UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO

DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS

DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DA EXTRAÇÃO DA

SERICINA E PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PARA

APLICAÇÃO EM COSMÉTICOS

FARM. AMANDA GOMES MARCELINO

AUTORA

PROFA DRA MARIA HELENA ANDRADE SANTANA

ORIENTADORA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA À FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM ENGENHARIA QUÍMICA

CAMPINAS - SÃO PAULO

DEZEMBRO - 2008

iv

AGRADECIMENTOS

Esse trabalho contou com a colaboração de muitas pessoas com as

quais tive o prazer de conviver e aprender muito durante esses anos.

Agradeço principalmente à professora Maria Helena, pela sua

orientação, apoio, incentivo e dedicação.

Agradeço à equipe da empresa Chemyunion, especialmente à

Carmen, Cecília, Marcos e Márcio, pelas discussões que contribuíram com

o desenvolvimento deste trabalho.

Agradeço ao Prof. Dr. César Costapinto Santana por ter

disponibilizado o uso do equipamento Autosizer® 4700 em seu laboratório.

Agradeço ao professor Prof. Dr. Nelson Durán, por ter disponibilizado

o ZetaSizer Nano® em seu laboratório.

Agradeço à empresa Evic Brasil pela utilização do Glossmetter e do

Colorímetro nos ensaios em mechas de cabelos.

Agradeço ao Laboratório de Recursos Analíticos e de Calibração da

Faculdade de Engenharia Química.

Agradeço à Profa. Dra. Marisa Beppu por ceder os fios de seda no

início deste trabalho.

Agradeço aos meus colegas da Unicamp: Aline, Amós, André,

Andréa, Beatriz, Carla, Danilo, Luciana, Lucimara Lopes, Lucimara Torre,

Pablo, Patrícia, Reinaldo, Silas, Sônia, Thaís e Viviane pela amizade e

pelos bons momentos que passamos. Agradeço especialmente ao Gilson

pela pronta disposição em nos auxiliar no dia-a-dia do laboratório.

Agradeço à Deus por me conceder a oportunidade de realizar esse

trabalho, à minha família por sempre me apoiar em todas as minhas

escolhas e ao Ivan, por me incentivar a seguir este caminho e me apoiar

durante todo ele.

Agradeço à Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e à

Chemyunion Química Ltda. pelo apoio financeiro.

v

RESUMO

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de nanopartículas de sericina

para aplicação no tratamento cosmético dos cabelos. As nanopartículas

foram obtidas a partir de soluções de sericina previamente extraídas de

casulos ou fios de seda e formadas através de complexação eletrostática

com goma guar. A superfície das nanopartículas foi modificada através da

incorporação de agentes tensoativos catiônicos, com a finalidade de

conferir-lhe densidade de carga positiva adequada para a adsorção aos

fios de cabelo. O processo de produção envolveu as etapas de extração

da sericina dos casulos ou fios de seda, reticulação, e modificação da

superfície das nanopartículas. A extração foi realizada em autoclave ou a

pressão atmosférica, utilizando água ou solução de carbonato de sódio

como solventes. Durante a complexação foi estudada a influência da

utilização de diferentes concentrações goma guar quaternizada, assim

como a forma de adição desse agente, que foi feita em pó e em solução

aquosa. A modificação na superfície das partículas foi feita com os

tensoativos catiônicos cloreto de cetiltrimetil amônio (CTAC) e cloreto de

behenyltrimetil amônio (BTAC), isoladamente e em mistura a diferentes

proporções. A incorporação dos tensoativos catiônicos foi feita na

presença dos eletrólitos resultantes da extração ou após separação das

nanopartículas através de precipitação com etanol e posterior

ressuspensão em água. Os efeitos foram analisados em termos de

rendimento dos processos, tamanho das nanopartículas e potencial zeta.

O poliquaternium 7, um derivado de amônia quaternária, foi adicionado à

suspensão de nanopartículas como agente de viscosidade. Os resultados

obtidos mostram a factibilidade da produção de nanopartículas de sericina

com propriedades sensoriais promissoras para o condicionamento de

cabelo danificado. O processo de produção é simples, escalonável e de

fácil transferência para o setor industrial.

vi

ABSTRACT

This work presents the development of sericin nanoparticles applied

to the cosmetic treatment of hair. The nanoparticles were obtained from

sericin solutions, previously extracted from cocoons or silk yarn, and

formed through electrostatic complexation with guar gum. The surface of

the nanoparticles was modified through the incorporation of cationic

surfactant agents, in order to obtain positive charge density, suitable for

the adsorption on the hair surface. The production process involved the

steps of sericin extraction from the cocoons or silk yarn, complexation and

modification of the nanoparticles surface. The extraction was performed in

autoclave and atmospheric pressure, using water or an aqueous solution

of sodium carbonate as solvents. During the complexation was studied the

effect of different concentrations of guar gum, as well as how to add this

agent, which was made in powder and in an aqueous solution. The surface

modification of particles was made with the cationic surfactant cetiltrimetil

ammonium chloride (CTAC) and behenyltrimetil ammonium chloride

(BTAC), alone and in combination with different proportions. The

incorporation of cationic surfactant was made in the presence of

electrolytes, resulting from the extraction, or after separation of the

nanoparticles by precipitation with ethanol and resuspended in water later.

The effects were analyzed in terms of efficiency of processes,

nanoparticle size and zeta potential. The poliquaternium 7, a quaternary

ammonium derivative, was added to the nanoparticles suspension as a

viscosity agent. The results show the feasibility of output of sericin

nanoparticles with promising sensory properties for the conditioning of

damaged hair. The production process is simple, scalable and easy to

transfer to the industrial sector.

vii

SUMÁRIO

1. Introdução...............................................................................................1

2. Objetivos .................................................................................................4

3. Revisão Bibliográfica ..............................................................................5

3.1. A Seda .................................................................................................5

3.1.1. Origem e disseminação da sericicultura ...........................................5

3.1.2. Composição da seda ........................................................................7

3.1.3. Aplicação na Indústria de Fiação ......................................................9

3.2. A sericina ...........................................................................................10

3.2.1. Extração e Separação.....................................................................10

3.2.2. Propriedades Físico-Químicas........................................................16

3.2.3. Aplicações.......................................................................................18

3.3. Nanopartículas...................................................................................20

3.4. Nanopartículas para aplicação em cosméticos..................................22

3.5. Preparação de partículas de proteína através da formação de

Complexos de Polieletrólitos (PECs) ........................................................25

3.6. Estabilidade das nanopartículas ........................................................30

3.6.1. Secagem por atomização ...............................................................31

3.6.2. Liofilização ......................................................................................32

3.7. O Cabelo Humano .............................................................................33

3.8. Condicionamento dos cabelos ...........................................................35

3.8.1. Agentes Condicionantes dos Cabelos ............................................36

3.8.1.1. Goma Guar Quaternizada (JaguarC13 ®) ...................................36

3.8.1.2. Cloreto de Cetiltrimetil amônio e Cloreto de Behenyltrimetil amônio

..................................................................................................................38

viii

3.8.1.3. Poliquaternium 07 ........................................................................39

4. Materiais e Métodos..............................................................................40

4.1. Materiais ............................................................................................40

4.2. Métodos .............................................................................................40

4.2.1. Extração da Sericina.......................................................................40

4.2.1.1. Matéria-prima...............................................................................42

4.2.1.2. Extração em autoclave.................................................................43

4.2.1.3. Extrações sob pressão atmosférica .............................................44

4.2.1.3.1. Extração em banho termostático...............................................44

4.2.1.3.2. Extração em Tanque agitado ....................................................45

4.2.1.3.3. Extração em coluna de recheio.................................................45

4.2.1.3.3.1. Escalonamento do processo de extração em coluna de recheio

..................................................................................................................46

4.2.2. Produção das nanopartículas de sericina .......................................48

4.2.2.1. Reticulação na presença de conservantes. .................................51

4.2.2.2. Secagem das nanopartículas.......................................................51

4.2.3. Precipitação das nanopartículas de sericina com etanol ................52

4.2.4. Formação de nanopartículas de sericina recobertas (NR)..............52

4.2.4.1. Recobrimento com cloridrato de arginina.....................................53

4.2.4.2. Recobrimento com BTAC e CTAC...............................................53

4.2.5. Adição de agente de viscosidade às nanopartículas de sericina

recobertas.................................................................................................54

4.2.6. Caracterização da proteína Sericina obtidas nas extrações ...........55

4.2.6.1. Determinação da Massa Molecular da Sericina em solução........55

4.2.6.2. Determinação do teor de proteína na SS pela metodologia de

Bradford ....................................................................................................57

ix

4.2.6.3. Determinação de nitrogênio total na SS pela metodologia de

Kjedahl......................................................................................................58

4.2.7. Caracterização de nanopartículas ..................................................59

4.2.7.1. Diâmetro hidrodinãmico ...............................................................59

4.2.7.2. Potencial Zeta ..............................................................................61

4.2.7.3. Morfologia das nanopartículas em solução..................................62

4.2.7.4. Morfologia das nanopartículas de sericinna secas ......................63

4.2.8. Avaliação do efeito das nanopartículas de sericina recobertas em

mechas de cabelos. ..................................................................................63

4.2.8.1. Análise de Brilho em mechas de cabelos ....................................63

4.2.8.2. Análise de volume das mechas ...................................................64

4.2.8.3. Geração de imagens por microscopia eletrônica de varredura....65

5. Resultados e Discussão........................................................................66

5.1. Extração da Sericina..........................................................................66

5.1.1. Matéria-Prima .................................................................................66

5.1. 2. Extração em autoclave...................................................................66

5.1.3. Extração sob pressão atmosférica..................................................68

5.1.3.1. Extração em banho termostático .................................................69

5.1.3.2. Extração em tanque agitado ........................................................69

5.1.3.3. Extração em coluna de recheio....................................................71

5.1.3.4. Extração em coluna-Planta Piloto ................................................73

5.2. Distribuição de Massa Molecular .......................................................75

5.3. Formação das nanopartículas de sericina e determinação do diâmetro

hidrodinâmico............................................................................................77

5.3.1. Agregados protéicos e nanopartículas de sericina formadas com

solução obtida da extração em autoclave.................................................78

x

5.3.2. Agregados proteicos - extração com carbonato de sódio ...............80

5.3.3. Nanopartículas preparadas a partir de solução de sericina obtidas

por extração em autoclave........................................................................81

5.3.4. Nanopartículas preparadas com a sericina extraída em carbonato de

sódio .........................................................................................................83

5.3.4.1. Influência da goma guar quaternizada na formação das

nanopartículas de sericina ........................................................................83

5.3.4.2. Nanopartículas obtidas utilizando-se goma guar quaternizada em

pó..............................................................................................................86

5.4. Precipitação das partículas de sercina com etanol ............................88

5.5.Caracterização das nanopartículas de sericina após recobrimento com

materiais catiônicos ..................................................................................89

5.5.1.Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas de sericina recobertas

com cloridrato de arginina.........................................................................89

5.5.2. Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas de sericina recobertas

com CTAC ................................................................................................92

5.5.3. Potencial zeta das nanopartículas de sericina recobertas com BTAC

..................................................................................................................94

5.5.4. Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas de sericina recobertas

com mistura de CTAC e BTAC .................................................................94

5.5.4.1. Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas de sericina

precipitadas com etanol e recobertas com mistura de CTAC e BTAC......95

5.5.4.2. Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas obtidas na solução

de extração e recobertas com mistura de CTAC e BTAC.........................97

5.6. Influência dos conservantes na formação das nanopartículas de

sericina ...................................................................................................103

5.7. Análise das partículas de sericina secas por atomização e por

liofilização ...............................................................................................104

xi

5.7.1. análise da morfologia das partículas de sercina secas por

atomização e por liofilização ...................................................................104

5.7.2. Diâmetro das partículas de sercina formadas pela ressuspensão dos

pós em água ...........................................................................................107

5.8. Morfologia das nanopartículas de sericina recobertas com ctac......108

5.9. Análise dos fios de cabelos – eficácia do tratamento ......................108

5.9.1. Efeito de brilho em mechas de cabelos ........................................108

5.9.2. Efeito de diminuição de volume em mechas de cabelos...............110

5.9.3. Imagens das fibras capilares analisadas por Microscopia Eletrônica

de Varredura...........................................................................................112

6. Conclusões .........................................................................................114

7. Sugestões para trabalhos futuros .......................................................116

8. Referências Bibliográficas...................................................................117

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: (a) Lagartas construindo casulos (b) Casulo (c) Pupa no interior

do casulo (Brancalhão, 2005) .....................................................................5

Figura 2: Metamorfose do inseto (Brancalhão, 2005) .................................6

Figura 3: Estrutura da fibroína constituída de folhas beta antiparalelas

(Lehninger, 2003)........................................................................................8

Figura 4 Representação esquemática das nanocápsulas e nanoesferas

poliméricas (Schaffazick et al, 2003). .......................................................22

Figura 5: Principais tendências nas interações entre proteínas e

polissacarídeos (Ye, A., 2008) ..................................................................26

Figura 6: Representação esquemática da estruturas "ladder-like" e do

modelo "scrambled-egg”. Preto representa o maior poliíon (negativo) e

cinza representa o poliíon de carga oposta (positivo). (a) mostra a

representação "ladder-like" onde ocorre um pareamento insuficiente de

íons em certas condições estequiométricas permitindo a formação de

agregados insolúveis e PECs solúveis (b) mostra o modelo "scrambled-

egg”, onde polímeros de tamanhos semelhantes se complexam formando

PECs insolúveis sob certas condições (Hartig et al, 2007). ......................27

Figura 7: Etapas do processo de secagem por atomização

(http://irtec1.irtec.bo.cnr.it/proc-spray-drying.htm, 2008)...........................31

Figura 8: Liofilizador de bancada

(www.liobras.com.br/biofreezer_l202_page.htm)......................................33

Figura 9: (a) Esquema da estrutura da fibra capilar (b) Seção transversal

da fibra capilar humana (Wei et al., 2005). ...............................................34

Figura 10: Estrutura Química da Goma Guar ...........................................37

Figura 11: Goma Guar Quaternizada - JaguarC13 ® ...............................37

Figura 12: Estrutura molecular do CTAC (R=C16) e BTAC (R=C22) .......38

xiii

Figura 13: Estrutura molecular do Poliquaternium 07® (Monteiro et al,

2003).........................................................................................................39

Figura 14: Representação esquemática do sistema utilizado para extração

da sericina.................................................................................................47

Figura 15: Estrutura molecular (a) ácido aspártico (b) Goma Guar

Quaternizada (Material Técnico Phytophora, revendora Rhodia). ............49

Figura 16:Identificação das camadas carregadas em torno de uma

partícula (Malvern Instruments)) ...............................................................62

Figura 17: Extração em coluna recheada com casulos secos ..................72

Figura 18: Eletroforese SDS –PAGE em gel acrilamida 7,5%.

(M)Marcadores; (1)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e

(2) Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 350C; (3) Solução obtida

pela extração com água a 1200C; (4)Solução obtida pela extração com

Na2CO3 a 900C e ajustada para neutralidade (pH7) ...............................76

Figura 19: Eletroforese SDS –PAGE em gel acrilamida 10%.

(M)Marcadores; (1)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e

(2) Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 350C; (3) Solução obtida

pela extração com água a 1200C; (4)Solução obtida pela extração com

Na2CO3 a 900C e ajustada para neutralidade (pH7). ..............................76

Figura 20: Diâmetro médio dos agregados protéicos em diferentes

temperaturas de extração (a) 1200C (b) 1240C (c) 1260C (Análise por

intensidade de luz espalhada). .................................................................79

Figura 21: Distribuição de tamanho dos agregados protéicos obtidos por

extração com solução Na2CO3 (Análise por intensidade de luz

espalhada). ...............................................................................................81

Figura 22: Diâmetro médio das nanopartículas obtidas a partir da sericina

extraída nas temperaturas: (a) 1200C (b) 1240C (c) 1260C (Análise por

intensidade de luz espahada). ..................................................................82

xiv

Figura 23: Diâmetro das nanopartículas de sericina formadas com

diferentes concentrações de goma guar quaternizada em solução (% m/v):

(a) 0,002; (b) 0,004; (c)0,02; (d) 0,03; (e) 0,035; (f)0,04; (g)0,05; (h) 0,1; (i)

0,14 (Análise por intensidade de luz espalhada). .....................................86


diferentes concentrações de goma guar quaternizada em pó: (a) 0,03% (b)

0,035% e (c) 0,04% (Análise por intensidade de luz espalhada). ............88

Figura 25: Diâmetro das nanopartículas de sericina recobertas com

diferentes concentrações de Cloritdrato de arginina ((a) 0,1; (b) 0,25;

(c)0,5; (d) 1,0; (e) 2,5; (f)5,0; (g)10,0 (Análise por intensidade de luz

espalhada). ...............................................................................................91

Figura 26: Diâmetro das nanopartículas de sericina (precipitadas com

etanol) recobertas com CTAC à: (a) 0,1; (b) 0,25 (Análise por intensidade

de luz espalhada)......................................................................................93


etanol) recobertas com mistura CTAC/BTAC nas concentrações à: (a)

0,2/0,8%; (b) 0,5/0,5% (c)0,8/0,2% (Análise em intensidade de luz

espalhada). ...............................................................................................96

Figura 28: Diâmetro das partículas recobertas com 0,2% de BTAC e 0,8%

de CTAC (a) número (b) intensidade. .......................................................98








de CTAC (a) número (b) intensidade. .....................................................100

xv









Figura 37: Diâmetro das nanopartículas de sericina formadas (a) antes e

(b) depois da adição dos conservantes. .................................................104

Figura 38: Morfologia das partículas de sericina, secas por spray, com as

seguintes concentrações de goma guar (a) 0; (b) 0,03% (c) 0,035% e (d)

0,04%......................................................................................................105

Figura 39: Morfologia das partículas de sericina, secas por liofilização,

com as seguintes concentrações de goma guar (a) 0; (b) 0,03% (c)

0,035% e (d) 0,04%. ...............................................................................106

Figura 40: Nanopartículas de sericina recobertas com1% de CTAC......108

Figura 41: Porcentagem de aumento de brilho nos cabelos virgens

tratados com Placebos (P) e com Nanopartículas de Sericina (N) em

diferentes concentrações, onde (P1%) solução aquosa do placebo a 1%,

(P3%) solução aquosa do placebo a 3%, (P5%) solução aquosa do

placebo a 5%, (N1%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a

1%, (N3%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a 3%, (N5%)

dispersão de nanopartículas de sericina em água a 5%.........................109

Figura 42: Porcentagem de aumento de brilho nos cabelos danificados

tratados com Placebos e com Nanopartículas de Sericina em diferentes

concentrações, onde (P1%) mecha tratada com solução aquosa do

placebo a 1%, (P3%) mecha tratada com solução aquosa do placebo a

3%, (P5%) mecha tratada com solução aquosa do placebo a 5%, (N1%)

dispersão de nanopartículas de sericina em água a 1%, (N3%) dispersão

xvi

de nanopartículas de sericina em água a 3%, (N5%) dispersão de

nanopartículas de sericina em água a 5%. .............................................110

Figura 43: Redução de volume das mechas (cm) nos cabelos tratados

com Controle (C), Placebos (P) e com Nanopartículas de Sericina (N) em

diferentes concentrações: (P1%) solução aquosa do placebo a 1%, (P3%)

solução aquosa do placebo a 3%, (P5%) solução aquosa do placebo a



de nanopartículas de sericina em água a 5%. ........................................111

Figura 44: Fios de cabelos virgens .........................................................112

Figura 45: Fios de cabelos danificados...................................................112

Figura 46: Fios de cabelos tratados com nanopartículas de sericina .....113

xvii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Composição de aminoácidos da sericina (Zhang et al, 2004).....9

Tabela 2: Massa de proteína recuperada por precipitação com acetato e

com álcool, a partir de 100 mL extrato (com 52,8 mg de N) obtido a

diferentes temperaturas de extração (Kodana, 1926)...............................12

Tabela 3: Rendimento das extrações pela precipitação da sericina com

etanol em diferentes concentrações (Hong et al, 2006)............................13

Tabela 4: Taxa de degomagem e conteúdo de sericina da fibra de seda

em várias condições de degomagem (Ki et al, 2007). ..............................16

Tabela 5: Classificação visual das transições de fases de uma mistura de

biopolímeros (Prata, 2006)........................................................................28

Tabela 6: Métodos, Solventes e Matéria Prima (MP) para Extração da

Sericina. ....................................................................................................42

Tabela 7: Condições experimentais utilizadas na extração em autoclave.44

Tabela 8: Condições experimentais utilizadas nas extrações realizadas em

planta piloto...............................................................................................48

Tabela 9: Concentrações de goma guar quaternizada utilizadas na

produção das nanopartículas....................................................................50

Tabela 10: Concentrações de BTAC e CTAC usados separadamente no

recobrimento das NS, com remoção do sal. .............................................53

Tabela 11: Concentrações das formulações (2,7% de proteína) preparadas

com misturas de CTAC e BTAC, com remoção do sal. ............................54

Tabela 12: Concentrações das formulações preparadas com misturas de

CTAC e BTAC, sem remoção do excesso e eletrólitos.............................54

Tabela 13: Teor de proteína nas soluções de sericina obtidas através da

extração com os fios e com os casulos, na extração em autoclave..........68


extração com os fios. ................................................................................69

xviii

Tabela 15: Concentração de nitrogênio total e proteína nas soluções

obtidas por extração com solução aquosa de Na2CO3 em tanque agitado,

à 80-900C. ................................................................................................70

Tabela 16: Concentração de proteína na solução de sericina obtida da

extração dos casulos (picados e íntegros), com solução aquosa de

Na2CO3 em tanque agitado, à 80-900C...................................................71

Tabela 17: Concentração de proteínas em diferentes tempos da extração,

utilizando casulos secos e picados, à 80-900C. .......................................72

Tabela 18: Concentração de proteínas em diferentes tempos da extração

em coluna (casulos intumescidos), à temperatura 80-900C .....................73

Tabela 19: Teor de proteína e rendimento das extrações realizadas em

planta piloto, à temperatura 80-900C, utilizando método de Bradford para

quantificação.............................................................................................74

Tabela 20: Potencial Zeta da Solução de Sericina e de uma Solução de

Goma Guar Quaternizada, em pH 5,5, em água. .....................................78

Tabela 21: Diâmetro médio dos agregados protéicos após a extração com

água (Análise em número)........................................................................79

Tabela 22: Diâmetro médio das partículas logo após a reticulação (Análise

em número)...............................................................................................81

Tabela 23: Diâmetro das partículas de sericina formadas com diferentes

concentrações de solução de Goma Guar Quaternizada. ........................84

Tabela 24: Diâmetro (em número) das nanopartículas de sericina

formadas com diferentes concentrações de goma guar quaternizada em

pó..............................................................................................................87

Tabela 25: Rendimento das precipitações com etanol 96% .....................89

Tabela 26: Distribuição de tamanho (em número) e potencial zeta das

nanopartículas de sericina obtidas em solução e recobertas com arginina.

