UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE … · zs/as/zota Data da defesa. ... À amiga...

UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA

INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

LUDMILA GUIMARÃES SOUZA

EFEITO DA FOTOTERAPIA NA REAÇÃO INFLAMATÓRIA INDUZIDA PELO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu E POR DUAS MIOTOXINAS

ISOLADAS DESSE VENENO

São José dos Campos, SP

2010

LUDMILA GUIMARÃES SOUZA

“Efeito da fototerapia na reação inflamatória induzida pelo veneno da serpente

Bothrops jararacussu e por duas miotoxinas isoladas desse veneno”

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.

Orientadora: Profa. Dra. Stella Regina Zamuner e Profa. Dra. Maricilia Silva Costa

São José dos Campos, SP

2010

s7t6Souza LufuilaGuimarães

Efeito da fototerryirr m ra@ inflmatória inúlzida pelo veneno da serpenteBothrops jararacassu e 1nr duas miotoxinas isoladas desse veneno / LudmilaGuimarães Souzq Oriedora: Profa. Dra. StellaRegina 74mrm€r e Proã. Dra.Maricilia Silva Costa - São Jose dos Campos, 2009..

I Disco laser: color-

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengeúria doInstiürto de Pesqúsa e Desenvolvimento daUniversidade do Vale do Paraiba2009.

l. Bothrops jworacassa 2.Bjierrla 3. Inflamação 4. Terapia a Laserde Baixalntensidade I. Zamuner, StellaRegin4 Orient.II. Cost4 MaÍicili4 ori€ní ItrTítnlo

CDU:615.8

Autorizo exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução tetal ou paÍcial

desta dissertação, por processos fotocopiadores ou transmissão eletrônicq desde que

citada à fonte.

zs/as/zotaData da defesa

LUDMILA GUIManÃns souzA

66EFEITO DA FOTOTERAPIA NA REAÇÃO fNn'f,,q.iu,lfÓnfA INDUZIDA PELO

VENENO DA SERPENTE Bothropsiararücussu E POR DUAS MIOTOXINAS

ISOLADAS DESSE VENENO''

Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia

Biomédica, do programa de pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa

e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte

banca examinadora:

prof. Dra. MARICÍLIA SILVA COSTA (UNIVAP)

Prof. Dra. STELLA REGINA ZAMUNER (UNICAMP

Prof. Dra. CLAUDIA BARBOSA LADEIRA DE CAM

PTof. DTa. CATARINA DE FÁTIMA PEREIRA TEIXEIRA (BUTANTA)

Profl. Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa

Diretor do IP&D - UniVaP

São José dos Campos, 23 de março de 2010'

A Deus,

presença constante em minha vida.

Aos meus queridos Pais,

meu eterno agradecimento pelo amor e esforço dispensado para

minha formação pessoal e profissional,

pelo constante incentivo e apoio incondicional.

A meu marido,

meu agradecimento pelo amor, companheirismo e incentivo.

A todos que sempre estiveram ao meu lado me apoiando e

torcendo pelo meu sucesso.

Dedico este trabalho.

AGRADECIMENTOS

Ao fim de mais uma etapa de minha vida, quero agradecer a todos aqueles que de uma

forma ou de outra participaram junto comigo dessa caminhada.

Em especial a professora Dra. Stella Regina Zamuner que me recebeu em seu

laboratório no início da minha vida científica, pelos seus ensinamentos, incentivo,

receptividade, paciência e amizade, em todos os momentos.

À Profa. Dra. Maricilia Silva Costa, pela imprescindível colaboração, não só pela

disponibilização de seu laboratório para a realização dos trabalhos, como também, pelo

incentivo e atenção.

À Dra. Ana Maria Barbosa pelo seu imenso carinho, disponibilidade e amizade, tantas

vezes demonstrado, não somente durante a realização da parte experimental desta pesquisa,

mas em todos os momentos.

Às amigas do laboratório, Nikele e Isabella, que muito me ajudaram.

À amiga Jéssie, um verdadeiro anjo em minha vida, que com muito carinho e

dedicação, me ajudou no momento que mais precisei.

Ao Prof. Dr. José Carlos Cogo por colaborar com essa pesquisa fornecendo o veneno

e permitindo o acesso ao seu laboratório.

Ao Prof. Dr. Andreimar Martins Soares, da FCFRP-USP (Universidade de São Paulo)

- Ribeirão Preto, SP pela importante colaboração me fornecendo as miotoxinas.

À Profa. Dra. Catarina de Fátima Pereira Teixeira, do Laboratório de Farmacologia do

Instituto Butantã, que disponibilizou seu laboratório para realização de parte desse projeto,

muitíssimo obrigada.

Aos amigos do Laboratório de Farmacologia do Instituto Butantã: Marlos, Eduardo e

Cristina, por toda atenção e colaboração, muito obrigada.

Às secretárias: Sra. Ivone V. Monteiro, Sra. Neuza de Moraes Macias Delgado,

Valéria Maeda e Vanessa Aparecida de Oliveira por estarem sempre disponíveis nas horas

que precisei.

Às bibliotecárias: Rubia Gravito C. Gomes e Rosangela Regis Cavalcanti, pela

contribuição, revisando essa dissertação e adequando-a de acordo com as normas da

UNIVAP.

À todos que direta ou indiretamente contribuíram e acreditaram na realização desta

pesquisa.

Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da Bolsa de Mestrado (processo 2007/07137-0)

“Só sei que nada sei”

Sócrates 470-399 a.c

EFEITO DA FOTOTERAPIA NA REAÇÃO INFLAMATÓRIA INDUZIDA PELO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu E POR DUAS MIOTOXINAS

ISOLADAS DESSE VENENO

RESUMO

O veneno das serpentes do gênero Bothrops induzem uma reação inflamatória local intensa, caracterizada por formação de edema e migração leucocitária. Neste trabalho avaliamos a atividade edematogênica e a migração leucocitária induzidos pelo veneno da serpente Bothrops jararacussu (VBjussu) e por duas toxinas isoladas deste veneno, as BthTX I e II. Ainda, utilizamos a terapia Laser de baixa potência (LBP) e Light Emitting Diode (LED) como um possível tratamento alternativo na neutralização do edema podal e na inibição da migração de leucócitos para a cavidade peritoneal, causado pelo veneno e toxinas. Utilizou-se camundongos Swiss machos (n=5). O efeito edematogênico foi avaliado por pletismografia, nos tempos 15, 30 min, 1, 3, 6 e 24 h após a injeção de 0,04; 0,1; 0,2 mg/kg/i.pl do veneno e 0,4 mg/kg/i.pl das toxinas ou salina (controle). Para a avaliação do efeito edematogênico foi escolhida a dose de 0,1 mg/kg por ser a dose que melhor caracterizou o edema. O veneno de VBjussu foi capaz de causar um efeito edematogênico com pico máximo na 1ª hora, assim como as toxinas. O influxo leucocitário foi avaliado no tempo de 6 h, na cavidade peritoneal após injeção de 0,2 mg/kg para o veneno, 1,6 mg/kg e 0,8 mg/kg para a BthTX I e II, respectivamente. A curva temporal da migração celular mostra que o VBjussu causou aumento significativo de leucócitos na sexta hora, bem como as toxinas. O LBP foi utilizado no comprimento de onda de 685 nm, potência 30 mW, densidade de energia 2,2 J/cm2, área 0,2 cm2, tempo 15” e os LEDs nos comprimentos de onda de 635 e 945 nm, potência 110 e 120 mW, densidade de energia 4 J/cm2 , área 1,2 cm2, tempo de 41” e 38” para o LED vermelho (LEDv) e infravermelho (LEDinf) respectivamente, sendo feita duas aplicações, nos tempos: 30 min e 3 h após a injeção do veneno, toxinas ou salina. O LBP e os LEDs nos parâmetros utilizados reduziram o edema e a migração celular. No edema causado pelo VBjussu a redução no pico máximo de formação deste foi de 39, 41 e 46%; pela BthTX I de 49, 54 e 67% e pela BthTX II de 51, 61 e 58% com o (LBP), (LEDinf) e (LEDv), respectivamente. O tratamento com o Laser e LEDs causaram redução de células Polimorfonucleares (PMN), na 6ª hora na ordem de 88, 90 e 84% após a injeção do VBjussu de 54, 83 e 70% após a BthTX I e de 55, 78 48% após a injeção de BthTX II, com o (LBP), (LEDinf) e (LEDv), respectivamente. O laser e LED não foram capazes de inibir a liberação de PGE2 causada pelo veneno ou miotoxinas. Portanto, estes resultados demonstram o benefício que o LBP e os LEDs oferecem como terapia alternativa no processo inflamatório induzido pelo veneno botrópico.

Palavras-chave: Bothrops jararacussu, edema, inflamação, miotoxinas, laserterapia.

EFECCT OF FOTOTERAPY IN THE INFLAMMATORY REACTION INDUCED BY Bothrops jararacussu SNAKE VENOM AND BY TWO MYOTOXYNS ISOLATED

THIS VENOM

ABSTRACT

The venom of the snakes of the genus Bothrops induces a local inflammatory reaction characterized by intense edema formation and leukocyte migration. This work evaluated the edematogenic activity and leukocyte migration induced by the venom of the snake Bothrops jararacussu (BjussuV) and two myotoxins isolated from this venom, the BthTX I and II. We also used the low level laser therapy (LLLT) and the Light Emitting Diode (LED) as an alternative treatment to the neutralization of paw oedema and inhibition of leukocytes migration to the peritoneal cavity, caused by venom and toxins. Swiss male mice was used (n = 5). The edematogenic effect was assessed by plethysmography, 15, 30 min, 1, 3, 6 and 24 hours after the venom injection of 0,04; 0,1; 0,2 mg/kg/i.pl and for the toxins we used 0,4 mg/kg/i.pl or saline (control). For the assessment of the edematogenic effect the dose of 0,1 mg/kg/i.pl was chosen to be the best dose that characterized oedema formation. VBjussu venom caused an edematogenic peak at 1 h, as well as the toxins. The leukocyte influx was evaluated 6 h after venom (0,2 mg/kg) or myotoxins (1,6 and 0,8 mg/kg for BthTX I and II, respectively) injection, in the peritoneal cavity. BjussuV caused a significant increase of leukocytes in the sixth hour, as well as the toxins. The LBP was used in the wavelength of 685 nm, power 30 mW power density; 2,2 J/cm2; area 0,2 cm2; time 15 "and the LEDs in wavelengths of 635 and 945 nm, power 110 and 120 mW; power density 4 J/cm2; area 1,2 cm²; time 41" and 38 "for the Red led (LEDv) and infrared (LEDinf) respectively. The LBP and LEDs reduced oedema formation and cell migration. In the oedema caused by BjussuV, the reduction was 39, 41 and 46%; by BthTX I it was 49, 54 and 67% and by BthTX II of 51, 61 and 58% with (LBP), (LEDinf) and (LEDv), respectively. The treatment with Laser and LEDs caused a reduction of Polymorphonuclear cells (PMN), at 6 h in the order of 88, 90 and 84% after the injection of BjussuV; 54, 83 and 70% after BthTX I injection and 55, 78 48% after the injection of BthTX II, with the (LBP), (LEDinf) and (LEDv), respectively. The Laser and LED were not effective in decrease the concentration of PGE2. Therefore, these results demonstrate the benefit that of the LBP and LEDs as an alternative therapy in inflammatory process induced by botropic venom.

Key words: Bothrops jararacussu, edema, inflammation, myotoxins, lasertherapy.

