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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
AVALIAÇÃO DO IMPACTO DAS HELMINTÍASES INTESTINAIS NA RESPOSTA CLÍNICA, MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR
JOAO HUGO ABDALLA SANTOS
MANAUS
2014
II
JOAO HUGO ABDALLA SANTOS
AVALIAÇÃO DO IMPACTO DAS HELMINTÍASES INTESTINAIS NA RESPOSTA CLÍNICA, MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Profª Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos
Co-orientadora: Profª Dra. Valéria Saraceni
MANAUS
2014
III
DEDICATORIA
A DEUS,
Pelo Dom da Vida, pela faculdade da inteligência, pela presença constante e
pela oportunidade de ser útil ao meu próximo. Agradeço-te senhor por guiar meus passos, pelo amparo, proteção, saúde,
família e por preencher de sentido minha existência, Agradeço também pelas coisas que eu ainda não sou capaz de enxergar.
AOS MEUS PAIS IVONILCE E CAIRO,
A quem devo o meu crescimento profissional e moral, me estimulando sempre com amor e carinho para que eu pudesse atingir esta conquista. Por me
apoiarem nas minhas decisões e me ensinarem os verdadeiros valores da vida, sendo exemplos de perseverança, dignidade e honestidade.
Dedico este trabalho com toda minha devoção e agradecimentos.
A MINHA ESPOSA,
Pela alegria constante, pelo incansável incentivo, companherismo, pelo conforto
nas horas tristes e pela vibração nas minhas vitórias. E simplesmente... por me amar e por acreditar em nós. Sem você nada disso
seria possível!
AOS MEUS FILHOS ISABELLA E JOAO HUGO FILHO,
Que me ensinaram o amor incondicional, que são a alegria da minha vida e a
forca para lutar e seguir sempre sem desistir.
IV
AGRADECIMENTOS
Graças a várias pessoas este projeto se concretizou. Não poderia deixar de agradecer cada uma delas. Ao Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos, pela paciência, incentivo, ensinamentos e dedicação
como orientador e amigo. À Dra. Valeria Saraceni, pelo apoio, orientações e contribuições neste trabalho como co-
orientadora. Ào Dr. Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda, coordenador do projeto que acreditou,
incentivou e apoiou o projeto em todas as suas fases À Dra. Alda Maria Da-Cruz – por ter se dedicado insensantemente juntamente comigo na
conclusão do artigo a Senhora este mestrado!!! Às Dras. Rocicleia Lins, Joelma Martins, Marilaine , por terem contribuido na realização dos
exames. A Enfermeira Celiana e Valda – por terem contribuido na coleta dos dados.
Meus sinceros agradecimentos
V
"Há pessoas que transformam o sol numa simples mancha amarela,mas há aquelas que fazem de uma simples mancha
amarela o próprio sol."
Pablo Picasso
VI
RESUMO
A Organização Mundial de Saúde estimou, em 2011, 8,7 milhoes de casos novos de tuberculose no mundo, com um total de 1,4 milhoes de óbitos. O controle imunológico dessa infecção é baseado na resposta imune celular, mediada predominantemente por células CD4+ Th-1. A presença de células T reguladoras está associada com uma supressão da atividade das células T CD4+ efetoras, e conseqüentemente com uma incapacidade em eliminar o Mycobacterium tuberculosis do local da infecção. Outro mecanismo capaz de mediar a supressão da resposta imune observada na tuberculose é a pré-existência de infecção por helmintos intestinais, parasitas indutores de uma forte resposta imune do tipo Th-2. O objetivo foi avaliar o fenótipo celular e o perfil de citocinas em pacientes com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar co-infectados ou não por helmintos intestinais e avaliar o impacto da helmintíase intestinal na resposta clínica durante o tratamento da Tb. Trata-se de um estudo analítico, de prognóstico, observacional e longitudinal, no qual foram arrolados 99 pacientes HIV-negativos, com idade igual ou superior a 18 anos, divididos em quatro grupos, atendidos no ambulatório de tuberculose da Policlínica Dr. Comte Telles e Cardoso Fontes. Os quatros grupos foram assim divididos: 1) 15 pacientes sintomtomas respiratório, com baciloscopia positiva, e helmintos intestinais presentes nas fezes, 2) 38 pacientes sintomático respiratório, com baciloscopia positiva, e helmintos intestinais ausentes nas fezes, 3) 34 pacientes sem sintomas respiratório, helmintos intestinais ausentes nas fezes, 4) 12 pacientes sem sintomas respiratório, helmintos intestinais presentes nas fezes. Amostras de sangue periférico e fezes foram obtidas de todos os participantes do estudo. As amostras de sangue foram utilizadas para avaliação da resposta imune inata e celular e as de fezes, para o diagnóstico de infecção por helmintos intestinais e como critério de cura pós-tratamento específico das helmintoses.
Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis. Tuberculose pulmonar. infecções helmínticas. Fenótipo celular. Perfil de citocinas.
VII
ABSTRACT
The World Health Organization estimated in 2011, 8.7 million new cases of tuberculosis worldwide, with a total of 1.4 million deaths. The immune control of this infection is based on the cellular immune response mediated primarily by CD4+ Th-1 cells. The presence of regulatory T cells is associated with suppressive activity of CD4+ effectors cells and consequently to a failure to eliminate the Mycobacterium tuberculosis infection. Another mechanism to mediate the suppression of the immune response observed in tuberculosis is the pre-existence of infection by intestinal helminthes, parasites induce a strong immune response of Th-2 type. The objective was to evaluate the cellular phenotype and cytokine profile in patients with newly co-infected or not by intestinal helminthes diagnosis of pulmonary tuberculosis and evaluate the impact of intestinal helminthiasis in clinical response during treatment of Tb. This is an analytical study of prognosis, observational, longitudinal, in which 99 HIV-negative patients, aged over 18 years, divided into four groups, treated at the outpatient clinic of the Polyclinic Dr. Comte Telles and Cardoso Fontes. The four groups were divided as follows: 1) 15 symptomatic respiratory patients, smear positive and intestinal helminthes present in the stool, 2) 38 symptomatic respiratory patients, smear positive, and absent intestinal helminthes in feces, 3) 34 patients without respiratory symptoms absent intestinal helminthes in feces, 4) 12 patients without respiratory symptoms, intestinal helminthes present in the stool. Peripheral blood samples and feces were obtained from all study participants. The blood samples were used for evaluation of innate and cellular immune response and fecal for the diagnosis of infection by intestinal helminthes as a criterion and specific post-curing treatment of helminthiasis
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Média de hemoglobina entre pacientes com tuberculose (Tb) com ou sem
Ascaris lumbricoides (Al) ao longo dos três meses de seguimento clínico
Figura 2: Perfil fenotípico de leucócitos mononucleares de indivíduos com tuberculose
(Tb) co-infectados por Ascaris lumbricoides (Al)
Figura 3: Perfil de citocinas séricas (Th-1 e Th-17 Th-2) de indivíduos com tuberculose
(Tb) co-infectados por Ascaris lumbricoides (TbAl)
IX
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Comparação da frequência dos dados demográficos, características clínicas,
exames laboratoriais e de imagens dos pacientes com tuberculose apenas (Tb) ou co-
infectados com Ascaris lumbricoides (TbAl), no momento da inclusão
Tabela 2: Características gerais dos pacientes com Tb e co-infectado por
Ascaris lumbricoides (TbAl).
Tabela 3: Análise comparativa da porcentagem de subpopulações de células
mononucleares sanguíneas em pacientes com Tb, TaAl, Al, e em indivíduos saudáveis.
Tabela 4: Análise comparativa das citocinas plasmáticas em pacientes com Tb, TbAl,
Al, e em indivíduos saudáveis
X
LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS
AIDS Síndrome da Imunodeficiencia Adquirida
BCG Bacilo Calmette Guerin
DC Células Dendríticas
HIV - Virus da Imunodeficiencia humana
HELM Helmintos
IL Interleucina
INF Interferon
LPS Lipopolissacarides
μm micrometro
MTB Micobacteryum tuberculosis
mAbs Anticorpos monoclonais
NK Natural killer
Tb Tuberculose
TLR Toll like receptors
TNF Fator de Necrose Tumoral
–
XI
SUMARIO
1. INTRODUCAO ...............................................................................................
01
1.1 Dados Epidemiológicos ................................................................................. 01
1.2 Agente Etiológico e Contágio ........................................................................ 02
1.3 Aspectos clínicos e diagnóstico da tuberculose ............................................ 03
1.3.1 Exames bacteriológicos ................................................................................. 04
1.3.2 Exame radiológico ......................................................................................... 05
1.4 Aspectos Imunológicos na Tuberculose ........................................................ 07
1.5 Resposta Imune contra Helmintos ................................................................. 13
1.6 Impacto da Infecção Helmíntica na Resposta Th-1........................................ 14
2.
OBJETIVO .....................................................................................................
19
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 19
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 19
3.
MATERIAIS E METODOS .............................................................................
20
3.1 Pacientes e indivíduos controles .................................................................... 20
3.2 Amostras ........................................................................................................ 20
3.3 Descrição das metodologias e estratégia ...................................................... 21
3.4 Análise Estatística .......................................................................................... 24
3.5 Calculo de Amostras ...................................................................................... 25
5.
RESULTADOS ..............................................................................................
26
6.
CONCLUSÃO ................................................................................................ 46
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 47
7. ANEXOS ........................................................................................................ 51
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Dados Epidemiológicos
Embora a tuberculose possa ser considerada um problema mundial, atingindo
as pessoas indistintamente, ela guarda importantes características sociais,
intimamente associadas à transmissão e à evolução da doença (1).
A Organização Mundial de Saúde estimou, em 2011, 8,7 milhões de casos
novos de tuberculose no mundo, com um saldo de 1,4 milhões de óbitos (2). Países
em desenvolvimento, concentram mais de 95% de todos os casos e 98% das mortes
devidas à tuberculose (3). Por outro lado, em países industrializados da Europa e na
América do Norte, onde a incidência é muito menor, a maioria dos casos ocorre
entre os imigrantes de países com alta prevalência de tuberculose (4).
Dentre os vinte e dois países responsáveis por cerca de 80% de todos os
casos de tuberculose no mundo, o Brasil ocupa a décima sétima posição. Em 2012,
foram diagnosticados 70 mil novos casos, cuja mortalidade, relatada neste mesmo
período, foi de aproximadamente 5.000 óbitos (5).
Segundo dados do Ministério da Saúde o Amazonas é hoje o estado da
federação com a maior incidência, 68,3/100.000, dos casos de Tuberculose (5).
Aproximadamente, 66% dos casos de tuberculose notificados são do sexo
masculino. Para os homens, a doença é mais frequente na faixa etária entre 25 a 34
anos e a maior taxa de incidência ocorre na faixa entre 45 a 54 anos de idade. Para
o sexo feminino, tanto o volume de casos quanto a taxa de incidência são maiores
entre os 25 e 34 anos de idade (6).
As populações mais vulneráveis são moradores de rua, a população privada
de liberdade, a população indígena e as pessoas que vivem com HIV/Aids. Mas a
condição determinante para a tuberculose, comprovada cientificamente, é a pobreza
(6).
2
Os helmintos intestinais são causa de significativa morbidade em humanos,
estima-se que um terço da população mundial estejam infectadas por pelo menos
uma espécie de helminto, dados apontam que infecção isoladamente por Ascaris
lumbricoides afeta mais de um bilhão de pessoas com morbidade significativa (7,8).
Segundo alguns autores, em alguns países em desenvolvimento, é mais comum
estar infectado do que não estar infectado (9).
A prevalência real das infecções helmínticas no Brasil e no Amazonas não é
conhecida, visto que estas parasitoses não são de notificação obrigatória. Portanto,
os dados aqui apresentados sobre a prevalência de infecção por helmintos são
oriundos de estudos realizados isoladamente.
Em um estudo conduzido com amostras de uma população urbana de São
Paulo, foi observada uma prevalência de 24% de infecção pelo A. lumbricoides (10).
Tavares-Dias & Grandini (1999) em um estudo no interior de São Paulo também
observaram uma prevalência elevada de enteroparasitoses, incluindo 13,9% de
positividade para o A. lumbricoides, 8,3% de Strongyloides. stercoralis e 3,7% de
Trichuris. trichiura.
Na África, a tuberculose é também fortemente associada com infecções
intestinal por helmintos. As probabilidades de infecção tuberculosa aumentam
quanto maior for o número de espécies diferentes de helmintos, com que uma
pessoa é infectada. Pacientes com tuberculose que têm infecções helmínticas
apresentam manifestações pulmonares mais grave, deficiência na resposta imuni
contra a tuberculose e resposta prejudicada a terapia anti-Tb (11).
1.2 - Agente Etiológico e Contágio
O gênero Mycobacterium é composto por microrganismos em forma de
bastão, aflagelados, com dimensões de 0,2-0,7 x 1,0-10 µm, que não formam
esporos e não possuem cápsula. Uma série de aspectos torna esses
microrganismos distintos dos demais gêneros bacterianos, muitos dos quais
relacionados à composição de sua parede celular (ácidos micólicos e ceras), a qual
confere resistência ao tratamento com álcool-ácido, facilmente evidenciada pela
3
técnica de coloração de Ziehl-Neelsen, bem como resistência a álcalis, ácidos, anti-
sépticos e a um amplo espectro de antibióticos (12).
O M. tuberculosis é um bacilo aeróbio estrito, considerado intracelular
facultativo por sua capacidade de multiplicar-se e sobreviver no interior de células
fagocitárias. Possui predileção pelos pulmões devido, tanto à tensão de oxigênio
existente nestes órgãos, quanto à temperatura ideal para seu crescimento (13, 3).
O crescimento lento, característico do M. tuberculosis, é um dos fatores
responsáveis pela demora normalmente observada em sua detecção em meios de
cultura e na ação das drogas utilizadas no tratamento (13, 3).
O contágio na tuberculose se dá mediante a inalação de partículas
microscópicas de 1 a 5µm, constituídas de dois ou três bacilos viáveis envolvidos
por secreção pulmonar desidratada, os chamados núcleos de Wells. Estes são
eliminados a partir das lesões pulmonares de um doente através da tosse, espirro,
riso ou fala (13, 3).
1.3 - Aspectos clínicos e diagnóstico da tuberculose
Clinicamente a tuberculose pulmonar não apresenta nenhum sinal ou sintoma
específico. Tem como característica principal a tosse, seca ou produtiva, podendo
ser a expectoração purulenta ou mucóide, com ou sem sangue (13). Observa-se,
normalmente, comprometimento do estado geral, febre baixa vespertina, não
costuma ultrapassar os 38,5º C, com sudorese, mas sem calafrios. Anorexia,
inapetência e emagrecimento são comuns (3,13).
Laboratorialmente o giagnóstico da Tb pulmonar é fundamentado, nos
seguintes métodos (3,13):
1. bacterioscópico – baciloscopia e cultura;
2. radiológico – rx de tórax e tomografia computadorizada do tórax;
3. outros – prova tuberculínica; anátomo-patológico (histológico e citológico);
sorológico; bioquímico; biologia molecular.
4
1.3.1 – Exames bacteriológicos
A pesquisa bacteriológica é método de importância fundamental em adultos,
tanto para o diagnóstico como para o controle de tratamento (3).
