UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

MICHELLE DEL BIANCHI AMARANTE CRUZ

Moxidectina em tecidos de cordeiros: desenvolvimento e validação de método analítico por LC-MS/MS e sua aplicação em estudo de depleção de resíduos

CAMPINAS 2017

MICHELLE DEL BIANCHI AMARANTE CRUZ

Moxidectina em tecidos de cordeiros: desenvolvimento e validação de método analítico por LC-MS/MS e sua aplicação em estudo de depleção de resíduos

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências de Alimentos.

Orientador: Prof. Dr. Felix Guillermo Reyes Reyes Coorientador: Dra. Patrícia Aparecida de Campos Braga Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Michelle Del Bianchi Amarante Cruz e orientada pelo Prof. Dr. Felix Guillermo Reyes Reyes.

CAMPINAS 2017

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, 141964/2012-0

Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Engenharia de AlimentosClaudia Aparecida Romano - CRB 8/5816

Cruz, Michelle Del Bianchi Amarante, 1982- C889m CruMoxidectina em tecidos de cordeiros : desenvolvimento e validação de

método analítico por LC-MS/MS e sua aplicação em estudo de depleção deresíduos / Michelle Del Bianchi Amarante Cruz. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.

CruOrientador: Felix Guillermo Reyes Reyes. CruCoorientador: Patrícia Aparecida de Campos Braga. CruTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de

Engenharia de Alimentos.

Cru1. Cordeiros. 2. Moxidectina. 3. QuEChERS, Método de. 4. LC-MS/MS. 5.

Depleção. I. Reyes, Felix Guillermo Reyes. II. Braga, Patrícia Aparecida deCampos. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia deAlimentos. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Moxidectin residues in lamb tissues : development and validationof analytical method by LC-MS/MS and application residue depletion studyPalavras-chave em inglês:LambsMoxidectinQuEChERS, MethodLC-MS/MSDepletionÁrea de concentração: Ciência de AlimentosTitulação: Doutora em Ciência de AlimentosBanca examinadora:Felix Guillermo Reyes Reyes [Orientador]Alda Lúcia Gomes MonteiroSônia Claudia do Nascimento QueirozCristiana Leslie CorreaNadia Regina RodriguesData de defesa: 23-08-2017Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________________________ Prof. Dr. Felix Guillermo Reyes Reyes

(Orientador) FEA/UNICAMP

_______________________________________________________________ Dra. Alda Lúcia Gomes Monteiro

(Membro Titular) Universidade Federal do Paraná -UFPR

_______________________________________________________________ Dra. Sônia Claudia do Nascimento Queiroz

(Membro Titular) EMBRAPA

_______________________________________________________________ Dra. Cristiana Leslie Correa

(Membro Titular) Planitox

______________________________________________________________ Dra. Nadia Regina Rodrigues

(Membro Titular) CPQBA/UNICAMP

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no

processo de vida acadêmica do aluno.

Dedico este trabalho,

- à minha família,

- aos meus pais Sérgio e Luzia,

- ao meu irmão Serginho,

- às minhas filhas Alice e Júlia

- e em especial ao meu marido Vitor.

AGRADECIMENTOS

A Deus e a Nossa Senhora Rosa Mística por ter realizado este trabalho.

Ao prof. Dr. Felix G. R. Reyes, pela orientação, confiança, dedicação, amizade e

aprendizado ao longo desse período.

A toda minha família, em especial ao meu pai Sérgio Del Bianchi que sempre me

incentivou aos estudos, a minha mãe Luzia Zan Del Bianchi e ao meu irmão Sérgio Del

Bianchi Júnior, pelo apoio e carinho.

Ao meu marido Vitor, pelo companheirismo durante todos esses anos e as minhas

princesas Alice e Júlia que de certa forma me acompanharam durante a realização deste

trabalho.

Aos meus amigos e colegas do laboratório de Toxicologia de Alimentos, em especial à

Silvia Helena, Maria José e Luciana Castello Branco que estiveram muito presentes em

minha vida.

Aos membros da banca examinadora desta tese pela disponibilidade e auxílio nas

correções.

A minha coorientadora Dra. Patrícia Ap. Campos Braga, pelas orientações, incentivo e

amizade.

A Dra. Juliana A. Teles pela amizade, ajuda e sugestões.

A prof. Dra. Alda Lúcia Gomes Monteiro pela colaboração, orientação e confiança e a

todos os alunos da LAPOC que fizeram parte do trabalho em especial à Dra. Maria

Ângela Fernandes pela ajuda, confiança e alegria que trazia para o nosso laboratório.

A todas as pessoas, que de certa forma, colaboraram para a realização deste trabalho.

Muito obrigada!

RESUMO

A ocorrência de resíduos de antiparasitários em matrizes biológicas, em concentrações

acima do Limite Máximo de Resíduos (LMR) estabelecidos pelo Codex Alimentarius,

pode ocorrer quando não se aplicam as Boas Práticas de Uso de Medicamentos

Veterinários. Em particular se deve levar em consideração as especificações de uso

como dose, período de tratamento e período de carência. Também, o conhecimento da

dimensão da exposição da população a esses compostos é de fundamental importância

para direcionar as ações de vigilância sanitária por parte dos órgãos governamentais

responsáveis pela proteção da saúde do consumidor. Para isto, é fundamental a

disponibilidade de métodos analíticos que apresentem seletividade e detectabilidade

adequadas. Dentre os diversos antiparasitários utilizados no tratamento de animais

produtores de alimentos destinados ao consumo humano, a moxidectina (MOX) recebe

destaque, pois é um fármaco de largo espectro de ação contra endo e ectoparasitas e tem

sido utilizado em todo país. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o

desenvolvimento e validação de um método analítico para determinação de resíduos de

MOX em tecidos de cordeiros (músculo, fígado, rim e gordura) através da técnica de

cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). O método foi

validado levando em consideração os critérios de validação de métodos analíticos

utilizados em estudos de resíduos de fármacos veterinários, bem como em estudos de

depleção, que foram estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (MAPA), União Europeia (UE) e da Cooperação Internacional para a

Harmonização dos Requisitos Técnicos para o Registo de Medicamentos Veterinários

(VICH). O preparo de amostra por QuEChERS garantiu seletividade adequada ao

método analítico e, de acordo com os guias de validação adotados, o método mostrou-se

adequado para o propósito pretendido. A quantificação do analito nas amostras foi

realizada a partir de curvas analíticas construídas pela fortificação das matrizes

biológicas isentas do analito, sendo possível estabelecer limite de quantificação (LOQ)

de 5 ng g-1

e limite de detecção (LOD) de 1,5 ng g-1

para todas as matrizes. O método

validado foi aplicado na quantificação de MOX em tecidos de cordeiros provenientes de

um ensaio de depleção de resíduos. Após o período de carência foi verificada nos

tecidos muscular, hepático e renal, a presença de MOX, porém em concentrações

inferiores ao LMR estabelecido de 50 ng g-1

, 100 ng g-1

e 50 ng g-1

, respectivamente.

Palavras-chave: moxidectina, cordeiro, QuEChERS, LC-MS/MS, depleção.

ABSTRACT

The occurrence of antiparasitic residues in biological matrices at levels above the

Maximum Residue Limit (MRL) established by the Codex Alimentarius can occur

when not applied the Good Veterinarian Practices for Use of Medicinal Products. In

particular, specifications of use such as dose, treatment period and withdrawal period

should be taken into account. Also, knowledge of the population exposure dimension to

these compounds is of fundamental importance to implement sanitary surveillance

actions by the governmental agencies responsible for the consumer health protection.

For this purpose, the availability of analytical methods which have appropriate

selectivity and detectability is required. Among several antiparasitic drugs used in the

treatment of animals intended for production of food for human consumption,

moxidectin (MOX) gets great importance because it is a drug of wide spectrum of

action against endo and ectoparasites, which has been widely used throughout the

country. Thus, this study aimed the development and validation of an analytical method

by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) for the

determination of MOX residues in lamb tissues (muscle, liver, kidney and fat). The

method was validated taking into consideration the criteria for the validation of

analytical methods used in veterinary drug residue studies, as well as in depletion

studies, that have been established by the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock

and Food Supply (MAPA), the European Union (EU) and the International Cooperation

on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal

Products (VICH). The sample preparation by QuEChERS methodology ensured

adequate recovery of MOX, and according to the guidelines adopted the method was

reliable for the intended purpose. In order to quantify the analyte, matrix-matched

calibration curves were constructed by spiked blank tissues, being possible to reach a

limit of quantitation (LOQ) of 5 ng g-1

, and limit of detection (LOD) of 1.5 ng g-1

for all

matrices. The validated method was applied in the quantification of MOX in tissue

samples from a residue depletion study. After the withdrawal period, in the muscle,

liver and kidney tissues it was verified the presence of MOX residues, however in

concentrations lower than the established MRL of 50 ng g-1

, 100 ng g-1

and 50 ng g-1

,

respectively.

Key words: Moxidectin, lamb, QuEChERS, LC-MS/MS, depletion

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

CAPÍTULO I - Ovinocultura: Uso de anti-helmínticos, aspectos analíticos e

de legislação

Figura 1. Classes terapêuticas no uso de medicamentos veterinários. 25

Figura 2. Esquema do desenvolvimento das avermectinas e milbemicinas. 28

Figura 3. Estrutura das lactonas macrocíclicas. 30

CAPÍTULO II - Desenvolvimento e validação de método analítico para

quantificação de moxidectina em tecidos de cordeiro

Figura 1: Diferenças estruturais entre nemadectina e moxidectina. 41

Figura 2. Cromatograma da matriz branco de músculo e matriz branco

fortificada na concentração do LOQ 5 µg kg-1

. 50

Figura 3. Cromatograma da matriz branco de fígado, e matriz branco fortificada

na concentração do LOQ 5 µg kg-1

. 51

Figura 4. Cromatograma da matriz branco de rim e matriz branco fortificada na

concentração do LOQ 5 µg kg-1

. 51

Figura 5. Cromatograma da matriz branco de gordura e matriz branco fortificada

na concentração do LOQ 5 µg kg-1

. 52

Figura 6. Curvas analíticas obtidas para MOX: Curvas no Solvente, Curvas no

Extrato da Matriz e Curvas na Matriz músculo, todas preparadas em

triplicata. 53


Extrato da Matriz e Curvas na Matriz fígado, todas preparadas em

triplicata. 53


Extrato da Matriz e Curvas na Matriz rim, todas preparadas em

triplicata. 54


Extrato da Matriz e Curvas na Matriz gordura, todas preparadas em

triplicata. 54

CAPÍTULO III – Depleção dos resíduos da moxidectina em músculo, fígado e

rim de cordeiros

Figura 1. Concentração média de moxidectina no músculo de cordeiro, longe do

local de aplicação (lombo), após única administração subcutânea (0,2

mg/kg de peso corporal). 71

Figura 2. Concentração média de moxidectina no fígado de cordeiro, após única

administração subcutânea (0,2 mg/kg de peso corporal). 71

Figura 3. Concentração média de moxidectina no rim de cordeiro, após única

administração subcutânea (0,2 mg/kg de peso corporal). 72

LISTA DE TABELAS


de legislação

Tabela 1. Principais exportadores de ovinos e caprinos. 23

Tabela 2. Distribuição do consumo mundial per capita (kg) de carne de ovinos e

caprinos. 23

Tabela 3. Valor nutricional da carne de cordeiro em comparação aos outros tipos

de carne (conteúdo por 100g). 24

Tabela 4. Valores de LMR de MOX em diferentes espécie ovina 27



Tabela 1.Composição da fase móvel e gradiente utilizado. 44

Tabela 2. Parâmetros de fonte de ionização (ESI modo positivo) utilizados. 45

Tabela 3. Precisão e Exatidão nas matrizes músculo, fígado, rim e gordura de

cordeiro por LC-MS/MS. 55

Tabela 4. Valores de LOD, LOQ, CCα e CCβ nos tecidos músculo, fígado, rim e

gordura de cordeiro por LC-MS/MS. 56

Tabela 5. Efeito matriz observado no método de quantificação de MOX em

músculo, fígado, rim e gordura de cordeiro por LC-MS/MS (expresso

em %). 57

Tabela 6. Estabilidade de curta duração da moxidectina (média ± desvio

padrão). 58

Tabela 7. Estabilidade de ciclos de gelo e degelo (média ± desvio padrão). 58

Tabela 8. Variações realizadas no método no teste de robustez 59

CAPÍTULO III – Depleção dos resíduos da moxidectina em músculo, fígado

e rim de cordeiros

Tabela 1. Dias após aplicação única do fármaco e número de repetições dos

animais que foram abatidos para coleta das matrizes. 69

Tabela 2. Concentração da moxidectina (µg kg-1

)em músculo, fígado e rim, após

administração única subcutânea de 0,2 mg/kg de peso corporal. 70

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACN: Acetonitrila

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CCα: Limite de decisão

CCβ: Capacidade de detecção

CNA Confederação Nacional da Agricultura

DAD: Detecção por arranjo de diodos

EC: Comunidade Europeia (European Commission)

EMA Emamectina

EMEA: Agência Europeia de Medicamentos (European Medicines Agency)

ESI: Ionização por electrospray (eletrospray ionization)

FAO: Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (Food and

Agriculture Organization of the United Nations)

FDA: Administração de Drogas e Medicamentos (Food and Drug Administration)

FIDA: Fundo Internacional de Desenvolvimento Agrícola

FLU: Detecção por fluorescência

HPLC: Cromatografia líquida de alta performance (High Performance Liquid

Chromatography)

IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IDA: Ingestão diária aceitável

INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial

ISO: Organização Internacional de Padronização(International Organization for

Standardization)

JECFA: Comitê de Peritos em Aditivos Alimentares (Joint Expert Committee on Food

Additives)

LC: Cromatografia líquida (Liquid cromatography)

LOD: Limite de detecção

LOQ: Limite de quantificação

LMR: Limite máximo de resíduo

MAPA: Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

MOX Moxidectina

MS: Espectrometria de massas (Mass spectrometry)

MS/MS: Espectrometria de massas sequencial (mass spectrometry in tandem)

MSPE: Microextração em fase sólida (Micro-Solid Phase Extraction)

OIE Organização Mundial da Saúde Animal

PAMVET: Programa Nacional de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários

PC Peso corporal

PI: Padrão interno

PNCR: Plano Nacional de Controle de Resíduos

PNCRC: Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes

PTFE: Politetrafluoretileno

PVDF: Fluoreto de polivinilideno

QuEChERS Rápido, Fácil, Econômico, Efetivo, Robusto e Seguro (Quick, Easy, Cheap,

Effective, Rugged and Safe)

QqQ: Triplo Quadrupolo

SEBRAE: Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas Empresas

SPE: Extração em fase sólida (Solid phase extraction)

UV: Radiação ultraviolet

WHO: Organização Mundial de Saúde (World Health Organization)

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL

16

OBJETIVOS 20


de legislação

Revisão Bibliográfica 22

A ovinocultura no Brasil e no mundo. 22

Controle de resíduos de medicamentos veterinários e segurança alimentar 24

Lactonas Macrociclícas. 27

Moxidectina: natureza química e farmacológica. 29

Determinação de lactonas macrociclícas. 31

Considerações Finais 32

Referências 33



Resumo 39

Abstract 40

Introdução 41

Material e Métodos 43

Solventes e Reagentes 43

Preparo de Soluções 43

Equipamentos 43

Condições do Sistema LC-MS/MS 44

Preparo de amostras 45

Validação do método analítico 46

Resultados e Discussão 48

Otimização do método de extração 48

Validação analítica 49

Conclusão 59

Referências 65

CAPÍTULO III – Depleção dos resíduos da moxidectina em músculo, fígado

e rim de cordeiros

Resumo 64

Abstract 65

Introdução 66

Material e Métodos 67

Administração Subcutânea MOX 67

Resultados e Discussão 69

Depleção de resíduo do músculo (longe do local de aplicação), fígado e rim 69

Conclusão 73

Referências 73

DISCUSSÃO GERAL 76

CONCLUSÃO GERAL 77

REFERÊNCIAS 78

ANEXO 1- Aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais 88

ANEXO 2 - Moxidectin residues in lamb tissues: Development and Validation

of Analytical Method by LC-MS/MS. 87

ANEXO 3- An updated residue depletion study of moxidectin in lamb tissues

conducted using an ultra-high performance liquid chromatography-

tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) method. 110

16

INTRODUÇÃO GERAL

Os parasitas em animais da espécie ovina interferem na sua produtividade,

podendo ocasionar baixa produção e má qualidade da lã, baixo ganho de peso, baixa

eficiência alimentar e mortalidade nos rebanhos. Dentre os helmintos de maior

importância na ovinocultura brasileira destaca-se o Haemonchus contortus, endoparasita

de maior prevalência nos Estados de São Paulo (AMARANTE, 1995), Paraná (CUNHA

FILHO et al., 1998), Santa Catarina (PALOSCHI & RAMOS, 1991) e Rio Grande do

Sul (BORBA, 1996). Sendo assim, é necessário que se promovam medidas de controle

e profilaxia que minimizem estas infestações por nematódeos do trato gastrintestinal.

As lactonas macrocíclicas (LMs) são endectocidas de amplo espectro

(avermectinas e milbemicinas), largamente utilizadas em animais e em algumas

parasitoses de humanos (SHOOP et al., 1995). O seu mecanismo de ação no parasita se

baseia na atuação do ácido gama-aminobutírico (GABA), como agonista, aumentando a

permeabilidade dos íons cloro, resultando em paralisia muscular dos parasitas

(MELLIN et al., 1983).

A moxidectina, milbemicina obtida em 1990, apresenta amplo espectro

contra endo e ectoparasitos, sendo seu mecanismo de ação semelhante ao das demais

lactonas. É um antiparasitário com característica lipofílica, apresenta longo tempo de

permanência no organismo, assim como uma ampla distribuição em doses relativamente

baixas (PRICHARD et al., 2012). A resistência parasitária a esses fármacos encontra-se

disseminada ao redor do mundo nos rebanhos bovinos e também ovinos, reduzindo a

eficácia do tratamento e, por consequência, o retorno econômico dos tratamentos

antiparasitários (KAPLAN, 2004).

No Brasil, o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes

(PNCRC) nos Produtos de Origem Animal do Ministério da Agricultura e

Abastecimento (MAPA), constitui uma ferramenta de “Gerenciamento de Risco” com o

objetivo de promover a garantia de qualidade do sistema de produção de alimentos de

origem animal ao longo das cadeias produtivas, e prevê regulamentações para alguns

alimentos, como leite bovino, carne de frango, carne bovina, carne suína, pescado, ovos

e mel (BRASIL, 2012). A partir de 2013, por meio do Programa de Controle de

Resíduos e Contaminantes, estabelecido através da Instrução Normativa SDA nº17, de

31 de maio de 2013, as carnes de ovinos e caprinos passaram a fazer parte do PNCRC/

17

animal. No entanto, utilizam-se os parâmetros do Codex Alimentarius como referência

de LMR (BRASIL, 2015).

Os possíveis riscos à saúde humana, decorrentes do emprego de

medicamentos veterinários em animais de produção, podem estar associados aos seus

resíduos, nos produtos de origem animal destinados ao consumo, em concentrações

acima dos limites máximos recomendados (LMRs). Isto pode ocorrer quando o

emprego do produto não observa as Boas Práticas de Uso de Medicamentos

Veterinários, em especial quanto às especificações de uso. O conhecimento da dimensão

da exposição da população a esses compostos é de fundamental importância para

nortear as ações de controle, visando à proteção do consumidor (ANVISA, 2003). O uso

indiscriminado de anti-helmínticos, na tentativa de controlar as perdas no

desenvolvimento dos animais causadas pelas verminoses, leva ao desenvolvimento da

resistência aos fármacos de diferentes grupos químicos, utilizados no tratamento dos

animais.

Entre as técnicas utilizadas para determinação de resíduos de lactonas

macrocíclicas em matrizes biológicas, a cromatografia líquida de alta performance

acoplada ao detector de fluorescência (HPLC-FLD) é a mais comum. Porém, como a

evolução dos equipamentos é constante, a cromatografia líquida acoplada à

espectrometria de massa (LC-MS) se tornou uma ferramenta importante e muito

utilizada na determinação de resíduos de antiparasitários em diferentes matrizes, como

fígado (HOWELLS & SAUER, 2001; INOUE et al., 2009; KINSELLA et al., 2009;

NOPPE et al., 2009), músculo (INOUE et al., 2009; KAUFMANN et al., 2011), rim,

leite (TURNIPSEED et al., 2005; DURDEN, 2007; KINSELLA et al., 2009, WHELAN

et al., 2010; RUBENSAM et al., 2011) e gordura (INOUE et al., 2009), dentre outras.

