UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DEPARTAMENTO DE...
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIROUNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIROFACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICASFACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIAPARASITOLOGIA
Métodos Fenotípicos para Caracterização Métodos Fenotípicos para Caracterização dos Mecanismos de Resistência aos dos Mecanismos de Resistência aos
AntimicrobianosAntimicrobianos
Prof. Robson LeãoProf. Robson Leão
Natural ou intrínseca
Aeróbios
Anaeróbios aminoglicosídeos
Adquirida Cromossômica Mutação de genes
Resistência é transmitida da célula-mãe para célula-filha
Plasmidial
Transmissível Resistência múltipla
Produção: ß-lactamases, fosfotransferases, hidrolases, redutases.
Metronidazol
Quinolonas
Para que eu preciso saber disso????
Riscos e Desvantagens do Uso Indiscriminado e Profilático dos Antimicrobianos:
1- Cada espécie de bactéria apresenta características próprias;
2- Fenômeno de resistência bacteriana;
3- Modificações produzidas na microbiota normal;
4- Efeitos colaterais de natureza tóxica, irritativa ou alérgica;
5- Drogas dispendiosas.
Benefícios e vantagens na profilaxia?!
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Variável entre os países, regiões e origem hospitalar ou comunitária das estirpes; Algumas espécies apresentam resistência/sensibilidade difundida em todo mundo;
A pressão seletiva do uso de antimicrobianos exerce papel fundamental na magnitude e
disseminação da resistência.
SENTRYSENTRY
SENTRYSENTRY
SENTRYSENTRY
SENTRYSENTRY
SENTRYSENTRY
SENTRYSENTRY
SP, RJSP, RJRS, SCRS, SC
SENTRY – Sistema de Vigilância para Monitoramento dos Principais Patógenos Relacionados a Infecções
Hospitalares
Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI – antigo NCCLS)
Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilização de normas e procedimentos laboratoriais padronizados.
A subcomissão do NCCLS é composta de representantes de profissões, do governo e indústria, incluindo laboratórios de microbiologia, educadores, farmacêuticos, etc.
Recomendações na escolha dos antimicrobianos
Padronização das técnicas
Critérios para a interpretação dos resultados
Parâmetros para o controle qualidade do teste.
Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI – antigo NCCLS)
MRSAMRSA GISAGISA
GRSAGRSAVREVRE
ESBLESBLP. aeruginosa MRP. aeruginosa MRAcinetobacter MR
Acinetobacter MR
Metalo-Metalo-lactamase
lactamase
O que fazer diante das “super-bactérias”??O que fazer diante das “super-bactérias”??
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médica:Fenótipos de resistência relevantes na prática médica:
1- 1- MRSA/ORSA=MRSA/ORSA=StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus resistente à metilicina e resistente à metilicina e oxacilinaoxacilina
Primeiro caso foi descrito em hospitais da Europa nos anos 60, Primeiro caso foi descrito em hospitais da Europa nos anos 60, e nos anos 70 já se tornava um problema de saúde públicae nos anos 70 já se tornava um problema de saúde pública Acima de 50% dos isolados de Acima de 50% dos isolados de S. aureus S. aureus em UTIem UTI Mutação cromossômica: produção de novas PBP, mediada pelo Mutação cromossômica: produção de novas PBP, mediada pelo gene gene mec Amec A..
2- 2- MRS = MRS = Staphylococcus Staphylococcus coagulase negativa (SCN) resistente à coagulase negativa (SCN) resistente à metilicina e oxacilinametilicina e oxacilina
Durante muito tempo, considerados como destituídos de patogenicidade, usualmente relatados como contaminantes. Hoje, importante papel nas infecções hospitalares e as taxas tem sido correlacionadas com o uso crescente de procedimentos médicos invasivos e o aumento no número de imunocomprometidos. 75% dos SCN isolados de UTI’s são resistentes a meticilina.
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
0
10
20
30
40
50
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90
Antimicrobianos
Taxas de resistência aos antimicrobianos em 100 cepas de SCN, determinadas pelo método de difusão em ágar – HUPE UERJ, 1999-2000.
