UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

VANIZE MARTINS GENOVA

EFEITO DA BIOTRANSFORMAÇÃO NA CAPACIDADE ANTIGLICANTE IN VITRO DE EXTRATO DE SOJA

CAMPINAS

2019

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VANIZE MARTINS GENOVA

EFEITO DA BIOTRANSFORMAÇÃO NA CAPACIDADE ANTIGLICANTE IN VITRO DE EXTRATO DE SOJA

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos, Departamento de Alimentos e Nutrição, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Alimentos e Nutrição, com área de concentração em Nutrição experimental e aplicada à Tecnologia de Alimentos

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Gabriela Alves Macedo Esse exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Vanize Martins Gênova e orientada pela Prof.ª Dr.ª Gabriela Alves Macedo.

CAMPINAS

2019

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Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, 130632/2018-0

Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Engenharia de AlimentosMárcia Regina Garbelini Sevillano - CRB 8/3647

Gênova, Vanize Martins, 1989- G288a G_uEfeito da biotransformação na capacidade antiglicante in vitro de extrato de

soja / Vanize Martins Gênova. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.

G_uOrientador: Gabriela Alves Macedo. G_uDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade

de Engenharia de Alimentos.

G_u1. Glicação. 2. Extrato de soja. 3. Isoflavonas. 4. Biotransformação. I.

Macedo, Gabriela Alves. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade deEngenharia de Alimentos. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Effect of biotransformation on the in vitro antiglycant capacity ofsoybean extractPalavras-chave em inglês:GlycationSoybean extractIsoflavonesBiotransformationÁrea de concentração: Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de AlimentosTitulação: Mestra em Alimentos e NutriçãoBanca examinadora:Gabriela Alves Macedo [Orientador]Eliana Setsuko KamimuraHelia Harumi SatoData de defesa: 25-02-2019Programa de Pós-Graduação: Alimentos e Nutrição

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

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BANCA EXAMINADORA

________________________________________________________

PROF.ª DR.ª GABRIELA ALVES MACEDO

FEA/UNICAMP (ORIENTADORA)

________________________________________________________

PROF.ª DR.ª ELIANA SETSUKO KAMIMURA

FZEA/USP (MEMBRO TITULAR)

________________________________________________________

PROF.ª DR.ª HELIA HARUMI SATO

FEA UNICAMP (MEMBRO TITULAR)

A Ata da Defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na

Secretaria do Programa da Unidade.

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“Dedico este trabalho aоs meus amados pais que, cоm muito carinho е apoio, nãо mediram esforços para que eu chegasse аté

esta etapa da minha vida.”

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AGRADECIMENTOS

À Deus, por ser meu guia e meu ajudador em todos os momentos da minha vida.

Aos meus queridos pais, Orlando e Dulcéia e minha queria avó Dinah, por todo apoio,

dedicação, trabalho, esforço e carinho, tornando esse título possível.

À Prof.ª Dr.ª Gabriela Alves Macedo pela oportunidade, apoio e ensinamentos. Meu

respeito e admiração.

À Prof.ª Dr.ª Juliana Alves Macedo pelas contribuições e carinho. Aos Professores da

banca examinadora pela presença e contribuições que servirão para o aprimoramento do

meu trabalho.

À todas as colegas de laboratório, pela companhia, apoio, ajuda e descontração.

À Lívia Dias, pela paciência e pelos grandes ensinamentos durante toda a realização

deste trabalho.

Em especial à Annayara, pela constante dedicação, paciência, apoio e ensinamentos

durante todo o desenvolvimento deste trabalho. À todas vocês, minha eterna gratidão e

amizade.

Aos meus tios e primo, Oswaldo, Regina e Rodolfo, pelo constante apoio, dedicação e

descontração. Meu respeito e admiração.

Aos meus amigos de pensionato e república que foram minha segunda família durante

todo o meu tempo de curso.

À todos aqueles que, apesar de não serem citados, contribuíram de alguma forma para a

realização deste trabalho.

"O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e

financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPQ) – Código de financiamento 130632/2018-0”.

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“Nenhum de nós é tão bom quanto todos nós juntos.”

Warren Bennis

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RESUMO

A reação de glicação ocorre entre uma proteína e um açúcar redutor, originando Bases de Schiff, que se rearranjam a produtos de Amadori, os quais dão origem a AGEs (sigla do inglês (Advanced Glycation end Products). Essa reação pode também ser conhecida como reação de Maillard que ocorre nos alimentos durante o processamento, a qual também origina AGEs, conhecidos como MRPs (Produtos da reação de Maillard). Uma vez que se conhece que o acúmulo de AGEs pode levar ao desenvolvimento de doenças, o estudo sobre o efeito da glicação nas mais diversas matrizes celulares, através de técnicas de quantificação e detecção, se torna importante para a pesquisa científica. A procura por compostos dos mais variados tipos com atividade antioxidante e antiglicante, vêm crescendo nos últimos anos, pois podem apresentar estratégias para o tratamento e controle de doenças relacionadas ao acúmulo dos AGEs. Dentre estes compostos, os fenólicos têm despertado interesse especial por serem abundantes em fontes vegetais da dieta, e, as isoflavonas pertencentes à classe dos flavonoides podem se apresentar como promissoras para esse processo. As isoflavonas na forma glicosilada possuem uma molécula de glicose ligada à sua estrutura e as agliconas não. Uma vez que há a quebra das ligações glicosídicas, pode haver também aumento da biodisponibilidade. Sua estrutura exerce importante influência no seu potencial biológico. Tanto os micro-organismos, quanto enzimas podem exercer atividade de desconjugação. Neste contexto, os micro-organismos probióticos podem ainda conferir diversos benefícios ao estado geral de saúde de um indivíduo, uma vez que atuam melhorando o sistema imunológico, entre outros fatores. A soja é um alimento conhecida pelo seu alto teor de isoflavonas e seus benefícios à saúde. Nosso grupo de pesquisa tem pesquisado nos últimos anos a obtenção e biotransformação de extratos vegetais ricos em fenólicos, empregando enzimas e outros processos biológicos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial antiglicante do extrato hidrossolúvel de soja submetido à diferentes processamentos. Para tanto, foram escolhidos os modelos de glicação in vitro: BSA / Frutose, BSA / Metilglioxal e Arginina / Metilglioxal. Como fonte de isoflavonas, foram testados padrões puros e isoflavonas obtidas do extrato hidrossolúvel puro de soja e biotransformados. Os extratos foram caracterizados quanto ao seu teor de fenóis totais pelo método TPC, capacidade antioxidante pelos métodos ORAC, FRAP e quanto ao perfil e quantificação das isoflavonas por cromatografia líquida de alta eficiência. Para todos os modelos de glicação in vitro, os extratos apresentaram atividade antiglicante dose / dependente, com potências variadas, apresentando inibição da glicação de proteínas entre 7 e 63%, sendo que os extratos que passaram por processos combinados de biotransformação, apresentaram maior capacidade de inibição da glicação de proteínas comparadas ao extrato puro. Os resultados obtidos podem contribuir para mais estudos in vitro e in vivo, a fim de elucidar melhor seus potenciais antioxidantes e antiglicantes de proteínas das isoflavonas, mecanismos de ação, doses de interesse, toxicidade, entre outros, contribuindo para o desenvolvimento desse extrato como um ingrediente funcional.

Palavras chave: Glicação; extrato de soja; isoflavonas; biotransformação.

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ABSTRACT

The glycation reaction occurs between protein and a reducing sugar, that originates Schiff Bases, which rearranges to Amadori Products, originating AGEs (Advanced Glycation end Products). This reaction also occurs during food processing and also generate AGEs, appointed MRPs (Maillard reaction products).Since it is known that the accumulation of AGEs can lead to the development of diseases, the study on the effect of glycation in the most diverse cell matrices, through quantification and detection techniques becomes important for scientific research. The demand for compounds of the most varied types with antioxidant and antiglycant activity has been increasing in the last years, since they can present strategies for the treatment and control of diseases related to the accumulation of AGEs. Among these compounds, phenolics have aroused special interest because they are abundant in vegetable sources of the diet and the isoflavones belonging to the class of flavonoids may present as promising for this process. The isoflavones in the glycosidic form have a glucose molecule attached to their structure and the non-aglycones. Since there is a breakdown of glycosidic bonds, there may also be increased bioavailability. Its structure exerts important influence on its biological potential. Both microorganisms and enzymes can exert deconjugation activity. In this context, probiotic microorganisms can still confer several benefits to the general health of an individual, since they act to improve the immune system, among other factors. Soy is a food known for its high content of isoflavones, and is then characterized with good antioxidant capacity and its health benefits. Our research group has been researching in recent years the obtaining and biotransformation of phenolic-rich plant extracts, using enzymes and other biological processes. Thus, the objective of this study was to evaluate the antiglycant potential of the soybean water soluble extract undergoing different treatments. In order to do so, in vitro glycation models were chosen: BSA / Fructose, BSA / Methylglyoxal and Arginine / Methylglyoxal. As source of isoflavones, pure standards of isoflavones and isoflavones of the biotransformed water soluble soy extracts. Both extracts were characterized as to their phenol content by TPC method, antioxidant capacity by ORAC and FRAP methods and the profile and quantification of isoflavones by high performance liquid chromatography. For all in vitro glycation models, the samples presented dose / dependent antiglycant activity, with varied potencies, presenting inhibition of glycation proteins from 7 to 63% and the samples combined biotransformation processes, showed largest capacity of inhibition of glycation proteins compared to pure extract. The results obtained can help to understand in vitro and in vivo studies in order to better elucidate its antioxidant and antiglycant activity of isoflavones, mechanisms of action, doses of interest, toxicity, among others, contributing to the development of the extract as a functional ingredient. Key words: Glycation; soybean extract; isoflavones; biotransformation.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Figura 1: Reação de Maillard in vivo e a formação de produtos de glicação avançada

(AGE)..............................................................................................................................19

Figura 2: Exemplos de propagadores e seus produtos de glicação avançada

(AGEs).............................................................................................................................20

Figura 3: Exemplos de Produtos de Glicação Avançada (AGEs) derivados de seus

precursores.......................................................................................................................21

Figura 4: Interação de AGE com seu receptor e seus efeitos na sinalização

celular...........................................................................................................................................22

Figura 5: Caminhos que levam à formação de AGEs, acúmulo no organismo e efeitos

na saúde........................................................................................................................................23

Figura 6. Classificação dos compostos fenólicos...........................................................24

Figura 7: Estruturas químicas das isoflavonas glicosiladas e agliconas........................25

Figura 8: O papel dos fitoquímicos na inibição da formação de AGEs.........................27

Figura 9: Conversão de isoflavonas glicosídicas em agliconas através da clivagem da

molécula de glicose..........................................................................................................28

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Figura 10 (a,b): Curva dose / resposta de inibição e inibições máximas da glicação de

proteínas no modelo in vitro BSA/FRU dos padrões puros de isoflavonas

glicosiladas......................................................................................................................44

Figura 11 (a,b): Curva dose/resposta de inibição e inibições máximas da glicação de

proteínas no modelo in vitro BSA/FRU dos padrões puros de isoflavonas

agliconas..........................................................................................................................44


proteínas no modelo in vitro BSA/MGO dos padrões puros de isoflavonas

glicosídicas......................................................................................................................45


proteínas no modelo in vitro BSA/MGO dos padrões puros de isoflavonas

agliconas..........................................................................................................................45

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proteínas no modelo in vitro ARG/MGO dos padrões puros de isoflavonas

glicosiladas......................................................................................................................46


proteínas no modelo in vitro ARG/MGO dos padrões puros de isoflavonas

agliconas..........................................................................................................................46


proteínas no modelo in vitro BSA/FRU dos

extratos.............................................................................................................................49


proteínas no modelo in vitro BSA/MGO dos

extratos.............................................................................................................................50


proteínas no modelo in vitro ARG/MGO dos

extratos.............................................................................................................................50

ANEXOS

Figura 1: Cromatogramas obtidos por HPLC - CLAE - DAD com tempo de retenção

das isoflavonas (Amostra 1 – EHS puro/controle)……………………………………........70


das isoflavonas (Amostra 2 – EHS fermentado (m.o.s))………………………….....…….71


das isoflavonas (Amostra 3 – EHS fermentado (m.o.s) + Tanase…………………….......72


das isoflavonas (Amostra 4 – EHS fermentado (Tanase) + m.o.s)……………………..73


das isoflavonas (Amostra 5 – EHS fermentado (Tanase))………………….....…………..74

Tabela 1: Medida da atividade enzimática específica de tanase do exrato enzimático

semipurificado de Paecilomyces variotti.........................................................................75

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Conteúdo de fenólicos totais pelo método Folin Ciocalteau e atividade

antioxidante pelos métodos ORAC e FRAP dos extratos hidrossolúveis de

soja...................................................................................................................................40

Tabela 2: Concentração de isoflavonas glicosídicas e agliconas nos extratos

hidrossolúveis de soja por análise HPLC - DAD............................................................42

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAPH - 2,2’-azinobis(2-amidinopropano) dihidrocloreto AGEs - Produtos finais de glicação avançada ARG - Arginina AUC - Área sob a curva de decaimento da fluorescência BSA – Albumina de soro bovino EHS - Extrato hidrossolúvel de soja EGCG - Epigalocatequinagalato Eq - Equivalentes FL – Fluoresceína FRAP – Método potencial redutor do íon férrico FRU – Frutose GO – Glioxal HPLC – CLAE - DAD - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos m.o.s – Micro-organismos MGO - Metilglioxal ORAC - Capacidade de absorção do radical oxigênio p/p - Relação peso/peso RAGE – Receptor de múltiplos ligantes ROS – Espécies reativas de oxigênio TPC - Teor de fenólicos totais v/v - Relação volume/volume w/v - Relação massa/volume w/w - Relação massa/massa