Referências

AMARANTE, A.F.T. Atualidades no controle das endoparasitoses ovinas. In: Simpósio

Paulista de Ovinocultura, 4, Campinas-SP, 1995. Anais. Campinas, CATI-ASPACO,

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consumo- PAMVet. Brasilia, 2003. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/alimentos/pamvet/ pamvet.pdf. Acesso em: 06/03/2014.

18

BRASIL. 2013. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Plano Nacional

de Controle de Resíduos e Contaminantes em produtos de origem animal.

PNCRC/Animal. Disponível em: http://www.agricultura.gov.br/animal/qualidade-

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2010.

20

OBJETIVOS

1. Objetivo Geral

Desenvolver e validar método analítico para quantificação de resíduos de

moxidectina (MOX) em tecidos de cordeiro: músculo, fígado, rim e gordura, e avaliar a

depleção dos resíduos nas matrizes, músculo, fígado e rim.

2. Objetivos Específicos

2.1. Desenvolver o método analítico para identificação e quantificação da MOX

através da técnica de LC-ESI-MS/MS;

2.2. Otimizar o preparo de amostra;

2.3. Validar o método analítico;

2.4. Analisar as amostras de músculo (local de aplicação do fármaco-corte pernil e

longe do local de aplicação- corte lombo), fígado, rim e gordura;

2.5. Caracterizar a depleção dos resíduos da MOX nos tecidos de cordeiros.

21

CAPÍTULO 1

OVINOCULTURA: USO DE ANTI-HELMÍNTICOS, ASPECTOS ANALÍTICOS

E DE LEGISLAÇÃO

Michelle Del Bianchi; Alda Lúcia Gomes Monteiro; Felix G. R. Reyes

Artigo em preparação para ser submetido à revista Ciência Rural

22

Revisão Bibliográfica

A ovinocultura no agronegócio do Brasil e do mundo

Os ovinos foram uma das primeiras espécies de animais domesticadas pelo

homem. A sua criação destinou-se a ser mais uma fonte de alimento, principalmente de

carne e de leite, além da lã, fonte de fibra que servia como abrigo contra as intempéries

do ambiente. A ovinocultura está presente em praticamente todos os continentes. A

ampla difusão da espécie se deve principalmente ao seu poder de adaptação a diferentes

climas, relevos e vegetações. A criação de ovinos está destinada tanto à exploração

econômica como à subsistência das famílias de zonas rurais (VIANA, 2008).

A caprinocultura e a ovinocultura têm se destacado no agronegócio

brasileiro. A ovinocultura, em particular, tem representatividade nos Estados da Bahia,

Ceará, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul, Paraná e Mato

Grosso do Sul (MAPA, 2016). No ano de 2013, segundo dados da Confederação da

Agricultura e Pecuária no Brasil (CNA, 2014), a produção de ovinos foi comprometida

em função das estiagens na região Nordeste, onde estão 55,5% dos animais criados no

país. Para garantir o abastecimento interno, foi preciso recorrer às importações. As

regiões Sul e Centro-Oeste respondem por 30% e 6,4%, respectivamente, do rebanho; o

Sudeste, por 4,4%; e o Norte, por 3,6%. Ainda no mesmo ano, mesmo com perspectiva

de crescimento, a cadeia não se organizou, abrindo espaço para o mercado uruguaio.

O aumento do volume de importação da carne ovina do Uruguai aponta para

um mercado aquecido, oportunidade para os criadores brasileiros melhorarem as

condições de produção dos animais. Na Tabela 1, pode-se verificar os principais países

exportadores de ovinos e caprinos, com grande destaque aos países da América Latina,

como Uruguai, Chile e Argentina e do Continente Australiano, como Austrália e Nova

Zelândia.

Países como Austrália e Nova Zelândia são reconhecidos por

desenvolverem sistemas de produção de ovinos de alto rendimento. Suas criações,

altamente tecnificadas, visam à produção de carne e lã, o que os leva a controlar o

mercado internacional desses produtos, devido principalmente ao desenvolvimento de

técnicas produtivas e raças especializadas de animais que se difundiram pelo mundo,

dando impulso para exploração econômica mundial (VIANA, 2008).

23

Tabela 1. Principais exportadores de ovinos e caprinos

US$ Volume (toneladas)

Uruguai 25.780,80 5.418,80

Chile 1.397,00 182,7

Argentina 825,2 166,5

Nova Zelândia 256,7 24

Austrália 315,4 15,9

Total 28.575,2 5.808,00

Fonte: CNA (2014).

O Brasil possui condições climáticas favoráveis para criação de ovinos e

caprinos. As técnicas de produção, o abate informal, a desorganização no setor primário

e a falta de canais de comercialização impediram o maior crescimento no setor.

Na Tabela 2, observa-se a distribuição de consumo de carne de ovinos e

caprinos em vários países do mundo, no ano de 2009, verificando-se que o maior

consumo ocorre em países como Mongólia, Turcomenistão, Nova Zelândia e Islândia,

com média entre 19 e 49 kg/habitante/ano. Aspectos religiosos, tradição na atividade e

cultura da população são os principais fatores que determinam esse elevado consumo. O

consumo de carne ovina no Brasil nos últimos anos foi de 0,6 kg/habitante/ano (CNA,

2014), índice inferior quando comparado ao consumo da carne bovina que é 37 kg/ano

(SEBRAE/CE, 2013).

Tabela 2. Distribuição do consumo mundial (por habitante/ano) carne de ovinos e

caprinos

Ranking País 2009 (kg/Média per capta)

1º Mongólia 49,3

2º Turcomenistão 26,4

3º Nova Zelândia 23,2

4º Islândia 19,9

5º Kuwait 16,5

6º Grécia 13,1

7º Samoa 11,7

8º Austrália 11,5

9º Mauritânia 11,2

10º Emirados Árabes 10,8

11º República da Síria 9,9

12º Fiji 9,4

13º Kazaquistão 8,5

---- Brasil 0,6

Fonte: CNA (2014)

24

O cordeiro é a categoria de ovinos que oferece carne de excelente qualidade,

com maior eficiência produtiva devido à sua alta taxa de crescimento em idade jovem.

Na fase de crescimento, os cordeiros apresentam um rápido ganho de peso e,

consequentemente, as exigências nutricionais são maiores (RIBEIRO et al., 2006).

A carne ovina contribui na alimentação humana como fonte rica em

proteína, ferro, zinco, niacina e vitamina B, além de apresentar todos os aminoácidos

essenciais ao funcionamento orgânico. De maneira geral, pode-se dizer que 100 gramas

de qualquer corte de cordeiro (animal jovem) correspondem a menos de 200 calorias,

podendo se comparar à carne de caprinos (Tabela 3) (FRANCO, 2001).

Tabela 3. Valor nutricional da carne de cordeiro em comparação aos outros tipos de

carne (conteúdo por 100g).

Tipos de Carne Calorias (Kcal) Proteínas (%) Gorduras (%)

Cordeiro 163 19,3 9,5

Bovino 244 18,7 18,2

Suíno 216 15,5 16,6

Caprino 165 18,1 9,4

Frango 129 25 3,75

Fonte: FRANCO (2001).

Controle de resíduos de medicamentos veterinários e segurança dos alimentos

No Brasil, assim como em outros países do mundo, existe uma demanda

crescente por alimentos de melhor qualidade, em que os critérios de escolha entre um ou

outro alimento são as características que o produto apresenta, como sabor, cor,

suculência, padrão, garantia de origem e respeito ao meio ambiente, entre outras. O

consumo de carne ovina tende a aumentar. Todavia, enfatiza-se a importância de se

desenvolver produtos de acordo com os desejos dos consumidores e critérios de

qualidade.

A saúde animal, numa visão ampliada, envolve questões relacionadas a

enfermidades dos animais, saúde pública, controle dos riscos em toda a cadeia

alimentar, assegurando a oferta de alimentos seguros e bem estar animal. Para

assegurar a saúde animal, é necessária a existência de serviços veterinários bem

estruturados, capacitados e aptos para detecção e adoção precoce das medidas de

controle e erradicação das doenças.

25

Em sintonia com a Organização Mundial de Saúde Animal – OIE, que

reconhece os serviços veterinários como um bem público mundial, o serviço veterinário

brasileiro, responsável pela condução da política de saúde animal, compartilha com o

setor privado as responsabilidades para aplicação das medidas que objetivam a melhoria

da saúde animal (MAPA, 2016).

Segundo a União Europeia (EC, 1990), resíduos de medicamentos

veterinários são todas as substâncias farmacologicamente ativas, sejam elas princípios

ativos, excipientes ou produtos de decomposição e respectivos metabólitos, que

permanecem nos gêneros alimentícios provenientes de animais aos quais tenham sido

administrados os mesmos medicamentos.

O mercado brasileiro de medicamentos veterinários entre os anos de 2008 a

2016, vem aumentando o seu faturamento, respectivamente de R$ 2,5 a 5,5 bilhões de

reais, segundo o Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para saúde Animal

(SINDAN, 2017). Dentre a classe desses medicamentos, o uso de antiparasitários é o

mais comercializado, conforme a Figura 1. Isso representa que esse setor é de grande

importância para a saúde animal e consequentemente para o consumidor do produto

final que é a carne.

Figura 1. Classes terapêuticas no uso de medicamentos veterinários

Fonte: SINDAN (2017)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

2008 2010 2012 2014 2016

34% 32% 27% 26% 21%

24% 26% 25% 27% 31%

18% 16% 16% 15% 14%

8% 8% 10% 14% 15%

4% 4% 5%

8% 8%

13% 14% 17% 11% 11%

ANOS

Classes dos medicamentos veterinários

BIOLÓG. ANTIPARASIT. ANTIMICROB. TERAPÊUT. SUPLEM. OUTROS

26

Os possíveis riscos à saúde humana decorrentes do emprego de

medicamentos veterinários em animais produtores de alimentos podem estar associados

aos resíduos dos mesmos em níveis acima dos limites máximos de resíduos (LMR). Isto

pode ocorrer quando o emprego do produto não observa as Boas Práticas de Uso de

Medicamentos Veterinários, em especial, quanto às especificações de uso. O

conhecimento da dimensão da exposição da população a esses compostos é de

fundamental importância para nortear as ações de controle visando à proteção do

consumidor (ANVISA, 2003a).

Na União Europeia, os órgãos regulatórios exigem o monitoramento de

resíduos de fármacos veterinários em tecidos comestíveis de animais produtores de

alimentos para estabelecer o grau de conformidade com os regulamentos do LMR,

assegurando assim a segurança da cadeia alimentar (HOLWELLS & SAUER, 2001).

O LMR é definido como a concentração máxima de resíduo tolerável no

alimento. O mesmo está fundamentado no tipo e quantidade de resíduo que pode ser

ingerido diariamente, durante toda a vida, sem que provoque danos à saúde, ou seja,

baseia-se na Ingestão Diária Aceitável (IDA) do composto, expressa em mg/kg de peso

corporal. A determinação da IDA é dada nas informações toxicológicas disponíveis do

composto analisado na época da avaliação (PASCHOAL et al., 2008).

Os procedimentos executados no âmbito do PNCRC/Animal são compostos

pela amostragem homogênea e aleatória das diversas matrizes e espécies animais

monitoradas, bem como de análises laboratoriais realizadas nos laboratórios da Rede

Nacional de Laboratórios Agropecuários, composta pelos Laboratórios Nacionais

Agropecuários – LANAGROs e laboratórios privados ou públicos credenciados pelo

MAPA. As diretrizes, programas, planos de trabalho e ações correspondentes constam

no Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes em Produtos de Origem

Animal (PNCRC/Animal), instituído pela Instrução Normativa SDA N.º 11, de 22 de

maio de 2012, na qual prevê a regulamentações para alguns alimentos: leite bovino,

carne de frango, carne bovina, carne suína, pescado, ovos e mel (BRASIL, 2012).

Em 2013, através da Instrução Normativa de nº 17 de 31 de Maio, as carnes

de ovinos e caprinos foram incluídas para serem monitoradas pelo PNCRC/ animal.

Então, utilizam-se os parâmetros do Codex Alimentarius (2015) como referência de

LMR para a MOX.

O Codex Alimentarius é um programa conjunto da Organização das Nações

Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) e da Organização Mundial de Saúde

(OMS), que trata de um fórum internacional de normalização sobre alimentos

27

(PASCHOAL et al., 2008). Ele age como um gestor de risco e é responsável pelas

decisões finais no estabelecimento de LMR de medicamentos veterinários,

contaminantes e aditivos.

Na Tabela 4, observa-se o Limite Máximo de Resíduo (LMR) em tecidos,

estabelecidos pelo Codex Alimentarius para a MOX em ovinos.

Tabela 4. Valores de LMR de moxidectina em diferentes matrizes para a espécie ovina.

Medicamento Tecido Limite Máximo de

Resíduo (LMR)

Moxidectina

Fígado 100 µg/kg

Músculo 50 µg/kg

Tecido adiposo (gordura) 500 µg/kg

Rim 50 µg/kg

Fonte: Codex alimentarius (2015)

Lactonas Macrociclícas

Os derivados macrocíclicos da lactona, as avermectinas e milbemicinas,

utilizados como anti-helmínticos para o controle de parasitas, foram descobertos na

década de 1970 e comercializados no Brasil a partir de 1981. Pertencem a uma grande

família de compostos amplamente utilizados na criação de animais contra nematódeos e

artrópodes (HOLWELLS & SAUER, 2001; BORGES, 2003; PRICHARD et al., 2012).

As avermectinas são produzidas a partir do fungo Streptomyces avermitilis,

selecionado com base na atividade anti-helmíntica e inseticida. Ivermectinas (IVM) e

abamectinas (ABM) foram as primeiras lactonas macrocíclicas para uso em animais, o

que revolucionou o controle de parasitas na produção animal e na prevenção de

doenças. Posteriormente, foram descobertas a doramectina (DRM), eprinomectina

(EPM) e selamectina (SLM). A outra família das lactonas macrocíclicas corresponde às

milbemicinas, produzidas a partir do fungo Streptomyces hygroscopicus em 1967

(Figura 2). Em 1983, a MOX foi obtida a partir da modificação química da

nemadectina, substância natural produzida a partir da fermentação do Streptomyces

cyaneogriseus e subsequentemente comercializado (SPINOSA, 2006; PRICHARD et

al., 2012).

As avermectinas e as milbemicinas, que compreendem o grupo das lactonas,

são potenciais endectocidas, que mesmo em doses extremamente baixas, possuem o

28

mesmo mecanismo de ação e baseiam-se na interferência da transmissão dos impulsos

nervosos, causando paralisia no parasito (TORRANO, 2003; SPINOSA, 2006;

PRICHARD et al., 2012).

Figura 2. Esquema do desenvolvimento das avermectinas e milbemicinas.

Fonte: PRICHARDet al. (2012).

Haemonchus contortus é o nematódeo de maior patogenicidade que infesta

os ovinos. Os adultos desta espécie, além de se alimentarem de sangue, inoculam

substâncias anticoagulantes que provocam hemorragias, gastrites e erosão na mucosa do

abomaso, com consequente anemia. Este parasita ingere 0,08 mL de sangue por dia.

Animais com elevada carga parasitaria podem apresentar anemia, edema

submandibular, caquexia, prostração, podendo culminar em óbito (BUZULINI, 2006).

A Ivermectina (IVM) e abamectina (ABM) foram as primeiras lactonas

macrocíclicas desenvolvidas no início dos anos 1980 para utilização em animais. A

ivermectina, em particular, revolucionou o controle de parasitas em animais de

produção (PRICHARD et al., 2012).

Ivermectina (IVM), doramectina (DOR), eprinomectina (EPR), e

moxidectina (MOX), são compostos anti-helmínticos que podem ser administrados em

bovinos no combate a infestações parasitárias, como ascarídeos e ácaros. A aplicação

destes compostos pode ser por via oral ou injetável em bovinos, mas é comum o uso

tópico (PRICHARD et al., 2012).

AVERMECTINAS MILBEMICINAS

Abamectina

Ivermectina

Doramectina

Eprinomectina

Selamectina

Streptomyces

S. cyanogriseus

Nemadectina

Moxidectina

S. higroscopicus

Milbemicina 5-Oxima

Streptomyces

cyaneogriseus/higroscopicus

29

O tratamento com anti-parasitários de amplo espectro tem sido muito

importante para o controle de parasitas internos em pequenos ruminantes nas últimas

décadas. No entanto, a dependência de anti-helmínticos tem impulsionado o

desenvolvimento rápido de resistência do parasita, após a introdução de novas classes

deste tipo de medicamento no mercado. Para cada nova classe, a resistência

desenvolveu-se em pelo menos uma das espécies de nematódeos importantes de ovelhas

e cabras, dentro de poucos anos (LITTLE et al., 2011). Seu uso intensivo, subdoses,

diagnósticos incorretos e a rotatividade de bases farmacológicas sem critérios, têm

provocado um sério problema sanitário, que é a resistência de nematoides aos fármacos.

Este fenômeno é definido como a capacidade hereditária de uma população parasitária

de reduzir a sua sensibilidade à ação de uma ou mais drogas (FIEL, 2003). O problema

da resistência anti-helmíntica chegou a um patamar que não pode mais ser ignorado

como questão importante no controle de parasitas em animais (KAPLANA &

VIDYASHANKARB, 2012).

Moxidectina: natureza química e farmacológica

A estrutura molecular das avermectinas e das milbemicinas é semelhante e

ambas pertencem ao grupo das lactonas macrocíclicas (LM). Elas apresentam uma

estrutura cíclica principal composta por 16 elementos, incluindo o grupamento éster, o

qual confere a classificação de lactona. Possuem também um grupamento espiroacetal

no carbono C17 e um anel benzofurânico. No caso das avermectinas, há ainda a

presença de um grupo dissacarídeo no carbono C13, o que as diferencia das

milbemicinas (Figura 3) (MCKELLAR & BENCHAOUI, 1996, LIFSCHITZ et al.,

2002).

As propriedades físico-químicas das lactonas macrocíclicas incluem uma

alta massa molecular e elevada lipofilicidade, o que confere características

farmacocinéticas de um grande volume de distribuição, com grande afinidade por

gorduras corpóreas e prolongada persistência de concentração no organismo

(McKELLER & BENCHAOUI, 1996).

A MOX é a milbemicina com maior uso no gado bovino para o tratamento

dos endo e ectoparasitas. É ativa em doses extremamente baixas, contra uma ampla

variedade de nematoidese artrópodes nos estágios maduros e imaturos (EGERTON et

al., 1979; RODRÍGUES-VIVAS et al., 2010). É também indicada e amplamente usada

em ovinos (McKELLAR & JACKSON, 2004). Esta substância, obtida sinteticamente a

30

partir da nemadectina, apresenta uma substituição do grupamento hidroxila no C23 por

um grupamento metiloxima (LIFSCHITZ et al., 1999).

A MOX é um fármaco que pode ser usado em doses terapêuticas de 0,2 a

1,0 mg/kg de peso corporal em ovinos, sem apresentar reações adversas (RODRÍGUES-

VIVAS et al, 2010).

21

23

O

CH3

R3

O

OO

CH3

O

CH3 CH3

OH

R2

O

CH3

R1

O

OCH3

O

OO

O

OH

CH3

CH3

CH3

1

2 3

4

5

6

78

10

12

14

16

17

19

AVERMECTINA

espiroacetal

dissacarídeo

anel benzofurânico

Figura 3. Estrutura das lactonas macrocíclicas.

MOX é um composto que apresenta característica lipofílica maior que a

ivermectina e é principalmente armazenado no tecido adiposo (RODRIGUES-VIVAS et

al., 2010). Como consequência, possui efeito acumulativo e resulta em maior tempo

médio maior de permanência do fármaco no organismo, como tem sido demonstrado em

bovinos (ESCUREDO et al., 1999), ovinos (ALVINERIE et al., 1998) e caprinos

(ESCUREDO et al., 1999). A biotransformação ocorre no fígado e o composto, na

forma inalterada, é o principal resíduo encontrado na gordura e no leite em bovinos,

ovinos e equinos, sendo identificados apenas dois metabólitos (2%), o C-29

hidroximetil e o C-14 hidroximetil, na gordura e no leite (SPINOSA, 2006).

