UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ LINCON BORDIGNON …siaibib01.univali.br/pdf/Lincon Bordignon...

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

LINCON BORDIGNON SOMENSI

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA E CICATRIZANTE GÁSTRICA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO OBTIDO DAS CASCAS DE

Persea willdenovii Kosterm (Lauracea).

Itajaí

2015

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS

SINTÉTICAS BIOATIVAS




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Vale do Itajaí como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade

Itajaí, Julho, 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

S694a

Somensi, Lincon Bordignon. 1991- Avaliação da atividade gastroprotetora e cicatrizante gástrica do extrato hidroalcoólico obtido das cascas de Persea willdenovii kosterm (Lauracea) / Lincon Bordignon Somensi. – Itajaí (SC), 2015. 113 f. ; il. : tab. ; fig.

Cópia do computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí. Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador: Prof.º Dr. Sergio Faloni de Andrade” Bibliografia: p. 87 - 106

1. Casca – Persea willdenovii Korter. 2. Úlcera gástrica. 3. Cicatrização. I. Título.

CDU: 616.33

Francisléia Paula Padilha Sales – CRB 14/1131



Lincon Bordignon Somensi

‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’

____________________________________ Sérgio Faloni de Andrade, Doutor

Orientador

__________________________________________________________ Clóvis Antonio Rodrigues, Doutor

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______________________________________ Dr. Sérgio Faloni de Andrade (Univali)

Presidente

______________________________________

Dra. Luisa Mota da Silva (Univali) Membro

______________________________________ Dra. Marcia Maria de Souza (Univali)

Membro

______________________________________

Dra. Angela Malheiros (Univali) Membro

____________________________________ Dr. Valber da Silva Frutuoso (Fiocruz)

Membro

Itajaí (SC), 30 de Julho de 2015.

Dedico esta dissertação aos meus

pais Antoninho e Marilene e a

minha irmã Tainan, pelo constante

apoio e amor que me foi dado na

realização deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

A Deus pela vida.

Aos meus pais Antoninho e Marilene.

A minha irmã Tainan.

Aos meus padrinhos Flávio e Inês Zaggo pela ajuda e dedicação para a realização

deste trabalho.

Aos amigos (as): Neimar, Marizete, Odair e Elaine, pela ajuda nos momentos

difíceis, amizade, compreensão e carinho.

A Sra. Enriqueta Prates, que cedeu as cascas da planta para o nosso estudo.

A Profª. Dra. Luisa Mota da Silva, pela amizade, paciência e dedicação na realização

deste trabalho.

Ao Prof°. Dr. Sérgio Faloni de Andrade, pela orientação e amizade, sempre com seu

bom humor fazendo o ambiente de pesquisa o melhor possível.

Ao Prof°. Dr. José Roberto Santin, pela amizade e conselhos.

Ao Prof.° Me. Nei Carlos Santin, o qual despertou-me para o lado acadêmico antes

do mestrado.

A amiga Ma.Thaise Boeing, pela ajuda e dedicação na realização dos experimentos.

Aos técnicos (as) de laboratório Rafael Conde e Viviane Steimbach pelo apoio e

amizade.

Ao Prof°. Me. Renê Artur Ferreira pela ajuda na identificação botânica da planta em

estudo.

Ao Farmacêutico Gleidson Kamilo dias de Moraes, pela amizade e ajuda.

Ao programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas pela oportunidade de

realização deste projeto.

A todos que de uma maneira direta ou indireta contribuíram para este trabalho e que

em algum momento fizeram parte da grande equipe, meu sincero MUITO

OBRIGADO.

“Feliz aquele que transfere o que

sabe e aprende o que ensina”

(Cora Carolina)

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA E CICATRIZANTE GÁSTRICA DO EXTRATO HIDROALCOOLICO

OBTIDO DAS CASCAS DE Persea willdenovii Kosterm (Lauracea).


Julho/2015

Orientador: Dr. Sérgio Faloni de Andrade Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 112 RESUMO: Persea willdenovii Korsterm, conhecida popularmente como Pau de Andrade é uma planta medicinal utilizada em Santa Catarina para o tratamento de úlceras e gastrites. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade gastroprotetora e cicatrizante gástrica do extrato hidroalcoólico obtido das cascas de Persea willdenovii Korsterm (EHPW) em diferentes modelos animais. Inicialmente tanto o teor de fenóis totais no EHPW pelo método de Folin – Ciocaulteau como a atividade sequestradora de radicais livres do extrato pelo método de DPPH foram mensurados. Nestes ensaios comprovamos que o EHPW possui compostos fenólicos e uma atividade sequestradora de radicais livres. Além disso, concentrações elevadas de compostos fenólicos na fração acetato de etila também foram identificadas. Para avaliação da atividade gastroprotetora foram utilizados os modelos de úlcera aguda induzidos por etanol, etanol acidificado e indometacina. Nos modelos de úlcera aguda induzida por etanol (1 mL/kg, v.o) ou indometacina (80 mg/kg, v.o), ratas tratadas oralmente com o EHPW (300 mg/kg) 1 hora antes da administração do agente ulcerogênico apresentaram uma redução na área ulcerada de 59 % e 75 %, quando comparado com grupo ulcerado tratado com veículo (46,18 ± 15,10 mm2 e 1,20 ± 0,89 mm2, respectivamente). Camundongos machos foram tratados por via intraperitoneal com o EHPW (3 mg/kg), ou oralmente com as frações hexano, diclorometano, acetato de etila ou aquosa (5; 11,5; 59,25; 224,25 mg/kg, respectivamente) 1 hora antes da administração do agente lesivo (Etanol 60% + HCl 0,3 M), neste ensaio o EHPW reduziu em 66% a área de lesão quando comparado com o grupo ulcerado tratado com veículo (15,41 ± 4,81 mm2), já as frações hexânica e diclorometano reduziram a área lesada em 79 % e 77 % , respectivamente. A atividade antisecretora ácida gástrica do extrato foi avaliada através do modelo de ligadura de piloro em ratas e o pH, acidez, volume e atividade péptica do suco gástrico foram mensurados. Contudo, a administração intraduodenal do extrato na dose efetiva para gastroproteção não modificou nenhum parâmetro mensurado em relação ao grupo tratado com veículo. Como esperado, o omeprazol (20 mg/kg, v.o), controle positivo do ensaio, aumentou o pH para 6,14 ± 0,57 e reduziu todos os outros parâmetros observados. Ainda no experimento de ligadura pilórica, a administração do EHPW não promoveu alterações nos níveis de muco aderido à mucosa gástrica quando comparado com o grupo tratado com veículo (172 ± 5,60 mg de Alcian Blue/g de tecido). No modelo de etanol acidificado, camundongos foram tratados com L-NAME (70 mg/kg, i.p) trinta minutos antes do tratamento com o EHPW (300 mg/kg, v.o) e confirmando a participação de mecanismos envolvidos com NO nos efeitos observados, a pré-administração do L-NAME aboliu o efeito gastroprotetor do EHPW. Para investigar o efeito cicatrizante

gástrico do EHPW, ratas foram submetidas ao modelo de úlcera crônica induzida pela instilação de ácido acético (500 μL, solução 80%). Neste modelo, a administração oral do EHPW (300 mg/kg) ou omeprazol (20 mg/kg) duas vez ao dia, durante sete, reduziu em 40,5 % e 48,8 % a área de lesão comparado com o grupo ulcerado tratado com veículo (127,9 ± 12,04), os níveis de mucina foram avaliados sendo que o EHPW aumentou em 206 % quando comparado com o grupo veículo (4,95 ± 0,47 pixels/campo). Os estômagos previamente ulcerados com ácido acético 80% foram utilizados para dosagem dos níveis de fatores citoprotetores como a glutationa reduzida (GSH) e das enzimas mieloperoxidase (MPO), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). A respeito desses parâmetros, o tratamento com o extrato não reverteu à depleção do conteúdo de GSH ou a redução da atividade da CAT, quando comparado com o grupo ulcerado tratado com veículo (474,5 ± 42,08 µg de GSH/g de tecido; 258,4 ± 85,96 µmol de H2O2 consumido/min/g tecido.) respectivamente, mas reduziu em 51,96 % a atividade da MPO quando comparado com o grupo ulcerado (28,73 ± 4,59 m D.O./ mg de proteína) e aumentou em 212 % a atividade da SOD, quando comparado com o grupo ulcerado (195,8 ± 36,20 U SOD/ mg de proteína). Adicionalmente os animais tratados com o EHPW não demonstraram sinais de toxicidade durante o tratamento de sete dias. Paralelamente, o efeito do EHPW sobre a motilidade gastrointestinal também foi mensurada, porém o extrato não alterou o esvaziamento gástrico ou o trânsito intestinal de camundongos. Em conjunto, nossos dados demonstram o efeito gastroprotetor e cicatrizante gástrico da casca do EHPW associado ao aumento de fatores protetores da mucosa gástrica e ao favorecimento de defesas antioxidantes. Contudo, mais estudos são necessários para a contínua elucidação de mecanismos envolvidos na atividade gastroprotetora e cicatrizante gástrica das cascas de Persea wiildenovii Korsterm e para a identificação de compostos envolvidos nos efeitos observados. Palavras-chave: Casca; Persea willdenovii Korterm; úlcera gástrica; cicatrização;

Evalution of the gastroprotective activity and gastric healing activity of hydroalcoholic extract obtained from the bark of Persea

willdenovii Kosterm (Lauracea). LINCON BORDIGNON SOMENSI

July 2015

Supervisor: Sérgio de Andrade Faloni, PhD Area of concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances Number of Pages: 112 ABSTRACT: Persea willdenovii Korsterm, popularly known as Pau de Andrade, is a medicinal plant used in Santa Catarina for the treatment of ulcers and gastritis. This study evaluates the gastroprotective and gastric healing activity of the hydroalcoholic extract obtained from the bark of Persea willdenovii Korsterm (EHPW) in different animal models. The study initially measured the total phenolic content in EHPW by the Folin - Ciocaulteau method, and the scavenging activity of the extract by the DPPH method. These assays demonstrated that EHPW has phenolic compounds and free radical scavenging activity. Furthermore, high concentrations of phenolic compounds in the ethyl acetate fraction were also identified. To evaluate the gastroprotective activity, acute ulcer models induced by ethanol, acidified ethanol and indomethacin were used. In the acute ulcer model induced by ethanol (1 ml/kg, po) and indomethacin (80 mg/kg, po), rats treated orally with EHPW (300 mg / kg) 1 hour prior to administration of the ulcerogenic agent showed a reduction in ulcerated area of 59% and 75% when compared with the ulcerated group treated with the vehicle (46.18 ± 15.10 mm 2 and 1.20 mm 2 ± 0.89, respectively). Male mice were treated intraperitoneally with EHPW (3 mg / kg) or orally with hexane, dichloromethane, ethyl acetate or aqueous fractions (5; 11.5; 59.25; 224.25 mg/kg, respectively) 1 hour before administration of the harmful agent (Ethanol 60% HCl + 0.3 M). In this assay, EHPW reduced the lesion area by 66, compared to the ulcerated group treated with the vehicle (15.41 ± 4.81 mm2), since the hexane and dichloromethane fractions reduced the lesion area by 79% and 77%, respectively. The gastric acid antisecretory activity of the extract was evaluated using the pylorus ligation model in rats, and the pH, acidity, volume and peptic activity of gastric juice were measured. However, intraduodenal administration of the extract at the effective dose for gastroprotection not modify any of the parameters measured in relation to the vehicle treated group. As expected, omeprazole (20 mg/kg, po), used as positive control, increased the pH to 6.14 ± 0.57 and reduced all the other parameters. Also, in the pyloric ligation experiment, the administration of EHPW did not cause changes in the levels of mucus adhering to the gastric mucosa, compared with the vehicle treated group (172 ± Alcian Blue 5.60 mg/g tissue). In the acidified ethanol model, mice were treated with L-NAME (70 mg/kg ip) thirty minutes before treatment with EHPW (300 mg/kg, po) and confirming the involvement of NO in the mechanisms involved in the observed effects, pre-administration of L-NAME abolished the gastroprotective effect of EHPW. To investigate the gastric healing effect of EHPW, rats were subjected to the chronic ulcer model induced by instillation of acetic acid (500μL, 80% solution). In this model, oral administration of EHPW (300 mg/kg) and omeprazole (20 mg/kg) twice a day, for seven days, reduced the lesion area by 40.5% and 48.8%, compared with the ulcerated group treated with vehicle (127.9 ±

12.04). Mucin levels were evaluated, wherein the EHPW increased the lesion area by 206% compared to the vehicle group (4.95 ± 0.47 pixels/field). Stomachs previously ulcerated with 80% acetic acid were used to determine the levels of cytoprotective factors such as reduced glutathione (GSH) and the enzymes myeloperoxidase (MPO), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). In relation to these parameters, treatment with the extract did not reverse the depletion of GSH content or reduction of CAT activity when compared to the ulcerated group treated with vehicle (474.5 ± 42.08 µg of GSH/g of tissue; 258.4 ± 85.96 µmol of H2O2 consumed/min/g ttissue.) respectively, but decreased by 51.96% MPO activity compared to the ulcerated group (28.73 ± 4.59 M/mg. protein), and increased SOD activity by 212% compared to the ulcerated group (195.8 ± 36.20 U SOD/mg protein). Additionally, animals treated with EHPW showed no signs of toxicity during the seven days of treatment. Simultaneously, the capacity of EHPW to modify intestinal transit and gastric emptying was also measured, but the extract did not alter these parameters. Taken together, our data demonstrate the gastroprotective and gastric healing effect of bark of EHPW associated with increased protective factors of the gastric mucosa and the favoring of antioxidant defenses. However, further studies are needed to elucidate the mechanisms involved in the gastroprotective and gastric healing activity of bark of Persea wiildenovii Korsterm, and to identify the compounds involved in the effects observed. Keywords: Bark; Persea willdenovii Korterm; gastric ulcer; healing;

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Tronco da P. wiilldenovii Kosterm ............................................................. 29

Figura 2. Folhas e frutos da P. wiildenovii Kosterm ................................................. 29

Figura 3. Anatomia do estômago ............................................................................. 31

Figura 4. Mecanismo de secreção de ácido gástrico no antro estomacal ................ 33

Figura 5. Conversão da glutationa para sua forma reduzida (GSH) e oxidada

(GSSG) ............................................................................................................... 38

Figura 6. Fluxograma de obtenção do EHPW e frações. ......................................... 44

Figura 7. Atividade sequestradora de radicais livres do EHPW no ensaio de DPPH.

............................................................................................................................ 56

Figura 8. Efeito do EHPW sobre úlcera aguda induzida por etanol. ........................ 57

Figura 9. Efeito da administração intraperitoneal do EHPW sobre úlcera aguda

induzida por etanol acidificado. ........................................................................... 58

Figura 10. Efeito das frações de EHPW sobre úlcera aguda induzida por etanol

acidificado. .......................................................................................................... 59

Figura 11. Efeito do EHPW sobre úlcera aguda induzida por indometacina. ........... 61

Figura 12. Efeito do EHPW sobre os níveis de muco gástrico após ligadura do piloro.

