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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS JÚLIA FIGUEIREDO MACHADO AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL E DE MARCADORES DA INFLAMAÇÃO DE PACIENTES COM DOENÇA DE CROHN Campinas 2017
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
JÚLIA FIGUEIREDO MACHADO
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL E DE MARCADORES
DA INFLAMAÇÃO DE PACIENTES COM DOENÇA DE CROHN
Campinas
2017
JÚLIA FIGUEIREDO MACHADO
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL E DE MARCADORES
DA INFLAMAÇÃO DE PACIENTES COM DOENÇA DE CROHN
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora
em Ciências, na área de Saúde da Criança e do
Adolescente.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Marluce dos Santos Vilela
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
JÚLIA FIGUEIREDO MACHADO,
E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARIA
MARLUCE DOS SANTOS VILELA.
Campinas
2017
DEDICATÓRIA
À minha querida Tia e Professora
Raquel (in memoriam) por ter
contribuído com a minha formação e por
todas as palavras de carinho e incentivo.
AGRADECIMENTOS
À FAPESP pelo apoio financeiro (Processo: 2008/53902-3).
À minha orientadora, Profa. Dra. Marluce, pela oportunidade, confiança e por
compartilhar seus conhecimentos.
Ao Dr. Claudio Coy, pela oportunidade de trabalhar com pacientes com Doença de
Crohn.
Ao Ambulatório de Doenças Inflamatórias Intestinais e a todos os seus profissionais.
Aos pacientes pela disponibilidade em contribuir com este estudo.
Ao programa de pós-graduação em Saúde da Criança e do Adolescente.
Aos amigos do Laboratório de Imunologia Pediátrica.
Ao Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida
(LaCTAD).
Aos funcionários e amigos do CIPED, em especial à Silvana.
À Lia por toda a ajuda.
Aos professores, Dra. Elizete Lomazi e Dr. Gabriel Hessel, pelas importantes
contribuições no exame de qualificação.
Ao meu pai Rubens, pelo incentivo e contribuições.
À minha mãe, pelo incentivo, amor, carinho, compreensão...
À minha família por todo o apoio.
RESUMO
A avaliação da atividade inflamatória durante o acompanhamento clínico da doença de
Crohn (DC) representa um desafio na prática clínica, pois é baseada em uma combinação
de sinais e sintomas clínicos, marcadores bioquímicos, ressonância magnética,
endoscopia com biópsia e histopatologia. A monitorização da doença clinicamente
silenciosa é fundamental para diferenciar os pacientes que permanecerão em remissão
daqueles em risco de ativação da doença. O objetivo do estudo foi analisar a atividade
inflamatória de pacientes com DC utilizando marcadores séricos. A análise incluiu
marcadores de soro, tais como: TNF-α, leptina, adiponectina, resistina, IL-8, CCL2,
proteína C reativa (PCR) e contagens de leucócitos e plaquetas. Um grupo de 31 adultos
com DC e 29 controles saudáveis (HC) foram incluídos no estudo. Para o escore de
atividade da doença, utilizou-se o Índice de Atividade da Doença de Crohn (IADC). Os
pacientes foram separados em dois grupos: grupo de pacientes em remissão da doença
(RDC), com IADC < 150, e grupo em atividade da doença (ADC), com IADC ≥ 150.
Para a análise das citocinas e quimiocinas foram utilizados os kits Multiplex da Millipore.
A Absorciometria com Raios-X de Dupla Energia (DEXA) foi realizada em todos os
participantes para fornecer dados sobre a composição corporal. A maioria dos pacientes
estava em remissão clínica da doença e compuseram o grupo RDC (n=25). Mesmo em
remissão da doença, o grupo RDC, quando comparado ao grupo HC, mostrou níveis
aumentados de leucócitos, neutrófilos, plaquetas e PCR. No entanto, a CCL2 apresentou-
se reduzida neste grupo, quando comparado aos grupos HC e ADC. Os monócitos foram
significativamente elevados no grupo ADC quando comparados aos grupos RDC e HC.
Quando os grupos RDC e ADC foram combinados e comparados ao grupo HC,
observamos aumento na gordura visceral e nos níveis de resistina e adiponectina. Os
pacientes com DC considerados em remissão pelo IADC, mostram uma redução
acentuada de CCL2 e consequente contagem de monócitos normais, indicando que esta
quimiocina é um biomarcador promissor de controle da doença de Crohn.
Palavras-chave: doença de Crohn; marcadores inflamatórios; composição corporal
ABSTRACT
The evaluation of inflammatory activity during clinical follow-up of Crohn's Disease
(CD) represents a challenge in clinical practice because it is based on a combination of
clinical signs and symptoms, biochemical markers, magnetic resonance imaging,
endoscopy with biopsy and histopathology. Monitoring of clinically silent disease is
critical to differentiate those patients who will remain quiescent of those at risk of disease
activation. The aim of the study was to analyze the inflammatory activity of the CD
patients using serum markers. The analysis included serum markers, such as TNF-α,
leptin, adiponectin, resistin, IL-8, CCL2, C-reactive protein (CRP) and leukocyte and
platelet counts. A group of 31 adults with CD and 29 health controls (HC) were enrolled
to the study. For disease activity scoring, the Crohn’s Disease Activity Index (CDAI) was
used. The patients were separated into two groups: remission group (RCD), with
CDAI<150 and in disease activity group (ACD), with IADC≥150. Millipore Multiplex
kits were used for cytokine and chemokine analysis. Dual Energy X-ray Absorptiometry
(DEXA) was performed in all participants to provide data on body composition. Most of
the patients were in disease clinical remission (n = 25). Even in remission, the RCD group,
when compared to the HC group, showed increased levels of neutrophils, platelets and
CRP. However, CCL2 was reduced in this group when compared to HC and ACD groups.
Monocytes were significantly elevated in the ACD group when compared to the RCD and
HC groups. When the RCD and ACD groups were combined and compared to the HC
group, we observed increases in visceral fat and resistin and adiponectin levels. CD
patients considered in remission by the CDAI show marked reduction of CCL2 and
consequent normal monocytes counts, indicating that this chemokine is a promising
biomarker for control of Crohn's disease.
Key Words: Crohn's disease; inflammatory markers; body composition
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.1 Estrutura conceitual para a patogênese da DII ............................................. 16
Figura 1.2 Modelo proposto de enriquecimento de monócitos CD16 + durante a
inflamação intestinal ....................................................................................................... 18
Figura 1.3 Um modelo de inflamação crônica causada por erros inatos de macrófagos de
pacientes com DC ........................................................................................................... 19
Figura 1.4. Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e dependente do
complemento (CDC) ... .................................................................................................. 21
Figura 1.5 Dois dos principais mecanismos alternativos de ação do anti-TNF. ............ 22
Figura 1.6 Características da gordura mesentérica na doença de Crohn. ....................... 26
Figura 1.7 Conceito hipotético de quatro passos da patogênese da gordura mesentérica na
doença de Crohn. ............................................................................................................ 27
Figura 4.1 Distribuição de leucócitos, linfócitos, neutrófilos, monócitos, proteína C
reativa (PCR) e CCL2. ................................................................................................... 35
Figura 4.2 Distribuição de leptina, adiponectina e resistina ........................................... 35
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1 Características clínicas dos pacientes com doença de Crohn ...................... 32
Tabela 4.2 Características demográficas e nutricionais dos participantes do estudo .... 32
Tabela 4.3 Exames laboratoriais .................................................................................... 34
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADA adalimumabe
AINEs fármacos anti-inflamatórios não esteroides
Anti-TNF anti-fator de necrose tumoral
AZA azatioprina
CC circunferência da cintura
CCL2 CC‑chemokine ligand 2
CCL13 CC‑chemokine ligand 13
CCR2 CC‑chemokine receptor 2
CCR6 CC‑chemokine receptor 6
CD14 cluster of differentiation 14
CD16 cluster of differentiation 16
CF calprotectina fecal
CIPED Centro de Investigação em Pediatria
DC Doença de Crohn
DEXA absorciometria de raios-x de dupla energia
DII Doença Inflamatória Intestinal
IADC Índice de Atividade da Doença de Crohn
IFX infliximabe
IL‑1 Interleucina 1
IL‑2 Interleucina 2
IL‑10 Interleucina 10
IL‑12 Interleucina 12
IL‑21 Interleucina 21
IL‑27 Interleucina 27
IL‑12R receptor de Interleucina 12
IL‑23R receptor de Interleucina 23
IFNγ Interferon gama
IMC Índice de Massa Corporal
HC controles saudáveis
HDL High Density Lipoprotein
JAK2 Janus kinase 2
LaCTAD Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho
LDL Low Density Lipoprotein
LF lactoferrina fecal
MCP-1 proteína quimioatraente de monócitos-1
M-CSF fator estimulador de colônias de macrófagos
MIP-1α proteína inflamatória do macrófago-1 alfa
NK natural killer cell
NOD2 nucleotide oligomerization domain 2
PCR proteína C reativa
PPARγ peroxisome proliferator-activated receptor gamma
STAT1 signal transducer and activator of transcription 1
STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
STAT4 signal transducer and activator of transcription 4
sTNF fator de necrose tumoral solúvel
Th 1 type 1 helper T cells
TLR1 toll-like receptor 1
tmTNF fator de necrose tumoral transmembrana
TNF-α fator de necrose tumoral alfa
TNFR1 receptor 1 do fator de necrose tumoral
TNFR2 receptor 2 do fator de necrose tumoral
TReg célula T reguladora
VAT tecido adiposo visceral
VLDL Very Low Density Lipoprotein
VPN valor preditivo negativo
VPP valor preditivo positivo
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO .................................................................................................... ..14
2- OBJETIVOS......................................................................................................... ...28
2.1 Geral......................................................................................................................28
2.2 Específicos .......................................................................................................... ..28
3- MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. ..29
3.1 Sujeitos do Estudo .............................................................................................. ..29
3.2 Classificação e avaliação da atividade da doença de Crohn ............................... ..29
3.3 Avaliação da composição corporal ....................................................................... 30
3.4 Avaliação de marcadores inflamatórios ............................................................... 30
3.5 Análise dos dados ................................................................................................. 30
4- RESULTADOS ....................................................................................................... 31
4.1 Características clínicas dos pacientes ................................................................... 31
4.2 Composição Corporal dos participantes do estudo .............................................. 32
4.3 Exames laboratoriais............................................................................................. 33
5- DISCUSSÃO ........................................................................................................... 36
6- CONCLUSÃO ........................................................................................................ 39
7- REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 41
8- APÊNDICES ........................................................................................................... 49
8.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para Adultos ................................ 49
8.2 Ficha de coleta dos dados ..................................................................................... 52
8.3 Artigo submetido à revista Inflammatory Bowel Disease .................................... 54
9- ANEXOS .................................................................................................................. 74
9.1 Carta de Aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da
Unicamp ......................................................................................................................... 74
14
1- INTRODUÇÃO
A doença de Crohn (DC) é uma doença inflamatória intestinal crônica (DII), de
natureza recidivante e transmural, que afeta de forma segmentar qualquer área do trato
gastrointestinal, principalmente o íleo e o cólon (1-3). As manifestações clínicas
gastrointestinais e extra intestinais associadas à doença são: diarreia, cólicas abdominais, febre,
anemia, perda de peso, osteoporose, artropatias, pioderma gangrenoso e eritema nodoso. Em
pelo menos 25% dos pacientes ocorrem manifestações extra intestinais (4). A formação de
estenoses, fístulas e abscessos são complicações comuns da doença, as quais podem necessitar
de intervenções cirúrgicas (3). A natureza prolongada da DC gera um grande impacto sobre a
qualidade de vida dos pacientes, marcada por uma sobrecarga de terapias, hospitalizações e
cirurgias (3, 5).