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................16

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................................18 2.1. Reação de Maillard, Produto de Glicação Avançada (AGE) e Reação de

Glicação.........................................................................................................18

2.2. Produtos de Glicação Avançada (AGEs) e doenças ....................................20

2.3. Compostos fenólicos presentes na soja.........................................................24

2.4. Correlação dos compostos fenólicos e efeito antiglicante............................26

2.5. Efeitos da biotransformação na conversão de compostos glicosilados para

agliconas.......................................................................................................27

3. OBJETIVOS......................................................................................................29

4. MATERIAL.......................................................................................................29 5. MÉTODOS……………………………………………………………………………..30 5.1.1. Fluxograma de atividades.............................................................................30 5.1.2. Produção de tanase e determinação de atividade

enzimática......................................................................................................31 5.1.2.1. Produção de tanase.................................................................................31

5.1.2.2. Determinação de atividade enzimática...................................................31

6. Obtenção e caracterização dos extratos hidrossolúveis de soja.........................31

6.1. Obtenção do extrato hidrossolúvel de soja...................................................31

6.1.1. Processo de preparo do EHS puro/controle – Amostra 1.............................32

6.1.2. Processo de biotransformação microbiana do EHS puro – Amostra 2........32

6.1.3. Processo de biotransformação microbiana do EHS seguida de

biotransformação enzimática – Amostra 3...................................................33

6.1.4. Processo de biotransformação enzimática do EHS seguida de

biotransformação microbiana – Amostra 4..................................................33

6.1.5. Processo de biotransformação enzimática do EHS puro – Amostra 5.........34

7. Caracterização dos extratos hidrossolúveis de soja...........................................34

7.1. Teor de fenólicos totais...................................................................................34

7.2. Determinação da capacidade antioxidante....................................................34

7.2.1. Capacidade de absorção do radical oxigênio – ORAC................................35

7.2.2. Método FRAP…………..................................................................................35

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7.3. Perfil de compostos fenólicos por análise por cromatografia liquida de alta

eficiência (HPLC – DAD)...............................................................................36

8. Modelos de glicação in vitro...............................................................................36

8.1. Modelo de glicação da albumina de soro bovina (BSA) com frutose

(Fru)................................................................................................................36

8.2. Modelo de glicação da albumina de soro bovina (BSA) com metilglioxal

(MGO).............................................................................................................37

8.3. Modelo de glicação da arginina com metilglioxal (MGO).............................38

9. TRATAMENTO DOS DADOS........................................................................38

10. RESULTADOS E DISCUSSĀO......................................................................39

10.1. Caracterização dos extratos hidrossolúveis de soja......................................39

10.2. Capacidade antiglicante dos padrões de isoflavonas nos modelos de glicação

in vitro.............................................................................................................43

10.3. Capacidade antiglicante dos extratos hidrossolúveis de soja nos modelos de

glicação in vitro..............................................................................................48

11. CONCLUSÕES..................................................................................................53

12. TRABALHOS FUTUROS................................................................................53

13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………....…54

14. ANEXOS………………………………………………………………….…....70

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1. INTRODUÇÃO

Estudos envolvendo a reação de Maillard in vivo iniciaram-se na década de 1970.

Estes, envolvendo a hemoglobina glicada relatam que esta é naturalmente menor em

indivíduos saudáveis, tendo os diabéticos níveis mais elevados (Koenig et al., 1977). O

diabetes mellitus é caracterizado por defeitos na secreção e/ou ação de insulina levando

à hiperglicemia. Isso pode causar disfunções e insuficiência de vários órgãos, como

olhos, rins, nervos, coração e vasos sanguíneos (Diabetes Care, 2008).

Dependendo do grau, duração da hiperglicemia e meia vida da proteína, pode haver

uma reação chamada de glicação, onde um grupo amínico livre de uma proteína reage

com um grupo carbonila de um açúcar redutor, dando origem a uma base de Schiff, que

se rearranja a produtos de Amadori, também conhecidos como proteínas glicadas. Essas,

sofrem modificações tornando-se estruturas desarranjadas, chamadas AGEs (produtos

de glicação avançada), sigla do inglês Advanced Glycation end Products (Ahmed,

2005).

Os AGEs são conhecidos pela sua toxicidade. O dano tecidual se caracteriza pela

comunicação dos AGEs com seus receptores (RAGES), o que ativa vias coagulantes e

pró-inflamatórias (Brownlee et al., 1995; Lapolla et al., 2005) podendo levar ao

desenvolvimento de doença vascular, doença de Alzheimer entre outras desordens

inflamatórias (Thomalley, 2001).

Dessa forma, a modificação das proteínas no corpo, desempenha um papel crítico

nas complicações de doentes diabéticos. A formação de radicais de oxigênio durante a

oxidação de glicose e glicação, mostra que a oxidação de proteínas pode estar envolvida

diretamente na formação de AGE e no processo de ligação cruzada do colágeno (cross-

linking) (Jakuš e Rietbrock, 2004).

Estudos indicam que os compostos fenólicos podem bloquear a formação de AGEs

eliminando intermediários reativos durante a glicação de proteínas. Assim, inibidores

naturais de AGEs podem então aliviar transtornos à saúde causados por eles, (Peng, et

al., 2011) a longo prazo.

A maioria dos compostos fenólicos possuem dois ou mais grupos hidroxila e

possuem capacidade antioxidante, dessa forma são consideradas substâncias bioativas.

Esses compostos podem ser classificados em três grupos, fenóis e ácidos fenólicos,

derivados de ácido hidroxicinâmico e flavonóides (Ho, 1992(a)).

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As duas formas químicas mais conhecidas de isoflavonas presentes na soja, são as

formas glicosiladas: daidzina, genistina e glicitina, as quais possuem maior

complexidade por estarem ligadas a uma molécula de glicose e as formas agliconas:

daidzeína, genisteína e gliciteína, de menor complexidade por não estarem ligadas a

uma molécula de glicose (Penha et al., 2007).

Tyug et al. (2010) relataram a capacidade antioxidante dos compostos fenólicos e

isoflavonas em produtos de soja. A dieta tradicional das populações asiáticas, na qual

têm a soja como importante componente, está parcialmente relacionada com a baixa

incidência de certos tipos de câncer e doenças cardiovasculares (Adlercreutz et al.,

1993).

A forma aglicona é considerada uma forma biologicamente ativa. Para passar da

forma glicosilada para a forma aglicona, a ligação b-glicosídica deve ser rompida.

(Pham e Shah, 2009). Normalmente, em um indivíduo saudável, a conversão das formas

glicosiladas em agliconas é realizada pelos micro-organismos presentes na flora

intestinal. No entanto, isso pode ser variável de pessoa para pessoa. Torna-se

interessante então, o estudo de ferramentas que realizem essa conversão, tornando-a

independente da microbiota intestinal do indivíduo.

O aumento da bioatividade é variável conforme o micro-organismo escolhido para o

processo. Alguns micro-organismos podem melhorar apenas propriedades biológicas,

outros as propriedades físico-químicas ou também podem agir em sinergia em ambas

(Chi e Cho, 2016). Assim, podem conferir também a qualidade de um produto

probiótico, contribuindo para a manutenção da flora intestinal e melhorando diversas

outras condições de saúde associadas a ela.

A enzima Tanase (Tanino Acil Hidrolase E.C.3.1.1.20), é conhecida por sua

capacidade de clivar ligações éster em taninos hidrolisáveis, produzindo ácido gálico e

glicose, atuar sobre polifenóis complexos e agir como enzima de descojugação. Sua

produção foi otimizada por nosso grupo de pesquisa por fermentação do fungo

Paecilomyces Variotti, em meio de cultura composto de farelo de trigo, ácido tânico e

água (Battestin e Macedo, 2007).

O uso do extrato semipurificado de tanase no suco de laranja removeu

glicosídeos da hesperidina e naringenina, alterando seu perfil fenólico final (Ferreira et

al., 2013).

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Atualmente, nosso grupo tem trabalhado com a extração e biotransformação de

extratos vegetais ricos em compostos fenólicos, dentre eles, o extrato de soja. Foi

estudada a biotransformação das isoflavonas do extrato hidrossolúvel de soja para

obtenção de produto rico em equol e isoflavonas bioativas por biotransformação,

utilizando-se usando bactérias ácido lácticas e tanase. Os resultados mostraram que

houve um aumento significativo no conteúdo total de compostos fenólicos para todas as

amostras biotransformadas (p < 0,05). Estes resultados sugerem que a fermentação e o

processo enzimático de biotransformação com tanase melhora a liberação de compostos

fenólicos a partir da matriz do leite de soja (Queirós et al., 2016).

Tendo em vista resultados de estudos recentes, indicando que os compostos

fenólicos podem exercer efeito antiglicante, a ideia de testar o extrato hidrossolúvel de

soja rico em isoflavonas bioativas obtido por biotransformação, poderia inibir reação de

glicação de proteínas foi colocada em prática neste trabalho. Estudar o efeito do

processamento desses extratos com diferentes perfis de isoflavonas, na capacidade

antiglicante de proteínas, pode nos indicar qual seria o melhor processo a empregar para

a produção de um extrato com maior efeito antiglicante.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Reação de Maillard, Reação de Glicação e a formação de Produtos de Glicação

Avançada (AGEs)

Kwon et al. (1965) e Montgomery e Day, (1965) classificaram a reação de Maillard

como àquela que ocorre inicialmente ocorre entre os grupos amínicos livres dos

aminoácidos, peptídeos ou proteínas e os grupos hidroxil-glicosídicos de açúcares

redutores. As primeiras etapas da reação levam à formação de um número de derivados

denominados bases de Schiff, aldose-aminas e compostos de Amadori. As etapas

seguintes se caracterizam pela degradação dos compostos de Amadori, conduzindo à

formação de compostos variados, muitos deles moléculas insaturadas que se

polimerizam (Finot e Magnenat, 1981).

O escurecimento é a maior característica final da reação de Maillard. A cor

produzida, a sua intensidade e as propriedades do produto final da reação dependem da

natureza dos reagentes e das condições de reação, especialmente do valor de pH e da

temperatura (Nunes e Baptista, 2001). Essa reação é muito desejada na preparação de

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muitos alimentos, como produtos de confeitaria, churrascaria, produtos industrializados

como batata chips, cereais matinais, café, entre outros. Os produtos da reação de

Maillard (MRPs), são conhecidos como AGEs dietéticos/exógenos, sendo absorvidos,

metabolizados e excretados através da urina. Assim, uma dieta hipercalórica constante

de produtos derivados dessa reação, pode acarretar acúmulo de AGEs no organismo,

causando malefícios à saúde.

Estudos têm mostrado a reação de Maillard também ocorre in vivo, como

demonstrado na figura 1, fruto da reação de uma proteína com um açúcar redutor,

originando bases de Schiff, rearranjadas a produtos de Amadori. Essa reação in vivo,

passa a ser intitulada como reação de glicação e as proteínas dos produtos de Amadori

como proteínas glicadas. O complexo de pigmentos e formações cruzadas formadas a

partir de uma proteína glicada durante o processo de glicação, é então caracterizado

como produtos de glicação avançada, também conhecidos como AGEs (Bucala et al.,

1992). Desde então, muitas evidências apontam os AGEs como iniciadores de

complicações no diabetes e envelhecimento (Ulrich e Cerami, 2001).

A glicação de proteínas pode levar ao desenvolvimento de doença vascular,

doença de Alzheimer e desordens inflamatórias, sendo evidenciada em maiores

proporções em complicações vasculares e urêmicas no diabetes, e, no processo de

envelhecimento (Thornalley et al., 2001).

Fig. 1. Reação de Maillard in vivo e a formação de Produtos de Glicação Avançada (AGEs) tendo a glicose como exemplo de açúcar redutor e a albumina como exemplo de proteína. Adaptação de Khan et al., (2018).

Glicose Albumina Bases de Schiff

Produtos de Amadori

Produtos de glicação avançada

AGEs

20

20

2.2. Produtos de Glicação Avançada (AGEs) e doenças

Os tipos mais comumente conhecidos de AGEs oriundos da reação de glicação de

proteínas são: 1-alquil-2-formil-3,4-diglicosil pirrol (AFGP) e FFI (2-(2-fluoril)-4,5-

furanil-1-H-imidazol), pirralina, dímero de lisina derivado do metilglioxal

(MOLD/MGO), N-carboximetil-lisina (CML), N-carboxietil-lisina (CEL), dímero de

lisina derivado do glioxal (GOLD), dímero de lisina derivado da 3-deoxiglicosona

(DOLD), e os fluorófuros pentosidina e argpirimidina (Ikeda et al., 1998; Yonekura,

2003).

Fig. 2. Estrutura de alguns AGEs. MOLD: Derivado de Metilglioxal, DOLD: Derivado de

deoxiglicosona e GOLD: Derivado de glioxal. Adaptado de Chinchansure et al., (2015).

Os AGEs podem emitir ou não fluorescência. Um estudo de Roubin et al.

(2013), mostrou que pessoas com altas quantidades de AGEs fluorescentes possuem

maiores chances de desenvolver tabagismo e hipertensão, o que pode levar à

aterosclerose e consequente aumento do risco de doenças do coração.

