UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE...
Transcript of UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE...
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ALINE VILLANOVA BRIDI
CAMPINAS
2016
BUSCA DE NOVOS LIGANTES PARA O PPAR
UTILIZANDO UMA ABORDAGEM BIOFÍSICA E
CELULAR
ALINE VILLANOVA BRIDI
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biologia da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de
Mestra em Ciências, na Área de
Fármacos, Medicamentos e Insumos
para Saúde.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA
PELA ALUNA ALINE VILLANOVA BRIDI E
ORIENTADA ANA CAROLINA MIGLIORINI
FIGUEIRA.
Orientadora: ANA CAROLINA MIGLIORINI FIGUEIRA
CAMPINAS
2016
BUSCA DE NOVOS LIGANTES PARA O PPAR
UTILIZANDO UMA ABORDAGEM BIOFÍSICA E
CELULAR
Campinas, 12 de julho de 2016
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcio Chaim Bajgelman
Prof. Dr. Marcelo Vizoná Liberato
Prof. Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus Pais...
“Ricorda questa sera, perché serà l’inizio dell’eternita”
Dante Alighieri
Primeiramente a Deus, por ter me dado sabedoria e paciência para a
realização deste trabalho;
Aos meus pais, Roberto e Roseli, que sempre me apoiaram em todos os
sentidos, sem vocês nada disso seria possível. Minha eterna gratidão, nunca serei
capaz de agradecer o suficiente por tudo que fizeram por mim. Vocês são
sensacionais!
Aos meus irmãos, Gustavo e Karine, que sempre me atormentaram, as
melhores risadas são com vocês! E sim, eu te ajudo... Papel de irmã mais velha né...
A toda minha família, que apesar de não entenderem nada do que eu
falava, acreditavam mesmo assim.
Ao meu namorado Rafael, que foi extremamente importante na conclusão
deste trabalho. Sem palavras para agradecer o quanto seu apoio foi fundamental.
Obrigada pelo incentivo, preocupação e todo carinho! (Always...)
À minha orientadora Ana Carolina, que me mostrou o caminho da ciência!
Obrigada por ter me aceitado como aluna, por ter acreditado mesmo eu nem sabendo
o que era uma pipeta direito. Obrigada por tudo que aprendi nesses 5 anos, a base
da minha carreira!
À minha querida amiga Juliana, meu eterno agradecimento. Obrigada por
me incentivar nos momentos difíceis, pelos ensinamentos e por toda a sua presteza
que é notável! Você teve papel essencial no desenvolvimento e finalização desse
trabalho. E acima de tudo, obrigada pela amizade e confiança, nunca me esquecerei
de você!
À minha querida amiga Jéssica, que sempre contagiou o laboratório com a
sua animação, obrigada por tornar os dias difíceis mais alegres! Obrigada por sempre
me mostrar um outro lado de tudo, principalmente na vida! Porque a chance foi única!
Um agradecimento especial as LECas: Nathynha, pela sua delicadeza
incomparável; Naty, pelo seu capricho com tudo; Tábata, pelo seu senso crítico;
AGRADECIMENTOS
Scarlet, pelos conselhos; Taisa, pela dedicação; Albane, pelas dicas excelentes para
valorizar o trabalho; Helder, pela paciência; Bia, pela disposição.
A todos amigos do LNBio, que sempre tornaram os dias mais agradáveis,
vocês são excepcionais!
Aos amigos que me viram crescer e até hoje me apoiam em todos os
sentidos, vocês são parte da minha história.
A pesquisadora Juliana Oliveira, por ter me ajudado com os experimentos
com ANS, que foram de grande importância para o desenvolvimento do pipeline.
Ao pesquisador Paulo e seu aluno José, que colaboraram com os estudos
de docking do PPAR, o que ajudou muito nas conclusões finais.
A todos os pesquisadores do CNPEM, UNICAMP, USP, UFSCAR e UFSC
que de alguma forma colaboraram com o desenvolvimento deste trabalho.
Ao CNPEM e LNBio, por todo apoio e infraestrutura disponível.
A todas as facilities do CNPEM as quais tive acesso e realizei experimentos
recebendo a muita atenção e empenho, como o laboratório de Cristalização de
Macromoléculas (Robolab), o laboratório de Espectometria de Massas, a
Bioinformática e o laboratório de Espectroscopia e Calorimetria
A UNICAMP e a Pós-Graduação do Instituto de Biologia, por todos os
esclarecimentos, conhecimentos e principalmente pela bolsa de estudo.
A Capes, pela bolsa de mestrado e ao Cnpq pelo financiamento do projeto.
E a todos os amigos que passaram por mim e de alguma forma
contribuíram para o meu crescimento, tanto profissional quanto pessoal.
O diabetes tipo 2 atinge pelo menos 15% da população mundial e 6% da população
brasileira, sendo caracterizado como parte do conjunto de patologias de efeitos
associados, característicos da Síndrome Metabólica. O PPAR regula a transcrição
de genes relacionados ao metabolismo de lipídeos, controle de inflamação e produção
de insulina, sendo um dos alvos diretos desta síndrome. Após observações de que a
sensibilização à insulina é desencadeada não pela ativação direta do PPAR, mas
pelo impedimento da fosforilação de um de seus resíduos, a Ser273, postulou-se que
um bom modulador deste receptor seria uma molécula que apresentasse baixa
ativação do receptor e impedisse a fosforilação da Ser273. Atualmente, este receptor
é modulado por fármacos como a rosiglitazona e a pioglitazona, que estão disponíveis
no mercado, mas que têm seu uso questionado, devido aos seus efeitos colaterais.
Neste trabalho buscamos, através da utilização de um conjunto de metodologias,
novos compostos que modulem de forma seletiva o receptor nuclear PPAR,
proporcionando sensibilização à insulina, auxiliando no tratamento de diabetes tipo 2.
Para tanto, padronizamos um conjunto de metodologias que fossem capazes de
definir os efeitos desejados na busca de novos moduladores de PPAR, através de
ensaios de estabilidade estrutural, ensaios celulares, testes de ativação/repressão do
receptor e ensaios de afinidade a ligantes. Mais ainda, tentamos elucidar as mudanças
estruturais provocadas pelos melhores compostos encontrados, por estudos de
biologia estrutural. Com isso, encontramos alguns compostos promissores para o
planejamento racional de fármacos no combate à diabetes, os quais, atualmente,
constituem uma das classes mais procuradas para a prática médica.
Palavras chave: PPAR gama, Diabetes, Receptores Nucleares, Síndrome Metabólica,
Ligantes e Rosiglitazona.
RESUMO
Screening of Novel PPARY Ligands by Biophysical and Celular Approaches. Type II diabetes affects at least 15% of world population and 6% of Brazil’s population,
being featured as part of the set of pathologies of associated effects, characteristic of
the metabolic syndrome. The PPAR regulates the gene transcription related to the
lipids metabolism, control of inflammation and insulin production, being one of the
direct targets of this syndrome. After observations that the insulin sensitization is
unleashed not by the direct activation of PPAR, but due to the prevention of one of its
residues, phosphorylation, the Ser273, it was postulated that a good modulator of this
receptor would be a molecule that present low activation of the receptor and that could
keep Ser273 from phosphorylation. Currently this receptor is modulated by drugs such
as rosiglitazone and pioglitazone, which are both available on the market, but which
have their use questioned due to its collateral effects. In this work, by applying a set of
methodologies, we look for new compounds that can selectively modulate the nuclear
receptor PPAR, providing sensitization to insulin, supporting the treatment of type II
diabetes. To do so, we standardized a set of methodologies that can be capable of
defining the desired effects on the research of new PPAR modulators, through
structural stability tests, cellular tests, activation/suppression of nuclear receptor tests
and affinity to ligands. Furthermore, we try to clarify the structural changes caused by
the best compounds, through protein crystallography studies and structural biology.
This way, we were able to achieve promising compounds for rational drug design in
order to treat diabetes, which currently, are one the medical practice most desired
class.
ABSTRACT
Figura 1. Organização estrutural dos receptores nucleares .......................... 22
Figura 2. Heterodímero PPAR-RXR. ................................................................. 25
Figura 3. Regulação positiva da transcrição gênica, ou transativação
dependente do ligante ............................................................................................ 26
Figura 4. Mecanismos de regulação negativa da expressão gênica ............. 27
Figura 5. Isoformas do PPAR. ........................................................................... 28
Figura 6. Efeitos conhecidos da ativação do PPAR ...................................... 29
Figura 7. Estrutura do PPAR LBD mostrando suas hélices e ligante
comercial Rosiglitazona. ........................................................................................ 39
Figura 8. Construção LBD do PPAR ............................................................... 44
Figura 9. SDS-PAGE da Purificação por afinidade do PPAR LBD. ............... 62
Figura 10. Cromatograma da purificação por gel filtração do PPAR LBD. .... 63
Figura 11. SDS-PAGE da gel filtração do PPAR LBD ...................................... 64
Figura 12. Gel Nativo do PPAR LBD ................................................................. 65
Figura 13. Espectro de CD do PPAR LBD ........................................................ 66
Figura 14. Desenovelamento térmico do PPAR LBD por CD .......................... 66
Figura 15. Metodologias para busca de ligantes para o PPAR ....................... 67
Figura 16. Compostos testados no TSA ............................................................ 70
Figura 17. Espectros de CD do PPAR LBD com os 20 compostos
selecionados no TSA .............................................................................................. 72
Figura 18. Desenovelamento térmico do PPAR LBD complexado com os 20
compostos por CD .................................................................................................. 72
Figura 19. Comparação entre as Tms obtidas nos experimentos de TSA e CD
dos 20 compostos. .................................................................................................. 73
Figura 20. Espectros de fluorescência do PPAR LBD com os 10 compostos
que mostraram atividade ........................................................................................ 76
Figura 21. Estrutura dos ligantes de PPAR ...................................................... 77
Figura 22. Curva de ligação dos compostos ao sítio do PPAR ...................... 78
Figura 23. Gráfico de ativação celular do PPAR .............................................. 80
LISTA DE FIGURAS
Figura 24. Cálculo de EC50 .................................................................................. 81
Figura 25. Diferenciação de adipócitos .............................................................. 82
Figura 26. Gráfico da quantificação de oil red ................................................... 83
Figura 27. Quantificação da transcrição gênica ................................................ 85
Figura 28. Western blot com anticorpo anti–Ser273P e anti - PPAR
apresentando a fosforilação do PPAR LBD (ensaio 1). ...................................... 86
Figura 29. Western blot com anticorpo anti–Ser273P e anti-PPAR
apresentando a fosforilação do PPAR LBD (ensaio 2). ...................................... 87
Figura 30. Curvas de recrutamento de coativador. ........................................... 89
Figura 31. Legenda de contatos do composto. ................................................ 90
Figura 32. Docking PPAR LBD e composto AM-879. ...................................... 91
Figura 33. Docking PPAR LBD e o composto P11 .......................................... 92
Figura 34. Docking do PPAR LBD com o composto R32 ............................... 94
Figura 35. Modo de ligação dos ligantes........................................................... 96
Tabela 1. Dados de DLS do PPAR LBD ......................................................... 64
Tabela 2. Tms dos 20 compostos selecionados por TSA ............................. 71
Tabela 3. Tabela com as Tms calculadas para os 20 ligantes ...................... 73
Tabela 4. Constante de afinidade aparente .................................................... 77
Tabela 5. Cálculo de energia livre de ligação ................................................. 95
LISTA DE TABELAS
3p25 - Região no cromossomo 3 que codifica o PPAR
AF-1 - função de ativação 1
AF-2 - função de ativação 2
AFR - África
AG - ácido graxo
AGGTCA - Hexanucleotídeo (Adenina, Guanina, Guanina, Timina, Citosina,
Adenina)
Akt - Oncogene viral de timona murino V-akt
ANS - Ácido 8-anilino-1-naftalenosulfônico
AP-1 - Proteína Ativadora 1
ATP - Trifosfato de Adenosina
CD - Dicroísmo Circular
CDK5 - Quinase dependente de ciclina 5
CEBPA - do ingês Enhancer-Binding Protein Alpha
CV - Volume de Coluna
DBD - domínio de ligação ao DNA
DLS - Espalhamento de Luz Dinâmico
DMEM - do inglês Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido Desoxirribonucleico
DPP-4 - Dipeptidil Peptidase 4
DR-1 - Repetições diretas da sequência consenso AGGTCA separadas por um
único nucleotídeo
DRE - do inglês Direct response element
DT1 - Diabetes Tipo I
DT2 - Diabetes Tipo II
EUR - Europa
FABP4 - Proteína ligadora de ácido graxo 4
FDA - do inglês Food and Drug Administration
LISTA DE ABREVIATURAS
FXR - Receptor de Farnesóides
GAL4 - Fator de Transcrição de Leveduras
GLP-1 - do inglês Glucagon-like peptide-1
GLUT2 - Transportador de Glicose 2
Glut-4 - Transportador de Glicose 4
GR - Receptor de Glucocorticóides
GRE - Elemento responsivo da Gal
GWAS - Estudos de Associação do Genoma
HDAC - Desacetilases de Histonas
HDL - Lipoproteína de densidade alta
HMGA-1 - do inglês AT-hook 1
HNF-1b - do inglês Hepatocyte Nuclear Factor 1 Homeobox B
HNF-1α - do inglês Hepatocyte Nuclear Factor 1 Homeobox α
HRE - Elementos Responsivos a Hormônios
IDF - do inglês International Diabetes Federation
IPF-1 - do inglês Insulin Promoter Factor 1
IRS - Substrato do Receptor da Insulina
Irs1 - do inglês Insulin receptor substrate 1
i-SGLT2 - Inibidor do transportador de sódio-glicose
JNK1 - do inglês Kinase/c-Jun N-terminal 1
LB - Lysogeny Broth
LBD - domínio de ligação ao ligante
LDL - Lipoproteína de densidade baixa
LPL - Lipoproteína Lipase
LQPN - Laboratório de Química e Produtos Naturais
LXR - Receptor X de Fígado
MENA - Oriente Médio e Norte da África
MODY - do inglês Maturity Onset Diabetes of the Young
MR - Receptor de Mineralocorticóides
NAC - América do Norte e Caribe
NCor - Correpressor de Receptores Nucleares
NEUROD1 - Neurogenic differentiation 1 Diferenciação neurogênica 1
NF-kB - Fator Nuclear Kapa β
NIDDM1 - do inglês Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus (Common, Type 2) 1
NIDDM2 - do inglês Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus (Common, Type 2) 2
[(human)]
OMS - Organização Mundial da Saúde
ON - Over Night
pBIND - Plasmídeo da proteína quimera composta pelo DBD da proteína GAL4 e
o LBD do PPAR
PBP - Proteína de Ligação ao PPAR
PBS - Tampão Fosfato-salino
PCR - Reação em cadeia da polimerase
Pdx-1 - do inglês Pancreatic and Duodenal Homeobox 1
pGRE-LUC - Plasmídeo Reporter
PI3K - Fosfatidilinositol-3-quinase
PPAR - Receptor Ativador de Proliferação de Peroxissomos
PPRE - Elemento Responsivo ao PPAR
RCF - Força relative de centrifugação ou Força-G
RI - Receptor Transmembranar de Insulina
RMSD - do inglês Root-Mean-Square Deviation
RN - Receptores Nucleares
RNA - Ácido Ribonucleico
RNS - Espécie Reativa de Nitrogênio
ROS - Espécie Reativa de Oxigênio
RPM - Rotações por minuto
RXR - Receptor de Retinóide X
SACA - América do Sul e Central
SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
SEA - Sudeste Asiático
Ser - Serina
SM - Síndrome Metabólica
SMTR - Mediador do silenciamento de receptor retinóide X e receptor de
hormônio tireoidiano
SNPs - Polimorfismos de Base Única
SRC - Coativador de Receptor Esteroidal
TCF7L2 - do inglês Transcription Factor 7-Like 2
Tm - Temperatura de Melting
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral-α
TR - Receptor de Hormônios Tireoidianos
TSA - Termo Estabilidade
TZD - Tiazolidinediona
Wnt - Via de sinalização Wnt
WP - Pacífico Ocidental
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 20
1.1. Aspectos gerais associados à síndrome metabólica e questões de saúde
pública .................................................................................................................... 20
1.2. Receptores nucleares podem ser utilizados como alvos terapêuticos no
tratamento da SM ................................................................................................... 21
Envolvimento do receptor ativador de proliferação de peroxissomos –
PPAR com a SM ................................................................................................ 23
1.3. Mecanismos de ação dos PPARs ................................................................ 24
Quando a ativação é dependente de um ligante ................................... 25
Quando a regulação transcricional pode ser negativa ........................... 26
1.4. O protagonista PPAR Gama ........................................................................ 27
Como o PPAR está envolvido com o DT2, uma das patologias da SM29
1.5. Um breve histórico sobre o Diabetes ........................................................... 31
Porque o DT2 é tão grave e merece atenção ........................................ 31
A situação do diabetes atualmente ........................................................ 34
Outro fator importante no tratamento do DT2, a resistência à insulina ..35
1.6. Histórico dos fármacos já utilizados para o tratamento do DT2 ................... 36
A Abordagem de novos fármacos para o DT2 ....................................... 37
Envolvimento da fosforilação e o tratamento do DT2 ............................ 40
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 41
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 42
3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 43
3.1. Procedência dos Clones e Ligantes ............................................................. 43
3.2. Expressão do domínio LBD do PPAR ......................................................... 43
3.3. Purificação do LBD do PPAR...................................................................... 44
3.4. Purificação por Gel Filtração ........................................................................ 45
3.5. Estocagem das Proteínas ............................................................................ 45
3.6. Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS - Dynamic Light Scattering) .............. 45
3.7. Eletroforese Nativa ....................................................................................... 46
3.8. Controle para Triagem de Ligantes .............................................................. 47
3.9. Termo Estabilidade (TSA – Thermal Shift Assay) ........................................ 47
3.10. Dicroísmo Circular (CD – Cicular Dichroism) ............................................ 48
Espectro de Dicroísmo Circular .......................................................... 48
Desnaturação Térmica Monitorada por CD ........................................ 49
3.11. Supressão de Fluorescência do ANS ....................................................... 50
3.12. Cultura de Células .................................................................................... 51
Transativação com Gene Repórter ..................................................... 51
Cálculo de EC50 .................................................................................. 53
Diferenciação de Adipócitos ............................................................... 53
Coloração por Óleo Vermelho O® ....................................................... 54
3.13. Ensaio de Fosforilação .............................................................................. 55
Western Blot ....................................................................................... 55
3.14. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) ........................... 56
3.15. Recrutamento de Coativador .................................................................... 59
3.16. Docking dos Ligantes ................................................................................ 59
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................................... 61
4.1. Produção de Proteína .................................................................................. 61
4.2. Caracterização do PPAR LBD .................................................................... 64
4.3. Metodologias para Busca de Ligantes ......................................................... 67
4.4. Testes com os Compostos ........................................................................... 68
Estabilidade Térmica ............................................................................. 69
4.5. Supressão de Fluorescência do ANS ........................................................... 74
4.6. Ensaios Celulares ........................................................................................ 79
Ativação Celular ..................................................................................... 79
Cálculo de EC50 ..................................................................................... 80
Diferenciação de Adipócitos .................................................................. 82
4.7. Transcrição Gênica - qPCR ......................................................................... 84
4.8. Ensaio de Fosforilação ................................................................................. 86
4.9. Recrutamento de Coativadores .................................................................... 88
4.10. Docking dos Ligantes ................................................................................ 89
5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 98
6. REFERÊNCIAS ................................................................................................... 100
7. ANEXOS ............................................................................................................. 113
20
1.1. Aspectos gerais associados à síndrome metabólica e questões de
saúde pública
A síndrome metabólica (SM) é considerada uma epidemia de proporções
mundiais, e representa um espectro de desordens que continua crescendo através do
mundo industrializado, sendo caracterizada por um conjunto de anormalidades como
diabetes tipo II (DT2), hipertensão arterial, obesidade intra-abdominal, esteatose,
dislipidemia, hiperglicemia, trombose, inflamação, entre outros (LORENZO et al.,
2007; ALBERTI et al., 2005; KLEIN et al., 2007; ECKEL et al., 2005; ZIMMET et al.,
2005).
Pode-se dizer que a SM se tornou um dos maiores desafios da saúde
pública no mundo, onde, por exemplo, 22,9% dos adultos nos Estados Unidos são
acometidos pela SM, de acordo com o relatório Facts and Figures Endocrine da The
Endocrine Society. Um adulto com SM tem custos totais médicos de US$ 40.873, em
média, por um período de 10 anos, em comparação aos custos médicos gerais de um
adulto, que é em média US$ 33.010, durante o mesmo período (ERVIN, 2009; PARK,
2015; ENDOCRINE SOCIETY, 2015; LOHR E GINGERY, 2015).
A SM é bem conhecida como fator de risco para doenças cardiovasculares
e aumento da gordura visceral, que está associado ao aumento da resistência à
insulina, o que aumenta os riscos de DT2 e aterosclerose, como pode ser observado
no trabalho de Sakashita e colaboradores (2015).
