da FHEMOAM, conforme normas técnicas

padronizadas (Pop/HEMOAM/Goldin 2001), adequadas para diferentes tipos de

infecções bacterianas. O protocolo clínico (Pop/FHEMOAM) interno específico

para pacientes hematológicos imunodeprimidos define como critério de infecção:

3.6.1 Pacientes Hematológicos Imunodeprimidos: Foram considerados pacientes portadores de doenças hematológicas

imunodeprimidos aqueles que apresentaram:

1- Neutropenia- quando a contagem de neutrófilo está abaixo de 500/células

por mm3 ou quando inferior a 1000/células por mm3 após quimioterapia.

2- Quebra de barreiras naturais: lesão de pele, mucosa, quimioterapia

35

3- Febre durante neutropenia (temperatura acima de 38,3°C ou acima de

38°C mais de uma hora). 3.6.2 Fatores de baixo risco para complicação:

Os pacientes hematológicos que apresentaram um dos sintomas abaixo

relacionados foram considerados como de baixo risco para complicação, mas

com probabilidade de desenvolver infecção bacteriana.

1- Contagem absoluta de neutrófilos acima de 100 células, monócitos

acima de 100 células raios X de tórax e função renal normal .

2- Leucopenia com menos de sete dias.

3- Ausência de infecção na corrente sanguínea e no cateter.

4- Recuperação precoce de produção celular pela medula óssea.

5- Remissão de malignidade.

6- Pico de temperatura abaixo de 39°C, ausência de rebaixamento de

alteração neurológica (ausência de dor abdominal e co-morbidade,

choque, pneumonia, vômito, diarréia).

3.7 Coleta de amostra biológica

A coleta de material biológico foi realizada seguindo as recomendações

de Winn et al., 2008 (142) e Manual Anvisa Módulo III (8,9), sendo transportados

imediatamente para o laboratório. Material de ponta de cateter foi coletado por

médico especializado e enviado imediatamente para o laboratório (frasco

estéril sem conservante) (8,9,142).

3.8 Cultura, Isolamento e Identificação das bactérias isoladas Para o isolamento primário de bactérias aeróbicas, foram utilizados meios

de cultura como ágar sangue de carneiro a 5% (Himedia Hexasystens-Mumbai,

India), ágar manitol salgado (Himedia), ágar eosina azul de metileno (EMB)

(Himedia), ágar Mac Conkey (Himedia), Mueller Hinton (Himedia).

36

Após coleta, as amostras foram semeadas e incubadas em estufa

bacteriológica à temperatura de 35,6ºC, por um período de 24/48 horas. Culturas

que apresentaram crescimento foram submetidas à reação de Gram (Newprov). As

colônias Gram-positivas foram submetidas aos testes de identificação de gênero e

espécie como, catalase, coagulase (Newprov), fermentação do manitol (Himedia),

teste do L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide-PYR-Test (Probac do Brasil), testes com

monodiscos de antibióticos como novobiocina 5µg (Laborclin), bacitracina 0,04UI

(Newprov), polimixina B-Pol 300 (Newprov), furazolidona-100mcg (Cefar).

As bactérias identificadas como Gram-negativas, foram submetidas a testes

de identificação de gênero e espécie como oxidase, Kit EPM-MILi-Citrato (Probac do

Brasil), Enterokit B (Probac do Brasil), Enterokit C (Probac do Brasil), Kit NFII

(Probac do Brasil), testes bioquímicos adicionais com os meios de Mac Conkey

(Himedia), ágar uréia (Himedia), meio de MIO (Himedia), caldo Lisina (Himedia),

meio de TSI (Himedia), açúcares como glicose (Himedia), maltose (Himedia), lactose

(Himedia), sacarose (Himedia), realizados conforme protocolos padronizados (142).

Os protcolos laboratoriais encontram-se descritos no anexo 3.

3.9 Teste da Beta-Lactamase (cefinase) Foi realizado o teste da beta-lactamase tanto nas bactérias Gram-positivas

quanto Gram negativas, a partir de fita impregnada com reagente contendo

cefalosporina cromogênica (Cefinase plus), segundo recomendações do fabricante

Beckton-Dickson (BD Diagnostic System, Sparks, MD). A detecção da enzima

sugere que a espécie bacteriana produz a enzima beta-lactamase sendo resistentes

aos antibióticos beta-lactâmicos (12).

3.9.1 Teste da Beta-Lactamase de espectro estendido (ESBL) O teste aplicado para detecção do fenótipo ESBL foi o epsilométrico (E-

teste®) utilizando-se os antibióticos cefotaxima (0.25–16 μg/mL)/cefotaxime (0.016–1

μg/mL) mais 4 μg/mL de ácido clavulânico; ceftazidima (0.5–32 μg/mL) /ceftazidima

(0.064–4 μg/mL) mais 4 μg/mL de ácido clavulânico, segundo recomendações do

37

fabricante (AB-Biodisk-Sweden®).

Fonte: William Antunes Ferreira

Figura 7: Imagem das fitas de cefinase plus utilizadas na realização do teste da beta-

lactamase.

Os organismos testes foram suspensos em solução salina a 0.8%, padrão de

turbidez número 0.5 da escala de McFarland e inoculados no meio de ágar Mueller-

Hinton (Himedia), seguidas por uma incubação a 37°C por 18–24h. A interpretação

do testes foi realizada segundo o manual técnico do Clinical and Laboratory

Standards (CLSI; Wayne, Pennsylvania, USA)(29), o qual fornece o ponto de corte

(break point) correspondente ao diâmetro da zona de inibição. Cepas de E. coli

ATCC 25922 e K. pneumoniae ATCC 700603 foram utilizadas como controle de

qualidade para os meios de cultura e testes de suscetibilidade.

O teste epsilométrico E-teste® consiste na aplicação de fitas plásticas, não-

porosas com cinco milímetros (mm) de altura e 60 mm de comprimento contendo em

um dos lados o MIC (Concentração Inibitória Mínima) num gradiente de µg/mL para

os antibióticos cefotaxime (CT) e ceftazidime (TZ) com escalas de 0,25-16 µg/mL e

0,50-32µg/mL, respectivamente. No outro apresenta dois gradientes predefinidos de

CTL (cefotaxime/ácido clavulânico) e TZL (ceftazidime/ácido clavulânico) com

escalas de 0,016-1 µg/mL mais 4 µg/mL de ácido clavulânico, e 0,064-4 g/mL mais 4

µg/mL de ácido clavulânico (Figura 7). Após o cultivo e isolamento, a cultura pura foi

armazenada em freezer a -70ºC segundo CLSI, 2005(29). Posteriormente, as cepas

resistentes foram submetidas a estudos moleculares para determinação genética de

sua resistência e os resultados armazenados em banco de dados apropriado.

38

Fonte: AB BIODISK.

Figura 8: Desenho esquemático das fitas utilizadas na realização do Etest® ESBL com os

gradientes de concentrações dos antibióticos CT e TZ e em associação com o inibidor, o

ácido clavulânico.

A produção de ESBL (figura 8) foi determinada a partir do aparecimento de

uma zona fantasma (phantom zone), deformação da elipse do lado contendo o CT

ou TZ, ou quando o MIC de CT ou TZ se apresentassem reduzidos a ≥ 3 log2 de

diluições na presença do ácido clavulânico (Quadro 3).

Quadro 3. Protocolo de interpretação do Etest® ESBL, conforme recomendações do fabricante AB BIODISK

ESBL MIC Descrição

Positivo

CT > 0,5 e CT/CTL > 8

ou

TZ > 1 e TZ/TZL > 8

ou

Zona fantasma ou deformação

da elipse no CT ou TZ

Produção de ESBL e resistência

a todos as penicilinas,

cefalosporinas e aztreonam

(CLSI)

Negativo CT < 0,5 ou CT/CTL < 8

e

TZ < 1 ou TZ/TZL < 8

Não produtora de ESBL

Não determinada

CT > 16 e CTL > 1

e

Quando uma fita é negativa

para ESBL e a outra não

determinada

ESBL não determinada. Se a

ESBL é suscetível, confirmar o

resultado com a genotipagem.

Fonte: (Etest® ESBL, AB BIODISK)

39

Fonte: Cristina Motta Ferreira

Figura 9: Imagem de detecção do fenótipo ESBL pelo método epsilométrico E-teste®.

Fita com os gradientes de concentrações dos antibióticos TZ e em associação com o

inibidor, o ácido clavulânico.

3.9.2 Teste de Suscetibilidade Antimicrobiana

O teste antimicrobiano epsilométrico E-teste® (figura 9), para a detecção da

MIC (concentração inibitótria mínima), foi realizado utilizando-se o meio de cultura

ágar Mueller Hinton (Himedia), conforme recomendações do fabricante AB Biodisk

(Solna, Sweden). Os critérios de interpretação utilizados seguiram as

recomendações do Institute for Clinical and Laboratory Standards CLSI (CDC-

Atlanta, USA, 2005)(29) . Os antibióticos amicacina, oxacilina, cefoxitina, penicilina G,

ciprofloxacina, cefepime, vancomicina, ceftazidime, cloranfenicol, imipenem e

tetraciclina foram escolhidos em comum acordo com o corpo clínico do HEMOAM.

As fitas de E-test® contendo os antibióticos utilizados para tratamento de

infecções bacterianas Gram-positivas foram: oxacilina, cefoxitina, vancomicina,

tetraciclina, ceftazidima, cloranfenicol, amicacina, cefepime (0.016-256.0 µg/mL),

benzilpenicillina, ciprofloxacina, imipenem (0.002-32.00 µg/mL). Para as bactérias

Gram-negativas foram: tetraciclina, ceftazidima, cefoxitina, cloranfenicol, cefepime,

amicacina (0.016–256.0 µg/mL), ciprofloxacina e imipenem (0.002–32.00 µg/mL).

Os organismos testes foram suspensos em solução salina a 0.8%, padrão

número 0.5 da escala de McFarland e inoculadas no meio de ágar Mueller-Hinton,

seguidas por uma incubação a 37°C por 18–24h. A interpretação do teste foi

realizada segundo o manual técnico do Clinical and Laboratory Standards (CLSI;

40

Wayne, Pennsylvania, USA)(29), o qual fornece o ponto de corte (break point),

correspondente ao diâmetro da zona de inibição. Cepa de S. aureus ATCC 25923 e

E. coli ATCC 25922 foram utilizadas com controle de qualidade para os meios de

cultura e testes de suscetibilidade.

Fonte: William Antunes Ferreira

Figura 10: Imagem do resultado do teste de suscetibilidade método

epsilométrico E-teste® para a detecção da MIC (concentração inibitótria

mínima).

3.9.3 Teste da PBP 2a

Os S. aureus com resistência no MIC/E-test maior ou igual a quatro

(>/=4µg/mL) para oxacilina e cefoxitina, e os SCoN com resistência no MIC/E-teste

maior ou igual a cinco (>/=0,5µg/mL) (CLSI) para oxacilina e cefoxitina, foram

submetidos ao teste da proteína ligadora de penicilina (PBP 2a ou PBP2’) conforme

protocolo do kit “PBP 2’Test Kit” (Oxoid,Japan). Este kit detecta os (MRSA) e MR-

SCoN, pois a PBP2’ é uma proteína presente na parede celular bacteriana

responsável pela resistência cromossômica a meticilina (oxacilina) nesta espécie.

3.9.4 Caracterizações Moleculares 3.9.4.1 Extração do DNA Total Bacteriano e Quantificação

Todas as espécies bacterianas identificadas através de metodologia

padronizada foram semeadas em meio sólido de Luria Bertani (LB) (Promega,

Madison, WI, USA) e incubadas a 37°C por 24hs. Após 24hs, retirou-se 01 colônia

41

pura para inoculação em 5ml de meio líquido de cultura LB com nova incubação a

37°C por uma noite, sob agitação, sendo a extração realizada conforme protocolo do

kit Easy DNA for genomic DNA isolation (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) com

adaptações em relação ao tempo, temperatura de incubação das amostras e

concentração enzimática, utilizando-se previamente tratamento com lisozima 50µl

(10mg/mL) para permitir a lise bacteriana.

O princípio do kit baseou-se na adição da solução A (solução de lise) ao pellet

bacteriano resuspenso em solução tampão PBS seguida de incubação a 65°C. As

proteínas e os lipídios das células foram precipitados e extraídos pela adição da

solução B (solução de precipitação) e clorofórmio. A fase de centrifugação teve por

objetivo separar a solução em duas fases com uma interface sólida entre as

mesmas. O DNA ficou na fase aquosa clara de cima e as proteínas e os lipídios na

interface sólida. O clorofórmio forma a fase abaixo da nterface sólida. O DNA foi

então removido, precipitado com etanol e ressuspenso com tampão TE (Invitrogen).

Após a extração o DNA foi submetido à eletroforese em gel de agarose a

0,8% com SYBR safe DNA gel stain 10.000X concentrate in DMSO (Invitrogen) por

uma hora e comparado com padrão de peso molecular 100bp DNA Ladder (2-

2,072bp) (Invitrogen). O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e

posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação. O DNA foi

quantificado em aparelho UV Spectrophotometer 50 Conc Varian e diluído para uma

concentração final de 5ng/µl sendo as amostras armazenadas a -70ºC.

3.9.4.2 Extração do DNA plasmidial

As bactérias Gram-negativas produtoras de ESBL, foram semeadas em meio

sólido de Luria Bertani (LB) com ampicilina (50mg/ml) (Promega) e incubadas a

37°C por 16hs. Após 16hs, retirou-se 01 colônia pura para inoculação em 5ml de

meio líquido de cultura LB com nova incubação a 37°C 16-18hs sob agitação sendo

a extração realizada conforme protocolo do kit Wizard® Plus SV Minipreps-DNA

purification System (Promega® , Madison, WI, USA).

42

A técnica baseou-se no rompimento da parede celular para se obter um

lisado, separando o DNA solúvel dos restos celulares e outros materiais insolúveis,

purificando-o de proteínas solúveis e outros ácidos nucléicos. O rompimento da

célula foi feito utilizando-se detergentes ou desnaturação alcalina. O lisado foi

clareado por centrifugação, filtração ou clareamento magnético. O DNA foi então

purificado da parte solúvel do lisado. Quando as matrizes de sílica foram utilizadas,

o DNA foi eluído em água livre de nuclease. Obteve-se então um material de alta

qualidade e pronto para ser utilizado em várias aplicações moleculares (Promega®).

Após a extração, o DNA plasmidial foi submetido à eletroforese em gel de

agarose a 0,8%, com SYBR safe DNA gel stain 10.000X concentrate in DMSO

(Invitrogen) por uma hora e vinte minutos, e comparado com padrão de peso

molecular 2-16Kb DNA Ladder (Promega). O gel foi examinado em transiluminador

ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de

fotodocumentação. A avaliação e classificação do plasmídio foi realizada a partir da

análise comparativa dos padrões de peso molecular do DNA plasmidial das cepas

isoladas resistentes aos antibióticos.

3.9.4.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) 3.9.4.3.1 Para o gene 16S rRNA

Realizou-se o PCR para amplificação do DNA genômico das bactérias Gram-

positivas e Gram-negativas. O protocolo para o 16S rRNA utilizando o primer

bacteriano universal (Invitrogen) com um produto de PCR de aproximadamente 900

bp, foram realizados para confirmar o gênero e espécie, conforme protocolo de

Miyoshi et al.(2005)(91). A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 35

ciclos de 95ºC por 2 minutos (min.), 94ºC por 1 min., 58ºC por 1 min., 72ºC por 1

min., 72ºC por 5 min., e 4ºC forever totalizando um tempo de 2,5hs.

A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 1%, corado com

Sybr safe DNA gel stain 10.000X concentrate in DMSO (Invitrogen) em 80v, por 50

minutos. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi

aplicado para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em

43

transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema

apropriado de fotodocumentação.

A sequência de similaridade da região 16S rRNA foi comparada com os

dados do Genbank utilizando-se a ferramenta BLAST com o algoritmo MegaBLAST.

Os Primers universais utilizados na reação foram 27F-5′-

AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′; 149 R -5′-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3′ (91) .

3.9.4.3.2 PCR em tempo real (q-PCR) para o gene mecA

Para a amplificação do gene mecA e Nuc utilizou-se 17µl de mix para reação

(330µl de Power sybr, 66µl de primers mix, 165µl de água mili-Q) e 3µl da amostra.

A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 95º C por 10 minutos, 45

ciclos de 95ºC por 10 segundos, 50ºC e 60ºC por 15 segundos, e a curva de

desnaturação (melt) padrão.

3.9.4.3.3 Gene mecA

Os primers mecA (mecA1 e mecA2), tipos de SCCmec (CIF2, ccrC, RIF5,

SCCmecV, SCCmecIII, dcs, ccrB2, kdp, mecIP2, mecIP3, mecAP4 e mecAP7),

toxinas bacterianas (seh, arcA, etd, LUKPV) foram obtidos de acordo com o

protocolo descrito por Jonas et al. (2002) (66), Thomas et al. (2007) (130), Milheiriço et

al. (2007) (87), e Strommenger et al., (2008)(110). Cepas S. aureus ATCC (33591) e

S. epidermidis (ATCC12228) foram utilizadas como controle positivo e negativo

(quadro 4).

Para uma reação com volume final de 25µl, utilizou-se 20µl de mix para a

reação (14,45µl de água ultrapura, 2,5µl de tampão 10X (Invitrogen), 1,25µl de

MgCl2 (50µm) (Invitrogen), 0,5µl dNTP (10µm) (Invitrogen), 1,0µl do total de primers

(forward e reverse), 0,3µl de DNA Taq polimerase (5U/ml) (Invitrogen) e 5µl de DNA

cromossomal (5ng). A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 30 ciclos

de 94º C por 4 minutos (min.), 94ºC por 45seg., 50ºC por 45seg., 72ºC por 60 seg.,

72ºC por 2min., e temperatura final de 4ºC, totalizando um tempo de 2,25hs.

44


Sybr safe DNA gel stain 10.000X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 75v, por uma

hora. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado

para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em transiluminador


fotodocumentação.

Quadro 4. Iniciadores mecA e SCCmec utilizados na reação Tipos de Primers Sequência de nucleotídeos

mecA1 5’-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA-3’

mecA2 5’-CCAATTCCACATTGTTCGGTCAA-3’

CIF2 F2 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG

CIF2 R2 ATTTACCACAAGGACTACCAGC

ccrC F2 GTACTCGTTACAATGTTTGG

ccrC R2 ATAATGGCTTCATGCTTACC

RIF5 F10 TTCTTAAGTACACGCTGAATCG

RIF5 R13 ATGGAGATGAATTACAAGGG

SCCmecVJ1 F TCTCCATTCTTGTTCATCC

SCCmecVJ1 R AGAGACTACTGACTTAAGTGG

dcs F2 CATCCTATGATAGCTTGGTC

dcs R1 CTAAATCATAGCCATGACCG

ccrB2 F2 AGTTTCTCAGAATTCGAACG

ccrB2 R2 CCGATATAGAAWGGGTTAGC

Kdp F1 AATCATCTGCCATTGGTGATGC

Kdp R1 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG

SCCmecIIIJ1 F CATTTGTGAAACACAGTACG

SCCmecIIIJ1 R GTTATTGAGACTCCTAAAGC

mecIP2 ATCAAGACTTGCATTCAGGC

mecIP3 GCGGTTTCAATTCACTTGTC

mecAP4 TCCAGATTACAACTTCACCAGG

mecAP7 CCACTTCATATCT TGTAACG

45

3.9.4.3.4 Tipos de SCCmec

Para uma reação com volume final de 25µl, utilizou-se 20µl de mix para a

reação (13,5µl de água ultrapura, 2,5µl de tampão 10X (Invitrogen), 0,75µl de MgCl2

(50µm) (Invitrogen), 0,5µl dNTP (10µm) (Invitrogen), 1,25µl do total de primers

(forward e reverse), 0,25µl de DNA Taq polimerase (5U/ml) (Invitrogen) e 5µl de

DNA cromossomal (5ng). A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 30

ciclos de 94º C por 4 minutos (min.), 94ºC por 30seg., 53ºC por 30seg., 72ºC por 1

min., 72ºC por 4 min., e temperatura final de 4ºC, totalizando um tempo de 2,25hs.

Cepas S. aureus ATCC (33591) e S. epidermidis (ATCC12228) foram utilizadas

como controle positivo e negativo






fotodocumentação.

3.9.4.3.5 Genes seh, etd, arcA e lukPV das toxinas bacterianas

Para a reação com volume final de 25µl, utilizou 20µl de mix para a reação

(12,95µl de água ultrapura, 2,5µl de tampão 10X (Invitrogen), 1,25µl de MgCl2

(50µm), 0,5µl de dNTPs (10µm) (Invitrogen), 2,5 µl do mix de todos os primers

(forward e reverse), 0,3µl de DNA Taq polimerase (Invitrogen) e 5µl de DNA

cromossomal (5ng). A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 30 ciclos

de 94ºC a 4 min., 94ºC por 45seg., 50ºC 45 seg., 72 ºC 60seg., 72 ºC 2min., e

temperatura final de 4ºC, perfazendo um total de 2,25horas. Os primers seh, etd,

arcA, lukPV foram obtidos de acordo com o protocolo descrito por Strommenger et

al. (2008)(110). Cepas S. aureus ATCC (29213) S. epidermidis (ATCC 12228) foram

utilizadas como controle positivo (quadro 5).

46


SYBR safe DNA gel stain 10.000X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 75v, por uma




fotodocumentação.

Quadro 5. Iniciadores das toxinas bacterianas utilizados na reação Tipos de primers Sequência de nucleotídeos

Seh f CAACTGCT GATTTAGCTCAG

Seh r GTCGAATGAGTAATCTCTAGG

arcA f TTGCTCAAACTTTGAGAGATGAA

arcA r TTACGTACGCCAGCCATGAT

Setd f CCCGTTGATTAGTCATGCAG

Setd r CCAGAATTTCCCGACTCAG

lukPV f ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA

lukPV r GCATCAAGTGTATTGGATAGCAA AAGC

3.9.4.3.6 Genes das Beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs)

A detecção dos genes bla (beta-lactamase) foi realizada através da

amplificação por PCR com os iniciadores para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e

blaOXA, respectivamente (quadro 6).

Quadro 6. Iniciadores das ESBLs

Genes Tipos de primers Sequência de nucleotídeos

blaTEM TEM-F 5’ – ATGAGTATTCAACATTTCCG – 3’

TEM-R 5’ – CTGACAGTTACCAATGCTTA – 3’

blaSHV SHV-F 5’ – GGTTATGCGTTATATTCGCC – 3’

SHV-R 5’ – TTAGCGTTGCCAGTGCTC – 3’

blaCTX-M CTX-F 5’ – ATGTGCAGYACCAGTAARGT – 3’

CTX-R 5’ – TGGGTRAARTARGTSACCAGA – 3’

blaOXA OXA-F 5’ – ACACAATACATATCAACTTCGC – 3’

OXA-R 5’ – AGTGTGTTTAGAATGGTGATC – 3’

Legenda: Y = C ou T; R = A ou G; S = G ou C.

47

Para uma reação com volume final de 25µl, utilizou-se 5µL de tampão 5X;

2,5µL de MgCl2 (25mM); 0,5µL de dNTP (10µM); 1µL de cada iniciador (10µM);

0,2µL de GoTaq™ DNA Polymerase, 5µL de DNA cromossomal (5ng) e 1µL para

DNA plasmidial (1:10). A seqüência do ciclo de amplificação foi de 96ºC por 5 min;

35 ciclos de 96ºC por 1 min, 58ºC(TEM) / 60ºC (SHV) por 1 min e 72ºC por 1 min.

Após a finalização dos ciclos, houve uma extensão final de 72ºC por 10 min. Para o

gene blaCTX-M: desnaturação inicial a 94ºC por 7 min; seguida de 35 ciclos de 50 seg

a 94ºC, 40 seg a 50ºC, 1 min a 72ºC; e extensão final de 5 min a 72ºC. Para blaOXA:

desnaturação inicial de 5 min a 96ºC; seguido de 35 ciclos de 1 min a 96ºC, 1 min a

60ºC, 2 min a 72ºC; e extensão final de 10 min a 72ºC.






fotodocumentação. Foi utilizado como controle positivo para o gene blaSHV cepa de

K. pneumoniae ATCC 700603 tanto para o plasmídeo como para o cromossomo.

3.9.4.3.7 Genotipagem para identificação dos clones bacterianos Os primers referentes aos sete loci dos genes housekeeping e os protocolos

para realização das PCRs para o clone do S. aureus: arc (Carbamato quinase), aro

(Siquimato deidrogenase), glp (Glicerol quinase), gmk (Guanilato quinase), pta (Fosfato acetiltransferase), tpi (Triosefosfato isomerase), yqi (Acetil coenzima A

acetiltransferase) e dos clones dos S. epidermidis: arcC (Carbamato quinase),

aroE (Siquimato deidrogenase), gtr (Transportador ABC), mutS (Proteína de reparo

do DNA), pyrR (Proteína operon reguladora da pirimidina), tpiA (Triosefosfato

isomerase), yqiL (Acetil coenzima A acetiltransferase), foram obtidos de acordo

com os protocolos descritos no site (http://www.mlst.net/) com adequações nas

concentrações dos reagentes e na temperatura do ciclo da reação (anexo 3).

http://www.mlst.net/

48


SYBR safe DNA gel stain 10.000X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 75v, por uma




fotodocumentação.