Lista de Figuras

Figura 1: Serpente Bothrops jararacussu. ...................................................................... 19

Figura 2: Distribuição geográfica da serpente Bothrops jararacussu. ........................... 20

Figura 3: Efeitos físicos da interação Laser-tecido ........................................................ 27

Figura 4: Efeitos biológicos da interação Laser-tecido .................................................. 30

Figura 5: Aparelho Laser de baixa potência................................................................... 38

Figura 6: Aparelho LED................................................................................................. 38

Figura 7: Pletismógrafo .................................................................................................. 40

Lista de Tabelas

Tabela 1: Protocolo da Irradiação Laser......................................................................... 37

Tabela 2: Protocolo da Irradiação LED.......................................................................... 37

Lista de Gráficos

Figura 1: Decurso temporal da resposta edematogênica induzida pelo veneno de B. jararacussu na pata de camundongos............................................................................. 44

Figura 2: Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II na formação do edema de pata em camundongos .................................................................................... 45

Figura 3: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs no edema induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu. .................................................................................................... 46

Figura 4: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na redução do edema induzido pela Bothropstoxina I e II....................................................................................................... 47

Figura 5: Perfil temporal da migração de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos após a injeção do veneno de Bothrops jararacussu. ............................... 48

Figura 6: Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II no influxo leucocitário no peritôneo de camundongos .................................................................... 50

Figura 7: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu........................................................................................................................... .............52

Figura 8: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pela BthTX I........................................ 54

Figura 9: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pela BthTX II....................................... 56

Figura 10: Efeito do Laser e do LED infravermelho na liberação de PGE2 induzida pelo veneno de B. jararacussu e pelas BthTX I e II .............................................................. 58

Lista de Abreviaturas e Símbolos

B. jararacussu – Bothrops jararacussu

VBjussu – veneno da Bothrops jararacussu

BthTX - I – Bothropstoxina I

BthTX – II – Bothropstoxina II

PLA2 – Fosfolipase A2

PAF – Fator ativador de plaquetas

PGE2 – Prostaglandina E2

TNF-α – Fator de necrose tumoral α

TXA2 – Tromboxano A2

LTB4 – Leucotrieno B4

IL-6 – Interleucina 6

NO – Óxido nítrico

AINEs – Antiinflamatórios não esteroidais

IASP – International Association for the Study of Pain

ATP – Adenosina trisfofato

LAP – Laseres cirúrgicos de alta potência

LBP – Laseres de baixa potência

TLBP – Terapia Laser de baixa potência

GaAs – Arseneto de Gálio

LED – Light Emitting Diode

i.p. – via intraperitoneal

i.pl. – via intraplantar

MN – Monomorfonuclear

PMN – Polimorfonuclear

Sumário

1 Introdução............................................................................................................................... 16

1.1 As Serpentes da fauna Brasileira ...................................................................................... 16

1.2 Epidemiologia................................................................................................................... 16

1.3 Acidente botrópico e sinais clínicos ................................................................................. 17

1.4 Bothrops jararacussu ....................................................................................................... 19

1.5 Miotoxinas com estrutura de fosfolipase A2 (PLA2)....................................................... 21

1.6 Resposta Inflamatória aguda no envenenamento ............................................................. 22

1.7 Laser ................................................................................................................................. 25

1.8 Interação Laser-tecido ...................................................................................................... 26

1.9 Efeitos da radição laser..................................................................................................... 28

1.10 Light Emitting Diode (LED) .......................................................................................... 31

1.11 Laser e acidente ofídico.................................................................................................. 31 2 Objetivos................................................................................................................................. 34 3 Material e métodos ................................................................................................................. 36

3.1 Animais............................................................................................................................. 36

3.2 Protocolo de Ética............................................................................................................. 36

3.3 Veneno e toxinas .............................................................................................................. 36

3.4 Protocolo de eutanásia ...................................................................................................... 37

3.5 Laser e LED...................................................................................................................... 37

3.6 Avaliação do edema ......................................................................................................... 39

3.7 Indução da reação inflamatória na cavidade peritoneal de camundongos........................ 40

3.8 Coleta e contagem dos leucócitos..................................................................................... 41

3.9 Determinação da concentração de prostaglandina E2 (PGE2)......................................... 41

3.10 Análise estatística ........................................................................................................... 42 4 Resultados............................................................................................................................... 44

4.1 Padronização da dose do veneno de B. jararacussu, através da curva dose-resposta...... 44

4.2 Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II na formação do edema de pata em camundongos. ........................................................................................................... 45

4.3 Efeito do Laser de baixa potência e dos LEDs no edema induzido pelo veneno de B. jararacussu em camundongos. ............................................................................................... 46

4.4 Efeito do Laser de baixa potência e dos LEDs no edema induzido pela Bothropstoxina I e II em camundongos.............................................................................................................. 47

4.5 Perfil temporal do influxo leucocitário induzido pelo veneno de B. jararacussu na cavidade peritoneal de camundongos. .................................................................................... 48

4.6 Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II no influxo leucocitário no peritônio de camundongos...................................................................................................... 49

4.7 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pelo veneno de B. jararacussu. .................................. 51

4.8 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzida pela Bothropstoxina I.................................................. 53

4.9 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzida pela Bothropstoxina II isolada do veneno de Bothrops jararacussu. ............................................................................................................................ 55

4.10 Efeito do Laser e do LED infravermelho sobre a liberação de PGE2 induzida pelo veneno de B. jararacussu e pela Bothropstoxina I e II. ......................................................... 57

5 Discussão................................................................................................................................ 60 6 Conclusão ............................................................................................................................... 68 Referências ................................................................................................................................ 70

INTRODUÇÃO

Introdução 16

1 Introdução

Os acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem um importante problema

de Saúde Pública em regiões tropicais do mundo. São considerados de grande importância

médica em virtude do grande número de pessoas atingidas e pela própria natureza do acidente,

caracterizado por graves manifestações sistêmicas e/ou locais que podem levar o indivíduo a

óbito ou ainda deixar sequelas como: deficiências, deformações ou até mesmo a perda do

membro afetado.

1.1 As Serpentes da fauna Brasileira

Há atualmente, cerca de 2.900 espécies de serpentes no mundo, distribuídas em 465

gêneros e 20 famílias. No Brasil, temos representantes de 9 famílias, 75 gêneros e 321

espécies, ou seja, cerca de 10% do total das espécies (FRANCO, 2003). Dentre todas as

serpentes peçonhentas existentes no Brasil destacam-se as pertencentes às famílias: Elapidae

onde o único gênero desta família no Brasil é o Micrurus, cujas espécies são conhecidas como

corais; e Viperidae na qual estão inseridas os gêneros: Crotalus cujas espécies são

popularmente conhecidas por cascavel, cascavel-quatro-ventas, boicininga, maracambóia,

maracá e outras denominações populares; gênero Lachesis (surucucu, surucucu-pico-de-jaca,

surucutinga, malha-de-fogo) e gênero Bothrops (jararaca, ouricana, jararacuçu, urutu-cruzeira,

jararaca-do-rabo-branco, malha-de-sapo, patrona, surucucurana, combóia, caiçara, e outras

denominações), sendo que este gênero compreende cerca de 30 espécies, distribuídas por todo

o território nacional (BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).

1.2 Epidemiologia

O verdadeiro número de mortes e a incidência por picadas de serpentes, no mundo todo,

são desconhecidos. A literatura mostra que no Brasil, o gênero da serpente peçonhenta,

responsável pelo maior número de acidentes é o gênero Bothrops (90,5%), seguido dos

Introdução 17

gêneros Crotalus (7,7%); Lachesis (1,4%) e Micrurus (0,4%). Quanto ao gênero responsável

pelo maior índice de letalidade, destaca-se o gênero Crotalus com 1,87%, seguido dos

gêneros Lachesis (0,95%); Micrurus (0,36%) e Bothrops (0,31%). A epidemiologia dos

acidentes ofídicos revela um perfil de vítimas do sexo masculino (70%), atingidos, sobretudo,

nos membros inferiores. Estes acidentes, em geral, estão relacionados a fatores climáticos e

aumento da atividade humana no campo (BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).

1.3 Acidente botrópico e sinais clínicos

As serpentes peçonhentas são capazes de sintetizar e secretar uma grande quantidade de

substâncias biologicamente ativas, compostas principalmente de proteínas e polipeptídeos

(FURTADO; COLLETO;DIAS DA SILVA, 1991) e ainda, seus venenos compreendem uma

mistura complexa de enzimas tóxicas e proteínas, como fosfolipases A2 (PLA2),

metaloproteinases, serinoproteases, neurotoxinas, citotoxinas, cardiotoxinas entre outras

(BRAUD; BOM;WISNER,2000; GUTIÉRREZ, 2002; OWNBY, 1990; SOARES et al.,

2004b). A fisiopatologia do envenenamento por serpentes, envolve uma complexa série de

eventos que vai depender da ação de uma dessas toxinas ou da combinação desses

componentes do veneno (GUTIÉRREZ, 2002).

De um modo geral, o veneno das diferentes espécies de serpentes do gênero Bothrops

induz a um quadro fisiopatológico semelhante, mas, variações na composição química e nas

atividades biológicas podem ocorrer entre famílias, gêneros, espécies e subespécies

(CHIPPAUX; WILLIAMS; WHITE, 1991; MOURA da SILVA et al., 1991).

Considerando os sinais e sintomas predominantemente relatados nos acidentes ofídicos,

o envenenamento botrópico pode ser dividido em sistêmico e local (ROSENFELD, 1971). As

manifestações sistêmicas são evidenciadas, principalmente, por alterações na homeostasia,

caracterizados por deficiência da coagulação, da agregação plaquetária e depleção de

fibrinogênio (HATI et al., 1999). A maioria dos venenos botrópicos ativa a cascata da

coagulação sanguínea, por atuarem sobre o fibrinogênio, a protrombina (Fator II), o fator X

(NAHAS; KAMIGUTI;BARROS, 1979) e o Fator VIII (NISHIDA et al., 1994), podendo

causar o completo consumo de fatores de coagulação (KAMIGUTI; CARDOSO, 1989). A

coagulopatia de consumo, consequente à ativação da cascata de coagulação, determina a

Introdução 18

incoagulabilidade sanguínea, caracterizada clinicamente por sangramentos espontâneos,

como, gengivorragia. Também são observados alterações do sistema cardiovascular, que

podem levar ao choque hipovolêmico, bem como à insuficiência renal aguda em casos mais

graves (AMARAL et al., 1985). Os efeitos sistêmicos como a insuficiência renal aguda

(AMARAL et al., 1985), sangramento em órgãos vitais e choque (KOUYOUMDJAIN et al.,

1991), estão relacionados às principais causas de óbito no envenenamento botrópico.

Os venenos botrópicos apresentam, ainda, a importante peculariedade de induzir sérias

reações locais. No local da picada, observa-se dor forte, edema intenso, além de hemorragia e

mionecrose (ROSENFELD, 1971; GUTIERREZ; LOMONTE, 1989; 1995). Segundo dados

da literatura, a hemorragia resulta da ação de metaloproteases, que contém zinco, de peso

molecular relativamente alto, as quais parecem atuar diretamente na membrana do endotélio

vascular (OHSAKA et al., 1973). A mionecrose é causada por uma família de proteínas

denominadas miotoxinas, as quais possuem características de fosfolipase A2 e atuam

diretamente sobre a membrana da célula muscular, causando dano tecidual proeminente

(GUTIERREZ; LOMONTE, 1995).

Ainda, o recrutamento e ativação de leucócitos induzido pelo envenenamento botrópico

foi relatado por diversos autores. Flores et al (1993) demonstraram que a administração dos

venenos de B. erythromelas e B. alternatus causam migração de leucócitos para a cavidade

peritoneal de ratos e Acosta de Pérez et al (1996) mostraram um infiltrado leucocitário,

composto principalmente de neutrófilos, em músculo gastrocnêmio de ratos, após a injeção do

veneno de B. jararaca da Argentina. Ademais, foi demonstrado que os venenos botrópicos

induzem a liberação de mediadores inflamatórios, como as citocinas interleucina-6 (IL-6) e

fator de necrose tumoral (TNF-α) e mediadores lipídicos como prostaglandina E2 (PGE2),

tromboxano A2 (TXA2) e leucotrieno B4 (LTB4) (OLIVO et al., 2007; ZAMUNER et al.,

2002, 2005). Os venenos botrópicos, além de induzirem a liberação de mediadores

inflamatórios, podem, eventualmente, ativar mecanismos intracelulares naquelas células, que

induzem a geração de substâncias capazes de ampliarem seu efeito lesivo (ZAMUNER et al.,

2001).

O tratamento utilizado no caso dos acidentes botrópicos é a soroterapia, em que, os

efeitos sistêmicos do veneno botrópico são normalmente revertidos, diminuindo assim o

coeficiente de letalidade decorrente desses acidentes. Entretanto, os antivenenos, apesar de

sua ação eficaz sobre o quadro sistêmico, dificilmente neutralizam as reações locais. Assim

Introdução 19

sendo, os estudos voltados para o esclarecimento dos mecanismos responsáveis pelos efeitos

fisiopatológicos locais do veneno, revestem-se de importância.

1.4 Bothrops jararacussu

A Bothrops jararacussu (Figura 1) é uma serpente de grande porte, podendo atingir até

2,20 m de comprimento. Diferencia-se das jararacas comuns pelo porte, padrão de desenho

em seu corpo e por possuir uma parte da cabeça negra. Há um acentuado dimorfismo sexual

entre fêmeas e machos, sendo que as fêmeas são marcadamente amarelas e pretas, enquanto

que os machos são marrons e pretos, além de serem menores e mais delgados. Estas serpentes

apresentam hábito noturno ou crepusculares. Geralmente são encontradas em florestas

tropicais, bancos de rios e pântanos (MILANI JUNIOR et al., 1997).

Figura 1. Bothrops jararacussu Fonte: http:// www.mundoreptil.com.br

Esta espécie está distribuída geograficamente em quase todo o território sul-americano:

Bolívia, Paraguai, norte da Argentina e Brasil (Figura 2). No Brasil, a espécie B. jararacussu

é predominantemente encontrada no estado do Mato Grosso, extremo sul da Bahia, sul de

Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e noroeste do

Rio Grande do Sul (CAMPBELL; LAMAR, 1989; MELGAREJO, 2003).