1. Baciloscopia direta do escarro
É o método prioritário, porque permite descobrir a fonte mais importante de
infecção, que é o doente bacilífero. Executado corretamente, permite detectar de 70-
80% dos casos de tuberculose pulmonar em uma comunidade. Por ser um método
simples e seguro, deve ser realizado por todos os laboratórios (13, 3).
A baciloscopia direta deve ser solicitada aos pacientes que apresentem:
Critérios de definição de sintomático respiratório (indivíduo com tosse e
expectoração por três semanas e mais);
Suspeita clínica e/ou radiológica de Tb pulmonar, independentemente
do tempo de tosse;
Também é utilizada para acompanhar a evolução bacteriológica do
paciente pulmonar, inicialmente positivo, durante o tratamento.
O controle bacteriológico deve ser de preferência mensal e, obrigatoriamente,
ao término do segundo, quarto e sexto mês de tratamento.
Recomenda-se, para o diagnóstico, a coleta de duas amostras de escarro:
uma por ocasião da primeira consulta, e a segunda na manhã do dia seguinte, ao
despertar. Nos casos em que há indícios clínicos e radiológicos de suspeita de Tb e
as duas amostras de diagnóstico apresentem resultado negativo, podem ser
solicitadas amostras adicionais.(13)
2. Cultura de escarro ou outras secreções
Indicada para suspeitos de tuberculose pulmonar negativos ao exame direto
do escarro, e para o diagnóstico de formas extrapulmonares, como meníngea, renal,
pleural, óssea e ganglionar, e também para o diagnóstico de tuberculose em
pacientes HIV positivo (3,13).
5
Solicitação desse exame também está indicada a acompanhado do teste de
sensibilidade, nos casos de suspeita de resistência bacteriana às drogas, ou ao final
do segundo mês de tratamento quando a baciloscopia se mantem positiva,
retratamento após falência ao esquema básico ou reinício após abandono.(13)
A cultura é um método de elevada especificidade e sensibilidade no
diagnóstico da Tb. Nos casos pulmonares com baciloscopia negativa, a cultura do
escarro pode aumentar em até 30% o diagnóstico bacteriológico da doença.
Os métodos clássicos para cultura de micobactérias utilizam a semeadura da
amostra em meios de cultura sólidos. Os meios mais comumente utilizados são
meios sólidos a base de ovo, Löwenstein-Jensen e Ogawa-Kudoh. Têm a vantagem
de serem os de menor custo e de apresentarem um índice de contaminação menor.
A desvantagem é o tempo de detecção do crescimento bacteriano que varia de 14 a
30 dias podendo se estender por até 8 semanas.
3. Diagnóstico molecular
Um novo teste de diagnóstico molecular chamado Xpert MTB / RIF detecta M.
tuberculosis complex dentro de 2 horas, com a sensibilidade muito maior do que a
de microscopia esfregaço (14).
1.3.2 – Exame radiológico
É auxiliar no diagnóstico da tuberculose, justificando-se sua utilização, se
possível, nos casos suspeitos. Permite a identificação de pessoas portadoras de
imagens sugestivas de tuberculose, ou de outras patologias. Importante lembrar que
até 15% dos casos de Tb pulmonar não apresentam alterações radiológicas,
principalmente pacientes imunodeprimidos.
O exame radiológico, em pacientes com baciloscopia positiva, tem como
função principal, a exclusão de outra doença pulmonar associada (exemplo câncer
de pulmão em fumantes com alta carga tabágica com idade superior a 40 anos), que
necessite de tratamento concomitante, além de permitir avaliação da evolução
6
radiológica dos pacientes, sobretudo daqueles que não responderam à
quimioterapia.
Os resultados das radiografias de tórax deverão obedecer à seguinte
classificação:
• Normal – não apresentam imagens patológicas nos campos pleuro-
pulmonares;
• Sequela – apresentam imagens sugestivas de lesões cicatriciais;
• Suspeito – apresentam imagens sugestivas de processo tuberculoso ativo;
• Outras doenças – apresentam imagens sugestivas de pneumopatias não-
tuberculosas (infecções bacterianas, micoses, abscessos ou neoplasias).
Quando suspeita as principais alterações são:
Tb primária - Pode apresentar-se radiologicamente como um foco
pulmonar e/ou um foco linfonodal. No pulmão pode ser representado por
pequena opacidade parenquimatosa acometendo mais os lobos superiores
na infância e os lobos médio e inferior nos adultos, com preferência ao
pulmão direito.
A linfonodomegalia é observada na maioria das crianças e em até metade
dos adultos. É mais comumente unilateral, embora possa ser bilateral. As
regiões mais comprometidas são hilar e paratraqueal direita, sobretudo em
crianças abaixo dos dois anos de idade. Pode ocorrer compressão
extrínseca de via aérea pela linfadenomegalia com conseqüente
atelectasia (epituberculose). Os segmentos mais comprometidos são o
anterior dos lobos superiores e o medial do lobo médio (síndrome do lobo
médio).
Ocasionalmente o foco pulmonar primário pode drenar o cáseo liquefeito
causando uma cavitação semelhante a um abscesso bacteriano. Pode
ocorrer ainda disseminação broncógena grosseira ocasionando uma
consolidação pneumônica indistinguível de uma pneumonia bacteriana
7
comum. A Tb primária pode ainda se apresentar sob a forma de derrame
pleural (raro na infância).
Tb pós-primária - Pequenas opacidades de limites imprecisos, imagens
segmentares ou lobares de aspecto heterogêneo, pequenos nódulos e/ou
estrias, são aspectos sugestivos de Tb pós-primária ou secundária. A
evolução das imagens é lenta e a localização típica é nos segmentos
posteriores dos lobos superiores e nos segmentos superiores dos lobos
inferiores de um ou ambos os pulmões.
Cavitação única ou múltipla, geralmente sem nível hidroaéreo, com
diâmetro médio de 2 cm e que não costuma ultrapassar 5 cm é muito
sugestiva, embora não exclusiva, deTb.
Outras formas menos comuns de apresentação radiológica de Tb
pulmonar são: forma nodular (única ou múltipla) que simula a doença
maligna, e a cavitação localizada atipicamente em lobo inferior simulando
abscesso pulmonar.
Assim como na Tb progressiva primária, também na Tb secundária pode
ocorrer uma consolidação pneumônica simulando pneumonia bacteriana,
com broncograma aéreo. Na Tb secundária não há linfonodomegalia hilar
satélite.
1.4 - Aspectos Imunológicos na Tuberculose
Aproximadamente cerca de 30% das pessoas expostas ao bacilo irão adquirir
a infecção. Desse total, apenas 10% irão evoluir para alguma forma clínica da
doença ao longo da vida. Os 90% dos indivíduos restantes, desenvolvem uma
resposta imune suficientemente eficaz para eliminar o bacilo ou pelo menos conter a
infecção, conhecida como tubrculose latente (15).
Estima-se que 2 bilhões de pessoas em todo o mundo têm a infecção latente
e correm o risco de reativação (2). Em recente estudo, foi descrito a possibilidade de
que algumas pessoas com tuberculose latente tem 79% menos risco de evoluir para
8
tuberculose após reinfecção que indivíduos não infectados. Este mesmo levanta a
possibilidade de que algumas pessoas adquirem e eliminam a infecção aguda (16).
Acredita-se que a susceptibilidade à infecção pelo M. tuberculosis, seja
resultante de uma interação complexa entre fatores ambientais, microbiológicos,
imunológicos e genéticos (17). Dentre esses fatores, a presença de uma resposta
imune eficaz contra o bacilo, parece ser fator crucial para o desenvolvimento de um
resistência à infecção.
Nos últimos anos, muitos estudos vêm sendo conduzidos com objetivo de
elucidar os mecanismos da resposta imune necessários em uma resposta eficaz
contra o M. tuberculosis.
Apesar de toda a complexidade ao redor do tema, é consenso entre os
pesquisadores que uma interação eficiente entre macrófagos infectados e linfócitos
Th1 é a base para uma imunidade celular protetora na tuberculose (18, 19).
O primeiro evento ocorrido após a entrada do M. tuberculosis no pulmão é a
fagocitose do bacilo pelos macrófagos alveolares. Sabe-se que células dendríticas
(DC) e os macrófagos derivados de monócitos também podem participar deste
processo (20). Estas células do sistema imune inato utilizam vários receptores para
o reconhecimento, fagocitose e ativação imune, incluindo receptores de manose, de
complemento, tipo “scavengers” e os receptores “toll-like” (TLR) (20,21), além de
DC-SIGN (“DC-specific ICAM-3 grabbing non-integrin”) em células dendríticas (21).
Sendo uma provável etapa crucial para o desenvolvimento de uma resposta
imune eficaz contra o bacilo, o reconhecimento do M. tuberculosis ou de produtos
micobacterianos pelos macrófagos através de receptores “toll-like” (TLR),
mediadores da resposta imune inata essenciais para o reconhecimento da
micobactéria pelos macrófagos e células dendríticas. Estes receptores, em sua
maioria utilizam a molécula adaptadora MyD88, a qual participa da ativação de
fatores transcricionais, como o NF-B, na sinalização para a produção de citocinas
(20,21).
9
Por meio dos TLR, antígenos do M. tuberculosis induzem a produção de IL-
12, importante citocina pró-inflamatória, pelos macrófagos e células dendríticas (22)
e uma das responsáveis pelo desencadeamento de uma resposta do tipo Th1,
considerada como a principal para o controle da infecção e eliminação do bacilo.
Por outro lado, ainda é controverso o papel de TLR individuais na resposta ao
M. Tuberculosis. Animais deficientes em TLR2, TLR4, TLR6 ou TLR9 apresentam
várias alterações de resposta ao M. tuberculosis, porém pouco aumento de
suscetibilidade a pequenas doses do patógeno em aerossol (15, 23).
Possívelmente múltiplos TLRs atuem em conjunto no controle do patógeno,
como demonstrado pelo aumento de suscetibilidade em camundongos deficientes
em TLR9 e TLR2 (23), embora animais deficientes em TLR 2 e TLR4 não
apresentem diminuição da resistência ao M. tuberculosis ou bacilo Calmette Guerin
(BCG) (24, 25). É interessante que camundongos TLR2-/- ou TLR9-/- (25), mas não
aqueles TLR4-/- (26), apresentam maior suscetibilidade a altas doses de M.
tuberculosis (23).
Já o reconhecimento de M. tuberculosis via molécula DC-SIGN induz a
produção de IL-10 por células dendríticas. DC-SIGN e provavelmente outros
receptores de LAM (lipoarabinoman), como o receptor de manose (27), podem
contrapor a ativação mediada por TLR, como p. ex: a produção de IL-12 pelo
reconhecimento de CpG por TLR9, ou LPS por TLR4 (28).
Subpopulações de DC humanas podem ser distingüidas pela expressão
diferencial de CD11c, TLR e receptores lectina tipo-C, como DC-SIGN (CD209),
receptor de manose (CD206) e ainda BDCA-2, dentre outros (29). Em humanos,
DCs convencionais ou mielóides (mDCs) recém-isoladas expressam TLR1, TLR2,
TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 e TLR8, CD11c e DC-SIGN, enquanto DCs linfóides ou
plasmacitóides (pDCs) expressam TLR7 e TLR9, BDCA-2, BDCA-4 e CD123 (30,
31). Os pDCs são a principal fonte de IFN- e INF- no sangue humano (32).
Em pacientes com tuberculose ativa, números de ambas subpopulações de
DCs circulantes diminuíram significativamente em relação aos controles, bem como
10
a produção de IFN-. Após terapia anti-tuberculose, pacientes com sucesso
apresentaram aumento de contagem de pDCs e de produção de IFN- e INF- (33).
A queda de DCs na circulação possivelmente esteja relacionada à migração destas
células para tecido inflamatório, pois mDCs CD11c+ foram encontradas infiltrando
áreas linfocíticas de granulomas tuberculosos associadas a células Th1 produtoras
de IFN- (34).
Modelo experimental, revelaram que a depleção de DCs CD11c+ leva a um
retardo no início da resposta antígeno-específica de células T CD4+ e a um prejuízo
no controle da replicação de M. tuberculosis em camundongos infectados (35).
Também durante a progressão da infecção pelo HIV-1, ocorre um progressivo
declínio nos números de mDC e pDC, sendo o declínio de pDCs inversamente
proporcional à carga viral e associado à queda de células CD4+ e produção de IFN-
/célula (36, 30).
É interessante que a produção de IL-12 mediada por estímulo de TLR9 em
resposta a CpG parece ser iniciada por ação de IL-15, envolvendo interação entre
pDC e mDC (37). Camundongos “knockout” para IL-15 tratados com CpG
apresentam produção defeituosa de IL-12 e IFN- e sucumbem à infecção por L.
monocytogenes. Em camundongos, mDCs são as principais produtoras de IL-15 e
IL-12, porém mDCs não produzem IL-12 em ausência de pDCs (38). IL-15 promove
também a produção de IL-12 por DCs e monócitos, em resposta ao LPS ou à ligação
ao CD40, e ainda, co-estimula a produção de IFN- por células NK e T quando em
sinergia com IL-12, assim como, de TNF- e GM-CSF (39).
Em um modelo murino de infecção por M. tuberculosis, foi também
demonstrado que a produção de IL-15 antecede à de IL-12 (40). Em três fases da
doença, IL-15 teve seu nível de expressão significativa e progressivamente
aumentado, enquanto que as outras citocinas (IL-10, IL-12, IFN-) apresentaram
aumento somente nas fases 2 e 3, nos pulmões dos murinos infectados (40). O
incremento de expressão dessas citocinas foi associado com a progressão ativa da
doença, porém, IL-15 decresce consideravelmente durante a tuberculose latente nos
pulmões e baço dos camundongos infectados (40). O conhecido efeito pró-
inflamatório de IL-15, junto com o seu aumento de expressão durante a progressão
11
da doença, sugerem que IL-15 aumenta a presença de citocinas pró-inflamatórias
(IL-12, IFN- e, em menor proporção, TNF), determinando o curso da infecção por M.
tuberculosis (40).
A IL-15 parece ser importante para o controle da infecção por M. tuberculosis.
Macrófagos infectados com M. tuberculosis secretam IL-7 e IL-15, e ambas citocinas
aumentam a sobrevivência de camundongos infectados pelo patógeno (41).
Além das células fagocíticas, outras células da resposta imune inata estão
envolvidas na resposta inicial na tuberculose, dentre elas, as células NK (“natural
killer”), as células NKT e as células T . Estas células podem estar envolvidas com
a produção não-específica de IFN-, citocina chave na resposta imune da
tuberculose, como veremos adiante (18, 22). Em 2002, Chackerian e colaboradores
(42) sugeriram a participação de células NKT na tuberculose. Essas células podem
participar da resposta imune protetora pela rápida produção de IFN-, pela sua
atividade citolítica ou pela ativação de células NK (43).
O M. tuberculosis é um exemplo clássico de patógeno cuja resposta protetora
é dependente de uma resposta imune eficiente. O controle imunológico dessa
infecção é baseado na resposta imune celular, mediada predominantemente por
células CD4+ Th-1. A produção de IL-12 por macrófagos e células dendríticas é
induzida após a fagocitose do bacilo por essas células e direciona o
desenvolvimento da resposta Th-1 com produção de IFN-, que é a citocina crucial
para o controle da infecção (44).