............................................................................................................................ 63

Figura 13. Influencia do NO sobre o efeito gastroprotetor do EHPW. ...................... 64

Figura 14. Efeito cicatrizante do EHPW em úlcera gástrica induzida por ácido

acético 80%. ....................................................................................................... 65

Figura 15. Análise macroscópica (A, B, C) e microscópica (D, E, F) das úlceras

crônicas gástricas induzidas por ácido acético. .................................................. 66

Figura 16. Efeito da administração oral do EHPW na análise histoquímica para

mucina (PAS). ..................................................................................................... 67

Figura 17. Atividade da administração oral do EHPW sobre a úlcera induzida por

ácido acético 80% sobre os níveis de MPO. ....................................................... 68

Figura 18. Avaliação da administração oral do EHPW sobre a úlcera induzida por

ácido acético 80% sobre os níveis de GSH. ....................................................... 69


ácido acético 80% sobe a enzima SOD. ............................................................. 70


ácido acético 80% sobe a enzima CAT. .............................................................. 71

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

TXA2 – Tromboxano

ACh- Acetilcolina

AINEs- Antiinflamatórios não esteroidáis

ALFAC- 85 partes de álcool etílico 80%, 10 partes de formaldeído 40% e 5 partes de

ácido acético gácial

ARH2 - Antagonistas de receptores para histamina do tipo 2

ATC- Ácido tricloroacético

ATP- Adenosina trifosfato

LTC4- Leucotrieno

Ca+2 - Íon cálcio

CAT- Catalase

CCD- Cromatografia em camada delgada

CCK2 - Receptores para colecistocinina do tipo 2

cGMP- monofosfato cíclico de guanosina

Cl- - íon Cloreto

CEUA- ComiçÃo de ética no uso de animais

CO2 – Gás carbônico

COX- Ciclooxigenase

COX-1- Ciclooxigenase do tipo 1

COX-2- Ciclooxigenase do tipo 2

DTNB- Ácido 5,5’ – ditio-bis-(2-nitrobenzóico)

DPPH- 2,2–Difenil–1–picril–hidrazila

EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético

EHPW- Extrato hidroalcoólico de Persea willdenovii

EARP®- Software de análise de imagens

EP- Receptores de prostanóides ou de prostaglandina

EP1- Receptores de prostaglandina do tipo 1




EROs- Espécies Reativas do Oxigênio

Fr AcOet- Fração acetato de etila

Fr H2O- Fração aquosa

Fr CH2Cl2- Fração diclorometano

Fr C6H14 - Fração hexano

GO- Glutationa oxidase

GPx- Glutationa reduxida

GSH- Glutationa reduzida

GSSG- Glutationa oxidada

GST - Glutationa S-transferase

HBR- Herbário Barbosa Rodrigues

H+/ K+ ATPase- enzima hidrogênio/potássio dependente de adenosina trifosfato

H2 – Receptores de histamina do tipo 2

HO2 – hidroperoxila

IBP- Inibidores da bomba de prótons

ICAM-1- Moléculas de acessão intracelular do tipo 1

i.d- Via intraduodenal

i.p- Via intraperitoneal

L-NAME- N-nitro L-arginina metil éster

MPO- Mieloperoxidase

M3 – Receptor muscarínico tipo 3

NO- Óxido nítrico

NOS - Óxido nítrico sintase

NaCl- Cloreto de sódio

O2- Ânion oxigênio

O2- - superóxido

O3- Ozônio

OMS- Organização mundial da saúde

PGs- Prostaglandinas

PGE2- Prostaglandinas E2

PGI2- Prostaciclinas I2

PNPIC- Política nacional de Práticas Integrativas

PNPMF- Política nacional de plantas medicinais e fitoterápicos

RO2- Peroxila

SOD- Superóxido dismutase

v.o- Via oral

SUMÁRIO

2 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 21

3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 25

3.1 Objetivo Geral: ......................................................................................... 25

3.2 Objetivos Específicos: ............................................................................ 25

4 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 27

4.1 Plantas medicinais .................................................................................. 27

4.2 Persea willdenovii Kosterm (Lauracea) ................................................ 28

4.3 Fisiologia do estômago .......................................................................... 30

4.4 Úlcera Gástrica ........................................................................................ 34

4.4.1 Fatores protetores da mucosa gástrica ............................................. 35

4.4.2 Fatores agressores da mucosa gástrica ............................................ 38

4.4.3 Tratamento convencional da úlcera gástrica .................................... 40

4.4.4 Fitoterapia no tratamento da úlcera gástrica..................................... 41

5 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 43

5.1. Animais .................................................................................................... 43

5.2. Coleta e preparação do extrato e frações ............................................ 43

5.2.1. Teste de fenóis totais .......................................................................... 44

5.2.2. Estudo in vitro da atividade sequestradora de radicais livres

(DPPH) ............................................................................................................ 45

5.3. Avaliação da atividade gastroprotetora do EHPW .............................. 45

5.3.1. Lesões gástricas induzidas por etanol em ratos ............................. 45

5.3.2. Lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em

camundongos. ............................................................................................... 45

5.3.3. Lesões gástricas induzidas por indometacina em ratos. ................ 46

5.4. Avaliação da Atividade Anti-Secretora ácida ...................................... 46

5.4.1. Ligadura de Piloro ............................................................................... 46

5.4.2 Quantificação da atividade péptica .................................................... 46

5.4.3. Mensuração do muco gástrico ........................................................... 47

5.4.4.Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção

promovida pelo EHPW .................................................................................. 47

5.5. Avaliação da atividade cicatrizante gástrica do EHPW ...................... 48

5.5.1. Lesões gástricas crônicas induzidas por ácido acético ................. 48

5.5.2. Avaliação histológica ......................................................................... 49

5.5.3 Avaliação histoquímica ........................................................................ 49

5.6. Avaliação de mecanismos envolvidos na ação cicatrizante gástrica

do EHPW ......................................................................................................... 49

5.6.1 Preparo do homogenato ...................................................................... 49

5.6.2 Mensuração da concentração proteína .............................................. 50

5.6.3 Quantificação da atividade da Mieloperoxidase (MPO) ................... 50

5.6.4. Quantificação de grupos sulfidrílicos não protéicos (GSH) ........... 50

5.6.5. Quantificação dos níveis de superóxido dismutase (SOD)............. 51

5.6.6. Quantificação a atividade da catalase (CAT) .................................... 51

5.7. Avaliação da Motilidade Gastrointestinal ............................................ 52

5.7.1 Esvaziamento Gástrico de semi-sólidos ............................................ 52

5.7.2 Trânsito Intestinal ................................................................................. 52

5.7.3. Avaliação Toxicológica preliminar .................................................... 53

5.7.4. Expressão dos dados e análise estatística ....................................... 53

6 RESULTADOS ....................................................................................................... 55

6.1 Quantificação de fenois totais................................................................ 55

6.2 Avaliação da atividade sequestradora de radicais livres (DPPH) ...... 55

6.3 RESULTADOS DA AVALIAÇÃO GASTROPROTETORA ...................... 56

6.3.1 Efeito do EHPW em úlceras induzidas por etanol ............................. 56

6.3.2 Efeito do EHPW em úlceras gástricas agudas induzidas por

indometacina .................................................................................................. 60

6.3.3 Avaliação da secreção gástrica. ......................................................... 61

6.3.4 Participação do óxido nítrico sobre a gastroproteção

desempenhada pelo EHPW . ........................................................................ 63

6.4 Efeito cicatrizante do EHPW no modelo de úlcera induzida por ácido

acético. ........................................................................................................... 64

6.4.1 Efeito do EHPW sobre os níveis de mucina ...................................... 66

6.4.2 Efeito do EHPW sobre a atividade da MPO em estômagos de ratas

após indução de úlcera por ácido acético 80%. ......................................... 67

6.4.3 Avaliação do efeito do EHPW sobre os níveis de GSH em

estômagos de ratas após indução de úlcera por ácido acético 80%. ...... 68

6.4.4 Efeito do EPWH sobre a atividade da enzima SOD em estômagos de

ratas após indução de úlcera por ácido acético 80%. ............................... 69

6.4.5 Efeito do EHPW sobre a atividade da enzima CAT em estômagos de

ratas após indução de úlcera por ácido acético 80%. ............................... 70

6.4.6 Avaliação do efeito do EHPW sobre o esvaziamento e motilidade

gastrointestinal. ............................................................................................. 71

6.4.7 Efeito do Tratamento por sete dias com EHPW sobre os parâmetros

toxicológicos.................................................................................................. 72

7 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 75

8 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 85

REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 87

ANEXO A- PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS

CEUA/UNIVALI ...................................................................................................... 107

21

2 INTRODUÇÃO

A úlcera péptica é uma lesão ulcerosa que tem como característica a perda

circunscrita de tecido ultrapassando os limites da camada muscular da mucosa

esofágica (úlcera esofágica), gástrica (úlcera gástrica) ou duodenal (úlcera

duodenal). A incidência anual dessa doença no mundo varia de 0,10% até 0,19% e a

prevalência de 0,12% até 1,5% (SUNG, 2009). Segundo o United States Census

Bureau (2015), a população mundial no dia 15 de julho de 2015 era

aproximadamente 7,256 bilhões de pessoas; portanto é possível calcular que são

diagnosticados anualmente entre 7,1 à 13,6 milhões de pacientes com úlcera

péptica em todo o mundo.

A etiologia e os eventos patológicos envolvidos no desenvolvimento das

úlceras pépticas ainda não estão totalmente elucidados, mas admite-se que fatores

genéticos e fatores exógenos (estresse, tabagismo, dieta alimentar, uso prolongado

de antiinflamatórios não esteroidáis, etanol e infecção por Helicobacter pylori)

contribuem para o surgimento das lesões (CARVALHO, 2000; BRZOZOWSKI, 2003;

MALFERTHEINER, 2009). No estômago, a úlcera é desencadeada por um

desequilíbrio entre fatores da defesa da mucosa (bicarbonato, mucina,

prostaglandinas, óxido nítrico e fatores do crescimento) e os fatores agressivos

(secreção de ácido e pepsina e a produção de radicais livres) (TARNAWSKI et al.,

2013).

Os principais fármacos atualmente utilizados no tratamento da úlcera gástrica

atuam inibindo a secreção ácida gástrica, entre eles estão os antagonistas de

receptores de histamina do tipo 2 (AR-H2), por exemplo: cimetidina e ranitidina; e os

inibidores da bomba de prótons (IBPs), por exemplo: omeprazol e esomeprazol. No

entanto, apesar de efetivos, nos últimos anos têm-se destacado que tais tratamentos

estão associados a uma baixa qualidade na cicatrização da lesão ulcerativa e

consequentemente à reincidência da doença e a necessidade do prolongamento do

tratamento (ARAKAWA et al., 2012; KANGWAN, 2014). Ainda, o uso prolongado dos

medicamentos anti-secretores provoca uma série de efeitos adversos, como

ginecomastia, cefaleia, dor abdominal, diarréia, vômito, hipermagnesemia, fraturas

osteoporóticas (devido à baixa calcificação óssea) e não osteoporótica (originada de

trauma), além de hipergastrinemia, que em casos mais acentuados pode contribuir

22

para o desenvolvimento de neoplasia gástrica (MOULI; AHUJA, 2011). Neste

contexto, se faz necessário investigar alternativas farmacológicas capazes de

promover a prevenção e a cicatrização de úlceras, com ausência ou redução de

efeitos colaterais.

Os produtos de origem natural são uma alternativa na busca por novas terapias

no tratamento de diversas doenças, entre elas a úlcera gástrica. O interesse na

utilização de plantas medicinais como alternativa terapêutica é crescente nas últimas

décadas. Estudos desenvolvidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS)

demonstram que 80% da população em países em desenvolvimento fazem uso de

plantas medicinais (ROSA et al., 2011). No Brasil, desde 2006 o governo federal tem

desenvolvido projetos para incentivar a pesquisa e o desenvolvimento do setor de

plantas medicinais e fitoterápicas (BRASIL, 2006).

A Portaria Ministerial MS/GM n° 971, de 03 de maio de 2006, aprovou a

Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema

Único de Saúde (SUS) e o Decreto no 5.813, de 22 de junho de 2006, aprovou a

Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF). Estas portarias

incentivam a investigação sobre o uso de plantas medicinais e fitoterápicos no nosso

país, e objetiva impulsionar a utilização da Fitoterapia nos programas de saúde

pública, incluindo alguns fitoterápicos na relação nacional de medicamentos

(RENAME, 2013; CARVALHO, 2008)

O gênero Persea spp.é constituído por espécies de plantas encontradas em

toda a América tropical, Índia ocidental, sul do México e do Chile. Pertence a família

Laureacea, que é composta por 52 gêneros e cerca de 3000 espécies, sendo a

grande maioria de origem lenhosa, tal como a espécie Persea willdenovii Kosterm que

é conhecida popularmente como: Casca do Andrade, Maçaranduba ou Abacate do

Mato (BATISTA et al., 2010).

Estudos fitoquímicos sobre a P. willdenovii Kosterm descreveram a presença

de quatro diferentes estruturas de lignanas-furofurânicas nas folhas (BATISTA et al.,

2010). A casca contém elevado caráter mucilaginoso em contato com a água.

Mucilagens são substâncias macromoleculares de natureza glicídica heterogênea,

ricas em polissacarídeos, compostos por pentoses, hexoses e ácidos urônicos

(COSTA, 2001). A presença de mucilagem está relacionada, entre outros efeitos

terapêuticos, à sua ação protetora em mucosas inflamadas (COSTA, 2001).

23

Uma pesquisa realizada em Curitiba (Paraná) revelou que a população utiliza

as cascas de P. willdenovii Kosterm em chás para o tratamento de úlcera gástrica e

como cicatrizante de feridas (MAZZA et al., 2000). Contudo, esta espécie está na lista

de ameaçadas de extinção no estado de Minas Gerais e do Rio Grande do Sul em

decorrência do elevado valor econômico da madeira, de escassos projetos de manejo

florestal para esta espécie e a utilização exploratória (BIOATIVAS, 2007; SILVA;

PERELLÓ, 2010). Portanto, a investigação pré-clínica do potencial gastroprotetor

desta espécie contribui para a validação de seu uso popular e, ao promover um

registro científico de seu potencial terapêutico também contribui para a

conscientização da necessidade de medidas sustentáveis no cultivo e/ou exploração

de P. willdenovii Kosterm para que esta planta continue a ser um recurso na medicina

popular Brasileira.

25

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral:

Estudar o potencial gastroprotetor e cicatrizante gástrico do extrato hidroalcoólico da

casca de Persea willdenovii Kosterm em modelos experimentais de úlcera gástrica.

3.2 Objetivos Específicos:

- Verificar a presença de fenóis totais e a atividade sequestradora de radicais livres no extrato de P. willdenovii Kostern. - Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico da casca de P.

willdenovii através do modelo de indução de úlcera aguda por etanol e indometacina

em ratos.

- Identificar a participação da via do oxido nítrico no na ação gastroprotetora do

extrato hidroalcoólico da casca de P. willdenovii Kosterm.

- Analisar o potencial cicatrizante gástrico do extrato hidroalcoólico da casca de P.

willdenovii Kosterm pelo modelo de indução de úlcera crônica com ácido acético em

ratos.

- Verificar o efeito do extrato hidroalcoólico da casca de P. willdenovii Kosterm

sobre a secreção gástrica ácida.

- Investigar o envolvimento dos fatores protetores da mucosa gástrica, tais como a

camada de muco e o sistema antioxidante gástrico.

- Analisar os efeitos do extrato de P. wildenovii Kosterm sobre o esvaziamento

gástrico e o trânsito intestinal.

- Registrar os efeitos tóxicos do extrato de P. wildenovii Kosterm.

27

4 REVISÃO DA LITERATURA

4.1 Plantas medicinais

Conforme Tribess e colaboradores (2015), em média 80% da população

mundial utilizam de alguma forma plantas medicinais como forma de acesso á

necessidades básicas de saúde. Estas plantas são importantes matérias-primas

para a obtenção de novos medicamentos, seja como um fármaco fitoterápico

padronizado ou como fonte de novas substâncias bioativas. Algumas classes de

fármacos incluem um protótipo de produto natural, como por exemplo: aspirina,

atropina, artemisinina, colchicina, digoxina, efedrina, morfina, fisiostigmina,

pilocarpina, quinina, quinidina, reserpina, taxol, tubocurarina, vimblastina e

vincristina. Muitas dessas drogas são de origem vegetal e foram descobertas através

de estudos com base em dados da medicina popular ou conhecimento empírico de

diversos grupos étnicos (GILANI et al., 1992; KOEHN et al., 2005).

O uso de plantas deve-se a alguns fatores sociais e econômicos, como o alto

custo dos medicamentos industrializados e a dificuldade da população à assistência

médica (BALDAUF, 2009). O registro do conhecimento popular sobre plantas para

fins medicinais tem sido nos últimos anos objetivo de políticas públicas nacionais

como a criação do Renisus que conta com 71 espécies de plantas medicinais, entre

elas o gênero Persea (BRASIL, 2006; RENISUS, 2009).