Introdução 20

Figura 2. Distribuição geográfica da serpente Bothrops jararacussu Fonte: Milani JunioR et al. (1997)

O envenenamento causado pela B. jararacussu tem grande mortalidade quando

comparada com outras serpentes do mesmo gênero e com a Crotaluss durissus terrificus

(SANCHES et al., 1992), sendo responsável por 0,8 a 10% dos acidentes ofídicos registrados

no Brasil (MILANI JUNIOR et al., 1997). O grande nível de letalidade, é atribuído aos 30%

de miotoxinas encontradas no veneno total (HOMSI-BRANDEBURGO,1988; RODRIGUES-

SIMIONI et al., 1983), e a componentes hemorrágicos (DA SILVA et al., 2007; QUEIROZ et

al., 1984).

Milani Junior et al (1997), fizeram um estudo clínico-patológico em 29 casos, atendidos

em um período de 20 anos, em dois hospitais do Estado de São Paulo. Este estudo mostrou a

importância e a gravidade dos acidentes causados pela serpente Bothrops jararacussu. Foram

encontrados sinais de necrose local, abscessos, coagulopatia, choque, necrose tubular renal e

morte. Este estudo ressalta a importância dos acidentes causados por esta serpente.

Introdução 21

1.5 Miotoxinas com estrutura de fosfolipase A2 (PLA2)

As fosfolipases A2 são enzimas que possuem baixo peso molecular (13-18 KDa), e

constituem uma família de proteínas que hidrolizam fosfolipídeos de membrana na posição

sn-2, de maneira cálcio-dependente, liberando ácidos graxos e lisofosfolipídeos (DENNIS,

1994). Ainda, por hidrolisarem a 1-o alquil, 2 araquidonil-glicerofosfocolina, algumas

enzimas geram o liso-PAF, precursor do fator ativador de plaquetas (PAF). Devido à

capacidade dessas PLA2 de promoverem a liberação do ácido araquidônico que é o substrato

para a biossíntese de vários mediadores lipídicos da inflamação, como prostaglandinas e

leucotrienos, muito interesse se tem demonstrado, no estudo dessa família de enzimas, pois,

os derivados do ácido araquidônico e o PAF, além de mediadores de fenômenos fisiológicos

estão envolvidos em vários processos inflamatórios (FLAMAND et al., 2006; REID, 2005).

A literatura mostra que as fosfolipases A2 estão abundantemente presentes nos venenos

de serpentes. Venenos viperídicos e crotalídicos contém PLA2s com a habilidade de causar

rápida necrose das fibras do músculo esquelético (PLA2s miotóxicas) (HARRIS; CULLEN,

1990). Em adição ao seu papel catalítico primário, as PLA2s dos venenos de serpentes

mostram ainda, outros importantes efeitos toxicos/farmacológicos, incluindo mionecrose,

neurotoxicidade, cardiotoxicidade e hemolítico, hemorrágico, hipotensivo, anticoagulante,

inibição da agregação plaquetária e indução da atividade edematogênica (GUTIÉRREZ;

LOMONTE, 1997; ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000). Algumas destas atividades são

correlacionadas com a atividade enzimática, mas outras são completamente independentes

(KINI et al., 1989; SOARES et al., 2004a).

Foi caracterizado como PLA2s básica os tipos Asp49 e Lys49 (HARRIS; CULLEN,

1990; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995). Além da miotoxicidade, a Asp49 e a Lys49,

promoveram eventos inflamatórios distintos em modelos experimentais (GUTIÉRREZ;

LOMONTE, 1995). É sabido que a Asp49 apresenta variável atividade enzimática, enquanto

que a Lys49 possui pouco ou nenhuma atividade enzimática. Esta variação na atividade

catalítica se deve a substituição do amino ácido na alça de ligação do cálcio, particularmente

na posição 49, onde a substituição da Asp49 pela Lys49 afeta drasticamente a catalise (para

revisão vide TEIXEIRA et al., 2003).

Introdução 22

Foram purificadas, do veneno de B. jararacussu, as miotoxinas BthTX-I e BthTX-II

(HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988). A BthTX-I é uma PLA2 Lys49, uma proteína

dimérica miotóxica, é a mais abundante miotoxina isolada do veneno de B. jararacussu e

pode ser considerada um modelo molecular que apresenta desafios, porque possui

miotoxicidade elevada e, no entanto apresenta pouca ou nenhuma atividade PLA2

(GUTIÉRREZ; OWNBY, 2003), danifica a membrana através de um mecanismo cálcio-

independente, capaz de induzir uma severa mionecrose (FLETCHER et al., 1996;

GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995; HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988; OWNBY et al.,

1999). Além da mionecrose, a BthTX-I causa diversos efeitos farmacológicos que incluem o

edema, degranulação do mastócito, o bloqueio irreversível da contração do músculo,

interrupção de lipossoma e citotoxidade em células endoteliais (ANDRIÃO-ESCARSO et al.,

2000; HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988; LANDUCCI et al., 1998).

A BthTX-II é uma Asp49, com estrutura homóloga ao da Lys49. Segundo Corrêa et al,

(2008), a BthTX II tem ação de uma Asp49 (desempenhando sua atividade catalítica) e de

uma Lys49 (sendo miotóxica e citotóxica), e ainda, esta proteína além de miotóxica, mostra

efeitos edematogênico e hemolítico (GUTIÉRREZ et al., 1991; HOMSI-BRANDEBURGO et

al., 1988). Foi demonstrado também que a BthTX II induz agregação plaquetária

(GUTIÉRREZ et al., 1991).

1.6 Resposta Inflamatória aguda no envenenamento

A inflamação é a reação protetora do tecido frente a uma injúria, tendo como finalidade,

proteger o organismo contra uma agressão local do tecido conjuntivo. Esta resposta do

organismo tem como característica fundamental, manifestar-se de forma estereotipada, ou

seja, ela obedece a um padrão semelhante, independente da natureza do estímulo lesivo. Após

o desencadeamento da inflamação, observa-se uma primeira fase, denominada de fase aguda,

evidenciada pelos sinais clássicos da inflamação: rubor, tumor, calor e dor, que são a

expressão de fenômenos estruturais e funcionais que ocorrem na microcirculação e no tecido

intersticial adjacente (FLOREY, 1970). A inflamação aguda pode dar origem a uma

inflamação crônica. Essa transição ocorre quando a resposta inflamatória aguda não pode ser

resolvida devido à persistência do agente lesivo ou a alguma interferência no processo normal

Introdução 23

de cicatrização. Se houver eliminação do agente lesivo, podem ocorrer fenômenos de

regeneração e reparo (COTRAN; KUMAR; ROBBINS, 1992).

A resposta imediata ao agente agressor inclui: alteração no calibre vascular e no fluxo

sanguíneo, mudanças estruturais na microvasculatura que favorecem o extravasamento de

proteínas do plasma e leucócitos, migração de leucócitos para a microcirculação e, sua

acumulação no foco da injúria, seguido de fagocitose pelas células competentes (GARCIA-

LEME et al., 1973; RYAN; MAJNO, 1977; GRANGER; KUBES, 1994).

Os sinais da resposta inflamatória induzida pelo veneno botrópico são característicos de

um quadro de inflamação aguda, que se caracteriza por três eventos principais: 1) alterações

no calibre vascular, que levam ao aumento do fluxo sanguíneo, surgindo sintomas como:

eritema e calor; 2) mudanças estruturais na microvasculatura, permitindo que fluídos e

proteínas plasmáticas, deixem a circulação, resultando em quadros álgicos e edematogênicos;

3) migração de leucócitos da microcirculação e sua acumulação no foco da injúria

(COLLINS, 1999).

Os diferentes eventos inflamatórios decorrem, em grande parte, da ação de mediadores

inflamatórios pré-formados e armazenados em grânulos ou recém sintetizados, que são

liberados no decorrer da resposta inflamatória (GARCIA-LEME, 1989). Esses mediadores

podem ser de origem plasmática (cininas e fatores do sistema complemento) ou celular

(histamina, serotonina, eicosanóides, óxido nítrico, fator ativador de plaquetas, citocinas e

neurocininas) (DIROSA et al., 1971; DOWNEN et al., 1999; PALMER et al., 1987; LYONS,

1995).

O componente celular da reação inflamatória é representado, primordialmente, pelos

leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e mononucleares

(monócitos e linfócitos) que migram dos vasos para o local da lesão. A migração de

leucócitos dos vasos para o local da lesão ocorre por entre as células endoteliais, e isso só é

possível devido a um movimento orientado desses leucócitos que depende da ação de

substâncias quimiotáticas e da expressão de moléculas responsáveis pela interação leucócito-

endotélio. Estas células locomovem-se orientadamente no sítio extravascular, em resposta a

um gradiente de concentração de mediadores inflamatórios, num processo conhecido como

quimiotaxia e acumulam-se no local da lesão para destruírem o agente lesivo (atividade

fagocítica e microbicida) (FLOREY, 1970).

Na inflamação aguda, os neutrófilos migram primeiro e os monócitos depois. Como

também há muito mais neutrófilos que monócitos no sangue, nas primeiras 24 a 48 horas a

Introdução 24

maioria do infiltrado inflamatório agudo é predominantemente neutrofílica (COTRAN;

KUMAR; ROBBINS, 1992).

A formação do edema ocorre devido a uma série de eventos que ocorrem na

microcirculação. Iniciando por uma breve vasoconstrição, seguido da dilatação, do aumento

do fluxo local e da permeabilidade vascular, com conseqüente extravasamento do material

protéico do plasma para o interstício. O edema inflamatório apresenta-se de forma localizada

e é composto de água, eletrólitos e proteínas (GARCIA-LEME et al., 1973). A essa ação

edematogênica dos venenos botrópicos, até o momento, não foi atribuída nenhuma proteína

isolada, por se tratar, possivelmente, da somatória de efeitos de várias toxinas presentes

nesses venenos. Há evidências quanto à participação de toxinas hemorrágicas, proteases,

fosfolipases A2, componentes dos venenos que causam a liberação de histamina de mastócitos

e substâncias que ativam o sistema complemento (GUTIERREZ; LOMONTE, 1989; DIAS da

SILVA et al., 1995). De fato, TREBIEN; CALIXTO (1989) demonstraram que o edema

induzido pelo veneno de B. jararaca em ratos é multimediado e resulta da ação de mediadores

e -adrenérgicos, de eicosanóides, PAF, além de serotonina e histamina. Por outro lado,

CHAVES et al (1995) observaram a participação de eicosanóides e de mediadores -

adrenérgicos, mas não de histamina e mediadores -adrenérgicos no edema induzido pelo

veneno de B. asper em camundongos. Essas discrepâncias podem dever-se aos diferentes

modelos animais utilizados experimentalmente, e/ou a variações nos componentes

edematogênicos presentes nos dois venenos estudados, justificando estudos adicionais.

A literatura mostra que os venenos botrópicos são capazes de induzir a liberação de

mediadores pró-inflamatórios como as citocinas interleucina-6 (IL-6), o fator de necrose

tumoral (TNF-), o interferon gama (IFN-) e mediadores lipídicos como a prostaglandina E2

(PGE2), tromboxano A2 (TXA2), leucotrieno B4 (LTB4) e prostaglandina D2 (PGD2) (OLIVO

et al., 2007; ZAMUNER 2001; 2005). Ainda, os venenos botrópicos, além de induzirem a

liberação de mediadores inflamatórios, podem, eventualmente, ativar mecanismos

intracelulares naquelas células que induzem a geração de substâncias capazes de ampliarem

seu efeito lesivo (ZAMUNER et al., 2001).

As lesões locais induzidas por venenos de serpentes do gênero Bothrops têm sido

amplamente investigadas, possibilitando o entendimento dos mecanismos farmacológicos e

fisiopatológicos envolvidos na gênese desses fenômenos e a caracterização das substâncias

presentes nestes venenos, responsáveis pelo quadro local. No entanto, ainda há uma série de

Introdução 25

incógnitas com relação à patogênese destes efeitos, que ainda permanecem como um desafio

para a pesquisa toxinológica na América Latina (GUTIERRÉZ ; LOMONTE, 2003).

1.7 Laser

A laserterapia tem sido muito utilizada nas últimas décadas, inclusive nas áreas médicas

e paramédicas. Embora o uso do laser nestas áreas venha crescendo, o conhecimento básico

de seu funcionamento, ainda é muito deficiente.

A palavra Laser é um acrônimo para “Light Amplification by Stimulated Emission of

Radiation” (amplificação da luz pela emissão estimulada da radiação), e designa atualmente,

uma vasta série de dispositivos com emissão de radiação eletromagnética em diversas faixas

do espectro eletromagnético, desde raios X até a microonda. As características que

diferenciam a luz laser das outras fontes luminosas são: monocromaticidade, colimação,

coerência espacial e temporal. A monocromaticidade significa que a luz laser emitida

apresenta apenas um único comprimento de onda, o qual é definido pelo meio ativo e pela

refletividade dos espelhos do laser e esta característica é considerada de grande importância,

pois determina quais moléculas absorverão a radiação e, portanto, a interação fotobiológica e

os efeitos terapêuticos específicos (BAXTER, 1997). A maioria dos laseres apresenta feixes

colimados, a colimação, refere-se ao alto grau de paralelismo do feixe laser (BAXTER, 1997),

com um mínimo ângulo de divergência. A coerência é a sincronicidade das ondas de luz, onde

as ondas propagam-se com a mesma fase no espaço e no tempo (KITCHEN; PARTRIDE,

1991; BAXTER, 1997; TUNER; HODE, 2002).