Os anti-helmínticos são absorvidos através do estômago e intestino

(preparações orais), do tecido subcutâneo e muscular (preparações injetáveis) e da pele

(pour-on), penetrando na circulação sistêmica. São transportados para diferentes tecidos

e órgãos, particularmente para o fígado, onde são biotransformados e posteriormente

31

excretados nas fezes e urina. A biotransformação e a excreção dos anti-helmínticos

varia entre as espécies animais e pode ser influenciada pela dose, via de administração e

propriedades físico-químicas (constantes de dissociação, solubilidade e peso molecular)

(SPINOSA, 2006).

O mecanismo de ação da MOX é de maneira semelhante a todas as lactonas.

Ela atua como agonista do GABA (ácido gama-aminobutírico), neurotransmissor das

células nervosas, estimulando a liberação pré-sináptica deste neurotransmissor, pelo

aumento de sua ligação aos receptores pós-sinápticos e também se liga aos canais de

cloro. Deste modo, o canal de cloro é aberto, aumentando a condução intracelular do

neurotransmissor, alterando a membrana do neurônio hiperpolarizando-a, resultando na

paralisia motora e eliminação do parasito (SPINOSA, 2006; AWASTHI et al., 2013).

Em relação à excreção, a MOX é excretada primeiramente nas fezes, com

um pico de excreção plasmática de aproximadamente 25 horas. Após a administração de

200 µg/kg, pelas vias oral e subcutânea, o pico plasmático foi de 6,5 ng/mL e 75 ng/mL,

respectivamente. O tempo de permanência da MOX nos tecidos foi também mais

prolongado quando aplicada por via subcutânea. A meia vida de eliminação no tecido

adiposo foi maior do que a ivermectina, entre 12 e 15 dias (MACKELLAR &

BENCHAOUI, 1996; SPINOSA, 2006).

Determinação das lactonas macrociclícas

O amplo uso de produtos antiparasitários em animais de produção e a

necessidade de assegurar a qualidade e inocuidade dos alimentos provenientes dos

mesmos levaram ao desenvolvimento de técnicas e metodologias mais sensíveis e

precisas para a determinação destes fármacos nos diferentes tecidos animais (SILVA,

2008).

Utilizando a técnica de ionização por electrospray (ESI), as avermectinas

são ionizadas preferencialmente no modo positivo, formando íons adutos de amônio

[M+NH4+] ou sódio [M+Na]

+. No modo negativo, formam principalmente íons

moleculares do tipo [M–H]-. Para essa fonte de ionização, o autor indica a aplicação do

modo negativo para substâncias que contém somente carbono, hidrogênio e oxigênio

nas suas estruturas, como ABA, a DORA e IVER. Para as demais substâncias que

apresentam nitrogênio nas suas estruturas, como EPR, MOX e EMA, o modo positivo

pode apresentar maior sensibilidade, sempre sendo considerados os diferentes aditivos

nas fases móveis (DURDEN, 2007).

32

A espectrometria de massa (EM) é uma ferramenta para o desenvolvimento

de métodos mais rápidos e sem a necessidade de derivatização dos analitos, os quais

tendem a ser instáveis e exigem processos laboriosos de preparo de amostra. A EM

permite trabalhar com um preparo de amostra mais simples, requerendo poucos passos

de purificação, além de possibilitar a análise quantitativa e confirmatória de analitos em

uma grande variedade de matrizes.

A cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massas triplo

quadrupolo (LC-MS/MS), através do monitoramento de ions em modo MRM

(monitoramento de reações múltiplas, do inglês multiple reaction monitoring), tem sido

a técnica mais difundida para a quantificação de resíduos de fármacos veterinários em

tecidos animais. Especialmente para a quantificação de resíduos de avermectinas e

milbemicinas, diversos trabalhos estão relatados na literatura, relacionados à

determinação desses fármacos em diversas matrizes como músculo (WANG et al.,

2001; SATO et al., 2003; INOUE et al., 2009;NOPPE et al., 2009; KAUFFMAN et

al.,2011), Fígado (WANG et al., 2001; INOUE et al.,2009; NOPPE et al. ,2009;

KINSELLA et al., 2010;), rim, leite (WANG et al., 2001; WHELAN et al., 2010;

KAUFFMAN et al. ,2011; RUBENSAM et al., 2011) e gordura (STOUT et al., 2000;

SATO et al., 2003; INOUE et al., 2009).

Considerações Finais

O Brasil possui grandes potencialidades para se tornar grande produtor de

ovinos. Problemas relacionados à sanidade na ovinocultura podem ser amenizados com

a adoção das boas praticas de manejo na produção, tendo com isso benefícios

econômicos.

As verminoses gastrointestinais são consideradas o principal problema

enfrentado pelos criadores de ovinos. A utilização de métodos inadequados no combate

à verminose vem gerando a resistência dos parasitas aos vermífugos. Questões

relacionadas à existência de resíduos de medicamentos veterinários em carnes são cada

vez mais frequentes e o desenvolvimento de métodos analíticos adequados e sensíveis

para a determinação de resíduos de fármacos em tecidos é uma ferramenta essencial

para este tipo de estudo.

A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas é uma técnica

que tem sido utilizada com grande frequência em determinação de resíduos de fármacos

veterinários em tecidos de cordeiros pelas vantagens que oferece, como confirmação da

presença da substância, seletividade, detectabilidade, dentre outras.

33

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38

CAPÍTULO II

Desenvolvimento e validação de método analítico para quantificação de

moxidectina em tecidos de cordeiro

Michelle Del Bianchi, Maria A. M. Fernandes, Patricia A. de C. Braga,

Alda L. G. Monteiro, Daniela Daniel, Felix G. R. Reyes

Artigo em preparação para ser submetido ao Journal of Chromatography B

39

RESUMO

Moxidectina (MOX) é um anti-helmíntico comumente utilizado na ovinocultura para o

tratamento de endo e ectoparasitoses. Haemonchus contortus é o nematódeo de maior

patogenicidade que acomete os ovinos e que pode provocar hemorragias, gastrites e

erosão na mucosa do abomaso, com consequente anemia no animal. O uso intensivo de

anti-helmínticos, subdoses e diagnósticos incorretos tem provocado um sério problema

sanitário, que é a resistência dos nematoides aos fármacos. Neste trabalho, foi

desenvolvido e validado um método para determinar os resíduos de MOX em tecidos de

cordeiro (músculo, fígado, rim e gordura) utilizando a cromatografia líquida acoplada à

espectrometria de massas (LC-MS/MS). No preparo de amostra foi empregado o

método QuEChERS com modificações. A técnica de LC-ESI-MS/MS foi extremamente

eficiente para a quantificação dos resíduos da MOX devido a sua alta seletividade e

sensibilidade. O método apresentou exatidão, precisão e linearidade adequadas com

base nas recomendações descritas nos guias de validação utilizados como referências.

Além disso, mostrou boa detectabilidade, tendo sido estabelecido um limite de

quantificação (LOQ) de 5,0 ng g-1

e limite de detecção (LOD) 1,5 ng g-1

, para todas as

matrizes. Os valores de recuperação do analito, frente às diferentes matrizes estudadas,

estiveram entre 71-120% e coeficientes de correlação (r) obtidos nas curvas analíticas

foram superiores a 0,99. O método de extração se mostrou eficiente, tendo sido

estabelecido o mesmo preparo de amostra para todas as matrizes. Além disso, foram

realizados teste de estabilidade do analito (solução e amostra) nos quais os resultados se

mostraram satisfatórios.

Palavras-chave: Moxidectina, tecidos de cordeiro, QuEChERS, LC-ESI-MS/MS.

40

ABSTRACT

Moxidectin (MOX) is an anthelmintic commonly used in the lamb farming for the

treatment of endo and ectoparasites. Haemonchus contortus is the most pathogenic

nematode that affects the animals and can cause bleeding, gastritis and erosion in the

lining of the abomasum, leading to the development of anemia in the animals. The

intensive use of anthelmintics, underdosing and misdiagnosis has caused a serious

health problem, which is the resistance of nematodes to the drugs. In this study, an

analytical method for quantitation of MOX residues in lab tissues (muscle, liver, kidney

and fat) was developed and validated using liquid chromatography-mass spectrometry

(LC-MS/MS). The sample preparation was carried out by the QuEChERS extraction

method with some modifications. The technique LC-ESI-MS/MS was extremely

efficient for the quantitation of MOX residues, due to its high selectivity and sensibility.

The method showed appropriate accuracy, precision and linearity, based on

recommendations described in the validation guides used as a reference. In addition, it

showed good detectability, having been established a limit of quantitation (LOQ) of 5.0

ng g-1

and limit of detection (LOD) of 1.5 ng g-1

, the recoveries achieved were between

71-120% and the correlation coefficients (r) achieved in the calibration curves were

higher than 0.99. Also, analyte stability tests (solution and sample) were performed in

which the results were satisfactory.

Key words: Moxidectin, lamb tissues, QuEChERS, LC-ESI-MS/MS

41

Introdução

As avermectinas e milbemicinas, derivadas de lactona macrocíclica

utilizadas como anti-helmínticos para o controle de parasitas (nematódeos e parasitas

artrópodes), pertencem a uma grande família de compostos amplamente utilizados na

criação de animais (HOWELLS & SAUER, 2001; BORGES, 2003; PRICHARD et al.,

2012).

As avermectinas são produzidas a partir do fungo Streptomyces avermitilis,

selecionado com base na atividade anti-helmíntica e inseticida. Ivermectina (IVM) e

abamectinas (ABM) foram as primeiras lactonas macrocíclicas descobertas no início

dos anos 80 para uso em animais, e que revolucionaram o controle de parasitas na

produção e prevenção de doenças animais. Posteriormente, foram descobertas a

doramectina (DRM), eprinomectina (EPM) e selamectina (SLM). A outra família das

lactonas macrocíclicas são chamadas de milbemicinas, produzidas a partir do fungo

Streptomyces hygroscopicus (PRICHARD et al., 2012).

Em 1983, a moxidectina (MOX) foi obtida a partir da modificação química

da nemadectina, substância natural produzida através da fermentação do Streptomyces

cyaneogriseus. A MOX, em relação à nemadectina, apresenta uma substituição do

grupamento hidroxila em C23 por um grupamento metiloxima (LIFSCHITZ et al.,

1999; SPINOSA, 2006; PRICHARD et al., 2012).

Figura 1: Diferenças estruturais entre nemadectina e moxidectina

Anastassiades e colaboradores (2003) desenvolveram uma técnica de

preparo de amostra para análise multirresíduo de agroquímicos em alimentos de origem

vegetal, denominado QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). O

21

2223

24

Moxidectina

O

CH3 CH3

CH3

O

OO

CH3

O

CH3 CH3

OH

N

H

OHH

CH3H

OCH3

H

O

CH3 CH3

CH3

O

OO

CH3

O

CH3 CH3

OH H

OHH

CH3H

OH

H

21

2223

24

Nemadectina

42

método apresenta como vantagens ser rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e

seguro, consistindo em um procedimento dinâmico que pode ser aplicado em qualquer

laboratório. O método consiste na extração com solventes orgânicos, seguida por

partição líquido-líquido com adição de sais para efeito salting-out, tamponamento

quando necessário, secagem e finalmente uma etapa de clean-up. Com objetivo de

atender a rigorosos LMRs, estabelecidos por legislações internacionais, este método de

preparo da amostra foi idealizado para gerar extratos que pudessem ser analisados por

cromatografia líquida e/ou cromatografia gasosa, acopladas a espectrometria de massas

(GC-MS/MS e LC-MS/MS) (ANASTASSIADES et al., 2003). Todavia, embora seja

um método oficial para resíduos de agroquímicos em alimentos pela Association of

Official Analytical Chemists (AOAC) e pelo European Committee for Standardization,

o método QuEChERS tem sido amplamente empregado na extração de outros tipos de

analitos como fármacos, acrilamida e micotoxinas, assim como na análise de matrizes

alimentícias de origem animal (PRESTES et al., 2009).

Trapero-Pimentel et al. (2016), determinaram lactonas macrocíclicas (ABA,

IVER, DORA e MOX) em tecido de fígado bovino, usando HPLC-FLD. Os analitos

foram extraídos utilizando o método QuEChERS. Embora no método utilizado tenha

sido necessária uma etapa de derivatização, a qual o torna mais demorado, os autores

consideraram o método de extração rápido e simples podendo ser utilizado em análise

de rotina. Outros autores também, utilizaram esse método através da técnica de LC-

MS/MS para determinação das lactonas em carnes (RUBIES, et al., 2015), produtos

lactéos (FURLANI, et al., 2015) e em fígado bovino (KINSELLA, et al., 2010).

Diversos trabalhos têm usado a espectrometria de massas para a

quantificação de resíduos de avermectinas e milbemicinas em músculo (WANG et al.,

2001; SATO et al., 2003; INOUE et al., 2009; NOPPE et al., 2009; KAUFFMAN et al.,

2011), fígado (WANG et al., 2001; INOUE et al., 2009; KINSELLA et al., 2010;

NOPPE et al., 2009), rim, leite (WANG et al., 2001;WHELAN et al., 2010;

KAUFFMAN et al., 2011; RUBENSAM et al., 2011) e gordura (STOUT et al., 2000;

SATO et al., 2003; INOUE et al., 2009).

O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de

método analítico (LC-MS/MS), para a quantificação da MOX em músculo, fígado, rim

e gordura de cordeiros utilizando no preparo da amostra o método QuEChERS com

algumas modificações.

44

Materiais e Métodos

Solventes e Reagentes

Acetonitrila (ACN) marca J.T. Baker (Philipsburg, USA) foi utilizada no

preparo de fase móvel e também no procedimento de extração das amostras. Ácido

fórmico e solução de formiato de amônio 5 M, utilizados no preparo de fase móvel,

foram fornecidos pela Agilent Technology. Sulfato de magnésio (MgSO4) e cloreto de

sódio (NaCl) foram obtidos da Sigma (Sigma-Aldrich Co. - USA). Para o cleanup

foram utilizados kits fornecidos pela Agilent Technology (Part. Nº5982-5022CH),

contendo PSA (amina primária secundária) e MgSO4 (nas proporções 50:150 mg) e

outro kit (Part. Nº 5982-5122CH), contendo PSA, C18 (octadecilsilano) e MgSO4 (nas

proporções 50:50:150 mg). Água ultra-pura foi obtida pelo sistema Milli-Q Simplicity

(Millipore, Bedford, MA, USA). As membranas de filtração de politetrafluoretileno

(PTFE) de 0,22 µm de porosidade foram adquiridas da empresa Nova Analítica e

utilizadas na filtração dos extratos da amostra.

Os padrões analíticos utilizados no projeto foram emamectina (EMA),

utilizada como padrão interno e MOX (Sigma-Aldrich), com grau de pureza de 99,7% e

97,2%, respectivamente.

Preparo de Soluções

As soluções estoque foram preparadas em ACN na concentração de 55 g

mL-1

para MOX e 60 g mL-1

para EMA, armazenadas em frascos âmbar e mantidas em

freezer a temperatura de -20 ºC, por até 90 dias.

As soluções de trabalho foram preparadas pela diluição apropriada das

soluções estoque em acetonitrila, sendo para MOX preparadas soluções nas

concentrações de 1,0 g mL-1

e 2,0 µg mL-1

e para EMA (padrão interno) 50,0 ng mL-1

e 100,0 ng mL-1

. As soluções foram armazenadas a -20 ºC, por até 15 dias.

Equipamentos

Para pesagem das amostras e dos padrões analíticos foi utilizada balança

analítica, modelo BL 2105 (Sartorius, Alemanha). A trituração das amostras foi

realizada em processador de alimentos modelo RI2086, marca Philips Walita (Barueri,

São Paulo), e a homogeneização foi feita utilizando-se um agitador de tubos tipo vortex

45

modelo G560 (DAIGGER-USA). Centrífuga refrigerada marca Eppendorf, modelo

5810R (Hamburg, Alemanha) foi utilizada na obtenção dos extratos.

As análises foram realizadas em sistema LC da Agilent modelo 1290,

composto por bombas quaternárias, injetor automático, termostato para coluna e para

amostrador acoplado a um espectrômetro de massas triplo quadrupolo modelo 6460

(Agilent Technology, CA, USA) usando ESI (Electrospray Ionization) como fonte de

ionização no modo positivo. O software de controle de aquisição e tratamento dos dados

foi o MassHunter (Agilent Technology, CA, USA), versão B.06.00.

Condições do sistema LC-ESI-MS/MS

A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna analítica

Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD (2,1 x 50 mm, 1,8 µm), Agilent Tecnhologies®,

mantida em forno com temperatura controlada de 30ºC. Utilizou como fase móvel um

gradiente de solução de formiato de amônio 5 mM + 0,1% de ácido fórmico (A) e

acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico (B), conforme Tabela 1. As condições de eluição

foram otimizadas com fluxo de 0,5 mL min-1

, volume de injeção de 5 µL e temperatura

do forno de 30 0C.

Tabela 1.Composição da fase móvel e gradiente utilizado.

Formiato de Amônio 5 mM

+ 0,1% Ácido Fórmico

Acetonitrila +

0,1% Ácido Fórmico

Tempo (min.) % A % B

0 45 55

1,50 45 55

1,51 5 95

4,50 5 95

4,51 45 55

6,00 45 55

A quantificação da MOX foi realizada em modo MRM (multiple reaction

monitoring), com utilização de emamectina como padrão interno. Foram monitoradas

duas transições para cada molécula, sendo uma transição relacionada ao íon

quantificador e outra relacionada ao íon qualificador, com objetivo de obter pelo menos

3 pontos de identificação, como preconizado pelo Guia da Comunidade Europeia

2002/657/CE (EC, 2002). Na Tabela 2 são apresentados os parâmetros da fonte de

46

ionização e energia de colisão que foram adotados para o método de determinação de

resíduos de MOX.

Tabela 2: Parâmetros de fonte de ionização (ESI modo positivo) utilizados

Parâmetro

Gas Temp. 200◦C

Gas Flow 10 Lmin-1

Nebulizer 15 psi

Sheat Gas Temp. 400◦C

Sheat Gas Flow 12 Lmin-1

Capillary 5000 v

Nozzle Voltage 2000 v

Fragmentor 120 v

Molécula Transição Energia de Colisão (v)

Emamectina 886,5 158,0 40

886,5 126,1 48

Moxidectina 640,4 528,0 4

640,4 498,0 8

Preparo da amostra

Neste trabalho o preparo da amostra foi realizado conforme o método

QuEChERS (Anastassiades et al., 2003), porém com modificações conforme descrito a

seguir:

Amostras dos tecidos (músculo, fígado, rim e gordura) foram trituradas

individualmente, ainda congeladas, em microprocessador. A seguir, foram pesadas 2,0 g

de amostra em tubos de polipropileno de 50 mL, e adicionados 20 µL da solução de

trabalho contendo o padrão interno (100 ng mL-1

). Em seguida foram adicionados 2 mL

de ACN e uma cerâmica de homogeneização (Part. Nº 5982-9313, Agilent

Technologies®), e os tubos foram submetidos a agitação em vórtex por 5 min. Em

seguida 0,8 g de MgSO4 e 0,2 g de NaCl foram adicionados, agitando-se o tubo em

vórtex por mais 5 min antes da centrifugação a 10.000 g, por 5 min, a 25 ºC. Uma

alíquota de 1,0 mL foi transferida para um microtubo contendo MgSO4 e PSA (150:50

mg) para realização do cleanup das amostras de músculo, fígado e rim. Agitou-se em

vórtex por 30 segundos e em seguida a amostra foi centrifugada a 10.000 g, por 1 min, a

25 ºC. O sobrenadante foi filtrado em membranas de PTFE diretamente no vial do LC, e

injetado no sistema LC-MS/MS. Para análise da gordura, o preparo de amostra foi

47

realizado seguindo o mesmo procedimento, porém na etapa de clean-up foi adicionado

C18 tendo-se, assim, utilizado PSA, C18 e MgSO4 na proporção de 50:50:150 mg,

respectivamente.