A prevalência da DC aumentou rapidamente na Europa e na América do Norte na
segunda metade do século XX e está se tornando comum no resto do mundo, principalmente
em países que adotam um estilo de vida ocidental (6). A incidência anual da DC varia entre 0-
20,2 por 100.000 habitantes na América do Norte e 0,3-12,7 por 100.000 habitantes na Europa
(5). Países em desenvolvimento estão apresentando um aumento na incidência da doença, à
medida que se tornam industrializados. Entretanto, nesses países os dados epidemiológicos de
base populacional são escassos (7). Um estudo realizado no estado de São Paulo encontrou no
período entre 2001 e 2005, uma taxa de incidência de 3,5 por 100.000 habitantes e prevalência
de 5,65 por 100.000 habitantes (8). A maioria dos estudos epidemiológicos apontam para um
pico de incidência na segunda a quarta década de vida, sendo que parte destes estudos sugerem
uma taxa de incidência bimodal, com um modesto segundo pico na sexta e sétima décadas de
vida (7).
A etiologia da DC não é totalmente conhecida, sabe-se que o seu aparecimento é
influenciado por fatores relacionados à predisposição genética, disbiose da microbiota intestinal
e influências ambientais. Os fatores genéticos levam a alterações imunológicas, que agem em
sinergia com o ambiente externo e com a composição da microbiota intestinal, o que dificulta
o entendimento da patogênese desta doença (5, 7; Figura 1.1). Sabe-se que os hábitos de vida
têm grande importância na etiologia da doença. Alimentação, uso de antibióticos, ausência de
aleitamento materno causam alterações na microbiota intestinal, contribuindo com o
aparecimento da doença. Outros fatores ambientais parecem estar relacionados com a doença,
como tabagismo, apendicectomia, uso de contraceptivos e exposição a infecções. Estudos estão
15
mostrando que modificações viáveis no ambiente externo podem contribuir com o tratamento
da DC, ajudando a manter a remissão da doença por longos períodos (5).
A natureza genética da DC foi inicialmente reconhecida em 2001, com a descoberta
do primeiro gene associado a esta doença (9). Posteriormente, um estudo internacional de
mapeamento genético identificou 163 loci de risco para DC (10). Os efeitos genéticos sobre o
sistema imunitário são variados, podem ocorrer alterações na resposta imune inata, adaptativa
e na integridade da barreira epitelial (5). Variantes genéticas do domínio de ligação da
oligomerização de nucleotídeo 2 (NOD2), por exemplo, podem interferir na resposta de
monócitos a compostos bacterianos (9). Já foram identificados loci de susceptibilidade à DC
com genes que codificam citocinas e proteínas envolvidas na sinalização de receptores de
citocinas e quimiocinas, por exemplo: interleucina-2 (IL-2), IL-21, IL-10, IL-27, interferon-y
(IFNγ), transdutor de sinal e ativador de transcrição 1 (STAT1), STAT3, STAT4, receptor 6 de
quimiocina CC (CCR6), ligante 2 de quimiocina CC (CCL2), CCL13, receptor de
interleucina12 (IL-12R), IL-23R e Janus quinase 2 (JAK2). Estas alterações imunológicas
promovem um desequilíbrio nas quantidades e proporções de fatores anti-inflamatórios, pró-
inflamatórios e imunomoduladores, contribuindo, então, com o aparecimento da doença (3).
16
Figura 1.1 Estrutura conceitual para a patogênese da DII.
Fatores genéticos e ambientais induzem a alterações na barreira intestinal. A função de barreira alterada
subsequentemente induz a translocação de bactérias comensais e de produtos microbianos do lúmen intestinal
para a parede intestinal, o que leva à ativação das células imunitárias e à produção de citocinas. Se a inflamação
aguda na mucosa não puder ser resolvida por mecanismos anti-inflamatórios e pela supressão de respostas
imunológicas pró-inflamatórias, desenvolve-se uma inflamação intestinal crônica. Por sua vez, a inflamação
crônica pode causar complicações da doença e destruição de tecidos. DII, doença inflamatória intestinal; AINEs,
fármacos anti-inflamatórios não esteroides; TReg, célula T regulatória (3).
17
Evidências sugerem que a DC é conduzida pelo avanço de lesões imunológicas no
trato gastrointestinal, caracterizadas por um infiltrado de células inflamatórias, incluindo
linfócitos T, macrófagos e neutrófilos (11-13). As quimiocinas têm a capacidade de atrair
células inflamatórias para as lesões intestinais, desta forma estas proteínas e seus receptores
orquestram a chegada e a retenção de células imunes no local da inflamação (13). Células
inflamatórias presentes em lesões intestinais, fibroblastos, células endoteliais e epiteliais são
capazes de produzir quimiocinas (12). A CCL2 tem sua expressão aumentada na mucosa
inflamada (14-16) e está elevada no soro de pacientes com DC em atividade (13, 17). Esta
quimiocina atrai monócitos periféricos, que são fontes de macrófagos na mucosa intestinal
inflamada (18). O subtipo de monócitos clássicos CD14+CD16− apresenta uma alta capacidade
de migrar para o intestino, devido a sua alta expressão de receptores de quimiocina CC-2
(CCR2) (19). Por outro lado, os monócitos não clássicos CD14+ CD16+ apresentam baixa
expressão de CCR2 (20) e estão aumentados no sangue periférico de pacientes com DC em
atividade, podendo ser utilizado como um marcador sérico de inflamação intestinal (21, 22). Os
papéis biológicos destes monócitos continuam a ser esclarecidos, principalmente em relação a
sua capacidade de migrar para os tecidos e sua função no sangue (20). A figura 1.2 mostra um
modelo de migração transendotelial de monócitos proposto por Koch et al. (20).
A infiltração da mucosa intestinal por neutrófilos está bem documentada na DC
ativa, sendo que a migração destas células para o local inflamado envolve uma resposta ao
gradiente positivo de substâncias quimiotáticas. A IL-8 é uma quimiocina produzida
principalmente por monócitos e macrófagos, e é altamente seletiva para neutrófilos (23). Um
aumento da expressão de IL-8 foi verificado em biópsias intestinais inflamadas de pacientes
com DC (24, 25) e sua expressão foi correlacionada positivamente com a infiltração de
neutrófilos (25). O acúmulo de neutrófilos dentro das criptas epiteliais e no lúmen intestinal se
correlaciona diretamente com a atividade da doença clínica e lesão epitelial (26). Os neutrófilos
são fagócitos que montam a resposta inflamatória aguda atuando como primeira linha de defesa
contra patógenos invasores. O papel destas células na DC ainda é obscuro, sua função
prejudicada pode resultar em depuração bacteriana limitada, levando a uma cronicidade da
resposta inflamatória (27).
Defeitos funcionais em células imunológicas, como monócitos e neutrófilos, foram
relatados na DC, e fez levantar a questão de se considerar a DC como uma imunodeficiência
(28). Existe um modelo, proposto por Casanova e Abel (29), de que a inflamação intestinal
crônica é causada por erros inatos de macrófagos (Figura 1.3). Esta proposta considera que
18
defeitos inatos em macrófagos ocasionam uma atração prejudicada de granulócitos para a
mucosa intestinal, comprometendo a depuração de bactérias, o que gera a inflamação crônica,
com formações de granulomas (29). Estes erros inatos, também, podem afetar outras funções
não inflamatórias dos macrófagos, como suas ações no reparo e remodelamento da mucosa
intestinal, agravando ainda mais as lesões intestinais (30).
Figura 1.2 Modelo proposto de enriquecimento de monócitos CD16 + durante a inflamação intestinal.
(A) CD14+ CD16– atravessam a mucosa em resposta a estímulos inflamatórios. (B) Na lâmina própria, os
monócitos inflamatórios sofrem uma mudança de fenótipo para expressar CD16+. (C) Alguns monócitos CD16 +
voltam para a corrente sanguínea. (D) Os monócitos CD16– e CD16+ perpetuam a inflamação intestinal através da
secreção de citocinas inflamatórias. (E) A eficácia dos glicocorticóides pode ser transmitida em parte pela sua
capacidade de esgotar células CD16 + na corrente sanguínea e na lâmina própria. (F) Em contraste, a aférese de
leucócitos apenas remove células imunes do sangue periférico, reduzindo assim o reservatório de leucócitos
infiltrantes (20).
19
Figura 1.3 Um modelo de inflamação intestinal crônica causada por erros inatos de macrófagos em
pacientes com DC. Os macrófagos dos pacientes são intrinsecamente defeituosos, com insuficiência de secreção
de citocinas, que normalmente são traduzidas, mas internamente degradadas. Devido à produção insuficiente de
citocinas e quimiocinas, há uma atração prejudicada de granulócitos. A inflamação aguda e granulocítica
prejudicada resulta em comprometimento da depuração de bactérias e detritos da parede intestinal, resultando em
inflamação crônica e granulomatosa (29).
20
Na DC, o manejo terapêutico tem como objetivo induzir e manter uma remissão
duradoura e evitar a progressão da doença, prevenindo o aparecimento de complicações (31).
Com base na importância das citocinas na patogênese da DC, foram testadas as ações de
citocinas anti-inflamatórias recombinantes e anticorpos específicos para citocinas pró-
inflamatórias no controle da doença. O uso de um anticorpo neutralizante específico para TNF-
α (anti-TNF-α) resultou em cicatrização da mucosa inflamada e melhorias clínicas. Vários
anticorpos quiméricos, humanizados ou totalmente humanos, tais como adalimumab,
certolizumab, golimumab e infliximab, estão sendo utilizados no tratamento da doença (2, 3).
Entretanto, o mecanismo exato destes novos agentes no controle da doença não é totalmente
compreendido (32).
Os efeitos do anti-TNF-α vão além da simples neutralização do TNF-α. Existem
duas formas principais de TNF-α; a forma solúvel (sTNF) e a forma transmembrana (tmTNF).
Tanto o infliximab (IFX) quanto o adalimumab (ADA) podem se ligar a estas duas formas.
Estas ligações desencadeiam um bloqueio na estimulação do receptor 1 e 2 do fator de necrose
tumoral (TNFR1 e TNFR2), o que resulta na inibição de vias pro-inflamatórias, reduzindo a
liberação de citocinas e infiltração de células inflamatórias. Além disso, a ligação no tmTNF
pode desencadear uma citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) ou dependente
do complemento (CDC). O anticorpo anti-TNF-α liga-se ao tmTNF na célula alvo e ao mesmo
tempo se liga às células natural killer (NK) ou ao sistema do complemento, ocasionando a
destruição da célula alvo (32, 33; Figura 1.4). A cicatrização da mucosa também foi associada
às outras ações alternativas dos anti-TNFs, que foram sugeridas nos últimos anos, tais como: a
indução da apoptose das células T na lâmina própria e a indução de macrófagos do tipo 2, que
estão associados à cicatrização (32; Figura 1.5).