Os derivados de metilglioxal emitem fluorescência, sendo mais fácil a sua

detecção através de métodos de avaliação luminescente e assim, são bastante estudados

por seus malefícios à saúde. Um estudo recente mostrou a relação desse metabólito

reativo como ‘start’ para o desenvolvimento da diabetes tipo 2 em alguns indivíduos, a

qual é resultante primordialmente da hiperglicemia e resistência à insulina, devido a

uma grande ocorrência de glicólise, aumentando os níveis de MGO no organismo, os

quais geram então, altos danos teciduais (Moraru et al., 2018).

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Fig. 3. Exemplos de Produtos de Glicação Avançada (AGEs) derivados de seus precursores. Adaptado de Lo, Chyh-Yo et al., (2011); Barbosa, Oliveira e Seara, (2008).

O diabetes mellitus insulino-dependente (MDDM – tipo 1) é caracterizado pela

deficiência na secreção da insulina, levando o indivíduo a precisar de reposição exógena

da mesma. O diabetes mellitus não insulino-dependente (NIDDM – tipo 2) é

caracterizado por resistência à insulina e / ou uma secreção inadequada da mesma. Além

do impacto sobre a saúde, o custo econômico do diabetes e de suas complicações é

muito grande, tanto para os cuidados de saúde quanto para a perda de produtividade na

sociedade (Songer, 1992). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (WHO), o

diabetes está entre as principais causas de morte por doença em muitos países. A

evolução de complicações de diabetes mellitus à longo prazo está correlacionada com a

gravidade e a duração da hiperglicemia (Thévenod, 2008).

A figura 4 ilustra a reação de glicação dando origem aos AGEs e a interação

desses com seu receptor RAGE (receptor de múltiplos ligantes), ativando vias de

sinalização, levando à formação de citocinas inflamatórias e iniciando o surgimento de

diversas doenças (Ahmad et al., 2018).

O sistema glioxalase é composto pelas enzimas glioxalase 1 e 2 (Glo1 e Glo2)

e glutationa reduzida. Ele é responsável pela metabolização do MGO através da via

intermediária S-d-lactoilglutationa, que converte o MGO em D-lactato (Xue, M. et al.

2011) a fim de evitar danos induzidos pelo mesmo. Quando seu funcionamento fica

Derivados de Metilglioxal (MGO) Derivados de

Deoxiglicosona

Derivados de Glioxal(GO)

CEL, MOLD, MG-Hidroimidazolona, Tetraidropirimidina,

Argpirimidina, MODIC

DOGDIC, DOLD, Glicosepane

CML, GOLA, GOLD, GALA,

G-hidroimidazolona, GODIC

Adaptação de LO, CHYH-YO et al., (2011); BARBOSA, OLIVEIRA e SEARA, (2008).

22

22

comprometido, há acúmulo de MGO, o que induzirá alterações no DNA, levando à

formação de várias doenças (Desai et al., 2010).

Figura 4. Interação de AGE com seu receptor e seus efeitos na sinalização celular.

Adaptado de Ahmad et al., (2018).

O caminho do poliol, a modificação da proteína C quinase, a formação de

produtos finais de glicação avançada (AGEs) e o estresse oxidativo, são amplamente

estudados a fim de explicar os potenciais mecanismos pelos quais a hiperglicemia pode

resultar em complicações diabéticas (Cumbie e Hermayer, 2007).

Ensaios imunoenzimáticos (Elisa), utilizando anticorpos específicos para AGE

demonstram que amostras de sangue de diabéticos possuem de 10 a 45 vezes mais

AGEs comparadas a amostras de não diabéticos. Estes resultados sugerem que a

formação de AGEs aumenta de forma proporcional ao aumento de glicose no sangue.

Dessa forma, grupos de pacientes com níveis mais elevados de glicose no sangue

tendem a ter maior prevalência de complicações diabéticas (Brownlee, 1995).

A acumulação de AGEs nos compartimentos glomerulares e tubulointersticial, e

alterações estruturais da matriz extracelular (ECM) da proteína, estão correlacionados

com a gravidade da nefropatia diabética. Na presença de AGEs, podócitos glomerulares

regulam a expressão de receptores para AGEs, desencadeando vários níveis de cascatas

intracelulares de transdução de sinal contribuindo para a lesão renal (Goh e Cooper,

2008).

Glicação = AGEs

NAPDH oxidase

ROS Citocinasinflamatórias

InflamaçãoGeração de tumor

MetástaseProliferação

RAGE

23

23

A figura 5 ilustra os diversos caminhos que levam ao acúmulo de AGEs no

organismo e seus potenciais efeitos à saúde, através do desbalanço do sistema

glioxalase, causando danos à proteínas relacionadas ao envelhecimento, levando

também à formação de doenças e diversas complicações diabéticas.

É suposto que o acúmulo de MGO no organismo pode modificar a função do

Nav.18, um canal de sódio expresso em neurônios de sinalização de dor, levando à

hiperalgesia metabólica na neuropatia diabética (Bierhaus et al., 2012).

Células glicolíticas tumorigênicas tendem a concentrar altas quantidades de

AGEs derivados de MGO, uma vez que a fonte central de MGO é a via da glicólise

(Bellahcène et al., 2018).

Através do estresse oxidativo, aumento da glicação e inflamação, o MGO induz

dano endotelial em ratos normais e piora o quadro de complicações vasculares em ratos

diabéticos (Sena et al., 2012).

Fig. 5. Caminhos que levam à formação de AGEs, acúmulo no organismo e efeitos na saúde.

Uma vez que se conhece que o acúmulo de AGEs, pode levar ao

desenvolvimento de doenças, o estudo sobre o efeito da glicação de proteínas nas mais

diversas matrizes celulares, por meio de técnicas eficientes de quantificação e detecção,

se torna uma fator crucial para a pesquisa científica (Barbosa et al., 2016).

2.3. Compostos fenólicos presentes na soja

AGEs

Diabetes

Metabolismo basal

RO

S

AGEs

AGEsdietéticos

AGEs

RO

S

AG

Es

Danos à proteínas comocolágeno e elastina = Envelhecimento

Metabolismo da glicose

Glicação

Peroxidação lipídica

Dieta hipercalórica; alto consumo de produtosque passaram pela Reação de Maillard

Doenças (ex: trombose, aterosclerose, câncer, complicações diabéticas)

Desbalanço do sistema glioxalase =

acúmulo de AGEs no organismo

AGEs AGEs

Danos aodna

24

24

As diversas classes de compostos fenólicos possuem variadas características fisico-

químicas, as quais determinarão o modo e eficiência de atuação numa estrutura celular

(Oliveira e Bastos, 2011). A figura 6 ilustra as diversas classes dos compostos fenólicos,

destacando a classe dos flavonóides e suas subclasses.

A classe dos flavonóides tem recebido crescente interesse nos últimos anos,

podendo ser encontrados nas plantas e o consumo de legumes e bebidas com um alto

nível de tais compostos podem reduzir o risco de desenvolvimento de diversas doenças

devido ao seu poder antioxidante, entre outros fatores (Giada, 2013).

Estudos em diversos modelos animais mostram que o consumo destas substâncias

contribui para a melhora da saúde, moderando substâncias relacionadas à melhora da

função mitocondrial e energética, diminuindo o estresse oxidativo, o processo

inflamatório de baixo grau, assim como estimulando a autofagia (Si and Liu, 2014).

Fig. 6. Classificação dos compostos fenólicos. Adaptado de Alves et al., (2015).

Outros dados levam a crer que os flavonóides podem regular células da

micróglia, diminuindo a neuroinflamação (Spagnuolo et al., 2018).

Em um levantamento realizado pela Embrapa Soja (safra 2017/2018), analisando

os dados da USDA (United States Department of Agriculture) e CONAB (Companhia

Nacional de Abastecimento), mostrou que a produção de soja no mundo representa um

total de 336,699 milhões de toneladas, sendo os Estados Unidos o maior produtor

mundial do grão, com uma produção de 119,518 milhões de toneladas. O Brasil se

Compostos fenólicos

Ácidos fenólicos

Estilbenos

Taninos

Cumarinas

Flavonóides

Flavonóis

Flavonas

Flavononas

Antocianinas

Isoflavonas

25

25

destaca como o segundo maior produtor mundial do grão, com uma produção de

116,996 milhões de toneladas.

A soja é conhecida pelo seu alto teor de isoflavonas, pertencentes à classe dos

flavonóides. A estrutura básica dos flavonóides é constituída de um esqueleto de 15

carbonos com dois anéis fenílicos (A e B), ligados por um anel pirano (C). Conforme a

ocorrência de diversas oxidações do anel C, há alteração desta estrutura básica, dando

origem as suas diferentes classes (Raffa et al., 2017).

As isoflavonas são conhecidas pelos seus diversos benefícios à saúde. Um

estudo recente mostrou que a ingestão de altas quantidades de isoflavonas no começo da

vida adulta, teve ação na atividade parassimpática e simpática, auxiliou na diminuição

da hiperglicemia, dislipidemia, hiperinsulinemia e do acúmulo de gordura (Silva et al.,

2018).

Sathyapalan et al. (2018), conduziram um estudo sobre a ingestão um snack

contendo proteína de soja em pó e isoflavonas em diferentes concentrações, duas vezes

ao dia e com seis meses de ingestão, observaram resultados de redução na pressão

arterial sistólica.

A figura 7 ilustra as estruturas das isoflavonas glicosiladas e agliconas presentes

na soja. As isoflavonas na forma aglicona não possuem a molécula de glicose ligada à

sua estrutura e podem ultrapassar mais facilmente a mucosa intestinal. (Yatsu e Bassani,

2016).

Fig. 7. Estruturas químicas das isoflavonas glicosiladas e agliconas. Adaptado de Silva et al., (2011).

2.4. Compostos fenólicos e efeito antiglicante

Daidzina

Genis*na

Glici*na

Daidzeína

Genisteína

Gliciteína

26

26

O estudo de compostos dos mais variados tipos com atividade antioxidante e

antiglicante vem crescendo nos últimos anos, pois podem apresentar estratégias para o

tratamento e controle de doenças relacionadas a ela. Têm-se descoberto que diversos

fitocompostos podem agir no controle do processo de glicação de proteínas

(Chinchansure et al., 2015). A figura 8 alguns dos papéis dos fitoquímicos na redução

da formação de AGEs no organismo.

Liu et al., (2011), demonstraram em um estudo in vitro, que pode haver inibição da

glicação da albumina sérica e hemoglobina humana, mediadas respectivamente por

glicose e MGO, por meio dos fitocompostos de cranberry. Esse efeito em parte pode ser

atribuído principalmente às procianidinas que agem eliminando carbonilas reativas.

Outro estudo mostrou diminuição da toxicidade de STZ (Streptozotocina) em

células β-pancreáticas e aumento da resposta à insulina, pela ingestão de alta dose de

genisteína por um dos grupos estudados (Kordy-El e Alsharani, 2015).

Através da análise da capacidade antiglicante de fluoretina, EGCG

(epigalocatequinagalato) e [6]-gingerol, utilizando células HRPE induzidas por glicose,

Sampath, et al., (2016), observaram que esses foram capazes de impedir a formação de

AGEs. A administração desses mesmos compostos a camundongos que apresentavam

alto teor de gordura, mostrou que esses reduziram o peso corporal, tiveram as

concentrações de AGEs inibidas no rim e coração, através da supressão da expressão de

RAGE, com consequente declínio na formação de catarata. Esses resultados indicam

que fitocompostos administrados em conjunto ou individualmente, podem agir como

agentes terapêuticos na prevenção de complicações relacionadas ao diabetes.

Onze extratos herbais foram testados quanto a sua capacidade de inibição de AGEs,

onde dois deles (Flos Sophorae Immaturus e Radix Scutellariae), mostraram as maiores

atividades inibitórias comparadas aos outros extratos. A figura 8, ilustra os caminhos

pelos quais os fitoquímicos agem da redução de AGEs. A capacidade de produtos

naturais em inibir AGEs então, pode estar associada com seu potencial bioativo, o que

provê um caminho promissor para mais estudos relacionados à aplicação desses como

agentes terapêuticos (Hou et al., 2014).

27

27

Fig. 8. O papel dos fitoquímicos na inibição da formação de AGEs. Adaptado de (Khangholi et al.,

2005).

2.5. Efeitos da biotransformação na conversão de compostos glicosilados para

agliconas.

O potencial antioxidante de um composto glicosilado pode ser menor do que um

composto aglicona. Uma vez que há a quebra das ligações glicosídicas, pode haver

também aumento da biodisponibilidade. Assim, sua estrutura exerce importante

influência no seu potencial antioxidante (Wang, Li e Bi, 2018).

Tanto os micro-organismos, quanto enzimas podem exercer atividade de conversão

de compostos glicosilados para agliconas. As bactérias probióticas ácido lácticas (LAB),

quando adicionadas a alguma matriz, acidificam a mesma produzindo ácidos orgânicos,

compostos aromáticos, exopolissacarídeos, diversas enzimas, entre outros compostos.

Sua atividade também pode servir para elevar a quantidade de nutracêuticos em

alimentos fermentados (Leroy e Vuyst, 2004). A figura 9 ilustra a conversão de

isoflavonas das formas glicosiladas para as formas agliconas através da clivagem da

molécula de glicose.

