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UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA (UNIVAP)

INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO (IP&D)

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOENGENHARIA

VANESSA FERNANDEZ BANHARA

ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES BIOMOLECULARES CAUSADAS PELO

FÁRMACO DICLOFENACO SÓDICO EM PEIXES DA ESPÉCIE Brycon opalinus

ATRAVÉS DA ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO POR

TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)

São José dos Campos, SP

2016


ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES BIOMOLECULARES CAUSADAS PELO



TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

Stricto sensu em Bioengenharia como complementação de

créditos necessários para a obtenção do título de Mestre em

Bioengenharia.

Orientadora: Profª Drª Kumiko Koibuchi Sakane

Co-orientadora: Profª Drª Maria Regina de Aquino Silva

São José dos Campos, SP

2016

FICHA CATALOGRÁFICA


“ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES BIOMOLECULARES CAUSADAS PELO



TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)”

Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de

Mestre em Bioengenharia, pelo programa de Pós-graduação em Bioengenharia, do

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade Vale do Paraíba, São José

dos Campos, pela seguinte banca examinadora:

Profª. Drª Andreza Ribeiro Simioni (UNIVAP) ________________________________

Profª. Drª Kumiko Koibuchi Sakane (UNIVAP) ________________________________

Profª. Drª Maria Regina de Aquino Silva (UNIVAP) ____________________________

Profª. Drª Andrea Santos Liu (IFSP) _______________________________________

Prof. Dr. Leandro José Raniero

Diretor do IP&D - UNIVAP

São José dos Campos, 06 de Maio de 2016.

DEDICATÓRIA

Á minha família e base de tudo, Rogério, Sarita, Marcelo e ao meu noivo Rafael, por serem grandes incentivadores e minha fonte de inspiração para que eu pudesse concluir com sucesso minha trajetória.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, pois sem Ele nada disso seria possível.

À Universidade do Vale do Paraíba, por ter me dado a grande oportunidade de

realizar este curso.

À minha orientadora Prof.ª Drª. Kumiko Koibuchi Sakane, pela calma e paciência em

momentos difíceis, pelos ensinamentos, dedicação, amizade, e total apoio em todas

as horas, sempre muito alegre e otimista.

Á minha co-orientadora Profª Drª. Maria Regina de Aquino Silva, pela amizade,

apoio e por todo conhecimento transmitido com muito carinho.

Á Profª Drª. Patrícia Marcondes dos Santos, pela dedicação e disposição em ajudar

no que era preciso, em qualquer momento.

Á equipe da Estação de Piscicultura da Companhia Energética de São Paulo –

CESP da Usina Hidrelétrica de Paraibuna, pela gentileza em ceder os peixes para o

experimento.

À minha amada família, que sempre me incentivou e deu forças para que pudesse

chegar até o fim.

Ao meu querido noivo Rafael, a quem agradeço muito pelas palavras de incentivo,

paciência, disponibilidade em ajudar sempre que necessário, pelo companheirismo e

amor.

Aos colegas de turma pela força e por toda a ajuda prestada, em especial ás minhas

amigas Andriele Maísa e Alessandra Silva.

Finalmente, á todas as pessoas que ajudaram e participaram direta ou indiretamente

para o desenvolvimento e conclusão deste curso.

RESUMO

O crescente consumo de medicamentos em todo mundo tem estimulado diversos estudos sobre os impactos causados pelo descarte inadequado dos resíduos farmacêuticos, contendo os princípios ativos no meio ambiente. Esses medicamentos depois de ingeridos são excretados na forma de outros compostos no esgoto doméstico e muitos deles são persistentes no ambiente e causam alterações fisiológicas nos organismos aquáticos. Em decorrência do crescimento populacional e consumo excessivo de alguns medicamentos, dentre os principais tipos encontrados nas águas superficiais brasileiras está o anti-inflamatório Diclofenaco sódico, em concentrações na faixa de µg.ml-1. Este estudo buscou avaliar as alterações biomoleculares que o princípio ativo selecionado gera em organismos aquáticos, como os da espécie Brycon opalinus, utilizando como ferramentas de análises o teste de Ecotoxicidade e a técnica de Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). Foram analisadas três diferentes concentrações de Diclofenaco sódico mais o controle para o teste de Ecotoxicidade. Os órgãos selecionados para análise através da técnica de Espectroscopia foram o fígado, brânquias e músculo. Foi realizada a análise qualitativa através da inspeção visual direta e a análise quantitativa através do cálculo das áreas das bandas correspondentes aos modos vibracionais das biomoléculas em estudo. Observaram-se alterações nas bandas dos lipídios, triglicerídeos, glicogênio e ácidos nucleicos. Já a banda correspondente às proteínas não demostrou alterações significativas. A técnica de Espectroscopia no Infravermelho se mostrou bastante eficiente, proporcionando ótimos resultados. Palavras-chave: Espectroscopia no Infravermelho. Peixes. Ecotoxicidade. Fármacos. Meio ambiente.

ANALYSIS OF BIOMOLECULAR CHANGES CAUSED BY DICLOFENAC SODIUM

DRUG IN FISHES OF THE KIND Brycon Opalinus THROUGH FOURIER

TRANSFORM INFRARED SPECTROSCOPY (FTIR)

ABSTRACT

The increasing worldwide consumption of drugs has spurred several studies on the impacts caused by the improper disposal of pharmaceutical wastes, containing the active ingredients in the environment. These medications after ingestion are excreted in the form of other compounds into the domestic sewage and many of them are persistent in the environment and cause physiological changes in aquatic organisms. As a result of population growth and excessive consumption of some medications, among the main types found in Brazilian surface water is the Diclofenac Sodium anti-inflammatory in concentrations on the order of µg L-1. The main objective of this work is to evaluate the biomolecular changes that its active compound causes in aquatic organisms such as that of Brycon opalinus species, using analyses tools such as the Ecotoxicity Test and the Fourier Transform Infrared Spectroscopy technique (FTIR). Three different concentrations and control of Diclofenac Sodium for Ecotoxicity test were chosen. The organs chosen for analysis through the spectroscopy technique were liver, gills and muscle. A qualitative analysis was performed by direct visual inspection and a quantitative analysis was made calculating the areas of bands corresponding to vibrational modes of the biomolecules under study. They were observed changes in regions of lipids, triglycerides, glycogen and nucleic acids. The band corresponding to the proteins did not show significant changes. Keywords: Infrared Spectroscopy. Brycon opalinus. Ecotoxicity. Drugs.

Environment.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Possíveis caminhos dos fármacos no meio ambiente. ................................. 16

Figura 2 - Fórmula estrutural do Diclofenaco sódico. ...................................................... 18

Figura 3 - Espécie Brycon opalinus – Pirapitinga do Sul. ............................................... 19

Figura 4 - Pirapitinga do Sul. ............................................................................................... 20

Figura 5 - Espectro de transmitância do ácido lático ....................................................... 23

Figura 6 - Espectro de absorbância de ácido lático. ........................................................ 23

Figura 7 - Modos normais de vibração das moléculas da água: (ѵa) estiramento

assimétrico; (ѵs) estiramento simétrico; (δ) deformação angular. ................................ 26

Figura 8 - Modos vibracionais do grupo CH2, representados por (a) “wagging”; (b)

“scissoring”; (c) “rocking” e (d) “twisting”. ........................................................................... 27

Figura 9 - Fórmula estrutural da molécula de Clorofórmio ............................................. 28

Figura 10 - Espectro infravermelho da molécula de Clorofórmio. ................................. 28

Figura 11 - Esquema ilustrativo para o interferômetro de Michelson e do espectro

resultante da aplicação da transformada de Fourier. ...................................................... 30

Figura 12 - (A) Interferograma de uma radiação monocromática; (B) de uma radiação

policromática; (C) de uma radiação policromática, com uma amostra entre o

interferômetro e o detector. .................................................................................................. 31

Figura 13 - Experimento montado. ..................................................................................... 37

Figura 14 – Ilustração do procedimento experimental. ................................................... 38

Figura 15 - Espectrofotômetro Spectrum Spotlight 400 FT-IR da Perkin Elmer. ........ 39

Figura 16 - Espectros infravermelhos médios do tecido hepático referente ao grupo

controle e concentrações 1, 2 e 3. ...................................................................................... 41

Figura 17 – Histogramas e suas respectivas regiões: (A) Região 3691-3021 cm-1; (B)

Região 3021-2988 cm-1; (C) Região 2988-2878 cm-1; (D) Região 2878-2821 cm-1; (E)

Região 1767-1715 cm-1; (F) Região 1715-1582 cm-1; (G) Região 1582-1477 cm-1; (H)

Região 1477-1425 cm-1; (I) Região 1425-1356 cm-1; (J) Região 1273-1185 cm-1; (K)

Região 1185-1169 cm-1; (L) Região 1169-1131 cm-1; (M) Região 1131-1062 cm-1; (N)

Região 1062-943 cm-1; (O) Região 943-889 cm-1; (P) Região 877-827 cm-1. ............. 45

Figura 18 - Espectro infravermelho médio do tecido de músculo referente ao grupo

controle e concentrações 1, 2 e 3. ...................................................................................... 49

Figura 19 - Histogramas e suas respectivas regiões: (A) Região 3657-3021 cm-1; (B)




Região 1271-1200 cm-1; (L) Região 1200-1131 cm-1; (M) Região 1131-1050 cm-1 (N)

Região 1050-988 cm-1; (O) Região 988-943 cm-1; (P) Região 943-903 cm-1; (Q)

Região 903-884 cm-1; (R) Região 884-863 cm-1; (S) Região 863-839 cm-1; (T) Região

839-817 cm-1. .......................................................................................................................... 53

Figura 20 - Espectro infravermelho médio do tecido de brânquias referente ao grupo

controle, concentrações 1, 2 e 3. ........................................................................................ 57

Figura 21 - Histogramas e suas respectivas regiões: (A) Região 3681-3106 cm-1 ; (B)




Região 1185-1128 cm-1; (L) Região 1128-1055 cm-1; (M) Região 981-941 cm-1. ....... 60

Figura 22 - Variação da razão lipídio-proteína em fígado (F); variação da razão

lipídio-proteína em brânquias (B), variação da razão lipídio-proteína no músculo (M).

.................................................................................................................................................. 65

Figura 23 - Variação da razão DNA-proteína em fígado (F); variação da razão DNA-

proteína em brânquias (B), variação da razão DNA-proteína no músculo (M). .......... 66

Figura 24 - Variação da razão Triglicerídeos-fosfolipídios em fígado (F); variação da

razão Triglicerídeos-fosfolipídios em brânquias (B), variação da razão Triglicerídeos-

fosfolipídios no músculo (M). ............................................................................................... 67

Figura 25 - Variação da razão Amida I/Amida II em fígado (F); variação da razão

Amida I/Amida II em brânquias (B), variação da razão Amida I/Amida II no músculo

(M). ........................................................................................................................................... 68

Figura 26 - Variação da razão Glicogênio-proteína em fígado (F). ............................... 69

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Lista parcial de compostos farmacêuticos detectados no meio hídrico. ... 15

Tabela 2 - Limites aproximados para as regiões no Infravermelho. .......................... 22

Tabela 3 - Número de onda e atribuições aproximadas do espectro de clorofórmio. 28

Tabela 4 - Concentrações de Diclofenaco sódico utilizadas nos ensaios

ecotoxicológicos para a espécie Brycon opalinus. .................................................... 35

Tabela 5 - Grupos e aquários correspondentes. ....................................................... 37

Tabela 6 - Número de onda e descrição aproximada do espectro de fígado controle.

