UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL Dr. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E DA BIOLOGIA MOLECULAR DA

HEPATITE B EM TRÊS COMUNIDADES DA AMAZÔNIA OCIDENTAL

BRASILEIRA

MÁRCIA DA COSTA CASTILHO

MANAUS

2012

MÁRCIA DA COSTA CASTILHO

ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E DA BIOLOGIA MOLECULAR DA

HEPATITE B EM TRÊS COMUNIDADES DA AMAZÔNIA OCIDENTAL

BRASILEIRA

Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Prof. Dr. Wornei Silva Miranda Braga

Co-Orientadora: Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira

MANAUS

2012

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus amados pais Maria Odete e Mario Castilho,

meu irmão Eduardo Castilho, e queridos sobrinhos André Thiago, Igor e Giovanni,

e a minha filha Yasmin Castilho Barbosa da Silva - essência da minha vida.

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, com Ele tudo é possível.

A Universidade do Estado do Amazonas, em proporcionar o Curso de Pós-

graduação em Medicina Tropical.

A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, meu trabalho,

minha segunda casa, pelo apoio em promover o curso de Pós-graduação em

Medicina Tropical/UEA/FMT-HVD, na pessoa da Dra. Maria das Graças Costa

Alecrim e Servidores.

A SUFRAMA e FAPEAM por incentivar a Educação, e no fomento a

Pesquisa no Estado do Amazonas.

Ao Professor Dr. Wornei Silva Miranda Braga, meu orientador, pela ajuda

inestimável, confiança, incentivo e, sobretudo a amizade. Minha sincera gratidão.

A Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira, pela orientação, ajuda nas técnicas de

biologia molecular, cumplicidade e amizade.

Aos Docentes do Programa Pós-graduação em Medicina

Tropical/UEA/FMT-HVD, pela formação acadêmica.

Aos meus colegas de Turma: Marlúcia Garrido, Jorge Leão, Carolina Talhari

e Mariana Broke, pela amizade e bons momentos durante o curso.

Aos meus colegas da Gerência de Virologia: Maria Paula Mourão, Michele

Bastos, Regina Figueiredo, João Bosco Gimaque, Liane Calado, Elizabeth

Galusso, Evaulino Itapirema, e do Laboratório de Endemias: Heline Vasconcelos,

pelo apoio, convivência e torcida.

Os Professores Dr. Cristovão Alves, Dr. Felipe Naveca, Dr. Jorge Guerra e

Sinésio Talhari, que gentilmente contribuíram com críticas e sugestões para o

enriquecimento deste trabalho.

Aos Professores Rajendranath Ramasawmy e Kátia Cavalcante, pela ajuda

e sugestões na confecção dos artigos.

iv

Aos Profissionais da Saúde de Lábrea: Farmacêutica-Bioquímica Maria do

Socorro Silva, Dr. Gabriele Lonardi, Enf. Aruzzo, Manoel Queiroz e Leandra Leal,

pela alegria e entusiasmo na execução das atividades de campo.

A Dom Jesús, Bispo Prelado de Lábrea, pela cessão da embarcação e

tripulação do “Laguna Negra”, que nos permitiu navegar com segurança e

tranquilidade pelo curso sinuoso de águas-brancas do rio Purus.

Aos cidadãos do Município de Lábrea, pela acolhida, em especial as

pessoas das comunidades ribeirinhas do Madeirinho, Sumaúma e Praia do

Buraco, que na sua simplicidade e esperança, permitiram a realização da

pesquisa.

v

EPÍGRAFE

Na procura de conhecimentos, o primeiro passo é o silêncio, o segundo ouvir, o terceiro relembrar, o quarto praticar e o quinto ensinar aos outros.

Provérbio Judaico

vi

RESUMO

A hepatite B é considerada a principal patologia hepática no mundo, e uma das doenças infecciosas mais desafiadoras à saúde pública mundial, causando elevados índices de morbidade e mortalidade, em decorrência de patologias relacionadas à evolução da infecção crônica pelo vírus da hepatite B (VHB). No Brasil, atualmente o Ministério da Saúde estima que 15% da população já teve contato com o VHB, e os casos crônicos, devem corresponder a 1% da população brasileira. A região Amazônica, há tempos, é caracterizada como uma das regiões do mundo de maior ocorrência de infecção pelo VHB, e suas sequelas. Estudos realizados no estado do Amazonas abordavam taxas de até 18% da prevalência de portadores do HBsAg (antígeno de superfície do VHB) e do anti-HBc total (anticorpos contra o antígeno do “core” do VHB), alcançava taxas, também elevadas de 52,1%, principalmente nas calhas dos rios Juruá, Purus e médio Solimões regiões. No Brasil, a vacinação contra o VHB foi iniciada em setembro de 1989, no mesmo município de Lábrea, em crianças até nove anos de idade e profissionais de saúde passando, então a fazer parte do calendário de vacinação em todo o Estado. Estudos recentes mostram que 19 anos, após a vacinação, as taxa de prevalência diminuíram, entretanto, ainda alcançam índices elevados, principalmente entre aqueles indivíduos procedentes de áreas rurais. Neste cenário o estudo teve como objetivos: a) determinar a prevalencia de infecção pela presença dos marcadores sorológicos; b) os aspectos da biologia molecular do VHB; c) e os fatores de risco para a infecção e da transmissão do VHB. Foram avaliados 225 indivíduos de três comunidades rurais, na calha do rio Purus, município de Lábrea, Amazônia ocidental brasileira: 115 (51.1%) na comunidade Madeirinho; 59 (26.2%) na Praia do Buraco e 51 (22.7%) em Samaúma. Do total, 121 (53.8%) pertenciam ao gênero masculino; média de idade de 21,3% (1 a 78 anos), e mediana de 15 anos. 79.1 % (IC 95% 78,50-79,70) tinham evidências de infecção prévia, 23/225 (10,2 %, IC 95% 8,96-11,44) eram reativos para o HBsAg. Entre estes, a prevalência do HBeAg (antígeno "e" do VHB) foi 47.8 % (11/23), e a média de idade era de 10,8 anos (1–36 anos). Em 57 amostras reativas somente para o anti-HBc T, o DNA-VHB foi isolado, quantificado a carga viral pela PCR em tempo real. O gene S foi amplificado pela PCR e as sequências nucleotídicas obtidas pelo sequenciado direto. Em 15/23 sequências foi possível classificar os genótipos do VHB: 14 no genótipo F, em 13 no subgenótipo F/F2a, e apenas 1 no genótipo D. No gene S, no domínio da transcriptase reversa (rt) foi identificado um padrão polimórfico ( rtE11Q + rtH13Y + rtM129L + rtS137T), na maioria das sequencias, entretanto não foi detectado mutações na região do determinante “a”, associado a expressão do HBsAg. A taxa de prevalência total encontra foi alta, entretanto não foi evidenciada a infecção B oculta na população do estudo, o que sugere uma baixa prevalência. A análise dos fatores de risco indica que o VHB é transmitido principalmente horizontalmente, no meio famíliar, de um portador crônico "ativo" (HBeAg-positivo), com baixa idade, sendo estes os potenciais reservatórios do VHB, e que mantêm os bolsões de infecção e, também uma forte possibilidade da ocorrência da transmissão vertical. O genótipo F/F2a foi predominante, com padrão de polimorfismos característico, descrito pela primeira vez, o que também reforça a transmissão familiar do VHB, nesta região.

Palavras chaves: Hepatite B. VHB. Prevalência. Epidemiologia molecular. Amazônia

vii

ABSTRACT

Hepatitis B, the main liver disease worldwide, is one of the most challenging infectious diseases to public health world, causing high morbidity and mortality due to patients progression to chronic infection with hepatitis B virus (HBV). In Brazil, the Ministry of Health estimates that 15% of the population may have contact with HBV and the thus should correspond to 1% of the population. The Amazon region has long been characterized, as one of the world regions, with the highest HBV of infection and its sequelae. Several studies showed that the state of Amazonas the prevalence rates of up to 18% of HBV carriers (HBV surface antigen) and up to 52.1% for the anti-HBc (antibodies against the antigen of the "core" of HBV), mainly in the riverines of the Juruá, Purus and Solimões regions. In Brazil, vaccination against HBV was initiated in September 1989 in the city of Lábrea in children up to 9 years old and healthcare, and then in the entire state. Recent studies showed, 19 years after vaccination, the prevalence rate has declined, but is still high among individuals of rural areas. Thus the aim of the study was: a) determine the prevalence of infection by the presence of serological markers, b) molecular characterization of HBV, c) and risk factors for infection and transmission of HBV. We evaluated 225 individuals from three rural communities in the valley of the Purus river, municipality of Lábrea, western Brazilian Amazon: 115 (51.1%) in the community Madeirinho, 59 (26.2%) in Praia do Buraco and 51 (22.7%) in Samaúma. Of the total, 121 (53.8%) were male, mean age 21.3% (1-78 years), and median 15 years. 79.1% (95% CI 78.50 to 79.70) had evidence of prior infection, 23/225 (10.2%, 95% CI 8.96 to 11.44) were reactive for HBsAg. Among these, the prevalence of HBeAg ("e" antigen of HBV) was 47.8% (11/23), and the mean age was 10.8 years (1-36 years). In 57 samples only reactive for anti-HBc T, HBV-DNA was isolated and the viral load by real-time PCR. The S gene was amplified by PCR and the sequenced. In 15/23 sequences, it was possible to determinate the HBV genotype. 14 were of F, 13 of subgenotype F/F2a, and 1 of genotype D. In S gene, encoding the reverse transcriptase (rt) region this polymorphic pattern (rtE11Q + rtH13Y + rtM129L + rtS137T) was identified sequences, However no mutations in the region determinant "a" associated with expression of HBsAg were described. The overall prevalence rate is high. Of those, we did not observe the hidden B infection, which suggests a low prevalence. The analysis of risk factors indicates that HBV is transmitted primarily horizontally, in the family, a chronic carrier "active" (HBeAg-positive), low age, these potential reservoirs of HBV, and keeping the pockets of infection and also a strong possibility of the occurrence of vertical transmission. The genotype F/F2a was predominating, with a characteristic pattern of polymorphisms, described for the first time, reinforcing the familial transmission of HB, in this region. Keywords: Hepatitis B. HBV. Prevalence. Molecular epidemiology. Amazon

viii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Padrões de endemicidade da infecção pelo vírus da hepatite

B ................................................................................................

04

TABELA 2. Estimativas das prevalências de anti-HBc e HBsAg e seus

respectivos intervalos de confiança (IC 95%) e endemicidade

de hepatite B para o conjunto das capitais de cada região e

Distrito Federal ..........................................................................

07

TABELA 3. Modelo classificatório, adotado pelo estudo, para as amostras

dos indivíduos submetidas aos testes sorológicos....................

28

TABELA 4. Seqüências dos oligonucleotídeos pré-selecionados................ 29

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Distribuição geográfica da infecção crônica pelo HBV.............

03

FIGURA 2. Distribuição da infecção pelo VHB no Brasil, 1999..................

07

FIGURA 3. Micrografia eletrônica de formas de partículas do VHB no

sangue......................................................................................

09

FIGURA 4. Desenho esquemático da partícula infecciosa do VHB............

10

FIGURA 5. Esquema da organização genômica do VHB.........................

11

FIGURA 6. Representação linear do genoma do HBV apresentando as

fases de leitura aberta (setas largas) e os produtos proteicos

correspondentes.......................................................................

13

FIGURA 7. Esquema do ciclo replicação do vírus da hepatite B no

hepatócito.................................................................................

17

FIGURA 8. Localização do município de Lábrea, no mapa do Estado do

Amazonas.................................................................................

25

FIGURA 9. Fluxograma para os testes laboratoriais...................................

35

x

LISTA DE ABREVIATURAS

a.C. Antes de Cristo

ALT Alanina aminotransferase

Anti-HBc Anticorpo contra o HBcAg

Anti-HBe Anticorpo contra o HBeAg

Anti-HBs Anticorpo contra HBsAg

Anti-HCV Anticorpo contra VHC

Anti-HDV Anticorpo contra VHD

AuAg Antígeno Austrália

C Citosina

cccDNA Covalente Circular DNA

CDC Centro de Controle de Doenças

CHC Carcinoma hepatocelular

CV Carga viral

DF Distrito Federal

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTP Desoxinucleotídeo

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ELISA Teste imunoenzimático

EUA/USA Estados Unidos da América

FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

G Guanidina

FAPEAM Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas

FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

GEHEP Grupo de Estudos das Hepatites

HBcAg Antígeno do nuclocapsídeo do vírus da hepatite B

HBeAg Antígeno “e” do vírus da hepatite B

HBsAg Antígeno de superfície do vírus da hepatite B

HBx Proteína “x”do Vírus da Hepatite B

xi

HCl Ácido clórico

HBIG Imunoglobulina humana contra o vírus B

IC Intervalo de confiança

Kb Kilo bases

Km2 Quilômetros quadrados

L Lisina - aminoácido

M Molar

M Metionina - aminoácido

mg Miligramas

MgCl2 Cloreto de magnésio

mL Mililitros

mM Milimolar

NaOH Hidróxido de sódio

ng Nanograma

nm Nanômetro

Nt Nucleotídeos

OMS Organização Mundial da Saúde

OPAS Organização Panamericana de Saúde

pb Pares de bases

PCR Reação em cadeia da polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

pmol Picomol

Pol Polimerase

qRT-PCR PCR em tempo Real quantitativo

RNA Ácido ribonucléico

SUFRAMA Superintendência da Zona Franca de Manaus

TBE Tampão Tris/Borato/EDTA

Tm Temperatura de fusão ou o melting T

Tris Tampão tris (hidroximetil) aminometano - (HOCH2)3CNH2

™ Marca registrada, do inglês Trade mark

UI Unidades Internacionais

xii

V Volt – tensão elétrica

V Valina

VHA/HAV Vírus da hepatite A

VHB/HBV Vírus da hepatite B

VHC/HCV Vírus da hepatite C

VHD/HDV Vírus da hepatite C

YMDD Seqüência de aminoácidos tirosina, metionina, ácido aspártico e ácido aspártico

xiii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................

01

1.1 A Doença........................................................................................................ 01 1.2 Aspectos epidemiológicos.............................................................................. 02 1.3 Modos de transmissão.................................................................................... 07 1.4 O Vírus da hepatite B...................................................................................... 08 1.4.1 Estrutura molecular do VHB........................................................................... 08 1.4.2 Proteínas virais............................................................................................... 11 1.4.3 Variabilidade genética e mutações................................................................. 13 1.4.4 Replicação do VHB......................................................................................... 16 1.5 A Carga viral................................................................................................... 18 1.6 A infecção oculta pelo VHB............................................................................ 20 2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 23 2.1 Geral............................................................................................................... 23 2.2 Específicos...................................................................................................... 23 3 METODOLOGIA ...................................................................................................... 24 3.1 Modelo de estudo........................................................................................... 24 3.2 Local de estudo e descrição da área.............................................................. 24 3.3 Definição dos sujeitos da investigação........................................................... 25

3.3.1 População de estudo...................................................................................... 25 3.3.2 Tamanho da amostra...................................................................................... 25 3.3.3 Critérios de inclusão....................................................................................... 26 3.3.4 Critérios de exclusão...................................................................................... 26 3.4 Procedimentos................................................................................................ 26 3.4.1 Coleta de informação e consentimento.......................................................... 26 3.4.2 Coleta, procedimento e armazenamento de amostra biológica...................... 26 3.5 Diagnóstico laboratorial.................................................................................. 27 3.5.1 Determinação e classificação sorológica dos participantes........................... 27 3.5.2 Detecção qualitativa do DNA-VHB................................................................. 28 3.5.2.1 Extração do DNA a partir do plasma sanguíneo............................................. 28 3.5.2.2 Seleção de oligonucleotídeos para a PCR e PCR em tempo real................. 29 3.5.3 Reação da polimerase em cadeia.................................................................. 30 3.5.3.1 Avaliação eletroforética dos produtos de amplificação................................... 31 3.5.4 Sequenciamento direto................................................................................... 32 3.5.4.1 Análise das seqüências.................................................................................. 32 3.5.5 Reação da polimerase em cadeia em tempo real.......................................... 33

xiv

3.5.5.1 Curvas de dissociação.................................................................................... 34 3.5.5.2 Detecção quantitativa do DNA-VHB .............................................................. 34 3.6 Análise dos dados........................................................................................... 36 3.7 Instituições participantes................................................................................. 36 3.8 Certificado de Aprovação no Comitê de Ética e Pesquisa............................. 36 4 RESULTADOS .........................................................................................................

38

4.1 Artigo 1 aceito ................................................................................................ 38 4.2 Artigo 2 para submissão ................................................................................ 45 4.3 Artigo 3 para submissão ................................................................................ 53

5 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 69 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 70 7 ANEXOS .................................................................................................................. 80 7.1 Termo de Consentimento............................................................................... 86 7.2 Questionário.................................................................................................... 88 7.3 Certificados de Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa......................... 90 7.4 Errata do Artigo 1 ........................................................................................... 93 7.5 Depósito das sequências nucleotídicas no GenBank..................................... 94 7.6 Análises pelos algoritmos HBVSeq e HepSEQ.............................................. 97 7.7 Genotipagem do VHB pelo NCBI ................................................................... 161

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 A Doença

A hepatite B é considerada a principal patologia hepática no mundo. A infecção

pelo vírus da hepatite B (VHB) pode induzir várias alterações hepáticas agudas,

variando de hepatite sub-clínica à fulminante, e doenças crônicas, como hepatite

persistente inativa, hepatite crônica ativa, cirrose hepática e carcinoma hepatocelular

(CHC). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), três quartos da

população mundial vivem em áreas onde as taxas de infecção crônica superam 2%.