As patologias que caracterizam a SM estão relacionadas principalmente a
disfunções de receptores nucleares (RNs), como TR (Receptor de Hormônios
Tireoidianos), PPAR (Receptor Ativador de Proliferação de Peroxissomos), GR
(Receptor de Glucocorticóides), MR (Receptor de Mineralocorticóides), LXR (Receptor
X de Fígado), FXR (Receptor de Farnesóides), dentre outros (SONODA et al., 2008;
AHMADIAN et al., 2013). Esses RNs estão intimamente ligados a essas patologias e,
por isso, têm sido considerados “alvos” para novas terapias. Os grupos de agonistas
e antagonistas que atuam nestes receptores constituem uma das classes de fármacos
1. INTRODUÇÃO
21
mais procuradas para a prática médica, sendo, portanto, alvos importantes para o
desenvolvimento de medicamentos (GRONEMEYER et al., 2004; CHOI et al., 2011).
1.2. Receptores nucleares podem ser utilizados como alvos terapêuticos
no tratamento da SM
Os RNs constituem uma superfamília de diferentes fatores de transcrição
ativados por ligantes, que atuam diretamente na iniciação e regulação de programas
de expressão gênica (EGEA et al., 2001; LAZAR et al., 2003). Estão relacionados à
manutenção da homeostase, metabolismo em geral e de lipídeos, desenvolvimento
embrionário e sexual, entre outras funções. Seus ligantes, moléculas sinalizadoras
pequenas e hidrofóbicas, penetram nas células alvo, ligando-se a seus receptores e
regulando a produção de diversas proteínas (LAUDET e GRONEMEYER, 2002).
A superfamília dos receptores nucleares compreende 48 genes que
codificam 75 proteínas diferentes, cuja atividade é regulada pela ligação direta dos
esteroides, vitaminas, lipídios, metabólitos e xenobióticos (CHAW et al., 2001b). Essas
proteínas atuam ligando-se em sequências específicas no DNA, denominadas
elementos responsivos a hormônios (HRE). Os HREs geralmente estão localizados
na região promotora dos genes alvos, são específicos para cada receptor e possuem
duas cópias de um hexanucleotídeo (AGGTCA), que podem estar arranjadas em
diversas orientações, com espaçamento e sequências flanqueadoras diferentes. Os
receptores nucleares podem se ligar aos HREs como monômeros, homodímeros ou
heterodímeros (ISSEMAN et al., 1990, FATTORI et al., 2014).
Todos os membros desta superfamília são proteínas modulares, com três
domínios principais (Figura 1) (KUMAR E THOMPSON, 1999; KLINGE, 2000). O
domínio amino-terminal (A/B), que não é conservado entre os membros da
superfamília, desempenha uma função de transativação independente de ligantes,
pois contêm um domínio de ativação independente do ligante, denominado função de
ativação 1 (AF-1), e seu comprimento é altamente variável entre os diversos RN. O
outro domínio (C), representado pela região DBD (DNA Binding Domain), possui cerca
de 70 – 80 aminoácidos e é a região mais conservada nos RN, onde se determina a
ligação ao DNA em sequências específicas, apresentando motivos estruturais
conhecidos como “dedos de zinco”. Foi constatado que este domínio é o responsável
tanto pela ligação específica do receptor à sequência de DNA alvo, assim como pela
22
fraca capacidade de dimerização (KUMAR E THOMPSON, 1999). O domínio D, entre
o DBD e o LBD, é uma região menos conservada, que se comporta como uma
dobradiça e confere flexibilidade estrutural ao receptor, o que permite que sua
dimerização com outro RN e ligação ao DNA ocorram simultaneamente. Já o quarto
domínio (E), a região carboxi-terminal, com aproximadamente 250 resíduos de
aminoácidos, é denominado de LBD (Ligand Binding Domain), tendo sua sequência
de aminoácidos moderadamente conservada entre os membros da família, e é
responsável pela ligação do receptor ao ligante, função de ativação 2 (AF-2), além de
ser responsável direto pela homo- e/ou heterodimerização entre os receptores. Este
domínio também é essencial para associação dos receptores com proteínas
correguladoras, correpressores e coativadores, respectivamente associados à
repressão ou ativação de genes essenciais. Além disso, o LBD é o domínio
responsável pela ativação do receptor de forma dependente de ligante (RASTINEJAD,
2001; GRESCHIK et al., 2002; MORAS e GRONEMEYER, 1998; BOURGUET et al.,
2000).
Figura 1. Organização estrutural dos receptores nucleares. Esquema geral da estrutura de um
receptor nuclear (1D), destacando os domínios: N-terminal (A/B) em vermelho, o domínio
de ligação ao DNA (C) em roxo, a região de dobradiça ou Hinge (D) em rosa, o domínio
de ligação ao ligante (E) em verde e o domínio C-terminal (F) em laranja. Abaixo tem-se
estruturas terciárias (3D) do DBD ligado ao DNA e do LBD ligado ao hormônio, sendo que
o N-terminal, hinge e C-terminal estão representados por linhas tracejadas em vermelho,
rosa e laranja, respectivamente, por serem móveis e não terem estrutura resolvida
experimentalmente (Adaptado de: Nuclear Receptor Structure.png).
Organização Estrutural dos Receptores Nucleares
23
Alguns RNs contêm também um domínio na extremidade carboxi-terminal,
conhecido como domínio F, com estrutura e função não conhecidas (EGEA et al.,
2001, SONODA et al., 2008, ROBINSON-RECHAVI et al., 2003, OLEFSKY et al.,
2001; AMATO, 2008). Podemos observar na Figura 1, um esquema simplificado dos
domínios dos RN, acima citados.
Envolvimento do receptor ativador de proliferação de peroxissomos –
PPAR com a SM
Dentre os RNs estão os receptores ativadores da proliferação de
peroxissomos (PPARs) (EVANS et al., 2004). Eles foram identificados em 1990
através da clonagem de um receptor órfão de murino, o qual era ativado por
compostos que auxiliam na proliferação de peroxissomos (como os fibratos) em
anfíbios, por isso esse nome (ISSEMAN et al., 1990). Eles surgiram provavelmente
durante a evolução dos metazoários (MICHALIK et al., 2002)
Os PPARs são fatores de transcrição presentes no núcleo da célula e são
ativados por ligantes naturais ou sintéticos. Os ligantes naturais do PPAR, são os
ácidos graxos (AG) e seus metabólitos, considerados sensores lipídicos capazes de
modular processos críticos para a homeostase energética. Exercem suas funções na
forma de heterodímeros com o receptor de retinóide X (RXR) (MUELLER, et al., 1998,
AHMADIAN et al., 2013). Assim, os PPARs podem influenciar a expressão gênica
direta ou indiretamente, através da competição com outros fatores de transcrição
(CUNARD et al., 2004), entretanto, podem também modular a atividade de genes
envolvidos na regulação de energia e processos inflamatórios (AHMADIAN et al.,
2013).
Foram identificados três isotipos de PPARs em mamíferos, os isotipos α, β
e , cada um codificado por um gene diferente (MICHALIK et al., 2002, AHMADIAN et
al., 2013).
O isotipo alfa (α), a primeira forma encontrada, é altamente expressa no fígado,
coração, tecido adiposo marrom, sendo associada principalmente ao aumento de
respostas inflamatórias, redução de triglicerídeos e aumento da lipoproteína de alta
densidade (High density lipoprotein - HDL) (EVANS et al., 2004; POULSEN et al.,
2012).
24
O isotipo beta/delta (β/δ) é o menos conhecido destes receptores, sendo
expresso em tecido adiposo, pele e fígado. Está ligado à proliferação de adipócitos,
redução nos níveis da lipoproteína de baixa densidade (Low density lipoprotein - LDL)
e triglicerídeos, termogênese e redução de peso, também está diretamente ligado à
oxidação de ácidos graxos (BARISH et al., 2006, POULSEN et al., 2012).
Por fim, o isotipo gama (), alvo desta dissertação, é expresso em tecido
adiposo branco, fígado e lesões ateroscleróticas, estando diretamente relacionado à
diabetes por promover a sensibilização à insulina.
O PPAR tem como ligantes sintéticos as tiazolidinedionas (TZDs),
utilizadas como sensibilizadores insulínicos no tratamento da diabetes tipo 2 (DT2), o
que aumentou o interesse por esses receptores como potenciais alvos farmacológicos
para o tratamento de doenças metabólicas humanas (TONTONOZ et al., 2008, KUNG
et al., 2012; EVANS et al., 2004).
1.3. Mecanismos de ação dos PPARs
Existem várias moléculas sinalizadoras, como proteínas, aminoácidos,
esteróides, retinóides, nucleotídeos e outros, que ativam os RNs na sinalização
celular. Os PPARs são encontrados no núcleo das células, ligados a correpressores,
que recrutam histonas desacetilazes e mantém a cromatina condensada, o que
reprime a transcrição gênica (YU, 2007). Na presença de agonistas, o PPAR recruta
coativadores, causando uma mudança conformacional no receptor, dissociando o
complexo correpressor (GRONEMEYER, et al., 2004; GUSMÃO, 2008, AMATO, et
al., 2012).
O PPAR heterodimeriza com o RXR, ativando a expressão gênica
(SONODA et al., 2008), sendo que este complexo se forma mesmo na ausência de
um ligante (FEIGE et al., 2005). Ele se liga a sequências específicas de DNA,
localizadas na região regulatória ou promotora dos genes-alvo, os elementos
responsivos ao PPAR (PPREs), e estimula a transcrição gênica quando ativado por
agonistas (ROSEN et al., 2001).
Os PPREs são repetições diretas de dois “meios sítios”, cuja a sequência
consenso é AGGTCA separadas por um único nucleotídeo espaçador, denominado
Direct Reapeat-1 (DR-1) (Figura 2) (ROSEN et al., 2001; BATISTA, 2012). Estão
presentes em uma ou várias cópias nos promotores de genes alvo gerando a
25
sequência consenso: 5’ – AACT AGGNCA N AGGTCA – 3’, essa sequência específica
promove a ligação seletiva do PPAR-RXR aos “meios-sítio” 5’ e 3’ do elemento
responsivo, respectivamente (FEIGE et al., 2005; JEANNIN et al., 1997).
Figura 2. Heterodímero PPAR-RXR. Eles se ligam a sequências específicas de DNA no promotor
de genes-alvo. Essas sequências, denominadas DR-1, são constituídas de repetições
diretas da sequência consenso AGGTCA separadas por um único nucleotídeo espaçador
(n) (GLASS et al., 2006)
Não se tem definido quais são as regiões regulatórias alvo, específicas de
cada isotipo de PPAR, visto que muitas células expressam um ou mais dos 3 tipos de
PPAR, e o PPRE é comum a eles (MICHALIK et al., 2006).
Quando a ativação é dependente de um ligante
Quando o heterodímero PPAR-RXR não está ligado a ligantes, a
transcrição é reprimida, pois ocorre a associação a proteínas correpressoras, tais
como o correpressor de RN (NCor) e o mediador do silenciamento de RXR e receptor
de hormônio tireoidiano (SMRT); e as desacetilases de histonas (HDAC) são
recrutadas por correpressores. Com a cromatina enovelada, não há o recrutamento
da maquinaria de transcrição, o que chamamos de repressão basal (YU et al., 2005;
ROSENFELD et al., 2006; FATTORI et al., 2014).
Quando o PPAR-RXR está na presença de substâncias agonistas, ocorre
o desligamento dos correpressores e o recrutamento de coativadores, tais como o
coativador de receptor de esteroide (SRC) – 1, 2 e 3 e a proteína de ligação ao PPAR
(PBP). Ocorre então, a acetilação das histonas e modificações na estrutura da
Heterodímero PPAR-RXR
PPAR RXR
AGGTCA AGGTCA
26
cromatina, causando o desenovelamento do DNA, o que permite o recrutamento da
maquinaria de transcrição nos promotores do genes-alvo e, assim, inicia-se a
transcrição gênica, como mostrado na Figura 3 (RICOTE et al., 2007; CHAWLA et al.,
2001; BERGER et al., 2002; FATTORI et al., 2014).
Figura 3. Regulação positiva da transcrição gênica, ou transativação dependente do ligante.
Na ausência do ligante (a), o heterodímero PPAR-RXR é capaz de se ligar aos elementos
responsivos no DNA (RE), recrutar proteínas do complexo correpressor e, assim, reprimir
a transcrição de genes-alvo. A alteração conformacional do receptor promovida pela
ligação do ligante (b) determina a dissociação de proteínas correpressoras, recrutamento
de coativadores e interação com a maquinaria de transcrição basal da célula, levando
assim, a ativação da transcrição de genes regulados positivamente pelo PPAR ativado
(GLASS et al., 2006).
A ligação de agonistas totais, resulta na modificação do estado de
repressão basal para a ativação transcricional (DOWELL et al., 1999). Os agonistas
parciais, tem uma interação menor com o heterodímero PPAR-RXR, causando uma
ativação transcricional menos eficaz. Já os antagonistas bloqueiam os receptores,
podendo diminuir ou até anular o efeito do agonista (BERGER et al., 2002).
Quando a regulação transcricional pode ser negativa
A expressão gênica também pode ser regulada negativamente através da
transrepressão. Esse mecanismo não envolve a ligação do receptor ao PPRE no
DNA (PASCUAL e GLASS, 2006). Ainda não se tem muitos detalhes sobre essa
Regulação Positiva da Transcrição Gênica Dependente do Ligante
a Complexo
Correpressor
b Complexo
Coativador
PPAR RXR PPAR RXR
PPRE TATA PPRE TATA
+ Ligante
27
atividade, acredita-se que o PPAR ativado interaja com outros fatores de transcrição,
impedindo a ligação com os elementos responsivos, a competição por coativadores,
repressão da atividade transcricional e bloqueio da depuração de complexos
corepressores (Figura 4) (DOWELL et al., 1999; RICOTE et al., 1998; RICOTE E
GLASS, 2007).
Figura 4. Mecanismos de regulação negativa da expressão gênica. a. Repressão transcricional
ativa na ausência do ligante. b. Transrepressão dependente ligante, caracterizada pela
atividade antagonista do PPARγ ativado sobre a estimulação da expressão gênica por
outros fatores de transcrição, como o fator nuclear kapa B (NF-kB) (GLASS et al., 2006).
A ação de fatores de crescimento com atividade pró-inflamatória como
NF-kB e proteína ativadora 1 (AP-1) é regulada pela transrepressão do PPAR, por
exemplo (RICOTE e GLASS, 2007; AMATO, 2008).
1.4. O protagonista PPAR Gama
O PPAR foi mapeado no cromossomo 3 em humanos (GREENE, et al.,
1995), na região 3p25, e por processamento alternativo origina três RNAs
mensageiros: PPAR1, PPAR2 e PPAR3, que são diferenciados apenas pela região
amino-terminal, na extremidade 5’, como pode-se observar na Figura 5.
O PPAR1 e o PPAR3 codificam a mesma proteína, sendo expressos em
diversos tecidos, incluindo coração, cólon, intestino delgado e grosso, rins, pâncreas
e baço (FAJAS et al., 1997, FAJAS et al., 1998). O PPAR2, conhecido como isoforma
canônica, contêm 28 aminoácidos a mais que o PPAR1/3 na sua região N-terminal,
Mecanismos de Regulação Negativa da Expressão Gênica
a Complexo
Correpressor
b
PPAR
PPAR RXR NF-kB
p50 p65
PPRE TATA TATA Elemento responsivo ao NF-kB
28
sendo altamente expresso no tecido adiposo (TONTONOZ et al., 1994a e 1994b,
TAVARES et al., 2007).
Figura 5. Isoformas do PPAR. As isoformas de PPAR, com AF-1, DBD e LBD destacados, além
dos sítios de fosforilação (p). Estrutura do LBD do PPAR com o ligante (AF-2 em marrom).
Adaptado de BROCK, 2015.
Inicialmente, o PPAR foi caracterizado como fator de transcrição que
regula a expressão gênica na adipogênese, induz a diferenciação dos pré-adipócitos,
sendo envolvido na homeostasia da glicose e sensibilização à insulina (RICOTE et al.,
1998; TONTONOZ e SPIEGELMAN, 2008). Além disso, atua também em outros
processos fisiológicos, como pode ser observado na Figura 6. A ativação do PPAR
pode causar efeitos benéficos no organismo, tais como: aumento da gliconeogênese
no fígado, estimulo na secreção de insulina no pâncreas, causa a sensibilização a
insulina no músculo esquelético e aumenta o metabolismo de lipídeos; ou efeitos
maléficos como: a retenção de líquidos, a descalcificação óssea, crescimento do
coração, diminuição da osteoblastogeneses e aumento da osteoclastogeneses,
Isoformas do PPAR
AF-1
DBD LBD
29
acúmulo de lipídeos no fígado e coração e causando aumento da adipogênese,
gerando ganho de peso (AHMADIAN et al., 2013).
Figura 6. Efeitos conhecidos da ativação do PPAR. As flechas verdes apontam os efeitos
benéficos da ativação do PPAR como, por exemplo, a sensibilização a insulina e o
aumento do metabolismo de lipídeos, já as setas vermelhas apontam para os seus efeitos
deletérios, como, por exemplo, o aumento do coração, o aumento dos níveis de sódio nos
rins, a retenção de líquidos e a adipogênese. Retirado de AHMADIAN et al. (2013, p 561)
Como o PPAR está envolvido com o DT2, uma das patologias da SM
A importância do PPAR no metabolismo humano passou a chamar
atenção em 1995, quando este foi identificado como um receptor para um grupo de
fármacos, conhecidos como tiazolidinedionas (TZDs), caracterizados por aumentar a
sensibilidade à insulina (LEHMANN, 1995). Assim, o PPAR passou a ser o receptor
funcional para as TZDs, como a rosiglitazona (Avandia®) e pioglitazona (Actos®), que
eram considerados medicamentos muito eficazes no tratamento de DT2, sendo bem
tolerados pela maior parte dos pacientes (AHMADIAN et al., 2013).
Efeitos conhecidos da ativação do PPAR.
30
As TZDs atuam como sensibilizadores da insulina in vivo, estão entre os
antidiabéticos orais mais potentes (YKI-JARVINEN et al., 2004; YKI-JARVINEN et al.,
2005) e se ligam ao PPAR com alta afinidade (LEHMANN et al.,1995; AHMADIAN et
al., 2013). Elas aumentam, entre outras coisas, o número de transportadores Glut-4 e
enzimas importantes na sinalização da insulina, levando a uma redução dos níveis de
glicose no sangue. As principais funções das TZDs são diminuir a concentração
plasmática dos ácidos graxos e da hiperglicemia de jejum, através da sensibilização
à insulina. As TZDs possuem outras funções importantes no tratamento da DT2,
auxiliando, por exemplo, na diminuição da hipertensão e redução do risco de
aterosclerose (LEHMANN et al., 1995).
A pioglitazona e rosiglitazona, são TZDs consideradas agonistas seletivas
do PPAR (LEHMANN et al., 1995) utilizadas no tratamento de DT2, devido a sua
pontencial sensibilização a insulina (SAKAMOTO et al., 2000; HALL et al., 2007;
HEIKKINEN et al., 2007). Devido aos efeitos colaterais advindos da ativação do
PPAR, o FDA (Food and Drug Administration) retirou o fármaco do mercado e
restringiu seu uso, sendo este apenas permitido sob avaliação médica (CHOI et al.,
2011; EUROPEAN MEDICINES AGENCY. 2010; JONES, 2005). Os efeitos colaterais
mais comuns das TZDs, são: retenção hídrica, ganho ponderal e adipogênese,
inflamação nos tecidos cardiovasculares, perda de massa óssea e arterosclerose
(NISSEN et al., 2007; SEMPLE et al., 2006; RUBENSTRUNK et al., 2007; GREY,
2008; GREY et al., 2007).
A alta potência que as glitazonas apresentam na ligação com o PPAR é
responsável por ativar seus efeitos indesejáveis. Baseados nisto, alguns estudos
propõem a busca de agonistas seletivos que possam ativar somente funções
benéficas e combinar os efeitos positivos da ativação do receptor, podendo assim,
substituir as glitazonas (NISSEN et al., 2007; GRAHAM et al., 2010; CHOI et al., 2010;
AHMADIAN et al., 2013). Existem evidências, que sugerem que os efeitos benéficos
das TZDs sejam mediados por mecanismos que não dependam da ativação do PPAR
(KIM et al., 2006; LECKA-CZERNIK et al., 2002) como por exemplo a fosforilação
(CHOI et al., 2011).
31
1.5. Um breve histórico sobre o Diabetes
No século XIX, o marco na história do diabetes foi a descrição das ilhotas
pancreáticas por Paul Langerhans (LANGERHANS, 1869), o que contribuiu muito
para a descoberta da insulina em 1921, pelos pesquisadores Banting e Best
(BANTING e BEST, 1922). Até o século seguinte (XXI) não se tinha muita informação
sobre alterações patológicas das ilhotas no DT2, diferente do DT1 (Diabetes Tipo I),
no qual os pacientes sofriam de insulite, que é caracterizada pela perda de células β
do pâncreas, a infiltração de linfócitos, causando inflamação nas células β, resultando
em sua destruição, e consequentemente, diminuição da produção de insulina (IN'T
VELD et al., 2007; YAGIHASHI et al., 2016).
Com a disponibilidade de medições precisas de glicose no sangue (YALOW
E BERSON, 1961) e radioimunoensaios de insulina, o DT2 foi caracterizado pela
hiperglicemia e baixa secreção de insulina. Assim o DT2 foi definido como uma doença
hiperglicêmica crônica causada pela deficiência da ação insulínica, sem antecedentes
patológicos distintos, tal clínica foi fornecida até ao final do século 20 (YAGIHASHI et
al., 2016).
Até então, o que se era sabido, era que o DT2 era uma condição crônica
que ocorria quando o corpo não produzia insulina suficiente ou não conseguia utilizar
a insulina, sendo diagnosticada pelos elevados níveis de glicose no sangue (EVANS
et al., 2000).