.................................................................................................................................. 42

Tabela 7 - Intensidade integrada das bandas das diferentes regiões do espectro do

fígado. ....................................................................................................................... 44

Tabela 8 - Número de onda e descrição aproximada do espectro de músculo

controle. .................................................................................................................... 50

Tabela 9 - Intensidade integrada das bandas das diferentes regiões do espectro de

músculo. .................................................................................................................... 52

Tabela 11 - Intensidade integrada das bandas das diferentes regiões do espectro de

brânquias................................................................................................................... 59

Tabela 12 - Quantificação das principais biomoléculas no fígado. ............................ 63

Tabela 13 - Quantificação das principais biomoléculas no músculo. ........................ 64

Tabela 14 - Quantificação das principais biomoléculas nas brânquias. .................... 64

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AINE’s Anti-inflamatórios não esteróides

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CESP Estação de Piscicultura da Companhia Energética de São Paulo

CETESB Companhia Ambiental do Estado de São Paulo

DOU Diário Oficial da União

ETE Estações de Tratamento de Esgoto

FAR Infravermelho distante

FENAFAR Federação Nacional dos Farmacêuticos

FT-IR Espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier

Ѵ Estiramento

δ Deformação angular

ρw Deformação “wagging” (to wag, abanar)

δscis Deformação “scissoring” (scissors, tesoura)

ρtw Deformação “twisting” (to twist, torcer)

δr Deformação “rocking” (to rock, balançar)

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IE Interferentes endócrinos

IUCN The World Conservation Union (A União de Conservação Mundial)

MID Infravermelho médio

NIR Infravermelho próximo

PFHP Produtos farmacêuticos de higiene pessoal

UATR Técnica FT-IR de Reflexão

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 13

1.1 Fármacos no meio ambiente .............................................................................. 13

1.2 Ecotoxicologia ..................................................................................................... 17

1.3 Diclofenaco sódico ............................................................................................. 18

1.4 Brycon opalinus - Pirapitinga-do-Sul: espécie endêmica do Rio Paraíba do

Sul ............................................................................................................................... 19

1.5 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR) .......................................................... 20

1.5.1 Vibrações moleculares .................................................................................... 24

1.5.2 Instrumentação ................................................................................................. 29

2 OBJETIVO ................................................................................................................. 33

2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................... 33

2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................... 33

3 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 34

3.1 Obtenção dos animais ........................................................................................ 34

3.2 Preparo das soluções de Diclofenaco de sódio ............................................... 34

3.3 Teste de Ecotoxicidade ....................................................................................... 35

3.4 Desenho experimental ........................................................................................ 36

3.5 Obtenção do material biológico ......................................................................... 37

3.6 Preparo das amostras para análise ................................................................... 38

3.7 Obtenção dos Espectros de Absorção no Infravermelho ................................ 38

3.7.1 Pré-processamento de dados ......................................................................... 39

3.7.2 Análise dos dados ............................................................................................ 40

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 41

4.1 Obtenção dos espectros infravermelhos dos tecidos de fígado .................... 41

4.1.1 Estudo das diferentes regiões do espectro no infravermelho do tecido de

fígado através de análise quantitativa entre as diferentes concentrações de

Diclofenaco sódico e controle ................................................................................. 45

4.2 Obtenção dos espectros infravermelhos dos tecidos de músculo ................ 48


músculo através de análise quantitativa entre as diferentes concentrações de


4.3 Obtenção dos espectros infravermelhos das brânquias ................................. 57

4.3.1 Estudo das diferentes regiões do espectro no infravermelho de brânquias

através de análise quantitativa entre as diferentes concentrações de


4.4 Quantificação de biomoléculas .......................................................................... 63

4.4.1 Razão Lipídio-proteína ..................................................................................... 64

4.4.2 Razão DNA-proteína ......................................................................................... 66

4.4.3 Razão Triglicerídeos-fosfolipídios .................................................................. 67

4.4.4 Razão Amida I/Amida II .................................................................................... 68

4.4.5 Razão Glicogênio-proteína .............................................................................. 69

5 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 71

ANEXO A - Comitê de Ética em Pesquisa ................................................................. 76

13

1 INTRODUÇÃO

1.1 Fármacos no meio ambiente

Com o aumento da população tem-se também o aumento no volume de

efluentes domésticos gerados. Todavia, o lançamento tanto do esgoto in natura

como de efluentes tratados em Estações de Tratamento de Esgoto (ETE) são as

principais fontes de contaminação por resíduos de princípios ativos presente em

medicamentos, devido aos tratamentos convencionais não eliminarem totalmente

estes compostos (ZUCCATO et al, 2006).

A água dos mares, rios e lençóis freáticos estão cada vez mais contaminadas

com fármacos, substâncias utilizadas no desenvolvimento de medicamentos.

Segundo pesquisa realizada pelas Faculdades Oswaldo Cruz em 2011, 75% das

pessoas descartam seus medicamentos no lixo doméstico e 6% na pia ou vaso

sanitário.

Segundo a Federação Nacional dos Farmacêuticos (2015) os índices do

crescimento do setor farmacêutico no Brasil demonstram de forma inequívoca a forte

expansão do consumo de medicamentos no país. Mesmo com a desaceleração da

economia nos últimos anos, este setor só aumenta. Entre 2007 e 2013, o Brasil

passou da décima para sexta colocação no mercado farmacêutico mundial. A

estimativa é de que em 2017 o país chegue ao quarto lugar ficando atrás somente

de Estados Unidos, China e Japão. Em 2013, o faturamento do setor farmacêutico

brasileiro foi de R$ 58 bilhões, um aumento de 140% em uma década.

De acordo com Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IBGE (2008), no

Brasil, devido a precariedade da estrutura sanitária de tratamento de esgotos,

estima-se que há uma grande quantidade de resíduo de fármacos não removidos

nos sistemas pluviais, sendo que dados revelam que apenas 52,2% dos municípios

brasileiros possuem serviço de coleta de esgoto e 33,5% dos domicílios são

atendidos por rede geral de esgotos (INSTITUTO..., 2008).

Bound e Voulvoulis (2005) realizaram uma pesquisa com 400 famílias no

Reino Unido para saber a disposição final dos medicamentos vencidos e não

utilizados. Eles descobriram que metade das pessoas entrevistadas não terminaram

seus medicamentos. Dentre essas pessoas, 63,2% descartaram em lixo doméstico

14

comum, 21,8% devolveram à farmácias, e 11,5% os descartaram em vasos

sanitários ou pias.

Na Alemanha, cerca de 16 mil toneladas de produtos farmacêuticos utilizados

para assistência médica humana foram eliminados a cada ano e 60 a 80% destes

medicamentos foram descartados em lixo comum ou em vasos sanitários e pias

(SCHEYTT; MERSMANN; HEBERER, 2006).

As mais modernas Estações de Tratamento de Esgoto (ETE) são

responsáveis pela eliminação do excesso de nutrientes e descontaminação

microbiológica, fatores que influenciam diretamente em um processo chamado

eutrofização, em corpos d’água. Entretanto, estudos da literatura mostram que

produtos farmacêuticos, de higiene pessoal (PFHP) e interferentes endócrinos (IE)

não são totalmente removidos ou biodegradados durante o tratamento do esgoto

(GHISELLI, 2008).

A presença e efeitos adversos dos compostos farmacêuticos no ambiente

aquático começaram a receber maior atenção da imprensa popular e científica nos

últimos anos. Este fator se deve a um elevado número de trabalhos publicados na

década de 90, na qual foram relatados diferentes níveis de produtos farmacêuticos

em ambientes aquáticos, incluindo águas subterrâneas, superficiais, residuárias,

efluente doméstico e até mesmo em água potável, principalmente nos países

Europeus (BOUND, VOULVOULIS, 2005).

A Tabela 1 mostra alguns dos compostos farmacêuticos que são encontrados

no meio hídrico.

15

Tabela 1 - Lista parcial de compostos farmacêuticos detectados no meio hídrico.

Classes dos Compostos Farmacêuticos

Compostos Farmacêuticos

Antibióticos Sulfametoxazol, sulfametazina

Analgésicos / Anti-inflamatórios

Diclofenaco, ibuprofeno, cetoprofeno, naproxeno, fenoprofeno, ácido

acetilsalicílico

Reguladores de Lipídios Bezafibrato, gemfibrozil, ácido clofíbrico, ácido fenofíbrico

Antiepiléticos Carbamazepina, primidona

Betabloqueadores Metoprolol, propranolol, timolol

Outros Diazepam, fluoxetina

Fonte: (CID, 2011).

Após o uso de medicamentos, os mesmos são excretados e entram em

sistemas aquáticos através de diversos caminhos. As águas residuais são a rota

principal destes fármacos para o meio ambiente (FENT, WESTON, CAMINADA,

2006). O grau em que o composto é alterado no organismo depende do seu

mecanismo de ação e estrutura (BOUND, VOULVOULIS, 2005).

Adicionalmente há também uma contribuição pelo descarte inadequado de

medicamentos provenientes de uso doméstico, uma vez que não há no Brasil

sistema de coleta e disposição final destes resíduos. A legislação específica para o

descarte de medicamentos engloba apenas os estabelecimentos de saúde. Assim,

no Brasil, esses medicamentos são descartados diretamente no lixo comum e no

esgoto doméstico.

Ainda pode existir a contaminação de solos e lençóis freáticos através da

lixiviação pelo descarte inadequado em aterros sanitários e lixões (CHAPMAN,

2006).

Os resíduos de fármacos no esgoto doméstico são provenientes da excreção

dos metabólitos e substâncias originais, uma vez que os fármacos não são

totalmente absorvidos pelo organismo e são liberados pela urina, fezes ou esterco

animal (BILA; DEZOTTI, 2003).

16

Figura 1 - Possíveis caminhos dos fármacos no meio ambiente.

Fonte: Autora.

A determinação da presença de resíduos farmacêuticos em águas

superficiais, subterrâneas e para abastecimento, tem sido alvo de diversos estudos,

entre eles alguns realizados no Brasil (GHISELLI, 2008). Dentre esses resíduos

farmacêuticos destaca-se o Diclofenaco sódico (nome IUPAC: Ácido 2-[2-(2,6-

diclorofenil)amino]benzoacético), um anti-inflamatório que apresenta elevado

consumo em todo mundo, sendo que apenas 35% do composto é absorvido pelo

organismo e o restante é excretado através da urina (BOUND, VOULVOULIS, 2005).

Este medicamento teve concentrações detectadas em diversas análises realizadas

em águas superficiais (CID, 2011; GHISELLI, 2008; BILA; DEZOTTI, 2003). Em

Berlim, ao menos ng.L-1 de Diclofenaco foram detectados em água potável de

torneira (HEBERER, 2002). Já no Brasil, foram encontradas na região de Campinas

concentrações na faixa de 1,8 g L-1 a 6,0 g L-1 do fármaco, em esgoto bruto,

esgoto tratado e em água bruta (GHISELLI, 2008).

O Diclofenaco é um medicamento anti-inflamatório frequentemente detectado

em estudos relacionados à presença de fármacos em estações de tratamento de

esgoto (ETE’s) (BORRELY et al., 2012).

17

Ainda sabe-se pouco sobre os efeitos ecotoxicológicos de fármacos em

organismos aquáticos e terrestres. Os organismos aquáticos são alvos

extremamente sensíveis, por estarem expostos a resíduos de águas residuais

durante a vida toda (FENT; WESTON; CAMINADA, 2006).

1.2 Ecotoxicologia

Segundo Truhaut (1978), a ecotoxicologia é a ciência que estuda o efeito

tóxico de substâncias químicas e agentes físicos sobre os seres vivos, em especial,

sobre populações ou comunidades naturais num determinado ecossistema, com a

finalidade de compreender os caminhos da transferência desses agentes e sua

interação sobre o ambiente. Neste sentido, estabelece um alerta para a identificação

de substâncias ou agentes que representem risco, sugerindo a aplicação de

medidas preventivas antes que ocorram grandes danos aos ecossistemas

(PAASIVIRTA, 1991). Assim, o objetivo principal da ecotoxicologia visa entender e

prever efeitos de substâncias químicas em seres vivos e comunidades naturais

(CHAPMAN, 2006).