Quanto aos parâmetros que descrevem o laser: tipo, comprimento de onda, densidade de

potência e densidade de energia, duração da exposição e o modo de entrega da energia para o

tecido alvo (KITCHEN; PARTRIDGE, 1991; MISERENDINO; PICK, 1995; BAXTER,

1997; TUNER; HODE, 2002). A interação da luz com o tecido é determinada pelo

comprimento de onda da emissão laser e pelas características ópticas do tecido alvo

(MISERENDINO; PICK, 1995). O comprimento de onda define a profundidade de

penetração no tecido alvo (FULLER, 1983). Diferentes comprimentos de onda apresentam

diferentes coeficientes de absorção para um mesmo tecido. As radiações emitidas nas regiões

do ultravioleta e do infravermelho médio apresentam alto coeficiente de absorção pela pele,

fazendo com que a radiação seja absorvida na superfície, no entanto, nas regiões do vermelho

Introdução 26

e infravermelho próximo, constata-se baixo coeficinte de absorção, implicando em máxima

penetração no tecido (KARU, 1987). A densidade de potência (irradiância), é definida como

sendo a potência óptica de saída do laser em Watts, dividida pela área irradiada em cm2. A

energia total entregue sobre a área da superfície irradiada é denominada densidade de energia

ou fluência.

Por ser uma radiação óptica, o laser está incluído no espectro eletromagnético, tendo

como intervalo espectral, mais usado na prática clínica e laboratorial, os comprimentos de

onda de 630 a 1300 nm, incluindo a luz visível e a parte próxima do espectro infravermelho,

chamado de “janela terapêutica” para tecidos biológicos (BAXTER, 1997).

Os laseres podem ser classificados em: laseres cirúrgicos de alta potência (LAP) e não

cirúrgicos de baixa potência (LBP). A aplicação do LAP tem por base, os seus efeitos

fototérmicos e fotoablativos sobre o tecido, portanto são utilizados para cortar, destruir

tecidos, soldar, entre outros efeitos e a aplicação do LBP baseia-se nas interações atérmicas da

luz do laser com o tecido, produzindo efeitos de biomodulação (TURNÉR; HODE, 1998;

OSHIRO, 1991) ou seja, a terapia com o LBP, ocorre por meio de reações atérmicas da luz

com o tecido ocasionando efeitos fotoquímicos (SCHAFER et al., 2000; HONMURA et al.,

1993). Os laseres LBP, estão situados na região do vermelho e infravermelho próximo onde

emitem radiações com potência inferior a 1 W, desta forma, não vão induzir efeitos térmicos,

nem ablação (BRUGNERA; PINHEIRO, 1998; GENOVESE, 2000).

O laser Arseneto de Gálio (GaAs) é um dos laseres mais utilizados nas aplicações de

terapias com laser de baixa potência. Quando o aparelho laser se encontra com seus

parâmetros ajustados, o laser é gerado polarizando diretamente um diodo constituído de

Arseneto de Gálio. Este diodo, quando polarizado diretamente e submetido a uma elevada

corrente de circulação, desprende ondas eletromagnéticas com comprimentos de onda em nm

e estas ondas são guiadas a uma janela de onde o feixe é emitido (DOURADO et al., 2003),

produzindo radiação na faixa situada entre 630 nm e 950 nm (vermelho visível até o

infravermelho próximo) (KITCHEN; BAZINI, 1996).

1.8 Interação Laser-tecido

Introdução 27

A luz laser ao incidir em um meio, pode ser refletida, espalhada, transmitida ou

absorvida. O laser fornece uma quantidade elevada de fótons que em parte são: refletidos,

dispersos e transmitidos ao atingir o tecido biológico e o restante é absorvido em diferentes

camadas da epiderme e da derme, de acordo com os constituintes de cada camada (Figura 3).

Para que a radiação laser produza em efeito terapêutico no corpo humano, é necessário que

ela seja absorvida para que ocorra a interação com as estruturas moleculares e celulares

(BRUGNERA; PINHEIRO, 1998; GENOVESE, 2000; LOW; REED, 2001).

Figura 3. Efeitos físicos da interação Laser-tecido Fonte: Albertini (2006)

A primeira interação da luz com a pele acontece na superfície do extrato córneo, onde

cerca de 5 a 7% da radiação incidente é refletida. A aplicação em contato perpendicular do

aparelho laser com a superfície do tecido tegumentar durante a irradiação, irá aumentar a

profundidade de penetração em razão da redução da reflexão e dispersão. Dessa forma a

dispersão e a absorção são dependentes do tipo de tecido por meio do qual a luz está

passando, assim como comprimento da luz incidente. Assim que a luz é absorvida e

dispersada pelos tecidos do corpo, ocorre uma redução no efeito da radiação em relação a

penetração, atenuando a luz em diferentes frequências e graus. Por isso, a penetração da luz

nos tecidos, é determinada especialmente pelo comprimento de onda e potência, além dos

fenômenos de dispersão e absorção (BAXTER, 1997).

Introdução 28

Os cromóforos, como por exemplo: hemoglobina, melanina e água, exercem

significativa influência sobre a interação laser-tecido, pois estes elementos teciduais

apresentam alto coeficiente de absorção para um comprimento de onda específico ou espectro

de energia (MISERENDINO; PICK, 1995; BAXTER, 1997). Os cromóforos absorvem luz na

região visível do espectro, já os aminoácidos e os ácidos nucleicos têm alta absorção na faixa

intermediária do espectro vermelho-visível (BAXTER, 1997).

Os fotorreceptores presentes nas células, através de sua capacidade de absorver os fótons

da radiação, provocam variações no metabolismo celular. Assim, estas ações, determinarão

mudanças fotodinâmicas em cadeias complexas e moléculas básicas de processos fisiológicos

com conotações terapêuticas (KARU, 1999).

1.9 Efeitos da radição laser

O princípio básico da laserterapia é a capacidade de alterar o comportamento celular, na

ausência de aquecimento (SCHINDL et al., 2000). A radiação com o LBP promove

modificações ou efeitos na zona irradiada ou zona circundante. Esta radiação faz com que a

energia possa provocar mudanças nas moléculas, que por sua vez, promoveriam respostas

biológicas. Um aspecto importante da terapia com o LBP é a necessidade de que o tecido

biológico esteja de alguma forma em desequilíbrio homeostático, ou seja, alguns autores

relatam que o LBP não apresenta efeitos sobre células ou tecidos que não apresentam algum

tipo de alteração fisiopatológica (TURNÉR; HODE, 1998).

Vários efeitos da radiação laser podem ser encontradas na literatura. Estudos mostram,

que a forma de energia utilizada pelas células é o ATP; as células absorvem os fótons e

transformam sua energia em ATP, que é então utilizado para gerar processos metabólicos,

sintetizar DNA, RNA, proteínas, enzimas e outros produtos necessários para reparar ou

regenerar os componentes celulares e restaurar a homeostase (ENWEMEKA, 2007). Ainda, a

irradiação laser exerce um estímulo sobre as mitocôndrias celulares provocando um aumento

na produção de adenosina trifosfato (ATP) no interior das células e consequente aceleração da

mitose. Assim, ocorrerá um aumento do consumo de oxigênio e ativação da respiração

celular, eliminando as atividades anaeróbicas ocorridas em um processo inflamatório (KARU;

PYATIBRAT; KALENDO, 1995; PASSARELO et al., 1984; WILDEN; KARTHEIN, 1998).

Introdução 29

O incremento de ATP, favorece também, o aporte energético para funções importantes como

o transporte da membrana, síntese de proteínas e contração muscular (PASSARELO et al.,

1984).

Vladimirov et al (2004) relatam os efeitos observados em clínicas como a ação

antiinflamatória da radiação laser, a regeneração acelerada de tecidos danificados, e a melhora

da circulação do sangue em órgãos, que podem estar associados com o efeito do laser, obtidos

nos experimentos: 1) aumento da atividade de certas células como leucócitos e fagócitos, bem

como o aumento de íons cálcio no citoplasma destas células; 2) aumento da divisão celular e

crescimento de células; 3) ativação de síntese de proteínas e citocinas e 4) melhora da

circulação do sangue na circulação sanguínea, devido ao relaxamento das paredes dos vasos

(vasodilatação).

Segundo Basford et al (1995), a luz laser estimula a atividade energética, induzindo

processos de bioestimulação, conduzindo a liberação de fatores de crescimento por

macrófagos (YONG et al, 1989), proliferação de queratinócitos (HAAS et al., 1990), aumento

da população e degranulação de mastócitos (EL SAYED; DISON, 1996) e angiogênese

(SCHINDL et al., 2000) e ainda, aceleram o processo cicatricial de feridas (RABELO et al.,

2006).

Além destes efeitos bioquímicos, podem ocorrer efeitos bioelétricos caracterizados pela

manutenção do potencial de membrana celular, o que impede que os estímulos dolorosos se

propaguem a centros nervosos, isso devido a eficiência da bomba de sódio e potássio

ocasionada pela maior disponibilidade de ATP resultante do efeito bioquímico (RICCI, 2003).

Existe um grande número de hipóteses sobre o possível mecanismo da radiação laser:

hipóteses baseada na idéia de uma ação específica da radiação coerente (laser) em tecidos

humanos e animais, em estruturas biológicas; hipóteses baseada na ação fotoquímica da luz,

incluindo a radiação de laseres, LEDs, e outros tipos de luz na região do visível e

infravermelho próximo.

Karu (1999), sugere que a absorção da luz realizada pelos componentes

(fotorreceptores) da cadeia respiratória, tais como as flavinas e os citocromos, resultam em

uma aceleração de tranferência de elétrons em partes da cadeia respiratória ocorrendo assim a

produção de ATP. Uma pequena quantidade de radicais livres ou forma de oxigênio reativo é

produzido como parte desse processo, e os íons cálcio (Ca+2) e as enzimas da cadeia

respiratória também desempenham importantes funções (Figura 4).

Introdução 30

Figura 4. Efeitos biológicos da Interação Laser-tecido

Os mecânismos primários, dizem respeito a interação entre os fótons e moléculas em tecidos, enquanto que os mecânismos secundários referem-se aos efeitos das alterações químicas induzidas pelos efeitos primários. A estimulação da produção de ATP celular tem sido apontada como um dos efeitos mais importantes da terapia laser. Os mecânismos secundários incluem efeito sobre a dor, sobre a circulação sanguínea, sobre mecânismos estimuladores e reguladores e os efeitos sobre o sistema imunitário. Adaptado e modificado a partir do texto original de Tuner e Hode (2002). Apesar de existir uma grande quantidade de estudos mostrando os efeitos do LBP sobre

as células, vale ressaltar que as informações sobre o mecanismo de ação do laser sobre os

tecidos biológicos, ainda não são conclusivas, portanto estudos adicionais são necessários.

Introdução 31

1.10 Light Emitting Diode (LED)

O LED é um diodo emissor de luz, que quando energizado emite luz monocromática e

não coerente. É uma luz com alto grau de pureza que permite a sua utilização sem que haja a

necessidade de filtros ópticos coletores. São dispositivos semicondutores, apresentam grande

eficiência de conversão de energia elétrica em óptica, dissipando pouca potência. Tem como

característica principal, conduzir a corrente elétrica em um único sentido, apresentando duas

regiões distintas, sendo a primeira receptora de elétrons denominada por “p” e a segunda

doadora de elétrons, denominada “n” (MEDEIROS, 2001). Quando polarizados

adequadamente esses dispositivos semicondutores emitem luz na faixa visível ou invisível,

dependendo de seus componentes (ZANIN et al., 2005). O processo de emissão de luz pela

aplicação de uma fonte elétrica é denominado “eletroluminescência”. A luz emitida se dá

devido ao diodo (junção de P-N) energizado (REBELLO, 2005). Segundo alguns autores, a

terapia com o LED em baixa potência pode gerar efeitos semelhantes aos obtidos com a

TLBP (terapia a laser de baixa potência), pois, o aumento da atividade celular, tanto em

divisão como em síntese, tem sido relacionados ao comprimento de onda e com a dose, e não

especificamente à fonte de luz (KARU, 2003). O processo de absorção luminosa por

cromóforo tecidual está relacionado ao comprimento de onda do fóton. Este deve possuir um

pacote energético específico para que promova reações moleculares. Quando ocorre a

absorção de fótons por um cromóforo, um estado molecular eletronicamente excitado se

estabelece, resultando em aumento ou redução de atividade celular. A fotobiomodulação tem

como característica a possibilidade de aplicação em vários métodos terapêuticos empregando

diferentes fontes emissoras (KARU, 2003) e o baixo custo do LED contribuiu para que ele se

tornasse uma fonte de luz alternativa neste processo.

Ainda que a literatura ateste o efeito benéfico da terapia com o LED (VINCK et al.,

2003), não há estudos sobre a avaliação do efeito local causado por veneno de serpente e

tratamento com o LED. Portanto, este estudo pode contribuir como medida terapêutica

complementar de baixo custo.