..................................................................................................................90

xix

Tabela 27: Diâmetro (em número) e potencial zeta das partículas

recobertas com CTAC ..............................................................................92

Tabela 28: Potencial zeta das partículas recobertas com BTAC ..............94

Tabela 29: Diâmetro e potencial zeta das partículas precipitadas com

etanol recobertas com mistura de CTAC e BTAC.....................................95

Tabela 30: Potencial zeta das nanopartículas de sericina em solução

recobertas com mistura de CTAC e BTAC ...............................................97

Tabela 31: Influência da ordem de adição dos conservantes no diâmetro

hidrodinâmico das partículas. .................................................................103

Tabela 32: Diâmetro médio das partículas formadas a partir da

ressuspensão em água dos pós obtidos por atomização e por liofilização

(Análise em número de partículas). ........................................................107

xx

NOMENCLATURA

BTAC: Cloreto de beheniltrimetil amônio

CTAC: Cloreto de cetiltrimetil amônio

MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura

MM: Massa Molecular

NLC: Nanocarreadores lipídicos sólidos

NP: Nanopartícula

NR: Nanopartículas de sericina recobertas

NS: Nanopartículas de sericina

PCS: Photo correlation spectroscopy (Espectroscopia de Correlação de

Fótons)

PEC: Complexo de polieletólitos

PZ: Potencial Zeta

SLN: Nanopartícula lipídica sólida

SS: Solução de sericina

1

1. INTRODUÇÃO

A nanotecnologia está sendo um dos principais recursos para o

desenvolvimento e inovação na área cosmética. Os avanços no

desenvolvimento de produtos de base nanotecnológica têm trazido

expressivos benefícios aos cosméticos para aplicação em pele e cabelos.

Desde 1995 grandes empresas internacionais como a L’Oreal e Lancôme

têm utilizado micro e nanopartículas em cremes e filtros solares, obtendo

maior eficiência na estabilidade e nos efeitos dos compostos ativos

incorporados. A partir do ano 2000, foram identificadas patentes com a

utilização de nanopartículas em produtos para cabelo como xampus e

condicionadores.

A seda derivada do bicho-da-seda Bombyx mori é constituída

principalmente das proteínas sericina e fibroína. A sericina constitui cerca

de 25-30% da proteína da seda e envolve a fibra de fibroína com

sucessivas camadas adesivas que ajudam na formação dos casulos. A

sericina é constituída principalmente dos aminoácidos: serina (31%), ácido

aspártico (18%), glicina (19%) e treonina (8%), e representa a fração

protéica da seda solúvel em água. A sericina é considerada como “cola

hidrofílica”, devido à sua propriedade de adesão das fibras de fibroína.

Os peptídeos de sericina possuem aplicações importantes em toda a

faixa de massa Molecular. Peptídeos com massa Molecular maior que 20

kDa estão sendo investigados para utilização como materiais médicos,

biomateriais degradáveis, polímeros compostos, biomembranas

funcionais, hidrogéis e fibras funcionais. Já os de baixa massa Molecular

(< 20 kDa), ou hidrolisados, são utilizados em cosméticos, incluindo

produtos para cuidados da pele e dos cabelos, além de possuírem

propriedades antioxidante, anticoagulante, previnem o câncer de pele.

Adicionalmente, a sericina possui atividade de hidratação da pele

(possivelmente devido ao alto conteúdo de serina), ação anti-rugas, pode

ser aplicada como antioxidante em medicina, cosméticos, alimentos e

aditivos alimentares, possui atividade antibacteriana, é resistente à

2

radiação ultra-violeta e absorve e libera a umidade facilmente. Além

disso, possui alta afinidade por outras proteínas, sendo capaz de se ligar à

queratina da pele e dos cabelos, formando um filme resistente, hidratante

e protetor, conferindo boas propriedades de barreira.

As fibras capilares, estruturas derivadas da epiderme, possuem entre

50-100 µm de diâmetro e consistem da cutícula e córtex e, em alguns

casos, da medula na região central. Todas elas são compostas por células

mortas, preenchidas principalmente com a proteína queratina. Os

principais constituintes do cabelo são: proteína, lipídeo, água e melanina.

O condicionamento dos cabelos tem o efeito contrário ao de

limpeza e envolve a adição ou reposição de compostos capazes de

promoverem efeitos sensoriais como suavidade, maciez e facilidade de

pentear, além dos efeitos visuais de brilho e acomodação de fios rebeldes.

Para obtenção desses efeitos os condicionadores devem possuir caráter

iônico positivo, para prolongar a sua permanência nos fios de cabelo que

possuem caráter iônico negativo, como será visto na Seção 3.7.

As aplicações inovadoras da nanotecnologia no setor de cosméticos,

a crescente demanda para produtos eficazes para o cuidado dos cabelos

e as propriedades funcionais da sericina, motivaram o desenvolvimento

desta pesquisa que trata do desenvolvimento tecnológico de

nanopartículas de sericina para aplicações em produtos para tratamento

de cabelos.

Este trabalho envolveu tanto a concepção de nanopartículas

funcionais quanto do seu processo de produção, desde a extração da

sericina, produção das nanopartículas, e modificações eletrostáticas na

sua superfície.

Nesta dissertação, são apresentados os resultados obtidos relativos

aos processos de extração da sericina, produção das nanopartículas e

modificações de carga na sua superfície. A caracterização das

nanopartículas produzidas é apresentada em termos de diâmetro

hidrodinâmico e distribuição populacional, potencial zeta e morfologia.

3

A aplicação das nanopartículas em mechas de cabelos mostrou

grande potencial como produto para recuperação de cutículas danificadas,

com promoção do aumento do brilho e diminuição de volume.

4

2. OBJETIVOS

O principal objetivo deste trabalho foi a preparação de nanopartículas

para aplicação capilar.

O tema foi abordado através dos seguintes aspectos:

� Extração da sericina da seda, através de um método eficiente e

escalonável;

� Formação de nanopartículas por reticulação eletrostática;

� Avaliação dos métodos de secagem;

� Precipitação da nanopartículas para separação de eletrólitos;

� Recobrimento com tensoativos catiônicos

� Caracterização físico-química

� Ensaios de eficácia do produto

5

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. A SEDA

3.1.1. ORIGEM E DISSEMINAÇÃO DA SERICICULTURA

A seda é uma fibra natural secretada pelo inseto Bombyx mori,

conhecido como bicho-da-seda, com a finalidade de protegê-lo dentro do

casulo (Figura 1) durante a sua transformação em pupa e

subsequentemente em mariposa (Figura 2).

Ao contrário de outras espécies, o Bombyx mori não sobrevive por

muito tempo sozinho no ambiente. Portanto, a sua criação deve ser feita

em ambiente fechado, chocando os ovos colocados na estação

precedente e alimentando as lagartas com as folhas de amoreira. A

produção dos casulos (sericicultura) envolve tanto o cultivo das amoreiras

para prover a alimentação, quanto a criação dos bichos-da-seda

(Frederico, 1997).

(a) (b) (c)

Figura 1: (a) Lagartas construindo casulos (b) Casulo (c) Pupa no interior do

casulo (Brancalhão, 2005)

6

Figura 2: Metamorfose do inseto (Brancalhão, 2005)

A primeira evidência arqueológica da utilização da seda data de

algum momento entre 2850 e 2650 a.C., no norte da China, mas sabe-se

muito pouco sobre as primeiras fases da história da indústria da seda. A

partir do primeiro milênio a.C. a China começou a exportar produtos de

seda manufaturados. Esses artigos eram vendidos até a Grécia e Roma

através da famosa rota da seda.

A China manteve o monopólio deste negócio por muitos séculos, que

acabou entre 200-300 a.C., durante um período de tumulto político. Os

ovos de bicho-da-seda foram contrabandeados para a Coréia, Ásia central

e Índia. A próxima onda de expansão da seda começou alguns séculos

mais tarde, em 300-400 d.C. com o início da produção de seda no Japão.

Em 552-556 d.C. a sericicultura alcançou a costa do Mediterrâneo e a

posterior expansão da sericicultura para o oeste foi interrompida em

alguns países, principalmente pela baixa condição econômica.

Eventualmente, os muçulmanos levaram a sericicultura para a Espanha

(séc. IX) e para a Sicília (séc. XI). A partir daí iniciou-se uma marcha lenta

para o norte, ao longo da Península Itálica, chegando à França no início

do século XV, com a produção da seda em larga escala iniciando-se

alguns anos mais tarde. No fim do século dezessete, a produção de seda

Pupa

Lagarta

Mariposa

7

se propagou pela Ásia e por tudo sul da Europa, permanecendo assim

pelos três séculos seguintes. A quantidade de seda comercializada

cresceu vinte vezes de 1820 a 1920 e, de 1870 a 1929, o valor da seda

comercializada subiu nove vezes. Esse crescimento foi abruptamente

interrompido entre 1929 e 1950, em virtude da Grande Crise, da 2ª Guerra

Mundial e da invenção de inúmeros substitutos sintéticos. A sericicultura

desapareceu totalmente da Europa e do Oriente Médio, e a produção

japonesa caiu para dois terços. A China permaneceu como único

exportador de seda, e tem sido acompanhada, em tempos recentes, por

concorrentes como o Brasil, Tailândia e Coréia do Sul (Frederico, 1997).

3.1.2. COMPOSIÇÃO DA SEDA

A seda derivada do bicho-da-seda Bombyx mori é constituída

principalmente das proteínas sericina e fibroína. A sericina constitui cerca

de 25-30% da proteína da seda e envolve a fibra de fibroína com

sucessivas camadas adesivas que ajudam na formação dos casulos

(Zhang, 2002).

A fibroína constitui 70-80%, é o principal produto no processamento

da seda e é uma fibra natural valiosa, com brilho e agradável ao tato. Além

do uso como fibra têxtil, a fibroína tem sido recentemente estudada para

outras aplicações como material funcional para produtos alimentícios,

cosméticos e farmacêuticos. Trata-se de uma proteína fibrosa, altamente

insolúvel em água, com alta massa Molecular, da ordem de 25 a 350

kDa,e estrutura constituída por uma série de folhas beta antiparalelas,

intercaladas com segmentos peptídicos irregulares, como apresentada na

Figura 3. Mais de 90% dos aminoácidos são glicina (Gli), alanina (Ala) e

serina (Ser). A repetição Gli-Ala-Gli-Ala-Gli-Ser produz aumento da

natureza cristalina da fibra da seda (Miyaguchi, 2005; Cozzone, 2002;

Handbook of Fiber Chemistry, 1998).

8

Figura 3: Estrutura da fibroína constituída de folhas beta antiparalelas

(Lehninger, 2003)

A sericina é uma proteína globular, solúvel em água e possui uma

ampla faixa de massa molecular, variando de 10 a mais de 300 kDa

(Zhang et al, 2004). É constituída por 17 aminoácidos e dentre os

principais estão a serina (31%), a glicina (19,1%), o ácido aspártico

(17,8%), a e a treonina (8,0%). A Tabela 1 mostra a composição completa

de aminoácidos na sericina (Kato et al, 1997).

Ala Cadeia lateral Gli Cadeia lateral

9

Tabela 1: Composição de aminoácidos da sericina (Zhang et al, 2004)

Aminoácido %Mol

Serina 31,00

Glicina 19,1

Ácido aspártico 17,8

Treonina 8,0

Ácido glutâmico 4,4

Arginina 3,9

Alanina 3,8

Tirosina 3,3

Valina 3,1

Lisina 2,7

Histidina 1,0

Leucina 0,8

Isoleucina 0,4

Prolina 0,4

Fenilalanina 0,2

Cisteína <0,05

Metionina <0,05

A sericina ocorre principalmente em estrutura randômica enovelada e

amorfa e, em menor extensão, como uma estrutura organizada em folha

do tipo beta (Padamwar, 2005). Ela pode ser reticulada, copolimerizada ou

misturada com qualquer outro material macromolecular, principalmente

polímeros sintéticos, para produção de materiais com melhores

propriedades (Sarovart et al, 2003).

3.1.3. APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA DE FIAÇÃO

O processamento dos casulos para utilização na indústria de fiação

inicia-se com o processo de secagem dos casulos. A secagem tem por

objetivos: a) interromper o processo da metamorfose da crisálida,

induzindo a sua morte evitando assim a sua saída dos casulos, como

10

mariposa, o que provoca a perda do casulo pelo rompimento do fio, b)

eliminar a umidade excessiva dos casulos, que prejudica a fiação. Nessas

condições, o comprimento dos fios de seda nos casulos varia

normalmente de oitocentos a mil e quinhentos metros, com espessura de

2mm (Holanda et al 2004).

A produção de seda bruta requer que parte da sericina seja removida

dos casulos. A remoção é feita pelo processo de degomagem, utilizando-

se água quente (aproximadamente 600C), a fim de dissolver a sericina e

liberar os fios para a posterior fiação.

(http://www.bndes.gov.br/conhecimento/setorial/is11seda.pdf).

De acordo com Zhang (2002), estima-se que a produção anual de

casulos no mundo é cerca de um milhão de toneladas (massa fresca), o

que é equivalente à quatrocentos toneladas de casulos secos. O

processamento da seda bruta gera cerca de cinquenta toneladas de

sericina anualmente, cuja recuperação e aproveitamento poderia

representar uma economia significativa, um benefício social e ambiental

(Zhang, 2002 e Wu, 2006).

3.2. A SERICINA

3.2.1. EXTRAÇÃO E SEPARAÇÃO

A extração ou remoção da sericina dos casulos, também conhecida

como degomagem, é feita por via física ou química. No primeiro caso, os

processos são bem conhecidos e baseiam-se principalmente na

solubilidade dessa proteína em água.

Os métodos de degomagem que utilizam enzimas como agentes são

mais eficazes e envolvem economia em termos de água, energia,

produtos químicos, e do tratamento de efluentes. Entretanto, o alto custo

das enzimas tem limitado a sua aplicação industrial (Lamoolphak et al,

2008).

11

Há vários métodos físicos descritos na literatura para a remoção da

sericina, sendo os mais estudados: a extração em água através da

utilização de alta pressão e a extração com soluções aquosas alcalinas.

Os primeiros métodos de extração da sericina utilizavam água em

ebulição e foram realizados por Cramer em 1895 e por Bondi em 1902,

como descritos no trabalho de Kodama (1926). Cramer extraiu a sericina

em água fervente, promoveu a sua precipitação com ácido acético e em

seguida decompôs esse precipitado com sulfeto de hidrogênio, separando

a proteína com etanol. Bondi também estudou a extração com água em

ebulição e a recuperação da proteína foi realizada através de dois

métodos. Primeiro o extrato foi evaporado, o material obtido lavado com

água, dissolvido em uma solução alcalina e precipitado com etanol. No

segundo método a proteína foi precipitada com ácido acético e o

precipitado obtido foi tratado com álcool.

Modificando a metodologia de separação da sericina usada por

Bondi, Kodama (1926), após extrair a sericina de cerca de 100 g de

casulos em água em ebulição, estudou a precipitação da proteína em

solução pela adição ácido acético (até pH 3,8). O precipitado foi separado

por decantação, lavado com água e aquecido com 25% de álcool até que

esse ficasse incolor. Cerca de 27 g de pó foi obtido pelo tratamento desse

precipitado com álcool e éter.

Kodama (1926) estudou também a extração da sericina em água sob

pressão, a partir de 20 g de casulos e 500 mL de água destilada, à 100 e a

1050C, durante uma hora. Esse procedimento foi repetido três vezes e a

água renovada a cada extração. A recuperação da proteína foi realizada

através da adição de ácido acético (até pH 3,8) ou álcool. Foi

demonstrado que a extração à 1050C é mais efetiva do que a 1000C, onde

os rendimentos, em porcentagem de Nitrogênio no extrato, foram de

0,165% e 0,150%, respectivamente, somando-se as três extrações.

Quanto maior a temperatura utilizada na extração, menor foi a quantidade

de proteína precipitada pelo acetato e maior a concentração de álcool

12

necessária para a precipitação da proteína no extrato (Tabela 2).

Concluiu-se, portanto, que o aquecimento a altas temperaturas causa

alguma mudança na proteína ou na sua decomposição.

Tabela 2: Massa de proteína recuperada por precipitação com acetato e

com álcool, a partir de 100 mL extrato (com 52,8 mg de N) obtido a

diferentes temperaturas de extração (Kodana, 1926).

Nitrogênio (mg) – precipitação

com diferentes concentrações de

álcool Temperatura da

Autoclave (0C)

Nitrogênio (mg)

precipitação

com acetato 25% 40% 50% 75%

100 32,1 20,0 20,4 20,4 20,4

105 12,4 36,1 37,5 38,0 38,0

110 10,2 29,9 40,6 41,0 41,0

112 9,4 29,9 40,0 41,0 41,0

125 7,1 26,8 31,1 26,4 44,0

130 6,2 7,0 16,9 25,2 40,2

140 6,2 0,6 6,6 10,2 14,6

Kurioka et al (2004) compararam a extração em água sob pressão,

com a extração alcalina e ácida. A degomagem alcalina foi feita com

solução de carbonato de sódio 0,5% (m/v), a extração em água sob

pressão foi feita a 110, 115 e 1210C e a extração ácida foi feita com

solução aquosa de ácido cítrico 1,25% em ebulição. O rendimento da

sericina em pó obtido pela degomagem ácida foi comparável ao obtido

pela degomagem alcalina e em água quente. A média de perda de massa

dos casulos na extração ácida foi de 27,8% e nas extrações alcalina e em

água foi de 25,7% e 21%, respectivamente.

A extração da sericina dos casulos em água sob pressão também foi

estudada por Hong et al (2006). A solução obtida foi concentrada pela

13

vaporização da água a 400C, secada por spray-dryer e o pó resultante foi

solubilizado em água destilada (razão 1:10) e refrigerado à 40C. A

precipitação foi feita com diferentes proporções de etanol (-180C), e

centrifugada a 3500 rpm por 20 minutos. O material precipitado foi

reservado e o etanol residual evaporado a 400C e liofilizado. Para

obtenção do teor de nitrogênio solúvel, determinou-se o teor de nitrogênio

do pó obtido por atomização e, após a solubilização desse pó em água e

centrifugação, determinou-se também o teor de nitrogênio do

sobrenadante. Dessa maneira o rendimento em termos de nitrogênio

solúvel, que correspondem à sericina, foi 95%. O rendimento da

precipitação da sericina com etanol aumenta com o aumento da

concentração de etanol (Tabela 3).

Tabela 3: Rendimento das extrações pela precipitação da sericina com

etanol em diferentes concentrações (Hong et al, 2006)

Concentração de etanol (% v/v) Rendimento da extração (% m/m)

30 46,1

50 52,1

70 61,2

75 63,6

90 71,3

Lamoolphak et al (2008) baseados na baixa eficácia da extração com

água em ebulição, propuseram a extração da sericina utilizando água

subcrítica, ou seja, água pressurizada à temperaturas acima da

temperatura de ebulição da água mas abaixo da temperatura crítica, na

remoção da sericina da seda. Nesse trabalho foram analisados os efeitos

da temperatura (120-1600C), da razão entre seda:água (1:20, 1:50 e

1:100) e do tempo de reação (10-60 min) no rendimento dos produtos. Em

baixas temperaturas (120 e 1300C) foram obtidos produtos mais viscosos

14

daqueles obtidos em temperaturas maiores e observou-se também a

gelificação desses produtos após o resfriamento. A massa de resíduo não

alterou significativamente com o aumento da temperatura de 120 para

1600C, indicando que a maior parte da fibroína não foi hidrolisada nessa

temperatura. A solução de sericina obtida após 30 minutos de extração à

baixas temperaturas continha misturas complexas de polipeptídeos com

massas moleculares que variavam de 10 - 225 KDa. Com tempo de

reação menor (10 minutos) os produtos obtidos apresentaram massas

moleculares entre 100 - 225 KDa. Foi observado que mesmo após 10

minutos à 1200C, a sericina pôde ser completamente removida e portanto,

a quantidade de proteína na solução de sericina não é significativamente

afetada pela temperatura e tempo de reação estudados. Ainda nesse

trabalho foi demonstrado a influência da razão mássica entre seda:água

na taxa de decomposição da proteína. Para razões menores (1:100) a

taxa de decomposição da sericina em peptídeos e aminoácidos foi menor,

quando comparado a razões maiores (1:50 e 1:20). Segundo os autores,

isso pode ter acontecido pois, no último caso, a viscosidade da proteína

pode aumentar a resistência à transferência de massa, limitando a taxa de

reação.

Muitos outros trabalhos na literatura descrevem a remoção da

sericina por degomagem alcalina para o aproveitamento da fibroína nas

mais diversas áreas, sem, no entanto, preocuparem-se com o rendimento

do material solúvel removido.

Ellis (1932), em sua patente sobre tratamento de tecidos, descreve a

degomagem da seda utilizando-se soluções de sais alcalinos orgânicos e

inorgânicos (como silicatos, boratos, carbonatos) e banhos contento

sabões, em pH 10-10,5 e temperatura de 800C.

A extração básica descrita por Li et al (2002), utiliza solução aquosa

de carbonato de sódio 0,5% (m/v), a 950C por 1 hora, para a completa

remoção da sericina da seda, com o objetivo de estudar a formação de

15

géis de fibroína e álcool polivinílico com potencial para utilização como

substrato em cultura de células.

Yeo et al (2002), com o objetivo de preparar microesferas de fibroína,

isolaram a sericina pela extração com solução de Na2CO3 0,3% (m/v) e

sabão de Marselha 0,5%, a 1000C por 1 hora, duas vezes.