Os indicadores fisiológicos e comportamentais são frequentemente utilizados

na avaliação dos impactos causados pelos agentes tóxicos nas populações. Uma

grande variedade de danos causados pelos agentes tóxicos pode ser observada nos

organismos, como, por exemplo, as alterações histológicas e morfológicas na

estrutura óssea, no fígado, nos rins e em outros órgãos. Muitas pesquisas têm por

base o estudo de lesões e necroses em tecidos. As brânquias dos peixes, por

exemplo, possuem tecidos sensíveis que indicam a presença de materiais irritantes.

Além disso, danos às brânquias causam impactos diretos à saúde do organismo. O

estudo de lesões e necroses em tecidos têm sido o fundamento de muitas pesquisas

(MELETTI; ROCHA; MARTINEZ, 2003).

Para avaliar os efeitos adversos de um agente tóxico nos organismos vivos

sob condições padronizadas, de maneira a permitir comparações com outras

substâncias e espécies testadas, são realizados os testes de toxicidade. Toxicidade

é uma propriedade relativa de uma substância química que se refere ao seu

potencial de causar danos aos organismos vivos e é uma função da concentração

da substância química e da duração da exposição (RAND; PETROCELLI, 1985).

18

Nos testes de toxicidade podem ser observados efeitos agudos e efeitos

crônicos, sendo os primeiros àqueles que ocorrem rapidamente como um resultado

da exposição ao agente tóxico por um curto período de tempo (para peixes, horas,

dias ou semanas) (MELETTI; ROCHA; MARTINEZ, 2003). De acordo com a

Companhia Ambiental do Estado de São Paulo (CETESB) (1990), o efeito agudo

trata-se de uma resposta severa e rápida dos organismos a um estímulo, que se

manifesta, em geral, num intervalo de 0 a 96 horas.

Segundo Wester e Vos (1994), os estudos dos organismos em laboratório são

indispensáveis para a identificação dos efeitos causados por baixas concentrações

de um dado agente tóxico em algum órgão ou tecido.

No Brasil, a Ecotoxicologia vem crescendo a cada ano, e hoje, os testes de

toxicidade aquática são desenvolvidos por inúmeras instituições de ensino e

pesquisa, e por órgãos de monitoramento ambiental do país. São realizados

experimentos com metais, efluentes industriais, amostras ambientais de água, entre

outras substâncias.

1.3 Diclofenaco sódico

O diclofenaco é derivado do ácido fenilacético e apresenta a fórmula

molecular C14H11Cl2NO2. É utilizado principalmente na forma de sal potássico ou

sódico e pode ser administrado por via oral, intramuscular, retal ou tópica (ZHANG,

GEIBEN, GAL, 2008). A estrutura química do Diclofenaco sódico é representada na

Figura 2.

Figura 2 - Fórmula estrutural do Diclofenaco sódico.

Fonte: Stoef (2012)

19

O Diclofenaco sódico alivia os sintomas da inflamação, tais como inchaço e

dor, bloqueando a síntese de moléculas (prostaglandinas) responsáveis pela

inflamação, dor e febre. Em condições inflamatórias pós-operatórias e pós-

traumáticas, o diclofenaco sódico alivia rapidamente tanto a dor espontânea quanto

a relacionada ao movimento e diminui o inchaço inflamatório e o edema do ferimento

(Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA) (2015).

O consumo mundial do Diclofenaco sódico como droga farmacêutica é em

torno de 1000 toneladas por ano (MEMMERT et al., 2013).

1.4 Brycon opalinus - Pirapitinga-do-Sul: espécie endêmica do Rio Paraíba do

Sul

Os peixes de água doce do gênero Brycon, pertencentes à família

Characidae, apresentam normalmente a cor cinza-prata, com tamanho de médio a

grande porte, e são importantes para a pesca comercial e de subsistência. A espécie

Brycon opalinus, Pirapitinga do Sul, está na categoria vulnerável (IUCN – The World

Conservation Union). O governo federal brasileiro declarou a espécie ameaçada de

extinção, de acordo com o DOU (Diário Oficial da União) de 21 de Maio de 2004,

proibindo a pesca e qualquer forma de remoção, com exceção do uso para

investigações científicas (GOMIERO; BRAGA, 2007).

A Pirapitinga do Sul é uma espécie endêmica dos rios de cabeceiras da bacia

do Paraíba do Sul (HILSDORF; PETRERE JUNIOR, 2002). Esta bacia está

localizada no extremo norte da área de floresta ombrófila densa no sudeste do

Brasil, e, em geral, a região tem uma alta porcentagem de espécies de peixes

endêmicas (GOMIERO; BRAGA, 2007). A espécie Brycon opalinus é apresentada

na Erro! Autoreferência de indicador não válida..

Figura 3 - Espécie Brycon opalinus – Pirapitinga do Sul.

Fonte: Urenha Júnior(2011)

20

Um dos fatos mais importantes pelo qual se utiliza os peixes em programas

de monitoramento é que os mesmos possuem sistemas orgânicos mais similares

histológica e fisiologicamente dos sistemas humanos (e de outros vertebrados),

permitindo assim extrapolações mais confiáveis. (MELETTI; ROCHA; MARTINEZ,

2003).

De acordo com Rand e Petrocelli (1985), a disponibilidade, abundância,

facilidade de cultivo em laboratório e conhecimento sobre a biologia da espécie são

os principais critérios considerados para a seleção dos organismos-teste.

Assim, a espécie escolhida como organismo-teste foi o peixe Brycon opalinus

(

Figura 4), conhecida popularmente como Pirapitinga do Sul, quem além de ser

uma espécie de pequeno porte e endêmica dos rios de cabeceiras da bacia Paraíba

do Sul como citado anteriormente, possui reprodução contínua ao longo do ano e é

de fácil adaptação às condições experimentais.

Figura 4 - Pirapitinga do Sul.

Fonte: Autora.

1.5 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR)

A Espectroscopia no Infravermelho é uma das mais importantes técnicas

analíticas utilizadas atualmente (STUART, 2004).

A técnica pode ser aplicada em estudos envolvendo diversas áreas, como a

agricultura, medicina, meio ambiente, indústria têxtil e de petróleo, indústria

farmacêutica, cosméticos, entre outros (PASQUINI, 2003). Existem vantagens da

Espectroscopia no Infravermelho sobre os métodos químicos analíticos tradicionais,

por ser um método físico, não destrutivo, que requer o mínimo de quantidade de

21

amostra, e obtém resultados rápidos com precisão elevada (BÜNING-PFAUE, 2003).

A técnica é aplicada em diversas áreas, como estudo de polímeros, identificação de

compostos orgânicos ou inorgânicos, mecanismo de catálise, transporte de

moléculas bioativas em tecidos vivos, dentre outras aplicabilidades (BARBOSA,

2011).

Além da Espectroscopia ser uma técnica rápida e fácil de usar, possui alta

sensibilidade em detectar mudanças, mesmo se forem pequenas, nos grupos

funcionais pertencentes aos componentes de tecidos, sem a necessidade da

utilização de sondas ou corantes (SEVERCAN et al., 2011).

A crescente preocupação mundial por questões ambientais, consideradas

relevantes, serviu de incentivo para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de

análises através da Espectroscopia no Infravermelho (COSTA FILHO; POPPI, 2002).

O princípio da Espectroscopia no Infravermelho se baseia em vibrações de

átomos de uma molécula através da radiação infravermelha, podendo assim

caracterizá-las por meio da análise dos espectros (STUART, 2004). Um espectro no

Infravermelho é normalmente obtido quando a radiação infravermelha passa através

de uma amostra, determinando qual fração da radiação incidente é absorvida como

energia particular. O pico de absorção que aparece no espectro corresponde á

frequência de vibração de uma determinada parte da molécula em análise

(STUART, 2004).

Certos grupos de átomos dão origem a bandas que ocorrem mais ou menos

na mesma região, independentemente da estrutura da molécula. Essas bandas

chamadas de bandas características permitem a obtenção de informações para a

identificação de estruturas químicas das moléculas. Até as moléculas mais simples

podem produzir espectros complexos (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2005).

O espectro infravermelho é dividido em infravermelho próximo (NIR), médio

(MID) e distante (FAR) (PASQUINI, 2003). Estas regiões estão situadas dentro do

espectro eletromagnético entre as regiões do visível e das micro-ondas. A região

espectral que corresponde ao infravermelho compreende a radiação com números

de onda no intervalo de 13.000 cm-1 a 100 cm-1 (STUART, 2004). A Tabela 2

apresenta os limites aproximados para cada região:

22

Tabela 2 - Limites aproximados para as regiões no Infravermelho.

Região do Infravermelho Número de onda (cm-1)

Próximo (NIR) 13.000 a 4.000

Médio (MID) 4.000 a 400

Distante (DIR) 400 a 100

Fonte: Stuart (2004).

A radiação infravermelha causa alterações nos modos vibracionais e

rotacionais das moléculas, enquanto as radiações do ultravioleta e visível causam

transições eletrônicas ao incidirem sobre uma molécula (BARBOSA, 2011). No

espectro eletromagnético, a faixa de 10 000 cm-1 a 100 cm-1 corresponde a

conversão da radiação infravermelha em energia de vibração molecular, quando

aquela é absorvida por uma molécula. As frequências de luz infravermelha que são

absorvidas são aquelas que têm as mesmas frequências dos modos vibracionais. O

espectro vibracional aparece como uma série de picos ou bandas as quais refletem

o nível de energia vibracional da molécula (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE,

2005). A região do espectro eletromagnético considerada a mais importante do

ponto de vista da caracterização de compostos orgânicos é a região entre 4000 cm -1

a 400 cm-1 (BARBOSA, 2011).

Os picos podem ser visualizados através do eixo vertical e a posição das

bandas, no eixo horizontal. Esta posição é descrita em número de ondas, e tem a

unidade em centímetro inverso (cm-1). A intensidade das bandas pode ser

apresentada como transmitância (T), como mostra a

Figura 5, ou absorbância (A) conforme Figura 6. A transmitância é a razão

entre a intensidade da radiação transmitida (I) por uma amostra e a intensidade da

radiação incidente (Io) e a absorbância é o logaritmo decimal do inverso da

transmitância (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2005).

23

Figura 5 - Espectro de transmitância do ácido lático


Figura 6 - Espectro de absorbância de ácido lático.


O espectro vibracional reproduz o espectro característico de diferentes tipos

de moléculas, onde todas as substâncias possuem seu próprio espectro

característico. Sendo assim, duas moléculas nunca terão espectros idênticos,

podendo o espectro infravermelho ser considerado uma impressão digital de

compostos químicos (SIMÕES, 2008).

24

Um composto pode ser analisado qualitativa e quantitativamente através da

técnica de Espectroscopia no Infravermelho. Na análise quantitativa, permite-se que

o composto seja estudado através da intensidade das bandas de absorção, na qual

está diretamente relacionada a sua concentração. Quanto maior for a intensidade da

banda, significa que a concentração do composto em estudo é maior, e vice versa

(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2005). Quanto à análise qualitativa, através da

técnica, é possível identificar um composto ou investigar a composição de uma

amostra (SIMÕES, 2008).

Há dois métodos importantes que podem ser utilizados para a obtenção dos

espectros: Espectroscopia de Transmissão e de Reflexão.

Na espectroscopia ATR, a radiação que passa través do cristal reflete na sua

superfície interna totalmente. Quando o material é colocado em contato com um

cristal, e absorve radiação, o feixe irá penetrar numa camada fina da superfície da

amostra e energia será perdida naqueles comprimentos de onda, onde o material

absorve. A intensidade é atenuada, ou seja, ocorre a refletância total atenuada.

Sendo assim, um espectro de superfície será obtido. Vale ressaltar que o contato

entre a amostra e o cristal é essencial (MATTOS et al., 2004).