1.11 Laser e acidente ofídico

Introdução 32

Na literatura há poucos trabalhos utilizando o laser de baixa potência para o tratamento

do efeito local causado por veneno ofídico. DOURADO et al. (2003), estudaram o efeito da

irradiação laser Ga-As (Arseneto de Galium), na mionecrose do músculo gastrocnêmio de

camundongo, causado pela injeção intramuscular de veneno de serpente Bothrops moojeni.

Esses autores observaram que o tratamento com esse laser diminuiu consideravelmente a

mionecrose, inibindo a habilidade do veneno em desfazer a integridade da membrana

plasmática. Também, Barbosa et al (2008, 2009), utilizando o laser Ga-As, verificaram que o

tratamento com o laser de baixa potência inibiu o edema, a migração de leucócitos e a

mionecrose, no músculo gastrocnêmio de camundongos, causada após a injeção do veneno de

B. jararacussu. Além disso, esses autores observaram que o tratamento com o laser de baixa

potência, juntamente com o antiveneno, foi capaz de causar uma inibição significativa, maior

do que o tratamento com o laser apenas. De acordo com os dados obtidos, estes autores

sugerem que o tratamento com o laser em acidentados ofídicos possa ser um instrumento

complementar para o tratamento de acidentes com serpentes botrópicas.

Dessa maneira, evidencia-se a importância do estudo do envenenamento botrópico bem

como o terapia com o laser de baixa potência, como uma alternativa no tratamento de

acidentados por serpentes botrópicas. Assim sendo, este estudo avaliou alguns efeitos pró-

inflamatórios causados pelo veneno da serpente Bothrops jararacussu e suas principais

miotoxinas (BthTX-I e BthTX-II), no que se refere a inflamação local e à eficácia da terapia

laser de baixa potência frente ao edema e o influxo de leucócitos e a liberação do mediador

inflamatório PGE2, induzido pelo veneno ou toxinas.

OBJETIVOS

____ Objetivos 34

2 Objetivos

I) Caracterizar a reação inflamatória induzida pelo veneno de Bothrops jararacussu e

pelas duas miotoxinas (Bothropstoxina I e II), isoladas deste veneno, em

camundongos, analisando:

- a formação do edema podal (cinética)

- o influxo leucocitário, no que se refere ao número, tipos celulares e cinética;

- a liberação do mediador inflamatório prostaglandina E2 (PGE2).

II) Avaliar o efeito do tratamento dos animais com a terapia com o Laser de Baixa

Potência e LEDs na evolução do edema podal, na migração celular e na liberação

da PGE2, induzidos pelo veneno ou miotoxinas.

MATERIAL E MÉTODOS

_____ Material e Métodos 36

3 Material e métodos

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss machos, pesando entre 22-25 g, provenientes do

Biotério da Anilab (Animais de Laboratório) Paulínia, São Paulo. Inicialmente os animais

foram pré-tratados com antiparasitários e receberam água e alimentação ad libitun, foram

mantidos em sala com temperatura e umidade constante (24oC – 60%), com ciclo claro/escuro

(12/12 horas).

3.2 Protocolo de Ética

A condução científica desta pesquisa seguiu as normas e registros da resolução CNS

196/96 do Conselho Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) e foi realizada somente após

aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da UNIVAP, sob o número

A028/2007/CEP.

3.3 Veneno e toxinas

O veneno total liofilizado de Bothrops jararacussu foi gentilmente cedido pelo Prof.

Dr. José Carlos Cogo do Serpentário do CEN (Centro de Estudos da Natureza) da UNIVAP.

A bothropstoxina-I e a bothropstoxina-II foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Andreimar

M. Soares, do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina, USP,

Ribeirão Preto. O veneno e as toxinas, liofilizados, foram mantidos a 10C e preparados (p/v)

em solução estéril de NaCl 0,9%, no momento do uso.


3.4 Protocolo de eutanásia

Os animais foram anestesiados com 10 mg/kg de xilazina (Virbaxyl 2% injetável; 0,1

mg/kg i.p.) + 100 mg/kg de ketamina (Dopalen injetável; 1 ml/Kg i.p.). Em seguida, sob o

efeito do anestésico, foi administrada overdose de cloreto de potássio a 10% (intracardíaco).

3.5 Laser e LED

O tratamento foi realizado com a utilização do laser de baixa potência (LBP),

semicondutor (modelo Theralaser D.M.C., São Carlos, S.P. Brazil) e LED (SANSEN

Tecnologia, SP Brasil).

Tabela 1 – Protocolo de irradiação laser

Parâmetros Valores

Comprimento de onda 685 nm

Densidade de energia (DE) 2,2 J/cm2

Potência 30 mW Tempo 15 ''

Área Irradiada 0,2 cm2

Tabela 2 – Protocolo de irradiação LED

LED vermelho LED Infravermelho Parâmetros

Valores Valores

Comprimento de onda 635 nm 945 nm

Densidade de energia (DE) 4 J/cm2 4 J/cm2

Potência 110 mW 120 mW Tempo 41 '' 38 ''

Área Irradiada 1,2 cm2 1,2 cm2


O aparelho laser e LEDs foram cedidos gentilmente pelo professor Dr. Carlos José de

Lima do laboratório de Instrumentação Optobiomédica do Instituto de Pesquisa da Univap.

Foram utilizados dois protocolos de irradiação para o laser e os LEDs: 1) imediatamente, 1ª e

3ª hora após a administração do veneno ou salina (controle); 2) 30 minutos e 3 horas após a

administração do veneno e/ou miotoxinas.

Figura 5: Aparelho Laser de baixa potência

Figura6: Aparelho LED Fonte: Ludmila Guimarães Souza (2007)


Tratamento:

3.6 Avaliação do edema

O veneno de Bothrops jararacussu (0,1 mg/kg) ou toxinas (0,4 mg/kg) foram

injetados, por via i.pl., em uma das patas posteriores dos camundongos. A pata contralateral

recebeu igual volume de salina (controle).

Para a avaliação do edema, o volume das patas posteriores, até a articulação tíbio-

társica, foram medidas antes e 15 e 30 min, e 1, 3, 6 e 24 horas após a administração do


veneno; 15 e 30 min e 1, 3, 6 horas após a administração das miotoxinas, com o auxílio de

pletismógrafo (Plethysmometer Ugo Basile, Itália), de acordo com a técnica descrita por Van

Arman et al., (1965). O aumento percentual das patas foi calculado através da expressão:

(Vf - Vi) E (%) = ------------------- x 100

Vi onde, E (%) = aumento percentual do volume da pata Vi = volume inicial Vf = volume final

Figura 7: Pletismógrafo UGO BASILLE 7140.

Fonte: Danielle Monteiro Pereira (2008).

3.7 Indução da reação inflamatória na cavidade peritoneal de camundongos

O veneno bruto, diluído em solução fisiológica, foi filtrado em filtros esterilizantes, de

poro de 0,22 m de diâmetro e injetado na cavidade peritoneal dos animais (via i.p.), na dose

(0,2 mg/kg) e as miotoxinas nas doses (1,6 mg/kg e 0,8mg/kg) em volume constante de 0,5


mL/cavidade. Os animais dos grupos controles receberam volume equivalente de solução

fisiológica apirogênica, por via i.p..

3.8 Coleta e contagem dos leucócitos

Os leucócitos foram coletados da cavidade peritoneal 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a

injeção i.p. do veneno de B. jararacussu ou solução fisiológica apirogênica e 1, 3 e 6 horas

após a injeção i.p. das miotoxinas, através da lavagem da cavidade peritoneal com 2 mL de

PBS contendo heparina (10 UI/mL). Alíquotas dos lavados foram usadas para a determinação

do número de leucócitos totais em hemocitômetro de Neubauer, em microscópio de luz, após

diluição (1:20, v/v) em líquido de Turk. Para a contagem diferencial das células, preparações

realizadas em citocentrífuga foram coradas com o corante Instant Prov. Foram contadas pelo

menos 100 células, ao microscópio de luz, classificadas como células polimorfonucleares ou

mononucleares, com base em critérios de morfologia convencional.

3.9 Determinação da concentração de prostaglandina E2 (PGE2)

A concentração de PGE2 foi mensurada no líquido peritoneal nos tempos de 1, 3 e 6

horas após a injeção do veneno, toxinas ou salina apirogênica. Os lavados peritoneais foram

coletados, centrifugados a 1000 rpm por 6 min. e o sobrenadante coletado para a

determinação dos níveis de PGE2 por ensaio imunoenzimático específico (EIA). Para isso, o

eicosanóide de cada amostra foi extraído em colunas Sep Pak C18, previamente ativadas com

10 mL de etanol absoluto, seguido de 20 mL de água deionizada. As amostras foram

acidificadas (pH 3,5) com HCl 0,1 N e adicionadas às colunas. Posteriormente, as colunas

foram lavadas com água, etanol-água (35%) e, finalmente, com etanol absoluto para eluição

da PGE2. Os eluatos foram conservados em atmosfera de nitrogênio e posteriormente

ressuspensos em tampão de ELISA e analisados por EIA, utilizando Kit comercial (Kit

monoclonal Prostaglandinas PGE-2 EIA. Caym- 514010-96 wells-LI - Cayman Chemicals).

Alíquotas contendo 50 µl de cada amostra foram adicionados a placas de 96 poços, e


incubados com igual volume de eicosanóide conjugado à acetilcolinesterase e antisoro

específico de coelho. Após a adição do substrato, a absorbância das amostras foi determinada

em leitor de ELISA – 412 nm e as concentrações de PGE2 foram estimadas a partir da curva

padrão específica representadas em ng/mL.

3.10 Análise estatística

Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste de análise de variância a 5%

ANOVA. Os dados coletados foram processados de forma a expressar os resultados em

gráficos.

RESULTADOS

____ Resultados 44

4 Resultados

4.1 Padronização da dose do veneno de B. jararacussu, através da curva dose-resposta

A atividade edematogênica foi avaliada após a injeção intraplantar do veneno de B.

jararacussu, em três doses diferentes (0,04; 0,1 e 0,2 mg/kg, por via i.pl.) ou salina (controle).

A cinética do edema foi avaliada nos tempos 15 e 30 min, 1, 3, 6 e 24 h, após a injeção do

veneno ou salina. A curva temporal do edema induzido pelo veneno de B. jararacussu,

demonstra que o efeito desse veneno é dose-tempo dependente, causando edema já aos 15

min após a sua aplicação intraplantar, seguida de um efeito máximo na 1ª hora, persistindo em

níveis elevados até 6 horas, retornando aos níveis basais em 24 horas (figura 1). Todas as

doses estudadas causaram aumento de formação do edema, sendo que na maior dose (0,2

mg/kg) ocorreu hemorragia. Dessa maneira, para os experimentos seguintes determinou-se a

dose de 0,1mg/kg/i.pl. como a dose edematogênica que melhor caracterizou o edema sem a

presença de hemorragia visível.

0

50

100

150

200

250

0,04 mg/kg

0,1 mg/kg

0,2 mg/kg

15 30 60 180 360 1440

Tempo (min)

Ed

ema

(%)

Figura 1: Decurso temporal da resposta edematogênica induzida pelo veneno de B. jararacussu na pata de camundongos. O edema foi avaliado por pletismografia após a injeção i.pl do veneno (0,04; 0,1 e 0,2 mg/kg) ou solução fisiológica (controle). O edema foi expresso como aumento percentual do volume em relação à pata controle. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais.

____ Resultados 45

4.2 Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II na formação do edema de pata em camundongos.

A atividade edematogênica foi avaliada após a injeção intraplantar do veneno de B.

jararacussu (0,1 mg/kg) e das Bothropstoxinas I e II (0,4 mg/kg), isoladas deste veneno. A

dose utilizada para as miotoxinas tiveram como base os estudos de Pereira et al (2009), que

verificaram que essas miotoxinas, nessas doses, induziram edema de pata em camundongos.

O veneno e as miotoxinas induziram um aumento do edema podal que foi significativamente

maior que o controle a partir dos 30 minutos e se manteve diferente do controle até 6 horas

após sua injeção. A BthTX II causou um aumento significativamente maior, no tempo de 3

horas, quando comparado com a BthTX I e o veneno (figura 2).

0

50

100

150

200

Controle

VBjussu - 0,1 mg/kg

BthTX I - 0,4 mg/kg

*

*

**

*

#

15 30 60 180 360

BthTX II - 0,4 mg/kg

*+

*

Tempo (min)

Ed

em

a (

%)

Figura 2: Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II na formação do edema de pata em camundongos. O veneno, miotoxinas e/ou controle salina, foram injetados no músculo plantar de camundongos. O edema foi avaliado por pletismografia e expresso como aumento percentual do volume da pata direita em relação à pata esquerda (controle). Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais *p<0,05 em relação ao controle; #p<0,05 quando comparado com o veneno; +p<0,05 quando comparado com o veneno e a Bothropstoxina I (ANOVA).