Com o avanço da tecnologia, fora possível distinguir os tipos de diabetes,
no qual observaram que a DT1 consiste de uma etiologia auto-imune e a DT2 inclui
um grupo heterógeno de desordens metabólicas caracterizadas pela incapacidade
das células β pancreáticas aumentarem a secreção de insulina, a fim de compensar
a resistência à insulina (STUMVOLL et al., 2005).
Porque o DT2 é tão grave e merece atenção
O DT2 é tipicamente diagnosticado na idade adulta, geralmente, por volta
dos 40 anos, sendo a forma mais comum de diabetes, correspondendo a 90% dos
casos no mundo (STUMVOLL et al., 2005; IDF DIABETES ATLAS, 2015). O número
de casos de DT2 está crescendo com uma taxa de aumento global de 3% ao ano (IDF
DIABETES ATLAS, 2015).
32
O desenvolvimento de DT2 resulta da interação entre fatores ambientais e
componentes genéticos (LANGE et al., 2008). Os fatores ambientais incluem
obesidade, sedentarismo, aumento de peso e estresse (ADEGHATE et al., 2006) e
influenciam em seu desenvolvimento, mas não todos da mesma forma, destacando o
papel que a genética desempenha na etiologia e na manifestação do DT2. Seguem
alguns exemplos, de estudos sobre o DT2.
As formas monogênicas do DT2 representam entre 5 a 10% dos casos de
diabetes, sendo que uma única mutação em um gene transmitido de forma
autossômica-dominante pode causar a doença. Exemplos dessa forma monogênica
de DT2 são representadas pelo MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young), por
mutações no gene e no receptor da insulina (KULKARNI et al., 1999; WITHERS et al.,
1998; REIS e VELHO, 2002).
O MODY é a forma monogênica mais frequente de DT2, sendo
caracterizado por hiperglicemia crônica de origem não auto-imune e anomalia primária
na secreção da insulina. Existem seis genes monogênicos implicados no
desenvolvimento do DT2. Uma mutação no gene codificador da enzima glicoquinase
causa o MODY2. As outras formas de MODY são causadas por mutações secundárias
em fatores de transcrição expressos nas células β-pancreáticas: HNF-1α (MODY3),
IPF-1 (MODY4), HNF-1b (MODY5) e NEUROD1 (MODY6) (YAMAGATA et al., 1996;
FROGUEL et al., 1993; STOFFERS et al., 1997; HORIKAWA et al., 1997; MALECKI
et al., 1999). Existindo genes ainda não identificados chamados de MODY-X (REIS e
VELHO, 2002).
As células β são sensores altamente sofisticados para a concentração de
glicose sistémica, capazes de liberar insulina de acordo com a variação de glicose no
sangue. Dentro das células β, a glicose é internalizada pelo transportador de glicose 2
(GLUT2) e fosforilada pela glicose-6-fosfato quinase que, posteriormente, é
metabolizada na mitocôndria para produzir ATP (Trifosfato de Adenosina). O aumento
na concentração de ATP leva ao fechamento dos canais de potássio (K+) dependentes
de ATP. Isso aumenta a concentração de K+ intracelular, que por sua vez provoca a
abertura dos canais de cálcio (Ca2+) e o afluxo culmina na liberação de vesículas
secretoras de insulina (HABER et al., 2001; FIUME, et al., 2012).
O PPAR é um regulador da transcrição, que atua nestes eventos das
células β. Após a ligação ao seu ligante, este receptor se heterodimeriza com o
33
receptor de retinóide X (RXR), e liga-se aos elementos responsivos (PPREs) dos
genes alvo. Estes incluem genes que regulam as funções de secreção das células β
pancreáticas, preservação e redução da apoptose (TAVARES et al., 2007). Os PPREs
estão presentes em 5 regiões importantes dos genes GLUT2, glicoquinase, Pdx-1
(Pancreatic and Duodenal Homeobox 1), Irs1 (Insulin receptor substrate 1), e insulina
(GUPTA et al., 2010).
Vários genes de risco para o DT2 foram identificados utilizando gene
candidato e estudos baseados em ligação, nos quais a frequência de diferentes alelos
de um determinado gene candidato é comparada entre um grupo de casos e um
grupo-controle. Mais recentemente, outros genes foram identificados por estudos de
associação do genoma (GWAS), que utiliza milhares de polimorfismos de base única
(SNPs) como marcadores genéticos, pois, estão espalhados no genoma todo e em
grande quantidade (NTZANI E KAVVOURA, 2012; MORAN et al., 2015).
Mais de 20 varreduras do genoma já foram realizadas com portadores da
DT2, mostrando diversas formas poligênicas do DT2, sendo que os resultados de um
grupo específico mostraram uma forte co-segregação do DT2 com a região telomérica
do cromossomo 2q (HANIS et al., 1996), que foi chamado de NIDDM1 (Non-Insulin-
Dependent Diabetes Mellitus (Common, Type 2) 1). Outro estudo também sugeriu
associação entre o DT2 e o cromossomo 12q (MAHTANI et al., 1996), mas apenas
em famílias com deficiência na produção de insulina, recebendo o nome de NIDDM2
(Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus (Common, Type 2) 2 [(human)]). Outras
análises demonstraram associações do DT2 com loci nos cromossomos 11q23-25,
1q21-1q23, 10q e 20 em várias outras populações (REIS e VELHO, 2002).
Vários genes têm sido testados para a predisposição ao DT2. No entanto,
os resultados positivos não são reprodutíveis em análises de populações diferentes.
Isso pode ocorrer pelo caráter multigênico secundário da doença, em que a
susceptibilidade genética desfavorável é diferente em cada grupo (REIS e VELHO,
2002). Um estudo muito recente, publicado por Yeinmy Moran e colaboradores
identificou o TCF7L2 que afeta a secreção de insulina (REIS e VELHO, 2002; MORAN
et al., 2015).
O TCF7L2 (Transcription Factor 7-Like 2) está entre os genes altamente
replicados mostrando forte associação com DT2 (SLADEK et al., 2007; CRUZ et al.,
2010). O gene TCF7L2 abrange um grupo de proteínas que atuam como fatores de
transcrição, envolvidas na via de sinalização Wnt (DUVAL et al., 2000). A via Wnt tem
34
um papel importante no metabolismo da glicose e lipídeos, proliferação de ilhotas
pancreáticas, regeneração e função, e na produção de GLP-1 (Glucagon-like peptide-
1) (YI et al., 2005; SHU et al., 2008; SHU et al., 2012; MORAN et al., 2015). Portanto,
alterações nesta via podem causar a redução de secreção de GLP-1, que afetam a
secreção de insulina, entre outros efeitos, e subsequentemente prejudicando
homeostase da glicose no sangue (MORAN et al., 2015).
A situação do diabetes atualmente
O diabetes é um dos maiores problemas de saúde emergênciais do século
XXI. A Organização Mundial da Saúde estima que, globalmente, a glicemia elevada é
o terceiro maior fator de mortalidade prematura, depois de pressão arterial elevada e
uso de tabaco (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009; IDF DIABETES ATLAS,
2015). Muitos estudos mostraram que uma proporção substancial de pessoas com
diabetes, ainda não tenham sido diagnosticadas. Muitas pessoas permanecem sem
diagnóstico, devido baixo nível de sintomas durante os primeiros anos de DT2 (DALL
et al., 2014).
Em países de renda alta, de 87% a 91% de todas as pessoas com diabetes,
são acometidos pela DT2, 7% a 12% DT1 e de 1% a 3% de tem outros tipos de
diabetes (EVANS et al, 2000; BOYLE et al, 1999; BRUNO et al, 2005; HOLMAN et al,
2013). Na maior parte dos países, a DT2 aumentou juntamente com as rápidas
mudanças culturais e sociais: o envelhecimento da população, a urbanização
crescente, redução da atividade física, aumento da ingestão de açúcar e o baixo
consumo de frutas e vegetais (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002).
Em todo o mundo, 415 milhões de pessoas, ou seja, 8,8% dos adultos com
idades entre 20-79, estão diagnosticados com diabetes. Se as tendências
continuarem, em 2040 serão 642 milhões de pessoas, ou um em dez adultos, terá
diabetes. E com relação a mortalidade, a cada 6 segundos uma pessoa morre de
diabetes, totalizando 5 milhões de mortes por ano (IDF DIABETES ATLAS, 2015). O
que torna evidente a necessidade de novos tratamentos para o diabetes,
principalmente porque o Brasil está em quarto lugar entre os 10 países com o maior
número de diabéticos. Além disso, é o pais que tem o maior gasto com a doença na
América do Sul e Central, cerca de 14,3 [12,9-15,8 ‡] milhões de euros, além de
possuir mais da metade das mortes dessa região (IDF DIABETES ATLAS, 2015).
35
Outro fator importante no tratamento do DT2, a resistência à insulina
A resistência à insulina é um fenômeno que desempenha um significativo
papel na progressão e desenvolvimento de doenças metabólicas associadas com a
neurodegeneração e obesidade, levando a casos de DT2. É caracterizada pela
incapacidade de resposta dos tecidos periféricos à insulina, comprometendo o
controle da glicose e do metabolismo de lipídeos, causando uma diminuição da
captação de glicose pelo músculo esquelético, aumentando a produção de glicose
hepática o que causa hiperglicemia pós-prandial (NEWSHOLME et al., 2014).
A alteração na homeostase da glicose coloca um aumento dos encargos
sobre células β pancreáticas, que produzem e secretam mais insulina a fim de
restaurar os níveis arteriais normais de carboidratos. Embora este mecanismo de
compensação possa aliviar os níveis de glicose no início ou no pré-diabetes, a
resistência à insulina continua. Com isso, a supra ativação das células β, em resposta
ao excesso de glicose e lipídios no sangue, acaba promovendo sua disfunção e
subsequente morte, culminando em diabetes (VERDILE et al., 2015).
Uma vez liberada a insulina na circulação, em resposta aos elevados níveis
de glicose no sangue, ela provoca efeitos anabolizantes em associação com o
receptor transmembranar de insulina (RI) em tecidos-alvo. A interação com a insulina
induz autofosforilação do receptor, recrutamento de coativadores e consequente
fosforilação do receptor da insulina (IRS) ativando as cascatas de sinalização
associadas, por exemplo, de PI3K (Fosfatidilinositol-3-quinase) e Akt (V-akt murine
thymoma viral oncogene) (WHITE, 2003; VERDILE et al., 2015).
A resistência à insulina pode ocorrer devido a interferências na cascata de
sinalização, devido a mutações genéticas ou modificações estruturais na via de
sinalização da insulina. Mutações na serina dos RI associadas a hiperfosforilação, tem
sido correlacionadas ao desenvolvimento de resistência à insulina, que pode estar
ligada a diminuição da interação com PI3K (SAINI, 2010; VERDILE et al., 2015).
A modificação estrutural por hiperfosforilação de serinas nos resíduos
Ser302, Ser307, Ser612, Ser632 nos IRS1, sugere ser um elemento responsável pelo
aumento da resistência à insulina. De fato, a expressão excessiva de citocinas pró-
inflamatórias e proteínas de sinalização, tais como fator de necrose tumoral-α (TNF-
α) e kinase/c-Jun N-terminal 1 (JNK1), que podem ser derivados da expansão do
tecido adiposo, induzi a hiperfosforilação das serinas de IRS1, particularmente no
36
resíduo Ser636. No entanto, não é inteiramente claro que os resíduos ou a
combinação de resíduos hiperfosforilados promovam o fenótipo de resistência à
insulina (KUBOTA et al., 2000; VERDILE et al., 2015).
O fenótipo de resistência à insulina pode ser uma consequência de um
mecanismo mais direto que promova a diminuição da expressão de IR ou
dessensibilização à insulina. Especula-se que a hiperglicemia crônica e
hiperinsulinemia prolongada, juntamente com o aumento dos níveis de espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS e RNS) podem causar a disfunção da
expressão de IR na transcrição de fatores como grupo de alta mobilidade AT-hook 1
(HMGA-1) (FOTI et al., 2005) ou pode induzir a dessensibilização de IR, que, em
condições normais, é um processo controlado por feedback negativo (GARVEY et al.,
1986). Cronicamente, hiperinsulinemia é a principal característica de resistência à
insulina (VERDILE et al., 2015).
1.6. Histórico dos fármacos já utilizados para o tratamento do DT2
O derivado sulfonamídico isopropiltiadiazol era utilizado para o tratamento
de febre tifoide em 1944, porém os pacientes estavam indo a óbito após hipoglicemia
prolongada, podendo este ser uma esperança para o tratamento do DT2, devido a
diminuição da glicose no sangue. Em 1955 foi lançada a primeira sulfonilureia,
baseada no fármaco anterior, que é um potencializador de secreção de insulina, e
logo em seguida foram lançadas a carbutamida, a tolbutamida, clorpropamida,
acetoexamida e tolazamida (TSCHIEDEL, 2013; NATHAN et al., 2006; BAILEY e
TURNER 1996; BAILEY e PUAH, 1986). Com a melhora no tratamento dos pacientes,
surgiu uma segunda geração de sulfonilureias, a glibenclamida, a gliclazida, a glipirida
e a gliquidona, e também uma terceira geração, representada pela glimepirida.
Com indícios de resistência à insulina, surgiram as biguanidas, que
atuavam através da diminuição dessa resistência, sendo dessa classe a fenformina
que diminuía a glicemia, mas foi retirada do mercado após observarem que muitos
pacientes tinham acidose lática concomitante ao uso (ROSENSTOCK et al., 1996;
SCHADE et al., 1998). Mesmo com a desconfiança gerada pela fenformina, a
metformina, também da classe das biguanidas, passou a ser cada vez mais utilizada,
sendo um dos principais medicamentos utilizados para o tratamento do DT2.
37
A acarbose é um fármaco que retarda a absorção de carboidratos, inibindo
a alfa-glicosidase e reduzindo a glicemia, porém, mesmo apresentando bons
resultados, não é muito utilizada devido aos efeitos desagradáveis na área digestiva
(BAILEY e PUAH, 1986).
Em 1990 surgiram as TZDs, que foram citadas no item 1.3.1. As glinidas,
repaglinida e nateglinida, são da classe dos secretagogos de insulina como
metformina e as sulfonilureias, mas de curta duração; elas agem estimulando a
secreção de insulina pelas células β pancreáticas e estão, em princípio, indicadas para
pacientes não obesos ou pacientes obesos cuja glicemia não foi controlada por
mudanças do estilo de vida (Aronson, et al., 2003).
No início do século XXI surgiram os inibidores da DPP-4 (Dipeptidil
Peptidase 4) e as gliptinas. O GLP-1 é um hormônio intestinal produzido nas células
neuroendócrinas do intestino delgado, é um potente hormônio anti-hiperglicêmico, que
induz estimulação dependente de glicose da secreção de insulina. Essas drogas
aumentam esse efeito e com isso potencializam a liberação da insulina endógena,
praticamente sem provocar hipoglicemia, pois têm efeito glicose-dependente
(LEBOVITZ et al, 2001; ARONOFF et al., 2000; PORETSKY, 2010).
Uma grande revolução começou com os inibidores dos transportadores de
sódio-glicose (i-SGLT2). Eles foram desenhados a partir da evidência de que os
pacientes com DT2 absorvem mais glicose nos túbulos renais. A SGLT2, molécula
expressa no rim é a responsável pela reabsorção da glicose no túbulo renal. Inibindo-
se o SGLT2 aumenta-se a excreção renal de glicose, diminuindo a glicosúria, que
sempre foi um parâmetro utilizado para avaliar o diabetes. Os fármacos disponíveis
hoje que atuam dessa maneira são: a Dapagliflozina e a Canagliflozina (TSCHIEDEL,
2013).
A Abordagem de novos fármacos para o DT2
As Glitazonas efetivamente melhoram a sensibilidade à insulina através da
alta ativação do PPAR, mas esta ativação da transcrição está associada a efeitos
secundários indesejados. Assim, a identificação de agonistas que modulam
parcialmente o PPAR e mantêm o potencial de redução de glicose, sem induzir os
efeitos secundários já descritos, é uma abordagem promissora para o
38
desenvolvimento de agentes de redução da glicose com um perfil de segurança
aceitável (ARGMANN et al., 2005; GRONEMEYER et al., 2004; LIU et al., 2015).
Foi assumido que Avandia® e Actos® agiam exclusivamente sobre a
ativação do PPAR. Em 2010, Spiegelman e Griffin relataram uma segunda função
para estes ligantes, as quais eram ignoradas até o momento (CHOI et al., 2010).
Segundo eles, estas TZDs também bloqueiam um processo chamado de fosforilação,
por uma molécula conhecida como CDK5 (Cell Division Protein Kinase), que modifica
o PPAR de uma maneira completamente separada do agonismo. Esse mecanismo,
de fato, está envolvido na sensibilização à insulina, aparentemente sem os efeitos
colaterais preocupantes (AMATO et al., 2012, FINAN et al., 2012).
O trabalho desenvolvido por Choi e colaboradores em 2011, além de
outros, explicam que a fosforilação do PPAR pela CDK5 não ativa, nem suprime a
atividade transcricional do receptor em geral, mas muda a expressão de genes
específicos como a adiponectina, por exemplo (CHOI et al., 2011). Estudos em
camundongos, com dieta rica em gordura, demonstraram que a fosforilação do PPAR
mediada pela CDK5 está ligada à obesidade. Vários ligantes do PPAR considerados
anti-diabéticos efetivos, com ou sem propriedades de agonistas clássicos, inibem
diretamente esta ação da CDK5, restaurando os padrões de expressão gênica. Além
disso, a inibição desta fosforilação pelo ligante rosiglitazona, em humanos, está
intimamente associada ao efeito antidiabético causado pelo fármaco (CHOI et al.,
2011; BERGER et al., 2002).
A sequência primária de aminoácidos do PPAR contêm um local consenso
para a fosforilação pela CDK5, a Serina 273 (Ser273). A CDK5 não é regulada por
ciclinas, mas em vez disso é ativada por p35/25, que são alvos de numerosas citocinas
pró-inflamatórias. Choi e seus colaboradores realizaram uma mutação da Ser273 para
uma alanina, bloqueando assim a fosforilação pela CDK5, e os resultados indicaram
que não há outras regiões do PPAR que sejam fosforiladas pela CDK5 (CHOI et al.,
2011).
Com isso, verificou-se que a inibição da fosforilação da Ser273 do PPAR
está intimamente associada com seus efeitos anti-diabéticos. Observaram que um
pequeno grau de agonismo, ou seja, um ligante que se acomode no sítio, mas não
recrute coativadores, não fechando a hélice 12 (Figura 7), mas mudando sua
conformação, escondendo a Ser273, irá bloquear a fosforilação mediada pela CDK5,
39
Estrutura do PPAR evidenciando suas hélices
sensibilizando à insulina. O que também irá diminuir os efeitos deletérios, causados
pela ativação, recrutamento de coativadores, incluindo o ganho de peso e a retenção
de fluidos, que podem ocorrer por meio de ações de agonistas clássicos. Em termos
gerais, a capacidade dos "agonistas parciais" para bloquear a fosforilação é válida,
permitindo a identificação de novas drogas. As quais não se liguem com muita
afinidade ao receptor, diminuindo assim os efeitos secundários, mas estabilizando o
receptor e bloqueando a fosforilação, causando assim, sensibilização a insulina (CHOI
et al., 2011; LIU et al., 2015).
Figura 7. Estrutura do PPAR LBD mostrando suas hélices e ligante comercial Rosiglitazona.
A Hélice 12 é um interruptor regulado por ligantes para a atividade de transcrição do
receptor nuclear. O ligante é mostrado em esferas (CPK), com a hélice 12 fechada na cor
púrpura, hélice 12 aberta na cor azul, as folhas β na cor amarela e um peptídeo coativador
ligado na cor de laranja. O ligante encontrado no sítio é a rosiglitazona (PDB 2PRG).
Adaptado de NETTLES (2008, v. 15, n. 9, p 1).
Essas pesquisas sugeriram que é possível desenvolver novas drogas
contra DT2 a partir de uma nova abordagem. Esta se basearia no desenvolvimento
de moléculas que induzissem o bloqueio da fosforilação da Ser273 contida no LBD do
PPAR. Com essas descobertas, ficou comprovado que alguns efeitos colaterais
causados pela administração das glitazonas são provenientes da alta ativação do
receptor, argumentando que uma melhor modulação do PPAR para a sensibilização
40
à insulina seria importante para a ativação de uma nova via de sinalização, na qual a
fosforilação do resíduo Ser273 dele estaria envolvida (CHOI et al., 2011; AHMADIAN
et al., 2013; ECKEL et al., 2005).
Envolvimento da fosforilação e o tratamento do DT2
Os efeitos colaterais causados pela ativação do PPAR, geraram muitas
discussões sobre como deviriam ser realizadas modulações no receptor, para que ele
fosse eficaz no tratamento de DT2, sem os efeitos colaterais causados pela
rosiglitazona. Os dados publicados por Choi e colaboradores mostraram que a
regulação da fosforilação da Ser273 do PPAR foi o principal responsável pelos efeitos
da sensibilização insulina, e os conceitos clássicos sobre a modulação deste receptor
mudaram (CHOI, et al; 2010). Curiosamente, os ligantes antidiabéticos do PPAR que
foram anteriormente estudados, agiam ativando o PPAR e essa ativação também
inibia a fosforilação mediada pela CDK5, provavelmente através da indução de uma
alteração conformacional no receptor. Com esta nova abordagem, os autores
propuseram que para buscar novos ligandos para o PPAR, a potência deve ser
separada do agonismo, pois se tem observado que o agonismo completo é
responsável pelos efeitos secundários indesejáveis, enquanto o bloqueio da
fosforilação da Ser273 pela CDK5, deve ser a melhor estratégia para melhorar a
sensibilização à insulina (KNOUFF, C. & AUWERX, J. 2004; HOUTKOOPER, R.H. &
JOHAN, A., 2010; JONES, D., 2010).