Outros medicamentos utilizados no controle da DC são os derivados de tiopurinas,
como a azatioprina (AZA) e a 6-mercaptopurina, conhecidos como antimetabolitos purínicos,
que inibem a replicação de DNA e RNA, impedindo a proliferação celular, principalmente de
células T. Além disso, eles inibem genes que codificam proteínas relacionadas com a
inflamação intestinal e com o tráfico de leucócitos, tais como: ligante indutor de apoptose
relacionado ao TNF, membro 7 da superfamília do receptor TNF e integrina-alfa-4 (34). Estes
fármacos são menos eficazes do que as drogas anti-TNF-alfa para a indução de remissão isenta
de esteroides. Por outro lado, a indução de remissão pela terapia combinada com AZA e IFX é
superior ao IFX sozinho (34).
21
Estudos com aférese adsortiva de granulócitos e monócitos (GMA), uma terapia
extracorpórea que reduz seletivamente granulócitos e monócitos, têm apresentado resultados
promissores no controle da DC (21), e demonstraram ter poucos efeitos adversos (35, 36). A
terapia combinada com GMA intensiva e tiopurinas foi eficaz e bem tolerada na indução e
manutenção de remissão clínica em pacientes com DC (37). Diferente dos medicamentos que
podem induzir a apoptose de células inflamatórias na lâmina própria, na aférese, estas células
são esgotadas apenas do sangue periférico (Figura 1.2). Isto pode reduzir o grupo de monócitos
que reabastece o infiltrado de células inflamatórias na mucosa intestinal e, assim, melhorar a
inflamação crônica (20).
Figura 1.4 Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e dependente do complemento (CDC).
Infliximabe e adalimumabe possuem uma porção Fc, cujos domínios CH1 e CH2 ativam os componentes C1 e C3
do sistema complemento, respectivamente, ocorrendo a formação de um complexo de ataque de membrana (C5b-
C9) e lise das células alvo. Infliximabe, adalimumabe e etanercept expressam domínios CH2 e CH3 que se ligam
aos receptores para Fc de IgG de células NK, que culminam na libertação de granzima B e perforina, que lisam as
células alvo (33).
22
Figura 1.5 Dois dos principais mecanismos alternativos de ação do anti-TNF. (A) Existe um sinal anti-
apoptótico por mTNF expresso em monócitos para o TNFRII expresso em células T CD4 +. Este mecanismo é
inibido por anti-TNFs, resultando em apoptose de células CD4 +. (B) Anti-TNFs se ligam ao mTNF em células T
ativadas; A parte Fc do anticorpo é reconhecida pelos receptores Fc expressos pelos monócitos, desencadeando a
sua diferenciação para o tipo M2, um subtipo de macrófagos que promove cicatrização. Este mecanismo depende
da presença da região Fc do anticorpo, que está ausente no caso do certolizumab (32).
23
O acompanhamento dos efeitos das terapias empregadas na DC, assim como o
diagnóstico da doença, requer uma combinação de exames clínicos, testes laboratoriais, exames
de imagem e endoscopia com histologia. A ressonância magnética (RM) pode ser utilizada no
diagnóstico e no acompanhamento de pacientes com DC. A enterografia por RM é capaz de
identificar pacientes com doença ativa e com complicações, por meio de diferentes imagens
identificadas antes e após a injeção de contraste. No entanto, a medida da intensidade da
inflamação intestinal possui limitações relacionadas a uma variabilidade interobservador
significativa (38). A ileocolonoscopia é considerada padrão-ouro para o diagnóstico e avaliação
da atividade inflamatória (39), este exame possibilita a análise da mucosa intestinal, porém é
extremamente invasivo e incomodo para os pacientes. A RM e a ileocolonoscopia são exames
dispendiosos, não sendo apropriados para uma avaliação periódica da atividade da doença (38,
40, 41).
O Índice de Atividade da Doença de Crohn (IADC) e sua versão simplificada, o
Índice Harvey-Bradshaw, são amplamente utilizados para avaliar a atividade clínica da doença.
No IADC são analisados sintomas subjetivos, sinais objetivos e dosagem de hematócrito. No
entanto, a correlação entre estes índices clínicos e a gravidade da doença endoscópica é fraca.
A medida da atividade clínica é importante no acompanhamento do paciente, mas não é
suficiente para medir a inflamação na mucosa intestinal (39). Recentemente, há uma
preocupação em avaliar não só os sintomas clínicos da doença, mas também a saúde da mucosa
intestinal, pois um grau de inflamação subclínica pode persistir silenciosamente na mucosa,
contribuindo para um risco de recidiva "sintomática" (31). A manutenção de uma mucosa
saudável gera benefícios em relação à durabilidade da remissão e à prevenção de lesões
intestinais. A avaliação não invasiva utilizando marcadores bioquímicos capazes de revelar a
presença ou ausência de inflamação subclínica, pode representar um avanço importante no
monitoramento rotineiro da doença (31, 42).
Muitos marcadores inflamatórios séricos têm sido estudados como indicadores de
atividade inflamatória na DC, por exemplo: proteína C reativa (PCR), taxa de sedimentação de
eritrócitos e contagem de leucócitos e plaquetas (39). Além disso, proteínas fecais, como a
calprotectina fecal (CF) e a lactoferrina fecal (LF), têm sido estudadas como promissores
biomarcadores inflamatórios não-invasivos (41, 43). Os resultados dos estudos que exploram
estes marcadores são bem diversificados, além disso poucos avaliam marcadores de remissão
da doença e uma minoria inclui a endoscopia na avaliação dos pacientes sintomáticos. Existe
também, uma dificuldade na interpretação dos resultados destes estudos, devido à falta de uma
24
análise da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e/ou negativo (VPP e/ou VPN)
dos marcadores (41, 44).
A PCR é uma proteína de fase aguda produzida por hepatócitos, que pode estar
elevada por várias razões, como infecções, inflamação intestinal e extra intestinal. Apesar desta
proteína não ser um marcador específico de inflamação intestinal, ela tem sido bastante utilizada
na prática clínica associada a outros biomarcadores (42). A PCR já foi correlacionada com a
atividade clínica da DC (45, 46), mas nem sempre pacientes com a doença ativa apresentam
níveis elevados deste marcador (42). Estudos mostram que uma concentração sérica de PCR ≥
5 mg/L tem uma especificidade relativamente alta (92%) e uma sensibilidade fraca (49%) na
detecção da atividade da doença endoscópica. Desta forma, um teste negativo não exclui de
forma confiável a presença de uma inflamação ativa. É fundamental lembrar que
aproximadamente 25% dos pacientes em atividade não conseguem produzir PCR, devido a
polimorfismos no gene desta proteína (42).
A CF e a LF são proteínas inflamatórias encontradas no citosol de neutrófilos, que
quando presentes nas fezes, indicam que houve migração de neutrófilos para o intestino durante
um processo inflamatório (42). Diferente dos marcadores séricos que podem estar aumentados
em várias condições inflamatórias extra intestinal, os marcadores fecais apresentam maior
especificidade na detecção da inflamação no intestino (47). A CF e a LF, quando comparadas
à PCR, apresentaram melhores resultados na avaliação da atividade inflamatória de pacientes
com DC, com maior sensibilidade (88% e 82%, respectivamente). A precisão na análise de
atividade da doença da CF e da LF são bastante semelhantes, porém a menor estabilidade da
LF à temperatura ambiente limita o seu uso na prática clínica (44).
Um marcador ideal deve revelar inflamação em um estágio pré-sintomático e, ao
mesmo tempo, deve ser fácil e rápido de se realizar, barato, minimamente invasivo e
reprodutível. Porém, dos marcadores sorológicos e fecais estudados, nenhum deles demonstrou
um alto poder preditivo quando usado sozinho. Desta forma, os dados obtidos a partir da
endoscopia e da histologia são de grande valor, mas sua utilização como preditores de recaída
clínica está fortemente limitada pela invasividade (31).
O estado nutricional dos pacientes com DC já foi muito associado ao baixo peso
corporal, porém estudos recentes documentaram uma prevalência crescente de obesidade nestes
pacientes. Considerando que a obesidade é um estado pró-inflamatório, existe a preocupação
em se investigar o impacto do aumento da gordura corporal no prognóstico da DC (48, 49). O
curso da doença demonstrou ser mais grave em pacientes obesos em comparação com pacientes
25
eutróficos (50, 51). Além disso, uma proporção elevada de gordura visceral é um marcador de
doença agressiva (52).
O tecido adiposo é um órgão produtor de adipocinas, que podem contribuir para a
atividade de doenças imunomediada. Pacientes com DC têm uma hipertrofia do tecido adiposo
visceral (VAT) que envolve a área intestinal inflamada (“creeping fat”; Figura 1.6) e
infiltrações intramurais de lipídios na parede intestinal podem ser visualizadas em tomografia
computadorizada (53). Alterações na produção de citocinas e quimiocinas ocorrem na
“creeping fat”, o que pode influenciar o sistema imunológico do trato gastrointestinal e em
alguns casos agravando a doença (54; Figura 1.7).
As adipocinas podem ter efeitos pró ou anti-inflamatórios. A adiponectina tem
efeitos anti-inflamatórios (55, 56) e está correlacionada inversamente com a concentração sérica
de PCR (57). O VAT de pacientes com DC apresenta um aumento na produção de adiponectina
(58, 59), entretanto, as concentrações plasmáticas desta proteína têm sido divergentes entre os
estudos. Enquanto Valentini et al. (60) relataram redução na concentração sérica de
adiponectina em pacientes com DC, comparado a controles saudáveis, Karmiris et al. (61)
identificaram um aumento.
Secretada em quantidades proporcionais à massa de gordura corporal, a leptina é
uma adipocina com efeitos pró-saciedade. Esta proteína possui um papel pró-inflamatório, pois
induz a ativação de linfócitos, a produção de citocinas e a expressão de moléculas de adesão
(56). Na DC há um aumento da secreção de leptina na gordura mesentérica hipertrófica (51).
Por outro lado, os níveis séricos de leptina apresentaram-se mais baixos em pacientes com DC
em comparação com controles saudáveis (55, 61, 62).
A resistina é outra adipocina com efeitos pró-inflamatórios, podendo estimular a
síntese e secreção de TNF-α, IL-12 e moléculas de adesão (63). O tecido adiposo não é uma
fonte exclusiva desta citocina, células sanguíneas mononucleares e macrófagos também a
produzem (55), com um aumento desta produção na presença de lipopolissacarídeos, TNF-α,
IL-1 e IL-6 (64). A expressão de resistina no tecido adiposo mesentérico e os seus níveis
sanguíneos estão aumentados em pacientes com DC (59, 60).
O papel das adipocinas na fisiopatologia da DC ainda não foi esclarecido. Acredita-
se que seus níveis séricos podem ser utilizados como marcadores inflamatórios e que a inibição
de adipocinas pró-inflamatórias pode expandir o espectro de intervenções terapêuticas para esta
doença (55).
26
Figura 1.6 Características da gordura mesentérica na doença de Crohn.