Na tuberculose, o IFN- é produzido por linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+,
células NK bem como por macrófagos (45, 46, 47, 48, 49). O papel fundamental
dessa citocina na resposta imune ao M. tuberculosis tem sido demonstrado por
vários autores, os quais demonstraram que camundongos “knockout” para gene do
IFN- são altamente susceptíveis à infecção pelo M. tuberculosis (50, 51, 52, 53).
Fenômeno semelhante foi observado em indivíduos com deficiência nos
genes do IFN- ou de seu receptor, os quais são mais susceptíveis a infecções
micobacterianas, incluindo o M. tuberculosis (54). A função principal do IFN- é ativar
12
o macrófago infectado e dessa maneira, induzir que esta célula exerça seu papel
microbicida, pela ativação da produção de reativos de oxigênio e de nitrogênio,
necessários para a eliminação do bacilo (55). Além disso, o IFN- estimula o
macrófago a liberar TNF, citocina importante para a formação do granuloma e para o
controle da extensão da infecção (56, 57).
Apesar de evidências de uma ativação crônica da resposta imune contra o
bacilo serem observadas durante a tuberculose ativa, tais como a presença de
hipergamaglobulinemia policlonal, aumento de níveis séricos de TNF e um aumento
na expressão de marcadores de ativação nas células T circulantes. como o HLA-DR
(58, 59, 60).
Paradoxalmente, apesar das evidências de ativação das células T e
monócitos, uma supressão significativa desta resposta também é encontrada. A
diminuição da produção de citocinas características da resposta imune Th-1, tais
como IFN- e IL-2, normalmente acompanhadas por um aumento de IL-10 e TGF-
levando a uma supressão da resposta linfoproliferativa bem como da produção de
citocinas tem sido amplamente descritas na literatura (59, 60, 61, 62, 63, 64,).
Supressão esta confirmada experimentalmente, utilizando-se células obtidas
de pacientes com tuberculose pulmonar as quais, após estimulação com antígenos
micobacterianos (derivado protéico purificado – PPD e antígeno 30Kd),
apresentavam uma diminuição tanto na produção de IL-2 e IFN-, quanto na
resposta linfoproliferativa antígeno-específica, quando comparados à indivíduos
saudáveis (61, 62, 64, 65).
Apesar desta supressão da função das células T na tuberculose, evidenciada
pela diminuição da produção de citocinas Th1 frente a estímulos específicos, poder
estar relacionada a um aumento na produção de IL-10 e TGF- (62, 66, 67, 68), a
presença de células supressoras poderia também explicar essa diminuição na
resposta celular e na produção de IFN-.
Recentemente, foi descrita uma sub-população de células T CD4+ que
expressam altos níveis de receptores CD25, as quais foram denominadas
13
CD4+CD25HIGH ou células T reguladoras. Evidências apontam como função
primordial, in vivo, destas células T reguladoras: a manutenção da tolerância a
antígenos próprios, através da modulação da atividade de células T auto-reativas
(30, 69).
Em indivíduos saudáveis, as células CD4+CD25HIGH representam de 5% a
10% do total de células T CD4+ circulantes (30, 69, 70, 71, 72).
Recentemente em um estudo publicado, observou-se que o número de
células CD4+CD25HIGH, na circulação periférica, em pacientes com tuberculose
pulmonar era 3 vezes maior ao observado em indivíduos saudáveis. Além disso,
demonstrou-se que a depleção de células T reguladoras (CD4+CD25+) levava a uma
restauração na produção de IFN- pelas células mononucleares de sangue
periférico, atingindo níveis comparáveis aos apresentados por indivíduos saudáveis
(73).
Corroborando estes resultados, Guyot-Revol e colaboradores (2006) (74)
também demonstraram, quase que simultaneamente, esse aumento do número de
células T reguladoras nos pacientes portadores de tuberculose e sugerindo também
a participação destas células na supressão da resposta Th1 específica na
tuberculose.
Outro mecanismo capaz de mediar a supressão da resposta imune observada
na tuberculose, seria a pré-existência de infecção por helmintos intestinais, parasitas
indutores de uma forte resposta imune do tipo Th-2, em indivíduos portadores de M.
tuberculosis.
1.5 - Resposta Imune contra Helmintos
A resposta imune típica induzida pelos helmintos intestinais é dependente de
células Th2, resposta que envolve produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, assim como
a produção de IgE e a mobilização e expansão de células efetoras específicas,
como mastócitos, eosinófilos e basófilos.
14
Portanto, a polarização da resposta imune para uma resposta tipo Th-2 pode
influenciar negativamente uma resposta do tipo Th-1, inibindo a proteção
imunológica do hospedeiro frente a patógenos cuja resposta protetora é Th-1-
dependente (75). As células Th-2 produzem IL-10, a qual age sobre os macrófagos
inibindo a ativação de resposta Th-1 e bloqueando a síntese de IL-12 pelo
macrófago. Adicionalmente, as células Th-2 podem produzir TGF-, a qual atuaria
diretamente sobre as células Th-1, impedindo a sua proliferação (76).
1.6 - Impacto da Infecção Helmíntica na Resposta Th-1
Resposta imune modulada frente a patógenos, induzida por infecções
helmínticas, vem sendo demonstrada por vários autores. Em estudo de pacientes
com infecções helmínticas crônicas, foi sugerido que a ativação persistente do
sistema imune pelos helmintos está associada a uma diminuição na transdução de
sinais com conseqüente diminuição da resposta imune (hiporesponsividade) e
anergia (77).
Esta hiporesponsividade é manifestada por prejuízo na transdução de sinais
na célula T, diminuição na expressão de CD28 (receptor co-estimulatório) com
concomitante aumento na expressão de CTLA-4, diminuição da secreção de
quimiocinas e diminuição de resposta imune do tipo tardia (77).
Também, em outro estudo de pacientes cronicamente infectados por
helmintos intestinais, foi demonstrada uma diminuição no número de células T CD4+
e aumento de células T CD8+ circulantes e estas células apresentavam um alto nível
de ativação (78).
Achados como estes sugerem que uma infecção helmíntica crônica tem efeito
importante e prolongado no sistema imune do hospedeiro (78).
A infecção helmíntica crônica afeta também a expressão de TLRs. Dois
estudos independentes mostraram que a expressão de TLR9 é diminuída em células
B de pacientes infectados (79, 80) quando comparados a indivíduos sadios. Em
15
modelos animais, antígeno do ovo do S. mansoni foi capaz de diminuir a produção
de IL-12 alterando a resposta de DCs a ligantes de TLRs.
Células dendríticas humanas expostas ao helminto Brugia malayi
apresentaram menor expressão de DC-SIGN, o que provavelmente explica sua
menor produção de IL-10 quando infectadas com M. tuberculosis. Estas mesmas
DCs apresentam menor expressão de CD14, CD54, HLA-DR e IFN- e, quando co-
cultivadas com células T CD4+ autólogas foram menos capazes de induzir a
produção de IFN- do que outras DCs (81).
Além da estimulação de uma resposta Th-2 vigorosa, alguns estudos
realizados demonstraram que as infecções helmínticas podem induzir células T
reguladoras, capazes de suprimir respostas do tipo Th-1 e, conseqüentemente,
interferir na ativação das células T efetoras (82, 83, 84, 85).
Em 2004, McKee e Pearce (83) demonstraram experimentalmente que
células CD4+CD25+ em camundongos infectados com Schistosoma mansoni
produziam IL-10, inibiam a produção de IFN- e o desenvolvimento de resposta Th-1
pela diminuição na secreção de IL-12, e suprimiam proliferação de células T CD4+
após a estimulação com antígeno do ovo do S. mansoni.
Os resultados de um estudo realizado em pacientes com hanseníase,
demonstraram que a freqüência de helmintos intestinais era significativamente maior
entre os pacientes com as formas multibacilares (38,3%) em relação aos pacientes
com formas paucibacilares (24,6%), sugerindo que a infecção por nematóides
intestinais pode aumentar o risco para uma forma mais grave da hanseníase (86).
Ainda em estudo com indivíduos portadores de hanseníase, infectados ou
não por helmintos intestinais, avaliou-se a produção de citocinas por células
mononucleares, observoundo que pacientes portadores de hanseníase co-
infectados com helmintos intestinais apresentavam uma menor produção de IFN-,
quando comparados a pacientes portadores de hanseníase sem infecção helmíntica
(86).
16
Por outro lado, pacientes infectados por M. leprae e helmintos apresentavam
uma maior produção de IL-4 e IL-10 em relação aos pacientes infectados apenas
pela micobactéria.(86).
Visando avaliar se, assim como na hanseníase, a tuberculose poderia
também estar associada à presença de helmintos intestinais, um outro estudo foi
conduzido por Tristão el al (87). Os resultados deste estudo indicaram uma
associação positiva entre a tuberculose e a infecção helmíntica.
Prevalência significativamente maior vem sendo demonstrada, de nematóides
intestinais em pacientes com tuberculose pulmonar (57,8%) em relação ao grupo
controle (20,9%), sendo S. stercoralis o helminto mais prevalente (24,5%)
encontrado entre todos os pacientes portadores de tuberculose (87).
Recentemente, foi demosntrado que pacientes com tuberculose pulmonar e
infecção por helmintos intestinais apresentam uma linfopenia significativa quando
comparados a pacientes com tuberculose pulmonar livre de helmintose (88).
As análises das subpopulações de linfócitos T (linfócitos T CD4+ e linfócitos T
CD8+) demonstram que pacientes com tuberculose pulmonar e infecção por
helmintos intestinais apresentam um número significativamente menor de linfócitos T
CD4+ e de CD8+ quando comparados aos pacientes com tuberculose pulmonar livre
de helmintíase e a indivíduos do grupo controle (88).
A produção de IFN- em culturas de sangue total estimuladas com filtrado de
cultura de M. tuberculosis tanto no início (Dia 0) quanto ao término do tratamento
anti-tuberculose (Mês 6), é significativamente menor entre pacientes com
tuberculose pulmonar e infecção por helmintos intestinais (Tb+Helminto) quando
comparado aos com tuberculose pulmonar livre de helmintíase (Tb) (88).
Enquanto que a quantificação dos níveis de IL-10 nestes mesmos
sobrenadantes de cultura de sangue total mostrou que, no início do tratamento (Dia
0), não existia diferença significativa entre os grupos Tb e Tb+Helminto. Entretanto,
ao término do tratamento anti-Tb (Mês 6), apesar dos níveis de IL-10 em
17
sobrenadante de cultura diminuírem significativamente entres os pacientes do grupo
Tb, os mesmos são mantidos elevados entre os pacientes com Tb+Helminto (88).
Adicionalmente, observou-se a presença de células T regulatórias em uma
freqüência elevada tanto no grupo TB quanto no TB+Helminto, quando comparados
à indivíduos saudáveis.
Considerando-se que a participação de células T regulatórias na tuberculose
humana foi descrita recentemente e que estas células são encontradas na mucosa
de modelos experimentais infectados com helmintos intestinais (85). É possível que
a presença de helmintos intestinais, além de ativar uma resposta do tipo Th2, ative
também células T reguladoras, e que a expansão destas células, mesmo que restrita
aos tecidos linfóides associados à mucosa, contribua para a interferência na
resposta Th1 específica contra o M. tuberculosis.
Em suma, a avaliação dos estudos já realizados, indica a existência de uma
forte associação entre infecção helmíntica e outras doenças infecciosas, incluindo a
tuberculose. Essa associação entre infecção helmíntica e tuberculose torna-se
relevante quando consideramos a situação de países em desenvolvimento, onde
ambas as infecções apresentam prevalências elevadas e podem coexistir em uma
mesma área.
Apesar de não conclusivos, alguns estudos indicam que a presença de
patógenos indutores de uma resposta imune do tipo Th2, como por exemplo os
helmintos, pode afetar a capacidade do hospedeiro em organizar uma resposta
imune apropriada para o controle de uma infecção por um patógeno, cuja eficiência
da resposta imune é Th1-dependente. Além disso, existem evidências que a
infecção por helmintos podem induzir células T reguladoras.
Baseando-se nas evidências fornecidas, a proposta do estudo é avaliar a
resposta imune celular em pacientes portadores de tuberculose co-infectados por
helmintos intestinais e o impacto da presença destes parasitas na resposta imune e
clínica durante a tuberculose.
Considerando-se que:
18
a) O sucesso do tratamento da TB, culminando com a eliminação do bacilo,
depende tanto da eficácia do esquema terapêutico quanto de uma
resposta potente de células T;
b) Uma resposta imune eficaz contra o M. tuberculosis depende de uma
resposta Th1 intacta, a qual pode ser afetada pelos níveis de IL-15, IL-12
ou IL-10, produzidas por macrófagos ou células dendríticas;
c) A participação de macrófagos ou células dendríticas na montagem de uma
resposta imune adequada ao M. tuberculosis pode ser afetada por
alterações numéricas e/ou fenotípicas/funcionais destas populações
celulares;
d) Uma resposta imune eficaz contra o M. tuberculosis depende de uma
resposta Th1 intacta, a qual pode ser alterada ou mesmo inibida pela ação
de células T reguladoras e/ou ativação de células T CD4+ do tipo Th1.
19
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
O presente estudo tem por objetivo avaliar o fenótipo celular e o perfil de
citocinas em pacientes com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar co-
infectados ou não por helmintos intestinais e avaliar o impacto da helmintose
intestinal na resposta clínica durante o tratamento da TB.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar o impacto da presença de helmintos intestinais na resposta imune
inata
Avaliar o impacto da presença de helmintos intestinais na resposta imune
celular específica;
Correlacionar a presença de helmintos intestinais e alterações na
resposta micobacteriológica, carga bacilífera, dos pacientes;
Avaliar o efeito da presença de helmintos intestinais na resposta clínica
paciente com tuberculose.
Correlacionar a presença de helmintos intestinais e alterações no
parenquima pulmonar atravéz do raio x de tórax
20
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Pacientes e indivíduos controles
Termo de consentimento informado, devidamente assinado será obtido tanto
dos pacientes quanto dos controles antes de sua inclusão no protocolo. Foram
incluidos no estudo, 53 pacientes HIV-negativos, com baciloscopia em amostra de
escarro positiva, com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar (Tb), atendidos
no ambulatório de tuberculose da Policlínica de Referencia Epidemiológica e
Sanitária Cardoso Fontes e Comte Telles sendo 38 pacientes com Tb (grupo 1)
apenas e 15 pacientes com Tb co-infectados por helmintos intestinais (Grupo 2).
O Grupo controle contou com 34 indivíduos clinicamente saudáveis, sem
sintomas clínicos e respiratórios, portanto sem Tb e com parasitológico de fezes
negativos e outros 12 indivíduos com helmintíase intestinal Tb negativo, ambos com
sorologia HIV negativa.
Exames parasitológicos de fezes foram realizados tanto em pacientes com Tb
quanto controles. O diagnóstico parasitológico foi realizado através das técnicas de
Lutz, Kato-Katz, e Baerman-Moraes em pelo menos 3 amostras consecutivas de
fezes, conforme descrito a seguir.