Caracterização da Resistência à Meticilina
Testes Convencionais: Teste de difusão em ágar e diluição em ágar, caldo (CMI) e Teste E.
Testes Comerciais: Vitek, ATB, MicroScan, dentre outros:
Caracterização da Resistência à Meticilina
Caracterização da Resistência à Meticilina
Testes Moleculares: Detecção do gene mecA
Caracterização da Resistência à Meticilina
Testes Imunoenzimáticos Teste do látex PBP 2a
Outros:
S. aureus– S. aureus R à meticilina Vancomicina– R vancomicina
• 1996 – foi isolada amostra com susceptibilidade reduzida no Japão
• 1997 – 2 casos de infecções por VISA nos EUA• 2002 – isolamento de VRSA nos EUA
– VISA – MIC = 8-16 g/mL– VISA – MIC > 32 g/mL
MRSAMecanismo de Resistência
Produção de uma proteína específica – PBP 2a ou PBP 2’ Produção de uma proteína específica – PBP 2a ou PBP 2’ codificada pelo gene codificada pelo gene mec Amec A
Afinidade reduzida a Afinidade reduzida a ß-lactâmicosß-lactâmicos mecA mecA → Cassete Cromossômico Estaficlocócico (→ Cassete Cromossômico Estaficlocócico (SCCmecSCCmec))
→ → elemento genético móvelelemento genético móvel
→ → SCCmecSCCmec I, II, III, IV e V I, II, III, IV e V
MRSAMRSA
CA-MRSACA-MRSA
HA-MRSAHA-MRSA
CA-MRSAManifestações clínicas
Infecções leves: abscessos e celulitesInfecções leves: abscessos e celulites
Infecções graves: pneumonias Infecções graves: pneumonias necrozantes, osteomielites e septicemias necrozantes, osteomielites e septicemias podendo levar a óbitos. podendo levar a óbitos.
Epidemiologia
1º caso CA-MRSA – 1º caso CA-MRSA – Aborígenes australianos Aborígenes australianos na década de 90na década de 90
Emergência mundialEmergência mundial
Surtos em populações Surtos em populações especificasespecificas
CA-MRSA Primeiros casos – década de 90Primeiros casos – década de 90 Apresentam características distintas da cepas HA-Apresentam características distintas da cepas HA-
MRSA:MRSA:
→ → SCCmec IV e VSCCmec IV e V
→ → Suscetibilidade a várias classes de antimicrobianos, Suscetibilidade a várias classes de antimicrobianos, resistência somente aos resistência somente aos ß-lactâmicosß-lactâmicos
→ → PVLPVL Ausência de fatores de risco específicos – indivíduos Ausência de fatores de risco específicos – indivíduos
saudáveis saudáveis
Cepas obtidas de Porto Alegre a partir de infecções de pele e tecidos Cepas obtidas de Porto Alegre a partir de infecções de pele e tecidos molesmoles
4 cepas → PFGE – clone OSWP (Oceania)4 cepas → PFGE – clone OSWP (Oceania)
USA300USA300
CA-MRSA no Brasil
Fatores de Risco Ao contrário do HA-MRSA, surtos de CA-MRSA tem sido Ao contrário do HA-MRSA, surtos de CA-MRSA tem sido
reportados entre indivíduos saudáveis e sem fatores de reportados entre indivíduos saudáveis e sem fatores de risco associados. risco associados.
Definição de infecção por CA-MRSA – CDC:Definição de infecção por CA-MRSA – CDC:
→ → Ausência de história previa de isolamento de MRSAAusência de história previa de isolamento de MRSA
→ → Ausência de hospitalização e/ou cirurgia durante os 12 Ausência de hospitalização e/ou cirurgia durante os 12 meses anteriores ai isolamento do MRSAmeses anteriores ai isolamento do MRSA
→ → Ausência de relato de catereres percutâneos, próteses, Ausência de relato de catereres percutâneos, próteses, ou de outros artigos e procedimentos invasivos no ou de outros artigos e procedimentos invasivos no momento da coleta ou nos últimos 12 meses que a momento da coleta ou nos últimos 12 meses que a antecederamantecederam
SCCmec Elemento genético móvelElemento genético móvel Carreia complexos de genes Carreia complexos de genes mecmec e e ccrccr
5 tipos:5 tipos:
I,II,III I,II,III → HA-MRSA→ HA-MRSA
IV e V → CA-MRSAIV e V → CA-MRSA
Tipo IV: menor tamanho. Perda de genes de resistência?Tipo IV: menor tamanho. Perda de genes de resistência?