Validação do método analítico

Os procedimentos de validação adotados no Brasil baseiam-se em guias

disponibilizados por órgãos credenciados nacionais, como a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA, 2003), o Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento- MAPA (BRASIL, 2011) e o Instituto Nacional de Metrologia,

Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO, 2007). Outros órgãos internacionais,

como União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC), Organização

Internacional para Padronização (ISO), Conferência Internacional de Harmonização

(ICH), Comunidade Europeia (EC), Organização das Nações Unidas para Alimentos e

Agricultura (FAO), a Agência Norte-Americana de Administração de Drogas e

Alimentos (FDA), também estabelecem procedimentos de validação como critério

fundamental no credenciamento de laboratórios (PASCHOAL et al., 2008). A validação

do método analítico deve garantir, através de estudos experimentais, que o método

desenvolvido atenda as exigências das aplicações pretendidas, assegurando a

confiabilidade dos resultados (ANVISA, 2003).

O método desenvolvido para a quantificação de resíduos de MOX em

tecidos de cordeiro foi validado seguindo as recomendações do Guia de Validação de

Métodos Analíticos estabelecido pelo MAPA (BRASIL, 2011), pela Comunidade

Europeia (EC, 2002) e pelo VICH (2011), no estabelecimento de critérios de

desempenho para métodos analíticos, destinados à determinação de resíduos e

contaminantes em alimentos de origem animal. Para tanto foram estabelecidos os

seguintes parâmetros: linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão intra e interdias,

exatidão, limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ), limite de

quantificação (LOQ) e limite de detecção (LOD).

Para a validação do método analítico, a fortificação dos tecidos foi realizada

com soluções de trabalho nas concentrações de 1000 e 2000 ng mL-1

de MOX e 50 e

100 ng mL-1

de EMA. Dessa forma, para cada nível de fortificação diferentes alíquotas

da solução de trabalho foram tomadas para obter a concentração desejada. Sendo que a

solução mais concentrada do padrão interno foi para preparar a curva na matriz.

48

A seletividade do método foi avaliada por comparação do cromatograma

obtido na análise das amostras branco de músculo, fígado, rim e gordura (n = 10) e das

matrizes fortificadas no LOQ (5 ng g-1

), verificando-se a ausência de interferentes

coeluindo com os analitos (MOX e EMA), ou próximo ao tempo de retenção.

A linearidade e sensibilidade foram estabelecidas a partir de curvas

analíticas dos padrões de MOX e EMA, preparadas em solvente, no extrato da amostra

branco, e através da fortificação da matriz branca propriamente dita na faixa de

concentração de 5 a 200 ng mL-1

e ng g-1

para cada tecido. Os resultados de linearidade

e sensibilidade foram expressos através dos coeficientes de correlação linear (r) obtidos

e pela inclinação da curva analítica, dada pelos coeficientes angular (b),

respectivamente.

O efeito matriz foi avaliado pela realização dos testes F e t de Student e os

efeitos obtidos para cada um dos analitos foram expressos em porcentagem. Para o

cálculo, foram comparados os resultados obtidos para o extrato fortificado, nos níveis

de concentração correspondentes a 5; 50; 100 e 200 ng mL-1

de extrato, com os

resultados obtidos para os mesmos níveis de concentração dos analitos em solvente.

A precisão do método foi determinada em duas situações: (i) repetibilidade

(precisão intradia) e (ii) a reprodutibilidade (precisão interdia). A precisão foi avaliada

nos seguintes níveis de fortificação: 5; 50; 100 e 200 ng g-1

, em 6 replicatas para cada

nível. A repetibilidade foi expressa pelo coeficiente de variação (CV %) dos resultados

de cada nível de fortificação, analisados no mesmo dia e usando o mesmo instrumento.

A reprodutibilidade também foi expressa pelo CV % dos resultados das análises

realizadas em três dias diferentes (n = 18), pelo mesmo analista, usando o mesmo

instrumento.

A exatidão foi avaliada através do teste de recuperação da matriz fortificada,

em 4 níveis de fortificação 5; 50; 100 e 200 ng g-1

. Cada nível de fortificação foi

avaliado utilizando 6 replicatas. Os resultados foram expressos como a percentagem das

concentrações médias fortificadas na matriz em relação a concentração fortificada no

extrato na mesma concentração.

Os limites de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) foram

estabelecidos através da análise da matriz fortificada com solução padrão de MOX. O

LOD foi expresso como a menor concentração cujo sinal equivale a 3 vezes a relação

sinal/ruído, enquanto que o LOQ foi estabelecido como menor concentração capaz de

produzir um sinal equivalente no mínimo, 10 vezes a relação sinal/ruído, com CV%

49

menor do que 20 % e exatidão entre 80-120%, conforme preconizado no guia do MAPA

(2011) e da Comunidade Europeia (EC, 2002).

Os valores de CCα e CCβ foram calculados utilizando-se os resultados da

curva analítica matrizada. CCα foi calculado como a concentração correspondente ao

LMR mais 1,64 o desvio padrão da reprodutibilidade, adotando-se erro igual à 5%. O

CCβ foi calculado como a concentração equivalente a CCα mais 1,64 vezes o desvio

padrão da reprodutibilidade, adotando-se erro β igual à 5%.

Os estudos de estabilidade visam avaliar se o analito sofre ou não influência

das condições de análise e estocagem das amostras (ANVISA, 2012). Foram realizados

dois testes de estabilidade durante a validação e na avaliação da robustez de alguns

parâmetros:

Estabilidade de curta duração: que tem como objetivo avaliar se o analito em

estudo permanece estável na matriz biológica nas condições de temperatura,

luminosidade e umidade presentes no laboratório. Neste caso as amostras foram

fortificadas no LMR de cada matriz e deixadas sobre a bancada por 4 horas e após esse

período as mesmas foram submetidas ao processo de extração e análise.

Estabilidade de ciclos de gelo e degelo: que tem como objetivo, avaliar se o

analito permanece estável após 3 ciclos de congelamento e descongelamento na matriz..

As amostras foram fortificadas e congeladas por 24 horas e então descongeladadas

novamente por 12 horas e posteriormente congeladas. Este processo foi repetido durante

3 ciclos, 24, 48 e 72 horas.

A robustez de um método determina sua sensibilidade a pequenas variações.

Um método diz-se robusto quando se revelar praticamente insensível a pequenas

variações intrínsecas da própria análise que possam ocorrer quando o mesmo está sendo

executado (BRASIL, 2011). Foi realizado o teste de robustez em relação ao fluxo da

fase móvel e a temperatura da coluna.

Resultados e Discussão

Otimização do método

O preparo da amostra consiste na obtenção do extrato representativo da

mesma. Deve ser conduzido de modo a extrair o máximo do analito de interesse sem

perdas e alterações em sua estrutura química. A homogeneização é uma etapa

indispensável em qualquer análise, pois a alíquota analisada precisa representar todo

material amostral. A fim de se evitar qualquer degradação do analito decorrente do

50

calor, utiliza-se a amostra ainda congelada ou parcialmente congelada. Deve-se utilizar

a menor quantidade de amostra representativa, de modo a reduzir o volume de solventes

e reagentes necessários (KOWALSKI et al., 2005).

Neste trabalho, para a extração dos resíduos de MOX em tecidos de cordeiro

(músculo, fígado, rim e gordura), foi utilizado o método QuEChERS (Quick, Easy,

Cheap, Effective, Rugged, Safe) proposto por Anastassiades et al., (2003), porém com

modificações.

No método original QuEChERS, os resíduos de agroquímicos são extraídos

a partir de 10 g de amostra com 10 mL de ACN. A remoção da água do extrato e o

aumento da extração de analitos polares pelo efeito salting out são promovidos pela

adição de 1 g de cloreto de sódio e 4 g de sulfato de magnésio. Após esta extração, uma

alíquota de 1 mL do extrato é submetida a etapa de clean-up e redução de água residual

com 25 mg do sorvente amina primária-secundária (PSA) e 150 mg de sulfato de

magnésio.

A fim de obter um método de baixo custo e que utilize menor quantidade de

solvente, optou-se em utilizar 2 g de amostra para 2 mL de ACN, utilizando também os

sais na mesma proporção do método original. A ACN é um solvente muito utilizado

para a extração de resíduos de MOX em diversos tecidos (KINSELLA et al., 2009;

NOPPE et al., 2009; WANG et al., 2011), proporcionando uma menor quantidade de

coextrativos lipofílicos provenientes da amostra e é compatível com o sistema

cromatográfico utilizado.

Devido à alta complexidade das matrizes, (ricas em água, proteínas, gordura

e minerais), após a extração, foram realizados testes com e sem clean-up, utilizando

PSA e C18.

O PSA possui um elevando efeito quelante, devido à presença dos grupos

amino primário e secundário em sua estrutura, retendo, portanto, ácidos graxos livres,

açucares e compostos polares presentes na matriz. O sorvente C18 promove uma

limpeza mais efetiva em matrizes que contem elevado teor de gordura, tendo uma boa

eficiência na remoção de compostos apolares como lipídeos e ácidos graxos de cadeia

longa. Por essa razão, fez-se o uso destes dois sais juntamente com o sulfato de

magnésio no processo de limpeza do extrato (PRESTES et al, 2009).

Somente na matriz gordura foi necessário o uso de C18 no procedimento de

limpeza do extrato, já nas outras matrizes apenas o PSA foi utilizado obtendo-se bons

51

resultados de recuperação. O uso do sulfato de magnésio em todas as matrizes foi

fundamental devido a sua maior capacidade da remoção de água.

Validação analítica

Para validação do método optou-se por seguir os guias disponibilizados pela

Comunidade Europeia (EC, 2002), MAPA (2011) e VICH (2011) que versam, entre

outros assuntos, sobre a validação de métodos bioanalíticos.

As amostras brancas utilizadas para o desenvolvimento do método analítico

foram extraídas e seus extratos avaliados quanto à presença de interferentes que

pudessem comprometer o método. Nenhum interferente foi detectado, nos tempos de

retenção correspondentes a MOX e EMA, em nenhum dos tecidos analisados (músculo,

fígado, rim e gordura), garantindo a seletividade e especificidade do método

desenvolvido, assim como a viabilidade das amostras brancas serem utilizadas na

validação do método analítico (Figuras 2, 3, 4, 5). O tempo de retenção da MOX nos

diferentes tecidos foi de TR: 4,28 e o da EMA TR: 1,29 min.

52

Figura 2. Cromatogramas em modo MRM das matrizes branco de músculo e branco

fortificada na concentração do LOQ (5 ng g

-1).

Figura 3. Cromatogramas em modo MRM das matrizes branco de fígado e branco


-1).

53

Figura 4. Cromatogramas em modo MRM das matrizes branco de rim e branco


-1).

Figura 5. Cromatogramas em modo MRM das matrizes branco de gordura e branco

fortificada na concentração do LOQ (5 ng g-1

).

A faixa de linearidade utilizada para todas as matrizes foi de 5-200 ng g-1

.

Os níveis de concentração para a construção da curva analítica ao redor do LMR para a

matriz músculo foram: 5, 10, 25, 50, 75, 100 e 200 ng g-1

. Já para as matrizes fígado,

rim e gordura, os níveis foram: 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150 e 200 ng g-1

. Os valores

obtidos de área dos sinais analíticos da MOX apresentaram forte correlação linear com

os valores de concentração, apresentando coeficientes de correlação (r) superiores a

0,99 para a MOX. Três tipos de curvas analíticas foram construídas para as quatro

matrizes analisadas: curvas do analito no solvente, curvas do analito no extrato da

matriz e curvas do analito na matriz propriamente dita, como pode ser observado nas

Figuras 6, 7, 8 e 9.

54

Figura 6. Curvas analíticas obtidas para MOX: curvas no solvente, curvas no extrato da

matriz e curvas na matriz músculo, todas preparadas em triplicata.

Figura 7. Curvas analíticas obtidas para MOX: curvas no solvente, no extrato da matriz

e na matriz fígado, todas preparadas em triplicata.

y = 0,013x + 0,0174 R² = 0,9997

y = 0,0097x + 0,0307 R² = 0,9986

y = 0,0087x + 0,0108 R² = 0,9996

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150 200 250

Áre

a M

ox/E

ma

Concentração (ng/g)

Matriz Músculo

Solvente

Extrato

Matriz

y = 0,1043x - 0,2091 R² = 0,9984

y = 0,0571x - 0,1628 R² = 0,9957

y = 0,0591x - 0,0069 R² = 0,9982

0,000000

5,000000

10,000000

15,000000

20,000000

25,000000

0 50 100 150 200 250

Áre

a M

ox/E

ma


Matriz Fígado

Solvente

Matriz

Extrato

55

Figura 8. Curvas analíticas obtidas para MOX: curvas no solvente, no extrato da matriz

e na matriz rim, todas preparadas em triplicata.

Figura 9. Curvas de Calibração obtidas para MOX: curvas no solvente, no extrato da

matriz e na matriz gordura, todas preparadas em triplicata.

Os resultados de exatidão e precisão do método (Tabela 3) estão de acordo

com os valores preconizados pelos Guias de Validação do MAPA (BRASIL, 2011), na

decisão da Comunidade Europeia 2002/657/EC (EC, 2002) e do VICH (2011). Assim,

y = 0,0135x - 0,0551 R² = 0,997

y = 0,0061x - 0,0351 R² = 0,9919

y = 0,0073x - 0,063 R² = 0,9858

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150 200 250

Áre

a M

ox/E

ma


Matriz Rim

Solvente

Matriz

Extrato

56

os valores médios de exatidão, obtidos mediante ensaios de recuperação, estão dentro do

intervalo de 70 a 120% preconizados pelos guias.

A precisão do método foi avaliada em função da repetibilidade e da precisão

intermediária de acordo com as recomendações dos guias já citados. Para o estudo da

repetibilidade, foi realizada a extração da amostra fortificada com solução de padrão em

quatro diferentes níveis de concentração: 5, 50, 100 e 200 ng g-1

, com seis replicatas

individuais por nível e, a partir das 24 determinações, foi calculado o CV(%). A

precisão intermediária foi avaliada, assim como a repetibilidade nos mesmos níveis de

concentração, porém em três diferentes dias. Os valores de CV% obtidos foram

adequados tanto para a precisão intradia como para a precisão interdia, conforme o guia

VICH (2011), os quais situaram-se entre 5,9-19,8% e 8,0-22,5%, respectivamente.

Tabela 3. Precisão e Exatidão nas matrizes músculo, fígado, rim e gordura de cordeiro

por LC-MS/MS

Parâmetros

analíticos Músculo Fígado Rim Gordura

Valores aceitáveis*

CV%

Precisão

Intradia (CV %)

5 ng g-1

(n=6) 5,89 13,11 10,81 19,18 25

50 ng g-1

(n=6) 6,64 11,82 10,12 15,05 15

100 ng g-1

(n=6) 6,63 7,03 13,03 14,45 15

200 ng g-1

(n=6) 8,51 6,01 7,62 16,08 15

Interdia (CV %)

5 ng g-1

(n=18) 20,6 21,81 17,66 22,5 32

50 ng g-1

(n=18) 8,68 11,9 8,7 15,1 23

100 ng g-1

(n=18) 8,47 8,5 14,57 13,7 15

200 ng g-1

(n=18) 8,02 9,51 8,85 9,8 16

Exatidão (%)

5 ng g-1

(n=6) 71,61 120 108,9 92,54 -40% a +20%

50 ng g-1

(n=6) 103,96 110,26 82,2 73,2 -30% a +10%

100 ng g-1

(n=6) 103,46 103,88 111,2 71,66 -30% a +10%

200 ng g-1

(n=6) 97,82 105,71 99,6 81,8 -20% a +10%

(CV %) Coeficiente de Variação.

*Valores preconizados no guia de validação da VICH (2015) e MAPA (2011).

Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram

estabelecidos através da análise de amostras branco fortificadas com soluções do analito

em acetonitrila. O LOQ foi considerado como sendo o primeiro ponto da curva em

57

todos os tecidos, ou seja, 5 ng g-1

, levando em consideração a precisão e a exatidão

aceitáveis. E o LOD foi estabelecido igual a mínima concentração detectável do analito

presente na amostra fortificada, com razão sinal-ruído igual a 3. Para determinar o

desempenho do procedimento analítico, avaliou-se o limite de decisão (CCα) e a

capacidade de detecção (CCβ), através de equações 1 e 2, em que os resultados foram

superiores ao LMR, sendo portanto considerados satisfatórios. Porém, não foi calculado

este parâmetro para matriz gordura, pois a curva foi construída abaixo do LMR

estabelecido, garantindo a quantificação do analito com uma boa margem de segurança.

CCα =LMR + 1,64 x σ (1)

CCβ = CCα + 1,64 x σ (2)

Em que σ: desvio padrão da reprodutibilidade intralaboratorial

Como a gordura tem um LMR de 500 ng g-1

e o trabalho tem como objetivo

análise de resíduos de MOX, optou-se por trabalhar com um range de concentração

abaixo do LMR permitido para a gordura a fim de se garantir a linearidade, mantendo o

LOQ de 5 ng g-1

e diluindo as amostras quando necessário.

Tabela 4. Valores de LOD, LOQ, CCα e CCβ nos tecidos músculo, fígado, rim e

gordura de cordeiro por LC-MS/MS.

Matriz

LMR

(ng g-1

)

LOD

(ng g-1

)

LOQ

(ng g-1

)

Ccα

(ng g-1

)

ccβ

(ng g-1

)

Músculo 50 1,5 5,0 60,89 71,8

Fígado 100 1,5 5,0 119,4 130,9

Rim 50 1,5 5,0 66,59 83,28

Gordura 500 1,5 5,0 ---- ----

(----) Não foi possível calcular, pois o range da curva analítica foi estabelecido abaixo do LMR

para este tecido.

O efeito matriz foi avaliado pela comparação estatística entre as

concentrações médias determinadas no extrato fortificado e as concentrações médias

dos analitos no solvente, utilizando teste F (Snedecor) para médias iguais e confirmação

através do teste t (para amostras diferentes), em amostras que apresentam efeito, no

nível de confiança de 95%. Não houve efeito matriz no ponto de 5,0 ng g-1

para as

matrizes músculo, rim e gordura, porém nos outros pontos em todas as matrizes

verificou-se a perda de sinal. Ou seja, houve efeito matriz o qual, calculado em

58

porcentagem, variou entre 17,7 a 88,4 % (Tabela 5). Dessa maneira, todas as amostras

foram quantificadas em curva matrizada.

Tabela 5. Efeito matriz observado no método de quantificação de MOX em músculo,

fígado, rim e gordura de cordeiro por LC-MS/MS (expresso em %).

Parâmetros Analíticos Músculo Fígado Rim Gordura

Efeito

Matriz

(%)

5 ng g-1

(n=6) * 38,70 * *

50 ng g-1

(n=6) 17,78 47,76 65,57 69,31

100 ng g-1

(n=6) 22,87 45,20 88,41 30,41

200 ng g-1

(n=6) 25,12 46,67 44,89 31,72

(*) Não houve efeito matriz

O estudo de estabilidade de curta duração teve como objetivo avaliar se o

analito em estudo permanece estável na matriz biológica nas condições de temperatura,

luminosidade e umidade presentes no laboratório. As amostras foram fortificadas (n=3)

na concentração do LMR de cada matriz e deixadas sobre a bancada por 4 horas , porém

com exceção da gordura, que foi fortificada no ponto central da curva 100 ng g-1

, pois

foi realizada a curva analítica com precisão e exatidão abaixo do LMR. Após esse

período foram submetidas ao processo de extração e análise. Os resultados obtidos

foram comparados com os resultados de amostras extraídas após a fortificação como

valor de CV% ≤ 15.

O estudo de estabilidade de ciclos de gelo e degelo teve como objetivo

avaliar se o analito permanece estável após 3 ciclos de congelamento e

descongelamento. As amostras foram fortificadas como no estudo anterior e congeladas

por 24 horas e então descongeladas, novamente congeladas por pelo menos 12 horas e

posteriormente descongeladas. Este processo foi repetido e as amostras foram

analisadas no tempo de 24, 48 e 96 horas neste ciclo de congelamento e

descongelamento. Após estes ciclos as amostras foram submetidas ao processo de

extração e análise. Os resultados obtidos foram comparados com os resultados de

amostras extraídas logo após a fortificação. Os critérios de aceitação utilizados foram os

mesmos para precisão e exatidão.