Estima-se que um terço da população mundial (cerca de dois bilhões de pessoas) foi

infectada pelo VHB e aproximadamente 400 milhões de pessoas encontram-se

infectadas cronicamente (2, 3).

Apesar da disponibilidade, eficácia e segurança das vacinas existentes desde

1982, a hepatite B permanece como uma das patologias infecciosas mais

desafiadoras à saúde pública mundial, ainda causando elevados índices de

morbidade e mortalidade. A cada ano, estima-se que acima de um milhão de

pessoas morrem em decorrência de patologias relacionadas à evolução da infecção

crônica pelo VHB, sendo a hepatite B considerada a sétima entre todas as causas

de óbitos no mundo (6). Em 15 a 40% dos pacientes crônicos constata-se evolução

para cirrose, descompensação hepática ou CHC. Dentre um milhão de novos casos

anuais de CHC estimados, 82% são atribuídos a hepatites virais e a maioria

diretamente associada ao VHB, correspondendo a aproximadamente 75% dos casos

de CHC, que apresenta grande risco de morte e constituem um reservatório de

indivíduos infectados por serem portadores do vírus em replicação (3, 7-10).

A história das hepatites vem dos primórdios da civilização. Tem-se notícia de

surtos de icterícia na Babilônia, há mais de 2500 anos, e Hipócrates (século IV a.C.)

faz referência nos seus escritos à icterícia epidêmica. Já a confirmação da existência

de uma forma de hepatite de transmissão parenteral foi documentada por Lüdman

em 1885, durante um surto epidêmico ocorrido em Bremen, na Alemanha, após a

vacinação antivaríola, que supostamente havia sido contaminada. Este achado foi

confirmado por MacCallum, na Inglaterra, que conduziu estudos da transmissão em

voluntários, demonstrando a transmissão oral da hepatite infecciosa e a transmissão

2

parenteral da hepatite sérica nos voluntários. É a este investigador que se deve a

introdução, em 1947, dos termos hepatite A e B, para as hepatites infecciosa e

sérica, respectivamente (11).

No entanto, ainda não havia sido esclarecido a questão da etiologia das

hepatites, e inesperadamente Blumberg e colaboradores, em 1963, investigando

anticorpos contra lipoproteínas séricas em pacientes politransfundidos, evidenciaram

um novo antígeno, denominado “Antígeno Austrália” (AuAg), por ter sido encontrado

no soro de um aborígene australiano (12). A identificação do antígeno Austrália foi

um passo importante na compreensão e diagnóstico das hepatites virais, sendo, em

1976 agraciado com o Premio Nobel de Medicina. A hepatite B foi estabelecida em

1968, quando comparado o antígeno AuAg com partículas virais esféricas e

cilíndricas isoladas do soro de indivíduos infectados, por meio da microscopia

eletrônica (11).

Em 1970, em Londres, o australiano Dane, demonstrou a existência de uma

terceira partícula, de forma esférica, em soro antígeno positivo, a partícula Dane,

que se comprovou corresponder ao próprio vírus. Dane e colaboradores (1970),

descreveram pela primeira vez a partícula viral íntegra do VHB (esferas de 42nm).

Posteriormente, foi confirmado que a camada mais externa da partícula viral

continha um antígeno idêntico ao AuAg e denominado como HBsAg (8, 11, 13).

1.2 Aspectos epidemiológicos

No mundo, o índice de prevalência de infecção pelo VHB divide as áreas

geográficas em três categorias distintas: alta endemicidade (>8%); média

endemicidade ou intermediária (2 – 7%) e baixa endemicidade (<2%) (Figura 1). Nas

áreas que correspondem à região de alta endemicidade o índice de portadores do

VHB alcança até 20%, Sudeste Asiático, África Sub-Sahariana, regiões do Pacífico

Sul, Alasca e Amazônia Ocidental, a infecção se dá geralmente por transmissão

vertical ou na infância e, horizontalmente antes dos cinco anos de idade, por

mecanismos ainda não bem definidos, provavelmente relacionados às

características ambientais como a possibilidade de transmissão por insetos

hematófagos ou a hábitos culturais da população, que levem a contato com sangue

de um indivíduo portador (14-21). Estima-se que essas regiões de elevada

3

endemicidade contribuam com mais de 90% dos casos mundiais, sendo o VHB

implicado como importante fator etiológico de hepatite crônica, cirrose hepática e

hepatocarcinoma (6, 22, 23). Nas áreas de prevalência intermediária, a transmissão

ocorre em todas as idades, embora a infecção na primeira infância seja responsável

pela manutenção de altas taxas de infecção crônica. Nas de baixa endemicidade a

infecção, em geral, ocorre na vida adulta onde a transmissão sexual e percutânea

assume uma importância significativa (7, 24).

Figura 1: Distribuição geográfica da infecção crônica pelo HBV, adaptado

Fonte: www.cdc.gov/ncidod/diseases/hepatitis/slideset/hep_b/slide_9.htm

4

Tabela 1 – Padrões de endemicidade da infecção pelo vírus da hepatite B

Característica

Endemicidade da Infecção

Baixa (%) Intermediária

(%)

Alta (%)

Prevalência de Infecção

Crônica (HBsAg +)

0,1 – 1 1 – 7 > 8

Prevalência de Infecção

Prévia (anti-HBc +)

5 – 7 10 – 60 70 – 90

Risco de Infecção < 20 20 – 60 > 60

Infecção Perinatal (até 1

ano de idade)

Rara

< 10

Incomum

10 – 60

Comum

> 20

Infecção na Primeira

Infância (1 a 5 anos)

Rara

< 10

Comum

10 – 60

Muito Comum

> 60

Infecção na Idade

Adulta/Adolescência

Muito Comum

70 – 90

Comum

20 – 50

Incomum

10 – 20

Fonte: França, 2005 (25), adaptado de Alter, 2003 (7) e Tanaka, 2000 (24)

Para o Brasil, estimava-se que 15% da população já teria tido contato com o

VHB e os casos crônicos deveriam corresponder a cerca de 1% da população. A

maioria das pessoas desconhece seu estado de portador e constituem elo

importante na cadeia de transmissão do VHB, o que perpetua a doença (4, 26).

Estudos realizados entre as décadas de 80 e 90 indicavam uma alta

prevalência do VHB na região Norte. Assim como convencionado, considerava-se

que ocorriam três padrões de distribuição da hepatite B: alta endemicidade, com

prevalência superior a 7%, presente na região Amazônica; algumas localidades do

Espírito Santo e oeste de Santa Catarina; endemicidade moderada, com prevalência

entre 2 e 7%, nas regiões Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste e baixa endemicidade,

com prevalência abaixo de 2% na região Sul do país (Figura 2) (27).

5

A região amazônica, há tempos, é caracterizada como uma das regiões do

mundo de maior ocorrência de hepatite pelo vírus B e suas seqüelas (16, 28-36). No

Estado do Amazonas, as calhas dos rios Juruá, Purus e médio Solimões são

consideradas as regiões de maior endemicidade (14, 37-41). Desde o final dos anos

60, uma forma de insuficiência hepática grave é descrita pelo nome de Febre Negra

de Lábrea, devido ao primeiro relato da ocorrência desse tipo de hepatite fulminante

referir essa cidade (40, 42).

No Brasil, a vacinação contra o VHB foi iniciada em setembro de 1989, na

cidade de Lábrea, logo se estendendo a mais de dez municípios dos rios Purus

(Canutama, Pauini, Tapauá e Boca do Acre), Juruá (Eirunepé, Carauari, Itamarati e

Envira) e médio Solimões (Coari e Codajás) (43). Foram vacinadas, sob a

coordenação daquela primeira campanha, crianças menores de 10 anos de idade e

profissionais de saúde, com três doses de vacina recombinante – que passou a

fazer parte do calendário de vacinação em todo o Estado do Amazonas, a partir de

1992 (44).

Anteriormente à introdução da vacina contra hepatite B na região, a

prevalência de portadores do HBsAg (antígeno de superfície do VHB) variava de

15,3%, em Lábrea (37) a 18,3% em Itamarati e 15,5% em Codajás (41). A

prevalência de anti-HBc total (anticorpos contra o antígeno do “core” do VHB)

alcançava taxas bastante elevadas, como 52,1% em Lábrea (37), 71,4% em

Itamarati e 62,5% em Codajás(41); e as taxas de prevalência do vírus da hepatite D

(VHD) em indivíduos com reatividade para o HBsAg era relatada em torno de 32%

(16, 40, 45).

Reduções significativas nas taxas de prevalência de marcadores do VHB

ocorreram em países que introduziram a vacina contra hepatite B em seus

programas nacionais de imunização (46, 47). Em Taiwan, por exemplo, a taxa de

prevalência de portadores do HBsAg caiu de 9,8%, em 1984, para 4,8% em 1989 e

1,3% em 1994 (48).

No estudo realizado na cidade de Eirunepé, vale do rio Juruá, Amazônia

Ocidental, no ano seguinte à vacinação em massa, os autores, após avaliarem

casos de hepatite aguda, sugeriam que o vírus da hepatite B continuava circular

6

entre indivíduos menores de dez anos de idade, inclusive crianças vacinas

adequadamente (44).

Em outro estudo, na cidade de Itamarati, vale do rio Juruá, sete anos após a

introdução da vacina, os autores estimaram a prevalência de marcadores do VHB e

do VHD. Apesar do registro de dificuldades em razão do tamanho da amostra, foi

encontrada uma prevalência de 7% para portadores do HBsAg e de 83,3% para a

presença do anti-HBc total, e de 22,2% para o anti-HD (anticorpo contra o antígeno

do vírus da hepatite D) entre indivíduos reativos para qualquer marcador do VHB.

Esses resultados sugerem redução significativa dessas taxas na região, ainda que

continuem bastante superiores às relatadas em outras regiões do país (36).

No início desta década o Ministério da Saúde em convênio com a

Universidade de Pernambuco e a Organização Panamericana da Saúde (OPAS)

vem conduzindo junto a pesquisadores de Universidade Federais, Estaduais e de

Secretarias Estaduais e Municipais de Saúde, o inquérito nacional de base

populacional nas capitais brasileiras, sobre as infecções pelos vírus das hepatites A,

B e C (27).

Os dados parciais mostram que o país está em melhores condições, do que

apontavam as estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a doença.

Diferentemente do que essa instituição estimava, o país tem baixa prevalência para

a hepatite B crônica. Isto é, menor que 2%. Os dados revelam que, no geral 7,44%

da população do conjunto das capitais brasileiras e do Distrito Federal (DF), entre 10

a 69 anos já tiveram contato com o VHB (10 a 19 anos: 1,14% e de 20 a 69 anos:

11,5%). Desses, 0,37% da população pesquisada, em torno de 127 mil pessoas,

eram portadores do VHB (10 a 19 anos: 0,055%; 20 a 69 anos: 0,6% e 10 a 69 anos:

0,37%). Outro importante aspecto revelado pela pesquisa são as diferenças

regionais. A prevalência do marcador sorológico HBsAg, em adultos, varia muito de

acordo com as regiões do país. Vai de 0,4% no Sudeste a 0,92% no Norte (Tabela

2) (49).

7

Tabela 2 - Estimativas das prevalências de anti-HBc e HBsAg e seus respectivos

intervalos de confiança (IC 95%) e endemicidade de hepatite B para o conjunto das

capitais de cada região e Distrito Federal

1.3 Modos de transmissão

O período de incubação situa-se entre 45 a 180 dias e a transmissão do VHB

é usualmente por via parenteral, e, sobretudo, pela via sexual, sendo considerada

uma doença sexualmente transmissível. Dessa forma, a hepatite B pode ser

Figura 2: Distribuição da infecção pelo VHB no Brasil, 1999 Fonte: Silveira et al., 1999(1) ; Souto et al., 1999 (4)

8

transmitida por solução de continuidade (pele e mucosa), relações sexuais

desprotegidas e por via parenteral (compartilhamento de agulhas seringas,

tatuagens, piercings, procedimentos odontológicos ou cirúrgicos, etc). Outros

líquidos orgânicos, como sêmen, secreção vaginal e leite materno, também podem

conter o vírus e constituir-se fonte de infecção. A transmissão vertical (de mãe para

filho) também é causa freqüente de disseminação do VHB em regiões de alta

endemicidade (50). Outros fluidos potencialmente infectantes são: líquido

cefalorraquidiano, líquido sinovial, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido

pericárdico e líquido amniótico. Os fluidos não potencialmente infectantes são as

fezes, urina, suor, lágrimas, saliva e vômito. Desde que não estejam contaminados

com sangue, estes fluidos contêm grandes quantidades de partículas de HBsAg mas

poucas partículas víricas infecciosas, o que os torna pouco eficazes na transmissão

da doença (51).

O vírus da hepatite B pode manter-se em superfícies, no ambiente externo, à

temperatura ambiente, por períodos longos, por sete ou mais dias. A inativação se

dá pela elevação da temperatura (fervura por 10 minutos), ou associado à elevação

da pressão em autoclave a 121ºC por 15 minutos ou por calor seco a 160ºC, durante

uma hora. Também podem ser utilizadas substâncias químicas como o hipoclorito

de sódio a 1%, durante 30 minutos, ou formaldeído aquoso a 16% durante duas

horas ou ainda pelo óxido de etileno, na esterilização a gás (52) Com relação ao

plasma infectado, este poderá ser inativado, aquecendo-o a 60ºC, por 5 horas (53).

1.4 O Vírus da hepatite B

O vírus da hepatite B é classificado como membro da família Hepadnaviridae

e gênero Orthohepadnavirus. Todos os membros da família são hepatotrópicos e

compartilham características estruturais e funcionais. Os demais membros do

gênero Orthohepadnavirus infectam mamíferos como marmotas, esquilos e

macacos. Além do homem, o VHB somente é transmissível aos chimpanzés. (8, 13,

54).

1.4.1 Estrutura molecular do VHB

O vírus da hepatite B diferencia-se de outros vírus humanos por encontrar-se

um vasto excesso de partículas subvirais referente ao título viral no soro dos

9

indivíduos infectados. Estas partículas (Figura 3), que consistem somente das

proteínas superficiais do vírus e pequenas quantidades de lipídios, apresentam-se

esféricas (20-22 nm de diâmetro) ou filamentosas (20-22 nm de diâmetro e

comprimento variável) e podem ser encontradas em quantidades que podem atingir

1014 partículas/mL (1 mg/mL). O vírion apresenta-se esférico (partículas com 42 –

47nm) e possui uma bicamada superficial, sendo a mais externa constituída pelo

envelope viral e a mais interna pelo nucleocapsídeo de forma icosaédrica (Core),

contendo uma DNA polimerase RNA dependente - ou seja, uma transcriptase

reversa - (Figura 4) (54, 55).

Nos vírions, o genoma apresenta-se circular, constituído por uma fita circular

parcialmente dupla de DNA e associado a DNA polimerase. O vírus da hepatite B

apresenta um dos menores genomas dentre os vírus conhecidos (3 -3,3 kb) e a

numeração da seqüência nucleotídica baseia-se no sítio de clivagem da enzima de

restrição EcoRI ou em sítios homólogos, caso o sítio da EcoRI esteja ausente.

Outros métodos de numeração também são empregados, baseados no códon inicial

da proteína Core ou na primeira base do RNA pré-genômico (54, 55).

Figura 3: Micrografia eletrônica de formas de partículas do VHB no sangue

Fonte: Liang, 2009 (5)

O genoma é constituído de uma fita de polaridade negativa (cadeia - / “anti-

senso”) longa apresentando extremidades 5´ e 3´ definidas, completa e codificante,

10

e outra fita de polaridade positiva (cadeia +/ “senso”) mais curta – incompleta e não

codificante (Figura 4). Em virtude do modo de maturação do genoma, a porção N-

terminal da polimerase viral é encontrada ligada à extremidade 5´ da fita negativa.

Portanto, a fita negativa não é covalentemente fechada. A estrutura circular em

dupla hélice é gerada pela existência de complementaridade entre a extremidade 5’

de ambas as cadeias – denominadas DR1 e DR2. In vivo, as partículas do HBV são

secretadas das células infectadas antes que a fita dupla esteja completa, restando

uma região DNA de fita simples nos capsídeos maduros (54, 55).

Figura 4: Desenho esquemático da partícula infecciosa do VHB

Fonte: http://viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/9.html

São identificadas quatro regiões de leitura principais (Open Reading Frames -

ORF) ou genes que codificam as diferentes proteínas virais: Pré-C/C, Pol, S e X,

definidas e sobrepostas parcialmente no genoma viral, que resultam na transcrição e

tradução de sete diferentes proteínas (Figuras 4 e 5), através da utilização de

códons iniciais variáveis. Todos os pares de bases no genoma do VHB estão

envolvidos na codificação de, no mínimo, uma proteína viral. O genoma ainda

apresenta elementos genéticos sobrepostos às regiões codificantes que regulam os

níveis de transcrição. Alguns destes elementos somente são predominantemente

11

encontrados nos hepatócitos, desta forma justificando o hepatotropismo do VHB (54,

55).