Os probióticos estimulam o sistema imunológico, a absorção de alguns

nutrientes, tratam casos de diarreia, alergias, constipação, previnem infecções,

melhoram a digestão, auxiliam na saúde da mucosa intestinal, agem como antiviraris e

antibactericidas, diminuem a inflamação intestinal e previne alguns tipos de câncer,

Fitoquímicos

Melhora da liberação de insulina

Melhora da absorção de glicose

Proteção das células-β pancreáticas

Diminuição da glicose sanguínea

Inibição da atividade da α-amilase ou α-glucosidase

Redução da formação de AGEs

Diminuição de radicais livres/agentes quelantes de

metais

28

28

principalmente os relacionados ao sistema gastrointestinal (Ghasemian, et al., 2018).

Neste contexto, o consumo de produtos probióticos vem crescendo nos últimos anos,

uma vez que seus benefícios vêm sendo largamente estudados, chamando atenção para

novos consumidores.

Diversas enzimas extracelulares são formadas e usadas para o processo de

remoção de compostos fenólicos de uma matriz, assim como podem ser produzidos

novos compostos através do metabolismo secundário de microrganismos durante os

processos de fermentação (Dey et al., 2016).

A enzima tanase (Tanino Acil hidrolase EC 3.1.1.20) estimula a fragmentação das

ligações éster presentes em taninos hidrolisáveis e ésteres de ácido gálico. Sua produção

através de diversas fontes microbianas, auxilia diferentes áreas como indústrias

farmacêuticas, cosméticas e de alimentos. Assim, o desenvolvimento de processos mais

produtivos e eficientes da produção de tanase se tornam necessários. Neste caminho, a

fermentação em estado sólido vem mostrando mais vantagens do que a fermentação

submersa (Belmares et al., 2004), proporcionando a melhora do conteúdo fenólico de

produtos alimentícios. Essa aplicação possui grande potencial, uma vez que as pessoas

têm buscado melhorar sua saúde consumindo alimentos mais saudáveis (Martins, et al.,

2011).

Fig. 9. Conversão de isoflavonas glicosídicas em agliconas através da clivagem da molécula de glicose.

Adaptado de Silva et al., (2011).

Daidzina

Genis*na

Glici*na

Daidzeína

Genisteína

Gliciteína

Micro-organismos -microbiota intes0nal

Processos de biotransformação

clivagem

Glicosiladas Agliconas

29

29

Nosso grupo de pesquisa mostrou que a tanase produzida por fermentação em

estado sólido de P. variotii (Battestin e Macedo, 2007), é uma enzima que não depende

de um único tipo de substrato utilizado, além de demonstrar que a biotransformação de

suco de laranja com tanase pode trazer um produto com melhor capacidade funcional

(Madeira et al., 2015). Outro estudo do impacto de biotransformações enzimáticas com

tanase, pectinase e celulase na hidrólise de polifenóis poliméricos em diferentes

amostras de vinhos, foi realizado e mostrou que os ensaios com tanase mostraram-se

mais eficientes no incremento da quantidade de polifenóis totais. Além disso, a tanase

mostrou a maior atividade hidrolítica e melhora da capacidade antioxidante de todas as

amostras (Martins et al., 2016).

Nosso grupo vem trabalhando nos últimos anos com o emprego da enzima tanase

produzida por P. variotti em diferentes matrizes, avaliando seu potencial em melhorar

seu conteúdo fenólico e estudando seus efeitos frente a diferentes sistemas biológicos.

3. OBJETIVOS

Este projeto teve como objetivo biotransformar o extrato hidrossolúvel de soja

através de diferentes processos e avaliar in vitro seus potenciais antiglicantes de

proteínas, correlacionando com a atividade antioxidante das isoflavonas presentes nas

amostras. A estratégia empregada foi a determinação do teor de fenóis totais e

capacidade antioxidante e capacidade antiglicante utilizando os modelos de glicação in

vitro: BSA / Frutose, BSA / Metilglioxal e Arginina / Metilglioxal. Como fonte de

fenólicos foram testados padrões puros comerciais de isoflavonas e extrato

hidrossolúvel de soja rico em isoflavonas.

4. MATERIAL

A soja (Glycinemax) foi adquirida em um supermercado local (Nattus, Campinas,

SP, Brasil). Daidzina, genistina, daidzeína, genisteína, glicitina, gliciteína, ácido tânico,

ácido gálico, ácido 2,2'-azobis (2-methilpropionamidina) (AAPH) (97%), 2,2-difenil-1-

picrilidrazil (DPPH) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha).

Fluoresceína foi adquirida a partir de ECIBRA (SP, Brasil), e Trolox® (97%) da Acros

Organics (Bélgica). Todos os outros produtos químicos foram adquiridos

30

30

comercialmente disponíveis. A cepa Bifidobacterium lactis (BLC1) comercial

liofilizada foi cedida pela empresa Sacco Brasil® e a cultura Lactobacillus casei (MB

151) pela Divisão de Microbiologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas,

Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da UNICAMP.

5. MÉTODOS

5.1. Fluxograma das atividades

Amostra 1: EHS puro/controle.

Amostra 2: EHS via processo de biotransformação microbiana.

Amostra 3: EHS via processo de biotransformação microbiana do EHS seguida de biotransformação enzimática.

Amostra 4: EHS via processo de biotransformação enzimática do EHS seguida de biotransformação microbiana.

Amostra 5: EHS via processo de biotransformação enzimática.

Obtenção do extrato hidrossolúvel de soja (EHS)

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5

Padrões puros comerciais de isoflavonas

Caracterização dos extratos hidrossolúveis de soja:

Determinação da capacidade antioxidante: Teor de fenóis totais

(Folin-Ciocalteau), Capacidade de absorção do radical oxigênio

(ORAC), Método do potencial redutor do íon férrico (FRAP) e

Perfil das isoflavonas por análise cromatografia liquida de alta

eficiência (HPLC - DAD).

Testes de capacidade antiglicante in vitro:

Modelo de glicação in vitro da Albumina de Soro Bovina (BSA)

com Frutose (FRU);

Modelo de glicação in vitro da Albumina de Soro Bovina (BSA)

com Metilglioxal (MGO);

Modelo de glicação in vitro da Arginina com Metilglioxal

(MGO).

31

31

5.1.2. Produção do extrato semipurificado de tanase (Tanino Acil Hidrolase

E.C:3.1.1.20) de P. variotti e determinação da atividade enzimática.

5.1.3. 5.1.3.1. Produção

A produção do extrato semipurificado de tanase foi realizada segundo estudo

desenvolvido por Battestin e Macedo (2007), por meio da fermentação sólida

empregando-se farelo de trigo e o fungo P. variotii, selecionado por Macedo, Matsuda e

Battestin (2005).

5.1.3.2. Determinação da atividade enzimática

A determinação da atividade enzimática do extrato semipurificado de tanase foi

realizada a partir da reação com ácido tânico (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha),

em triplicata, conforme o método de Sharma, Bhat e Dawra (2000), com modificações.

Soluções de ácido tânico, de extrato semipurificado de tanase e tampão acetato 0,02 M

pH 5,0 foram previamente preparadas. Para o teste, foram utilizados 250 µL da solução

de ácido tânico e 250 µL da solução do extrato semipurificado de tanase. O branco foi

composto por 250 µL da solução com ácido tânico e 250 µL de tampão acetato 0,02 M

pH 5,0, e um controle foi preparado com 250 µL da solução do extrato semipurificado

de tanase e 250 µL de tampão acetato 0,02 M, pH 5,0. O teste, o branco e o controle

foram então incubados a 40ºC por 5 minutos em banho termostatizado (modelo B12D,

Micronal, São Paulo, Brasil) e, então, receberam, respectivamente, com intervalo de 5

minutos entre cada reagente, 300 µL de solução de rodanina 0,665% em etanol [5-(4-

dimetilaminobenzilideno)-rodanina 99%, AcrosOrganics, Belgica], 200 µL de solução

de hidróxido de potássio (KOH 0,5 mol.L-1) e 4 mL de água destilada. Após 10 minutos,

foram realizadas as leituras de absorbância a 520 nm (Espectrofotômetro DU® 640,

Beckman CoulterTM, EUA).

6. Obtenção e caracterização dos extratos hidrossolúveis de soja

6.1. Obtenção do extrato hidrossolúvel de soja

32

32

Para a produção do extrato hidrossolúvel de soja (EHS) foram utilizados grãos

de soja de marca comercial Natu’s, Grupo / Tipo I, Classe: Amarela. O preparo do EHS

foi realizado de acordo com a metodologia proposta pela Embrapa Soja, com algumas

modificações (Mandarino; Carrão-Panizzi, (1999); Queirós et al., (2016)).

Inicialmente, os grãos de soja íntegros e em boas condições foram submetidos à

lavagem em água comum, seguido de maceração em água por 6 horas (grãos de

soja/água; 1:3 p / v;), com adição de bicarbonato de sódio (0,3% em relação ao peso de

soja). Em seguida, a água utilizada para a maceração foi desprezada e os grãos foram

submetidos à fervura em água (grãos de soja/água; 1:4 p/v) por cinco minutos a 97 º C.

Logo após, os grãos foram triturados em água com auxílio de liquidificador industrial,

(grãos de soja/água; 1:6,4 p / v), por 5 minutos, em potência alta. A massa obtida foi

então centrifugada a 5000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente e o sobrenadante

obtido correspondente ao EHS foi submetido a tratamento térmico a 97 º C por 10

minutos e, logo após, a resfriamento com circulação de água. Em seguida o EHS foi

resfriado, pesado e congelado em freezer a – 4 ˚ C. Após o congelamento, o EHS foi

liofilizado e armazenado novamente a 4 º C para a utilização nas análises posteriores.

6.1.2. Processo de preparo do EHS puro/controle – Amostra 1

O EHS liofilizado foi suspenso em água destilada autoclavada e, como se trata

de um controle, para garantir as mesmas condições de tempo, temperatura e agitação

para todas as amostras, os frascos foram incubados a 37 º C por 24 h, em shaker sob

agitação de 50 rpm em condições de anaerobiose, utilizando frasco anaeróbio com

reagente (Anaerobac, Probac). (Tamime; Robinson, (2007); Queirós, et al., (2016)),

com modificações.

6.1.3. Processo de biotransformação microbiana do EHS puro – Amostra 2

Foram utilizadas para a fermentação do EHS estirpes de micro-organismos

disponíveis no Laboratório de Bioprocessos do Departamento de Alimentos e Nutrição,

da Universidade Estadual de Campinas – SP, realizado com um mix das cepas

Bifidobacterium lactis (BLC1) e Lactobacillus casei (MB 151).

33

33

O EHS liofilizado foi suspenso em água destilada autoclavada e os micro-

organismos foram inoculados em uma concentração de 1% (v / v) dos probióticos (Cruz

et al., 2013) com contagem de 1,5 x 109 UFC / mL cada, padronizados através da escala

de Mc. Farland. Os frascos foram incubados a 37 º C por 24 h, em shaker sob agitação

de 50 rpm em condições de anaerobiose, utilizando frasco anaeróbio com reagente

(Anaerobac, Probac). O processo foi realizado em triplicata. (Tamime; Robinson,

(2007); Queirós, et al., (2016)), com modificações.

6.1.4. Processo de biotransformação microbiana do EHS seguida de biotransformação

enzimática – Amostra 3

O EHS foi fermentado conforme descrito no item anterior. No entanto, após as

24 h, ao EHS fermentado com os probióticos foram adicionadas 3.8 U da enzima

Tanase e incubado em banho-maria termostatizado (modelo B12D, Micronal, São

Paulo, Brasil) a 50 º C, 100 rpm, por 45 min. A reação foi interrompida em banho de

gelo por 15 min. O processo foi realizado em triplicata. (Tamime; Robinson, (2007);

Queirós, et al., (2016)), com modificações.

6.1.5. Processo de biotransformação enzimática do EHS seguida de biotransformação

microbiana – Amostra 4

O EHS liofilizado foi suspenso em água destilada autoclavada e incubado com

3.8 U da enzima Tanase em banho termostatizado (modelo B12D, Micronal, São Paulo,

Brasil) a 50 º C, 100 rpm, por 45 min. A reação foi interrompida em banho de gelo por

15 min. Após a reação de biotransformação enzimática com Tanase, os micro-

organismos foram inoculados no EHS em uma concentração de 1% (v / v) (Cruz et al.,

2013) com contagem de 1,5 x 109 UFC / mL, padronizados através da escala de Mc.

Farland. Os frascos foram incubados a 37 º C por 24 h, em shaker sob agitação de 50

rpm em condições de anaerobiose, utilizando frasco anaeróbio com reagente

(Anaerobac, Probac). O processo foi realizado em triplicata. (Tamime; Robinson,

(2007); Queirós, et al., (2016)), com modificações.

34

34

6.1.6. Processo de biotransformação enzimática do EHS puro – Amostra 5

O EHS foi suspenso em água destilada autoclavada e incubado com 3.8 U da

enzima Tanase em banho termostatizado (modelo B12D, Micronal, São Paulo, Brasil) a

50 º C, 100 rpm, por 45 min. O processo de hidrólise foi interrompido com banho de

gelo por 15 min. O processo foi realizado em triplicata. Para garantir as mesmas

condições de tempo, temperatura e agitação para todas as amostras, os frascos foram

incubados a 37 º C por 24 h, em shaker sob agitação de 50 rpm em condições de

anaerobiose, utilizando frasco anaeróbio com reagente (Anaerobac, Probac).

7. Caracterização das amostras de EHS

Todas as amostras foram identificadas, congeladas e liofilizadas para posteriores

análises de capacidade antioxidante, perfil de isoflavonas e capacidade antiglicante.