Seguindo essa premissa, as estratégias para a busca de novos ligantes
para PPAR também mudaram. Agora, é necessário encontrar um composto capaz
de se ligar PPAR, não o ativando, mas preservando as capacidades de não diferenciar
adipócitos e prevenir a fosforilação. Aqui propomos um conjunto de metodologias que
permite visualizar esses efeitos e, também, apresentamos uma triagem de 102
compostos utilizando esta abordagem. Nossos resultados mostram três moléculas
que podem ser candidatos de sucesso para esta nova modulação do PPAR.
41
Devido ao aumento global e alarmante na incidência de obesidade e DT2,
há uma necessidade urgente de desenvolver tratamentos mais eficazes e estratégias
de prevenção. Além das intervenções no estilo de vida, tornando-a mais saudável, a
aplicação de medicamentos seguros pode ajudar no tratamento da atual epidemia da
SM e ajudar na resistência à insulina, que induz o DT2. O PPAR desempenha um
papel central na regulação da diferenciação dos adipócitos, no metabolismo dos
lipídeos, na homeostase da glicose e sensibilização à insulina; portanto, a modulação
farmacológica deste receptor nuclear é uma estratégia estabelecida para tratar a
resistência à insulina e as dislipidemias causadas pela SM (WILLSON et al., 2001).
Nesse sentido, este projeto teve como principal alvo a busca de novos
agonistas parciais, ou ligantes seletivos para o receptor PPAR, utilizando um conjunto
de metodologias para a triagem de compostos sintéticos e derivados de substâncias
naturais, que foram testados em ensaios biofísicos e celulares, afim de selecionar
aqueles que diminuem a ativação do receptor e principalmente impedem a fosforilação
da Ser273.
2. JUSTIFICATIVA
42
Este trabalho consistiu no desenvolvimento de um conjunto de
metodologias (pipeline) para uma busca racional de ligantes para o receptor nuclear
PPAR, visando encontrar um “hit” antidiabético para o tratamento da SM.
Os objetivos específicos deste projeto foram:
1. Reunião de compostos de origem sintética e de produtos naturais.
2. Realização de estudos de estabilização das estruturas secundária e
terciária do PPAR; confirmação da ligação dos compostos que estabilizam o sítio do
PPAR por ensaios biofísicos; e estudos celulares de ativação do PPAR pelos
compostos selecionados.
3. Verificação, em células, de efeitos deletérios causados pelos compostos
selecionados através de ensaios de diferenciação de adipócitos; análise da expressão
gênica mediante o tratamento com ligantes selecionados; e estudos de inibição de
fosforilação do receptor também mediante tratamento com os ligantes selecionados.
4. Estudos estruturais e biofísicos de interação proteína/ligante.
3. OBJETIVOS
43
3.1. Procedência dos Clones e Ligantes
Para os experimentos em células 293T foi utilizado o plasmídeo repórter
pGRE-LUC, contendo o elemento responsivo GRE (Gal Responsive Element) do
GAL4 upstream do gene repórter da luciferase de vagalume e o plasmídeo pBIND,
que possui a sequência que transcreve o elemento regulatório, ou seja, a proteína
quimera composta pelo DBD da proteína GAL4 e o LBD do PPAR, com controle
exercido por um promotor forte de citomegalovírus (CMV). Os plasmídeos utilizados
foram cedidos pelo Dr. Paul Webb (The Methodist Hospital Research Institute,
Houston, EUA)
O plasmídeo utilizado para a expressão heteróloga do LBD-PPAR
(aa 207-476) com cauda de histidina foi o pET28a, existente no Laboratório de
Espectroscopia e Calorimetria da Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira.
Dos compostos testados, 71 foram gentilmente cedidos pelo grupo dos
professores Dr. Ricardo José Nunes e Dr. Rosendo Augusto Yunes, do Laboratório
de Estrutura e Atividade da Universidade Federal de Santa Catarina; 18 ligantes, pela
EMBRAPA. Outros 6 compostos foram doados pelo Prof. Dr. Ronaldo Aloise Pilli do
Instituto de Química da UNICAMP, 6 compostos pelo Prof. Dr. Alessandro Silva
Nasciment da USP e 1 composto pelo grupo LQPN (Laboratório de Química e
Produtos Naturais) do CNPEM. Todos estes totalizaram 102 compostos para
realização dos testes propostos no projeto, sendo que parte deles foram pré-
selecionados no laboratório de nossos colaboradores e apresentaram alguma
atividade antidiabética em camundongos.
3.2. Expressão do domínio LBD do PPAR
Para a expressão do domínio LBD do PPAR, foi utilizado meio LB com
kanamicina na concentração de 50 μg/mL para inocular as bactérias E. coli
BL21(DE3), que foram previamente transformadas com o vetor pET28a possuindo o
gene relativo à construção LBD, representada a seguir:
3. MATERIAL E MÉTODOS
44
Figura 8. Construção LBD do PPAR. Sequenciamento do receptor utilizado nos experimentos.
O crescimento da pré-cultura foi realizado a 37 °C por 12 horas, a qual foi
posteriormente diluída 100x em meio 2xYT com 50 μg/mL de kanamicina. O cultivo foi
mantido na temperatura de 22 °C sob vigorosa agitação (200 rpm) por 16 horas, sendo
induzido com 1 mM de IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo) por 8 horas. Após
as 8 horas de indução, a cultura foi sedimentada em uma centrífuga Avanti J26xPT
(Beckman Coulter) a 8000 rcf por 20 min à 4 °C, separando o sobrenadante da fração
sólida (pellet bacteriano). Ao final do processo a proteína foi purificada a partir do
sobrenadante do lisado celular.
3.3. Purificação do LBD do PPAR
O pellet bacteriano foi ressuspendido em tampão contendo 300 mM de
NaCl, 50 mM de Tris pH 8,0, 5% de Glicerol e 2 mM de β-Mercaptoetanol em uma
proporção de 30 mL de tampão para cada litro de cultura expressa. Após a
ressuspensão foi feita a lise das bactérias com a adição de 80 µg/mL de lisozima, por
40 min, a 4 °C. Em seguida, o extrato foi sonicado no Vibra Cell (Sonics), 25 vezes
com pulsos de 10 segundos intercalados por 10 segundos de descanso, em uma
amplitude de 35%. A fração solúvel foi separada por centrifugação a 15000 rcf por 40
minutos à 4 °C na centrifuga Allegra X-30R Centrifuge (Beckman Coulter).
A purificação foi feita por cromatografia de afinidade, pois a proteína alvo
apresenta uma cauda de histidina, conferida pelo vetor pET28a. A fração solúvel foi
Cronstução LBD do PPAR
Cauda de
Histidina
Sítio de
Clivagem da
Trombina
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKT
TDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEY
AKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLR
KPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQAL
ELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKD
LY
45
incubada com a resina Talon Superflow (Clontech), na quantidade de 1,5 mL de resina
para cada litro de cultura por 1 h a 4 °C, depois centrifugada a 500 rcf por 10 min a
4 °C para retirar o FT (flow through). Após a centrifugação, a resina foi empacotada
em uma coluna de plástico PoliPrep (Biorad) e lavada com 10 CV (volumes de coluna)
com um tampão contendo 50 mM de tris pH 8,0, 300 mM de NaCl, 5% de glicerol,
5 mM de imidazol e 2 mM de β-Mercaptoetanol. Em seguida, o PPAR foi eluído da
resina com um tampão contendo 50 mM de Tris pH 8,0, 300 mM de NaCl, 5% de
glicerol, 300 mM de imidazol e 2 mM de β-Mercaptoetanol. Todos os procedimentos
de lavagem e eluição foram realizados na câmara fria, a 4 °C, pois o PPAR é
termossensível. As amostras obtidas foram analisadas em SDS-PAGE 12%,
visualizado através de coloração com Coomassie Blue (0,25% de Coomassie briliant
blue).
3.4. Purificação por Gel Filtração
Para obter um maior grau de pureza, utilizou-se mais um passo de
purificação. A gel filtração foi realizada utilizando uma coluna Superdex 200 16/60,
previamente equilibrada com 2 CV de solução tampão contendo 50 mM deTris/HCl
pH 8,0, 300 mM de NaCl e 5% de glicerol. Foram injetados 5 mL de proteína em uma
concentração de 8 mg/mL na coluna de gel filtração em um fluxo de 1 mL/min,
realizando-se uma eluição isocrática com um volume e meio de coluna. Todo processo
necessariamente ocorreu com o coletor de amostras, a coluna e o tampão mantidos
gelados devido ao fato das proteínas serem termossensíveis, no ÄKTA FPLC (GE
Healthcare Life Sciences).
3.5. Estocagem das Proteínas
Após a purificação da proteína de interesse, a amostra foi dividida em
alíquotas de 100 e 200 µL, contendo 5% de glicerol, congeladas em nitrogênio líquido
e mantidas em freezer a -80 °C.
3.6. Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS - Dynamic Light Scattering)
Partículas suspensas em um líquido estão sujeitas ao movimento
browniano, sendo que partículas pequenas movem-se mais rápido que as partículas
46
maiores (ROBERT BROWN, 1827; SILVIO, 2005). O DLS permite o cálculo do raio
hidrodinâmico das partículas em solução, podendo ser correlacionado com o tamanho
das partículas em solução. A técnica de DLS consiste na análise das flutuações de
intensidade da luz espalhada em um determinado ângulo. Essa análise fornece
informações sobre o movimento da partícula, movimento este que é a causa das
flutuações da intensidade. A variação de intensidade espalhada é analisada
examinando sua função de autocorrelação e, assim, é possível calcular o tamanho
das partículas.
Neste ensaio, um feixe de laser (633 nm) é direcionado na amostra e todas
as partículas existentes na solução espalham a luz em todas as direções, sendo que
os fótons espalhados são coletados por uma fotomultiplicadora, a um ângulo fixo de
90°. A autocorrelação é calculada em uma função na qual cada população
monodispersa de partículas irá produzir uma função única de autocorrelação
(TANNER, 1982).
A técnica de DLS foi empregada para estudar a qualidade da amostra a ser
submetida à cristalização, após purificação. As medidas foram realizadas em
triplicatas, sendo cada uma composta por 50 acumulações de 2,5 segundos, com a
proteína variando sua concentração de 1 a 5 mg/mL, a 10 °C. Foram avaliados a
monodispersão e o estado oligomérico do PPAR. O equipamento utilizado foi o
ProteinSolutions DynaPro (Wyatt).
3.7. Eletroforese Nativa
A eletroforese baseia-se na movimentação de partículas carregadas em um
campo elétrico em direção a um eletrodo de carga oposta. A eletroforese nativa é
realizada na ausência de SDS, deste modo, a mobilidade passa a depender da carga
e do tamanho da proteína. A carga elétrica da proteína depende da sua estrutura
primária e do pH no qual é realizada a corrida eletroforética. Já o tamanho da proteína
varia conforme a natureza da sua conformação, sendo que conformações mais
compactas apresentarão uma maior mobilidade. Deste modo, a eletroforese nativa
pode ser utilizada para estudar a conformação, a oligomerização e a agregação de
proteínas (MORAES et al, 2013).
Neste estudo, a eletroforese nativa foi usada no intuito de verificar a
qualidade da amostra. Nos ensaios foram utilizados géis nativos PhastGel™ do
47
sistema PhastSystem (GE), com a concentração de acrilamida variando em um
gradiente de 8 a 25%, sendo aplicadas 4 μg de proteína no gel. Após a corrida, os
géis foram corados por 1 hora no corante A (0,2% de azul de bromofenol, 20% de
glicerol e 100 mM de Tris-HCl pH 6,8). Em seguida, foi descorado no descorante A1
(30% de metanol e 10% de ácido acético) até que as bandas pudessem ser bem
visualizadas. Os géis descorados foram fixados por 1 a 2 horas em solução de
preservação (10% de ácido acético e 13% de glicerol).
3.8. Controle para Triagem de Ligantes
Em todos os experimentos realizados para a triagem de novos ligantes para
o PPAR, utilizamos como controle positivo a molécula de rosiglitazona, visto que é
um ligante bem conhecido e caracterizado para o PPAR e como controles negativos,
utilizamos DMSO (solvente dos compostos) e o PPAR sem ligante.
3.9. Termo Estabilidade (TSA – Thermal Shift Assay)
O ensaio de termo estabilidade é uma ferramenta rápida e sensível para
monitorar a estabilidade da estrutura terciária em diversas condições. As condições
que podem ser examinadas são muito diversas, por exemplo, pH, sais, aditivos,
medicamentos, leads de drogas, oxidação/redução ou mutações. A ligação de ligantes
de baixo peso molecular pode aumentar a estabilidade térmica de uma proteína, tal
como descrito por Koshland e Linderstrom-Lang e Schellman (KOSHLAND et al.,
1958), auxiliando na identificação de condições ótimas para a estabilidade proteica e
investigando interações entre proteínas e seus ligantes específicos. Devido a essas
características utilizamos o TSA para dar início a nossa triagem de ligantes.
O ensaio de TSA é baseado na desnaturação da proteína induzida por
temperatura, que é monitorada por um fluoróforo sensível como, por exemplo, uma
sonda que se liga as partes hidrofóbicas da proteína. Nesse caso, à medida que a
proteína se desenovela, expõe suas partes hidrofóbicas e o fluoróforo se liga e emite
fluorescência. Os dados de fluorescência podem ser submetidos a um ajuste
sigmoidal e, a partir dele, pode-se determinar a temperatura de melting (Tm).
Comparações entre as Tms obtidos podem ser usadas para determinar as melhores
condições experimentais de trabalho, assim como a influência de outras moléculas
48
(como ligantes e substratos) na estabilidade da estrutura terciária das proteínas (LOA,
et al., 2004).
Esse ensaio foi realizado no 7500 Real Time PCR System (Applied
Biosystems), com o fluoróforo SYPRO® Orange (conforme as instruções do
fabricante). A concentração de proteína utilizada foi de 4 µM final em solução tampão
contendo 50 mM de Tris pH 8,0, 300 mM de NaCl, 5% de glicerol, 300 mM de imidazol
e 2 mM de β-Mercaptoetanol, com 3 vezes de excesso de ligante (12 µM) e 1x de
sonda (estoque 5000x). A proteína incubada com seus respectivos ligantes e a sonda
foram colocados em uma placa MicroAmp™ Optical 96-well Reaction plate (Applied
Biosystems), em um volume final de 25 μL, e então, submetidas à leitura no 7500 Real
Time PCR System, com comprimento de onda de excitação de 470 nM e 570 nM para
emissão. As amostras foram submetidas a uma rampa de temperatura iniciada em
10 °C e finalizada em 90 °C, totalizando 80 aquisições de 0,5 segundo por grau. Todas
as medidas foram feitas em triplicatas, em 3 experimentos independentes.
Os dados foram transpostos no excel e adicionados a planilha Excel script
for the analysis of protein unfolding data acquired by Differential Scanning Fluorimetry
(DSF Analysis v3.0.2) de Frank Niesen e depois submetidas a um ajuste sigmoidal no
OriginPro 9.0 (NIESEN, 2010).
3.10. Dicroísmo Circular (CD – Cicular Dichroism)
O dicroísmo circular corresponde à medida da absorbância diferencial da
luz circularmente polarizada por uma molécula assimétrica. Este fenômeno é
rotineiramente utilizado no estudo da estrutura secundária de proteínas. Para este
experimento utilizamos o espectropolarímetro J-810 (Jasco). Com esta técnica
pudemos confirmar se, de fato, os ligantes que estabilizaram a estrutura terciária
mantiveram e estabilizaram a estrutura secundária do PPAR LBD.
Espectro de Dicroísmo Circular
A aquisição do espectro de CD foi necessária para avaliar a estrutura
secundária da proteína, como α-hélice, folhas-β ou formas desordenadas (random
coil).
Para realizar as leituras no espectro, as amostras de proteína em uma
concentração de 5 µM foram dialisadas ON (over night) em água, para a retirada do
49
imidazol e DMSO contidos na solução tampão, e consequentemente houve diluição
de todos os componentes ali presentes. Após a diálise, as amostras foram submetidas
a uma varredura espectral de 190 nm até 260 nm, a 10 °C, utilizando uma cubeta de
1 mm de espessura. Esta medida também foi realizada com o PPAR LBD
complexado com os ligantes. Eles foram adicionados à proteína em 3 vezes de
excesso molar, (15 µM) incubados por 30 min antes de serem dialisadas em tubos
Slide-A-Lyzer® Mini Dialysis Units de 10000 MWCO, em água ON (over night). Os
dados foram tratados no OriginPro 9.0.
A deconvolução do espectro foi realizada no Dichroweb (WHITMORE and
WALLACE, 2008; WHITMORE and WALLACE, 2004; LOBLEY et al, 2002) e o
algorítmo utilizado foi o K2D (ANDRADE et al., 1993).
Desnaturação Térmica Monitorada por CD
A maioria das proteínas pode ser desnaturada pelo calor, que afeta as
interações em uma proteína (especialmente entre as ligações de hidrogênio) de forma
complexa. Quando a temperatura se eleva lentamente, uma conformação proteica
geralmente permanece intacta até que haja uma perda abrupta de estrutura em uma
faixa estrita de temperaturas. Essa alteração repentina indica que o desenovelamento
é um processo cooperativo: a perda da estrutura em uma parte da proteína
desestabiliza outras partes (LESK, 2008).
Durante a desnaturação térmica foi monitorado o sinal de CD nos
comprimentos de onda de 208 e de 222 nm, sendo que estes foram os mínimos
observados na varredura espectral realizada no passo 4.10.1. O monitoramento foi
feito através de rampa de temperatura entre 10 °C e 100 °C, com uma taxa de
aumento de 1 °C por minuto, mantendo-se a temperatura em cada grau Celsius,
durante 5 segundos. Os dados foram tratados no OriginPro 9.0 e submetidos a um
ajuste sigmoidal, típico de processos cooperativos, avaliando sua estabilidade na
presença e na ausência de ligantes, a partir da Tm (temperatura de Melting) calculada
pelo ajuste sigmoidal das curvas.
50
3.11. Supressão de Fluorescência do ANS
Um modo para obter parâmetros físico-químicos e monitorar o metabolismo
e a eficiência de fármacos é estudar a supressão de fluorescência em proteínas,
induzida pela presença desses fármacos (EFTINK et al., 2000; MATILIS, 1998).
O ANS só fluoresce quando em ambiente hidrofóbico, como o sítio ativo
(pocket) do PPAR. Quando adicionadas moléculas que tenham mais afinidade ao
sítio, essas deslocam o ANS, o qual perde a fluorescência em ambiente aquoso.
Os 20 compostos selecionados no TSA e confirmados no CD, ou seja, os
20 compostos que melhor estabilizaram as estruturas terciária e secundária do PPAR
LBD foram submetidos ao ensaio de supressão de fluorescência do ANS para assim
selecionar aqueles que, de fato, interagem com o sítio do receptor.
Os experimentos com a sonda ácido 8-anilino-1-naftalenosulfônico (ANS)
foram feitos para mostrar possíveis alterações estruturais nas regiões hidrofóbicas do
PPAR com diferentes ligantes. A sonda ANS, é conhecida por auxiliar em
experimentos envolvendo sítios hidrofóbicos de proteínas. Sua excitação no
comprimento de onda de 360 nm resulta em uma emissão com o máximo em torno de
545 nm. A interação do ANS com as proteínas ocorre principalmente pelo pareamento
iônico entre os grupos sulfonatos da sonda com os aminoácidos carregados
positivamente, histidina (H), lisina (K) ou arginina (R) (MATILIS et al., 1998).
O sítio do PPAR é composto pelos aminoácidos Glu295, Ala292, Arg288,
Ser289, Cys285, Phe226, Met329, Ile326, e Leu330 da H3 (Hélice) e H5, que tem
características hidrofóbicas, permitindo a ligação da sonda ANS (LIBERATO et al.,
2012). Nesse ensaio, utilizamos a supressão estática de fluorescência observada
após a formação de um complexo entre o PPAR e os compostos testados, os quais,
deslocaram o ANS do sítio do receptor à medida que tinham suas concentrações
aumentadas. Dessa forma, o ANS é desligado do PPAR e retorna para a solução,
fazendo com que o fluoróforo não esteja em ambiente adequado para fluorescer,
havendo, assim, mudanças nos padrões de interações iônicas, o que diminui a
intensidade da fluorescência emitida. (OKTAY et all, 2008)
Para a realização do ensaio, incubou-se a proteína a 1 µM final com
concentrações diferentes dos compostos (0; 0,1; 0,3; 1,0; 3,0; 5,0; 10; 20; 30; 40; 50
e 60 µM), por 1 hora, a 4 °C. Após a incubação, adicionou-se a mistura PPAR +
51
compostos em uma placa de 96 poços (Microplaca 96 cav. Preta). Em seguida
adicionou-se o tampão (50 mM de Tris, 50 mM de NaCl, pH 8,0) e a sonda ANS em
uma concentração de 10 µM, obtendo assim o volume final de 50 µL. A leitura foi
realizada no EnSpire multimode plate reader (Perkin Elmer) com excitação no
comprimento de onda de 380 nm e varredura de emissão entre 400-600 nm, na
temperatura de 25 °C, apresentando o máximo de emissão de fluorescência em
480 nM.