(A) intestino grosso não afetado e intestino desgado afetado visto durante a laparotomia de um paciente que sofre
de doença de Crohn. (B) e (C) intestino delgado ressecado afetado pela doença de Crohn com inflamação
transmural e “creeping fat”. A linha de fixação do tecido adiposo na superfície intestinal não é nítida e parece
desfocada (a). A superfície do intestino parece granular em comparação com o intestino normal (b). O tecido
adiposo se estende sobre a camada serosa do intestino (“creeping fat”) (54).
27
Figura 1.7 Conceito hipotético de quatro passos da patogênese da gordura mesentérica na doença de Crohn.
(A) O processo primário de inflamação intestinal leva a uma liberação sustentada de citocinas, que aumentam a
expressão dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma gama (PPAR-γ) no tecido adiposo visceral
(VAT). (B) O aumento da expressão de PPAR-γ interfere diretamente na hiperplasia do tecido adiposo e aumenta
a expressão de TNF-α. (C) A PPAR- γ exerce efeitos profundos na expressão de adipocinas, com elevação da
expressão de adiponectina e redução de leptina. As quimiocinas, como a proteína quimioatraente de monócitos-1
(MCP-1) e a proteína inflamatória do macrófago-1alfa (MIP-1α) são secretadas em quantidades mais elevadas e
direcionam a diapedese de monócitos sanguíneos para o tecido adiposo. Sob este microambiente, os macrófagos
podem desenvolver tanto a partir de monócitos de sangue transmigrados, quanto de pré-adipócitos ativados. O
aumento da infiltração de macrófagos no tecido adiposo visceral conduz a uma transformação inflamatória do
tecido adiposo visceral. O aumento da produção de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) a partir
de macrófagos potencializa o crescimento do tecido adiposo, levando ao aparecimento de “creeping fat”. (D) Uma
"tempestade" de adipocinas e mediadores de macrófagos secretados na “creeping fat" perpetuam o processo
inflamatório intestinal, levando a ulcerações mucosas ao longo da borda mesentérica, característica típica da
doença de Crohn. Os linfonodos mesentéricos ativados interagem ainda mais com os adipócitos mesentéricos (54).
28
2- OBJETIVOS
2.1 Geral
O objetivo do estudo foi analisar a atividade inflamatória de pacientes com doença
de Crohn utilizando marcadores séricos.
2.2 Específicos
Classificar os pacientes de acordo com o Índice de Atividade da Doença de Crohn
(IADC);
Avaliar a composição corporal dos participantes;
Dosar no soro dos participantes os seguintes marcadores séricos:
Citocina: TNF-α;
Adipocinas: leptina, adiponectina e resistina;
Quimiocinas: IL-8 e CCL2;
Leucócitos: contagens de neutrófilos, linfócitos e monócitos;
Plaquetas.
Comparar os dados de composição corporal e de marcadores séricos de pacientes
com doença de Crohn com indivíduos saudáveis.
29
3- MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Ciências Médicas da Unicamp (número de referência 32192614.0.0000.5404), conforme
recomendações para pesquisas biomédicas envolvendo seres humanos propostas pela
Resolução nº 196 de 10 de outubro de 1996 do Conselho Nacional de Saúde (Anexo).
3.1 Sujeitos do estudo
Pacientes com diagnóstico de doença de Crohn (DC) e indivíduos saudáveis,
controles saudáveis (HC), foram recrutados de fevereiro a dezembro de 2015 no Ambulatório
de Doença Inflamatórias Intestinais (DII), do Gastrocentro, e no Centro de Investigação em
Pediatria (CIPED), da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). O grupo de HC foi
composto por funcionários e alunos do CIPED, e acompanhantes de pacientes atendidos no
ambulatório de DII.
Foram incluídos no estudo pacientes com DC em acompanhamento médico no
ambulatório DII e indivíduos saudáveis, sem qualquer doença aguda ou crônica.
Os critérios de exclusão para o grupo de pacientes com DC foram: presença de
outras doenças, uso de corticoides e gestação. Os critérios de exclusão para o grupo HC foram:
uso de medicamentos e gestação.
3.2 Classificação e avaliação da atividade da doença de Crohn
Para a avaliação da atividade da doença, foi utilizado o Índice de Atividade da
Doença de Crohn (IADC) (65). Os pacientes foram separados em dois grupos: o primeiro
incluiu pacientes com IADC < 150, nomeado de RDC (doença de Crohn em remissão); o
segundo incluiu pacientes com IADC ≥ 150, nomeado de ADC (doença de Crohn em atividade).
As características e comportamento da DC foram avaliadas de acordo com a
classificação de Montreal (66), que considera a idade de início da doença (A), localização da
doença (L) e comportamento da doença (B).
30
3.3 Avaliação da composição corporal
O estado nutricional foi avaliado por meio de medidas de peso corporal, altura e
circunferência da cintura (CC). O índice de massa corporal (IMC) foi calculado a partir do peso
e da altura (quilogramas por metro quadrado). A absorciometria de raios-x de dupla energia
(DEXA) foi realizada para fornecer dados sobre a porcentagem de gordura corporal e a
quantidade de gordura visceral.
3.4 Avaliação de marcadores inflamatórios
As amostras de sangue foram coletadas no período da manhã, após um jejum de 12
horas. Parte do sangue foi enviado para a Divisão de Patologia Clínica, do Hospital de Clínicas
da UNICAMP, para as dosagens e contagens de: proteína C reativa (PCR), glicose,
triglicerídeos, colesterol total, LDL (Low Density Lipoprotein), HDL (High Density
Lipoprotein), VLDL (Very Low Density Lipoprotein), leucócitos, neutrófilos, linfócitos,
monócitos e plaquetas. Outra parte do sangue foi enviada para o Laboratório de Imunologia do
CIPED, na UNICAMP. O sangue foi centrifugado por 10 minutos a 1000g. O soro foi separado
e congelado a -80 °C.
Após a coleta de todas as amostras de sangue, os soros de todos os participantes
foram encaminhados para o Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho
(LaCTAD), na UNICAMP. Os níveis de TNF-α, IL-8, CCL2, leptina, adiponectina e resistina
foram dosados nos soros utilizando os kits MILLIPLEX MAP Adipokine Human Bead Panel
1 e 2, da Millipore. Estes kits utilizam a tecnologia Luminex xMAP®, que permite a análise de
múltiplas proteínas simultaneamente em uma pequena quantidade de amostra. As amostras
foram analisadas pelo sistema de Imunoensaio Multiplex da marca Bio-Rad, modelo Bio-plex
200. Todos os testes foram realizados de acordo com as instruções fornecidas pelos fabricantes.
3.5 Análise dos dados
As análises estatísticas foram realizadas usando o pacote de software SPSS 16.0.
As variáveis quantitativas foram apresentadas como médias e desvios-padrão. As variáveis
qualitativas foram apresentadas como frequências. A comparação dos dados categóricos entre
os grupos foi realizada utilizando o método χ² ou o teste exato de Fisher. As comparações entre
dois grupos (DC e HC) foram realizadas utilizando o teste T de Student ou Mann Whitney. As
comparações entre três grupos (RDC, ADC e HC) foram realizadas por meio do teste de
31
ANOVA ou Wilcoxon. As análises de comparações múltiplas, post hoc, foram realizadas pelo
teste de Bonferroni. A transformação log foi utilizada em algumas variáveis. Foi estabelecido
um nível de significância de 5%.
4- RESULTADOS
4.1 Características clínicas dos pacientes
A Tabela 4.1 mostra as características clínicas dos pacientes em remissão (RDC) e
em atividade (ADC). A maioria dos pacientes (n=25) estava em remissão clínica da doença.
60% dos pacientes do grupo RDC tinham exames de colonoscopia ou ressonância magnética,
sendo que a maioria não apresentou atividade inflamatória, apenas um paciente apresentou
atividade inflamatória endoscópica leve. Os medicamentos mais utilizados foram o anti-TNF-
α e a AZA. O anti-TNF-α mais utilizado foi o infliximabe, apenas dois pacientes aplicavam o
adalimumabe.
A média da duração da doença foi menor no grupo ADC do que no grupo RDC (p
= 0,032). Além disso, a maioria desses pacientes ativos não passou por cirurgias prévias, ao
contrário dos pacientes em remissão (p = 0,013). Três pacientes não estavam no momento da
avaliação sob tratamento medicamentoso, dois deles estavam com a doença ativa e não tinham
sido submetidos a cirurgias prévias.
32
Tabela 4.1 Características clínicas dos pacientes com doença de Crohn
RDC1 (n=25) ADC2 (n=6) p*
Duração em anos da doença (média ± DP) 13,9 ± 6 7,7 ± 6,3 0,032
Evacuações por dia (média ± DP) 2,6 ± 1,8 3,5 ± 3,3 0,364
Tratamentos
Cirurgia intestinal (sim / não) 19/6 1/5 0,013
Número de cirurgias (média ± DP) 1,2 ± 1 0,5 ± 1.2 0,150
Anti-TNF 7 3
Anti-TNF + Azatioprina 9 1
Azatioprina 6 0
Sem imunossupressor 2 0
Sem medicação 1 2
Classificação de Montreal3
Idade ao diagnóstico (A1/A2/A3) 5/16/4 1/4/1
Localização (L1/L2/L3/L4) 5/11/9/0 1/3/2/0
Comportamento
B1/B2/B3/P 5/7/2/3 1/1/0/3
B1+P/ B2+P/B3+P 4/1/3 0/0/1 *p:Teste T de Student; 1RDC: doença de Crohn em remissão; 2ADC: doença de Crohn em atividade 3Classificação de Montreal: (A1) 16 anos ou menos / (A2) 17 a 40 anos / (A3) mais de 40 anos
(L1) íleo / (L2) cólon / (L3) ileocolônica / (L4) trato gastrointestinal superior
(B1) não estenosante e não penetrante / (B2) estenosante / (B3) penetrante / (P) perianal
4.2 Composição corporal dos participantes do estudo
Enquanto o IMC e o percentual de gordura corporal foram semelhantes entre os
grupos DC e HC, a circunferência da cintura e a gordura visceral foram significativamente
maiores no grupo DC (Tabela 4.2). A classificação do estado nutricional, de acordo com o IMC,
mostrou que o sobrepeso estava presente em 22,5% dos pacientes com DC e 27,5% dos
indivíduos saudáveis. A obesidade grau I atingiu 22,5% dos pacientes com DC e 7% dos
indivíduos saudáveis. Em ambos os grupos apenas um indivíduo apresentou desnutrição leve.
Tabela 4.2 Características demográficas e nutricionais dos participantes do estudo
DC1 (n=31) HC2 (n=29) p
Masculino (n) 15 11 0,446
Idade (anos) 40,5 ± 11,4 35,3 ± 9,9 0,059
Hábito de fumar (ativo/ex fumantes/nunca) 0/8/23 0/3/26 0,112
Atividade física (sedentária/ativo) 20/11 15/14 0,159
Composição corporal
IMC3 (Kg/m²) 25,2 ± 4,9 23.9 ± 3,3 0,222
CC4 (cm) 82,4 ± 11,7 76 ± 9,5 0,025
Gordura visceral (g) 870,3 ± 765,1 498.3 ± 446,2 0,027
Porcentagem de gordura corporal 33,7 ± 10,9 32.6 ±7,8 0,659 *p:Teste T de Student; 1DC: doença de Crohn; 2HC: controle saudável; 3IMC: índice de massa corporal;
4CC: circunferência da cintura
33
4.3 Exames laboratoriais
A Tabela 4.3 mostra os dados dos marcadores inflamatórios nos grupos RDC, ADC,
HC. Os leucócitos estavam aumentados nos grupos RDC e ADC quando comparados ao grupo
HC (p=0,045 e p=0,012, respectivamente), sendo que os neutrófilos estavam aumentados no
grupo RDC quando comparado ao grupo HC (p = 0,034) e os monócitos estavam aumentados
no grupo ADC quando comparado aos grupos RDC (p=0,033) e HC (p=0,004). As plaquetas
estavam mais elevadas no grupo RDC quando comparado ao grupo HC (p=0,028).