7.1. Teor de fenólicos totais

A determinação dos fenólicos totais presentes em todas as amostras, foi

realizada de acordo com o método de Singleton et al., (1999), em triplicata. Para a

realização do ensaio, 50 µL das amostras, nas diluições 1:2, 1:5 e 1:10 (m / v), foram

adicionados 800 µL de água destilada e 50 µL do reagente Folin-Ciocalteau (Dinâmica

Química Contemporânea, Brasil). Após 3 minutos de reação, foram adicionados 100 µL

de solução 75% (m / v) de carbonato de sódio e o meio reacional foi incubado em

repouso por 2 horas no escuro, em temperatura ambiente. As leituras de absorbância

foram realizadas a 725 nm (Espectrofotômetro DU® 640, BeckmanCoulterTM, EUA). O

branco foi constituído por todos os componentes da reação, exceto a amostra, que foi

substituída por água. Foi feita uma curva de calibração com ácido gálico (Sigma-

Aldrich, Steinheim, Alemanha) e os resultados foram expressos em µg de equivalentes

de ácido gálico (GAE) por mL de amostra.

7.2. Determinação da capacidade antioxidante

35

35

7.2.1. Capacidade de absorção do radical oxigênio – ORAC

A determinação da capacidade antioxidante pelo método ORAC foi realizada em

triplicata, conforme metodologia descrita por Dávalos, Gómez-Cordovés e Bartolomé

(2004), adaptada por Macedo et al. (2011). As amostras foram diluídas em tampão

fosfato 75 mM pH 7,4 e testadas em distintas concentrações. Para a realização da curva

padrão, foram preparadas soluções de Trolox®, com concentrações entre 30 e 1500

µmol.mL-1. Alíquotas de 20 µL das amostras, 20 µL de soluções de Trolox e 20 µL de

tampão (branco) foram distribuídas em microplaca de 96 poços, de cor preta e opaca,

seguidas da adição de 120 µL de solução de fluoresceína. A reação foi iniciada pela

adição de 60 µL de solução do radical AAPH (2,2’-azobis(2-

amidinopropano)dihidrocloreto). A fluorescência foi monitorada a cada 80 segundos

durante 105 minutos, a 37 º C, com filtro de excitação de 485 nm e de emissão de 520

nm, (Espectrofotômetro DU® 640, Beckman CoulterTM, EUA). Os valores de ORAC

foram baseados na diferença entre a área sob a curva de decaimento da fluorescência

das amostras e do branco (AUClíquido), e equações de regressão linear entre a AUClíquido

e concentrações foram calculadas para todas as amostras. Os resultados foram expressos

em µmol de equivalente de Trolox por mL de amostra.

7.2.2. Método do potencial redutor do íon férrico - FRAP

A determinação da capacidade antioxidante pelo método FRAP foi realizada de

acordo com Benzie e Strain (1996). Foram preparados para compor o reagente de

FRAP: tampão acetato 0,3 M pH 3,6, solução de ácido clorídrico (HCl) 40 mM, solução

de TPTZ (2,4,6 -Tris(2-pyridyl)s-triazine) 10 mM (=0,01 M) e solução de cloreto

férrico (FeCL3) 20 mM. Foi realizada uma curva padrão de Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-

tetrametilcromo-2-ácido carboxílico, preparado em etanol 100%) nas concentrações

entre 15 a 1500 μmol / mL. O ensaio foi realizado em microplaca transparente de 96

poços, em triplicata. Em cada cavidade da placa foram adicionados 30 µL das

amostras/padrão/branco, 90 µL de água destilada e 900 µL do reagente de FRAP. As

leituras das absorbâncias foram realizadas em fluorímetro a 595 nm em 7 leituras de 88

segundos (10 min), (Espectrofotômetro DU® 640, Beckman CoulterTM, EUA). Os

resultados foram expressos como μmol equivalente em Trolox/mL de amostra.

36

36

7.3. Perfil das isoflavonas por análise Cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC

- DAD).

As isoflavonas glicosiladas (daidizina, glicitina e genistina), agliconas

(daidizeína, gliciteína e genisteína) foram identificadas e quantificadas em todas as

amostras por HPLC-DAD.

A extração das isoflavonas nas amostras foi realizada de acordo com Queirós et al.,

(2016), com modificações. Dez mg de cada amostra foi misturada com 1 mL de metanol

70% (v / v) (individualmente). Em seguida, a mistura foi filtrada através de uma

membrana de 0,45 µm antes de ser injetada no equipamento.

A condição cromatográfica foi a descrita por Queirós et al., (2016). Foi utilizado

um Dionex UltiMate 3000 (Alemanha) de cromatografia líquida equipado com um C-18

Atlantis® (Águas, 5 µm, 4,6 x 150 mm) mantida a 30 ° C. A detecção foi realizada

utilizando UV / VIS (PAI-3000). A fase móvel foi constituída de água acidificada com

0,1% de ácido fórmico (A) e metanol (B). O gradiente de eluição foi preparado da

seguinte forma: 20% B (0-15min), de 20% a 80% B (15-75 min), de 80 a 100% B (75-

80 min), 100 a 20% B (80-90 min) e 20% B (90-95 min) com uma taxa de fluxo de 0,5

ml min-1. O volume de injeção foi de 20 µL e todas as amostras foram analisadas em

triplicata. Os espectros foram obtidos a 190 e 480 nm e os cromatogramas foram

processados em 254 nm.

As isoflavonas individuais foram identificadas comparando o seu tempo de retenção

e espectro com os padrões Sigma: daidizina, genistina, daidzeína, genisteína, glicitina e

gliciteína. A quantificação das isoflavonas foi realizada através da integração do pico de

áreas e utilizando calibração das curvas que foram estabelecidas na faixa de

concentração de 0,01-1,0 mg / mL de padrões de isoflavonas. Os resultados foram

expressos em µg de cada isoflavona, com composto de exemplo mL-1.

8. Modelos de glicação in vitro

Os padrões comerciais de isoflavonas e as amostras de EHS foram avaliados

quanto à inibição da glicação de proteína conforme descrito a seguir:

8.1. Modelo de glicação da albumina de soro bovina (BSA) com frutose (FRU)

37

37

O ensaio anti-glicação no modelo BSA / FRU foi realizado utilizando o método

de Wang et al. (2011a) seguindo as modificações realizadas por Shen, Xub e Sheng

(2017). Este modelo avalia todos os estágios da glicação protéica. Frutose (1,5 mol / L),

solução de BSA (60 mg / mL), uma série de concentrações dos padrões de isoflavonas e

das amostras de EHS (individualmente), foram preparados em tampão de fosfato de

potássio (0,2 M, pH 7,4, contendo 0,02% de azida de sódio para prevenir crescimento

microbiano). Uma alíquota de 500 µL de solução de frutose (1,5 mol / L) foi misturada

com 500 µL de solução dos padrões de isoflavonas (750, 850 e 950 μg / μL) e das

amostras de EHS (50, 100, 200, 300 mg / mL) (individualmente) em tubos de 10 mL,

com tampa de rosca e foram mantidos a 37 ° C durante 2 h em estufa. Posteriormente

500 µl de solução de BSA (60 mg / mL) foi adicionada a cada tubo de ensaio. Esses,

foram então incubados a 37 ° C por 6 dias em estufa. Tampão fosfato (1 mL) sem

composto fenólico foi usado como um controle branco. Após os 6 dias, 200 μL do

conteúdo dos tubos foi transferido para uma placa de 96 poços de cor preta, em

triplicata. AGEs fluorescentes foram então monitorados utilizando um comprimento de

onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm por

luminescência (Espectrofotômetro DU® 640, BeckmanCoulterTM, EUA). A

porcentagem de inibição de AGEs foi calculada pela seguinte equação:

Capacidade antiglicante (%) = [1-(Intensidade do controle / Intensidade da amostra)x100]

8.2. Modelo de glicação da albumina de soro bovina (BSA) com metilglioxal (MGO)

O ensaio anti-glicação no modelo BSA / Metilglioxal foi realizado utilizando o

método de Wang et al. (2011a), seguindo as modificações realizadas por Shen, Xu e

Sheng (2017). Esse modelo avalia o estágio intermediário da glicação de proteínas.

Metilglioxal (60 mmol / L), BSA (60 mg / mL) e uma série de concentrações dos

padrões de isoflavonas e das amostras de EHS (individualmente), foram preparados em

tampão de fosfato de potássio (0,2 M, pH 7,4, contendo 0,02% de azida de sódio para

prevenir crescimento microbiano). Em seguida, uma alíquota de 500 µL de solução de

metilglioxal foi misturada com 500 µl de solução dos padrões de isoflavonas (750, 850

e 950 μg / μL) e das amostras de EHS (50, 100, 200 e 300 mg / mL) (individualmente)

em tubos de 10 mL, com tampa de rosca e foram mantidos a 37 ° C durante 2 h em

38

38

estufa. Posteriormente 500 µl de solução de BSA foi adicionada a cada tubo de ensaio e

foram então incubados a 37 ° C durante 6 dias em estufa. Tampão fosfato (1 mL) sem

composto fenólico foi usado como um controle branco. Após os 6 dias, 200 μl do

conteúdo dos tubos foi transferido para uma placa de 96 poços de cor preta, em

triplicata. AGEs fluorescentes foram então monitorados utilizando um comprimento de

onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm por

luminescência (Espectrofotômetro DU® 640, Beckman CoulterTM, EUA). A

porcentagem de inibição de AGEs foi calculada utilizando a mesma equação do modelo

de BSA / FRU.

8.3. Modelo de glicação da arginina (ARG) com metilglioxal (MGO)

O ensaio anti-glicação no modelo Arginina / Metilglioxal foi realizado

utilizando o método de Wang et al. (2011a), seguindo as modificações realizadas por

Shen, Xu e Sheng (2017). Esse modelo avalia o estágio intermediário da glicação de

proteínas. Metilglioxal (60 mmol / L), Arginina (60 mg / mL) e uma série de

concentrações dos padrões de isoflavonas e das amostras de EHS (individualmente),

foram preparados em tampão de fosfato de potássio (0,2 M, pH 7,4, contendo 0,02% de

azida de sódio para prevenir crescimento microbiano). Em seguida, uma alíquota de 500

µL de solução de metilglioxal foi misturado com 500 µL de solução dos padrões de

isoflavonas (750, 850 e 950 μg / μL) e das amostras de EHS (50, 100, 200 e 300 mg /

ml) (individualmente) em tubos de 10 mL, com tampa de rosca e foram mantidos a 37 °

C durante 2 h em estufa. Posteriormente uma alíquota de 500 µL de Arginina foi

adicionada a cada tubo de ensaio e serão incubados a 37 ° C durante 6 dias em estufa.

Tampão fosfato (1 mL) sem composto fenólico foi usado como um controle branco.

Após os 6 dias, 200 μl do conteúdo dos tubos foi transferido para uma placa de 96 poços

de cor preta, em triplicata. AGEs fluorescentes foram então monitorados utilizando um

comprimento de onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão

de 460 nm por luminescência (Espectrofotômetro DU® 640, Beckman CoulterTM, EUA).

A porcentagem de inibição de AGEs foi calculada utilizando a mesma equação do

modelo de BSA / FRU.

9. TRATAMENTO DOS DADOS

39

39

Os resultados foram expressos como médias e desvios-padrão. Uma análise de

variância (ANOVA) foi utilizada para avaliar diferenças entre os vários grupos, sendo

as médias entre o controle e as amostras comparadas pelo teste de Tukey (p < 0,05),

apresentados em curva dose-resposta de estímulo (EC50) e gráfico com diferenças entre

as inibições máximas, através do programa estatístico Graphpad, PRISMA 7.0.

10. RESULTADOS E DISCUSSÃO

10.1. Caracterização dos extratos hidrossolúveis de soja

Todos os extratos foram submetidos às análises de caracterização de fenóis

totais, quantificação das isoflavonas como principais fenólicos por HPLC – DAD e

capacidade antioxidante.

Para todos os ensaios de avaliação da capacidade antioxidante apresentados na

Tabela 1, foi observado que os extratos que foram biotransformados apresentam maior

capacidade antioxidante comparado ao extrato padrão. Com relação ao teor de fenóis

totais, observa-se que o processo de biotransformação (amostra 2) e o processo de

biotransformação enzimática (amostra 5), não alteraram significativamente o seu teor

final de fenólicos.

Kumari et al., (2017) concluem que em alguns casos, algumas bactérias ácido

lácticas, quando crescidas em matriz de EHS, pela ação das enzimas polifenol oxidase e

fitase (endógenas ou da microflora da matriz), podem modificar componentes fenólicos

presentes, diminuindo o conteúdo fenólico total após a fermentação. Neste estudo, foi

inoculada a cepa de L. casei PLA5 em 100 mL de EHS autoclavado, a 30°C (até atingir

a máxima contagem possível), apresentando seu conteúdo fenólico final diminuído de

14,01 mg / 100 mL para 6,01 mg / 100 mL após o período de fermentação de 48 horas.

Esses resultados poderiam explicar o fato de não haver diferença estatística para os

resultados quanto ao teor de fenólicos da amostra 2 em relação ao controle, onde essa

possível ação pode ter limitado um incremento significativo na capacidade antioxidante

final dessa amostra.