3.12. Cultura de Células
Com a finalização dos testes biofísicos iniciais, os 3 compostos mais
promissores (P11, R32 e AM-879) foram testados na cultura de células em 3
experimentos diferentes. Através deles pudemos avaliar os resultados de forma mais
abrangente, pois se tratam de resultados in vivo. Apesar de não serem organismos
completos, já existe a possibilidade de conclusões iniciais importantes.
As células 293T e HepG2 foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium), pH 7,4, contendo 50 unidades/mL de antibiótico penicilina
e estreptomicina, 3,7 mg/L de bicarbonato de sódio e 10% (v/v) de soro fetal bovino,
em garrafas T75 para cultura de tecidos Tissue Culture Flask (Sarstedt). As garrafas
foram então mantidas em estufa de ambiente controlado a 37 °C, 95% de ar e 5% de
CO2. As células 3T3L1 foram cultivadas praticamente da mesma forma que a 293T e
HepG2, sendo a única diferença o soro utilizado, que no caso foi o soro neonatal
bovino, não deixando as células ultrapassarem da confluência de 70%.
Para realização da transfecção celular, utilizada nos experimentos de
transativação e EC50, foram utilizadas células aderidas 293T. E para a realização do
ensaio de qPCR foi utilizada a célula HepG2, disponíveis no LEC (Laboratório de
Espectoscopia e Calorimetria) do LNBio. No ensaio de diferenciação de adipócitos
foram utilizadas as células aderidas 3T3-L1, gentilmente cedidas pela Professora Dra.
Ana Campa da Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas.
Transativação com Gene Repórter
O ensaio com gene repórter é um método utilizado na pesquisa e
identificação de ligantes para receptores nucleares (FORMAN et al., 1995). Esse
ensaio consiste na inserção de plasmídeos de expressão nas células de interesse
52
(transfecção), seguido do tratamento das células com os ligantes de estudo. Na
presença de substâncias agonistas, o gene repórter (luciferase) terá sua produção
aumentada e servirá de indicador da atividade transcricional de um determinado
receptor.
Os plasmídeos utilizados para realização do ensaio foram:
O plasmídeo repórter pGRE-LUC, contendo o elemento responsivo GRE
(Gal Responsive Element) do GAL4 e o gene repórter da luciferase de vagalume, que
é um gene marcador altamente sensível da expressão gênica em células e tecidos.
O plasmídeo pBIND possuindo a sequência que transcreve o elemento
regulatório, ou seja, a proteína quimera composta pelo DBD da proteína GAL4 e o
LBD do PPAR, com controle exercido por um promotor forte de citomegalovírus
(CMV). A ligação do ligante ao LBD ativa a proteína e seu DBD reconhece uma
sequência específica no DRE (direct response elemento) que controla a expressão de
luciferase. Quando a luciferase expressa através da ativação da proteína quimérica
encontra moléculas de luciferina, ocorre uma reação enzimática que resulta em
luminescência.
O plasmídeo pRL-TK, é utilizado como controle do experimento. Ele produz
uma sequência que transcreve constitutivamente o gene da luciferase de Renilla
depois de transfectado. Dessa forma, podemos normalizar os dados e minimizar a
variabilidade causada por diferenças na viabilidade celular ou eficiência da
transfecção, além de diferenças causadas pela pipetagem e pelo processo de lise
celular. Esse plasmídeo é proveniente do Kit Dual-Luciferase Report Assay system
(Promega, Madison, WI).
O plasmídeo pBLUE foi utilizado para controle negativo de transfecção,
para que assim haja a mesma quantidade de DNA transfectado nas células e também
para que possamos observar a expressão basal para normalização dos dados.
Para o ensaio de transativação, foram utilizadas células 293T, que foram
tripsinizadas, ressuspendidas em DMEM e colocadas em placas de 24 poços
(densidade de 1,6x105 células/poço). Após 24 horas, o meio DMEM foi trocado por
meio DMEM Incompleto (sem adição de antibiótico e soro fetal bovino) e procedeu-se
com a transfecção de 500 ng depGRE-LUC, 500 ng de pBind contendo o PPAR
LBD/GAL4 DBD, 500 ng de pRL-TK e 500 ng de pBLUE, utilizando-se lipofectamina
2000 (invitrogen®). A relação utilizada de DNA (µg) para lipofectamina (µL) foi de
53
1,5:2. Após 4 horas o meio DMEM Incompleto foi trocado por meio CHARCOAL
(Charcoal stripped fetal bovine serum Life Technologies), que é um meio sem lipídeos,
para evitar a ligação de ácido graxo no sítio ativo do PPAR e, então, as células foram
tratadas com 1 µM dos compostos em estudo e mantidas por 36 horas na estufa.
Após esse período, a monocamada celular foi ressuspendida em tampão
de lise (Kit Dual-Luciferase Report Assay System (Promega). As atividades da
luciferase de vagalume e de Renilla, presentes no lisado celular, foram determinadas
usando o kit Dual-Luciferase Report Assay System, conforme indicado pelo fabricante,
sendo as medidas realizadas no luminômetro Glomax (Promega).
Os dados gerados a partir dessa leitura de luminescência foram graficados
e tratados no Microsoft Excel 2013, obtendo assim a ativação do receptor com cada
molécula de tratamento.
Cálculo de EC50
A concentração do fármaco que induz metade do efeito máximo (EC50), é
usada normalmente como medida da potência de uma droga, sendo que uma curva
de dose-resposta graduada representa a concentração do composto para qual 50%
do efeito é observado (GRAPHPAD SOFTWARE, 2016; LEFERS, 2004).
Para o cálculo dos valores de EC50 dos 3 compostos, estes foram
adicionados a cultura de células em diferentes concentrações, de forma a traçar uma
curva entre a capacidade de ativação do respectivo ligante e sua concentração.
As células 293T, foram transfectadas da mesma forma como descrito no
item 3.13.1. e então, as células foram tratadas com 7 concentrações diferentes
(0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM e 100 µM) dos compostos em estudo e
mantidas por 36 horas na estufa para transcrição dos genes.
Os dados obtidos através da leitura de luminescência foram tratados no
Microsoft Excel 2013, normalizados e depois as curvas foram submetidas a um ajuste
sigmoidal no OriginPro 9.0 utilizando a equação de dose-resposta.
Diferenciação de Adipócitos
O processo de adipogênese é avaliado com o estudo de alguns tipos
celulares que podem ser induzidos, a diferenciar-se em adipócitos em cultura. O
primeiro e melhor modelo já caracterizado de adipogênese é a linhagem celular
54
3T3L1, uma subcepa da linhagem 3T3 do camundongo Swiss, comprometida com a
diferenciação adipocitária (GREEN e KEHINDE, 1975). As células 3T3-L1 têm uma
morfologia do tipo fibroblasto e, em condições adequadas, as células se diferenciam
em adipócitos. Com o acúmulo de lipídeos as células adquirem um formato
arredondado. Estas células também são sensíveis aos hormônios e drogas
adipogênicas e lipolíticas, incluindo epinefrina, isoproterenol e insulina (GREEN e
KEHINDE, 1975; SPIEGELMAN, 1998).
As células 3T3L1 foram utilizadas para avaliarmos o processo da
adipogênese e observar quais dos 3 compostos (P11, R32 e AM-879) diminuiria a taxa
de acúmulo de lipídeos dentro das células, quando comparadas com as células
tratadas com rosiglitazona, que provoca o ganho de peso como efeito colateral.
As células foram cultivadas como descrito no item 4.13. e ao atingirem a
confluência de 70%, estas foram tripsinizadas, contadas e adicionadas em placas de
6 poços (Corning®) em uma densidade de 2,8x105 células/poço até atingirem
novamente a confluência de 70%. Após aguardar 48 horas, as células foram tratadas
com 1 µM de dexametasona, adicionado ao meio de cultura e 1 µM dos compostos
selecionados, sendo o DMSO utilizado como controle negativo e a rosiglitazona como
controle positivo. A cada 48 horas o meio de cultura foi trocado e novamente feita a
adição dos compostos e dos controles. Esse processo foi repetido por 6 dias, e ao
final da diferenciação as células 3T3L1 foram fotografadas.
Coloração por Óleo Vermelho O®
Após a diferenciação completa, as células 3T3-L1 foram lavadas com
tampão fosfato-salino (PBS), fixadas com formalina 10% (v/v) em tampão PBS
durante 1 hora, e então coradas com solução de óleo vermelho (Oil Red O) (0,3% em
isopropanol 60%) durante 20 minutos. Após a coloração, foram lavadas com PBS e
fotografadas em um microscópio Nikon MTS em um aumento de 40x.
Após a visualização das células nas condições obtidas na diferenciação de
adipócitos, elas foram lisadas em 200 µL de igepal 4% em isopropanol e coletadas em
microtubos de centrífuga para a leitura da absorbância. A absorbância das amostras
foi medida em uma cubeta de quartzo 10 mm no comprimento de onda de 520 nm, no
Espectrofotômetro da Jasco V-530. Este procedimento foi realizado para avaliarmos
quais condições tiveram mais acúmulo de lipídeos. Com a leitura da absorbância,
55
quantificamos o oil red presente em cada condição. Após a leitura da absorbância os
valores foram graficados.
3.13. Ensaio de Fosforilação
Como dito anteriormente, a ação da CDK5 muda a expressão de genes
específicos relacionados a obesidade e a sensibilização a insulina (CHOI et al., 2011;
BERGER et al., 2003). Portanto, este ensaio foi utilizado para analisar quais dos 3
compostos selecionados (P11, R32 e AM-879) diminuem a fosforilação da Ser273,
que é mediada pela CDK5.
O PPAR LBD, em uma concentração final de 29 µM, foi incubado por
30 min no gelo com os compostos em 3 concentrações diferentes, 1 µM, 10 µM e
100 µM e solução tampão contendo 70 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2 e 5 mM DTT.
Após a incubação, 50 µM de ATP, responsável pela adição do grupo fosfato ao
aminoácido Ser273, foi adicionado à amostra juntamente com 0,1 µg de CDK5. Estas
foram incubadas a 30 ºC por 1 hora. Após as reações, as amostras foram analisadas
por western blot.
Western Blot
O Western blot é um método que detecta proteínas em um homogenato de
células, amostras ou extratos de um tecido biológico. Essa técnica usa eletroforese
em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa. As proteínas são então
transferidas do gel para uma membrana, onde são usados anticorpos específicos à
proteína como sonda. Com o intuito de analisar as amostras obtidas no ensaio de
fosforilação, utilizamos como anticorpo primário o Anti-PPAR gamma (Ser273)
polyclonal antibody (Bioss Antibodies) e o anticorpo Anti-PPAR gamma polyclonal
antibody (Bioss Antibodies).
As amostras obtidas através do ensaio de fosforilação foram aplicadas em
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12%, e a corrida eletroforética foi realizada a uma
voltagem de 120 v por volta de 2 horas. Para a estimativa do peso molecular do PPAR
LBD foi utilizado o marcador PageRuler™ Prestained Protein Ladder (ThermoFisher
Scientific). Ao final da eletroforese, a proteína foi transferida do gel para a membrana
de nitrocelulose de 0,45 µm, pelo método de transferência semi-úmido, utilizando o
56
Trans-Blot® SD semi-dry transfer cell (Bio-Rad), com a solução tampão contendo
24 mM de Tris, 192 mM de glicina, 0,1% de SDS e 20% de metanol, pH 7,5.
A transferência ocorreu por 1 hora e 20 minutos a 80 mA. Ao final da
transferência a membrana foi corada com pounceau para observarmos se as
amostras haviam sido transferidas. Em seguida a membrana foi lavada com água, até
a retirada do pounceau, e então bloqueada com solução de bloqueio contendo 5% de
leite, por uma hora, a temperatura de 20 - 25º C, sob leve agitação. Passado o tempo
do bloqueio a membrana foi lavada três vezes com solução de lavagem contendo
150 mM de NaCl, 20 mM de Tris e 0,1% de Tween 20 (TBS-T) pH 8,0, durante 10
minutos. Após a lavagem, adicionamos o anticorpo primário Anti-PPAR gamma
(Ser273) polyclonal antibody (Bioss Antibodies) na membrana em uma diluição de
1:1000 em 4% de bovine serum albumin (BSA) e TBS-T, e mantivemos à 4 ºC over
night, sob leve agitação. Depois de incubada com o anticorpo primário, a membrana
foi lavada três vezes com TBS-T, tendo 10 minutos de duração cada lavagem.
Ao término da lavagem, adicionamos o anticorpo secundário na membrana,
o conjugado Anti-Rabbit IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat
(Sigma Aldrich), diluído em 1:10000 com 3% de leite. A membrana foi incubada nas
condições ambiente, por uma hora sob leve agitação. Para retirada do excesso de
anticorpo secundário, a membrana foi lavada por 6 vezes de cinco minutos.
Para analisar o western blot, utilizamos o Westar Supernova Enhanced
Chemiluminescent HRP Substrate XLS3 (Cyanagen) e o Gel Logic 2200 Imaging
System (Molecular Imaging System Carestream Health, INC) através do programa
Carestream 7500. Ao final da exposição, a membrana foi novamente bloqueada e
realizado o mesmo processo descrito acima, mas utilizando como anticorpo primário
o Anti PPAR gamma polyclonal antibody (Bioss Antibodies).
3.14. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR)
A qPCR é uma técnica baseada no princípio da reação em cadeia da
polimerase (PCR) para multiplicar ácidos nucleicos e quantificar o DNA obtido. A
reação em cadeia de polimerização quantitativa combina a metodologia de PCR
convencional com um mecanismo de detecção e quantificação por fluorescência.
57
Para o ensaio, o RNA total das células foi extraído utilizando-se o kit
RNeasy (Qiagen), com posterior síntese do cDNA utilizando o kit RT2FirstStrand
(Qiagen).
Os primers utilizados no experimento foram:
Glut4 Chamado transportador de glicose insulino-sensível, cujo principal
papel é proporcionar a captação de glicose insulino-mediada em tecidos adiposo e
muscular, tecidos que expressam especificamente, mas não unicamente, a
proteína GLUT4 (MACHADO et al., 2006).
Primer Forward 5' - GCTGTGCCATCTTGATGACGG - 3'
Primer Reverse 5' - GTCCTCCTGCTTGGCTTCTTCA - 3'
FABP4 Codifica a proteína AP2 (FABP4), uma pequena molécula de
15 kDa que faz parte da família de LBPs (lipid-binding proteins), mais especificamente
das FABPs (fatty acid binding proteins - proteínas que se ligam a ácidos graxos de
cadeia longa); e é expressa principalmente no tecido adiposo (BIRON-SHENTAL et
al. 2007; LIU et al. 2008). A Fabp4 pode regular a expressão gênica, ativando várias
classes de receptores nucleares, sendo PPAR o melhor caracterizado. Está
envolvida em processos como diferenciação adipocitária, modulação da sensibilidade
à insulina e função de macrófagos (BENEVIDES, 2012).
Primer Forward 5' - TGGAAGCTTGTCTCCAGTGA - 3'
Primer Reverse 5' - CCCCATTCACACTGATGATC - 3'
LPL Regulador mais importante para a deposição dos triglicerídeos. A
LPL hidrolisa os triglicerídeos das lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) e
quilomicra (partículas produzidas pelas células intestinais, compostas de cerca de 85
a 95% de triglicerídeos de origem da dieta), liberando os ácidos graxos que são
captados pelo adipócito. Quanto à regulação hormonal da LPL, a insulina e os
glicocorticóides são os estimuladores fisiológicos da atividade da LPL e a sua
associação tem um papel importante na regulação da topografia da gordura corporal,
sendo a LPL central para o desenvolvimento da obesidade visceral abdominal (KERN
et al., 1996; WAJCHENBERG et al., 2000).
Primer Forward 5' - GCTGGGCCTAACTTTGAGTATG - 3'
Primer Reverse 5' - TTCTCCTGATGACGCTGATTT - 3'
58
Beta-actina Utilizado como housekeeping. É um gene humano de uma
das seis isoformas diferentes de actina que foram identificadas. Tem ações no
citoesqueleto e são proteínas altamente conservadas e estão envolvidas na motilidade
celular, estrutura e integridade, utilizada como controle no experimento (GUNNING et
al, 2009; HANUKOGLU et al, 1983).
Primer Forward 5' - GCCGGGACCTGACTGACTAC - 3'
Primer Reverse 5' - TTCTCCTTAATGTCACGCACGAT - 3'
CEBPα A proteína codificada por este gene, é um fator de transcrição
BZIP que pode ligar-se como um homodímero a determinados promotores e
potenciadores. Também pode formar heterodímeros com as proteínas relacionadas
CEBP-beta e gama-CEBP. A proteína codificada é um promotor que modula a
expressão do gene da leptina, uma proteína que desempenha um papel importante
na homeostase do peso corporal. Além disso, a proteína codificada pode interagir com
CDK4 e CDK2, inibindo assim estas quinases, e impedindo crescimento celular em
cultura (www.ncbi.nlm.nih.gov > Entrez Gene: CEBPA CCAAT/enhancer binding
protein (C/EBP), alpha).
Primer Forward 5' - GCGGGAACGCAACATC - 3'
Primer Reverse 5' - GTGCTGGAGTTGACCAGTGAC - 3'
PPAR É um membro da família de receptores nucleares como descrito
no item 1.4.
Primer Forward 5' - CACAGAGATGCCATTCTGGC - 3'
Primer Reverse 5' - AGTCAACAGTAGTGAAGGGC - 3'
Como todos esses genes estão envolvidos de alguma forma na via de
sensibilização à insulina e ganho de peso, tratamos as células de hepatocarcinoma
(HepG2) por 36 horas, com 1 µM dos compostos selecionados (P11, R32 e AM-879)
para quantificarmos quais genes estão sendo ou não mais expressos frente aos
tratamentos.
Após a extração do RNA e síntese do cDNA, de acordo com o manual do
fabricante, foi realizado um PCR convencional para testes dos primers e, em seguida,
a reação do qPCR, utilizando 100 ng de cDNA, 200 nM de primer (Forward + Reverse)
e SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes (ThermoFisher Scientific). A reação foi
adicionada a placa MicroAmp™ Optical 96-well Reaction plate (Applied Biosystems),
59
colocada no 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) e realizado o qPCR.
Os resultados foram analisados no programa 7500 software v2.0.6. e graficados no
Microsoft Excel 2013.
3.15. Recrutamento de Coativador
Este ensaio foi realizado pela Dr.a Juliana Fattori com os 3 compostos
selecionados nos testes biofísicos, para a verificação de recrutamento de coativadores
e avaliar a atividade agonista dos compostos. Para tanto, o PPAR foi incubado com
os ligantes Rosiglitazona (controle positivo), P11, R32 e AM-879 em concentrações
que variaram de 0 a 20µM, e com 50 nM do peptídeo SRC-1 que continha o ID2 de
ligação a RNs (SRC1-2). A mistura foi então submetida a medidas de anisotropia de
fluorescência no leitor de placas ClarioStar® (Molecular Devices). Os dados foram
então graficados e tratados no programa origin 9.0. O modelo de interação utilizado
foi o de medida de afinidade por Hill.
3.16. Docking dos Ligantes
Estes ensaios foram realizados em colaboração do Dr. Paulo S. L Oliveira
e com o aluno José Geraldo de Carvalho Pereira, do grupo de bioinformática do LNBio
(LBI). Os 3 compostos triados como ligantes do PPAR foram recebidos no formato
“mol”. Utilizando o programa MarvinSketch (ChemAxon), foram geradas
conformações inicias tridimensionais desses compostos e a conformação de menor
energia de cada um deles foi salvo em formato “mol2” para ser utilizado no docking.
Foram selecionadas todas as estruturas de PPAR LBD com resolução
maior que 2.5 Å, o que resultou em 104 arquivos pdb. Essas estruturas foram
separadas por cadeia, totalizando 177 cadeias, ou seja, 177 receptores. Os receptores
foram preparados utilizando o programa Surflex. A preparação envolve a remoção de
águas e ligantes e a adição dos átomos de hidrogênios. A estruturas dos receptores
foram clusterizadas dado que diversos artigos indicam que a utilização de múltiplos
receptores durante o docking, sobretudo estruturas resolvidas com ligantes, aumenta
a confiabilidade do método. Para selecionarmos quais receptores seriam utilizados no
docking, foi feito um alinhamento estrutural do sítio de ligação de cada um dos
receptores. Através desse alinhamento foi realizado um clustering hierárquico dos
receptores e então, utilizando o clustering, foram separados 50 grupos. O membro
60
central desses grupos foi selecionado para ser utilizado no docking, ou seja, foram
selecionados 50 receptores para o docking. Todos os procedimentos mencionados,
alinhamentos, clustering e seleção dos representantes de cada grupo foram feitos com
o programa Surflex.
O docking dos 3 compostos (AM-879, P11 e R32) foi realizado utilizando
os 50 receptores selecionados. E escolheu-se as 100 melhores poses para cada
ligante. Após o docking, essas poses foram refinadas de dois modos para obter um
score mais preciso: (1) otimização dos hidrogênios tanto do ligante quanto do receptor;
(2) otimização dos hidrogênios do ligante e do receptor juntamente com a otimização
de outros átomos da proteína próximos ao ligante. Há indicações que o refinamento
após o docking permite uma melhor estimativa do score, no entanto, não há uma
definição sobre qual dos métodos é mais eficaz.