59

Na tabela 6 e 7, são apresentados os resultados (concentração da média ±

desvio padrão) de estabilidade de curta duração e de ciclos de gelo e degelo que

demonstraram que não houve diferença significativa entre as amostras, quando

analisado pela ANOVA (nível de confiança 95%), através do teste F e teste t. Portanto,

não houve degradação da MOX nas matrizes biológicas, garantindo a estabilidade da

molécula nas matrizes analisadas.

Tabela 6. Estabilidade de curta duração da moxidectina (média ± desvio padrão).

Matriz Concentração após 4 horas

Músculo (50 µg kg-1

) 50,25± 1,04

Fígado (100 µg kg-1

) 102,55±1,50

Rim (50 µg kg-1

) 51,40± 1,30

Gordura (100 µg kg-1

) 103,30±1,80

Tabela 7. Estabilidade de ciclos de gelo e degelo (média ± desvio padrão).

Matriz 24 horas 48 horas 96 horas

Músculo (50 µg kg-1

) 53,14 ± 1,04 50,20± 1,25 49,86±1,40

Fígado (100 µg kg-1

) 102,80 ± 1,50 102,95 ± 1,10 104,40 ± 1,90

Rim (50 µg kg-1

) 52,40 ± 1,95 54,60 ± 1,80 53,20 ± 1,70

Gordura (100 µg kg-1

) 101,35 ± 1,60 102,40 ± 1,50 105,40 ± 1,20

Amostras n=3

Em relação à robustez, foram avaliados dois parâmetros relacionados a

variações intrínsecas do sistema de cromatografia líquida: fluxo da fase móvel e a

temperatura da coluna.

O fluxo da fase móvel utilizada no método foi 0,50 mL min-1

, e as

alterações realizadas foram de fluxo de 0,55 e 0,45 mLmin-1

. Em relação à temperatura

da coluna, a utilizada no método foi de 30ºC e as alterações realizadas foram de 35ºC e

25ºC. Através da análise da ANOVA, pelo teste F e teste t, verificou-se que não houve

diferença na resposta do analito frente a estas variações no método analítico, mostrando

precisão e exatidão dentro do preconizado nos guias de validação.

60

Na Tabela 8, são apresentados os dados adquiridos para avaliação da

robustez do método, na concentração de cada matriz no ponto especificado com o

desvio padrão e as variações realizadas no método analítico.

61

Tabela 8. Variações realizadas no método no teste de robustez.

Fluxo da fase móvel

(ml min-1

)

Temperatura da coluna

Concentração

Referência 0,55 0,45 35 ºC 25 ºC

Músculo (50 ng g-1

) 52,93± 1,04 54,65±1,50 50,13±0,30 50,00±0,40 53,88±2,20

Fígado (100 ng g-1

) 101,25±1,30 102,40±1,3 100,90±1,60 104,50± 1,20 102,60± 1,80

Rim (50 ng g-1

) 51,70±1,60 54,50± 1,25 53,70±2,02 54,60±1,80 52,70± 1,50

Gordura(100 ng g-1

) 102,90±1,32 101,40 ± 1,80 103,50±1,40 101,30 ±1.40 102,50±1,60

Conclusão

O método desenvolvido para quantificação de resíduos de MOX em tecidos de

cordeiro (músculo, rim, fígado e gordura) demonstrou atender aos requisitos dos guias

de validação adotados no estudo (EC, 2002/657, MAPA, 2011 e VICH, 2011) para os

parâmetros de seletividade/especificidade, linearidade, precisão, exatidão, limite de

quantificação (LOQ), limite de detecção (LOD), limite de decisão (CCα), capacidade de

detecção (CCβ) e robustez.

Com base nos estudos realizados, este método analítico, apresentou-se como

uma alternativa promissora para a extração de resíduos de MOX em matrizes de

cordeiro, sendo realizadas modificações em relação ao método QuEChERS original.

Além disso, foi aplicado às diferentes matrizes (músculo, fígado, rim e gordura). No que

diz respeito à recuperação do analito das matrizes, os resultados foram considerados

satisfatórios, assim como o limite de quantificação estabelecido, de 5 ng g-1

. Desta

forma, pode-se concluir que o método analítico validado é aplicável para a finalidade

proposta no range de 5-200 ng g-1

, uma vez que se mostrou reprodutível e linear na

faixa de trabalho estabelecida.

62

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65





2010.

66

CAPÍTULO III

Depleção de resíduos de moxidectina em músculo (lombo), fígado e rim

de cordeiros

Michelle Del Bianchi; Maria Ângela M. Fernandes; Alda Lúcia G. Monteiro; Juliana A.

Teles; Arturo Anadón, Felix G. R. Reyes.

Artigo em preparação para ser submetido ao Food and Chemical Toxicology

67

RESUMO

A verminose é a principal responsável por grandes perdas observadas na ovinocultura,

reduzindo o potencial produtivo dos animais, causando prejuízos aos criadores. A

prática indevida do uso de anti-helmínticos em ovinos e não cumprimento do período de

carência para a espécie, eleva o risco ao consumo de níveis de resíduos farmacológicos

não permitidos em produtos cárneos. No entanto, foi realizado o estudo de depleção em

músculo, fígado e rim de cordeiros Vinte e dois cordeiros foram utilizados para o

estudo, após aplicação subcutânea de uma única dose de 0,2 mg/kg de peso corporal de

moxidectina (MOX). Os tecidos (músculo, fígado e rim) foram coletados após o abate

nos tempos 2, 4, 7, 14, 28 e 42 dias após aplicação do fármaco. Todos os resultados da

quantificação de resíduos de MOX foram menores do que o limite máximo de resíduo

(LMR) permitido para cada tecido. As concentrações da MOX no músculo variaram

entre 9,0 a 25,9 µg kg-1

, no fígado entre 11,6 a 44,2 µg kg-1

e no rim entre 9,4 a 46, 9 µg

kg-1

indicando uma baixa absorção de MOX nos tecidos analisados, não representando,

portanto, risco à saúde do consumidor.

Palavras-chave: moxidectina, sistema LC-ESI-MS/MS, depleção de resíduos.

68

ABSTRACT

The verminose is the main responsible for great losses observed in the sheep, reducing

the productive potential of the animals, causing damage to the breeders. The improper

practice of the use of anthelmintics in sheep and failure to comply with the grace period

for the species raises the risk of consumption of pharmacological residues not allowed

in meat products. However, the study of muscle, liver and kidney depletion of lambs.

Twenty-two lambs were used for the study, after subcutaneous administration of a

single dose of 0.2 mg / kg body weight, 1% moxidectin in injectable concentration.

Tissues were collected after slaughter at times: 2, 4, 7, 14, 28, 42 days after drug

application. The results even in the first days of slaughter were lower than the maximum

residue limit allowed for each tissue. The MOX concentrations in muscle, this was

between 25.90 to 9.0 µg/kg, This indicates a low absorption of MOX in the analyzed

tissues, not representing therefore risk to consumer health.

Key words: moxidectin, LC-ESI-MS/MS, depletion residue

70

Introdução

A ovinocultura possui um sistema de produção caracterizada por pastagens

com altas lotações de animais e, consequentemente, grande contaminação de larvas. As

infecções por nematódeos gastrintestinais é um entrave à expansão da produção de

ovinos de corte, destacando-se como o principal parasita, o Haemonchus contortus.

Esse parasito se localiza no abomaso e se alimenta de sangue. Devido ao seu hábito

hematófago, os animais com altos índices parasitários desenvolvem um quadro de

anemia grave, se desenvolvem de maneira lenta e incompleta levando até a morte

(VIEIRA, 2003).

A medida de controle dos nematódeos gastrointestinais é a utilização de

anti-helmínticos. A moxidectina (MOX), uma milbemicina pertencente à classe das

lactonas macrocíclicas, é o antiparasitário que se destaca na ovinocultura, devido ao seu

amplo espectro de ação a endo e ectoparasitas.

As lactonas macrocíclícas (LM) (avermectinas e milbemicinas) possui baixa

hidrossolubilidade e elevada lipossolubilidade o que favorece a sua deposição no local

de aplicação por via subcutânea, o que prolonga o tempo de residência do medicamento

no organismo (SPINOSA et al., 2006). Por ser um composto lipofílico, possui grande

afinidade por gorduras corpóreas e prolongada persistência de concentração no

organismo.

A MOX é ativa, mesmo em doses baixas, contra uma ampla variedade de

nematoides e artrópodes (McKELLER & BENCHAOUI, 1996). Ela é altamente solúvel

em lipídeos e sua biotransformação ocorre no fígado. O composto, na forma inalterada,

é o principal resíduo encontrado na gordura e no leite, em bovinos, ovinos e equinos

(SPINOSA et al., 2006; PRICHARD et al., 2012).

A MOX pode ser administrada por via oral ou formulação injetável no

tecido subcutâneo ou intramuscular. A biodisponibilidade dos endectocidas, por

administração oral, resulta em baixa eficácia devido à inativação parcial da droga no

rumem dos ovinos (ALVINERIE et al., 1998; LLOBERAS et al., 2013; McKELLER &

BENCHAOUI, 1996). No entando, a forma mais usual de aplicação deste tipo de

fármaco é por via subcutânea, na qual ele é rapidamente absorvido e amplamente

distribuído aos tecidos, particularmente naqueles contendo alto teor de gordura

(LIFSCHITZ et al., 1999).

71

A MOX armazena-se principalmente no tecido gorduroso, sendo o principal

reservatório a gordura abdominal e subcutânea, mas também está presente no intestino e

na pele do animal. O depósito da MOX no tecido adiposo atua como um reservatório da

droga, liberando-a para a corrente sanguínea gradualmente. Este fato contribui para a

persistência da atividade da molécula nos tecidos alvos e para a meia vida longa

(LLOBERAS et al., 2013). Inversamente, uma baixa concentração da droga é

encontrada no tecidosmagros, como o músculo, apresentando um baixo tempo de

residência. O tempo de residência prolongado da MOX proporciona um impacto

positivo na eficácia, como demonstrada pelomaior intervalo para o reaparecimento de

parasitas após o tratamento, quando comparado com outros compostos, minimizando a

oportunidade para o desenvolvimentoderesistência (LIFSCHITZ et al., 1999). Os

animais jovens, por apresentarem menor teor de gordura no corpo, quando comparados

com o animal adulto, tendem a armazenar menor quantidade do composto

(ALVINERIEet al., 1998).

No Brasil, a MOX não está autorizada para uso em ovinos. Apenas para

bovinos, equinos e animais de companhia (CPVS, 2016). No entanto, há evidências na

prática do seu uso extra-label por ovinocultores brasileiros. A prática tem se tornado

preocupante devido ao aumento dos riscos de resistência parasitária e ao mesmo tempo,

o desconhecimento ou o não cumprimento do período de carência para essa espécie,

eleva o risco associado ao consumo de níveis de resíduos farmacológicos não

permitidos no produto cárneo.

Diante do exposto o objetivo do presente estudo foi caracterizar a depleção

de resíduos de MOX em músculo (longe do local de aplicação- corte lombo), fígado e

rim de cordeiros, após única administração subcutânea de MOX em cordeiros na

concentração de 0,2 mg/kg peso corporal.

Material e Métodos

O método analítico utilizado está descrito no Capítulo II.

Neste trabalho é apresentada a caracterização da depleção nos tecidos

músculo, analisado longe do local de aplicação do fármaco, considerado o corte lombo

do animal, fígado e rim. Os outros tecidos, como o músculo (corte pernil) analisado no

local de aplicação do fármaco e a gordura, foram apresentados por FERNANDES

(2015) em sua tese de doutorado, utilizando o mesmo método analítico.

72

Administração subcutânea MOX

O estudo com os animais foi desenvolvido no Laboratório de Produção e

Pesquisa em Ovinos e Caprinos (LAPOC), da Fazenda Experimental do Canguiri, da

Universidade Federal do Paraná (UFPR), localizada na região metropolitana de Curitiba

(Pinhais), Paraná, Brasil, entre novembro e janeiro de 2012. O processo de criação, do

nascimento até ao abate foi descrito abaixo por FERNANDES (2015).

Com o propósito de analisar as concentrações de MOX em tecidos de

cordeiro, para posterior caracterização da depleção de MOX 1% (Cydectin® NF, Fort

Dodge Saúde Animal) injetável na dose de 0,2 mg para cada quilo de peso corporal

(pc), por um período de até 42 dias após o tratamento, foram selecionados 22 cordeiros

da raça Suffolk, em bom estado nutricional, clinicamente saudáveis, com peso médio

semelhante (36,1 ± 3,2 kg) e que nunca receberam tratamento com anti-helmíntico. Dois

cordeiros foram abatidos antes do início das avaliações para serem utilizados como

“branco” (tecido isento do principio ativo) no desenvolvimento e validação da

metodologia analítica para posterior quantificação da MOX nos tecidos de cordeiro.

Do nascimento até o desmame, os cordeiros e as ovelhas foram mantidos em

aprisco suspenso ripado. A partir da 1ª semana de vida, os cordeiros receberam dieta

composta de concentrado farelado (20% de Proteína Bruta) e silagem de milho, por

meio de suplementação em creep feeding. Os cordeiros foram desmamados e em

seguida foram confinados em baias individuais, em aprisco suspenso com piso ripado.

A dieta era composta por 40% de feno de azevém (volumoso) e 60% de concentrado

farelado (20% de PB), formulada para atender às exigências de cordeiros com potencial

de crescimento rápido (NRC, 2007). Os animais foram tatuados na face interna da perna

esquerda para padronização do local de aplicação do anti-helmíntico e coleta do

material no momento da necropsia.

Todos os cordeiros receberam uma única aplicação subcutânea de MOX

1%, na dose de 0,2 mg/ kg de peso corporal, aplicada no local previamente demarcado

na face interna da perna esquerda. No dia anterior à aplicação do anti-helmíntico, os

animais foram pesados após jejum sólido de 12h e a dose foi calculada individualmente

com base no peso obtido. A dose de cada cordeiro foi aplicada com auxílio de seringa

plástica graduada em escala de 0,1. A quantidade total de MOX administrada, em mg,

foi calculada por regra de três simples, sabendo que a sua concentração nominal na

fórmula farmacêutica utilizada é de 1%.

73

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado e os animais

testes foram distribuídos aleatoriamente em seis tratamentos (tempos de abate após a

aplicação da MOX) conforme a Tabela 1. Em cada uma dessas seis datas observacionais

foi abatido um animal do grupo controle (não dosificado com anti-helmíntico). Após

abate, os tecidos foram separados e congelados até análise.

Tabela 1. Dias de abate após aplicação única do fármaco e número de repetições dos

animais que foram abatidos para coleta das matrizes.

Dias de abate após aplicação

do anti-helmíntico

Número de repetições dos

animais

2 4

4 4

7 3

14 3

28 4

42 4

Total de cordeiro 22

Fonte: FERNANDES (2015)

Os abates foram realizados nas datas pré-determinadas, após jejum sólido de

12 h. A insensibilização foi realizada por eletronarcose com descarga elétrica de 220 V

por oito segundos e a sangria, pela secção das veias jugulares e artérias carótidas.

Todas as amostras foram acondicionadas em sacos plásticos incolores

devidamente identificados (tecido/órgão, dias pós-tratamento, data da amostragem,

número do animal e grupo) e congeladas a -20ºC para posterior análise no Laboratório

de Toxicologia de Alimentos, Departamento de Ciência de Alimentos da UNICAMP.

Todas as avaliações e manejos envolvendo os animais foram realizados de

acordo com as normas aprovadas pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Setor

de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná (Protocolo No. 055/2011).

74

Resultados e discussão

Depleção de resíduos em tecidos de músculo (lombo), fígado e rim

As concentrações médias de MOX nos tecidos de músculo (corte-lombo),

fígado e rim nos diferentes dias após aplicação única do fármaco e as respectivas

estimativas dos desvios padrão relativos estão apresentadas na Tabela 2. Os valores

mostram que as concentrações máximas de resíduo de MOX foram 25,93 µg kg-1

no

músculo, 44,20 µg kg-1

no fígado e 46,95 µg kg-1

no rim, já nos primeiros dias de abate

após aplicação única do fármaco.

De acordo com o Codex Alimentarius (2005), os limites máximos de

resíduos (LMR) permitidos em tecidos ovinos para MOX são 50 µg kg-1

no músculo e

rim, 100 µg kg-1

no fígado e 500 µg kg-1

na gordura. No presente experimento, os

valores detectados foram inferiores a estes limites máximos.

Para melhor visualização dos resultados, nas Figuras 1, 2 e 3 estão

representadas as curvas de os depleção da MOX em músculo (lombo), fígado e rim,

respectivamente. Fernandes (2015), em mesmo estudo, após única dose de 0,2 mg/kg pc

de MOX administrada por via subcutânea em cordeiros, resultou em concentração

abaixo do LMR no músculo (local de aplicação - perna), 5 dias após a aplicação. Outro

tecido analisado foi a gordura, na qual encontrou concentração abaixo do LMR 17 dias

após aplicação do fármaco. Porém, mesmo após 28 dias, que é considerado o período

de carência para MOX, foi encontrada na gordura, concentração de 319,1 μg kg-1

, sendo

que o LMR para este tecido é de 500 µg kg-1

.

Tabela 2. Concentração da moxidectina (µg kg-1

) no músculo (lombo), fígado e rim,

após administração única subcutânea de 0,2 mg/kg de peso corporal.

DAA Músculo (lombo) Fígado Rim

Concentração

da MOX

(Média ± DP)

2 25,93 ± 6,90 34,85 ± 9,25 33,96 ± 8,35

4 22,46 ± 3,65 44,20 ± 7,00 42,30 ± 11,70

7 20,65 ± 4,45 43,95 ± 6,30 46,95 ± 7,00

14 14,51 ± 1,74 17,90 ± 3,85 19,00 ± 7,90

28 11,57 ± 2,27 16,80 ± 3,30 16,52 ± 4,82

42 9,04 ± 0,50 11,65 ± 2,20 9,41 ± 0,78

DAA: Dias após aplicação do fármaco

75

Em estudo realizado por Lifschitz et al. (2000), após administração

subcutânea de 0,2 mg kg-1

MOX em ovelhas, observaram que as concentrações no

músculo e fígado estiveram abaixo do LMR. Os autores analisaram a gordura também,

na qual obteve uma concentração maior em relação aos outros tecidos em 21 dias após

tratamento, mas ainda abaixo do LMR. A MOX tem como característica ser um

composto lipofílico, o que explica sua afinidade maior pelo tecido adiposo.

Com relação ao consumo da carne, o cordeiro é a categoria de maior

preferência, por ter uma carne mais macia. Dessa maneira, o consumidor está

privilegiado, considerando que não há concentração alta desse tipo de fármaco mesmo

antes do período de carência de 28 dias para MOX, trazendo segurança ao consumo.

76

Figura 1. Concentração média de moxidectina no músculo de cordeiro, longe do local

de aplicação (lombo), após única administração subcutânea (0,2 mg/kg de

peso corporal).

Figura 2. Concentração média de moxidectina no fígado de cordeiro, após única

administração subcutânea (0,2 mg/kg de peso corporal).

0

5

10

15

20

25

30

35

0 10 20 30 40 50

Co

nce

ntr

açã

o µ

g k

g-1

Dias após administração

Músculo longe do local de aplicação

0

20

40

60

0 10 20 30 40 50

Con

cen

traçã

o µ

g k

g-1


Fígado

77

Figura 3. Concentração média de moxidectina no rim de cordeiro, após única

administração subcutânea (0,2 mg/kg de peso corporal).

Neste trabalho, houve concentração maior da MOX no fígado e rim, em sete

dias após o tratamento e também um perfil semelhante na depleção do fármaco.

Palma et al., (2006) pesquisaram resíduos de abamectina em tecidos de

bovinos tratados via oral, onde observaram as maiores concentrações em tecidos de

fígado, aos sete dias pós-tratamento, seguido dos tecidos de gordura, rim e, por último,

nas amostras de musculatura. Embora seja outra molécula e em outra espécie de animal,

a abamectina é uma lactona macrocíclica, assim também como a MOX.

A metabolização da MOX é feita em baixa proporção no fígado, secretada

pela bile, reabsorvida pelo intestino e eliminada na sua forma ativa através das fezes,

sendo esta a principal via de excreção (LIFSCHITZet al., 1999).