Figura 5: Esquema da organização genômica do VHB Fonte: Liang, 2009 (5)

1.4.2 Proteínas virais

A ORF-C traduz dois tipos de produtos protéicos de acordo com o códon de

iniciação utilizado: a proteína do Core, que constitui o nucleocapsídeo (HBcAg) e

uma proteína precursora denominada pré-core (pré-C). Está é secretada para a luz

do retículo endoplasmático, após modificação pós-tradução dando origem a

proteínas – o antígeno “e” (HBeAg). Níveis elevados de HBeAg são freqüentemente

encontrados no soro de pacientes altamente virêmicos, durante fase precoce em

infecções agudas e estágios replicativos em algumas infecções crônicas, e também

12

em quase todos os compartimentos da célula infectada. A positividade no soro para

o HBeAg é um indicador de viremia do VHB (54-56).

O gene P (ORF-P) sobrepõe-se em parte do gene C e gene X, e todo o S

gene, resultando na maior fase de leitura aberta do genoma do VHB. Responsável

pela codificação da DNA polimerase viral que possui atividade de DNA polimerase –

RNA dependente (transcriptase reversa, RNase H e Primase (proteina que funciona

como iniciador –primer- à transcrição reversa do RNA pré-genômico, para a síntese

de DNA (cadeia -) (54, 55).

O gene S (ORF-S) é inteiramente sobreposto ao gene P, e contém três

domínios - pré-S1, pré-S2 e S - e três códons de início de tradução na mesma fase

de leitura, que codificam respectivamente três formas do invólucro viral: grande (L),

média (M) e a pequena (S). As três proteínas de superfície do VHB são

relacionadas entre si, dispondo do mesmo códon de parada e compartilhando uma

região denominada domínio S, que codifica a proteína S (HBsAg) do envelope do

VHB e as partículas não infectantes. A proteína S é a mais abundante e sua

seqüência está presente em todos os outros, e vem sendo utilizada na classificação

do VHB, através da análise da sequencia do genoma viral, ou seja, pela

genotipagem. O HBsAg contém um epítopo altamente antigênico denominado

determinante “a” que também permite a subtipagem do VHB pela análise sorológica

com emprego de anticorpos monoclonais. A proteína pré-S1 parece reconhecer os

receptores da superfície da célula, contribuindo para a especificidade dos vírus a um

determinado hospedeiro (54, 55).

O gene X (ORF-X) é a menor fase de leitura aberta no genoma do VHB e

codifica a proteína X (HBx) que contém 154 aminoácidos, no entanto ainda não é

muito bem caracterizada. Esta proteína parece ter funções essencialmente

regulatórias da expressão gênica, tanto no ciclo viral e da célula hospedeira. A

proteina HBx tem sido associada com o desenvolvimento do carcinoma

hepatocelular. Mas seu papel na replicação do vírus e patogênese em indivíduos

infectados continua longe de ser completamente compreendida (54, 55, 57).

13

Figura 6: Representação linear do genoma do HBV apresentando as fases de leitura aberta (setas largas) e os produtos protéicos correspondentes Nota: As setas tracejadas verticais indicam transcrição e tradução e a seta íntegra vertical indica clivagem por proteases celulares. Fonte: França, 2005(25), adaptado de Kann, 2002(58)

1.4.3 Variabilidade genética e mutações

Existe um grande interesse em identificar os subtipos e genótipos mais

prevalentes, a fim de correlacioná-los com manifestações clínicas e distribuição

geográfica. Inicialmente, a variabilidade do VHB é baseada em estudos sorológicos

de três determinantes antigênicos, denominados “a”, “d” e “y”, e subdeterminantes

(“w” e “r”) codificadas pelo gene S (HBsAg), o que permite classificar o VHB em nove

subtipos sorológicos, sendo quatro os principais: “adw”, “ayw”, “adr” e “ayr”. Estes

subtipos têm diferente distribuição geográfica e são úteis como marcadores

epidemiológicos (53, 59). O determinante "a" é comum a todos estes subtipos e é o

alvo para o anticorpo neutralizante (anti-HBs). A infecção por um dado subtipo

exerce proteção cruzada em relação aos outros, assim, a coinfecção com mais do

que um subtipo do VHB é rara (51).

14

Em 1988, Okamoto e colaboradores sugeriram que a variabilidade genética

do HBV poderia ser utilizada na geração de um sistema de classificação que

substituísse ou complementasse a classificação sorológica vigente. No presente,

são reconhecidos dez grupos genômicos (ou genótipos) do VHB, designados de A a

J, definidos arbitrariamente como portadores de divergência nucleotídica completa

superior a 8% (60-66).

Diversos estudos têm indicado padrões característicos quanto à distribuição

geográfica dos genótipos do HBV, os quais somente são conhecidos parcialmente

devido ao número não representativo de amostras de algumas partes do globo. O

genótipo A, além de pandêmico, é mais prevalente na América do Norte, Europa

(exceto a região Mediterrânea) e África Central e Meridional. Os genótipos B e C são

característicos dos países asiáticos. O genótipo D, apesar de mundialmente

distribuído, é mais prevalente na região Mediterrânea e Oriente Médio e o genótipo

E é predominante no continente Africano (61, 67-69). O genótipo F é considerado

próprio dos residentes nas Américas, verificando-se uma associação forte entre este

genótipo e populações nativas das Américas Central e do Sul (70). O genótipo F

apresenta a mais elevada divergência entre todos os genótipos (69, 71). Os

genótipos descritos recentemente (G e H) foram encontrados na América do Norte e

França (64), e América Central e México (60), respectivamente. Na Ásia, no mesmo

período, foi sugerido um novo genótipo diferente dos que já haviam sido descritos

anteriormente (72), e que mais tarde teria sido confirmado o genótipo I (73, 74) e, o

mais recente o genótipo J, descrito, também no continente asiático (75).

No Brasil, os estudos de levantamento da distribuição regional dos genótipos

do HBV têm sido raros e com número reduzido de amostras. Os genótipos A, D e F

foram descritos entre portadores crônicos acompanhados ambulatorialmente no Rio

de Janeiro e entre pacientes submetidos à hemodiálise em Goiânia e Santa Catarina

(76-79). Entre pacientes procedentes de São Paulo, os genótipos A, D e F são

encontrados, em maior proporção, em indivíduos de famílias de origem ocidental,

enquanto os portadores dos genótipos B ou C foram descritos entre aqueles de

origem asiática (80). Entre indígenas da região Amazônica, apenas o genótipo F foi

encontrado nas tribos que não mantinham contato com não-índios, enquanto que o

genótipo A foi encontrado nas tribos com intenso contato com estes (81). Outros

estudos conduzidos em portadores do HBsAg, naturais da Amazônia brasileira,

15

revelou maior prevalência do genótipo A, seguido do genótipo F e, em menor

freqüência o genótipo D (82-84). Estudos recentes mostram que em amostras

procedentes de populações indígenas, localizadas dentro dos limites do município

de Lábrea, evidenciou-se em maior frequência o genótipo A, seguido do genótipo D.

No entanto, o genótipo F não foi encontrado (85).

O fato do genoma do VHB, mesmo sendo este constituído de DNA de fita

dupla, ser replicado através de um RNA intermediário, torna-o suscetível a elevada

taxa de mutações. As polimerases dos hepadnavírus não possuem a capacidade de

verificação e remoção de bases incorporadas erroneamente e apresentam taxas de

mutação da ordem de 10-4 a 10-5 substituições de bases/sítio/ano, ou seja, similares

à taxa do gene retroviral gag (68, 86).

A variabilidade genética do VHB é observada tanto como uma expressão da

evolução dos genótipos virais, ou seja, o reflexo da divergência do genoma viral na

população portadora, quanto por meio do surgimento de mutações em cada

indivíduo isoladamente analisado (87, 88). Os desenvolvimentos em vacinação e

terapia antiviral levaram ao surgimento de variantes (mutações pontuais) do VHB, e

com o auxilia das técnicas de biologia molecular as descobertas, as quais vêm

demonstrando importância clínica crescente. As mais conhecidas estão associadas

às regiões S e C (89)

A proteína S (HBsAg) é a principal alvo dos anticorpos neutralizantes anti-

HBs, alterações de aminoácidos nesta região do genoma, podem impedir a

neutralização do vírus por estes anticorpos. As variantes são detectadas na região

com as mudanças no determinante "a" do HBsAg (epítopo imunodominante,

aminoácidos de 99 a 147) que escapam à vacinação e da ação protetora do terapia

imunoglobulina específica (HBIG). O primeiro variante descrito foi o G145R, que é o

mais comum (90). Os programas de vacinação contra o VHB universalmente têm

agido como um fator de seletividade dessas variantes, o que levou a um aumento

importante na sua prevalência. Estudos em Taiwan, 10 anos após a vacinação,

mostraram que a prevalência global de positividade do DNA do VHB em crianças

caiu de 8,6-2,1%, enquanto as mutações do determinante 'a' subiram de 7,8% para

28,1% (91).

16

As variantes do promotor do core e pré-core originam vírus que não produzem

HBeAg. A mutação mais comum do promotor do core apresenta uma alteração

dupla A1762T e G1764A que diminui o RNA mensageiro do pré-core, e assim, a

secreção de HBeAg (92). Foram descritas variantes do promotor do core em

associação com infecção pelo VHB fulminante (10% dos casos) e hepatite crônica

progressiva (27%) (93). A variante do pré-core mais comum tem um códon de

terminação (stop códon) prematuro (G1896A) que previne a translação do

polipeptídeo do précore eliminando assim a produção de HBeAg, mas mantendo-se

a produção do peptídeo do core. Estas variantes encontram-se, sobretudo em

pacientes sem o HBeAg com os genótipos B, C e D. Foram descritos casos severos

de hepatite aguda e crónica associados com mutantes do pré-core, mas em geral o

significado patológico destes mutantes não é bem claro (89).

Têm também sido encontradas mutações no gene da polimerase em

pacientes que fazem terapêutica antivíral, que passam a desenvolver resistências a

estes fármacos. Os mutantes da polimerase mais bem caracterizados são os que

ocorrem no decurso da terapêutica com lamivudina. Estes mutantes têm alterações

no domínio catalítico "YMDD" da enzima polimerase, conferindo resistência à

lamivudina e outros nucleosídeos relacionados (92). Os mutantes mais comuns

resistentes à lamivudina têm uma alteração no codon 552 de M (metionina) para V

(valina) (M552V) ou de M (metiolina) para I (isoleucina) (M552I) e são

frequentemente acompanhados por uma alteração adicional no códon 528 de L

(leucina) para M (metionina) (L528M) (89).

As mutações no gene X têm uma prevalência e significado clínico incertos

(57).

1.4.4 Replicação do VHB

Embora não se conheça com exatidão os mecanismos deste processo, a

replicação começa com a união do vírus a membrana do hepatócito através da

proteína Pré-S1. O Envelope da partícula viral se funde com a membrana celular e é

liberado no citoplasma o nucleocapsídeo (core), que se dirige ao núcleo (Figura 7).

Dentro do núcleo da célula se completa a síntese da cadeia positiva (incompleta) do

DNA viral, de tal forma que o genoma do VHB se converte em uma cadeia fechada

17

de DNA com ligações covalentes superespiraladas (cccDNA). Este cccDNA serve

como base para transcrição do RNA viral (54).

O RNA viral (pré-genômico), por sua vez, constitui o molde para a síntese de

uma das cadeias da molécula de DNA (cadeia -) pela atividade enzimática da

transcriptase reversa (polimerase do vírus), a qual ao mesmo tempo em que copia o

RNA em DNA, o vai removendo através da atividade RNAse H que também possui.

A digestão do RNA não é completa e o oligoribonucleotideo terminal, que inclui a

seqüência repetida DR1 é translocado e emparelhado com a região DH2 perto do

terminal 5’ da mesma cadeia negativa (-) onde atua como iniciador da síntese da

cadeia positiva (+) (54, 89).

Posteriormente, as progênies virais adquirem o envoltório, a partir das

membranas intracelulares (retículo endoplasmático e o complexo de Golgi), quando

então os virions podem retornar ao núcleo celular para continuar o processo de

replicação genômica ou podem ser secretados (94).

Figura 7: Esquema do ciclo replicação do vírus da hepatite B no hepatócito.

Fonte: Liang, 2009 (5)

18

1.5 A Carga viral

A quantidade do DNA-VHB no soro é proporcional à carga viral presente,

estando, por tanto, associada à replicação viral. A pesquisa e a quantificação destas

partículas são úteis para diagnosticar a replicação (infectividade), resposta a

terapêutica específica e para detectar o DNA do VHB nos casos de hepatites

crônicas anti-HBe reagentes (95).

De forma geral, os portadores do VHB podem ser divididos em dois grupos:

os HBeAg positivos (replicadores) ou os HBeAg negativos (não replicadores ou

indivíduos que normalmente apresentam mutações no promotor pré-core ou core

que não produzem HBeAg apesar da replicação viral). Os pacientes HBeAg

positivos normalmente apresentam níveis de carga viral superiores àqueles HBeAg

negativos. Entretanto, indivíduos HBeAg negativos mutantes com carga viral mais

elevada tendem a apresentar doença e lesão hepática mais grave (87, 96, 97).

O DNA do VHB pode ser detectado precocemente na fase aguda da hepatite

viral B, persistindo no soro em altos níveis nas hepatites crônicas acompanhado do

HBsAg, e em casos de hepatites fulminantes, quando o HBsAg estiver ausente (98).

Os testes para ácido nucléico utilizam diferentes técnicas de quantificação da

carga viral, seja pela técnica da captura híbrida, PCR ou PCR em Tempo Real (99).

A metodologia se baseia na técnica da PCR: emprego de oligonucleotídeos,

DNA molde, polimerase e nucleotídeo, no entanto, utiliza equipamento e corantes

especiais, e procedimentos de otimização e adequações para um nível de

sensiblidade muito maior.

Trata-se de uma técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a

avaliação do número de moléculas produzidas ciclo a ciclo, então recebeu a

denominação PCR em tempo real A metodologia se baseia na técnica da PCR:

emprego de oligonucleotídeos, DNA molde, polimerase e nucleotídeo, no entanto,

utiliza equipamento e corantes especiais, e procedimentos de otimização e

adequações para um nível de sensiblidade muito maior (100).

Comercialmente, estão disponíveis uma variedade de diferentes métodos que

quantificam a carga viral do VHB, incluindo amplificação de sinal (Versant HBV

19

bDNA; Siemens Healthcare Diagnostics), PCR convencional (Amplicor HBV teste

Monitor; Roche Diagnostics), e PCR em tempo real (Cobas AmpliPrep / Cobas

TaqMan HBV teste [Roche Diagnostics] e RealTime HBV test Abbott RealTime:

HBV IUO [Abbott Molecular] e Qiagen artus HBV TM ASR (101).

Embora sejam rotineiramente utilizados no diagnóstico laboratorial, eles

possuem algumas limitações na sensibilidade, na taxa linear, no volume das

amostras e limite de detecção alto, como aqueles encontrados em pacientes em

terapia antiviral ou com infecção oculta (102).

Mais recentemente, uma nova metodologia conhecida como PCR em Tempo

Real (Real Time PCR) foi desenvolvida. Trata-se de uma PCR cuja detecção dos

amplicons (produtos da amplificação) é simultânea à amplificação. O DNA viral pode

ser detectado em pequenos níveis, abaixo de 500 cópias/mL (103) ou < 50UI/mL

(104) . A cinética de amplificação é dividida em três fases: Geométrica, Linear e de

Platô. E para se detectar o produto de uma PCR ao longo do ciclo é preciso marcar

o produto com um tipo de fluorescência, como por exemplo, o SYBR Green ou

TaqManTM (105).

Apresenta como vantagem a alta sensibilidade, alta capacidade de amplificar

grande número de amostras simultaneamente, baixo risco de contaminação por

produtos da PCR, larga faixa dinâmica de amplificação, alta precisão e

reprodutibilidade, além de baixos custos. Na atualidade, este teste é de

desenvolvimento próprio ou fornecido por algumas empresas, sendo o grande

desafio para os laboratórios que utilizam metodologias de desenvolvimento próprio

para PCR em tempo real, além da padronização são também a construção de um

controle interno e a padronização de uma curva externa padrão. Os testes de carga

viral para o VHB podem ter o resultado relatado em números absolutos ou logaritmo

(log10). O resultado do exame também pode ser relatado em cópias por mL de

amostra ou em unidades internacionais (UI) por mL de amostra, sendo que esta

última é preferível. As UI surgiram a partir da necessidade de padronização da

quantificação, já que uma amostra apresentava resultados consistentemente

diferentes, quando se usavam metodologias diferentes. Foram então introduzidos

padrões de DNA-VHB da Organização Mundial de Saúde. Desta forma são

produzidos pelo National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC)

20

controles feitos a partir de amostras positivas para o DNA-VHB com títulos altos de

vírus (106).

Pela sua importância, muitos esforços têm sido realizados para obtenção de

melhores desempenhos destes testes, principalmente em relação à sensibilidade.

Sabe-se que os níveis do DNA-VHB durante a fase de replicação viral intensa do

vírus em geral estão acima de 104 cópias/mL. Níveis abaixo de 104 cópias/mL

podem ser detectados em qualquer fase da doença, mesmo na convalescença

(107).