3.10 Purificação pré-sequenciamento

A purificação foi realizada conforme recomendação do fabricante do kit illustra TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Buckinghamshire,

UK). A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 1%, corado com

SYBR safe DNA gel stain 10.000X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 80 v, por uma




fotodocumentação. O seqüenciamento de todas as amostras foi realizado no

aparelho ABI Sequence (Applied Biosystems) para se detectar a seqüência

nucleotídica e posterior comparação com o banco de dados público BLAST e

GenbanK databases. Para os genes pesquisados no MLST (Multi Locus Sequence

Typing) a purificação foi realizada conforme protocolo do Big Dye® X terminatorTM

purification kit (Applied Biosystems) sendo posteriormente sequenciados.

3.11 Precipitação do DNA com Isopropanol/etanol

Para a reação com volume final de 20µl, utilizou 19µl de mix para a reação de

pré-sequencimamento (12,0µl de água ultrapura, 3,0µl de tampão 5X (Invitrogen),

1,5µl de cada primer separadamente, 2,5µl de Big Dye (invitrogen) e 1,0µl de DNA

amplificado (forward e reverse separadamente) com Big Dye. A seqüência do ciclo

de amplificação da reação foi de 30 ciclos de 96 ºC a 1 min., 96ºC por 15seg., 50ºC

15 seg., 60ºC 4 min., 4ºC forever, perfazendo um total de 2,30horas.

49

Posteriormente as amostras foram precipitadas adicionando-se 80µl de

isopropanol a 75% e submetidas ao vortex. A placa foi selada com papel colante e

deixada a T.A. (temperatura ambiente) por 15min. protegida da luz. Em seguida a

mesma foi centrifugada por 20min. a 14.000 rpm descartando-se o sobrenadante por

inversão sobre um papel absorvente. Aplicou-se um pulso de rotação da centrífuga

com a placa invertida sobre o papel absorvente. Adicionou-se 20µl de etanol a 70%

em cada amostra e selou-se a placa novamente, submetendo a mesma a uma nova

centrifugação a 14000 rpm a T.A. Posteriormente, descartou-se o sobrenadante e

repetiu-se a centrifugação com a placa invertida sobre o papel absorvente. O pellet

preso no fundo do poço ficou a temperatura ambiente para secar, protegido da luz, e

a placa foi preparada para o seqüenciamento.

3.12 Seqüenciamento

Para a ressuspensão da amostra foi utilizada 10 µl formamida Hi-Di (applied

Biosystems P/N 4311320) em cada uma, sendo posteriormente tampadas com papel

laminado. A palca foi selada, submetida ao vortex, uma rotação na centrifuga e

desanturada no termociclador a 95ºC por 2 min. Posteriormente a placa foi colocada

no gelo seco por 2 min. e submetida a uma nova rotação na centrífuga para

remoção de bolhas de ar. Removeu-se o adesivo selante da placa. Posteriormente,

ambas placa, bandeja e tampa adaptativa foram inseridas no autosampler do

aparelho de seqüenciamento 3130/genetic analyser (applied Biosystems Hitachi) e

procedida à reação de seqüenciamento.

3.13 Controle de Qualidade Dos meios de cultura e do antibiótico utilizado no teste de suscetibilidade,

foram utilizados as cepas de: S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 33591, S.

aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922, S. saprophyticus ATCC 15305, S.

epidermidis ATCC 12228, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, S. pyogenes

ATCC 19615, K. pneumoniae ATCC 13883; , K. pneumoniae ATCC 700603; E.

aerogenes ATCC 13048; E. cloacae ATCC13047 (American Type Culture and

Collection), recomendado pelo Institute for Clinical and Laboratory Standards (CLSI,

50

2005) (29). Para os testes moleculares utilizou-se os padrões de peso molecular

Supercoiled DNA Ladder de 2- 10Kb (Promega), DNA Ladder de 100bp e 123bp

(Invitrogen).

3.14 Armazenamentos de amostras As amostras de bactérias isoladas foram armazenadas em meio de cistina

tripticase soja com 10% de glicerol em freezer a -70ºc (CLSI, 2005) (29).

3.15 Análise de Dados Os dados coletados foram armazenados em planilha do Excel e os

resutados descritos e demonstrados através de tabelas de freqüência e

gráficos. 3.16 Fontes de financiamento (Nacionais e/ou Internacionais)

Projeto submetido e aprovado pelo Edital MS/CNPq/FAPEAM N. 014/2006,

Programa de pesquisa para o SUS: gestão compartilhada em saúde.

51

4 RESULTADOS Os resultados estão apresentados na forma de artigos originais.

52

4.1 Artigo 1 Extended-spectrum beta-lactamase-producing bacteria isolated from hematologic patients in Manaus, State of Amazonas, Brazil

Cristina Motta Ferreira1*, William Antunes Ferreira2, Nayanne Cristina Oliveira da

Silva Almeida3, Felipe Gomes Naveca4, Maria das Graças Vale Barbosa5

1Universidade Estadual do Amazonas (UEA); Fundação de Medicina Tropical do

Amazonas (FMT-AM); Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas

(HEMOAM), Manaus, State of Amazonas, Brazil. 2Fundação de Dermatologia Tropical e Venereologia Alfredo da Matta (FUAM). 3Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Manaus, State of Amazonas, Brazil. 4Leônidas and Maria Deane Institute/FIOCRUZ, Manaus, State of Amazonas, Brazil. 5The Amazon Tropical Medicine Foundation FMT-AM; Universidade Estadual do

Amazonas (UEA), Manaus, State of Amazonas, Brazil.

*Corresponding Author Cristina Motta Ferreira

Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM)

Address: Avenida Constantino Nery, 2533 Apto. 704, Bloco B, Residencial.

Maria da Fé. CEP: 69050-001, Manaus, Amazonas, Brazil.

Telephone: (55)-92-3233-30-89; Email: [email protected]

Abstract Antibiotic therapy in hematologic patients, often weak and susceptible to a

wide range of infections, particularly nosocomial infections derived from long

hospitalization periods, is a challenging issue. This paper presents ESBL-producing

strains isolated from such hematologic patients treated at the Amazon Hematology

and Hemotherapy Foundation (HEMOAM) in the Brazilian Amazon Region to identify

the ESBL genes carried by them as well as the susceptibility to 11 antimicrobial

agents using the E-test method. A total of 146 clinical samples were obtained from

July 2007 to August 2008, when 17 gram-negative strains were isolated in our

mailto:[email protected]

53

institution. The most frequent isolates confirmed by biochemical tests and 16S rRNA

sequencing were E. coli (8/17), Serratia spp. (3/17) and B.cepacia (2/17).

All gram-negative strains were tested for extended-spectrum-beta-lactamases

(ESBLs), where: (12/17) strains carried ESBL; among these, (8/12) isolates carried

blaTEM, blaCTX-M, blaOXA , blaSHV genes, (1/12) blaTEM gene and (3/12) blaTEM, blaCTX-M,

blaOXA genes. Antibiotic resistance was found in (15/17) of the isolates for

tetracycline, (12/17) for ciprofloxacin, (1/17) resistance for cefoxitin and

chloramphenicol, (1/17) for amikacin and (3/17) cefepime. This research showed the

presence of gram-negative ESBL-producing bacteria infecting hematologic patients

in HEMOAM. These strains carried the blaTEM, blaSHV, blaCTX-M and blaOXA genes

and were resistant to different antibiotics used in the treatment. This finding was

based on a period of 13 months, during which clinical samples from specific

populations were obtained. Therefore, caution is required when generalizing the

results that must be based on posological orientations and new breakpoints for disk

diffusion and microdilution published by CLSI 2010.

Key words ESBL, beta-lactams, nosocomial infection, TEM, SHV, OXA, CTX-M

Running Title ESBL-producing bacteria from hematologic patients

Introduction

Extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) are enzymes produced by gram-

negative bacteria such as Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli (24) as well as

by species from other genera, such as Enterobacter sp., Salmonella sp., Proteus sp.,

Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, and

Burkholderia cepacia (2, 3, 31, 26).

ESBLs originate from punctual genetic mutations in the active sites of the

TEM-1, TEM-2, and SHV-1 enzymes (3, 10, 12, 31, 19, 23, 26, 34), which enable the

54

hydrolysis of extended-spectrum cephalosporins, monobactams, penicillins. (2, 3, 5,

9, 11, 12, 27, 30). However, these plasmid mediated enzymes have their activity

inhibited by clavulanic acid, tazobactam and sulbactam. Another important

epidemiological characteristic is the possibility of these enzymes being transferred to

other species via plasmids or transposons (2, 3, 5, 6, 9, 11, 12, 21, 27, 28, 30, 34).

The emergence of ESBL-producing bacteria, responsible for infectious

processes with high levels of morbidity and mortality has complicated the therapeutic

options available for elderly, immunocompromised, and debilitated individuals (4, 31).

The prevalence of ESBLs among clinical isolates varies according to countries and

institutions (31). In the United States, the presence of these enzymes among

Enterobacteriaceae has increased from 0% to 25%, with a national average of 3%,

whereas the percentage of Klebsiella sp. has demonstrated an increased resistance

from 5% to 10% to ceftazidime (6).

In other countries, such as Switzerland, the frequency of ESBL-producing

bacteria varies from 3% to 8%, whereas it is 34% in Portugal, 4.8% in Korea, 8.5% in

Taiwan, 12% in Hong Kong, and 58% in Turkey. In Latin America, studies have

reported frequencies ranging from 30% to 60% (6, 21). The prevalence of ESBL

resistance to antibiotics in Brazil has reached 45.4%, 65% of which stand for K.

pneumoniae and E. coli, which is considered one of the highest levels in the world.

For the city of Manaus, in the State of Amazonas, Brazil, no published data is found

regarding the prevalence of such bacteria (3, 5).

ESBL-producing bacteria are responsible for serious infectious processes,

commonly associated with outbreaks of nosocomial infections. This situation is

relevant as most patients with hematologic diseases undergo chemotherapy that can

lead to a deficient immune response. These medical conditions can lead to

prolonged hospitalization, elevation of the risks of mortality and morbidity, and

increased treatment costs.

This study therefore aimed to detect ESBL-producing strains isolated from

such hematologic patients treated at the HEMOAM in the Brazilian Amazon region to

55

identify the ESBL genes carried by them and susceptibility to 11 antimicrobial agents

using the E-test method. Materials and Methods The study was approved by the HEMOAM Ethics Committee (Approval

number 170 CAAE- 0005.0.112.000-06 -Version 003/06). An informed consent was

obtained from each patient before specimens were collected and the results were

used for the management of each respective patient.

We conducted a descriptive cross-sectional study including patients of both

sexes at any age who had been admitted to the HEMOAM Foundation in the city of

Manaus, State of Amazonas, with prior diagnosis of hematologic disease, presenting

clinical signs and symptoms suggestive of acute gram-negative bacterial infection,

whether feverish or not, or having developed fever during hospital stay in the period

from July 2007 to August 2008.

Gram-negative bacteria strains were identified using colonial morphology on

blood, MacConkey, Eosin Methylene Blue (EMB), and Mueller-Hinton agar plates

(Himedia- Hexasystems, Mumbai, India), followed by biochemical panels like NF II

Kit, enterokit C, and enterokit B (Probac, São Paulo, Brazil). Other tests, such as

urease, oxidase, glucose, mannose, lactose, and maltose fermentation, were also

performed. The 16S rRNA protocol with the bacterial primers 27F (5′-

GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) and 1492R (5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′)

(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) with a product size around 900 bp, were performed

to confirm genus and species (17).

The sequence analysis of the 16S rRNA region was compared with GenBank

data using BLAST search with the MegaBLAST algorithm for identifying high-

similarity sequences. The sequences with the highest levels of similarity were

considered as being consistent for species identified by the biochemical tests.

The antibiotics E-test® strips representing common drugs used in the

56

treatment of suspected gram-negative bacterial infections in our hospital were

chosen for antimicrobial testing. Strips included tetracycline, ceftazidime, cefoxitin,

chloramphenicol, cefepime, and amikacin (0.016–256.0 µg/mL), and ciprofloxacin

and imipenem (0.002–32.00 µg/mL).

Test organisms were suspended in 0.8% saline to 0.5 McFarland standards

and then inoculated on Mueller-Hinton agar plates, followed by overnight incubation

at 37°C for 18–24 hours. Interpretation was performed using guidelines laid down in

the Clinical and Laboratory Standards (CLSI; Wayne, Pennsylvania, USA) manual,

which provides break points corresponding to the diameter of the zone of inhibition.

The isolates were screened for the production of ESBL by the E-test® method

with the antibiotics cefotaxime (0.25–16 μg/mL)/cefotaxime (0.016–1 μg/mL) plus 4

μg/mL clavulanic acid, ceftazidime (0.5–32 μg/mL) /ceftazidime (0.064–4 μg/mL) plus

4 μg/mL clavulanic acid, following manufacturer’s recommendations (7). Strains of E.

coli ATCC 25922 and K. pneumoniae ATCC 700603 were used as quality controls for

culture media, susceptibility tests, PCR and the ESBL-production E-test®.

The bacteria deemed as positive for ESBL-production were inoculated in 5 ml

of Luria-Bertani (LB) broth with ampicillin (50 µg/mL) and incubated at 37°C for 16

hours for plasmid extraction following the protocol described in the Kit Wizard® Plus

SV Minipreps-DNA purification System (Promega®; São Paulo, Brazil).

Electrophoresis was performed in 0.8% agarose gel stained with SYBR Safe

(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for the identification of plasmid sizes. The

Supercoiled Loading Dye Ladder 2-16 Kb (Invitrogen) was used as a standard

molecular weight. Data were filed by using Excel programs. ESBL isolates were

preserved for future molecular analysis. PCR amplification for the detection of

chromosomal beta-lactamase resistance AmpC type in Pseudomonas spp. isolates

was not included in our study.

The Polimerase Chain Reaction (PCR) assay to amplification and detection of

the blaTEM, blaSHV, blaCTX-M and blaOXA was carried out in a final volume reaction of

57

25µl using 10X buffer, MgCl2(50mµ), dNTP (10mµ), DNA Taq polimerase (5U/mL)

(Invitrogen), 1,25µl of each primer TEM-F, TEM-R, SHV-F, SHV-R, blaCTX-M-F,

blaCTX-M-R, blaOXA-F, blaOXA-R and 5µl of plasmidial DNA. Cycling parameters were

previously described (Table 2). The amplified products obtained have not been

sequenced up to the present moment.

Results

A total of 146 clinical samples were obtained from 69 patients over a period of

thirteen months. These samples included the following: urine, pus, blood, marrow

aspirate, sputum, feces, abscesses, and oropharyngeal and nasopharyngeal swabs.

The strains isolated from different specimen type are presented in Table 5.

Table 2. Primer sequence and PCR conditions

Primers Oligonucleotide sequence

(5’to 3’) PCR conditions Reference

Expected size (bp)

TEM-F ATGAGTATTCAACATTTCCG 1 cycle of 5 min at 96oC; 35 cycles

of 1min at 96ºC; 1min at 58 ºC;

1min at 72 ºC ; 1 cycle of 10 min at

72oC

14 867 TEM-R CTGACAGTTACCAATGCTTA

SHV-F GGTTATGCGTTATATTCGCC 1 cycle of 5min at 96 ºC; 35 cycles

of 1min at 96 ºC, 1min at 60oC,

1min at 72 ºC; 1 cycle of 10 min at

72 ºC

14 867 SHV-R TTAGCGTTGCCAGTGCTC

CTX-M-F ATGTGCAGYACCAGTAARGT 1 cycle of 7min at 94oC; 35 cycles

of 50 sec at 94 ºC, 40 sec at 50 ºC,

1 min at 72 ºC; 1 cycle of 5min at

72 ºC.

14 593 CTX-M-

R TGGGTRAARTARGTSACCAGA

OXA- F ACACAATACATATCAACTTCGC 1 cycle of 5min at 96oC; 35 cycles

of 1min at 96 ºC, 1min at 60 ºC, 2

min at 72 ºC; 1 cycle of 10 min at

72 ºC.

14 885 OXA- R AGTGTGTTTAGAATGGTGATC

58

Table 5. Strains isolated from different specimen type detected from patients with

infections

Specimen types Isolates

Blood

K. pneumoniae, E. coli, Pseudomonas sp., P.

stutzery, Serratia sp., B. cepacia

Urine E. coli

feces E. coli

Eye secretion Pseudomonas aeruginosa

In relation to gender, (35/69) were male and (34/69) were female. Among the

collected samples, we isolated 44 bacterial strains, 17 of which were gram-negative.

The most frequent hematological diseases in the patients were acute lymphocytic

leukemia (36/69) and acute myeloid leukemia (6/69) (Table 1).

Table 1. Frequency of hematologic diseases diagnosed in this study

Hematologic disease N

Acute lymphocytic leukemia 36

Acute myeloid leukemia 6

Sickle cell anemia 4

Pancytopenia 4

Chronic myeloid leukemia 3

Chronic lymphocytic leukemia 3

Hemophilia 2

Multiple myeloma 2

Others● 9

Total 69 ● Hypofibrinogenemia + hemophilia (2/9), Thalassemia (1/9), aplastic anemia (1/9),

thrombocytopenic idiopathic purpura (1/9), acute hemolytic anemia (1/9), lymphoma (1/9),

unidentified leucopenic disease (1/9), myelodysplastic syndrome (1/9)

59

Biochemical tests and 16S rRNA sequencing detected E. coli (8/17), followed

by Serratia sp. (2/17), Serratia liquefaciens (1/17) and B. cepacia (2/17) as the most

frequent gram-negative strains. All the strains were tested for the production of ESBL

and the E-test showed that (12/17) were ESBL producers (Table 3).

All of them had their plasmid extracted and the molecular weights were 3.5, 7

and >15 Kb. The PCR assay showed that that (8/12) isolates carried blaTEM, blaCTX-M,

blaOXA , blaSHV genes, (1/12) blaTEM gene and (3/12) blaTEM, blaCTX-M, blaOXA genes.

As presented in Table 4, the results from antimicrobial susceptibility tests

demonstrated antibiotic resistance in (15/17) of the isolates for tetracycline, (12/17)

for ciprofloxacin, (1/17) resistance for cefoxitin/chloramphenicol, and (1/17) for

amikacin and (3/17) for cefepime.

Data regarding the molecular epidemiology of ESBL clonality and PCR

amplification for the detection of chromosomal beta-lactamase resistance AmpC type

in Pseudomonas spp. isolates have not been presented so far, but we believe that

this will not expressively impact on this study as it was aimed to detect ESBL-

producing strains in hematologic patients only. Our finding was based on a period of

13 months, during which clinical samples were obtained from a specific population.

Therefore, caution is required when results are generalized as they must be based

on posological orientations and new breakpoints for disk diffusion and microdilution according to the CLSI 2010 manual M100-S20.

60

Table 3. Gram-negative strains, ESBL phenotypes and genes detected from patients with infections

Bacteria Identified Strains

ESBL ESBL encoding gene detected by PCR positive indeterminate negative

n n N n

Escherichia coli 8 6 - 2 blatEM, blaOXA, blaCTX-M, blaSHV, blaTEM, blaOXA, blaCTX-M. Klebsiella pneumoniae 1 - - 1 ND Serratia spp. 2 2 - - blaTEM,blaCTX-M, blaOXA. blaTEM Serratia liquefaciens 1 - 1 - ND Pseudomonas aeruginosa 1 - - 1 ND Pseudomonas stutzeri 1 1 - - blaOXA, blaTEM, blaCTX-M. Pseudomonas spp. 1 1 - - blaTEM.,blaCTX-M, blaSHV, blaOXA. Burkholderia cepacia 2 2 - - blaTEM,blaCTX-M, blaSHV, blaOXA. Total 17 12 1 4

61

Table 4. Antimicrobial Susceptibility test (E-test) for 17 Gram-negative bacteria isolated from patients with

bacterial infection

Antibiotics

Bacteria

E. coli K.

pneumoniae

Serratia

spp.

S.

liquefaciens

P.

aeruginosa P. stutzeri

Pseudomonas

spp.

B.

cepacia

S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R

Tetracycline - - 8 - - 1 1 - 1 - - 1 1 - - - - 1 - - 1 - - 2

Ciprofloxacin 1 - 7 1 - - 1 - 1 1 - - 1 - - - - 1 - - 1 - - 2

Ceftazidime 2 6 - 1 - - 1 1 - 1 - - 1 - - 1 - - - 1 - 1 1 -

Cefoxitin 5 2 1 1 - - 1 1 - 1 - - - 1 - 1 - - - 1 - 2 - -

Chloramphenicol 6 1 1 1 - - 2 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 2 - -

Amikacin 7 - 1 1 - - 2 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 2 - -

Imipenem 8 - - 1 - - 2 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 2 - -

Cefepime 3 3 2 1 - - 1 - 1 1 - - 1 - - 1 - - - 1 - 1 1 -

S: susceptible; I: intermediate; R: resistant

62

Discussion

ESBLs are enzymes that act by inhibiting the action of beta-lactam antibiotics

(1, 25). Concerns regarding the clinical and epidemiological aspects of such ESBL-

producing pathogens are related to the use of extended-spectrum antimicrobials

such as carbapenems for their treatment (12, 22), thus increasing treatment costs as

well as patient risks due to longer hospital stay and prolonged therapy (1, 29).

Furthermore, hematologic patients often undergo chemotherapy, which can

lead to an immunodeficient status and leave these patients susceptible to a wide

range of infections (32, 33). This is particularly important with respect to nosocomial

infection in the hospital environment, which can elevate the risks of mortality and

morbidity, mainly in the case of infections caused by ESBL-producing bacteria.

In our study, the most frequent ESBLs-producing bacteria were E. coli, B.

cepacia, Serratia spp., and Pseudomonas spp. In addition, ESBL-producing strains

of E. coli and K. pneumoniae have also been isolated in other studies from patients

with outbreaks of bacterial peritonitis (32), bloodstream infections (33) in ICU (1) from

different clinical samples from patients in Mwanza (Tanzania) (20), in Enugu (Nigeria)

(31), and in France, Portugal (9), Brazil (33), as well as several other countries (2,

13, 16, 19, 37).

These E. coli isolated from samples of the patients point to the possibility of a

hospital-acquired infection probably due to inadequate antibiotic therapy,

inappropriate prescriptions without culture results and susceptibility testing and

cross-infections that contributed to increase the number of these resistant isolates (1,

10, 25, 27, 40).

The detection of ESBL enzymes is very important, because according to CLSI

M100-S17 and M100-S18 (25, 27) criteria, these organisms should be reported as

resistant to all extended-spectrum beta-lactam antibiotics, regardless of their

susceptibility test results. Currently, according to CLSI M100-S20, new interpretive

criteria are available for routine ESBL testing (1, 25, 27).

63

The reduced sensitivity to cephalosporins detected in E. coli strains in this

study might be due to the variations in substratum preference, the differing accuracy

between tests for enzyme detection, weak inhibition by clavulanic acid, or different

combined resistance mechanisms that led either to reduced or no sensitivity (26, 35).

This type of phenotype could be demonstrated in other multicenter study developed

in Norway in 2003, in which 60% of ESBL-producing isolates showed reduced

sensitivity to extended-spectrum cephalosporin, possibly indicating an increased

level of resistance (26, 36).

Our findings demonstrated that all the ESBL-producing Enterobacteriaceae

were sensitive to imipenem, while 94.1% were sensitive to amikacin, indicating that

these agents can still be used in the treatment of infections caused by these

pathogens in HEMOAM. Similar results have been observed by Tumbarello et al.

(37) in a teaching hospital in Rome (Italy).

The existence of ESBL-producing Pseudomonas spp. is of serious concern as

it stands for a pathogen with the capacity to acquire resistance to a wide range of

clinically important antimicrobials and it can lead to numerous infectious processes.

In this study, we detected 33.4% of the isolates to be resistant to tetracycline and

ciprofloxacin (12, 25, 29). Similar results have been observed in India, Iran, Spain,

Portugal, Canada, and Brazil. However, in Norway, positive CTX-M isolates showed

reduced sensitivity only to ciprofloxacin (12, 16, 24, 36).

In Europe, 20% of hyperproductive ESBL isolates have demonstrated

resistance to ceftriaxone and aztreonam, while in Latin America, reports show that

the resistance rate is higher in relation to other regions of the world (12, 25). In

Manaus (Brazil), our study provides the first data regarding the existence of ESBLs in

clinical samples from patients. Thus, it is not possible to compare our results

regarding the spectrum of antimicrobial resistance.

The therapeutic alternative for treating infections caused by ESBL-positive

pathogens such as Pseudomonas spp. lies in the use of imipenem or meropenem;

however, this may stimulate the appearance of multiresistant strains in hospitals,

64

which could lead to additional serious problems for patients as well as difficulties for

physicians regarding viable therapeutic options (12, 16, 25, 39).

The control of bacterial resistance is directly related to the detection of this

mechanism through laboratory and molecular tests as well as the implementation of

rational use of antibiotics in hospitals (26, 39). We documented the presence of

blaTEM, blaSHV, blaCTX-M and blaOXA genes in E.coli, Serratia spp., Pseudomonas spp.,

and B.cepacia strains (Table 3).

Similar results were detected in other studies such as the blaCTX-M gene

detected in E.coli isolates in Cambodia, Canada, United Kingdom (28) and in clinical

outbreaks of CTX-M-15-type in India, Spain, and Portugal (9), considered as the

most prevalent ESBL-encoding gene worldwide, now replacing TEM and SHV as the

predominant ESBL isolate in European countries (14).