Gilaverte (2014), avaliou a cinética de excreção da MOX por meio das fezes

de ovinos, após aplicação subcutânea de 0,2 mg/kg peso corporal, e verificou o pico de

excreção do fármaco em 36 horas com concentração de 22,73µg kg-1

, e a presença da

molécula até aos 42 dias após aplicação, mesmo em baixa concentração de

aproximadamente 6,5 µg kg-1

.

Baptista et al., (2017), realizaram a farmacocinética da MOX em soro de

cordeiros, procedente do mesmo estudo e verificaram concentração máxima 7,4 ng ml-

1, com permanência do fármaco no soro em nove dias. Após este período não foi

possível quantificar as amostras mostrando portanto, que houve lenta absorção do

fármaco no soro.

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50

Con

cen

traçã

o µ

g k

g-1


Rim

78

Na literatura há poucos estudos de resíduos da MOX em especial em

tecidos de cordeiros. No geral, o presente estudo mostra que se medicamento for

aplicado na dose correta, respeitando o período de carência, os tecidos estarão

conformes e poderão ser destinados ao consumo humano.

Conclusão

O método analítico desenvolvido e validado através da técnica LC-ESI-

MS/MS foi aplicado para quantificação de MOX em amostras de músculo (longe do

local de aplicação-lombo), fígado e rim de cordeiros tratados com o medicamento,

visando caracterizar a depleção deste principio ativo nos tecidos mencionados. A análise

dos resultados obtidos na caracterização da depleção indicou a presença de resíduos de

MOX em valores inferiores ao do LMR do músculo, fígado e rim (50 µg kg-1

, 100 µg

kg-1

e 50 µg kg-1

, respectivamente). Os valores de concentração da MOX encontrados

no músculo foram menores que os encontrados no fígado e rim, resultado este

interessante do ponto de vista de risco para os consumidores, uma vez que o tecido

muscular transformado em carne no post-mortem, é o mais consumido.

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81

DISCUSSÃO GERAL

As verminoses gastrointestinais são consideradas o principal problema

enfrentado pelos criadores de ovinos. A utilização de métodos inadequados no combate

à verminose vem gerando a resistência dos parasitas aos vermífugos. Questões

relacionadas à existência de resíduos em medicamentos veterinários em carnes são cada

vez mais frequentes, buscando a segurança no consumo de alimentos.

Métodos analíticos mais sensíveis para determinar estes resíduos são muito

importantes. Novos vermífugos surgirão no mercado e, mesmo que alternativas a esse

controle químico também sejam disponibilizadas, seu uso inadequado fará com que em

pouco tempo perca-se a eficácia no controle parasitário. Portanto, é importante entender

que o sucesso do controle dependerá de um conjunto de ações dentro da propriedade e,

para que esse sucesso de fato ocorra, a informação é a melhor ferramenta de trabalho.

O emprego da técnica cromatografia líquida acoplada à espectrometria de

massas apresenta vantagens como a seletividade e a possibilidade de confirmação da

identidade dos analitos, aumentando assim a confiabilidade dos resultados. O

procedimento de preparo de amostras anterior à quantificação é uma etapa fundamental

para garantir a detectabilidade e seletividade do método. O preparo de amostra, usando

método QuECHERS, apresentou um ótimo desempenho na remoção dos interferentes

para a determinação da moxidectina nos tecidos de cordeiro, além de ter sido simples e

rápido.

O trabalho realizado em parceria com a UFPR, de onde as amostras de

tecidos foram obtidas, foi de grande importância para a pesquisa e para o produtor, bem

como para o consumidor final.

Os limites de detecção e quantificação do método analítico foram 1,5 ng g-1

e 5,0 ng g-1

, respectivamente, para todas as matrizes. As recuperações nos 4 níveis de

concentração analisados mostraram resultados entre 71,61-103,96 % para músculo,

103,40-120,40 % para fígado, 82,2 - 111,20% para rim e 73,20-92,54% para gordura.

O método foi desenvolvido e validado para as matrizes músculo (local de

aplicação do fármaco, corte perna e longe do local de aplicação do fármaco, corte

lombo), fígado, rim e gordura.

O músculo analisado no local de aplicação do fármaco e gordura foram

apresentados por FERNANDES (2015), evidenciando que após única dose de

moxidectina administrada por via subcutânea, resultou na concentração abaixo do LMR

82

no músculo (local de aplicação: perna) e na gordura, antes do período de carência que é

de 28 dias. Nos tecidos estudados neste trabalho, músculo (longe do local de aplicação-

lombo), fígado e rim, as amostras estiveram também abaixo do LMR logo no segundo

dia após aplicação, mostrando, que os produtos seriam seguros para o consumo humano,

respeitando o prazo de carência, mesmo com uso frequente.

CONCLUSÃO GERAL

Em conformidade com os guias de validação da ANVISA (2012), do

MAPA (2011), VICH (2011) e da Comunidade Europeia (2002), o método

desenvolvido e validado para a quantificação da MOX em tecidos de cordeiro,

utilizando o sistema LC-ESI-MS/MS (Agilent Technologies), foi eficiente, seletivo e

preciso.

O preparo de amostra foi unificado para determinação da moxidectina em

quatro matrizes diferentes, mostrando-se robusto, além de ser um método de execução

rápido para análise de rotina.

Em relação à caracterização da depleção de resíduos em músculo (longe do

local de aplicação - lombo), fígado e rim, as concentrações da MOX foram inferiores

aos limites máximos de resíduos (LMR), dando, portanto, segurança ao consumo deste

tipo de produto.

Do ponto de vista de segurança, o método mostrou que a carne de cordeiro

obtida nesse manejo é segura para o consumo humano. Porém, vale salientar que se

ocorrer o uso indiscriminado de medicamentos veterinários e tal como aplicar dose

repetitiva do anti-helmíntico para o tratamento de parasitas, e o desrespeito ao período

de carência do fármaco, podem levar a diferentes resultados. Além disso, os abates,

muitas vezes, são realizados de forma clandestina no Brasil, o que dificulta o controle

de qualidade e desmotiva o produtor a investir na profissionalização do rebanho.

Neste sentido, os métodos desenvolvidos podem ser utilizados em programa de

monitoramento destes alimentos, a fim de garantir a segurança do seu consumo.

83

REFERÊNCIAS




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91

ANEXO 1 – Aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais

92

ANEXO 2

Moxidectin residues in lamb tissues: Development and Validation of

Analytical Method by LC-MS/MS

Artigo submetido ao Journal of Chromatography B

93

Moxidectin residues in lamb tissues: Development and Validation of Analytical

Method by UHPLC-MS/MS

Michelle Del Bianchi A. Cruza, Maria A. M. Fernandesb, Patricia A. de C. Bragaa,

Alda L. G. Monteirob, Daniela Danielc and Felix G. R. Reyes*a

aDepartment of Food Science, School of Food Engineering, University of Campinas – UNICAMP,

Rua Monteiro Lobato, 80, 13083-862 Campinas, SP, Brazil

bDepartment of Animal Science, Sheep and Goat Production and Research Center (LAPOC),

Universidade Federal do Paraná, Rua dos Funcionários, 1540, CEP: 80035-050 Curitiba-PR,

Brazil

cAgilent Technologies Brasil, Alameda Araguaia 1142, (Alphaville Industrial), CEP 06455-000

Barueri, SP, Brazil.

Corresponding Author: Felix G. R. Reyes

Phone: +55 (19) 3521-2167

E-mail: [email protected]

94

Highlights

1. Novel method for determination of moxidectin residues in lamb tissues by UHPLC-ESI-

MS/MS.

2. Single sample preparation step developed for moxidectin extraction from target

tissues.

3. Incurred samples from all target tissues used in the validation step.

4. Short chromatographic run (5.0 min) per sample.

5. Reliable high-throughput method for surveillance of moxidectin in animal tissue.

95

ABSTRACT

The development and validation of a throughput method for the quantitation of

moxidectin residues in lamb tissues (muscle, kidney, liver and fat) was

conducted by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass

spectrometry (UHPLC-MS/MS). To achieve higher recovery of the analyte from

the matrices, a modified QuEChERS method was used for sample preparation.

The chromatographic separation was carried out on a Zorbax Eclipse Plus C18

RRHD column using mobile phase comprising 5 mM ammonium formate

solution + 0.1% formic acid (A) and acetonitrile + 0.1% formic acid (B) in a linear

gradient program. Method validation was performed per the Commission

Decision 2002/657/EC and VICH GL49. To quantify the analyte, matrix-matched

analytical curves were constructed with spiked blank tissues, with the limit of

quantitation of 5 ng g-1 and limit of detection of 1.5 ng g-1 for all matrices.

Linearity, decision limit, detection capability accuracy, inter- and intra-day

repeatability of the method are reported. The method was successfully applied

to incurred lamb tissue samples, suitable for monitoring moxidectin residues in

lamb tissues in health surveillance programs, as well as for pharmacokinetics

and residue depletion studies.

Keywords: UHPLC-MS/MS, moxidectin, lamb tissues, QuEChERS, residues

determination.

96

1.Introduction

Consumers frequently search for alternatives of animal protein sources.

In Brazil, as in other countries of the world, there is a growing demand for better

quality foods, considering characteristics of the products such as flavor, color,

juiciness, guarantee of origin, and environmental costs of production, among

others. In this context, sheep breeding is distributed worldwide, with an annual

growth rate of 1.5% in the last 5 years, and a forecast for continued growth.

This kind of agribusiness has also been prominent in Brazil since the country

has propitious climatic conditions for breeding this species, with the 18th largest

population of sheep worldwide [1]. The lamb, in particular, has good feed

conversion , and provides meat of excellent quality. Lamb consumption tends

to increase, either with natural population growth, or by better organization of

production sectors for expansion of the market. However, a main limiting factor

for the greater economic use of this protein source is lamb gastrointestinal

infections by nematodes, mainly by Haemonchus contortus, an endoparasite

that is highly pathogenic to lambs. Usually, animals affected by this parasite

may show anemia, submandibular edema, cachexia, prostration, and even

death of the animal. In cases of chronic infection, the animals present slow

growth and low yields of wool and meat [2].

One strategy used to minimize losses from infections caused by

gastrointestinal nematodes has been the use of anti-parasitic agents. However,

the intensive use of these drugs as well as the administration of sub-optimal

doses and drug misuse because of misdiagnoses has caused a serious

problem of nematode drug resistance, which appears to be a worldwide

phenomenon [3]. Macrocyclic lactones are among the anthelmintics the control

of endo and ectoparasites in sheep, which have high efficiency and wide

spectrum of action. Such a macrocyclic lactone is moxidectin (MOX) (Figure 1),

a milbemycin produced from nemadectin, which in turn is obtained by the

fermentation of the fungus Streptomyces cyaneogriseus [4]

“Insert Figure 1”

MOX is a lipophilic compound and is stored mainly in abdominal and

subcutaneous adipose tissue [5]. Because MOX is slowly metabolized in these

tissues, it results in a mean residence time of the drug in the organism, greater

than that reported for other more hydrophilic antiparasitics, e.g. ivermectin,

according to studies reported in the literature for goats [6] and sheep [7].

Residues of veterinary drugs present in animal tissues in concentrations above

the maximum residue limits (MRLs) allowed by regulatory bodies, in meat

intended for human consumption, may endanger human health [8]

97

In general, the methods reported for the determination of MOX in food

matrices of animal origin such as bovine liver [9], bovine muscle [10], bovine

muscle and liver [11], milk [12, 13, 14], muscle, eggs and milk [15] and sheep

tissues (muscle, liver and fat) [16] make use of liquid chromatography with

fluorescence detection (LC-FLD). This detection technique is selective and

sensitive. However, a disadvantage is the requirement of a derivatization step to

produce a fluorescent derivative [17]. Also, the use of solid phase extraction

(SPE) cartridges during the sample preparation step is usually necessary [16,

18]. Those requirements make the LC-FDL methods time consuming, requiring

large amounts of organic solvents. On the other hand, liquid chromatography

with mass spectrometry in tandem (LC-MS/MS) as a detection technique can

use simpler procedures for the sample preparation, LC-MS/MS confers

specificity, detectability, accuracy, and allows the identity confirmation of the

analytes, required for the determination of trace residues (ng/g) of different

analytes in different matrices [19]. However, only a few studies have been

reported on the use of this technique for the determination of MOX residues in

edible tissues derived from animals [20, 21]. A comprehensive review related to

analytical and biological aspects of macrocyclic lactones was published by

Danaher et al. [17]. Nevertheless, to our knowledge, there is no reported study

regarding the determination of MOX residues in lamb tissues by UHPLC-

MS/MS.

The development of reliable analytical methods for monitoring veterinary

drug residues to meet strict MRLs established by national regulatory bodies and

international agencies is desirable. Thus, the aim of this study was to develop

and validate an analytical method using UHPLC-MS/MS for the determinations

of MOX residues in lamb tissues (muscle, liver, kidney and fat), applying

QuEChERS with modifications at the sample preparation step.

2. Materials and Methods

2.1. Solvents and reagents

Acetonitrile (ACN) HPLC grade was purchased from J.T. Baker

(Mallinckrodt Baker, USA) and was used for both in the preparation of mobile

phase and in the extraction of the samples. Formic acid and 5 M ammonium

formate solution used both as additive in the mobile phase preparation were

provided by Agilent Technology (Agilent Technology, CA, USA, p/n G1946-

85021). Magnesium sulphate (MgSO4) and sodium chloride (NaCl) were

obtained from Sigma (Sigma-Aldrich Co., USA) and used in the sample

extraction process. In the cleanup step, a kit supplied by Agilent Technology

98

containing PSA (primary secondary amine) and MgSO4 (in the proportions

50:150 mg/mg, p/n 5382-5022CH) and another kit containing PSA, C18

(octadecylsilane) and MgSO4 (in the proportions 50:50:150 mg/mg/mg, p/n

5982-5122CH) were used. Ultra-pure water was obtained by the Milli-Q

Simplicity system (Millipore, Bedford, MA, USA). The 0.22 μm porosity

polytetrafluoroethylene (PTFE) filtration membranes were purchased from Nova

Analítica (São Paulo, Brazil) and used for the filtration of sample extracts. The

analytical standards were emamectin (EMA), used as internal standard and

moxidectin (MOX) (Sigma-Aldrich, Co., USA), with a purity of 99.7% and 97.2%,

respectively.

2.2. Solutions preparation

The stock solutions were prepared in ACN at a concentration of 55 µg

mL-1 for MOX and 60 µg mL-1 for EMA, stored in amber bottles and kept at -20 0C for up to 90 days. The working solutions were prepared by appropriate

dilution of the stock solutions in ACN;MOX at the concentrations of 1.0 µg mL-1

and 2.0 µg mL-1 . and for EMA (internal standard) at 50 ng mL-1 and 100 ng mL-

1. The working solutions were stored at -20 0C, for up to 15 days.

2.3 Lamb samples

The blank samples of lamb used to develop the analytical method and to

accomplish the validation of the method were of known origin, with a guarantee

of freedom from the presence of MOX and EMA (internal standard) that were

the analytical focus of this work. The samples were provided by the Department

of Animal Science, Sheep and Goat Production and Research Center (LAPOC),

Federal University of Paraná, Curitiba, PR, Brazil. Nevertheless, to ensure the

viability of using these as blank samples, they were analyzed and the

chromatograms were inspected for the presence of any interference that could

compromise the development of the analytical method. No interference was

detected in the retention times corresponding to MOX and EMA.

In addition to the blank samples, incurred samples (samples

contaminated with MOX from an experiment conducted at LAPOC) were used.

In that study, the lambs were treated with a single dose of MOX (0.2 mg/kg

BW), by subcutaneous administration. Samples of target tissues were collected

from lambs slaughtered on the day 14 after the dose administration. All samples

were stored at -20 0C until analysis.

99

2.4. UHPLC-ESI-MS/MS conditions

The analyses were carried out in an UHPLC 1290 system coupled with

an Agilent 6460 triple quadrupole tandem mass spectrometer, with Electrospray

Ionization (ESI) source in the positive mode (Agilent Technology, CA, USA).

The source operation conditions were as follows: gas temperature, 200 0C; gas

flow, 10 L min-1; nebulizer, 15 psi; sheath gas flow, 12 L min-1; sheath gas

temperature, 400 0C; capillary voltage, 5.0 kV and nozzle voltage, 2.0 kV.

Sample analyses were performed in MRM scan mode (multiple reaction

monitoring, using a dwell time of 50 ms per channel), using MassHunter

software workstation, version B.06.00. Two transitions were monitored for MOX,

aiming to obtain at least 3 identification points, as recommended by the

European Community Guide 2002/657/EC [22]. Thus, the optimized mass

spectrometric parameters were established: fragment, 120 V and collision

energy 4 V for transitions m/z 640.0→528.0 (qualifier transition) and 8 V for

transitions m/z 640.4→498.0 (quantifier transition). Product ion spectrum was

obtained and high intensity fragments were chosen for quantification (Figure 2).

The chromatographic separation was carried out on a Zorbax Eclipse Plus C18

RRHD column (1.8 µm, 2.1 mm x 50 mm) (Agilent Technology, CA, USA, p/n

699775-902) using mobile phase comprising 5 mM ammonium formate solution

+ 0.1% formic acid (A) and acetonitrile + 0.1% formic acid (B) in a linear

gradient program as follows: 0 min until 1.50 min, 45% A and 55% B; 1.51 min

until 4.50 min, 5% A and 95% B; 4.51 min until 6.00 min, returned to the initial

proportion. The elution conditions were: a flow rate of 0.5 mL min-1, the

injection volume was 5 µL and the column oven temperature was 30 0C.

“Insert figure 2”

2.5. Sample preparation

Sample preparation was performed based on the original QuEChERS

method, described by Anastassiades et al. [23], but modifications were made to

improve the extraction efficiency, considering the comments of Prestes et al.

[24, 25] that discussed the original QuEChERS method and successful

modifications. In the first step the tissue samples (muscle, kidney, liver or fat)

were individually ground, still frozen, using a waring blender. Then, 2.0 g of

tissue was weighed into a 50 mL polypropylene tube, and 20 μL of 100 ng mL-1

100

EMA was added together with 2 mL of ACN and a ceramic homogenizer

(Agilent Technologies, p/n 5982-9313) and the tubes were vortexed for 5 min.

Then 0.8 g of MgSO4 and 0.2 g of NaCl were added, and the tube was shaken

for a further 5 min prior to centrifugation at 10,000 g, for 5 min, at 25 0C. For

cleanup of the muscle, liver and kidney samples an aliquot of 1.0 mL of the

supernatant was transferred to a microtube containing MgSO4 and PSA (150:50

mg/mg). vortexed for 30 s and then centrifuged for 1 min at 10,000 g, at 25 0C.

The supernatant was filtered on PTFE membranes (0.22 m) directly into the

sample vial, capped and injected into the UHPLC-MS/MS system. For fat

analysis, sample preparation was performed following the same procedure, but

the cleanup step was performed using MgSO4, PSA and C18 in the proportion

150:50:50, mg/mg/mg, respectively.

2.6. Validation of the analytical method

The analytical method developed for the analysis of MOX residues in

lamb tissues was validated following the recommendations of the Guide for

Validation of Analytical Methods established by European Community [22] and

the Veterinary International Conference on Harmonization [26]. The parameters

evaluated were linearity, sensitivity, selectivity, matrix effect, intra and inter-day

precision, accuracy, decision limit (CCα) and detection capability (CCβ). Limit of

quantitation (LOQ) and limit of detection (LOD) were also established.

3. Results and discussion

3.1. Optimization of the sample preparation procedure

Sample preparation procedure (extraction of the analyte and cleanup of

the extract) for MOX residues determination in the target tissues (muscle, liver,

kidney and fat) was conducted on a modified QuEChERS method, taking into

consideration modifications reported by Rúbies and et al. [27] for determination

of ivermectin, abamectin, emamectin, eprinomectin, doramectin and moxidectin

in meat, and by Furlani et al. [28] for quantitation of ivermectin, abamectin,

doramectin, and moxidectin in dairy products. The purpose for introducing

modifications in the QuEChERS method was to increase the extraction

efficiency for MOX residue determination in the lamb target tissues, as well as

to develop a green and low cost method by minimizing the use of solvents and

reagents. Thus, in the original QuEChERS method [23], the analyte residues

are extracted from 10 g of sample with 10 mL of ACN, however in our method

101

only 2.0 g of sample of each target tissue were extracted with 2 mL of ACN.