Li, K. H. (2003) em seu trabalho sobre a influência da sericina na

cristalização da fibroína para preparação de um filme formado por essas

proteínas, isolou a sericina através da extração alcalina com uma solução

aquosa (Na2CO3 0,5% e sabão de Marselha 0,3% (m/v)) em ebulição, por

1 hora.

Ki et al (2007) em seu trabalho sobre o efeito da sericina residual na

estrutura e na propriedade mecânica do filamento de seda extraíram a

sericina dos casulos, previamente secos, com água a e com misturas em

diferentes concentrações de sabão de Marselha e carbonato de sódio, a

1000 C, durante 1 h. A taxa de degomagem foi calculada através da

Equação 1 e o conteúdo de sericina residual foi calculada de acordo com

a Equação 2, onde d é a taxa de degomagem.

100)deg1(

)( 00 ×

−=

casulosdetotalmassa

omadoscasulosdemassaDegomagemdeTaxa

Equação 1

1001

266,011)(Re 0

0 ×

−−

−=d

SericinadesidualConteúdo Equação 2

Os resultados obtidos pelos autores mostram o aumento na taxa de

degomagem com o aumento da concentração de sabão e de carbonato de

sódio, como mostrado na Tabela 4.

16

Tabela 4: Taxa de degomagem e conteúdo de sericina da fibra de seda em

várias condições de degomagem (Ki et al, 2007).

Condição Água em

ebulição 1000C

Sabão 0,012%

Na2CO3 0,008%

(m/v)

Sabão 0,024%

Na2CO3 0,016%

(m/v)

Sabão 0,3%

Na2CO3 0,2%

(m/v)

Taxa de

degomagem (%) 9,5 13,1 18,8 26,6

Conteúdo de

sericina (%) 18,9 15,5 9,6 0

3.2.2. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

A sericina produzida pelo bicho da seda Bombyx mori é constituída

por frações com diferentes massas moleculares e a separação dessas

frações (Takasu et al, 2002), assim como as propriedades de gelificação e

solubilidade dessa proteína, são assuntos bastante estudados.

Os métodos tradicionais de extração (descritos no item 3.2.1) usam

soluções aquosas ácidas ou alcalinas, ou ainda, altas pressões, o que

resulta em redução da massa molecular causada por hidrólise. Quando a

sericina é dissolvida em um solvente polar, hidrolisada em soluções

ácidas, alcalinas ou degradada por proteases, o tamanho resultante das

suas moléculas depende de fatores como pH, temperatura e tempo de

processamento. Os peptídeos pequenos resultantes são solúveis em água

fria e podem ser recuperados nos estágios iniciais de produção da seda

bruta. Peptídeos maiores são solúveis em água quente e podem ser

obtidos nos estágios finais do processamento da seda (Zhang, 2002).

Na tentativa de identificar os vários tipos de sericina, e extrair essa

proteína íntegra, inibindo a redução de massa molecular causada pela

hidrólise, utilizou-se solução aquosa de tiocianato de lítio na preparação

de uma solução contendo sericina e fibroína. Para remoção do sal,

procedeu-se a diálise contra água e a solução resultante foi analisada por

eletroforese SDS-PAGE, mostrando bandas que iam de 20 a mais de 400

17

KDa. Dentre elas comprovou-se que duas são derivadas da fibroína (300 e

20 KDa), uma vez que após a degomagem dos casulos, e solubilização

em solução de tiocianato de zinco, confirmou-se a presença dessas duas

bandas. Dessa maneira, atribuiu-se as outras bandas à proteína sericina

(400, 250 e 150 KDa). Paralelamente, extraiu-se a sericina diretamente

da glândula sericígena do bicho-da-seda (Midlle Silk Gland), dividindo-a

em três partes distintas (anterior, média e posterior) e solubilizando-as em

água. Quando da eletroforese dessas soluções, verificou-se a presença de

três componentes principais que correspondiam àqueles observados

anteriormente. O maior peptídeo (400 KDa) foi encontrado na parte média

dessa glândula e portanto foi denominado sericina M. As duas bandas ao

redor de 250 KDa, foram encontradas na parte anterior da glândula

sericígena e por isso foram denominadas sericina A. A banda por volta de

150 KDa foi encontrada abundantemente na parte posterior da glândula e

foi denominada sericina P (Takasu et al, 2002).

Tsubouchi et al (2004) identificaram e quantificaram quatro frações

de sericina: A, B, C e D. A sericina A apresentou uma massa molecular

em torno de 400 kDa. A fração D possui aproximadamente 250 kDa, a

sericina B possui cerca de 200 kDa e a C apresenta massa molecular de

35 kDa, e correspondem a aproximadamente 45%, 34%, 15,5% e 5,3%,

respectivamente. Nesse trabalho os autores concluíram que quando a

seda passa pelo processo de degomagem as frações B e D, que são mais

fáceis de serem dissolvidas em água, são removidas nos primeiros

estágios.

Quando a degomagem é feita com aquecimento, quanto mais

distante da neutralidade estiver o pH, mais fácil será a remoção da

sericina.

A formação espontânea de géis após a extração ácida foi estuda por

Kurioka et al (2004), que comparou as extrações ácida e alcalina da

sericina. Esses géis foram estáveis por pelo menos 5-8 meses à 100C, e

puderam ser resolubilizados por aquecimento à 980C. Por outro lado, na

18

extração alcalina, a proteína não apresentou a capacidade de formação de

gel.

A solubilidade da sericina em água está relacionada à sua estrutura e

diminui quando as suas moléculas adquirem o estado cristalino

característico da estrutura de folhas beta (Kweon et al, 2000). A sericina

possui ainda propriedade de gelificação dependente da temperatura, a

qual se deve à mudança da sua estrutura de aleatória randômica para a

estrutura organizada de folha beta. Desse modo, a sericina dissolve-se

facilmente a 50-600C e gelifica-se reversivelmente com o abaixamento da

temperatura (Padamwar, 2005).

O ponto isoelétrico da sericina determinado por Kodama (1926) é

cerca de 3,9. Essa proteína pode ser considerada como uma “cola

hidrofílica” devido a sua propriedade de adesão das fibras de fibroína.

3.2.3. APLICAÇÕES

Os peptídeos de sericina de alta massa molecular (> 20 KDa) estão

sendo investigados para utilização como materiais médicos, biomateriais

degradáveis, polímeros compostos, biomembranas funcionais, hidrogéis e

fibras funcionais e tecidos. Já os de baixa massa molar (< 20 KDa), ou

hidrolisados, são utilizados em cosméticos, incluindo produtos para

cuidados da pele e dos cabelos (Zhang, 2002).

Kato et al (1998) demonstraram a primeira evidência da ação

antioxidante da sericina através do estudo da inibição da atividade da

tirosinase (polifenol oxidase), enzima responsável pelas reações de

escurecimento (Maillard) de vários alimentos e biossíntese da melanina,

sugerindo que este biomaterial é uma valiosa matéria-prima para a

indústria de alimentos e de cosméticos.

A supressão da incidência e do número de câncer de cólon através

da ingestão de sericina foi descrita no trabalho de Sasali et al (2000). Essa

proteína também mostrou forte efeito anti-tumoral em modelos de pele

19

animal, sugerindo sua aplicação como agente preventivo contra o câncer

de pele (Zhaorigetu et al, 2003).

Dentre outras propriedades, a sericina possui atividade de hidratação

da pele (possivelmente devido ao alto conteúdo de serina) e ação anti-

rugas (Kato et al, 1998), possui atividade antibacteriana, é resistente à

radiação ultra-violeta e absorve e libera a umidade facilmente (Zhang,

2002). Além disso, possui alta afinidade por outras proteínas, sendo capaz

de se ligar à queratina da pele e dos cabelos, formando um filme

resistente, hidratante e protetor, conferindo boas propriedades de barreira

(Tyrrell et al, 2003).

Zhang et al (2004) prepararam micropartículas de sericina da ordem

de 1-30 µm, as quais foram reticuladas quimicamente com a enzima L-

asparaginase e utilizadas para tratamento de leucemia linfoblástica.

Géis de sericina foram preparados usando pluronic PF-127 e

carbopol 934 P como estabilizantes, com a finalidade de investigar os

efeitos de hidratação dessa proteína, os quais foram demonstrados pela

diminuição da impedância e pelo aumento nos níveis de hidroxiprolina e

hidratação das células epidérmicas. Além disso, foi observada a

diminuição da perda de água transepidermal (TEWL), devido ao efeito

oclusivo, que previne a perda de água da camada superior da pele

Padamwar et al (2005).

Aramwit et al (2007) estudaram os efeitos da sericina na cicatrização

e diminuição do tamanho de feridas em ratos. Um creme contendo 8% de

sericina não mostrou nenhum efeito tóxico nos ratos, mostrando-se seguro

e biocompatível, sendo que as reações inflamatórias da pele, nas feridas

tratadas com sericina, mostraram-se menores do que aquelas tratadas

com o controle. A cicatrização das feridas tratadas com o creme contendo

sericina foi mais rápida do que a cicatrização das feridas tratadas com o

controle (11 vs. 15 dias).

O uso de sericina na formulação de um cosmético para as unhas foi

patenteado por Yamada et al (2007). Segundo os autores, a sericina na

20

concentração de 0.2 a 20%, é capaz de diminuir a secura das unhas,

tornando-as brilhantes e mantendo ou melhorando a sua saúde.

Fox et al (2006), descreveram os estudos realizados por Yao (2004),

que mostrou a relação entre a massa molecular de peptídeos de sericina e

os seus efeitos nos cuidados com os cabelos. Neste trabalho foram

estudadas influência da adsorção desses peptídeos na superfície e nas

propriedades mecânicas dos cabelos humanos. Os peptídeos que tiveram

maior afinidade ao cabelo humano, formaram um filme transparente na

superfície, protegendo-os dos danos causados por fatores externos,

conferindo brilho e elasticidade, e facilitando a penetração para a

reparação do cabelo danificado.

3.3. NANOPARTÍCULAS

O domínio da nanotecnologia está compreendido entre 1nm e 1cm.

Essa ciência tem evoluído muito nos últimos anos devido ao fato de os

materiais em escala nanométrica apresentarem novos comportamentos

e/ou propriedades diferentes daqueles que apresentam em escala

macroscópica.

Atualmente, a utilização de sistemas carreadores de bioativos para a

liberação em sítios específicos é área de intensa pesquisa. Esses

sistemas incluem os lipossomas e as nanopartículas (Schaffazick et al,

2003).

Lipossomas ou vesículas lipídicas são estruturas esféricas,

compostas por bicamadas fosfolipídicas, que encapsulam no seu interior

parte do solvente aquoso do meio no qual ele está disperso. Podem

apresentar uma ou várias lamelas concêntricas, variando o tamanho de

poucos nanômetros até algumas dezenas de micrômetros. A bicamada

pode acomodar em seu interior ativos lipofílicos (Lasic, 1993).

Porém, alguns problemas associados à essas vesículas tais como

baixa eficiência de encapsulação, rápida liberação de ativos hidrofílicos na

21

presença de elementos sanguíneos e baixa estabilidade durante a

estocagem, fazem das nanopartículas (NPs) uma alternativa interessante,

com algumas vantagens em relação aos lipossomas como aumento da

estabilidade dos bioativos e propriedades úteis de liberação controlada

(Soppimath et al, 2001).

Dentre os sistemas nanoparticulados, os mais recentes são as

nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) e os carreadores lipídicos

nanoestruturados (NLC) utilizados principalmente para a encapsulação de

ativos lipofílicos. As SLNs são derivadas das nanoemulsões O/A pela

substituição dos lipídeos líquidos (óleo) por lipídeos sólidos, sendo sólidos

à temperatura corpórea (370C) (Muller et al, 2007). As SLNs foram a

primeira geração de partículas lipídicas desenvolvidas, porém

apresentaram problemas de baixa eficiência de encapsulação devido à

matriz da partícula formar uma estrutura de cristal relativamente perfeita,

com espaço limitado para acomodar o ativo, o que pode levar à sua

expulsão durante o armazenamento. Em contraste, as NLCs, usam uma

mistura lipídica (lipídeos sólidos e líquidos à temperatura ambiente) com

moléculas estruturadas em diferentes tamanhos que distorcem a formação

de um cristal perfeito. Dessa maneira, a matriz da partícula possui muitas

imperfeições criando espaços para a acomodação do ativo na forma

molecular, promovendo o aumento da eficiência de encapsulação e a

liberação mais lenta do ativo da matriz (Muller et al, 2007).

Outros sistemas bastante estudados atualmente são as

nanopartículas poliméricas, que incluem as nanocápsulas e as

nanoesferas, diferenciadas de acordo com a organização estrutural e a

composição (Figura 04). As nanocápsulas possuem um invólucro de

polímero biodegradável e um núcleo oleoso, sendo que o ativo pode estar

dissolvido no núcleo oleoso ou adsorvido ao invólucro polimérico

(Schaffazick et al, 2003). Lambert et al (2000) desenvolveram

nanocápsulas lipofílicas com núcleo aquoso, utilizando

poliisobutilcianoacrilato.

22

As nanoesferas são sistemas poliméricos matriciais no qual o ativo

está uniformemente distribuído (Soppimath et al, 2001).

Figura 4 Representação esquemática das nanocápsulas e nanoesferas

poliméricas (Schaffazick et al, 2003).

Essas partículas podem ser preparadas através de uma variedade de

técnicas, algumas envolvendo a utilização de solventes e componentes

potencialmente tóxicos. Para relevar essas limitações de processo, têm

sido desenvolvidas nanopartículas hidrossolúveis, biodegradáveis, obtidas

a partir de polímeros e polieletrólitos. Essas NPs, denominadas dispersões

de complexos de polieletrólitos (PECs), resultam de interações

eletrostáticas fortes entre microdomínios carregados de pelo menos dois

polieletrólitos de cargas opostas (Hartig et al, 2007).

Entre os polímeros naturais utilizados na produção de nano e

microesferas estão a albumina, gelatina, colágeno, quitosana, entre outros

(Oliveira, 2005).

3.4. NANOPARTÍCULAS PARA APLICAÇÃO EM COSMÉTICOS

Nos últimos anos têm ocorrido avanços na área cosmetológica,

realizados pelas empresas de ponta do setor, sendo esta uma área em

franca expansão com fins dos mais lucrativos (Schmaltz et al, 2005).

A definição legítima de cosmético é um produto que melhora a

aparência, auxilia na higiene pessoal e não afeta a estrutura ou a função

da pele. Produtos cosméticos não possuem, portanto, fármacos ativos

(Jackson, 1999).

Parede Polimérica

Núcleo

Ativo Ativo

Matriz Polimérica

23

O departamento americano “Food and Drud Administration” (FDA)

define cosmético como (1) artigos destinados a serem esfregados,

vertidos, espalhados ou borrifados, ou aplicado de outra maneira no corpo

humano, com o objetivo de limpeza, embelezamento, promoção de

atratividade, ou alteração da aparência e (2) artigos destinados ao uso

como componentes de quaisquer desses artigos, exceto aqueles que não

incluam o termo sabão. O FDA não reconhece nenhuma categoria como

“cosmecêutico”. Um produto pode ser um fármaco, um cosmético ou a

combinação dos dois, mas o termo “cosmecêutico” não tem significado

sob a lei norte-americana (http://www.fda.gov).

A nanotecnologia está sendo um dos principais recursos para o

desenvolvimento e inovação na área cosmética. As empresas do ramo

destinam cada vez mais recursos para pesquisas nesta nova opção

tecnológica (Schmaltz et al, 2005).

Os lipossomas representam o sistema carreador de cosmético mais

inovador dos anos 80, introduzidos no mercado pela companhia Dior em

1986 (produto Capture). Apesar das características positivas, o maior

problema hoje é a sua estabilidade física limitada (Muller et al, 2007).

Em 1995, as nanocápsulas poliméricas foram introduzidas no

mercado cosmético pela L’Oreal. Subseqüentemente, vários artigos

científicos baseados na penetração cutânea e distribuição de fármacos e

cosméticos encapsulados em nanopartículas poliméricas foram publicados

(Guterres et al, 2007).

A Lancôme lançou há alguns anos um produto cosmético contendo

nanocápsulas de vitamina E (Primordiale). A proposta é de que a vitamina

se distribua largamente através das camadas externas da pele formando

um gradiente. A eficácia da vitamina E protegida, quando incorporada em

nanopartículas foi mostrada in vivo (Jansen et al, 2001). Dingler et al

(1999) mostraram que a incorporação de vitamina E em SLN é capaz de

estabilizar quimicamente esse ativo. As partículas ultrafinas formam um

24

filme adesivo fino na pele, levando a um efeito oclusivo e à hidratação, o

que promove a penetração da vitamina E na pele.

Zulli et al (2001) encapsularam Uvinil T 150 (filtro UV-B) em

nanopartículas lipídicas. Eles observaram uma afinidade quase cem vezes

maior do Uvinil T ao cabelo nas partículas carregadas positivamente

comparadas àquelas carregadas negativamente.

Shefer et al patentearam em 2002 um sistema de liberação

controlada para produtos de cuidados com os cabelos como xampus e

condicionadores, incluindo nanopartículas formadas por polímeros e

copolímeros hidrofóbicos, em combinação com agentes condicionantes

catiônicos para melhorar o sistema de deposição nos cabelos. As

nanopartículas, formadas por um núcleo sólido e uma superfície externa

catiônica, incluem ingredientes ativos e marcadores sensoriais. A

substantividade das nanopartículas foi avaliada através da análise de

amostras de cabelos tratadas com as nanopartículas por microscopia

eletrônica de varredura.

As NLCs foram desenvolvidas em 1999 e o primeiro produto

introduzido no mercado em 2005, pela companhia alemã Dr. Rimpler, foi o

NanoRepair Q10 Cream e NanoRepair Q10 Serum (Muller et al, 2007).

Nanopartículas de sericina de 200 a 400 nm foram obtidas por

autoagregação para aplicação cosmética, através da conjugação química

da proteína sericina com polietilenoglicol ativado em meio básico, à 40C,

durante 12 horas aproximadamente. Em seguida, essa solução foi

dialisada contra água por dois dias, e para a formação das nanopartículas,

o conjugado foi solubilizado em etanol e dialisado contra água novamente

por dois dias (Cho et al, 2003).

25

3.5. PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS DE PROTEÍNA ATRAVÉS DA FORMAÇÃO DE

COMPLEXOS DE POLIELETRÓLITOS (PECS)

As preparações de micro e nanopartículas para aplicações

farmacêutica e cosmética têm sido bastante estudadas. Dentre os vários

métodos utilizados para a preparação de micro/nanopartículas de proteínas

destaca-se a formação de complexos de polieletrólitos.

Uma mistura de dois biopolímeros terá o comportamento de fases

determinado por parâmetros físico-químicos como a estrutura dos

polímeros em solução (Schmitt et al, 1998). Essas misturas são geralmente

instáveis, com a separação em duas fases (Ye, A., 2008), onde as forças de

desestabilização são maiores do que as forças de estabilização, podendo

ocorrer a segregação de cada macromolécula em fases separadas,

conhecida por incompatibilidade termodinâmica (Schmitt et al, 1998). Uma

mistura diluída de biopolímeros (proteína e polissacarídeo) que não

interagem, pode ser co-solúvel, formando uma solução estável. Porém, se a

proteína e o polissacarídeo apresentam atração eletrostática, pela presença

de grupos com cargas opostas, ocorrerá a coacervação complexa ou

separação de fase associativa como ilustrado na Figura 5 (Ye, A., 2008).

26

Figura 5: Principais tendências nas interações entre proteínas e

polissacarídeos (Ye, A., 2008)

Portanto, a formação de complexos de polieletrólitos consiste na

mistura de soluções de poliânions e policátions permitindo a agregação

espontânea com a liberação de contra-íons (Dautzenberg, 2000). A força

molecular predominante na agregação dos polieletrólitos é a forte

interação eletrostática. Entretanto, ligações de hidrogênio, interações

hidrofóbicas e forças de van der Waals complementam a formação dos

PECs. A formação dos PECs é composta de duas etapas principais: (1) o

processo de difusão cinética do entrelaçamento mútuo entre polímeros,

que ocorre em um espaço de tempo relativamente curto e depende das

diferenças dos tamanhos molares e (2) o rearranjo termodinâmico dos

agregados simples já formados devido a mudança conformacional e

desentrelaçamento (Hartig et al, 2007).

Dois modelos estruturais de PECs são descritos na literatura,

baseados nas características dos grupos de poliíons, na estequiometria e

massa molecular (Figura 6): o modelo "ladder-like", onde a formação dos

complexos ocorre em nível molecular, através de adaptação

Insolúvel (Separação de Fases)

Incompatibilidade

Separação de Fases

Co-solubilidade

Sem Separaração de Fases

Solúvel

Complexos

Polissacarídeo Proteína

27

conformacional e o modelo “scrambled-egg”, onde um grande número de

cadeias são incorporadas no interior das partículas.

Figura 6: Representação esquemática da estruturas "ladder-like" e do

modelo "scrambled-egg”. Preto representa o maior poliíon (negativo) e

cinza representa o poliíon de carga oposta (positivo). (a) mostra a

representação "ladder-like" onde ocorre um pareamento insuficiente de

íons em certas condições estequiométricas permitindo a formação de

agregados insolúveis e PECs solúveis (b) mostra o modelo "scrambled-

egg”, onde polímeros de tamanhos semelhantes se complexam formando

PECs insolúveis sob certas condições (Hartig et al, 2007).

De acordo com Hartig et al (2007), três tipos de complexos de

polieletrólitos aquosos podem ser formados:

� PECs solúveis: sistemas macroscopicamente homogêneos, contendo

pequenos PECs agregados;

� Coloidais turvos: sistemas de PECs na transição para separação de

fases, exibindo um aparente espalhamento de luz;

� Sistema de duas fases, com um sobrenadante líquido e um precipitado

de PEC, que são isolados como um sólido após lavagem e secagem.

A Tabela 5 apresenta um resumo do comportamento das

macromoléculas em solução.

28

Tabela 5: Classificação visual das transições de fases de uma mistura de

biopolímeros (Prata, 2006).

Clara Turva Duas Fases Precipitado Interações fracas. Os polieletrólitos possuem baixa densidade de carga iônica

efetiva

Maior densidade de cargas. A

interação entre os polieletrólitos é mais forte, mas

não ocorre separação

macroscópica de fases.

Um ligeiro aumento na

densidade de cargas é capaz de

promover a separação

associativa das macromoléculas

O precipitado se forma devido ao grande número

de formas iônicas ligadas.