Pacientes com Tb e controles saudáveis co-infectados por helmintos
intestinais foram denominados Tb+Helm e Controle+Helm, respectivamente. Tanto
Tb+Helm quanto Controle+Helm receberam tratamento padrão para suas
verminoses, e foram re-avaliados (exames parasitológico de fezes) durante o
projeto. Pacientes com Tb receberam tratamento padrão para Tb de acordo com o
Manual de recomendações brasileiro para tratamento da tuberculose.
3.2 Amostras
Amostras de sangue periférico, plasma e fezes foram obtidas de todos os
participantes do estudo (Tb, Tb+Helm, Controle, Controle+Helm) (Figura 1).
Amostras de sangue periférico foram utilizadas para avaliação quantitativa e
fenotípica das populações celulares, para a realização de sorologia para HIV.
21
Amostras de plasma foram obtidas e utilizadas para avaliação do perfil de citocinas
no sangue periférico. Amostras de fezes foraam utilizadas para o diagnóstico de
infecção por helmintos intestinais e como critério de cura pós-tratamento específico
das helmintíases. Amostras de escarro foram obtidas dos pacientes Tb e Tb+Helm,
antes e durante o curso do tratamento anti-TB, Amostras de sangue, fezes e escarro
foram obtidas nos seguintes pontos: Dia 0, 30, 60 e 90.
3.3 Descrição das metodologias e estratégia
Para melhor detalharmos nossa estratégia e as metodologias que foram
empregadas durante a execução do projeto (tabela 1), as mesmas foram descritas
em contexto de cada um dos cincos objetivos específicos listados acima.
Tabela 1 – Fluxograma dos experimentos a serem realizados.
Dia 0 1 mês 2 mês 3 mês
GRUPO 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Tb X X X X X X X X X X X X
Tb + Helm X X X X X X X X X X X X
Controle X X X
Controle+Helm X X X X X X
Legenda: 1 – Exame parasitológico de fezes; 2 – Escarro (baciloscopia e cultura); 3 - Sangue;
Observação: quadrículas preenchidas (X) denotam experimentos a serem realizados por período no
respectivo grupo.
22
Afim de avaliar a freqüência fenotípica das células do sangue periférico e o
perfil de citocinas produzidas em resposta a antígenos específicos realizamos os
experimentos descritos abaixo em amostras de sangue periférico.
1. Imunofenotipagem dos leucócitos de sangue periférico pela citometria de fluxo
Amostras de 5 ml de sangue periférico todo foram coletadas em tubos
Vacutainer EDTA (BD Bioscience , Mountain View , CA ) por punção venosa e
mantidos à temperatura ambiente até 12 horas antes da análise imunofenotípica .
Alíquotas de 100 mL, foram incubadas na presença de 5 ml de anticorpos
monoclonais (mAbs) específicos para marcadores de superfície das células T. Para
a determinação das subpopulações leucocitárias foram utilizados os seguintes
conjuntos de anticorpos monoclonais: linfócitos T (CD3 CD4 CD8 CD69), linfócitosB
(CD5 CD19 HLA- DR), células NK (CD3, CD16 , CD56 , CD69), monócitos (CD14 ,
CD40 , CD80 CD86), linfócitos T (CD4 regulador , CD25 , CD152 , FOXP3)
(CD8/CD4/CD3) (BD). Os anticorpos foram acoplados com os seguintes
fluorocromios: PE, APC, FITC , PE- Cy7 e PerCP. Os mAbs foram todos adquiridos
a partir de Caltag (Burlingame , CA) e incluíram anti - CD3 - TC (MHCD0306 , clone
S4.1), anti - CD4 - PE (MHCD0404 , clone S3.5), anti - CD8 - FITC (MHCD0801 ,
clone 3B5) e anti - CD69 - FITC ( MHCD6901 , clone CH/4 ). Após a incubação
durante 30 minutos à temperatura ambiente, no escuro os eritrócitos foram lisados
usando 2 ml de solução de lise FACS ( BD Biosciences / Pharmingen, San Diego,
CA).
Os leucócitos foram então lavados com 2 ml de solução salina tamponada
com fosfato contendo azida de sódio a 0,01% e fixado em 200 mL de solução de
FACS - FIX (10g/L de paraformaldeído , cacodilato de sódio a 1%, cloreto de 6,65g/L
de sódio, 0,01% de sódio azida).
Um total de 10.000 eventos/tubo foram adquiridas usando uma FACSCalibur
citômetro de fluxo (Becton Dickinson, San Jose, CA) corretamente configurado para
medir a frente (FSC), lateral (SSC), espalha luz, FITC (FL- 1), PE (FL -2), e TC (FL –
3) de fluorescência . O software CellQuestTM fornecido pelo fabricante foi utilizado
para a aquisição e análise de dados. Análise seletiva de linfócitos foi realizada pela
primeira gating a população do FSC (baixo) / SSC eventos (baixo) no FSC vs SSC
23
distribuições gráficos de pontos, seguido por quantificação de TCD3+ , TCD4+ ,
TCD8+ e ativação lance estado CD69+ expressão de superfície, usando anti - CD3
bi-dimensional CT versus anti - CD4 com FITC, anti - CD3 CT versus anti - CD8 PE
ou FSC versus anti - CD69 FITC gráficos de pontos
Um portal de dispersão específicas de FSC contra SSC foi realizada para
análise de monócitos identificados como FSC ( intermediário) / SSC eventos
(intermediário). Os dados foram registados como percentagem de células positivas
dentro fechado leucócitos subpopulações, tal como obtido ao longo do quadrante
estatísticas aplicadas sobre gráficos de pontos.
2. Quantificação de citocinas séricas
A dosagem de citocinas das amostras de plasma dos pacientes e controles foi
realizada pela técnica de Citometria de Fluxo CBA (Cytometric Bead Array) com o Kit
BDTM Human TH1/TH2/TH17 Cytokine (Cat. N° 560484, Lot.: 29132, marca BD®
Biosciences, San Diego, CA, USA), seguindo as orientações descritas pelo
fabricante. As citocinas quantificadas foram: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN- e
IL17.
O Kit BDTM CBA utiliza uma série de partículas (microesferas ou beads) de
tamanho conhecido e com intensidade de fluorescência distinta para detectar
simultaneamente através de uma superfície de captura as várias citocinas solúveis.
Cada bead de captura esta conjugada com um anticorpo específico para cada
citocina. A detecção das citocinas presentes na amostra é realizada através de
anticorpos conjugados ao fluorocromo ficoeritrina (PE) que fornecem um sinal
fluorescente em proporção a quantidade de citocina da amostra ligada a bead. Os
complexos formados de bead de captura + citocina da amostra + anticorpo de
detecção são quantificados através da Citometria de Fluxo.
A intensidade da Fluorescência PE de cada complexo revela a concentração
em pg/mL de cada citocina. Para a aquisição das amostras foi utilizado o Citômetro
de Fluxo FACSCanto II (Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA) do
Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD) - Fiocruz Amazônia. Para o cálculo das
24
concentrações em pg/mL e Intensidade Média de Fluorescência (MFI) de cada
citocina foi utilizado o software FCAP-ArrayTM (v3.0.1).
O efeito da presença de helmintos intestinais na resposta clínica do paciente
com tuberculose foi avaliado da seguinte forma:
1. Análise da evolução clínica – Os pacientes do estudo foram submetidos a
exame radiológico torácico e os resultados avaliados. Considerando o aspecto
radiográfico das lesões pulmonares no raio-X de tórax, os pacientes portadores
de tuberculose foram classificados de acordo com o grau de extensão da
doença: mínima, moderada ou avançada (CLASSIFICATION OF PULMONARY
TUBERCULOSIS, 1969). Os critérios para determinação da extensão da
doença são descritos a seguir:
a) Doença mínima: caracterizada pela presença de infiltrações de densidade
leve a moderada e nenhuma cavidade deve estar presente. As lesões podem
envolver uma pequena porção de ambos os pulmões, porém o volume total
de infiltrações deve ser o volume de um pulmão;
b) Doença moderada: as lesões podem estar presentes em ambos os pulmões,
mas a extensão total destas não deve ser maior que o volume total de um
pulmão ou o volume equivalente de ambos. Caso elas se apresentem em
formas densas e confluentes, não devem envolver mais do que 1/3 do volume
de um pulmão, sendo que o diâmetro total da cavidade (se presente) não
deve ser maior que 4 cm;
c) Doença avançada: lesões mais extensas do que as descritas na doença
moderada.
O exame radiográfico foi repetido no fim do tratamento anti-tuberculose e os
resultados foram comparados aos obtidos no início do tratamento entre pacientes
com Tb e com Tb + Helmintos.
3.4 Análise Estatística
25
Para a descrição dos grupos de comparação foram utilizadas frequências,
proporções e medidas de tendência central e dispersão. As variáveis categóricas
foram comparadas por homogeneidade de proporções, por meio do teste do qui-
quadrado. As médias foram comparadas com o teste-t de Student ou teste-t
pareado. Para comparar a carga bacilar, dividida em três categorias de resultados
de baciloscopia direta (1+++/3+++, 2++/3+++ e 3+++/3+++), utilizou-se o teste de
McNemar. O mesmo procedimento estatístico foi aplicado para os laudos das
imagens das radiografias de tórax, também dividida em quatro categorias (normal,
alteração mínima, moderada e avançada). O nível de significância estatística foi
fixado em 5% para todos os testes. Esta análise estatística foi realizada com
pacote STATA version 11 (STATA Corporation, College Station, TX, USA).
O Kruskal-Wallis seguido Turk pos-test (Dunn’s multiple comparison test) foi
usado para a análise quantitative do fenótipo e citocinas e foi usado GraphPad
Prism software, versão 5.0 (GraphPad Prism Inc., San Diego, CA). Adicionalmente
a análise para variáveis não paramétricas foi usado test T. Os valores foram
expressos em medianas e interbvalos interquatis.
3.5 Cálculo De Amostras
O cálculo da amostra foi realizado com a utilização do programa Statcalc
(Epiinfo versão 3.5.1), utilizando-se uma aproximação para estudo de coorte, tendo
em vista que a presença ou não de helmintos intestinais é o fator de risco
hipotetizado para a evolução clinica diferenciada. Assim, adotando-se erro alfa de
5% e erro beta de 20% (poder de 80%), com freqüência estimada de boa evolução
clinica entre o grupo não exposto (sem helmintos intestinais) de 80% e entre o grupo
exposto (com helmintos intestinais) de 40%, obtivemos, na proporção de 1 caso
exposto: 1 não exposto, 22 pacientes por grupo.
Obs: Os resultados serão apresentados em forma de artigo segundo formatação da
revista
26
4. RESULTADOS Plos Neglected Tropical Diseases Title: AVALIAÇÃO DO IMPACTO DA INFEÇÃO POR ASCARIS LUMBRICOIDES NA RESPOSTA
CLÍNICA, MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE
PULMONAR
João Hugo Abdalla Santos1, João Paulo Pimentel
3, Marcelo Cordeiro dos Santos,
1,2, Valeria Saraceni
4, Alda
Maria Da-Cruz5, Marcus V. G. Lacerda
1, 2*
Running title: Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Amazonas, Brazil
1. Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas Brasil
2. Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas, Brazil;
3. Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil;
4. Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil;
5. Secretaria Municipal de Saúde, Prefeitura da Cidade do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil;
6. Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ; Rio de Janeiro, Brazil
*Address correspondence to Marcus V. G. Lacerda, Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira
Dourado, Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus - Amazonas - Brasil - 69040-000, Fone: + 55 92 2127 3430
Fone/fax: + 55 92 2127 3498, Celular: + 55 92 9114 7633. Electronic mail: [email protected]
Other authors: [email protected], [email protected], [email protected],
27
Abstract: Backgraund: O controle imunológico da tuberculose pulmonar (Tb) é baseado na resposta imune celular,
mediada predominantemente por células TCD4+ Th1. A presença de células T reguladoras está associada com
uma supressão da atividade das células T CD4+ efetoras, e conseqüentemente com uma incapacidade em
eliminar o Mycobacterium tuberculosis do local da infecção. Outro mecanismo capaz de mediar a supressão da
resposta imune observada na tuberculose é a pré-existência de infecção por helmintos intestinais, parasitas
indutores de uma forte resposta imune do tipo Th2. Avaliamos o fenótipo celular e o perfil de citocinas em
pacientes com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar co-infectados ou não por helmintos intestinais e o
impacto da helmintose intestinal na resposta clínica durante o tratamento da Tb.
Finding: A frequência de A lumbricoides nos pacientes co-infectados com tuberculose foi de 78%. Quando
comparados com os pacientes de Tb apenas, estes pacientes tiveram menos lesões avançadas no parenquima
pulmonar e aproximadamente 60% destes se enquadraram como paucibacilar quando avaliado quanto a sua
carga bacilar no escarro. Nos casos de co-infecção TbAl houve uma recuperação mais lenta dos níveis médios de
hemoglobina. A resposta imunológica, fenotípica e perfil de citocinas, dos pacientes com tuberculose pulmonar
co-infectados ou não, apresentaram-se semelhantes.
Conclusion: A infecção por A. lumbricoides parece não levar a repercussões clínicas expressivas na
apresentação e evolução da tuberculose pulmonar. Parece haver uma tendência de redução da lesão do
parenquima pulmonar bem como da carga bacilar e a IL-6 deve estar envolvida neste mecanismo. Ao contrário
do esperado, a associação com Al tambem não influenciou na resposta do tipo Th1 e Th2, bem como o
percentual das subpopulações de linfócitos T.
Keywords: Mycobacterium tuberculosis. Tuberculose pulmonar. Ascaris lumbricoides. Fenótipo celular. Perfil
de citocinas.
Author Summary
A prevalência de tuberculose é alta em áreas endêmicas para helmintos , sugerindo que muitas pessoas estão
cronicamente infectado com ambos os patógenos. Como a infecção por helmintos pode suprimir o sistema
imunitário do hospedeiro a fim de facilitar a sua própria sobrevivência, eles freqüentemente afetam a resposta
imune do hospedeiro. Vários estudos têm mostrado que a infecção por helminto prejudica as respostas
imúnológicas específicas de Mycobacterium tuberculosis, levantando a possibilidade de que possa haver uma
diminuição da capacidade do hospedeiro em controlar a infecção M. tuberculosis. Avaliamos a resposta imune
celular em pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais, tendo como foco a
ascaridiose, e o impacto da presença deste parasito na resposta imune e na clínica da tuberculose pulmonar.
Foram avaliados 91 indivíduos: 38 pacientes com primo-diagnóstico de tuberculose pulmonar apenas (Tb, grupo
1), 11 pacientes com Tb coinfectados com A. lumbricoides (grupo 2, TbAl), 10 pacientes com A. lumbricoides
apenas e 34 indivíduos negativos para ambos as infecções e clinicamente saudáveis. Nossos resultados apontam
que a infecção por A. lumbricoides parece não levar a repercussões clínicas expressivas na apresentação e
evolução da tuberculose pulmonar. Curiosamente, parece haver uma tendência de redução da lesão do
parenquima pulmonar bem como da carga bacilar e a IL-6 deve estar envolvida neste mecanismo. Ao contrário
do esperado, a associação com Al tambem não influenciou na resposta do tipo Th1 e Th2, bem como o
percentual das subpopulações de linfócitos T.
28
Introdução
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou, em 2011, 8,7 milhões de casos
novos de tuberculose no mundo, com um saldo de 1,4 milhões de óbitos (1). Segundo dados
do Ministério da Saúde do Brasil, o Amazonas é hoje o estado da federação com a maior
incidência contabilizando 68,3/100.000, casos de tuberculose.