Quando a quimiocina IL-8 e a citocina TNF-α foram dosadas no soro, muitos
pacientes tinham valores abaixo do limite de detecção do ensaio. Considerando apenas os
participantes que tiveram estas proteínas detectadas, não houve diferenças entre os grupos. Por
outro lado, a quimiocina CCL2 foi detectada em todos os participantes e apresentou-se muito
baixa no grupo RDC quando comparado aos grupos ADC (p=0,049) e HC (p <0,001). A PCR
foi maior nos grupos RDC e ADC quando comparados ao grupo HC (p<0,001 e p<0,001,
respectivamente). A Figura 4.1 mostra a distribuição dos leucócitos, PCR e CCL2 nos grupos
RDC, ADC e HC.
As adipocinas não foram diferentes entre os três grupos, mas ao analisar o grupo de
pacientes (DC) versus o grupo HC, algumas diferenças foram encontradas. Os níveis médios
de adiponectina no soro foram de 65,4 ± 110,2 μg/mL no grupo DC (n = 31) e 22,4 ± 22,7
μg/mL no grupo HC (n=29), sendo significativamente maiores no grupo DC (Student Test,
p=0,046). O mesmo ocorreu com a resistina, que foi significativamente mais elevada no grupo
DC (Teste de Mann-Whitney, p = 0,046), sendo que os níveis médios de resistina encontrados
foram 60,4 ± 30,8 ng/mL no grupo DC e 46,8 ± 24,1 ng/mL no grupo HC. A Figura 4.2 mostra
a distribuição das adipocinas nos grupos DC e HC.
34
Tabela 4.3 Exames laboratoriais
RDC (n=25) ADC (n=6) HC (n=29) p
Hemoglobina (g/dL)
(n=22)
14,2 ± 1,8 (n=6)
13,7 ± 1,2 (n=26)
14 ± 1,2
0,784
Hematócrito (%) 42,7 ± 4,6 42,2 ± 3,1 41,4 ± 3,3 0,487
Plaquetas (x10³/mm³) 279,3 ± 72,61 282,0 ± 58,9 233 ± 44,6 0,015*
Leucócito (x10³/mm³) 6,334 ± 1,5061 7,21 ± 1,1272 5,41 ± 1,278 0,005*
Linfócitos (x10³/ mm³) 1,877 ± 0.629 2,518 ± 0,619 1,928 ± 0,531 0,058
Neutrófilos (x10³/mm³) 3,954 ± 1,3181 3,96 ± 1,029 3,513 ± 1,137 0,027*
Monócitos (x10³/mm³) 0,504 ± 0,223 0,738 ± 0,2342,3 0,443 ± 0,134 0,005*
(n=21) (n=6) (n=28)
Colesterol total (ml/dL) 157,8 ± 39,5 192,3 ± 39,92 188 ± 32,6 0,012*
HDL (mg/dL) 48,6 ± 10,6 60,8 ± 19,2 56,5 ± 14,9 0,093
LDL (mg/dL) 98,3 ± 43 109 ± 44 112 ± 29,4 0,430
VLDL (mg/dL) 19,3 ± 8,7 23,8 ± 7,2 18,7 ± 10,5 0,326
Triglicerídeos (mg/dL) 93,8 ± 43 114,3 ± 33,8 94,9 ± 52,9 0,424
Glucose (mg/dL) 82,9 ± 9,2 75,8 ± 13,2 76,6 ± 9,7 0,066
(n=25) (n=6) (n=29)
CCL2 (pg/dL) 180,78 ± 81,661,3 305,99 ± 136,72 370,52 ± 156,93 <0,001*
(n=6) (n=2) (n=21)
TNF-α (pg/mL) 3,9 ± 2,4 3 ± 2,1 3,1 ± 2 0,767
(n=15) (n=5) (n=20)
IL-8 (pg/mL) 7,54 ± 9,1 5,27 ± 3,61 4,68 ± 2,63 0,826
(n=25) (n=6) (n=27)
PCR (mg/L) 17,7 ± 23,71 43,4 ± 46,32 1,44 ± 1,7 <0,001*
(n=25) (n=6) (n=29)
Leptina (ng/dL) 15,95 ± 18.89 13,17 ± 8,04 11,93 ± 11,70 0,777
Adiponectina (μg/dL) 62,68 ± 115,9 61,33 ± 67,58 22,39 ± 22,72 0,130
Resistin (ng/dL) 63,56 ± 31,45 48 ± 19,9 46,1 ± 23,2 0,089
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa; IL-8: Interleucina-8; CRP: proteína C-reativa; CCL2: C-C Motif Chemokine Ligand 2
*p<0,05, diferença entre os grupos RDC, ADC e HC pelo teste de ANOVA ou Wilcoxon; 1 p<0,05, diferença entre os grupos RDC e HC pelo teste de Bonferroni (pos hoc); 2 p<0,05, diferença entre os grupos ADC e HC pelo teste de Bonferroni (pos hoc); 3 p<0,05, diferença entre os grupos RDC e ADC pelo teste de Bonferroni (pos hoc);
35
Figura 4.2 Distribuição de leptina, resistina e adiponectina nos grupos DC e HC. Os gráficos de
caixa mostram os quartis e a mediana.
Figura 4.1 Distribuição de leucócitos, linfócitos, neutrófilos, monócitos, proteína C reativa (PCR) e
CCL2 nos grupos RDC, HC e ADC. Os gráficos de caixa mostram os quartis e a mediana.
36
5- DISCUSSÃO
O objetivo do presente estudo foi avaliar os níveis de diferentes marcadores
inflamatórios em pacientes com DC. A maioria dos pacientes estava em remissão clínica da
doença e compuseram o grupo RDC (n=25). Neste grupo, 15 pacientes fizeram exames de
colonoscopia ou RM, que detectaram ausência de atividade inflamatória intestinal em 14
indivíduos. Mesmo em remissão da doença, este grupo mostrou contagens elevadas de
leucócitos, neutrófilos e plaquetas. No entanto, a CCL2 apresentou-se reduzida, o que indica
que esta quimiocina poderia ser utilizada como marcador de remissão da doença.
A CCL2 é um potente fator quimiotático para monócitos, e o seu aumento na
mucosa intestinal está associado a um maior grau de inflamação endoscópica, e a uma maior
gravidade da DC (12, 14, 15). Considerando que os monócitos periféricos são fontes exclusivas
de macrófagos no intestino (18), um número normal de monócitos associado a uma redução
significativa de CCL2 pode levar a reduções de macrófagos na mucosa intestinal, controlando
a atividade inflamatória.
A maioria dos pacientes deste estudo estava em terapia com anti-TNF e/ou AZA,
indicando que estes medicamentos podem ter influenciado nos níveis de CCL2, monócitos e
linfócitos. Magnusson et al. (67) mostrou reduções de CCL2 após o uso de infliximabe por
pacientes com Colite Ulcerativa. Esses autores acreditam que o infliximabe age reduzindo a
tenascina C (TNC), uma glicoproteína pró-inflamatória da matriz extracelular, que está ausente
em tecidos saudáveis. Nas DIIs e na artrite reumatoide a TNC é um indicador de inflamação
(68, 69), pois esta glicoproteína além de induzir a expressão de CCL2, ativa a sinalização dos
receptores Toll-like 4 (TLR4), aumentando a síntese de citocinas pró-inflamatórias (67). O
controle das contagens de monócitos e linfócitos podem ser explicados pelos efeitos da AZA,
que inibe a proliferação destas células, e do anti-TNF que pode levar à apoptose ou destruição
destas células (32, 34).
Os pacientes do grupo RDC apesar de não apresentarem sintomas da doença,
mostraram elevado número de neutrófilos e plaquetas, em comparação ao grupo HC. Embora
haja um aumento dos neutrófilos, a quimiocina que atrai estas células, a IL8, não mostrou um
aumento correspondente. Provavelmente os neutrófilos aumentados podem estar relacionados
às plaquetas elevadas, pois os trombócitos também podem regular o tráfego de muitos tipos de
leucócitos, incluindo os neutrófilos (70). Na DC, a contagem de leucócitos demonstrou uma
37
baixa precisão (de 54%) na detecção de doença endoscopicamente ativa, com sensibilidade de
55% e especificidade de 50% (71). As plaquetas têm uma boa correlação com a atividade
inflamatória, mas o seu aumento não pode ser atribuído apenas à inflamação, portanto sua
contagem não é utilizada na prática clínica como indicador de atividade inflamatória (72).
Na DC, a produção de PCR por hepatócitos tem sido associada à atividade
inflamatória observada por endoscopia, e à gravidade da doença (45, 73, 74). O ponto de corte
de 5 mg/L para PCR apresentou uma acurácia de 66% na detecção de inflamação endoscópica,
com uma sensibilidade de 68% e especificidade de 58% (71). A baixa sensibilidade indica que
valores de PCR menores que 5 mg/L não excluem de forma confiável a presença de inflamação
ativa. Sabe-se que alguns indivíduos apresentam polimorfismos no gene desta proteína, fazendo
com que eles produzam menos PCR (42). Neste estudo muitos pacientes (n=14) do grupo RDC
apresentaram PCR acima de 5 mg/L, o que poderia indicar atividade da doença. Porém, 50%
destes pacientes tinham exames de colonoscopia ou RM, que indicaram remissão da doença em
todos estes indivíduos, o que mostra uma limitação na especificidade da PCR.
Os resultados no grupo ADC devem ser interpretados com cautela, devido ao
pequeno tamanho amostral. Os monócitos estavam aumentados neste grupo, quando comparado
aos grupos RDC e HC, e apenas um paciente tinha PCR menor que 5 mg/dL. Principalmente,
o subtipo CD14+ CD16+ de monócito está aumentado no sangue periférico de pacientes com
DC em atividade e foi sugerido que estas células poderiam ser utilizadas como um marcador
sérico de inflamação intestinal (21,22). Curiosamente, o aumento de monócitos não foi
acompanhado por um aumento correspondente de CCL2. Considerando que a maioria desses
pacientes estava na terapia com infliximabe, os valores normais de CCL2 neste grupo podem
ser atribuídos ao uso de infliximabe, conforme relatado por Magnusson et al (67). Um aumento
no número de pacientes neste grupo e exames de colonoscopia para comprovar a atividade
inflamatória intestinal são necessários para uma melhor interpretação desses resultados.