Quando empregamos a enzima tanase ao processo de biotransformação

microbiana, observamos que as amostras 3 e 4 apresentaram maior atividade

antioxidante em todos os testes, indicando que a combinação da biotransformação

40

40

microbiana com a biotransformação enzimática, independente da ordem de aplicação, é

eficaz no aumento da capacidade antioxidante nos dois processos, não apresentando

diferença estatística entre eles. Isso pode estar associado ao modo de ação da tanase, ao

hidrolisar as ligações das moléculas de açúcar ao anel fenólico, a tanase pode liberar

mais fenólicos de menor massa molecular da matriz, o que possivelmente contribuiu

para o aumento da capacidade antioxidante final dessas amostras. E, quando a enzima

tanase é empregada no processo simples de biotransformação enzimática, não apresenta

diferença estatística no aumento do conteúdo fenólico total, porém apresenta aumento

da capacidade antioxidante em relação ao controle.

Tabela 1. Conteúdo de fenólicos totais pelo método Folin Ciocalteau e atividade antioxidante pelos

métodos ORAC e FRAP dos extratos hidrossolúveis de

soja.

A Tabela 2 ilustra a quantificação das isoflavonas glicosiladas e suas agliconas

nos extratos hidrossolúveis de soja produzidos. Nota-se que o extrato em sua forma

pura, apresenta concentrações de isoflavonas nas formas glicosiladas em maior

quantidade. Com os processos de biotransformação, houve grande porcentagem de

conversão das formas glicosiladas para as formas agliconas, como pode ser observado

pelo acréscimo de suas concentrações na tabela 2.

A amostra 2 (EHS biotransformado com m.o.s) apresentou conteúdo aumentado

para a forma aglicona daidzeína em 7,2 vezes, 3,2 vezes para a genisteína, não

apresentando aumento no conteúdo de gliciteína, totalizando um aumento no teor de

Tabela 2. Conteúdo de fenólicos totais e atividade antioxidante pelos métodos ORAC e FRAP dos extratos hidrossolúveis de soja.

Processo/Amostra Fenóis Totais ORAC FRAP µg de ácido gálico mL-1 Eq. Trolox µmol mL-1 Eq. Trolox µmol mL-1

1 - Controle - EHS puro 9,7b ± 0,31 54,8d ± 2,30 17,7b ± 0,76

2 - EHS fermentado (m.o.s) 10,4b ± 0,41 79,22c ± 1,47 19,5b ± 1,34

3 - EHS fermentado (m.o.s) + Tanase 12,6a ± 0,27 152, 7a ± 4,85 26,4a ± 0,72

4 - Tanase + EHS fermentado (m.o.s) 13,04a ± 0,28 139,8ab ± 9,39 28,4a ± 0,33

5 - EHS + Tanase 10,4b ± 0,13 124,2b ± 2,25 26,1a ± 0,96

Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (n = 3). A média na mesma coluna com letras diferentes é significativamente diferente (p < 0,05).

41

41

agliconas de 10,4 vezes. A amostra 3 (EHS biotransformado com m.o.s + tanase) teve

seu conteúdo de daidzeína aumentado em 13 vezes, em 7,5 vezes para a genisteína,

totalizando um aumento no teor de agliconas de 20,5 vezes. Ao observar os valores

obtidos para a amostra 4 (EHS + tanase + m.o.s), constata-se que o seu conteúdo de

daidzeína foi aumentado em 13,4 vezes, 7,7 vezes para a genisteína, totalizando um

aumento no teor de agliconas de 21,1 vezes. A amostra 5 (EHS + tanase) apresentou

acréscimo na concentração de daidzeína em 11,3 vezes e em 6,2 vezes para genisteína,

totalizando um aumento no teor de agliconas de 17,5 vezes.

Esses resultados condizem com outros já estudados sobre a biotransformação de

EHS, onde houve aumento da capacidade antioxidante total por meio da bioconversão

das isoflavonas glicosídicas para a forma aglicona.

Queirós et al., (2016) estudou quais micro-organismos apresentariam melhor

capacidade de conversão para agliconas, trabalhando com a incubação das cepas

Streptococcus ssp. Thermophilus (YF-L811), Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus

(LB-340), Bifidobacterium animals ssp. Lactis (Bb-12) e Lactobacillus acidophillus

(LA-05), com contagem final de 106 – 107 log UFC ml-1, em matriz de EHS estéril

(amostra 2). Uma alíquota dessa mesma amostra foi adicionada da enzima tanase

(amostra 3). A amostra 2 teve seu conteúdo de isoflavonas agliconas aumentado em 28

vezes para daidzeína e 25 vezes para genisteína e a amostra 3 teve seu conteúdo

aumentado em 37 vezes para daidzeína e 32 vezes para genisteína, ambas comparadas

ao controle. Essa diferença na taxa de conversão comparada aos nossos resultados, pode

estar relacionada aos micro-organismos utilizados e suas concentrações, onde o mix de

4 cepas, aumentou a capacidade de conversão das isoflavonas, incrementando assim, a

taxa de conversão final. De qualquer forma, a combinação de duas cepas utilizadas

neste trabalho, apresenta boa capacidade de conversão. Apesar de ter sido empregado

apenas duas cepas e não três, como no estudo de Queirós, et al., (2016), foi possível

observar resultados interessantes. O presente estudo mostrou que uma menor

concentração de probióticos ainda foi capaz de aumentar a quantidade final de

isoflavonas agliconas nos extratos. Quanto à capacidade antioxidante, os dados

publicados por Queirós et al., (2016) mostraram que houve um aumento no teor

antioxidante para todas as amostras biotransformadas, o que condiz os resultados

obtidos neste trabalho. Duas grandes questões importantes a se considerar ao comparar

42

42

a composição de extratos vegetais: lote e variedade de soja utilizada para a obtenção de

EHS, uma vez que suas condições de cultivo podem variar, podendo determinar

composições químicas diferentes.

Vemos na tabela 2 que quando a enzima tanase foi empregada ao EHS, a forma

aglicona gliciteína não foi detectada. Uma hipótese aplicável se dá quando analisamos

as estruturas químicas das isoflavonas agliconas. A daidizeína e genisteína possuem

estruturas muito parecidas, diferenciando-se apenas por uma hidroxila, enquanto a

gliciteína possui ainda um grupo metoxi, o qual possivelmente sofreu ação da enzima

durante a clivagem da molécula de glicose, descaracterizando sua estrutura, tornando-a

não identificável na análise HPLC-DAD.

Tabela 2. Concentração de isoflavonas nos extratos hidrossolúveis de soja puro e biotransformados por

análise HPLC – DAD.

Hati et al., (2014) inocularam seis culturas probióticas de Lactobacillus (L.

rhamnosus NCDC19 e NCDC24, L. rhamnosus C2 e C6 e L. casei NCDC17 e

NCDC297) ( 1% v / v) ao EHS que foi incubado a 37 ° C por 12 h. Observaram um

aumento considerável no conteúdo de agliconas, sendo que a cepa L. rhamnosus C6 foi

a que produziu o maior conteúdo, totalizando 2,95 mg a cada 100 mL de EHS.

No trabalho de Baú et al., (2015) foi empregado uma cultura comercial de kefir

liofilizada (Lyofast TM 036 LV, Clerici-Sacco®, Campinas-SP, Brasil) composta por

um mix de Lactococcus lactis spp lactis, Lactococcus lactis spp lactis diacetylactis,

Lactobacillus brevis, Leuconostoc spp e Saccharomyces cerevisiae (0,02 UFC / L) em

EHS estéril a 25 ° C por 30 h com cobertura semi aberta. Os resultados mostraram

aumento no teor de isoflavonas agliconas em 7,2 vezes. Esses valores se mostram

Tabela 3. Concentração de isoflavonas nos extratos hidrossolúveis de soja por análise HPLC DAD.

Amostra Isoflavonas Glicosídicas (µg / mL) Isoflavonas Agliconas (µg / mL) Daidzina Genistina Glicitina Daidzeína Genisteína Gliciteína

1 - Controle - EHS puro 0,8828 ± 0.02 0,7094 ± 0.02 0,1361 ± 0.01 0,0933d ± 0.01 0,1700d ± 3.39 0,2953a ± 1.28

2 - EHS fermentado (m.o.s) n.d n.d n.d 0,6770c ± 0.07 0,5533c ± 0.02 0,2954a ± 7.02

3 - EHS fermentado (m.o.s) + Tanase n.d n.d n.d 1,2554a ± 0.01 1,3006a ± 0.01 n.d

4 – EHS + Tanase + m.o.s n.d n.d n.d 1,2126ab ± 0.12 1,2800a ± 0.13 n.d

5 – EHS + Tanase n.d n.d n.d 1,0553b ± 0.03 1,0333b ± 0.03 n.d

Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (n = 3); n.d: não detectado; média na mesma coluna com letras diferentes é significativamente diferente (p < 0,05).

43

43

inferiores aos encontrados neste estudo. O extrato denominado amostra 2, incubado com

apenas duas cepas de Lactobacillus, apresentou concentração total de isoflavonas

agliconas 3,2 vezes maior.

Delgado et al., (2018) estudaram a fermentação de duas bebidas comerciais de

soja compradas em supermercados locais, inoculando-as com dez cepas diferentes de

Lactobacillus. As maiores concentrações de agliconas foram observadas na bebida

incubada com B. pseudocatenulatum C35, juntamente com L. casei LP71, L. plantarum

E112 e L. rhamnosus E41.

A grande vantagem em empregar bactérias probióticas na biotransformação de

extrato hidrossolúvel de soja é quanto à sua alta capacidade de conversão de isoflavonas

glicosiladas para agliconas. Além deste aspecto, aplica-se a qualidade de um produto

rico em probióticos, oferecendo ao consumidor os diversos benefícios à saúde citados

anteriormente, tendo as amostras 2, 3 e 5 como grandes alternativas de produtos

fermentados. Além do mais, o uso de extrato semipurificado de tanase de P. variotti

entra como uma grande inovação por parte do nosso grupo de pesquisa, usado para a

biotransformação de EHS.

10.2. Capacidade antiglicante dos padrões de isoflavonas nos modelos de glicação in

vitro – Isoflavonas glicosiladas x agliconas

Para o modelo BSA / FRU, os padrões de isoflavonas glicosiladas, apresentaram

capacidade antiglicante dose/dependente, tendo a genistina apresentado maior

capacidade antiglicante com 20,66%, seguido pela glicitina com 11% e daidzina com

1% (Figura 10 (a/b)). Observamos que as isoflavonas agliconas também apresentaram

capacidade antiglicante dose/dependente, tendo a genisteína apresentado maior

capacidade antiglicante com 64%, seguido da gliciteína com 10,33% e daidizeína com

2,33% (Figura 11 (a/b)). Dessa forma, foi observado que a capacidade antiglicante da

forma aglicona genisteína foi 43,34% maior que sua forma glicosilada.

44

44

Fig. 10 - Perfil de inibição da glicação de proteínas pelas isoflavonas glicosiladas no modelo BSA /

FRU

(a). Curva dose / resposta de inibição da glicação de proteínas pelos padrões puros de isoflavonas

glicosiladas. (b). Inibições máximas da glicação de proteínas no modelo dos padrões puros de isoflavonas

glicosiladas.

Fig. 11 - Perfil de inibição da glicação de proteínas pelas isoflavonas agliconas no modelo BSA /

FRU


agliconas. (b). Inibições máximas da glicação de proteínas pelos padrões puros de isoflavonas agliconas.

Para o modelo BSA / MGO, as isoflavonas glicosiladas também apresentaram

capacidade antiglicante dose/dependente, tendo a genistina apresentado um leve

decaimento, mas ainda mostrando maior capacidade antiglicante com 17,66%, seguido

da glicitina com 10,33%, que também apresentou leve decaimento e a daidizina com

potencial aumento da sua capacidade antiglicante, com 11% (Figura 12 (a/b)), enquanto

as isoflavonas agliconas também apresentaram capacidade antiglicante dose/

dependente, tendo a genisteína apresentado um leve decaimento, mas ainda

apresentando maior capacidade antiglicante com 59%, seguido da gliciteína que

a) b)

µg / mL Isoflavonas 950 µg / mL

C*

a*

a) b)


a*

c*

45

45

manteve sua capacidade de 10,33% e a daidizeína com pequena diminuição de sua

capacidade antiglicante com 1,66% (Figura 13 (a/b)).

O perfil de comportamento da isoflavona agliconas genisteína se confirma, com

maior atividade antiglicante comparada à sua forma glicosilada. Este resultado, sugere

que extratos mais ricos em genisteína sejam mais eficientes na inibição da glicação nos

modelos testados.

Fig. 12 - Perfil de inibição da glicação de proteínas pelas isoflavonas glicosiladas no modelo BSA /

MGO


glicosiladas. (b). Inibições máximas da glicação proteínas pelos padrões puros de isoflavonas glicosiladas

Fig. 13 - Perfil de inibição da glicação de proteínas pelas isoflavonas agliconas no modelo BSA /

MGO


agliconas. (b). Inibições máximas da glicação de proteínas pelos padrões puros de isoflavonas agliconas.

No modelo ARG / MGO, para as isoflavonas glicosiladas, a glicitina apresentou

maior capacidade antiglicante, com 24% de inibição, aumentando seu potencial

comparado ao segundo modelo, seguida da glicitina e genistina, com 18,66 e 18%

a) b)


a*

bb

a) b)


a*

c*

46

46

respectivamente, sem diferença estatística entre si (Figura 14 (a/b)), enquanto para as

agliconas, apenas a gliciteína apresentou capacidade antiglicante com 20% de inibição.

