UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASFALCUDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

LABORATÓRIO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS - DEALABORATÓRIO DE GENÔMICA E EXPRESSÃO - IB

Projeto de Doutorado

Determinação das Propriedades Lignocelulolíticas e Estudo Determinação das Propriedades Lignocelulolíticas e Estudo Genético de Leveduras Silvestres Isoladas de Diversas Genético de Leveduras Silvestres Isoladas de Diversas Regiões Brasileiras Visando a Produção de BioetanolRegiões Brasileiras Visando a Produção de Bioetanol

Nome: Rosana GoldbeckOrientador: Prof. Dr. Francisco Maugeri Filho

Co-Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira

Campinas, 2010

TÓPICOS ABORDADOS

INTRODUÇÃO

OBJETIVOS

MATERIAS E MÉTODOS

RESULTADOS PRELIMINARES

CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

INTRODUÇÃO

Recente retorno preço do petróleo;

Perspectivas de esgotamento das fontes não-renováveis;

Riscos geopolíticos decorrentes da dependência do petróleo de países politicamente instáveis;

Preocupações de natureza ambiental emissão de poluentes ao meio ambiente;

Renascer Atenção nas Fontes Alternativas de Energia Bioetanol

Novo conceito de etanol (bioetanol) ou etanol de 2° geração matéria-prima utilizada é biomassa lignocelulósica;

Matérias-primas sobras e resíduos de produtos naturais (sabugo e palha do milho, bagaço, pontas e palhas da cana-de-açúcar) fundamentais p/ expressiva ampliação da produção de etanol;

Nova tecnologia de produção de etanol fundamental nos países desenvolvidos matérias-primas hoje utilizadas competem produção de alimentos e $$$ produção são ainda altos.

Introdução

Bioetanol de Celulose Introdução

Utilização de biocombustíveis emissão de gases tóxicos para a atmosfera significativo interesse econômico e ambiental;

Se faz necessário o uso da biotecnologia conversão de celulose em etanol perspectivas no desenvolvimento de enzimas celulases;

Busca de MO. capazes quebrar a celulose, fermentar o açúcar, tolerar conc. etanol produzir etanol.

SFS Sacarificação e Fermentação Simultânea em Etanol

Conversão de celulose em etanol envolve 2 passos fundamentais:

(1) quebra das cadeias das moléculas de celulose em açúcares

(2) fermentação desses açúcares em etanol

Resíduos lignocelulósicos não são convertidos em etanol polímeros complexos leveduras não conseguem metabolizar

“Engenheirar” um microrganismo (levedura)

Introdução

Microbiota Silvestre Brasileira

Brasil é o país de maior biodiversidade do Planeta área de 8,5 milhões km2 diferentes zonas climáticas variações ecológicas;

Devido biodiversidade espécies fauna/flora não são em sua totalidade conhecidas nº espécies ainda não identificadas dezena de milhões;

Interesse espécies de MO. ainda não catalogados produtores insumos de interesse à indústria em geral.

Programas Aproveitamento Biodiversidade

Introdução

Microrganismos Produtores de Celulases

Embora muitos fungos e bactérias degradem a celulose

Poucas cepas fungos têm sido consideradas grandes produtoras enzimas capazes de degradar celulose insolúvel açúcares solúveis

PEIXOTO (2006) selecionou leveduras silvestres de diversas regiões brasileiras potencial para produção de celulases

Introdução

OBJETIVOS

Estudar as propriedades lignocelulolíticas de leveduras silvestres isoladas de diversas regiões brasileiras, bem como realizar um estudo genético destas leveduras visando a produção de bioetanol.

Objetivo Principal

Objetivos EspecíficosSelecionar leveduras silvestres produtoras de celulose que apresentam potencial etanologênico;Identificar e caracterizar geneticamente as leveduras selecionadas;Isolar e Sequenciar genes específicos de celulase;Expressar o gene de interesse em Saccharomyces cerevisiae;Produzir Bioetanol levedura geneticamente modificada.