Quando os grupos RDC e ADC foram combinados (grupo DC) e comparados ao
grupo HC, observamos algumas diferenças estatísticas nas quantidades de gordura visceral,
avaliadas por meio da DEXA e medida da CC. O grupo DC apresentou maiores quantidades de
gordura visceral, o que pode ser justificado pela hipertrofia do VAT apresentada por pacientes
com DC (54). O aumento do VAT já foi relatado em outros estudos e está relacionado com um
pior prognóstico da DC (52, 53). Principalmente ao redor da área intestinal inflamada, ocorre
um aumento no número de adipócitos (“creeping fat”) e alterações na produção de citocinas, e
isto pode influenciar a atividade inflamatória intestinal (54). Além desse excesso de gordura
38
abdominal, 45% dos pacientes com DC deste estudo também apresentaram sobrepeso ou
obesidade. A porcentagem de pacientes com excesso de peso corporal parece estar aumentando,
pois o nosso estudo de 2013, também feito no ambulatório de DII do Gastrocentro, mostrou que
de 68 pacientes com DC, 36% tinham sobrepeso ou obesidade (75). O aumento na prevalência
de sobrepeso e obesidade em pacientes com DC tem sido relatado em outros estudos (48, 76),
pacientes portugueses com DC (n=78) apresentaram uma taxa de 32% de sobrepeso e 8% de
obesidade (77) e outro estudo feito na Escócia mostrou que de 489 indivíduos com DII, 38%
tinham sobrepeso e 18% obesidade (78). O excesso de peso, também, vem atingindo a
população pediátrica, um estudo multicêntrico nos Estados Unidos, encontrou um percentual
de 23,6% de sobrepeso ou obesidade em 1598 crianças com DII (79). O tecido adiposo
representa um órgão metabolicamente ativo, que produz adipocinas com efeitos
proinflamatórios, as quais podem contribuir com a atividade inflamatória da DC (48). O
aumento do IMC e das quantidades de gordura mesentérica foram associados a maiores níveis
de PCR e a uma maior taxa de doença estenosante ou penetrante (52, 80). Pesquisas futuras são
necessárias para permitir uma melhor compreensão dessa interação complexa entre a doença de
Crohn e a obesidade.
A adiponectina é uma adipocina anti-inflamatória e parece ter um papel na DC (59).
Um aumento de adiponectina no grupo DC foi verificado, o mesmo foi observado por Karmiris
et al. (61), confirmando os dados de que o VAT na DC produz mais adiponectina (58, 59).
Entretanto, outros estudos apresentaram resultados diferentes: Valentini et al. (60) encontraram
reduções de adiponectina sérica em pacientes com DC e Waluga et al. (55) não encontraram
diferenças entre pacientes com DC e controles. Estes estudos incluíram indivíduos que usavam
medicamentos anti-inflamatórios esteroides ou não esteroides e imunossupressores, o que
dificulta a análise desses resultados. Sabe-se que o tratamento com esteroides pode suprimir a
secreção de adiponectina (59), com isso os efeitos dos medicamentos nos níveis desta proteína,
podem ter levado a estes resultados controversos.
A resistina possui efeitos pró-inflamatórios e já foi correlacionada com o escore da
atividade da doença, contagem de leucócitos e PCR (60, 81). Nós e outros autores encontramos
um aumento nos níveis de resistina no soro de pacientes com DC (55, 60, 61). Além disso,
Karmiris et al. (82) determinaram níveis de leptina, adiponectina e resistina no soro de 17
pacientes com DC antes e após o tratamento com infliximabe. Apenas a resistina foi
significativamente reduzida após a terapia. Eles sugeriram que na DC a resistina poderia ser
usada como marcador de terapia bem-sucedida. Um ponto vulnerável desse trabalho é que não
39
havia grupo de controle. Em nosso estudo não é possível interpretar o papel do anti-TNF-α no
controle da resistina, uma vez que os pacientes não realizaram a dosagem desta proteína antes
da terapia.
Com relação a leptina, assim como Valentini et al. (60), nós verificamos que as
quantidades séricas desta adipocina em pacientes com DC eram semelhantes ao grupo controle,
diferente de dois outros estudos que mostraram reduções (55, 61). Apesar da leptina não
apresentar correlação com a atividade da doença (60, 61), estudos indicam que o TNF-α pode
diminuir a síntese de leptina durante a inflamação crônica (83, 84). Franchimont et al. (85) e
Waluga et al. (55) demonstraram que o tratamento com infliximabe ou AZA aumentam os
níveis de leptina. Desta forma, acreditamos que neste estudo os níveis similares de leptina
circulante entre os grupos DC e HC, podem ser justificados pelo uso de infliximabe e AZA pelo
grupo DC. Os valores controlados de TNF-α encontrados no grupo DC, indicam que não houve
a inibição na produção de leptina.
A principal limitação deste estudo é ter uma amostra pequena de pacientes do grupo
ADC. Embora o IADC falhe algumas vezes na identificação de inflamação intestinal ativa, nós
constatamos que 15 pacientes do grupo RDC apresentavam imagens de colonoscopia e ou de
RM, que indicaram ausência de inflamação em 14 deles. Como a CCL2 está fortemente
reduzida no grupo RDC, acreditamos que esta quimiocina pode ser utilizada como preditor de
mucosa saudável, reconhecendo, no entanto, a necessidade de ampliar a amostra de pacientes
para a confirmação desta hipótese.
6- CONCLUSÃO
Os pacientes com doença de Crohn deste estudo estavam em sua maioria em
remissão clínica da doença, mostrando a eficácia das terapias com anti-TNF-α e azatioprina.
Foi identificado nestes pacientes um aumento na gordura intra-abdominal, que pode estar
relacionada a hipertrofia do tecido adiposo mesentérico, a qual pode ter levado às alterações
das adipocinas séricas, com aumento da resistina e adiponectina.
Mesmo em remissão, os pacientes apresentaram elevações nas contagens de
neutrófilos e plaquetas, e nos níveis de proteína C reativa. Por outro lado, estes pacientes
mostraram reduções acentuadas de CCL2 e consequente controle de monócitos, indicando que
40
apenas a CCL2 poderia ser utilizada como um biomarcador sérico de controle da doença de
Crohn.
41
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8- APÊNDICES
8.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para Adultos
Título da pesquisa: Influência da obesidade no quadro clínico e inflamatório de pacientes com Doença de
Crohn
Responsáveis: Júlia Figueiredo Machado e Profa. Dra. Maria Marluce Dos Santos Vilela.
Número do CAAE: 32192614.0.0000.5404
Você está sendo convidado a participar como voluntário de um estudo. Este documento, chamado Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido, visa assegurar seus direitos e deveres como participante e é elaborado em
duas vias, uma que deverá ficar com você e outra com o pesquisador.
Por favor, leia com atenção e calma, aproveitando para esclarecer suas dúvidas. Se houverem perguntas
antes ou mesmo depois de assiná-lo, você poderá esclarecê-las com o pesquisador. Se preferir, pode levar para
casa e consultar seus familiares ou outras pessoas antes de decidir participar. Se você não quiser participar ou
retirar sua autorização, a qualquer momento, não haverá nenhum tipo de penalização ou prejuízo.
Justificativa e objetivos:
Esta pesquisa tem o objetivo de avaliar se o excesso de peso corporal pode influenciar a Doença de
Crohn (DC). Para isso, serão avaliados os sintomas da doença, a inflamação e o estado nutricional dos pacientes.
O conhecimento da relação entre a obesidade e a Doença de Crohn é essencial para o direcionamento do
tratamento e acompanhamento da doença.
Procedimentos:
Participando do estudo você está sendo convidado a comparecer (em jejum de 12 horas) no Centro de
Investigação em Pediatria (CIPED) - UNICAMP, em apenas um dia (a ser combinado) para:
Uma entrevista com o profissional da área de nutrição, para coleta de informações sobre a Doença de
Crohn e alimentação (máximo 20 minutos);
Coleta de 20 ml de sangue para a realização de exames;
Exames antropométricos (peso, altura e medida do abdômen) (máximo 10 minutos);
Exame de composição corporal pelo aparelho de Absortometria Radiológica de Dupla Energia (máximo
30 minutos);
Observação: um grupo controle (com indivíduos sem a doença de Crohn e sem outras doenças) será
incluído no estudo para comparações.
Desconfortos e riscos:
Você não deve participar deste estudo se:
For portador de outras doenças;
Tiver algum implante metálico (dispositivo intra-uterino – DIU, válvula cardíaca, placa, pino, parafuso,
piercing, prótese metálica, aparelho ortodôntico) ou implante eletrônico (marca-passo cardíaco);
Suspeitar de gravidez.
Como todos os processos de raios-X, o aparelho de Absortometria Radiológica de Dupla Energia
carrega um ligeiro risco de causar câncer. Esse risco, no entanto, é muito pequeno, especialmente porque muito
50
pouca radiação é realmente utilizada neste procedimento. Todos os procedimentos de segurança serão feitos
durante o exame.
Na coleta de sangue, será necessária a introdução de uma pequena agulha na veia, o que irá ocasionar
uma dor muito leve, já que a agulha é de pequeno calibre. Um enfermeiro com experiência irá fazer a coleta do
sangue, seguindo todos os procedimentos adequados, com o objetivo de minimizar esta dor.
Benefícios:
A partir destes exames os participantes terão informações sobre sua saúde:
Saúde dos ossos;
Composição corporal (gordura e massa muscular);
Lipídeos séricos;
Inflamação;
Glicemia de jejum.
Estes exames mostram o estado de saúde dos participantes e contribuirão no seu atendimento
ambulatorial, já que estará disponível nos prontuários de cada paciente.
Além disso, o estudo dos dados coletados ajudará a esclarecer se a obesidade em portadores da doença
de Crohn pode trazer prejuízos no tratamento e controle da doença. A partir deste estudo, medidas para o
controle da obesidade no ambulatório de Doença de Crohn poderão ser implantadas, contribuindo com o
tratamento dos pacientes.
Acompanhamento e assistência:
Os participantes passarão por apenas um dia de avaliação. Após esta avaliação, os pesquisadores
entrarão em contato com cada participante informando os resultados dos exames. Os exames também estarão
disponíveis nos prontuários para o acompanhamento médico. Caso seja detectada alguma alteração nos exames,
a equipe médica responsável pelos pacientes será informada, para que medidas adequadas sejam tomadas.
Sigilo e privacidade:
Você tem a garantia de que sua identidade será mantida em sigilo e nenhuma informação será dada a
outras pessoas que não façam parte da equipe de pesquisadores. Na divulgação dos resultados desse estudo, seu
nome não será citado. Os resultados do estudo não constarão nos prontuários, porém os exames médicos e
nutricionais de cada paciente estarão disponíveis no prontuário médico.
Ressarcimento:
Não haverá ressarcimento de despesas (por exemplo, transporte, alimentação, diárias etc.). Os
participantes receberão um lanche (biscoitos e suco), após coleta de sangue. O estudo será feito durante a rotina
do participante, nos dias de consultas médicas ou nos dias em que os participantes comparecem ao hospital para
retiradas de medicamentos.
Contato:
Em caso de dúvidas sobre o estudo, você poderá entrar em contato com:
Profa. Dra. Maria Marluce dos Santos Vilela: Fone: 55-19-35218973; Fax: 55-19-3521.8972. Centro de
Investigação em Pediatria - CIPED, Faculdade de Ciências Médicas – UNICAMP, Rua Tessália Vieira de
Camargo, 126, CEP 13083-970, Campinas – SP.
51
Júlia Figueiredo Machado: Fone: 55-19-35218989; Cel: 55-19-93025424; Email: [email protected].