A formação dos PECs é governada pela força e localização dos

grupos iônicos, pela rigidez da cadeia polimérica, por precursores

químicos, pH, temperatura, intensidade de mistura e outros fatores

controláveis (Hartig et al, 2007).

A investigação teórica da formação de PECs é importante para o

desenvolvimento da teoria de separação de fases num sistema de

polieletrólitos contendo poliíons de cargas opostas. Esse fenômeno

estudado pela primeira vez por Bungenberg de Jong foi denominado

coacervação complexa (Borue et al, 1990).

Coacervação é a separação em duas fases líquidas num sistema

coloidal. A fase mais concentrada no componente coloidal é o coacervado

e a outra fase é a solução em equilíbrio. A separação de fase associativa

entre dois polímeros ocorre quando há atração eletrostática (Kruif et al,

2004).

O fenômeno de coacervação pode ser definido como simples ou

complexo, dependendo se o sistema contem um ou mais biopolímeros

(Burgess, 1994, in Schmitt et al, 1998). A presença de sal no sistema pode

não somente suprimir a coacervação, mas também aumentá-la (Borue et

al, 1990).

29

Atualmente, a coacervação complexa entre biopolímeros é utilizada

em produtos alimentícios, farmacêuticos, médicos e cosméticos (Schmitt

et al, 1998).

Ye et al (2006) preparam nanopartículas através da complexação

eletrostática entre caseinato de sódio e goma arábica. Os complexos

apresentaram-se estáveis e solúveis em uma faixa de pH de 5.4 a 3.0,

com proporção específica de caseinato de sódio e goma arábica,

dependente também da força iônica. As partículas formadas apresentam

diâmetro médio de cerca de 100-200 nm, obtido por espectroscopia de

correlação de fótons e morfologia esférica, obtida por Microscopia

Eletrônica de Transmissão. Postula-se neste trabalho que a estrutura das

nanopartículas compreende um núcleo protéico agregado, protegido de

sucessivas agregações através da repulsão estérica de uma ou mais

moléculas de goma arábica unidas eletrostaticamente.

A coacervação complexa entre fibroína da seda (SF) e ácido

hialurônico (HA) foi descrita por Malay et al (2006) como uma promessa

no desenvolvimento de novos biomateriais, com novas propriedades. A

formação do complexo, investigada pelo monitoramento da turbidez do

sistema sob lenta acidificação, se deu entre pH 2,5 a 3,5, onde o

complexo apresentou maior turbidez e menor viscosidade. A turbidez é

proporcional tanto à massa molecular quanto à concentração de partículas

no sistema. A complexação se dá entre os grupos amino protonadados da

SF e os grupos carboxila desprotonados do polissacarídeo (HA). O

complexo formado apresentou relação de cargas não estequiométrica,

com excesso de cargas negativas provenientes do HA, que favoreceu a

estabilização dos coacervados, inibindo interações entre eles.

30

3.6. ESTABILIDADE DAS NANOPARTÍCULAS

As suspensões coloidais homogêneas tendem a não separar porque

partículas submicrométricas sedimentam tão lentamente que esse efeito é

eliminado pelos movimentos de difusão e convecção. O movimento de

partículas em escala coloidal é conhecido como o movimento Browniano,

onde as partículas mudam de direção continuamente em conseqüência de

colisões aleatórias com as moléculas do meio no qual estão suspensas,

com outras partículas, e com as paredes do recipiente onde estão

armazenadas. Em conseqüência do movimento, essas partículas

difundem de uma região mais concentrada para uma região menos

concentrada, até que a concentração esteja uniforme. As forças

gravitacionais e o movimento Browniano opõem-se entre si e estão

relacionadas ao tamanho de partícula. As partículas submicrométricas

estão na faixa de tamanho onde o movimento browniano domina sobre as

forças gravitacionais, portanto elas tendem a permanecer suspensas .

Porém as nanopartículas podem ser desestabilizadas, por exemplo,

pela adsorção de moléculas ativas que promovem sua agregação ou, no

caso de suspensões carregadas, pela adsorção de contra-íons na dupla

camada elétrica, promovendo a coagulação das partículas. A estabilidade

química desses sistemas depende das condições de estocagem (da

temperatura e do pH do meio) e da composição exata da formulação

armazenada (da massa molecular do polímero usado na preparação, por

exemplo). Geralmente as nanopartículas apresentam uma pobre

estabilidade em longo prazo. Os principais obstáculos que limitam o uso

destas nanopartículas é a instabilidade física (agregação/fusão da

partícula) e/ou instabilidade química (hidrólise dos polímeros que dão

forma às nanopartículas) descritas acima, que são observadas

freqüentemente quando estas suspensões aquosas são armazenadas por

um tempo prolongado. Contudo, estabilidade física e química das

nanopartículas pode ser aumentada pela remoção da água desses

31

sistemas. Os processos mais comumente utilizados, que permitem

converter soluções ou suspensões em sólidos com boa estabilidade são a

liofilização e a secagem por atomização (Abdelwahed et al, 2006).

3.6.1. SECAGEM POR ATOMIZAÇÃO

O processo de secagem por atomização, ou “spray-drying” envolve

quatro etapas, como mostrado na Figura 7:

� atomização da solução de alimentação;

� contato das gotículas produzidas com o fluido de secagem

(normalmente ar);

� evaporação do solvente;

� recuperação do produto.

Figura 7: Etapas do processo de secagem por atomização

(http://irtec1.irtec.bo.cnr.it/proc-spray-drying.htm, 2008).

32

A secagem por atomização apresenta como vantagens a

simplicidade, reprodutibilidade, baixo custo e condições brandas de

operação. Além de ser um processo esterilizável e escalonável (Alves,

2003). Nesse processo o fluido é atomizado usando-se um atomizador do

tipo rotatório (rotatory) ou duplo fluído (nozzle) e as gotículas entram

imediatamente em contato com o fluxo de ar quente do meio. O tempo de

secagem das gotas é muito pequeno em comparação a outros processos

de secagem, permitindo o processamento de materiais extremamente

termosensíveis (Nath et al, 1998). O controle da umidade é feito através

da regulagem do fluxo de ar e da temperatura. Quanto maior a

temperatura de secagem e o conteúdo de sólidos, maior é a eficiência do

processo (Masters, 1972).

3.6.2. LIOFILIZAÇÃO

A liofilização é um processo relativamente lento e caro, aplicado

especialmente para produtos com alto valor agregado. Esse processo

pode ser dividido em três etapas: congelamento (solidificação), secagem

primária (sublimação do gelo) e secagem secundária (dessorção da água

não congelada). Na primeira etapa a suspensão líquida é congelada,

formando-se os cristais de gelo. A secagem primária envolve a sublimação

do gelo do produto congelado e, no final da sublimação um material

poroso é obtido, sendo que esses poros correspondem aos espaços

ocupados pelos cristais de gelo. A secagem secundária envolve a

remoção da água absorvida do produto, água esta que não congelou na

primeira etapa e, portanto, não foi sublimada. O liofilizador típico, como

mostrado na Figura 8, consiste em uma câmara de secagem contendo

prateleiras com temperatura controlada, que é conectada a uma câmara

de condensação. Essa, por sua vez, abriga uma série de placas ou

bobinas capazes de manter a temperatura muito baixa (menor que −500C).

Uma ou mais bombas de vácuo, em série, são conectadas a câmara de

33

condensação para que se consigam pressões na escala de 4 a 40 Pa, no

sistema inteiro, durante a operação (Abdelwahed et al, 2006).

Figura 8: Liofilizador de bancada (www.liobras.com.br/biofreezer_l202_page.htm)

3.7. O CABELO HUMANO

As fibras capilares, estruturas derivadas da epiderme, possuem entre

50-100 µm de diâmetro e são constituídas da cutícula e córtex e, em

alguns casos, da medula na região central, como se observa pela Figura

9. Todas elas são compostas por células mortas, preenchidas

principalmente com a proteína queratina (Weia et al, 2005). Os principais

constituintes do cabelo são: proteína, lipídeo, água e melanina. O córtex é

o maior em volume e contribui principalmente com as propriedades de cor

e mecânicas do cabelo. É constituído de células na forma de haste,

intimamente empacotadas, preenchidas com filamentos de queratina, que

são orientados paralelamente ao eixo longitudinal do cabelo (Harrison et

al, 2004).

34

(a) (b)

Figura 9: (a) Esquema da estrutura da fibra capilar (b) Seção transversal

da fibra capilar humana (Wei et al., 2005).

A queratina é caracterizada pelo alto teor de cisteína, um aminoácido

que tem a capacidade de reticular a proteína pelas suas ligações

dissulfeto intermoleculares, conferindo altas propriedades mecânicas

(Weia et al, 2005).

A cutícula consiste de seis a oito camadas de células achatadas e

sobrepostas e tem influência marcante na aparência dos cabelos. No

cabelo virgem a cutícula tem aparência lisa que permite a reflexão da luz,

reduz o atrito entre os fios do cabelo, sendo responsável pelo brilho e

textura dos cabelos. Os danos na cutícula podem ser causados pelo atrito

mecânico durante a escovação e/ou pela temperatura elevada do secador

(Harrison et al, 2004).

A medula, quando presente, geralmente corresponde a uma pequena

porcentagem da massa total do cabelo e acredita-se que tem uma

contribuição desprezível para as propriedades mecânicas da fibra capilar

(Weia et al, 2005).

A superfície dos cabelos possui característica aniônica devido à

presença dos grupos sulfonato e carboxila nas proteínas e nos lipídeos

Proteína alfa-hélice

Medula

Protofibrila

Córtex

Cutícula

Cutícula

Córtex

Camada A

Exocutícula

Endocutícula

Membrana Celular complexa

35

que constituem suas fibras. Quando os cabelos são expostos a radiação

ultravioleta ou descolorados com peróxido de hidrogênio, as pontes

dissulfeto presentes na cisteína são oxidadas a sulfonato. A concentração

dessas cargas negativas pode variar ao longo da superfície dos cabelos

em decorrência de tratamentos químicos ou exposição a fatores

ambientais como a radiação ultravioleta. Essa variação é um fator que

pode afetar a adsorção de compostos catiônicos na superfície dos cabelos

(Stranick, 1996).

Atualmente, há grande necessidade de se tratar dos cabelos

danificados ou enfraquecidos resultante de tratamentos químicos como

descoloração, tinturas e alisamentos. Assim, um dos grandes desafios da

indústria cosmética é inovar com produtos para condicionamento de

cabelos, que atuem fornecendo-lhe substantividade, com alta eficiência na

reparação das cutículas, resultando na melhoria dos efeitos sensoriais,

tais como brilho e maciez, além da redução do volume dos cabelos.

A nanotecnologia tem se destacado como alternativa para o

desenvolvimento e inovação na área cosmética, contando com

investimentos elevados em pesquisa e desenvolvimento por parte das

empresas do ramo (Schmaltz et al, 2005).

3.8. CONDICIONAMENTO DOS CABELOS

O condicionamento dos cabelos é o contrário da limpeza. Em

contraste com os xampus, que envolvem a remoção de materiais da

superfície do cabelo, o condicionamento é a ação de colocar de volta

quantidades devidas de ingredientes apropriados. Enquanto o xampu

depende da ação de materiais aniônicos, o condicionamento dos cabelos

requer o uso de materiais que sejam diferentes em aspectos como caráter

iônico, propriedades de superfície e características de solubilidade (Wong,

2003).

Uma exigência para um agente condicionante efetivo de cabelos é o

próprio grau de substantividade dado ao cabelo (Wong, 2003). O termo

36

“substantividade”, na indústria de cuidados com os cabelos, refere-se à

deposição de ingredientes ativos ou marcadores sensoriais no cabelo e a

retenção e percepção desses marcadores na superfície do cabelo tratado

(Shefer et al, 2002). Com o condicionamento dos cabelos, é esperada

uma sensação de suavidade, maciez e facilidade ao pentear (Wong,

2003).

Os agentes condicionantes efetivos de cabelos são em geral

catiônicos e muito menos solúveis em água. Os mais comumente

utilizados são compostos quaternários de amônio, polímeros catiônicos, e

óleos de silicone. A substantividade dos materiais catiônicos é devido à

forte interação entre as cargas positivas e a superfície do cabelo

carregada negativamente (Wong, 2003).

3.8.1. AGENTES CONDICIONANTES DOS CABELOS

3.8.1.1. GOMA GUAR QUATERNIZADA (JAGUARC13 ®)

As gomas guar quaternizadas são derivados catiônicos da goma

galactomanana (guar) e a massa molar desses derivados estão

normalmente em torno de 50 a 2500 KDa (Dias, 2003).

A goma guar utilizada na preparação desses derivados é obtida

naturalmente de uma planta chamada Guar (Cyamopsis tetragonoloba (L.)

Taub (http://www.lsbu.ac.uk/water/hygua.html).

A goma guar é um hidrocolóide natural acumulado no endosperma

das sementes da planta guar. A estrutura macromolecular da guar está

entre um colóide esférico (como a amilopectina) e um hidrocolóide linear

(como a celulose). A espinha dorsal é formada por unidades de manose

unidas por ligações glicosídicas beta 1,4, onde cada segunda unidade é

ramificada com uma galactose unida por ligação alfa 1,6 (Figura 10).

Como a maioria dos polissacarídeos, a goma guar possui dois ou três

grupos hidroxila livres na unidade de manose da cadeia principal ou nas

cadeias laterais de galactose (Ray et al, 2005).

37

Figura 10: Estrutura Química da Goma Guar

A goma guar quaternizada (Jaguar C 13S®) é um derivados catiônico

da goma guar comercializado pela empresa Rhodia (Dias et al, 2003). Sua

estrutura molecular é representada na Figura 11.

Figura 11: Goma Guar Quaternizada - JaguarC13 ®

A goma guar quaternizada é um polímero de alta massa molar, que

fornece excelentes propriedades condicionantes para produtos de

cuidados da pele e dos cabelos. Usado em xampus, cremes rinse, loções,

cremes e outros produtos de cuidado pessoal (www.Rhodia.com, 2007).

Catiônica / Guar Quaternizada

38

3.8.1.2. CLORETO DE CETILTRIMETIL AMÔNIO E CLORETO DE BEHENYLTRIMETIL

AMÔNIO

O cloreto de cetiltrimetil amônio (CTAC) e o cloreto de beheniltrimetil

amônio (BTAC) são sais de amônio quaternário e possuem pelo menos

um átomo de nitrogênio, com quatro grupos alquilas ou arilas ligados á

eles. O CTAC apresenta um grupo alquila com 16 carbonos e no BTAC o

grupo alquila é constituído por 22 carbonos. Sua estrutura molecular está

apresentada na Figura 12 (Tismaneanu, 2001).

Figura 12: Estrutura molecular do CTAC (R=C16) e BTAC (R=C22)

(Barbosa et al, 2006)

Esses compostos são sempre catiônicos independentemente do pH

do meio e, por essa razão, são em geral incompatíveis com tensoativos

aniônicos (Wong, 2003).

Os grupos alquilas longos promovem uma melhora da deposição nos

cabelos, levando a benefícios condicionantes como melhora da suavidade

em cabelos secos, comparados à tensoativos catiônicos com grupos

alquilas menores. Acredita-se também que esses compostos possam

reduzir a irritação, comparados aos tensoativos com grupos alquila

menores (Midha et al, 2006). Tratam-se de matérias-primas essenciais,

que são adsorvidas na superfície dos cabelos, aumentando a flexibilidade

das fibras e reduzindo a fricção entre elas (Akatsuka et al, 2006).

O CTAC é o principal monoalquil quaternário e, pelo seu custo

benefício, é largamente aplicado à formulações de produtos

condicionantes para os cabelos.

39

Portanto, as propriedades dos diferentes derivados de amônio

quaternário estão relacionadas à densidade catiônica e ao número e

tamanho das cadeias alquílicas presentes na molécula. Quanto mais

cadeias estiverem presentes e quanto maiores elas forem, maior o poder

de lubrificação (Correa, 2006).

3.8.1.3. POLIQUATERNIUM 07

Polímeros catiônicos são bastante utilizados na formulação de

xampus. Estes compostos conduzem à modificações na superfície que

variam da formação de uma película de proteção nas fibras do cabelo à

ação sinérgica que melhora o desempenho de outros produtos para a

melhoria de aspectos como maciez e a facilidade de penteado. O

Poliquaternium 07 é um copolímero catiônico, constituído de acrilamida e

cloreto de dialildimetil amônia. Sua fórmula molecular é apresentada na

Figura 13 (Monteiro et al, 2003).

Figura 13: Estrutura molecular do Poliquaternium 07® (Monteiro et al,

2003)

O Poliquaternium 7® É utilizado como agente anti-estático, formador

de filme e fixador de cabelo em uma variedade de cosméticos, e

considerado seguro para o uso em formulações cosméticas (Andersen,

1996).

40

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. MATERIAIS

A sericina foi extraída de fios de seda e de casulos de bicho-da-seda,

(Bratac AS -Bastos, SP), utilizando-se água deionizada ou solução aquosa

de carbonato de sódio p.a. (Merck). A Goma Guar Quaternizada – Jaguar

C 13S® – (Rhodia Brasil) foi usada na complexação da sericina para a

formação das nanopartículas, cuja superfície foi recoberta com o cloreto

de cetiltrimetil amônio (Capuani), cloreto de beheniltrimetil amônio (KCI

Limited) e cloridrato de arginina (Ajinomoto). O Poliquaternium 7 (Galaxy

Surfactants) foi usado como agente de viscosidade. O fenoxietanol e o

sorbato de potássio foram os conservantes antimicrobianos utilizados.

4.2. MÉTODOS

4.2.1. EXTRAÇÃO DA SERICINA

A extração da sericina dos fios de seda e dos casulos de bicho-da-

seda foi estudada por 02 métodos: (i) extração à pressão atmosférica (ii)

extração em autoclave.

As extrações em autoclave, descritas na Seção 4.2.1.2, utilizaram

fios de seda ou casulos, e água deionizada como solvente. Os fios foram

usados íntegros (como recebidos do fornecedor) e os casulos foram

usados tanto íntegros quanto picados em tamanhos da ordem de 1cm2.

As extrações à pressão atmosférica foram feitas em banho

termostático sem agitação, em tanque com agitação mecânica e em

colunas de recheio, utilizando como solventes solução aquosa de

carbonato de sódio ou água deionizada.

As extrações em tanque agitado, com água ou solução de carbonato

de sódio 0,5% (m/v) são descritas na Seção 4.2.1.3.2.

41

A extração da sericina dos casulos em coluna foi feita tanto em

escala laboratorial quanto em escala piloto, como descrito nas Seções

4.2.1.3.3 e 4.2.1.3.3.1, respectivamente.

Para a determinação do teor de proteína nas soluções de sericina

extraídas foi usada a metodologia de Bradford, descrita na Seção 4.2.8.2.

Trata-se de uma técnica simples, rápida e barata; porém, é uma medida

comparativa em relação à proteína BSA. Portanto, para se obter a

concentração real (CR) de proteína extraída, fez-se uma curva de

calibração da dosagem de proteína obtida por Bradford (em diferentes

concentrações) versus a massa de proteína obtida pelo processo de

liofilização dessas soluções, nas mesmas concentrações, onde houve

perda somente de água.

A metodologia de Kjedahl descrita na Seção 4.2.8.3 também foi

utilizada, em alguns casos, para determinação do teor de nitrogênio e,

através da multiplicação pelo fator de conversão para proteína, obteve-se

a concentração real (CR) de proteína.

O Rendimento (% de proteína extraída) foi calculado a partir da

concentração real de proteína (CR) obtida, multiplicada pela massa

solução de sericina ao final de cada extração, em relação à massa inicial

de matéria-prima (MP) usada para as extrações, como é mostrado na

Equação 3.

××=Ο

Ο

MPMassa

SSfinalMassaCRExtraídaoteína

100Pr

Equação 3

A Tabela 6 resume os métodos de extração, solventes e pré-

tratamento das matérias-primas utilizadas neste trabalho.

42

Tabela 6: Métodos, Solventes e Matéria Prima (MP) para Extração da

Sericina.

Sol-

vente Matéria-prima Método Seção

Fios

Casulos picados e íntegros

Autoclave 4.2.1.2

Ág

ua

Fios Tanque agitado 4.2.1.3.2

Fios Banho

termostático 4.2.1.3.1

Casulos íntegros Tanque agitado 4.2.1.3.2

Casulos

picados Tanque agitado 4.2.1.3.2

Casulos picados e secos Coluna escala

lab. 4.2.1.3.3

Casulos picados e intumescidos Coluna escala

lab. 4.2.1.3.3

Casulos picados e secos Coluna-escala

piloto 4.2.1.3.3.1

Na

2CO

3

Casulos íntegros e secos Coluna-escala

piloto 4.2.1.3.3.1

4.2.1.1. MATÉRIA-PRIMA

As matérias-primas utilizadas para extração da sericina, os fios de

seda e os casulos de bicho-da-seda, tiveram o teor de proteína total

determinado pela metodologia de Kjedahl.

43

Inicialmente a sericina foi extraída dos fios de seda doados pela

empresa Bratac SA. Porém, sabe-se que para a produção dos fios de

seda, os casulos são antes submetidos ao processo de degomagem, ou

seja, a remoção de parte da sericina para facilitar a fiação da seda.

Portanto os fios possuem, teoricamente, menor teor de sericina do que os

casulos e, além disso, o fio trata-se de um produto com maior custo, uma

vez que já passou por um processamento. Por essa razão, foi estudada

também a extração da sericina a partir dos casulos.

Os fios de seda utilizados nas extrações não passaram por nenhum

processamento prévio.

Os casulos foram utilizados tanto íntegros quanto pré-processados.

Os pré-processamentos empregados foram: (i) picagem, feita

manualmente com tesoura, obtendo-se pedaços de aproximadamente

1cm2 e (ii) intumescimento, onde os casulos permaneceram 05 minutos

em contato com a solução extratora de Na2CO3, antes do recheio da

coluna, sendo essa solução posteriormente utilizada no processo de

extração.