A técnica FT-IR de Reflexão (UATR) é considerada de última geração e gera

espectros de boa qualidade para a maior parte das substâncias, devido seu alto

índice de refração do elemento ATR (SANCHES et al., 2008).

Já na Espectroscopia de transmissão, amostras líquidas e gasosas podem

ser analisadas. Essa técnica é baseada na absorção da radiação infravermelha em

determinados comprimentos de onda, à medida em que a radiação atravessa a

amostra. É possível também analisar amostras sólidas, através da técnica de

pastilha (disco prensado), onde se tem a mistura de KBr (brometo de potássio) à

amostra, que após a moagem é prensado à vácuo, resultando em discos

transparentes (pastilhas) (STUART, 2004).

Nas biomoléculas, a maior absorção espectral situa-se nas bandas referentes

às ligações N-H, C=O, C-O, C-H e P=O, que são encontrados em lipídios, proteínas,

açúcares e ácidos nucleicos. Assim, arranjos biológicos tais como proteínas, lipídios,

biomembranas, carboidratos, e tecidos têm sido caracterizados com sucesso através

da Espectroscopia no Infravermelho (STUART, 1997).

Atualmente o valor, a funcionalidade e os benefícios apresentados pela

Espectroscopia no Infravermelho são incontestáveis (VALDERRAMA, POPPI, 2005).

25

1.5.1 Vibrações moleculares

A radiação infravermelha causa alterações nos modos vibracionais e

rotacionais de uma molécula (BARBOSA, 2011). Essas vibrações correspondem à

energia de fótons infravermelhos, que são absorvidos pelas moléculas, originando

assim os espectros de absorção no Infravermelho (SILVA, 2011). Na região do

infravermelho, podem ser observadas bandas espectrais de absorção, que fornecem

informações a respeito de vibrações moleculares, tornando possível a investigação

da geometria e das forças de interação entre os átomos constituintes das moléculas,

através da espectroscopia molecular.

Uma molécula com N átomos possui 3N graus de liberdade: (i) movimentos

de translação da molécula como um todo; (ii) movimento de rotação em torno de um

referencial com origem no centro de massa da molécula; e (iii) vibrações dos átomos

que constituem a molécula (SALA, 1996).

Considerando 3N graus de liberdade de uma molécula, três correspondem à

translação da molécula como um todo e três correspondem a rotações, restando

assim (3N-6) graus de liberdade, correspondentes a vibrações dos átomos nas

moléculas. Não se consideram rotações em torno do eixo que contém todos os

átomos das moléculas, no caso de moléculas lineares, pois os núcleos dos átomos

são considerados puntiformes. Sendo assim, há apenas dois graus de liberdade que

correspondem a rotações, fazendo com que as moléculas lineares tenham o número

de graus de liberdade correspondente a vibrações (3N-5) (SAKANE et al., 2011).

Em um modo normal de vibração, todos os átomos vibram em sincronia,

atingindo ao mesmo tempo o afastamento máximo à sua posição de equilíbrio,

passando também ao mesmo tempo por sua respectiva posição de equilíbrio. Uma

vibração normal da molécula corresponde a uma frequência, denominada frequência

fundamental ou normal. Estes modos normais vibracionais das moléculas

apresentam propriedades de simetria que vão depender da simetria da própria

molécula (SAKANE et al., 2011).

26

Figura 7 - Modos normais de vibração das moléculas da água: (ѵa) estiramento assimétrico; (ѵs) estiramento simétrico; (δ) deformação angular.

Fonte: Barbosa (2011).

A Figura 7 representa os modos normais de vibração da molécula de água

(H2O), sendo dois modos correspondentes aos estiramentos das ligações OH

(estiramento simétrico e assimétrico) e um modo corresponde à variação do ângulo

HOH (deformação angular). As frequências normais de vibração que correspondem

a estiramentos são indicadas pela letra grega ѵ, com um índice s se for simétrico e a

se for assimétrico. No caso da deformação angular, a letra grega correspondente é

δ (BARBOSA, 2011).

O cálculo das frequências pode ser realizado pelas massas dos átomos,

geometria da molécula e pelas constantes de força de interação entre os átomos. No

caso da molécula de água (H2O), que é considerada uma molécula simples, o

cálculo das frequências para todos os modos normais de vibração é relativamente

simples, mas no caso se moléculas mais complexas estes cálculos podem ser bem

mais trabalhosos, tornando-se necessário o uso de considerações empíricas.

Observa-se que certos grupos de átomos que podem fazer parte de diferentes

moléculas apresentam bandas espectrais em uma região característica do espectro.

As frequências que correspondem a essas bandas caracterizam o grupo de átomos,

fazendo-se necessário uma boa interpretação dos espectros para identificação

destas bandas (SAKANE et al., 2011). Como exemplo, pode-se usar uma molécula

plana do tipo X2C=CH2, onde “X” é considerado um átomo diferente do hidrogênio. O

grupo CH2, que está presente em várias moléculas, apresenta uma vibração em que

27

os átomos de hidrogênio se movem, em fase, fora do plano do grupo. Isso acontece

pela variação do ângulo entre o plano CH2 e a ligação C=C, sendo que o restante da

molécula praticamente não se move. Este modo de vibração é chamado de

“wagging” (ρw) (de to wag, abanar), como mostra a figura 9 (BARBOSA, 2011).

Há outros tipos de modos de vibração semelhantes aos da molécula da água,

como por exemplo, o grupo =CH2 apresenta modo de vibração que envolve a

deformação do ângulo HCH, denominado “scissoring”, onde é indicado por δscis,

sendo que o índice “scis” corresponde a palavra “scissors” (tesoura, em inglês).

Além disso, ainda há outros tipos de modos de vibração, pois o grupo CH2 está

ligado a outros átomos para a formação de moléculas, como a “twisting” (ρtw) e

“rocking” (δr). Estes modos de vibração são indicados também na Figura 8

(TWARDOWISKI; ANZENBACHHER, 1994).

Figura 8 - Modos vibracionais do grupo CH2, representados por (a) “wagging”; (b) “scissoring”; (c) “rocking” e (d) “twisting”.

Fonte: Twardowiski e Anzenbachher (1994).

Para um melhor entender como interpretar um espectro de uma molécula

mais complexa que a da água, por exemplo, podemos estudar o clorofórmio (CHCl3),

ou triclorometano (Erro! Fonte de referência não encontrada.):

28

Figura 9 - Fórmula estrutural da molécula de Clorofórmio

Fonte: Lopes (2012).

Figura 10 - Espectro infravermelho da molécula de Clorofórmio.

Fonte: Santos (2014).

AErro! Fonte de referência não encontrada. representa o espectro

infravermelho da molécula de clorofórmio, onde é identificado nas regiões

analisadas o estiramento das ligações C-H e C-Cl e deformações C-H e C-Cl3

(BARBOSA, 2011). As atribuições dos picos identificados na análise espectral

constam na Tabela 3:

Tabela 3 - Número de onda e atribuições aproximadas do espectro de clorofórmio.

Numeração das bandas Número de onda (cm-1) Atribuição aproximada

1 3019 ѵ (C-H)

2 1215 δ (C-H)

29

3 770 Δ (C-H) / δ (C-Cl3)

4 669 ѵ (C-H) / δ (C-Cl3)

Fonte: Colthup; Daly; Wiberly (1990).

Pôde-se verificar a partir da análise do espectro do clorofórmio que com o

aumento do número de átomos há um aumento da dificuldade na interpretação dos

espectros infravermelhos (BARBOSA, 2011).

1.5.2 Instrumentação

A partir dos anos 70, iniciaram-se novos estudos na área da Espectroscopia,

também no campo de análises quantitativas, através do desenvolvimento dos

espectrofotômetros com Transformada de Fourier, da informática, do

interfaceamento de instrumentos eletrônicos com computadores e o uso de recursos

matemáticos mais sofisticados (VALDERRAMA, POPPI, 2005).

O instrumento utilizado para a obtenção de um espectro no infravermelho é

chamado de espectrofotômetro no infravermelho. O espectrofotômetro de dispersão

é um modelo de equipamento mais antigo, e é composto por três partes: i) uma fonte

de radiação infravermelha contínua, ii) um monocromador para dispersar a radiação

e iii) um detector sensível á radiação infravermelha (BARBOSA, 2011). Este

equipamento foi utilizado por muito tempo e, após apresentar algumas limitações, foi

gradativamente sendo substituído pelo espectrofotômetro no infravermelho com

Transformada de Fourier ou, simplesmente, FT-IR (sigla inglesa, comumente

utilizada em português) (SILVERSTEIN, WEBSTER, KIEMLE, 2005).

O desenvolvimento da espectroscopia de infravermelho (NIR e MIR) como

técnica de análise quantitativa está associado à combinação da Transformada de

Fourier com a nova geometria dos espectrofotômetros, denominado interferômetro

de Michelson. (SIMÕES, 2008). O interferômetro de Michelson foi aperfeiçoado pelo

físico alemão naturalizado americano Albert Michelson, em 1887, com o propósito de

se estudar a luz e a relatividade (BARBOSA, 2011).

O seu modo de funcionamento consiste no método interferométrico, que

utiliza o interferômetro de Michelson, como mostra a Figura 11:

30

Figura 11 - Esquema ilustrativo para o interferômetro de Michelson e do espectro resultante da aplicação da transformada de Fourier.

Fonte: Helfer et al., 2006.

O esquema acima apresenta dois espelhos planos (um fixo e um móvel),

perpendiculares, e um divisor de feixe (beam-splitter) que transmite 50% da radiação

incidente da fonte para o espelho móvel e 50% para o espelho fixo. Os dois raios

são refletidos por esses espelhos, retornando ao separador de feixes, onde se

recombinam e sofrem interferências construtivas e destrutivas. Para a radiação

infravermelha (policromática) um sinal complexo denominado interferograma é

gerado após a soma de todas as interações construtivas e destrutivas. Quando

aplicado a transformada de Fourier, o detector recebe o interferograma, convertendo

os dados obtidos no interferômetro em um espectro que relaciona a intensidade com

a frequência (nº de onda), que é a forma mais utilizada em análises atualmente

(HELFER et al., 2006; BARBOSA, 2011).

Assim que uma radiação monocromática de comprimento de onda λ passa

pelo instrumento, gera-se um retardo no caminho óptico. O sinal que chega ao

detector (interferograma) varia de intensidade quando este retardo aumenta,

31

podendo passar por uma série de valores máximos e mínimos. Se os retardos forem

números inteiros múltiplos do comprimento de onda λ (δ = nλ; n = 0, ±1, ±2, etc.) os

valores observados serão máximos. Isso significa que os raios provenientes dos

espelhos E1 e E2 estarão em fase quando chegarem ao espelho separador S,

fazendo com que o sinal tenha um valor máximo ao atingir o detector, pois a

amplitude da radiação aumenta em duas vezes o valor inicial.

Quando δ = (n + ½) λ, para n = 0, ± 1, ± 2 etc. a intensidade do sinal cai a 0. A

intensidade deste sinal de interferência I(δ) varia de acordo com a equação

apresentada abaixo à medida que E2 se move continuamente.

I(δ) = 0,5I(ῡ)cos2π ῡ δ (Equação 1)

Onde: I(ῡ) = intensidade da fonte de radiação com nº de onda ῡ = 1/λ;

Fator 0,5 = 50% da radiação inicial alcança o detector.

O interferograma é representado por I(δ) versus δ, conforme mostra a Figura

12:

Figura 12 - (A) Interferograma de uma radiação monocromática; (B) de uma radiação policromática; (C) de uma radiação policromática, com uma amostra entre o interferômetro e

o detector.