De fato, no Brasil o conhecimento e a utilização de plantas medicinais no

tratamento de doenças não é algo novo, relatos indicam que muito deste

conhecimento originou-se dos índios, escravos e imigrantes, proporcionando assim

um conhecimento único e muito rico para a medicina popular brasileira (SIMÕES,

2010). Conforme Franco (2005), a utilização de plantas medicinais pelos povos vem

desde os primórdios da humanidade, sendo sustentada pelo acúmulo de

informações passadas oralmente. Entretanto, uma redução do conhecimento

tradicional tem ocorrido, devido à diminuição das áreas naturais, a desvalorização do

saber popular pelas novas gerações e o crescente acesso à medicina alopática

(FERREIRA, 2015; AMOROZO, 1988). Portanto registros destes conhecimentos

precisam ser feitos antes que as espécies sejam extintas e para o fornecimento de

informações que auxiliem em medidas para a exploração e o cultivo sustentável

dessas plantas (JOSHI, 2000).

28

4.2 Persea willdenovii Kosterm (Lauracea)

A espécie Persea willdenovii Kosterrm é conhecida popularmente como

Casca do Andrade, Maçaranduba ou Abacate do Mato (BATISTA et al., 2010). Seus

homônimos botânicos são os táxons: Persea pyrifolia Ness & Mart; Persea pyrifolia

(D. Don) Spreng e Persea schuwackei M.A (SAUERESSIG, 2012; PACHECO;

MORAES, 2013). P. willdenovii é uma espécie de grande porte, podendo alcançar

cerca de 25 metros de altura, até 70 cm de diâmetro e tem como revestimento uma

casca cinzenta (Figura 1). A espécie apresenta flores amareladas (Figura 2), com

frutos pequenos, arredondados e de cor roxa escura e brilhante quando maduros. O

período de frutificação desta planta é bastante restrito, florescem nos meses de

dezembro a fevereiro (BAITELLO, 2003); contudo Silva e Perelló, (2010) descreveu

o período de floração entre outubro a novembro e o de frutificação entre de janeiro a

março. É amplamente utilizada na ornamentação de parques e praças por ser uma

árvore exuberante, além disso, sua madeira é utilizada principalmente na construção

civil, marcenaria, confecção de móveis, entre outros usos (BATISTA et al., 2010).

Popularmente as cascas de P. willdenovii são utilizadas para o tratamento de

úlceras gástricas e feridas (MAZZA et al., 2000). Contudo, nenhum estudo clínico ou

pré-clínico colabora com algum indicativo de eficácia ou segurança para o uso

popular. Mesmo assim, a exploração desenfreada faz com que esta espécie torne-se

ameaçada de extinção (FIOR et al., 2006). Para solucionar este problema várias

maneiras de proliferação foram sugeridas, como a coleta de frutos que caem

espontaneamente da árvore e posterior plantio desses frutos secos a sombra

(SILVA; PERELLÓ, 2010).

29

Figura 1. Tronco da P. wiilldenovii Kosterm

Fonte:Disponível ein: <http://florestaombrofilamista.com.br/sidol/?menu=species&menu=home&page=details&id=155>. Acesso em: 29/Jun/2015.

Figura 2. Folhas e frutos da P. wiildenovii Kosterm

Fonte: Disponível ein: <http://ceapla2.rc.unesp.br/atlas/esp_persea.php)>. Acesso em: 08/ Jul/2015

30

O gênero Persea é composto por muitas espécies com potencial terapêutico,

entre elas a P. major Kopp que também é utilizada popularmente para o tratamento

de distúrbios gastrointestinais e que possui o efeito gastroprotetor associado à

presença de ácidos, taninos condensados, esteroides e triterpenos (MARANHO,

1998). No estado de Santa Catarina a P. venosa também é bastante utilizada

popularmente para tratar desordens gástricas (TRIBESS et al., 2015), seu perfil

fitoquímico foi descrito por Mendes e colaboradores (2013) que encontraram uma

série de metabólitos secundários como: taninos, terpenos, antraquinonas,

cumarinas, flavonoides e alcalóides.

Estudos fitoquímicos nas cascas da espécie P. willdenovii ainda não são

encontrados na literatura, entretanto, De Luca (2005) relata a presença de quatro

lignanas furofurânicas (sesamina, metilpiperitol, eudesmina e magnolina) nas folhas

e Batista e colaboradores (2010) corroborando com este estudo confirmam a

presença destas moléculas.

4.3 Fisiologia do estômago

A função primordial do trato gastrointestinal é promover a digestão e a

absorção de nutrientes a fim de manter a homeostasia do organismo. O estômago é

um dos órgãos que compõem este sistema, e é formado por várias camadas de

músculo liso e seu corpo (luz) é recoberto por uma camada de muco para sua

proteção. Quanto à anatomia, o órgão é dividido em quatro regiões principais, a

saber: 1) cárdia: região próxima à junção esofagogástrica; 2) fundo: região bulbosa

subdiafragmática do estômago; 3) corpo: maior região do estômago entre o fundo e

o antro; 4) Porção pilórica ou antro: vai desde o corpo até o esfíncter pilórico (Figura

3) (CRAWFORD, 2000).

31

Figura 3. Anatomia do estômago

Fonte: Disponível em :< http://lokaciencia.blogspot.com.br/2011/06/sistema-digestorio.html> acesso em: 23 de Maio. 2015.

No corpo e no antro estão localizadas as células parietais, as quais

promovem a secreção de ácido gástrico, composto por ácido clorídrico, através de

estimulação mediada por histamina, gastrina e acetilcolina (Figura 4) (BITZIOV;

PATEL, 2012). Alem do mais, o ácido gástrico está envolvido na absorção de ferro,

cálcio, vitamina B12 e digestão de proteínas (SHUBERT, 2008).

A histamina é secretada pelas células enterocromafins (ECL) da mucosa,

onde se difunde e é agonista dos receptores de histamina do tipo 2 (RH2), os quais

são acoplados à uma proteína G. Em resposta à ligação da histamina aos RH2 e

subsequente estimulação de adenilato ciclase, há um aumento nos níveis de 3´5´-

adenosina-monofosfato-cíclico (AMPc), o qual ativa a proteína quinase dependente

de AMPc (PKA) e culmina com acentuado aumento na quantidade de ácido

cloródrico (HCI) secretado pelas células parietais (CONSTANZO,2011; BARRET,

2015; GUYTON; HALL, 2011; ZAHO; CHEN 2012).

Além da histamina, a gastrina também é um secretagogo importante na

estimulação da célula parietal, essa substância é secretada endocrinamente pelas

células G localizadas na região do antro estomacal e estimula a secreção gástrica

através da atividade agonista nos receptores de colecistocinina do tipo 2 (CCK2)

presentes na membrana das células parietais. Os receptores CCK2 são acoplados à

proteína G e em resposta à ligação com a gastrina ocorre ativação de fosfolipase-C

(CONSTANZO, 2011; BARRET, 2015; GUYTON; HALL, 2011). Quando os

32

receptores CCK2 são ativados ocorre um aumento indireto na produção de

pepsinogênio, seguido da estimulação direta da secreção, motilidade gástrica e do

fluxo sanguíneo (COOKBURN, 2013).

A acetilcolina (ACh), por sua vez, é liberada através de estímulos pós-

ganglionares no sistema nervoso autônomo (SNA). A ACh é um agonista de

receptores muscarínicos, os quais são acoplados à proteína G e, entre outras

coisas, modulam a secreção ácida nas células parietais. Em consequência da

ligação da ACh nos receptores muscarínicos do tipo 3 (M3) e da gastrina nos

receptores CCK2 na membrana da célula parietal ocorre a estimulação de fosfolipase

C. Esta por sua vez, estimula a liberação de diacilglicerol (DAG) e – inositol 1,4,5

trifosfato (IP3) que promove a liberação de Ca2+ das reservas intracelulares. Por final

o Ca2+ e o DAG estimulam proteínas quinases, as quais através de fosforilação

ativam a H+/K+-ATPase e fazem com que ocorra a secreção de íons H+ pelas células

parietais culminando em um aumento na secreção de ácido gástrico no lúmen do

estômago (CONSTANZO, 2011; BARRET, 2015; CHU, SHUBERT, 2013).

Além de a secreção ácida gástrica ser regulada diretamente pela ligação da

histamina, gastrina e ACh em seus respectivos receptores presentes na membrana

das células parietais, ela também pode ser estimulada indiretamente através dos

efeitos da ACh e gastrina na liberação de histamina pelas células ECL

(CONSTANZO, 2011).

A bomba de prótons (H+/K+-ATPase), que está localizada na porção apical

das células parietais, tem como função fazer o transporte ativo e libera íons (H+)

contra um gradiente de concentração, o mais intenso do corpo humano (4 milhões

para 1), executando um papel crucial na secreção de ácido gástrico. Esta enzima

divide-se em duas subunidades α e β. A subunidade α realiza as ações catalíticas e

de transporte da enzima, enquanto que a β, que é extremamente glicosilada, protege

a enzima de degradação durante seu descolamento entre o citoplasma e a

membrana (RABON et al., 1983; WANG et al. 2015). A bomba de prótons também

exerce um papel na secreção do íon H+ no lúmen gástrico, trocando-o pelos íons K+,

o Cl- através de seus canais ativados por AMPc é expelido da célula parietal, já o

HCO3-, formado pela dissociação do H2CO3 é expelido por processo de antiporte na

membrana basolateral das células parietais que trocam o HCO3- principalmente por

Cl- (RAMSAY; CARR, 2011).

33

As céluas D exercem um papel fundamental para o controle inibitório da

secreção gástrica. Elas são responsáveis pela secreção de somatostina no antro e

no fundo do órgão e estão localizadas próximas às células parietais, assim como as

células G e ECL (SCHUBERT e PEURA, 2008). Portanto um aumento na acidez

gástrica, libera somatostatina para que exerça um papel inibitório no processo sobre

a secreção ácida-gástrica.

Figura 4. Mecanismo de secreção de ácido gástrico no antro estomacal

Fonte: Olbe et al. (2003)

Além da secreção ácida, as células do epitélio gástrico são responsáveis

também pela secreção de íons bicarbonato e muco, os quais formam uma barreira

que tem a função de proteger o lúmen estomacal contra a ação do ácido clorídrico

(HAN; KAUNITS, 2007). Por outro lado, esta barreira formada tem limitada

capacidade de proteção da mucosa contra o ácido, pepsina e danos mecânicos. Sua

composição é formada por um gel com característica elástica, aderente e viscosa,

que mantém um pH próximo a neutralidade (HAN; KAUNITS, 2007).

34

4.4 Úlcera Gástrica

Mudanças na fisiologia do estômago, modificações na função celular e na

estrutura tecidual levam a um desequilíbrio na homeostase, podendo levar ao

aparecimento da úlcera gástrica, que é definida como uma lesão crônica que

transpassa a camada de muco e o tecido muscular formando uma cavidade (NAJIM,

2011). Estas lesões, costumeiramente instalam-se na pequena curvatura na zona de

transição entre o corpo e o antro (MALFERTHEINER, 2009).

A principal manifestação clínica da úlcera gástrica é a dor epigástrica, que

pode ser amenizada pela ingestão de alguns alimentos, fármacos antisecretores e

antiácidos (RAMAKRISHMAN; SALINAS, 2007). Cerca de 80 a 90% dos pacientes

com úlcera gástrica manifestam outros sintomas, como a dispepsia que ocorre pelo

aumento da secreção de ácido gástrico (BARKUM; LEONTIADIS, 2010).

As úlceras menores não causam quaisquer sintomas, porém algumas úlceras

maiores podem causar hemorragias graves ou ocasionar outros sintomas

(MALAGELADA, 2007) tais como:

Sensação de plenitude

Fome e sensação de estômago vazio, após uma refeição

Náuseas

Dor no abdômen inferior

Melena

Dor epigástrica

Fadiga

Perda de peso

Êmese

Além da úlcera gástrica, os pacientes também podem apresentar gastrite, a

qual é caracterizada pela inflamação da mucosa gástrica (LIPOF, 2006;

MAHADEVA; GOEH, 2006).

Um levantamento feito por Overmier e Mourison (2013) mostrou que em

média 300 mil americanos são diagnosticados com úlcera gástrica todos os anos, já

na Coréia do Sul, cerca de 20% sofrem da doença. Entretanto dados

epidemiológicos sobre essa doença no Brasil são escassos, mas sua incidência na

população brasileira pode variar de 1 a 20 % (D’ACAMPORA et al., 2008 Segundo

Naik e colaboradores (2007) quem possui maior propensão em desenvolver úlcera

35

gástrica são os homens de 10 a 20% contra 8 a 11% das mulheres, entretanto, na

menopausa as mulheres passam a desenvolver maiores chances de desenvolver

úlcera gástrica, decorrente da menor produção secreção de hormônios. Os idosos

devido à polifarmácia (utilização concomitante de vários medicamentos) também

estão propensos ao desenvolvimento de lesões gástricas (SANTIN, 2013).

A úlcera gástrica é uma doença de etiologia multifatorial, dependendo de

alterações endógenas e estímulos exógenos, uma vez que o trato gastrointestinal é

exposto a estímulos nocivos diariamente (HAWKEY, 2000).

As alterações que podem culminar no desenvolvimento da úlcera gástrica são

a redução dos fatores protetores da mucosa ou o aumento dos fatores agressores.

4.4.1 Fatores protetores da mucosa gástrica

A mucosa gástrica mantém sua integridade estrutural e função apesar de

continuamente estar exposta a fatores nocivos, incluindo o ácido gástrico (HCl 0.1

mol/L HCl) e pepsina, que são capazes de digerir tecidos (LAINE et al., 2008).

Em condições normais a integridade da mucosa gástrica é mantida através de

diferentes mecanismos de proteção. A primeira barreira de defesa da mucosa

gástrica é pré-epitelial e constituída de uma camada espessa de muco e

bicarbonato. O trato gastrointestinal produz muco, desde o estômago até o cólon,

através das células epiteliais (LAINE et al., 2008), sua constituição é principalmente

água que corresponde a 95%, lipídeos e glicoproteínas chamadas de mucinas. Sua

estrutura é de um tetrâmero ligado por pontes de dissulfeto, com 80% de seu peso

formado por carboidratos. Quando esta unidade é polimerizada, surge um gel

viscoso, que se adere facilmente à mucosa gástrica, que por sua vez irá prevenir o

aparecimento de colônias bacterianas, reter íons bicarbonato secretados, também

impedindo a ação proteolítica da pepsina no epitélio gástrico (WALLACE, 2001;

LAINE, 2008).

Praticamente todos os mecanismos de defesa gástrica são mediados pelas

prostaglandinas (PGs), que por sua vez, também desempenham um papel biológico

em outros tecidos (TARNAWSKI, 2013). No estômago, as prostaglandinas E2 (PGE2)

e as prostaciclinas (PGI2) são sintetizadas pela isoforma 1 da enzima ciclooxigenase

(COX-1) (ATAY et al., 2000; CALDER, 2001).

36

As PGs estão diretamente envolvidas na inibição da secreção gástrica, na

liberação de muco e bicarbonato, inibição das funções de neutrófilos, onde pode-se

incluir quimiotaxia e adesão de leucócitos ao endotélio vascular, na manutenção do

fluxo sanguíneo na mucosa gástrica e na restauração das células epiteliais (LAINE

et al., 2008). Elas também contribuem para a citoproteção através da estabilização

das membranas lisossomais, mitocondrial e celular e pela prevenção da apoptose

(TAKEUCHI, 1987). A função da PGE2 é decorrente de sua ligação com quatro

receptores diferentes de prostanóides, denomidados EP1, EP2, EP3, EP3 e EP4

(ATAY et al., 2000). Em adição as PGE2 e PGI2, a superfície das células epiteliais

conectadas por junções de oclusão também compõem a barreira epitelial de

proteção à mucosa gástrica.