O Mycobacterium tuberculosis é um exemplo clássico de patógeno cuja resposta
protetora é dependente de uma resposta imune efetora eficiente. O controle imunológico desta
infecção é dependente da resposta imune celular, mediada predominantemente por células T
CD4+ do tipo Th1 (2).
Por meio dos receptores semelhantes a Toll (Toll Like Receptors, TLR), antígenos do
M. tuberculosis induzem a produção de IL-12 pelos macrófagos e células dendríticas, sendo
esta uma importante citocina pró-inflamatória, (2, 3) e uma das responsáveis pelo
desencadeamento de uma resposta do tipo Th1. Estes linfócitos Th por sua vez liberam IFN-,
também produzido por T CD8+ e células NK. (4, 5, 6).
Considerada como a principal citocina no controle da infecção e eliminação do bacilo,
o IFN- ativa o macrófago infectado e dessa maneira, induz a que esta célula exerça seu papel
microbicida, pela ativação da produção de reativos de oxigênio e de nitrogênio, necessários
para a eliminação do bacilo (5,6). Além disso, o IFN- estimula o macrófago a liberar TNF,
citocina importante para a formação do granuloma e para o controle da propragação da
infecção (7; 8).
Os helmintos intestinais são causa de significativa morbidade em humanos, estima-se
que um terço da população mundial esteja infectado por pelo menos uma espécie de helminto.
Dados apontam que a infecção isoladamente por Ascaris lumbricoides afeta mais de um
bilhão de pessoas com morbidade significativa. (9). A prevalência atual das infecções
helmínticas no Brasil e no Amazonas não é conhecida.
A resposta imune típica induzida pelos helmintos intestinais é dependente de células
Th2, resposta que envolve produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, assim como a produção de
IgE e a mobilização e expansão de células efetoras não-específicas, como mastócitos,
eosinófilos e basófilos (10). Pacientes com infecções helmínticas crônicas, mantêm ativação
persistente do sistema imune pelos antígenos parasitários, estando associada a uma
diminuição na transdução de sinais na células T, com conseqüente diminuição da resposta
imune (hiporresponsividade) e anergia. (10)
A polarização da resposta imune para uma resposta tipo Th2 pode influenciar
negativamente uma resposta do tipo Th1, inibindo a proteção imunológica do hospedeiro
29
frente a patógenos cuja resposta protetora é Th1 dependente (11). As células Th2 produzem
IL-10, a qual age sobre os macrófagos inibindo a ativação de resposta Th-1 e bloqueando a
síntese de IL-12 (12). Também levam a um aumento na expressão de CTLA-4, diminuição da
secreção de quimiocinas e diminuição de resposta imune do tipo tardia (10).
Pacientes crônicamente infectados por helmintos intestinais, apresentaram uma
diminuição no número de células T CD4+ e aumento de células T CD8
+ circulantes, sendo que
estas células apresentavam um alto nível de ativação (10). A infecção helmíntica crônica afeta
também a expressão de TLR. Dois estudos independentes mostraram que a expressão de
TLR9 é diminuída em células B de pacientes infectados (13,14) quando comparados a
indivíduos sadios. Curiosamente, alguns estudos têm relatado que as infecções por helmintos
podem modular a resposta imune influenciando no desenvolvimento de algumas co-infecções
como a malária, tuberculose e HIV (2). Foi demonstrado que pacientes com tuberculose que
têm infecções helmínticas apresentam manifestações pulmonares mais graves, deficiência na
resposta imune contra a tuberculose e resposta prejudicada a terapia anti-TB (15). No entanto,
como a indução da resposta imune pode ser diferenciada em em função do tipo de interação
que cada espécie de helminto estabelece com o hospedeiro, fica dificil determinar a real
influência de cada helminto na tuberculose.
Em suma, a avaliação dos estudos já realizados, indica a existência de uma forte
associação entre infecção helmíntica e outras doenças infecciosas, incluindo a tuberculose.
Essa associação entre infecção helmíntica e tuberculose torna-se relevante quando
consideramos a situação de países em desenvolvimento, onde ambas as infecções apresentam
prevalências elevadas e podem coexistir em uma mesma área.
Baseando-se nas evidências objetivamos avaliar a resposta imune celular em pacientes
portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais, tendo como foco a
ascaridose, e o impacto da presença deste parasito na resposta imune e clínica na tuberculose
pulmonar.
Material e Métodos
População estudada
Foram avaliados 91 indivíduos: 38 pacientes com primo-diagnóstico de tuberculose
pulmonar apenas (Tb, grupo 1), 11 pacientes com Tb coinfectados com A. lumbricoides
(grupo 2, TbAl), 10 pacientes com A. lumbricoides(Al) apenas e 34 indivíduos negativos para
ambos as infecções e clinicamente saudáveis. Os pacientes controles (Al e clinicamente
30
saudáveis) foram escolhidos aleatoreamente nas proximidades em que se encontrava a
unidade de atendimento dos pacientes casos.
Foram considerados casos de Tb os indivíduos que apresentavam baciloscopia positiva
no escarro e que não tinham relato anterior da doença. Para o diagnóstico parasitológico
foram avaliadas três amostras de fezes coletadas em dias consecutivos. As técnicas de Lutz,
Kato-Katz e Baerman-Moraes foram utilizadas para o diagnóstico e controle de cura. A
distribuição dos helmintos na população estudada foi: A. lumbricoides 21 casos (77,8%),
Trichuris trichiura 2 casos (7,4%) Strongyloides stercoralis 2 casos (7,4%), e ancilostomideo
2 casos (7,4%). Foram selecionados apenas os 21 casos que apresentavam infecção por
A. lumbricoides. Todos os indivíduos que apresentassem sorologia HIV positiva eram
excluídos do estudo.
Os pacientes com Tb foram tratados com o esquema padrão com quatro drogas
(rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol), de acordo com as recomendações do
Ministério da Saúde do Brasil (16). Para o monitoramento terapêutico foi utilizado a
quantificação da carga baciliar no escarro (1+/3+++ , 2++/3+++, 3 +++/3+++) (16) e a
quantificação semiquantivativa de imagens de alterações parequimatosas visualizadas na
radiografia de tórax (mínima, moderada e avançada) (17). As radiografias foram analisadas
por dois observadores independentes. Os pacientes com helmintose foram tratados com
mebendazol (500 mg/dia por tres dias) ou tiabendazol (500 mg/dia por três dias).
As amostras de sangue, fezes e escarro dos pacientes com Tb e TbAl foram estudadas
nos dias 0, 30, 60 e 120 após a inclusão no estudo. O sangue dos pacientes com Al e controles
sadios foram coletados apenas no momento de inclusão no estudo. Foram utilizados 10 mL de
sangue periférico para as seguintes análises: leucograma, indices hematimétricos, fenótipo de
células mononucleares e quantificação de citocinas no plasma.
Considerações éticas. Este projeto foi aprovado pelo Comite de Ética em Pesquisa em
Humanos da Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado (1348-10). Todos os
sujeitos da pesquisa concordaram em participar do estudo e assinaram o Termo de
consentimento informado, antes de sua inclusão no protocolo.
Imunofonotipagem dos leucócitos do sangue priférico por citometria de fluxo
Amostras de 5 ml de sangue periférico todo foram coletadas em tubos Vacutainer
EDTA (BD Bioscience , Mountain View , CA ) por punção venosa e mantidos à temperatura
ambiente até 12 horas antes da análise imunofenotípica. Alíquotas de 100 mL, foram
incubadas na presença de 5 ml de anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para
31
marcadores de superfície das células T. Para a determinação das subpopulações leucocitárias
foram utilizados os seguintes conjuntos de anticorpos monoclonais: linfócitos T (CD3 CD4
CD8 CD69), linfócitosB (CD5 CD19 HLA- DR), células NK (CD3, CD16 , CD56 , CD69),
monócitos (CD14 , CD40 , CD80 CD86), linfócitos T (CD4 regulador , CD25 , CD152 ,
FOXP3) (CD8/CD4/CD3) (BD). Os anticorpos foram acoplados com os seguintes
fluorocromios: PE, APC, FITC , PE- Cy7 e PerCP. Os mAbs foram todos adquiridos a partir
de Caltag (Burlingame , CA) e incluíram anti - CD3 - TC (MHCD0306 , clone S4.1), anti -
CD4 - PE (MHCD0404 , clone S3.5), anti - CD8 - FITC (MHCD0801 , clone 3B5) e anti -
CD69 - FITC ( MHCD6901 , clone CH/4 ). Após a incubação durante 30 minutos à
temperatura ambiente, no escuro os eritrócitos foram lisados usando 2 ml de solução de lise
FACS ( BD Biosciences / Pharmingen, San Diego, CA).
Os leucócitos foram então lavados com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato
contendo azida de sódio a 0,01% e fixado em 200 mL de solução de FACS - FIX (10g/L de
paraformaldeído , cacodilato de sódio a 1%, cloreto de 6,65g/L de sódio, 0,01% de sódio
azida).
Um total de 10.000 eventos/tubo foram adquiridas usando uma FACSCalibur
citômetro de fluxo (Becton Dickinson, San Jose, CA) corretamente configurado para medir a
frente (FSC), lateral (SSC), espalha luz, FITC (FL- 1), PE (FL -2), e TC (FL – 3) de
fluorescência . O software CellQuestTM fornecido pelo fabricante foi utilizado para a
aquisição e análise de dados. Análise seletiva de linfócitos foi realizada pela primeira gating a
população do FSC (baixo) / SSC eventos (baixo) no FSC vs SSC distribuições gráficos de
pontos, seguido por quantificação de TCD3+ , TCD4
+ , TCD8
+ e ativação lance estado CD69
+
expressão de superfície, usando anti - CD3 bi-dimensional CT versus anti - CD4 com FITC,
anti - CD3 CT versus anti - CD8 PE ou FSC versus anti - CD69 FITC gráficos de pontos.
Um portal de dispersão específicas de FSC contra SSC foi realizada para análise de
monócitos identificados como FSC ( intermediário) / SSC eventos (intermediário). Os dados
foram registados como percentagem de células positivas dentro fechado leucócitos
subpopulações, tal como obtido ao longo do quadrante estatísticas aplicadas sobre gráficos de
pontos.
Quantificação de citocinas séricas
As citoquinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IFN- e IL-17 foram medidos no soro
criopreservado utilizando o cartão do kit de matriz citométrico t (CBA, BD Biosciences
Pharmingen, EUA) seguindo as instruções do fabricante.
32
Análise estatística.
Para a descrição dos grupos de comparação foram utilizadas frequências, proporções
e medidas de tendência central e dispersão. As variáveis categóricas foram comparadas por
homogeneidade de proporções, por meio do teste do qui-quadrado. As médias foram
comparadas com o teste-t de Student ou teste-t pareado. Para comparar a carga bacilar,
dividida em três categorias de resultados de baciloscopia direta (1+++/3+++, 2++/3+++ e
3+++/3+++), utilizou-se o teste de McNemar. O mesmo procedimento estatístico foi
aplicado para os laudos das imagens das radiografias de tórax, também dividida em quatro
categorias (normal, alteração mínima, moderada e avançada). O nível de significância
estatística foi fixado em 5% para todos os testes. Esta análise estatística foi realizada com
pacote STATA version 11 (STATA Corporation, College Station, TX, USA).
O Kruskal-Wallis seguido Turk pos-test (Dunn’s multiple comparison test) foi
usado para a análise quantitative do fenótipo e citocinas e foi usado GraphPad Prism
software, versão 5.0 (GraphPad Prism Inc., San Diego, CA). Adicionalmente a análise para
variáveis não paramétricas foi usado test T. Os valores foram expressos em medianas e
interbvalos interquatis.
Resultados
A co-infecção com Ascaris lumbricoides não altera a evolução clínica da tuberculose
pulmonar, mas pode influenciar na gravidade das lesões pulmonares
A tabela 1 apresenta a frequência dos dados demográficos, características clínicas,
exames laboratoriais e de imagens dos pacientes estudados. A amostragem dos grupos TbAl e
Al foi similar em termos de faixa etária e sexo, apontando para uma homogeneidade dos
pacientes estudados. Tosse, dor torácica, perda ponderal e febre foram os sintomas mais
frequentes, sendo descritos em acima de 80% dos casos. Não houve diferença significativa na
frequência de nenhum dos sinais e sintomas estudados quando foram comparados os grupos
TbAl e Tb (Tabela 1).
Vinte e oito porcento (7 em 25 casos) dos pacientes de Tb apresentavam evidências
radiológicas de um grau avançado de comprometimento do parênquima pulmonar. Em
contrapartida, nenhum dos 11 pacientes de TbAl apresentou avançado. Em relação à carga
bacilar, mais da metade dos pacientes TbAl eram paucibacilares (1+/3+++), sendo esta
proporção mais elevada do que a observada nos casos de Tb. Entretanto, essas diferenças em
33
termos de comprometimento pulmonar e carga bacilar não foram estatisticamente
significativas entre os dois grupos estudados.
34
Tabela 1. Comparação da frequência dos dados demográficos, características clínicas, exames
laboratoriais e de imagens dos pacientes com tuberculose apenas (Tb) ou co-infectados com
Ascaris lumbricoides (TbAl), no momento da inclusão.
Parâmetros avaliados
Grupo 1
TbAl
(n=11)
Grupo 2
Tb
(n=38)
p-valor
Dados demográficos
Sexo masculino (%) 63,6 71,1 ns
Idade (média) 45,7 40,0 ns
Sintomas Cínicos
Tosse (%) 100,0 89,5 ns
Dor torácica (%) 90,9 86,8 ns
Perda ponderal (%) 90,9 86,8 ns
Febre (%) 81,8 83,8 ns
Dispnéia (%) 72,7 60,5 ns
Sudorese (%) 72,7 52,6 ns
Astenia (%) 63,6 47,4 ns
Dor abdominal (%) 27,3 29,0 ns
Diarréia (%) 18,2 18,4 ns
Hemoptoicos (%) 9,1 13,2 ns
Perda ponderal (média, Kg) 6,5 7,6 ns
Imagens radiográficas do tórax
Grau não Avançada* (n) 11 18 ns
Grau Avançada (n) 0 7 ns
Carga bacilar
1+/3+++ 54,6 34,2 ns
2++/3+++ 18,2 39,5 ns
3+++/3+++ 27,2 26,3 ns
n = número; ns = não significante
* imagens “Grau não avançada” incluem os critérios de alteração mínina e moderada
35
Os pacientes foram acompanhados por três meses para verificar se os co-infectados
TbAl apresentariam uma resposta ao tratamento com quatro drogas (rifampicina, isoniazida,
pirazinamida e etambutol) diferente dos pacientes apenas com Tb. Foi evidenciado que a
remissão, simultânea dos principais sintomas, tosse, torácica, perda ponderal e febre, se deu
de forma semelhante, já no segundo mês de acompanhamento, em ambos os grupos, sem
significância estatística.