The prevalence of ESBL production in Enterobacteriaceae in France (18)

belonged to CTX-M variants such as CTX-M-I, and CTX-M-9. In Spain and Portugal,

they frequently detected TEM-24, CTX-M-15, CTX-M-32 and SHV-12. In Bulgaria,

CTX-M-3, CTX-M-15 and SHV-12 in S.marcescens isolates (18). In Amsterdam,

CTX-M-1, SHV-1, TEM-116 in P. aeruginosa and CTX-M-1, SHV-1 in S. maltophilia

(22). In Brazil, CTX-M-14, TEM-1, CTX-M-15, OXA-1, OXA-4 and OXA-7 (7, 22, 23).

The detection of the blaTEM, blaSHV, blaCTX-M and blaOXA genes in gram-

negative isolates in this study allows us to consider the possibility of plasmidial

resistance. Both the genes that encode the ESBLs and those that encode resistance

to non-beta-lactam antibiotics are frequently located in the same conjugative plasmid,

transmitted conjunctively from one isolate to another, showing the ability of being

separated by selective pressure due to the use of multiple antibiotics under effective

control (16, 26).

The early identification of infectious processes linked to the use of appropriate

antimicrobials based on microbiological diagnosis, rational prescription of antibiotics,

and effective control can help avoid serious hospital infections. Most significantly, it is

important to consider the inclusion of new antibiotics as therapeutic choices. These

65

measures will help the implementation of effective public policies for epidemiological

surveillance and control by Brazilian health authorities in the State of Amazonas.

This research showed the presence of gram-negative ESBL-producing

bacteria infecting hematologic patients in HEMOAM. These strains carried the blaTEM,

blaSHV, blaCTX-M and blaOXA genes and were resistant to different antibiotics used in

the treatment. It is necessary to perform screening and confirmatory test for

phenotypic detection of these strains in a routine laboratory to avoid health care

failure.

Acknowledgements

The authors are grateful to acknowledge the support provided by the

Amazonas State Research Foundation (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado

do Amazonas - FAPEAM). Inputs to carry out this research derived from a project

approved by the Research Program of SUS (the Brazilian National Health Care

System): Shared Health Management - PPSUS- Posting 014/2006-FAPEAM

Manaus, State of Amazonas, Brazil. This paper stems from the preliminary findings

reported by the author’s doctoral thesis at the Amazon State University (UEA) and

the Amazon Tropical Medicine Foundation (FMT-AM) in the field of clinical

bacteriology.

In addition, the Amazon Hematology and Hemotherapy Foundation

(HEMOAM), the Tropical Dermatology and Veneorology Foundation Alfredo da Matta

(FUAM), and the Graduate Program of Biotechnology (PPGBiotec).

Disclosure Statement No competing financial interests exist.

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70

4.2 Artigo 2 Novel Methicillin resistant coagulase-negative Staphylococci clone isolated from patients with hematological diseases at the Blood Bank Center of Amazon, Brazil Cristina Motta Ferreira1*, Felipe Gomes Naveca2*, William Antunes Ferreira3*, Cíntia

Mara Costa de Oliveira4, Maria das Graças Vale Barbosa5.

Authors affiliations: 1 Universidade do Estado do Amazonas ; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor

Vieira Dourado; Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas-HEMOAM,

Manaus-Amazon-Brazil. Manaus-Amazon-Brazil. PhD student in Infectious and

Tropical Diseases. 2Instituto Leônidas e Maria Deane/FIOCRUZ. PhD in Microbiology. Manaus-Amazon-

Brazil. 3 Fundação de Dermatologia Tropical e Venereologia Alfredo da Matta, Manaus-

Amazon-Brazil; Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. PhD student in Infectious and Tropical Diseases.

Manaus-Amazon-Brazil. 4,5 Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Manaus-Amazon-

Brazil. 4PhD in Biotecnhology; 5PhD in Biological Sciences.

*These authors contributed equally to this work Financial support: This Research Project (Nr. 3098766263) was funded by

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM. Manaus,

Amazonas, Brazil, through a Grant Proposal approved for the SUS Research

Program (called “Gestão Compartilhada em Saúde-PPSUS-014/2006”).

71

Corresponding author: Dr. Cristina Motta Ferreira. Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas-

HEMOAM, 4397 Constantino Nery Avenue, Chapada. Laboratory of Bacteriology,

CEP: 69050-002, Manaus, Amazonas, Brazil. Telephone: (55)-92-3655-01-00;

E-mail: [email protected]

Running title: Methicillin resistant Staphylococcus in Manaus Keywords: SCCmec, ST clones, coagulase-negative Staphylococcus, S. aureus,

methicillin resistant, nosocomial infection, blood infection, hospital, hematologic

disease.

Abstract Methicillin-resistant Staphylococcus remains as a severe public health problem

worldwide. We conducted MLST analysis that revealed three different sequence

types isolated from patients with hematological diseases: S. aureus ST243, S.

epidermidis ST2, and a new clone of S. epidermidis ST365. Those findings reinforce

the potential of dissemination presented by multiresistant Staphylococcus.

Methicillin-resistant Staphylococci stand as main pathogens responsible for

high levels of infectious process worldwide. The methicillin resistance has to do with

penicillin binding protein (PBP 2a) encoded by the mecA gene, located at the

staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). In S. aureus types I and VI

are noticed, whereas types IV and V are found in S. epidermidis and S. haemolyticus

(1).

The genotype distribution of Staphylococci differs in different geographical

regions. USA300 CAMRSA clone ST8 is dominant in the United States and the ST80

and ST30 in Europe, Kuwait, Singapore, the Southwest Pacific islands and, New

Zealand (2). In relation to S. epidermidis, the ST69 clone, is predominant in Greece;

ST57, ST88 in Portugal, ST2 in China, ST2, ST22, ST61, ST71 in Mexico and ST63

in Argentina (4).

The risk for immunocompromised patients can be significant if they catch

infections caused by those species in hospitals. The presence of

72

immunocompromised patients at the hospital and blood bank where this research

took place is common due to chemotherapy applied against leukemia, myeloma,

hemolytic anemia, hemophilia, etc. This can increase morbimortality risks due to

prolonged hospitalization, spread of multi-resistant strains, and rise in treatment

costs.

Therefore, the resistance of these bacteria against antibiotics, their respective

SCCmec and ST was identified. The knowledge of geographic distribution,

transmission mechanisms, factors that contribute to the appearance and spread of

these genotypes will help control hospital infection outbreaks and dissemination, and

implement programs to supervise the resistance presented by these pathogens. The Study

In the period from July 2007 to August 2008, we conducted a descriptive

cross-sectional study including patients of both sexes, admitted to the HEMOAM

Foundation, who had a previous diagnosis of hematologic disease, presenting clinical

signs and symptoms suggestive of acute bacterial infection, whether feverish or not,

or having developed fever during hospital stay. The HEMOAM Foundation is a high

complexity hospital for hematological diseases that supplies blood and

hemoderivatives for the city.

Each patient provided more than one sample: urine, blood, sputum, feces,

catheter tip, bone marrow aspirate, and abscess fluid along with oropharyngeal,

ocular, perianal, nasopharynx, open wound, and skin lesion secretions were

collected. Biochemical tests and nucleotide sequencing of the 16S rRNA region

presented Staphylococcus epidermidis, S. intermedius, S. aureus and

Staphylococcus sp. as the most frequent species. Other isolated species were S.

hyicus, S. haemolyticus, S. simulans, S. intermedius, S. lugdunensis (Table 1).

73

Table 1. Strains isolated from patients with hematologic disease

Strains n°

Micrococcus sp 1

Staphylococcus aureus 4

Staphylococcus hyicus 1

Staphylococcus sp 5

Staphylococcus haemolyticus 1

Staphylococcus epidermidis 8

Staphylococcus simulans 1

Staphylococcus intermedius 4

Staphylococcus lugdunensis 2

TOTAL 27

The extraction of the genomic DNA of the 26 Gram-positive bacteria isolated

from the 146 biological samples collected from 69 patients, and the PCR protocol for

the identification of the mecA gene, SCCmec, toxins (seh, arcA, Setd) and the

Panton-Valentine leukocidin gene was performed as described by Jonas et al. (2002)

(5), Milheiriço et al. (2007) (6), and Strommenger et al. (2008) (7), confirming the

presence of the mecA gene and the absence of the lukPV gene.

The PCR for MLST was made as described by Thomas et al. (2007) (8) and

Enright et al. (2000) (9), disclosing three types of different sequences typing (ST): S.

aureus ST243, one of S. epidermidis ST2, and two newly isolates of S. epidermidis

ST365 clone. The ST243 strain harboured the SCCmec type I, III, V, ST2 the

SCCmec type II, III, V, and ST365 the SCCmec type I, III, V (Table 2). The

sequence of genes of this study is found at GenBank with the following access

numbers: JN398483-07.

74

Table 2. Phenotypes and genotypes profiles of the Staphylococcal strains isolated from patients with hematologic diseases

*Gold standard; ǂ S. epidermdis: arcC, aroE, gtr,

mutS, pyrR, tpiA, yqiL; S. aureus: arcC, aroE, glpF,

gmk,pta, tpi, yqiL ;

† not determined (there is no MLST protocols for those

species yet).

Strains

Phenotypes tests Genotypes tests

Oxac Cefox PBP2a mecA* SCCmec types

Allelic profileǂ MLST

S. epidermidis R S + + I,III,V 3 25 5 5 3 4 4 365

S. epidermidis R S + + I,III,V 3 25 5 5 3 4 4 365

S. epidermidis R R + + II,III,V 7 1 2 2 4 1 1 2

S. aureus R R + + I,III,V 2 2 5 2 6 3 2 243

S. intermedius R S + + I,III,V NT† NT NT NT NT NT NT NT

S. lugdunensis S S + + III NT NT NT NT NT NT NT NT

Staphylococcus sp R S + + I,III,V NT NT NT NT NT NT NT NT

Staphylococcus sp R S + + I,III,V NT NT NT NT NT NT NT NT

Staphylococcus sp. R R + + I NT NT NT NT NT NT NT NT

S. hyicus R R + + I,II,IV NT NT NT NT NT NT NT NT

75

The S. epidermidis ST 365 clone was isolated from the peripheral blood of two

male and female patients (9 and 2 years old) presenting acute lymphocytic leukemia.

The susceptibility tests showed that both presented resistance against methicillin,

tetracycline, penicillin, oxacillin, and chloramphenicol; reduced sensitivity to

ceftazidime and sensitivity to vancomycin, cefoxitin, ciprofloxacin, amikacin,

imipenem and cefepime.

The S. epidermidis ST2 clone isolated from blood infection from a 24-year-

old patient with chronic myeloid leukemia presented resistance against methicillin,

cefoxitin, oxacillin, amikacin, ceftazidime, ciprofloxacin, imipenem, cefepime; reduced

sensitivity to chloramphenicol, and sensitivity to vancomycin. Its presence in our

hospital may be due to colonized patients (reservoirs) or colonized patient,

contaminated healthcare workers-to-patient transmission, resistance profile of the

isolate in relation to antimicrobial agents, high formation of biofilm, recognized as a

critical factor for the for the colonization of medical devices, heterogeneous

expression of the gene and the SCCmec found in disease-associated isolates, ica

gene cluster, insertion sequence element IS256, and the presence of SCCmec

present in disease-associated strains. This reflects highly ability to adjust through

genetic exchange to environmental changing and antibiotics therapy (10, 11).

ST2, founder of the CC2 clonal complex, is considered as the prevalent

international cause of most S. epidermidis hospital infections, also detected as an

epidemic hospital pathogen worldwide and in different European hospitals (10, 11).

The detection of resistant methicillin strains belonging to this virulent clonal

lineage in hospitalized - mainly immunocompromised - patients, points to a possible

hospital infection, as they had been in hospital for over 72 hours, did not come from

other hospitals, received no prolonged antibiotic therapy at the moment of collection,

and presented frequent use of catheter because of the treatment.

The S. aureus ST243 clone isolated from a 30-year-old hemophilic patient with

blood infection presented resistance to methicillin, penicillin, tetracycline, cefoxitin,

oxacillin, and ceftazidime; sensitivity to ciprofloxacin, chloramphenicol, vancomycin,

76

and amikacin. Despite the in vitro sensitivity against imipenem and cefepime, CLSI

M-100 S20 recommendations suggest that they should be reported as resistant due

to low treatment effectiveness.

The presence of ST243 in our hospital may have come from patient/patient or

colonized patient/ contaminated healthcare workers- transmission and prolonged

antibiotic therapy. Other risk factors that can be considered for hematogenous

infection are nasal carriers, and skin/soft tissue infections (11, 12). This clone is

spread over the USA, Thailand and Japan (data available at www.mlst.net), though

only the Thailand clone is methicillin-resistant.

The presence of the SCCmec III cassette in S. epidermidis, with no clinical

importance in infections, must be revised, because the horizontal transfer of a large

number of resistance genes between species opens way to methicillin resistance

(13,14), which induces to the use of different antibiotics as a therapeutic option

(mainly vancomycin).

Another fact observed was the presence of SCCmec type V in S. epidermidis.

Types IV and V are small, structurally similar elements that carry the mecA gene as a

unique antibiotic resistance encoder. As they have a high competitive transfer

capacity, this can explain the presence of SCCmec type V in relation to type IV (15).

Another important factor detected was the existence of various SCCmec types. This

may suggest that multiple introductions are occurring. And their presence in the

same ST may suggest a possible horizontal transfer between the species (9).

Conclusions A horizontal transfer of the mec gene may be occurring, which favors the

appearance of methicillin resistance between the species. Microbial resistance

monitoring programs are important to avoid hospital infection outbreaks and the

spread of pathogenic clonal lines.

Acknowledgements We are grateful to acknowledge the support provided by Fundação de Amparo a

Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM. In addition, the Superintendent of the

State of the Amazonas (SUFRAMA).


77

Conflict of Interest The authors have no conflict of interest related to the development of the present

study.

Biographical Sketch Cristina Motta Ferreira, Biochemistry, MSc in Tropical Pathology, PhD student in

Infectious and Tropical Diseases, professor of clinical bacteriology in the Nilton Lins

University. The author develops activity, with emphasis on methicillin resistant

staphylococci and beta-lactamase-producing bacteria (ESBL), at the Fundação de

Hematologia e Hemoterapia do Amazonas-HEMOAM, in clinical bacteriology

laboratory.

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79

5 DISCUSSÃO

5.1 Freqüência dos gêneros e espécies bacterianas.

Neste estudo as bactérias mais freqüentes produtoras de ESBL foram a E.

coli, B. cepacia, Serratia sp. e Pseudomonas aeruginosa. As E. coli produtoras de

ESBL identificadas indicam uma possível infecção hospitalar, devido a uma

inadequada antibióticoterapia, sem exame de cultura e teste de suscetibilidade e

infecções cruzadas que contribuíram para a elevação do número desses isolados

resistentes (1, 106, 142). Bactérias gram-negativas como K. pneumoniae, E. coli assim

como outras espécies de enterobactérias tais como Salmonella sp., Serratia

marcescens, Proteus sp., Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa e B.

cepacia, podem produzir uma enzima denominada de beta-lactamase de espectro

estendido (ESBL) (2, 102) .

As ESBLS são enzimas que agem inibindo a ação de antibióticos beta-

lactâmicos. A grande preocupação clínica em relação a esses isolados, reside no

uso de outras opções terapêuticas como os carbapenêmicos e ao elevado tempo de

internação dos pacientes. Na FHEMOAM , os pacientes hematológicos são

frequentemente submetidos a quimioterapia apresentando baixa em sua imunidade,

tornando-se assim suscetíveis a uma ampla gama de infecção, principalmente as

hospitalares, elevando o risco de mortalidade (114).

5.2 Identificação dos fenótipos de sensibilidade, sensibilidade reduzida e a

resistência dessas bactérias aos antibióticos indicados no tratamento.

Com relação a sensibilidade e resistência bacterianas, foram identificadas

bactérias Gram-negativas produtoras da enzima ESBL resistentes as drogas beta-

lactâmicas, e espécies de estafilococos (MRSA e MR-SCoN) resistentes aos

antibióticos beta-lactâmicos, com a presença do gene mecA, localizado no SCCmec.

A sensibilidade reduzida detectada nas E. coli pode ser devida a variação no

substrato preferencial de ação, na fraca acurácia dos testes de detecção desta

enzima, fraca inibição pelo ácido clavulânico ou diferentes mecanismos combinados

de resistência bacteriana. Este tipo de fenótipo também foi detectado em outros

80

estudos. As enterobactérias produtoras de ESBL identificadas, demonstraram

sensibilidade ao imipenem e amicacina, indicando que estes antimicrobianos ainda

podem ser utilizados na rotina de tratamento (102, 118).

A presença de Pseudomonas sp produtoras de ESBLs é preocupante, pois

apresentam elevada capacidade de adquirir resistência a vários tipos de antibióticos.

Neste estudo, 33,4% das mesmas apresentaram resistência a tetraciclina e

ciprofloxacina. A opção terapêutica nesses casos reside no uso de meropenem e

imipenem. Entretanto, o uso freqüente desses antimicrobianos pode estimular o

surgimento de isolados mutiresistentes, o que pode prejudicar os pacientes (84, 118).

A detecção de enzimas ESBL é muito importante pois, conforme os critérios

do CLSI M100-S17 e M100-S18, devem ser reportadas como resistentes a todos os

antibióticos beta-lactâmicos, independentemente do resultado do teste de

suscetibilidade. O surgimento de bactérias produtoras de ESBL, responsáveis por

processos infecciosos com elevada morbi-mortalidade, tem dificultado a opção

terapêutica (29).

Os genes detectados nos isolados produtores de ESBL como a E. coli,

Serratia sp. Pseudomonas sp., e B. cepacia foram blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e blaOXA ,

indicando uma possível resistência plasmidial. Os genes que codificam as ESBLs e

aqueles que codificam a resistência aos antibióticos não beta-lactâmicos, estão

localizados no mesmo plasmído conjugativo, sendo transmitidos conjuntamente

entre as bactérias, podendo ser separados por pressão seletiva devido ao uso de

múltiplos antibióticos (84, 102).

Nas bactérias Gram-positivas, a resistência a meticilina nos estafilococos

ainda continua sendo um desafio para a saúde pública em diversos hospitais do

mundo. Ela é expressa devido a produção da proteína ligadora de penicilina,

codificada pelo gene mecA, localizado no cassete cromossômico estafilocócico mec,

sendo o mais freqüente o tipo I e VI nos S. aureus e, nos estafilococos coagulase

negativos o tipo IV e V. Esses patógenos representam um risco potencial para os

pacientes, principalmente os imunodebiltados. Na FHEMOAM, a presença de

pacientes imunodebilitados é comum devido a quimioterapia a que são submetidos

81

para tratamento da doença de base como leucemia, mieloma,anemia hemolítica

dentre outras, contribuindo assim para a elevação do risco de morbi-mortalidade,

prolongamento no tempo de internação e disseminação de isolados resistentes entre

os pacientes (124).

5.3 Identificar as alterações genético-moleculares de resistência envolvidas.

O clone do estafilococo coagulase negativo ST2, isolado do sangue periférico

dos pacientes, apresentou resistência a meticilina. Sua presença pode estar

relacionada com a formação de biofilme, reconhecido como fator crítico para

colonização de equipamentos hospitalares, perfil de resistência do isolado aos

antibióticos utilizados na rotina hospitalar, expressão heterogênea do gene mec,

clone do gene ica, sequência do elemento de inserção IS256 e ao SCCmec presente

em isolados associados a doença. O clone ST2 é reconhecido internacionalmente

como o agente responsável por inúmeros casos de infecções em vários hospitais da

Europa. A detecção de isolados resistentes a meticilina pertencentes a esse clone

virulento, sugere uma possível infecção hospitalar, pois os pacientes também

utilizavam cateteres, estavam internados há mais de 72 horas, não eram

procedentes de outros hospitais e nem submetidos a antibióticoterapia prolongada (139).

A presença do clone de S. aureus ST243, isolado de infecção hematogênica

dos pacientes, pode ser devida a transmissão por contato direto entre pacientes,

antibióticoterapia prolongada ou pacientes colonizados/ corpo clínico contaminado.

Outros fatores importantes que podem contribuir para o desenvolvimento de

infecção sanguínea são o portador nasal e as infecções de tecido mole. O clone

ST243 apresentou resistência a meticilina sendo detectado apenas nos Estados

Unidos, Japão e Tailânda. Somente o clone da Tailândia apresentou resistência a

meticilina, os demais foram sensíveis (139).

Em relação ao cassete cromossômico, o tipo III detectado no S. epidermidis,

considerado anteriormente como agente sem importância clínica, deve ser revisto,

pois a transferência de vários genes de resistência, pode induzir o desenvolvimento

da resistência a meticilina, tendo como conseqüência o uso de diferentes antibióticos

82

como opção terapêutica (principalmente a vancomicina). A presença do SCCmec V

em relação ao tipo IV no S. epidermidis, pode ser explicada pela elevada

competitividade entre ambos no momento da transferência entre os isolados. Outro

fator importante observado foi a presença de varios tipos de SCCmec. Isto sugere

que múltiplas introduções de cassetes podem estar ocorrendo, e a presença de um

mesmo tipo de SCCmec em um único clone, pode indicar também transferência

horizontal do gene mec entre as espécies (11, 64) .

83

6 CONCLUSÃO

Freqüência dos gêneros e espécies bacterianas

1. Identificaram-se pacientes hematológicos com infecção ocasionada por bactérias

Gram-positivas e negativas resistentes a diferentes grupos de antibióticos. As

bactérias Gram-positivas mais frequentes foram os Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus intermedius, Staphylococcus aureus e Staphylococcus sp.,

enquanto que as Gram-negativas, foram a Escherichia coli, Serratia sp., Serratia

liquefaciens e Burkholderia cepacia.

Identificação dos fenótipos de sensibilidade, sensibilidade reduzida e a resistência dessas bactérias aos antibióticos indicados no tratamento.

2. Com relação a sensibilidade e resistência bacterianas, foram identificadas

bactérias Gram-negativas produtoras da enzima ESBL resistentes as drogas

beta-lactâmicas, e espécies de estafilococos (MRSA e MR-SCoN) resistentes

aos antibióticos beta-lactâmicos, com a presença do gene mecA, localizado no

SCCmec.

Identificar as alterações genético-moleculares de resistência envolvidas.

Os genes detectados nos plasmídeos isolados das bactérias Gram-negativas foram

blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e blaOXA comprovando a presença de isolados implicados

em processos infecciosos hospitalares.

Os clones das espécies de estafilococos detectados foram:

- S. aureus ST 243 (SCCmec I, III, V) (4133 MLST database).

- S. epidermidis ST2 (SCCmec II, III, IV,V) (529 MLST database).

- Dois isolados pertencentes ao novo clone de S. epidermidis - ST 365

(SCCmec I, III, V) (527,528 MLST database).

A identificação do S. aureus ST 243 (SCCmec I, III, V, S. epidermidis ST2 (SCCmec

II, III, IV,V), e do novo clone S. epidermidis ST 365 (SCCmec I, III, V), nos

84

estafilococos meticilina resistentes, comprovam a presença de linhagens

patogênicas implicadas em processos infecciosos hospitalares.

A presença dos diferentes tipos de cassetes nos isolados meticilina resistentes

sugere múltipla introdução e, sua presença no mesmo ST, transferência horizontal

do gene mec.

85

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103

8 Anexos 8.1 Termo de Consentimento Livre esclarecido

Prevalência e sensibilidade a antibióticos das bactérias aeróbicas isoladas de processos

infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM

Este é um trabalho de pesquisa que tem como finalidade realizar um exame do micróbio que esteja

provavelmente causando uma infecção em seu corpo, e o resultado do exame poderá trazer boas

coisas para a sua saúde, pois será encaminhado para o médico que fará o tratamento adequado.

Para realizar o teste será necessária a coleta do seu sangue com agulha descartável, onde você

sentirá um leve aperto em seu braço e um pouco de dor no momento da picada da agulha, mas nada

disto comprometerá sua saúde ou seu bem estar físico. Poderá sentir também, dependendo do tipo

de exame e a solicitação do médico, uma sensação de um swab (cotonete grande) que será passado

em alguma parte de seu corpo (garganta, nariz, ferida), ou a urina que tiver que coletar. Não se

preocupe com seu sangue, pois logo após termos feito os exames ele será desprezado e somente

será guardado num freezer o germe que foi identificado como o responsável pela sua doença

infecciosa. Caso o(a) Sr. (a) ou seu filho concorde em participar, estarão nos ajudando a ter

informações sobre sua saúde e também como prevenir algumas doenças graves. O projeto poderá

ser encerrado se ocorrerem problemas além dos mencionados acima que possam prejudicá-lo. O Sr

(a) ou seu filho poderão ser ressarcidos (as) pelos integrantes da pesquisa, caso haja algum tipo de

prejuízo físico extremo, durante a coleta do exame para a pesquisa, mas não se preocupe pois para

este projeto vocês não correm esse risco. Todos os resultados dos exames feitos serão mantidos em

segredo e somente o (a) Sr.(a), e/ou seu filho e/ou o responsável pelo projeto poderão ver os

resultados. Também queremos lhe dizer que eles poderão ser publicados em uma revista médica

para que outros colegas da nossa profissão possam tomar conhecimento e tentar ajudar outras

pessoas. O (a) Sr. (a) ou seu filho terão liberdade a qualquer momento de sair do estudo sem que

isso lhe traga algum prejuízo ao seu modo de vida e qualquer dúvida poderá ser tirada com a

responsável que é a Drª Cristina Motta Ferreira pelo telefone 3655-01-00 ramal 0109 ou na Fundação

HEMOAM, Laboratório de Microbiologia pelo período da tarde.