Analisar os resultados do docking, ou seja, as melhores poses para os
ligantes, apenas pela score obtido é um procedimento sujeito a diversos erros, entre
eles a imprecisão presente nas funções do cálculo de score. Uma forma de tentar
contornar este problema, quando o objetivo do docking é obter a pose correta do
ligante, é realizar um clustering das poses utilizando a semelhança
tridimensional (RMSD) e considerando os scores dos grupos para estabelecer as
poses com maior probabilidade de ocorrer. Este procedimento de clustering dos
ligantes também foi realizado utilizando o programa Surflex.
61
O alvo central deste projeto foi buscar ligantes de PPAR que possibilitem
o bloqueio da fosforilação da Ser273, aumentando a sensibilidade a insulina e
reduzindo-se efeitos colaterais de fármacos para DT2. Sendo assim, realizamos
diferentes ensaios para verificar se os ligantes candidatos preenchiam critérios
necessários, evidenciados pelos experimentos. Apresentados neste conjunto de
metodologias:
4.1. Produção de Proteína
O protocolo de expressão do receptor PPAR já estava bem estabelecido
no laboratório da Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira, sendo necessários poucos
ajustes, tais como quantidade de IPTG e tempo de indução. O objetivo neste momento
era expressar o domínio LBD do isotipo do PPAR, para obter quantidade suficiente
e alta pureza para os ensaios cristalográficos e espectroscópicos, pois é neste
domínio que se encontra o sítio ativo do receptor.
Subsequentemente, os experimentos posteriores de purificação indicaram
que a temperatura, o tempo e a concentração de IPTG utilizados eram suficientes para
a expressão em larga escala da proteína. As amostras resultantes da purificação por
IMAC (cromatografia de afinidade) foram observadas em gel de SDS-PAGE (Figura
9). O retângulo vermelho na Figura 9, evidência as bandas proteicas intensas do
PPARγ LBD as quais aparecem na altura do marcador entre 25 e 35 kDa, sendo
33,6 kDa o peso molecular esperado para esta construção com a cauda de histidina.
O rendimento médio da purificação foi de 40 mg de proteína para cada litro de cultura
expresso.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
62
Figura 9. SDS-PAGE da Purificação por afinidade do PPAR LBD. Onde MW é o marcador de
massa molecular (bandas de 100, 75, 50, 35, 25, 15, 10 kDa), FT é o flow through, L é a
lavagem e E1-E4 são as eluições do PPAR da coluna de afinidade. O retângulo evidencia
as bandas contendo PPAR.
Após a purificação por afinidade, tentamos eliminar os poucos
contaminantes existentes na amostra afim de se obter a proteína em um maior grau
de pureza. Para isso o PPAR foi submetido a outro processo de purificação e as
amostras eluídas da afinidade foram submetidas à cromatografia por exclusão de
tamanho.
As frações da purificação por afinidade foram reunidas, concentradas e
então aplicadas na coluna Superdex 200 - 16/600 (GE), em um FPLC. O
cromatograma obtido nessa etapa de purificação apresentou um pico principal
abrangendo as frações de 43 a 58 (Figura 10). A proteína eluiu em torno 86 mL e pela
calibração prévia da coluna, estimou-se que a mesma apresenta um raio
hidrodinâmico de 2,3 nm e uma massa molecular aproximada de 30 kDa. Que são
correspondentes a monômeros, de acordo com dados já publicados para o PPAR
LBD (BERNARDES, et al., 2012).
SDS-PAGE PPAR LBD
100 kDa
75 kDa
50 kDa
35 kDa
25 kDa
PPAR – 33,6 kDa
15 kDa
10 kDa
MW FT1 FT2 L1 L2 E1 E2 E3 E4
63
Figura 10. Cromatograma da purificação por gel filtração do PPAR LBD. Tendo seu pico
principal entre as frações 43 a 58. Com eluição em torno de 86 mL no pico principal com
raio hidrodinâmico de 2,3 nm e MW de ~ 30 kDa correspondente a manômeros.
Alíquotas correspondentes ao pico da gel filtração foram submetidas à
eletroforese, em SDS-PAGE (Figura 10), sendo que a banda de contaminante, um
pouco mais intensa no SDS-PAGE da IMAC (Figura 9), também apareceu no SDS-
PAGE da gel filtração (Figura 11, banda acima de 75 kDa). Diante disto, as bandas
proteicas desta altura foram recortadas do gel e enviadas para análise dos peptídeos
por Espectrometria de Massas. Curiosamente, estas bandas correspondem ao próprio
PPARγ, que pode formar oligômeros através de pontes dissulfeto, e estes podem ser
separados por centrifugação.
Cromatograma da purificação por gel filtração do PPAR LBD
64
Figura 11. SDS-PAGE da gel filtração do PPAR LBD. Onde MW é o marcador molecular (bandas
de 100, 75, 50, 35, 25, 15, 10 kDa), os poços 43, 45, 47, 50, 51, 52, 54, 56 e 58 são as
amostras obtidas na gel filtração.
4.2. Caracterização do PPAR LBD
A partir da obtenção do PPAR LBD puro, fizemos ensaios de DLS a fim de
analisar a agregação e monodispersão da amostra para a realização de subsequentes
ensaios de cristalografia. Os resultados de DLS (Tabela 1) revelam que a maior massa
espalhadora tem raio hidrodinâmico de 2,9 nm, indicando que o PPAR está
monomérico. Este raio está em concordância com o obtido pela gel filtração, o qual
indicou a presença de monômeros em solução. Adicionalmente, há baixo índice de
agregação na amostra (0,6% massa) e a polidispersão, que é um fator que indica a
distribuição de pesos moleculares dos polímeros, está baixa (~15%). Portanto, a
amostra encontra-se monodispersa, monomérica e com pouca agregação, ideal para
o experimento de cristalização.
Tabela 1. Dados de DLS do PPAR LBD. A tabela mostra os dados obtidos no DLS, a partir de
uma amostra de 4 mg/mL, a amostra tem pouco agregado e a proteína está monodispersa.
Dados do DLS do PPAR LBD
Item R (nm) %Pd MW-R (kDa) %Int %Mass
+Pico 1 2,9 14,2 39 85,4 99,4
+Pico 2 13,7 27,9 1540 12,4 0,6
+Pico 3 2674,2 0,0 351649000 2,2 0,0
56
65
Com a Eletroforese Nativa (Figura 12) pudemos observar que existe uma banda
principal bem formada, sem fortes arrastes, indicando que a amostra se encontra em
um só estado oligomérico e bem enovelada, o que condiz com o resultado obtido na
filtração em gel e no DLS.
Figura 12. Gel Nativo do PPAR LBD. MW é o marcador e o PPAR produzido no laboratório. O gel
nativo mostra que o PPAR está em um único estado oligomérico e bem enovelada.
O ensaio de dicroísmo circular permite que avaliemos a estrutura
secundária do receptor, atuando como uma análise prévia da cristalografia e dos
ensaios para a triagem dos compostos. Desta forma, analisamos se o PPAR LBD
teria conformação predominante em α-hélice. Observamos no espectro de CD (Figura
13) dois mínimos característicos, em 222 e 208 nm, o que indica que o PPAR LBD
tem estrutura secundária majoritária em α-hélice, compatível com os registros de
estrutura do PDB (4XTA). Pela deconvolução do espectro observou-se 45% de α-
hélice, 23% folha β e 31% de estrutura randômica. A técnica de CD também pode ser
um método eficiente de monitoramento de regiões espectrais quanto a mudanças
conformacionais nas proteínas devido a fatores ambientais, como presença de
ligantes, mudança de temperatura, pH e outros. Após a aquisição do espectro,
analisamos a perda de estrutura secundária do PPAR, com aquecimento,
monitorando o sinal de CD em 208 nm, pois é um dos mínimos característicos de α-
hélice.
Gel Nativo do PPAR
669 kDa
440 kDa
250 kDa
140 kDa
66 kDa
MW PPAR
66
(x-x0)/dx))
Desenovelamento térmico do PPAR LBD por CD
PPARY
Espectro de CD do PPAR LBD
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
(nm)
Figura 13. Espectro de CD do PPAR LBD. Espectro obtido com varredura espectral de 195 nm até
260 nm, a 10 °C. As setas apontam os 2 mínimos característicos de α-hélice, em 208 e
222 nm.
Adicionalmente, os resultados mostraram que o PPAR, na ausência de
ligantes, apresenta uma Tm de 48,7 + 0,2 °C (Figura 14).
Equation y = A2 + (A1-
A2)/(1 + exp( Adj. R-Sq 0.98855
Value Standard
B A1 -22.94 0.0716
B A2 -12.11 0.06853
B x0 48.676 0.16163
B dx 2.7477 0.14017
Figura 14. Desenovelamento térmico do PPAR LBD por CD. Perda da elipsidade com o aumento
da temperatura, monitorada por dicroísmo circular em 208 nm. A Tm apresentada pelo
PPAR foi de 48,7 + 0,2 °C.
Em conjunto, esses dados (CD, DLS e Gel Nativo) indicam que a proteína
está em boas condições para a realização dos próximos experimentos uma vez que a
mesma se apresenta monodispersa, com pouquíssimo agregado, enovelada e com a
PPARY
(
md
eg
)
(m
de
g)
67
maioria da estrutura secundária em α-hélice. Desta forma, esta primeira etapa do
trabalho avaliou a qualidade da amostra para que os resultados obtidos
posteriormente apresentassem alto grau de confiabilidade.
4.3. Metodologias para Busca de Ligantes
Com a união das metodologias apresentadas na Figura 15, estabelecemos
o pipeline para a busca de novos ligantes para PPAR.
Figura 15. Metodologias para busca de ligantes para o PPAR. Conjunto de metodologias
utilizadas para a busca de novos ligantes para o PPAR.
Após a caracterização do PPAR LBD e a reunião dos compostos, o
primeiro passo foi a realização de ensaios de estabilidade estrutural. Esta etapa é
composta pelos ensaios de Thermal Shift Assay (TSA) e Dicroísmo Circular (CD), e
nessa primeira triagem, foram selecionados os compostos que, de alguma forma,
estabilizaram a estrutura terciária e secundária do receptor. Para verificar essa
Metodologias para Busca de ligantes para o PPAR
68
estabilização, o segundo passo foi observar a ligação desses compostos no sítio ativo
do receptor, utilizando o ensaio de supressão de fluorescência do ANS, selecionando
assim, os compostos que de fato se ligam ao sítio. Essa primeira triagem permitiu a
redução de compostos para os próximos experimentos, que foram mais específicos e
trabalhosos.
Os ensaios celulares utilizados foram de transativação celular, que
mostraram o quanto os compostos ativaram o receptor nas células transfectadas e,
com ensaios de EC50, observamos a concentração necessária do composto para a
ativação. Também realizamos ensaios para observar o efeito colateral de ganho de
peso, o ensaio de diferenciação de adipócitos, que nos mostrou quais dos tratamentos
acumulam mais lipídeos dentro das células.
Na sequência realizamos ensaios de quantificação da expressão gênica. O
qPCR foi utilizado para monitorar genes específicos envolvidos na DT2 e verificar se
o tratamento com os ligantes selecionados interferem nas vias de sensibilização à
insulina.
Como próximo passo, realizamos um dos ensaios mais importantes do
projeto, o ensaio de fosforilação, que nos permitiu observar quais dos compostos
selecionados pelos experimentos anteriores, de fato, impedem a fosforilação da
Ser273, que é responsável pela sensibilização a insulina.
Finalizando a metodologia, mapeamos e quantificamos as interações entre
o receptor e os compostos. Para tanto, utilizamos ensaios de docking molecular para
previsão da forma de ligação no sítio, ensaios de cristalização e cristalografia de raios
X para observarmos a estrutura receptor/ligante e ensaios de recrutamento de
coativadores que influenciam na transcrição gênica.
Com isso, desenvolvemos um conjunto de metodologias efetivo para busca
de novos ligantes para o PPAR, como pode ser observado nos resultados mostrados
a seguir.
4.4. Testes com os Compostos
Com a proteína produzida e inicialmente caracterizada nos estudos
espectroscópicos, realizamos testes com os 102 compostos disponibilizados pelos
colaboradores, a fim de selecionarmos os possíveis hits.
69
Estabilidade Térmica
O ensaio de TSA foi o primeiro teste a ser realizado, já que oferece uma
caracterização da estabilização da amostra através da medida da perda de estrutura
terciária da proteína. Assim pudemos avaliar e selecionar quais compostos
estabilizaram a estrutura terciária do PPAR, sendo estes considerados bons
candidatos a hits.
Quando o PPAR foi submetido ao aquecimento, este apresentou uma Tm
de 48,75 ± 0,08 °C (controle representado pela linha vermelha na Figura 15), e
quando complexado com o ligante rosiglitazona, apresentou uma Tm de
49,71 ± 0,05 °C (controle representado pela linha verde na Figura 15). O aumento não
foi muito significativo, pois esperávamos uma Tm maior devido à característica
agonista do composto rosiglitazona. Entretanto, acredita-se que o PPAR produzido
de forma heteróloga, na maioria das vezes está ligado a ácidos graxos, seus ligantes
naturais, os quais são originários das bactérias que produziram o receptor. Portanto,
a Tm obtida do PPAR sem ligantes, provavelmente é correspondente ao complexo
PPAR + Ácido graxo, e por isso, não há tanta diferença em relação ao PPAR sem
ligante e com rosiglitazona. Vários compostos utilizados conferiram ao PPAR Tms
pouco acima da encontrada para o PPAR sem ligante, indicando que possivelmente
alguns deles interagem de alguma forma com o receptor, estabilizando-o.
Com o intuito de selecionar os compostos que mais estabilizam a estrutura
do receptor, selecionamos os 20 que apresentaram as maiores Tms a partir de 49 °C
neste experimento, considerando a presença do ácido graxo no sítio do PPAR
(Figuras 16 a e b e Tabela II).
70
Figura 16. Compostos testados no TSA. a. Resultados do TSA comparando Tms do PPAR sem
ligante (PPARY), com o ligante rosiglitazona (ROSI) e com todos os ligantes testados
(numerados de 1 a 102). Para facilitar visualização da escolha dos ligantes o gráfico foi
marcado com os controles para a indicação de condições em que o receptor está
estabilizado e não estabilizado por ligantes. A linha em verde representa a Tm do controle
rosiglitazona, a linha vermelha representa o Tm do PPAR sem adição de compostos. b.
Gráfico representativo das Tms encontradas para os 20 compostos (numerados de 1 a
20), entre os 102 do gráfico a, que mais estabilizaram a estrutura terciária do PPAR LBD,
provavelmente estes compostos estão interagindo de alguma forma com o receptor,
estabilizando sua estrutura.
Ao analisarmos os dados obtidos, pudemos observar que dentre os 20
compostos selecionados, o maior Tm encontrado foi o do composto C.46 (Tm 50,3 ±
0,4 °C), sendo este maior que do controle rosiglitazona, o que pode indicar que este
composto teve uma boa interação com o PPAR, estabilizando assim a sua estrutura
terciária. Dentre os compostos selecionados, os que apresentaram os menores Tms
a
b
TSA do PPAR LBD complexado com os Compostos
Compostos que mais estabilizaram o PPAR LBD
PP
AR
Y
Ro
si
71
Tms dos 20 compostos selecionados por TSA
foram o composto C.14 (Tm 49,12 ± 0,01 °C); C.84 (Tm 49,1 ± 0,2 °C) e o C.54 (Tm
49,10 ± 0,02 °C), sendo que, provavelmente, são os que se ligam com uma afinidade
menor ao receptor (Tabela 2).
Tabela 2. Tms dos 20 compostos selecionados por TSA. Tabela com as Tms calculados para os
20 compostos que mais estabilizaram a estrutura terciária do PPAR no termal shift assay.
Ligante Tm (°C) Desvp. Ligante Tm (°C) Desvp.
PPARY 48,75 0,08 C.44 49,9 0,5
ROSI 49,71 0,05 C.46 50,3 0,4
C.14 49,12 0,01 C.47 49,238 0,005
C.24 49,5 0,3 C.48 49,3 0,1
C.35 49,4 0,1 C.54 49,1 0,2
C.36 49,8 0,1 C.72 49,83 0,01
C.37 49,7 0,1 C.78 49,21 0,02
C.39 49,3 0,1 C.79 49,38 0,02
C.41 49,2 0,1 C.80 49,22 0,02
C.42 49,93 0,04 C.81 49,34 0,02
C.43 49,8 0,2 C.84 49,1 0,02
Em seguida, os 20 compostos selecionados no TSA foram testados em
outros experimentos para a confirmação da estabilização que conferiram ao PPAR,
visto que foram considerados bons candidatos a ligantes. Para tanto, primeiramente,
realizamos ensaios de CD do PPAR incubado com estes 20 compostos (Figura 17).
Os espectros obtidos mostram os 2 mínimos característicos de estrutura secundária
em α-hélice. Nenhum dos compostos causou uma mudança visível no espectro geral
do PPAR, indicando que, se existe interação do PPAR com esses compostos, a
interação não leva a alterações na estrutura secundária da proteína.
72
Desenovelamento térmico do PPAR LBD por CD
PPARY
ROSI
C.14
C.72
C.42
C.43
C.41
C.47
C.24
C.84
C.36
C.44
C.37
C.78
C.79
C.80
C.81
C.54
C.35
C.48
C.46
C.39
Espectros de CD do PPAR LBD com os Compostos
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
Figura 17. Espectros de CD do PPAR LBD com os 20 compostos selecionados no TSA.
Espectros obtidos através da varredura espectral de 195 nm até 260 nm, a 10 °C.
Observamos os 2 mínimos, apontados pelas setas vermelhas, característicos de α-hélice
o 208 e 222 nm, mostrando que os compostos não causaram uma mudança na estrutura
secundária do receptor.
Após a aquisição dos espectros de CD, as 20 amostras e os controles foram
submetidos ao desenovelamento térmico, para avaliarmos a perda da estrutura
secundária e obter a Tm. As curvas obtidas foram submetidas ao ajuste sigmoidal
para se obter os Tms (Figura 18, Tabela 3).
Figura 18. Desenovelamento térmico do PPAR LBD complexado com os 20 compostos por
CD. Monitoramento da estrutura secundária do PPAR complexado com os 20 compostos
que estabilizaram a estrutura terciária do receptor nuclear, para avaliar a perda de
estrutura secundária.
PPARY
ROSI
C.14
C.72
C.42
C.43
C.41
C.47
C.24
C.84
C.36
C.44
C.37
C.78
C.79
C.80
C.81
C.54
C.35
C.48
C.46
C.39
(
mde
g)
Norm
aliz
ado
(
md
eg
) N
orm
alisa
do
73
Comparação entre as Tms obtidas nos experimentos de TSA e CD
TSA CD
55
54
53
52
51
50
49
48
47
46
45
Compostos
Tabela 3. Tabela com as Tms calculadas para o PPAR LBD com os 20 ligantes. A partir do
desenovelamento térmico monitorado por CD, obtivemos os Tms da perda de estrutura
secundária do PPAR complexado com os 20 compostos.
Ligante Tm (°C) Desvp. Ligante Tm (°C) Desvp.
PPARY 48,7 0,2 C.44 47,6 0,1
ROSI 50,1 0,4 C.46 48,5 0,1
C.14 49,80 0,06 C.47 50,3 0,1
C.24 51,9 0,4 C.48 47,03 0,14
C.35 50,8 0,4 C.54 48,09 0,09
C.36 53,3 0,9 C.72 49,06 0,21
C.37 49,5 0,5 C.78 50,9 0,5
C.39 46,0 1,5 C.79 50,5 0,4
C.41 48,1 0,3 C.80 48,1 0,1
C.42 49,3 0,2 C.81 48,5 0,1
C.43 50,7 0,2 C.84 47,3 0,2
Ao compararmos as Tms obtidas no TSA e no CD (Figura 19), observamos
com mais facilidade a variação entre estabilização da estrutura terciária e secundária
dos 20 compostos selecionadas.
Figura 19. Comparação entre as Tms obtidas nos experimentos de TSA e CD dos 20
compostos. Pode-se observar a diferença na estabilidade entre a estrutura secundária e
terciária do PPAR complexado com os 20 compostos. A linha azul representa a Tm do
PPAR sem composto para estrutura secundaria e terciária, visto que as duas foram muito
próximas, sendo a Tm secundária 48,7 ± 0,2 °C e a Tm terciária 48,75 ± 0,08.
Tem
per
atu
ra -
Tm
74
Interessantemente, a Tm observada da estrutura secundária do PPAR
LBD foi de 48,7 ± 0,2 °C, praticamente a mesma da estrutura terciária. Este mesmo
comportamento também foi observado após a incubação do PPAR LBD com C.37.
Com a rosiglitazona e com os compostos C.14, C.43, C.47, C.24, C.36, C.78, C.79 e
C.35, a estabilização da estrutura secundária foi maior que a da estrutura terciária,
destacando os compostos C.24 e C.36, que estabilizaram estrutura secundária em
2,5 °C e 3,5 °C, respectivamente. Os demais compostos, C.72, C.42, C.41, C.84,
C.44, C.80, C.81, C.54, C.48, C.46 e C.39, conferiram ao PPAR uma maior
estabilização na estrutura terciária, sendo que o C.84, C.44 e C.48 estabilizaram em
mais de 2 °C a estrutura do PPAR LBD, e C.36 e C.39, em mais de 3 °C.