Além das barreiras pré-epitelial e epitelial, a presença de uma barreira

endotelial ou sub-epitelial também possui importante papel na manutenção da

integridade da mucosa gástrica (LAINE et al., 2008; KAUNITZ; AKIBA 2006).

Tarnawski (2005) reportou que a formação de novos vasos sanguíneos é um

mecanismo importante para a defesa sub-epitelial, pois atua no reparo e

manutenção dos danos causados na mucosa gástrica (TARNAWSKI, 2005). A rede

vascular além de transportar nutrientes e oxigênio para o tecido gástrico, auxilia no

aumento de bicarbonato, que por sua vez, neutraliza o ácido que é secretado pelas

células parietais no estômago, sendo também responsável pela produção de um

vasodilatador potente, o óxido nítrico (NO). O NO e as PGI2 agem causando um

relaxamento do músculo liso, protegendo a mucosa contra substâncias pró-

inflamatórias e vasoativas, como os leucotrienos (LTB4) e os tromboxanos (TXA2),

que diminuem a microcirculação da mucosa gástrica (WALLACE, 2008).

As defesas antioxidantes tissulares também são importantes na manutenção

da homeostasia da mucosa gástrica contra a formação de espécies reativas de

oxigênio (EROs) em decorrência do estresse oxidativo que pode ocorrer na mucosa

gástrica (HELLOU, 2012). O estresse oxidativo é um estado caracterizado pelo

aumento da formação de EROs em detrimento da atividade do sistema antioxidante

enzimático ou não enzimático (CNUBBEN et al., 2001) As EROs são compostos

instáveis que possuem um ou mais elétrons desemparelhados abrangendo os

radicais como o superóxido (O2-), peroxila (RO2), hidroxila (OH), hidroperoxila (HO2)

e outros agentes que não são radicais, porém, podem ser convertidos facilmente em

compostos radicalares como é o caso do peróxido de hidrogênio (H2O2), ozônio (O3)

37

e ácido hipocloroso (HClO) (HALLIWELL; GUTRIDGE, 1989).Entre as defesas

antioxidantes presentes no tecido gástrico estão as enzimas superóxido dismutase

(SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx). A metaloproteina SOD

consegue converter uma grande parte do ânion superóxido em peróxido de

hidrogênio (H2O2) através de sua dismutação, apresentando um importante poder

inibitório da inflamação, pois o ânion superóxido eleva a infiltração de neutrófilos por

meio da geração de mediadores quimiotáticos (leucotrieno B4) ou pelo aumento da

expressão de moléculas de adesão como a ICAM-1 (YASUI; BABA, 2006). O H2O2

gerado pela SOD, não é um radical livre, mas por ser uma molécula extremamente

reativa, está envolvido na formação de outros radicais, entre eles o radical hidroxila

(OH•) e o ácido hipocloroso (HOCl) (FERREIRA, 1997). A CAT age através da

redução do H2O2 em água e oxigênio molecular (H2O e O2), e é encontrada no

sangue, medula óssea, mucosas, rins e fígado. A suplementação da catalase

exógenamente, previne a oxidação da GPx mediada pala H2O2 (FERREIRA, 1997;

CNUBBEN et al., 2001).

A glutationa reduzida (GSH), conforme demonstrado na figura 5, um

componente não enzimático, exerce um papel fundamental para a defesa contra o

estresse oxidativo (FESHAREKI et al., 2006). Este tripeptídeo está presente em

concentrações elevadas nas células, sendo o principal sistema endógeno

antioxidante. O grupamento sulfídrica que está presente em sua molécula é

responsável pela reação com compostos químicos eletrofílicos como EROs,

deixando-os mais estáveis. Entretanto, para que esta atividade protetora se

mantenha, a GSH sofre oxidação através das enzimas glutationa oxidase (GO) e

glutationa peroxidase (GPx), dando origem a glutationa oxidada (GSSG)

(CNUBBEN, 2001). Em condições favoráveis, ocorre este ciclo redox, que

basicamente é a redução de GSSG em GSH pela ação da glutationa redutase (GR)

na presença do fosfato de dinucleotídeo de nicotidamina e adenina (NADPH).

Quando em condições de estresse oxidativo a GSSG é exportada por proteínas

dependentes de trifosfato de adenosina (ATP), para não alterar e manter o ambiente

de oxi-redução intracelular (CNUBBEN, 2001).

38

Figura 5. Conversão da glutationa para sua forma reduzida (GSH) e oxidada

(GSSG)

Fonte: Rover Júnior et al.,(2001)

4.4.2 Fatores agressores da mucosa gástrica

A secreção ácida gástrica e a pepsina são os principais fatores endógenos

que podem provocar dano à mucosa gástrica. O aumento da secreção ácida e a

ativação da pepsina podem ser provocados por diferentes fatores, dentre os quais

se destacam o estresse. O aumento da secreção ácida gástrica mediada pelo

estresse envolve duas vias distintas, o eixo-hipotálamo-pituitária-adrenal e o sistema

simpatoadrenal (SAAVEDRA et al., 2011). Além disso, vale ressaltar a intensa

hipersecreção ácida que ocorre em pacientes com síndrome de Zollinger-Ellison,

uma doença caracterizada pela presença de gastrinoma e associada à lesão no

epitélio gástrico (WILCOX; HIRSCHOWITZ, 2009).

39

Os fatores agressores da mucosa gástrica exógenos são o excesso de

consumo de álcool, o uso prolongado de antiinflamatórios não esteroidáis (AINEs) e

a infecção por H. pylori.

A infecção causada por H. pylori juntamente com o uso de antiinflamatórios

não esteroidais (AINES) correspondem aos maiores agentes para a formação da

ulceração gástrica. Esta lesão causada pela ação da H. pyloriI corresponde a cerca

70 %, enquanto 30 % é causada pela ação de AINES. Já a úlcera duodenal é

causada em 90 % e 10 % respectivamente (KUSTERS et al., 2006). A presença da

H. pylori tem sido associada com a ERO, podendo levar ao aparecimento de

estresse oxidativo na mucosa gástrica. O tratamento comumento utilizado nas

úlceras pépticas causadas pela H. pylori são uma associoção de antibióticos

(amoxicilina e claritomicina) e de medicações anti-secretoras (omeprazol)

(ROBERTSON et al., 2003).

O etanol é um dos mais intensos agentes agressores da mucosa gástrica,

causando uma redução na produção de muco e da secreção de bicarbonato,

exercendo um efeito tóxico diretamente no epitélio, que induz a formação de lesões

necróticas características, além do aparecimento de radicais livres e isquemia

(HIRUMA-LIMA et al., 2000; HIRUMA-LIMA et al., 2009; MASSIGNANI et al., 2009).

Os AINEs, que estão no grupo de medicamentos mais prescritos do mundo,

causam danos no estômago, pois inibem a enzima COX-1 e consequentemente

reduz a síntese de PGE2, que está envolvida na secreção de muco, liberação de

bicarbonato e na regulação do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica (VANE;

BOTTING, 1999). Além disso, vale ressaltar que os AINEs causam efeitos diretos na

mucosa gástrica, através da degradação de fosfolipideos presentes na mucosa

gástrica e no muco aderido, atuando na diminuição da hidrofobicidade e favorecendo

a retrodifusão de íons H+ na mucosa gástrica (BERSTAD, 2002).

A H. Pylori é uma bactéria gran-negativa podendo colonizar a mucosa

gástrica e é encontrada em 50% da população mundial, sendo sua maior

prevalência em países em desenvolvimento (USTON, 2006). Esta bactéria induz

estresse oxidativo, inflamação gástrica, dano no DNA, apoptose das células

epiteliais e uma desregulação do ciclo celular (LEE, 2004).

40

4.4.3 Tratamento convencional da úlcera gástrica

A terapia utilizada na gastroproteção por muitos anos foi baseada somente na

utilização de antiácidos, que tem como mecanismo de ação neutralizar a secreção

ácida gástrica. Atualmente os antagonistas dos receptores de histamina do tipo 2

(ARH2) e os inibidores da bomba de próton (IBPs), fármacos que reduzem a

secreção de ácido no estômago, são drogas bastante utilizadas no tratamento da

úlcera gástrica (SACHS, 2007,2010; ASOKKUMAR, 2014). Os IBPs são a classe

mais prescrita, pois não apresentam perda de eficácia ou tolerância como os ARH2

(KUBECOVA et al., 2011; SHEEN et al., 2011).

Em resumo, a terapia atual para o tratamento das úlceras gástricas pode ser

realizada pelos seguintes fármacos (GOODMAN, 2010; RANG, 2012):

Antiácidos: Hidróxido de alumínio e Hidróxido de magnésio

Inibidores da H+/K+ATPase: Omeprazol, Pantoprazol, Esomeprazol

Antagonistas do receptor H2: Ranitidina, Cimetidina.

Agentes citoprotetores: Misoprostrol e Sais de Bismuto

Inicialmente as úlceras gástricas foram controladas com o auxilio cirúrgico,

porém as taxas de recorrência e mortalidade eram enormes. O tratamento

farmacológico basicamente era neutralizar a acidez gástrica estomacal com a

utilização de fármacos antiácidos, como por exemplo: hidróxido de alumínio Al(OH)3,

carbonato de cálcio (CaCO3), bicarbonato de sódio (NaH2CO3) e hidróxido de

magnésio Mg(OH)2 ou associações como é o caso do medicamento Magnésia

Bisurada®. Estes medicamentos podem alterar o pH gástrico e urinário. Eles

interagem com uma variedade de fármacos através de interações farmacocinéticas,

podendo alterar a absorção, biodisponibilidade e eliminação por via renal e os

efeitos adversos podem incluir constipação ou diarréia (YUAN et al., 2006;

BRUNTON et al., 2006). Os sais de bismuto são utilizados há muito tempo para o

tratamento de desordens gástricas (BAGCHI et al., 1997) e mais atualmente é

utilizado em conjunto à antibioticoterapia contra H. pylori (GISBERT et al., 2015), seu

mecanismo de ação não está totalmente elucidado apesar de serem potentes

citotoprotetores (TANAKA et al., 1997).

41

Os ARH2 como Cimetidina (1976) e Ranitidina (1982) foram os precursores de

uma nova classe para o tratamento da úlcera gástrica. Estes medicamentos têm

eficácia na diminuição da secreção ácida e foram usados até surgimento dos IBPs

como Omeprazol (1988), seguido por Lansoprazol (1995), Rabeprazol (1999) e

Esomeprazol (2001) atualmente utilizados (JAIN, 2007).

Os IBPs são pró – fármacos que necessitam de ativação em ambiente ácido,

que acessam a célula parietal e, advinda da sua fraca natureza básica, ficam

acumulados em canalículos nas células parietais, onde são ativados por um

processo catalisado por prótons que resulta na formação de uma sulfenamida

tiofílica ou ácido sulfênico. Quando ativados reagem por meio de ligação covalente

com o grupo sulfidril de cisteínas do domínio extracelular da H+/K+-ATPase,

ocasionando uma inativação irreversível da bomba. A volta da secreção do ácido só

se reinicia após a síntese e inserção de novas moléculas de H+/K+-ATPase na

membrana luminal (YUAN et al., 2006; BRUNTON et al., 2006).

4.4.4 Fitoterapia no tratamento da úlcera gástrica

A palavra "fitoterapia" é de origem grega, onde "Phython" significa planta e

"Therapia" significa terapia, ou seja, terapia com plantas, tendo como objetivo o

estudo das plantas medicinais e suas aplicações em patologias (CARVALHO, 2004;

TESKE; TRENTINI, 2001).

Alguns fitoterápicos já estão disponíveis para o tratamento da úlcera gástrica,

como é o caso de cápsulas de Maytenus ilicifolia, que é comercializada por diversos

laboratórios (ALKOFAHI; ATTA, 1999; GONZALES, 2000; SOUCCAR; LIMA-

LANDMAN; LAPA, 2002).

Objetivando contribuir com a pesquisa e desenvolvimento de novos

fitoterápicos no tratamento de úlceras gástricas, o programa de pós-graduação em

Ciências Farmacêuticas, em especial o grupo coordenado pelo Prof. Dr. Sérgio

Faloni de Andrade, estuda plantas utilizadas comumente pela população para o

tratamento de distúrbios gástricos e visa contribuir com a validação cientificas do uso

popular através de estudos pré-clínicos.

De fato, a atividade gastroprotetora de algumas plantas já foi descrita por

nosso grupo de pesquisa, incluindo: Achyrocline satureoides (SANTIN et al. 2010);

42

Polygala cyparissias (KLEIN-JUNIOR et al. 2012); Rubus imperialis (BERTE et al.

2014); Maytenus robusta (RAIMUNDO et al. 2012);Brassica oleracea (LEMOS et al.

2011) Baccharis dracunculifolia DC (FUKUI et al. 2010). No momento a ação

gastroprotetora de diferentes plantas está sendo testada, dentre elas a Persea

wildenovii Korsterm, que possui difundido uso popular para o tratamento de úlceras

gástricas na região do meio Oeste de Santa Catarina e no Rio Grande do Sul.

43

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Animais

Os animais (ratos e camundongos) foram mantidos de acordo com as normas

e cuidados com animais de laboratório, bem estar e biosseguranca na

experimentação, conforme descritas da Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de

acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de

Laboratório. Os protocolos foram submetidos ao Comitê de Ética na Utilização de

Animais da Universidade do Vale do Itajaí, sendo aprovado sob o parecer n° CEUA

02/2015p. Nos ensaios biológicos foram utilizados ratos fêmeas Wistar (200 - 250 g),

camundongos machos Swiss (20 - 30 g), provenientes do Biotério Central da

Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de

polipropileno, em sala com temperatura (25⁰C) e ciclo controlados (claro/escuro 12

horas cada), tendo ração e água ad libitum. Nas doze horas anteriores aos

experimentos, os animais foram mantidos em jejum e com livre acesso a água,

sendo adicionada a caixa uma grade para impedir a coprofagia.

5.2. Coleta e preparação do extrato e frações

As folhas de Persea willdenovii Kosterm foram coletadas, identificadas pelo

Engenheiro Agrônomo Renê Artur Ferreira e uma amostra foi depositada no herbário

Barbosa Rodrigues localizado na cidade de Itajaí – SC, sob numeração HBR: 55226.

As Cascas de Persea willdenovii Kosterm após coletadas, foram secas, moídas,

extraídas por maceração com etanol a 70%, passando pelo rotaevaporador

resultando no extrato bruto (EHPW), com rendimento final de 15,70 %. Uma aliquota

foi separada e feita o fracionamento, obtendo-se os seguintes rendimentos: fração

hexânica (1,66%), diclorometano (3,83%), acetato de etila (19,75%) e aquosa

(74,75%), conforme esquematizado na figura 6.

44

Figura 6. Fluxograma de obtenção do EHPW e frações.

5.2.1. Teste de fenóis totais

Este método quantitativo foi descrito por (ARNOUS, 2001), os fenóis totais

foram determinadas utilizando o reagente de Folin – Ciocalteau diluído 1:10. As

concentrações finais do EHPW no meio reacional foram: 200, 150, 100 e 50 µg/mL.

Para este ensaio, 0,5 ml de solução de amostra foi adicionado em um tudo contendo

2,5 ml da solução de Folin – Ciocalteau e 2mL da solução a 7,5 % de Na2CO3.Os

tubos foram incubados a 45 °C durante 15 min e a absorbância foi lida a 750 nm

utilizando um espectrofotômetro e a concentração total de polifenóis foi calculado a

partir de uma curva de calibração, utilizando o ácido tânico como um padrão. Os

resultados foram expressos em equivalentes de ácido tânico (TAE) em µg/mL.

45

5.2.2. Estudo in vitro da atividade sequestradora de radicais livres (DPPH)

Este método quantitativo mede a reatividade do extrato com o radical livre

estável 2,2-difenil-1-picrilhidrazil DPPH foi determinada através de medidas de

alteração da absorbância a 517 nm. O sistema de reação foi constituído de 750 μL

de extrato e 250 μL de solução metanólica de DPPH (1mg em 25 mL). Após 5

minutos, o decréscimo da absorbância foi medido, a água destilada foi utilizada

como controle negativo e a solução do agente redutor, ácido ascórbico (50 μg/ml),

como controle positivo (BLOIS, 1958; CHEN et al., 2004).