A determinação da carga viral é muito útil em acompanhar a progressão da

doença, conhecer os níveis do DNA-VHB no pré-tratamento, em monitorar a

resposta dos antivirais e indicação de falha terapêutica – resistência às drogas (103,

108, 109).

1.6 Infecção oculta pelo VHB

Com o desenvolvimento das técnicas da biologia molecular, estudos foram

conduzidos e contribuíram para o melhor conhecimento do VHB, bem como a sua

variabilidade genética, o que também conduziram à revisão dos padrões sorológicos

desta doença.

Baseado em achados sorológicos e biomoleculares são classificados em três,

os estados de persistência viral (110): hepatite B crônica - persistência do HBsAg no

soro por mais de seis meses, associado com a presença do HBeAg e do DNA-VHB,

carga viral e aminotransferases elevadas; portador assintomático – presença do

HBsAg no soro por mais de seis meses, HBeAg negativo, presença do DNA-VHB e

baixos níveis da carga viral e aminotransfeases; hepatite B oculta – presença do

DNA-VHB no soro e/ou fígado, com HBsAg não detectáveis no soro (111).

A infecção oculta pelo VHB é definida como a detecção do DNA-VHB no soro

e/ou no tecido hepático de indivíduos negativos para o antígeno de superfície do

vírus da hepatite B (HBsAg) (107, 111). O diagnóstico dessa nova entidade clínica

dá-se pela sorológica e o baixo nível do DNA-VHB (carga viral) no soro, média de

102-3 cópias/mL, comparado com níveis de 104, em portadores assintomáticos

21

(HBsAg reativo/HBeAg negativo) e 108 cópias/mL, nos pacientes com hepatite

crônica (HBsAg positivo/HBeAg positivo) (112-114).

A hepatite B oculta, frequentemente é mais evidenciada em pacientes com o

anti-HBc total como único marcador sorológico (107, 115, 116). Entretanto, também

foi observada em pacientes com o anti-HBs, ou até sem qualquer marcador

sorológico de infecção pelo VHB (115, 117, 118). É importante ressaltar que a

presença do anti-HBc total isolado pode ocorrer em outras situações que não

caracteriza a hepatite B oculta: reação sorológica falso-positiva, e o período não

detectáveis, compreendido entre o início da soroconversão do HBsAg para o anti-

HBs (119-121).

Considerando que a região Amazônica, de longa data, é uma das mais

importantes áreas de elevada endemicidade do vírus da hepatite B no mundo, onde

esta infecção constitui grave problema de saúde pública e assume características

epidemiológicas e clínicas peculiares.

Relatos de surtos familiares de uma forma grave de hepatite fulminante,

chamada popularmente de “Febre Negra de Lábrea”, motivaram o início dos estudos

das hepatites na Amazônia ocidental, a partir do final da década de 50. Com isso,

medidas de controle e prevenção como a vacinação em massa contra a hepatite B,

foram adotadas na região, desde o início na década de 90, em crianças menores de

dez anos de idade.

Investimentos financeiros do governo estadual e federal, por meio de projetos

de pesquisa possibilitaram investigações, 14 anos após a introdução da vacina

contra hepatite B, por meio de inquéritos soroepidemológicos para os vírus das

hepatites A, B, C e Delta no município de Lábrea, em populações das zonas urbana

e rural, e áreas indígenas, bem como estudos sobre a biologia molecular, na

caracterização dos genótipos do vírus da hepatite B mais prevalentes,

demonstrando que os genótipos A e F são os mais prevalentes e, o menos

frequente, o genótipo D.

No entanto, estes estudos ainda são escassos, por isso da necessidade de se

ampliar o conhecimento da diversidade genética, através das análises filogenéticas,

e da epidemiologia molecular de cepas do vírus da hepatite B.

22

Neste cenário, a proposta deste estudo foi realizar um estudo pioneiro na

região, que tem o objetivo de caracterizar os aspectos biomoleculares do vírus da

hepatite B, através da determinação dos genótipos circulantes e mutações no

genoma, infectividade/progressão da doença, pela determinação da carga viral e,

finalmente, para que se possa traçar um perfil epidemiológico e avaliar o impacto

desta infecção, entre as populações (comunidades) isoladas (ribeirinhos),

localizadas na área rural de Lábrea.

23

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Determinar os aspectos da epidemiologia molecular da infecção pelo vírus da

hepatite B em população ribeirinha da calha do rio Purus, no Município de Lábrea,

Amazonas, Brasil.

2.2 Específicos

Determinar a prevalência de marcadores sorológicos de infecção pelo VHB na

população do estudo;

Determinar a prevalência da infecção oculta pelo VHB, em amostras de soro

de indivíduos que apresentam padrão sorológico HBsAg negativo e anti-HBc

positivo co-infectados ou não pelo VHC e/ou VHD;

Identificar os genótipos do VHB na população de estudo;

Avaliar a freqüência de mutações no gene de superfície (S) e os genótipos do

VHB identificados;

Quantificar o DNA viral sérico nas amostras da população do estudo;

Correlacionar os dados epidemiológicos e da biologia molecular do VHB.

24

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Modelo de estudo

Estudo descritivo com a determinação da prevalência de infecção e

caracterização molecular do vírus da hepatite B (VHB), utilizando técnicas

moleculares para a detecção do DNA-VHB, em amostras procedentes de três

comunidades ribeirinhas de alta prevalência do VHB, no município de Lábrea,

Amazonas.

3.2 Local de estudo e descrição da área

O município de Lábrea (Figura 8) está localizado na região sul do estado do

Amazonas (7º15´35,99”S/ 64º48´36,28” W), no vale do rio Purus, afluente da

margem direita do rio Solimões. Distante da capital do Estado, Manaus, a 783 km

em linha reta e 1.926 km por via fluvial, está localizado a 75 m acima do nível do

mar, e compreende uma área de 68.234 Km2. Segundo o Censo Demográfico

Brasileiro de 2010, a população é de 37.701 habitantes (13.494 habitantes na zona

rural e 24.207 na urbana). É uma região pouco habitada com uma densidade

demográfica de 0,55 habitantes por quilômetro quadrado (122).

Nos últimos anos a região sul do estado do Amazonas vem ganhando

notoriedade na mídia local e internacional, devido à grande parte do desmatamento

recente está concentrado em áreas localizadas em alguns municípios da região.

Dados mostram que essa área concentrou até 2004 aproximadamente 30% do total

no Estado. O processo de expansão da fronteira agropecuária corresponde aos

processos migratórios oriundos dos estados vizinhos ao longo das BR-364 e BR-

317, impulsionado pela expansão da pecuária e pela extração predatória de

madeira, bem como a implantação de culturas de grãos, com alta tecnologia e

investimentos empresariais (123).

No Município de Lábrea foram estimados, pelo IBGE, para o ano de 2009,

indicadores sociais e de morbimortalidade nada animadores, como: o número de

óbitos em menores de 1 ano é o dobro em relação a média do Estado (1,5%); tem

alta taxa de analfabetismo (15 anos ou mais) de 41% e uma altíssima taxa de

mortalidade materna (141 óbitos maternos por 100.000 nascidos vivos). Na

25

população urbana, menos da metade (48%) tem cobertura de rede de

abastecimento de água, e menos de 30% tem sistema de esgotamento sanitário e

coleta de lixo. No entanto 4,35% das mortes estariam associadas às doenças

infecciosas e parasitárias, índice abaixo da média nacional (5,15) e do Estado (7,88).

(Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2000)

3.3 Definição dos sujeitos da investigação

3.3.1 População de estudo

A população alvo deste estudo consiste na população das comunidades

ribeirinhas: Madeirinho, Sumaúma e Praia do Buraco, município de Lábrea, Estado

do Amazonas, Amazônia ocidental, Brasil.

3.3.2 Tamanho da amostra

Nestas populações ribeirinhas foi identificado, através de um inquérito soro-

epidemiológico anterior, realizado entre os anos de 2005 a 2008, padrões de alta e

média endemicidade (37 a 6,5%) de infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) (124).

Pelo fato dessas populações reconhecerem o problema, comumente são receptivas

à pesquisa. Foram coletadas amostras de todos os indivíduos presentes, optou-se

Figura 8: Localização do município de Lábrea, no mapa do Estado do Amazonas. Fonte: http://www.manausonline.com/municípios_detalha. asp?id_mun=35

26

por trabalhar com toda a população das comunidades, inclusive aqueles que haviam

participado do inquérito soro-epidemiológico anterior.

3.3.3 Critérios de inclusão

Amostras procedentes da população ribeirinha da calha do rio Purus,

de todas as faixas etárias, ambos os gêneros, residentes nas

comunidades Madeirinho, Sumaúma e Praia do Buraco, no município

de Lábrea, Amazonas.

Amostra que apresentar o marcador sorológico HBsAg-reativo e/ou

anti-HBc-reativo isolado.

Detecção do DNA-VHB no sangue, pela técnica da PCR,

independentemente de sua concentração no soro.

3.3.4. Critérios de exclusão

Não concordância em participar do estudo;

Pessoas que utilizam ou utilizaram qualquer tipo de tratamento antiviral

nos últimos seis meses.

3.4 Procedimentos

3.4.1. Coleta de informação e consentimento

Após esclarecimentos sobre os objetivos da pesquisa e obtenção do

consentimento formal de inclusão na pesquisa (Anexo 6.1), foi realizada uma

entrevista e utilizou-se como instrumento de investigação um questionário individual

estruturado (Anexo 6.2), onde foram anotados os dados sociodemográficos,

epidemiológicos, história pregressa de hepatite e na família, outras infecções atuais

e passadas e imunização contra hepatite B.

3.4.2. Coleta, procedimento e armazenamento das amostras biológicas

Amostra do sangue venoso de cada participante foi coletada, no mesmo

momento, em dois tubos a vácuo identificados por ordem numeral crescente: um

sem conservantes e aditivos, para obtenção do soro e outro contendo EDTA k3, para

27

o plasma e células mononucleadas de sangue periférico, com 5 mL cada. Após a

retração do coagulo em temperatura ambiente, os tubos são centrifugados a 3000

rpm, por 05 minutos, para separação do soro e do plasma. As amostras foram

divididas em duas alíquotas cada, sendo a de soro utilizada para as determinações

sorológicas, e a de plasma para os ensaios das técnicas de biologia molecular

prevista no estudo. Imediatamente após o processo de separação e alíquotas, estas

foram mantidas a -20ºC, tanto no campo como no Laboratório de Lábrea. Para a

coleta, processamento e transporte das amostras do campo, até Manaus, foram

adotados medidas de biossegurança e conservação. Estas amostras encontram-se

estocadas a -80ºC, na Gerência de Virologia da Fundação de Medicina Tropical

Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD).

3.5 Diagnóstico laboratorial

3.5.1 Determinação e classificação sorológica dos participantes

A determinação dos marcadores sorológicos para a pesquisa de infecção dos

vírus da hepatite B (Anti-HBs quantitativo, anti-HBc total, HBsAg, anti-HBc total,

HBeAg, anti-HBe), e anticorpos contra o vírus da hepatite A (anti-HAV, total), da

hepatite C (anti-HCV) e da hepatite Delta (anti-HD total) foram realizados por meio

de conjunto de reagentes (kits) comerciais, do tipo imunoenzimático em fase sólida

(ELISA) (DiaSorin, S.p.A. – Saluggia, Itália), de acordo com o manual do fabricante.

Estes exames são realizados de rotina no Laboratório de Análises Biológicas da

Secretaria Municipal de Saúde de Lábrea, e classificados como mostra a Tabela 3.

Considerando que o presente estudo tem com base o inquérito

soroepidemiológico, os resultados da sorologia foram entregues aos respectivos

participantes, em forma de laudos, que constava o nome, localidade e listagem dos

marcadores sorológicos para hepatites A, B, C e D testados. Os resultados foram

qualificados como positivo (soro reagente) e negativo (soro não reagente). Sendo o

anti-HBs possível a quantificação, este foi anotado e interpretado como reativo,

títulos >10 UI/mL, seguindo a recomendação da OMS (125). Consequentemente

este tipo de estudo identifica inicialmente, pelo diagnóstico sorológico, a presença de

infecção nos indivíduos participantes. Naqueles em que se identificou a presença de

infecção, o laudo expedido aconselhava a necessidade do participante, procurar os

28

colaboradores do projeto, na Unidade Hospitalar de Lábrea na sede do município.

Estes eram encaminhados para consulta médica e avaliação clínica, laboratorial,

confirmação sorológica e condutas. Para aqueles identificados como susceptível a

infecção pelo VHB, isto é não reagente para o anti-HBs, foi indicado à vacinação

contra hepatite B.

Tabela 3 – Modelo classificatório, adotado pelo estudo, para as amostras dos

indivíduos submetidas aos testes sorológicos

Marcador (+) Significado

Anti-HAV total

HBsAg

Infecção passada pelo VHA

Infecção presente pelo VHB

HBsAg e anti-HBc total Hepatite B crônica

HBeAg Replicação viral

Anti-HBe Fim da fase replicativa

Anti-HBc total isolado Infecção passada pelo VHB

Anti-HBs isolado Imunidade por vacina

Anti-HBc total e anti-HBs

Anti-HCV total

Anti-HD total

Imunidade por contato com o VHB

Infecção pelo VHC

Infecção pelo VHD

3.5.2 Detecção do DNA-VHB

Os ensaios foram realizados no Laboratório da Gerência de Virologia e

Laboratório de Pesquisa em Doenças Endêmicas da FMT-HVD empregando-se a

técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR), pela estratégia semi-nested,

segundo (83). As características gerais do ensaio são descritas a seguir:

3.5.2.1 Extração do DNA-VHB a partir do plasma sanguíneo

Para a extração do DNA-VHB, 200 μL de plasma foram adicionados 30 μL

contendo 2 mg/mL de Proteinase K e solução de lise (AL). A mistura será incubada

por 24 horas a 56°C, em termobloco. O DNA viral foi purificado utilizando-se o

conjunto de reagentes Qiamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Sciences, Maryland,

USA). Após a incubação, foram realizados de acordo com as instruções do

29

fabricante, salvo que o DNA total foi eluído em 50 μL em água pura livre de

DNAse/RNAse, e mantidos a -80ºC.

Posteriormente, realizou-se a leitura espectrofotométrica das soluções nos

comprimentos de onda 260 e 280 nm (nanômetros) para a determinação da

concentração de DNA total em cada amostra extraída e de uma estimativa do seu

grau de pureza, a partir da relação A260/A280, em espectrofotômetro NanoDrop 2000

(Thermo Fisher Scientific Inc. USA ).

3.5.2.2 Seleção de Oligonucleotídeos para a PCR e PCR em tempo real

Os oligonucleotídeos foram desenhados para a região do Gene S do VHB,

pelo programa PRIMER 3, desenvolvido pelo Whitehead Institute e Howard Hughes

Medical Institute, EUA, e considerados os seguintes parâmetros: tamanho dos

oligonucleotídeos, conteúdo de G/C, temperatura de hibridização e tamanho do

amplicon. Utilizou-se também, o programa de comparação de seqüências BLAST

(Basic Local Alignment Search Tool), www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, para determinar

a combinação de oligonucleotídeos mais específica. A sequencia do protótipo foi

HVHEPB genoma completo do VHB, de acesso nº X51970.1 do GenBank.

Selecionou-se oligos aplicados em estudos, e que foram divulgados na

literatura científica. Os oligonucleotídeos utilizados no estudo foram sintetizados por

empresas especializadas.

Os oligonucleotídeos sintetizados foram inicialmente testados na temperatura

de hibridização desejada, pelo método da PCR convencional. A confirmação do

produto da amplificação foi verificada em gel de agarose corado com brometo de

etídeo.

30

Tabela 4 - Seqüências dos oligonucleotídeos pré-selecionados

Nome do Oligo

Sequência Fragmento (pb)

Referência

α-tubulina L 5’-CAC CCG TCT TCA GGG CTT CTT GGT TT-3’ 400

α-tubulina R 5’-CAT TTC ACC ATC TGG TTG GCT GGC TC-3’

(126)

S56 5’-CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA-3’

208

S264 5’-GTC CAC CAC GAG TCT AGA CTC T-3’

Não

publicado

783 5’-CTC ACG ATG CTG TAC AGA CTT-3’ 1200

2821 5’-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’ (83)

P1 5’- GCC TCT CAC ATC TCG TCA AT -3’ 680

3.5.3 Reação da polimerase em cadeia

Foram tomadas as precauções para evitar a contaminação cruzada durante o

isolamento do DNA, preparação das misturas da PCR e eletroforese em gel. Os

controles negativos foram incluídos desde a extração para cada ensaio. A

amplificação do HBV-DNA para cada isolado foi realizada pelo menos duas vezes,

por meio da escolha de diferentes regiões para se excluir resultados falso-positivos e

falso-negativos.

Como controle externo de validação do DNA extraído utilizou-se marcadores

moleculares de cromossomos humano, descritos na literatura, que amplificam uma

região da α-tubulina, de acesso nº X01703 do GenBank (126) (Tabela 4). Os ensaios

da PCR foram processados em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient, às

seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos, seguido de 35 ciclos

compostos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, hibridização a 60°C por 40

segundos e extensão a 72°C por 50 segundos, e extensão final a 72°C por 10

minutos. O tamanho esperado do fragmento amplificado é de aproximadamente 400

pb.