Para a obtenção de um espetro no infravermelho através do método

interferométrico, é preciso fazer um background para a obtenção do interferograma

sem a amostra. Logo após, a amostra é colocada entre o interferômetro e o detector,

32

absorvendo preferencialmente alguns comprimentos de onda, onde os mesmos são

reduzidos. Em seguida, utiliza-se um método matemático denominado

transformação de Fourier, que tem por objetivo transformar os interferogramas em

espetros no domínio da frequência. Subtraindo os dois espectros, gera-se o espectro

de absorção da amostra (BARBOSA, 2011).

Com a Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FT-

IR), os espectros obtiveram uma melhora significante em sua qualidade, e o tempo

para obtenção dos dados foi reduzido, facilitando assim as análises realizadas

através da Espectroscopia (STUART, 2004).

33

2 OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral

Identificar as alterações das biomoléculas como lipídios, proteínas, DNA,

glicogênio e triglicerídeos, constituintes das amostras de fígado, brânquias e

músculo, através da análise por espectroscopia no infravermelho com Transformada

de Fourier (FT-IR), utilizando como contaminante o fármaco Diclofenaco sódico.

2.2 Objetivos Específicos

(a) Obter e analisar os espectros obtidos de amostras de brânquias, músculo

e fígado do peixe Pirapitinga-do-sul;

(b) Identificar a banda marcadora do Diclofenaco no FT-IR;

(c) Avaliar, qualita e qualitativamente, por FT-IR, amostras dos órgãos que

foram expostos ao medicamento em questão, após 24 horas de experimento.

34

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Este estudo foi realizado após aprovação do projeto de pesquisa pelo Comité

de Ética em Pesquisa com Animais do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

(IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) (A11/CEUA/2014 – Anexo A)

3.1 Obtenção dos animais

De acordo com Rand e Petrocelli (1985), os critérios a serem considerados

para a seleção dos organismos-teste em análises ecotoxicológicas são: a

disponibilidade, abundância, facilidade de cultivo em laboratório sendo ainda

recomendada a utilização de espécies autóctones, mais representativas do

ecossistema em análise.

No presente trabalho, a espécie escolhida como objeto de estudo foi o peixe

Brycon opalinus em estágio juvenil, cujos animais foram gentilmente cedidos pela

Estação de Piscicultura da Companhia Energética de São Paulo – CESP da Usina

Hidrelétrica de Paraibuna, de onde foram retirados e transportados para o

Laboratório de Ciências Ambientais, no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

(IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP).

3.2 Preparo das soluções de Diclofenaco de sódio

Uma análise preliminar por espectroscopia no infravermelho por transformada

de Fourier (FTIR) (OLIVEIRA; BANHARA; RABELO, 2013) foi realizada procurando

verificar o efeito toxicológico do fármaco Diclofenaco sódico sobre a sobrevivência

da fauna ictiológica, utilizando a espécie Danio rerio, como objeto de estudo por ser

esta uma espécie internacionalmente padronizada e recomendada pelos protocolos

ABNT NBR 15499 (ASSOCIAÇÃO...,2007) e CETESB (COMPANHIA...,1990). Os

testes de ecotoxicidade realizados mostraram alterações nas bandas infravermelhas

de biomoléculas como glicose, proteína e lipídio, nas diferentes concentrações

(0,0022; 0,0044; 0,0088; 0,01791 e 0,02743 µg mL-1) de Diclofenaco sódico. Assim,

as concentrações de diclofenaco utilizadas no presente trabalho foram estabelecidas

35

a partir da experimentação inicial (OLIVEIRA; BANHARA; RABELO, 2013), sendo

consideradas a avaliação das respostas verificadas para as concentrações mínima,

intermediária e máxima deste trabalho. As concentrações utilizadas são

apresentadas na Tabela 4.

Tabela 4 - Concentrações de Diclofenaco sódico utilizadas nos ensaios ecotoxicológicos para a espécie Brycon opalinus.

Solução Concentração (µg mL-1)

Controle

Concentração 01

0,0000

0,0022

Concentração 02 0,0088

Concentração 03 0,02743

Fonte: Oliveira, Banhara E Rabelo, 2013; Ghiselli, 2008.

Para o preparo das soluções utilizou-se um total de 20 comprimidos

revestidos de Diclofenaco sódico de 50mg cada um. Os comprimidos foram

macerados em um almofariz de Ágar até ficarem com uma aparência homogênea.

Em seguida, foram pesadas as quantidades necessárias do fármaco, em gramas,

para cada uma das três concentrações apresentadas na Tabela 4, em balança

analítica digital AL 500 Marte, para um volume total de 20L de água por aquário.

3.3 Teste de Ecotoxicidade

Os testes ecotoxicológicos resultam em dois tipos de efeito: agudo e crônico,

sendo o primeiro aquele que ocorre rapidamente como resposta a exposição do

organismo ao agente tóxico num curto espaço de tempo ou seja, trata-se de uma

resposta severa e rápida dos organismos a um estímulo, que se manifesta, em

geral, num intervalo de 0 a 96 horas (COMPANHIA..., 1990). Neste sentido, o

parâmetro sobrevivência/mortalidade no presente trabalho foi realizado a partir da

observação direta do comportamento dos indivíduos estudados.

36

3.4 Desenho experimental

Foram utilizados setenta e dois peixes da espécie Brycon opalinus juvenis,

machos e fêmeas, com peso médio de 8g e tamanho de 8,5cm, mantidos no

laboratório de Ciências Ambientais do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

(IP&D) /UNIVAP, de acordo com os princípios éticos descritos na ABNT NBR

15499/2007 e CETESB / L5.019 – II. Os animais permaneceram em aquários

submetidos à temperatura média de 27ºC e alimentados com ração comercial

granulada 38% de proteína. Foram divididos igualmente em quatro grupos de

aquários, em triplicata, totalizando doze aquários com capacidade de 20L, providos

de aeradores para oxigenação da água, onde foram submetidos à aclimatação no

período de uma semana. A alimentação foi interrompida 24 horas antes do início dos

experimentos.

Foi realizada também a renovação de 50% da água de todos os aquários

diariamente. A renovação da água deve ser realizada para manter a faixa de pH,

baixo teor de amônia e a eliminação dos detritos depositados no fundo dos

recipientes. Segundo a norma ABNT NBR 15499/2007 (ASSOCIAÇÃO..., 2007) o

procedimento não influencia nas propriedades físico-químicas da água.

O teste de sensibilidade com substância de referência, recomendado pela

norma da CETESB / L5.019 – II (COMPANHIA..., 1990), foi realizado anteriormente

com o organismo Danio rerio, no Trabalho de Conclusão de Curso, em 2013.

O material resultante do experimento serviu de base para a realização da

dissertação de mestrado – Adaptação bioquímica de Brycon opalinus (Pisces –

Characiformes) exposto ao fármaco Diclofenaco sódico, tendo portanto o teste de

toxicidade uma duração de 96h. No presente trabalho foram avaliadas as amostras

obtidas 24h após o experimento, sendo monitorada a temperatura através de um

termômetro de mercúrio. A Tabela 5 mostra a divisão dos aquários em estudo e a

Figura 13 mostra o experimento montado.

37

Tabela 5 - Grupos e aquários correspondentes.

Grupos Aquários

Controle 01, 02 e 03

Concentração 01 04, 05 e 06



Fonte: Autora.

Figura 13 - Experimento montado.

Fonte: Autora.

3.5 Obtenção do material biológico

A retirada do material biológico dos peixes em estudo foi realizada durante o

teste de Ecotoxicidade no Laboratório de Ciências Ambientais. Após 24 horas, um

indivíduo por aquário foi eutanasiado para a retirada dos órgãos a serem estudados

que, para o presente trabalho foi escolhido o fígado (responsável pela destoxificação

de drogas e o principal órgão de metabolismo), as brânquias (devido ao contínuo

contato com a água) e o músculo (armazena moléculas ricas em energia, como

38

glicogênio). Todo procedimento foi realizado mediante aprovação do Comitê de Ética

em Pesquisa com Animais IP&D UNIVAP (A11/CEUA/2014 – Anexo A).

3.6 Preparo das amostras para análise

Os materiais biológicos foram acomodados em lâminas de vidro e

posteriormente congelados a -6º C. Em seguida as amostras foram submetidas à

liofilização no Concentrator Plus com a função: dessicator /D–AQ (dessicator-

aqueaus), por 20 horas. O procedimento experimental está ilustrado na sequência

conforme a Figura 14.

Figura 14 – Ilustração do procedimento experimental.

Fonte: Autora.

3.7 Obtenção dos Espectros de Absorção no Infravermelho

39

Neste trabalho, foi utilizado a técnica espectroscópica FT-IR de Reflexão

(UATR) para a obtenção dos espectros.

As amostras dos órgãos foram colocadas em contato com a superfície do

cristal de seleneto de zinco (ZnSe) com diamante, aplicando um torque

correspondente a 100 N com o braço articulado. Com um bom contato entre a

amostra e o cristal, através da dureza e estabilidade química do diamante, é

possível a obtenção direta de espectros de materiais de ótima qualidade (SANCHES

et al., 2008)

Com a técnica espectroscópica FT-IR de Reflexão (UATR), foram obtidos 36

espectros infravermelhos na faixa 4000 a 500 cm-1, com resolução de 4 cm-1 a 20 °C

e o espectrofotômetro utilizado foi o de modelo Spectrum Spotlight 400 FT-IR da

PERKIN ELMER (Figura 15). Para uma melhor análise, foram obtidos espectros

médios de cada grupo de amostras dos três órgãos em estudo, para as

concentrações 1, 2, 3 e grupo controle.

Figura 15 - Espectrofotômetro Spectrum Spotlight 400 FT-IR da Perkin Elmer.

Fonte: Autora.

3.7.1 Pré-processamento de dados

40

Todos os espectros obtidos foram pré-processados com software Spectrum

5.3 (PerkinElmer) e realizadas as correções de linha de base, suavização espectral

utilizando o algoritmo Savistzky Golay (9 pontos) e absorbância.

3.7.2 Análise dos dados

Os espectros foram analisados através de dois métodos, sendo o primeiro a

inspeção visual direta (análise qualitativa) e o segundo, o cálculo da área das

bandas em estudo (análise quantitativa).

Foram obtidos histogramas para melhor visualização dos resultados. O

software utilizado para a construção dos histogramas foi o Origin 7.5.

41

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nesta seção são apresentados os resultados e discussão dos estudos das

amostras dos tecidos de fígado, músculo e brânquias, após 24 horas de experimento

através da Espectroscopia no Infravermelho.

4.1 Obtenção dos espectros infravermelhos dos tecidos de fígado

Primeiramente foram obtidos três espectros para cada concentração de

exposição e controle. Para uma melhor análise, foram obtidos os espectros médios

destas concentrações e do controle, conforme é mostrado na Figura 16. A

numeração das bandas atribuídas na Tabela 6 é mostrada na Figura 16.

Figura 16 - Espectros infravermelhos médios do tecido hepático referente ao grupo controle e concentrações 1, 2 e 3.

42

Fonte: Autora. Tabela 6 - Número de onda e descrição aproximada do espectro de fígado controle.

Item

Nº de

onda

(cm -1)

Atribuições Aproximadas (Cakmak; Togan; Severcan, 2005;

Barbosa, 2011)

1 3280 Estiramento da ligação N-H (amida A de proteínas)

2 3014 Estiramento da ligação =C-H (lipídios, colesterol)

3 2955 Estiramento Assimétrico do grupo -CH3 (principalmente

lipídios)

4 2920 Estiramento Assimétrico do grupo -CH2 (principalmente

lipídios)

5 2871 Estiramento Simétrico do grupo -CH3 (principalmente

proteínas)

6 2851 Estiramento Simétrico do grupo -CH2 (principalmente lipídios)

7 1737 Estiramento de C=O do grupo éster (triglicerídios, colesterol)

8 1728

9 1639 Amida I – Estiramento da ligação C=O (80%)

10 1541 Amida II – Deformação angular de N-H (60%) com

estiramento da ligação C-N (40%)

11 1454 Deformação angular do grupo -CH2 (principalmente lipídios)

12 1392 Estiramento simétrico de COO- (ácidos graxos e aminoácidos)

13 1220 Estiramento assimétrico de PO2- (principalmente ácidos

nucleicos)

14 1178 Estiramento assimétrico de CO-O-C (glicogênio e ácidos

nucleicos)

15 1151 Estiramento assimétrico de CO-O-C (glicogênio e ácidos

nucleicos)

16 1078 Estiramento simétrico de PO2- (ácidos nucleicos e

fosfolipídios); estiramento de ligação C-O (glicogênio)

17 1026

18 930

19 852 Vibrações em tipo N-Açúcares em ácidos nucleicos

Fonte: Autora.