4.2.1.2. EXTRAÇÃO EM AUTOCLAVE

A extração da sericina em autoclave foi realizada partindo-se de 12,5

g de casulos íntegros ou fios de seda em 300 mL de água, e de 22,5 g de

casulos picados e 400 mL de água. Devido à perda de água durante o

processo, tanto por evaporação quanto pela absorção da solução pelas

MPs, a massa final de solução obtida foi pesada após cada extração para

o cálculo do rendimento. Após a extração, a solução de sericina foi filtrada

para a remoção do material insolúvel. As condições experimentais de

tempo e temperatura empregadas estão expostas na Tabela 7.

44

Tabela 7: Condições experimentais utilizadas na extração em autoclave.

Matéria-prima Tempo (h) Temperatura (0C)

Fios 1,0 120

Casulos Íntegros 1,0 120

1,0 120

1,4 124 Casulos picados

1,5 126

4.2.1.3. EXTRAÇÕES SOB PRESSÃO ATMOSFÉRICA

A extração da sericina sob pressão atmosférica foi feita em tanque

agitado, em banho termostático sem agitação e em coluna de recheio. O

processo de extração em coluna foi escalonado para a preparação de

lotes piloto.

4.2.1.3.1. EXTRAÇÃO EM BANHO TERMOSTÁTICO

A extração em banho termostático, sem agitação, foi realizada

partindo-se de 25,00 g de fios de seda imersos em 300 mL de solução

aquosa de carbonato de sódio 0,5% (m/v), por 30 minutos. Esse

procedimento foi realizado três vezes, trocando-se a solução extratora. Ao

final, os fios foram lavados com 300 mL de água. As soluções

provenientes das 03 extrações foram misturadas à água de lavagem. Esse

procedimento foi feito à 350C e a 85-900C.

Após as extrações, as soluções foram filtradas para a remoção da

fibroína em seguida foi feita a dosagem de proteína total por Bradford

(4.2.8.2) e o cálculo do rendimento das extrações baseado na massa de

sericina extraída.

Uma parte da sericina extraída à 850C foi armazenada durante um

mês em pH básico (10,4) (a 80C), outra parte teve o pH ajustado para

45

neutralidade logo após a extração, sendo então submetidas às análises de

massa molecular por Eletroforese SDS-PAGE (4.2.8.1), a fim de verificar

se a estocagem em pH básico influenciaria no tamanho dos peptídeos

extraídos.

4.2.1.3.2. EXTRAÇÃO EM TANQUE AGITADO

A extração em tanque agitado foi feita em água e em solução aquosa

de carbonato de sódio.

Na extração com água deionizada, 12,5 g de fios de seda foram

imersos em 300 g do solvente, a 950C, sob agitação mecânica (100rpm),

durante 3 horas. O teor de proteínas na solução extraída foi analisado pela

metodologia de Bradford para o cálculo da porcentagem de proteína

extraída.

Para a extração com solução aquosa de carbonato de sódio, 25 g de

fios foram submetidos a 3 extrações (com temperatura entre 80-900C),

trocando-se a solução extratora a cada 30 minutos, com o objetivo de

verificar o tempo suficiente para remoção da maior parte da proteína. A

concentração de proteínas foi obtida através da dosagem de Nitrogênio

total pela Metodologia de Kjedahl.

A sericina foi também extraída a partir de 12,5 g de e casulos

íntegros e picados em 200 g solução aquosa de carbonato de sódio 0,5%

(m/v), sob agitação mecânica a100 rpm.

4.2.1.3.3. EXTRAÇÃO EM COLUNA DE RECHEIO

A extração em coluna foi realizada com o objetivo de obter soluções

mais concentradas e facilitar o escalonamento do processo.

Uma coluna de vidro encamisada, de dimensões 22 x 5 cm (altura x

diâmetro), foi recheada com 25 g de casulos secos e picados. Por essa

46

coluna, alimentada pela base do leito e com vazão de 5 L/h, foram

recirculados 700 mL de solução aquosa de Na2CO3 0,5% (m/v), a 900C.

A extração em coluna também foi realizada com os casulos

previamente intumescidos. Recheou-se uma coluna com 45 g de casulos

picados, que haviam sido previamente imersos em 400 mL solução de

Na2CO3 à 900C, durante 5 minutos. A mesma solução foi passada através

da coluna, com auxílio de uma bomba peristáltica, na vazão 5 L/h.

Durante as extrações foi determinado o teor de proteína por Bradford

periodicamente, por até 2 horas.

4.2.1.3.3.1. ESCALONAMENTO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO EM COLUNA DE

RECHEIO

Para o aumento de escala do processo de extração foi feito um

projeto piloto com capacidade para produção de 10 L de solução de

sericina. A Figura 14 é uma representação esquemática do sistema

utilizado.

As colunas 1 e 2 possuem capacidade de 5 L cada uma e dimensões

25 x 15 cm (altura x diâmetro), ambas com base e topo cônicos de 10 cm

de altura. O misturador apresenta dimensões 31,5 x 28,5 cm (altura x

diâmetro), com capacidade para 20 L.

As extrações foram feitas com os casulos secos (picados e íntegros),

com solução aquosa de carbonato de sódio 0,5% (m/v) entre 85-900C.

47

Figura 14: Representação esquemática do sistema utilizado para extração

da sericina.

Aqui se tornou difícil o processo de intumescimento prévio dos

casulos, uma vez que teriam que ser imersos na solução extratora antes

do recheio da coluna, requerendo a utilização de outro tanque, além de

um sistema para realizar a transferência. Dessa forma, o recheio das

colunas foi feito com os casulos secos, que foram realimentados nas

colunas durante o processo de extração. Abaixo há uma breve descrição,

em tópicos, de um processo de extração realizado na planta piloto:

� Doze litros de solução extratora de carbonato de sódio foram

aquecidos entre 85-900C e foram reservados 1,1 Kg de casulos.

� Cada coluna foi completamente recheada com uma parte (aprox.

1/8) dos casulos secos. A solução extratora foi bombeada através da

coluna 1 durante 30 minutos e em seguida essa solução foi esgotada

no misturador.

Bomba

48

� A solução extratora foi bombeada através da coluna 2 por mais 30

minutos e esgotada no misturador.

� Esse procedimento foi repetido quatro vezes sendo que, após cada

ciclo de 30 minutos, a coluna era realimentada com casulos secos.

Isso porque os casulos acabam se compactando pelo efeito da

passagem da solução extratora, criando um “volume morto” nas

colunas, o qual era preenchido com mais casulos secos, até que

todos os 1,1 Kg fossem carregados.

O teor de Nitrogênio total das soluções extraídas foi determinado

pela Metodologia de Kjedahl e o rendimento das extrações calculado

através da porcentagem de proteína extraída em função da massa inicial de

casulos. A Tabela 8 resume as condições utilizadas nesses estudos.

Tabela 8: Condições experimentais utilizadas nas extrações realizadas em

planta piloto.

Casulos (g) Picados Íntegros Vazão (L/min)

X 6,2

X 16,4

1100

X 6,2

4.2.2. PRODUÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA

As nanopartículas de sericina (NS) foram produzidas na própria

solução de sericina obtida na extração. A goma guar quaternizada ou

Jaguar C13 S®, cuja estrutura está representada na Figura 15b, foi

utilizado como agente de complexação (MM=1,8x106 kDa). A formação

das partículas ocorreu em pH 5,5 e, onde a goma e a proteína sericina

possuem cargas opostas, o que foi confirmado pela medida do Potencial

zeta de cada um deles. O aminoácido ácido aspártico é o que mais

contribui para a carga aniônica da sercina (Figura 15a).

49

(a)

(b)

Figura 15: Estrutura molecular (a) ácido aspártico (b) Goma Guar Quaternizada

(Material Técnico Phytophora, revendora Rhodia).

Para a preparação das nanopartículas, utilizou-se solução de sericina

na concentração de 1 mg/mL e diferentes quantidades de solução de

goma guar quaternizada 1% (m/v), como apresentado na Tabela 9. O

processo foi feito sob agitação mecânica, a 1000 rpm, durante 30 minutos,

à temperatura ambiente.

Catiônica / Guar Quaternizada

50

Tabela 9: Concentrações de goma guar quaternizada utilizadas na

produção das nanopartículas.

Concentração (% m/v)

0,002 0,03 0,05

0,004 0,035 0,1

0,02 0,04 0,14

A escolha da concentração adequada de goma a ser utilizada foi

baseada no diâmetro hidrodinâmico das partículas formadas, analisado

por Espectroscopia de Correlação de Fótons (PCS), descrita na Seção

4.2.9.1. A relação mássica entre os polieletrólitos (sericina e goma guar

quaternizada) foi calculada através da razão molar de cargas, apresentada

na Equação 4.

A razão molar de cargas é o parâmetro de controle do tamanho e

reprodutibilidade da produção das nanopartículas, sendo também o fator

de escalonamento para a sua produção em maior escala.

( )

××

×=

+

+

−

−

+−1200

18,0

)(

)(

)(

)(

/DSM

MW

MW

MR

JG

JG

P

P

Equação 4

onde,

R-/+: Razão de cargas;

M(P-):Massa proteína (g);

M(JG+): Massa de goma guar quaternizada (g);

MW(P-):Massa molecular média da proteína;

MW(JG+): Massa molar média da goma guar quaternizada

51

DS: Grau de derivação substituição catiônica = 0,1

0,18 = fração molar de ácido aspárticos presente na sericina

1200: número de monômeros presente na molécula do polímero catiônico

A reticulação da sericina também foi feita com a Goma Guar

quaternizada em pó, utilizando-se as mesmas concentrações de polímero

presentes na solução, para comparação com os diâmetros obtidos no

procedimento anterior.

4.2.2.1. RETICULAÇÃO NA PRESENÇA DE CONSERVANTES.

A reticulação da solução de sericina (SS) com goma guar

quaternizada foi realizada antes e após a adição dos conservantes sorbato

de potássio (0,4% m/m) e fenoxietanol (0,7% m/m), a fim de verificar a

influência deles na formação das partículas, as quais foram analisadas

através da medida do diâmetro hidrodinâmico por PCS (4.2.9.1).

4.2.2.2. SECAGEM DAS NANOPARTÍCULAS

As nanopartículas de sericina (NS), com concentrações de goma

iguais a 0,03; 0,035 e 0,04% (m/v), obtidas em solução, foram secas por

atomização, e por liofilização.

A secagem por atomização foi feita em equipamento Labmaq,

modelo LM MSD 1.0, com bico atomizador do tipo duplo fluido com

diâmetro de 1mm, utilizando-se vazão de 15mL/min para a alimentação da

solução de sericina, sendo as temperaturas na entrada e na saída do

spray-dryer 1100C e 580C, respectivamente.

A secagem por liofilização foi realizada em equipamento marca

LIOBRAS, modelo L101. As suspensões contendo as nanopartículas

foram previamente congeladas com nitrogênio líquido e liofilizadas por 24

horas.

52

Os pós obtidos em ambos os processos foram analisados através de

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e em seguida foram

ressuspensos em água (cerca de 40 mg pó/10 mL de água), sob agitação

mecânica de 1000 rpm, por 30 minutos, para análise do diâmetro

hidrodinâmico das partículas por PCS .

4.2.3. PRECIPITAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA COM ETANOL

Com o objetivo de separar as NS do excesso de eletrólitos,

presentes no meio, em decorrência das etapas de extração e ajuste de

pH, foi feita a precipitação das NS em solução com etanol 96%.

Diferentes proporções entre suspensão de nanopartículas:etanol

foram estudadas para se chegar a um melhor rendimento (1:1,5; 1:2; 1:3)

A precipitação foi feita em temperatura entre 5-100C durante 1 hora.

Após esse tempo as amostras foram centrifugadas a 3200 rpm por 20

minutos, secas no ambiente e ressuspensas em água na concentração

requerida.

4.2.4. FORMAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE SERICINA RECOBERTAS (NR)

Como visto na Seção 3.7, os cabelos possuem superfície carregada

negativamente e, como isso, os materiais condicionantes, os quais

geralmente possuem cargas positivas foram utilizados para recobrir as

nanopartículas de sericina.

Portanto, a fim de tornar as partículas de sericina com valores

positivos de potencial zeta, após a reticulação com goma guar, promeveu-

se o recobrimento com materiais catiônicos como cloridrato de arginina e

com os tensoativos catiônicos CTAC e BTAC, em diversas concentrações.

53

4.2.4.1. RECOBRIMENTO COM CLORIDRATO DE ARGININA

Após a reticulação da proteína com a goma guar quaternizada em

solução, foi adicionado o cloridrato de arginina nas seguintes

concentrações: 0,1%; 0,25%; 0,5%; 1,0%; 2,5%; 5,0% e 10% (m/v), á

temperatura ambiente e sob agitação magnética, durante 10 minutos. Em

seguida foi feita a medida do potencial zeta (4.2.9.2)

4.2.4.2. RECOBRIMENTO COM BTAC E CTAC

O recobrimento das NS com os tensoativos BTAC e CTAC, foi feito

na presença e na ausência do excesso de eletrólitos, ou seja, nas

partículas que precipitadas com etanol e ressuspensas e nas partículas

que não passaram por essa etapa.

O BTAC e o CTAC foram adicionados em solução, em banho de gelo

a 70C sob agitação magnética durante 10 minutos. As concentrações

utilizadas desses materiais estão apresentadas nas Tabelas 10, 11 e 12.

Essas amostras foram analisadas quanto ao Potencial Zeta e ao

diâmetro hidrodinâmico, nas Seções 4.2.9.2 e 4.2.9.1, respectivamente.

Tabela 10: Concentrações de BTAC e CTAC usados separadamente no

recobrimento das NS, com remoção do sal.

CTAC (%) BTAC (%)

0,25 -

1 -

2 -

- 1

- 2

54

Tabela 11: Concentrações das formulações (2,7% de proteína) preparadas

com misturas de CTAC e BTAC, com remoção do sal.

BTAC (%) CTAC(%)

0,2 0,8

0,5 0,5

0,8 0,2

0,4 1,6

1,0 1,0

1,6 0,4

Tabela 12: Concentrações das formulações preparadas com misturas de

CTAC e BTAC, sem remoção do excesso e eletrólitos.

Proteína (%) BTAC (%) CTAC(%)

2,4 0,2 0,8

2,4 0,2 1,5

2,4 0,2 2,5

2,13 0,4 1,6

2,13 0,4 3,0

2,13 0,4 5,0

1,19 0,6 2,4

1,19 0,6 4,5

1,19 0,6 7,5

4.2.5. ADIÇÃO DE AGENTE DE VISCOSIDADE ÀS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA

RECOBERTAS

Às nanopartículas de sericina recobertas (NR), foi adicionado 25% de

poliquaternium 07, usado como agente de viscosidade, com o objetivo de

fornecer maior estabilidade à preparação.

55

4.2.6. CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA SERICINA OBTIDAS NAS EXTRAÇÕES

As soluções de sericina (SS), obtidas pelos diferentes métodos de

extração, foram caracterizadas quanto ao teor de proteína pela

metodologia de Bradford ou pela metodologia de Kjedahl. A massa

molecular dos peptídeos formados, em alguns casos, foi determinado por

eletroforese SDS-PAGE. As sub-Seções a seguir descrevem as

metodologias e os fundamentos dessas técnicas.

Essas soluções também foram caracterizadas quanto diâmetro

hidrodinâmico dos agregados protéicos presentes em solução, antes da

reticulação da proteína. A técnica utilizada nesse caso foi a

Espectroscopia de Correlação de Fótons (PCS), descrita na Seção

4.2.9.1.

4.2.6.1. DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR DA SERICINA EM SOLUÇÃO

Foi determinada a massa molecular das soluções de sericina obtidas

da extração dos fios: (i) com carbonato de sódio em banho termostático à

900C; (ii) a 350C, ambas armazenadas em pH básico durante 30 dias; (iii)

com água a 1200C (iv) com carbonato de sódio a 900C, e pH ajustado para

a neutralidade logo após a extração.

As placas para eletroforese foram preparadas com géis de acrilamida

nas concentrações 7,5 e 10%. As amostras foram diluídas com tampão

de desnaturação até concentração entre 0,1-1,0mg;/mL, e em seguida

foram adicionadas duas gotas de glicerol. A mistura foi agitada e aquecida

por 5-7 minutos à 1000C. Os marcadores foram preparados da mesma

forma.

As placas foram preenchidas com os géis de separação e de

concentração. Colocou-se o tampão de corrida nas cubas e injetou-se 5-

12mL de amostra em cada poço. A corrida eletroforética foi realizada sob

56

tensão de 180 V, durante aproximadamente 60 minutos e a revelação dos

géis foi feita através de coloração com nitrato de prata/ditiltrietol.

A eletroforese é um método relacionado com a migração de

partículas carregadas em um determinado meio, sob a influência de uma

diferença de potencial. Nos dias atuais, a eletroforese de proteínas e

peptídeos é muito desenvolvida em meios gelatinosos como gel de

poliacrilamida e gel de agarose (Junior, 2001). A eletroforese permite a

determinação de propriedades cruciais de uma proteína como seu ponto

isoelétrico e massa molecular aproximada.

Na eletroforese, a força que move a macromolécula é o potencial

elétrico (E). A mobilidade eletroforética da molécula (µ) é a relação entre a

velocidade da partícula (V) e o potencial elétrico. A mobilidade

eletroforética é também, igual à carga líquida da molécula (Z) dividida pelo

coeficiente de fricção (f). Assim:

µ = V/E = Z/f

A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis feitos de

polímeros entrecruzados de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida

funciona como uma peneira molecular, reduzindo a velocidade de

migração das proteínas em proporção aproximada à massa molecular.

O SDS (dodecilsulfato de sódio) é um detergente que se liga à

maioria das proteínas, adicionando grande quantidade de carga negativa e

tornando insignificantes as cargas intrínsecas da proteína. A conformação

nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioria

adquire a mesma forma geométrica, tornando-se muito semelhantes entre

si e, por essa razão, passam a ter a mesma relação entre a carga elétrica

e a massa. Assim, a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas

quase exclusivamente pela massa molecular, com os peptídeos menores

migrando mais rapidamente. Depois de realizada a eletroforese as

proteínas são visualizadas pela adição de um corante, como o Coomassie

Blue (Lehninger, 2003).

57

4.2.6.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA NA SS PELA METODOLOGIA DE

BRADFORD

A determinação do teor de proteína por essa metodologia envolveu

inicialmente a preparação do Reagente de Bardford e da curva de

calibração para o microensaio foi feita com a proteína BSA (Bovine Serum

Albumin).

As amostras de sericina extraídas da seda foram adequadamente

diluídas (concentração máxima 0,1 mg/mL) e em seguida cerca de 1000

µL do reagente de Bradfoord foram adicionados a 100 µL dessa amostra.

Após homogeneização, aguardou-se aproximadamente 10 minutos e foi

feita a leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 595 nm.

As concentrações foram determinados através da curva de calibração da

proteína BSA e os resultados expressos em mg/mL, em relação à proteína

BSA. Todas as amostras foram analisadas em triplicata.

Esse método trata-se uma técnica espectrofotométrica para a

determinação de proteínas totais que utiliza o corante de “Coomassie

brilliant blue” BG-250. A ligação do corante com a proteína causa uma

mudança na absorção máxima do corante de 365 para 595 nm. Baseia-se

na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que

contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de

reação, a interação entre a proteína de alta massa molecular e o corante

BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma

aniônica, que absorve fortemente em 595 nm.

A falta de linearidade na lei de Beer-Lambert tem sido observada

devido a uma variação do pH quando da adição da amostra ao reagente

BG-250. Existem poucas substâncias, citadas na literatura, que são

interferentes no método de Bradford. Estes interferentes normalmente

reagem com as proteínas impedindo a reação com o corante BG-250 ou

reagem com o corante causando aumento na absorbância. (Zaia, 1998)

58

4.2.6.3. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO TOTAL NA SS PELA METODOLOGIA DE

KJEDAHL

Para determinação do teor de nitrogênio pela metodologia de Kjedahl

utilizou-se Unidade de Digestão K-424 na fase de digestão, Scrubber B-

414: para captação os gases liberados no processo de digestão e Unidade

de destilação B-324 na fase de destilação, todos da marca BUCHÜ

A cada tubo digestor foram adicionados 0,5 g de amostra, 10 g de

mistura catalítica (sulfato de potássio e sulfato de cobre) e 20 mL de ácido

sulfúrico concentrado. O tubo foi então colocado na Unidade Digestora à

4500C, por cerca de 1 hora, até a solução tornar-se clara. Durante a

digestão os vapores de ácido sulfúrico são neutralizados na unidade

Scrubber. Após resfriamento à temperatura ambiente, conectou-se o tubo

digestor com a amostra na Unidade de Destilação.

Em um erlenmeyer de 500 mL adicionou-se 30 mL de solução

receptora de N (ácido bórico + azul de metileno + vermelho de metila),

onde foi mergulhada a extremidade afilada do condensador.

Procedeu-se então o programa de destilação: o equipamento

adicionou 60 ml de solução aquosa de ácido bórico 20% (m/v) no

erlenmeyer contendo a solução receptora, em seguida adicionou 60 mL de

água destilada e 80 mL de solução aquosa de NaOH 32% (m/m), no tubo

digestor contendo a amostra. O equipamento realizou um pré-

aquecimento do sistema e iniciou a destilação, conforme programação.

Retirou-se o erlenmeyer da unidade de destilação e titulou-se a

amostra com solução de ácido sulfúrico 0,1 N, até ocorrer mudança da

coloração de verde para rosa.

Os cálculos para se encontrar o teor de nitrogênio e proteína foram

feitos através das equações 05 e 06, respectivamente:

( )m

fcVnitrogêniomm

14,0/%

××=

Equação 5

59

( )m

FfcVproteínamm

×××=

14,0/%

Equação 6

Onde:

V= Volume da solução de ácido sulfúrico 0,1 N gasta na Titulação

fc = fator de correção da solução de ácido sulfúrico 0,1 N

F= Fator de conversão de Nitrogênio para proteína, (para a sericina = 6,5)

m= massa da amostra (g).

Na presença de H2SO4 e dos catalisadores (K2SO4 e CuSO4), os

nitrogênios de aminas presentes na maioria sos materiais orgânicos são

convertidos em sulfato de amônia [(NH4)2SO4]. Amônia livre e amônica

ligada ao nitrogênio são também convertidas a (NH4)2SO4 . A amônia é

destilada a partir de um meio alcalino, fixada em solução de ácido bórico e

titulada com ácido sulfúrico 0,1N.