Fig. 14 - Perfil de inibição da glicação de proteínas pelas isoflavonas glicosiladas no modelo ARG /

MGO


glicosiladas. (b). Inibições máximas da glicação de proteínas pelos padrões puros de isoflavonas

glicosídicas.

Fig. 15 - Perfil de inibição da glicação de proteínas pelas isoflavonas agliconas no modelo ARG /

MGO


agliconas.

Comparando os resultados de inibição entre as isoflavonas glicosiladas e

agliconas para o modelo BSA / FRU, a forma aglicona daidzeína apresentou uma

porcentagem de inibição ligeiramente maior comparada à sua forma glicosilada, a forma

aglicona glicitina e gliciteína apresentaram porcentagens de inibição quase iguais,

variando em menos de 1% a mais para a forma glicosilada, a forma aglicona genisteína

apresentou porcentagem de inibição superior à sua forma glicosilada, além de ser

a) b)


v

a*

bb

a) b)


a*b b

a*

bb

47

47

superior também quando comparada a todas as outras isoflavonas, sejam elas

glicosiladas ou agliconas.

Para o modelo BSA / MGO, a forma glicosídica daidzina mostrou maior

capacidade antiglicante de proteína quando comparada à sua forma aglicona, a forma

glicosilada glicitina e sua aglicona apresentaram a mesma porcentagem de inibição da

glicação. A forma aglicona genisteína apresentou porcentagem de inibição superior à

sua forma glicosilada, além de ser superior também quando comparada a todas as outras

isoflavonas, sejam elas glicosiladas ou agliconas.

Para o modelo ARG / MGO, a forma glicosídica daidzina apresentou capacidade

antiglicante de proteína, enquanto a sua forma aglicona não apresentou atividade, a

forma glicosilada glicitina e sua aglicona apresentaram porcentagens de inibição

parecidas. A forma glicosilada genistina apresentou capacidade de inibição, enquanto a

sua forma aglicona não apresentou atividade.

O modelo BSA / FRU avalia todos os estágios da glicação e os modelos BSA/

MGO e ARG / MGO os estágios intermediários da glicação.

A forma aglicona genisteína mostrou-se mais efetiva para a inibição da glicação

de proteína nos modelos BSA / FRU com 64% e no modelo BSA / MGO com 59% de

inibição, mostrando ser efetiva tanto no estágio inicial quanto no estágio intermediário

da glicação.

São poucos os estudos publicados a respeito da atividade antiglicante de padrões

de isoflavonas. Os resultados que encontramos corroboram com esses estudos, onde

Lishuang et al. (2001), mostraram que a genisteína possui significativo efeito na

interceptação de MGO, formando adutos de mono - e di-MGO sob condições

fisiológicas. Foi também demonstrado que a genisteína pode efetivamente inibir a

formação de AGEs em ensaio BSA / metilglioxal. Esses resultados indicam ainda, que a

uma dieta rica em flavonóides que tenham a mesma estrutura circular da genisteína,

podem ter potencial para inibir a formação de AGEs por interceptação reativa de

espécies carbonila.

Shao et al. (2008) mostraram que a glicosilação pode diminuir a eficácia de

interceptacão do Metilglioxal. Mais tarde, numa tentativa de elucidar melhor o modo de

ação das isoflavonas daidzeína e genisteína, esse mesmo grupo correlacionou seus

potenciais antiglicantes e mostraram que o poder antiglicante dos flavonóides está

relacionado com o grupo hidroxila no C-5 do anel A, que age como agente interceptador

48

48

do MGO. Como resultado de suas estruturas, a genisteína mostrou-se mais eficaz que a

daidizeína na interceptação do mesmo (Shao et al., 2014).

A bioatividade de uma isoflavona aglicona pode variar muito com a matriz na

qual ela está inserida e com a metodologia empregada para investigação. A genisteína

por exemplo, mostrou-se majoritariamente mais capaz em inibir a glicação de proteína

comparada às outras isoflavonas testadas, inclusive à sua forma glicosilada. Porém, as

formas glicosiladas das demais isoflavonas podem ter efeito similar ou até ligeiramente

maior comparados às suas formas agliconas. Dessa forma, associar maior bioatividade a

uma forma aglicona, relacionando-a à uma maior atividade antiglicante de proteína,

limita-se apenas para a genisteína, não se estendendo às demais isoflavonas.

10.3. Capacidade antiglicante de proteínas pelos extratos hidrossolúveis de soja nos

modelos de glicação in vitro

Para todos os modelos de glicação in vitro testados neste trabalho, as amostras

apresentaram atividade antiglicante de proteína dose/dependente, com potências

variadas.

Para compreender melhor o potencial antiglicante do EHS em suas diferentes

formas de biotransformação, deve-se levar em consideração que se trata de um extrato

complexo, que pode conter em sua matriz diferentes compostos fenólicos, além das

isoflavonas identificadas por HPLC-DAD. De qualquer forma, como as isoflavonas são

mais abundantes na matriz de soja e seus benefícios vêm sendo relatados há muito

tempo, foi dado enfoque ao seu potencial antioxidante e como os resultados mostrados,

antiglicante.

Para o modelo BSA / FRU (Figura 16 (a/b)), a amostra 1 (puro/controle)

apresentou boa capacidade antiglicante com 45% de inibição. A amostra 1 contêm com

as duas formas de isoflavonas (glicosiladas e agliconas) (tabela 2), e baseado nos

resultados com os padrões de isoflavonas testados, ambas as formas possuem potencial

antiglicante de proteína. Dessa forma, parece haver um possível sinergismo entre as

formas glicosiladas e agliconas, além dos demais possíveis compostos fenólicos

presentes na matriz, garantindo ao extrato hidrossolúvel de soja em sua base pura, uma

boa capacidade antiglicante de proteínas quando comparado aos extratos

biotransformados.

49

49

A amostra 2, onde o processo fermentativo com micro-organismos não foi

combinado com a ação da enzima tanase, apresentou menor atividade antiglicante de

proteína comparada às outras amostras, com 24,33% de inibição. O processo de

biotransformação microbiana sozinho então, pode não ser tão eficiente para a inibição

da glicação, comparados com a combinação de biotransformações enzimáticas.

Lembrando que trata-se de um produto com característica probiótica, o que em um

estudo in vivo, poderia apresentar resultados diferentes, uma vez que a ação dos

probióticos pode influenciar beneficamente outros aspectos de saúde.

As amostras 4 e 3, onde foram combinados os processos de biotransformação

enzimática e microbiana, não apresentaram diferença estatística entre si, com 57 e

57,33% de inibição. Esses, apresentaram maior atividade antiglicante de proteína

comparadas às outras amostras. A enzima tanase além de agir na deglicosilação, o que

contribui para uma maior efetividade na conversão das isoflavonas glicosiladas para

agliconas, ainda pode ser capaz de liberar mais fenólicos da matriz, aumentando o

sinergismo entre os compostos fenólicos no geral, elevando o potencial antiglicante de

proteína. Na amostra 5, onde o foi empregado o processo de biotransformação

enzimática com tanase, a atividade antiglicante foi bem próxima dos resultados das

amostras 4 e 3, com 53,66% de inibição, o que reforça ainda mais a capacidade da

tanase em aumentar a capacidade antiglicante da matriz do EHS, relacionada com o

aumento da capacidade antioxidante.

Fig. 16 - Perfil de inibição da glicação de proteínas pelas amostras de EHS no modelo BSA / FRU

(a). Curva dose / resposta de inibição da glicação de proteínas pelos extratos hidrossolúveis de soja. (b). Inibições máximas da glicação de proteínas pelos extratos hidrossolúveis de soja. Legenda: Amostra 1

(EHS puro / controle), Amostra 2 (EHS fermentado com m.o.s), Amostra 3 (EHS fermentado com m.o.s

+ tanase), Amostra 4 (EHS + tanase + fermentação com m.o.s), Amostra 5 (EHS + tanase).

mg / mL Amostras 300 mg / mL

v

b*

d*

50

50

Para o modelo BSA / MGO (Figura 17 (a / b)), a amostra 1 apresentou leve

diminuição da porcentagem de inibição da glicação de proteínas em relação ao primeiro

modelo, com 31 % de inibição. A amostra 2, apresentou menor potencial antiglicante

comparado ao ensaio BSA / FRU, com 7,33% e as amostras 3, 4 e 5 apresentam

capacidade antiglicante ligeiramente maior em relação ao seu desempenho no primeiro

modelo, sem diferença estatística entre si, com 61, 63 e 60,33% de inibição.

Fig. 17 - Perfil de inibição da glicação de proteínas pelas amostras de EHS no modelo BSA / MGO (a). Curva dose / resposta de inibição da glicação de proteínas para os extratos hidrossolúveis de soja. (b). Inibições máximas da glicação para os extratos hidrossolúveis de soja. Legenda: Amostra 1 (EHS puro /

controle), Amostra 2 (EHS fermentado com m.o.s), Amostra 3 (EHS fermentado com m.o.s + tanase),

Amostra 4 (EHS + tanase + fermentação com m.o.s), Amostra 5 (EHS + tanase).

Para o modelo ARG / MGO (Figura 18 (a / b)), a amostra 1 mostrou aumento da

porcentagem de inibição da glicação de proteínas em relação ao segundo modelo, com

42% de inibição, sendo ainda ligeiramente menor comparada ao primeiro modelo. A

amostra 2 apresentou maior potencial antiglicante em relação aos modelos anteriores,

com 36% de inibição. As amostras 3 e 5 apresentam capacidade antiglicante menor em

relação ao seu desempenho nos modelos anteriores, sem diferença estatística entre si,

com 45,33 e 44% de inibição respectivamente. E, a amostra 4 apresentou nesse modelo,

maior capacidade antiglicante de proteínas comparada à todas as amostras, com 48% de

inibição, porém menor em relação ao seu desempenho nos modelos anteriores.

Fig. 18 - Perfil de inibição da glicação de proteínas das amostras de EHS no modelo ARG / MGO


v

b*c*

d*


vb*

c*

51

51

(a). Curva dose / resposta de inibição da glicação de proteínas para os extratos hidrossolúveis de soja. (b). Inibições máximas da glicação para os extratos hidrossolúveis de soja. Legenda: Amostra 1 (EHS puro /

controle), Amostra 2 (EHS fermentado com m.o.s), Amostra 3 (EHS fermentado com m.o.s + tanase),

Amostra 4 (EHS + tanase + fermentação com m.o.s), Amostra 5 (EHS + tanase).

Comparando as amostras individualmente nos três modelos testados, todas

apresentaram capacidade antiglicante de proteínas. A amostra 1 mostrou-se mais efetiva

no modelo BSA / FRU, onde pode agir tanto impedindo a formação de MGO, quanto

agindo na sua interceptação, uma vez já formado. A amostra 2 mostrou-se mais efetiva

no modelo ARG / MGO, assim como as amostras 3, 4 e 5 mostraram-se mais efetivas

no modelo BSA / MGO, apresentando então maior efetividade no estágio intermediário

da glicação, sendo eficientes em agir na interceptação do mesmo. A maior capacidade

antiglicante desses extratos pode ser correlacionada com suas capacidades

antioxidantes, como por exemplo relativas às quantidades de genisteína, que são

maiores comparadas com as amostras 1 e 2 (Tabela 1 e 2), sendo a genisteína como já

discutido anteriormente, a isoflavona aglicona que apresenta maior potencial

antiglicante.

Uma vez que a quantificação das isoflavonas por HPLC - DAD para os extratos

hidrossolúveis de soja foi expressa em μg/μL (Tabela 2) e esses foram testados em

mg/mL, para conseguirmos entender melhor a capacidade antiglicante dos extratos

relacionadas às suas quantidades de isoflavonas, deve-se considerar uma conversão de

unidades. Por exemplo, na Tabela 2 a amostra 1 possui 1,08 mg de daidzina, dessa

forma, a cada 1 mg de extrato aproximadamente, tem-se 0,95 mg de daidzina. Em 350

mg de extrato então, essa amostra possui aproximadamente 335,25 mg de daidzina.

Aqui figuramos a conversão da daidzina, porém essa regra vale para todas as outras

isoflavonas identificadas na amostra 1, assim como para todas as outras amostras.

Esta pesquisa representa uma contribuição ao estudo da atividade do EHS em

inibir a glicação de proteínas, uma vez que não se encontra na literatura muitos estudos

in vitro com essa matriz, biotransformada ou não.

A fim de entender melhor os benefícios do consumo de soja, Celec P. et al.,

(2013) estudaram parâmetros do estresse oxidativo em jovens saudáveis, após ingestão

de soja todos os dias por sete dias (2 g / kg de peso corporal diariamente). Os resultados

52

52

mostraram aumento da capacidade antioxidante levando à diminuição de níveis

oxidativos protéicos nas mulheres.

Yonei et al., (2015) em um estudo randomizado, simples-cego, placebo-

controlado, de grupos paralelos, aplicaram teste dietético com ingestão de bebida de

soja suplementada com óleo e farelo de arroz durante três meses, estudando alterações

no receptor solúvel para AGESs (sRAGE), entre outros. Seus resultados mostraram

diminuição de hemoglobina glicada (HbA1c). Esses resultados figuram de uma maneira

clara o grande potencial bioativo e antiglicante das amostras testadas, que tanto

poderiam agir para a melhoria das condições de saúde, como as aqui citadas.