5.3. Avaliação da atividade gastroprotetora do EHPW

5.3.1. Lesões gástricas induzidas por etanol em ratos

Ratas foram mantidos em jejum por 12 horas com acesso livre a água.

Grupos de seis animais receberam tratamento por via oral com veículo (água +

tween 80 0,5%, 1ml/100g), carbenoxolona (200mg/kg) e o EHPW nas concetrações

de 1, 10, 100 e 1000 g/Kg Uma hora após o tratamento, foi administrado 1 ml de

etanol 80% e após mais uma hora os estômagos foram abertos para mensuração da

área lesada (MIZUI; DOTEUCHI, 1983). As lesões foram quantificadas medindo a

área total lesada de cada estômago em mm² pelo programa EARP® (BERTE, 2014).

5.3.2. Lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em camundongos.

Camundongos foram mantidos em jejum por 12 horas com acesso livre a

água. Grupos de cinco animais receberam tratamento por via oral de (água + tween

80 0,5%, 1ml/100g), carbenoxolona (200 mg/kg), extrato na dose de 3 mg/kg por via

intraperitoneal (i.p) e oralmente as frações aquosa, acetato de etila, diclorometno e

hexano nas doses de 224,25 mg/kg; 59,25 mg/kg; 11,5 mg/kg e 5 mg/kg,

respectivamente. As doses das frações foram calculadas de acordo com o

rendimento de cada fração em relação ao extrato e a dose efetiva em promover

gastroproteção do extrato. Uma hora após o tratamento, foi administrado 1 ml de

etanol 60% + HCl 0,3M e após mais uma hora os estômagos foram abertos para

mensuração da área lesada (MIZUI; DOTEUCHI, 1983; ROBERT, 1979). As lesões

46

foram quantificadas medindo a área total ulcerada de cada estômago em mm² pelo

programa EARP® (BERTE, 2014).

5.3.3. Lesões gástricas induzidas por indometacina em ratos.

Os animais foram mantidos em jejum por 12 horas com acesso livre a água.

Grupos de 6 animais foram tratados por via oral com veículo (água + tween 80 0,5%,

1 mL/100g), carbenoxolona (200 mg/kg) e o EHPW na dose de 300 mg/Kg. Uma

hora após estes tratamentos, foi administrada a indometacina (80mg/kg, v.o) e após

seis horas os estômagos foram abertos pela curvatura maior para mensuração da

área lesada (MORIMOTO et al., 1991). Foi utilizado o programa EARP® como

descrito anteriormente (BERTE, 2014).

.

5.4. Avaliação da Atividade Anti-Secretora ácida

5.4.1. Ligadura de Piloro

Ratas foram mantidas em jejum por 12 horas com acesso livre a água. Depois

anestesiadas com uma mistura de anestésicos Xilazina e Cetamina (10 mg/kg e 5

mg/kg, i.p.) foi realizada uma incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide,

para marcação do piloro e a administração por via intraduodenal dos diferentes

tratamentos: veículo (água + Tween 80 0,5% - 0,1 mL/100 g, i.d), omeprazol (20

mg/Kg, v.o), e EHPW (300 mg/kg, i.d). Quatro horas após a cirurgia os estômagos

foram removidos e o esôfago fechado com auxílio de uma pinça. A mucosa foi

lavada com 3 mL de água destilada, recolhendo-se o suco gástrico e o lavado em

tubos de ensaios para a centrifugação por 10 min a 3000rpm. O pH foi medido

através de um pHmetro, o volume gástrico foi quantificado em proveta e a acidez

total quantificada por titulação simples com NaOH 0,1N, utilizando fenolftaleína 2%

como indicador ácido-base (SHAY, 1945).

5.4.2 Quantificação da atividade péptica

Uma alíquota de 0,1 mL do suco gástrico foi obtida como descrito no item

anterior (5.4.1) e em seguida colocada em um tubo cônico e incubada com 5 mL de

47

albumina bovina (5 mg/mL em HCl 0,06N), em temperatura de 37°C por 10 minutos.

Interrompeu-se a reação com 0,5 ml de ácido tricloroacético (ATC) 10%, em seguida

os tubos foram centrifugados em uma velocidade de 4000 rpm por 20 minutos. Após

isso, 1 ml foi retirado e alcalinizado com 5 mL de carbonato de sódio a 0,55 M. Ao

meio reacional, foram adicionados 0,5 mL do reagem de Folin-Ciocalteau 1N, onde

foram incubados novamente por 30 minutos em temperatura ambiente. Terminada a

incubação retirou-se 0,3 mL do preparado a absorbância foi mensurada em um

espectrofotômetro a 660 nm. A curva padrão foi feita com tirosina e os resultados

expressos em tirosina/ mL/ 4horas (ANSON, 1938).

5.4.3. Mensuração do muco gástrico

As amostras de estômago da região do corpo gástrico dos animais

submetidos à ligadura do piloro (item 5.4.1) foram pesadas e incubadas por 2 horas

em 5 mL de solução do corante Alcian Blue 0,1% preparado em sacarose 160 µM e

acetato de sódio 50 mM (pH 5), a qual complexa com o muco aderido à mucosa. O

excesso de solução de Alcian Blue foi removido através de duas lavagens

sucessivas com sacarose 250 mM, a primeira por 15 min e a segunda durante 45

min. Depois, o conteúdo de corante no tecido complexado com o muco gástrico foi

extraído com solução de cloreto de magnésio 500 mM durante 2 h. O material

extraído foi então misturado com 1 ml de éter dietílico e centrifugado a 3600 rpm por

15 minutos. A absorbância foi determinada em comprimento de onda de 598 nm. O

conteúdo de muco foi calculado usando uma curva padrão de Alcian Blue (6,25-100

µg) e os resultados foram expressos em µg Alcian Blue/g tecido (CORNNER et al.,

1974).

5.4.4.Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção

promovida pelo EHPW

Apos 12 h de jejum, camundongos foram divididos em dois grupos de acordo

com o tratamento recebido: veículo (NaCl 0,9%, 1ml/100 g, i.p) ou L-NAME (70

mg/kg, i.p) que é um inibidor da óxido nítrico sintase (NOs). Trinta minutos após

esses tratamentos, cada um dos dois grupos foi dividido em dois, um tratado com

veículo (água + Tween 80 0,5% - 0,1 mL/100 g, v.o) e outro tratado com EHPW (300

48

mg/kg, v.o). Depois de 1 hora, os animais receberam também por via oral 1 ml de

etanol 60% em HCl 0.03 M para indução das úlceras. Decorrida 1 hora da indução

das úlceras, os animais foram eutanasiados, seus estômagos retirados e as lesões

foram quantificadas em mm² pelo programa EARP® (ARRIETA et al., 2003;

MATSUDA, 1999).

5.5. Avaliação da atividade cicatrizante gástrica do EHPW

5.5.1. Lesões gástricas crônicas induzidas por ácido acético

Ratas, mantidas em jejum por 12 horas com acesso livre a água, separadas

em diferentes grupos de 6 animais, foram anestesiadas com xilazina e cetamina (10

mg/kg e 5 mg/kg, i.p.), a seguir a parede abdominal foi aberta e o estômago foi

exposto. Logo após, um cilindro de vidro (6 mm) contendo 500 μL de ácido acético

80% foi aplicado sobre a serosa do estômago para a indução da úlcera. Após 1 min

deste procedimento, o ácido no interior do cilindro foi aspirado e substituído por

solução salina. Em seguida a salina foi aspirada, o local foi seco com o auxílio de

uma haste com algodão, o cilindro foi retirado da superfície do estômago, o órgão foi

recolocado na cavidade abdominal e a paredeabdominal foi suturada. Após a

recuperação da anestesia, os animais retornaram a sala de ambientação e

permaneceram em regime de restrição alimentar com consumo livre de água até o

segundo dia, quando iniciou o tratamento. O tratamento por via oral consistiu na

administração de veículo (água + Tween 80 0,5% - 0,1 mL/100 g), omeprazol (20

mg/kg) e EHPW (300 mg/kg, v.o). O tratamento foi iniciado no segundo dia após a

cirurgia e realizado durante sete dias, durante esse período os animais recebiam

ração durante 1 hora, logo após era retirada e esperava-se 30 minutos para iniciar a

administração dos diferentes tratamentos. Ao final do período de tratamento, os

animais foram eutanasiados, o estômago removido e esticado para posterior análise.

A avaliação das lesões gástricas foi feita pela medida do comprimento x altura (mm2)

da úlcera, utilizando uma régua graduada (OKABE et al. 1971).

49

5.5.2. Avaliação histológica

A porção ulcerada do estômago submetido à lesão gástrica induzida por ácido

acético foi fixada durante 24 horas em ALFAC (solução composta de etanol 85%,

formol 10% e ácido acético 5%). Logo após as amostras foram desidratadas,

embebidas em parafina e cortadas em finas seções de 7μm (KALLAYA et al., 2006).

Uma parte das amostras foi submetida à coloração de hematoxilina e eosina (HE)

para avaliação de mudanças histológicas e da extensão das lesões gástricas, sendo

desidratadas em uma série ascendente de álcoois, diafanizadas em xilol e montadas

entre lâmina e lamínula (DA SILVA, 2014).

5.5.3 Avaliação histoquímica

A análise histoquímica para mucina foi realizada com a finalidade de verificar

o conteúdo de mucinas da mucosa gástrica após a indução das úlceras pelo ácido

acético 80 % e os efeitos dos diferentes tratamentos neste parâmetro. Desta forma,

os cortes histológicos obtidos (item 5.5.2) foram oxidados em ácido periódico 0,5%

por 5 min, lavados em água destilada, corados com reativo de Schiff por 20 min e

lavados em água sulfurosa e em água corrente (MOWRY et al., 1956). Para a

quantificação da mucina foi utilização o programa ImageJ® (PEREIRA, 2013).

5.6. Avaliação de mecanismos envolvidos na ação cicatrizante gástrica do

EHPW

5.6.1 Preparo do homogenato

Amostras teciduais de úlcera induzida por ácido acético (80%) foram pesadas

e homogenizadas com tampão fosfato 200 mM (pH 6,5). Este homogenato foi

utilizado para as análises de quantificação de níveis de GSH, e de atividade das

enzimas mieloperoxidase (MPO), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT).

50

5.6.2 Mensuração da concentração proteína

A concentração de proteína foi mensurada em espectrofotômetro a 590nm

utilizando o reagente de Bradford (Amresco®) e albumina bovina (0,012 – 0,100

mg/ml) foi utilizada como curva padrão.

5.6.3 Quantificação da atividade da Mieloperoxidase (MPO)

O homogenato obtido conforme citado anteriormente (item 5.6.1) foi

centrifugado a 10000 rpm durante 20 minutos, o precipitado obtido foi ressuspendido

com 1 mL de tampão fosfato de potássio 80 mM com 0,5% de

hexadeciltrimetilamônio (HTAB). Logo após a homogeinização, as amostras foram

novamente centrifugadas a 12000 rpm, 20 minutos a temperatura de 4°C em

microcentrífuga de alta velocidade refrigerada. Em uma placa de 96 poços foram

adicionados em triplicata alíquotas de 30 μL do sobrenadante de cada amostra, ou

água destilada para o branco, e então 200 μL de uma solução reacional (100 μL de

tampão fosfato 80 mM, 85 μL de tampão fosfato 22 mM e 15 μL de H2O2 0,017%) foi

acrescida. A reação deu início com a adição de 20 μL de tetrametilbenzidina (TMB),

um substrato enzimático que resulta num produto colorido em cada poço. A placa

contendo as amostras foi incubada por 3 min a 37ºC, e a reação foi interrompida

pela adição de 30 μL de acetato de sódio 1,46 M (pH=3,0) em cada poço. A

atividade enzimática foi determinada em espectofotômetro a 620 nm. Os resultados

foram expressos como unidade de densidade óptica (D.O)/mg de proteína.

5.6.4. Quantificação de grupos sulfidrílicos não protéicos (GSH)

No homogenato obtido conforme o item 5.6.1 foram adicionados 50 μL de

homogenato foram adicionados a 40 μL de ácido tricloroacético (ATC) 12,5% e os

tubos foram agitados em um agitador de tubos. Logo após, centrifugados por 15 min

a 3.000 rpm em microcentrífuga de alta velocidade refrigerada à 4°C. Posteriormente

foi adicionada uma alíquota de 10 μL do sobrenadante, ou água destilada (branco)

em uma placa de 96 poços. Seguido de 290 μL de tampão TRIS 0,4 M (pH 8,9) nas

amostras. A reação foi iniciada com a adição de 5μL de DTNB (5,5’-ditiobis 2-ácido

nitrobenzóico) 1 mM, 15 minutos antes da leitura espectrofotométrica em

51

comprimento de onda de 415 nm. Os procedimentos foram realizados a 4ºC e os

valores individuais interpolados em uma curva padrão de GSH (1,23–9,9 μg/mL),

com os valores expressos emμg de GSH/g de tecido (SEDLAK et al., 1968).

5.6.5. Quantificação dos níveis de superóxido dismutase (SOD)

O homogenato obtido conforme o citado no item 5.6.1 foram utilizados para

verificar a participação da SOD na proteção da mucosa gástrica promovida pelo

EHPW e baseia-se na capacidade da SOD em inibir a auto oxidação do pirogallol.

Em um tubo cônico foram adicionados 442,5 μl Tampão Tris - EDTA e 20 μL de

amostra. Após agitação em agitador de tubos, foi acrescentado 25 μL de pirogallol

1mM e incubado, depois foram centrifugados e 300 μL do sobrenadante pipetado em

microplaca para leitura em espectrofotômetro a 205 nm. Os resultados foram

comparados com o controle (Tampão Tris-EDTA com pirogallol sem incubação +

média sem amostra sem incubação), sendo este valor igual a 100%. A quantidade

de proteína que inibe a reação em 50% (IC50) equivale a 1 unidade (U) de SOD. Os

resultados foram expressos em U de SOD/mg de proteína (MARKLUND et al.,

1974).

5.6.6. Quantificação a atividade da catalase (CAT)

Conforme descrito no item 5.6.1 o homogenato foi utilizados para verificar a

participação da enzima catalase (CAT) na proteção da mucosa promovida pelo

EHPW. A mucosa gástrica foi homogeneizada em tampão fosfato pH 6,5. Em uma

cubeta 990 μl de solução reação 20 mM (Tampão Tris/ EDTA 5mM, pH8,0 +

peróxido de hidrogênio 30% + água ulta pura) foi adicionado 10μL da amostra diluída

e feitas 2 réplicas de cada homogenato. O decréscimo da absorbância foi medida

em comprimento de onda de 240 nm por 1 minuto (AEBI, 1984). Os resultados foram

expressos em µmol de H2O2 consumido/min/g de tecido.

52

5.7. Avaliação da Motilidade Gastrointestinal

5.7.1 Esvaziamento Gástrico de semi-sólidos

Consiste na administração de um marcador colorido semi-sólido (vermelho de

fenol 0,05% em carboximetilcelulose 1,5%) e na avaliação da quantidade do

marcador que permanece no estômago durante um período de tempo. Após 12

horas em jejum os camundongos foram tratados com veículo (H2O + tween 5% 1

mL/kg, v.o), EHPW (300 mg/kg, v.o) e atropina (3 mg/kg, s.c) e decorridos 30 min

(administração s.c) ou 1 hora (administração v.o) foi administrado o marcador

colorido. O grupo controle tempo zero foi sacrificado logo após a administração do

marcador colorido, e os outros grupos após 20 min da administração. A cavidade

abdominal foi aberta, o piloro e a parte distal do esôfago pinçados, o estômago

retirado com seu conteúdo e então aberto e lavado com 7 mL de água destilada. O

conteúdo gástrico coletado foi centrifugado e coletado 1 mL do sobrenadante, ao

qual foi adicionado 1 mL de NaOH 1N (pH 12). Os resultados foram obtidos por

leitura espectrofotométrica a 560 nm e expressos em porcentagem de esvaziamento

gástrico em relação ao grupo controle (SCARPIGNATO et al., 1980).