4.2.7. CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS

4.2.7.1. DIÂMETRO HIDRODINÃMICO

O diâmetro hidrodinâmico das NS e das NR foi caracterizado por

espectroscopia de correlação de fótons (PCS), utilizando laser de alta

potência. O sinal foi analisado através do espalhamento de luz, quasi

elastic light scattering. O equipamento (Autosizer 4700 – Malvern) foi

regulado para um ângulo de 900C em relação ao feixe de luz incidente

(laser He-Ne) e as amostras foram diluídas em água para reduzir a

turbidez e a viscosidade das dispersões.

As partículas em suspensão estão em movimento constante devido

às colisões entre as moléculas do meio. Quanto menor a partícula, mais

rapidamente ela se movimenta, fenômeno esse denominado movimento

60

Browniano. A taxa de flutuação da intensidade de luz espalhada varia de

acordo com a velocidade de difusão, e o diâmetro médio é determinado

através da equação de Stoke-Einstein (Equação7).

R

TD

πηκ6

=

Equação 7

Onde:

κ = constante de Boltzmann

T= temperatura absoluta

R = raio das nanopartículas

η = viscosidade da solução dispersante

A primeira distribuição gerada pela análise de dados, e portanto a

mais exata, é a distribuição de intensidade de luz espalhada pelas

partículas. A partir da distribuição de intensidade são geradas as

distribuições em volume e número de partículas. A distribuição de

intensidade, volume e número são proporcionais ao diâmetro elevado à

sexta, terceira e primeira potência, respectivamente.

(http://www.malvern.co.uk/home/index.htm)

Portanto, torna-se necessário considerar as distribuições em volume

ou número sempre associadas à distribuição por intensidade, para análise

mais completa dos resultados.

61

4.2.7.2. POTENCIAL ZETA

Neste trabalho todas as medidas de potencial zeta foram feitas em

equipamento Zetasizer ® Nano (Malvern). As amostras foram previamente

diluídas em água e injetadas nas cubetas com o auxílio de uma seringa. O

equipamento realiza 10 medidas de cada amostra, os resultados são

fornecidos em miliVolts (mV).

Como regra geral, dispersões com potencial zeta maior que 30 mV

(em valor absoluto) são fisicamente estáveis, maior do que 60 mV

mostram excelente estabilidade, e abaixo de 5 mV elas apresentam

pronunciada agregação. Esses limites não são rígidos, e consideram

regiões otimizadas.

O Potencial zeta é uma medida eletrocinética que envolve efeitos de

movimento e fenômeno elétrico na dupla camada (Stern e difusa) (Figura

16). Estas camadas são formadas pela presença de contra-íons ao redor

da superfície coloidal para neutralizar suas cargas. A camada Stern é a

mais próxima e a primeira a envolver o colóide, tendo como principal

característica uma grande rigidez, pois é formada apenas pelos contra-

íons. A camada difusa também é formada por contra-íons que estão em

equilíbrio dinâmico, no qual tentam se aproximar do colóide, sofrendo

repulsão pela presença da camada Stern. Esta variação de contra-íons

que ocorre entre a superfície do colóide e o seio do líquido promove a

formação de um potencial elétrico, que é denominado potencial de

superfície. Assim, se um campo elétrico é aplicado, o fenômeno de

eletroforese ocorre, pois a partícula coloidal irá movimentar-se, com

mobilidade que depende do potencial elétrico criado entre a camada que

envolve a partícula e o seio do líquido, além da viscosidade, da constante

dielétrica do meio e da intensidade do campo elétrico.

Neste contexto, o potencial zeta é a medida de um fenômeno de

superfície, definido como potencial elétrico no ponto que separa a camada

Stern e difusa e é dependente também da mobilidade eletroforética.

62

Figura 16:Identificação das camadas carregadas em torno de uma

partícula (Malvern Instruments))

4.2.7.3. MORFOLOGIA DAS NANOPARTÍCULAS EM SOLUÇÃO

A morfologia das nanopartículas de sericina, recobertas com os

catiônicos foi analisada através de microscopia eletrônica de transmissão.

Foi adotada a metodologia proposta por NEW (1990), na qual telas de

cobre de 200 mesh foram utilizadas como suporte para a amostra

recoberta com carbono com filme de parlódio com acetato de celulose.

Uma gota da suspensão de partículas (diluída em água 20 vezes) foi

aplicada sobre a tela e incubada à temperatura ambiente. Após cinco

minutos foi retirado o excesso da amostra com uma ponta de papel de

filtro. Uma gota de solução aquosa de acetato de uranila 1% (m/v) foi,

então, adicionada mantendo-se a incubação por mais 1 minuto à

temperatura ambiente, sendo também o excesso eliminado e a tela seca

ao ar. As estruturas foram visualizadas em microscópio Carl Zeiss, CEM

902, equipado com filtro de energia Castaing-Henry-Ottensmeyer, e as

imagens foram captadas através de câmera CCD (Proscan).

63

4.2.7.4. MORFOLOGIA DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINNA SECAS

As NS secas por atomização e por liofilização foram caracterizadas

quanto à morfologia através de microscopia eletrônica de varredura. O

equipamento utilizado foi da marca Leica, modelo LEO 440i. As amostras

de partículas secas foram fixadas em um porta-amostra através de fita

adesiva dupla-face, recobertas com ouro (sob vácuo) e posteriormente

analisadas e fotografadas.

4.2.8. AVALIAÇÃO DO EFEITO DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA RECOBERTAS

EM MECHAS DE CABELOS.

As nanopartículas de sericina, recobertas com os tensoativos

catiônicos CTAC e BTAC, e suspensas em Poliquaternium 7, foram

aplicadas à mechas de cabelos para avaliação dos seus efeitos no

tratamento cosmético dos cabelos. Todas as mechas foram previamente

lavadas com solução aquosa de lauril éter sulfato de sódio 10% e secas.

Os resultados foram analisados quanto à diminuição de volume e aumento

de brilho dos cabelos, além da avaliação da recuperação das cutículas

dos fios feitas por imagens obtidas por MEV.

4.2.8.1. ANÁLISE DE BRILHO EM MECHAS DE CABELOS

O efeito de brilho em mechas de cabelos caucasianos virgens e

tratados quimicamente por descoloração foi avaliado utilizando-se

equipamento Glossmeter Novo Gloss®. As formulações estudadas nesse

ensaio foram (i) NR dispersas em água em três diferentes concentrações

(1%, 3% e 5%) e (ii) placebo solubilizado em água, nas mesmas três

concentrações. O placebo era composto pelos mesmos componentes da

formulação das NR, com exceção da proteína sericina. Mechas tratadas

somente com água foram utilizadas como controle.

Cada mecha foi imersa nas formulações estudadas, de forma

separada, por 2 minutos. Em seguida elas foram penteadas, secas com ar

64

frio e foram feitas dez medidas de brilho em cada uma. O efeito de brilho

do cabelo foi analisado em termos de porcentagem de aumento de brilho,

comparando-se os valores médios de brilho obtidos das mechas controle

com os valores obtidos das mechas tratadas com as NR e com o placebo.

A técnica de medida do brilho baseia-se no princípio de medida da

intensidade da luz refletida. O cabelo é totalmente esticado e preso à um

suporte onde é iluminado sob uma luz incidente oblíqua (sob ângulo de

850). A luz refletida é registrada de acordo com o ângulo de observação e,

quanto maior a reflexão, maior o brilho. A luz refletida é medida por um

detector e os valores são expressos em unidades de brilho (GU- 0,1 a

1000).

Os resultados foram avaliados através de análise estatística

utilizando-se o teste Tukey-kramer de comparação múltipla, para

verificação do grau de significância do aumento de brilho.

4.2.8.2. ANÁLISE DE VOLUME DAS MECHAS

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da aplicação das NR

na redução de volume em mechas de cabelo afro-americano tratados

quimicamente (descoloração), comparando-os aos cabelos tratados com

placebo e aos cabelos tratados apenas com água (controle). As

formulações avaliadas nesse ensaio foram as mesmas utilizadas na

Seção 4.2.10.2.

Mechas de cabelo afro-americano, danificadas por descoloração,

foram imersas em cada amostra a ser avaliado durante 2 minutos. Em

seguida as mechas foram penteadas e suspensas em um suporte de

modo a ficarem posicionadas verticalmente para a remoção do excesso de

água, secas com ar frio e fotografadas. A abertura das mechas foi medida

com ao auxílio do software Image Tool.

Os resultados foram avaliados quanto à diminuição de volume das

mechas (em centímetros), e foi feita uma análise estatística utilizando-se o

65

teste Tukey-kramer de comparação múltipla, para verificação do grau de

significância da diminuição de volume das mechas.

4.2.8.3. GERAÇÃO DE IMAGENS POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Após molhadas com água fria, as mechas de cabelos danificados

foram massageadas com o sistema contendo as NR, e secas foram à

temperatura ambiente.

Mechas de cabelos caucasianos virgens e danificadas quimicamente

(após processo de descoloração) foram utilizadas como controle na

geração das imagens. A ação na fibra capilar foi avaliada através da

captação de imagens por SEM, utilizando-se equipamento 6469LV – Jeol

66

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. EXTRAÇÃO DA SERICINA

A caracterização das matérias-primas utilizadas para extração da

sericina foi feita através da determinação do teor de Nitrogênio total pela

metodologia de Kjedahl (Seção 5.1.1).

Os rendimentos das extrações da sericina, realizadas com os

casulos de bicho-da-seda e com os fios de seda são apresentados nas

sessões 5.1.2 e 5.1.3.

5.1.1. MATÉRIA-PRIMA

O teor de nitrogênio total (sericina + fibroína) nos casulos, dosado

pela metodologia de Kjedahl foi de 15,26% (m/m) e o teor de proteínas,

usando-se como fator 6,5, foi de 99,19% (m/m), já os fios de seda

apresentaram teor de nitrogênio igual à 15,66% (m/m), e 101,8% (m/m) de

proteína.

A diferença entre o teor de nitrogênio nos casulos e nos fios de seda

não é significativa (2,5%). A concentração de proteína total nos fios tende

a ser maior pois esse já sofreu o processo de degomagem que,

juntamente com a sericina, pode ter removido impurezas.

Lembrando que aqui foi determinado o teor total de proteínas, não

sendo possível determinar separadamente sericina sem fazer sua

extração da fibroína.

5.1. 2. EXTRAÇÃO EM AUTOCLAVE

As soluções de sericina obtidas da extração com água, em

autoclave, foram comparadas quanto ao teor de proteína e ao rendimento.

Os resultados apresentados na Tabela 13 mostram que não houve

diferença significativa (6,5%) nos rendimentos da extração realizada com

os casulos íntegros ou com os fios mostrando que o processo de

degomagem realizado antes da fiação da seda deve ter removido uma

67

fração muito pequena de sericina. Portanto, optou-se pela utilização dos

casulos, por ser a matéria-prima de menor custo.

Ainda na Tabela 13, comparando-se agora os rendimentos das

extrações realizadas com os casulos picados e inteiros, a 1200C, vê-se

que não houve diferença significativa (menor que 5%) na porcentagem de

proteína extraída em relação à massa inicial de matéria-prima. A solução

obtida da extração com casulos picados apresentou-se mais concentrada

pois, nesse caso, a relação matéria-prima:solução extratora foi maior.

As soluções extraídas a 1200C gelificaram após 6-8 horas à

temperatura ambiente pela mudança na estrutura da proteína de “random

coil” para folha beta conforme descrito Padamwar et al (2004). A presença

desta nova configuração foi confirmada pelo maior tamanho das partículas

medidas por PCS. A forma de gel dificulta a formação das nanopartículas.

Como estratégia para aumentar o rendimento e diminuir a

gelificação da solução de sericina, foram utilizadas temperaturas maiores

para a extração.

Os resultados apresentados na Tabela 13, mostram que à 124 e

1260C ocorreu aumento significativo nos rendimentos, 33 e 24%

respectivamente, em relação às extrações a 1200C. Entretanto, o

rendimento a 1260C foi cerca de 10% menor, oposto ao esperado. Esse

resultado pode ser devido a própria quantificação pelo método de

Bradford, já que a extração a 1260C tende a produzir peptídeos de menor

massa molecular. Observou-se que a extração em temperaturas mais

elevadas retardou a formação de gel, reduzindo também a viscosidade da

solução final.

68


extração com os fios e com os casulos, na extração em autoclave.

DP: Desvio Padrão de n=3

(i) :Utilizado o método de Bradford para quantificação de proteína.

A extração com água em pressões maiores do que a atmosférica é

promissora para obtenção de solução de sericina livre de eletrólitos, o que

facilitaria o posterior recobrimento das nanopartículas para obtenção da

carga positiva. No entanto, a gelificação apresenta-se como limitação

desse processo, sendo necessário a utilização de maiores pressões para

a quebra das estruturas ou a combinação de pressão, temperatura e baixa

concentração de carbonato de sódio. Por questões de segurança em

laboratório e de dificuldades na transferência de escala desses processos,

os estudos da extração em autoclave não foram continuados.

5.1.3. EXTRAÇÃO SOB PRESSÃO ATMOSFÉRICA

A extração da sericina com solução de carbonato de sódio foi a mais

explorada neste trabalho. Neste item são apresentados os resultados

quanto ao teor de proteína nas soluções de sericina obtidas das

extrações: (i) dos fios de seda em banho termostático, (ii) dos fios e dos

casulos em tanque agitado (iii) dos casulos em coluna de recheio.

Matéria

Prima

Tempo de

extração

(h)

Temp. (0C)

Proteína (i)

(mg/mL

± DP)

Conc. Real

(mg/mL

±DP)

Proteína

extraída

(%±DP)

Casulos

íntegros 1,0 120 0,82 ±0,035 8,82 ±0,38 15,17 ±0,65

Fios 1,0 120 0,78 ±0,028 8,39 ±0,30 14,43 ±0,52

1,0 120 1,15 ±0,047 12,36 ±0,51 15,84 ±0,65

1,0 124 1,57 ±0,04 16,88 ±0,43 23,48 ±0,60 Casulos

picados 1,5 126 1.38±0,054 14,84 ±0,58 20,78 ±0,81

69

5.1.3.1. EXTRAÇÃO EM BANHO TERMOSTÁTICO

A extração da sericina dos fios de seda com solução de carbonato de

sódio em banho termostático, apresentou teor de proteína conforme

mostrado na Tabela 14.


extração com os fios.

Temperatura (0C)

Proteína (i) (mg/ml ± DP)

Conc. Real (mg/mL ± DP)

Proteína extraída (%± DP)

35 0,037 ±0,0032 0,40 ±0,032 1,59 ±0,13

90 0,98 ±0,057 10,54 ±10,62 33,72 ±1,6

DP: Desvio Padrão de n=3 (i) – Utilizado o método de Bradford para quantificação de proteína.

A extração à 900C apresentou rendimento muito superior (maior que

95%), comparando à extração feita à 350C, indicando que a utilização de

altas temperaturas é essencial para a extração da proteína.

A porcentagem de proteína extraída à 900C foi bastante alta, o que

pode estar relacionado com a troca da solução extratora durante o

processo. Porém, a solução foi obtida bastante diluída, já que grande

volume de solução extratora foi utilizado. Portanto, esse método implicaria

em maior custo, além da necessidade de posterior concentração da

solução.

5.1.3.2. EXTRAÇÃO EM TANQUE AGITADO

A extração da sericina dos fios com água (900C), durante 03 horas

sob agitação mecânica, apresentou concentração muito baixa de proteína

(0,014 mg/mL), com 1,79 % de proteína extraída, o que confirma a

necessidade de temperatura e pressão maiores ou utilização de sais para

uma extração mais eficiente.

70

Já a extração da proteína dos fios de seda realizada com solução de

carbonato de sódio, obteve 22% de proteína extraída já nos primeiros 30

minutos. Os principais resultados obtidos são mostrados na Tabela 15.

Tabela 15: Concentração de nitrogênio total e proteína nas soluções

obtidas por extração com solução aquosa de Na2CO3 em tanque agitado,

à 80-900C.

Extração de 30

minutos

Teor de

nitrogênio total

(% ± DP)

Conc. Real

(mg/mL)

Proteína

extraída (%)

1ª 0,31±0,00 20,15 22,41

2ª 0,05±0,00 3,25 4,31

3ª 0,03±0,00 1,95 2,41


Analisando os resultados, conclui-se que em 30 minutos foi extraída

a maior parte da sericina. Portanto, as outras duas extrações

subsequentes não produziriam aumento substancial no rendimento

encontrado. A soma das porcentagens de proteína extraída nos três casos

corresponde a 29,13 %, valor próximo do teórico esperado da quantidade

de sericina (25-30%).

Os rendimentos das extrações realizadas a partir dos casulos

(íntegros e picados) em solução de carbonato de sódio são mostrados na

Tabela 16. Comparando-se a porcentagem de proteína extraída em 30

minutos, dos fios (22,41%) e dos casulos (24,86 e 27,64) conclui-se que,

nesse tempo de processo, a porcentagem de proteína extraída dos

casulos picados e íntegros foi cerca de 19% e 10% maior do que a

extraída dos fios, respectivamente.

Contudo, como discutido na Seção 5.1, optou-se por extrair a

sericina a partir dos casulos de bicho-da-seda, por ser um material com

menor custo.

71

Tabela 16: Concentração de proteína na solução de sericina obtida da

extração dos casulos (picados e íntegros), com solução aquosa de

Na2CO3 em tanque agitado, à 80-900C.

Matéria-prima Proteína (i)

(mg/ml ±DP)

Conc. Real

(mg/mL ± DP)

Proteína

extraída

(% ± DP)

Casulos íntegros 1,7 ±0.20 18.28 ±2.15 24.86 ±2.93

Casulos picados 1,89 ±0.08 20.32 ±0.88 27.64 ±1.20


(i): Utilizado o método de Bradford para quantificação de proteína.

A extração com casulos picados (1cm2) e íntegros, apresentou

praticamente o mesmo rendimento, considerando o desvio padrão.

Porém, os casulos de bicho da seda são extremamente leves,

flutuam em água ou na solução de carbonato à temperatura ambiente,

sendo dificilmente imersos totalmente na solução extratora, além de

enroscarem facilmente no impelidor, quando utilizada agitação mecânica,

tornando difícil a remoção da fibroína depois de terminada a extração da

sericina. Para contornar essas dificuldades e obter soluções de sericina

mais concentradas, realizou-se a extração dos casulos em coluna de

recheio.

5.1.3.3. EXTRAÇÃO EM COLUNA DE RECHEIO

As extrações em coluna, em escala laboratorial, foram realizadas

com os casulos picados para facilitar o recheio das colunas, uma vez que

o seu diâmetro interno (5cm) dificultava a alimentação dos casulos

íntegros.

Na primeira extração, onde as colunas foram recheadas com os

casulos secos, houve grande compactação do leito à medida que os

casulos foram se intumescendo, como mostra a Figura 17. O rendimento

da extração foi cerca de 20%, porém as soluções obtidas estavam pouco

72

concentradas (aprox. 14 mg/mL) como mostrado na Tabela 17. Para a

obtenção de soluções mais concentradas seria necessário adicionar mais

casulos à coluna a medida que esses vão intumescendo e compactando.

Para cálculo do rendimento foram sempre consideradas as perdas

por evaporação durante o processo, uma vez que o sistema não era

totalmente vedado.

Figura 17: Extração em coluna recheada com casulos secos

Tabela 17: Concentração de proteínas em diferentes tempos da extração,

utilizando casulos secos e picados, à 80-900C.

Tempo de

extração (h)

Proteína (i)

(mg/mL ±DP)

Conc. Real

(mg/mL ± DP)

Proteína

extraída

(%± DP)

0,5 1,39 ±0,11 14,95 ±1,15 19,91 ±1,53

1,0 1,35 ±0,03 14,52 ±0,27 19,54 ±0,36

1,5 1,36 ±0,02 14,62 ±0,22 19,48 ±0,29

2,0 1,38 ±0,05 14,84 ±0,55 19,77 ±0,73

DP: Desvio Padrão de n=3 (i): Utilizado o método de Bradford para quantificação de proteína.

73

Na extração em coluna, realizada com os casulos previamente

intumescidos, também foram recolhidas alíquotas da solução de sericina,

para determinação de proteína total pelo método de Bradford como

apresentado na Tabela 18.

O intumescimento prévio desses casulos na solução extratora, antes

do recheio da coluna, tornou-os mais flexíveis e deformáveis, permitindo a

utilização de maior massa de casulos e, consequentemente menor volume

de solução extratora, com a obtenção de soluções mais concentradas e de

melhor rendimento como mostrado na Tabela 18.

Tabela 18: Concentração de proteínas em diferentes tempos da extração

em coluna (casulos intumescidos), à temperatura 80-900C

Tempo de

extração (h)

Proteína

(mg/mL± DP)

Conc. Real

(mg/mL ±

DP)

Proteína

extraída

(%± DP)

0,25 4,76 ±0,26 51,18 ±2,80 27,42 ±1,50

0,5 5,43 ±0,05 58,39 ±0,49 31,28 ±0,26

1,0 5,43 ±0,02 58,39 ±0,25 31,28 ±0,13

1,5 5,45 ±0,41 58,60 ±4,45 31,39 ±2,38


Pelos resultados apresentados concluiu-se que 30 minutos foram

suficientes para a extração e, após esse tempo, a concentração

permaneceu aproximadamente constante.

5.1.3.4. EXTRAÇÃO EM COLUNA-PLANTA PILOTO

O teor de proteína nas soluções de sericina obtidas da extração em

planta piloto e o rendimento, expresso em porcentagem de proteína

extraída estão apresentados na Tabela 19.

74

Tabela 19: Teor de proteína e rendimento das extrações realizadas em

planta piloto, à temperatura 80-900C, utilizando método de Bradford para

quantificação.

Pré -

tratamento

dos casulos

Vazão

(L/min)

Teor de

nitrogênio

total (%)

Conc. Real

(mg/mL)

Proteína

extraída (%)

6,2 0,41 26,7 15,19 picados

16,4 0,31 20,2 16,12

íntegros 6,2 0,43 28,0 14,30

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 19, conclui-se

que as duas extrações realizadas na vazão de 6,2 L/min apresentaram

diferença de rendimento de apenas 5,8% e, portanto, é possível realizar o

processo com os casulos íntegros sem comprometimento do rendimento.

Comparando-se as extrações realizadas com os casulos picados, em

nas vazões utilizadas, observa-se que na vazão maior o rendimento do

processo é somente 5,8% maior.