Wang et al., (2017) estudaram os efeitos antiglicantes dos flavonóides

genisteína, rutina, quercetina, luteolina e catequina, adicionados ao leite de soja de

marca comercial (0,2-2 mmol / L). Todos eles foram capazes de agir sobre o MGO e

GO de forma dose / dependente, impedindo que os mesmos gerassem AGEs, podendo a

genisteína diminuir os níveis AGEs derivados de GO em até 45,6% e 42,7% de MGO

em uma concentração de 2 mmol / L. Os resultados aqui se mostram superiores, uma

vez que foi estudada a matriz de EHS puro e biotransformados sem a adição de

isoflavonas e esses foram capazes de inibir a glicação de proteínas em mais de 50 %

para as amostras biotransformadas com micro-organismos e tanase (3 e 4) e com tanase

(5) nos modelos BSA / FRU e BSA / MGO e em mais de 40 % para o modelo ARG /

MGO, além da amostra pura (1) que variou de 31 a 45 % nos modelos testados.

Trabalhar então com um extrato e não com um padrão puro de isoflavona se

torna muito mais barato e efetivo, uma vez que o extrato traz uma matriz com mais de

uma isoflavona e outros possíveis compostos fenólicos presentes, em quantidades

extremamente maiores, que num todo contribuem para uma grande capacidade

antiglicante do EHS.

Analisando as Tabelas 1 e 2 com as capacidades antiglicantes dos extratos

produzidos neste trabalho, fica claro que biotransformação eleva a capacidade

antioxidante das amostras e que esta está diretamente relacionada com a capacidade

antiglicante dos mesmos. Assim, quanto maior a capacidade antioxidante, maior a

atividade antiglicante dos extratos. O aumento da capacidade antioxidante após o

processo de biotransformação, se deve em parte ao aumento de fenólicos diglicosilados.

Como foi observado no estudo com os padrões de isoflavonas puras, a atividade

antiglicante de formas agliconas é significativamente maior que as formas glicosiladas.

53

53

Assim, pode-se em parte entender a superioridade dos extratos biotransformados na

inibição da glicação de proteínas.

11. CONCLUSÕES

Os modelos de estudo in vitro para determinação da atividade antiglicante de

extrato hidrossolúvel de soja rico em isoflavonas, indicam que o EHS puro ou

biotransformado pode agir nos diferentes estágios da glicação, apresentando efetividade

em inibir e interceptar a formação de AGEs derivados de MGO, diminuindo a glicação

de proteínas e potencialmente seus efeitos deletérios à saúde.

Analisando todos os processos de obtenção dos extratos testados, pode-se

concluir que para a obtenção de EHS com efeito antiglicante de proteínas, o processo

fermentativo simples (amostra 2) não se mostra muito vantajoso, dando o poder de

inibição máxima de 36%. Por outro lado, se o objetivo for o de produzir um EHS

adicionado de probióticos, contribuindo para a melhora de saúde consumidor, e, por

mais que a atividade antiglicante para esse extrato tenha sido menor comparada aos

outros extratos, ainda assim, ter também esse benefício seria muito interessante.

O EHS puro (amostra 1) apresentou capacidade antiglicante máxima de 45%, o

que mostra que a matriz ainda pura, oferece bom potencial antiglicante de proteínas.

A biotransformação enzimática com tanase combinada ou não com a

fermentação da matriz do EHS (amostra 3, 4 e 5), mostrou-se capaz de elevar a

quantidade das isoflavonas agliconas daidizeína e genisteína, sendo a última, dentre

todas as isoflavonas, a mais potente em inibir a glicação de proteínas, tornando os

extratos mais bioativos e eficientes na diminuição da glicação. Dessa forma, apresentam

aumento das capacidades antioxidante e antiglicante para esses extratos, apresentando

inibições máximas da glicação de proteínas de 61, 63 e 60,33% respectivamente. Dessa

forma, a combinação de biotransformações enzimática e microbiana ou a

biotransformação enzimática somente com tanase, é uma boa alternativa para a

obtenção de extratos com atividade antiglicante e efeito probiótico.

12. TRABALHOS FUTUROS

54

54

Os resultados obtidos neste trabalho podem propiciar o desenvolvimento de mais

estudos in vitro e in vivo, para melhor elucidação dos mecanismos de ação, doses de

interesse e toxicidade, além dos efeitos dos probióticos no perfil geral de saúde, a fim de

contribuir para o desenvolvimento de um extrato rico em isoflavonas como um

ingrediente funcional e auxiliar na diminuição da glicação de proteínas e das

complicações da diabetes.

13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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70

70

ANEXOS

Fig. 1. Cromatogramas obtidos por HPLC - CLAE - DAD com tempo de retenção das isoflavonas (Amostra 1 – puro / controle).

Operator:Administrador Timebase:Bioquímica Sequence:ISOFLAVONAS + TANASE Page 1-15/12/2018 3:03 PM

METOD_FENOLICOS_CENTEIO/IntegrationChromeleon (c) Dionex 1996-2006

Version 6.80 DU10a Build 2826 (171948)

194 Repetição Amostra 1-3 10 mg/ml

Sample Name: Repetição Amostra 1-3 10 mg/ml Injection Volume: 20,0 Vial Number: RA2 Channel: UV_VIS_1Sample Type: unknown Wavelength: 254.0Control Program: MetIsoflavonas3 Bandwidth: 4Quantif. Method: CalcIsoflavonas Dilution Factor: 1,0000 Recording Time: 6/4/2018 20:48 Sample Weight: 1,0000 Run Time (min): 95,00 Sample Amount: 1,0000

No. Ret.Time Peak Name Height Area Rel.Area Amount Type min mAU mAU*min % ug

1 32,11 Daidzina 23,889 19,598 23,19 n.a. BMB2 34,29 Glicitina 3,744 3,012 3,56 n.a. BMB3 41,37 Genistina 38,670 21,577 25,54 n.a. BMB4 50,00 Gliciteína 54,482 27,506 32,55 n.a. BMB5 52,16 Daidzeína 7,772 3,519 4,16 n.a. BMB6 61,20 Genisteína 19,760 9,283 10,99 n.a. BMB

Total: 148,318 84,495 100,00 0,000

12,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0-20

50

100

150

200

250

ISOFLAVONAS + TANASE #194 [modified by Administrador] UV_VIS_1

mAU

min

1 - D

aidz

ina

- 32,

108

2 - G

licitin

a - 3

4,28

5

3 - G

enist

ina

- 41,

372

4 - G

licite

ína

- 49,

995

5 - D

aidz

eína

- 52

,155

6 - G

enist

eína

- 61

,200

WVL:254 nm

12 - G...

3 45 - D...

6 - E...7 - S

8

9 - Ge...

TlSn

sF =

3,0

Absorbância[mAU]

Tempo de retenção [min]

Amostra 1

71

71

Fig. 2. Cromatogramas obtidos por HPLC - CLAE - DAD com tempo de retenção das isoflavonas (Amostra 2 – EHS fermentado (m.o.s)).




178 Amostra 2-2 10 mg/1ml

Sample Name: Amostra 2-2 10 mg/1ml Injection Volume: 20,0 Vial Number: RA2 Channel: UV_VIS_1Sample Type: unknown Wavelength: 254.0Control Program: MetIsoflavonas3 Bandwidth: 4Quantif. Method: CalcIsoflavonas Dilution Factor: 1,0000 Recording Time: 5/4/2018 21:37 Sample Weight: 1,0000 Run Time (min): 95,00 Sample Amount: 1,0000


1 3,70 n.a. 10,363 0,201 0,19 n.a. BMB*2 6,37 n.a. 3,695 1,536 1,49 n.a. BMB3 43,13 Genistina 27,865 15,963 15,47 n.a. BMB*4 49,99 Gliciteína 58,461 29,464 28,56 n.a. BM 5 52,16 Daidzeína 52,521 25,428 24,65 n.a. MB6 61,20 Genisteína 64,363 30,573 29,64 n.a. BMB

Total: 217,268 103,165 100,00 0,000

12,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0-20

50

100

150

200

250


mAU

min

3 - G

enist

ina

- 43,

127

4 - G

licite

ína

- 49,

988

5 - D

aidz

eína

- 52

,155

6 - G

enist

eína

- 61

,195

WVL:254 nm

12 - G...

3 45 - D...

6 - E...7 - S

8

9 - Ge...

TlSn

sF =

3,0

Amostra 2

Abs

orbâ

ncia

[mA

U]


72

72

Fig. 3. Cromatogramas obtidos por HPLC - CLAE - DAD com tempo de retenção das isoflavonas (Amostra 3 – EHS fermentado (m.o.s) + Tanase).





Sample Name: Amostra 3-3 10 mg/1ml Injection Volume: 20,0 Vial Number: RB3 Channel: UV_VIS_1Sample Type: unknown Wavelength: 254.0Control Program: MetIsoflavonas3 Bandwidth: 4Quantif. Method: CalcIsoflavonas Dilution Factor: 1,0000 Recording Time: 6/4/2018 4:02 Sample Weight: 1,0000 Run Time (min): 95,00 Sample Amount: 1,0000


1 3,68 n.a. 30,603 23,085 14,87 n.a. BMb*2 6,37 n.a. 3,991 1,617 1,04 n.a. bMB3 7,92 n.a. 2,492 1,208 0,78 n.a. BMB4 47,03 Gliciteína 2,922 1,739 1,12 n.a. BMB5 52,20 Daidzeína 109,788 52,667 33,93 n.a. BMB6 61,24 Genisteína 156,942 74,893 48,25 n.a. BMB

Total: 306,738 155,209 100,00 0,000

12,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0-20

50

100

150

200

250


mAU

min

4 - G

licite

ína

- 47,

032

5 - D

aidz

eína

- 52

,200

6 - G

enist

eína

- 61

,238 WVL:254 nm

12 - G...

3 45 - D...

6 - E...7 - S

8

9 - Ge...

TlSn

sF =

3,0

Amostra 3

Absorbância[mAU]


73

73

Fig. 4. Cromatogramas obtidos por HPLC - CLAE - DAD com tempo de retenção das isoflavonas (Amostra 4 – EHS fermentado (Tanase) + m.o.s).





Sample Name: Amostra 4-3 10 mg/1ml Injection Volume: 20,0 Vial Number: RC2 Channel: UV_VIS_1Sample Type: unknown Wavelength: 254.0Control Program: MetIsoflavonas3 Bandwidth: 4Quantif. Method: CalcIsoflavonas Dilution Factor: 1,0000 Recording Time: 6/4/2018 7:15 Sample Weight: 1,0000 Run Time (min): 95,00 Sample Amount: 1,0000


1 3,45 n.a. 134,322 71,833 38,48 n.a. BMb2 3,66 n.a. 13,586 1,915 1,03 n.a. Rd3 6,38 n.a. 3,422 1,501 0,80 n.a. bM 4 7,91 n.a. 6,763 4,449 2,38 n.a. MB5 52,21 Daidzeína 91,231 43,868 23,50 n.a. BMB6 61,24 Genisteína 132,029 63,110 33,81 n.a. BMB

Total: 381,353 186,676 100,00 0,000

12,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0-20

50

100

150

200

250


mAU

min

5 - D

aidz

eína

- 52

,207

6 - G

enist

eína

- 61

,242

WVL:254 nm

12 - G...

3 45 - D...

6 - E...7 - S

8

9 - Ge...

TlSn

sF =

3,0

Amostra 4

Absorbância[mAU]


74

74

Fig. 5. Cromatogramas obtidos por HPLC - CLAE - DAD com tempo de retenção das isoflavonas (Amostra 5 – EHS fermentado (Tanase)).





Sample Name: Amostra 5-1 10 mg/1ml Injection Volume: 20,0 Vial Number: RD1 Channel: UV_VIS_1Sample Type: unknown Wavelength: 254.0Control Program: MetIsoflavonas3 Bandwidth: 4Quantif. Method: CalcIsoflavonas Dilution Factor: 1,0000 Recording Time: 6/4/2018 8:51 Sample Weight: 1,0000 Run Time (min): 95,00 Sample Amount: 1,0000


1 3,67 n.a. 144,015 83,440 42,80 n.a. BM 2 5,18 n.a. 3,845 2,050 1,05 n.a. M 3 6,36 n.a. 3,728 1,480 0,76 n.a. Mb4 7,92 n.a. 3,319 1,912 0,98 n.a. bMB5 52,19 Daidzeína 94,534 45,216 23,20 n.a. BMB6 61,23 Genisteína 127,355 60,835 31,21 n.a. BMB

Total: 376,797 194,934 100,00 0,000

12,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0-20

50

100

150

200

250

ISOFLAVONAS + TANASE #185 Amostra 5-1 10 mg/1ml UV_VIS_1

mAU

min

5 - D

aidz

eína

- 52

,193

6 - G

enist

eína

- 61

,230

WVL:254 nm

12 - G...

3 45 - D...

6 - E...7 - S

8

9 - Ge...

TlSn

sF =

3,0

Amostra 5

Abs

orbâ

ncia

[mA

U]


75

75

Tabela 1. Medida da atividade enzimática específica de Tanase do extrato enzimático semipurificado de Paecilomyces variotii.

Tabela 4. Medida da atividade enzimática específica de Tanase do extrato enzimático semipurificado de Paecilomyces variotii.

Atividade de Tanase Atividade (U* / g enzima) Proteínas totais (mg proteína / g enzima) Atividade específica (U* / mg proteína)

Extrato semipurificado de Tanase

de Paecilomyces variotii 0.23 0.15 1.63

*1U de atividade enzimática foi definida como a quantidade em µmol de ácido gálico formado por minuto de reação.

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