Eu,.............................................................................................................................................................

................................recebi a explicação de que serei um dos participantes dessa pesquisa. Se eu não

souber ler ou escrever, uma pessoa de minha confiança lerá este documento para mim e depois

escreverá nesta página o meu nome. Por estar devidamente informado (a) e esclarecido (a) sobre o

este termo, livremente, sem qualquer pressão por parte dos pesquisadores, expresso meu

consentimento para a minha inclusão.

Eu,...............................................................................................responsável pelo paciente menor de

idade ................................................................................................recebi a explicação de que o

mesmo será um dos participantes dessa pesquisa. Se eu não souber ler ou escrever, uma pessoa de

minha confiança lerá este documento para mim e depois escreverá nesta página o meu nome. Por

104

estar devidamente informado (a) e esclarecido (a) sobre o este termo, livremente, sem qualquer

pressão por parte dos pesquisadores, expresso meu consentimento para a minha inclusão.

......................................................................

......../......./.........

Assinatura do paciente Data / /

Impressão do polegar direito do paciente,

caso este não saiba escrever seu nome.

............................................................................................

Assinatura do pesquisador que conversou com o paciente

105

8.2 Anexo 2 PROTOCOLO MÉDICO

Prevalência e sensibilidade a antibióticos das bactérias aeróbicas isoladas de processos infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM

Nome do paciente:_______________________ Registro:___________ Data do exame:_____

D. Nasc:_______________ Idade:__________ Procedência________________________

Clínica ( ) Leito ( ) nº ___ Ambulatório ( )

Dados Clínicos: Provável origem do processo infeccioso: comunitário ( ) hospitalar ( )

Relacionado a procedimento invasivo? Sim ( ) Não ( )

Cirurgia ? Qual? ___________________________________________

Doença Hematológica: Anemia aplástica ( ) Leucemia (LLA) ( ) A.falciforme ( )

Leucemia (LMC) ( ) Leucemia (LLC) ( ) LMA( )

Mieloma Múltiplo( ) Linfoma ( ) Hemofilia ( )

Foco infeccioso- Descrição da Amostra:

Trato respiratório:

Ouvido: Otite ( ) Seios da face: Sinusite ( )

Boca: Abcesso dentário ( ) Úlcera ( ) Faringe( ) amigdala ( )

Pulmão: tuberculose ( ) pneumonia ( ) escarrro( )

Coração: endocardite ( )

Trato urinário: infecção urinária ( )

Sintomático ( ) assintomático ( ) jato médio ( )

sonda de alívio ( ) punção suprapúbica ( ) saco coletor( )

Trato intestinal: diarréia ( ) tiflite ( )

Pele: ferida cutânea ( ) abcessos ( ) úlceras ( ) foliculite ( ) sepse( ) ponta

de cateter ( ) foco de origem desconhecida ( ) próteses ( ) outros ( )

Hemocultura: sangue periférico ( ) sangue colhido de cateter ( )

Topografia(local da coleta) _________________________________

nível de coleta : superficial ( ) profunda ( )

Via de obtenção de material: punção ( ) swab ( ) raspado ( ) drenagem ou fístula ( )

dreno ( ) outros : _______________

Fez uso nos últimos dias de antibiótico ? Sim ( ) não ( )

Quais ?______________________________________________

Existe infecção em outra topografia ? Sim ( ) não ( )

Existe comprometimento imunológico ? Sim ( ) não ( )

É paciente transferido de outro hospital ? Sim ( ) não ( )

106

É portador de bactérias multirresistentes? Sim ( ) não ( )

Condição clínica do paciente: febre antes da internação ( ) febre no decorrer da internação ( )

neutropenia febril ( ) neutropenia afebril ( ) febre após alta da internação ( )

Data do pedido _/___/___

Médico solicitante (Nome legível) e CRM : ____________________________

107

8.3 Anexo 3 PROTOCOLO LABORATORIAL

Nome:______________________________Registro:________________ Procedência_______________

Data:_______ Clínica ( ) Leito ( ) Ambulatório ( )

Local do Nascimento____________________ Médico:_____________ Amostra biológica

coletada:________________________________ Data da coleta ___/___/___

Responsável pela coleta _______________________________________

Natureza do teste solicitado: teste direto ( ) Gram ( ) Ziehl ( )

Rotina bacteriológica (Gram+cultura) ( )

Resultados: Método de Gram:

BGN ( ) BGP ( ) CGP ( ) CGN ( )

Testes Identificação de cocos (Micrococos e estafilococos):

Catalase pos ( ) negativa( ) Ferment. Manitol_______

Coagulase pos ( ) negativa( )

Novobiocina halo ___mmm –sensível ( ) halo ___mmm –resistente ( )

Furazolidona halo ___mmm –sensível ( ) halo ___mmm –resistente ( )

Bacitracina halo ___mmm –sensível ( ) halo ___mmm –resistente ( )

polimixina |B halo ___mmm –sensível ( ) DNAse _________ PYR ______

Testes Identificação de Estreptococos:

Catalase pos ( ) negativa( ) Hemólise alfa (parcial) ( ) beta (total) ( ) gama (ausência) ( )

Bacitracina halo ___mmm –sensível ( ) halo ___mmm –resistente ( )

Optoquina halo ___mmm –sensível ( ) halo ___mmm –resistente ( )

STX halo ___mmm –sensível ( ) halo ___mmm –resistente ( )

Cresc e em NaCl 6,5%_______ PYR ______Bile-esculina ____CAMP _____

Testes Bioquímicos:

Oxidase______ Glicose (gás)_____Sacarose _____ Maltose ________ Lactose ______H2S ______

Oxidase_______ Citrato ______ Uréia _____ Manitol ______ TSI_______Motilidade _____

Lisina _____ Arginina________Ornitina_______ Indol_____ Triptofano desaminase_____

gelatina_______ Beta lactamase________

Microorganismo identificado:_________________________

Resultado do Teste de Suscetibilidade (difusão com disco): Microrganismo Gram-positivo ( )

Eritromicina ( ) S ( )R Sulfazotrim ( )S ( )R

Oxacilina ( )S ( )R Rifampicina ( )S ( )R

Gentamicina ( )S ( )R Tetraciclina ( )S ( )R

Cefepime ( )S ( )R Vancomicina ( )S ( )R

Penicilina G ( )S ( )R Cloranfenicol ( )S ( )R

Clindamicina ( )S ( )R Ciprofloxacin ( )S ( )R

Microrganismo Gram-negativo ( )

Ampicilina ( )S ( )R Amicacina ( )S ( )R

Sulfazotrim ( )S ( )R Gentamicina ( )S ( )R

Imipenem ( )S ( )R Amoxicilina + Clavulanato ( )S ( ) R

108

Ceftazidima ( )S ( )R Ciprofloxacin ( )S ( )R

Cefalotina ( )S ( )R Cefuroxima ( )S ( )R

Cefepime ( )S ( )R Cefoxitina ( )S ( )R

Urinocultura ( ) sim ( ) Não Contagem de colônias.................................

Ácido Nalidixico ( )S ( )R Gatifloxacin ( )S ( )R

Ampicilina ( )S ( )R Norfloxacina ( )S ( )R

Gentamicina ( )S ( )R Nitrofurantoína ( )S ( )R

Tetraciclina ( )S ( )R Cefalotina ( )S ( )R

Cefepime ( )S ( )R Sulfazotrim ( )S ( )R

Cloranfenicol ( )S ( )R Ciprofloxacin ( )S ( )R

Técnico responsável pelos resultados de exame:_________________

109

8.4 Anexo 4

Protocolos Laboratoriais

Coloração pelo método de Gram Fonte: Winn et al. 2008.

1 - Solução de violeta de metila Solução 1: Violeta de metila P.A. (Neon)............................................. 2,0g

Álcool etílico 99,5GL P.A. (Labsynth) .............................. 100,0mL

Álcool metílico 99,5GL P.A. (Granquimica) ...................... 100,0mL

Solução 2: Oxalato de amônia P.A. (Reagen) ................................... 4.0g

Água deionizada .............................................................. 400,0mL Obs: Misturar as soluções 1 e 2, deixando em repouso por 24 horas ao abrigo da luz

filtrando em papel de filtro comum, estocando em frasco âmbar ao abrigo da luz.

2 - Preparo da solução de lugol (estoque) Iodeto de potássio P.A. ............................................................ 4,5g

Iodo metálico P.A. .................................................................. 3,0g

Água deionizada .................................................................. 450,0mL

2.1 - Preparo da solução de lugol diluído 1/20 (uso) Em frasco apropriado, juntar 2ml de lugol (estoque) com 38ml de água

deionizada. Obs: Misturar o Iodeto de Potássio (Merck) na água, até a completa dissolução.

Acrescentar o Iodo metálico (Cinética Química) até completa dissolução com água

destilada. Estocar em frasco âmbar ao abrigo da luz.

110

3 - Solução de safranina Safranina O P.A. ............................................................ 2,5g

Água deionizada ............................................................ 500mL

Obs: Misturar a safranina O (Vetec) na água até completa dissolução. Estocar em

frasco âmbar ao abrigo da luz. 4 - Solução descorante

Álcool etílico a 95,5° GL.

5 - Técnica de coloração

a) Cobrir o esfregaço com violeta de metila (Vetec, lt. 25) por 15seg;

b) Adicionar água deionizada sobre a lâmina com violeta de metila por 45seg;

c) Escorrer o corante e lavar em água corrente;

d) Cobrir a lâmina com lugol diluído 1/20 (uso), por aproximadamente 1

minuto;

e) Escorrer o lugol e lavar em água corrente;

f) Descorar o esfregaço adicionando álcool etílico 95,5° GL até que não haja

mais o desprendimento de corante;

g) Lavar em água corrente;

h) Cobrir a lâmina com safranina O por aproximadamente 30seg;

i) Lavar em água corrente;

j) Deixar secar a temperatura ambiente antes de examinar ao microscópio.

111

Protocolo de Coleta de material Biológico Fonte: Manual Anvisa módulo III (116).

Instrução para coleta

Hemocultura: A hemocultura é o exame definitivo para o diagnostico de invasão de

microorganismos na corrente sanguínea.

Definição de hemocultura: Coleta de um par de frascos, num mesmo momento e

num único local (frasco aeróbio e anaeróbio ou dois frascos aeróbios, por exemplo)

Obs.: A coleta de mais de 2 frascos (3,4,5 ...) num mesmo momento e de um único

local deve ser interpretada como uma hemocultura única.

Técnica: 1-Colher antes da administração de antibióticos (quando possível) ou na troca dos

mesmos;

2-Lavar as mãos e seca-las;

3-Usar luvas estéreis;

4-Remover o selo da tampa do frasco de hemocultura, e fazer assepsia previa nas

tampas com álcool a 70 %.

5-Garrotear o braço do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta área não

deverá mais ser tocada com os dedos. Fazer a anti-sepsia com álcool a 70 % de

forma circular e de dentro para fora, concetricamente.

6-Aplicar solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 10%) também com

movimento em espiral de dentro para fora. Para ação adequada do iodo, deixar

secar por 1 a 2 minutos antes de efetuar a coleta. Para pacientes alérgicos ao iodo,

passar novamente o álcool a 70 %.

7-Venopunção: coletar a quantidade de sangue e o numero de amostras

recomendadas de acordo com as orientações descritas ou discriminadas no pedido

medico.

8-Não é necessária a troca de agulhas para inoculação nos frascos.

112

9-Misturar o conteúdo nos frascos por inversão (método manual).

10-Limpar o local da venopunção com álcool a 70% removendo todo o iodo;

11-Identificar cada frasco conforme a padronização e enviar ao laboratório

juntamente com a solicitação médica devidamente preenchida, em caso de frasco

automatizado não rasurar o código de barra.

Observações: Não é recomendada a coleta de hemocultura através de cateteres ou cânula, por

demonstrarem nível significativo de contaminação quando comparada à veia

periférica.

Preferir punções venosas, pois as artérias não trazem beneficio em relação a

recuperação de microorganismos.

Método de coleta do sangue e o volume coletado influenciam diretamente no

sucesso de recuperação de microorganismos e uma interpretação adequada dos

resultados.

O melhor momento da coleta:

1-Antes de instituir a terapêutica antimicrobiana.

2-Antes do pico febril ou da ascenção da temperatura (30 a 90 minutos: bacteremia

máxima).

3-Se não for possível detectar a ascensão da temperatura, coletar durante ou

imediatamente ao pico febril.

Volume e número de amostras:

A sensibilidade aumenta 3% a cada ml de sangue coletado. Trabalhos recentes

mostram que, quanto maior o volume de sangue, por amostra, melhor a recuperação

do microorganismo(respeitando a porção sangue/ meio), sendo que o volume ideal

corresponde a 10 % do volume total do frasco de coleta. Os frascos de sistemas

automatizados permitem a coleta de até 10 ml de sangue. O número de frascos

113

deverá ser coletado de acordo com as condições clinicas do paciente. Preconiza-se

para o paciente adulto a coleta de 20 ml de sangue a cada hemocultura, ou seja, 02

frascos de hemocultura a cada coleta. Os frascos do sistema manual com 45 ml de

meio, coletar 5 ml de sangue. Frascos pediátricos de sistemas automatizados

permitem a coleta de 1 a 4 ml de sangue.No caso de recém - nascidos e crianças

pequenas, coletas apenas um frasco de hemocultura. Os frascos de sistema manual

com 9 ml de meio , coletar 1 ml de sangue. Um total de 3 culturas em 24 horas

costuma ser suficiente para descartar bacteremia ou endocardite. Coletas acima de

quatro amostras não trouxeram maior índice de recuperação microbiana.

Obs.: O uso de frascos específicos para cultura de anaeróbios e micobactérias,

deve ser considerado apenas em situação especificas onde ser pode esperar

participação de anaeróbios e micobacterias, e, deverá ser solicitado para tal. Ou

ainda, nos quadros clínicos cirúrgicos envolvendo o trato digestivo, infecções

pélvicas e outros, coletar sistematicamente um par de frascos: aeróbio e anaeróbio.

Nunca resfriar o frasco e enviar o mais rápido possível ao laboratório

Condições clínicas especificas Infecções Sistêmicas e localizadas (sepse, osteomielite, meningite): Duas amostras sanguíneas de punções venosas diferentes (braço direito e

esquerdo) com intervalo de, no máximo 5 minutos , entre as punções. Se possível

10 a 20 ml por amostra.

Bacteremia ou febre de origem desconhecida (abscessos, febre tifóide, brucelose): Duas as três amostras coletadas no primeiro dia de punções venosas diferentes com

intervalos superiores a uma hora . Se negativo, 24 ou 36 horas após, colher mais

duas amostras.

Endocardite: Aguda: três amostras sanguíneas de punções venosas diferentes (braço esquerdo e

direito) nas 1º a 2 º horas com intervalos mínimos de 20 a 30 minutos.

114

Subaguda: três amostras no primeiro dia (15 min. Ou mais de intervalo). Se o

resultado for negativo, após 24 horas obter mais duas amostras.

Pacientes com picos febris regulares, coletar duas amostras antes do inicio da febre

(1 hora), evitar o pico febril.

Crianças: duas culturas são recomendadas para diagnostico de

bacteremias em recém-nascidos. Pacientes em uso de antimicrobianos, coletar duas

hemoculturas separadamente, em cada dia, durante 3 dias consecutivos , se as

primeiras negativas.

Trato respiratório:

Escarro: 1-Lembrar que este material não é considerado ideal para avaliação microbiológica,

do trato respiratório.

2-A melhor coleta é feita com a supervisão direta do pessoal de enfermagem

treinado ou fisioterapeuta.

3-Orientar o paciente sobre a importância da coleta do escarro e não da saliva.

4-Colher o escarro através da tosse, de modo que o material venha do “peito” e não

da garganta.

5-Colher somente uma amostra por dia, se possível, o primeiro escarro da manhã,

antes da ingestão de alimentos, em recipiente estéril da boca larga e enviar o mais

rapidamente possível ao laboratório.

6-Orientar o paciente para escovar os dentes somente com água, e gargarejar varias

vezes a boca com água. Não usar pasta de dente ou colutórios.

Obs.: Caso o paciente tenha dificuldade de escarrar, esta amostra poderá se

induzida por inalação de 20 ml de 3% a 10% de NaCl 0,85% ou ser realizada coleta

por aspiração transtraqueal.

115

Secreção de orofaringe: 1-O sucesso de detecção do germe depende da amostra coletada exatamente na

área inflamada, evitando outros sítios da cavidade oral.

2-Solicitar ao paciente que abra bem a boca.

3-Usando o abaixador de língua e swab estéril, fazer esfregaço sobre as amídalas e

faringe posterior, evitando tocar na língua e bochechas.

4-Passar o swab nas áreas hiperemiadas (faringe posterior, pilare D e E, ou abaixo

das amigdalas), próximo aos pontos de supuração ou abaixo das placas ou

membranas.

5-Coletar preferencialmente dois swabs e colocá-los em meio transporte quando

houver.

6-Enviar imediatamente ao laboratório para evitar a secagem do marterial, quando

não houver meio de transporte.

Secreção de nasofaringe: 1-A coleta deve ser feita antes do uso de produtos tópicos.

2-Introduzir em swab flexível e estéril, pelo meato nasal, paralelo ao palato superior,

buscando atingir o orifício posterior das fossas nasais, tentando evitar tocar o swab

na mucosa da narina, fazer um discreto movimento circular e retirá- lo.

3-Recolocar o swab no tubo com meio de transporte e enviar ao laboratório

imediatamente.

URINA:

1- A coleta deve ser feita pela manhã, preferencialmente da primeira micção do dia,

ou então após retenção vesical de duas a três horas.

Crianças: 1-Realizar assepsia rigorosa prévia dos genitais com água e sabão neutro e

posterior secagem com gaze estéril.

116

2-Ideal: jato médio espontâneo.

3-Em lactentes em que não se consegue colher através do jato médio, pode se usar

o saco coletor de urina, porém, a troca deve ser realizada de 30 em 30 minutos e ao

trocar o coletor, refazer a assepsia.

4-Casos especiais (RN, lactentes de baixo peso, resultados repetidamente

duvidosos) indicar punção vesical suprapúbica, que deverá ser realizada por médico.

Adultos do sexo feminino: 1-A coleta deve ser supervisionada pessoalmente por uma enfermeira ou auxiliar

treinada.

2-Orientar a paciente que ao sentar no vaso sanitário, deverá afastar os grandes

lábios com uma das mãos e com a outra lavar as genitálias de frente para trás,

utilizando gaze estéril.

3-Continuar afastando os grandes lábios para urinar, o primeiro jato de urina deve

ser desprezado no vaso sanitário. Colher o jato médio urinário no frasco fornecido

pela enfermagem, evitando encher o frasco.

4-Fechar bem o frasco e entregar ao pessoal de enfermagem.

5-Enviar ao laboratório até 30 minutos, caso não seja possível , as amostras

deverão ser resfriadas até 2 horas.

Adultos do sexo masculino: 1-A coleta deve ser feita pela manhã, preferencialmente da primeira micção do dia,

ou então após retenção vesical de duas a três horas.

2- Realizar a higiene local da genitália utilizando uma gaze estéril embebida com

água e sabão neutro e gaze estéril.

3-Coletar jato médio em um frasco estéril descartável e levar ao laboratório

Pacientes cateterizados com sistema de drenagem fechada:

1-Colher a urina puncionando- se o cateter na proximidade da junção com o tudo de

drenagem. Não Colher urina da bolsa coletora.

2-No pedido laboratorial deverá constar que o paciente está cateterizado.

117

Ponta de sonda vesical:

1-Não realizar cultura da ponta da sonda vesical, porque o crescimento bacteriano

representa a flora de uretra distal.

2-Recomenda-se cultura de urina após 48 horas da retirada da sonda na

monitoração de processos infecciosos.

3-Urocultura realizadas antes deste período podem fornecer resultados positivos

sem que eles estejam, necessariamente, associadas à infecção. Fezes:

1-Devem ser coletadas no inicio ou fase aguda da doença, quando os patógenos

estão usualmente presentes em maior número e, preferencialmente, antes da

antibióticoterapia, e quatro dias após o uso de contrastes radiológicos.

2-Coletar as fezes e colocar em um frasco contendo o meio para transporte (Cary

Blair ou salina glicerinada tamponada), em quantidade equivalente a uma colher de

sobremesa. Preferir sempre as porções mucosas e sanguinolentas.

3-Fechar bem o frasco e agitar o material.

4-Se a amostra não for entregue no laboratório em uma hora, conservar na geladeira

a 4ºC, no máximo por um período de 12 horas. Marcar o horário da coleta.

Swab retal: 1-Usar swab de algodão.

2-Umedecer o swab em solução salina estéril (não usar gel lubrificante) e inserir no

esfíncter retal, fazendo movimentos rotatórios.

3-Ao retirar certifique-se que existe coloração fecal no algodão.

4-Enviar ao laboratório no intervalo de 30 minutos ou utilizar o meio de transporte

Cary Blair.

Lesões abertas úmidas e úlceras: 1-Esta coleta deve ser realizada pelo médico assistente.

118

2-A área ao redor da lesão deverá ser limpa com gaze embebida em álcool a 70%.

3-Remover crostas e excesso de secreção com solução salina e gaze estéril.

4-Passar o swab na base e nas bordas da lesão, colocar o swab no meio de

transporte e enviar o mais rápido possível para o laboratório, sem refrigerar.

Observações: Não coletar o pus emergente. O material das margens da lesão e a parte mais

profunda do sítio escolhido são mais representativos e possuem maior viabilidade de

microrganismos. A cultura de lesões secas e crostas não são recomendadas, a

menos que a obtenção de exsudato não seja possível. A coleta de ferida de

queimadura deve ser realizada após extensa limpeza e debridamento da lesão.

Biopsia de pele é a técnica mais recomendada.

Espécimes cirúrgicos – biópsias e secreções: 1-Esta coleta é realizada pelo médico assistente.

2-Verificar, no momento do recebimento do material, se as instruções de coleta

foram seguidas.

3-Colher o material por aspiração com seringa.

4-Técnica de coleta asséptica.

Secreção conjuntival (Ocular): 1-A coleta deverá ser realizada antes do uso de qualquer produto tópico.

2-Retirar o excesso de secreção purulenta com gaze estéril.

3-Com uma das mãos afastar as pálpebras superior e inferior, e com a outra passar

o swab na mucosa conjuntival.

3-Colocá-lo no meio de transporte e enviar diretamente ao laboratório.

Semeadura em meios de cultura

Fonte: Manual Anvisa módulo V (110) ; Oplustil et al. 2000(109)

119

Tabela 1- Meios de culturas de triagem para semeadura primária Meios de cultura Meios utilizados

Urina Laminocultivos ( CLED/MacConkey), Ágar EMB + CLED

Fezes Selenito (Meio Líquido), ágar EMB e Agar SS

HEMOCULTURAS Frascos de Hemocultura

Secreções Ágar sangue ou chocolate BEM

Ponta de cateter Ágar sangue

Líquidos Ágar sangue (EMB), frascos de hemocultura

Fragmentos Ágar sangue meio líquido TSB (frascos de hemocultura)

Lavabo Brônquico Ágar sangue, Ágar chocolate EMB.

Preparo dos materiais clinicos e semeadura inicial

Amostras recebidas em “swab”:

Amostras colhidas com “swab” são utilizadas para a coleta de diversos materiais

clínicos, mas seu uso deve ser evitado quando outras metodologias podem ser

empregadas. Quando as amostras forem coletadas em “swab” duplo utilizar um dos

“swabs” para fazer o esfregaço em uma lâmina, e o outro, para colocar no meio de

transporte (caso não seja semeado na mesma hora).

Quando somente um “swab” for coletado, suspender o swab em um pequeno

volume de solução fisiológica estéril (esta na geladeira), agitar (vortex ou centrifuga)

2000 por dois comprimir o swab na parede do tubo e utilizar esta suspensão para o

preparo do esfregaço e semeadura nos meios aquáticos. Semear por esgotamento

nos meios apropriados, colocar na estufa a 35º C.

OBS.: Não deixar o “swab dentro do tubo sem meio de transporte, ou colocar na

geladeira ou estufa para ser semeado no outro dia”. Sempre executar semeadura

primaria.

Cultura de urina:

120

1-Abrir o lâminocultivo e submergir a lâmina contendo e meio de cultura na urina

recém-coletada. Ambas as superfícies dos meios de cultura devem ser

completamente umedecidas pela urina.

2-Retirar o excesso de urina deixando-a escorrer junto à borda do recipiente.

3-Fechar o tubo e encubar ente 35º C+- 1ºC em posição vertical durante 18 a 24

horas.

Obs.: Sempre fazer uma lâmina a fresco e observar a presença de leucócitos,

eritrócitos e bactérias.

Cultura de fezes:

Amostra aceitável: 1-Fezes sem conservante devem ser encaminhadas e processadas no máximo

dentro de 1 hora após a coleta.

2-Fezes com conservante podem ser mantidas á temperatura ambiente por ate 24

horas.

Amostra não aceitável: Amostras sem conservantes que foram obtidas há mais de três horas

Várias amostras colhidas no mesmo dia de urina e fezes

Fezes liquidam colidas ou enviadas em fraldas.

Procedimento 1-Semear três a quatro alçadas de fezes no tubo contendo meio selenito (meio

enriquecida).