Observando estes dados, podemos concluir que os compostos que mais
estabilizaram a estrutura secundária, não foram os mesmos que mais estabilizaram a
estrutura terciária. Entretanto, os dados mostram que C.72, C.42, C.43, C.36, C.37,
C.35 e C.46 parecem ter um melhor desempenho na estabilização de ambas as
estruturas. Porém, como as diferenças encontradas não foram significativas, demos
continuidade aos experimentos com os 20 compostos selecionados pelo TSA.
4.5. Supressão de Fluorescência do ANS
Com a confirmação dos compostos que mais estabilizaram a estrutura
secundária e terciária do PPAR, partimos para o próximo experimento, que foi a
supressão de fluorescência do ANS. Este experimento foi realizado para verificar se,
de fato, os 20 compostos selecionados se ligam ao sítio do PPAR, diminuindo assim
a ligação do composto ANS no sítio e causando uma diminuição na intensidade de
fluorescência emitida (quenching).
Ao observarmos as curvas obtidas neste ensaio, notamos que alguns dos
compostos testados mostraram um melhor desempenho que outros (Figura 16). O
C.72, C.35 e C.48, mostraram um perfil de supressão de fluorescência semelhante ao
obtido para o ligante rosiglitazona que se liga com boa afinidade ao sítio ativo do
PPAR, sendo considerado ligante sintético do receptor. Entre os outros 17 compostos
restantes apenas sete, C.14, C.42, C.43, C.47, C.36, C.54 e C.39, apresentaram um
perfil intermediário, quando comparado ao observado para o ligante rosiglitazona e o
controle negativo DMSO (Figura 20).
75
C.72 C.35
C.48 C.14
C.42 C.43
76
CH8 NO2
R8 L5
Figura 20. Espectros de fluorescência do PPAR LBD com os 10 compostos que mostraram
atividade. Foram obtidos espectros de fluorescência do PPAR LBD + ANS complexado
com os 20 compostos previamente selecionados, porém, estão apresentados somente os
10 que mostraram supressão na fluorescência, e os controles positivo (Rosi) e negativo
(DMSO). Para a realização de cada curva, os compostos foram titulados sobre o PPAR
nas concentrações indicadas no lado direito de cada gráfico. As setas verdes apontam os
compostos que tiveram um perfil de supressão semelhante ao do controle positivo
rosiglitazona que também está apontado pela seta verde e as setas laranjas apontam os
ligantes que tiveram um desempenho intermediário entre o controle negativo DMSO
apontado pela seta vermelha.
A partir desse experimento, selecionamos os compostos C.72, C.35 e C48
para dar continuidade ao conjunto de metodologias. Visto que trabalharemos apenas
com 3 compostos, utilizaremos seus nomes originais e estes passarão a ser referidos
como ligantes. O C.72 é o ligante AM-879, C.35 o ligante P11 e o C.48 o ligante R32.
Na Figura 21 temos as estruturas desses ligantes.
C.47 C.36
C.54
C.39
Inte
nsi
da
de
de
Flu
ore
scê
nci
a (
u.a
.)
Inte
nsi
da
de
de
flu
ore
scê
nci
a (
u.a
.)
40
0
41
2
42
4
43
6
44
8
46
0
47
2
48
4
49
6
50
8
52
0
53
2
54
4
55
6
56
8
58
0
59
2
40
0
41
2
42
4
43
6
44
8
46
0
47
2
48
4
49
6
50
8
52
0
53
2
54
4
55
6
56
8
58
0
59
2
Inte
nsi
da
de
de
Flu
ore
scê
nci
a (
u.a
.)
Inte
nsi
da
de
de
Flu
ore
scê
nci
a (
u.a
.)
40
0
41
2
42
4
43
6
44
8
46
0
47
2
48
4
49
6
50
8
52
0
53
2
54
4
55
6
56
8
58
0
59
2
40
0
41
2
42
4
43
6
44
8
46
0
47
2
48
4
49
6
50
8
52
0
53
2
54
4
55
6
56
8
58
0
59
2
77
Figura 21. Estrutura dos ligantes de PPAR. Estrutura dos ligantes que se ligaram ao sítio do
PPAR LBD no experimento de supressão de fluorescência do ANS. Em solução os
ligantes AM-879 e R32 estão desprotonados.
Ao analisarmos a variação das intensidades no máximo de emissão de
fluorescência (480 nm) em cada concentração dos compostos AM-879, P11 e R32,
no programa OriginPro 9.0 (Figura 22), e após submetermos as curvas a um ajuste
sigmoidal de Hill, pudemos observar que há um padrão de ligação destes compostos
ao sítio do PPAR, conforme a concentração dos mesmos aumenta. Dessa forma, foi
possível obter uma curva de ligação dos compostos à proteína. A partir dessa curva
de ligação, foi possível proceder com o cálculo das constantes de afinidade aparente
(Tabela 4) entre o PPAR LBD e os compostos supracitados.
Tabela 4. Constante de afinidade aparente. Constantes obtidas através do ensaio de supressão
de fluorescência do ANS.
Constante de afinidade aparente
Molécula Constante de Afinidade (µm) Desv Padrão
Rosiglitazona
AM-879
P11
R32
0,6
4
3,4
19,8
0,1
1
0,7
0,7
COO-
Estrutura dos ligantes de PPAR
AM-879
(C.72)
P11
(C.35)
R32
(C.48)
78
Figura 22. Curva de ligação dos compostos ao sítio do PPAR. Curvas da intensidade de
fluorescência no máximo de emissão (480 nm) versus a concentração da molécula
adicionada, ajustadas pela equação de Hill. Na tabela estão mostradas as constantes de
afinidade dos compostos pelo PPAR LBD.
A rosiglitazona apresentou uma constante de afinidade de 600 ± 100 nm,
afinidade um pouco distante da encontrada na literatura, no trabalho de Jürgen M.
Lehmann e colaboradores, que é de 43 nM e Berger e colaboradores, de ~40 nM
(BERGER, et al., 2002; YOUNG, et al., 1998; LEHMANN et al., 1995). Os ligantes AM-
879 e P11 mostraram ter uma boa afinidade pelo receptor, por volta de 3 µM e
observamos que o P11 apresentou uma afinidade de 3,4 ± 0,7 µM, sendo pouco
melhor que o AM-879, que apresentou afinidade de 4 ± 1 µM, enquanto que o R32,
apresentou a afinidade mais baixa, de 19,8 ± 0,7 µM. Estes resultados são de grande
importância uma vez que confirmam a ligação entre o PPAR e os compostos
testados. Além disso, estes resultados também confirmam que a estabilização da
estrutura do receptor é um indicativo de interação PPAR-ligante, sendo este tipo de
medida bastante válida para a busca de compostos para o PPAR uma vez que não
existe uma boa definição de metodologia para a triagem de compostos que se liguem
ao seu sítio.
Curva de ligação dos compostos ao sítio do PPAR
Concentração
Inte
nsid
ad
e d
e F
luore
scê
ncia
No
rmaliz
ad
a
79
4.6. Ensaios Celulares
A partir dos ensaios biofísicos com os compostos, utilizamos os 3 ligantes
com melhor desempenho no ensaio de supressão de fluorescência, P11, R32 e AM-
879, para realizar os ensaios de transativação celular. Nosso objetivo neste
experimento foi de observar a atuação destes compostos in vivo, com relação,
principalmente, à ativação, para obtermos um entendimento maior sobre como podem
atuar no ambiente celular, se diante do tratamento com os ligantes, o receptor é
ativado ou não.
Ativação Celular
Os ligantes não ativaram o receptor quando comparados com a ativação
da rosiglitazona (Figura 23), que apresentou uma ativação significante, 3 vezes maior
em relação ao controle. Os ligantes não apresentaram ativação sendo o mesmo valor
de 2x apresentado pelo controle negativo (DMSO), mostrando que estes ligantes
podem interagir com o PPAR, de forma a não ativá-lo.
Vale a pena ressaltar que buscamos compostos que, além conferir uma
estabilidade à estrutura do receptor, proporcionem uma baixa ativação do mesmo,
amenizando os efeitos colaterais causados pelo fármaco atual (rosiglitazona), os quais
são provenientes da alta ativação do receptor (NISSEN et al., 2007). Nossa premissa
neste projeto foi que um bom ligante, além de estabilizar e ativar pouco o PPAR,
também evite a diferenciação de adipócitos e fosforilação do PPAR no resíduo de
Ser273, e, dessa forma aumente a sensibilização à insulina.
80
Figura 23. Gráfico de ativação celular do PPAR. Gráfico obtido através do ensaio de transativação
celular. Todos os ligantes ativaram menos o receptor e que o controle positivo rosiglitazona
e pouco mais que o controle (PPAR sem ligante). Ensaio realizado em triplicata com n=5.
Com este experimento podemos observar que os novos ligantes do PPAR,
além de estabilizarem o receptor e apresentarem ligação física com o PPAR, não o
ativam. O ensaio foi realizado na concentração final de tratamento de 1 µM, pois é a
concentração mais indicada para bons fármacos, pois é uma concentração tolerável
para o organismo.
Esta baixa ativação pode ser atribuída à baixa afinidade apresentada pelos
3 compostos no ensaio de supressão de fluorescência, destacando o R32, que tem a
menor delas e também a menor ativação. E também pode estar ligada a modificações
no receptor que impeçam a fosforilação da Ser273, evitando os efeitos indesejados
causados pelo agonismo total e favorecendo a sensibilização a insulina. Os
compostos AM-879, P11 e R32, podem ser candidatos muito promissores a moléculas
HIT de ligantes de PPAR.
Cálculo de EC50
O EC50 (concentração necessária para ativar 50% da atividade do PPAR)
das amostras foi calculado através das curvas de dose resposta sigmoidal, calculada
a partir de equações do programa OriginPro 9.0 e apresentados na Figura 24. Com
isso observamos quanto foi necessário de cada tratamento para a metade da ativação
do receptor, a qual podemos correlacionar com a afinidade obtida nos experimentos
anteriores.
Gráfico de ativação celular do PPAR
81
Figura 24. Cálculo de EC50. O gráfico acima apresenta as curvas obtidas a partir do ensaio de dose
resposta dos ligantes P11, R32, AM-879 ao PPAR e o controle positivo Rosiglitazona.
Observamos que o ligante comercial rosiglitazona ativou o receptor em uma concentração
de 1 µM enquanto os outros ligantes não mostraram uma boa ativação. Experimento único.
O ligante comercial rosiglitazona, agonista total do PPAR, apresentou 5,4
vezes de ativação na concentração de 1 µM, e então com o aumento da concentração
essa ativação foi se elevando, chegando a um EC50 de 55 µM. O ligante R32 também
apresentou uma ativação gradativa, também iniciada na concentração de 1 µM, mas
a concentração necessária foi bem maior que a apresentada pela rosiglitazona, com
EC50 de 926 µM. Os outros dois ligantes, P11 e AM-879, não apresentaram uma
resposta a concentração de tratamento utilizada, não indicando o comportamento de
agonista do receptor. Os 3 ligantes mostraram resultados esperados de acordo com
o ensaio de transativação, que mostrou que estes não ativam o receptor na
concentração de 1 µM, o que é esperado para bons agonistas. Este é mais um indício
de que esses ligantes se ligam ao receptor, mas de forma a não ativá-lo.
Principalmente o R32 que apresenta uma afinidade aparente menor, mas um EC50
melhor que o P11 e AM-879. Seguindo essa abordagem, é possível minimizar os
efeitos colaterais causados pela ativação, o que torna esses compostos, ligantes
promissores para futuros fármacos para o tratamento de DT2, pois estes conferiram
ao PPAR estabilização estrutural, afinidade pele sítio ativo e baixa ativação,
exatamente o que estamos buscando.
Cálculo de EC50
82
Diferenciação de Adipócitos
O ensaio de diferenciação de adipócitos foi realizado para ativar o acúmulo
de lipídeos no interior das células 3T3L1 frente ao tratamento com os compostos
previamente selecionados, visto que o ganho de peso é um dos efeitos colaterais
causados pelo ligante rosiglitazona. Os resultados foram comparados com o
tratamento da rosiglitazona e DMSO. Após 12 dias foi possível visualizar o acúmulo
de lipídeos dentro das células. Antes dos tratamentos, as células se encontravam
como no campo representado por 3T3L1, sendo que a condição com maior
diferenciação foi a do controle positivo, com rosiglitazona. A condição que apresentou
a menor diferenciação dos adipócitos foram as células sem tratamento (S. TRAT) e
as tratadas com DMSO (controles negativos) (Figura 25). Os compostos não
diferenciaram muito mais que os controles negativos.
Figura 25. Diferenciação de adipócitos. Fotos do ensaio de diferenciação de adipócitos em campos
aleatórios, o círculo representa um aumento de 40X. Em vermelho observamos os lipídios,
corados por Oil Red O, acumulados dentro da célula, experimento realizado em triplicata
com n=3.
Fotografias da diferenciação de adipócitos
3T3L1 S. Trat. DMSO ROSI
AM-879 P11 R32
83
Gráfico da quantificação de oil red
O controle positivo, rosiglitazona, utilizado na concentração de 1 µM,
resultou em uma grande diferenciação de adipócitos, na qual podemos observar uma
grande quantidade de lipídeos acumulados dentro das células, que foi comprovada
com a leitura de absorbância do Oil Red O (Figura 25).
As fotos foram tiradas de campos aleatórios nos quais houve diferenciação,
portanto não representam a quantidade de célula diferenciada em cada condição, pois
esta é feita através da absorção do oil red. A quantidade de célula diferenciada em
cada tratamento foi visível quando comparada com o controle positivo, sendo nítido
que os compostos em questão não influenciaram a diferenciação de adipócitos, devido
ao menor acúmulo dos lipídeos.
A quantificação real da diferenciação dos adipócitos foi realizada a partir
das células tratadas com os compostos e, subsequentemente, coradas com oil red.
Para este procedimento, cada condição teve as células lisadas, coradas e a
absorbância de cada condição foi lida. A leitura de absorbância do Oil Red O® foi
realizada no espectrofotômetro no comprimento de onda 520 nm (Figura 26).
Figura 26. Gráfico da quantificação de oil red. Quantidade de oil red presente nas células 3T3L1
que passaram pelo processo de diferenciação de adipócitos e foram tratados com os 3
ligantes selecionados, P11, R32 e AM-879. Ensaio realizado em triplicata com n=3.
Segundo nossos resultados, os tratamentos com os compostos R32, P11
e AM-879 geraram um acúmulo de lipídeos dentro das células semelhante ao dos
controles negativos (S. Trat e DMSO), por volta de 1 unidade de absorbância,
enquanto o tratamento com rosiglitazona, apresentou uma absorbância de 1,8 u.a.
Interessantemente, P11 e AM-879, no ensaio de supressão de fluorescência do ANS,
84
mostraram ter uma boa afinidade pelo sítio ativo do PPAR, diferentemente do R32,
que mostrou uma afinidade menor pelo sítio ativo do receptor, os 3 ligantes
diferenciaram praticamente a mesma quantidade de adipócitos, quando normalizados
os dados.
Ao correlacionar esses dados com os resultados anteriores de supressão
de ANS, transativação e EC50, sugerimos que o ligante R32 tenha um comportamento
de ligação diferente dos outros 2 ligantes, talvez se a concentração do tratamento
fosse aumentada, como visto no ensaio de EC50, poderíamos observar resultados
diferentes.
4.7. Transcrição Gênica - qPCR
Este experimento foi desenvolvido para avaliar as diferenças na transcrição
de genes relacionados com efeitos da sensibilização à insulina e aumento da
obesidade que poderiam ser causados pelos ligantes AM-879, R32 e P11, visto que
são efeitos observados pela ação da rosiglitazona.
Os resultados, Figura 27, demonstram que o PPAR teve sua transcrição
pouco aumentada com o tratamento dos ligantes, indicando que esses ligantes não
sinalizam para a degradação do PPAR, podendo ser um indício de que o receptor
está sinalizando para possíveis vias de sensibilização à insulina. O LPL, importante
por promover aumento da obesidade abdominal foi reduzido nos 3 tratamentos, pouco
reduzido com o ligante P11, e por volta da metade com os ligantes AM-879 e R32
quando comparados à rosiglitazona, indicando a diminuição de um dos genes que
causam seus efeitos colaterais, assim como FABP4, que apresentou uma grande
diminuição nos níveis de transcrição, cerca de 16 vezes, sendo este gene envolvido
em processos de diferenciação adipocitária, modulação da sensibilidade à insulina e
função de macrófagos. O CEBPα, importante para a manutenção da homeostase do
peso corpóreo, foi pouco diminuído com os 3 tratamentos. O Glut4, que é responsável
pela captação da glicose após a sensibilização à insulina teve sua transcrição
aumentada com o tratamento de R32, perante os outros tratamentos, que diminuíram
a expressão desse gene, o que não é muito interessante, mas os valores são muito
baixos e também a célula HEPG2 não é o melhor modelo para estudar a transcrição
de GLUT4, mas indica que a maquinaria para a sensibilização à insulina está sendo
produzida.
85
Figura 27. Quantificação da transcrição gênica. O PPAR teve sua transcrição pouco aumentada,
indicando que esses ligantes não sinalizam para a degradação do PPAR. O LPL,
importante por promover aumento da obesidade abdominal foi reduzido nos 3 tratamentos.
O FABP4, gene envolvido em processos de diferenciação adipocitária, apresentou uma
grande diminuição nos níveis de transcrição, cerca de 16 vezes. O CEBPα, importante
para a manutenção da homeostase do peso corpóreo, foi pouco diminuído com os 3
tratamentos. O Glut4, que é responsável pela captação da glicose após a sensibilização à
insulina, não mostrou grandes mudanças na transcrição. Experimento realizado em
triplicata com n=4.
Quantificação da transcrição gênica
PPAR LPL
FABP4 CEBPα
GLUT4
86
Western Blot do ensaio de fosforilação 1
Anti – SER273P
Anti – PPAR
4.8. Ensaio de Fosforilação
Este experimento foi desenvolvido para avaliar se os ligantes do PPAR
encontrados neste projeto inibem a fosforilação do resíduo Ser273, sendo, de fato, um
bom sensibilizador da insulina. Para tanto, o PPAR LBD purificado foi incubado com
a enzima CDK5 e, posteriormente a mistura foi incubada com ATP para que o PPAR
fosse fosforilado. Como controle de inibição de fosforilação, incubamos a mistura à
rosiglitazona, descrita como sendo capaz de inibir a fosforilação do PPAR em altas
concentrações (CHOI, 2010). Por fim, os novos ligantes (P11, R32 e AM-879) foram
também testados quanto à sua capacidade de fosforilar o PPAR, sendo adicionados
à mistura nas concentrações de 1 µM, 10 µM e 100 µM. Após as incubações, as
amostras foram analisadas em um SDS-PAGE e reveladas por western blot, com
anticorpo anti-Ser273 fosforilada. Na Figura 28 podemos observar o primeiro teste de
fosforilação dos ligantes, o qual foi repetido com os ligantes na mesma concentração
que a rosiglitazona, Figura 29.
1 2 3 4 5 6 7 8
PPAR + + + + + + + +
CDK5 + + + + + + + +
ATP - + + + + + + +
Rosi - - 1 µM 10 µM 100 µM - - -
P11 - - - - - 10 µM - -
R32 - - - - - - 10 µM -
AM-879 - - - - - - - 10 µM
Figura 28. Western blot com anticorpo anti–Ser273P e anti - PPAR apresentando a fosforilação
do PPAR LBD (ensaio 1). No primeiro poço temos somente PPAR e CDK5, sem
fosforilação (background e controle negativo), seguido por PPAR incubado com CDK5,
ATP e DMSO (controle positivo de fosforilação). E na sequência o PPAR foi fosforilado
na presença de 1, 10 e 100 µM de rosiglitazona e dos demais ligantes, P11, R32 e AM-879
na concentração de 10 µM.
87
Western Blot do ensaio de fosforilação 2
Anti – SER273P
Anti – PPAR
PPAR
CDK5
ATP
Rosi
P11
R32
AM-8
b 80%
70%
60% 50%
40%
30%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
+ + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + +
- + + + + + + + + + + + + +
-
- 1
µM 10 µM
100 µM
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
- 1
µM 10 µM
100 µM
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
- 1
µM 10 µM
100 µM
-
-
-
79
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
- 1
µM 10 µM
100 µM
ROSI 1, 10, 100 µM
P11 1, 10, 100 µM
R32 1, 10, 100 µM
AM-879 1, 10, 100 µM
Figura 29. a- Western blot com anticorpo anti–Ser273P e anti-PPAR apresentando a
fosforilação do PPAR LBD (ensaio 2). No primeiro poço temos somente PPAR LBD e
CDK5, sem fosforilação (background e controle negativo), seguido por PPAR LBD
incubado com CDK5, ATP e DMSO (controle positivo de fosforilação). Na sequência o
PPAR LBD foi fosforilado na presença de 1, 10 e 100 µM de rosiglitazona e dos demais
ligantes, P11, R32 e AM-879. É possível observar, que a intensidade das bandas tratadas
com os ligantes é mais fraca, o que é causado pela diminuição da fosforilação. Podemos
observar que as bandas menos intensas são as pertencentes ao ligante R32,
principalmente na menor concentração. b- Porcentagem de Ser273 Fosforilada. Ao
realizar a densintometria das bandas do western blot realizadas a partir do ensaio de
fosforilação, pudemos observar que a porcentagem de serina 273 fosforilada diminui de
acordo com a concentração do tratamento. Atingindo uma porcentagem igual ou menor a
do PPAR não fosforilado.