MATERIAL E MÉTODOS

Seleção de Leveduras

Identificação da Levedura

Isolamento e Seqüenciamento Genes

Expressão em Saccharomyces

Produção de Bioetanol

Meio SólidoMeio Líquido

Potencial Etanologênico

Frascos AgitadosFermentador

Açúcares (ART e AR)Concentração EtanolConcentração Celular

Viabilidade Celular

CMCaseCelobiase

FPase

Obtenção das Leveduras

Vegetação litorânea (Bertioga) Mata Atlântica (SP)

Vegetação da Serra do Mar (São Sebastião)

Cerrado (GO) Vegetação da “Chapada dos Veadeiros”

Pantanal (MT) Vegetação ciliar e de várzeas (Cáceres)

Floresta Amazônica (AM) Vegetação de matas (próximas de Manaus)

Tabela 1. Regiões na qual foram isolados os microrganismos.

Fonte: Banco de culturas do LEB – FEA/UNICAMP.

Amostras coletadas de flores, frutos e solos de diversas regiões brasileiras (HERNALSTEENS, 2008).

Material e Métodos

Material e Métodos

Seleção em Meio Sólido

Seleção das Leveduras

Seleção das Leveduras Capacidade de Degradação

Carboximetilcelulose (CMC) Celulose (Troca Iônica)

pH 5,0 / 30ºC / 96 h Revelação Vermelho Congo Halo descolorido.

Meio Seletivo: 10 g/L CMC ou Celulose0,6 g/L Extrato de Levedura7,0 g/L KH2PO4

2,0 g/L K2HPO4

1,0 g/L (NH4)2SO4

15 g/L Agar

Material e Métodos

Atividade em Meio Sólido

Metodologia descrita por STAMFORD et al. (1998) c/ alterações:

Meio de cultura anterior placas incubadas a 30 ºC por 96 horas;

Vermelho de Congo Halo descolorido Paquímetro;

Relação entre o DM Halo e DM Colônia IEA;

Análise de Variância Teste Tukey (p≥0,05).

Material e Métodos

Seleção em Meio Líquido

pH 5,5 Incubados a 30ºC e 150 rpm por 240 h Centrifugação;Sobrenadante 3 Determinações de Atividade:

CMCase Celobiase FPase

Meio Seletivo: 10 g/L Celulose (Troca Iônica) 0,6 g/L Extrato de Levedura 7,0 g/L KH2PO4

2,0 g/L K2HPO4

1,0 g/L (NH4)2SO4

0,15 g/L MgS04.7H2O 0,01 g/L FeSO4.7H20

0,50 g/L KCl

Material e Métodos

Atividade de CMCase

Metodologia proposta por OGAWA et al. (1982) c/ alterações:

Mistura Reacional: 2,0 mL CMC (10g/L) em Tampão Acetato 0,2 M 0,1 mL Solução Enzimática

Banho Termostato a 45ºC 10 min 5 min banho fervente banho gelo AR liberados Método DNS 540 nm

1 unidade de Atividade de CMC Capacidade da enzima em liberar 1 mol de glicose por min a partir da CMC original.

Material e Métodos

Atividade de Celobiase

Metodologia proposta por HENRY et al. (1974):

Amostra Reacional: 0,1 mL Celobiose (20mM) em Tampão Acetato 0,1 mL Solução Enzimática

Banho Termostato a 45ºC 30 min 5 min banho fervente banho gelo AR liberados Método glicose-oxidase

1 unidade de Atividade de Celobiase Capacidade da enzima em liberar 1 mol de glicose por min a partir da Celobiose original.

Material e Métodos

Atividade de FPase

Metodologia proposta por MANDELS et al. (1976) c/ alterações:

Amostra Reacional: 50 mg Papel Filtro Whatman nº 1 Tubos de ensaio com 2 mL Tampão Acetato 1 mL Solução Enzimática

Banho Termostato a 45ºC 60 min 5 min banho fervente banho gelo AR liberados método DNS 540 nm

1 unidade de Atividade de FPase Capacidade da enzima em liberar 1 mol de glicose por min a partir do papel de filtro original.