5.7.2 Trânsito Intestinal

O transito intestinal também foi avaliado através da administração de um

marcador colorido (vermelho de fenol 0,05% em carboximetilcelulose 1,5%) e na

avaliação do trajeto do mesmo no intestino delgado durante um período de tempo.

Camundongos, em jejum de doze horas, foram tratados com veículo (H2O + tween

5% 1 mL/kg, v.o), EHPW (300 mg/kg, v.o) e atropina (3 mg/kg, s.c) e decorridos 30

min (administração s.c) ou 1 hora (administração v.o) foi administrado o marcador

colorido. Após 20 min os animais foram eutanasiados e o comprimento total do

intestino delgado de cada animal (distância entre o piloro até a válvula ileocecal), e a

distância percorrida pelo marcador (até a última porção que contenha pelo menos 1

cm contínuo do marcador) foi mensurada. Os resultados foram expressos em

porcentagem da distância percorrida pelo marcador em relação ao comprimento total

do intestino delgado (STICKNEY e NORTHUP, 1959).

53

5.7.3. Avaliação Toxicológica preliminar

Para obter a análise toxicológica preliminar as ratas mantidas por 7 dias de

tratamento com o veículo (água + Tween 80 0,5% - 0,1 mL/100 g), omeprazol (20

mg/kg) e EHPW (300mg/kg), durante o experimento de úlcera crônica induzida por

ácido acético, tiveram o peso corporal registrado e foram observados diariamente

alterações clínicas e comportamentais. No final do experimento, os animais foram

eutanasiados e os órgãos (baço, coração, fígado, pulmão, rins, ovários e útero)

foram retirados e pesados. O peso dos órgãos foi apresentado como peso relativo

[(peso do órgão/peso do corpo) × 100] (BORATO, 2014).

5.7.4. Expressão dos dados e análise estatística

Os dados foram analisados pelo programa estatístico GraphPadPrism 5®

representados como as médias ± erro padrão. As diferenças entre as médias foram

determinadas através da análise de variância (ANOVA) de uma via seguida do teste

de Bonferroni, onde foram adotados níveis de significância para p<0,05.

55

6 RESULTADOS

6.1 Quantificação de fenois totais

Como indicado na tabela 01, a quantificação de fenóis totais do EHPW e da

fração acetato de etila, ambos nas concentrações de 200, 150, 100, 50 µg/mL,

revelou elevados teores de compostos fenólicos medidos em equivalentes de ácido

tânico. Contudo, nas frações diclorometano e hexânica estes compostos não foram

detectados.

Tabela 1. Quantificação de fenóis totais

Resultados expressos como equivalentes de ácido tânico ± E.P.M. A comparação entre grupo tratado

com veículo EHPW, fração hexânica (Fr C₆H₁₄), diclorometano (Fr CH₂Cl₂) e fração acetato de etila

(FracOet).

6.2 Avaliação da atividade sequestradora de radicais livres (DPPH)

A capacidade antioxidante in vitro do EHPW foi observada através do ensaio

da redução do radical DPPH. Neste experimento, EHPW foi capaz de inibir nas

concentrações de 100 e 1000 µg/mL os níveis dos radicais livres no meio reacional

em 49%, quando comparado com veículo (Vei: 91,11 ± 0,40 μM) (Figura 7). Para

56

este experimento foi utilizado o ácido ascórbico como controle positivo, que foi capaz

de reduzir o conteúdo de DPPH em 91,73%.

Figura 7. Atividade sequestradora de radicais livres do EHPW no ensaio de DPPH.

Atividade sequestradora de radicais livres do EHPW in vitro, ácido ascórbico (AA 50 µg/mL). Os

resultados foram expressos como média ± E.P.M (n = 3).***p <0,001 quando comparado ao grupo incubado com veículo. (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni)

6.3 RESULTADOS DA AVALIAÇÃO GASTROPROTETORA

6.3.1 Efeito do EHPW em úlceras induzidas por etanol

Como esperado, a administração de etanol foi capaz de lesar a mucosa

gástrica em 148,00 ± 14,83 mm2. O tratamento oral com EHPW na dose de 300

mg/kg foi capaz de reduzir em 59% a área de lesão em relação ao grupo ulcerado

tratado com veículo. Diferentemente as doses de 30 mg/kg e 100 mg/kg não

demonstraram ação gastroprotetora. A carbenoxolona (200 mg/ kg,v.o), controle

positivo do teste, reduziu as lesões 97% (Figura 08).

A administração intraperitoneal (i.p) do EHPW (3 mg/kg) reduziu as lesões em

66 % em relação ao grupo ulcerado tratado com veículo (15,41 ± 1,64) (Figura 9). A

fração diclorometano reduziu as lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em

77% e a fração hexânica reduziu essas lesões em 79%. Contudo o tratamento com a

Vei AA 1 10 100 1000

0

20

40

60

80

100

EHPW (g/mL)

***

*** ***

DP

PH

(

M)

57

fração aquosa e acetato de etila não mostraram diferença significativa na área

lesada em relação ao veículo (18,98 ± 4,56) como demonstrado na figura 10.

Figura 8. Efeito do EHPW sobre úlcera aguda induzida por etanol.

Vei Cbn 30 100 3000

50

100

150

200

**

HEPW (mg/kg v.o)

Etanol

***Áre

a

da L

esão

(m

m2)

Veículo Carbanoxolona 200 mg/kg

P. willdenovii30 mg/kg

P. willdenovii 100 mg/kg


A

B

Etanol

Painel A:Os animais receberam veículo (Vei:H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), carbenoxolona (Cbn 200 mg/kg) e EHPW nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg. Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).**P< 0,01, ***P< 0,001 quando comparados ao grupo tratado com veículo e (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni). Painel B: Imagens representativas de estômagos dos diferentes grupos experimentais após indução de úlcera com etanol.

58

Figura 9. Efeito da administração intraperitoneal do EHPW sobre úlcera aguda induzida por etanol acidificado.

Vei Cbn EHPW0

5

10

15

20

25

*

*

Etanol 60%+ HCl 0,3M

Áre

a L

esad

a (

mm

²)A

B

Veículo Carbanoxolona 200 mg/kg


Etanol 60%+ HCl 0,3M

Painel A: Os animais receberam veículo (Vei:H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg v.o), carbenoxolona (Cbn 200 mg/kg v.o) e EHPW (3 mg/kg, i.p). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).*P< 0,05, quando comparados ao grupo tratado com veículo e (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).Painel B: Imagens representativas de estômagos dos diferentes grupos experimentais após indução de úlcera com etanol acidificado.

59

Figura 10. Efeito das frações de EHPW sobre úlcera aguda induzida por etanol acidificado.

Vei Cbn Fr H2O Fr AcOet Fr C6H14 Fr CH2Cl2

0

10

20

30

40

* **

Etanol 60% + HCl 0,3M

Áre

a

da L

esão

(m

m2)

A

B

Veículo Carbenoxolona 200 mg/kg

Fr H2O Fr AcOet

Fr C6H14 Fr CH2Cl2

Etanol 60% + HCl 0,3M

Painel A: Os animais receberam veículo (Vei: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), carbenoxolona (Cbn: 200mg), fração aquosa (Fr H2O: 224,25 mg/kg), fração acetato de etila (FrAcOet: 59,25 mg/kg),

fração diclorometano (Fr CH₂Cl2: 11,5 mg/kg) e fração hexânica (Fr C₆H₁₄: 5,0 mg/kg). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).*P< 0,05: quando comparados ao grupo tratado com veículo e (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni). Painel B: Imagens representativas de estômagos dos diferentes grupos experimentais após indução de úlcera com etanol.

60

6.3.2 Efeito do EHPW em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina

A administração de indometacina foi capaz causar uma lesão de 1,20 ± 0,89

mm2 de área de estômago nos animais tratados com veículo. O tratamento oral com

HEPW na dose de 300 mg/kg, foi capaz de reduzir 75 % a área de lesão em relação

ao grupo ulcerado tratado com veículo. Da mesma forma, o grupo carbenoxolona

(200 mg/kg) também demonstrou uma redução da lesão em 62% quando comparado

ao grupo ulcerado tratado com veículo, conforme mostrado na figura 11.

61

Figura 11. Efeito do EHPW sobre úlcera aguda induzida por indometacina.

Vei Cbn EHPW0.0

0.5

1.0

1.5

****

Indometacina (80 mg/ kg v.o)

Are

a

da L

esão

(m

m2)

A

B

Indometacina 80 mg/kg

Carbenoxolona 200 mg/kg


Indometacina 80 mg/kg

Painel A: Os animais receberam veículo (Vei:H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), carbenoxolona (Cbn 200 mg/kg) e o EHPW (300 mg/kg). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).**P<0,01: quando comparados ao grupo tratado com veículo e (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni). Painel B: Imagens representativas de estômagos dos diferentes grupos experimentais após indução de úlcera com indometacina.

6.3.3 Avaliação da secreção gástrica.

Para avaliar os mecanismos envolvidos na gastroproteção observada nos

modelos clássicos descritos anteriormente (etanol, etanol acidificado e

indometacina), o modelo de ligadura pilórica foi utilizado a fim de verificar a ação

anti-secretora ácida gástrica do EHPW. Ademais, este experimento permite observar

62

se o extrato é absorvido e possui efeito sistêmico, uma vez que que a administração

do mesmo se faz pela via intraduodenal (LEMOS et al., 2011).

Como indicado na tabela 02, a administração do EHPW (300 mg/kg i.d), não

alterou o volume, a acidez total da secreção gástrica, o pH e nem a atividade péptica

secretada durante 4 h, quando comparados com o grupo veículo (7.92 ± 0.46 mL;

0.07 ± 0.00 Eq[H+]/mL; 1.63 ± 0,11 e 1,03 ± 0,09 µmol de tirosina/mL,

respectivamente). Como esperado, a administração de omeprazol (20 mg/kg, v.o.)

diminuiu o volume, a acidez total e a atividade péptica da secreção gástrica em

63,63 %, 90 % e 63 % respetivamente.

Paralelamente, o conteúdo do muco gástrico também foi avaliado. Contudo

tanto o tratamento com EHPW (300 mg/kg i.d) ou omeprazol (20 mg/kg v.o), não foi

capaz de aumentar os níveis de muco na mucosa gástrica quando comparados com

o grupo submetido a ligadura do piloro (172 ± 5,60 µg de Alcian Blue/g de tecido)

(Figura 12).

Tabela 2. Efeito da administração intraduodenal do EHPW em parâmetros da secreção ácida gástrica.

Os resultados foram expressos como média ± D.P. (n =5).**P< 0,01, *** P <0,001 quando comparado com o grupo veículo. (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

63

Figura 12. Efeito do EHPW sobre os níveis de muco gástrico após ligadura do piloro.

Vei Ome EHPW0

50

100

150

200

250M

uco

( g

de A

lcia

n B

lue/g

de t

ecid

o)

Os animais receberam veículo (Vei:H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg i.d), omeprazol (Ome 20 mg/kg v.o) e o EHPW (300mg/kg i.d). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5). (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

6.3.4 Participação do óxido nítrico sobre a gastroproteção desempenhada pelo

EHPW .

Conforme demonstrado na figura 13, os animais tratados com veículo

apresentaram úlceras gástricas em uma extensão de em média 26.62 ± 6.17 mm2 do

estômago. Como esperado, o tratamento com EHPW reduziu a área de lesão em 73

%. O grupo tratado com veículo e pré-tratado com L- NAME apresentou área de

lesão semelhante ao grupo tratado com veículo e pré-tratado com salina (p>0.05).

Contudo, o pré-tratamento com L-NAME aboliu o efeito gastroprotetor do EHPW,

evidenciado pelo aumento em 168,41 % da área de lesão nesses animais.

64

Figura 13. Influencia do NO sobre o efeito gastroprotetor do EHPW.

Vei EHPW Vei EHPW0

20

40

60

80

100

*

L-NAME (70mg/kg i.p)

Etanol 60% + HCl 0,3 M

Salina

*

###A

rea

da L

esão

(m

m2)

O grupo que não recebeu L-NAME foi tratado com veículo (salina 0,1 mL/ 100g) e EHPW (300 mg/ kg). Já o grupo tratado com L-NAME (70 mg/kg) recebeu o veículo (salina 0,1 mL/ 100g) e EHPW (300 mg/kg). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).*P< 0,05 quando comparados ao grupo tratado com veículo e (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni). ### P< 0,001, quando comparado com o EHPW sem L-NAME.

6.4 Efeito cicatrizante do EHPW no modelo de úlcera induzida por ácido

acético.

Neste experimento, o grupo ulcerado tratado com veículo apresentou área de

lesão de 127,9 ± 12,04 mm2 no estômago. O tratamento oral do EHPW na dose de

300 mg/kg reduziu esta área para 76,00 ± 9,5 mm2. Similarmente, o omeprazol que é

utilizado como controle positivo, reduziu a área de lesão para 65,50 ± 13,9 mm2

(Figura 14). Confirmando os dados da área de lesão, as análises microscópicas de

extensão da lesão gástrica nos animais tratados com omeprazol e EHPW

apresentaram aumento da margem da úlcera acompanhado pela redução da base

dessa lesão (Figura 15 E e F).

65

Figura 14. Efeito cicatrizante do EHPW em úlcera gástrica induzida por ácido acético 80%.

Vei Ome EHPW0

50

100

150

** *

Ácido acético 80%

Áre

a d

e L

esão

(m

m2)

Os animais receberam veículo (Vei: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), omeprazol (Ome 20 mg/kg) e EHPW na dose de 300 mg/kg. Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).*P< 0,05 e ** P< 0,01 quando comparados ao grupo tratado com veículo e (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

66

Figura 15. Análise macroscópica (A, B, C) e microscópica (D, E, F) das úlceras crônicas gástricas induzidas por ácido acético.

Os animais receberam veículo (Vei: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg; painel A e D), omeprazol (Ome 20 mg/kg; painel B e E) e EHPW (300 mg/kg; painel C e F). Setas indicam o sítio da lesão. m: margem da úlcera e b: base da úlcera (Aumento de 200 X).

6.4.1 Efeito do EHPW sobre os níveis de mucina

Nos animais ulcerados pela instilação de ácido acético na mucosa gástrica e

tratados com veículo, foi possível observar que os níveis de marcação para mucina

(glicoproteínas que compõem o muco) foram em média de 4,95 ± 0,47 pixels/campo.

(Figura 16 A). Nos animais que receberam o tratamento oral o EHPW (300 mg/kg)

houve um aumento na coloração de PAS para mucina em 206 %, (Figura 16 B e C)

67

Figura 16. Efeito da administração oral do EHPW na análise histoquímica para mucina (PAS).

Vei Ome EHPW0

5

10

15

20

***

Ácido acético 80%

Pix

els

/cam

po

(X

10

06)

Painel A: Os animais receberam veículo (Vei: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), omeprazol (Ome 20 mg/kg) e EHPW na dose de 300 mg/kg. Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).***P< 0,001 quando comparados ao grupo tratado com veículo e (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni). Painel B: Avaliação dos níveis de mucina pelo método histoquímico de PAS nas úlceras induzidas por ácido acético 80%. Os animais foram tratados com veículo (H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg, A), omeprazol (20 mg/kg, B) e EHPW (300 mg/kg, C).

6.4.2 Efeito do EHPW sobre a atividade da MPO em estômagos de ratas após

indução de úlcera por ácido acético 80%.

Como demonstrado na figura 17, a instilação de ácido acético na mucosa

gástrica foi capaz de aumentar os níveis de atividade da MPO em 294,64%, quando

A

B

68

comparado ao grupo não ulcerado (Naive: 7.28 ± 1.33 m D.O./ mg de proteína). Por

outro lado, os tratamentos por via oral com EHPW (300 mg/kg) e omeprazol (20

mg/kg) foram capazes de reduzir esse aumento em 51,96% e 74,52%

respectivamente, em relação ao grupo ulcerado tratado com veículo (Vei: 28,73 ±

4,59 m D.O./ mg de proteína).