____ Resultados 46

4.3 Efeito do Laser de baixa potência e dos LEDs no edema induzido pelo veneno de B. jararacussu em camundongos

Para melhor avaliar a eficácia do laser no tratamento do edema induzido pelo veneno de

B. jararacussu, foram utilizados dois protocolos experimentais, no qual o laser foi aplicado

em diferentes tempos. No primeiro protocolo, o laser e os LEDs foram aplicados em três

tempos (imediatamente, 1 e 3 horas após a injeção do veneno), onde houve redução no pico

máximo de formação do edema (1 h) na ordem de 56% com o Laser 635 nm, 76% com o LED

945 nm (infravermelho) e 26% com o LED 635 nm (vermelho) (figura 3A), no segundo

protocolo, o laser e LEDs foram aplicados em dois tempos (30 minutos e 3 horas após a

injeção do veneno), onde também houve uma redução significativa na ordem de 39%, 41% e

46% com o Laser, LED infravermelho e LED vermelho, respectivamente (figura 3B). No

acidente ofídico, dificilmente o paciente chega ao local de atendimento logo após o acidente,

assim sendo, para os experimentos seguintes, o segundo protocolo, com a irradiação laser e

LEDs, 30 minutos e 3 horas após a injeção do veneno ou miotoxinas, foi o escolhido pois

seria o que melhor caracteriza o acidente ofídico.

0

50

100

150

200

VBjussu - 0,1 mg/kg

Ven + Laser 685 nm

Ven + LED 945 nm

Ven + LED 635 nm

15 30 60 180 360

*

*

**

*

A

Tempo (min)

Ed

em

a (

%)

0

50

100

150

200

15 30 60 180 360

*

*

VBjussu - 0,1 mg/kgVen + Laser 685 nmVen + LED 945 nmVen + LED 635 nm

Tempo (min)

Ed

em

a (

%)

B

Figura 3: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs no edema induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu. A terapia com o laser e os LEDs foram aplicadas diretamente no local da injeção de veneno e/ou solução salina. O edema foi avaliado por pletismografia e expresso como aumento percentual do volume da pata direita em relação à pata esquerda (controle). A figura (A) mostra os resultados da irradiação laser e LEDs com três aplicações através da fibra óptica: imediatamente, 1 e 3 horas após a injeção do veneno. A figura (B) mostra os resultados da irradiação laser e LEDs com duas aplicações através da fibra óptica: 30 minutos e 3 horas após a injeção do veneno. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação ao veneno (ANOVA).

____ Resultados 47

4.4 Efeito do Laser de baixa potência e dos LEDs no edema induzido pela Bothropstoxina I e II em camundongos.

O efeito do tratamento com o laser e LEDs sobre o edema induzido pelas

Bothropstoxinas I e II (0,4 mg/kg), foi avaliado no período de 6 horas após sua injeção. Os

resultados demonstram que o Laser e LEDs reduzem significativamente o edema induzido no

pico máximo do edema causado pela Bothropstoxina I (BthTX-I), na ordem de 49%, 54% e

67% (figura 4A), e para a Bothropstoxina II (BthTX-II) (figura 4B), na ordem de 51%, 61% e

58% com o Laser 685 nm, LED 945 nm (infravermelho) e LED 635 nm (vermelho),

respectivamente.

0

50

100

150

BthTX I - 0,4 mg/kgBthTX + Laser 685 nmBthTX + LED 945 nmBthTX + LED 635 nm

15 30 60 180 360

*

*

*

*

Tempo (min)

Ed

ema

(%)

A

0

50

100

150

15 30 60 180 360

*

**

BthTX II - 0,4 mg/kgBthTX II + Laser 685 nmBthTX II + LED 945 nmBthTX II + LED 635 nm

Tempo (min)

Ed

ema

(%)

B

Figura 4: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na redução do edema induzido pela Bothropstoxina I e II. A terapia laser e LEDs foram aplicadas diretamente no local da injeção da Bothropstoxina I ou II (0,4 mg/kg) e/ou solução salina. O edema foi avaliado por pletismografia e expresso como aumento percentual do volume da pata direita em relação à pata esquerda (controle). A figura (A) mostra os resultados da irradiação laser e LEDs sobre o edema induzido pela Bothropstoxina I. A figura (B) mostra os resultados da irradiação laser e LEDs sobre o edema induzido pela Bothropstoxina II. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação as Bothropstoxinas (ANOVA).

____ Resultados 48

4.5 Perfil temporal do influxo leucocitário induzido pelo veneno de B. jararacussu na cavidade peritoneal de camundongos.

A caracterização da reação inflamatória induzida pelo veneno de B. jararacussu foi feita

após a injeção intraperitoneal deste veneno (0,2 mg/kg/i.p.). A cinética da migração de

leucócitos foi avaliada nos tempos 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração do veneno ou

solução fisiológica (controle). A curva temporal da migração celular mostra que o veneno de

B. jararacussu causou aumento significativo da concentração de leucócitos na sexta hora.

(figura 5).

Total

0

5

10

15

20

Controle

VBjussu - 0,2 mg/kg

1 3 6 12 24

*

Tempo (h)

*

*

nº

célu

las

x 10

6/m

L

PMN

0

5

10

15

20

*

1 3 6 12 24

Tempo (h)

*

nº

célu

las

x 10

6/m

L

MN

0

5

10

15

20

Tempo (h)

1 3 6 12 24

nº

célu

las

x 10

6/m

L

* *

*

Figura 5: Perfil temporal da migração de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos após a injeção do veneno de Bothrops jararacussu. O veneno foi injetado na cavidade peritoneal dos camundongos na dose de 0,2 mg/kg via i.p. O total de leucócitos, polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) foi determinada através da contagem de células obtidas do lavado peritoneal nos tempos de 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a injeção do veneno de Bothrops jararacussu e/ou solução salina (controle), conforme descrito em Materiais e Métodos. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação ao veneno (ANOVA).

____ Resultados 49

4.6 Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II no influxo leucocitário no peritônio de camundongos.

A migração celular foi avaliada após a injeção intraperitoneal do veneno de B.

jararacussu (0,2 mg/kg/i.p.) e das Bothropstoxina I e II (1,6 e 0,8 mg/kg/i.p.,

respectivamente). A figura 6A demonstra que tanto o veneno (11,590±1,26x106/mL), quanto

as Bothropstoxinas I (7,240±1,02x106/mL) e II (11,079±0,83x106/mL) isoladas do veneno de

B. jararacussu causaram influxo de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos

que foi significativamente diferente do controle (salina) (3,8±0,22x106/mL). A BthTX I

causou influxo leucocitário significativamente menor quando comparado com o veneno e a

BthTX II. A contagem diferencial mostra que as células polimorfonucleares são as

predominantes na 6ª hora após a injeção do veneno ou miotoxinas (figura 6B), VBjussu

(7,146±1,24 x106/mL), Bothropstoxinas I (3,920±1,05 x106/mL) e II ( 6,094±0,99 x106/mL),

controle (0,584±0,21 x106/mL). A figura 6C demostra que somente a Bothropstoxina II

causou um aumento das células mononucleares (MN): VBjussu (4,443±0,51 x106/mL),

Bothropstoxinas I (4,017±0,77 x106/mL) e II ( 4,985±0,36 x106/mL) e controle (3,181±0,39

x106/mL).

____ Resultados 50

0

5

10

15

Controle

VBjussu - 0,2 mg/kg

BthTX I - 1,6 mg/kg

BthTX I I - 0,8 mg/kg

6 horas

**

#

*

Total

nº

célu

las

x 10

6/m

L

A

PMN

0

5

10

15

6 horas

*

*

*

nº

célu

las

x 10

6 /mL

B

MN

0

5

10

15

nº

célu

las

x 10

6/m

L

*

6 horas

C

Figura 6: Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II no influxo leucocitário no peritôneo de camundongos. Os animais receberam injeção i.p. do veneno, miotoxinas ou salina, Decorrido 6 h, efetuou-se a lavagem da cavidade peritoneal para a contagem de A: leucócitos totais, B: polimorfonucleares (PMN) e C: mononucleares (MN). Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação ao controle; #p<0,05 quando comparado com o veneno e com BthTX II (ANOVA).

____ Resultados 51

4.7 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pelo veneno de B. jararacussu.

Foram utilizados o laser e os LEDs, conforme descrito em Materiais e Métodos, para

determinar a sua capacidade de redução sobre a migração de leucócitos, induzida pelo veneno

de B. jararacussu (0,2 mg/kg/i.p). O Laser e os LEDs reduziram o número de leucócitos na

cavidade peritoneal de camundongos na 6ª hora de aplicação do veneno: 11,6±1,26 x 106/mL;

2,2±0,19 x 106/mL (Laser 685 nm); 3,4±0,45 x 106/mL (LED 945 nm); 2,8±0,41 x 106/mL

(LED 635 nm) (figura 7A). A contagem diferencial mostrou que tanto o laser quanto os LEDs

reduziram significativamente o influxo de leucócitos polimorfonucleares (PMN): 7,146 ± 1,24

x 106/mL (VBjussu); 0,818±0,12 x 106/mL (Laser 685 nm); 0,737±0,20 x 106/mL (LED 945

nm); 1,131±0,30 x 106/mL (LED 635 nm) (figura 7B). A figura 7C mostra que o laser e os

LEDs também causaram uma redução das células mononucleares (MN): 4,443±0,51 x

106/mL; 1,465±0,25 x 106/mL; 2,652±0,33 x 106/mL; 1,659±0,16 x 106/mL, para o VBjussu,

Laser 685 nm; LED 945 nm e LED 635 nm, respectivamente.

____ Resultados 52

Total

0

5

10

15VBjussu - 0,2 mg/kg

Ven + Laser 685 nm

Ven + LED 945 nm

Ven + LED 635 nm

** *

6 horas

nº

célu

las

x 10

6/m

L

A

PMN

0

5

10

15

* **

nº

célu

las

x 10

6/m

L

6 horas

B

MN

0

5

10

15

* **

6 horas

nº

célu

las

x 10

6 /mL

C

Figura 7: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu. Os animas receberam injeção i.p. do veneno. Decorrida 6 h, efetuou-se a lavagem da cavidade peritoneal para a contagem de A: leucócitos totais, B: polimorfonucleares (PMN) e C: mononucleares (MN). A terapia laser e os LEDs foram aplicados diretamente no local da injeção do veneno. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação ao veneno (ANOVA).

____ Resultados 53

4.8 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzida pela Bothropstoxina I.

Como terapia alternativa no tratamento da reação inflamatória induzida pela

Bothropstoxina I, o laser e os LEDs foram utilizados conforme descrito em Materiais e

Métodos. A figura 8A mostra que o Laser e os LEDs causaram a redução de leucócitos totais

na cavidade peritoneal de camundongos, na 6ª hora após a injeção da BthTX I (7,240±1,06 x

106/mL); 3,840±0,27 x 106/mL (Laser 685 nm); 3,000±0,12 x 106/mL (LED 945 nm);

3,460±0,10 x 106/mL (LED 635 nm). A contagem diferencial mostrou que tanto o laser

quanto o LED reduziram significativamete o influxo de polimorfonucleares (PMN):

4,919±0,48 x 106/mL (BthTX I); 2,270±0,46 x 106/mL (Laser 685 nm); 0,831±0,06 x 106/mL

(LED 945 nm); 1,422±0,23 x 106/mL (LED 635 nm), sendo que o tratamento com LED

Infravermelho foi mais eficiente quando comparado com o tratamento com o Laser (figura

8B); e leucócitos mononucleares (MN): 4,017±0,77 x 106/mL; 1,780±0,33 x 106/mL;

2,199±0,08 x 106/mL; 2,038±0,21 x 106/mL; para a BthTX I, Laser 685 nm, LED 945 nm e

LED 635 nm, respectivamente (figura 8C).

____ Resultados 54

Total

0

2

4

6

8

10

BthTX I - 1,6 mg/kg

BthTX I + Laser 685 nm

BthTX I + LED 945 nm


***

6 horas

nº

célu

las

x 10

6/m

L

A

PMN

0

2

4

6

8

10

*

**#n

º cé

lula

s x

106/m

L6 horas

B

MN

0

2

4

6

8

1 0

* * *

6 horas

nº

célu

las

x 10

6/m

L

C

Figura 8: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pela BthTX I. Os animas receberam injeção i.p. da BthTX I. Decorrida 6 h, efetuou-se a lavagem da cavidade peritoneal para a contagem de A: leucócitos totais, B: polimorfonucleares (PMN) e C: mononucleares (MN). A terapia laser e os LEDs foram aplicados diretamente no local da injeção do veneno. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação a BthTX I; #p<0,05 quando comparado com o tratamento Laser. (ANOVA).

____ Resultados 55

4.9 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzida pela Bothropstoxina II isolada do veneno de Bothrops jararacussu.