43

Para interpretar um espectro, não há regras rígidas a serem utilizadas, porém

deve-se levar em consideração alguns requisitos: (SILVERSTEIN; WEBSTER;

KIEMLE, 2005).

- O espectro deve ter resolução adequada e intensidade razoável;

- O composto utilizado deve ser razoavelmente puro;

- O espectrofotômetro deve ser calibrado contra padrões, de forma que as

bandas sejam observadas nas frequências ou comprimentos de onda corretos;

- O método de manipulação da amostra deve ser especificado.

A Espectroscopia no Infravermelho monitora os modos de vibração de grupos

funcionais no interior de biomoléculas. Mudanças na posição do pico, alterações na

largura das bandas, intensidades, e valores das áreas das bandas no infravermelho

são usadas para obter valiosas informações estruturais e funcionais sobre o sistema

em estudo (CAKMAK; TOGAN; SEVERCAN, 2005).

A Tabela 6 relaciona as atribuições para os principais grupamentos orgânicos

encontrados nas moléculas orgânicas com o número de onda correspondente a sua

localização no espectro do infravermelho.

Após a análise das atribuições aproximadas do espectro do tecido hepático,

foram escolhidas as principais bandas de absorção e definidas as regiões dos

intervalos de área destas bandas. Foi realizado o cálculo das áreas destas bandas

para todas as concentrações do princípio ativo Diclofenaco sódico (concentrações 1,

2 e 3) e controle, através do software Spectrum 5.2. Os resultados dos cálculos são

apresentados na Tabela 7.

A intensidade e/ou, mais precisamente a área das bandas de absorção está

diretamente relacionado com a concentração das moléculas, permitindo assim uma

análise quantitativa (CAKMAK; TOGAN; SEVERCAN, 2005).

44

Tabela 7 - Intensidade integrada das bandas das diferentes regiões do espectro do fígado.

Numeração Nº de onda (cm-¹) Regiões Área

Controle

Área

Concentração 1

Área

Concentração 2

Área

Concentração 3

1 3280 3691-3021 334,7365 355,6477 325,1114 324,0253

2 3014 3021-2988 14,0555 15,7531 13,8980 14,5991

3 2955-2920 2988-2878 69,0240 77,0866 69,6064 74,4579

4 2871-2851 2878-2821 28,7563 33,0207 29,2402 31,6913

5 1737-1728 1767-1715 6,9101 7,7271 7,3475 8,1332

6 1639 1715-1582 111,8349 115,7994 112,7181 115,5249

7 1541 1582-1477 81,1440 82,9103 81,4691 85,8488

8 1454 1477-1425 25,5416 27,4847 26,0088 27,9633

9 1392 1425-1356 34,1615 37,2292 34,6455 37,0892

10 1220 1273-1185 37,8629 37,6033 37,4346 41,2385

11 1178 1185-1169 6,2559 5,9878 5,6103 6,4644

12 1151 1169-1131 17,8894 18,5388 17,2708 17,2224

13 1078 1131-1062 44,6049 48,3886 45,3005 45,5958

14 1026 1062-943 86,0528 96,5911 84,0371 79,4069

15 930 943-889 4,3030 4,7108 4,0365 3,8979

16 852 877-827 1,0351 1,2731 0,9543 0,6401

45


fígado através de análise quantitativa entre as diferentes concentrações de

Diclofenaco sódico e controle

Os histogramas da Figura 17 ilustram as alterações dos modos vibracionais

das biomoléculas em cada região, causadas pela interferência do princípio ativo

Diclofenaco sódico no tecido hepático, nas diferentes concentrações de diclofenaco

sódico em estudo (0,0000; 0,0022; 0,0088; e 0,02743 µg mL-1).

Figura 17 – Histogramas e suas respectivas regiões: (A) Região 3691-3021 cm-1; (B) Região 3021-2988 cm-1; (C) Região 2988-2878 cm-1; (D) Região 2878-2821 cm-1; (E) Região 1767-1715 cm-1; (F) Região 1715-1582 cm-1; (G) Região 1582-1477 cm-1; (H) Região 1477-1425

cm-1; (I) Região 1425-1356 cm-1; (J) Região 1273-1185 cm-1; (K) Região 1185-1169 cm-1; (L) Região 1169-1131 cm-1; (M) Região 1131-1062 cm-1; (N) Região 1062-943 cm-1; (O) Região

943-889 cm-1; (P) Região 877-827 cm-1.

46

Fonte: Autora.

Os histogramas B, C, D, H e I representam lipídios e correspondem as

vibrações das ligações C-H e do grupo COO-. Pode-se observar um padrão de

alteração semelhante entre as intensidades, quando comparados ao grupo controle.

Primeiramente observou-se um aumento de intensidade correspondente a

concentração C1 e logo uma diminuição da intensidade correspondente ao grupo da

concentração C2 e C3.

Comparando os histogramas A, F e G, que representam proteínas e

correspondem ao estiramento da ligação N-H (Amida A), estiramento da ligação

C=O (Amida I), e deformação angular de N-H e estiramento da ligação C-N (Amida

II), observou-se um padrão de alteração semelhante. A diferença entre as

intensidades é mínima, podendo, assim, concluir que a alteração na quantidade de

proteínas encontradas não é significativa.

47

O histograma E representa os triglicerídeos e corresponde ao estiramento de

C=O do grupo éster. Foi observado um aumento maior de intensidade na última

concentração (C3).

Os histogramas J, K, L, M, N, O e P, que correspondem aos grupos PO2- com

alguma contribuição de fosfolipídios, ligação C-O de glicogênio, polissacarídeos,

ácidos nucleicos, e bandas de DNA nas regiões menores que 1000 cm-1,

apresentam superposição de bandas, e por isso a atribuição de bandas é dificultada.

Nos histogramas L, M, N, O e P foram observadas alterações semelhantes

entre si, com um aumento de intensidade na concentração C1 e logo uma

diminuição nas concentrações C2 e C3. Nos histogramas J e K, que correspondem

ao estiramento assimétrico de PO2- de ácidos nucleicos com alguma contribuição de

fosfolipídios observou-se um aumento da intensidade na concentração C3.

O histograma M que corresponde à superposição do modo simétrico de PO2-

de ácidos nucleicos, fosfolipídios e ao estiramento de C-O de glicogênio indica que

houve uma diminuição na intensidade na concentração C3, portanto conclui-se que

é significativa a contribuição de glicogênio nesta banda.

O fígado dos peixes é muito semelhante estruturalmente ao dos demais

vertebrados. As células hepáticas possuem várias funções vitais, incluindo a

participação do metabolismo de proteínas, gorduras e carboidratos. Também estão

envolvidas nos processos de desintoxicação e servem como locais de

armazenamento de glicogênio e lipídios (MELETTI; ROCHA; MARTINEZ, 2003).

O Diclofenaco sódico é extensivamente metabolizado no fígado

(BOELSTERLI, 2003). Cerca de metade da substância ativa do Diclofenaco sódico é

metabolizada durante a primeira passagem através do fígado, quando administrada

via oral ou retal.

Em casos raros, o Diclofenaco sódico, assim como outros anti-inflamatórios

não esteróides (AINE’s), pode causar lesões hepáticas em pacientes (BOELSTERLI,

2003).

Um estudo realizado com a espécie de peixe truta arco-íris (Oncorhynchus

mykiss), no qual foram expostos ao hormônio 17-β-Estradiol, revelaram, através da

técnica de Espectroscopia no Infravermelho, algumas alterações no tecido hepático.

Dentre essas alterações, observou-se uma diminuição dos níveis de glicogênio e de

proteína, além de um aumento de lipídios hepáticos, principalmente triglicerídeos. O

48

teor relativo de ácidos nucleicos também foi observado no fígado (CAKMAK,

TOGAN, SEVERCAN, 2005).

No estudo em questão, os níveis de proteínas praticamente não se alteraram,

ao contrário do observado para os níveis de lipídios, colesterol e, principalmente,

triglicerídeos, que apresentaram um aumento. Já as regiões relacionadas ao

glicogênio, também não apresentaram alterações significativas, exceto na região

1185-1169 cm-1 onde observou-se uma pequena diminuição nas bandas

relacionadas as concentrações 1 e 2. Já nas regiões correspondentes aos ácidos

nucleicos foram observadas alterações, principalmente, nas últimas regiões do

espectro, onde as áreas das bandas da concentração 1 tiveram um aumento

significativo. Ao contrário das áreas das concentrações C2 e C3 que apresentaram

uma diminuição bastante significativa.

4.2 Obtenção dos espectros infravermelhos dos tecidos de músculo




numeração das bandas atribuídas na Tabela 8 é mostrada na

18.

49

Figura 18 - Espectro infravermelho médio do tecido de músculo referente ao grupo controle e concentrações 1, 2 e 3.

Fonte: Autora.

50

Tabela 8 - Número de onda e descrição aproximada do espectro de músculo controle.

Item

Nº de

onda

(cm -1)


Barbosa, 2011)

1 3278 Estiramento da ligação N-H (proteínas)


3 2955 Estiramento Assimétrico do grupo -CH3 (principalmente lipídios)




7 1631


9 1534 Amida II – Deformação angular de N-H (60%) com estiramento da

ligação C-N (40%)



12 1303 Torção e flexão de CH2 (proteína, lipídio e ácidos nucleicos)

13 1235 Estiramento assimétrico de PO2- (principalmente ácidos nucleicos)

14 1221

15 1170 Estiramento assimétrico de CO-O-C (glicogênio e ácidos nucleicos)

16 1112

17 1086 Estiramento simétrico de PO2- (ácidos nucleicos e fosfolipídios);

estiramento de ligação C-O (glicogênio)

18 1044 Estiramento C-O (Polissacarídeos)

19 975 Estiramento C-N+-C (ácidos nucleicos)

20 933 Forma Z-DNA




24 830

Fonte: Autora.

Após a análise das atribuições aproximadas do espectro do tecido de

músculo, foram escolhidas as principais bandas de absorção e definidas as regiões

dos intervalos de área destas bandas. Foi realizado o cálculo das áreas destas

51

bandas para todas as concentrações do princípio ativo Diclofenaco sódico

(concentrações 1, 2 e 3) e controle, através do software Spectrum 5.2. Os resultados

dos cálculos são apresentados na Tabela 9.

.

52

Tabela 9 - Intensidade integrada das bandas das diferentes regiões do espectro de músculo.

.