Figura 17. Atividade da administração oral do EHPW sobre a úlcera induzida por ácido acético 80% sobre os níveis de MPO.

Naive Vei Ome EHPW0

10

20

30

40

##

**

*

Ácido acético 80%

MP

O (

m D

.O/m

g p

rote

ína)

Os animais receberam veículo (Vei: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), o grupo Naive não recebeu tratamento, e EHPW na dose de 300 mg/kg. Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).##P< 0,01 quando comparados ao grupo não ulcerado (Naive). *P<0,05, ** P<0,01 quando comparado os grupo ulcerado tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

6.4.3 Avaliação do efeito do EHPW sobre os níveis de GSH em estômagos de

ratas após indução de úlcera por ácido acético 80%.

No intuito de saber se a manutenção dos níveis de GSH está envolvido na

ação cicatrizante gástrica do EHPW (300 mg/kg), os níveis de GSH foram avaliados

em amostras de estômagos previamente ulcerados com ácido acético 80 %. A figura

18 mostra que o nível de GSH no estômago de animais ulcerados tratados com

veículo diminuiu em 35,25 %, quando comparado ao grupo não ulcerado (Naive:

69

474,50 ± 42,08 µg de GSH/g de tecido). O tratamento com EHPW ou omeprazol não

foi capaz de manter os níveis de GSH próximos aos níveis encontrados nos animais

não ulcerados.

Figura 18. Avaliação da administração oral do EHPW sobre a úlcera induzida por ácido acético 80% sobre os níveis de GSH.

Naive Vei Ome EHPW0

200

400

600

##

Ácido acético 80%

###

GS

H (

g/g

tecid

o)

Os animais receberam veículo (Vei: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), o grupo Naive não recebeu tratamento,e EHPW na dose de 300 mg/kg. Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5).#P< 0,5 ;##P< 0,01 quando comparados ao grupo não ulcerado (Naive) (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

6.4.4 Efeito do EPWH sobre a atividade da enzima SOD em estômagos de ratas

após indução de úlcera por ácido acético 80%.

Como demonstrado na figura 19, os níveis da atividade da enzima SOD foram

diminuídos para 69,93 % no grupo ulcerado tratado com veículo, quando comparado

com o grupo não ulcerado (Naive: 651,30 ± 122,70 U SOD/ mg de proteína).

Confirmando o efeito antioxidante do extrato, os níveis dessa enzima no grupo

tratado com o EHPW foram semelhantes (p>0.05) aos níveis encontrados no grupo

não ulcerado e aumentados em até 100 % em relação ao grupo ulcerado tratado

70

com veículo. Os animais ulcerados tratados com omeprazol apresentaram níveis de

atividade da enzima SOD com média de 392,0 ± 97,76 U SOD/ mg de proteína.

Figura 19. Avaliação da administração oral do EHPW sobre a úlcera induzida por ácido acético 80% sobe a enzima SOD.

Naive Vei Ome EHPW0

200

400

600

800

1000

Ácido acético 80%

*

##

U S

OD

/mg

pro

teín

a

Os animais receberam veículo (Vei: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), o grupo Naive não recebeu tratamento, omeprazol (Ome: 20 mg/kg) e EHPW na dose de 300 mg/kg. Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5). ##P< 0,01 quando comparados ao grupo não ulcerado (Naive). *P<0,05,quando comparado os grupo ulcerado tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

6.4.5 Efeito do EHPW sobre a atividade da enzima CAT em estômagos de ratas

após indução de úlcera por ácido acético 80%.

O grupo ulcerado tratado com veículo apresentou a atividade da enzima CAT

igual a 258.4 ± 85.96 µmol de H2O2 consumido/min/g de tecido, o que representa

uma diminuição de 91% na atividade dessa enzima (Naive; 3100 ± 85.96 µmol de

H2O2 consumido/min/g de tecido). De forma não esperada, o tratamento com extrato

ou com omeprazol não foi capaz de reverter a diminuição da atividade da CAT nos

tecidos ulcerados, quando comparado ao grupo ulcerado tratado com veículo

(p>0.05) conforme figura 20.

71

Figura 20. Avaliação da administração oral do EHPW sobre a úlcera induzida por ácido acético 80% sobe a enzima CAT.

Naive Vei Ome EHPW0

1000

2000

3000

4000

###

Ácido acético 80%

### ###

µm

ol d

e H

2O

2 c

on

su

mid

o/m

in/g

tecid

o.

Os animais receberam veículo (Vei: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg), o grupo Naive não recebeu tratamento, omeprazol (Ome: 20 mg/kg) e EHPW na dose de 300 mg/kg. Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5). ).###P< 0,001 quando comparados ao grupo não ulcerado (Naive). (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

6.4.6 Avaliação do efeito do EHPW sobre o esvaziamento e motilidade

gastrointestinal.

Como indicado na tabela 3, a administração do EHPW (3, 30 e 300 mg/kg

v.o), não alterou o esvaziamento gástrico e o transito intestinal, quando comparados

com o grupo veículo (61,06 ± 6,24 % e 65,62 ± 3,96 % respectivamente). A atropina

(antagonista muscarínico) promoveu uma redução significativa em relação ao grupo

tratado com veículo e EHPW nas diferentes doses (P<0,001).

72

Tabela 3. Efeito da administração oral do EHPW em diferentes doses.

Administração oral do EHPW sobre a taxa de esvaziamento gástrico. Os animais foram tratados com veículo (0.1mL/100g), atropina (3 mg/kg, s.c) e EHPW (3, 30, 300 mg/kg).n.d: não detectado. *** p <0,01 (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

6.4.7 Efeito do Tratamento por sete dias com EHPW sobre os parâmetros

toxicológicos.

O tratamento dos animais com EHPW 300 mg (v.o), duas vezes ao dia

durante sete dias, não alterou significativamente o peso dos órgão quando

comparamos com o grupo tratado com veículo (H2O + Tween 80 0,1mg/kg),

conforme mostra a tabela 04.

73

Tabela 4. Efeito da administração oral do EHPW no peso relativo dos órgãos na úlcera gástrica induzida por ácido acético 80% em ratas após sete dias de tratamento.

Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 5). A comparação entre grupo tratado com veículo: H2O + Tween 80 0,1 mL/ kg; Omeprazol: 20 mg/kg e EHPW 300mg/kg (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni.

75

7 DISCUSSÃO

As plantas medicinais são empregadas no tratamento de várias patologias

sendo que algumas delas são utilizadas no tratamento de úlceras gástricas como é o

caso da Persea willdenovii Kosterm (MAZZA et al., 2000). A úlcera gástrica foi uma

das doenças mais comum no século XX, dados mostram que sua incidência é de

cerca de 13,6 milhões de pessoas por ano. Porém com o avanço nas pesquisas,

conseguiu-se elucidar melhor a sua fisiopatologia e melhorar o seu tratamento. Nos

dias atuais, as estratégias terapêuticas são fundamentadas no uso de fármacos anti-

secretores, tais como os IBPs (omeprazol, esomeprazol, por exemplo) e os

antagonistas dos receptores histaminérgicos do tipo 2 (cimetidina e ranitidina, por

exemplo) (DAVIDE, 2009).

Apesar da eficácia, o tratamento convencional baseado na supressão ácida

pode, em longo prazo, causar tolerância e outros efeitos adversos. Kangwan (2014)

aponta que a supressão ácida pode não ser suficiente para uma cicatrização

gástrica completa, podendo ocorrer reincidência da úlcera no decorrer da vida do

paciente e, por conta disso, prolongar a terapia com os fármacos antisecretores

(KANGWAN, 2014; TANG; CHAN, 2012). Com a necessidade da manutenção em

longo prazo da terapia com antisecretores, os efeitos colaterais desses fármacos em

decorrência da supressão ácida gástrica prolongada aparecem e são motivo de

questionamentos e preocupações da terapia antiúlcera vigente. Entre os efeitos

colaterais associados à supressão ácida prolongada estão os relacionados com o

desenvolvimento da acloridriase e uma menor absorção de vitamina B12 e cálcio

(JAIN, 2007). Neste contexto, novas terapias eficazes e mais seguras são desejadas

e produtos de origem natural são promissores para o desenvolvimento dessas

alternativas. (GARCIA-RODRIGUEZ; RUIGOMEZ, 2007).

Dentre os produtos naturais utilizados pela população da região Sul do Brasil

para o tratamento de desordens gástricas está o chá das cascas da Persea

willdenoviiI Kostern (MAZZA et al., 2000). Por tal motivo, este estudo avaliou a

atividade gastroprotetora e cicatrizante gástrica das cascas dessa planta. O modelo

de úlcera gástrica aguda induzida pela administração oral de etanol é classicamente

utilizado para a pesquisa de substâncias com potencial gastroprotetor. O efeito

ulcerogênico do etanol é relacionado à sua capacidade de causar lesões

hemorrágicas na mucosa gástrica através de um processo necrótico (HIRUMA-LIMA,

76

2000). Além disso, devido a sua propriedade físico-química, o etanol rompe a

barreira de muco e bicarbonato, causando danos celulares e um desequilíbrio na

homeostase gástrica, aumentando a formação de EROs e alterando a

microcirculação gástrica provendo danos à mucosa (REPETTO; LLESUY, 2002;

MADALOSSO, 2011; ROZZA, 2012; SZABO, 1981; KALIA, 2000). De fato, no

presente estudo tanto a administração de etanol em ratos, como a administração de

uma solução etanólica acidificada com ácido clorídrico em camundongos, foi capaz

de ulcerar a mucosa gástrica. Comprovando o efeito gastroprotetor de Persea

willdenovii, observou-se nestes modelos que o EHPW, na dose de 300 mg/kg

administrado por via oral ou 3 mg/kg por via intraperitoneal, promove uma diminuição

na área lesada do estômago. Similarmente, Cosmo e colaboradores (2007) e

Owoyele e colaboradores (2010) avaliaram a atividade gastroproterora do extrato

hidroalcoólico das cascas de Persea major Kopp e do extrato aquoso das folhas de

Persea americana Mill e também constataram que ambas as espécies possuem

efeito gastroprotetor na ulceração induzida por etanol quando administradas por via

oral (COSMO 2007; OWOYELE 2010). Vale ressaltar que como o EHPW também

promove gastroproteção quando administrado por via intraperitoneal podemos inferir

que os efeitos promovidos pelo extrato são devido a uma ação sistêmica e não

somente a uma ação local (tópica) na mucosa gástrica.

No presente estudo, as frações obtidas do EHPW através da extração

sucessiva com solventes de polaridades diferentes também foram testadas no

modelo de úlcera induzida por etanol acidificado, sendo suas doses calculadas a

partir dos rendimentos de cada fração em relação ao EHPW e a mínima dose efetiva

do extrato. Neste experimento, somente as frações obtidas com diclorometano e

hexano reduziram a área de lesão causada pelo etanol. Sabe-se que em geral nas

frações diclorometano e hexano estão retidos em maior concentração compostos

apolares como, por exemplo, os terpenos que possuem ação gastroprotetora já

descrita por Kwiecién et al. (2004). Contudo, a participação desses compostos nos

efeitos observados ainda precisa ser comprovada.

Com relação à fitoquimica realizada até o momento, observou-se uma maior

concentração de fenóis totais no EHPW e na fração solúvel em acetato de etila.

Sieben (2012) observou uma concentração elevada de fenóis totais no extrato

hidroalcoólico das cascas de Persea major Kopp, onde a fração acetato de etila foi

identificada como rica em taninos e aminogrupos. Como descrito por Alanko (1999),

77

os compóstos fenólicos, grupo químico presente no extrato e na fração, podem

estimular a formação de PGE2, que esta relacionada com vários mecanismos de

gastroproteção. Entretanto, como a fração rica em fenóis totais (FrAcOet) não

desempenhou atividade gastroprotetora, é provável que o efeito desses compostos

não possa estar associado, pelo menos diretamente, com a atividade

gastroprotetora desempenhada pelo EHPW.

Considerando os resultados no modelo de úlcera induzida por etanol ou

etanol acidificado, o EHPW também foi testado no modelo de lesão gástrica induzido

por indometacina. A indometacina é um antiinflamatório não esteroidal (AINE), uma

classe de medicamentos comumente utilizada na clínica para doenças inflamatórias

e condições dolorosas (ROBBINS, 2013). Os efeitos terapêuticos dos AINEs são

mediados pela inibição da isoforma do tipo 2 da enzima cicloxigenase (COX-2), que

está envolvida diretamente na patogênese da dor, febre e inflamação (ROBBINS,

2013). Porém, a inibição da isoforma do tipo 1 da COX (COX-1) causada pela

administração de AINEs não seletivos, como a indometacina, promove a redução

dos níveis de PGE2 e consequentemente os níveis de muco aderido à mucosa

gástrica, um importante fator de proteção da mucosa, também são reduzidos.

Devido a esse fato, o uso prolongado desses fármacos está associado ao

surgimento de lesões gástricas ou ao agravamento de lesões já existentes (JONES

et al., 1999; HALTER 2001). Experimentalmente, a indometacina, em uma dose

adequada, também é uma ferramenta para estudos de substâncias com atividade

antiúlcera.

Comprovando mais uma vez o efeito gastroprotetor, os resultados deste

experimento demonstraram que o EHPW também apresenta efeito protetor contra a

ação ulcerogênica da indometacina em ratos. Esses resultados corroboram com o

estudo de Owoyele (2010), o qual também demonstrou que o extrato aquoso das

folhas da Persea americana Mill promoveu atividade gasproproterora contra

indometacina. Porém, contrastando com nossos resultados, Cosmo (2007) não

observou gastroproteção desempenhada pelo extrato hidroalcoólico das cascas de

P. major Kopp neste modelo. As diferenças entre os estudos podem ser explicadas

pela variabilidade fitoquímica entre os extratos, apesar de serem obtidos por

espécies do mesmo gênero.

Os efeitos colaterais dos AINEs não seletivos são classicamente atribuídos à

sua capacidade de inibição da COX-1 e como consequência uma diminuição da

78

síntese das PGs, que são responsáveis pela modulação de vários componentes

envolvidos na defesa da mucosa gástrica (KONTUREK, 2005). Deste modo, perante

os resultados obtidos, é possível que um dos mecanismos envolvidos na

gastroproteção exercida pelo EHPW poderia estar relacionado à síntese ou a

disponibilidade de PGs na mucosa gástrica, porém, experimentos são necessários

para confirmar tal hipótese.

Conforme Gill (2011), a secreção ácida compõe um dos fatores agressores da

mucosa gástrica, e em conjunto com a pepsina colabora para o desenvolvimento de

lesões gástricas. Por este motivo, os medicamentos mais comumente utilizados nos

dias atuais para o tratamento de úlceras são os fármacos antisecretores (GILL,

2011). Diante disso, considerou-se pertinente avaliar o efeito antisecretor do EHPW

e com esse propósito o experimento de ligadura pilórica foi realizado. Como descrito

nos resultados, o EHPW não foi capaz de alterar o volume e nem a acidez da

secreção gástrica quando administrado por via intraduodenal em animais

submetidos ao modelo de ligadura do piloro. Assim, pode-se inferir a ausência de

atividade antisecretora ácida gástrica no efeito gastroprotetor demonstrado pelo

EHPW e que outros mecanismos, provavelmente associados ao fortalecimento de

fatores defensores da mucosa, participem desse efeito. De forma similar, Cosmo e

colaboradores (2007) avaliaram o potencial gastroprotetor da espécie Persea major

Kopp e também descreveram que o extrato hidroalcoólico das cascas não altera os

parâmetros mensurados de secreção ácida gástrica.