Visando avaliar se havia diferença em termos de alterações hematológicas entre
grupos TbAl e Tb, analisou-se a evolução dos parametros hematimétricos ao longo dos três
meses de acompanhamento. Foram realizadas com quatro coletas de sangue nos dias 0, 30, 60
e 90 após o diangóstico de Tb. Nas quatro comparações não se evidenciou diferença no
percentual de células sanguíneas (leucócitos, eosinófilos, linfócito, neutrófilo e plaquetas)
entre os dois grupos. Ao avaliarmos a recuperação da hemoglobina, pela média, observou-se
uma recuperação mais rápida e normalização dos níveis da mesma no grupo com tuberculose
isoladamente, embora a diferença não tenha sido significativa (Figura 1)
Figura 1. Média de hemoglobina entre pacientes com tuberculose (Tb) com ou sem
Ascaris lumbricoides (Al) ao longo dos três meses de seguimento clínico (sem significância
estatística).
Perfil fenotípico de monocuncleares do sangue periférico de pacientes com associação
tuberculose e Ascaris lumbricoides em relação aos monoinfectados e saudáveis.
As infecções por M. tuberculosis e A. lumbricoides podem levar a alterações no grau
de ativação do sistema imune, influenciando o percentual e a funcionalidade de
36
mononucleares na circulação sanguínea (18). Sabe-se que pacientes com tuberculose
pulmonar apresentam resposta imune celular, mediada predominantemente por células TCD4+
Th-1 (18). A presença de células T reguladoras está associada com uma supressão da
atividade das células T CD4+ efetoras, e conseqüentemente com uma incapacidade em
eliminar o bacilo do local da infecção (18).
Por outro lado, antígenos de A. lumbricoides são indutores de uma resposta imune do
tipo Th2, que podem mediar a supressão da resposta efetora contra a tuberculose, favorecendo
a replicação dos bacilos e, consequentemente, influciando a progressão da doença (2,3).
Objetivando avaliar se a infecção por A. lumbricoides pode modular o percentual de linfócitos
(B, B1, TCD4+, TCD8
+) e monócitos, bem como de células NK (NK e NKT) e reguladoras,
foram comparados pacientes co-infectados com aqueles com ascaridiose ou tuberculose
apenas. Como controle foram utilizados indivíduos sem ambas as doenças, considerados
sadios. Os resultados estão apresentados na Figura 2.
Não houve diferença estatística para nenhum dos parâmetros avaliados, quando os
pacientes co-infectados foram comparados aos casos de ascaridiose ou tuberculose apenas. No
entanto, os pacientes de tuberculose apresentaram um aumento significativo do percentual de
TCD4+CD69
+, Treg, Treg CTLA4, CD14
+ em relação ao individuos sadios/controles. O
aumento do grau de ativação de linfócitos TCD4+ observado nos casos de tuberculose também
ocorreu nos casos de co-infecção e ascaridiase apenas, mas a diferença para estes dois últimos
grupos não foi significante em relação ao controle (Figura 2C). Um fenomeno similar ocorreu
para Treg e Treg CTLA4 (Figuras 2D e 2E). Diferentemente, o aumento de macrófagos
CD14+ foi visto apenas nos casos de tuberculose Figure 2F).
Não houve correlação entre os niveis de citocinas e a carga bacilar.
37
Contr Tb TbAl Al0
20
40
60
80
100
% T
CD
4+
Contr Tb TbAl Al0
20
40
60
80
100
% T
CD
8+
Contr Tb TbAl Al0
2
4
6
8
10
100*
% T
CD
4+
CD
69+
Contr Tb TbAl Al0
2
4
6
100 *%
T R
eg
Contr Tb TbAl Al0
5
10
1520
100
**
% C
D14
Figure
Contr Tb TbAl Al0.0
0.5
1.0
100
*
% T
Re
g C
TL
4
A B
C D
FE
Figura 2. Perfil fenotípico de leucócitos mononucleares de indivíduos com tuberculose (Tb) e
co-infectados por Ascaris lumbricoides (Al). Os linfócitos T (Linf.,%P), linfócitos B
(Linf./LB (CD19+), monócitos (CD14
+), foram analisados por citometria de fluxo. Foram
estudados indivíduos com co-infecção TbAl (n=11), Tb apenas (n = 25), Al apenas (n = 10) e
controles sem Tb ou Al (control, n = 34) Cada símbolo representa um indivíduo. As barras
horizontais e verticais representam a mediana e o intervalo interquartil. Kruskal-Wallis with
pos-test: * = p < 0.05, ** = p < 0.01
38
Quantificação de citocinas plasmáticas de pacientes com associação tuberculose e
Ascaris lumbricoides em relação aos monoinfectados e saudáveis.
A imunomodulação da resposta celular, Th2 versus Th1 versus Th17, mostrada em
vários estudos também interfere no grau de produção das citocinas, dentre as quais podemos
citar a IL-10, IL-4, suprimindo a estimulação da produção de IFN-γ e IL-2, e esta por sua vez
reduz a produção do TNF.
Os niveis das citocinas IFN-γ, TNF, IL-4 e IL-10 dos pacientes com TbAl foram
similares aos individuos sadios, e aos pacientes com Tb apenas e Al apenas (Figura 3, Th1 e
Th2). A IL-6 está aumentada nos casos de lesão pulmonar e também participa na alça de
indução de Th17 (19). Neste estudo, houve um aumento significativo dos níveis de IL-6 nos
pacientes de Tb e TbAl quando comparados ao controle sadio. No entanto, os pacientes com
associação TbAl, apresentaram níveis mais baixos de IL-6, quando comparados aos casos de
Tb, embora a diferença não tenha sido significativa. A infecção por Al não alterou os níveis
de IL-6. Esses resultado podem indicar uma provável imunomodulação nos níveis de IL-6
devido a presença de A. lumbricoides.
A IL-17 é uma das citocinas pro-inflamatória envolvida no controle da infecção de
patógenos intracelulares e nas patogenese de doenças autoimunes (19). Os casos estudados
aqui apresentaram uma elevação significativa nos controles com Al em comparação com os
de Tb. (p < 0,01, T test), demonstrando que a infecção por A. lumbricoides parece interferir
com a indução dos niveis de IL-17.
39
Figure 3
Control Tb TbAl Al0
100
200
300
IFN
- p
g/m
L
Control Tb TbAl Al0
50
100
150
200
TN
F p
g/m
L
Control Tb TbAl Al0
10
20
30
40
50 **
***
***
***
IL-6
pg/m
L
Control Tb Tb+Al Al0
50
100
150
200
250
IL-4
pg
/mL
Control Tb TbAl Al0
50
100
150
200
IL-1
0 p
g/m
L
Th17
Th2
Th1
Control Tb TbAl Al0
10
20
30 *
IL-1
7A
pg
/mL
Figura 3. Perfil de citocinas séricas efetoras (Th1 e Th17), reguladoras e supressoras (Th2) de
indivíduos com tuberculose (Tb) co-infectados por Ascaris lumbricoides (TbAl). As citocinas
do tipo Th1 (IFN-γ, TNF e IL-6), Th17 (IL-17A) e Th2 (IL-4 e IL-10) foram quantificadas no
plasma através de citometria de fluxo. Foram estudados indivíduos com co-infecção TbAl
(n=11), Tb apenas (n = 25), Al apenas (n= 10 ) e controles sem Tb ou Al (control, n= 34 ).
Cada símbolo representa um indivíduo. As barras horizontais e verticais representam a
mediana e o intervalo interquartil. Kruskal-Wallis with pos-test: * = p < 0.05, ** = p < 0.01,
*** = p < 0.001. obs.: IL-17A - Control vs Tb p < 0.01 pelo test T two-tail
40
Discussão
A frequência de A lumbricoides nos pacientes co-infectados com tuberculose foi de
78%. Quando comparados com os pacientes de Tb apenas, estes pacientes tiveram menos
lesões avançadas no parenquima pulmonar e aproximadamente 60% destes se enquadraram
como paucibacilar quando avaliado quanto a sua carga bacilar no escarro. Nos casos co-
infecção TbAl houve uma recuperação mais lenta dos níveis médios de hemoglobina. A
resposta imunológica, fenotífica e perfil de citocinas, dos pacientes com tuberculose pulmonar
co-infectados ou não apresentaram-se semelhantes.
Nosso estudo tem a particularidade de apresentar como helminto predominante na co-
infecção, tuberculose pulmonar e helmintose, o A. lumbricoides, bem como ter
correlacionando, ao longo dos 120 dias do início do tratamento de ambas as doenças, a parte
clínica (sintomas, hematimétricas, alterações de parenquima pulmonar) com a resposta
imunológica, aqui apenas no momento do diagóstico.
A predominância de A. lumbricoides nos pacientes co-infectados com tuberculose e o
grau de comprometimento do parenquima pulmonar dos pacientes TbAl, difere dos resultados
obtidos em outra coorte. Em estudo semelhante, onde o S. stercoralis foi o helminto mais
frequente, a lesão pulmonar de grau avançado foi mais frequente nos pacientes co-infectados
do que nos casos de Tb apenas (20), enquanto nos casos aqui apresentado, os pacientes co-
infectados não apresentaram nenhum caso de grau avançado de lesão pulmonar. Isso indica
que a espécie de helminto pode levar a um desfecho mais ou mesno favorável do quadro de
tuberculose pulmonar.
Segundo o nosso conhecimento, não há na literatura nenhum estudo que tenha
abordado a influência da helmintose no agravamento da anemia crônica causada pela
tuberculose. Após o tratamento da tuberculose, os niveis médios de hemoglobina exibiram
uma recuperação mais lenta nos pacientes coinfectados TbAl do que nos Tb. Também nos
casos de malária observa-se que a co-infecção com helminto leva a prejuizo na eritropoiese,
Esses resultados reforçam a idéia que a helmintose agrava a anemia crônica associada a
doenças infecciosas.
Foi possível observar aumento significativo do percentual de células ativadas
(TCD4+CD69
+) bem como de celulas reguladoras (Treg, Treg CTLA4) e de monócitos
(CD14+) nos pacientes com Tb em relação ao individuos sadios/controles. O aumento da
ativação linfocitária deve estar relacionada a carga antigenica circulante. Por outro lado, o
aumento da atividade reguladora pode sinalizar para uma supressão da função efetora ao
bacilo. O aumento do percentual de monócitos consequentemente eleva o número de células
hospedeiras para o M. tuberculosis, favorecendo a propagação da infecção. Com exceção dos
41
níveis de ativação em TCD4+, o aumento destas células também foi observado nos pacientes
com TbAl, embora não significativo. Esses resultados nos levam a sugerir uma influência da
resposta do tipo Th2, induzida pelo A. lumbricoides (21,22,23,24).
A IL-6 está relaciona aos processos de lesão do parenquima pulmonar, e o aumento
desta citocina observado no casos de Tb deste estudo, corroboram a existência deste
mecanismo. Os pacientes com associação TbAl, apresentaram níveis mais baixos de IL-6,
quando comparados aos casos de Tb, embora a diferença não tenha sido significativa. Esses
resultados podem indicar uma provável imunomodulação nos níveis de IL-6 devido a
presença de A. lumbricoides. A IL-6 é crucial para resistência contra a tuberculose, e é
essencial para a geração de respostas imunes Th-1 e Th-17 (25). Este resultado pode
corroborar com o fato de 100% dos nossos pacientes TbAl não apresentarem grau avançado
de lesão parenquimatosa pulmonar. Reforçando a idéia de um possível efeito benéfico da
associação com Al na Tb, verificou-se que 60% dos casos de TbAl foram paucibacilar,
número este bastante superior aos casos de Tb apenas. A redução da Th17 foi expressiva nos
casos de Tb com e sem Al, mostrando que a ausencia desta citocina deve favorecer o processo
infeccioso.
A ausência de alterações expressivas nas citocinas séricas e células sanguíneas
também podem dever-se ao fato dessas infecções Tb e Al não terem causado uma repercussão
sistemica expressiva dos indivíduos.
As limitações que podem ser apontadas no estudo são: 1. o número de pacientes
estudados; 2. a não avaliação de poliparasitismo nos pacientes com tuberculose para efeito
comparação; 3. a indicação inquestionável de tratamento para helmintose no momento do
diagnóstico, não nos permitindo avaliar a imunomodulação dos mesmos ao longo do
acompanhamento clínico, e 4. a não avaliação genética dos grupos, pois sabemos que há
influencias genéticas na resposta imune. Por outro lado, devido a dificuldade de recrutamento
destes casos, sobretudo para formar uma coorte de avaliação prospectiva de três meses, onde
diferentes parametros clínicos, bacteriológicos, parasitológicos, radiológicos, laboratoriais e
imunológicos foram avaliados, tornam o desenho deste estudo bastante complexo. Talvez por
isso, não haja ainda na literatura, uma estudo semelhante para comparação. Além disso, a
estratégia de se estudar a co-infecção por apenas um helminto, mas de grande importância
epidemiologica devido a sua alta prevalncia, no caso o A. lumbricoides, permite inferir que
apenas as consequeências imunopatogências apenas deste parasito devam ser responsáveis por
possíveis as diferenças observadas entre os grupos.
42
Em resumo, nossos resultados apontam que a infecção por A. lumbricoides parece não
levar a repercussões clínicas expressivas na apresentação e evolução da tuberculose pulmonar.
Curiosamente, parece haver uma tendência de redução da lesão do parenquima pulmonar bem
como da carga bacilar e a IL-6 deve estar envolvida neste mecanismo. Ao contrário do
esperado, a associação com Al também não influenciou na resposta do tipo Th1 e Th2, bem
como o percentual das subpopulações de linfócitos T. Logo, a avaliação da resposta imune
específica aos antígenos de ascaris e micobacteria, deve ser um nova abordagem
metodologica para auxiliar na compreensão desta associação. Assim, uma perpectiva futura
sera estudar a resposta antígenos específica e in situ no tecido pulmonar de células
reguladoras, a Th17, IL-6, bem como as citocinas envolvidas na eritropoiese e os
subtipos/funcionalidade dos macrófagos.
43
List of abbreviations:
ML – mucosal leishmaniasis
Conflicts of interest: The authors declare that they have no competing interests.
Authors' contributions
RSN, RCB, and DSM carried out the immunologic studies and participated in the acquisition
of data. RSN and AG-S participated in the analysis and interpretation of data, drafting the
manuscript or revising it critically for important intellectual content. VSA, MSM and MPO-N
collected the clinical data and accompanied the patients. SGC and AMD-C conceived the
study, and participated in its design and coordination and helped to draft the manuscript. All
authors read and approved the final manuscript.
Acknowledgments: The authors thank Dr. Alvaro Luiz Bertho for flow cytometric analysis;
Dr. Josué da Costa Lima Junior for ELISPOT read and image capture. We are also grateful to
Ms Rosângela Pellegrino for secretarial assistance. This work was funded by IOC/FIOCRUZ
internal funds, PAPESIV/VPPDT/FIOCRUZ, and by FAPERJ APQ-1 (grant number E-
26/170·844/2003). AG-S is a PhD sponsored by CNPq/FIOCRUZ research visitor program.
AMD-C is a CNPq and FAPERJ (JCNE) research fellow.