Material e Métodos

Identificação Molecular

Foram seqüenciadas as regiões espaçadoras utilizados os primers universais :

ITS1 (5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) ITS4 (5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)

Também foram seqüenciados os domínios D1/D2 da subunidade 26S, utilizando os primers: NL1 (5’ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 3’)

NL4 (5’ GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’)

Reações de Seqüenciamento MegaBACE (GE Healthcare), no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS).

Material e Métodos

Isolamento e Seqüenciamento de Genes Específicos

Protocolo Descrito por LEE et al. (2005):

Serão utilizadas bibliotecas de cDNA construídas a partir do RNA extraído das leveduras celulolíticas;

Para amplificação desses genes desenhados primers degenerados baseados em organismos filogeneticamente próximos a espécie de interesse;

Genes serão clonados pGEM T-easy Seqüenciados.

Material e Métodos

Expressão em Saccharomyces Cerevisiae

Expressão do gene de interesse na Saccharomyces cerevisiae construção de um plasmídeo SAMBROOK et al. (1989);

Após construção plasmídeo, transformação DNA da S. cerevisiae com acetato de lítio dimetilsulfona descrito por HILL et al. (1991);

Microrganismo geneticamente modificado será então submetido fermentações para produções de bioetanol de celulose.

Material e Métodos

Produção de Bioetanol

Meio de Cultivo

Frascos Agitados 30ºC 150 rpm 120 horas

10 g/L Celulose (Troca Iônica)0,6 g/L Extrato de Levedura7,0 g/L KH2PO4

2,0 g/L K2HPO4

1,0 g/L (NH4)2SO4

0,15 g/L MgS04.7H2O0,01 g/L FeSO4.7H200,50 g/L KCl

FermentadorMaterial e Métodos

Fermentação Fermentador Bioflo III volume útil de 2,5 L;

Meio de cultura Mesmo utilizado fermentações frascos agitados;

Fermentações em batelada Controle Temperatura (30ºC) e Agitação (300 rpm);

Agitador tipo turbina de pás planas;

Sistema possuirá medidores on-line de vazão de CO2, pH e turbidez.

Material e Métodos

Determinação de Açúcares Redutores será utilizado o Método Espectrofotométrico – 3,5-DNS MILLER (1959).

Métodos Analíticos

Açúcares Redutores

Açúcares TotaisDeterminação de Açúcares Totais será utilizado o Método de Antrona TREVELYAN & HARRISON (1952).

Determinação de Etanol

Material e Métodos

Amostras centrifugadas sobrenadante diluído e filtrado com membrana microporosa;

Amostras colocadas em “vials” para injeção automática mo HPLC;

Cromatógrafo líquido (HPLC) operado através do uso de uma fase móvel (solução de H2SO4 pH = 1,4) vazão da coluna 0,7 mL/min.

Concentração de Células Totais

Análise gravimétrica peso seco estufa com circulação de ar e temperatura constante a 70°C.

Material e Métodos

Viabilidade Celular

Técnica redução do azul de metileno descrita YOSHIDA et al. (1999);

Método baseia-se no fato células viáveis reduzirem o corante azul de metileno a azul leucometileno incolores; células não viáveis não apresentam esta capacidade azuis.

RESULTADOS PRELIMINARES

SELEÇÃO EM MEIO SÓLIDO

16 leveduras silvestres banco de culturas do Laboratório de Engenharia de Bioprocessos (LEB) – FEA/UNICAMP;

Cultivadas em placas de Petri Meio: carboximetilcelulose (CMC) e celulose (SERVACEL®) como única fonte de carbono;

Selecionadas por meio da observação de um halo descolorido formado em torno da colônia presença de enzimas hidrolíticas;

De um total de 16 leveduras 5 leveduras apresentaram halo descolorido em ambos os meios.

SELEÇÃO EM MEIO SÓLIDO

Figura 1. Halo de hidrólise formado ao redor da colônia quando cultivada em meio sólido por 96 horas à 30 ºC.

Resultados Preliminares

ATIVIDADE EM MEIO SÓLIDO

IEA relação entre diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia avaliar a capacidade de produção de enzimas por mo. em meio sólido.