Apesar de constituir um fator agressor, a acidez gástrica é de extrema

importância no processo de digestão (HUANG; HUNT, 1996). Sabe-se que em

ambiente ácido, as células principais secretam pepsinogênio que é catalisado para a

sua forma ativa, a pepsina, que através da sua ação proteolítica participa ativamente

da digestão de proteínas (RAUFMAN, 1996). Assim, como a hipersecreção ácida, o

aumento da atividade da pepsina também constitui um importante fator agressivo da

mucosa (TARNAWSKI, 2005). Entretanto, em nossos experimentos somente a

administração de omeprazol reduziu a atividade péptica do conteúdo gástrico, o que

atesta mais uma vez a ausência de efeitos antisecretores no potencial gastroprotetor

das cascas de P. willdenovii Korstern.

A redução da secreção ácida e o aumento dos níveis plasmáticos de gastrina

são verificados durante a supressão ácida promovida por drogas antisecretoras

como os IBPs (ANDRIULLI et al., 1991). Este fenômeno está associado com a

79

hiperplasia de células parietais observadas com o uso prolongado de IBPs

(HASHIMOTO et al., 2007; QVIGSTAD et al., 1998; STOLTE et al., 1992;

KARASAWA et al., 1988). A hipergastrinemia persistente ocasionada pela terapia

prolongada com estes fármacos pode promover várias alterações histológicas,

incluindo o aparecimento de pólipos na mucosa gástrica (STOLTE et al., 1992;

KARASAWA et al., 1988) e mais tardiamente, o aparecimento de um processo

neoplásico (BRZOZOWSKI, 2003). Considerando que os efeitos gastroprotetores de

P. willdenovii não estão envolvidos com a inibição da secreção ácida gástrica, é

provável, mas ainda não provado, que a administração do extrato não esteja

associada ao aumento dos níveis séricos de gastrina e conseqüentemente aos

efeitos adversos associados a isso.

Em contrapartida aos fatores agressores, a mucosa gástrica dispõe de fatores

protetores que contribuem para a homeostasia tissular. O muco gástrico é a primeira

barreira de defesa da mucosa contra a secreção ácida devido à formação de um gel

viscoso, elástico e aderente (LAINE, 2008). Essa camada de muco evita os danos

causados pelo contato das células epiteliais com o ácido clorídrico da luz estomacal

(MOJZIS; HEGEDUSOVA; MIROSSAY, 2000; NAM et al., 2005; WALLACE, 2007).

De forma curiosa, apesar do resultado obtido no modelo de úlcera induzida por

indometacina, o EHPW não alterou os níveis de muco aderido em animais

submetidos à ligadura pilórica, sendo assim é possível que mecanismos não

associados ao aumento do muco aderido através da ativação da via PGE2/COX-1

estejam envolvidos no efeito gastroprotetor do extrato.

Diante dos resultados obtidos, nos interessou verificar a participação do NO

no efeito gastroprotetor do EHPW. Os resultados demonstraram o envolvimento da

via do NO na atividade gastroprotetora do extrato, pois a pré-administração de L-

NAME um inibidor da enzima NOS, a qual catalisa a formação de NO, foi capaz de

abolir o efeito gastroprotetor do EHPW. O NO é formado a partir da L-arginina

através da enzima NOS, que pode ser de origem neuronal (nNOs ou NOS1),

induzida (iNOS ou NOS2) ou endotelial (eNOS ou NOS3) (WANG; MARDSEN, 1995).

É reportado na literatura que o NO participa diretamente na modulação da defesa na

mucosa gástrica, mediante a regulação do fluxo sanguíneo, pois age como

vasodilatador produzindo um aumento de fluxo sanguíneo, melhorando a irrigação e

impedindo a ação de agentes vasoconstritores como os leucotrienos, endotelina e

tromboxanos (LAPA et al., 2008; LEMOS et al., 2011; WALLACE; MILLER, 2000). O

80

efeito vasodilatador do NO é devido sua interação com guanilato ciclase, na via da

guanosina-3’,5’-monofosfato ciclico (GMPc) e diretamente sobre os canais de

potássio dependentes de cálcio, gerando hiperpolarização nas células endoteliais

dos vasos.

Devido aos efeitos encontrados nos modelos de agudos (etanol, etanol

acidificado, indometacina, ligadura de piloro e óxido nítrico), nos interessou

investigar os efeitos cicatrizantes gástricos do EHPW e com tal proposta o modelo

de úlcera induzida por ácido acético foi utilizado.

A úlcera induzida por ácido acético se desenvolve por meio de alterações

originadas por múltiplos fatores, entre eles: citocinas, alterações nos níveis de PGs,

e diversos fatores de crescimento, além de mudanças no padrão de aderência do

muco e alterações na microcirculação (KOBAYASHI et al., 2001), além de

reproduzirem com severidade e cronicidade as alterações encontradas nas úlceras

gástricas em humanos, inclusive o processo de cicatrização (TAKAGI; SAZIKI,

1969). Por tais características, o modelo de ulceração crônica através da instilação

de ácido acético 80 % na mucosa gástrica é utilizado no mundo todo para avaliação

do potencial cicatrizante gástrico de substâncias (OKABE; AMAGASE, 2005).

Histologicamente a úlcera gástrica obtida pela exposição da mucosa ao ácido

acético é composta de duas estruturas principais: a margem e a base da úlcera. A

margem, também é chamada de zona de cicatrização, e a base da úlcera é formada

por fibroblastos, macrófagos, células linfóides e células endoteliais (TARNAWSKI,

2005). Como descrito por Konturek (2005) a cicatrização dessa lesão é um processo

complexo e orquestrado para reconstrução da mucosa lesionada, onde envolve a

formação de tecido de granulação na base da úlcera, a proliferação celular na

margem da lesão para o restabelecimento da arquitetura glandular e a formação de

novos vasos (KONTUREK, 2005).

A respeito das úlceras crônicas induzidas por ácido acético, os resultados

deste estudo demonstraram uma diminuição da área ulcerada nos animais tratados

com EHPW, indicando assim que o extrato testado além da atividade gastroprotetora

em modelos agudos, também acelera a cicatrização de úlceras gástricas já

instaladas.

Existe uma relação muito estreita entre a inflamação e a cicatrização gástrica

(HARTET, 1998). Um dos fatores que ocorrem durante o processo inflamatório na

mucosa gástrica é a ativação de leucócitos, que causam um aumento no consumo

81

de O2 para a produção de ânions superóxidos, um radical livre precursor de várias

espécies reativas de oxigênio (HARTET, 1998). Conforme Hamaishi (2006), o

surgimento de radicais livres induzidos pelos neutrófilos, pode ser um fator crucial

para a formação de lesões gástricas (HAMAISHI, 2006). Estes compostos podem

provocar danos celulares, pois não possuem estabilidade, podendo se associar com

outras estruturas como lipídios da membrana, proteínas e DNA (HELLOU, 2012).

Sendo assim, a ativação e a infiltração de neutrófilos promove um desequílibrio no

balanço oxidativo e na microcirculação, contribuindo para o retardo da cicatrização

gástrica (BOU-ABBOUD et al., 1998).

A atividade da MPO é classicamente utilizada para a mensuração indireta da

infiltração de neutrófilos em diferentes tecidos, pois esta enzima está presente nos

grânulos azurófilos dos neutrófilos (NISHIDA, 1997; POTRICH, 2010). Como

observado em nossos resultados, a exposição da mucosa gástrica ao ácido acético

aumentou a atividade da MPO, comprovando a participação de um infiltrado

neutrofílico na gênese da lesão gástrica. Por outro lado, como o tratamento com o

EHPW promoveu uma diminuição na atividade da MPO no tecido ulcerado, é

possível inferir que a redução na infiltração neutrifílica durante a cicatrização gástrica

também contribui para os efeitos cicatrizantes gástricos do extrato. Por conseguinte,

também podemos indicar que a redução do dano oxidativo promovido pela formação

de EROS de origem neutrofílica também seja decorrente dos efeitos do tratamento

com o EHPW.

O ensaio de sequestro do radical DPPH é um método clássico para

investigação in vitro da atividade antioxidante de substâncias, originalmente sendo

sugerido em 1950 (BORGES, 2011). Considerando os resultados obtidos nesse

ensaio, podemos inferir que o EHPW é eficaz no sequestro de radicais livres. Assim

o tratamento com o EHPW é capaz de restaurar o equilíbrio redox tecidual tanto pela

redução da atividade da mieloperoxidase, como por uma atividade sequestradora de

radicais livres. Da mesma forma, Gorinstein (2010) que estudou o potencial

antioxidante da Persea americana, o abacate, também observou um potencial

antioxidante neste fruto. Além disso, Carpena - Rodrigues (2011) analisou o

potencial antioxidante de duas diferentes variedades da Persea americana, sendo

que o extrato acetônico e metanólico das cascas e sementes da varidade “Has”

demonstrou maior eficácia no sequestro de radicais livres DPPH.

82

Além da redução da atividade da MPO e consequentemente da migração de

neutrófilos e da atividade sequestradora de radicais livres, é possível que o

favorecimento do sistema antioxidante gástrico esteja envolvido nos efeitos

cicatrizantes do EHPW. O tripeptídeo GSH é encontrado em concentrações

elevadas na mucosa gástrica de ratos e de humanos (BODY et al., 1979), compondo

um importante mecanismo citoprotetor (CNUBBEN et al., 2001). O GSH atua

diretamente como um antioxidante potente e de maneira indireta como substrato

para várias outras enzimas antioxidantes, sendo elas: a glutationa S-transferase

(GST), glutationaperoxidase (GPx) e glutationaredutase (GR) (CNUBBEN et al.,

2001). De fato, em nossos experimentos foi demonstrado que após a exposição dos

estômagos ao ácido acético ocorre uma diminuição nos níveis de GSH na mucosa

gástrica, pressupondo que a ulceração da mucosa está associada com o declínio

das defesas antioxidantes. Contudo, apesar dos efeitos do EHPW discutidos até

aqui, o restabelecimento dos níveis basais de GSH não foi verificado nos animais

ulcerados por ácido acético e tratados com o EHPW

O prejuízo nos sistemas enzimáticos antioxidantes tem sido investigado

durante a patogênese da úlcera gástrica, como é o caso das enzimas SOD e CAT.

Em altas concentrações o ânion superóxido (O2-) pode ativar a enzima SOD, que por

sua vez, catalisa a dismutação deste radical em peróxido de hidrogênio (H2O2). A

molécula de H2O2 é então inativado pela CAT ou GPx, sendo degradada em água e

O2 (KWIECIEN et al. 2002).

Atestando a redução na atividade de enzimas antioxidantes, as mensurações

no sítio da úlcera induzida por ácido acético em animais tratados com veículo

comprovaram a redução nos níveis de atividade da SOD e CAT. Confirmando mais

uma vez o potencial antioxidante do EHPW, observou-se a participação do aumento

na atividade da enzima SOD durante o processo cicatricial gástrico em animais

tratados com o extrato. Contudo, os efeitos do extrato na atividade das enzimas

antioxidantes é pelo menos parcial, uma vez que os níveis de atividade da CAT não

foram aumentados após o tratamento com EHPW. Embora não esperado, esse

resultado pode ser explicado através da possibilidade de o extrato aumentar a

atividade da GPx, uma vez que esta enzima também pode catalisar a degradação da

H2O2, através da oxidação do GSH em GSSG (REED et al., 1984). Da mesma

forma, é provável, mas também ainda não provado que esta hipótese possa explicar

83

a redução dos níveis de GSH na mucosa gástrica dos animais ulcerados tratados

com o EHPW.

O muco gástrico é importante durante o processo de cicatrização, pois efetua

a proteção das células da mucosa gástrica (LAINE, 2008), o efeito do EHPW sobre

os níveis de mucina em úlceras crônicas induzidas por ácido acético 80% também

foi mensurado pelo método histoquímico de PAS. Nessa técnica, o ácido periódico

oxida seletivamente os resíduos de glicose, produzindo aldeídos que reagem com o

reagente de Schiff e confere uma cor final púrpura-magenta, revelando a presença

de macromoléculas de carboidratos como glicoproteínas, glicogênio e

proteoglicanos, tipicamente encontrados no muco. No presente estudo, a exposição

da mucosa gástrica ao ácido acético 80% reduziu os níveis de mucina e o

tratamento com o EHPW restaurou esses níveis. Interessantemente, como descrito

anteriormente, no modelo de mensuração de muco gástrico durante a ligadura

pilórica, observou-se que o EHPW não protegeu a mucosa, porém no modelo ulcera

crônica foi verificado que os níveis de mucina foram preservados durante a

cicatrização gástrica mediada pelo EHPW. As diferenças entre os resultados obtidos

podem ser explicadas pela duração do tratamento, sendo que no modelo de úlcera

induzida por ácido acético os animais foram tratados sete dias enquanto que na

ligadura foi administrado apenas um tratamento.

Em paralelo, nos interessou avaliar se o EHPW exerceria efeito sobre o

esvaziamento gástrico e/ou trânsito intestinal. Entretanto, os resultados demonstram

que em todas as doses testadas, o EHPW não altera o trânsito intestinal ou o

esvaziamento gástrico. O esvaziamento gástrico tem seu início com a acomodação

do bolo alimentar na porção do estômago proximal, que quando estimulada

responde a distensão muscular permitindo que o conteúdo gástrico flua pelo

estômago distal e alcance o duodeno (ROSTAS et al., 2011). A ACh é um dos

reguladores da motilidade, atuando através dos receptores muscarínicos M1 e M3

(HANSEN, 2003), por tal motivo nestes experimentos a atropina (um antagonista

muscarínico), foi utilizada como controle positivo. Diante dos resultados obtidos

descartamos qualquer efeito prócinético do EHPW. Contudo, Potrich (2014)

descreveu o efeito procinético de um extrato hidroalcoólico das cascas de Persea

major.

Diante do uso popular do chá das cascas de Persea willdenovii Korstern e de

uma literatura escassa sobre sua toxicidade, investigou-se sinais de toxicidade

84

durante o tratamento de sete dias com o EHPW no experimento de úlcera crônica.

Com base na RDC 48/04, os produtos datados como fitoterápicos, devem como os

demais garantir sua segurança e seus efeitos terapêuticos. Desta maneira é

importante ressaltar que a exposição dos animais ao EHPW durante sete dias não

produziu sinais de toxicidade ou alterações na massa tecidual dos órgãos

analisados. Contudo, para a completa afirmação de ausência de efeitos tóxicos ou

não, é necessária a realização de estudos com doses maiores e com um período

prolongado de tratamento.

85

8 CONCLUSÃO

Os resultados do presente estudo demonstraram que:

1. A análise fitoquímica preliminar no EHPW nos possibilitou observar a

presença de compostos fenólicos, porém seu efeito gastroprotetor não

está associado à ação destes compostos.

2. O EHPW possui atividade sequestradora de radicais livres.

3. O EHPW e as frações diclorometano e hexânica apresentam efeito

gastroprotetor em diferentes modelos de úlcera gástrica aguda.

4. Embora o tratamento vigente para as úlceras gástricas seja realizado

através de fármacos antisecretores, o EHPW não apresenta qualquer

atividade antisecretora.

5. A atividade gastroprotetora do EHPW mediante administração de L-NAME

é abolida, o que sugere a participação de vias relacionadas ao óxido

nítrico neste efeito.

6. O efeito do EHPW sobre a cicatrização gástrica é mediado pelo aumento

nos níveis de mucina, pela redução da infiltração neutrofílica (medida em

temos de atividade da enzima MPO) e pelo favorecimento das defesas

antioxidantes gástricas.

Em conjunto os resultados nos permitem concluir que o EHPW possui efeito

gastroprotetor e cicatrizante gástrico, além de diminuir a ação de radicais livres

favorecendo as defesas antioxidantes, além disso, supõe-se que o mecanismo de

gastroproteção está relacionado à via do óxido nítrico. Contudo, mais estudos são

necessários para a continuidade da elucidação de mecanismos envolvidos na

atividade gastroprotetora e cicatrizante gástrica das cascas de Persea wiildenovii

Korsterm e para a identificação de compostos envolvidos nos efeitos observados.

87

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ LINCON BORDIGNON …siaibib01.univali.br/pdf/Lincon Bordignon...

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