Origem das cepas de CA-MRSA:1ª hipótese → deleções de genes de resistência de
HA-MRSA2ª hipótese → transferência de SCCmec para MSSA
Leucocidina de Panton-Valentine (PVL)
É uma exotoxina, composta de 2 subunidades que são É uma exotoxina, composta de 2 subunidades que são codificadas pelos genes codificadas pelos genes lukS-PVlukS-PV e e lukF-PVlukF-PV (genes (genes pvl)pvl) → → lise em PMNslise em PMNs
Isolados de CA-MRSA responsáveis por doenças carreiam Isolados de CA-MRSA responsáveis por doenças carreiam PVL com prevalência praticamente universal PVL com prevalência praticamente universal → Associada → Associada aos casos de infecções mais gravesaos casos de infecções mais graves
EExemplo: pneumonias associadas a xemplo: pneumonias associadas a S. aureusS. aureus pvl-positiva pvl-positiva está mais frequentemente associada com sepse, febre está mais frequentemente associada com sepse, febre alta, leucopenia e hemoptíase, derrame pleural e morte.alta, leucopenia e hemoptíase, derrame pleural e morte.
CA-MRSA in Cystic Fibrosis
Chest / 133 / 6 / June, 2008.Chest / 133 / 6 / June, 2008.
Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica
3- 3- VRSA/GISA (VISA) = VRSA/GISA (VISA) = StaphylococcusStaphylococcus sp resistente/sensibilidade sp resistente/sensibilidade intermediária à glicopeptídeosintermediária à glicopeptídeos
A partir de 1996 no Japão (VISA)A partir de 1996 no Japão (VISA) Posteriormente: EUA, França, Alemanha, outrosPosteriormente: EUA, França, Alemanha, outros Brasil: resistência intermediária em RJ, SP e Porto AlegreBrasil: resistência intermediária em RJ, SP e Porto Alegre Mutação cromossômica: hiperprodução de PBP, espessamento Mutação cromossômica: hiperprodução de PBP, espessamento da parede celular e aprisionamento das drogas por excesso dos da parede celular e aprisionamento das drogas por excesso dos componentes da paredecomponentes da parede
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Caracterização da Resistência Intermediária a glicopeptídeos (GISA ou ViSA):
Teste de difusão em ágar com halos de inibição inferiores a 14 mm para vancomicina; Confirmar resultados determinando a CMI (8-16 mcg/mL) intermediário.
Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica
4- 4- EnterococcusEnterococcus spp. resistente à vancomicina (VRE) spp. resistente à vancomicina (VRE)
• A partir de 1986 no Reino Unido A partir de 1986 no Reino Unido • Posteriormente: EUA, Europa, Japão, América Central e do SulPosteriormente: EUA, Europa, Japão, América Central e do Sul• Brasil: Brasil: 1996-Curitiba; 1997-SP; 2000–RJ; 2001–Porto Alegre• Resistência plasmidial e cromossômica: produção de Resistência plasmidial e cromossômica: produção de precursores alterados do peptideoglicano, que não são precursores alterados do peptideoglicano, que não são reconhecidos pela vancomicinareconhecidos pela vancomicina
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
VRE no Rio de JaneiroVRE no Rio de Janeiro
Rio de Janeiro: HUPE/UERJ - Enterococcus gallinarum Hospital da rede pública - E. faecalis Hospital da rede privada - E. faecium
Niterói: HU Antônio Pedro/UFF - Enterococcus faecalis Hospital da rede privada - E. faecium
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Caracterização da Resistência a glicopeptídeos (VRE):
Inicialmente teste de difusão em ágar; Diluição em ágar ou caldo
Resistência à Vancomicina
Baixo nível: CMI 8 – 32 mcg/mL
Resistência Elevada: CMI ≥ 64 mcg/mL
Teste moleculares: Van A, Van B, Van D, E, G, R, X e outros.