2-Colocar o tubo na estufa por 12 a 18 horas.

3-Semear depois para os meios selenito, ágar SS e ágae BEM.

4-Incubar por mais de 18 a 24 horas.

121

Conservantes mais comuns: Glicerina tamponada

Cary-blair (meio de transporte para fezes)

Swab com meio de transporte Stuart

Obs.: Se houver suspeita de vibrio spp, a amostra de fezes ou “swab” retal deve ser

encaminhada em cary-blair à temperatura ambiente.

Hemocultura: Procedimento

1- Identificar o frasco com: nome do paciente, data e hora da coleta e numero da

amostra.

2-Levantar a parte central da tampa de alumínio com o auxilio de uma pinça.

3-Fazer assepsia da tampa de borracha com álcool 70% e deixar secar e introduzir o

sangue: 5ml no frasco para adulto e 1ml no frasco pediátrico.

4-Incubar a 35ºC com agulha estéril para realizar a incubação em aerobiose.

5-Se possível coletar 02 amostras.

6- Sepse, pneumonia, meningite, artritre e pielonefrite: 2 a 3 hemoculturas antes

do início da terapia. Coletar sem necessidade de intervalo, intercalando os sítios da

punção.

7-FOI, endocardite ou outra bacteriemia ou fungemia contínua: 2 a 3

hemoculturas com 20 min de intervalo entre as coletas. Se forem negativas nas

primeiras 24hs, repetir o procedimento.

8-Paciente em uso de terapia antimicrobiana- utilizar frasco com inibidores de

antibióticos e coletar antes da próxima dose do antibiótico.

Técnica para processamento de hemocultura manual Frasco de hemocultura- incubar a 35ºC em C02. Após 24hs (1º dia)-- semear em

ágar: sangue, chocolate, Mac Conkey e realizar o teste de Gram (sugerir

122

agrupamento).

Resultados: Positivo- sem crescimento em ágar sangue e chocolate com bactérias no Gram,

semear em anaerobiose. Relatar cultura positiva para anaeróbio. Não realizamos

este tipo de cultura.

Negativo- emitir resultado parcial – reincubar.

Reincubar a 35ºC. Após 48hs(2º dia) – semear em Agar sangue, chocolate, Mac

Conkey e BEM. Realizar o Gram.

Resultados:

Positivo- emitir resultado parcial- identificação e TSA (cocos ou bastonetes)


Reincubar 35ºC. Após 120hs (5º dia) – semear em Agar: Chocolate, Mac Conkey e

EMB. Realizar o Gram.

Resultados:

Positivo- emitir resultado parcial- identificação e TSA (cocos ou bastonetes).


Reincubar 35ºC. Após o 7º dia: Semear uma gota em ágar chocolate.

Resultados:

Positivo- emitir resultado parcial- identificação e TSA (cocos ou bastonetes).

Negativo- resultado neg, desprezar o frasco. —FUNGOS????

123

OBS: No resultado emitir o sítio da coleta, horário e temperatura do paciente no momento da coleta.

Microrganismos mais freqüentes em hemocultura: S. aureus, Staphylococcus

coagulase negativa, Enterococcus spp., Streptococcus spp., mais raramente Listeria

spp..

Entre os fungos temos Cândida spp., Crytococcus neoformans.

Entre os gram-negativos: E. coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp.,

Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, N.

meningitidis e outros. Em crianças ocorrem também os mesmos que nos adultos,

mas há maior prevalência de bacteremia por estafilococos, estreptococos, (S.

pneumoniae), meningococos, hemófilos.

Cultura de secreções: Material clínico: Amostras de exsuadato de lesão:

Superficial

Profunda

Operatória

Obs.: Quando for solicitada bacterioscopia conjuntamente com a cultura, é

recomendado coletar dois “swabs”. Um dos “swabs” deve ser utilizado

imediatamente após a coleta para confeccionar uma lâmina e outro ser colocado em

meio de transporte.

Procedimento Incubação nos meios de cultura: Amostra não coletada com “swab”: Ágar sangue, chocolate (opcional para feridas profundas) e EMB.

124

“Swab” sem meio de transporte:

Ressuspender a amostra colhida com “swab” em volume pequeno de caldo TSB (o

mesmo de hemocultura) ou solução fisiológica estéril. Homogeneizar vigorosamente

a solução para inocular em ágar sangue e ágar EMB e fazer uma lâmina para a

coloração de gram.

“Swab” como meio de transporte:

Semear em ágar sangue e ágar EMB.

Seringa:

Inocular diretamente em ágar sangue e ágar EMB.

Protocolo para Identificação de Cocos Gram-positivos Fonte: Manual Anvisa módulo V (110).

Tabela 2- Divisão dos cocos Gram positivos pela prova da catalase

Staphylococcus spp Enterococcus spp Micrococcus spp. Streptococcus spp. Planococcus spp Aerococcus spp Stomatococcus spp. Gemella spp., Leuconostoc spp. Lactococcus spp., Stomatococcus spp.

125

1-Teste da catalase

1- Reagentes a) Peróxido de hidrogênio a 3 ou 30% armazenado em frasco escuro, sob

refrigeração.

b) Cultura pura (24h) do isolado bacteriano.

2 - Controle de qualidade a) Devem-se realizar os testes de controle com microorganismos positivos (S.

aureus) e negativos (Streptococcus spp.), diariamente ou antes de se testar a

bactéria em estudo.

3 – Procedimento técnico: a) Com agulha de inoculação ou aplicador de madeira estéril, transferir coletar uma

colônia para a superfície de uma lâmina de vidro.

b) Acrescentar uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% ou 30%.

4 – Interpretação

O aparecimento rápido e prolongado de bolhas ou de efervescência significa que o

teste é positivo.

2-Teste da citocromo oxidase (oxidase) 1- Reagentes a) Diidrocloreto de tretrametil-p-fenilenodiamina, 1% (reagente de Kovac)

b) Diidrocloreto de dimetilp-fenilenodiamina, 1% (reagente de Gordon e Mcleod)

Reativo: (Merck) Diidrocloreto de tetrametil ou dimetil-p-fenilenodiamina P. A. ......... 1g

Água deionizada ............................................................................... 10mL

126

2 - Controle de qualidade a) Devem-se realizar testes de controle com bactérias que apresentam reações

positivas (E. coli) e negativas (P. aeruginosa), rotineiramente.

3 – Procedimento a) Adicionar duas a três gotas diretamente na colônia bacteriana a ser estada

b) Procedimento direto em tira de papel.

OBS: Algumas gotas do reagente são adicionadas em papel de filtro ou em discos

de tiras de papel comerciais impregnados com reagente seco. Em qualquer dos

métodos, utiliza-se alça de platina ou aplicador de madeira impregnada com a

colônia suspeita na área do papel de filtro.

4 – Interpretação

O aparecimento de cor azul-escura no local da inoculação no intervalo de 10

segundos significa que a colônia é positiva para produção de citocromo oxidase.

3-Diferenciação de gêneros e espécies Fonte: Manual Anvisa módulo V (110).

Tabela 3 - Provas bioquímicas para identificação dos gêneros de Cocos Gram-positivos catalase positivos

Gênero Motilidade NaCl 5% Oxidase Bacitracina Tétrade Manitol

Staphylococcus Neg + Neg Resist até o

disco

variável Cresce

fermenta

Planococcus + + Neg variável

Micrococcus Neg + + Sens

>=10mm

+ Cresce não

fermenta

Stomatococcus Neg Neg Neg variável

127

Tabela 4- Identificação das espécies de cocos Gram-positivos catalase positivos

Espécies DNAse PYR Novob Uréia Polimixina Outras

S.aureus + Neg Sens Variável Resist Pig amarelo

S.epidermidis Neg Neg Sens + Resist

S.lugdunensis Neg + Sens Variável Variável Ornitina+

S.haemolyticus Neg + Sens Neg Sens Ornitina neg

S.saprophyticus Neg Neg Resist + Sens Isolado em

urina

S.schleiferi Neg + Sens Neg Sens Sacarose

neg

S.intermedius + + Sens + Sens

S. hyicus + Neg Sens Variável resist

Identificação das espécies de cocos Gram-positivos catalase positivos

Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas,

das quais os mais freqüentes são:

1- S. epidermidis – causador de infecções de cateteres e próteses e o mais

freqüente microrganismo encontrado em hemocultura.

2- S. saprophyticus- causador de ITU em mulheres.

3- S. haemolyticus-importante devido à resistência aumentada aos antimicrobianos,

pode ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemólise na placa

de ágar sangue de carneiro.

128

Tabela 5- Esquema para diferenciação de espécies de Cocos Gram-positivos catalase negativa sensíveis a vancomicina

Espécie Hemólise Bacitracina Optoquina SXT NaCl 6,5%

CAMP Bile

esculina

S. pneumoniae α- hemólise Variável Sens Sens - - -

S. pyogenes β- hemólise Sens Resist Resist - - -

S. agalactiae Novobiocina -

sensível

Gama

hemólise Resist Resist Resist - + -

Enterococcus

gama ou α-

hemólise Resist Resist Resist + - +

Grupo Viridans α- hemólise - - -

S. bovis Gama ou α-

hemólise - - +

PYR Test Fonte: PROBAC DO BRASIL

Indicações: Baseado na hidrólise enzimática da L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide, o PYR TEST

destina-se à identificação dos Streptococcus spp, Staphylococcus spp e bacilos

Gram negativos não fermentadores de glicose.

A hidrólise do L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide através da enzima L-pyroglutamyl-

aminopeptidase é verificada através da reação do PYR Reagente com a beta-

naphtylamide livre, que forma uma Base de Schiff de coloração vermelha.

Procedimento: 1-Com o auxílio de uma pinça previamente flambada, retirar um disco de PYR do

frasco.

129

2-Utilizando uma pipeta ou um frasco conta-gotas, impregnar o disco de PYR com

água destilada estéril ou água de torneira* Depositá-lo sobre uma lâmina ou placa

de Petri.

3-Com o auxílio de uma alça previamente flambada, faça um esfregaço da bactéria

recém isolada a ser identificada no disco de PYR umedecido.

4-Aguardar 5 minutos, a temperatura ambiente, e colocar uma gota do PYR

reagente. As reações positivas ocorrem em até 1 minuto.

* O uso de salina torna a reação mais lenta e menos intensa.

Leitura: PYR positivo: O desenvolvimento de uma cor vermelho-cereja indica resultado

positivo.

PYR negativo: Uma coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo.

Observação: Dos Streptococcus spp (cocos Gram positivos, catalase negativa) o Streptococcus

pyogenes e o Enterococcus spp são PYR positivo. Nos casos de amigdalite

bacteriana, com isolamento de estreptococos beta hemolíticos

a prova rápida de PYR é extremamente útil para o diagnóstico do S.pyogenes e o

tratamento precoce do paciente.

Precauções: Após leitura os discos devem ser descartados conforme as recomendações vigentes

para resíduos de serviços de saúde.

Apresentação: Caixa com 24 discos de PYR e 1 frasco com 2 mL de PYR

Reagente.

Conservação: Manter em geladeira (2º a 8º C), ao abrigo da luz.

Validade: 3 meses.

130

Protocolo para Identificação de Bastonetes Gram-negativos

Principais provas para a identificação das enterobactérias de importância clínica

ENTEROKIT B Fonte: PROBAC DO BRASIL

1. Fermentação da glicose

2. Fermentação da lactose

3. Motilidade

4. Utilização de citrato

5. Descarboxilação da lisina

6. Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S)

7. Produção de gás (CO2)

8. Oxidase

9. Produção de indol

10. Produção de urease

11. Produção de fenilalanina desaminase ou opção triptofanase

12. Produção de gelatinase ou opção DNAse

Provas complementares de Identificação 1- Fermentação de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina,

dulcitol, manitol, etc.

2- Utilização de aminoácidos: arginina e ornitina

3-Hidrólise da esculina, etc.

4- ONPG

5-Utilização de acetato

6-Provas úteis, mas pouco utilizadas: vermelho de metila, voges-proskauer,

crescimento em KCN, tartarato de jordan e lipase.

Os esquemas de identificação baseiam-se na determinação dos gêneros e

espécies mais isolados na clínica, e nas provas mais características de cada gênero

131

e espécie, baseado em alguns critérios como: facilidade de execução, facilidade de

interpretação, custo, rapidez para leitura, etc.

ENTEROKIT B Fonte: PROBAC DO BRASIL

Indicações: O Enterokit B consiste dos seguintes meios: EPM, MILi e Citrato de Simmons. O

meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás em glicose,

produção de H2S, hidrólise da uréia e desaminação do triptofano.

O meio MlLi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de lisina. O

Citrato de Simmons oferece o teste de utilização do citrato como única fonte de

carbono. Os três meios totalizam 8 testes que somados ao da fermentação da

lactose na placa de isolamento, permitem identificar com fidelidade a grande maioria

das enterobactérias isoladas de espécimes clínicos.

Procedimento: 1-Tocar a colônia com agulha de platina e semear os 3 meios na seguinte ordem:

Citrato, EPM e MlLi.

2-Para inocular o meio de Citrato deslizar a agulha pelo centro estriando toda a

superfície inclinada. No meio

3-EPM introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do

meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o fundo

do tubo.

4-Incubar o Enterokit a 35°C ± 2°C com as tampas semi-rosqueadas e fazer a leitura

após 18 horas a 24 horas.

Leitura e interpretação:

1. Meio EPM Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura do

fundo do tubo.

Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade.

Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reação fraca) que

se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não.

132

Desaminação do triptofano (LTD): Aparecimento de cor verde-garrafa na

superfície do meio.

2. Meio MlLi Motilidade (MOT): A bactéria móvel cresce além da linha de picada. A imóvel

somente nesta linha.

Descarboxilação da lisina: Quando a lisina é descarboxilada o meio adquire cor

púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio

adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre

que o meio não estiver amarelo.

Produção de indol: Adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs à superfície do meio

e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou

vermelha. Quando não produz, o reativo mantém sua cor inalterada.

3. Meio Citrato de Simmons

A utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície

do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio não sofre

alteração.

Precauções: Após o uso, o produto deverá ser descartado conforme as recomendações vigentes

para resíduos de serviços de saúde.

Apresentação: Caixa com 16 conjuntos e um frasco de Reativo de Kovacs.

Conservação: Manter em temperatura ambiente entre 10º e 25ºC (local fresco).

Validade: 6 meses.

133

Tabela 6- Identificação de gênero e espécie bacteriana

NÚMERO ESPÉCIE BACTERIANA

000 Shigella

004 Shigella spp - Yersinia enterocolitica - Escherichia coli

006 Escherichia coli

011 Citrobacter freundii

012 Hafnia alvei

013 Serratia marcescens - Hafnia alvei


015 Citrobacter diversus


035 Providencia stuartii - Providencia alcalifaciens

040 Yersinia pseudotuberculosis - Yersinia enterocolitica

044 Yersinia enterocolitica

051 Citrobacter freundi

053 Serratia marcescens


070 Proteus penneri

074 Morganella morganii

075 Providencia stuartii - Providencia rettgerii


112 Salmonella Typhi

113 Salmonella spp


170 Proteus mirabilis - Proteus penneri

171 Proteus mirabilis

174 Proteus vulgaris


202 Hafnia alvei



210 Salmonella Paratyphi A - Serratia liquefaciens

211 Citrobacter freundii - Serratia liquefaciens

212 Hafnia alvei - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens

213 Serratia marcescens - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens


134

Tabela 6- Identificação de gênero e espécie bacteriana NÚMERO ESPÉCIE BACTERIANA



235 Providencia alcalifaciens


253 Serratia marcescens


270 Proteus penneri

274 Morganella morganii

310 Salmonella Paratyph A


312 Salmonella Choleraesuis

313 Salmonella Choleraesuis - Salmonella spp

316 Edwardsiella tarda


370 Proteus mirabillis - Proteus penneri

371 Proteus mirabillis





410 Serratia liquefaciens

411 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp


413 Serratia sp.




417 Serratia odorífera

443 Klebsiella pneumoniae

447 Klebsiella oxytoca

451 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae




135

Tabela 6- Identificação de gênero e espécie bacteriana

NÚMERO ESPÉCIE BACTERIANA





611 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp


613 Enterobacter aerogenes - Serratia SP


615 Citrobacter diversusi


643 Klebsiella pneumoniae


651 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae




Referências bibliográficas: 1. Ewing, W. H., 1986 - Edwards and Ewing’s Identification of Enterobacteriaceae,

4th edition. Elsevier Science Publishing Co., Inc., N. York.

2. Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., 1982 - EPM - Uma modificação

do meio de Rugai e Araújo, para a realização simultânea dos testes de produção de

gás a partir de glicose, H2S, urease e triptofano desaminase. Rev. Microbiol., 13:

309 - 315.

3. Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., 1982 - MILi - Um meio para a

realização dos testes de motilidade, indol e lisina descarboxilase. Rev. Microbiol., 13:

230 - 235.

4. Farmer III, J. J. e cols. 1985 - Biochemical Identification of new species and

biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol.,

21: 46 - 76.

136

ENTEROKIT C Fonte: PROBAC DO BRASIL

Indicações: O ENTEROKIT C consiste nos testes de descarboxilação da lisina, arginina e

ornitina (base Moeller), fermentação de adonitol e arabinose e liquefação da

gelatina. Sua finalidade principal é complementar o Enterokit B na identificação das

espécies mais importantes de Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e Serratia. Assim

todas as vezes que o Enterokit B não identificar o microrganismo com precisão,

recorre-se ao Enterokit C.

A soma dos testes do Enterokit B e C permite diagnosticar com segurança as

espécies mais importantes de Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e Serratia. O Enterokit

C também é extremamente útil na identificação de amostras atípicas pertencentes

aos outros gêneros de enterobactéria.

Composição/Conjunto: Meios Descarboxilase de Moeller: Controle, Lisina, Arginina e

Ornitina...................................................................................................4 mL/tubo

Meio de Adonitol....................................................................................4 mL/tubo

Meio de Arabinose................................................................................. 4 mL/tubo

Meio de Gelatina.................................................................................... 1 fita/tubo

Procedimento: 1-Inocular os meios de Moeller (lisina, arginina, ornitina e controle) da maneira usual,

e os meios de adonitol e arabinose por picada central, introduzindo a agulha até o

fundo do tubo

2-Pingar 10 gotas de salina estéril, no tubo identificado como Gelatina, com o auxílio

do conta gotas, que acompanha o produto.

3-Com o auxílio de uma alça, turvar a salina (inóculo pesado).

4-Incubar a 35º ± 2°C durante 24 a 48 hs.

137

Leitura e interpretação: Descarboxilação de lisina, arginina e ornitina: quando positiva, o meio adquire

cor púrpura discreta ou intensa; se negativa, a cor do meio permanece inalterada.

Fermentação de adonitol e arabinose: quando positiva, o meio se torna rosa

discreto ou intenso; se negativa, a cor do meio permanece inalterada.

Liquefação da gelatina: Gelatinase +: utilização da gelatina impregnada na fita, com alteração da cor cinza-

esverdeada opaca para azul transparente.

Gelatinase -: a cor da fita de gelatina permanece inalterada.

Na tabela, são apresentadas as características das principais espécies de

enterobactérias.

Apresentação: Caixa com 6 conjuntos.

Conservação: Manter em temperatura ambiente (entre 10° e 25°C)

Validade: 6 meses.

Tabela 7- Diferenciação das enterobactérias pelo Enterokit C

Bactérias % de Amostras positivas

Enterob. Lisina Argin. Ornitina Gelat. Adon. Arabinose

E. coli 90 17 65 0 5 99

Shigella sp. 0 5 1 0 0 60

S. sonnei 0 2 98 0 0 95

E. tarda 100 0 100 0 0 9

Salmonella sp 98 70 97 0 0 99

S. typhi 98 3 0 0 0 2

S. paratyphi A 0 15 95 0 0 100

C. freundii 0 65 20 0 0 100

C. diversus 0 65 99 0 98 100

K. pneumoniae 98 0 0 0 90 99

K. oxytoca 99 0 0 0 99 98

E. aerogenes 98 0 8 0 98 100

E. cloacae 0 97 96 0 25 100

138

Tabela 7- Diferenciação das enterobactérias pelo Enterokit C Bactérias % de Amostras positivas

Enterob. Lisina Argin. Ornitina Gelat. Adon. Arabinose

Hafnia alvei 100 6 98 0 0 95

S. marcescenes 99 0 99 90 40 0

P. mirabilis 0 0 99 90 0 0

P. vulgaris 0 0 0 91 0 0

P. rettgeri 0 0 0 0 100 0

P. stuartii 0 0 0 0 5 1

P. alcalifaciens 0 0 1 0 98 1

M. morganii 0 0 98 0 0 0

Y. enterocolitica 0 0 95 0 0 98

Y. pestis 0 0 0 0 0 100

Y. pseudotuberculosis 0 0 0 0 0 50

139

EPM-MILi

Fonte: PROBAC DO BRASIL

Indicações: Identificação bioquímica das bactérias da Família Enterobacteriaceae.

Composição: Meio EPM: Este meio é uma modificação do meio de Rugai e Araújo e contém os

seguintes testes: produção de gás por fermentação de glicose, produção de H2S,

hidrólise de uréia e desaminação do triptofano.

Meio MILi: Este meio é utilizado para avaliar a motilidade, produção de indol e

descarboxilação da lisina.

Os sete testes, quando considerados com os resultados da reação de fermentação

da lactose observada nas placas de isolamento (lactose positiva ou negativa),

permitem identificar presuntivamente as seguintes enterobactérias: Shigella,

Salmonella, E. coli e Y.enterocolitica.

Procedimento:

1. Semeadura

Tocar com agulha de platina uma colônia bem isolada e inocular os 2 meios com o

mesmo inóculo. Para inocular o meio EPM, introduzir a agulha até o fundo do tubo e

ao retirá-la semear a superfície do meio. A inoculação do MILi deve ser feita por

picada central, introduzindo a agulha até o fundo do tubo.

Incubar entre 35°C a 37°C com as tampas semi-rosqueadas e fazer a leitura após 18

a 24 horas.

2. Leitura e interpretação

Meio EPM Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio do fundo do

tubo.

Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade.

140

Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde-azulada (reação fraca) que

se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não.

Desaminação do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na superfície do

meio. Quando a reação é negativa a superfície do meio adquire cor azul ou

raramente amarela.

Meio MILi Motilidade: A bactéria móvel cresce além da picada turvando parcial ou totalmente

o meio. A bactéria imóvel cresce somente na picada.

Descarboxilação da lisina: Quando a lisina é descarboxilada, o meio adquire cor

púrpura. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarela nítida

nos seus 2/3 inferiores.

Produção do indol: Após leitura dos testes de motilidade e lisina, adicionar 3 a 4

gotas do Reativo de Kovacs a superfície do meio e agitar levemente. Quando a

bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não produz, o

reativo mantém sua cor inalterada.

A tabela mostra as características dos enteropatógenos nos meios EPM e MILi, bem

como os resultados da reação de fermentação da lactose observados nos meios de

isolamento (lactose positiva ou negativa). A identificação complementar destas

bactérias pode ser feita por meio de testes de aglutinação em lâmina com anti-soros

correspondentes a cada um deles (ver linha de soros Probac do Brasil).

Precauções:

Após o uso o produto deverá ser descartado seguindo-se as normas vigentes de

resíduos de serviços de saúde. Não utilizar o produto em caso de turvação do meio

líquido ou na presença de outros sinais de contaminação.

Conservação:

Manter em temperatura ambiente entre 10° a 25°C (local fresco).

141

Validade: 6 meses.

Tabela 8- Características dos enteropatógenos da família Enterobacteriaceae nos meios EPM-MILi.

Lactose

(placa de

isolamento)

Meio EPM Meio MILi

Aspecto Geral Gás H2S U LTD Mot I Lis

Shigella

dysenteriae

flexneri

boydii

- B/Am e S/Az

Au/b(a) e Au/e - a - - - - +/- -

Shigella

sonnei -

B/Am e S/Az

Au/b e Au/e - - - - - - -

E.coli

invasora +/-

B/Am e S/Az

AP/b e Au/e +/- - - - - + -

E.coli

outras +

B/Am e S/Az

G/b e Au/e +/- - - - - + -

Salmonella -b B/Am e S/Az

P/b e P/e + + - - + - +

Yersinia

enterocoliti

ca

- B/Am e S/Az

Au/b e Au/e - - + - - -/+ -

U: urease, LTD: L-triptofano desaminase, Mot: motilidade, I: indol, Lis: lisina, B/Am: Base Amarela, Au/b: Ausência de bolhas de gás, Au/e: Ausência de enegrecimento, B/Az: Base Azul, P/b: Presença de bolhas de

gás, P/e: Presença de enegrecimento, S/Az: Superfície Azul, G/b: Geralmente com bolhas de gás e AP/b:

Ausência ou presença de bolhas de gás

a) Alguns sorotipos de Shigella flexneri e Shigella boydii produzem gás.

b) A Salmonella Typhimurium lactose + é raramente isolada atualmente.

Referências bibliográficas: 1. Almeida, P. C. A. & Trabulsi, L. R. - Características culturais, bioquímicas,

sorológicas e virulência de amostras de Salmonella typhimurium fermentadoras de

lactose. Rev. Microbiol., 5:27 - 35, 1974.

2. Edwards, P. R. & Ewing, W. H. - Identification of Enterobacteriaceae Burgess

Publishing Company, Minneapolis, Minnesota, 1972.