ACN was used as the extraction solvent since it produces protein precipitation

and a lower amount of lipophilic coextractives, which is required for LC-MS

analyzes. Methods for extracting MOX residues using ACN are reported in the

literature for different matrices, such as bovine liver [29] and porcine liver, meat

and fish tissue [30], but not for the lamb target tissues reported in this study.

The salting out effect, aiming to increase the efficiency of MOX extraction was

promoted by use of 0.2 g of NaCl and 0.8 g of MgSO4.

After the extraction process, cleanup tests were performed by dispersive

solid-phase extraction (d-SPE), employing PSA and C18. The PSA has a strong

chelating effect, due to the presence of the primary and secondary amino

groups in its structure, thus retaining free fatty acids, sugars and polar

compounds present in the matrix. The sorbent C18 promotes a more effective

cleanup in matrices that contain high fat content, showing good efficiency in the

removal of apolar compounds. Thus, for muscle, kidney and liver matrices, the

cleanup process using PSA and MgSO4 provided a suitable extract for injection

in the UHPLC-MS/MS system. However, for the fat target tissue, C18 dispersive

was used together with PSA to promote a more effective cleanup. Thus, after

extraction step with 2 mL of ACN, an aliquot of 1 mL of the extracts from

muscle, kidney and liver tissues was submitted to a cleanup by adding 50 mg of

(PSA) and 150 mg of MgSO4, while for fat tissues 50 mg of PSA, 50 mg of C18

and 150 mg of MgSO4 were used.

3.2. Method validation

To evaluate the specificity and selectivity of the analytical method,

samples of all tissues free of MOX and EMA (blank samples), were extracted

and evaluated for the presence of possible interferents. No interferences were

observed in the retention times corresponding to MOX (4.28 min) and EMA

(1.29 min) in any analyzed target tissue (muscle, liver, kidney and fat) when the

transitions monitored in MRM for each molecule were extracted, This ensures

the selectivity and specificity of the analytical method, as well as the viability of

the blank samples to be used in the validation procedure.

“Insert Figure 3”

For matrix effect evaluation, analytical curves of MOX and EMA were

prepared in solvent and in the extract from the target tissues (muscle, kidney,

102

liver and fat). The matrix effect was evaluated by the statistical comparison

between the average concentrations obtained from the analysis in the solvent

and in the extract from the target tissues, using F test (Snedecor) for equal

means and confirmation by the t test (for different samples), at the 95%

confidence level. Thus, since matrix effect was observed, all samples were

quantified using a matrix-matched analytical curve in seven different

concentration levels for muscle (5, 10, 25, 50, 75, 100 e 200 g kg-1) and eight

different concentration levels for kidney, liver and fat (5, 10, 25, 50, 75, 100, 150

e 200 g kg-1). To evaluate linearity, three analytical curves with seven

concentration levels were prepared in triplicate. The calibration was performed

by linear regression of the peak-area ratios of MOX/EMA (internal standard)

versus standard concentration ratios. The linearity was expressed as the linear

correlation coefficient (r), presenting r values higher than 0.99 (Table 1),

showing strong correlation between the concentration levels and analytical

response.

“Insert Table 1”

The precision of the method was carried out in two steps: intra-day

precision and inter-day precision. For intra-day precision, the blank sample was

spiked with working solution for different concentration levels: 5, 50, 100 and

200 g kg-1, representing low, low middle, high middle and high concentration

levels. Each concentration level was prepared in six individual replicates and

the results were expressed as coefficient of variation (CV%). The inter-day

precision was performed as the intra-day precision, but on three different days,

by the same analyst using the same instrument. For both intra-day and inter-

day precision, the CV% values obtained were between 5.89-19.8% and 8.02-

22.5% respectively, as recommended in the guidelines [22, 26]. Accuracy was

assessed through the recovery test, by spiking blank samples with working

solution at 4 levels of fortification 5; 50; 100 and 200 ng g-1. Each level of

fortification was evaluated using 6 replicates. The results were expressed as the

percentage of concentrations in the fortified blank samples regarding the

concentration in the fortified extract blank sample at the same concentration.

The mean values of accuracy, obtained through recovery trials, were within the

range of 70 to 120%, as recommended by the guidelines adopted [22, 26].

Limits of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were established

by analyzing the fortified matrix with standard solution of MOX. LOD was

expressed as the lowest concentration whose signal is equal to 3 times the

signal-to-noise ratio, while LOQ was established as the lowest concentration

capable of producing a signal equivalent to 10 times the signal-to-noise ratio.

103

The LOQ was taken as the first level of the analytical curve for all tissues, that

is, 5 g kg-1. The LOD (1.5 g kg-1) was obtained by diluting the LOQ.

The decision limit (CCα) and detection capability (CCβ) were determined

as described in the European Community Guide 2002/657/EC [22], in

accordance with ISO 11843 [31], by matrix-matched analytical curves

procedure, taking into account that MOX has MRL‟s established [32]. CCα was

(α = 5%) equal to the MRL plus 1.64 times the standard deviation (CCα =LMR +

1,64 x σ) and CCβ corresponding to the decision limit (CCα) plus 1.64 times the

standard deviation of reproducibility, adopting a β error equal to 5%.

MOX stability tests both in solution and in the tissue samples were

performed under the validation of the analytical method. The short-term stability

study was carried out to evaluate if MOX remains stable in the biological matrix

under the conditions of temperature, luminosity and humidity present in the

laboratory. Thus, tissue samples were fortified (n=3) at the MRL level of each

tissue (except fat tissue, which was fortified at the central point of the analytical

curve, 100 ng g-1) and left on the bench for 4 hours and after that period were

submitted to the extraction and analysis process. The results obtained were

compared with the results of samples extracted after fortification as RSD value

≤ 15%.

In the study of stability of freeze/thaw cycles, the aim was to evaluate if

the analyte remains stable after 3 cycles of freezing and thawing. The samples

were fortified as in the previous study and frozen for 24 hours and then thawed,

again frozen for at least 12 hours and then thawed. This process was repeated

and the samples were analyzed at the time of 24, 48 and 96 hours in this

freeze-thaw cycle. After these cycles the samples were submitted to the

extraction and analysis process. The results obtained were compared with the

results of samples extracted shortly after fortification. The acceptance criteria

used were the same for precision and accuracy.

The results (mean ± standard deviation) of short-term stability and

freeze/ thaw cycles show that there was no significant difference between the

samples when analyzed by ANOVA (confidence level 95 %), through the F test

and the t test. Therefore, there was no degradation of the MOX in the biological

matrices, guaranteeing the stability of the MOX in the matrices analyzed.

Results of the analytical method validation parameters are described in Table 1.

Analysis of incurred samples is recommended to demonstrate the

precision of a method in samples genuinely contaminated, providing confidence

that the method can be deemed appropriate for the intended purpose and

provide confidence that the method could be used by regulatory agencies in

health surveillance programs, as well as in pharmacokinetics and depletion

studies [32, 33]. Thus, the analytical method developed and validated in this

study was applied to quantify MOX residues in incurred samples of lamb tissues

104

(muscle far from and near of the MOX application site, kidney, liver and fat).

Three animals treated with MOX were slaughtered to obtain the tissues

analyzed, and all final processed extracts were prepared in triplicate prior to

instrumental analysis by UHPLC-MS/MS. Data obtained (Table 2) demonstrated

that the method is suitable for the determination of MOX residues in all lamb

tissues since all, but one, CV% values for the triplicates of the all samples

analyzed were in the range of 1.25 to 14.70%. The only triplicate out of this

range was from a fat samples (CV 23%). Nevertheless, for the other two

samples of fat the CV value was lower than 8.90%. These results contribute to

demonstrate the applicability of the method in unknown samples.

Per the Codex Alimentarius [34] the MRLs allowed in sheep tissues for

MOX are: 50 μg kg-1 in muscle and kidney, 100 μg kg-1 in the liver and 500 μg

kg-1 in fat. The results found for all samples from muscle, kidney and liver

showed MOX residues at concentration levels lower than the MRLs established

for each tissue (Table 2). However, the MOX residues levels found in two

samples from the fat tissue were higher than the established MRL value, which

demonstrates a longer period of persistence of MOX in this tissue, related to the

high lipophilicity of the drug, as observed by Lifschitz et al. [35].

“ Insert Table 2”

4. Conclusions

The analytical method developed and validated in this study is adequate

for the quantitation of MOX residues in lamb tissues (muscle, kidney, liver and

fat). The same extraction procedure and dispersive solid phase extraction (d-

SPE) for the extract cleanup was applied to the different matrices studied, which

demonstrates the versatility of the method. In addition, the d-SPE extract

cleanup procedure used is made simple, cheaper and faster by avoiding the

use of SPE cartridges, which is important for methods to be used for routine

analysis. The method reported here enabled unequivocal quantitation and

confirmation of MOX due to the selectivity of the MS/MS system. Also, must be

mentioned that has high detectability and provide suitable results for the

quantitation of MOX residues in accordance to the MRL values established by

the European Union for lamb tissues, as well as well below the MLR values.

Data from incurred samples demonstrated the precision of the method in

samples genuinely contaminated, providing confidence that can be considered

appropriate for determining MOX residues in lamb tissues available at the retail

market (as part of health surveillance programs for the protection of consumer

health), as well as to be used in pharmacokinetic and depletion studies.

105

Acknowledgements

The authors would like to thank the São Paulo Research Foundation-

Agilent Technologies for supplying the Agilent UHPLC 1290-MS/MS 6460

system employed in this study (FAPESP-Agilent Grant number 2013/50452-5);

and to the National Council for Scientific and Technological Development

(CNPq Grant number 305390/2013-9; CNPq Grant number 141964/2012-0),

Brazil. We also thank Dr. Lenore Kelly, from Agilent Technologies, for her

assistance with the language correction of the manuscript.

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108

Figure captions

Figure 1: Moxidectin chemical structure.

Figure 2: Mass Spectrum of moxidectin.

Figure 3: Extracted MRM chromatograms for blank tissues and blank tissues spiked with

moxidectin at the method limit of quantitation concentration (5 ng g-1). (A) Muscle, (B) Kidney,

(C) Liver and (D) Fat.

109

Figure 1

21

2223

24

O

CH3 CH3

CH3

O

OO

CH3

O

CH3 CH3

OH

N

H

OHH

CH3H

OCH3

H

110

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Figure 2 11

12

111

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

Figure 3 23

24

112

Table 1: Analytical results of the method validation parameters

Parameters Specifications* Muscle Kidney Liver Fat

Specificity/

Selectivity

No interference OK OK OK OK

Linearity r ≥ 0.98 y = 0,0087x + 0,0108

r = 0.9998

y = 0,0073x - 0,063

r = 0.9929

y = 0,0591x - 0,0069

r = 0.9991

y = 0.0289x – 0.1534

r = 0.9969

Intra-day

precision

n=6

Analite

Concentration

%CV

Analite

concentration

%CV)

Analite

concentration

%CV)

Analite

concentration

%CV

Analite

concentration

%CV)

< 1 µg/kg 30 5 µg/kg 5.9 5 µg/kg 10.8 5 µg/kg 13.1 5 µg/kg 19.2

≥ 1µg/kg < 10 µg/kg 25 50 µg/kg 6.6 50 µg/kg 10.1 50 µg/kg 11.8 100 µg/kg 15.1

≥ 10 µg/kg < 100 µg/kg 15 100 µg/kg 6.6 100 µg/kg 13.0 100 µg/kg 7.0 500 µg/kg 14.5

≥ 100 µg/kg 10 200 µg/kg 8.5 200 µg/kg 7,6 200 µg/kg 6.0 1000 µg/kg 16.1

Inter-day

precision

Analite

Concentration

%CV

Analite

concentration

%CV

Analite

concentration

%CV

Analite

concentration

%CV

Analite

concentration

%CV)

< 1 µg/kg 45 5 µg/kg 20.6 5 µg/kg 17.7

5 µg/kg 21.8 5 µg/kg 22.5

≥ 1µg/kg < 10 µg/kg 32 50 µg/kg 8.7 50 µg/kg 8.7 50 µg/kg 11.9 100 µg/kg 15.1

≥ 10 µg/kg < 100 µg/kg 23 100 µg/kg 8.5 100 µg/kg 14.6 100 µg/kg 8.50 500 µg/kg 13.7

≥ 100 µg/kg 16 200 µg/kg 8.0 200 µg/kg 8.9 200 µg/kg 9.51 1000 µg/kg 9.8

Accuracy

Analite

Concentration

%

Accuracy

Analite

concentration

%

Accuracy

Analite

concentration

%

Accuracy

Analite

concentration

%

Accuracy

Analite

concentration

%

Accuracy

< 1 µg/kg -50% a +

20%

5 µg/kg 71.6 5 µg/kg 78.4 5 µg/kg 108.9 5 µg/kg 92.5

≥ 1µg/kg < 10 µg/kg -40% a

+20%


≥ 10 µg/kg < 100 µg/kg -30% a

+10%


≥ 100 µg/kg -20% a

+10%


LOD n = 10 1.5 µg/kg 1.5 µg/kg 1.5 µg/kg 1.5 µg/kg

LOQ n = 10 5 µg/kg 5 µg/kg 5 µg/kg 5 µg/kg

Specification from the guidelines

113

Table 2: MOX residues in lamb tissues collected after single subcutaneous dose administration of 0.2 mg/kg body weight and after 28 days withdrawal

period.

Animal

Muscle - near of application site Average (ng g-1) CV %

Muscle - far from application site

Average (ng g-1)

CV%

Kidney Average (ng g-1)

CV%

Liver Average (ng g-1)

CV%

Fat Average (ng g-1)

CV%

(ng g-1) (ng g-1) (ng g-1) (ng g-1) (ng g-1)

1

22,45

20,23 10,90

12,91

12,83 3,50

18,60

18,00 6,25

14,64

13,60 9,90

328,90

332,52 1,25 18,04 13,22 16,70 12,07 336,90

20,21 12,34 18,63 14,00 331,17

2

19,50

19,66 4,35

13,78

14,40 5,90

19,50

18,05 14,45

23,00

21,80 9,70

633,20

625,75 23,00 20,60 15,37 19,63 19,34 476,76

18,92 14,04 15,04 22,80 767,27

3

21,66

21,54 1,78

16,95

16,30 3,75

19,85

20,95 14,70

19,50

18,40 7,90

848,00

768,95 8,90 21,85 16,23 24,45 16,75 731,50

21,11 15,74 18,59 18,95 727,35

114

ANEXO 3

Tissue residue depletion study of moxidectin conducted in lambs

using an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass

spectrometry (UHPLC-MS/MS) analytical method

Artigo em preparação para ser submetido ao Journal Food and Chemical

Toxicology

115

Tissue residue depletion study of moxidectin conducted in lambs

using an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass

spectrometry (UHPLC-MS/MS) analytical method

Michelle Del Bianchi a; Maria Ângela M. Fernandes b; Alda Lúcia G. Monteiro b;

Juliana A. Teles a; Arturo Anadón c, Felix G. R. Reyes a.

a School of Food Engineering, Department of Food Sciences, University of

Campinas - UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.

b Department of Animal Science, Sheep and Goat Production and Research

Center (LAPOC), Federal University of Paraná, Curitiba, PR, Brazil.

c Department of Toxicology and Pharmacology, Faculty of Veterinary Medicine,

Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spain.

Corresponding author.

Email addresses <[email protected]> (F.G.R. Reyes)

Phone: +55-19-35212167

Manuscript to be submitted for publication at Food and Chemical Toxicology

mailto:[email protected]

116

University State of Campinas

Food Engineering College

Department of Food Sciences

Highlights

1. A tissue residue depletion study of Cydectin® NF, containing 1% of

moxidectin, in lambs is reported by the first time.

2. A reliable validated UHPLC-MS/MS method was used for quantitation of

moxidectin of tissue residues in lamb target tissues.

3. No residues of moxidectin in tissues were below the the method LOQ

meaning consistency on withdrawal time calculation.

4. A withdrawal time of 31 days could be established for Cydectin® NF

when is used in the lamb.

5. Depletion study valuable to regulatory agencies and national authorities‟

responsible for consumer health protection.

117

ABSTRACT

To date, a tissue depletion study of moxidectin (Cydectin® NF) in lambs is not

available. Thus, the aim of the present study was to conduct such study determining

the residue concentration of moxidectin (MOX) in the target tissues (i.e., muscle,

liver, kidney and fat) and subsequently calculate the withdrawal period for moxidectin

in the lamb. For this purpose, 22 healthy Suffolk lambs, weighing 36.1 ± 3.2 kg and

untreated with anthelmintics, were analyzed using a reliable ultra-high-performance

liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) analytical

method. All individual samples from the different target tissues (i.e. muscle, liver,

kidney and fat) showed result above the method limit of quantitation (LOQ) (5.0 μg/kg

for all matrices) at the several sacrifice point times (days). The lambs were treated

with a single subcutaneous (s.c.), dose of 0.2. mg Cydectin® NF/kg BW. Samples of

target tissues were collected on 2, 4, 7, 14, 28 and 42 days after Cydectin® NF

administration. During the whole study, the highest drug residue level occurred in the

target tissue fat. From the other target tissues (i.e. muscle, liver, kidney), MOX

concentrations were below the maximum residue limit (MRL) recommended by the

European Union (EU), under Commission Regulation (EU) nº. 37/2010. Considering

the MRL value of 500 µg/kg for MOX residues in fat for ovine, our results allowed the

estimation of a MOX withdrawal period of 31 days. This indicates that the withdrawal

period established for MOX in sheep, do not apply for lamb (other category of

animal), must ensure human food safety and not to hinder international trade of this

food commodity. Thus a specific withdrawal period for the lamb is necessarily

established.

Keywords: moxidectin; lamb; tissue depletion study; UHPLC-MS/MS; withdrawal

period.

1. Introduction

118

Sheep farming for meat is an activity that has been expanding in several

regions of Brazil (Zen et al., 2014). In this species, lamb meat is the one with the

highest acceptability in the consumer market, with better carcass yields in a shorter

production cycle, but higher efficiency due to the high growth rate of the animals

(Warner et al., 2010). However, gastrointestinal nematode infections have been a

critical obstacle to the expansion of this animal activity, with Haemonchus contortus

infection (McManus et al., 2011; Hoste et al., 2016) of overwhelming importance.

Macrocycline lactones (i.e., avermectins and milbemycins) are potent

antiparasitic drugs widely used in the treatment of parasitic infections in animals and

human parasites for the prevention of river blindness, a parasitic disease caused by

Onchocerca volvulus. Macrocyclic lactones are considered as the last „traditional‟

class of anthelmintics introduced consisting of two closely related chemical groups:

avermectins, which include abamectin, doramectin, ivermectin, emamectin,

eprinomectin, and selamectin; and milbemycins (also called nemodectins), with

moxidectin being the most representative compound. They are broad-spectrum drugs

with endectocidal and ectocidal parasiticide activity, ectoparasiticides (Shoop et al.,

1995).

Moxidectin (MOX) (5 - O -demethyl - 28 - deoxy-25-(1,3-dimethyl-1-butenyl)-

6,28 - epoxy - 23 - (methoxyimino) - (6R,23E,25S(E)) -milbemycin B); with molecular

formula: C37H53NO8) and CAS Number: 113507-06-5 was introduced in 1997 and

isolated from Streptomyces cyanogrise and Streptomyces hygroscopicus. Moxidectin

has been worldwide regulated for use in several animal species intended to produce

food for human consumption (i.e. cattle, sheep and equidae) (Global MRL Data

Base; Romero-González et al., 2014). In sheep is used in respiratory and

119

gastrointestinal nematodes, diptera larvae and mange mite‟s infections; of particular

interest is its use in the gastrointestinal nematode infection Haemonchus contortus

resistant to benzimidazoles, ivermectin and doramectin.

The mode of action on parasites of the milbelmicin moxidectin is similar to

ivermectin and abamectin by binding to ligand-gated chloride channels, more

specifically the subtypes that are gamma-aminobutyric (GABAA) mediated and

glutamate-gated (Shoop et al., 1995). The consequence of moxidectin binding and

activation is an increased membrane permeability leading to death.

The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) evaluated

MOX at its 45th and recommended a health-based acceptable daily intake (ADI) of 0-

0.0015 mg/kg bw (JECFA, 1998). In this regard, JECFA also recommended MRL

(maximum residue limit) values for cattle, sheep and deer, referring to residues of the

pharmacological active substances in edible tissues form the food producing animals.