Comparando as extrações em planta piloto e em laboratório,

observa-se diferenças de cerca de 50% em eficiência. Uma causa desse

resultado é a diferença de velocidades superficiais, um fator de

escalonamento importante na extração.

Nos estudos em laboratório a velocidade superficial, definida como a

vazão pela área, era cerca de 255 cm/h. Porém, na coluna piloto essa

velocidade era, no mínimo, 2000 cm/h, considerando a área de cada

coluna e a vazão mínima da bomba (6,2L/h). Sabendo que quanto menor

a velocidade superficial, maior o tempo de contato entre a solução

extratora e o recheio e mais eficiente a extração, esse foi um fator decisivo

na diminuição do rendimento na planta piloto.

75

5.2. DISTRIBUIÇÃO DE MASSA MOLECULAR

As soluções de sericina provenientes da extração dos fios com água

e com solução de carbonato de sódio, foram avaliadas quanto à massa

molecular média por Eletroforese SDS-PAGE. Os géis revelados são

mostrados nas Figuras 18 e 19. A letra M corresponde aos marcadores de

alta massa molecular, os números 1 e 2 referem-se às soluções extraídas

com carbonato de sódio em banho termostático à 900C e 350C,

respectivamente, e armazenadas em pH em torno de 10. A amostra 3

refere-se à extração feita em autoclave, com água à 1200C e a amostra 4

também refere-se à uma solução extraída com carbonato de sódio a 900C,

que teve o pH ajustado para a neutralidade (pH=7) logo após a extração.

Como apresentado anteriormente (Seção 5.1), não houve diferenças

significativas em termos de rendimento nas extrações realizadas com os

casulos e fios de seda em solução de carbonato de sódio. Nessas

condições, admitiu-se que o perfil eletroforético das proteínas

provenientes do casulo é semelhante ao perfil da extração a partir dos fios

de seda.

76

Figura 18: Eletroforese SDS –PAGE em gel acrilamida 7,5%. (M)Marcadores;

(1)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e (2) Solução obtida pela

extração com Na2CO3 a 350C; (3) Solução obtida pela extração com água a

1200C; (4)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e ajustada para

neutralidade (pH7)

Figura 19: Eletroforese SDS –PAGE em gel acrilamida 10%. (M)Marcadores;

(1)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e (2) Solução obtida pela

extração com Na2CO3 a 350C; (3) Solução obtida pela extração com água a

1200C; (4)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e ajustada para

neutralidade (pH7).

77

Conclui-se, portanto, que a faixa de MM da sericina extraída segue o

mesmo perfil descrito na literatura, com a presença de peptídeos de alta

MM, bem como de peptídeos de MM menores que 53 KDa.

A solução de sericina extraída em solução aquosa de carbonato de

sódio à 350C (2) apresentou concentração de proteína muito baixa, não

sendo possível a revelação.

As amostras 1 e 4 apresentaram o mesmo perfil eletroforético,

mostrando que o pH não influenciou significativamente na integridade da

proteína durante os 30 dias de armazenagem em pH 10.4, sob

refrigeração.

Os perfis eletroforéticos mostram que, aparentemente a extração em

meio básico provocou maior fragmentação da proteína (1 e 4), comparada

à extração em autoclave (3).

5.3. FORMAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA E DETERMINAÇÃO DO

DIÂMETRO HIDRODINÂMICO

As soluções de sericina obtidas das extrações em água e em solução

de carbonato de sódio foram analisadas quanto ao diâmetro hidrodinâmico

(por PCS) dos agregados protéicos formados.

A formação das NS se deu por complexação eletrostática da solução

de sericina com a goma guar quaternizada. A Tabela 20 apresenta os

valores de potencial zeta da solução de sericina e de uma solução de

goma guar quaternizada, mostrando que essas substâncias são

carregadas com cargas opostas sendo possível a atração eletrostática

entre elas.

78

Tabela 20: Potencial Zeta da Solução de Sericina e de uma Solução de

Goma Guar Quaternizada, em pH 5,5, em água.

Substância Potencial Zeta (mV ±DP)

Solução de Sericina

-25,9 ±2,2

Goma Guar Quaternizada

+20,2±1,9


Em seguida realizou-se um estudo para se achar a concentração

ideal de goma para a reticulação baseando-se nos tamanhos das

partículas formadas e na razão de cargas entre os dois polímeros.

Após a complexação eletrostática dessa proteína com goma guar

quaternizada foram medidos os diâmetros das nanopartículas formadas.

Os resultados das análises, feitas por PCS, estão expressos em termos de

número de partículas e em intensidade de luz espalhada.

5.3.1. AGREGADOS PROTÉICOS E NANOPARTÍCULAS DE SERICINA FORMADAS COM

SOLUÇÃO OBTIDA DA EXTRAÇÃO EM AUTOCLAVE

A partir das soluções de sericina obtidas da extração dos casulos

com água, em autoclave, foi feita a leitura do diâmetro hidrodinâmico dos

agregados protéicos formados logo após a extração e resfriamento dessas

soluções à temperatura ambiente, como mostrado na Tabela 21 e na

Figura 20.

79

Tabela 21: Diâmetro médio dos agregados protéicos após a extração com

água (Análise em número).


41.1 226.5 1119.0 6504.2

0

10

20

30

40

50

60

70

± 3.7 ± 12.9 ± 379,3 ± 433.2

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

38.4 225.9 1066.5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

± 12.0 ± 12.9 ± 314,3

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)

27.3 144.5 698.5

0

10

20

30

40

50

60

± 3.3 ± 14.5 ± 93.1

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

Figura 20: Diâmetro médio dos agregados protéicos em diferentes

temperaturas de extração (a) 1200C (b) 1240C (c) 1260C (Análise por

intensidade de luz espalhada).

Tempo e temperatura de extração Diâmetro (nm ± DP)

1,0 h à1200C 39,2 ± 0,5

1,0 h à 1240C 26,9 ± 1,5

1,5 h à 1260C 23,7 ± 2,0

80

Os resultados, analisados por número e por intensidade de luz

espalhada apresentados na Tabela 20 e Figura 20, respectivamente,

mostraram que com o aumento da temperatura de extração ocorreu

diminuição do diâmetro dos agregados. A análise por intensidade de luz

espalhada apresenta três a quatro populações (25-45; 130-240; 605-1500;

6504 nm) dentre as quais predominam a primeira população de acordo

com a análise por número de partículas. A presença de mais de uma

população pode ser justificada pela ampla faixa de massa molecular

apresentada pela sericina.

Uma parte dessa solução foi imediatamente reticulada com goma

guar quaternizada e os resultados são apresentados na Seção 5.3.1.

Outra parte dessa SS foi reservada e analisada após 24 horas em

temperatura ambiente. Nesse caso, o diâmetro médio das partículas

apresentou muito grande, demonstrando agregação das partículas, não

sendo possível a leitura por essa técnica.

5.3.2. AGREGADOS PROTEICOS - EXTRAÇÃO COM CARBONATO DE SÓDIO

As soluções de sericina obtidas por extração com solução de

carbonato de sódio apresentaram agregados protéicos com diâmetro

hidrodinâmico de 20,3 nm com desvio padrão de ± 0,26, de acordo com a

distribuição por número predominante de partículas.

A distribuição de tamanhos por intensidade de luz espalhada é

apresentada na Figura 21, onde há presença de basicamente, duas

populações: a 1ª com diâmetro médio médio de 26 nm e a 2ª com

diâmetro em torno de 230 nm.

81

26.11 244.79

0

25

50

75

± 3.6 ± 11,9

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

Figura 21: Distribuição de tamanho dos agregados protéicos obtidos por

extração com solução Na2CO3 (Análise por intensidade de luz espalhada).

Nesse caso os agregados protéicos são menores, comparados aos

agregados presentes na SS obtida da extração em autoclave, como

apresentado na Seção anterior.

5.3.3. NANOPARTÍCULAS PREPARADAS A PARTIR DE SOLUÇÃO DE SERICINA

OBTIDAS POR EXTRAÇÃO EM AUTOCLAVE

As soluções de sericina foram reticuladas com goma guar quaternizada

imediatamente após o resfriamento, e em seguida foi feita a leitura do diâmetro

hidrodinâmico das nanopartículas formadas. Na Tabela 22 são apresentados os

diâmetros analisados por número e na Figura 22 são apresentados os diâmetros

analisados por intensidade de espalhamento da luz.

Tabela 22: Diâmetro médio das partículas logo após a reticulação (Análise em

número).


Tempo e temperatura de extração Diâmetro (nm ± DP)

1,0 h à1200C 67,0 ± 2,6

1,0 h à 1240C 45,8 ± 1,8

1,5 h à 1260C 63,3 ± 4,7

82

66.2 517.8 4174.2 8394.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

± 1.2 ± 30.0 ± 2004.6 ± 2470.3

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

45.3 263.4 1778.6 8288.7

0

10

20

30

40

50

60

70

± 1.8 ± 29,1 ± 308,5 ± 278.4

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)

62.88 515.37 2664.45

0

25

50

75

±6.2 ± 115.0 ± 580.7

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(c)

Figura 22: Diâmetro médio das nanopartículas obtidas a partir da sericina

extraída nas temperaturas: (a) 1200C (b) 1240C (c) 1260C (Análise por

intensidade de luz espahada).

As partículas formadas apresentam diâmetro maior em relação aos

agregados protéicos apresentados na Seção 5.3.1, indicando a interação

da goma com a sericina.

Após armazenadas por 24 horas, foi novamente medido o tamanho

dessas partículas, que apresentaram-se muito grandes, não sendo

possível a leitura pelo equipamento, o que se deve provavelmente à

mudança de estrutura protéica para folha-beta. Isso dificulta a utilização

dessa técnica de extração para a formação das partículas.

83

Uma alternativa seria a utilização de pressões e temperaturas ainda

maiores para a extração, entretanto, tem-se a limitação da pressão

máxima de segurança para uso da autoclave (recomendada pelo

fabricante), que é de 1,5 Kgf/cm2.

A obtenção de partículas pela extração feita em autoclave é

interessante, pois dispensaria a extração alcalina e conseqüentemente,

eliminaria os eletrólitos do processo, que devem interferir na mudança de

carga das partículas.

5.3.4. NANOPARTÍCULAS PREPARADAS COM A SERICINA EXTRAÍDA EM

CARBONATO DE SÓDIO

Após realizada a extração da sericina em carbonato de sódio, essa

solução foi reticulada com goma guar quaternizada, mantedo-se a mesma

razão molar de cargas.

Nas próximas Seções serão apresentados os resultados de

distribuição de tamanho de partículas, a fim de investigar da concentração

ideal de goma para a formação das nanopartículas de sericina e a

possibilidade de se realizar a reticulação com a goma guar quaternizada

em pó.

5.3.4.1. INFLUÊNCIA DA GOMA GUAR QUATERNIZADA NA FORMAÇÃO DAS

NANOPARTÍCULAS DE SERICINA

Diferentes concentrações de uma solução aquosa de goma guar

quaternizada (1%m/v) foram utilizadas para a reticulação da sericina. Os

diâmetros das nanopartículas formadas estão apresentados, em termos

de número, na Tabela 22, onde é observada sempre a presença de uma

única população. A análise do diâmetro hidrodinâmico pele intensidade de

luz espalhada é apresentada na Figura 23.

84

Tabela 23: Diâmetro das partículas de sericina formadas com diferentes

concentrações de solução de Goma Guar Quaternizada.

Goma guar quaternizada

(% m/v)

Diâmetro (nm ±DP)

0,002 20,6

0,004 21,6 ± 1,06

0,02 24,4 ± 1,4

0,03 31,8 ± 1,2

0,035 31,4 ± 1,13

0,04 226,95 ±125,55

0,05 176,03 ± 81,07

0,1 363,1 ± 71,8

0,14 2548.68 ± 254.8


Através dos resultados mostrados na Tabela 23, obteve-se a faixa

de diâmetro de partículas requerida, em torno de 30 nm.

A partir da massa de goma adicionada e da massa de sericina

presente em solução, fez-se o cálculo da razão de cargas para manutenção

dessa faixa de tamanho de partículas, chegando-se a um valor de R-/+ =

0,74. Portanto, mantendo-se essa razão de cargas, espera-se que as

partículas formadas permaneçam sempre nessa faixa de tamanho. Nesse

caso as partículas potencial zeta ainda com valor negativo (-18,7 mV ±0,3)

e serão posteriormente recobertas com os materiais catiônicos

A Figura 22, que analisa o tamanho dessas partículas com ralação a

quantidade de luz espalhada, mostra sempre a presença de mais de uma

população. Em (a), (b), (c), (d) e (e) observam-se, basicamente, duas

populações com diâmetro médio de 20-70 e 200-300 nm e em (f), (g) e (h),

tem-se uma população em torno de 200-300 e outra entre 2000-3000 nm,

85

aproximadamente. Isso mostra que o resultado fornecido, em termos de

número de partículas acompanha sempre a primeira população na

avaliação por intensidade.

24.30 255.60 2694.00

0

10

20

30

40

50

60

70

80

±9.3 ± 300.0 ± 911.2

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

24.00 239.50 1421.00

0

25

50

75

± 8.3 ± 258,4 ± 890,1

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a)0,002% (b)0,004

33.70 227.99 2781.64

0

10

20

30

40

50

60

70

± 19,6 ± 262,0 ± 1102,2

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

45.88 288.73 3979.57

0

10

20

30

40

50

60

± 36,8 ± 355,5 ± 939,2

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(c) 0,02 (d) 0,03

66.80 331.13 2163.20

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

± 5.9 ± 267.6 ± 866.6

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

230.63 2315.95

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

± 79.25 ± 667.0

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(e) 0,035 (f) 0,04

86

180.41 2589.61

0

25

50

75

± 15.1 ± 683.4

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

313.02 3109.87

0

10

20

30

40

50

60

70

± 82.7 ± 743.5

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(g) 0,05 h (0,1)

2527.70

0

50

100

± 206.7

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(i) 0,14


diferentes concentrações de goma guar quaternizada em solução (% m/v):

(a) 0,002; (b) 0,004; (c)0,02; (d) 0,03; (e) 0,035; (f)0,04; (g)0,05; (h) 0,1; (i)

0,14 (Análise por intensidade de luz espalhada).

5.3.4.2. NANOPARTÍCULAS OBTIDAS UTILIZANDO-SE GOMA GUAR QUATERNIZADA

EM PÓ

A reticulação da sericina foi estudada também através da utilização

da goma guar quaternizada em pó, mantendo-se a mesma razão de

cargas. As partículas resultantes apresentaram diâmetros semelhantes

àquelas reticuladas com a goma em solução. A análise de diâmetro por

número (Tabela 24) mostra a presença de uma única classe ou

população.

87

Tabela 24: Diâmetro (em número) das nanopartículas de sericina

formadas com diferentes concentrações de goma guar quaternizada em

pó.

Goma guar quaternizada (% m/v) Diâmetro (nm ± DP)

0,03 25,4 ± 0,8

0,035 30,4 ± 1,3

0,04 42,3 ± 2,1

DP = Desvio Padrão, n=3

A análise de tamanho de dessas partículas, em relação à intensidade

de luz espalhada é mostrada na Figura 24. Observa-se em (a), (b) e (c), a

presença de duas populações principais, uma na faixa de 30-40 nm e a

outra na faixa de 200 nm.

Portanto, conclui-se que é possível fazer a reticulação da proteína

com a goma no estado sólido (na forma de pó), sem que ocorra

modificação na distribuição de tamanho das nanopartículas formadas.

88

34.81 233.32 2477.53

0

10

20

30

40

50

± 22.0 ± 260.4 ± 1449.3

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

34.97 207.27 1825.84

0

10

20

30

40

50

60

±12.8 ± 140.0 ± 1059.3

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)

41.26 247.31 2227.30

0

10

20

30

40

50

60

70

80

± 3.1 ± 92.7 ± 454.4

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(c)


diferentes concentrações de goma guar quaternizada em pó: (a) 0,03% (b)

0,035% e (c) 0,04% (Análise por intensidade de luz espalhada).

5.4. PRECIPITAÇÃO DAS PARTÍCULAS DE SERCINA COM ETANOL

A precipitação das NS em suspensão, obtidas em solução de

carbonato, foi feita com etanol 96%, em diferentes proporções, foi

estudada quanto ao rendimento através da massa de precipitado

recuperada. Os valores obtidos são mostrados na Tabela 24.

Após a ressuspensão dessas partículas em água, obtiveram-se

tamanhos de partículas próximos aos obtidos antes da precipitação, na

89

faixa de 55-65 nm (análise por número). Na análise por intensidade foram

observadas basicamente duas populações, em torno de 60 e 350 nm.

Tabela 25: Rendimento das precipitações com etanol 96%

Proporção suspensão de

nanopartículas:etanol

Rendimento (%)

1:1,5 30,7

1:2 50,5

1:3 84,9

O melhor rendimento foi obtido utilizando-se a proporção 1:3v/v

Suspensão de nanopartículas:Etanol. Essas partículas depois de

precipitadas foram novamente ressuspensas em água. Em alguns ensaios

de recobrimento das nanopartículas com catiônicos (Seção 5.6), foram

utilizadas essas partículas ressuspensas, sem a presença de eletrólitos.

5.5.CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA APÓS

RECOBRIMENTO COM MATERIAIS CATIÔNICOS

As nanopartículas de sericina, formadas em solução ou após a

precipitação com etanol, foram recobertas com materiais catiônicos (4.2.5)

e analisadas quanto à distribuição de tamanho de partículas e ao potencial

zeta, descritas nas sub-seções abaixo.

5.5.1.DIÂMETRO E POTENCIAL ZETA DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA

RECOBERTAS COM CLORIDRATO DE ARGININA

As nanopartículas de sericina formadas em solução e recobertas

com cloridrato de arginina foram analisadas quanto ao tamanho (por PCS)

e ao potencial zeta. Os resultados dessas análises são apresentados na

Tabela 26, sendo que o diâmetro é aqui representado em termos de

90

número de partículas. As análises de diâmetro em termos de intensidade

de luz espalhada são apresentados na Figura 25.

Tabela 26: Distribuição de tamanho (em número) e potencial zeta

das nanopartículas de sericina obtidas em solução e recobertas com

arginina.

Arginina (% m/v) Diâmetro

(nm ± DP) Potencial zeta (mV ± DP)

0,1 22,5 ± 0,9 -1,54 ±6,10

0,25 21,0 ± 2,3 -1,65 ± 4,23

0,5 19,7 ± 0,7 -0,29 ± 14,7

1 21,4 ± 1,0 2,58 ± 20,1

2,5 19,6 ± 0,5 2,64 ± 18,2

5 22,7 ± 4,6 2,61 ± 10,9

10 18,5 ± 0,99 3,18 ± 6,08

DP = Desvio Padrão, n=3

34.92 230.89 2272.42

0

10

20

30

40

50

60

± 31.8 ±296.3 ±1071.0

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

20.99 150.74 795.45

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

± 3.75 ± 85.4 ± 438.6

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)

91

22.40 205.32 2745.43

0

10

20

30

40

50

60

± 8.5 ± 176.6 ± 912.2

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

30.24 194.65 3129.65

0

10

20

30

40

50

60

± 18.9 ± 221.6 ± 1137.7

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(c) (d)

20.09 136.94 477.25 3556.37

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

± 2.4 ± 91.4 ± 293.1 ± 365.8

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

22.30 144.73 478.13 2434.00

0

10

20

30

40

50

60

± 1.9 ± 70.3 ± 211.8 ± 220.8

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(e) (f)

63.64 289.92 539.14

0

10

20

30

40

50

60

70

± 17,6 ± 99.1 ± 251.7

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(g)

Figura 25: Diâmetro das nanopartículas de sericina recobertas com

diferentes concentrações de Cloritdrato de arginina ((a) 0,1; (b) 0,25;

(c)0,5; (d) 1,0; (e) 2,5; (f)5,0; (g)10,0 (Análise por intensidade de luz

espalhada).

92

As partículas recobertas com arginina permaneceram com diâmetro

na faixa requerida (entre 20 e 30 nm, na análise em número). Na análise

em intensidade de luz espalhada ocorre a presença de basicamente duas

classes, uma de menor tamanho (20- 30 nm) e outra entre 120-230 nm.

Porém, a análise do potencial zeta dessas partículas mostra que,

mesmo utilizando-se 10% de arginina, não foram obtidas partículas com

carga positiva. Isso pode ser devido à presença dos eletrólitos em

solução, que dificultam a mudança de cargas. O potencial zeta obtido,

próximo da neutralidade não é favorável à aplicação pretendida das

nanopartículas, tanto por não contribuir para a estabilidade das

suspensões durante a estocagem, quanto pela baixa adesividade aos fios

de cabelo, que possuem carga negativa.

5.5.2. DIÂMETRO E POTENCIAL ZETA DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA

RECOBERTAS COM CTAC

As nanopartículas de sericina precipitadas com etanol, ressuspensas

em água (2,8% de proteína) e recobertas com CTAC, foram analisadas

quanto à distribuição de tamanho (PCS) e ao Potencial Zeta. Os

resultados são apresentados na Tabela 27.

Tabela 27: Diâmetro (em número) e potencial zeta das partículas

recobertas com CTAC

Concentração de CTAC

(%)

Potencial Zeta

(mV ±DP)

Diâmetro (nm ± DP)

0,25 +5,21 ±2,63 *

1,00 +22,3 ±3,37 81,1 ± 4,3

2,00 +21,4 ±4,34 34,0 ± 1,13

DP: Desvio Padrão de n=3 * Análise não realizada pois o potencial zeta nessa concentração não satisfazia as características as partículas que desejava-se alcançar.

93

As análises do diâmetro das partículas em intensidade estão

apresentadas na Figura 26.

80.30 962.80 2575.56

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

± 5.1 ± 485.1 ± 1572.4

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

32.90 226.80 787.80 5792.10

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

± 1.3 ± 133.6 ± 470.1 ± 299.2

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)


etanol) recobertas com CTAC à: (a) 0,1; (b) 0,25 (Análise por intensidade

de luz espalhada).

Observa-se com os resultados apresentados na Tabela 27, que o

diâmetro das partículas permanece em até 80 nanômetros e que a sua

carga positiva é atingida com adição de 1% de CTAC.