Figura 2. Índices enzimáticos de atividade registrados para as 5 cepas de leveduras cultivadas em meio sólido.

Resultados Preliminares

a

b bb

a

A A

A A A

0,02,04,06,08,0

10,012,014,016,0

AAP7 AAJ6 AAG16 AAQ5 L03

Código das Leveduras Testadas

IEA

(Índi

ce E

nzim

átic

o de

Ativ

idad

e) Carboximetilcelulose

Celulose

SELEÇÃO EM MEIO LÍQUIDO

Seleção em meio líquido fermentações das 5 leveduras que se destacaram produção de celulase no cultivo em meio sólido;

Fermentações meio contendo celulose (SERVACEL®) como única fonte de carbono monitoradas 240 h;

Amostras coletadas a cada 48 horas posterior análise da atividade enzimática do caldo fermentado;

Determinação da atividade 3 experimentos distintos: Atividade em carboximetilcelulose (CMCase)Atividade de hidrólise em papel filtro (FPase) Atividade de celobiase

Resultados Preliminares

ATIVIDADE DE CMCASEResultados Preliminares

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0 48 96 144 192 240

Tempo (horas)

Ativ

idad

e C

MC

ase

(U/m

L)

AAP7

AAJ6

AAG16

AAQ5

L03

Figura 3. Gráfico da Atividade de CMCase em relação ao tempo de fermentação para as 5 leveduras estudadas.

ATIVIDADE DE FPASEResultados Preliminares

0,025

0,030

0,035

0,040

0 48 96 144 192 240

Tempo (horas)

Ativ

idad

e FP

ase

(U/m

L) AAP7

AAJ6

AAG16

AAQ5

L03

Figura 4. Gráfico da Atividade de FPase em relação ao tempo de fermentação para as 5 leveduras estudadas.

ATIVIDADE DE CELOBIASEResultados Preliminares

Figura 5. Gráfico da Atividade de Celobiase em relação ao tempo de fermentação para as 5 leveduras estudadas.

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0 48 96 144 192 240

Tempo (horas)

Ativ

idad

e C

elob

iase

(U/m

L)

AAP7

AAJ6

AAG16

AAQ5

L03

Resultados Preliminares

INICIOU 16 LEVEDURAS SILVESTRE

SELEÇÃO EM MEIO SÓLIDO

5 LEVEDURAS SILVESTRE

SELEÇÃO EM MEIO LÍQUIDO

1 LEVEDURA SILVESTRE

AAJ6

IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR

Figura 6. Eletroforese realizada no teste de determinação da temperatura ideal de anelamento dos primers utilizados para a amplificação do DNA.

(a) marcador GeneRuler™ 100 bp; (b) branco ITS1 e ITS4; (c) AAJ6, 52°C, ITS1 e ITS4; (d) AAJ6, 55°C, ITS1 e ITS4; (e) AAJ6, 58°C, ITS1 e ITS4; (f) branco NL1 e NL2; (g)

AAJ6, 52°C, NL1 e NL4; (h) AAJ6, 55°C, NL1 e NL4; (i) AAJ6, 58°C, NL1 e NL4.

Resultados Preliminares

IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR

PCR 40 ciclos a 58°C;

Produto do PCR Purificado e Quantificado;

Reação de Seqüenciamento MEGABACE LNLS;

Seqüência obtidas comparadas com as seqüência depositadas nos bancos de dados BLAST;

Acremonium strictum

Resultados Preliminares

IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR

Resultados Preliminares

CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

Atividades 2008 2009 2010 2011

1ºSem 2ºSem 1ºSem 2ºSem 1ºSem 2ºSem 1ºSem Créditos

Realizados X X

Estágio de Docência X X

Revisão Bibliográfica X X X X X

Exame de Qualificação de Área X

Seleção das Leveduras X

Identificação das Leveduras X X

Isolamento do gene específico

Seqüenciamento do gene de celulase

Redação de Artigo Científico

Exame de Qualificação Geral

Expressão do gene na Saccharomyces

Produção de Bioetanol

Redação de Artigo Científico

Redação da Tese

Defesa Final

Muito Obrigada!rosanag@fea.unicamp.br