142

3. Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., 1982 - MILi - Um meio para a

realização dos testes de motilidade, indol e lisina descarboxilase. Rev. Microbiol., 13:

230 - 235.

4. Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., 1982 - EPM - Uma modificação

do meio de Rugai e Araújo, para a realização simultânea dos testes de produção de

gás a partir de glicose, H2S, urease e triptofano desaminase. Rev. Microbiol., 13: 09

- 315.

143

KIT NF Fonte: PROBAC DO BRASIL

Indicações: O KIT NF da PROBAC DO BRASIL é constituído pelos testes de oxidase, utilização

de glicose em meio base OF, descarboxilação de lisina e arginina (base Moeller),

liquefação da gelatina, hidrólise da uréia, DNAse, e sensibilidade a polimixina. Os

resultados destes testes permitem identificar a maioria dos bacilos Gram negativos

não fermentadores da glicose isolados na rotina laboratorial.

Características dos componentes: Meios OF glicose com óleo e sem óleo............................................ 4 ml/tubo.

Meios Descarboxilase de Moeller: controle, lisina e arginina .............2 ml/tubo.

Meio de Gelatina ................................................................................ 1fita/tubo.

Meio DNAse..........................................................................................6 ml/placa.

Uréia......................................................................................................3 ml/tubo

Polimixina..............................................................................................6 discos/frasco

Fitas para determinação de oxidase.....................................................6 fitas/frasco

Procedimento: Os testes devem ser realizados a partir de colônias isoladas e puras com 24 horas de crescimento. 1-Oxidase: com auxílio de alça de platina, bastão de vidro ou madeira, faça um

esfregaço da colônia na fita de oxidase.

-Não utilize qualquer tipo de alça ou bastão que contenha vestígios de ferro, pois

este poderá provocar uma reação falso-positiva.

-Não utilize colônias de meios com indicadores, pois poderão apresentar resultados

falso-positivos.

-Meios de cultura: inocular densamente todos os meios do KIT NF, a partir do

crescimento bacteriano no meio EPM ou agar inclinado:

144

2-OF glicose com óleo e sem óleo: inocular por picada central, introduzindo a

agulha até o fundo.

-Controle, Lisina e Arginina: inocular com alça ou agulha, depositando o inóculo na

parede do tubo, abaixo do óleo mineral.

-Gelatina: - pingar 10 gotas de salina estéril, no tubo identificado como GEL, com o

auxílio do conta gotas, que acompanha o produto. Com o auxílio de uma alça turvar

a salina (inóculo pesado).

-Uréia: semear com inóculo denso na superfície do meio.

-DNAse: semear 2-3 colônias em spot ( círculo de 0,5 cm de diaâmetro) deixando

bastante espaço entre os teste para avaliar a presença de halo.

-Polimixina: fazer antibiograma em M.Hinton e colocar o disco.

-Incubar os meios de cultura a 37ºC durante 24-48 h; quando houver dúvidas quanto

a interpretação dos testes, reincubar por mais 24 a 48 h e fazer nova leitura.

Interpretação do resultado: A) Teste de Oxidase: a leitura é feita em poucos segundos:

Oxidase + : o esfregaço bacteriano na fita apresenta coloração rosa intenso, que

após alguns segundos pode mudar para preta.

Oxidase -: o esfregaço bacteriano não apresenta alteração de cor.

A cor rosa intensa aparece rapidamente (15-20 segundos). Após este intervalo,

cores: rosa, violeta pálido são falsos positivos. A B. cepacia pode dar reação fraca.

B) Tabela 9- Glicose O/F: OF glicose

Tubos c/ óleo s/ óleo

Oxidação do açúcar (Oxidativo) Inalterado amarelo só na superfície

Não utilização do açúcar (Inerte ou alcalino) 1 Inalterado inalterado ou azulado

Fermentação da glicose (Fermentador ou Ácido)2 amarelo amarelo

1. Aguardar no mínimo 72 h para definir como inerte, pois pode ocorrer a oxidação

tardia ou lenta. 2. Quando a bactéria fermenta a glicose, não pode ser identificada pelo KIT NF II.

Deve ser repicada em ENTEROKIT B para diagnóstico.

145

C) Descarboxilação de aminoácidos: Lisina e Arginina:

-Cor púrpura do meio mais acentuado que a do tubo controle: utilização do

aminoácido.

-Cor do meio igual ou mais amarelada que a do tubo controle: não utilização do

aminoácido.

Se negativo aguardar até 5 dias. Apenas uma prova deve ser positiva, exceto a

B.cepacia que pode ser ornitina + e lisina +.

D) Gelatina: Gelatinase (+): Utilização da gelatina impregnada na fita, com alteração da cor de

cinza metálica para azul transparente.

Gelatinase (-): A cor da fita permanece inalterada.

Obs: antes de fazer a leitura, agitar suavemente o tubo.

E) Uréia: a cor rosa forte aparece em parte do ápice ou em todo o meio após 24-72

h de incubação: ligeira mudança de cor rósea no ápice que não progride com maior

incubação é considerada negativa. A Bordetella bronchiseptica pode dar reação

positiva em 4 h.

F) DNAse: adicionar ácido clorídrico 1N e aguardar 5 minutos. Observar a presença

de halo transparente em volta do inoculo e o restante do meio fica leitoso. Se

negativo repetir o teste com leitura em 48 h. Sempre usar uma cepa controle positivo

e negativo.

G) Polimixina: qualquer halo em torno do disco significa sensibilidade.

Provas adicionais não incluídas: -Crescimento em Mac Conkey: Semear com alça uma colônia isolada o crescimento

deverá ocorrer entre 1 e 3 dias.

-Motilidade: Se a motilidade em tubo for negativa, recomenda-se a confirmação do

resultado com o teste em lâmina.

-Teste de motilidade em lâmina: Inocular 2 colônias em um caldo TSB e incubá-lo pó

18-24 h á 37ºC.

Agitar o tubo e com uma pipeta ou alça estéril retirar uma gota e depositar sobre

uma lâmina. Sobre a gota depositar uma lamínula e observar com aumento de 400

146

vezes. A presença de muitas ou poucas bactérias cruzando o campo é significativa

de motilidade positiva. Movimentos vibratórios fracos são considerados negativos. A

motilidade deve

ser observada em 37º e 20ºC.

-Coloração de Gram: Realizar a coloração de Gram para a observação da

morfologia bacteriana

-Crescimento a 42º C: semear 2 colônias no meio. Incubar a 42º C. A prova será

positiva quando ocorrer com a turbidez do meio ou for nítido o aumento da

densidade bacteriana. O ideal é comparar com um controle mantido a temperatura

ambiente.

A interpretação dos resultados obtidos no KIT NF deve ser realizada de acordo com

o Sistema Numérico que acompanha o produto. Quando necessário, outros testes

podem ser realizados para confirmação do diagnóstico.

Apresentação: Caixa com 6 conjuntos.

Validade: 6 meses.

Conservação: Manter os meios de cultura em temperatura ambiente 10º- 25ºC

(local fresco). Manter as Fitas

de Oxidase, os discos de polimixina e as placas de DNAse em geladeira (2 a 8º C).

Precauções: Após o uso, o produto deverá ser descartado conforme as

recomendações vigentes para resíduos de serviços de saúde.

147

ESQUEMA NÚMERICO PARA IDENTIFICAÇÃO EM BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS

Etapa 1 Fazer as seguintes provas:

• Oxidase

• Motilidade

• O/F Glicose / Controle

• Crescimento em Mac Conkey

• Gram

• Gelatina

• DNAse

• Uréia

• Lisina

• Arginina

• Crescimento a 42ºC

• Teste de sensibilidade a polimixina

Tabela 10- Valores das provas de Oxidase e Motilidade VALORES

PROVAS Provas positivas Provas negativas

Oxidase 4 0

Motilidade 2 0

Somar valores obtidos para as provas de oxidase e motilidade= A

Tabela 11- Valores das provas de OF, MC e Morfologia VALORES

PROVAS Provas positivas Provas negativas

OF Oxidativo=4 Inerte ou alcalino=0

Mac Conkey Crescimento=2 Não crescimento=0

Morfologia (Gram) Bacilo=1 Coco/cocobacilo=0

Somar valores obtidos para as provas de OF glicose + Crescimento em Mac Conkey + Gram= B

148

Tabela 12- Valores dos testes bioquímicos

Leitura AB C D E Leitura ABCDE

42º C

4 Gel 2

DNA 1

URE 4

LIS 2

ARG 1

PMX 1

00 * *

01 * *

02 * *

03 * *

06 * *

07 * *

22 * * *

26 * * * * * *

40 * * *

41 * * * *

42 * * *

43 * * *

45 * * *

47 * * *

63 * * * * *

65 * *

67 * *

*Campos preenchidos não considerar a leitura da prova

Etapa 3 Provas complementares Estas provas poderão ser indicadas para caracterizar alguns não fermentadores ou

diferenciar outros cujas provas empregadas apresentaram padrão semelhante.

1. Citrato

2. Crescimento em NaCl 6,5%

3. Esculina

4. Indol

5. PYR

Etapa 4 Localizar o número com 5 algarismos obtido e a correspondente identificação na

coluna da esquerda.

149

A tabela de freqüência mostra para alguns microrganismos a freqüência que o

conjunto de provas pode ocorrer.

Frequências baixas (<10% ) sugerem necessidade de revisão das provas (p. ex.

aguardar mais tempo para interpretar provas negativas ou repetição de todas elas).

Números não encontrados sugerem bactéria com padrão não comum, falha de

interpretação de uma ou mais provas ou bactéria rara.

150

Tabela 13- Identificação de isolados Não fermentadores A B C D E Freq.

% Provas complementares

Acinetobacter iwofii 0 0 0 0 0 80 Citrato negativo

Acinetobacter iwofii 0 0 0 0 0 10 Citrato negativo

A.haemolyticus 0 2 2 1 0 45 Citrato negativo

A.haemolyticus 0 2 2 1 0 ˂10 Citrato positivo

A.calcoaceticus 0 3 0 1 0 90 Citrato pos. hemólise em

Agar sangue pos. A.baumannii 0 6 4 1 0 90 Citrato positivo

A.baumannii 0 6 4 5 0 ˂10 Citrato positivo

A.calcoaceticus 0 6 0 1 0 ˂10 Citrato positivo



A.haemolyticus 0 6 2 1 0 45 Citrato positivo

A.haemolyticus 0 7 2 1 0 ˂10 Citrato pos. hemólise em

Agar sangue pos. Acinetobacter spp 0 0/1/2/3/

4/5/6/7

2/0 2/0 0 ˂10 Citrato pos. hemólise em

Agar sangue pos

S.maltophilia 2 2 1 2 0 15

S.maltophilia 2 6 1 2 0 56

P.oryzihabitans 2 6 0 0 0 86

B. cepacia 2 6 0 2 1 80

P. luteola 2 6 0 1 0 99 Esculina pos. e PYR pos

P.oryzihabitans 2 6 0 0 0 14 Esculina neg. e PYR pos

B.cepacia 2 2 0 2 1 80 PYR negativo

S.maltophilia 2 6 0 1 0 29 PYR negativo

Moraxella spp 4 0 0 0 0 50

Moraxella catarrhalis 4 0 1 0 0 99

Moraxella lacunata 4 0 2 0 0 99

C.indologenes 4 1 2 0 1 ˂10

151



C.meningosepticum 4 1 3 0 1 ˂10

Moraxella spp 4 2 0 0 0 50

M/Ureolytica 4 2 0 4 0 99 M.canis 4 2 1 0 0 99

C.Indologenes 4 3 2 0 1 ˂10 indol pos C.Meningosepticum 4 3 3 0 1 ˂10 indol pos

S.paucimobilis 4 5 0 0 0 indol neg

Sphingobacterium 4 5 0 4 1 indol neg

Sphingobacterium 4 5 1 4 1 indol neg

C.Indologenes 4 5 2 0 1 90 indol pos

C.Meningosepticum 4 5 3 0 1 45 indol pos

Sphingobacterium 4 7 0 4 1 indol neg Sphingobacterium 4 7 1 4 1 indol neg

C.Indologenes 4 7 2 4 1 ˂10 indol pos

C.Meningosepticum 4 7 3 4 1 45 indol pos

A.Denitrificans 6 3 0 0 0 NaCl 6,5% neg. e PYR pos

A.faecalis 6 3 0 0 2 NaCl 6,5% pos.e PYR neg

B. bronchiseptica 6 3 0 4 0 Uréia pos. ++ e PYR neg.

A. Denitrificans 6 3 0 4 0 Uréia Fraca e PYR pos

S. Paucimobilis 6 5 0 0 0




A. xilosoxidans 6 7 0 0 0 07 Esculinaneg., NaCl6,5%neg.

S.Paucimobilis 6 7 0 0 0 Esculina positiva

P.Stutzeri 6 7 0 0 0

B.cepacia 6 7 0 0 1 03

A. xilosoxidans 6 7 4 0 0 43 Esculina neg.,NaCl 6,5%

S.paucimobilis 6 7 4 0 0 Esculina positiva

P.stutzeri 6 7 4 0 0

B.cepacia 6 7 4 0 1 13 Esculinaneg., NaCl6,5%pos.

P. putida 6 7 0 1 0

P.aeruginosa 6 7 4 1 0 18 NaCl 6,5%=Variável P.mendocina 6 7 4 1 0 90 NaCl 6,5%=positiva

B.pseudomallei 6 7 4 1 1 21

A.Xilosoxidans 6 7 0 2 0 07

152



B. cepacia 6 7 0 2 1 13

A.Xilosoxidans 6 7 4 2 0 43

B.cepacia 6 7 4 2 1 51

S.paucimobilis 6 7 1 0 0 Esculina positiva

S.putrefaciens 6 7 1 0 0 H2S pos.,no TSI e Esculina

S.Paucimobilis 6 7 5 0 0

B.cepacia 6 7 2 0 1 01

B.cepacia 6 7 6 0 10 3

P.fluorescens 6 7 2 1 0

P.aeruginosa 6 7 6 1 0 82

B. pseudomallei 6 7 6 1 1 79

B. cepacia 6 7 2 2 1 03

B. cepacia 6 7 6 2 1 13

S. putrefaciens 6 7 3 0 0 H2S positivo no TSI



Tabela 14- Valores das provas bioquímicas Colônias com Pigmento rosa

Microrganismo A B C D E Microrganismo

Methylobacterium spp 6/4/2/0 5/1 0 4 0

Coral e seca

Roseomonas spp 6/4/2/0 7/6/3/2 0 4 4

Rosada e mucóide

153

Penicillin-binding protein (PBP2’) Teste de Aglutinação em Látex

Fonte: Kit PBP 2’- Oxoid Brasil

Introdução Este teste é um ensaio de aglutinação rápida em látex, para a detecção de PBP2’

(também chamado de PBP2a), em Staphylococcus spp. Isolados, como uma ajuda a

identificação de Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) e

Staphylococcus coagulase negativa meticilina resistente.

Princípio do teste

Os Staphylococcus spp. são a principal causa de infecções nosocomiais e de

infecções comunitárias adquiridas no mundo. Em muitas instituições

aproximadamente 25% a 50% das cepas de S. aureus e 75% das cepas de

Staphylococcus coagulase (CoNS) são resistentes a meticilina. Os MRSA podem ser

vistos como um problema particular pela facilidade com que certas cepas

epidêmicas se difundem e colonizam pacientes debilitados. O tratamento de cepas

sensíveis com penicilinas resistentes a penicilinase (PRP) é recomendável, uma vez

que as drogas ß-lactâmicas são facilmente absorvidas pelos líquidos corpóreos e

tecidos, causam menores complicações durante o tratamento e não selecionam os

organismos vancomicina-resistentes. A identificação segura de meticilina resistente

é, portanto importante.

Cepas de S. aureus com reduzida sensibilidade para PRP estão divididas nas

seguintes categorias:

(I) S. aureus meticilina resistente (MRSA), que possui uma baixa afinidade a

proteína de ligação à penicilina PBP2’, codificada pelo gen mecA;

(II) S. aureus “bordeline” meticilina resistente (BORSA), geralmente assim

considerado por possuir ums hiperprodução de beta lactamase – tipo A; e

(III) Cepas com PBPs modificado devido à capacidade de alteração da

penicilina “binding” ou a hiperprodução de PBPs (MODSA). MODSA são

raramente isolados e sua resposta clínica à terapia aos beta-lactâmicos

não tem sido bem estudada. Desse modo, para propostas clínicas, com

154

raras exceções, a presença de PBP2’ é responsável pela meticilina

resistência nos tratamentos de infecções com S. aureus e CoNS.

O fenótipo de meticilina resistente pode ser altamente heterogêneo,

dificultando a detecção pelos métodos convencionais dos testes de sensibilidade a

antimicrobianos, como a concentração mínima inibitória (MIC) ou a triagem em disco

e Agar. A precisão deste método é afetada pelo tamanho do inoculo, tempo e

temperatura de incubação, meio, pH, concentração de sal e outros fatores. Em

adição, estes métodos de cultura requerem 24 horas de incubação para resultados

precisos. CoNS com freqüência produzem os mais baixos níveis de PBP2’ e

requerem indução por exposição de um PRPS para produzir suficiente produto a ser

detectado. A detecção do gen mecA, tem sido considerado o padrão (“gold

standard”) para a determinação de meticilina resistente devido a sua precisão, mas o

método é extremamente trabalhoso e de alto custo.

O teste de Látex Oxoid PBP2’ possui a vantagem de detectar diretamente a

proteína do PBP2’ num tempo rápido e com o mínimo de trabalho. O teste tem

potencial para ser até mais preciso que a detecção pelo gen mecA, uma vez que

resultados falso positivos não ocorrem com cepas que apresentam mecA, mas são

incapazes de produzir o produto de proteína do gene. Em adição, o teste não

detecta cepas que são hiperprodutoras de beta lactamase ou PBPs.

O teste Oxoid PBP2’ foi previamente avaliado mundialmente, demonstrando

possuir uma alta sensibilidade e especificidade. Partículas de látex sensibilizadas

com anticorpo monoclonal contra PBP2’ reagem especificamente com os

Staphylococcus meticilina resistentes causando aglutinação visível a olho nu.

Componentes do kit - DR901 Látex Teste – sensibilizado com anticorpo monoclonal contra PBP2’.

- DR902 Látex Controle – sensibilizado com anticorpo monoclonal da mesma

subclasse de IgG mostrando não reatividade com as proteínas de S. aureus.

- DR903 Reagente de Extração 1

- DR904 Regente de Extração 2

Cartões de Teste

Bastões homogenizadores

Folheto de instrução

155

Materiais necessários, mas não fornecidos - Micropipetas e ponteiras (50µl)

- Alças microbiológicas (5µl/1µl)

- Banho-maria ou banho aquecido

- Centrífuga (1500 x g)

- Tubos de microcentrífuga (tampa de segurança)

- Desinfetante apropriado para laboratório

Precauções

Este produto se destina exclusivamente ao uso diagnóstico in vitro. O tempo

de aquecimento deve ser de três minutos. Aquecimento por mais de cinco minutos

pode causar diminuição da sensibilidade. Aquecimento somente por um minuto ou

menos, pode causar uma aglutinação não específica.

Ao remover o sobrenadante a ser utilizado pelo teste após a centrifugação,

retirara a pipeta cuidadosamente para evitar que o material sólido do fundo do tubo

não seja aspirado. A utilização de material sólido pode causar aglutinação não

específica. Misturar bem os reagentes (Látex) antes se sua utilização, para a

obtenção de uma suspensão homogênea.

Os reagentes contém como preservante azida sódica a 0,095%. A azida sódica é

tóxica e pode reagir com encanamentos de chumbo ou cobre produzindo metais de

azida que são explosivos por contato. Para prevenir o acúmulo de azida nos

encanamentos, lavar abundantemente com água imediatamente após despejar os

reagentes no esgoto.

Como as amostras podem conter organismos patogênicos, manipular utilizando

precauções apropriadas. Os procedimentos de extração podem não matar as

bactérias; portanto a extração deve ser realizada segundo as mesmas precauções.

Os reagentes de extração 1 e 2 contém uma leve solução irritante e um fraco

ácido. Evitar contato direto através do uso de equipamentos de proteção

convenientes. Caso o material entrar em contato com a pele, membranas mucosas

ou olhos, lavar imediatamente o local com água em abundância.

Armazenagem

Armazenar o kit entre 2° e 8°C. Nestas condições os reagentes manterão sua

156

atividade até a data de validade mostrada na caixa.

Procedimento para controles Para cada novo lote do kit e semanalmente, os seguintes procedimentos para

controle deverão ser realizados.

1. Controle Positivo – Utilizar uma cepa MRSA conhecida como ATCC®

43300 (Culti-Loops Oxoid® C9022L). Seguir o método informado no

procedimento do teste. Assegurar que a aglutinação ocorra dentro de 3

minutos.

2. Controle Negativo – Utilizar uma cepa conhecida de Staphylococcus

aureus Meticilina Sensível (MRSA) como a ATCC® 25933 ou ATCC® 29213

(Culti-Loops Oxoid® C7010L ou C7011L). Seguir o método informado no

procedimento do teste. Assegurar que a aglutinação não ocorra dentro de 3

minutos. Não utilizar o teste se as reações observadas com os organismos

controles estiverem incorretas. 3. Não utilizar o kit após a data de validade.

Importante nota de procedimento Não encostar o conta gotas no cartão de teste onde se encontra a amostra para

evitar a contaminação dos reagentes. Assegurar que as tampas dos reagentes

estejam fechadas após a sua utilização evitando assim uma contaminação ou

ressecamento dos mesmos. Após o uso, retornar o kit ao refrigerador assegurando

que os frascos estejam na posição correta.

Preparação da cultura As colônias poderão ser testadas a partir dos seguintes meios de cultura:

Tryptone Soya Agar (TSA) com 55 de sangue de carneiro, Muller-Hinton Agar. O uso

de culturas recentes (18 A 24 hs) é recomendado. Entretanto, para garantir

crescimento suficiente, culturas com crescimento entre 24 e 48 horas poderão ser

testadas se necessário. O desempenho verificado nos dados constantes nesta bula

foi gerado utilizando estes meios como parte do processo submetido ao FDA (North

American Food and Drugs Administration). Os dados demonstram que o teste

também é efetivo com colônias de S. aureus provenientes de Tryptone Soya Agar e

157

Columbia Agar com 5% de sangue de cavalo, Iso-Sensitest Agar e DSTA. Estes

meios são comumente utilizados na Europa, mas não nos EUA, e, portanto, não

foram utilizados nos testes que geram os dados mostrados na seção

“Características de Desempenho”.

Requisito especial O teste PBP2’deve ser realizado somente com as espécies de Staphylococcus spp.

(cocos Gram positivos). O teste de coagulase ou equivalente deve ser realizado para

determinar se as cepas isoladas são Staphylococcus aureus ou outras espécies de

estafilococos.

Preparação para inoculo Para os Staphylococcus aureus, o teste pode ser realizado a partir de colônias em

placa de isolamento primário, se o crescimento for suficiente, ou a partir de

subculturas do isolado. Outras espécies de bactérias não devem estar presentes na

placa para não interferir no teste. Para Staphylococcus coagulase negativa, uma

indução é necessária para a produção de PBP2’ suficiente.

1. Preparar uma suspensão em caldo do microrganismo no padrão da escala

de McFarland 1 e semear em uma placa de TSA com sangue, Columbia

Sangue Agar ou Mueller-Hinton Agar. Alternativamente inocular a placa de

ágar com várias colônias e semear em quatro quadrantes.

2. Colocar um disco de oxacilina (1µg/ml) sobre o microrganismo semeado ou

no principal quadrante inoculado.

3. Incubar a 37°C por não menos de 24hs e não mais de 48hs.

Cuidado: Para evitar resultados falsos negativos, não realizar o teste se não

houver inóculo suficiente disponível.

158

Método do teste Procedimento de Extração do PBP2’

1. Adicionar 4 gotas do Reagente 1 em um tudo de microcentrífuga.

2. Aproximadamente 1.5 x 109 (3-5 µl) células devem ser testadas. Isto pode ser

conseguido usando uma alça estéril de 5µl para remover suficiente

quantidade de células e completar o diâmetro interno da alça.

Alternativamente, uma alça estéril de 1 µl pode ser utilizada para remover

várias colônias num tamanho equivalente de 1 µl ou 1mm de altura cobrindo

todo o diâmetro caso grumos estejam presentes. Uma suspensão muito turva

deve ser observada.

3. Colocar o tubo em um Banho-Maria ou em um bloco aquecido (SUPERIOR A

95°C) e aquecer Por 3 minutos.

4. Retirar o tubo de microcentrífuga e deixar atingir a temperatura ambiente.

5. Adicionar 1 gota do Reagente 2 no tubo e misturar.

6. Centrifugar a 1500 x g por 5 minutos, ou seja, 3.000 rpm para um raio de

rotação de 15 cm ou 4500rpm para um raio de rotação de 4,5cm. Utilizar o

sobrenadante para o teste.

Procedimento de aglutinação em Látex

1. Para cada sobrenadante a ser testado, utilizar um círculo do cartão de teste

para testar com o Látex Reagente e outro para testar com Látex Controle.

2. Homogenizar os reagentes de Látex por inversão por várias vezes, e

adicionar uma gota de Látex Teste ou Látex Controle em cada um dos

círculos.

3. Colocar 50µl do sobrenadante no círculo teste e no círculo controle, com

cuidado para evitar a formação de bolhas. Misturar o látex e o

sobrenadante em cada círculo utilizando os bastões homogenizadores.