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica
5- 5- Enterococcus Enterococcus sp sp HLAR ( (High-Level Aminoglycoside Resistance)
Elevado nível de resistência à aminoglicosídeosElevado nível de resistência à aminoglicosídeos Mutação no alvo ribossômico (Estreptomicina)Mutação no alvo ribossômico (Estreptomicina) Inativação enzimática (Estreptomicina e Gentamicina)Inativação enzimática (Estreptomicina e Gentamicina)
Caracterização a Níveis Elevados de Antimicrobianos - HLAR:
Teste de difusão em ágar – disco difusão: (concentração elevadas de aminoglicosídeos).
HLAR conc. do disco R I S
Gentamicina 120 μg 6 7-9 >10
Estreptomicina 300 μg 6 7-9 >10
CLSI-2006
Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica
6- 6- Enterobactérias produtoras de ESBL (Enterobactérias produtoras de ESBL (-Lactamase de Espectro -Lactamase de Espectro EstendidoEstendido))
Resistência transferível: hidrólise de cefalosporinas de amplo Resistência transferível: hidrólise de cefalosporinas de amplo espectro (ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima), degradam todos espectro (ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima), degradam todos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens e cefamicinas.carbapenens e cefamicinas.Geralmente, inibidas pelos inibidores de Geralmente, inibidas pelos inibidores de -Lactamase (ácido -Lactamase (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam)clavulânico, sulbactam e tazobactam) Vários genes: TEM, SHV, PER, GES, CTX, OXA...Vários genes: TEM, SHV, PER, GES, CTX, OXA...
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica
Enterobactérias produtoras de ESBL (Enterobactérias produtoras de ESBL (-Lactamase de Espectro -Lactamase de Espectro EstendidoEstendido))
Primeira ESBL: 1983 - Primeira ESBL: 1983 - Klebsiella ozaenae Klebsiella ozaenae (Alemanha)(Alemanha) Posteriormente: Posteriormente: Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae (França)(França) Hoje: > 200 tipos de ESBL caracterizadosHoje: > 200 tipos de ESBL caracterizados K. oxytoca, E. coli, Enterobacter K. oxytoca, E. coli, Enterobacter sppspp, Proteus mirabilis, , Proteus mirabilis, P.aeruginosa, AcinetobacterP.aeruginosa, Acinetobacter spp. spp.
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Caracterização Beta – Lactamase de Espectro Ampliado
Todos os métodos fenotípicos se baseiam na
inibição da atividade da enzima pelos inibidores de
-lactamases (IBL)
Limites de triagem do CLSI (antigo NCCLS) Teste de Adição de IBL aos discos de
cefalosp. Discos combinados Teste de dupla-difusão em disco Etest Métodos automatizados
Caracterização Beta – Lactamase de Espectro Ampliado
Disco difusão: Utilizar discos de ceftazidima e cefotaxima sozinhos e os associados
ao ácido clavulânico Meio de Müller-Hinton
POSITIVO
Aumento do halo 5 mm da associação
CAZ/AC ou CTX/AC vs. halo de CAZ ou CTX
Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste confirmatório recomendado pelo CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis
Jacoby & Han, 1996 Carter et al., J Clin Microbiol. 38:4228, 2000.
Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste de adição de IBL
1.Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,
3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico,
5. Cefotaxima 6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados
1
23
4
56
Teste Positivo
Detecção de amostras produtoras de ESBLDisco-difusão dupla ou teste de aproximação
Vantagens Teste simples; Não necessita de reagentes especiais
Limitações Distância entre os discos; Armazenamento dos discos com ácido
clavulânico; Interpretação
Detecção de amostras produtoras de ESBLEtest®
Vantagens Teste simples;
Limitações Substrato específico; Não detecção de amostras,
cuja as MICs situem acima das diluições testadas;
Custo
MicroScan – Painéis de Gram-negativos
Triagem para ESßLPoços que contêm cefpodoxima 4 g/mL e ceftazidima 1 g/mL associados ao clavulanato
ESßL plus Confirmation PanelAntimicrobiano (conecntação testada em g/ml)
Aztreonam 0.5 – 64 Cefpodoxima 0.5 – 64Cefepima 1 – 32 Ceftazidima 0.5 – 128Cefoxitina 2 – 32 Ceftazidima/Clav4 0.12/4 – 16/4Cefotaxima 0.5 – 128 Ceftriaxona 1 – 64Cefotaxima/Clav4 0.12/4 – 16/4 Meropenem 0.5 – 16Cefotetan 1 – 32 Piperacillina 16 – 64
Imipenem 0.5 – 16
Detecção de amostras produtoras de ESBLMétodos Automatizados
Triagem para ESßL
Poços que contêm cefotaxima e ceftazidima 0,5 g/mL associados ao clavulanato
Detecção de amostras produtoras de ESBLMétodos Automatizados
Vitek – Painéis de Gram-negativos
Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica
7- 7- P. aeruginosa P. aeruginosa produtora deprodutora de Metalo - Metalo - lactamase: lactamase:
Resistência transferível: hidrólise de penicilina, cefalosporinas Resistência transferível: hidrólise de penicilina, cefalosporinas e carbapenemas (imipenem, meropenem, ertapenem)e carbapenemas (imipenem, meropenem, ertapenem) Primeiramente caracterizada do anos 90 em Enterobactérias, Primeiramente caracterizada do anos 90 em Enterobactérias, P. P. aeruginosaaeruginosa e e AcinetobacterAcinetobacter spp. (Japão) spp. (Japão) Brasil (SENTRY): 44,8% de resistência à imipenem em Brasil (SENTRY): 44,8% de resistência à imipenem em P. P. aeruginosaaeruginosa 43,9% por metalo 43,9% por metalo -lactamase-lactamase
Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Resistência aos carbapenensMetalo--lactamases
Genes cromossômicos e plasmidiais (tranposons, integrons)
Zn++ como cofatores enzimáticos
Inibidas por EDTA e compostos derivados do thiol
Família IMP-1 a -16 (Japão, China, Europa, Canadá, Portugal, Taiwan, Brasil)
Família VIM-1 a -11 (Argentina, Colômbia, Europa, Coréia, Taiwan, EUA)
GIM-1 (Alemanha)
SPM-1 (São Paulo Metalo- -lactamase)
outras ...
Detecção de Metalo- -lactamases Importância Clínica
A maior parte da produção destas enzimas é mediada por genes plasmidiais, que podem se disseminar entre espécies distintas
Medidas de Controle
Detecção de amostras produtoras de MBL Disco- aproximação IMBL
Distância de 15-25
mm
CAZ CAZ
IMBL
Distância de 4-5 cm
IMBLEDTA – 5 l 100 mM2-MPCA puro – 2 a 3 l
Ceftazidima
Disco- aproximação com ácido 2-mercaptopropiônico
Detecção de amostras produtoras de Metalo--lactamases
NEGATIVA POSITIVA
Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Etest
Critério de positividade : Redução 3.0 diluições
Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa Producer of SPM Metallo--
Lactamase in Distinct Brazilian Regions
Notar a distorção do halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela amostra de K. pneumoniae testada, pelo método de disco-difusão.
KPC
Medidas de Combate à Resistência:
1. Reversão do estado de sensibilidade primitiva por perda de fatores de resistência ou por mutação;
2. Uso de altas concentrações do antimicrobiano pra superar o mecanismo de inativação;
3. Rodízio do uso de antimicrobianos em hospitais;
4. Uso da associação de antibióticos;
5. Descobertas de novas drogas antimicrobianas;
6. Inibição do mecanismo bioquímico da resistênica;
7. Vigilância epidemiológica e Sistemas de controle de Infecção Hospitalar;
8. Restrição do uso de antimicrobianos;
9. Educação para prescrição e o uso racional de antimicrobianos
Bactérias Multiresistentes ?!?!
Obrigado!!