In the case of sheep, the recommended values are 50; 100; 50 and 500 µg/kg for

muscle, liver, kidney and fat, respectively (JECFA, 1998). Those recommended

values for those target tissues have been adopted by Codex Alimentarius

Commission (Codex, 2015a), and the European Union (EU, 2010) and by the

legislative framework of several countries, such as Argentina, Chile and Colombia

among others. United State of America established MRLs values of 200, 50 and 900

µg/kg for liver, muscle and fat, respectively (Global MRL Data Base) but not for the

target tissue kidney as established by the Codex alimentarius and the European

Union.

To ensure that target tissues do not contain residues of the pharmacologically

active substance in excess of the MRL value a withdrawal period is established. That

is, the period of time between the last administration of a drug and the collection of

120

edible tissue or products from a treated animal that ensures the contents of residues

in food comply with the MRL for this veterinary drug (Codex 2015b). The withdrawal

period could be different for each veterinary medicinal product, animal

species/category and target tissue (Anadón et al., 2001, 2012).

Presently, MOX is not legally authorized for use in sheep in Brazil, only for

cattle and horses (CPVS, 2016). However, there is evidence in practice of its “extra-

label” use by sheep breeders in Brazil (Cezar et al., 2010; Cruz et al., 2010;

Veríssimo et. al., 2012). The practice has become worrisome due to the worldwide

increased reports of parasitic resistance (Kaplan and Vidyashankar, 2012; Martínez-

Valladares et al., 2013; Papadopoulos et al., 2012). At the same time, the lack of

knowledge or failure to comply with the withdrawal period for this species raises the

risk associated with the consumption of levels of pharmacological residues not

allowed in the meat product. Furthermore, to our knowledge no information is

available in the literature regarding tissue residue depletion studies of MOX in the

lamb meat.

Oral, injectable and pour-on formulations containing MOX are the veterinary

pharmaceutical presentations available on the world market for sheep treatment

against external and internal parasites (Prichard et al., 2012). Injectable moxidectin is

completely and rapidly absorbed through the subcutaneous (s.c.) pathway being

widely distributed to tissues, particularly those with high fat content (Lifschitz et al.,

1999).

It has been reported that the high lipophilicity of MOX favors its deposition at

the site of application, which allows it to be slowly released into the bloodstream,

providing longer intervals between treatments with lower dose and greater efficacy.

121

This may contribute to its persistence in target tissues and to a prolonged elimination

half-life (Alvinerie et al., 1998; Prichard et al., 2012; Rodriguez-Vivas et al., 2010).

In general, the methods reported for the determination of MOX in meat food

matrices of animal origin such as bovine muscle liver (Ali et al., 2000; Chou et al.,

2004; Xia et al., 2010), and sheep muscle, liver, and fat (Berendsen et al., 2007;

Lifschitz et al., 2000) make use of liquid chromatography with fluorescence detection

(LC-FLD). This detection technique is selective and sensitive. However, presents as

a disadvantage the requirement of a derivatization step to produce a fluorescent

derivative (Cerkvenik-Flajs et al., 2010) and usually the use of solid phase extraction

(SPE) cartridges during the sample preparation step. On the other hand, liquid

chromatography with mass spectrometry in tandem (LC-MS/MS) requires simpler

procedures in the sample preparation step and provides structural identity of the

individual components with high molecular specificity and detection capability (Pitt,

2009), being recommended by Bandeira et al. (2017) for determination of

avermectins residues in ovine muscle samples. However, few studies have been

reported in the literature on the use of this technique for the determination of MOX

residues in edible tissues derived from animals (Pan, 2011; Robert et al., 2013). In

addition, to our knowledge, there is no reported study regarding the depletion of MOX

residues in lambs in which target tissues have been analyzed by ultra-high

performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)

method for the calculation of the withdrawal period. To date, the only report related to

a LC-MS/MS method for the determination of MOX is the one published by Baptista

et al. (2017) in serum from Suffolk lambs.

Therefore, the aim of this study was to conduct a MOX tissue depletion study

in lambs by determining MOX residues in four different target tissues (muscle, liver,

122

kidney and fat), after s.c. administration of a single recommended dose of 0.2 mg

Cydectin® NF /kg BW with a view to calculate the withdrawal period of MOX in lambs.

In order to monitor the presence of MOX residues in the lamb target tissues, an

analytical method by UHPLC-MS/MS was developed and fully validated. Based on

the results data obtained, the MOX withdrawal period was calculated following the

recommendations of the European Medicines Agency (EMEA, 1996).

2. Materials and methods

2.1. Chemicals and reagents

Cydectin® NF was supplied by Zoetis-Fort Dodge Animal Health, Brazil.

Analytical standards of MOX and emamectin (EMA) (internal standard) were obtained

from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), 99.7% purity and 97.2% purity,

respectively. Magnesium sulphate (MgSO4) and sodium chloride (NaCl) were

supplied by Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). At the sample preparation step, for

the extract cleanup, a kit containing PSA (primary secondary amine) and MgSO4 (in

proportions 50:150 mg) (Part No. 5,982-5022CH) and another kit containing PSA,

C18 (octadecylsilane) and MgSO4 (in the proportions 50:50:150 mg) (Part No. 5982-

5122CH) were supplied by Agilent Technology (Santa Clara, CA, USA). Acetonitrile

(ACN) was from J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA). Formic acid and ammonium

formate solution (5M) were supplied by Agilent Technology (Santa Clara, CA, USA).

Polytetrafluoroethylene (PTFE) filtration membranes (0.22 μm) were from Nova

Analítica Importação e Exportação Ltda (São Paulo, SP, Brazil). Water was purified

by distillation and passage through a Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA, USA).

123

2.2 Standards

Analytical standards - moxidectin (MOX) and emamectin (EMA) - {internal

standard (PI)} were obtained from Sigma-Aldrich, 99.7% pure and 97.2% pure,

respectively. The stock solutions were prepared in ACN at the concentration of 55

μg/mL for moxidectin and 60 μg/mL for emamectin, stored in amber bottles at -20 °

C. The working solutions were prepared by appropriate dilution of stock solutions and

stored at -20 °C for up to 15 days.

2.3 Animals and handling

The experiment was conducted at the Sheep and Goat Production and

Research Center (LAPOC), Federal University of Paraná, Curitiba, PR, Brazil

(25º25'S, 49º8'W, 930 m altitude). All animal evaluations and handling were carried

out according to the standards approved by the Ethics Committee on Animal Use of

the Agricultural Science Sector of the Federal University of Paraná (Protocol No.

055/2011).

Twenty-two male and female Suffolk lambs, clinically healthy and never

treated with antiparasitc medicines, were selected. From birth to weaning, these

lambs and their mothers (ewes) were kept in suspended sheep shed. During this

period, lambs received a diet composed of pelleted concentrate (Golden Sheep

Cordeiros e Borregos®; Agraria Ovinos; 20 g/kg Crude Protein) and corn silage,

through creep feeding supplementation, with free access to water. The ewes had

been no treated with MOX (Cydectin® NF) for more than 6 months before. The lambs

124

were vaccinated against clostridial diseases (Sintoxan Polivalent®, Merial, Brazil)

and weaned at 74 ± 10 days of age and 27.0 ± 2.1 kg body weight (BW). After

weaning, lambs were kept in individual suspended pens including the evaluation

period and they received 40% ryegrass hay and 60% concentrate (Golden Sheep

Cordeiros e Borregos®; Agraria Ovinos; 20 g/kg Crude Protein) ad libitum, twice a

day, with a surplus daily of approximately 10% not to limit feed intake. The diet was

formulated to meet the requirements of weaned lambs with fast growth potential

(NRC, 2007). In only two moments, the lambs underwent solid fasting: (i) 12 hours

prior to weighing to calculate the drug dosage and (ii) 16 hours prior to slaughter.

2.3.1 Experimental design

The evaluation started when the lambs presented 113 ± 1 days of age and

36.1 ± 3.2 kg. All the animals received a single dose (0.2 mg/kg BW) of Cydectin® NF

- contain 1% moxidectin by subcutaneous application (Zoetis-Fort Dodge Animal

Health, Brazil) at the inner surface of the left thigh. The dose was calculated based

on individual body weight, considering the 1% concentration of the veterinary

medicine used.

The experimental design was completely randomized and the twenty-two

animals were randomly sacrificed at different times after drug application (2, 4, 7, 14,

28 and 42 days after application). The animals at each time point consisted of two

males and two females, with the exception of days 7 and 14 in which only 2 females

and 1 male were sacrificed. In addition, 2 males were used as control (without

treatment with MOX) to obtain the blank target tissue samples for validation of the

analytical method.

125

The lambs were slaughtered in the experimental farm abattoir (Federal

University of Paraná) after solid fasting of 16 h. The stunning was performed using

electric discharge of 220 V for eight seconds and bleeding by sectioning the jugular

veins and carotid arteries. During the evisceration of the carcasses, the perirenal fat

samples were collected. Carcasses were cooled in a cold chamber at 5 °C for 24 h

and then divided longitudinally into two half-carcasses and seven commercial cuts.

The subcutaneous fat of the loin was taken and combined with the perirenal fat to

determine the concentrations of MOX residues in the adipose tissue. In addition to

fat, liver, kidney and muscle samples (loin) were also collected and conditioned in

appropriately identified plastic bags (tissue, days post-treatment, date of sampling,

animal number and group) and frozen at -20 0C until analysis.

2.4. Analytical method and validation

The MOX residues in the target tissues were determined by liquid

chromatography (UHPLC) coupled to a triple quadrupole mass spectrometer

(MS/MS) using electrospray ionization in the positive mode as ionization source. The

developed analytical method was validated taking into consideration the International

Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for Registration of

Veterinary Medicinal Products requirements (VICH, 2015).

2.4.1. Samples preparation

126

In this work, modifications were made to the original QuEChERS (Quick, Easy,

Cheap, Effective, Rugged, Safe) method, proposed by Anastassiades et al. (2003).

Thus, in a 50mL polypropylene tube containing 2.0 g of sample (previously crushed

and still frozen), were added 20 μL of the working solution containing the internal

standard (100 ng mL-1), 2 mL ACN and a homogenization ceramic (Part. No. 5982-

9313, Agilent Technologies®). Then the tubes were vortexed for 5 minutes and

subsequently 0.8 g of MgSO4 and 0.2 g of NaCl were added. Again, the tubes were

vortexed for 5 minutes and centrifuged at 10,000 g (5 minutes / 25 ° C). For cleanup,

1.0 mL aliquot of the organic phase was transferred to a microtube containing MgSO4

and PSA (150: 50 mg), shaken for 30 seconds and centrifuged at 10,000 g (1 minute

/ 25 ° C). The cleanup of the fat sample was performed using the ratio of 150: 50: 50

mg of MgSO4, PSA and C18, respectively. The supernatant was then filtered into

PTFE membranes with porosity 0.22 μm in diameter, directly into the vial, and

injected into the LC-MS / MS system.

2.4.2. LC-MS/MS analysis

All analyzes were performed on the Agilent UHPLC 1290 system consisting of

quaternary pumps, automatic injector, thermostat for column and sampler coupled to

a 6460 triple quadrupole mass spectrometer (Agilent Technology, CA, USA). The

data acquisition and treatment control software was MassHunter (Agilent

Technology, CA, USA) version B.06.00. The samples were analyzed using Zorbax

Eclipse Plus C18 RRHD column ( 1.8 µm, 2,1 mm x 50mm) (Agilent Tecnologies,

CA, USA, p/n 699775-902). and mobile phase gradient solution of 5 mM ammonium

formate + 0.1% formic acid (A) and acetonitrile + 0.1% formic acid (B) in a linear

gradient program as follows: 0 min until 1.50 min, 45% A and 55% B; 1.51 min until

127

4.50 min, 5% A and 95% B; 4.51 min until 6.00 min, returned to the initial proportion.

The elution conditions were optimized with flow rate of 0.5 mL/min, injection volume

was 5 μL and oven temperature was 30 °C. The following ionization source

parameters were adopted for the MOX method: gas temperature – 200ºC; gas flow –

10L/min; nebulizer – 15 psi; sheath gas temperature – 400 ºC; sheath gas flow –

12L/min; capillary – 5000 V and nozzle voltage – 2000 V.

MOX quantitation was performed in MRM (multiple reaction monitoring) mode

using EMA as an internal standard. For the two analytes, two transitions were

monitored, being a transition related to the quantifying ion and another related to the

qualifying ion, aiming to obtain at least 3 identification points, as recommended by

the European Community Guide 2002/657 / EC (EC, 2002).

2.4.3. Validation of the analytical method

The developed analytical method was fully validated according the

International Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for

Registration of Veterinary Medicinal Products requirements (VICH, 2015)

requirements - linearity, accuracy, precision, method quantitation limit (LOQ), method

detection limit (LOD) and specificity.

2.5. Data analysis

Data obtained was calculated with the withdrawal period calculation program

WT 1.4 that was recommended by the Committee for Veterinary Medicinal Products

EMEA/CVMP/036/95 (EMEA, 1996). This guide recommends consider the linear

128

regression technique of log-transformation; it was determined as the time when the

one-sided 95% upper tolerance limit of the regression line was below the MRL with

95% confidence.

3. Results and Discussion

3.1. Analytical method

As previously mentioned, the method developed for the analysis of moxidectin

in lamb tissues was validated following the recommendations of the VICH (2015).

Analytical curves for the determination of MOX residues in the target tissues were

prepared by fortifying blank tissues with MOX to produce a linear concentration in the

range of 5 - 200 μg/kg, and showed a correlation coefficient exceeding 0.99. The

method limit of quantitation (LOQ) was 5.0 μg/kg for all matrices. The overall

accuracy for the determination of MOX in target tissues was between 70 - 120%,

obtained from recovery tests. The average interday and intraday precisions were

evaluated from the relative standard deviations and were lower than 5.5% for MOX in

all matrices.

3.2. Tissue residue depletion

In this study, the injectable veterinary medicinal product Cydectin® NF

containing MOX was well tolerated by lambs after subcutaneous application of the

recommended dose (0.2 mg Cydectin® NF/kg BW), and no adverse reactions were

observed at the injection site of administration (i.e. left thigh).

129

Mean MOX residue concentration in muscle tissue (i.e. loin, liver, kidney and

fat – perirenal plus subcutaneous) on days 2, 4, 7, 14, 28 and 42 after subcutaneous

application and respective estimates of relative standard deviations are show in

Table 1, and MOX residue depletion in the target tissues is shown in Figure 1. The

curves were constructed from the MOX residue concentration averages obtained at

each point of collection. Data indicates that there is a slow elimination of MOX in all

tissues, with a higher permanence in the adipose target tissue (perirenal and

subcutaneous). It is clearly observed in both liver and kidney residue depletion

curves a great similarity from the 2nd to the 28th day after moxidectin subcutaneous

application.

Table 1. Residue concentrations of moxidectin (MOX) in lamb target tissues after

single dose (0.2 mg Cydectin® NF/kg BW) subcutaneous injection.

Days

Post -administration

Tissue residue concentration (mean ± SD) of MOX (µg/kg)

Muscle Liver Kidney Fat

2 25.93 ± 6.90 34.85 ± 9.25 33.96 ± 8,35 750.12 ± 202.84

4 22.46 ± 3.65 44.20 ± 7.00 42.30 ± 11.70 729.18 ± 239.3

7 20.65 ± 4.45 43.95 ± 6.30 46.95 ± 7.00 675.57 ± 240.06

14 14.51 ± 1.74 17.90 ± 3.85 19.00 ± 7.90 575.73 ± 208.76

28 11.57 ± 2.27 16.80 ± 3.30 16.52 ± 4.82 297.8 ± 84.41

42 9.04 ± 0.50 11.65 ± 2.20 9.41 ± 0.78 123.29 ± 35.57

130

Figure 1. Residue depletion curves of MOX from lamb fat, liver, kidney and muscle

after single dose subcutaneous injection (0.2 mg Cydectin® NF/kg BW).

As shown in Table 1, from the first to the last day of collection all samples for

the 4 target tissues were quantifiable. Thus, all values were above the LOQ (5

μg/kg). The maximum residue concentrations of MOX found in muscle (25.93 ± 6.90

μg/kg, 2 hours after), liver (44.20 ± 7.00 μg/kg, 4 hours after), kidney (46.95 ± 7.00

μg/kg, 7 days after) and fat (750.12 ± 202.84 μg/kg, 2 hours after), corroborate that

fat should be considered the main target tissue of MOX in lambs, due to the fact that

in this target tissue it was verify the highest residue level of MOX. MOX is very

lipophilic, which causes it to have a high volume of distribution and concentrates in

the animal‟s adipose tissue from where is released (Zulalian et al., 1994).

On the second day after MOX application the residue levels in muscle, liver

and kidney were all below the recommended MRL values for each target tissue.

1

10

100

1000

0 10 20 30 40

log.

con

c. (

µg/

kg)

Days post-administration

liver

kidney

muscle

fat

131

Lifschitz et al. (2000) in a similar study conducted in adult sheep (i.e. other category

of animal species) also reported MOX residue levels in muscle, liver and fat tissues

below the respective MRL value at all collection times. Nevertheless, those authors

collected the samples for analysis from day 21 until day 49 post-treatment.

In addition, comparing our results to those obtained by Lifschitz et al. (2000) it

can be verified that MOX decays in adipose tissue in sheep (abdominal) is faster

than in lambs (perirenal plus subcutaneous). Furthermore, on the 42nd day post-

treatment the MOX residue level found in the adipose tissue was 23.04 ± 21.84 μg/kg

and 123.29 ± 35.57 μg/kg for adult sheep and lambs, respectively. This demonstrates

longer MOX mean residence time in lambs than in sheep; what probably justifies this

difference is the age of the animals, since according to Owens et al (1993) and

Santos et al. (2001) the proportional amount of fat in adult sheep (17% total fat; 70 to

80 kg BW) is greater than in lambs (2-4% total fat; 35 to 40 kg BW).

3.3. Withdrawal period estimation

Statistics methodology applied on data analysis of this study follows the

recommendation of the Committee for Veterinary Medicinal Products (EMEA), using

the linear regression analysis of the logarithmic transformation data techniques

(EMEA, 1996). Using this concept, the withdrawal period was determined as the time

when the one-sided 95% upper tolerance limit of the regression line with 95%

confidence level was below the MRL values and analysis of homogeneity of

variances.

Withdrawal period are determined to ensure that residues in tissues are

reduced to the permissible safe intake levels. It assures the producer and the

132

consumer that the concentration of residues will be below the permitted MRLs (EMA,

1996; Vranic et al., 2003). Based on this information, is possible to estimate the

withdrawal period from the MRL (500 μg/kg) for fat. The value found was 31days

(Figure 2).

Figure 2. Plot of withdrawal time calculation for lamb fat at the time when the one-

sided 95% upper tolerance limit was below the MRL (500 µg/kg).

The withdrawal time must be established in relation to each target animal

species (i.e. sheep) and category (i.e. lamb) due to differences in physiological (in

this case, ruminants and pre-ruminant) and biochemical characteristics (Anadón el

at., 2016). For instance, data available in the public literature database indicates

there is a shortage of this type of study in lambs.

WT = 30.94

MRL

133

Conclusions

The reliable and sensitive UHPLC-MS/MS method used in this study for

quantitation of MOX residue levels in lambs target tissues (muscle, liver, kidney and

fat) was suitable for the tissue depletion study conducted. At the first point time of

sample collection (2 days after treatment) MOX residue levels in liver, kidney and

muscle were below the established MRL for these matrices in sheep. Furthermore,

results from the residue depletion study corroborates that the adipose tissue should

be considered as the main target tissue for MOX in lambs after single subcutaneous

administration, as well as allowed the calculation of an estimated withdrawal period

of 31 days. Thus, to ensure human food safety and not to hinder international trade

of this food commodity, a specific withdrawal period for MOX residues in lamb edible

tissues must be established.

Conflict of Interest

The authors declare that there are no conflicts of interest.

Acknowledgments

The authors would like to thank the São Paulo Research Foundation-Agilent

Technologies for supplying the Agilent UHPLC 1290-MS/MS 6460 system employed

in this study (FAPESP-Agilent Grant number 2013/50452-5), and the funding support

from the Coordination for the Improvement of Higher Level Education Personnel

(Process PROEX/CAPES number 3300301702P1) and the National Council for

Scientific and Technological Development (Process CNPq number 305390/2013-9).

134

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