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46
5. CONCLUSÃO
Em resumo, nossos resultados apontam que a infecção por A. lumbricoides
parece não levar a repercussões clinicas expressivas na apresentação e evolução
da tuberculose pulmonar. Curiosamente, parece haver uma tendencia de redução da
lesão do parenquima pulmonar bem como da carga bacilar e a IL-6 deve estar
envolvida neste mecanismo. Ao contrario do esperado, a associação com Al tambem
não influenciou na resposta do tipo Th1 e Th2, bem como o percentual das
subpopulações de linfócitos T. Logo, a avaliação da resposta imune especifica aos
antigenos de ascaris e micobacteria, deve ser um nova abordagem metodologica
para auxiliar na compreensão desta associação. Assim, uma perpectiva futura sera
estudar a resposta antígenos específica e in situ no tecido pulmonar de células
reguladoras, a Th17, a IL-6, bem como as citocinas envolvidas na eritropoiese e os
subtipos/funcionalidade dos macrófagos.
47
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74. Guyot-Revol V, Innes JA, Hackforth S, Hinks T, Lalvani A. Regulatory T cells are expanded in blood and disease sites in patients with tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 2006; 173(7):803-10.
75. Abbas AK, Murphy KM, Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature. 1996; 383(6603): 787-93.
76. Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M. Imunobiologia: o sistema imune na saúde e na doença. 5 ed. Porto Alegre: Artmed; 2002.
77. Borkow G, Leng Q, Weisman Z, Stein M, Galai N, Kalinkovich A, Bentwich Z. Chronic immune activation associated with intestinal helminth infections results in impaired signal transduction and anergy. J Clin Invest. 2000; 106(8):1053-60.
78. Kalinkovich A, Weisman Z, Greenberg Z, Nahmias J, Eitan S, Stein M, Bentwich Z. Decreased CD4 and increased CD8 counts with T cell activation is associated with chronic helminth infection. Clin Exp Immunol. 1998; 114(3):414-21.
79. Ayash-Rashkovsky M, Bentwich Z, Borkow G. TLR9 expression is related to immune activation but is impaired in individuals with chronic immune activation. Int J Biochem Cell Biol. 2005 Nov; 37(11):2380-94.
80. Babu S, Blauvelt CP, Kumaraswami V, Nutman TB. Diminished expression and function of TLR in lymphatic filariasis: a novel mechanism of immune dysregulation. J Immunol. 2005 175(2):1170-6.
81. Talaat KR, Bonawitz RE, Domenech P, Nutman TB. Preexposure to live Brugia malayi microfilariae alters the innate response of human dendritic cells to Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 193(2):196-204.
82. King CL, Mahanty S, Kumaraswami V, Abrams JS, Regunathan J, Jayaraman K, Ottesen EA, Nutman TB. Cytokine control of parasite-specific anergy in human lymphatic filariasis, Preferential induction of a regulatory T helper type 2 lymphocyte subset. J Clin Invest. 1993; 92(4):1667-73.
83. McKee AS, Pearce EJ. CD25+CD4+ cells contribute to Th2 polarization during helminth infection by suppressing Th1 response development. J Immunol. 2004; 173(2):1224-31.
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85. Satoguina J, Mempel M, Larbi J, Badusche M, Loliger C, Adjei O, Gachelin G, Fleischer B, Hoerauf A. Antigen-specific T regulatory-1 cells are associated with immunosuppression in a chronic helminth infection (onchocerciasis). Microbes Infect. 2002; 4(13):1291-300.
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51
ANEXOS
52
ANEXO 1 – Parecer de Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)
53
ANEXO 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE
Você está sendo convidado para participar da pesquisa: Avaliação do impacto das helmintíases intestinais na resposta clínica, microbiológica e imunológica em pacientes com tuberculose pulmonar. A qualquer momento você pode desistir de participar e retirar seu consentimento. Sua recusa não trará nenhum prejuízo em sua relação com o pesquisador ou com a instituição. O acompanhamento da sua doença e tratamento continuará sendo realizado independentemente de você estar na pesquisa ou não. Você será retirado do estudo caso você deixe de seguir as orientações para a participação no estudo. A Cidade de Manaus apresenta, anualmente, um grande número de pessoas acometidas com tuberculose, sendo que parte destas pessoas ainda apresenta infectado por helmintos intestinais. Para melhor entendermos a melhor forma de a doença, o controle e tratamento, nós estamos convidando você a considerar a participação deste estudo. Precisamos do maior número possível de pessoas. Trata-se de um estudo observacional sobre o impacto das helmintoses em pacientes com tuberculose pulmonar atendidos no ambulatório de tuberculose da Policlínica Conte Telles e terá duração de 24 meses. Você não precisa fazer qualquer coisa especial para participar desse projeto e receberá o mesmo tratamento e acompanhamento estabelecido de acordo com as normas do Ministério da Saúde. Nós coletaremos além de várias informações clínicas, uma amostra de sangue (20 ml) através de uma agulha (venopunção) para fazer exames laboratoriais, amostras de escarro para fazer teste para tuberculose (baciloscopia) e amostras de fezes para pesquisa de parasitas. Nós gostaríamos de sua permissão para fazer testes com as amostras de sangue coletadas e para guardar o restante do sangue para ser usado em estudos sobre tuberculose no futuro. Isto pode exigir o armazenamento mais prolongado de seu sangue em laboratórios da FMT/HVD-AM. Para isso, seu sangue será guardado com um código e não deverá identificar seu nome. Você pode sentir alguma dor por causa da coleta de amostra de sangue na veia do braço. Mas qualquer dor deve durar apenas alguns instantes. Existe um risco muito pequeno de infecção onde o sangue for coletado, mas qualquer infecção será monitorada e tratada pela equipe médica. A amostra de sangue colhida é pequena e não representa nenhum risco à sua saúde. O benefício em estar participando deste estudo será um aumento de informações sobre tuberculose e helmintos e seus riscos na nossa cidade, mas você não será pago nem receberá incentivo financeiro durante o acompanhamento. Os participantes da pesquisa que vierem a sofrer qualquer tipo de dano previsto ou não no termo de consentimento e resultante de sua participação, além do direito à assistência integral, tem direito à indenização. Jamais poderá ser exigido do participante da pesquisa, sob qualquer argumento, renúncia ao direito à indenização por dano. Se você concordar em participar, todas as informações coletadas serão confidenciais, usadas somente no estudo. Nós não compartilharemos suas informações, e um código será usado para identificar você em vez de seu nome. Nós não tornaremos público qualquer detalhe sobre você. No caso de algum pesquisador tirar uma foto sua, ele cuidará para que você não seja identificado. Esta imagem sua será publicada apenas em revistas para médicos.
54
Pessoas para contato Se você tiver qualquer pergunta ou preocupação sobre o estudo, por favor, vamos esclarecer isso agora. Mesmo assim, se depois você desejar esclarecer suas dúvidas sobre a pesquisa ou sobre ser um sujeito de pesquisa, por favor, sinta-se à vontade para contatar João Hugo Abdalla Santos, pesquisador principal do projeto na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. O endereço do hospital é Av. Pedro Teixeira, nº 25, Dom Pedro e o número do telefone é (92) 91135525. O endereço do Comitê de Ética em Pesquisa da FMT/HVD-AM (que é um grupo de pessoas que avaliam este projeto e acompanham a pesquisa) é também na Av. Pedro Teixeira, n° 25, Bairro Dom Pedro, e o telefone para contato é o (92) 2127 3432. O presidente deste comitê é o Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira. Eu,..............................................................................................................., participante desse estudo ou responsável pelo paciente ......................................................................................, entendi todas as informações dadas a mim sobre o estudo: Avaliação do impacto das helmintíases intestinais na resposta clínica, microbiológica e imunológica em pacientes com tuberculose pulmonar, inclusive o seu propósito e a forma como será executado. Eu tive a chance de fazer perguntas sobre o estudo e concordo em participar do mesmo. ________________________________ Data ___/___/___ Assinatura do participante ou responsável ou impressão do polegar direito _________________________ ____________________ Data___/___/____ Nome do entrevistador Assinatura do entrevistador _____________________________ ________________________ Data___/___/____ Nome do pesquisador responsável Assinatura do pesquisador responsável
55
ANEXO 3 – Questionário
Ficha de Acompanhamento de Pacientes com Tuberculose Pulmonar e Parasitoses Intestinais
DATA:
IDENTIFICAÇÃO
REG: Nº. REG:
IDADE: SEXO: ( ) 1 - MASC 2 -FEM
ENDEREÇO:
PTO DE REF: TEL:
END. ANTERIOR:
Nº DE HAB. NA RESID.: CASO DE TB NA FAM: ( ) 1 - SIM 2 - NÃO
RAÇA/ETNIA: ESCOLARIDADE:
OCUPAÇÃO: RENDA FAM.:
Nº FAMILIARES:
DROGAS ILÍCITAS: ( ) 1 - SIM 2 - NÃO SE 1, QUAL (IS):
ETILISTA: ( ) 1- SIM 2 - NÃO SE 1, DISCRIMINAR NATUREZA E QUANTIDADE:
CERVEJA: ( ) 1 - SIM 2 - NÃO SE 1, QTD LATAS 350mℓ:
DESTILADOS: ( ) 1 - SIM 2 - NÃO SE 1, QTD GARRAFAS 750mℓ
OUTROS: ( ) 1 - SIM 2 - NÃO SE 1, QUAL E QTD:
TABAGISTA: ( ) 1 - SIM 2 - NÃO SE 1, QTD E QTO TEMPO:
COMORBIDADES: 1 - SIM 2 -NÃO 3 - NÃO SABE
DM HAS ASMA DPOC
LEUCEMIA LES QT RECENTE OUTRAS:
ACOMPANHAMENTO DA TB E PARASITOSES INTESTINAIS
DATA DE INÍCIO DOS SINT.:
SINAIS E SINT. DA 1ª CONSULTA 1 - SIM 2 - NÃO
FEBRE SUDORESE DOR TORÁCICA DATA 1ª CONSULTA:
TOSSE DISPNÉIA DOR ABDOMINAL CEFALÉIA
TAQUIPNÉIA DIARRÉIA HEMOPTÓICOS ASTENIA
HIPOCORADO PERDA POND SE 1, QTOS Kg: OUTROS:
SINAIS E SINT. DA 2ª CONSULTA 1 - SIM 2 - NÃO
FEBRE SUDORESE DOR TORÁCICA DATA 2ª CONSULTA:
TOSSE DISPNÉIA DOR ABDOMINAL CEFALÉIA
TAQUIPNÉIA DIARRÉIA HEMOPTÓICOS ASTENIA
HIPOCORADO PERDA POND SE 1, QTOS Kg: OUTROS:
SINAIS E SINT. DA 3ª CONSULTA 1 - SIM 2 - NÃO
FEBRE SUDORESE DOR TORÁCICA DATA 3ª CONSULTA:
TOSSE DISPNÉIA DOR ABDOMINAL CEFALÉIA
TAQUIPNÉIA DIARRÉIA HEMOPTÓICOS ASTENIA
HIPOCORADO PERDA POND SE 1, QTOS Kg: OUTROS:
SINAIS E SINT. DA 4ª CONSULTA 1 - SIM 2 - NÃO
FEBRE SUDORESE DOR TORÁCICA DATA 4ª CONSULTA:
TOSSE DISPNÉIA DOR ABDOMINAL CEFALÉIA
TAQUIPNÉIA DIARRÉIA HEMOPTÓICOS ASTENIA
HIPOCORADO PERDA POND SE 1, QTOS Kg: OUTROS:
DESCRIÇÃO DO RAIO-X (Pesquisador 1) 1 - SIM 2 - NÃO
1º RAIO-X: 1)
TIPO: INFILTRADO OPACIFICAÇÃO CAVERNA
56
MISTO OUTROS:
2) EXTENSÃO: UNILATERAL BILATERAL DIFUSO
2º RAIO-X: 1)
TIPO: INFILTRADO OPACIFICAÇÃO CAVERNA
MISTO OUTROS:
2) EXTENSÃO: UNILATERAL BILATERAL DIFUSO
DESCRIÇÃO DO RAIO-X (Pesquisador 2) 1 - SIM 2 - NÃO
1º RAIO-X: 1)
TIPO: INFILTRADO OPACIFICAÇÃO CAVERNA
MISTO OUTROS:
2) EXTENSÃO: UNILATERAL BILATERAL DIFUSO
2º RAIO-X: 1)
TIPO: INFILTRADO OPACIFICAÇÃO CAVERNA
MISTO OUTROS:
2) EXTENSÃO: UNILATERAL BILATERAL DIFUSO
Conclusão do RAIO X (Pesquisador 1) 1 - SIM 2 - NÃO
Conclusão MANTIDO MELHORADO PIORADO
Conclusão do RAIO X (Pesquisador 2) 1 - SIM 2 - NÃO
Conclusão MANTIDO MELHORADO PIORADO
RESULTADOS DO BAAR (inicial) RESULTADO DO GENE Xpert (inicial)
1ª AMOSTRA: +/+3 1ª AMOSTRA: ( )Positivo ( )Negativo Se Pos Rifampicina R ( )Sim ( ) Não
2ª AMOSTRA: +/+3 2ª AMOSTRA: ( )Positivo ( )Negativo Se Pos Rifampicina R ( )Sim ( ) Não
RESULTADOS DO BAAR (1º. mês) RESULTADO DO GENE Xpert (1º. mês)
1ª AMOSTRA: +/+3 1ª AMOSTRA: ( )Positivo ( )Negativo Se Pos Rifampicina R ( )Sim ( ) Não
2ª AMOSTRA: +/+3 2ª AMOSTRA: ( )Positivo ( )Negativo Se Pos Rifampicina R ( )Sim ( ) Não
RESULTADOS DO BAAR (2º. mês) RESULTADO DO GENE Xpert (2º. mês)
1ª AMOSTRA: +/+3 1ª AMOSTRA: ( )Positivo ( )Negativo Se Pos Rifampicina R ( )Sim ( ) Não
2ª AMOSTRA: +/+3 2ª AMOSTRA: ( )Positivo ( )Negativo Se Pos Rifampicina R ( )Sim ( ) Não
RESULTADOS DO BAAR (3º. mês) RESULTADO DO GENE Xpert (3º. mês)
1ª AMOSTRA: +/+3 1ª AMOSTRA: ( )Positivo ( )Negativo Se Pos Rifampicina R ( )Sim ( ) Não
2ª AMOSTRA: +/+3 2ª AMOSTRA: ( )Positivo ( )Negativo Se Pos Rifampicina R ( )Sim ( ) Não
RESULTADOS DO EPF (INICIAL) 1 - SIM 2 - NÃO
1ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
2ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
3ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
57
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
RESULTADOS DO EPF (PÓS-TRATAMENTO/1º mês) 1 - SIM 2 - NÃO
1ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
2ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
3ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
RESULTADOS DO EPF (2º. mês) 1 - SIM 2 - NÃO
1ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
2ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
3ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
RESULTADOS DO EPF (3º. mês) 1 - SIM 2 - NÃO
1ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
2ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
58
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
3ª AMOSTRA: Ascaris lumbricoides Trichiura tricuris
Ancilostoma sp. Giardia sp.
Balantidium coli Hyminolepis sp.
Entamoeba sp. S. mansoni
Enterobius vermicularis Taenia sp.
Strongyloides sp. OUTROS: QUAL:
RESULTADOS DO TESTE DE HIV 1 - SIM 2 - NÃO
1ª AMOSTRA: REAGENTE NÃO REAGENTE
2ª AMOSTRA: REAGENTE NÃO REAGENTE
RESULTADOS DA CULTURA (inicial) 1 - POSIT 2 - NEGAT
1ª AMOSTRA:
2ª AMOSTRA:
RESULTADOS DA CULTURA (3º. mês) 1 - POSIT 2 - NEGAT
1ª AMOSTRA:
2ª AMOSTRA:
PESQUISADOR
59
ANEXO 4 – Tabelas analisadas que não entraram no artigo Tabela 1. Características gerais dos pacientes com TB e com ou sem presença de helmintíase.