Na análise de tamanho de partículas por intensidade observa-se a

presença de mais de uma população, sendo que a primeira possui

diâmetro médio em torno de 30-80 nm, como na análise em número. As

outras populações apresentam diâmetro em torno de 1000-2000 nm.

Todas as amostras apresentaram sedimentação expressiva, com a

formação de um precipitado que é facilmente ressuspenso através de

agitação não vigorosa. Para diminuir a sedimentação, foi adicionada às

amostras 25% de Poliquaternium 07, que forneceu viscosidade às

suspensões, reduzindo a sedimentação.

94

5.5.3. POTENCIAL ZETA DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA RECOBERTAS COM

BTAC

As nanopartículas de sericina precipitadas com etanol e

ressuspensas em água (2,8% de proteína) foram também recobertas com

BTAC. As amostras foram analisadas quanto ao potencial zeta. Os

resultados são apresentados na Tabela 28.

Tabela 28: Potencial zeta das partículas recobertas com BTAC

Concentração de BTAC

(%)

Potencial Zeta

(mV ±DP)

1,00 +25,3 ± 4,5

2,00 +20,3 ± 4,48


O diâmetro dessas partículas não foi medido pois a suspensão,

mesmo após a adição do agente de viscosidade (Poliquaternium 07),

apresentava muito sedimento e partículas extremente grandes, e portanto,

não puderam ser avaliadas por essa técnica.

5.5.4. DIÂMETRO E POTENCIAL ZETA DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA

RECOBERTAS COM MISTURA DE CTAC E BTAC

O recobrimento com a mistura dos catiônicos CTAC e BATC foi feito

tanto com as partículas de sericina precipitadas com etanol e

ressuspensas, quanto com as partículas na solução de extração por

carbonato de sódio.

95

5.5.4.1. DIÂMETRO E POTENCIAL ZETA DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA

PRECIPITADAS COM ETANOL E RECOBERTAS COM MISTURA DE CTAC E BTAC

As partículas de sericina (2,8% de proteína) precipitadas com etanol

e ressuspensas em água foram recobertas com a mistura dos catiônicos

(CTAC e BTAC) em diferentes concentrações.

A Tabela 29 apresenta os resultados de tamanho de partículas (em

número) e potencial zeta das partículas recobertas.

A Figura 27 mostra os diâmetros das partículas analisados por

intensidade de luz espalhada. Em (a) há uma pequena população com

cerca de 30 nm e uma população maior na faixa de 200 nm. Em (b), existe

uma população (cerca de 50%) com 100 nm e outra na faixa dos 300 nm

e,em (c) há cerca de 5% das populações com 50 nm e 80-90% entre 250-

350 nm.

Observa-se que as amostras que contem no máximo 1% da mistura

dos catiônicos apresentam partículas com diâmetro na faixa de poucos

nanômetros (Tabela 28) e carga positiva, como objetiva esse trabalho.

Portanto essas amostras foram selecionadas como as mais promissoras

Tabela 29: Diâmetro e potencial zeta das partículas precipitadas com

etanol recobertas com mistura de CTAC e BTAC.

BTAC CTAC Zeta (mV±DP) Diâmetro (nm ± DP)

0,2 0,8 +23,0± 4,16 31,9 ±2,5

0,5 0,5 +27,5 ±3,67 88,0 ± 9,5

0,8 0,2 +25,8 ±3,97 43,3 ± 7,5

0,4 1,6 +26,4 ± 4,63 *

1,0 1,0 +28,7 ± 4,81 *

1,6 0,4 +31,6 ±4,82 *


(* )= Diâmetro muito elevado, superior a 1500 nm

96

33.68 218.14 3305.12

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

± 9.3 ± 254.6 ± 1976.5

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

80.30 962.80 2575.56

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

± 5.1 ± 485.1 ± 1572.4

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)

50.94 275.80 6518.06

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

± 10.4 ± 284.2 ± 781.4

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(c)


etanol) recobertas com mistura CTAC/BTAC nas concentrações à: (a)

0,2/0,8%; (b) 0,5/0,5% (c)0,8/0,2% (Análise em intensidade de luz

espalhada).

Nestas condições, as amostras apresentaram sedimentação, porém

menor do que a sedimentação presente quando do uso do BTAC

somente. Essa sedimentação foi contornada com a adição de 25% de

Poliquaternium 07.

97

5.5.4.2. DIÂMETRO E POTENCIAL ZETA DAS NANOPARTÍCULAS OBTIDAS NA

SOLUÇÃO DE EXTRAÇÃO E RECOBERTAS COM MISTURA DE CTAC E BTAC

As nanopartículas de sericina obtidas em solução de carbonato de

sódio foram diretamente recobertas com as misturas dos catiônicos CTAC

e BTAC, sem a remoção prévia dos sais por precipitação com etanol.

Os resultados de Potencial Zeta são mostrados na Tabela 30 e os

diâmetro obtidos das partículas são mostrados em intensidade e número

nas Figuras de 28 a 36.

Tabela 30: Potencial zeta das nanopartículas de sericina em solução

recobertas com mistura de CTAC e BTAC

Proteína (%)

BTAC (%)

CTAC(%)

Potencial Zeta (mv ± DP)

2,4 0,2 0,8 + 11.4 ±3,04

2,4 0,2 1,5 +11.0 ±3,32

2,4 0,2 2,5 +14.9 ±3,36

2,13 0,4 1,6 +13.5 ±3,02

2,13 0,4 3,0 +17.6 ±3,35

2,13 0,4 5,0 +23.0 ±3,88

1,19 0,6 2,4 +19.6 ±3,20

1,19 0,6 4,5 +25.6 ±3,56

1,19 0,6 7,5 +25.5 ±4,35


Observa-se que as partículas formadas estão todas com carga

positiva, sendo que aumentando a concentração dos catiônicos, há

também aumento do valor do potencial zeta.

98

148.33 451.31 4812.40

0

10

20

30

40

50

60

70

± 14.9 ± 238.5 ±3805.5

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

192.80 794.05 4986.72

0

10

20

30

40

50

60

70

± 65.8 ± 1025.6 ±5789.7

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)


de CTAC (a) número (b) intensidade.

122.25 395.71

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

± 67.0 ± 223.3

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

364.07 4752.53 9318.90

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

± 413.5 ± 4167.8 ±3040.5

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)



99

150.29 456.39 1301.90

0

25

50

75

100

± 8.5 ± 170.6 ± 683.5

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

239.75 1376.45 6884.87

0

10

20

30

40

50

60

± 186.1 ± 1579.6 ±4707.9

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)



178.59 673.20

0

25

50

75

100

± 14.8 ± 509.5

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

211.11 797.38 4706.88

0

10

20

30

40

50

± 111.8 ± 613.65 ±4296.5

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)



100

77.03 413.50

0

25

50

75

100

± 6.3 ± 196.3

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

92.65 442.35 4076.12

0

10

20

30

40

50

60

70

± 44.5 ± 509.65 ±4301.9

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)



36.57

0

50

100

± 1.0

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

41.86 273.24 3264.22

0

10

20

30

40

50

60

70

80

± 13.3 ± 274.2 ±2436.8

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)



101

80.03

0

50

100

± 2.03

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

81.42 424.75 2608.99 4519.28

0

10

20

30

40

50

60

± 11.1 ± 232.4 ±2309.8±1276.6

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)



40.50

0

50

100

± 1.2

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

40.90 283.20 2156.20 7376.10

0

10

20

30

40

50

60

70

± 3.8 ± 165.7 ± 758.8±1006.1

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)



102

1366.51 5693.23

0

10

20

30

40

50

60

70

± 640.8 ±2795.5

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

1339.93 6714.43

0

10

20

30

40

50

60

70

± 380.9 ± 1333,6

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)



Pelos resultados apresentados nos gráficos acima, observa-se que o

tamanho das nanopartículas, após o recobrimento com a mistura de

catiônicos, apresenta-se em uma faixa aceitável, na análise por número

(entre 30-200 nm), para aplicação a que se destina, com exceção da

última amostra. As amostras que apresentaram melhores e menores

tamanhos, em número, estão representadas nas Figuras 32, 33 e 35.

Além disso, devido à presença dos eletrólitos em solução, a

sedimentação dessa amostra é bem menor e a adição 25% de do

Poliquaternium 07 é suficiente para evitar toda a precipitação, apesar da

viscosidade dessas amostras também terem sido menores pela presença

dos sais.

Porém a presença de eletrólitos não é interessante em produtos para

cuidados dos cabelos e por esse motivo as amostras escolhidas para

investigações futuras foram aquelas formadas com as partículas

precipitadas em etanol.

103

5.6. INFLUÊNCIA DOS CONSERVANTES NA FORMAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE

SERICINA

Os conservantes fenoxietanol e sorbato de potássio, adicionados

antes e depois da reticulação da sericina com a goma guar, apresentaram

grande influência no diâmetro das partículas no segundo caso. Quando

adicionados após a reticulação, não foi observada alteração no diâmetro

hidrodinâmico das partículas (Tabela 31), que se manteve com uma única

população, na faixa dos 30 nm, quando da análise em número de

partículas.

Tabela 31: Influência da ordem de adição dos conservantes no diâmetro

hidrodinâmico das partículas.


A análise de tamanho de partículas dessas amostras, apresentadas

por intensidade de luz espalhada, é mostrada na Figura 37. Observa-se

que na amostra (a), onde primeiro foi feita a reticulação, há predominância

de duas populações, sendo que a maior (mais de 50%) apresenta

partículas com 40 nm, em média e a segunda (aprox. 30%) apresenta

partículas com 230 nm em média. Já as partículas que foram reticuladas

após a adição dos conservantes (b), apresentam populações

predominantes com diâmetro médio de 270 e 2000 nm.

Adição de Conservantes

Reticulação Diâmetro (nm ± DP)

1º 2º 36,2 ± 1,3

2º 1º 179,9 ± 115,1

104

41.60 232.76 3197.95

0

10

20

30

40

50

60

± 13.9 ± 185.6 ±1283.3

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

277.90 1939.10 6989.60

0

25

50

75

± 64.6 ± 788.5 ±1624.4

Diâmetro (nm)

% e

m C

lass

es

(a) (b)

Figura 37: Diâmetro das nanopartículas de sericina formadas (a) antes e

(b) depois da adição dos conservantes.

Portanto, analisando esses dados, conclui-se a adição dos

conservantes deve ser feita após a formação das partículas para não

perturbar as suas interações eletrostáticas.

5.7. ANÁLISE DAS PARTÍCULAS DE SERICINA SECAS POR ATOMIZAÇÃO E POR

LIOFILIZAÇÃO

As NS (com concentrações de goma 0,03; 0,035 e 0,04% m/v)

obtidas em solução de carboato e secas por atomização e por liofilização

foram analisadas quanto á morfologia, por MEV e após ressuspensas em

água foram analisadas quanto ao diâmetro hidrodinâmico por PCS.

5.7.1. ANÁLISE DA MORFOLOGIA DAS PARTÍCULAS DE SERCINA SECAS POR

ATOMIZAÇÃO E POR LIOFILIZAÇÃO

As nanopartículas de sericina secas por atomização e analisadas por

Microscopia Eletrônica de Varredura são mostradas na Figuras 38.

105

A

B

C

D

Figura 38: Morfologia das partículas de sericina, secas por spray, com as

seguintes concentrações de goma guar (a) 0; (b) 0,03% (c) 0,035% e (d)

0,04%.

Através da Figura 38 observa-se que as partículas de sericina secas

por atomização são esféricas e apresentam diâmetro em torno de 2-3 µm.

As nanopartículas de sericina secas por liofilização e analisadas por

MEV são mostradas na Figura 39.

106

A

B

C

D

Figura 39: Morfologia das partículas de sericina, secas por liofilização,

com as seguintes concentrações de goma guar (a) 0; (b) 0,03% (c)

0,035% e (d) 0,04%.

Observa-se pelas micrografias que, as partículas secas pelo

processo de liofilização apresentam-se fundidas, amorfas, diferentemente

das amostras secas pelo processo de atomização. Isso ocorre,

principalmente, pela natureza da secagem nos dois processos, o primeiro

por sublimação e o segundo por evaporação.

107

5.7.2. DIÂMETRO DAS PARTÍCULAS DE SERCINA FORMADAS PELA

RESSUSPENSÃO DOS PÓS EM ÁGUA

Os pós obtidos por secagem atomização e liofilizados foram

ressuspensos em água e analisados quanto ao diâmetro hidrodinâmico

das partículas por PCS. Os resultados, em número, são apresentados na

Tabela 32.

Tabela 32: Diâmetro médio das partículas formadas a partir da

ressuspensão em água dos pós obtidos por atomização e por liofilização

(Análise em número de partículas).

Goma guar quaternizada

(% m/v) Diâmetro (nm ± DP)

0 20,8 ± 0,35

0,03 43,7 ± 0,47

0,035 23,3 ± 2,4

Ressuspensão das

partículas secas por

spray-drying 0,04 1587,7 ± 1249,1

0 20,1 ± 3,2

0,03 227,2 ± 189,6

0,035 6018,0 ± 1535,5

Ressuspensão das

partículas secas por

liofilização 0,04 6765,7 ± 128,6


As partículas ressuspensas em água, que haviam sido secas por

atomização, apresentaram diâmetro na mesma faixa de tamanho

apresentada antes da secagem, mesmo a amostra controle, que

representa os agregados protéicos antes da reticulação com a goma.

Porém, as partículas secas por liofilização, quando ressuspensas em

água, apresentaram diâmetros maiores, com exceção do controle, que

apresentou diâmetro igual ao que era medido antes da reticulação.

108

Portanto, a secagem por atomização seria a mais indicada para a

obtenção das nanopartículas.

5.8. MORFOLOGIA DAS NANOPARTÍCULAS DE SERICINA RECOBERTAS COM CTAC

As nanopartículas de sericina, recobertas com 1% CTAC, na

presença do Poliquternium 07, usado como agente de viscosidade, foram

visualizadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (Figura 40).

Por essas imagens verifica-se que essas partículas possuem

predominantemente diâmetro de cerca de 100 nm, o que confirma a leitura

feita pela técnica PCS.

Figura 40: Nanopartículas de sericina recobertas com1% de CTAC

5.9. ANÁLISE DOS FIOS DE CABELOS – EFICÁCIA DO TRATAMENTO

5.9.1. EFEITO DE BRILHO EM MECHAS DE CABELOS

As Figuras 41 e 42 apresentam os resultados de porcentagem de

aumento de brilho nos cabelos virgens e danificados, obtidos por análise

instrumental, resultantes da aplicação das nanopartículas de sericina e de

placebo, comparando-os com o controle. Através da Figura 41 observa-se

que o brilho dos cabelos virgens promovido pela aplicação das

nanopartículas de sericina é superior ao brilho promovido pela adição do

Placebo, nas três concentrações estudadas.

109

A análise estatística revela que o aumento de brilho promovido pelas

nanopartículas de sericina é significativo (P < 0,001) quando comparado

ao aumento de brilho promovido pelos placebos, nas mesmas

concentrações.

% Aumento de brilho - cabelos virgens

P1% N1% P3% N3% P5% N5%-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

Amostra

% a

um

ento

de

bri

lho

Figura 41: Porcentagem de aumento de brilho nos cabelos virgens

tratados com Placebos (P) e com Nanopartículas de Sericina (N) em

diferentes concentrações, onde (P1%) solução aquosa do placebo a 1%,

(P3%) solução aquosa do placebo a 3%, (P5%) solução aquosa do

placebo a 5%, (N1%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a


dispersão de nanopartículas de sericina em água a 5%.

A Figura 42 compara o aumento de brilho obtido em cabelos

danificados tratados com as nanopartículas de sericina e com Placebo,

tendo como referência cabelos tratados somente com água. Observa-se

novamente nesse caso que o brilho promovido pela aplicação das

nanopartículas de sericina é superior ao brilho promovido pelos placebos,

nas três concentrações estudadas. A análise estatística mostra que o

P < 0,001

P < 0,001

P < 0,001

110

aumento do brilho promovido pelas nanopartículas de sericina é

significativo (P < 0,001) quando comparado ao aumento de brilho

promovido pelos placebos, nas mesmas concentrações.

% Aumento de brilho - cabelos danificados

P1% N1% P3% N3% P5% N5%0

50

100

150

200

250

300

350

Amostra

% a

um

ento

de

bri

lho

Figura 42: Porcentagem de aumento de brilho nos cabelos danificados

tratados com Placebos e com Nanopartículas de Sericina em diferentes

concentrações, onde (P1%) mecha tratada com solução aquosa do

placebo a 1%, (P3%) mecha tratada com solução aquosa do placebo a

3%, (P5%) mecha tratada com solução aquosa do placebo a 5%, (N1%)


de nanopartículas de sericina em água a 3%, (N5%) dispersão de

nanopartículas de sericina em água a 5%.

5.9.2. EFEITO DE DIMINUIÇÃO DE VOLUME EM MECHAS DE CABELOS

As nanopartículas de sericina dispersas em água e aplicadas aos

cabelos, mostraram-se eficazes na diminuição do volume das mechas,

sendo que a diminuição de volume promovida pelas nanopartículas foi

maior do que a redução de volume produzida pelo placebo e pela água.

No Figura 43 é apresentada a média observada de redução de

volume das mechas (em cm), com desvio padrão.

P < 0,001

P < 0,001

P < 0,001

111

C P1% P3% P5% N1% N3% N5%0

1

2

3

4

5

6

Amostra

Dim

inuiç

ão d

e vo

lum

e (c

m)

Figura 43: Redução de volume das mechas (cm) nos cabelos tratados

com Controle (C), Placebos (P) e com Nanopartículas de Sericina (N) em

diferentes concentrações: (P1%) solução aquosa do placebo a 1%, (P3%)

solução aquosa do placebo a 3%, (P5%) solução aquosa do placebo a



de nanopartículas de sericina em água a 5%.

Através da Figura 43 observa-se que a redução de volume

promovida pelo controle foi superior à redução de volume promovida pelos

placebos a 3% e 5%. Comparando-se o efeito de redução de volume do

controle com o placebo a 1%, percebe-se pequena redução do volume,

porém com baixa significância estatística. Comprovando-se, portanto, que

o efeito dos agentes condicionantes catiônicos presentes na formulação,

nas concentrações aplicadas, é o mesmo da água.

As mechas tratadas com as nanopartículas de sericina, em diferentes

concentrações, apresentaram grande redução no volume quando

comparados a redução de volume promovida pelos placebos e pelo

P<0.001 em relação aos placebos nas mesmas concentrações e em relação ao controle. Portanto, essa redução do volume possui significância estatística.

P<0.01 em relação ao controle, o que indica menor significância estatística.

112

controle, demonstrando o efeito superior das nanopartículas de sericina na

diminuição de volume dos cabelos.

5.9.3. IMAGENS DAS FIBRAS CAPILARES ANALISADAS POR MICROSCOPIA

ELETRÔNICA DE VARREDURA

Através de Microscopia Eletrônica de Varredura foram obtidas

imagens de cabelos virgens (Figura 44), danificados (Figura 45) e tratados

com uma formulação de nanopartículas de sericina recobertas com 0,5% de

BTAC e 0,5% de CTAC (Figura 46).

Figura 44: Fios de cabelos virgens

Figura 45: Fios de cabelos danificados

113

Figura 46: Fios de cabelos tratados com nanopartículas de sericina

Pode-se observar pelas imagens a clara recuperação dos cabelos,

que voltam a ter o mesmo aspecto dos cabelos virgens.

114

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos permitem as seguintes conclusões:

• A extração da sericina utilizando casulos íntegros é o processo

mais factível de implantação no setor industrial e mais viável

econômicamente.

• A extração em colunas com solução de carbonato de sódio

apresentou rendimentos adequados (31%) em escala de laboratório

• A extração em coluna, em escala piloto apresentou rendimento de

cerca de 15% (50% menor) devido principalmente ao aumento da

velocidade superficial

• A presença de grande quantidade de eletrólitos limita a

incorporação de tensoativos catônicos na superfície das partículas,

e as propriedades sensoriais do produto.

• A extração em autoclave utilizando água como solvente produz

rendimentos também adequados (21%), porém a tendência de

gelificação da solução resultante limita a produção de partículas

com tamanhos na faixa nanométrica.

• A produção das nanopartículas através da reticulação com goma

guar quaternizada mostrou-se factível tanto do ponto de vista de

produto quanto de processo. A goma guar pode ser adicionada na

forma líquida ou na forma de pó sem alteração dos resultados.

• A secagem das nanopartículas por atomização,, possibilitou a

posterior reconstituição dos tamanhos das nanopartículas após

ressuspensão em água, o que não foi conseguido através da

secagem por liofilização.

• A separação das partículas através de precipitação com etanol

apresentou rendimento adequado (80%), dependente da proporção

de etanol utilizada. A ressuspensão das partículas em água

reconstituiu o seu tamanho original.

115

• A incorporação de CTAC e BTAC às nanopartículas produziu as

modificações no potencial zeta pretendidas tanto para a

estabilidade da suspensão quanto para as aplicações no cabelo.

• A modificação do potencial zeta com BTAC e CTAC foi obtida tanto

na presença dos eletrólitos da extração e reticulação, quanto nas

nanopartículas precipitadas com etanol e ressuspensas em água.

• A incorporação do CTAC produziu maior estabilidade à suspensão

de nanopartículas enquanto que o BTAC produz melhores efeitos

sensoriais. A proporção que melhor associou ambos os efeitos foi

1:1, para as nanopartículas precipitadas e ressuspensas em água.

• A adição do Poliquaternium 7 aumentou a viscosidade da

formulação, conferindo-lhe melhor efeito sensorial e estabilidade

através da redução da agregação e sedimentação das

nanopartículas durante a estocagem.

• A formulação de nanopartículas de sericina contendo os

tensoativos catiônicos CTAC E BTAC e o Poliquaternium 7

apresenta propriedades adequadas para aplicações no tratamento

de cabelos.

• O processo completo de extração da sericina, produção das

nanopartículas e modificação da sua superfície é simples,

escalonável e promissor para implantação no setor industrial.

116

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

São sugeridos os seguintes temas para realização de trabalhos

futuros:

� Extração da sericina sob aplicação de maiores pressões e

temperaturas em reatores adequados bem como a adição de

pequenas quantidades de carbonato de sódio são alternativas

promissoras para contornar a gelificação.

� Extração da sericina em coluna de recheio, em escala piloto ou

industrial, com controle da velocidade superficial.

117

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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