Item Nº de onda (cm-¹) Regiões Área Controle

Área

Concentração1

Área

Concentração2

Área

Concentração 3

1 3278 3657-3021 262,0815 247,5515 253,7716 260,4416

2 3011 3021-2988 13,7577 13,2436 13,1471 13,1584

3 2955-2922 2988-2878 69,4296 70,1741 66,7585 58,1824

4 2852 2878-2821 27,6518 28,0404 26,5125 22,8897

5 1743 1767-1715 9,7399 10,4492 9,6774 5,5282

6 1631-1637 1715-1582 116,3939 116,6518 115,3307 113,9771

7 1534 1582-1477 106,2482 106,2772 104,8985 105,3963

8 1455 1477-1425 33,2435 33,1720 31,7610 29,8096

9 1390 1425-1356 43,9814 44,8134 42,8046 41,2049

10 1303 1330-1271 29,1012 30,1323 28,4449 26,5609

11 1235-1221 1271-1200 40,0965 40,6850 38,7168 34,2099

12 1170 1200-1131 38,5973 39,3846 36,8314 29,2391

13 1112-1086 1131-1050 43,2655 45,3453 42,8412 37,4466

14 1044 1050-988 17,9120 18,2284 16,9374 15,1429

15 975 988-943 4,9056 4,7335 4,3949 4,0675

16 933 943-903 1,2250 1,2232 1,3197 1,2885

17 897 903-884 0,0931 0,1701 0,0627 0,0473

18 875 884-863 0,0411 0,0666 0,0287 0,0202

19 851 863-839 0,0296 0,0351 0,0382 0,0458

20 830 839-817 0,0926 0,1027 0,0820 0,0927

53


músculo através de análise quantitativa entre as diferentes concentrações de


Os histogramas da Figura 19 ilustram as alterações dos modos vibracionais

das biomoléculas em cada região, causadas pela interferência do princípio ativo

Diclofenaco sódico no tecido de músculo nas diferentes concentrações de

diclofenaco sódico em estudo (0,0000; 0,0022; 0,0088; e 0,02743 µg mL-1).

Figura 19 - Histogramas e suas respectivas regiões: (A) Região 3657-3021 cm-1; (B) Região 3021-2988 cm-1; (C) Região 2988-2878 cm-1; (D) Região 2878-2821 cm-1; (E) Região 1767-1715 cm-1; (F) Região 1715-1582 cm-1; (G) Região 1582-1477 cm-1; (H) Região 1477-1425

cm-1; (I) Região 1425-1356 cm-1; (J) Região 1330-1271 cm-1; (K) Região 1271-1200 cm-1; (L) Região 1200-1131 cm-1; (M) Região 1131-1050 cm-1 (N) Região 1050-988 cm-1; (O) Região 988-943 cm-1; (P) Região 943-903 cm-1; (Q) Região 903-884 cm-1; (R) Região 884-863 cm-1;

(S) Região 863-839 cm-1; (T) Região 839-817 cm-1.

54

Fonte: Autora.

Os histogramas apresentados em A, F e G representam proteínas e

correspondem ao estiramento da ligação N-H (Amida A), estiramento da ligação

C=O (Amida I), e deformação angular de N-H e estiramento da ligação C-N (Amida

II). Pode-se observar que não houve alterações significantes na quantidade de

proteína entre as intensidades.

Os histogramas apresentados em B, C, D, H e I representam a região dos

lipídios e correspondem as vibrações das ligações C-H e do grupo COO-. Pode-se

observar um padrão de alteração semelhante entre as intensidades dos histogramas

C, D, H e I. Observou-se uma diminuição gradativa entre as intensidades das

55

concentrações. Somente o histograma B não apresentou mudanças significativas,

quando comparado ao grupo controle.


C=O do grupo éster. Observou-se um pequeno aumento de intensidade na

concentração C1 e logo uma diminuição bastante significativa em C3.

Os histogramas J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S e T, que correspondem aos

grupos PO2- com alguma contribuição de fosfolipídios, lipídio, ligação C-O de

glicogênio, polissacarídeos, ácidos nucleicos, proteína e bandas de DNA nas regiões

menores que 1000 cm-1, possuem superposição de bandas, e por conta disso, a

atribuição de bandas é dificultada.

Nos histogramas J, K, L, M e N foram observadas alterações semelhantes,

com um pequeno aumento de intensidade na concentração C1 e logo uma

diminuição nas concentrações C2 e C3.

O histograma M que corresponde à superposição do modo simétrico de PO2-

de ácidos nucleicos com contribuição de fosfolipídios e ao estiramento de C-O de

glicogênio revela que houve uma diminuição na intensidade da concentração C3.

Os histogramas O, P, Q, R, S e T, que representam as regiões das bandas de

DNA (menores que 1000 cm-1), apresentaram grandes alterações significativas nas

intensidades de todas as concentrações e não possuem alterações semelhantes

entre si. Somente os histogramas Q e R apresentaram alterações semelhantes,

onde houve um aumento bastante significativo na intensidade da concentração C1 e

logo uma diminuição significativa e gradativa em C2 e C3.

O histograma O apresentou uma diminuição gradativa de intensidade e o

histograma S, um aumento gradativo de intensidade entre as concentrações que

indica a alteração da conformação de DNA sugerindo a existência do polimorfismo

conformacional. O histograma P não apresentou mudanças significativas.

Na região apresentada pelo histograma S observou-se um aumento gradativo

na intensidade das concentrações, quando comparado ao controle C0.

O histograma T apresentou um aumento na intensidade das concentrações

C1 e C3.

A musculatura esquelética está entre os principais órgãos-alvo em estudos,

por ser um dos locais de acúmulo de substâncias (MELETTI; ROCHA; MARTINEZ,

2003).

Analisando todas as regiões em estudo, não houve alterações em proteínas.

56

Foram observadas alterações em algumas regiões correspondentes ás

biomoléculas de lipídios, triglicerídeos, colesterol, glicogênio, fosfolipídios e

polissacarídeos. Houve uma diminuição na intensidade destas regiões. Na região

1767-1715 cm-1 que corresponde ao estiramento de C=O do grupo éster, que

representa triglicerídeos, a diferença foi ainda mais notável.

Quanto aos ácidos nucleicos, as alterações também foram grandes e bem

perceptíveis, principalmente nas últimas regiões do espectro. Pode-se concluir que

de todas as regiões analisadas, as bandas de DNA apresentaram mais alterações.

57

4.3 Obtenção dos espectros infravermelhos das brânquias




numeração das bandas atribuídas na Erro! Fonte de referência não encontrada. é

mostrada na Erro! Fonte de referência não encontrada.0.

Figura 20 - Espectro infravermelho médio do tecido de brânquias referente ao grupo

controle, concentrações 1, 2 e 3.

58

Tabela 10 - Número de onda e descrição aproximada do espectro de brânquias controle.

Após a análise das atribuições aproximadas do espectro do tecido de

brânquias, foram escolhidas as principais bandas de absorção e definidas as regiões

dos intervalos de área destas bandas. Foi realizado o cálculo das áreas destas

bandas para todas as concentrações do princípio ativo Diclofenaco sódico

(concentrações 1, 2 e 3) e controle, através do software Spectrum 5.2. Os resultados

dos cálculos são apresentados na Tabela 10.

Item

Nº de

onda

(cm -1)


Barbosa, 2011)

1 3282 Estiramento da ligação N-H (amida A de proteínas)




5 2870 Estiramento Simétrico do grupo -CH3 (principalmente proteínas)




9 1536 Amida II – Deformação angular de N-H (60%) com estiramento da

ligação C-N (40%)



12 1390

13 1231 Estiramento assimétrico de PO2- (principalmente ácidos nucleicos)

14 1172 Estiramento assimétrico de CO-O-C (glicogênio e ácidos nucleicos)

15 1081 Estiramento simétrico de PO2- (ácidos nucleicos e fosfolipídios);

estiramento de ligação C-O (glicogênio) 16 969 Estiramento C-N+-C (ácidos nucleicos)

59

Tabela 10 - Intensidade integrada das bandas das diferentes regiões do espectro de brânquias.

Item Nº de onda (cm-¹) Regiões Área

Controle

Área

Concentração 1

Área

Concentração 2

Área

Concentração 3

1 3282 3681-3106 234,6726 235,6258 220,3725 219,072

2 3010 3026-2988 16,8594 15,7932 14,132 15,6838

3 2955 - 2922 2988-2878 76,2388 71,7004 59,4703 79,7904

4 2870 - 2852 2878-2821 31,4039 29,217 24,015 32,997

5 1743 1767-1715 10,5211 10,158 6,3013 14,1101

6 1638 1715-1582 119,8756 118,1901 115,0017 117,6974

7 1536 1582-1477 100,0398 97,5903 95,6113 94,7315

8 1454 1477-1425 34,1349 32,7893 30,0668 33,9484

9 1398 - 1390 1425-1356 42,488 40,4781 36,9701 40,4939

10 1231 1268-1185 51,7549 48,7714 45,003 52,3992

11 1172 1185-1128 29,8261 28,3066 22,9115 33,8439

12 1081 1128-1055 45,5252 42,8707 38,3575 45,7292

13 969 981-941 6,6929 6,318 5,0374 6,0704

60

4.3.1 Estudo das diferentes regiões do espectro no infravermelho de brânquias

através de análise quantitativa entre as diferentes concentrações de


Os histogramas da Erro! Fonte de referência não encontrada.21 ilustram as

alterações dos modos vibracionais das biomoléculas em cada região, causadas pela

interferência do princípio ativo Diclofenaco sódico no tecido das brânquias. nas

diferentes concentrações de diclofenaco sódico em estudo (0,0000; 0,0022; 0,0088;

e 0,02743 µg mL-1).

Figura 21 - Histogramas e suas respectivas regiões: (A) Região 3681-3106 cm-1 ; (B) Região 3026-2988 cm-1; (C) Região 2988-2878 cm-1; (D) Região 2878-2821 cm-1; (E) Região 1767-1715 cm-1; (F) Região 1715-1582 cm-1; (G) Região 1582-1477 cm-1; (H) Região 1477-1425

cm-1; (I) Região 1425-1356 cm-1; (J) Região 1268-1185 cm-1; (K) Região 1185-1128 cm-1; (L) Região 1128-1055 cm-1; (M) Região 981-941 cm-1.

61

Os histogramas B, C, D, H e I representam lipídios e correspondem ás

vibrações das ligações C-H e do grupo COO-. Um padrão de alteração semelhante

foi observado entre as intensidades. Houve primeiramente uma diminuição da

intensidade em C1 e C2 e logo um aumento em C3, quando comparados ao grupo

controle CO.

Os histogramas A, F e G representam proteínas e correspondem ao

estiramento da ligação N-H (Amida A), estiramento da ligação C=O (Amida I), e

deformação angular de N-H e estiramento da ligação C-N (Amida II). Observou-se

um padrão de alteração semelhante entre os histogramas. A diferença entre as

intensidades são muito pequenas, podendo concluir que as quantidades de

proteínas apresentadas não são significativas.


C=O do grupo éster. Foi observada uma diminuição na intensidade em C2 e logo um

grande aumento significativo na intensidade da última concentração (C3).

Os histogramas J, K, L e M correspondem aos grupos PO2- com alguma

contribuição de fosfolipídios, ligação C-O de glicogênio, polissacarídeos e ácidos

nucleicos. Por apresentarem superposição de bandas, a atribuição das bandas é

dificultada. Foi observado alterações semelhantes entre si, com uma diminuição de

62

intensidade em C1 e C2 e um aumento em C3. Os histogramas J e K correspondem

ao estiramento assimétrico de PO2- de ácidos nucleicos com alguma contribuição de

fosfolipídios. O histograma M corresponde as bandas de DNA que apresentaram

alteração significativas nas intensidades para concentrações diferentes.

As brânquias, a pele e o trato digestivo são locais onde se tem grande

absorção de agentes tóxicos presentes na água. As brânquias possuem

características como uma grande superfície de absorção, e uma pequena distância

de difusão e o grande fluxo contracorrente entre a água e o sangue, e por esses

motivos são consideradas o órgão dominante na tomada de substâncias da água.

Estas, por possuírem tecidos sensíveis, frequentemente indicam a presença de

materiais irritantes na água (MELETTI; ROCHA; MARTINEZ, 2003).

Pode-se observar, de acordo com o estudo realizado, que não houve

alterações significantes nas regiões de proteína.