Características Grupo 1
TB+ / EPF+
(n=15)
Grupo 2
TB + /EPF –
(n=38)
p-valor
Sexo masculino (%) 66,7 71,1 0.754
Idade (média) 46,2 40,0 0,156
Tabagismo (%) 20,0 36,8 0,237
Helmintíase (%) 100,0 0,0 -
Ascaris (%) 73,3 - -
Strongiloides (%) 13,3 - -
Trichuris (%) 20,0 - -
Ancylostoma (%) 6,7 - -
Enterobius (%) 0,0 - -
Tabela 3 Análise comparativa da porcentagem de subpopulações de células mononucleares sanguíneas em pacientes com Tb, TaAl, Al, e em indivíduos saudáveis..
Cellular phenotype
%
Health Subjects
Tuberculosis Tuberculosis +
Ascaris lumbricoides
Ascaris lumbricoides
P
value
n=34 n=25 n=11 n=10
Lymphocyte B
9.7 [7.2 – 13.1]
7.6 [6.5 - 12.2]
8.6 [3.4 - 13.6]
9.8 [5.0 - 11.5]
ns
Lymphocyte B1
2.9 [2.2-3.6]
3.1 [1.3 – 3.5]
2.4 [0.9 – 2.8]
3,1 [1.6 – 4.2]
ns
TCD4+
39.1 [33.7 - 45.6]
42.8 [33.9 – 44.5]
40.4 [33.4 – 46.5]
38.0 [32.4 – 41.9]
ns
TCD4CD69
3.3 [2.5 – 4.9]
4.4 [3.8-5.6]
4.0 [3.5 - 5.6]
4.1 [2.9 – 5.1] 0.03*
TCD8+
25.6 [20.3 – 30.1]
23.2 [16.9 – 27.8]
23.2 [19.3 – 32.6]
23.9 [16.5 – 36.1]
ns
TCD8CD69
4.9 [3.7 – 6.6]
6.1 [4.6 – 6.7]
6.2 [5.3 – 7.3]
5.5 [4.5 – 7.0]
ns
TReg 1.8
[1.4 – 2.3]
2.3
[1.7 – 3.3]
2.7
[1.1 – 3.4]
2.2
[1.6 – 2.6] 0,04*
TReg CTLA4
0.13 [0.11 – 0.17]
0.2 [0.2 – 0.3]
0.2 [0.1 – 0.3]
0.2 [0.1 – 0.2] 0,0009*
NK 12.8 [9.1 – 17.3]
14,3 [9.2 – 19.1]
18.1 [11.3 – 26.1]
16.3 [11.2 – 23.2]
ns
NKT 3.9 [2.7 – 5.4]
4.1 [2.7 – 5.5]
4.6 [4.0 – 6.9]
3.8 [2.5 – 5.5]
ns
CD14 5.1 [4.3 – 6.1]
6.6 [5.7 – 8.1]
5.5 [4.5 – 9.2]
5.5 [3.1 – 6.2] 0,006*
* heath subjects versus tuberculosis; the results are expressed as median [interquartil range]
60
Tabela 4: Análise comparativa das citocinas plasmáticas em pacientes com Tb, TbAl, Al, e em indivíduos saudáveis
Citocinas
%
Health Subjects
Tuberculosis
Tuberculosis +
Ascaris lumbricoides
Ascaris lumbricoides
P
value
n=34 n=25 n=11 n=10
IL-12 165.9 [158.4 – 176.2]
163 [154.4 – 170.2]
165.9 [151.6 – 174.5]
170.9 [158.0 – 178.8]
ns
IL-4 94.3 [88.3 – 100.1]
90.1 [87.2 – 100.8]
90.1 [87.2 – 127.3]
91.5 [85.8 – 93.3]
ns
IL-6
0.1 [0.0 – 0.8]
5.5 [1.9 – 11.7]
4.1 [1.7 – 8.2]
0.0 [0.0 – 0.0]
<0.0001*
MIF IL-6
121.6 [111.5 – 139.1]
298.9 [170.2 – 429.0]
266.0 [165.9 – 341.8]
125.1 [111.2 – 135.1]
<0.0001*
IL-10
55.0 [51.5 – 60.4]
58.6 [50.7 – 64.3]
50.0 [48.6 – 68.6]
55.7 [47.5 – 60.7]
ns
TNF
60.0 [55.4 – 66.1]
63.0 [56.5 – 70.0]
65.8 [60.0 – 71.5]
60.0 [59.7 – 68.3]
ns
IFN-γ 44.3 [40.0 – 48.6]
48.6 [43.6 – 55.0]
55.7 [44.3 – 67.2]
43.6 [39.7 – 51.8]
0,058
IL-17 0.0 [0.3 –9.5]
0.0 [0.0 – 0.8]
0.1 [0.0 – 7.8]
6.2 [0.7 – 14.5]
0,03*
MIF-IL17 0.0
[0.3 –9.5]
0.0 [0.0 – 0.8]
0.1 [0.0 – 7.8]
6.2 [0.7 – 14.5]
0.012
* heath subjects versus tuberculosis; the results are expressed as median [interquartil range]
61
ANEXO 5 -Instruções para os autores Revista Plos Neglected Tropical Diseases
Organization of the Manuscript
Most articles published in PLOS Neglected Tropical Diseases are organized into the
following sections: Title, Authors and Affiliations, Abstract, Author Summary, Introduction,
Methods, Results, Discussion, Acknowledgments, References, Figure Legends, and Tables.
Uniformity in format facilitates the experience of readers and users of the journal. To provide
flexibility, however, the Results and Discussion can be combined into one Results/Discussion
section. All manuscripts must contain line numbers. Although we have no firm length
restrictions for the entire manuscript, we urge authors to present and discuss their findings
concisely.
Title (150 characters)
The title should be specific to the study yet concise, and should allow sensitive and specific
electronic retrieval of the article. It should be comprehensible to readers outside your field.
Avoid specialist abbreviations if possible. Titles should be presented in title case, meaning
that all words except for prepositions, articles, and conjunctions should be capitalized. If the
paper is a randomized controlled trial or a meta-analysis, this description should be in the title.
Examples:
Climate Change and Spread of Lymphatic Filariasis in Sub-Saharan Africa
A Cluster-Randomized Controlled Trial of a Nurse-Led Deworming Program for Soil-
Transmitted Helminths
Please also provide a brief Short Title of no more than 50 characters (including spaces).
Authors and Affiliations
Provide the first names or initials (if used), middle names or initials (if used), surnames, and
affiliations—department, university or organization, city, state/province (if applicable), and
country—for all authors. One of the authors should be designated as the corresponding author.
It is the corresponding author's responsibility to ensure that the author list, and the summary
of the author contributions to the study are accurate and complete. If the article has been
submitted on behalf of a consortium, all consortium members and affiliations should be listed
after the Acknowledgments.
(For authorship criteria, see Supporting Information and Materials Required at Submission)
Abstract
The abstract succinctly introduces the paper. We advise that it should not exceed 250 – 300
words. It should mention the techniques used without going into methodological detail and
summarize the most important results with important numerical results given. The abstract is
conceptually divided into the following three sections with these headings: Background,
Methodology/Principal Findings, and Conclusions/Significance. Please do not include any
citations in the abstract. Avoid specialist abbreviations.
Author Summary
62
We ask that all authors of research articles include a 150- to 200-word non-technical summary
of the work, immediately following the Abstract. Subject to editorial review and author
revision, this short text is published with all research articles as a highlighted text box.
Distinct from the scientific abstract, the author summary should highlight where the work fits
in a broader context of life science knowledge and why these findings are important to an
audience that includes both scientists and non-scientists. Ideally aimed to a level of
understanding of an undergraduate student, the significance of the work should be presented
simply, objectively, and without exaggeration.
Authors should avoid the use of acronyms and complex scientific terms and write the author
summary using the first-person voice. Authors may benefit from consulting with a science
writer or press officer to ensure that they effectively communicate their findings to a general
audience.
Examples are available at:
Pseudogenization of a Sweet-Receptor Gene Accounts for Cats' Indifference toward Sugar
A Hybrid Photoreceptor Expressing Both Rod and Cone Genes in a Mouse Model of
Enhanced S-Cone Syndrome
Life in Hot Carbon Monoxide: The Complete Genome Sequence of Carboxydothermus
hydrogenoformans Z-2901
Introduction
The introduction should discuss the purpose of the study in the broader context. As you
compose the introduction, think of readers who are not experts in this field. Include a brief
review of the key literature. If there are relevant controversies or disagreements in the field,
they should be mentioned so that a non-expert reader can delve into these issues further. The
introduction should conclude with a brief statement of the overall aim of the experiments and
a comment about whether that aim was achieved.
Methods
This section should provide enough detail for reproduction of the findings. Protocols for new
methods should be included, but well-established protocols may simply be referenced.
Detailed methodology or supporting information relevant to the methodology can be
published on our Web site.
This section should also include a section with descriptions of any statistical methods
employed. These should conform to the criteria outlined by the Uniform Requirements, as
follows: "Describe statistical methods with enough detail to enable a knowledgeable reader
with access to the original data to verify the reported results. When possible, quantify findings
and present them with appropriate indicators of measurement error or uncertainty (such as
confidence intervals). Avoid relying solely on statistical hypothesis testing, such as the use of
P values, which fails to convey important quantitative information. Discuss the eligibility of
research participants. Give details about randomization. Describe the methods for and success
of any blinding of observations. Report complications of treatment. Give numbers of
observations. Report losses to observation (such as dropouts from a clinical trial). References
for the design of the study and statistical methods should be to standard works when possible
(with pages stated) rather than to papers in which the designs or methods were originally
reported. Specify any general-use computer programs used."
http://www.plosgenetics.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pgen.0010003#toclink1
http://www.plosgenetics.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pgen.0010011#toclink1
http://www.plosgenetics.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pgen.0010011#toclink1
63
Results
The results section should include all relevant positive and negative findings. The section may
be divided into subsections, each with a concise subheading. Large datasets, including raw
data, should be submitted as supporting files; these are published online alongside the
accepted article. The results section should be written in past tense.
As outlined in the Uniform requirements, authors that present statistical data in the Results
section, should "...specify the statistical methods used to analyze them. Restrict tables and
figures to those needed to explain the argument of the paper and to assess its support. Use
graphs as an alternative to tables with many entries; do not duplicate data in graphs and tables.
Avoid nontechnical uses of technical terms in statistics, such as "random" (which implies a
randomizing device), "normal," "significant," "correlations," and "sample." Define statistical
terms, abbreviations, and most symbols."
Discussion
The discussion should be concise and tightly argued. It should start with a brief summary of
the main findings. It should include paragraphs on the generalisability, clinical relevance,
strengths, and, most importantly, the limitations of your study. You may wish to discuss the
following points also. How do the conclusions affect the existing knowledge in the field?
How can future research build on these observations? What are the key experiments that must
be done?
Acknowledgments
People who contributed to the work, but do not fit the criteria for authors should be listed in
the Acknowledgments, along with their contributions. You must also ensure that anyone
named in the acknowledgments agrees to being so named.
Details of the funding sources that have supported the work should be confined to the funding
statement provided in the online submission system. Do not include them in the
acknowledgments.
References
Only published or accepted manuscripts should be included in the reference list. Papers that
have been submitted but not yet accepted should not be cited. Limited citation of unpublished
work should be included in the body of the text only as “unpublished data.” All “personal
communications” citations should be supported by a letter from the relevant authors.
Style information:
PLOS uses the numbered citation (citation-sequence) method and first five authors, et
al.
References are listed and numbered in the order that they appear in the text.
In the text, citations should be indicated by the reference number in brackets.
The parts of the manuscript should be in the correct order before ordering the
citations: body, boxes, figure captions, tables, and supporting information captions.
Abstracts and author summaries may not contain citations.
Journal name abbreviations should be those found in the NCBI databases:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/journals.
64
Because all references will be linked electronically as much as possible to the papers they
cite, proper formatting of the references is crucial. For convenience, a number of reference
software companies supply PLOS style files (e.g., Reference Manager, EndNote).
Published Papers
1. Hou WR, Hou YL, Wu GF, Song Y, Su XL, et al. (2011) cDNA, genomic sequence
cloning and overexpression of ribosomal protein gene L9 (rpL9) of the giant panda
(Ailuropoda melanoleuca). Genet Mol Res 10: 1576-1588.
Note: Use of a DOI number for the full-text article is acceptable as an alternative to or in
addition to traditional volume and page numbers.
Accepted, unpublished papers
Same as above, but “In press” appears instead of the page numbers.
Electronic Journal Articles
1. Huynen MMTE, Martens P, Hilderlink HBM (2005) The health impacts of globalisation: a
conceptual framework. Global Health 1: 14. Available:
http://www.globalizationandhealth.com/content/1/1/14. Accessed 25 January 2012.
Books
1. Bates B (1992) Bargaining for life: A social history of tuberculosis. Philadelphia:
University of Pennsylvania Press. 435 p.
Book Chapters
1. Hansen B (1991) New York City epidemics and history for the public. In: Harden VA,
Risse GB, editors. AIDS and the historian. Bethesda: National Institutes of Health. pp. 21-28.
Figure Legends
The aim of the figure legend should be to describe the key messages of the figure, but the
figure should also be discussed in the text. An enlarged version of the figure and its full
legend will often be viewed in a separate window online, and it should be possible for a
reader to understand the figure without switching back and forth between this window and the
relevant parts of the text. Each legend should have a concise title of no more than 15 words
that can stand alone, without the use of figure part labels. The overall legend itself should be
succinct, while still explaining all figure parts, symbols, and abbreviations. Avoid lengthy
descriptions of methods.
Tables
All tables should have a concise title. Footnotes can be used to explain abbreviations.
Citations should be indicated using the same style as outlined above. Tables should not
occupy more than one printed page; larger tables can be published as online supporting
information. Tables must be cell-based; do not use picture elements, text boxes, tabs, or
returns in tables. Please ensure that the files conform to our Guidelines for Figure and Table
Preparation when preparing your tables for production.
Tables should be placed at the end of the manuscript file, rather than uploaded separately into
the submission system.
Multimedia Files and Supporting Information
We encourage authors to submit essential supporting files and multimedia files along with
their manuscripts. All supporting material will be subject to peer review, and should be
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smaller than 10 MB in size because of the difficulties that some users will experience in
loading or downloading files of a greater size.
Supporting files should fall into one of the following categories: Dataset, Figure, Table, Text,
Protocol, Audio, or Video. All supporting information should be referred to in the manuscript
with a leading capital S (e.g., Figure S4 for the fourth supporting information figure). The
numbered title and caption for each supporting information file should be included in the
main article file, after the titles and captions for the main figures.
Supporting files may be submitted in a variety of formats, but should be publication-ready, as
these files are not copyedited. Carefully consider whether your supporting information needs
to be searchable and/or editable, and choose the most suitable format accordingly. See the
Supporting Information Guidelines for more details about our requirements for supporting
information and multimedia files.