Inicialmente, para a detecção da presença do DNA-VHB, optou-se em

amplificar um fragmento pequeno (208 pb), a fim de se aumentar sensibilidade, que

31

corresponderá ao gene Pré-S, com os oligonucleotídeos S56 e S264 (Tabela 4). Os

ensaios da PCR foram processados em termociclador Eppendorf Mastercycler

Gradient às seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos,

seguido de 40 ciclos compostos de desnaturação a 95°C por 30 segundos,

hibridização a 60°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 30 segundos, e extensão

final a 72°C por 5 minutos.

Para a classificação do genótipo (genotipagem) do VHB, o DNA viral foi

amplificado pela estratégia “semi-nested” PCR, sendo a primeira reação realizada

com 5 μl do DNA eluído, utilizando os oligonucleotídeos 783-2821, e a segunda da

PCR, com 1L do produto da primeira reação, utilizando os oligonucleotídeos P1-

783 (Tabela 4). O fragmento resultante da amplificação com 783-2821, de

aproximadamente 680 pb (pares de bases), corresponde ao gene S, região pré-S1 e

pré-S2. Os ensaios da PCR com os oligonucleotídeos externos 783-2821 e internos

P1-783 foram processados em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient às

seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos

compostos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, hibridização a 57,1°C por 2

minutos e extensão a 72°C por 30 segundos, e extensão final a 72°C por 7 minutos.

Os ensaios de PCR com os oligonucleotídeos internos 783-2821 foram realizados

nas mesmas condições.

Todos os ensaios da PCR foram realizados em um volume final de 25 μl de

solução de amplificação (25 mM de MgCl2, 10 mM de dNTPs, 10 pmol de cada

oligonucleotídeo) e 1U de Taq DNA polimerase. Para estes ensaios também foram

utilizados misturas do tipo PCR Master Mix (TopTaq PCR Master Mix – Qiagen

Sciences, Maryland, USA), comercializadas para tal fim.

Os produtos da PCR das regiões do VHB (Pré-S e S) foram estocados a -

20°C, até o seqüenciamento dos nucleotídeos dos fragmentos amplificados.

3.5.3.1 Avaliação eletroforética dos produtos de amplificação

A partir da obtenção dos produtos da reação da PCR, alíquotas de 5 µL foram

adicionados a 2 µL do tampão de amostra (0,25% azul de bromofenol, 25% xileno

cianol e 30% glicerol em H2O) 6X (seis vezes concentrado), e utilizados marcadores

de peso molecular "Ladder 100pb” (Invitrogen Carlsbad, CA, USA), que foram

32

analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose, adicionado o brometo de

etídeo (10mg/ml), submerso em cuba horizontal com tampão TBE 1X (estoque 10X

Tris (1,0M), ácido bórico (0,9M) e EDTA (0,01M) pH 8,4) (Invitrogen Carlsbad, CA,

USA) , aplicado uma corrente elétrica (100V), para migração, até aproximadamente,

2/3 da área do gel. As bandas foram visualizadas por meio da incidência de radiação

ultravioleta em uma câmara escura, equipada com um transluminador e uma câmera

fotográfica digital para aquisição das imagens, e arquivadas em um

microcomputador.

3.5.4 Seqüenciamento direto

Os produtos da PCR amplificados foram quantificados (ng/µL) em

espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc. USA). Definido as

concentrações para cada amostra, estas foram amplificadas utilizando-se os

reagentes e protocolo “Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA), no termociclador Eppendorf Mastercycler

Gradient. ), e posteriormente purificados, por kits de purificação comercial BigDye®

XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), a fim de

se eliminar bases não incorporadas e reagentes excedentes.

O seqüenciamento e a leitura automática das seqüências serão feitos no

analizador genético, modelo DNA analyzer 3130XL (Applied Biosystems, Foster City,

CA, USA), em placas ópticas de 96 amostras.

Em cada orifício da placa foram adicionados entre 30 a 100ng/µL de DNA.

Para melhor análise e consistência dos resultados, ambas as fitas de DNA foram

seqüenciadas, utilizando-se um único oligonucleotídeo por reação (senso ou anti-

senso) que foram empregados no presente estudo para genotipagem do VHB.

3.5.4.1 Análise das seqüencias

A análise das seqüências obtidas neste estudo foram feitas por meio dos

algoritmos do programa BioEdit Sequence Alignment Edit, versão 7.0.9.0 (Hall

1999), para edição manual, alinhamento dos nucleotídeos e tradução das

seqüências de aminoácidos, convertido em um arquivo FASTA. Cada amostra

seqüenciada foi alinhada com outras seqüências obtidas neste estudo, e outras

33

conhecidas e disponíveis no GenBank, utilizando a página na internet Genotyping do

National Institute of Health

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi), onde há ferramentas

específicas para genotipagem viral do VHB.

Para o alinhamento múltiplo dos nucleotídeos e construção da árvore

filogenética para as regiões do VHB (Pré-S e S), utilizou-se o programa Molecular

Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versão 5.0 (127), e as sequencias

depositadas no GenBank.

Para a caracterização de variações no genoma do VHB, as sequencias

nucleotídicas foram analisadas em dois algorítimos internacionais de repositório de

estirpes do VHB: HepSEQ - (http://www.hepseq.org/Public/Web_Front/main.php) e

HBVseq - (http://hivdb.stanford.edu/HBV/HBVseq/development/HBVseq.html), que

caracterizam mutações no gene da polimerase (transcriptase resversa). Para a

caracterização das variações no gene S, as sequencias foram alinhadas çom

sequencias de referencia do GenBank.

3.5.5 Reação da polimerase em cadeia em tempo real

O sistema de escolha para a detecção foi o Maxima® SYBR Green qPCR

Master Mix (2X) (Fermentas - Thermo Fisher Scientific Inc. USA), agente

fluorescente que se intercala em fitas duplas de DNA. A reação (25 µL) consistiu na

mistura de 12,5 µL SYBR Green qPCR Master Mix (2X), 10 pmol de cada primer

S56/S264 e 5 µL do DNA purificado. A reação da PCR consistiu na desnaturação

inicial em dis passos de 50°C por 2 min e 95°C, por for 10 min, seguido de 45 ciclos

de 95°C por 30 seg, 60°C por 1min, e 72°C por 30 seg. Os dados foram coletados

usando ABI Prism 7500 Fast sequence detection system (Applied Biosystems,

Foster City, CA, USA). Para o controle negativo de amplificação, adotou-se uma

mesma mistura de reagentes das amostras experimentais, sem o DNA, na mesma

placa óptica, a fim da possibilidade da exclusão de contaminação.

34

4.5.5.1 Curvas de dissociação

A curva de dissociação foi programada para ser realizado após a reação de

qRT-PCR, para que se possa determinar a especificidade dos produtos de PCR

formados. Reações que apresentarem curvas de dissociação com picos de Tm

menores que o produto de PCR específico (formação de dímeros de

oligonucleotideos). Os gráficos da curva de dissociação foram fornecidos pelo

programa Dissociation Curve 2.0 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA).

4.5.5.2 Detecção quantitativa do DNA-VHB

Nas amostras HBsAg-positiva, os níveis do DNA do VHB foram quantificados,

utilizando-se o teste comercial COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B virus

(HBV) (CAP/CTM 48; Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), sistema de

plataforma totalmente automatizado para quantificação do DNA-VHB DNA em

amostras de plasma, que assegura ter um limite inferior de detecção de 12 UI/mL e

um limite superior de quantificação do 1,10×108 UI/mL, e fator de conversão igual a

5,82 cópias/UI.

35

Figura 9 – Fluxograma para os testes laboratoriais

36

3.6 Análise dos dados

Os dados serão registrados em planilha do programa Microsoft Office Excel

2007. Análises estatísticas serão conduzidas utilizando-se softwares, incluindo o

Epi-Info e SPSS. A análise dos dados se dará com descrição estatística simples:

cálculo de razões e prevalência, e respectivos intervalos de confiança ao nível de

95% para validar essas proporções encontradas. O efeito da exposição ao fator de

risco de interesse, por níveis crescentes de exposição, será avaliado pelo teste do

Qui-quadrado (X2) de tendência. Associações entre a exposição a um fator e a

presença de marcador sorológico foram avaliadas por razões de prevalência (RP).

O controle de possíveis variáveis de confusão durante a análise dos

resultados é feito por estratificação, avaliando a associação para cada categoria ou

estrato da variável de confusão, bem como estimativas gerais após ter sido

considerado o efeito do fator. Possíveis modificadores de efeito podem ser

identificados e relatados durante análises estratificadas e avaliadas por testes de

Qui-quadrado (X2) de homogeneidade. Todos os cálculos serão considerados como

tendo significado estatístico quando a probabilidade - o valor de p<0,05 ou o valor

nulo - estiver fora do intervalo de confiança.

3.7 Instituições participantes

Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD),

Fundação Nacional de Saúde (FUNASA), Secretaria de Saúde do Estado do

Amazonas (SUSAM), Secretaria de Saúde do Município de Lábrea (SEMSA).

3.8 Certificado de aprovação no Comitê de Ética e Pesquisa

O presente projeto está associado a dois projetos de maior amplitude

designados: “Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na saúde pública”,

(aprovado pelo Comitê de Ética da FMTAM – processo Nº 2957/2003-FMTAM)

(Anexo 6.3a), que tem como objetivo geral, determinar a prevalência de marcadores

sorológicos de infecção presente e passada do vírus da hepatite B (VHB), vírus da

hepatite C (VHC), vírus da hepatite Delta (VHD) e vírus da hepatite A, na zona rural

do município de Lábrea (rio Purus), quatorze anos após a introdução da vacina

contra hepatite B na região; “Febre Negra de Lábrea: O papel das populações

37

indígenas na epidemiologia da hepatite B e Delta” (aprovado pelo Comitê de Ética

da FMTAM – processo Nº 2090/2005-FMTAM) (Anexo 6.3b), que tem como objetivo

geral estudar a biologia molecular dos vírus das hepatites B e Delta, em populações

indígenas do município de Lábrea, Amazônia Ocidental brasileira.

38

4 RESULTADOS

39

40

41

42

43

44

Errata, Anexo 93

45

SHORT COMMUNICATION

Pouca evidência da ocorrência de infecção B oculta em população geral de

área endêmica do vírus da hepatite B, na Amazônia Ocidental brasileira

Márcia da Costa Castilho1,2, Cintia Mara Costa de Oliveira1,2, João Bosco de Lima

Gimaque1,2, Heline Lira Vasconcelos1, Wornei Silva Miranda Braga1,2

1. Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Gerência de

Virologia, Manaus, Amazonas, Brasil

2. Universidade do Estado do Amazonas, Programa de Pós-graduação em

Medicina Tropical, Manaus, Amazonas, Brasil

RESUMO

A Amazônia Ocidental brasileira é uma região endêmica para a infecção pelo

vírus da hepatite B (VHB). Este estudo propõe-se a identificar a ocorrência de

infecção B oculta, em populações isoladas da Amazônia Ocidental brasileira. Trata-

se de um estudo de base populacional, de inquérito sorológico realizado em 2008. A

técnica empregada para detecção do DNA-VHB foi a PCR em tempo real, contudo o

DNA-VHB foi detectado apenas nos isolados com infecção presente (HBsAg-

reativas), e em nenhuma amostra de indivíduos com infecção passada, o que mostra

a baixa prevalência de infecção B oculta na população estudada.

INTRODUÇÃO

A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 2 bilhões de pessoas

estão infectadas com o vírus da hepatite B (VHB), destas 400 milhões são

portadoras crônicas da hepatite B.1 A Amazônia brasileira é descrita como uma das

regiões, no mundo, mais prevalentes da infecção pelo VHB. 2-5

46

A infecção B oculta (IBO) é definida como a detecção do DNA-VHB no tecido

hepático, ou no soro em baixos títulos, de pacientes negativos para o HBsAg,6,7 e é

comumente relatado a ocorrência e a elevada prevalência, entre populações de risco

específicos, tais como: usuários de drogas injetáveis,8,9 hemodialisados,10,11

doenças e/ou tratamentos que causam imunossupressão 12,13 e hepatopatias

crônicos sem etiologia definida14 . Esta forma de IBO é, também relatado nas

coinfecções com outros vírus VHC,15 HDV,16 HIV.17,18 No entanto, em população

geral é pouco estudado. O objetivo do presente estudo foi descrever a ocorrência da

IBO, em três comunidades isoladas procedentes da Amazônia Ocidental brasileira,

caracterizada como área de alta prevalência de infecção pelo VHB (79,1%) e de

portadores crônicos (10,2%).19

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de

Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus, Amazonas, Brasil

(No.:1775/2006/FMT).

MATERIAIS E MÉTODOS

Este estudou avaliou 57 amostras de sangue coletadas no inquérito

soroepidemiológico realizado em junho de 2008, em três comunidades ribeirinhas,

(Madeirinho, Sumaúma e Praia do Buraco), no Município de Lábrea, Estado do

Amazonas.

Todas as amostras reativas para o anti-HBc total, negativas e/ou positivas

com títulos < 10UI/mL do anti-HBs foram extraídos o DNA-VHB, a partir de uma

amostra de 200 uL de plasma, utilizando-se o QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN, AG,

Basel, Switzerland), modificado aumentando-se o tempo de incubação com

Proteinase K para, no mínimo 6 horas. O DNA-VHB foi detectado, inicialmente, pelo

47

sistema de detecção da PCR em tempo real (RT-PCR) ABI 7500 Fast (Applied

Biosystems). Na reação foi adicionada uma mistura de SYBR-Green (Qiagen,

Hilden, Alemanha) e as sequencias iniciadoras S56 [senso] (5’-CCT GCT GGT

GGC TCC AGT TCA-3’) e S264 [anti-senso] (5’-GTC CAC CAC GAG TCT AGA

CTC T-3’), desenhadas para a região do gene S ( pré-S2/S) do genoma do VHB, e

amplificar um produto de 208 pares de base (pb), nas seguintes condições

temperatura, tempo e ciclos: 50 ° C, por 2 minutos e 95 ° C, durante 10 minutos;

seguidos por 45 ciclos de 95 ° C, durante 30 segundos, 60 ° C, durante 1 minuto e

72 ° C, durante 30 segundos.

Posteriormente, as amostras positivas no sistema RT-PCR desenvolvido, o

DNA-VHB foi quantificado em sistema comercial totalmente automatizado COBAS

AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B virus (HBV) em se utilizou o teste

(CAP/CTM 48; Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), que apresenta um

limite inferior de 12 UI / mL (fator de conversão = 5,82 cópias / UI).

RESULTADOS

Do total de amostras avaliadas em 47,4% (27/57) dos isolados foi identificado

a presença do VHB-DNA, pela técnica da PCR em tempo real desenvolvida, e em

23/57 (40,3%) confirmadas pela qRT-PCR comercial, sendo todas estas amostras

dos isolados reativas, também para o HBsAg, em que não foi identificado a infecção

oculta pelo VHB, nesta população de estudo.

48

DISCUSSÃO CONCLUSÃO

Apesar de a Amazônia ocidental ser considerada uma das regiões do mundo

de maior prevalência de infecção pelo VHB, ainda pouco se sabe sobre a infecção B

oculta.

Com o desenvolvimento das técnicas empregadas no estudo da biologia

molecular possibilitou a identificação do VHB-DNA, o que permite compreender

melhor a epidemiologia da infecção.

No presente estudo a técnica da RT-PCR utilizada na detecção do VHB, com

sistema SYBR-Green, mostrou-se sensível, porém pouca específica, uma vez que 4

amostras foram consideradas positivas. Este resultado é esperado devido o sistema

apresentar sinais falso-positivos, pois os fluoróforos ligam-se a qualquer dupla-fita

de DNA, além da sequência alvo, principalmente após vários ciclos. 20

Este trabalho pode ser considerado pioneiro na busca de evidencias da

infecção B oculta, em populações remotas da Amazônia Ocidental brasileira. Nos

grupos populacionais, em geral, é descrito a IBO de forma heterogênea na sua

prevalência, o que se observa é que não obrigatoriamente, esta forma de infecção

segue os mesmos padrões de prevalência infecção do VHB pelo mundo, como no

continente Asiático como a Indonésia (12,5%),21 Hong Kong (0,13%) 22 e pré-

doadores de sangue na Coréia (0,7%); 23 na Europa, entre os imigrantes na Itália

(3,2%);24 países do Continente Americano: México (14,2%),25 nos Estados Unidos

da América, naqueles com evidencia de infecção prévia (18%) e sem evidencia

(8,1%)26 e entre os Ameríndios na Argentina.27

No Brasil é relatado a IBO em comunidades afrodescendentes (1,7%) 28 e

rural (6,5%) 29 no estado da Bahia, e 0% em pré-doadores de sangue em Porto

49

Alegre.30 Na região Amazônica, no estado do Amazonas, foi detectado a presença

do DNA-VHB (17%), em portadores de hepatopatia crônica de etiologia

desconhecida, com associação positiva a presença de icterícia e a coinfecção com o

HIV.31

Conclui-se que a prevalência da IBO é baixa na população de estudo.

Embora, o estudo tenha sido realizado em área considerada de alta prevalência de

infecção pelo VHB, em que não foi identificado a infecção B oculta, entre os

participantes, com evidencias sorológicas de contato prévio com VHB (anti-HBc-

reativo).