4. Imprimir ao cartão teste movimentos rotatórios por três minutos e observar

a aglutinação sob condições normais de luminosidade. Anotar os

resultados observados no teste e controle.

159

5. Descartar o cartão teste com segurança em recipiente contendo solução

desinfetante ou em descarte de materiais infecciosos.

Tabela 15 - Leitura e interpretação dos resultados da PBP 2a

Aglutinação verificada com Látex teste, mas não com o Látex controle em 3 minutos PBP2’Positivo (MRSA)

Nenhuma aglutinação verificada com o Látex Teste em 3 minutos PBP2’Negativo (MRSA)

Aglutinação verificada com o Látex Controle em 3 minutos Indeterminado

Aglutinação verificada com Látex teste, mas não com o Látex controle em 3 minutos PBP2’Positivo (MRSA)

Tabela 16- Tipos de reação de aglutinação

Negativa (-) Uma suspensão de partículas homogênea sem grupos visíveis.

Fracamente Positiva (+) Grupos pequenos, mas definidos contra o fundo turvo

Fortemente Positiva (+) Grupos grandes e pequenos contra um fundo ligeiramente turvo ou grandes grumos

contra um fundo muito claro

Obs: Ocasionalmente, reações negativas podem apresentar uma aparência granular

fina ou reações podem ser observadas. Nestes casos, a visualização do fundo pode

ser utilizada para interpretar o resultado. Um fundo opaco indica um resultado

negativo e um fundo claro pode ser interpretado como resultado positivo.

Limitações

Resultados indeterminados devem ser retestados com um material extraído

recentemente. Se, sob reteste o resultado se mantiver indeterminado, a resistência a

meticilina deverá ser determinada por outro método.

Resultados falsos negativos podem ocorrer se for utilizado no teste material

160

insuficiente. Neste caso, o teste deverá ser repetido com a quantidade suficiente de

material. Verdadeiros resultados positivos geralmente apresentam fortes reações.

Reações falso positivas ocorrem raramente, e são limitadas geralmente a

fracas reações. Estes resultados podem ser verificados por retestes em culturas

recentes. Staphylococcus aureus hiperprodutores de PBP ou chamados de S.

aureus modificados (MODSA) e cepas S. aureus bordeline resistente (BORSA) não

possuel PBP2’e não se espera reação neste teste.

Cepas de alguns microrganismos podem ter baixo nível de meticilina

resistência ou em raros caos, produzirem PBP2’em baixas quantidades e

apresentarem resultados falsos negativos.

Devido às limitações de sensibilidade e especificidade dos testes de

sensibilidade para Staphylococcus coagulase negativa, determinados pelo NCCLS,

particularmente para outras cepas que não o Staphylococcus epidermidis, os

resultados do ensaio de PBP2’ não devem concordar com os resultados dos testes

de sensibilidade. Cepas com MICs > 4 g/ml de

resistentes, apesar do resultado no teste de PBP2’.

Características de Desempenho

O teste de aglutinação em látex Oxid Penicillin-Binding protein foi avaliado em

4 laboratórios geograficamente diversos com isolados clínicos frescos de S. aureus.

201 isolados foram testados com os métodos do NCCLS e com o teste Oxid PBP2’

para cada três meios. Uma fraca reação falso positiva (negativa na repetição) em

TSA com sangue foi encontrada no látex Oxoid. Todas as reações positivas foram

fortes, exceto três reações fracas (mas positivas) com ágar Mueller-Hinton.

161

Tabela 17- Resultados do teste com 201 isolados clínicos frescos de S.

aureus de quatro laboratórios

NÚMERO TESTADO MRSA BORSAA MSSA

Crescimento com Agar Sal

Oxacilina 68 3 130

MIC > 4g/ml NCCSL 68 0 0

Látex positivo com TSA

Sangue 68 0 0

Látex positivo com

Columbia Sangue 68 0 1 (1)a

Látex positivo com Mueller-

Hinton 68(3)a 0 0

0 0

A MICs foram de 2mg/ml e mecA foi negativo a Número de fracas reações mostradas em parênteses

2. Teste de desafio de cepas de S. aureus em três áreas geograficamente distintas Três laboratórios examinaram cada um, uma série previamente coletada de

cepas de S. aureus para desafio e compararam o resultado do PBP2’ com os

resultados dos métodos determinados pelo NCCLS para os MRSA. Um total de 774

cepas foram testadas utilizando TSA com sangue. A sensibilidade encontrada no

teste Oxid PBP2’ foi de 98,5% e a especificidade foi de 100%. As sensibilidades

encontradas nos métodos de triagem em ágar e MIC foram de 98,7% e 99,2% e as

especificidades foram de 90,0% e 88,7%. Duas cepas de MODSA foram também

testadas separadamente, ambas tiveram resultados negativos com o teste de Látex.

3. Teste de Staphylococcus coagulase negativa Dois laboratórios testaram Staphylococcus coagulase negativa pelo PBP2’

após a indução com os discos de oxacilina. Um laboratório testou 115 cepas

resistentes a meticilina e 45 cepas sensíveis a meticilina, incluindo 58 isolados

clínicos recentes. A sensibilidade foi de 96,5% para os testes utilizando TSA com

sangue e 95,6% utilizando o Mueller-Hinton Agar.

162

A especificidade foi de 100% utilizando TSA com sangue e 98% utilizando o

Mueller-Hinton Agar. A obtenção de um bom inóculo foi mais difícil com Mueller-

Hinton Agar. O segundo laboratório testou 212 cepas de meticilina resistente e 203

cepas de meticilina sensível obtendo uma sensibilidade de 99,5% e uma

especificidade de 99,5% utilizando o inóculo crescido em Columbia Agar.

4. Reprodutibilidade Dez diferentes cepas bem caracterizadas de Staphylococcus aureus (3MRSA,

3MSSA, 3 BORSA e MODSA) foram enviadas a três laboratórios geograficamente

diversos com cada cepa submetida por 5 vezes em códigos cegos. Todos os 150

resultados obtidos concordaram com os resultados esperados com 100% de

reprodutividade. As três cepas mecA positivas foram positivas todas as vezes que

foram testadas (45/45 testes). As três cepas MSSA e as três cepas BORSA

apresentaram resultados negativos toda vez que o teste foi realizado (90/90 testes).

A MODSA obteve um MIC de 16µg/ml para a oxacilina e um resultado negativo no

Oxoid Latex Teste, como esperado, toda vez que os teste foi realizado (15/15

testes).

163

Teste de suscetibilidade pelo método ETEST

Fonte: Etest- PROBAC DO BRASIL

1 - Utilização

O Etest é uma técnica quantitativa, que permite a determinação da

concentração mínima inibitória (MIC) dos agentes antimicrobianos e a detecção dos

mecanismos de resistência para uma variedade de microrganismos.

2 - Fundamento

O Etest consiste numa tira de plástico inerte, não poroso (5 x 57 mm). A

superfície superior da tira contém uma escala que expressa a CMI em μg/mL e o

código identificador do agente antimicrobiano ou reagente (figura 1).

Na superfície inferior da tira está um gradiente de concentrações,

correspondentes a 15 diluições duplas, do antibiótico pré-definido baseado no

método convencional para a determinação da MIC. Quando a tira de Etest é

aplicada à superfície, previamente inoculada, do meio, o gradiente do antimicrobiano

e imediatamente transferido para a matriz da gelose. O gradiente contínuo de

concentrações, estabelecido ao longo da tira, mantém-se estável durante um longo

período de tempo, cobrindo os tempos críticos para uma grande variedade de

microrganismos.

Após 24 horas ou mais de incubação, forma-se uma elipse de inibição,

simétrica e centrada ao longo da tira. O ponto de intercepção da elipse com a tira

corresponde ao valor da MIC em μg/mL, que é lido diretamente na escala e

posteriormente relacionado à tabela padrão para indises de resistência,

sensibilidade reduzida ou sensibilidade. 3 - Conservação

A embalagem selada deve ser conservada, de acordo com as condições

especificadas na carteira de folha de alumínio até à expiração do prazo de validade.

As tiras Etest que permanecem numa embalagem aberta, devem ser mantidas secas, conservadas num contentor estanque ao ar ou num tubo de conservação

com dessecante ou re-selando a carteira com uma mola e utilizá-la até à expiração

164

do prazo de validade. Quando não estão em utilização, as tiras Etest devem ser

protegidas da humidade e da luz.

4 – Manipulação A menos que seja conservada numa sala de temperatura controlada (18 a

22°C), a embalagem deve atingir a temperatura ambiente antes de ser aberta. Abra

a carteira de folha de alumínio e retire as tiras manualmente com os dedos, pinça ou

com aplicador específico. Não toque no lado da tira, que tem os reagentes, isto é, no

lado oposto da escala MIC.

5 – Método

Meio de cultura Seleccione os suplementos adequados ao microrganismo a ser ensaiado.

Assegure-se que o meio cumpre as especificações do controlo de qualidade,

profundidade da gelose de 4.0 ± 0.5 mm. Preparação do Inóculo

Emulsione várias colónias isoladas, a partir de uma cultura pura “overnight”,

para um meio de suspensão adequado. Os organismos fastidiosos devem ser

suspensos num caldo e utilizados no período de 15 minutos. Compare a turvação

com o padrão McFarland adequado.

Inoculação

Mergulhe uma zaragatoa de algodão estéril na suspensão de inóculo e

pressione contra a parede interna do tubo, para remover o excesso de líquido.

Espalhe cuidadosamente em toda a superfície do meio gelosado, em três direcções,

também pode ser utilizado o Retro C80™ (inoculador rotativo). Para testes com

antifúngicos, abra 2 sulcos na placa, mergulhando a ansa no inoculo, entre eles.

Deixe que o excesso de humidade seja completamente absorvido e que a

superfície esteja completamente seca, antes de aplicar as tiras Etest.

165

Aplicação das tiras

Aplique a tira de Etest à superfície do meio de cultura com a escala de CMI

de frente e virada para cima (para a abertura da placa). Tal pode ser feito com pinça,

com um aplicador manual, Nema C88™ (caneta de vácuo) ou Simplex C76™

(aplicador automático). Assegure-se que a tira fica totalmente em contacto com a

superfície do meio de cultura e sem bolhas de ar. Uma vez aplicada, não remova a

tira (figura 2).

Incubação

As placas são colocadas na estufa de incubação, na posição invertida (com a

tampa para baixo); as temperaturas e os tempos de incubação são aplicados de

acordo com os microrganismos em estudo.

Leitura

O valor de MIC é lido no ponto onde a elipse de inibição intersecta a tira. No

endereço www.abbiodisk.com estão disponíveis vários padrões de

crescimento/inibição para diferentes microrganismos, assim como oprocedimento

correto para a leitura dos resultados.

Figura 1 Figura 2

Figura 1 e 2 – Imagem da fita de E-teste para ESBL com a escala em MIC

aplicadas no meio de cultura. Fonte: AB Bidisk

166

Teste de Suscetibilidade pelo método Eteste para confirmação in vitro de ESBL

cefotaxime/cefotaxime + clavulanic acid ceftazidime/ceftazidime + clavulanic acid

Fonte: Etest para ESBL- PROBAC DO BRASIL

Reagents

100 ou 30 unidades de fitas E-teste reagents de cada CT/CTL ou TZ/TZL

Armazenamento

Todos os pacotes com fitas não abertas ou não utilizadas devem ser

armazenados a -20°C ou na temperatura sigerida na bula do kit até a data de

expiração do mesmo. Fitas não utilizadas devem ser armazenadas em um frasco

contendo sílica colorida para retirar a umidade. Proteger as fitas Etestes da

exposição a misturas, calor e luz direta forte em qualquer hora.

Evitar a penetração de umidade dentro do pacote ou no frasco. As fitas devem ser mantidas secas. Manuseio

Antes de utilizar as fitas Eteste de um pacote fechado, inspecionar

visualmente para verificar se está intacto. Não utilizar as fitas se o pacote estiver

danificado.

Ao retirar do freezer a -20°C, deixar o pacote ou container atingir a

temperatura ambiente por 30 minutos. A umidade condensada na superfície de fora

deve evaporar antes de abrir o pacote. Abra o pacote de acordo com as instruções.

Ao segurar as fitas de Eteste, pegue apenas a fita na área de Eteste ESBL. Não

toque na superfície da fita com o antibiotic, por exemplo, o lado oposto da escala. As

fitas podem ser colocadas utilizando-se um aplicador (figura 2).

167

Precauções

• O Eteste ESBL é somente para uso diagnóstco in vitro.

• O uso apropriado do sistema requer o conhecimento de pessoal terinado em

microbiologia e teste antimicrobiano.

• O Eteste ESBL deve ser utilizado de acordo com os procedimentos descritos.

Procedimentos assépticos devem ser realizados todas às vezes que se utilizar

espécimes bacterianas e medidas de precaução devem ser tomadas contra danos

microbiológicos. As placas de Agar devem ser esterilizadas após uso, antes do

descarte.

• Ocasionalmente a estática pode ocasionar a aderência de uma ou mais fitas.

Tenha certeza que você separou as fitas e as appliqué somente uma vez na

superfície do ágar.

• Devido à rápida difusão do antibiotico, as fitas Eteste ESBL não podem se

removidas uma vez em contato com a superfície do ágar.

• Consultar o guia técnico do Eteste (www.abbiodisk.com), e ler a bula do mesmo

antes da utilização. Procedimento

Materiais necessários que não acompanham as fitas:

• Placas de ágar Mueller Hinton (depth of 4 ± 0.5 mm)

• Salina estéril (0.85% NaCl)

• lupa estéril, swabs, tubos, pipetas e tesouras

• Aplicador manual de Eteste

• Turbidez número 0.5 da escala padrão de McFarland

• Incubatora (35 ± 2 °C)

• Cepas de controle de qualidade

• Frasco de estocagem com sílica

• Informação técnica adicional www.abbiodisk.com/Etest Technical Manual

168

Meio de ágar

Tenha certeza de que a espessura do ágar seja 4.0 ± 0.5 mm com pH 7.3 ± 0.1 .

Preparação do inóculo

Emulsionar várias colônias recém isoladas de uma cultura de 24hs em meio

sólido, em salina até uma turbidez de 0.5 da escala padrão de McFarland. Se o

inoculo estiver correto, uma camda confluente será obtida após a incubação. Faça

uma contagem de colônias para verificar se o seu procedimento atingiu uma densidade correta do inóculo no que se refere à UFC/mL

Nota:

Como as ESBL são dependentes do inóculo, uma quantidade muito pesada

ou leve da mesma afeta diretamente o resultado. O excesso da enzima pode

interferir no componente do ácido clavulânico no teste e reduzir potencialmente o

raio do MIC da CT/CTL ou TZ/TZL e fornecer um resultado falso negativo. Ao

contrário, pouca enzima pode fornecer um MIC baixo para a CT ou TZ, e reduzir o

raio da CT/CTL e TZ/TZL.

Inoculação

Inserir um swab estéril, não tóxico na suspensão do inóculo. Remover o

excesso de fluido pressionando o swab contra a parede interna do tubo. Passar o

swab na superfície do ágar por 3 vezes, rodando a placa aproximadamente 60º cada

vez, para assegurar uma boa distribuição. Permitir que a umidade seja absorvida por

aproximadamente 15 minutos de modo que a superfície esteja completamente seca antes de aplicar as fitas de ESBL.

169

Aplicação

Verificar se a superfície do ágar inoculado esteja completamente seca antes

de aplicar as fitas. Abra o pacote e aplique às fitas conforme descrito abaixo.

Manuseio

As fitas de Eteste ESBL podem ser aplicadas na superfície do ágar inoculado

com uma pinça, um aplicador de Eteste manual, ou Nema C88. Sempre coloque a

fita no ágar com a escala do MIC para cima (na direção da placa aberta), e o

gradiente do antibiótico na superfície do ágar. Se for colocada de modo errado, não

será formada a zona de elipse devido ao antibiótico não ter se difundido pela fita

pástica não porosa. Tenha certeza de que toda a fita esteja em completo contato

com a superfície do ágar. Se necessário, remover o ar das mesmas pressionando-as

gentilmente com a pinça, sempre movendo da mais baixa concentração até a mais

alta. Pequenas bolhas abaixo das fitas não afetam o resultado. Uma vez aplicada, a

fita não pode ser movida pois o antibiótico é rapidamente liberado na superfície do

ágar.

Incubação

Incubar as places de agar numa posição invertida a 35 ± 2 °C por 16-20 horas

em temperatua ambiente.

Leitura Quando o crecimento bacteriano estiver visível, ler os valores do MIC para

CT, CTL, TZ e TZL, onde as respectivas elipses inibitórias se encontram com a fita

(figura 4). Crecimento em todo o gradiente sem zona de inibição indica que o MIC é

maior ou igual (≥) ao maior valor na escala de leitura. Uma elipse inibitória abaixo do

gradiente indica que o MIC é menor (<) do que o menor valor na escala. Quando

colônias mutantes estiverempresentes na elipse de inibição, ler o MIC onde estas

colônias estiverem completamente inibidas. Para valor de MIC em alta escala, elipse

de inibição pode ser muito pequena ou não claramente discernível. Ocasionalmente,

uma zona fantasma (phantom zone) pode ser vidualizada abaixo do gradiente de

CTL ou TZL e a elipse pode ou não ser vista em prózimo ao fim da fita de CT ou TZ

(Figura 5). Elipse de inibição de CT ou TZ pode também ser deformada no final da

fita (Figure 6). A presença de uma zona fantasma ou deformação da elipse é uma

170

vantagem única da técnica de fita do Eteste ESBL. Ela indica claramente a detecção

da ESBL em raios não usuais de sinergia entre o substrato ß-lactâmico de CT ou TZ

e o ácido clavulânico difundido através da seção CTL ou TZL.

Diferentes padrões de inibição de crescimento são ilustrados nas figuras de 4-7.

Diferentes padrões de inibição de crescimento:

Figure 4. Corte ESBL positiva:

MIC CT/CTL =1.5/0.047 =32

Figura 5. Zona fantasma de inibição abaixo de CT indicativa de ESBL.

Figura 6. Deformação da inibição da elipse de TZ indicativo de ESBL.

Figura 7. Quando o valor de MIC estiver acima dos valores de testes, o resultado é não determinado (ND).

171

Tabela 18 - Guia para interpretação do Eteste ESBL

ESBL MIC Raio do MIC Reporting

Positivo

CT > 0,5 e CT/CTL > 8

ou

TZ > 1 e TZ/TZL > 8

ou

Zona fantasma ou deformação da

eclipse no CT ou TZ

Produção de ESBL e resistência a

todos as penicilinas, cefalosporinas e

aztreonam (CLSI)

Negativo CT < 0,5 ou CT/CTL < 8

e

TZ < 1 ou TZ/TZL < 8

Não produtora de ESBL

Non-determinado (ND)

CT > 16 e CTL > 1

e

Quando uma fita é negativa para

ESBL e a outra não determinada

ESBL não determinada. Se a ESBL é

suscetível, confirmar o resultado com

a genotipagem.

Exemplos de como interpretar os raios de MIC: CT/CTL 8/0.125 = 64 = ESBL +

TZ/TZL >32/<0.064 = >500 = ESBL +

CT/CTL 1/<0.016 = >62 = ESBL +

CT/CTL 4/>1 = <4 = ESBL -

TZ/TZL 0.5/0.25 = 2 = ESBL -

CT/CTL 0.25/0.19 = 1.3 = ESBL -

TZ/TZL 1/41) = 0.25 = ESBL -

TZ/TZL >32/>4 = out of range = ND 2)

CT/CTL ESBL negative and TZ/TZL ND = ND 3)

Notas:

1) Quando os MICs de CTL ou TZL forem mais elevados do que CT ou TZ

respectivamente, pode refletir a indução da produção de ß-lactamase pelo ácido

clavulânico.

2) Quando ambos os valores do MIC estiverem acima da escala do teste, o

resultado é ND= não-determinado. Isto pode sugerir a presença de um inibidor

172

resistente TEM ou enzima AmpC ou que o valor do MIC está fora do alcance do

valor do teste.

3) Quando um resultado for ESBL negativo e o outro ND, a interpretação deve ser

ND.

Controle de qualidade

Cepas de controle de qualidade devem ser testadas pelo método descrito em

procedimentos para verificar a qualidade dos reagents e a abilidade do teste em

confirmer a produçõ de ESBL. E. coli ATCC® 35218 produz ß-lactamase TEM-1

(não ESBL) e serve como controle negative para o teste. K. pneumoniae ATCC

700603,um genótipo positive para ESBL, fornece um valor de MIC dentro da escala

e serve como controle positive, ambos pelo critério do raio de MIC ou pelo fenômeno

de deformação da elipse. Atenção cuidadosa deve ser dada para a mautenção e

armazenamento de K. pneumoniae ATCC 700603 pois a perda espontânea do

plasmídeo codificador de ESBL tem sido documentada e pode dar resultados de

controle de qualidade fora dos limites aceitáveis. Valor de MIC para CTL ou TZL

acima das especificações pode indicar degradação do ácido clavulâncio ou um

inóculo excessivamente pesado. Verificar o armazenamento e manuseio das fitas e

repetir o teste utilizando o inoculo de forma correta.

173

Protocolo de extração plasmidial KIT PROMEGA Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System

1 - Centrifugar de 1 a 10 ml de cultura em meio líquido crescido overnight em tubo

de eppendorf de contendo 1,5ml por 5minutos.

2 - Dispensar o sobrenadante e retirar o excesso com pipeta de 200μl. Em seguida,

adicionar 250μl da solução de ressuspensão (Tris-HCl, EDTA e RNase A). 3- Desprender o pellet com o auxílio de ponteira esterilizada.

4 - Adicionar 250μl da solução de lise (NaOH e SDS - 2), invertendo 4 vezes para

misturar.

5 - Adicionar 10μl da solução de protease alcalina, invertendo 4 vezes para

misturar. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.

6- Adicionar 350μl de solução de neutralização (hidrocloridrato de guanidina, Acetato de potássio e Ác. acético glacial - 4), invertendo 4 vezes para misturar.

7-Centrifugar a 12.000 rpm (velocidade máxima), por 10 minutos a temperatura

ambiente.

Obtenção do DNA plasmidial 8 – Centrifugar a 12.000 rpm (velocidade máxima), por 1 minuto a temperatura

ambiente dispensando o decantado e voltando a inserir a coluna Spin no mesmo

tubo de coleta.

Lavagem 1-Inserir a coluna Spin no tubo de coleta.

2-Decantar o lisado na coluna Spin retirando com cuidado (pipeta de 1000μl - vol. de

750μl). 3-Deixar 1 minuto a T.A.

4- Centrifugar a 12.000 rpm (velocidade máxima), por 1 minuto a temperatura

ambiente dispensando o decantado e voltando a inserir a coluna Spin no mesmo

tubo de coleta.

Lavagem: 1-Adicionar 750μl de solução de lavagem (com etanol adicionado). Centrifugar a

12.000 rpm (velocidade máxima), por 1 minuto a temperatura ambiente

dispensando o decantado e voltando a inserir a coluna Spin no mesmo tubo de

174

coleta.

2-Repetir os passo 1 com 250μl de solução de lavagem.

3-Centrifugar a 12.000 rpm (velocidade máxima), por 2 minutos a temperatura

ambiente por 2 vezes.

Eluição: 1-Transferir a coluna Spin num microtubo de 1,5ml, tendo o cuidado de não

transferir a solução de lavagem junto. Se por acaso estiver solução de lavagem,

centrifugar novamente por 1 minuto a velocidade máxima, e então, transferir em um

novo tubo estéril de 1,5ml.

2-Adicionar 100μl de água livre de nuclease na coluna spin. Centrifugar na

velocidade máxima por 1 minuto a T.A.

3-Descartar a coluna e guardar o DNA a -20ºC ou temperatura menos.

4-Correr em gel de agarose a 0.8% 1μl de cada amostra com 1μl de Ladder por 50

minutos registrando o resultado em fotodocumentação.

Observação: Frasco 1- (Sol. de resuspensão): Tris-HCl → Atua como tampão.

EDTA :Age como quelante sequestrando os íons Ca2+ e Mg2-, desestabilizando a

membrana da célula, causando o inchamento devido a entrada da glicose.

RNase: Degrada o RNA presente, evitando que este possa prejudicar a extração.

Frasco 2 (Sol. de lise): NaOH: Auxilia na formação dos poros devido a elevação do pH o que desestrutura a

membrana.

SDS: Detergente aniônico que atua rompendo as ligações covalentes da membrana,

retirando lipídios e levando a formação de pequenos poros que possibilitam a

passagem dos plasmídios para o meio extracelular sem permitir a passagem do

DNA cromossomal.

Frasco 3 (Protease alcalina): Inativa endonucleases e outras proteínas liberadas durante o processo de lise que

podem afetar a qualidade do DNA purificado.

Frasco 4 (Sol. de neutralização): Atua retirando as proteínas que envolvem o plasmídio e elevando o pH da solução

para próximo de 8.

175

Protocolo de extração de DNA total

Kit Invitrogentm - Easy-DNAtm Kit for Genomic DNA Isolation

Adaptações realizadas por Cristina Ferreira, Nayanne Oliveira e William Ferreira

Repicar uma colônia da bactéria em LB sólido por 24hs a 35 ºC. Pescar com a

haste do swab estéril 01 colônia da bactéria recém-crescida e inseri-la no tubo

baquelite de rosca contendo o LB líquido, deixando a tampa frouxa, em shaker por

25hs na estufa a 35 ºC.