Como terapia alternativa no tratamento da reação inflamatória induzida pela

Bothropstoxina II isolada do veneno de Bothrops jararacussu, o laser e os LEDs foram

utilizados conforme descrito em Materiais e Métodos. O Laser e os LEDs causaram a redução

de leucócitos totais na cavidade peritoneal de camundongos, na 6ª hora após a injeção da

BthTX II (11,079±0,83 x 106/mL); 6,319±0,06 x 106/mL (Laser 685 nm); 4,269±0,12 x

106/mL (LED 945 nm); 6,170±0,33 x 106/mL (LED 635 nm) (figura 9A). A contagem

diferencial mostrou que tanto o laser quanto os LEDs reduziram significativamete o influxo

de polimorfonucleares (PMN): 6,094±0,99 x 106/mL (BthTX II); 2,762±0,86 x 106/mL (Laser

685 nm); 1,347±0,11 x 106/mL (LED 945 nm); 3,192±0,20 x 106/mL (LED 635 nm) (figura

9B) e leucócitos mononucleares (MN): 4,985±0,36 x 106/mL; 3,663±0,45 x 106/mL;

2,922±0,14 x 106/mL e 2,946±0,38 x 106/mL, para a BthTX II, Laser 685 nm, LED 945 nm e

LED 635 nm, respectivamente (figura 9C).

____ Resultados 56

Total

0

5

10

15


BthTX I I + Laser 685 nm

BthTX I I + LED 945 nm


*

*

*

6 horas

A

nº

célu

las

x 10

6/m

L

PMN

0

5

10

15

*

*

*

6 horas

nº

célu

las

x 10

6/m

L

B

MN

0

5

10

15

**

6 horas

nº

célu

las

x 10

6/m

L

C

Figura 9: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pela BthTX II. Os animas receberam injeção i.p. da BthTX II. Decorrida 6 h, efetuou-se a lavagem da cavidade peritoneal para a contagem de A: leucócitos totais, B: polimorfonucleares (PMN) e C: mononucleares (MN). A terapia laser e os LEDs foram aplicados diretamente no local da injeção do veneno. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação a BthTX II (ANOVA).

____ Resultados 57

4.10 Efeito do Laser e do LED infravermelho sobre a liberação de PGE2 induzida pelo veneno de B. jararacussu e pela Bothropstoxina I e II.

A PGE2 é um mediador importante para a formação de edema e esta relacionada ao

aumento da hiperalgesia, dessa maneira, a concentração de PGE2 na cavidade peritoneal dos

camundongos foi avaliada no sobrenadante do lavado peritoneal coletado 1, 3 e 6 horas da

injeção i.p. do veneno ou miotoxinas.

A Figura 10A mostra que o tratamento dos animais com o laser ou o LED causou um

aumento significativo da concentração de PGE2 1 hora da injeção i.p. do veneno de B.

jararacussu, se comparado ao grupo veneno sem tratamento. No período de 3 e 6 horas não

houve diferença significativa entre os grupos. A bothropstoxina I causou um aumento da

concentração de PGE2 no período de 1 hora da injeção i.p da miotoxina, no período de 3 horas

houve uma significativa redução desse mediador, tanto para o tratamento com o laser quanto

para o LED, no período de 6 horas não houve diferença significativa da concentração da PGE2

(figura 10B).

A figura 10C mostra que o tratamento com o laser ou LED não causou mudança

significativa na concentração da PGE2 após a injeção de bothropstoxina II em nenhum

período de tempo estudado.

____ Resultados 58

0

5

10

15

20

25

VBjussu - 0,2 mg/kg

Ven + Laser 685 nm

Ven + LED 945 nm

*

A

*PG

E2

(ng

/mL

)

0

5

10

15

20

25

BthTX I - 1,6 mg/kg

BthTX I + Laser 685 nm


* *

**

B

PG

E2

(ng

/mL

)

0

5

10

15

20

25


BthTX I I + Laser 685 nm


1 3 6

Tempo (h)

C

PG

E2

(ng

/mL

)

Figura 10: Efeito do Laser e do LED infravermelho na liberação de PGE2 induzida pelo veneno de B. jararacussu e pelas BthTX I e II. Os animais receberam injeção i.p. de VBjssu ou BthTX I ou II). A concentração de PGE2 foi avaliada por EIA, em lavados peritoneais coletados 1, 3 e 6 horas após as injeções. A terapia laser e o LED foram aplicados diretamente no local da injeção do veneno ou miotoxinas. Os dados representam a média E.P.M. de 4-5 animais. *p< 0,05 relação ao veneno (ANOVA).

DISCUSSÃO

_____ Discussão 60

5 Discussão

A serpente jararacussu pertence ao gênero Bothrops sendo uma espécie de serpente

viperídica muito encontrada no sudeste do Brasil, sul da Bolívia, no leste do Paraguai e norte

da Argentina (CAMPBELL; LAMAR, 1989). O envenenamento pelas serpentes deste gênero

induzem um quadro fisiopatológico caracterizado por efeitos locais e sistêmicos, devido às

diferentes enzimas e toxinas presentes neste veneno (OWNBY et al., 1982; GUTIERREZ;

LOMONTE, 1995; TREBIEN; CALIXTO, 1989). Dentre estas enzimas estão as fosfolipases

A2, largamente presentes nos venenos das serpentes. Estas enzimas têm a habilidade de

causar rápida necrose das fibras do músculo esquelético, sendo portanto, reportadas como

PLA2 miotóxicas (HARRIS; CULLEN, 1990). Além disto, desde a descoberta das

fosfolipases A2 como enzimas-chave na liberação do ácido araquidônico, substrato para a

biosíntese de vários mediadores lipídicos da inflamação, como prostaglandinas e leucotrienos,

muito interesse foi demonstrado por esta família de enzimas no estudo da inflamação

(TEIXEIRA et al., 2003).

A picada pela serpente Bothrops jararacussu frequentemente produz um pronunciado

envenenamento local e sistêmico, sendo que as principais causas de óbitos estão relacionadas

aos efeitos sistêmicos, como choque, hemorragia sistêmica e falência renal (MILANI

JUNIOR et al., 1997). Embora a inflamação local seja uma característica proeminente do

envenenamento por picadas de serpentes viperidícas entre outras (DENNIS, 1994), os efeitos

locais não são neutralizados pelo uso do antiveneno convencional (CAMEY et al., 2002).

Em geral, em envenenamentos botrópicos observa-se no local da picada edema intenso

(ROSENFELD, 1971) e em picada de serpentes, o edema é o resultado da síntese de potentes

autacóides ou eicosanóides provocada por componentes enzimáticos do veneno, bem como

por danos na microcirculação com extravasamento do plasma e a liberação de citocinas

(NÚÑEZ et al., 2004). O estudo desta reação local no envenenamento reveste-se de

importância, visto que a formação do edema resulta em quadros álgicos por promover a

distenção dos tecidos adjacentes atingindo assim terminações nociceptivas aí presentes,

quando não promove a perda do membro afetado devido à síndrome compartimental em que o

quadro pode evoluir para necrose (ROSENFELD, 1971).

Nosso resultado, demonstrou que, em camundongos, o veneno de B. jararacussu na

dose de 0,1 mg/kg/i.pl., causou a formação do edema de forma dose-tempo dependente, com

_____ Discussão 61

resposta máxima em 1 hora. Este perfil temporal apresenta características análogas aos dados

obtidos por Pereira et al (2009) ao investigar a atividade edematogênica induzida pelo veneno

da B. jararacussu em camundongos, e também, outros autores obtiveram dados semelhante,

como Olivo et al (2007), que demonstraram a formação do edema podal máxima entre 30 min

e 1 hora após a administração do veneno de B. asper e B. jararaca, respectivamente. Também

as PLA2 administradas exógenamente podem gerar respostas inflamatórias locais, e esta

habilidade das PLA2s, foi reportada primeiramente por Brain e Whittle (1977), eles

mostraram que a PLA2s isoladas dos venenos de Vipera russelli e Crotalus durissus terrificus,

induzem edema de pata em ratos e liberação de histamina por mastócitos in vitro. De acordo

com Andrião-Escarso et al (2000), foram purificadas do veneno de Bothrops jararacussu, as

miotoxinas Bothropstoxin I (BthTX-I) e a Bothropstoxin II (BthTX-II). Desde que foram

isoladas do veneno de Bothrops jararacussu a BthTX-I e a BthTX-II têm sido intensamente

investigadas. Landucci et al (1998), mostraram que as PLA2 Lys 49 e Asp 49 (BthTX-I e

BthTX-II, respectivamente) isoladas do veneno de B. jararacussu induzem edema de pata e

de pele em ratos. No presente estudo, dados semelhantes foram obtidos, ao verificarmos que

as miotoxinas administradas na dose de 0,4 mg/kg/i.pl, causaram um proeminente efeito

edematogênico no músculo plantar de camundongos.

A permeabilidade vascular aumentada e o edema estão entre os eventos mais precoces

da resposta inflamatória, seguida pela infiltração dos leucócitos. Estes eventos são iniciados e

mantidos por uma sequência de mediadores inflamatórios de origem celular e plasmática

(VANE, 1993).

A infiltração de leucócitos para o foco inflamatório foi outro evento importante da

resposta inflamatória avaliada neste estudo. Na infiltração de leucócitos, leucócitos

circulantes – neutrófilos, linfócitos, monócitos e eosinófilos – migram, seletivamente e em

número significativo, para o tecido inflamado (ALBELDA et al., 1994). Nos estágios iniciais

de uma resposta inflamatória aguda, há acúmulo predominantemente de neutrófilos

(ISSEKUTZ; MOVAT, 1980). Estas células representam a primeira linha de defesa do

organismo e apresentam uma alta capacidade fagocitária e microbicida para a eliminação e/ou

neutralização do agente agressor. Os leucócitos mononucleares são observados na fase mais

tardia dessa resposta e em processos crônicos (ISSEKUTZ et al., 1981). A infiltração de

leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos) em tecidos inflamados é um sinal da reação

inflamatória aguda e tambem reflete uma resposta imunológica primária a invasão de

patógenos (BEZERRA et al., 2007).

_____ Discussão 62

Para avaliar o influxo leucocitário induzido pelo veneno de B. jararacussu na dose de

0,2 mg/kg, fizemos uma cinética da migração de leucócitos onde houve avaliações nos

tempos 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração do veneno ou solução fisiológica

(controle). A curva temporal da migração celular mostrou que o veneno de B. jararacussu

causou aumento significativo da concentração de leucócitos na sexta hora, e estes dados são

semelhantes aos obtidos por Zamuner et al (2001), que ao estudar o influxo de leucócitos

induzido pelo veneno da B. asper e B.jararaca nessa mesma dose, verificaram que esses

venenos causaram aumento da concentração de leucócitos na sexta e na décima segunda hora,

respectivamente. Também Pereira et al (2009), demostraram que o veneno da B. jararacussu

causa influxo de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos, com predomínio

dessas células na sexta hora, dados estes que corroboram com nosso resultado. Neste estudo,

também foi avaliado o influxo de leucócitos induzido pela BthTX-I e BthTX-II. As doses

utilizadas para as Bothropstoxina I (1,6 mg/Kg) e Bothropstoxina II (0,8 mg/Kg), bem como o

tempo de 6 horas para avaliação da migração celular foram baseados nos estudos de Zuliani et

al, 2005 (que mostrou um aumento da migração de leucócitos, causado pelas miotoxinas MT-

II e III, isoladas do veneno de B. asper, nestas doses). Nossos resultados demonstraram que

tanto a BthTX-I, destituída de atividade enzimática quanto a BthTX-II, enzimaticamente

ativa, foram capazes de induzir o influxo de leucócitos para o local de sua injeção. A literatura

documenta a presença de infiltrados de polimorfonucleares e mononucleares após a injeção de

PLA2 miotóxicas dos venenos de Bothrops nummifer (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989) e

Bothrops jararacussu (GUTIÉRREZ et al., 1991) em músculo esquelético de camundongos, e

após a administração intrapleural de miotoxinas similares, isoladas dos venenos de Bothrops

jararacussu e Bothrops pirajai (CASTRO et al., 2000). Desse modo, é possível sugerir que as

PLA2 presentes nesses venenos contribuam para tal efeito e que a BthTX-I e BthTX-II sejam

um fator relevante para o recrutamento leucocitário evocado pelo veneno de B. jararacussu.

O Laser de Baixa Potência (LBP) vêm ganhando espaço como alternativa de

tratamento antiinflamatório por oferecer vantagens à terapia medicamentosa devido aos

menores efeitos adversos produzidos por esta terapia física (ALBERTINI, 2006), e por ser

uma terapia efetiva na dor inflamatória e não inflamatória (KAMIKAWA, 1989;

HONMURA, 1992), não somente reduzindo o processo inflamatório, como também

melhorando a reparação tecidual de uma maneira mais eficiente do que o uso de corticóides

(BJORDAL et al., 2006). Embora a literatura descreva o efeito da terapia com LBP sobre

_____ Discussão 63

doenças inflamatórias, o seu mecanismo de ação antiinflamatória ainda é pouco explorado

(AL-WATBAN, 1999; CAMPANA et al., 1998; MIZUTANI et al., 2004).