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53

ORIGINAL PAPER

Filogenia e caracterização do genótipo F do vírus da hepatite B (F/VHB) em

comunidades remotas da Amazônia ocidental brasileira

Márcia da Costa Castilho1,2, Cintia Mara Costa de Oliveira1,2, Rajendranath

Kamasawmy1, Wornei Silva Miranda Braga1,2

1. Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Gerência de

Virologia, Manaus, Amazonas, Brasil

2. Universidade do Estado do Amazonas, Programa de Pós-graduação em

Medicina Tropical, Manaus, Amazonas, Brasil

RESUMO

Com base nas características moleculares do VHB, este estudo propõe-se em

classificá-lo filogenéticamente, bem como descrever as variações no seu gene de

Superfície (S), nas sequências nucleotidicas procedentes de área endêmica de

infecção, da Amazonia Ocidental Brasileira. Materiais e Métodos: Foram estudas

13 sequências parciais do DNA-VHB, previamente classificadas como genótipo

VHB/F, isoladas de portadores crônicos do VHB (HBsAg-reativo), de um inquérito

soroepidemiológico, em três comunidades ribeirinhas remotas, do estado do

Amazonas, Brasil. As sequências foram alinhadas com as de referência depositadas

no GenBank. Utilizou-se os programas BioEdit para alinhamento, Mega 5 para a

análise filogenética, além dos algoritmos HepSEQ e HBVSeq para caracterização de

mutações. Resultados: Todos as sequencias foram classificadas como genótipo

F/F2a. Foram detectadas variações polimórficas no gene S/VHB, no dominio da

transcriptase reversa (rt), em 11 dos isolados, foi observado um padrão de

mutações (rtE11Q + rtsH13Y + rtM129L + rt137TS). Destas, 10 com presença de

viremia (HBeAg-reativo e carga viral elevada). Um isolado apresentou a mutação na

posição 184 (rtA184V). No gene do envelope foram encontradas mutações, porém

não associado à expressão do HBsAg (determinante “a”). Conclusão: Este estudo

descreve a predominância do subgenótipo VHB/F2a, e pela primeira vez as

variantes polimórficas naturais, numa população de elevada endemicidade, da

Amazônia Ocidental brasileira.

54

INTRODUÇÃO

A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 2 bilhões de pessoas

estão infectadas com o vírus da hepatite B (VHB), destas 400 milhões são

portadoras crônicas da hepatite B.1 A região Amazônica é descrita como uma das

regiões, no mundo, mais prevalentes da infecção pelo VHB. 2-5

O VHB é um vírus DNA da família Hepdanaviridae, o genoma é dupla fita-

parcialmente circular, composto de aproximadamente 3.200 nucleotídeos (nt), com 4

aberturas de leitura (ORF) que codificam os genes P, préC/C, préS1/préS2/S e X.6

Com base nas diferenças genéticas (> 8%), entre as sequencias completas, e do

antígeno de superfície ( > 4%) entre os grupos, 7 o VHB, atualmente, é classificado

em 10 genótipos (A-J), na sua maioria, com distribuição geográfica restrita.8 O

genótipo A é de distribuição global, principalmente descrito na Europa, América do

Norte, África e Índia. Os genótipos B e C são característicos da Ásia, enquanto o

genótipo D tem distribuição mundial, e predomina nas regiões do Mediterrâneo. Os

genótipos E é encontrado no continente Africano e o F nas populações indígenas da

América do Sul. O genótipo G nos Estados Unidos, México e França, o genótipo H,

nos países da América Central, 9 e recentemente, dois novos genótipos foi proposto:

o genótipo I descrito no Vietnam 10 e o J no Japão.11

No entanto, a origem e a história evolutiva do VHB e, em particular, do

genótipo F, típico do continente americano, ainda são incertas, 12 e o conhecimento

da disseminação do HBV/F na América permanece indescritível. 13 O que se

conhece da literatura é a distribuição geográfica do genótipo F, que ocorre desde o

Alaska até a Argentina, relatado de forma quase exclusiva, como característico das

populações indígenas. É classificado em 4 subgenótipos (F1 a F4).14 O F1 é

encontrado no Alaska, Argentina e Brasil; O F2 é prevalente na Venezuela e Brasil,

55

e o F3 na Venezuela, Colômbia e Panamá, e o genótipo F4 é referido na Argentina

e Bolívia.14 Os genótipos F2 e F3 estão associados às formas fulminantes de

hepatite, na coinfeccão com o vírus da hepatite D (VHD). 15-17

Na Amazônia brasileira, em estudos anteriores, as análises filogenéticas

indicaram a ocorrência18-23 e, em algumas localidades a predominância do genótipo

F na região ocidental. 24

Ainda, com correlação a variabilidade genética do VHB, a seleção de

mutações pontuais, nos diferentes genes virais é influenciada, seja sob a pressão da

imunidade do hospedeiro ou tratamento antiviral. A proteína do envelope do VHB

(HBsAg) é composto por 226 aminoácidos (aa) e contém uma região central

chamada de Região Hidrofílica Maior (MHR), que compreende os aminoácidos da

posição 99 a 169. Esta região é altamente imunogênica e sofre pressão selectiva do

sistema imunitário.25,26 Nesta mesma região está localizado um agrupamento de

epítopos, entre os aminoácidos 124 e 147, denominado determinante “a”. As

mutações que ocorrem na região MHR têm influenciado importantes questões

médicas e de saúde pública, tais como: falha na resposta da vacina contra hepatite

B, má resposta às terapias antivirais e fallha na detecção sorológica da infecção, por

alguns reagentes (kits) comerciais. 27 Entretanto, mutações podem também surgir

naturalmente em portadores crônicos do HBV, e está associado à persistência viral e

gravidade da doença. 28

Os objetivos do presente estudo foram avaliar as características filogenéticas,

e relatar a ocorrência de variações no gene S do genoma VHB, de sequências

nucleotídicas obtidas de amostras de portadores crônicos do VHB, procedentes de

comunidades isoladas da Amazônia Ocidental brasileira, considerada área de alta

prevalência da infecção.

56

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de

Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus, Amazonas, Brasil

(No.:1775/2006/FMT).

MATERIAIS E MÉTODOS

Foram incluídas neste estudo 13 sequências nucleotídicas parciais do DNA-

VHB, isolados de amostras de portadores crônicos do VHB (HBsAg-reativo)

coletadas durante um inquérito soroepidemiológico de base populacional, realizado

em junho de 2008, em três comunidades ribeirinhas (Madeirinho, Praia do Buraco e

Samúma), no Município de Lábrea, Estado do Amazonas, conforme descrito em

estudo anterior. 24

As sequências dos isolados, aqui analisadas, estão depositadas no GenBank

sob os número de acesso: 17 LBra (JQ246014); 26 LBra (JQ246015), 36 LBra

(JQ246016); 38 LBra (JQ246017), 44 LBra (JQ246018), 45 LBra (JQ246019), 46

LBra (JQ246020), 68 LBra (JQ246021), 70 LBra (JQ246022), 74 LBra (JQ246023),

75 LBra (JQ246024), 78 LBra (JQ246025), 138 LBra (JQ246027). Todas

classificadas previamente como genótipo F/VHB.

O percentual similaridade entre as sequências do estudo, e as depositadas no

GenBank, foi obtido usando o algoritmo BLASTN 29 2.2.27+

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Posteriormente, estas foram alinhadas com

as sequências que não apresentavam descrição de variações em seu genoma (Wild

Type - WT) obtidas, também no GenBank, utilizando-se o programa BioEdit

Sequence Alignment Editor 30 versão 7.0.9.0.18. A análise filogenética foi realizada

com o programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 5) 31 versão 5.19

(REF), utilizou-se o modelo de substituiçao de nucleotideos Kimura 2 parâmetros

57

(G=1,98). O intervalo de confiança para inferência dos grupos filogenéticos, foi

obtido pelo método não-paramétrico de bootstrap baseado em 1000 replicações.

Para a caracterização das mutações no gene S do VHB, as sequências

nucleotídicas foram analisadas em dois algoritmos internacionais de repositório de

estirpes do VHB: HepSEQ32 - (http://www.hepseq.org/Public/Web_Front/main.php) e

HBVseq33 - (http://hivdb.stanford.edu/HBV/HBVseq/development/HBVseq.html), que

caracterizam mutações na regiao/domínio da transcriptase resversa A tradução da

sequência em aminoácidos, bem como a localização dos códons, junto as

sequencias de referencias foi realizado com o programa BioEdit.

RESULTADOS

A análise filogenética agrupou as 13 sequências do genótipo F/VHB, com as

sequências de referência dos subgenótipos F/F2a (Figura 1), com intervalo de

confiança de 65% comparada às sequencias (WT) VHB/F2a, e divergência de 59%,

em relação outros subgenótipos. A análise realizada no BLASTN demonstrou que

essas sequências apresentam similaridade de 99% (e-value=0,0), comparadas às

sequências (WT) VHB/F2a (AY311369 e AY090455), em que foram demonstradas

variações polimórficas (Figura 2).

A análise de mutações em 11 sequências do estudo, demonstrou que 5

apresentaram polimorfismo no gene S do VHB/F, na Região Hidrofílica Maior (MHR),

sendo em 3, identificada no domínio do determinante “a”: sQ129M, sL127P,

sG130E, sF134V, sC137V e sC138R (Figura 2). Detectou-se, também polimorfismos

na região da rt, sendo as mais frequentes: H13Y (92,7%); E11Q (85,7%); M129L

(78,6%) e S137T (78,6%), destre outras variações encontradas isoladamente. Em

10/11 sequencias com viremia presente (HBeAg-reativo), foi observado o padrão

58

polimórfico (rtE11Q + rtH13Y + rtM129L + rtI137T). A sequencia do isolado LBra 138

apresentou a mutação na posição 184 (A184V) (Tabela 1).

DISCUSSÃO

Embora a Amazônia ocidental seja considerada uma das regiões do mundo

de maior prevalência de infecçao pelo VHB, pouco se sabe sobre as características

moleculares das cepas circulantes.

De acordo com as análises das variações polimórficas do gene S, entre os

códons Região Hidrofílica Maior (MHR), que contem o determinante “a”, (posição aa

124-147), que codifica o antígeno de superfície (HBsAg), não foram encontrados

mutações associadas à expressão do HBsAg, nas posições 145 , 131 e 141, que

pudessem ter causado efeito na resposta vacinal. 34

A caracterização molecular de Seqüências de HBV é importante para

estabelecer a evolução origens e padrões para a dispersão viral. A Análise

filogenética mostrou que o genótipo VHB F/F2a foi o predominante na área de

estudo. O subtipo F2 é descrito circulando em tribos indígenas localizadas no oeste

das Américas . 14,35

Com relação à predominância do genótipo F e o surgimento dos

subgenótipos, alguns estudos tentam explicar essas particularidades e

peculiaridades na sua manutenção e dispersão pelo continente Américano. Uma

hipótese estaria realacionado as características genéticas da população, favoráveis

à interação vírus e hospedeiro, e as circunstâncias, também favoráveis de

transmissão, sejam pelo próprio crescimento da população, processos migratórios,

59

mudanças no padrão de comportamento, conflitos ou guerras civil, em que teriam

essas variantes do VHB/F se estabelecido em uma região. 12,13

No Brasil o genótipo F tem uma baixa prevalência, em comparação ao

genótipo A, que é pertinente à intensa imigração africana para o país. 36 Estudos

realizados na Amazônia ocidental brasileira, o genótipo F é frequentemente descrito

em diferentes localidades, no Amazonas,19-21,23.24 Acre 18 e Rondônia,22 sugerindo a

influência indígenas nesta população específica.14 Todas as sequências descritas no

estudo foram caracterizadas como subgenótipo F2a, e que também foi encontrado

em Rondônia, 22 Os sequências do gene S, neste estudo são semelhantes às

procedentes da Venezuela, 37 Nicarágua 38 e, no Brasil de Santa Catarina.39

Em relação à análise de mutações da sequencia referente à amostra 138

LBra, destacamos a presença da mutação na posição 184 (rtA184V), no gene S

dentro do domínio da transcriptase reversa (rt), associado a resistência ao análogo

de nucleosídeo (Entecavir). Esta mutação é descrita quando associadas às

mutações de resistência ao antiviral (Lamivudina). Ressaltamos que a amostra é

proveniente de estudo em população geral, considerada assintomática, sem história

ou uso de antivirais, portanto não foi identificado suas correspondentes nas posições

sM204V/I e sL180M que pudesse conferir resistência antiviral. 40

Finalmente, apesar das sequências do estudo apresentaram semelhanças

com o subgenótipo VHB/F2a, é descrito pela primeira vez um padrão de variantes

polimórficas, naturalmente encontradas, numa população de elevada endemicidade

para o VHB, da Amazônia Ocidental brasileira.

60

Figura 1. Árvore filogenética em que demonstra a classificaçao dos genótipos e

subgenótipos do VHB, nos 13 isolados identificados como LBra. A topologia foi

obtida com 46 sequencias parciais do gene S do VHB (33 de diferentes

subgenótipos obtidas do GenBank que são apresentadas com número de acesso,

seguido pelo genótipo e pais de origem). A análise filogenética foi realizada pelo

programa Mega 5, com método Neibor-Joining e o modelo de substituiçao de

nucleotideos Kimura 2 parâmetros (G = 1,98). Os valores de bootstrap obtidos com

1000 replicações.

61

Figura 2. Sequências parcial de aminoácidos do gene S região que codifica o

HBsAg do VHB, dos isolados (LBra), em que todas foram caracterizadas no genótipo

HBV/F2a, alinhados com as sequências consenso obtidas no GenBank. A caixa

indica o domínio determinante “a", e as substituiçoes de aminoácidos.

62

63

ID/(FN): Amostra/(Família número); M: Masculino; F: Feminino; Gene S , inclui a região

Hidrofílica Maior (MHR); Carga viral no plasma (DNA-HBV): IU/mL; *> acima do limite de

detecção do teste; <** abaixo do limite de detecção do teste; N: Negativo; P: Positivo; ND:

Não determinado. ∆ mutação identificada apenas pelo programa HepSEQ.

64

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5 CONCLUSÕES

1) O VHB circula com importante intensidade na região;

2) Foi demonstrado um padrão em que se define a existência de bolsões de

portadores crônicos do VHB, onde se concentram os potenciais reservatórios,

estando à infecção associada a idades precoces, e provavelmente também à

frequência e intensidade dos contatos com o VHB;

3) Fica demonstrado a importancia da transmissão vertical, uma vez que foram

identificados portadores menores de 4 anos de idade;

4) Não foi possível identificar os prováveis mecanismos de transmissão

horizontal de caráter familiar, embora tenham se identificado os principais

atores envolvidos na dinâmica de transmissão;

5) Foi encontrada uma baixa prevalência da infecção B oculta, uma vez que, não

foi identificado o DNA-VHB, naqueles participantes com evidências

sorológicas de contato prévio com VHB (anti-HBc-reativo);

6) O genótipo F foi predominantemente encontrado, independente da

comunidade estudada, sendo ainda todos classificados como F/F2a;

7) As semelhanças entre as sequências nucleotidicas confirmam o caráter

familiar da transmissão do VHB na população estudada;

8) Foi possivel determinar um padrão de polimorfismo característico nas

sequencias analisadas, o que também reforça a transmissão familiar.

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86

7 ANEXOS

7.1 Termo de Consentimento

87

88

7.2 Questionário

FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS GERÊNCIA DE VIROLOGIA

Questionário Projeto: Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na Saúde Pública

Nº da Amostra: ____________ Família: ____________________ IDENTIFICAÇÃO 1 – Nome:_____________________________________________________________________ 2 – Parentesco com o responsável pela família: [ ]Esposa(o) [ ]Filho(a) [ ]Pai/Mãe [ ]Irmão(ã) [ ]Enteado(a) [ ]Sobrinho(a) [ ]Neto(a) [ ]Agregado [ ] outro: ____________________ 2 – Endereço: _______________________ Localidade: _________________________________ 3 – Idade: __________________ anos 4 – Data do nascimento:______/_____ /______5 – Sexo: [ ] Masculino [ ] Feminino 6 – Procedência:_________________________ 7 – Tempo em que vive neste local:_____________________________________ 8- Razões para mudança:_________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ASPECTOS SOCIO-ECONÔMICOS 1 – Já freqüentou ou freqüenta escola? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, quantos anos? _____________ 2 – Ocupação principal: _______________________ 3 – No momento você está: [ ] Casado [ ] Junto [ ] Separado/divorciado [ ] Viúvo [ ] Solteiro 4– Com que idade você se casou pela primeira vez? ________ anos. 5- Quantas vezes? _________ 6 – Renda familiar: R$ ________________________ 7 – Quantos cômodos tem a sua casa? _______ cômodos. 8 - Quantos quartos? ____________quartos. 9 - Quantas pessoas vivem na casa?_______ pessoas. 10 - Qual o número de pessoas por quarto?________ pessoas. ______________________________________________________________________________ FATORES DE RISCO ABASTECIMENTO DE ÁGUA TRATAMENTO DA ÁGUA

[ ] Rio [ ] Poço [ ] Chuva [ ] Serv. Público [ ] Outros____________

[ ] Filtrada [ ] Fervida [ ] Clorada [ ] Não tratada [ ] Outros____________

DESTINO DO LIXO DESTINO DOS DEJETOS INSTALAÇÃO DO SANITÁRIO

[ ] Coleta Pública [ ] Queimado [ ] Enterrado [ ] Mata [ ] Rio [ ] Outros__________

[ ] Fossa negra [ ] Mata [ ] Rio [ ] Esgoto público [ ] Outros____________

[ ] Dentro da casa [ ] Fora da casa [ ] Outros____________

89

1-Fez cirurgia? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, que tipo?____________________________ Onde?____________________ Por quê? _____________________Quando?_____/_____/_____ 2- Recebeu transfusão de sangue? [ ]SIM [ ]NÃO Se, sim, onde?___________________ Quando? _____/_____/_____ 3-Compartilha escova de dente com outras pessoas? [ ] SIM [ ] NÃO 4- Compartilha lâmina de barbear? [ ] SIM [ ] NÃO 5-Tem tatuagem? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, há quanto tempo ?__________ anos. 6-Tem orelha furada? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, há quanto tempo ?__________ anos. 7-Quantos anos você tinha quando manteve a sua primeira relação sexual? ________ anos.