Centro de Investigação em Pediatria-CIPED, Faculdade de Ciências Médicas – UNICAMP. Rua Tessália
Vieira de Camargo, 126, CEP 13083-970, Campinas – SP.
Em caso de denúncias ou reclamações sobre sua participação no estudo, você pode entrar em contato com a
secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP): Rua: Tessália Vieira de Camargo, 126; CEP 13083-887
Campinas – SP; telefone (19) 3521-8936; fax (19) 3521-7187; e-mail: [email protected]
Consentimento livre e esclarecido:
Após ter sido esclarecimento sobre a natureza da pesquisa, seus objetivos, métodos, benefícios previstos,
potenciais riscos e o incômodo que esta possa acarretar, aceito participar:
Nome do(a) participante: _____________________________________________________________________
Data: ____/_____/______.
_____________________________________________________
(Assinatura do participante ou nome e assinatura do responsável)
Responsabilidade do Pesquisador:
Asseguro ter cumprido as exigências da resolução 466/2012 CNS/MS e complementares na elaboração
do protocolo e na obtenção deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Asseguro, também, ter explicado
e fornecido uma cópia deste documento ao participante. Informo que o estudo foi aprovado pelo CEP perante o
qual o projeto foi apresentado e pela CONEP, quando pertinente. Comprometo-me a utilizar o material e os
dados obtidos nesta pesquisa exclusivamente para as finalidades previstas neste documento ou conforme o
consentimento dado pelo participante.
______________________________________________________
Data: ____/_____/______.
___________________________________
(Assinatura do pesquisador)
52
8.2 Ficha de coleta de dados
53
54
8.3 Artigo submetido para a revista Inflammatory Bowel Disease
CCL2: A marker of clinical remission in patients with Crohn’s Disease
Júlia Figueiredo Machado, MSc1; Cláudio Saddy Rodrigues Coy, PhD, MD2; Daniéla Oliveira
Magro PhD2; Maria Rita Lazzarini Barreto, MSc2; Lia Furlaneto Marega, MSc1; André Moreno
Morcillo, PhD, MD1, Raquel Franco Leal, PhD, MD2; Maria de Lourdes Setsuko Ayrizono,
PhD, MD2; Maria Marluce dos Santos Vilela, PhD, MD1*.
1 Center for Investigation in Pediatrics, Pediatrics Department, Medical Sciences Faculty,
University of Campinas - UNICAMP, Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, CEP 13083-970,
Campinas, São Paulo, Brazil, Fone: 55-19-3521.8973 and Fax: 55-19-3521.8970.
2 Gastrocenter - Coloproctology Unit, Surgery Department, Gastrocenter, Medical Sciences
Faculty, University of Campinas, Rua Carlos Chagas, 420, CEP 13083-878, Campinas – São
Paulo, Brazil.
Emails: [email protected]; [email protected]; [email protected];
[email protected]; [email protected]; [email protected];
[email protected]; [email protected]; [email protected].
*Correspondence to: [email protected].
Acknowledgments
The Research Support - Regular Fapesp 2008 / 53902-3, Foundation for Research Support of
the State of São Paulo, supported this work.
55
Abstract
Background Monitoring of clinically silent disease is critical to differentiate patients who will
remain quiescent from those at risk of disease reactivation. The aim of this study is to analyze
the inflammatory activity in Crohn's Disease patients with Activity Index (CDAI) score <150
using biologic markers from peripheral blood.
Methods A group of 25 adults with CD under anti-TNF-α associated or not to azathioprine
therapy and 29 health controls (HC) were enrolled to the study. All patients had a Crohn's
Disease Activity Index (CDAI) score <150 and in 60% of them, colonoscopy or magnetic
resonance imaging (MRI) was performed. All participants were evaluated by body mass index
(BMI) and dual energy X-ray absorptiometry (DXA). Serum level of TNF-α, IL-8, leptin,
adiponectin, resistin, CCL2, C-reactive protein (CRP) and leukocyte as well as platelet counts
were measured in all participants.
Results: The groups had similar nutritional status. The colonoscopy was normal in almost all
patients and only one showed mild inflammatory activity. The MRI was normal in all patients.
When compared to the HC group, the CD group showed CCL2 significantly reduced (p <0.001),
similar monocyte count, similar TNF-α, IL-8, leptin and adiponectin levels, increased
neutrophil and platelet counts, as well as CRP and resistin levels.
Conclusions Patients with Crohn's disease considered in remission by the CDAI show marked
reduction of CCL2 and consequent normal monocyte counts, indicating that this chemokine is
a promising biomarker for control of Crohn's disease.
Keywords: Crohn’s disease, Biologic markers, CCL2, monocytes
56
Introduction
The diagnosis of Crohn's Disease (CD) represents a challenge in clinical practice because it is
based on a combination of clinical and laboratory findings, endoscopy with histological
analysis, and imaging findings. In addition, the evaluation of inflammatory activity and of the
effects of drug therapies during clinical follow-up of patients repeats this whole tool
requirement, which employs the combination of signs and symptoms such as Crohn’s Disease
Activity Index (CDAI), biochemical markers, magnetic resonance imaging (MRI) and
endoscopy with biopsy and histopathology. This is necessary because often patients in clinical
remission may present a degree of subclinical inflammation in the intestinal mucosa, which
predict to a risk of relapse.1–3
MRI, for example, is a high-cost method and susceptible to interobserver variability
even when scoring systems are used to minimize this variation. Thus, MRI limitations do not
encourage its indication to assess inflammation in these patients.2,4 The CDAI is the most used
in clinical practice; it consists of a score system with markers, which includes subjective
symptoms, objective signs and laboratory test results and the Harvey-Bradshaw Index, which
is a simplified version of the CDAI. Measurement of clinical activity is important, but it is no
longer sufficient to measure tissue inflammation.5 Endoscopic evaluation is considered an
excellent method in predicting inflammatory activity in the intestinal mucosa of CD patients.
On the other hand, this examination is invasive and time consuming which requires anesthesia,
which is often a burden for the patient, so it is not suitable for routine use.3 This complexity of
interventions raises the cost of diagnosis and clinical follow-up of patients without the
counterpart of accuracy in the intensity of inflammation in the intestine. Therefore, research has
sought laboratory markers that indicate the presence or absence of inflammatory activity, easy
to apply, minimally invasive and inexpensive.2,3
57
Several biomarkers have been proposed to evaluate disease activity, including
erythrocyte sedimentation rate (ESR), C-reactive protein (CRP), and, more recently, fecal
calprotectin and lactoferrin6. However, sensitivity and specificity have been a concern for each
of these markers7. According to Karczewski J et al.8, most of the systemic markers used in the
follow-up of CD patients appear to have low sensitivity and specificity in detecting intestinal
inflammation, and often do not correlate with CDAI. Jones J et al.9 found no correlation
between CDAI and serum CRP, fecal lactoferrin or calprotectin.
Many cytokines and chemokines are increased in CD patients and appear to play a key
role in the induction of inflammation and intestinal tissue damage.10 Tumor necrosis factor
alpha (TNF-α), produced by macrophages and activated monocytes, is strongly involved in the
pathogenesis of CD11 and its blockade has been successful in the management of its treatment.12
The main role of chemokines is to regulate cell traffic.13 IL-8, an important activator and
chemoattractant for neutrophils, has been implicated in the pathogenesis of inflammatory
diseases and shows a good correlation with the endoscopic/histological grades of intestinal
inflammation in CD patients.14–15 The expression of CCL2, a chemokine known as monocyte
chemoattractant protein 1 (MCP-1), is increased in the intestinal mucosa of patients with CD,
and this increase was correlated with a high degree of intestinal inflammation.16–18 CCL2 is
among the most studied members of the chemokine family and has been shown to be a potential
intervention point for the treatment of chronic diseases such as multiple sclerosis19 and
rheumatoid arthritis.20
CD patients have a hypertrophy of the visceral adipose tissue (creeping fat) that
surrounds the mesentery, and intramural infiltrations of lipids in the intestinal wall can be
visualized in computed tomography.21 Recently, it has been suggested that this hypertrophy
could cause alterations in the secretion of adipokines and thus play a central role in the
58
inflammatory process, increasing disease activity.21,22 These adipokines correlate with the
activity of a variety of autoimmune and infectious diseases.23,24
In this context, as there is a lack of good predictors of disease progression and a low
correlation among symptoms and intestinal lesions8, our main objective was to analyze the
inflammatory activity in Crohn's Disease patients with Activity Index (CDAI) score <150 using
serum markers such as CRP, cytokine (TNF-α), adipokines (leptin, adiponectin and resistin),
chemokines (IL-8 and CCL2), neutrophil, monocyte and platelet counts.
Methods
Crohn’s Disease (CD) patients and Healthy Controls (HC)
Twenty-five patients diagnosed with CD (13 females, 12 males) were recruited from February
to December 2015 in the Inflammatory Bowel Disease Outpatient Clinic, Coloproctology Unit
of the University of Campinas Clinical Hospital. The CD diagnosis was based on endoscopic
and histopathological findings. The HC group consisted of twenty-nine individuals (11 females,
18 males).
Exclusion criteria included the presence of any other inflammatory or metabolic disease,
pregnancy and corticosteroids. Healthy subjects were included if they did not have any disease.
For the evaluation of disease activity, the Crohn’s Disease Activity Index – CDAI was
used. All patients had disease remission, with the CDAI score <150. Fifteen patients had
endoscopy or MRI scans. Fourteen had no inflammatory activity and one had mild activity. The
clinical characteristics of the disease were evaluated according to the Montreal classification,
which considers age of onset (A), disease location (L) and disease behaviour (B).
Body composition
Nutritional status was additionally assessed using anthropometric parameters. Body weight,
body height and waist circumference (WC) were measured. Body mass index (BMI) was
59
calculated from weight and height (kilograms per meter squared). Dual energy X-ray
absorptiometry (DXA) was performed to provide data on percentage body fat and visceral fat
amount.
Laboratory Tests
Blood samples were collected in the morning after an overnight fast. Dosages of plasma
lipoproteins, glucose, CRP, leukocyte and platelets were performed using standard techniques
at the University of Campinas Clinical Hospital.
A portion of the blood was centrifuged 10 min after collection and serum samples were
immediately frozen at -80 ℃, to be used in analysis of cytokines and adipokines.
Serum levels of TNF, IL-8, leptin, adiponectin, resistin and CCL2 were measured by
radioimmunoassay (MILLIPLEX MAP Human Adipokine Magnetic Bead Panel 1 and 2 -
Endocrine Multiplex Assay). All laboratory tests were performed according to the instructions
provided by the manufacturers.
Statistical analyses.
Statistical analyses were performed using SPSS 16.0 software package. Descriptive variables
are presented as medians with range, and categorical variables as frequencies. Comparison of
categorical data between the groups was performed using the χ² method or Fisher exact test.
Comparisons among the groups was performed using the Student T or Mann Whitney test. The
log transformation was used on some variables. A level of 5% significance was established.
Ethical Considerations
Written informed consent from all participants was obtained. The ethics committee of the
University of Campinas (reference number 32192614.0.0000.5404) approved the study.
Results
In total, 25 patients with a 42-year median age and 29 controls with a 33-year median age were
included in the study.
60
Clinical characteristics
The main treatments were anti-TNF and azathioprine (AZA), and the most used anti-TNF was
infliximab, only two patients used adalimumab. Table 1 shows the clinical characteristics of the
patients.