Já nas outras regiões relacionadas aos lipídios, ácidos graxos, fosfolipídios,

colesterol e triglicerídeos observou-se uma diminuição destas biomoléculas

principalmente nas regiões das bandas relacionadas ás concentrações 1 e 2. Na

região da banda de concentração 3, onde a concentração do princípio ativo

Diclofenaco é maior, notou-se um aumento no nível dessas biomoléculas,

principalmente na região a que se refere ao estiramento C=O do grupo éster, onde a

diferença foi ainda maior.

Nas regiões dos ácidos nucleicos e glicogênio observou-se também uma

diminuição na intensidade das bandas referentes ás concentrações C1 e C2. Já na

maioria das regiões, a intensidade da banda da concentração 3 mostrou-se maior,

ou quase no mesmo nível de intensidade que a do grupo controle.

É importante ressaltar que na inspeção visual direta, observou-se que não

foram encontrados resíduos do princípio ativo Diclofenaco sódico nos tecidos.

Sugere-se que os mesmos possam ter sido metabolizados e excretados pelos

organismos em estudo.

A Espectroscopia no Infravermelho é uma técnica poderosa que permite a

investigação das alterações estruturais e funcionais de moléculas e é comumente

utilizada em diversas áreas (SEVERCAN et al., 2011). Por isso, foi a ferramenta

escolhida para estudar e analisar as principais alterações dos modos vibracionais

das biomoléculas em questão, e se mostrou bastante efetiva e conclusiva, além de

ter proporcionado ótimos resultados para avaliação de estudos de ecotoxicologia.

63

4.4 Quantificação de biomoléculas

Após a análise qualitativa dos histogramas, foi realizada a quantificação de

biomoléculas para fígado, músculo e brânquias. Foram observadas alterações nas

principais biomoléculas como lipídios, proteína, triglicerídeos, DNA e glicogênio.

A área sob os picos nos fornece a informação sobre a concentração dos

diferentes grupos funcionais e sobre as ligações químicas relacionadas aos modos

vibracionais. Por exemplo, a razão entre lipídio e proteína é calculada através da

razão entre a área de junção do estiramento assimétrico de CH2, e CH3 e as bandas

de estiramento simétrico de CH2 pela área da banda de Amida I. A razão entre DNA

e proteína é calculada através da razão da junção da área de estiramento simétrico

de PO2- e bandas de tipo N-açúcares pela área da banda de Amida I. Já a razão

entre triglicerídeos e fosfolipídios é calculada através da razão entre o estiramento

de C=O do grupo éster e a soma das bandas de estiramento simétrico e assimétrico

de CH2 (SEVERCAN et al., 2011).

A quantificação das principais biomoléculas em estudo de fígado, músculo e

brânquias é apresentada nas Tabela 11, 13 e 14.

Tabela 11 - Quantificação das principais biomoléculas no fígado.

Razão Controle

24h

Concentração 1-

24h

Concentração 2-

24h

Concentração 3-

24h

Lipídio-proteína 1,0000 1,0869 1,0002 1,0452

DNA-proteína 1,2160 1,3037 1,1917 1,1213

Triglicerídeos-

fosfolipídios 0,0707 0,0702 0,0743 0,0766

Amida I-Amida II 1,3782 1,3967 1,3836 1,3457

Glicogênio-proteína 0,1600 0,1601 0,1532 0,1491

64

Tabela 12 - Quantificação das principais biomoléculas no músculo.

Razão Controle

24h

Concentração 1-

24h

Concentração 2-

24h

Concentração 3-

24h


DNA-proteína 0,5805 0,5993 0,5697 0,5102

Triglicerídeos-

fosfolipídios 0,1003 0,1064 0,1037 0,0682

Amida I-Amida II 1,0955 1,0976 1,0995 1,0814

Tabela 13 - Quantificação das principais biomoléculas nas brânquias.

Razão Controle

24h

Concentração 1-

24h

Concentração 2-

24h

Concentração 3-

24h


DNA-proteína 0,4356 0,4161 0,3773 0,4401

Triglicerídeos-

fosfolipídios 0,0977 0,1006 0,0755 0,1251

Amida I-Amida II 1,1982 1,2110 1,2028 1,2424

Foram feitos histogramas para uma melhor visualização e análise dos

resultados. Os histogramas representam a variação da razão, que permite a

quantificação das biomoléculas.

4.4.1 Razão Lipídio-proteína

Os histogramas que representam a variação da razão lipídio-proteína dos

respectivos órgãos em estudo são apresentados na Erro! Fonte de referência não

encontrada.22:

65

Figura 22 - Variação da razão lipídio-proteína em fígado (F); variação da razão lipídio-proteína em brânquias (B), variação da razão lipídio-proteína no músculo (M).

O histograma F se refere a razão lipídio-proteína de fígado, e pode-se

observar que a quantidade de lipídios é maior na concentração C1, e nas demais

concentrações observa-se uma diminuição nessa quantidade relativa quanto a esta

biomolécula.

O histograma M se refere a razão lipídio-proteína no músculo, e apresenta

uma diminuição gradativa da quantidade de lipídios no organismo. Este

comportamento se deve ao stress e a agitação pela luta da sobrevivência, que fez

com que a quantidade de lipídios diminuísse no músculo aos poucos.

O histograma B se refere a razão lipídio-proteína nas brânquias e teve uma

diminuição gradativa da quantidade de lipídios em C1 e C2. Na concentração C3

observou-se um aumento dos lipídios.

66

4.4.2 Razão DNA-proteína

Os histogramas que representam a variação da razão DNA-proteína dos


encontrada.23:

Figura 23 - Variação da razão DNA-proteína em fígado (F); variação da razão DNA-proteína em brânquias (B), variação da razão DNA-proteína no músculo (M).

No histograma F, referente a razão DNA-proteína do fígado, pode-se observar

claramente que na concentração C1 a quantidade de DNA aumenta e nas

concentrações C2 e C3 a quantidade diminui gradativamente. No histograma M, no

qual se refere a razão DNA-proteína de músculo, observou-se um padrão de

alteração semelhante a do fígado.

67

Nas brânquias, no histograma B, foi observada uma diminuição na quantidade

de DNA nas concentrações C1 e C2 e um aumento em C3.

4.4.3 Razão Triglicerídeos-fosfolipídios

Os histogramas que representam a variação da razão Triglicerídeos-

fosfolipídios dos respectivos órgãos em estudo são apresentados na Erro! Fonte de

referência não encontrada.24:

Figura 24 - Variação da razão Triglicerídeos-fosfolipídios em fígado (F); variação da razão Triglicerídeos-fosfolipídios em brânquias (B), variação da razão Triglicerídeos-fosfolipídios

no músculo (M).

O histograma F representa a razão triglicerídeos-fosfolipídios no fígado, que

são os principais lipídios de organismos eucariotos, como os peixes. Neste caso foi

68

possível observar um aumento gradativo da quantidade de triglicerídeos entre as

concentrações comparando com o grupo controle.

O histograma M que se refere a razão triglicerídeos-fosfolipídios no músculo,

mostra que a quantidade de triglicerídeos aumenta nas concentrações C1 e C2 e

logo diminui significantemente em C3.

No histograma B, que representa brânquias, observou-se um grande aumento

na quantidade de triglicerídeos também na concentração C3. A concentração C2

apresentou uma grande diminuição na quantidade.

4.4.4 Razão Amida I/Amida II

Os histogramas que representam a variação da razão Amida I/Amida II dos


encontrada.25:

1 2 3 4

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ra

zã

o

Diferentes concentrações

Amida I/Amida II

1 2 3 4

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Ra

zã

o

Diferentes concentrações

Amida I/Amida II

Nos histogramas F, M e B que se referem a razão Amida I-Amida II

(correspondente as proteínas) dos respectivos órgãos, não foram observadas

alterações significantes entre as concentrações estudadas, sugerindo então que a

quantidade de proteína no organismo estudado praticamente não se alterou.

Amida I/Amida II

Razã

o

Figura 25 - Variação da razão Amida I/Amida II em fígado (F); variação da razão Amida I/Amida II em brânquias (B), variação da razão Amida I/Amida II no músculo (M).

(FÍGADO)

(MÚSCULO)

(BRÂNQUIAS)

69

4.4.5 Razão Glicogênio-proteína

Não foi possível a construção dos histogramas referentes a razão glicogênio-

proteína de brânquias e músculo, pois através da inspeção visual os espectros não

apresentaram definições suficientes para identificação da banda de estiramento

assimétrico CO-O-C.

O histograma que representa a variação da razão Glicogênio-proteína do

fígado é apresentado na Erro! Fonte de referência não encontrada.26:

Figura 26 - Variação da razão Glicogênio-proteína em fígado (F).

No histograma F, que corresponde à razão glicogênio-proteína do fígado,

notou-se uma diminuição gradativa na quantidade de glicogênio no organismo. O

glicogênio é um polissacarídeo formado por milhares de unidades glicose, sendo o

fígado o principal órgão de seu armazenamento, bem como de metabolização,

quando o organismo, em situações de stress, necessita da disponibilização imediata

de glicose.

De acordo com o presente estudo, pode-se concluir que o princípio ativo

Diclofenaco sódico modifica e afeta algumas biomoléculas do organismo do peixe,

70

como lipídios, DNA, triglicerídeos e glicogênio. Não foram observadas mudanças

significativas somente em proteínas.

Outro estudo também realizado com a espécie truta arco-íris faz uma

avaliação dos efeitos tóxicos subletais quando expostos a diferentes concentrações

de Diclofenaco sódico (1 µg.L-1 a 500 µg.L-1), através de métodos histopatológicos.

Além disso, os resíduos de Diclofenaco sódico também foram analisados em vários

órgãos através das técnicas de cromatografia gasosa e espectrometria de massa. A

análise química revelou a acumulação relacionada com a concentração de

Diclofenaco sódico nos órgãos em estudo. Os valores mais altos foram detectados

no fígado, rim, brânquias e tecido de músculo, respectivamente. A partir deste

estudo, pode-se presumir que a exposição prolongada em concentrações

ambientalmente relevantes de Diclofenaco sódico leva a um comprometimento do

estado geral de saúde dos peixes (SCHWAIGER et al., 2004).

Os resultados do trabalho são claros quanto ao comprometimento da saúde

dos peixes. Pode-se observar que cada órgão apresentou uma alteração diferente,

após a exposição ao princípio ativo Diclofenaco sódico.

71

5 CONCLUSÃO

Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que a exposição da espécie

Brycon opalinus ao Diclofenaco sódico alterou as concentrações de biomoléculas,

principalmente lipídios, triglicerídeos, glicogênio e ácidos nucleicos evidenciadas por

alterações nas bandas infravermelhas analisadas. Somente as proteínas não

apresentaram mudanças significativas. Conclui-se também que cada órgão

apresentou uma alteração diferente. Além disso, os resultados do presente estudo

nos alertam sobre possibilidades de alterações semelhantes em células hepáticas

humanas, após longa exposição ao princípio ativo.

É importante ressaltar que a banda marcadora do princípio ativo Diclofenaco

sódico não apareceu nos espectros dos tecidos. Sugere-se que o fármaco possa ter

sido metabolizado e excretado pelos organismos em estudo.

As concentrações que foram utilizadas para este trabalho são muito

pequenas, e mesmo assim foi possível obter resultados através da Espectroscopia

no Infravermelho, podendo ressaltar que a técnica é eficaz no monitoramento da

qualidade dos corpos hídricos. A técnica de espectroscopia no Infravermelho com

Transformada de Fourier se mostrou eficiente e pode ser utilizada como uma

ferramenta analítica para estudos ambientais, tanto para análises qualitativas quanto

quantitativas, principalmente por ser uma técnica rápida, de baixo custo e exata.

Sugere-se como trabalho futuro as análises das amostras obtidas após 48

horas de exposição ao princípio ativo Diclofenaco sódico.

72

REFERÊNCIAS

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http://revistapescaecompanhia.com.br/fique-por-dentro/noticias/pirapitinga-do-sul

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ANEXO A - Comitê de Ética em Pesquisa

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