Após 24hs, se o mesmo turvar, retirar da estufa e do shaker. Levar para

capela de fluxo laminar classe II de extração de DNA, colocar um pouco no tubo de

eppendorf de 1,5mL, centrifugar por 5min. Na centrífuga de microtubo a 20 ºC

(deixar o cool ligado). Após centrifugação, decantar por inversão o sobrenadante no

descartex, e acrescentar mais meio ao tubo centrifugando novamente até acabar

todo o LB líquido e ficar somente o pellet bacteriano no eppendorf.

Retirar todo o sobrenadante que restar após inversão do tubo com pipeta de

20 µl. Ressuspender o pellet com 200 µl de tampão PBS 1X. Soltar o pellet com

muito cuidado.

Isolamento do DNA 1-Adicionar 350µl da Solução A na suspensão de célula e homogeneizar por

inversão ou com ponteira com muito cuidado.

2- incubar em banho-maria a 65ºC por 20min.

3-Adicionar 150µl da Solução B e homogeneizar por inversão o tubo até que a

amostra esteja uniformemente viscosa (10seg. a 1 minuto).

4-Adicionar 500µl de clorofórmio (PA) e agitar até diminuir a viscosidade e a mistura

estar homogênea.

5-Centrifugar com velocidade máxima (12.000rpm) por 15min. a 4ºC para separar

as fases. Retirar com pipeta o sobrenadante e colocá-lo em um novo tubo de

eppendorff de 1,5ml desprezando o usado.

6-Iniciar a precipitação do DNA.

176

Precipitação do DNA 10- A solução de DNA, adicionar 1mL de etanol a 100% (PA), refrigerado

(congelador) a -20 ºC e homogeneizar por inversão o tubo.

11- Incubar por 1 hora e 30 minutos ou mais em gelo (congelador e mergulhar o tubo

no gelo)

12- Centrifugar com velocidade máxima (12.000 rpm) por 12min. a 4ºC , removendo

o etanol por inversão do tubo e retirando excesso com pipeta de 200µl.

13-Adicionar 500µl de etanol a 80% (contendo 80 mL de etanol + 20 mL de água)

refrigerado a -20 ºC e homogeneizar por inversão por 20 vezes.

14- Centrifugar com velocidade máxima (12.000 rpm) por 5min. a 4ºC, retirar o

excesso por inversão do tubo.

15- Centrifugar com velocidade máxima (12.000 rpm) por 3min. Retirar o etanol

residual com a pipeta de 20 µl. Deixar secar na capela por 10-15min. Cuidado ao

retirar para não desprender o pellet que fica no fundo do tubo ou parede .

16-Ressuspender o pellet com 50µl de tampão TE, com a ponteira com muito

cuidado. Adicionar 2µl de RNase a 2mg/mL para ficar a uma concentração de

40µl/mL. Retirar do congelador a RNase somente na hora em que for colocá-la,

descongelar na mão, usar e congelar novamente.

17-Incubar em banho-maria a 37ºC por 30 min. O DNA está pronto para futuros

experimentos. Guardar a 4ºC.

18- Correr em gel de agarose a 0.8% 1μl de cada amostra com 1μl de Ladder por 50

minutos registrando o resultado em fotodocumentação.

177

Protocolo adaptado para PCR 16S rRNA

Fonte: Myoshi et al. 2005

Utilizar como controle o S. aureus (ATCC 25923) e o S. epidermidis (ATCC12228)

Preparação do Master Mix 16S no DNA Workstation Reagentes Para 1 reação (µl)

Água ultrapura 13,45

Tampão 10X * 2,5

MgCl2 (50 mM)* 1,25

dNTP (10 mM) 0,5

Primer F (10 mM) 0,5

Primer R (10 mM) 0,5

Taq polimerase (5U/mL) 0,3

20

* Obs: Descongelar bem o tampão e MgCl2 em vórtex, para não atrapalhar a reação.

Acrescentar em cada tubo de eppendorff de 0,2ml, 20 µl do máster mix + 5 µl do

DNA lisado (5ng/ µl) (da extração, quantificado e diluído com água Q). Fazer na

capela de fluxo laminar classe IIA. O volume final da reação será de 25 µl.

Utilizar o termociclador com o programa 16S

Temp tempo 95ºC 2min

94ºC 1min

35 Ciclos 58ºC 1min 72ºC 1min

72ºC 5 min

4ºC forever

Total 2,5horas

Correr em gel de agarose a 1% 5µl do produto do PCR (DNA). Preparar o gel antes

e deixar esfriar. Aplicar 18 bolinhas de 3µl de corante xilenocianol. Pipetar 5 µl do

DNA lisado, misturar com o corante e depois 1µl do ladder com o xilenocianol e

aplicar nos poços do gel . Congelar o restante a -20C. Utilizar o Ladder de 100bp.

178

Purificar antes do seqüenciamento com o Kit GE. Esperar bandas de amplicon de aproximadamente 900bp. Caso necessite preparar o dNTP 100 µl. na (10 mµ) misturar: 10 µl dATP, 10 µl

dttp , 10 µl dctp, 10 µl dgtp + 60 µl de água Q . Colocar em um único tubo.

179

Protocolo adaptado para PCR mecA1 e mecA2 femB1 e femB2

Fonte: Jonas et al, 2002.

Diluir os primers liofilizados obtidos por compra.

Preparação do Master Mix mecA1 e A2 e femB1 e B2 no DNA Workstation Reagentes Para 1 reação (µl)


Tampão 10X * 2,5

MgCl2 (50 mM)* 1,25

dNTP (10 mM) 0,5

Primer mecA1 e A2(5 mM) 1,0

Primer FemB1 e B2(5 mM) 1,0


20

Utilizar o termociclador com o programa Jonas.

Temp tempo 94ºC 45seg

50ºC 45seg

30 Ciclos 72ºC 60seg

72ºC 2 min

4ºC forever

Total 2,25horas

Correr em gel de agarose a 1% 5 µl do produto do PCR (DNA). Deixar correr 1hora a

75 volts. Utilizar o Ladder 100bp. Esperar para o mecA1 e mecA2 bandas de amplicon em torno de 310bp. Esperar para o femB1 e femB2 bandas de amplicon de aproximadamente de 651bp.

180

Protocolo adaptado de PCR para PCR mecP4 e P7

Fonte: Milheiriço et al. 2007.

Diluir os primers liofilizados obtidos por compra. O mecP4 e mecP7 são controles

internos positivos da Milheiriço.

Preparação do Master Mix mecP4 e mecP7 no DNA Workstation Reagentes Para 1 reação (µl)


Tampão 10X * 2,5

MgCl2 (50 mM)* 1,25

dNTP (10 mM) 0,5

Primer mecP4 (5 mM) 1,0

Primer MEC P7 (5 mM) 1,0


20

* Obs: Acrescentar em cada tubo de eppendorff de 0,2ml, 20 µl do máster mix + 5 µl

do DNA lisado (5ng/ µl) (extraído, quantificado e diluído com água Q). Fazer na


Utilizar o termociclador com o programa denominado de Jonas.

Temp tempo 94ºC 4 min

94ºC 45seg


72ºC 60 seg

72ºC 2min

4ºC Forever

Total 2,25horas

Correr em gel de agarose a 1% 5 µl do produto do PCR (DNA). Pipetar 5 µl do DNA

lisado, misturar com 3µl do corante. Depois misturar 1µl do ladder 100bp com o

181

xilenocianol e aplicar nos poços do gel. Deixar correr 1hora a 75 volts.

Congelar o restante a -20C. Descongelar e purificar antes do seqüenciamento com o

Kit GE. Esperar para o mecP41 e mecP7 duas bandas de amplicon de aproximadamente 162bp.

182

Protocolo adaptado de PCR para toxinas estafilocócicas

Fonte: Strommmenger et al., 2008.

Diluir os primers liofilizados obtidos por compra. O primer mãe está a uma

concentração de 100 mµ. Diluir para uma concentração de (10 µm) e, depois, (5µm).

Cepa controle do PCR é a ATCC 29213 (MSSA PVL neg). Zhang et al.,2008.

A partir do mix de cada par de (5µm), retirar de cada um deles:

Setd F+ Setd R 1- retirar 25µl

ArcA F+ ArcA R 2 - retirar 25µl

Seh F+ seh R 3- retirar 25µl

luKPV F + lukPV R 4- retirar 25µl

Acrescentar mais 25µl de água Q ou de injeção. Teremos um único mix denominado

de mix toxina que terá 125 µl a uma concentração de 1 mµ. Retirar 1/10 do volume

total da reação (2,5 µl).

Preparação do Master Mix Toxinas no DNA Workstation Reagentes Para 1 reação (µl)


Tampão 10X * 2,5

MgCl2 (50 mM)* 1,25

dNTP (10 mM) 0,5

Primers setdF/R, ArcAF/R, 2,5

sehF/R, lukPV F/R (5 mM).


20

* Obs: Acrescentar em cada tubo de eppendorff de 0,2ml, 20 µl do master mix + 5 µl

do DNA lisado(5ng/ µl) (extraído, quantificado e diluído com água Q). Fazer na


Utilizar o termociclador com o programa denominado de Toxinas.

183


94ºC 45seg


72ºC 60 seg

72ºC 2min

4ºC Forever

Total 2,25horas


lisado, misturar com 3 µl do corante. Depois misturar 1µl do ladder 100bp com o



Kit GE.

Esperar para a toxina bandas de amplicon entre 200 a 600bp.

Setd ........................607 bp arcA...........................215bp

Seh............................358 bp

lukPV ........................432 bp

184

Protocolo apatado de PCR para cassetes cromossômicos Fonte: Milheiriço et al. , 2007.

Diluir os primers liofilizados obtidos por compra. O primer mãe está a uma

concentração de 100 mµ. Diluir depois para uma concentração de (10µm)= 10µl do

primer mãe +90 µl de água Q ou injeção) e após retirar 50µl de cada par de primer,

misturar os mesmos e ficará a uma concentração de (5µm).

Primes controles internos positivos ctles mecA P4 mecA P7 - Milheiriço et al. ,

2008.

Cepas controles ATCC 12228 S. epidermidis (ctle negativo) e ATCC 33591 S. aureus (ctle pos) Machado et al,2007. Utilizar 4 primers (2 F+R) mais os 2 ctles internos positivos e proceder o PCR.

CIF2 F+ CIF2 R e os ccrC F2+ ccrC R2 com os primers ctles mecA P4 e mecA P7

RIF5 F10+ RIF5 R13 e os SCCmec V J1 F+ SCCmec V J1 R com os primers ctles

mecA P4 mecA P7 dcs F2 + dcs R1 e os ccrB2 F2+ccrB2 R2 com os primers ctles mecA P4 mecA P7 Kdp F1 + Kdp R1 e os SCCmec III J1 F+ SCCmec III J1 R os primers ctles mecA P4 mecA P7 mecI P2+ mecI P3 e os primers ctles mecA P4 e mecA P7 .

Preparação do Master Mix Cassete cromossômico no DNA Workstation Reagentes Para 1 reação (µl)


Tampão 10X * 2,5

MgCl2 (50 mM)* 0,75

dNTP (10 mM) 0,5

Primers 2 pares- 2 + 2ctles 1,25


50

185

* Obs: Acrescentar em cada tubo de eppendorff de 0,2ml, 20 µl do master mix

+ 5 µl do DNA lisado(5ng/ µl) (extraído, quantificado e diluído com água Q). Fazer na


Utilizar o termociclador com o programa denominado de Cassete.

Temp tempo

94ºC 4 min

94ºC 30seg


72ºC 1min

72ºC 4min

4ºC Forever


lisado, misturar com 3µl do corante. Depois misturar 1µl do ladder 100bp com o



Kit GE. Esperar para o cassete produtos com amplicon de: CIF2 ..........................495 bp

ccrC ...........................449 bp

FIF5 ...........................4141 bp

SCCmec………….…377 bp

dcs ……..........……....342 bp

ccrB2 ……..................311 bp

Kdp ………………..…284 bp

SCCmec ………….....243 bp

mecI ………................209 bp

mecA P4 eP7 ............162 bp

186

Protocolo adpatado de PCR para Genotipagem dos clones estafilocócicos

Fonte: http://www.mlst.net/

Para o S. aureus: Diluir os primers liofilizados obtidos por compra. O primer mãe está a uma

concentração de 100 mM. Diluir depois para uma concentração de (10mM)= 10µl do

primer mãe +90 µl de água Q ou injeção) e após retirar 50µl de cada par de primer,

misturar os mesmos e ficará a uma concentração de (5mM).Cepas controles ATCC 12228 S. epidermidis (ctle negativo) e ATCC 33591 S. aureus (ctle pos). Realizar adaptações na temperatura de hibridização, se necessário. Preparação do Master Mix no DNA Workstation Reagentes Para 1 reação (µl)


Tampão 10X * 2,5

MgCl2 [50mM]* 0,75

dNTP [10 mM] 0,5

Mix genes [5mM] 1,0

Taq polimerase [5U/mL] 0,25

20

* Obs: Acrescentar em cada tubo de eppendorff de 0,2ml, 20 µl do master mix + 5 µl

do DNA a 5ng/ µl. Fazer na capela de fluxo laminar classe IIA. O volume final da

reação será de 25 µl. Utilizar o termociclador com o programa denominado de

MLST-SA.


95ºC 1 min

57ºC 1 min

30 Ciclos 72ºC 1 min

72ºC 5 min

4ºC forever

4ºC Forever


187

Correr em gel de agarose a 0,7% 5 µl do produto do PCR (DNA) misturado com 3µl

do corante Load Blue. Depois homogeneizar 1µl do ladder 100bp com o Load Blue e

aplicar nos poços do gel. Deixar correr 1hora a 75 volts.


Kit GE. Esperar produtos com amplicon de aproximadamente 500bp para os genes: arc, aro, glp,gmk,pta,tpi,yqi.

Para o S. epidermidis Realizar adaptações na temperatura de hibridização, se necessário.

Preparação do Master Mix no DNA Workstation Reagentes Para 1 reação (µl)


Tampão 10X * 2,5

MgCl2 [50mM]* 0,75

dNTP [10 mM] 0,5

Mix genes [5mM] 1,0

Taq polimerase [5U/mL] 0,25

20

* Obs: Acrescentar em cada tubo de eppendorff de 0,2ml, 20 µl do master mix

+ 5 µl do DNA a 5ng/µl. Fazer na capela de fluxo laminar classe IIA. O volume final

da reação será de 25 µl.

Utilizar o termociclador com o programa denominado de MLST-SE.


95ºC 30 seg

50ºC 1 min

34 Ciclos 72ºC 1 min

72ºC 10 min

4ºC forever

4ºC Forever

188

Correr em gel de agarose a 0,7% 5 µl do produto do PCR (DNA) misturado com 3µl

do corante Load Blue. Depois homogeneizar 1µl do ladder 100bp com o Load Blue e

aplicar nos poços do gel. Deixar correr 1hora a 75 volts.


Kit GE. Esperar para os genes descritos abaixo produtos com amplicon de: arcC............................................465bp

aroE............................................420bp

gtr................................................438bp

mutS...........................................412bp

pyr..............................................428bp

tpi................................................424bp

yqiL.............................................416bp

189

Protocolo para preparação de gel agarose

Fonte: Pop de Preparação de gel de agarose-Laboratório de Biologia Molecular- Fundação Alfredo da Matta

Descrição

Preparar o gel agarose a uma concentração de 0,8%, 1% e 2%

Produto Agarose NA frs 500 ou 100U invitrogen.

Protocolo

Observações: Esta preparação é para ser utilizada em cuba de eletroforese para 50ml de

gel. A proporção é de Massa/volume. O tampão diluidor é o TAE 1X. Caso não

tenha, pegar o frasco grande com o tampão TAE50X e seguir a bula para fazer a

diluição para 1X utilizando a água Milli Q ou deionizada.

Pesar em papel laminado na balança analítica:

Gel a 0,8%. Pesar 0,2g de agarose para 25mL de tampão TAE

Gel a 1%. Pesar 1,5g de agarose para 150ml de tampão TAE

Gel a 2% Pesar 0,6g de agarose para 30 de tampão TAE

Gel a 3% Pesar 1,5g de agarose para 50mL de tampão TAE

190

Técnica 1. Colocar o gel em pó no Erlenmeyer, diluir com tampão TAE, homogeneizar e levar

para o microondas durante 40 segundos. Quando faltarem 7 segundos para terminar

o ciclo no microondas (33seg), desligá-lo, observar se houve dissolução (isto é para

evitar que entre em ebulição).

2.Levar o erlenmeyer para a torneira e ficar molhando o vidro para acelerar o

resfriamento. Assim que a temperatura estiver morna (tipo mamadeira na mão),

adicionar o Syber safe e homogeneizar bem.

3. Despejar e caso fiquem bolhas, perfurá-las com agulha estéril. Colocar os pentes

e deixar gelificar cobrindo a cuba com papel alumínio (evita ação da luz). Após

gelificação, retirar os pentes com cuidado. Retirar o gel e encaixá-lo na cuba de

corrida. Acrescentar o tampão TAE 1X até mergulhar todo o gel. Caso ele esteja a

60 mA, deve ser trocado por um novo.

4-Sempre que correr tampar com papel alumínio. Um pente de 10 corre 45minutos.

Caso a coloração do gel não fique boa, pode-se acrescentar o TAE 1X mais 5ul de

Syber e deixar no aparelho Hibrid capture para homogeneizar.

8. Para observar a corrida do gel, só uma pessoa com óculos vê. Deve-se limpar a

placa com gaze e água deionizada.

191

Preparo das amostras para aplicação no gel

Fonte: Pop Preparação de gel de agarose-Laboratório de Biologia Molecular-Fundação Alfredo da Matta

1- Cortar um segmento de PARAFILM, adicionando 1,5μl de SYBR safe (Invitrogen),

sobre a superfície do mesmo, ou o igual volume de xilenocianol.

2- Pipetar 8μl do DNA extraído, misturando com o SYBR depositado no PARAFILM.

3- Misturar 2μl do BLUE ORANGE 6X LOADING DYE (Promega®) em PARAFILM e

1μl do Super Coiled DNA ladder 2-16kb (Promega®), misturando e adicionando no

poço do GEL destinado ao MARCADOR DE DNA. 3-Ligar a cuba de eletroforese, calibrando a corrida para 75 volts por 1 hora de 20min. Cobrir o GEL com papel alumínio. (preto -) → (vermelho +).

Obs: Blue/Orange Loading Dye, 6X – Marcador contendo 0.4% de orange G,

0.03% azul de bomofenol, 0.03% xileno cianolc FF, 15% Ficoll® 400, 10mM Tris-HCl

(pH 7.5) e 50mM EDTA (pH 8.0). Utilizado para carrear e monitorar a migração das

em eletroforese em gel de poços.

192

Procedimento para acionamento da fonte de eletroforese

Fonte: Pop Preparação de gel de agarose-Laboratório de Biologia Molecular-Fundação Alfredo da Matta

1-Ligar a cuba de eletroforese na tomada de 220v.

2- Colocar os cabos nos seus respectivos eletrodos. Ligar o FIO PRETO no pólo

POSITIVO e o VERMELHO no NEGATIVO (o DNA migra do pólo negativo (cátodo

– fio preto) para o positivo (ânodo – fio vermelho).

3- Depois de ligada, acionar o botão SET – AMPERAGEM: NÃO ALTERAR.

4- Apertar SET novamente: PROGRAMA: NÃO ALTERAR.

5- Apertar SET novamente: TEMPO: ACIONAR AS SETAS PARA ALTERAR.

6-- Apertar SET novamente. A palavar OFF aparecerá na tela.

7-Apertar o run.

193

Protocolo para purificação de DNA de solução ou de reação enzimática.

KIT ILLUSTRATM GFXTM PCR DNA AND GEL BAND PURIFICATION KIT FOR

THE PURIFICATION AND CONCENTRATION OF DNA

Captura da amostra

1-Adicionar 100µL de tampão de captura 2 (tampa azul) em 20µL de amostra.

2- Misture completamente.

Ligação da amostra 1- Centrifugar o mix tampão de captura 2 + amostra brevemente (30 seg) para

coletar o líquido do fundo do tubo.

2- Transferir o centrifugado x na coluna e no tubo coletor.

3- Centrifugar a 12.000 rpm por 30 seg.

4- Descartar o sobrenadante e recolocar a coluna no tubo coletor.

Lavagem e secagem 1- Adicionar 100µL de tampão de lavagem tipo 1 (tampa amarela) na microcoluna

Spin.

2- Centrifuguar a 12.000 rpm por 30 seg.

3- Descartar o tubo coletor e transferir a microcoluna spin para um tubo eppendorff

de 1,5mL.

Eluição 1-Adicionar 20µL do tampão de eluição tipo 6 (tampa rosa) ao CENTRO da

membrana da microcoluna ou ÁGUA ULTRA-PURA.

2- Incubar por 1 min a temperatura ambiente.

3-Centrifugar a 12.00 rpm por 1 min para recuperar o DNA.

4- Armazenar o DNA purificado a -20°C.

5-Correr em gel de agarose a 1% por 30min e registrar o resultado

194

Reação de PCR para seqüenciamento

Fonte: Manual da Applied Biosystems aparelho 3130/genetic analyser- Hitachi.

Mix para Reação de Seqüenciamento

A reação deve ser feita com os primers Forward e reverse separadamente.

Fazer um mix para cada um deles se for o caso.

A ordem a ser acrescentada no tubo de eppendorf deve ser: Água mili-Q, Tampão

5X do Big Dye, primer específico.

CUIDADO! O DYE É SENSÍVEL À LUZ. DEVE SER ADICIONADO POR ÚLTIMO A REAÇÃO E COM A LUZ DA CAPELA DO DNA WORKSTATION APAGADA. APÓS ADIÇÃO DO DYE AO MIX, COBRIR O MIX COM PAPEL ALUMÍNIO. DISPENSAR O MIX NOS POCINHOS SEM DEMORA. Cálculo das amostras para microplaca: PCR (n=1) Mix Pgem H2O mili-Q__________5,0µl Big Dye_____2,0µl

Tampão 5X_________2,0 µl pgem ______2,0 µl

Big Dye____________1,0 µl M13________3 µl

Primer (1:3)_________ 1,0 µl H20 mili Q ___3 µl

Amostra ___ ________ 1,0 µl (pode variar- 1,5 µl).

Levar ao termociclador: Programa de 25 ciclos por 2,10hs:

96ºC ___1 min

96ºC ____15seg

50ºC ____15 seg

60ºC ____4 min

60ºC ____1min

195

4ºC _____forever.

Protocolo para precipitação de DNA com Isopropanol/Etanol


1-Utilizar placa com 96 poços, o papel selante do próprio fabricante

2-Para a reação de 20µl, adicionar 80µl de isopropanol a 75% e submetê-las ao

vortex.

3- Selar a placa com papel selante e deixar a T.A. (temperatura ambiente) por

15min. protegida da luz.

4- Centrifugar a placa por 20min. a 14.000 rpm e descartado o sobrenadante

invertendo a placa sobre um papel absorvente.

5- Aplicar um pulso de rotação na centrífuga com a placa invertida sobre o papel

absorvente.

6- Adicionar 20µl de etanol a 70% em cada amostra e selar a placa novamente.

7- Centrifugar a placa por 10min. a 14.000 rpm e descartado o sobrenadante

invertendo a placa sobre um papel absorvente.

8-Repetir os passos 5 a 7 por mais uma vez, só que ao descartar o sobrendante

inverter a placa com foca na pia e depois dar umas batidas sobre o papel

absorvente até estar mauis seca.

9-Deixar o pellet secando a T.A. protegido da luz com papel laminado.

10-A placa com o pellet seco pode ser armazenada no freezer até estar pronta para

ser seqüenciada.

196

Protocolo de preparo de amostras para seqüenciamento com Big-Dye X-Terminator


1- Para reação de 10 µl utilizar 45 µl do SAM solution.

2-Ajustar a pipeta multicanal para 45 µl e pipetar a SAM solution acrescentando

nos poços.

3-Acrescentar para reação de 10 µl, 10 µl de Big Dye X-terminator solution.

4-Homogeneizar sempre que possível no vortex o Big Dye X-terminator, pois a

solução é difícil de pipetar e acrescentar em cada poço.

5-Selar bem a placa com o selo adesivo (optical adhesive covers).

6-Levar para o homogeneizador (vortex) por 1hora e 30 minutos.

7-Retirar do vortex e levar para o aparelho seqüenciador

8-Iniciar o procedimento de seqüenciamento.

197

Protocolo para preparo de amostras para seqüenciamento


1-Para ressuspender a amostra, utilizar formamida Hi-Di (applied Biosystems P/N

4311320). Ela vem congelada e deve ser aliquotada em tubos de 1,5mL para não

degradar.

2-Adicionar 10µl de formamida Hi-Di em cada amostra. Tampar com papel

laminado.

3-Selar a placa, submeter ao vortex e aplicar um pulso na centrífuga.

4-Marcar o lado adesivo plástico que está usando.

5-Desnaturar no termociclador a 95ºC por 2 min.

6-Colocar a placa no gelo por 2min.

7-Aplicar um pulso na centrífuga para remover bolhas de ar.

8-Remover o adesivo e colocar a septa (aparador do aparelho) na placa.

9-Colocar a placa com a bandeja e tampa adaptativa no “autosampler”.

10-As amostras com formamida devem ser corridas em até 48hs para evitar a

degradação da fluoresceína e da formamida.

11- Iniciar o seqüenciamento no aparelho seqüenciador da Applied Biosystems

3130/genetic analyser- Hitachi.

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