The CD and HC groups were found to be similar in terms of average age and gender
ratios (Table 2). The clinical and nutritional characteristics of all the participants included in
the study are presented in Table 2.
CD patients presented similar nutritional status to the HC group. Only the mean waist
circumference was higher in the CD group. The CD group presented lower cholesterol and HDL
levels and higher glucose levels than the HC group.
Inflammatory Biomarkers
Table 3 shows the data of the inflammatory markers in the CD and HC groups. Some
statistical differences were verified between the groups. Patients in the CD group had lower
levels of CCL2 when compared to the HC group (p <0.001). On the other hand, monocytes
were similar in the two groups. Leukocytes, neutrophils, platelets and CRP were increased in
the CD group (p=0.018, p=0.013 and p=0.009, p=0.009, respectively). Figure 1 shows the
distribution of serum leukocytes, lymphocytes, neutrophils, monocytes, CRP and CCL2 in the
CD and HC groups.
When IL-8 and TNF cytokines were dosed in the serum, many patients had values
outside the range (below the detection limit of the assay). Considering only the participants
with these cytokines detected, there were no differences between the groups.
Leptin and adiponectin were not different between the two groups; however, CD
patients had significantly higher resistin levels than HC (p=0.031).
61
Discussion
In this study, we verified that the chemokine CCL2 was significantly reduced in the CD group
when compared to the HC group and monocytes were similar in the two groups. However,
leukocytes, platelets and CRP were increased in the CD group.
CCL2 is a potent chemotactic factor for monocytes18, and macrophages in intestinal
inflammation originates exclusively from blood monocytes.25 The expression of CCL2 in the
intestinal mucosa is correlated with the degree of endoscopic inflammation and with a greater
severity of CD.16,17. Our results show a normal number of monocytes associated with significant
reduction of CCL2 in the remission patients. Considering that most of these patients were on
infliximab therapy, the reduction of CCL2 can be attributed to the use of this medication, as
reported by Magnusson MK et al.26 Reduction in serum levels of CCL2, and normalization of
monocyte numbers in the CD group are biological markers strongly indicative that the patients
are in the disease control phase. Most likely, the major consequence is a reduction of
macrophages in the areas of intestinal inflammation.
Compared to the HC group, the CD patients showed an increase in neutrophil and
platelet counts while lymphocyte and monocyte counts were similar. Although there is an
increase of the neutrophils, IL8 did not show a corresponding enhance. Probably, increased
neutrophils may be related to elevated platelets, as thrombocytes regulate the traffic of many
types of leukocytes, including neutrophils.27 The role of leukocytes in the pathogenesis of CD
has been reinforced in the studies with selective granulocyte and monocyte apheresis (GMA),
which have shown promising results in the non-pharmacological treatment of CD patients.28,29
Despite this, total leukocyte count has a low sensitivity of 45.4% in the analysis of disease
activity.30 Platelets have a good correlation with the inflammatory activity of CD, but their
increase cannot be attributed solely to inflammation, so its count is not used in clinical practice
62
as an indicator of inflammatory activity6. In view of these observations, we believe that the
inclusion of neutrophil, monocyte and platelet counts in the CDAI scores could improve the
detection of active patients. We note that one patient under infliximab and azathioprine therapy
showed leukocytosis (> 11,000 cells / mm3) with neutrophilia (> 7,500 cells / mm3) and
monocytosis (> 800 cells / mm3). Despite this, he did not present signs of active inflammation
by colonoscopy neither by CCL2, CRP, TNF-α, IL-8 serum levels, but he has had more severe
clinical evolution characterized by colon penetrating disease and perianal involvement. Another
patient with non-penetrating, non-stricturing colon disease showed only monocytosis.
The majority of patients were on anti-TNF and / or AZA therapy, indicating an effective
action of these drugs on monocyte and lymphocyte counts. Infliximab, in addition to
neutralizing soluble TNF, blocks the anti-apoptotic membrane TNF signaling (mTNF) from
monocytes to T cells on the lamina propria. Thus, the tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR-
2) of T cells is activated for pro-apoptotic signaling. The mechanism of infliximab-induced
apoptosis in monocytes of CD patients remains obscure.31 The major immunosuppressive
activity of AZA (purine antimetabolite) is to inhibit cell proliferation, especially T lymphocytes.
Other mechanisms include the inhibition of genes related to inflammatory proteins and genes
related to the trafficking of leukocytes to the intestine, such as the TNF-related apoptosis
inducing ligand (TRAIL), tumor necrosis factor receptor superfamily, member 7 (TNFRS7)
and alpha -4-integrin.32
Regarding leptin and adiponectin, no significant differences were found between the
groups. Studies of adiponectin in CD patients show controversial results. Steroid treatment
suppressed adiponectin secretion33, while adipokine reduction was found in patients using
steroidal or non-steroidal anti-inflammatory drugs34 and there was no difference in adiponectin
among patients receiving AZA-associated corticosteroid.35 Our results and from other authors
63
show an increase in serum levels of resistin in CD patients.34–36 Resistin has been correlated
with the disease activity score, leukocyte count and CRP.34,37 In addition, Karmiris et al.38
determined leptin, adiponectin and resistin serum levels in 17 patients with CD before and after
infliximab treatment. Only resistin levels were significantly decreased following infliximab
therapy. They suggested that in CD the resistin can be used as a marker of successful therapy.
A vulnerable point of this work is that there was no control group. In our study, since patients
did not perform resistin dosing prior to infliximab, we cannot interpret their role in controlling
the secretion of this cytokine.
In CD, the production of CRP by hepatocytes has been associated with inflammatory
activity observed in clinic, endoscopy and histology.39 In this study, CRP levels were higher in
the CD group than in the HC group. However, several reports have shown inconsistent and
controversial correlations between CRP and CDAI.40-42 Additionally, patients with low CRP
are not always in remission, and may have active endoscopic lesions and CDAI elevated,43,44
confirming the low sensitivity of 60% of this protein.31
It is observed that many of these studies focus their efforts on the search for markers for
inflammatory activity and neglect the analysis of those markers that could predict disease
inactivity. The results of this study allow us to recommend inclusion in the CDAI score of the
serum CCL2 dosage and peripheral blood monocyte count as predictors of Crohn's disease
inactivity. This will need further exploration, but if these findings hold up in robust larger
studies, they will be a welcome addition to clinical care where neutrophil and monocyte counts
and CCL2 dosage are readily obtainable.
64
Conclusion
Patients with Crohn's disease considered in remission by CDAI show marked reduction of
CCL2 and consequent normal monocytes counts, indicating that this chemokine is a promising
biomarker for control of Crohn's disease.
Acknowledgments
The Research Support - Regular Fapesp 2008 / 53902-3, Foundation for Research Support of
the State of São Paulo, supported this work. The measurement of cytokines was made by the
Central Laboratory of High Performance Technologies (LaCTAD) using the equipment
Multiplex Immunoassay of Bio-Rad brand, Bio-plex 200 model.
Disclosure of conflict of interest
None.
65
Table 1 Clinical characteristics of the patients included
in the study CD (n=25)
Disease duration, years 14 (1–23)
Evacuations per day 2 (1–8)
Treatments
Previous intestinal surgery 19
Number of surgeries 1 (0–4)
Anti-TNF 7
Anti-TNF + Azathioprine 9
Azathioprine 6
Without immunosuppressant 2
Without medication 1
Montreal classification*
Age at diagnosis (A1/A2/A3) 5/16/4
Location (L1/L2/L3/L4) 5/11/9/0
Behavior
B1/B2/B3/P 5/7/2/3
B1+P/ B2+P/B3+P 4/1/3 *Montreal classification:
(A1)16 years or younger/(A2) 17 to 40 years/(A3) older than 40 years.
(L1) ileum/(L2) colon/(L3) ileocolon /(L4) upper gastrointestinal tract.
(B1) nonstricturing and nonpenetrating/(B2) stricturing/(B3) penetrating/
(P) perianal
66
Table 2 Clinical and nutritional characteristics of the patients and health controls
CD (n=25) HC (n=29) p value
Male/Female 12/13 11/18 0.583
Age (year) 42 (22–58) 33 (21–57) 0.109
Smoking habit (active/ex
smokers/never)
0/6/19 0/3/26 0.275
Physical activity (sedentary/active) 16/9 15/14 0.283
Body composition
BMI (Kg/m²) 24.1 (16.1–34.4) 23.41(17.7–31.6) 0.276
Waist circumference (cm) 79.5 (66–107.5) 75 (61.4–97.5) 0.028*
Visceral fat (g) 617 (42–2832) 274 (13–1516) 0.118
Body fat percentage 34.1 (13.1–52.1) 33 (15.7–48.5) 0.684
Laboratory tests
(n=21) (n=28)
Total cholesterol (mg/dL) 152 (9–228) 185.5 (130–257) 0.005*
HDL (mg/dL) 49 (31–67) 56 (33–93) 0.045*
LDL (mg/dL) 97.1 (37–176) 111 (48–193) 0.217
VLDL (mg/dL) 17 (7–35) 15.5 (6–51) 0.634
Triglycerides (mg/dL) 85 (36–177) 77.5 (31–254) 0.937
Glucose (mg/dL) 82 (59–103) 77.5 (62–97) 0.024* *p<0.05; BMI: Body Mass Index
67
Table 3 Inflammatory Biomarkers
CD HC p value
Hemoglobin (g/dL)
(n=22)
14 (10.4–17.7)
(n=26)
13.95 (12–16.8)
0.709
Hematocrit (%) 42.1 (33.6–51.4) 41.3 (35–47.6) 0.244
Platelets (x10³/mm³) 284.5 (166–534) 232 (152–336) 0.009*
Leukocyte (x10³/mm³) 5.865 (4.66–11.5) 5.27 (2.87–7.74) 0.018*
Lymphocytes (x10³/mm³) 1.845 (0.7–2.91) 1.825 (0.85–3.16) 0.759
Neutrophils (x10³/mm³) 3.750 (2.16–7.93) 3.055 (1.06–5.39) 0.013*
Monocytes (x10³/mm³) 0.435 (0.28–1.23) 0.430 (0.21–0.72) 0.268
(n=6) (n=21)
TNF-α (pg/mL) 3.88 (1.33–6.53) 2.49 (0.32–8.11) 0.471
(n=15) (n=20)
IL-8 (pg/mL) 5.65 (0.38–38.3) 4.28 (1.13–12.01) 0.550
(n=25) (n=27)
CRP (mg/L) 6 (0.1–90) 0.9 (0.2–8.3) <0.001*
(n=24) (n=29)
Leptin (ng/dL) 8.27 (0.41–71.85) 7.60 (0.3–50.57) 0.931
Adiponectin (μg/dL) 21.99 (2.26–550.21) 15.74 (0.29–106.91) 0.077
Resistin (ng/dL) 57.44 (18.68–147.26) 41.49 (0.53–119.2) 0.031*
CCL2 (pg/dL) 166.72(58.43–376.21) 349.51 (126.7–818.04) <0.001* *p<0.05; TNF-α: factor de necrosis tumoral alpha; IL-8: Interleukin-8; CRP: C-reactive protein;
CCL2: C-C Motif Chemokine Ligand 2
68
69
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9.1 Carta de Aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da
UNICAMP
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