[ ]Criança [ ]Não quis responder 8- Você teve alguma doença abaixo:

[ ]Gonorréia [ ]Sífilis [ ]Verrugas genitais [ ]Corrimento genital [ ]Bolhas genitais [ ]Câncro [ ]Outras, Especificar__________________________________________

9- Você trabalha em serviço de saúde? [ ] SIM [ ] NÃO 10- Bebe bebida alcoólica? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim: [ ] Todos os dias [ ] Fins de semana [ ] Eventualmente 11- Você fuma? [ ] SIM [ ] NÃO Se, sim. Fuma, por dia: [ ] de 1 a 10 [ ] de 11 a 20 [ ] mais de 20 cigarros 12- Uso de drogas injetáveis? [ ] SIM [ ] NÃO 13- Uso de drogas fumadas? [ ] SIM [ ] NÃO 14- Uso de drogas cheiradas? [ ] SIM [ ] NÃO 15- Alguém na sua casa teve:

Hepatite? [ ] SIM [ ] NÃO

Icterícia (olho amarelado)? [ ] SIM [ ] NÃO

Colúria (urina cor de guaraná)? [ ] SIM [ ] NÃO

Se sim, quem? [ ]Mãe [ ]Pai [ ]Irmão(ã) [ ]Companheiro(a) [ ]Filho(a) [ ]Outros: _________________

Passado de icterícia (olho amarelado)? [ ] SIM [ ] NÃO 16-Passado de colúria (urina cor de guaraná)? [ ] SIM [ ] NÃO 17-Você já teve hepatite? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, quando? ____/_____/_____ 18- História de vacina contra hepatite B ? [ ] SIM [ ] NÃO 19-Número de doses: [ ] UMA Data da 1ª DOSE : ____/____/____ [ ] DUAS Data da 2ª DOSE : ____/____/____ [ ] TRÊS Data da 3ª DOSE : ____/____/____ 20-Passado de malária? [ ] SIM [ ] NÃO

DATA: ____/_____/_____ _____________________________

ENTREVISTADOR

90

7.3 Certificados de Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa

91

92

93

7.4 Errata do Artigo 1

Am. J. Trop. Med. Hyg, 2012

doi:10.4269/ajtmh.2012.12-0083

Copyright © 2012 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene

Epidemiology and Molecular Characterization of Hepatitis B Virus Infection in Isolated

Villages in the Western Brazilian Amazon

A data de acesso dos endereços eletrônicos referenciados: 16 de novembro de

2011.

Temos sublinhados:

1) Na página 3 da Discussion: 2º’ parágrafo, linha3: onde se lê 20,27 considerar as

reas referências 26,27;

2) Na página 4, Table 3. Onde se lê Lbrea, o correto é a palavra Lábrea;

3) Página 5, Figure 2. Onde se lê Lbrea, o correto é a palavra Lábrea;

4) Página 6. Acknowledgments. Por favor, remova e na linha 6 e adicionar na linha 7

Professores Kátia ....

5) Página 6, References 22. A palavra correta é Austrália;

6) Página 7 References 38 e 56, onde se lê Paran, a palavra correta é Paraná.

94

7.5 Depósito das sequencias nucleotídicas no GenBank

1.Hepatitis B virus isolate 74_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,056 bp linear DNA

Accession: JQ246023.1

GI: 385153554

GenBank FASTA Graphics PopSet

2.Hepatitis B virus isolate 78_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,056 bp linear DNA

Accession: JQ246025.1

GI: 384597974

GenBank FASTA Graphics PopSet

3.Hepatitis B virus isolate 70_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,043 bp linear DNA

Accession: JQ246022.1

GI: 384597969

GenBank FASTA Graphics PopSet

4. Hepatitis B virus isolate 46_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,034 bp linear DNA

Accession: JQ246020.1

GI: 384597965

GenBank FASTA Graphics PopSet

5. Hepatitis B virus isolate 44_LBra large S protein (S) gene, partial cds

610 bp linear DNA

Accession: JQ246018.1

GI: 384597961

95

GenBank FASTA Graphics PopSet

6. Hepatitis B virus isolate 36_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,033 bp linear DNA

Accession: JQ246016.1

GI: 384597957

GenBank FASTA Graphics PopSet

7. Hepatitis B virus isolate 138_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,056 bp linear DNA

Accession: JQ246027.1

GI: 385153556

GenBank FASTA Graphics PopSet

8.UNVERIFIED: Hepatitis B virus isolate 26_LBra large S protein-like (S) gene, partial

sequence

1,001 bp linear DNA

Accession: JQ246015.1

GI: 385153553

GenBank FASTA Graphics PopSet

9. Hepatitis B virus isolate 124_LBra large S protein (S) gene, partial cds

990 bp linear DNA

Accession: JQ246026.1

GI: 384597976

GenBank FASTA Graphics PopSet

10. Hepatitis B virus isolate 75_LBra large S protein (S) gene, partial cds

210 bp linear DNA

Accession: JQ246024.1

GI: 384597972

GenBank FASTA Graphics PopSet

96

11. Hepatitis B virus isolate 68_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,056 bp linear DNA

Accession: JQ246021.1

GI: 384597967

GenBank FASTA Graphics PopSet

12. Hepatitis B virus isolate 45_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,056 bp linear DNA

Accession: JQ246019.1

GI: 384597963

GenBank FASTA Graphics PopSet

13. Hepatitis B virus isolate 38_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,056 bp linear DNA

Accession: JQ246017.1

GI: 384597959

GenBank FASTA Graphics PopSet

14. Hepatitis B virus isolate 17_LBra large S protein (S) gene, partial cds

1,056 bp linear DNA

Accession: JQ246014.1

GI: 384597954

GenBank FASTA Graphics PopSet

97

7.6 Análises pelos algoritmos HBVSeq e HepSEQ

HBVseq

SeqID: 74 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%).

(c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation.

(d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H Y

1.3

N0.3

L0.3

R H

4.9

L3.7

S0.6

C0.3

N

0.3

N H

23.9

S4.1

R1.6

Y0.8

L

0.5

H N

0.6

Y0.4

R0.1

L0.1

H Y

1.4

H Y

18.7

H H H H N

R

S1.2

Y1.2

L

0.7

C0.0

H N

R

S0.8

L0.8

D

0.4

Y0.4

H N

R

S6.2

L2.1

H N

R

S0.8

C0.8

L

0.8

129 CTG L M

L44.1

V

1.4

P0.5

K0.2

M

L1.1

V

0.4

M

L8.4

M

L10.0

V

0.3

I0.1

L

M0.9

H

0.4

M

L22.0

L

M4.3

L M

L25.8

M

L V

0.4

P0.1

H0.0

I

0.0

K0.0

M

L V

0.5

M

L

M

L

137 ACA T S

T1.2

S S

T0.4

Y

0.1

S

T0.4

S S

T24.4

S S S S

T1.1

Y

0.0

S

T0.7

Q

0.2

S S

Q0.5

T

0.5

98

Genotype Analysis 74 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1056 99.82 F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

99

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

100

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

101

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

HBVseq

SeqID: 78 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their

frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be

obtained by clicking here.

Pos NA AA NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

102

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H Y

1.3

N0.3

L0.3

R H

4.9

L3.7

S0.6

C

0.3

N0.3

N H

23.9

S4.1

R1.6

Y

0.8

L0.5

H N

0.6

Y0.4

R0.1

L

0.1

H Y

1.4

H Y

18.7

H H H H N

R

S1.2

Y

1.2

L0.7

C0.0

H N

R

S0.8

L

0.8

D0.4

Y0.4

H N

R

S6.2

L

2.1

H N

R

S0.8

C

0.8

L0.8

129 CTG L M L

44.1

V1.4

P0.5

K0.2

M L

1.1

V0.4

M L

8.4

M L

10.0

V0.3

I0.1

L M

0.9

H0.4

M L

22.0

L M

4.3

L M L

25.8

M L

V0.4

P0.1

H0.0

I

0.0

K0.0

M L

V0.5

M L

M L

137 ACA T S

T1.2

S S

T0.4

Y

0.1

S

T0.4

S S

T24.4

S S S S

T1.1

Y

0.0

S

T0.7

Q

0.2

S S

Q0.5

T

0.5

Genotype Analysis 78 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1056 99.82 F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

103

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

104

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ............................................................

105

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

106

HBVseq

SeqID: 70 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.7%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation.

(d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N0.3

L

0.3

R

H4.9

L3.7

S

0.6

C0.3

N0.3

N

H23.9

S4.1

R

1.6

Y0.8

L0.5

H

N0.6

Y0.4

R

0.1

L0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N

R S

1.2

Y1.2

L0.7

C

0.0

H

N

R S

0.8

L0.8

D0.4

Y

0.4

H

N

R S

6.2

L2.1

H

N

R S

0.8

C0.8

L0.8

129 CTG L M

L44.1

V1.4

P

0.5

K0.2

M

L1.1

V0.4

M

L8.4

M

L10.0

V0.3

I

0.1

L

M0.9

H0.4

M

L22.0

L

M4.3

L M

L25.8

M

L

V0.4

P

0.1

H0.0

I0.0

K0.0

M

L

V0.5

M

L

M

L

137 ACA T S T

1.2

S S T

0.4

Y0.1

S T

0.4

S S T

24.4

S S S S T

1.1

Y0.0

S T

0.7

Q0.2

S S Q

0.5

T0.5

107

Genotype Analysis 70 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1043 99.64 F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

108

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

109

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .................c...a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

110

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

111

HBVseq

SeqID: 46 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.7%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by

clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be

obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N0.3

L

0.3

R

H4.9

L3.7

S

0.6

C0.3

N0.3

N

H23.9

S4.1

R

1.6

Y0.8

L0.5

H

N0.6

Y0.4

R

0.1

L0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N

R S

1.2

Y1.2

L0.7

C0.0

H

N

R S

0.8

L0.8

D0.4

Y0.4

H

N

R S

6.2

L2.1

H

N

R S

0.8

C0.8

L0.8

18 AAG K R

K2.7

S0.3

R

K1.7

R

K0.8

S0.2

R

G1.0

S0.7

T0.1

K

0.1

R

K0.9

G0.5

R R R

K4.3

R R

K1.0

S0.3

G0.3

T

0.0

R

S1.1

K0.7

T0.4

R

S2.0

K2.0

R

S1.6

T0.8

K0.8

129 CTG L M

L44.1

V1.4

P

0.5

K0.2

M

L1.1

V0.4

M

L8.4

M

L10.0

V0.3

I

0.1

L

M0.9

H0.4

M

L22.0

L

M4.3

L M

L25.8

M

L

V0.4

P

0.1

H0.0

I0.0

K

0.0

M

L

V0.5

M

L

M

L

137 ACA T S

T1.2

S S

T0.4

Y0.1

S

T0.4

S S

T24.4

S S S S

T1.1

Y0.0

S

T0.7

Q0.2

S S

Q0.5

T0.5

112

Genotype Analysis 46 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1034 99.64 F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, R18K, M129L, S137T

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__K__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

113

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t...............a..................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

114

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

115

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

116

HBVseq

SeqID: 44 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

The following warning messages have been generated. Please take corrective action and

try again.

1. Too small RT amino acid positions found: position 1 to 45

Genotype Analysis 44 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted

genotype

610 68.12 E

No confidence prediction - Max sequence %ID < intra-genotype E lower boundary

The query sequence is not similar enough to any reference sequence to allow

genotype prediction.

Intra-genotype E mean %ID: 98.98 Intra-genotype E st dev.: 0.37

Genotype E lower boundary: 98.25

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence H06_042_0358 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

K11Q, H13Y, I16T, A38T

117

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype E consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__K__H__H__I__R__I__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggaaagcatcacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttctt

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__-__-__-__-_

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__A__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ---------------....gc.gg.....a...---.....-.-cc.a.c....gg....

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__R__G__S__S__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggagctcccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactc

Input ..c..acca..a...tc.a.-..aga.-.-...............t.-..t.-.a...a-

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcttgtcctccaatttgtcctggctatcgctggatgtgtctgcggcgttttat

Input .a...g.ag...---g..-.a------....a.a.aag.t.g.a..gg.a.....cc.-.

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

118

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ..-.a-..c.ca..cggg.....--..-----------g.g...g..c..a--.gc.-..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__N__S__R__I__I__N__H__Q__Y__G__T__L_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcatcaaccaccagtacgggaccctg

Input ....g....c..a..cc.-.....gc..-.-----..c...t.gg.g..c.....-----

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _P__N__L__H__D__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__M__L__L__F__K_

Consensus ccgaacctgcacgactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgttcaaa

Input --.....aa.-.--.cag.-..--------...c.cc--.--..-.------a.---...

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _T__F__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__M__G__F__R__K__I_

Consensus accttcggacggaaattgcacttgtattcccatcccatcatcatgggctttcggaaaatt

Input ...a..-c....c..-....-g..g.a-.t..a....c..c..g.ct....--.g--.-.

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttca

Input ..c.-...taa......g.c...--.g..gg........-..--c..g.a..------..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__V__V__L_

Consensus gtggttcgccgggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggtattg

Input .aac.g.t-.c.a....g..t.t..ca.a-t.-a...a.ct.c.c..a..-c.-.----.

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

119

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__S__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttatacctctgttaccaattttcttttg

Input ...c....--...a........ag..c...tagg..--..........gg.g.gt..c.-

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__L__G__I__H__L__N__P__N__K__T__K__R__W__G__Y__S__L__N__F_

Consensus tctttgggtatacatttaaatcccaacaaaacaaaaagatggggatattccctaaatttc

Input .-g..--.---...--a.........t.cc...g.g.........c--------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgtaattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

HBVseq

SeqID: 36 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence;

120

Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%).

(c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N0.3

L0.3

R

H4.9

L3.7

S0.6

C

0.3

N0.3

N

H23.9

S4.1

R1.6

Y

0.8

L0.5

H

N0.6

Y0.4

R0.1

L

0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N

R

S1.2

Y

1.2

L0.7

C0.0

H

N

R

S0.8

L

0.8

D0.4

Y0.4

H

N

R

S6.2

L

2.1

H

N

R

S0.8

C

0.8

L0.8

129 CTG L M L

44.1

V1.4

P0.5

K

0.2

M L

1.1

V0.4

M L

8.4

M L

10.0

V0.3

I0.1

L M

0.9

H0.4

M L

22.0

L M

4.3

L M L

25.8

M L

V0.4

P0.1

H

0.0

I0.0

K0.0

M L

V0.5

M L

M L

137 ACA T S

T1.2

S S

T0.4

Y

0.1

S

T0.4

S S

T24.4

S S S S

T1.1

Y

0.0

S

T0.7

Q

0.2

S S

Q0.5

T

0.5

Genotype Analysis 36 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1033 99.82 F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

121

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

122

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

123

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

124

HBVseq

SeqID: 138 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.3%)

Mutations at established drug resistance positions: 181V

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation.