Atualmente os LEDs (Light Emitting Diodes) estão sendo investigados na área

biológica como alternativa para terapias que utilizam LBP, tendo em vista o seu baixo custo,

praticidade e baixo consumo de energia (KARU, 2007; ANDRADE et al., 2001). Dessa

forma, neste trabalho, propusemos o tratamento de grupos de animais com o LBP e LED,

para avaliar o efeito destes na redução do processo inflamatório caracterizado pela formação

do edema podal e da migração leucocitária induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu ou

suas miotoxinas, em camundongos.

Quando utilizamos o aparelho laser, temos de escolher o comprimento de onda e

ajustar alguns parâmetros para obter os efeitos fisiológicos desejados. Dos parâmetros que

descrevem o laser, o comprimento de onda é extremamente importante, pois é ele quem

define a profundidade de penetração no tecido alvo (FULLER, 1983). Segundo Basford

(1989); Yew; Ling; Chan (1982), a densidade de energia é o parâmetro mais importante, pois,

esta determina a energia entregue ao tecido biológico, uma vez que a resposta fisiológica é

dose-dependente. Neste estudo, o Laser utilizado foi o Arseneto de Gálio (Ga-As), na região

do vermelho (685 nm) com densidade de energia de 2,2 J/cm2 e os LEDs utilizados, um na

região do vermelho (635 nm) e o outro na região do infravermelho próximo (945 nm), ambos

com uma densidade de 4 J/cm2. A escolha destes parâmetros foram feitas com base na

literatura que mostra que a irradiação mais efetiva está na escala do vermelho e infravermelho

próximo ao espectro onde as fontes mais utilizadas são o laser de helio-neôneo (HeNe com

radiação até 632,8 nm), laser Galio-Alumíneo (Ga-Al – 630-685nm), laser Arseneto de helio-

neôneo (He-Ne-As – 780-870 nm) e o laser Arseneto de Galio (Ga-As – 904 nm), assim como

para o LED, onde a faixa de emissão se encontra em uma larga região do espectro (670 a 950

nm) (KARU, 2003). A principal razão para se utilizar diferentes irradiações na região do

vermelho e infravermelho próximo, está no fato de que a hemoglobina não absorve nesta

região e a luz pode penetrar profundamente no tecido (VLADIMIROV et al.; 2004). Na

literatura, encontramos diversos estudos prévios que descrevem diferentes densidades de

energia utilizadas em diferentes afecções, como exemplo, densidade de energia de 1 a 3 J/cm2

(efeito antiinflamatório) e de 2 a 4 J/cm2 (efeito antiálgico) (COLLS, 1984). Lopes-Martins et

al (2005), constataram que o LBP foi capaz de reduzir a migração de células inflamatórias

(neutrófilos) para o lavado pleural, quando os animais foram tratados com o LBP com

densidades de energia de 3, 7,5 e 10 J/cm2. Também no que diz respeito aos tempos da

_____ Discussão 64

aplicação da radiação LBP e LED, encontramos na literatura diferenças, como por exemplo,

Barbosa et al (2008), estudando o efeito do LBP na resposta inflamatória induzida pelo

veneno de B. jararacussu, aplicou a irradiação laser imediatamente, 1, 3 e 12 horas após a

administração do veneno e ainda Morais et al (2008), estudando o efeito antiinflamatório do

LBP e LED em osteoartrite induzida por zymosan em ratos, aplicou a irradiação laser e LED,

imediatamente, 1 e 2 horas após a administração do zymosan. Todos estes dados comprovam

que na laserterapia encontram-se ainda muitos parâmetros em fase de análise experimental

para a aplicação em cada afecção específica, justificando, assim, as densidades de energia e os

tempos de irradiação utilizados neste trabalho. Vale lembrar que, neste estudo, aplicamos a

irradiação laser e LEDs imediatamente, 1 e 3 horas após a administração do veneno bruto de

B. jararacussu, com base nos tempos encontrados na literatura. Posteriormente determinou-se

que seria aplicada a irradiação laser e LEDs nos tempos de 30 minutos e 3 horas após a

administração do veneno bruto ou miotoxinas isoladas do veneno da serpente B .jararacussu,

tendo em vista que, embora seja importante o atendimento precoce, dificilmente este ocorre

imediatamente à picada, devido a alguns fatores como a distância da zona rural (onde ocorre

o maior número de acidentes), que leva ao atendimento depois de um longo tempo da

ocorrência do mesmo e a dificuldade de acesso aos serviços de saúde (BRASIL.

MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).

Para verificar se o LBP e os LEDs eram capazes de reduzir o edema no músculo

plantar de camundongos, avaliamos esse efeito no decorrer de 6 h após a injeção de B.

jararacussu ou miotoxinas, sendo que o pico do edema foi em 1 hora para ambos. Nossos

resultados demonstraram claramente que a radiação laser e LEDs nos parâmetros utilizados

diminuem significativamente o edema da primeira até a terceira hora da inflamação, quando

aplicados imediatamente, 1 e 3 horas após a administração do veneno, promovendo uma

redução do pico de formação de edema pelo veneno na ordem de 56% com o Laser 685 nm;

76% com o LED 945 nm (infravermelho) e 26% com o LED 635 nm (vermelho). Também

quando feita somente duas aplicações, houve significativa redução do edema no pico de

formação do edema pelo veneno na ordem de 39% com o Laser 685 nm; 41% com o LED 945

nm (infravermelho) e 46% com o LED 635 nm (vermelho). Honmura et al (1992), estudando

o modelo inflamatório de pata induzido por carragenina, mostraram um redução do edema de

20-30%, ao analisar o efeito terapêutico do LBP (AsGaAl). Em relação às miotoxinas, os

resultados da redução do edema também foram muito significativos sendo que, o LBP e os

LEDs apresentaram efeito antiinflamatório, causando redução do edema no pico de formação

_____ Discussão 65

do edema pela Bothropstoxina I (BthTX I), na ordem de 49, 54 e 67% , e para a

Bothropstoxina II (BthTX II), na ordem de 51, 61 e 58% para o Laser, LED infravermelho e

LED vermelho respectivamente. Barbosa et al (2010), investigou a capacidade da terapia laser

de reverter o efeito local ocasionada pelas miotoxinas (BthTX I e II) isoladas do veneno de B.

jararacussu e constatou que ambas as toxinas causaram um proeminente efeito

edematogênico no músculo gastrocnêmio de camundongos e que a terapia laser foi capaz de

reduzir este efeito, dados estes que corroboram com nossos resultados. Alguns autores

sugerem que os componentes celulares (fotorreceptores) podem absorver fótons fornecidos

através da energia do LBP e acelerar a produção do ATP, fornecendo assim, energia para a

célula modulando a resposta inflamatória (BREITBART et al., 1996; LUBART et al., 2005;

MANTEIFEL et al., 1997).

A prostaglandina E2 (PGE2) é um dos mediadores-chave da inflamação aguda e a

inibição desse mediador, através da inibição da COX-2, é amplamente usado como opção de

tratamento em diversos doenças inflamatórias (EGAN et al., 2002). De acordo com a

literatura, a terapia laser age reduzindo os níveis de PGE2 e a expressão de COX-2 (SHIMIZU

et al., 1995; CAMPANA et al., 1998). Ainda, Olivo et al., (2007) relataram que os venenos

de B. jararaca e B. asper causam a formação de edema podal e que este aumento é devido, ao

menos em parte, ao aumento da concentração de PGE2, via expressão de COX-2, no músculo

plantar. Ademais, o veneno de B. jararaca causa um aumento da concentração deste mediador

no peritôneo dos animais (MOREIRA et al., 2007). Neste sentido, avaliamos a capacidade do

laser e do LED de inibir a liberação de PGE2 causada pelo veneno e pelas miotoxinas. Nossos

resultados mostraram que o laser foi capaz de inibir a liberação de PGE2 somente no período

de 3 horas após a injeção de Bothropstoxina I. O tratamento com o laser e o LED causou

aumento desse mediador no período de 1 h quando o veneno e a Bothropstoxina I foram

injetados, nos demais períodos não houve diferença significativa entre os grupos estudados. É

possível que nos períodos iniciais da resposta inflamatória causada pelo veneno, o laser

causou um aumento de ATP e consequente aumento da produção de mediadores. Ainda, o

tratamento com o laser e LED foram capazes de inibir a migração de neutrófilos para o

peritônio. Pode ser, que as células responsáveis pela liberação de PGE2 sejam os neutrófilos,

e por esse motivo não conseguimos detectar esse mediador. A falta de inibição por parte do

laser e LED não exclui a possibilidade do laser e LED inibirem esse mediador quando

iniciado o tratamento em períodos mais precoces, vale lembrar que utilizamos o tratamento 30

minutos após a injeção do veneno, hipótese que necessita estudos adicionais.

_____ Discussão 66

Os efeitos do LBP e dos LEDs foram avaliados quanto à migração celular para a

cavidade peritoneal do camundongo. Nossos resultados demonstraram claramente que a

radiação laser e LEDs na mesma dosagem anteriormente utilizada, diminuem

significativamente a migração de leucócitos polimorfonucleares na sexta hora de inflamação,

quando aplicados 30 minutos e 3 horas após a administração do veneno no peritôneo de

camundongos na ordem de 88, 90 e 84% e no pico máximo de migração causado pela

Bothropstoxina I (BthTX I), na ordem de 54, 83 e 70% , e para a Bothropstoxina II (BthTX

II), na ordem de 55, 78 e 48% para o Laser 685 nm, LED 945 nm (infravermelho) e LED 635

nm (vermelho) respectivamente. Estes dados nos levam a sugerir que o Laser e os LEDs

inibem mais algum componente do veneno, além da miotoxinas, pois a redução do influxo

leucocitário pelo Laser e LED foi maior para o veneno bruto de B. jararacussu do que para

estas miotoxinas.

A migração de leucócitos da circulação para o tecido requer diferentes fatores, tais

como: moléculas de adesão, da família das selectinas, integrinas e imunoglobulinas. A

ativação e a ''up-regulação'' dos membros da família CD integrinas (CD 11/CD 18) são a

chave da ligação das moléculas de adesão intracelular (ICAM 1 e 2) na superfície das células

endoteliais (PETERS et al., 2006; MIZGERD et al., 1997), assim é possível que a eficácia da

terapia com o LBP sobre o modelo de inflamação aguda possa estar relacionada ao efeito do

laser sobre algum dos eventos relacionados as moléculas de adesão (ALBERTINI, 2006). Um

outro possível mecanismo de ação para o LBP sobre o processo inflamatório pode estar

relacionado à modulação no mecanismo de produção de citocinas inflamatórias liberados

pelas células já presentes no tecido e as que migram para o foco da lesão, essa hipótese ainda

requer estudos adicionais.

Portanto, os dados apresentados vêm reforçar o benefício que o LBP e LED oferecem

como terapia alternativa no tratamento do envenenamento botrópico.

CONCLUSÃO

_____ Conclusão 68

6 Conclusão

O veneno bruto de B. jararacussu e as miotoxinas (BthTX-I e BthTX-II), nas doses

utilizadas, foram capazes de induzir uma intensa atividade edematogênica em pata de

camundongos.

O veneno e as miotoxinas (BthTX-I e BthTX-II) de B jararacussu , induziram

importante influxo de leucócitos para cavidade peritoneal de camundongos. Houve

predomínio de polimorfonucleares 6 horas após a injeção do veneno e das miotoxinas.

A radiação Laser e LEDs, nos parâmetros utilizados, promoveram redução do edema

podal induzida pelo veneno, e BthTX-I e II de forma significativa.

A radiação Laser e LEDs, promoveram a inibição da migração de leucócitos para a

cavidade peritoneal induzida pelo veneno e BthTX-I e II também de forma

significativa.

O laser e o LED não foram eficientes em inibirem a liberação de PGE2 induzida pelo

veneno ou miotoxinas.

REFERÊNCIAS

_____ Referências 70

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Certifiçamos que o Protocolo n."A*2&Í2SE'I/C!1F, sobre "Es'sssér da

reaçã* í*$*wat$órfua Enúwzid* BeÍç vefterr* da serpeftteW*tkrops jarara*ussË! e

p*r tfat*s wei*ísxiftses tssísd&s ãesfe veÍesÉer" sob a responsabilidarle de Profa.

Dra. SÉeííe Regirs* ZazçEilner faí eprovado por esta Comissão ds Étiça em

Pesquisa por estar cle acordo com os Princípios Eticos seguindo as Dketrizes

Nacionais e Internacionais da pesquisa envolvendo animais.

Inf.ormamos que o pesquisador responsável por este Protocolo de Pesqi-iisa

deverá apresentar a este Comitê de Etíca um relatório das atividades

desenvalvidas no período de 12 meses a çontar dadatade sua aprovação.

São José dos Campos, 01 de setembro de20A7.

PR.OF EË,LA. R.EGINA ZAMUÏqER.

Preiideste do Comitê de Etica em Pesquisa

Universidade do Vale do Paraíba - Univap

Av.ShishimaHifimi,2gll-ÌJRBANOVL-CE?-12.2+14A0-PÁBX(12)39+7.ll2l-FÁX(I2)3917.1149- CaixaPstal 82- S-LCamPorsP

UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE … · zs/as/zota Data da defesa. ... À amiga...

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