(d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N0.3

L

0.3

R

H4.9

L3.7

S

0.6

C0.3

N0.3

N

H23.9

S4.1

R

1.6

Y0.8

L0.5

H

N0.6

Y0.4

R

0.1

L0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N

R S

1.2

Y1.2

L0.7

C

0.0

H

N

R S

0.8

L0.8

D0.4

Y

0.4

H

N

R S

6.2

L2.1

H

N

R S

0.8

C0.8

L0.8

129 CTG L M

L44.1

V1.4

P

0.5

K0.2

M

L1.1

V0.4

M

L8.4

M

L10.0

V0.3

I

0.1

L

M0.9

H0.4

M

L22.0

L

M4.3

L M

L25.8

M

L

V0.4

P

0.1

H0.0

I0.0

K0.0

M

L

V0.5

M

L

M

L

137 ACA T S T

1.2

S S T

0.4

Y0.1

S T

0.4

S S T

24.4

S S S S T

1.1

Y0.0

S T

0.7

Q0.2

S S Q

0.5

T0.5

181 GTT V A

S0.2

G

0.2

A

T0.2

A

S0.1

G

0.1

A

S0.3

T

0.3

A A

S1.2

A A A A

S0.2

T

0.1

G0.1

A

T1.7

V

0.7

S0.4

A

V11.8

T

5.4

S2.2

A

V5.3

T

2.1

S1.1

185 AGG R S

G0.5

S

R0.2

S S

G0.3

T

0.1

S

G0.4

S S S S S

G0.2

T

0.0

R0.0

S

C0.2

G

0.2

S S

125

188 GGT G C R

0.2

C G

0.2

C Y

0.1

C C C C C C C R

0.0

G0.0

Y0.0

C C C

Genotype Analysis 138 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1056 99.28 F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

Mutation Drug(s)

Affected Comments Reference

A181V Lamivudine,

Adefovir

A181V/T is associated with

resistance to Adefovir

and/or Lamivudine

Yeh et al.,

Hepatology

2000;31:1318-1326,

Angus et al.,

Gastroenterol

126

2003;125:292-297

Resistance Pathway:

Pathway Inhibitor Interactions Reference

A181V

The A181T/V mutation has been associated

with resistance to Lamivudine (3TC) in the

absence of M204V/I. The A181T/V mutation is

associated with resistance to Adefovir

(ADV). The A181T/V mutation is associated

with cross resistance to Adefovir (ADV) and

Lamivudine (3TC).

al., Hepatology

2000;31:1318-1326;

Angus et al.,

Gastroenterol

2003;125:292-297

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T, S185R, C188G

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

127

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

128

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__V__.__.__.__R__.__.__G__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ..................................t............g......g.....

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

129

HBVseq

SeqID: 26 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 166

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.6%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: 165

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation.

(d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N0.3

L

0.3

R

H4.9

L3.7

S

0.6

C0.3

N0.3

N

H23.9

S4.1

R

1.6

Y0.8

L0.5

H

N0.6

Y0.4

R

0.1

L0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N

R S

1.2

Y1.2

L0.7

C

0.0

H

N

R S

0.8

L0.8

D0.4

Y

0.4

H

N

R S

6.2

L2.1

H

N

R S

0.8

C0.8

L0.8

129 CTG L M

L44.1

V1.4

P

0.5

K0.2

M

L1.1

V0.4

M

L8.4

M

L10.0

V0.3

I

0.1

L

M0.9

H0.4

M

L22.0

L

M4.3

L M

L25.8

M

L

V0.4

P

0.1

H0.0

I0.0

K0.0

M

L

V0.5

M

L

M

L

137 ACA T S T

1.2

S S T

0.4

Y0.1

S T

0.4

S S T

24.4

S S S S T

1.1

Y0.0

S T

0.7

Q0.2

S S Q

0.5

T0.5

165 TGC C G

D0.2

G G G

A0.1

G G G G G G

A0.0

D

0.0

G G G

130

Genotype Analysis 26 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1001 98.00 F

Low confidence prediction - Max sequence %ID > genotype F lower boundary

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T, G165C, K168N, P170L

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

131

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

132

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__C__.__.__N__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t.......................t......c..t....

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _L__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input t...g.a..a.at-.....-----------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

133

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

HBVseq

SeqID: 124 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: D (99.1%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype D sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%).

(c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation.

(d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

134

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

21 TCT S A S

0.5

T0.5

A S

0.3

G0.3

A S

0.2

A S

13.8

T1.2

A A A S A A S

T0.4

G0.0

A S

A S

T2.0

A S

57 CCT P S P

0.3

S P

0.3

S F

0.3

Y0.2

S P

0.1

S S F

1.3

S S S S F

0.1

P0.1

Y0.0

S F

0.3

C0.3

S S P

0.6

122 CTC L N H

35.6

Y0.7

K0.5

Q

0.5

P0.2

D0.2

I0.2

L

0.2

I N

0.9

F0.6

V0.6

S

0.4

L0.4

T0.2

I F

3.4

N1.6

L1.4

V

1.1

T0.3

H0.1

del0.1

F L

14.8

I6.5

V4.0

S

0.4

N0.3

C0.1

D0.1

I F

0.9

L0.9

S0.4

T

0.4

N0.4

H Y

15.9

N1.2

L Y N

13.0

F4.3

L N

6.7

F3.3

I L

H

F N

Y

V1.5

S0.2

T

0.1

K0.1

Q0.1

D

0.1

P0.0

del0.0

C0.0

I L

H

F N

Y

V1.8

S0.3

D

0.3

R0.3

I L

H

F N

Y

V1.2

I L

H

F N

Y

V1.1

130 CCG P Q

A0.7

S0.2

K0.2

P

0.2

Q

P0.2

Q Q

P12.1

S0.4

H0.1

E

0.1

P

Q2.2

Q Q Q Q Q

P

A0.1

S0.1

H

0.0

K0.0

E0.0

Q

P

S0.7

H0.2

K

0.2

R0.2

Q

P

Q

P

Genotype Analysis 124 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

135

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

990 99.46

D

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype D mean %ID

Intra-genotype D mean %ID: 98.00 Intra-genotype D st dev.: 0.80

Genotype D lower boundary: 96.40

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X65257 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

A21S, S57P, F122L, Q130P

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype D consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__S__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__I__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttctt

Input .................................t..........................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__A__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaagaatcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

136

Input ........................................................g...

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__P__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__N__Y__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggaactaccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactc

Input .................c...c......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__N__S__R__I__F__N__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcttcaaccaccagcacgggaccatg

Input ....................................c.......................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _P__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__D__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__Y__Q_

Consensus cagaacctgcacgactcctgctcaaggaacctctatgtatccctcctgttgctgtaccaa

Input .c..........................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

137

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__F__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accttcggacggaaattgcacctgtattcccatcccatcatcctgggctttcggaaaatt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__V__V__L_

Consensus gtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattg

Input ..............----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__F__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaagtctgtacagcatcttgagtccctttttaccgctgttaccaattttcttttg

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__L__G__I__H__L__N__P__N__K__T__K__R__W__G__Y__S__L__H__F_

Consensus tctttgggtatacatttaaaccctaacaaaacaaaaagatggggttactctttacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

138

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggctatgtcattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

HBVseq

SeqID: 75 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

The following warning messages have been generated. Please take corrective action and try again.

1. Too small RT amino acid positions found: position 1 to 45

Genotype Analysis 75 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

210 100.00

F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

139

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__-__-__-__-_

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ................................................------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

140

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

141

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

HBVseq

142

SeqID: 45 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.0%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation.

(d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N0.3

L

0.3

R

H4.9

L3.7

S

0.6

C0.3

N0.3

N

H23.9

S4.1

R

1.6

Y0.8

L0.5

H

N0.6

Y0.4

R

0.1

L0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N

R S

1.2

Y1.2

L0.7

C0.0

H

N

R S

0.8

L0.8

D0.4

Y0.4

H

N

R S

6.2

L2.1

H

N

R S

0.8

C0.8

L0.8

129 CTG L M L

44.1

V1.4

P0.5

K

0.2

M L

1.1

V0.4

M L

8.4

M L

10.0

V0.3

I0.1

L M

0.9

H0.4

M L

22.0

L M

4.3

L M L

25.8

M L

V0.4

P0.1

H

0.0

I0.0

K0.0

M L

V0.5

M L

M L

137 ACA T S T

1.2

S S T

0.4

Y0.1

S T

0.4

S S T

24.4

S S S S T

1.1

Y0.0

S T

0.7

Q0.2

S S Q

0.5

T0.5

145 TGT C M

L0.9

M

L1.9

V

0.2

L

M4.4

V

0.6

F0.1

L

M5.2

M

L1.8

L M L M

L10.0

M

L V

0.2

F0.0

M

L

M

L

M

L

146 GCG A L L L

V0.1

L

M0.1

V0.1

L L L L L L

V0.1

M0.0

L

V0.2

L L

S0.5

M0.5

143

Genotype Analysis 45 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1055 99.64 F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T, L145C, L146A

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

144

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

145

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__C__A__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................-....c..........

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c...-----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

146

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

HBVseq

SeqID: 68 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%).

(c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. +

147

439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4

93

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N

0.3

L0.3

R

H4.9

L

3.7

S0.6

C0.3

N

0.3

N

H23.9

S

4.1

R1.6

Y0.8

L

0.5

H

N0.6

Y

0.4

R0.1

L0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N R

S1.2

Y1.2

L

0.7

C0.0

H

N R

S0.8

L0.8

D

0.4

Y0.4

H

N R

S6.2

L2.1

H

N R

S0.8

C0.8

L

0.8

129 CTG L M

L44.1

V

1.4

P0.5

K0.2

M

L1.1

V

0.4

M

L8.4

M

L10.0

V

0.3

I0.1

L

M0.9

H

0.4

M

L22.0

L

M4.3

L M

L25.8

M

L V

0.4

P0.1

H0.0

I0.0

K

0.0

M

L V

0.5

M

L

M

L

137 ACA T S

T1.2

S S

T0.4

Y0.1

S

T0.4

S S

T24.4

S S S S

T1.1

Y0.0

S

T0.7

Q0.2

S S

Q0.5

T0.5

Genotype Analysis 68 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1056 99.82

F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference

148

sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

149

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

150

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

151

HBVseq

SeqID: 38 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (97.1%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

138

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: 92, 104

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation.

(d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N0.3

L

0.3

R

H4.9

L3.7

S

0.6

C0.3

N0.3

N

H23.9

S4.1

R

1.6

Y0.8

L0.5

H

N0.6

Y0.4

R

0.1

L0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N

R S

1.2

Y1.2

L0.7

C

0.0

H

N

R S

0.8

L0.8

D0.4

Y

0.4

H

N

R S

6.2

L2.1

H

N

R S

0.8

C0.8

L0.8

92 TCT S P P P P P P P P P P P P P

93 CAT H L L

M0.6

L L

R0.1

L L L L L L

M0.1

R0.0

L

F0.3

H0.3

L L

H0.6

104 GTC V G G G C

0.1

G G G G G G G C

0.0

G G G

123 GAA E N

H0.2

Y0.2

N

D2.8

H0.6

S

0.2

K0.2

N

H3.4

D0.4

del

0.1

Y0.1

N

D3.1

K0.8

E

0.3

H0.1

S0.1

N

D1.3

K0.9

D

N12.2

H1.2

D N

D4.3

D

N13.3

N

D

H1.1

K

0.3

S0.1

E0.1

Y0.1

del

0.0

N

D

H1.7

K

0.7

I0.2

N

D

H1.2

N

D

K0.5

128 CCC P T

N2.5

A0.9

I

0.5

T

N1.9

I1.9

A

1.7

T

A7.4

N0.4

P

0.3

T

N2.0

I1.2

P

0.4

T

P0.4

T

S2.4

T T

S4.3

T T

A2.4

N1.4

I

0.8

T

N2.5

I2.2

A

1.2

T

I7.0

N5.8

A

1.2

T

N3.7

A1.6

I

1.1

152

P0.5

H

0.2

S0.2

S0.4

P

0.4

I0.1

S0.3

A

0.1

P0.4

S

0.3

H0.0

S0.5

P

0.5

129 TTG L M

L44.1

V

1.4

P0.5

K0.2

M

L1.1

V

0.4

M

L8.4

M

L10.0

V

0.3

I0.1

L

M0.9

H

0.4

M

L22.0

L

M4.3

L M

L25.8

M

L V

0.4

P0.1

H0.0

I

0.0

K0.0

M

L V

0.5

M

L

M

L

137 ACA T S

T1.2

S S

T0.4

Y

0.1

S

T0.4

S S

T24.4

S S S S

T1.1

Y

0.0

S

T0.7

Q

0.2

S S

Q0.5

T

0.5

138 TGA * R

K2.3

G0.2

R

K1.1

R

K2.1

E0.1

R

K1.3

S0.1

R R

T1.2

R R R R

K1.5

S0.0

T0.0

G

0.0

E0.0

R

K0.9

S0.2

Q0.2

W

0.2

I0.2

R R

K1.1

Q0.5

G0.5

142 GGT G V

A0.2

I

0.2

G0.2

V

I1.1

D

0.4

A0.2

G0.2

V

D0.6

I

0.3

A0.1

N0.1

E

0.1

V

E1.5

A

0.9

I0.4

D0.1

G

0.1

V

I0.4

V V V V V

I0.5

A

0.4

E0.4

D0.2

G

0.1

N0.0

V

I1.8

D

0.9

E0.9

A0.7

G

0.4

N0.2

V

D1.2

V

E1.1

187 ATG M I

L2.7

I

V9.6

L

2.3

I

L0.3

I

L2.4

V

0.1

I

V0.9

I

L1.2

I I I I

V1.9

L

1.6

I

V3.5

L

1.1

I

V4.5

I

V2.6

Genotype Analysis 38 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction

Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1056 97.48 F

Low confidence prediction - Max sequence %ID > genotype F lower boundary

153

Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, P92S, L93H, G104V, H122N, D123E, T128P, M129L, S137T, R138*,

V142G, I187M

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

154

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__S__H__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__V__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input .....ct...a.............................-...................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__N__E__.__.__.__.__P__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input ..........................c.........a....a...........ac..t..

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__*__.__.__.__G__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a..t.a..........g......................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

155

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__M__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input .....................................................g......

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

156

-750-------760---

HBVseq

SeqID: 17 LBra_1 Date: 26-Aug-2012

Summary Data

Sequence includes RT: codons: 1 - 193

Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%)

Mutations at established drug resistance positions: None

Sequence Quality Assessment

Gene QA Problem Codons

RT Stop Codons, Frame Shifts:

None

RT B,D,H,V,N: None

RT Unusual Residues: None

Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance.

Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment

(a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class

exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation.

(d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here.

Pos NA AA

NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons

A

439

B

535

C

707

D

758

E

227

F

82

G

23

H

23

I

32

pooled

2806

L-Nucl.

465

Acyclic

PO4

93

L-Nucl. +

Acyclic

PO4

191

13 TAC Y H

Y1.3

N0.3

L

0.3

R

H4.9

L3.7

S

0.6

C0.3

N0.3

N

H23.9

S4.1

R

1.6

Y0.8

L0.5

H

N0.6

Y0.4

R

0.1

L0.1

H

Y1.4

H

Y18.7

H H H H

N

R S

1.2

Y1.2

L0.7

C

0.0

H

N

R S

0.8

L0.8

D0.4

Y

0.4

H

N

R S

6.2

L2.1

H

N

R S

0.8

C0.8

L0.8

129 CTG L M

L44.1

V1.4

P

0.5

K0.2

M

L1.1

V0.4

M

L8.4

M

L10.0

V0.3

I

0.1

L

M0.9

H0.4

M

L22.0

L

M4.3

L M

L25.8

M

L

V0.4

P

0.1

H0.0

I0.0

K0.0

M

L

V0.5

M

L

M

L

137 ACA T S T

1.2

S S T

0.4

Y0.1

S T

0.4

S S T

24.4

S S S S T

1.1

Y0.0

S T

0.7

Q0.2

S S Q

0.5

T0.5

157

Genotype Analysis 17 LBra:

This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences.

Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty:

Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction

Red - No confidence prediction

Result

Query Sequence Length Max Sequence %ID Predicted genotype

1056 99.82 F

High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID

Intra-genotype F mean %ID: 98.04

Intra-genotype F st dev.: 0.65

Genotype F lower boundary: 96.74

The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here

The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here

Resistance Mutations:

No resistance mutations detected in this sequence!

Genotype Variants:

E11Q, H13Y, M129L, S137T

Sequence Alignment

Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference

sequence.

Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase

numbering.

10----------------------------20----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

158

Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_

Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt

Input ...c.....t..................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-30--------40--------50--------60--------70--------80-------

30----------------------------40----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_

Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-90--------100-------110-------120-------130-------140------

50----------------------------60----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_

Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-150-------160-------170-------180-------190-------200------

70----------------------------80----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_

Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-210-------220-------230-------240-------250-------260------

90----------------------------100----------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_

Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-270-------280-------290-------300-------310-------320------

110---------------------------120---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_

Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_

Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg

Input .........................................................c..

159

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-330-------340-------350-------360-------370-------380------

130---------------------------140---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_

Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa

Input .....................a......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-390-------400-------410-------420-------430-------440------

150---------------------------160---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_

Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata

Input .....................t......................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-450-------460-------470-------480-------490-------500------

170---------------------------180---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._

Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_

Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca

Input ............................................................

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-510-------520-------530-------540-------550-------560------

190---------------------------200---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_

Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg

Input .........c....----------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-570-------580-------590-------600-------610-------620------

210---------------------------220---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_

Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-630-------640-------650-------660-------670-------680------

160

230---------------------------240---------------------------

-|-----------------------------|----------------------------

Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_

Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_

Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc

Input ------------------------------------------------------------

--|---------|---------|---------|---------|---------|-------

-690-------700-------710-------720-------730-------740------

250---------------

-|----------------

Input _-__-__-__-__-__-

Consensus _M__G__Y__V__I__G

Consensus atgggttatgttattgg

Input -----------------

--|---------|----

-750-------760---

161

7.7 Genotipagem do VHB pelo NCBI

Descrição:

A parte superior do gráfico mostra, para cada janela do código de cores, a sequência de

referência, com a maior pontuação. Se existirem dois pontos idênticos para uma janela com

diferentes subtipos específicos, a barra da janela é dividida diagonalmente.

74 LBra

162

78 LBra

70 LBra

163

46 LBra

44 LBra

164

36 LBra

138 LBra

165

26 LBra

124 LBra

166

75 LBra

68 LBra

167

45 LBra

38 LBra

168

17 LBra