Os resultados sugerem que, apesar do anticorpo apresentar bastante
background por reconhecer a banda do PPAR não fosforilado, foi possível observar
88
uma diferença entre as bandas do PPAR sem fosforilação e fosforilado,
principalmente quando realizado a densitometria das bandas e estas colocadas em
porcentagem como mostrado na Figura 29b. Podemos observar uma possível
diminuição da fosforilação do PPAR com o aumento da concentração da rosiglitazona
(100 µM).
Ao testarmos os ligantes selecionados frente à fosforilação, observamos
que o P11, o R32 e o AM-879 estão diminuindo a intensidade das bandas com relação
a rosiglitazona, sendo que o que menos diminuiu a intensidade foi o P11 na
concentração de 10 µM, porém a intensidade ainda é menor que a da rosiglitazona. E
o composto que apresentou as bandas menos intensas foi o R32. Com isso, podemos
sugerir que dos 3 ligantes testados, o que possui maior potencial para atuar como
sensibilizador à insulina é o R32, seguido do AM-879 e P11, porém, este experimento
precisa ser repetido para melhores resultados, assim como gerar erros e diminuir o
background.
4.9. Recrutamento de Coativadores
Este ensaio foi realizado pela Dr.a Juliana Fattori para a verificação do
recrutamento de coativadores após a ligação dos ligantes no PPAR LBD. Para tanto,
após a incubação do PPAR LBD com AM-879, R32 e P11, a mistura foi titulada sobre
o peptídeo coativador SRC1-2 e medidas de anisotropia de fluorescência foram
realizadas.
Os resultados demonstram que os ligantes P11 e R32 recrutaram
coativadores com valores de afinidade próximos dos encontrados para a Rosiglitazona
(Kd P11 = 8 µM, Kd R32 = 8 µM e Kd Rosi = 7,5 µM), Figura 30. Interessantemente,
o ligante AM-879, demonstrou não recrutar coativadores, apresentando
comportamento similar ao do controle negativo DMSO.
A comparação destes dados com os ensaios celulares de ativação e
diferenciação de adipócitos demonstram que, mesmo com a possibilidade de se ligar
ao PPAR e fazer contatos com a H12, recrutando coativadores, como demonstrado
na Figura 30, os ligantes P11 e R32 ativam pouco o receptor. Correlacionando os
resultados podemos observar que os ligantes P11 e R32 agem de forma diferente no
receptor, sendo que o R32 mostra melhores perspectivas com relação a ativação,
principalmente pelo fato de que a ativação é responsável pelos efeitos deletérios
89
causados pela rosiglitazona. Por outro lado, estes dados explicam porque AM-879 não
ativa o receptor e não proporciona a diferenciação de adipócitos.
Figura 30. Curvas de recrutamento de coativador. Sobreposição das curvas de afinidade do PPAR
LBD incubado com DMSO (controle negativo, em preto), Rosiglitazona (controle positivo,
em vermelho), P11 (azul), R32 (rosa) e AM-879 (verde), pelo peptídeo coativador SRC1-2.
Os dados demonstram que P11 e R32 conferem ao PPAR afinidade pelo coativador
semelhante a rosiglitazona e que AM-879 não recruta coativadores.
4.10. Docking dos Ligantes
Dado que não foi possível obter estruturas cristalográficas do PPAR
complexado aos ligantes, foi realizada análise estrutural da interação dos três ligantes
(AM-879, P11 e R32) através de docking e cálculo da energia livre de ligação, com a
colaboração dos pesquisadores Paulo Sergio Lopes De Oliveira e José Geraldo de
Carvalho Pereira.
O docking das 3 moléculas (AM-879, P11 e R32) foi realizado utilizando 50
receptores selecionados. As 100 melhores poses para cada ligante foram
selecionadas. Após o docking, essas poses foram refinadas de dois modos para obter
um score mais preciso: (1) otimização dos hidrogênios tanto do ligante quanto do
receptor; (2) otimização dos hidrogênios do ligante e do receptor juntamente com a
otimização de outros átomos da proteína próximos ao ligante. Há indícios de que o
Recrutamento de Coativadores - PPAR + Ligantes
0,055
0,050
DMSO (-) - nd
ROSI (+) - kd = 7.5 + 0.1 M
P11 - kd = 8.0 + 0.8 M
R32 - kd = 8 + 2 M
27AM - nd
0,045
0,040
0,035
0,030
0,025
0,020
100
10000
An
iso
tro
py (
A)
90
refinamento após o docking permite uma melhor estimativa do score, no entanto, não
há uma definição sobre qual dos métodos é mais eficaz. Legenda para os contatos do
composto, Figura 31.
Figura 31. Legenda de contatos do composto. Cada símbolo, traço, tracejado e flecha
representam um contato que o composto realiza com o receptor nuclear PPAR LBD.
Quadro “c” das figuras 32, 33 e 343.
Composto AM-879
O composto AM-879 apresentou um grupo conformacional (pose)
dominante com probabilidade > 98% entre todas as poses geradas. As posições com
maior score dos grupos dominantes foram identificadas em PPAR onde a hélice 12
não está posicionada a frente da cavidade do sítio. Diferentemente de ligantes como
a rosiglitazona, este composto não faz contatos com a hélice 12 (Figura 32). O que
está totalmente de acordo com o resultado obtido no ensaio de recrutamento de
coativadores, que mostrou que o AM-879 não recrutou nenhum coativador utilizado
no experimento. Condiz também com os resultados de supressão de fluorescência,
EC50 e ativação, que mostraram uma afinidade aparente razoável e baixa ativação.
São necessários mais estudos para compreender como este ligante interage com o
PPAR.
Legenda de contatos do composto
91
a 1 2
c
Figura 32. Docking PPAR LBD e composto AM-879. a. Refinamento 1 e refinamento 2 nos gráficos
circulares, demonstrando as conformações preferenciais encontradas em azul; b. Poses
do ligante AM-879 com maior score após o refinamento 1 e 2 e c. Contatos da molécula
AM-879 com o PPAR.
Composto P11
O composto P11 apresentou um grupo conformacional (pose) dominante
com probabilidade > 99% após o refinamento 1, a qual diminuiu após o refinamento 2,
mas permaneceu acima de 80%. As poses com maiores scores após os
refinamentos 1 e 2 apresentam uma conformação em que grupos polares estão
Docking PPAR LBD e ligante AM-879
b
92
c
próximos a hélice 12 e assim, por similaridade à rosiglitazona, é possível que este
ligante estabilize a hélice 12 (Figura 33). O que também condiz com os ensaios
realizados anteriormente, principalmente o ensaio de recrutamento de coativadores,
que apresentou semelhança ao da rosiglitazona, porém menor. Este dado não é muito
interessante, pois sabemos que a interação com a hélice 12, e consequente
fechamento dela, causa uma mudança conformacional no receptor permitindo sua
ativação e o recrutamento de coativadores, o que está intimamente ligado aos efeitos
colaterais causados pela rosiglitazona.
Figura 33. Docking PPAR LBD e o composto P11. a. Refinamento 1 e refinamento 2 nos gráficos
circulares, demonstrando as conformações preferenciais encontradas em azul; b. Poses
do ligante P11 com maior score após o refinamento 1 e 2 e c. Contatos da molécula P11
com o PPAR.
a 1 2
c
Docking PPAR LBD e ligante P11
b
93
Composto R32
O composto R32 apresentou um grupo dominante (pose) com
probabilidade >85% após o refinamento 1. Após o refinamento 2, o R32 apresentou
dois grupos com probabilidades muito próximas. A pose entre esses dois grupos difere
apenas pela rotação do grupo nafitila (duplo anel aromático). As poses dominantes da
molécula R32 indicam que o grupo apolar nafitila está próximo a hélice 12. A presença
de um grupo apolar, diferentemente da rosiglitazona que apresenta um grupo polar,
poderia estabilizar a hélice 12 em uma conformação diferente da rosiglitazona ou
aumentar a instabilidade dessa região, Figura 34. Com esse resultado podemos
sugerir que o R32 interage de forma diferente com o PPAR, recrutando coativadores,
mas de forma diferente da rosiglitazona, principalmente pela diferença entre o grupo
apolar e o polar apresentado pela rosiglitazona. Este ligante mostrou uma ativação
menor que a rosiglitazona e recrutou menos coativadores, porém, como dito
anteriormente, seria interessante não haver recrutamento de coativadores, assim
como acontece com o ligante AM-879.
94
Figura 34. Docking do PPAR LBD com o composto R32. a. Refinamento 1 e refinamento 2:
nos gráficos circulares, demonstrando as conformações preferenciais encontradas em
azul; b. Poses do ligante R32 com maior score após o refinamento 1 e 2 e c. Contatos
da molécula R32 com o PPAR.
4.10.1.1. Cálculo da energia livre de ligação.
A energia livre de ligação foi calculada utilizando o programa Yank através
do método alchemical. Este cálculo de energia livre de ligação dos ligantes foi
realizado para otimização das estruturas dos ligantes após o docking. O tempo de
simulação foi de 1 ns em solvente explícito utilizando 16 réplicas (H-REMD). Foram
utilizadas como entrada a estrutura dos complexos após o refinamento dos
a 1 2
c
Docking PPAR LBD e ligante R32
b
95
hidrogênios (Rescore 1) e também a estrutura do refinamento de todos os átomos da
proteína próximos ao ligante (Rescore 2). Os resultados estão demonstrados na
tabela abaixo.
Tabela 5. Cálculo de energia livre de ligação. Após refinamento foi feito o cálculo dos átomos de
hidrogênio (Refinamento 1) e após o refinamento de todos os átomos (refinamento 2).
Cálculo de energia livre de ligação
Molécula Refinamento 1 Refinamento 2
AM-879
P11
R32
-7,9 ± 0,35 Kcal/mol
-8,9 ± 0,25 Kcal/mol
-10,2 ± 0,24 Kcal/mol
-12,1 ± 0,41 Kcal/mol
-9,2 ± 0,25 Kcal/mol
-7,6 ± 0,22 Kcal/mol
Como as estruturas iniciais da simulação diferem tanto em relação ao
ligante quanto em relação à proteína, o tempo de 1 ns pode não ter sido suficiente
para que a amostragem conformacional permitisse a convergência. Mesmo assim,
para os ligantes P11 e R32, a diferença encontrada foi relativamente pequena (P11
< 0,5 kcal/mol e R32 < 1,5 kcal/mol), mostrando estabilização da estrutura dos ligantes
no sítio. Entretanto, a molécula AM-879 apresentou uma diferença > 4 kcal/mol, que
indica necessidade de uma maior estabilização da estrutura do ligante no sítio de
ligação do PPAR.
Outro aspecto importante é que as conformações da proteína diferem
principalmente entre o ligante AM-879 e os ligantes P11 e R32, como é evidenciado
pelas posições da hélice 12 (Figura 34). A ampla variedade conformacional do PPAR
pode dificultar uma correta amostragem durante a dinâmica molecular, o que poderia
exigir um tempo de simulação muito elevado. Logo, é necessário considerar esta
diferença entre as estruturas proteicas, pois pode ser uma fonte de erros ao
compararmos a energia livre de ligação entre os ligantes. Ainda será necessário
96
aplicar operações de dinâmica molecular com tempos maiores para medidas melhores
de estabilidade destes ligantes no sítio de ligação do PPAR.
Figura 35. Modo de ligação dos ligantes. Os ligantes se ligam de forma diferente com PPAR. O
P11 se liga de forma semelhante a rosiglitazona, com ligações polares e interage com a
H12. O R32 apresentou uma rotação do grupo nafitila (duplo anel aromático) o que sugere
uma ligação apolar, essa poderia estabilizar a H12 em uma conformação diferente da
rosiglitazona ou aumentar a instabilidade dessa região. O AM-879 se liga totalmente
diferente da rosiglitazona, não mostrando contado com a H12, o que não permite o
recrutamento de coativadores, sugerindo que ele pode ser um bom ligante de acordo com
os objetivos do trabalho.
É possível observar que, em termos de afinidade obtida através do ensaio
de supressão do ANS, o ligante AM-879 se liga melhor ao sítio, seguido por R32 e
Modo de ligação dos ligantes
PPAR + P11 PPAR + R32 PPAR + AM-879
97
P11. O que de acordo com os resultados obtidos nesse trabalho, podemos concluir
que os 3 ligantes se ligam de formas diferentes no PPAR, sendo que o R32 e o P11,
mostram comportamentos mais parecidos, observado em praticamente todos os
ensaios. Com o docking, podemos sugerir que a falta de contato com a H12 observada
pelo ligante AM-879, explicaria o não recrutamento de coativadores. Esse resultado
pode sugerir que o AM-879 seja o melhor composto obtido neste conjunto de
metodologias, seguido pelo R32 e P11.
98
Com os dados obtidos, acreditamos que este trabalho possui duas
importantes contribuições. Primeiramente, foi possível padronizar um conjunto de
ensaios para a busca de compostos que possam modular o PPAR, sem causar
ativação, mas bloqueando a fosforilação da Ser273 e, desta forma, impedindo o
aumento da obesidade, um dos efeitos deletérios dos tratamentos de DT2 à base de
tiazolidinedionas.
A segunda contribuição, foi que após diversos testes e ensaios do pipeline,
conseguimos obter 3 ligantes que são capazes de se ligar ao PPAR, sem ativar o
receptor e promover proliferação de adipócitos. Dos 3 ligantes, o AM-879 se mostrou
capaz de se ligar ao sítio do PPAR de forma diferenciada, não recrutando
coativadores, conforme observado nos experimentos de docking e anisotropia de
fluorescência. O P11 apresentou um modo de ligação semelhante ao da
Rosiglitazona, também sendo capaz de recrutar coativadores, porém não
diferenciando adipócitos, o que indica que, de alguma maneira, atua diferentemente
quanto ao recrutamento de coativadores. O R32 se liga no sítio ativo do PPAR de
forma diferente da rosiglitazona, principalmente pela rotação do grupo nafitila (duplo
anel aromático), o que sugere uma ligação apolar com a H12, que poderia estabilizar
a H12 em uma conformação diferente da rosiglitazona ou aumentar a instabilidade
dessa região. O R32 também apresentou uma afinidade aparente diferenciada dos
outros 2 ligantes, uma baixa ativação e um EC50 razoável provavelmente por essa
diferença na ligação.
Em comparação à rosiglitazona, esses 3 ligantes são capazes de
estabilizar o sítio do receptor, prevenindo a fosforilação da Ser273; sendo que o P11
e R32 recrutam menos coativadores e o AM-879 não recruta. No ensaio de
fosforilação, pudemos observar que os 3 ligantes diminuíram a quantidade de receptor
fosforilado de acordo com a sua concentração, que no caso do R32 se manteve
diminuída já na concentração mais baixa. O qPCR demonstrou que os ligantes P11,
R32 e AM-879 são capazes de ativar a expressão de genes relacionados à
sensibilização da insulina, sem promover a adipogênese, e por fim, os ensaios de
5. CONCLUSÃO
99
docking sugeriram a energia de ligação de cada um dos ligantes e a forma de ligação
deles no sítio ativo.
Os resultados obtidos foram de fundamental importância para a
comprovação de que os ligantes AM-879, P11 e R32 são bastante promissores para
modularem o PPAR. O ligante AM-879 apresentou os melhores resultados,
principalmente por não fazer contato com a H12, o que não causa alterações na
conformação do receptor, impedindo o recrutamento de coativadores e ativação do
receptor, levando assim a redução de grande parte dos efeitos colaterais causados
pela rosiglitazona. Os resultados sugerem que o AM-879 pode ser um bom Hit para o
tratamento de diabetes tipo II.
Como perspectivas para este trabalho, temos a intenção de continuar os
experimentos com esses 3 ligantes para entender melhor a sua interação com o
PPAR. Pretendemos obter as estruturas cristalográficas dos complexos PPAR +
Ligantes, fazer ensaios de mutação, o mapeamento da interação da CDK5, testes de
toxicidade e otimização do ligante. Realizando os testes pré-clínicos necessários para
transformar esse Hit em lead e futuramente possa se dar prosseguimento aos testes
clínicos.
100
1. ADEGHATE, E.; SCHATTNER, P.; DUNN, E. An update on the etiology and
epidemiology of diabetes mellitus. Ann N Y Acad Sci. v. 1084:1-29, 2006.
2. AHMADIAN, M.; SUH, J.M.; HAH, N.; LIDDLE, C.; ATKINS, A.R.; DOWNES, M.;
EVANS, R.; PPARγ signaling and metabolism: the good, the bad and the future. Nature
Medicine. V. 19: 557-566, 2013.
3. ALBERTI, K.G.; ZIMMET P.; SHAW J.; IDF Epidemiology Task Force Consensus Group:
The metabolic syndrome: a new worldwide definition. The Lancet, v.366:1059–1062,
2005.
4. ALEXANDER, S.P.H.; MATHIE, A.; PETERS, J.A. Guide to Receptors and Channels
(GRAC), Br J Pharmacol153 (Suppl. 2): S1–S2093ed edn. , 2008.
5. AMATO, A. A. Investigação da atividade farmacológica de benzilideno-e
acridinilidenotiazolidinedionas e de isoflavonas nos receptores alfa, beta/delta e gama
ativados por proliferadores peroxissomais. (Doutorado). Universidade de Brasília,
Brasília, 2008.
6. AMATO, A.A., RAJAGOPALAN, S., LIN, J.Z., CARVALHO, B.M., FIGUEIRA, A.C., LU,
J., AYERS, S.D., MOTTIN, M., SILVEIRA, R.L., SOUZA, P.C., MOURAO, R.H., SAAD,
M.J., TOGASHI, M., SIMEONI, L.A., ABDALLA, D.S., SKAF, M.S., POLIKPARPOV, I.,
LIMA, M.C., GALDINO, S.L., BRENNAN, R.G., BAXTER, J.D., PITTA, I.R., WEBB, P.,
PHILLIPS, K.J., AND NEVES, F.A. GQ-16, a novel peroxisome proliferator-activated
receptor gamma (PPARgamma) ligand, promotes insulin sensitization without weight
gain. J Biol Chem 287, 28169-28179, 2012.
7. ARGMANN, C. A.; COCK, T. A. & AUWERX, J. Peroxisome proliferator-activated
receptor gamma: the more the merrier? Eur J Clin Invest 35, 82–92, 2005.
8. ARONOFF, S.; ROSENBLATT, S.; BRAITHWAITE, S.; EGAN, J.W.; MATHISEN, A.L.;
SCHNEIDER, R.L. Pioglitazone hydrochloride monotherapy improves glycemic control
in the treatment of patients with type 2 diabetes: a 6-month randomized placebo-
controlled dose-response study. The Pioglitazone 001 Study Group. Diabetes Care. v.
23:1605–1611, 2000.
9. ARONSON, D.; MITTLEMAN, M.A.; BURGER, A.J. Effects of sulfonylurea hypoglycemic
agents and adenosine triphosphate dependent potassium channel antagonists on
ventricular arrhythmias in patients with decompensated heart failure. Pacing Clin
Electrophysiol. 26:1254-1261, 2003.
10. BAILEY, C.J., PUAH, J.A. Effect of metformin on glucose metabolism in the mouse
soleus muscle. Diabetes Metab. 12:212–218, 1986.
11. BAILEY, C.J.; TURNER, R.C. Metformin. NEJM. 334:574–579, 1996.
12. BANTING, F.G.; BEST, C.H. Pancreatic extracts. J Lab Clin Med; 7: 464-472, 1922.
13. BARISH, G.D., NARKAR, V.A.; EVANS, R.M., PPARα: a dagger in the heart of the
metabolic syndrome. J. Clin. Invest. v. 116, 590–597, 2006.
6. REFERÊNCIAS
101
14. BATISTA, F.A.H. Estudos Estruturais do Receptor Ativado por Ativadores de
Peroxissomos Humanos, hPPARβ. (Doutorado). Universidade de São Paulo, Instituto
de Física de São Carlos, São Carlos, 2012.
15. BENEVIDES, C.F.L. Avaliação do perfil de expressão de genes modulados por tnf e
melfalano em culturas mistas de células endoteliais, células de melanoma e macrófagos.
São Paulo, 2012. 159p. Tese (Doutorado) Fundação Antônio Prudente. Curso de Pós-
Graduação em Ciências - Área de concentração: Oncologia. Orientador: Vladmir
Cláudio Cordeiro de Lima, 2012.
16. BERGER, J., MOLLER, D.E. The mechanisms of action of PPARs. Annu Rev Med. 2002;
53:409-35.
17. BERGER, J.; MOLLER, D.E. The mechanisms of action of PPARs. Annu Rev Med. v.
53:409-35, 2002.
18. BIRON-SHENTAL, T.; SCHAIFF, W.T.; RATAJCZAK, C.K., BILDIRICI, I.; NELSON,
D.M.; SADOVSKY, Y. Hypoxia regulates the expression of fatty acid-binding proteins in
primary term human trophoblasts. Am J Obstet Gynecol; 197:516.e1-6, 2007.
19. BOURGUET, W.; VIVAT, V.; WURTZ, J.M.; CHAMBON, P.; GRONEMEYER, H.;
MORAS, D. Crystal structure of a heterodimeric complex of RAR and RXR ligand-binding
domains. Mol Cell. 2000;5:289–98.
20. BOYLE, J.P.; ENGELGAU, M.M.; THOMPSON, T.J.; GOLDSCHMID, M.G.; BECKLES,
G.L.; TIMBERLAKE, D.S. et al. Estimating prevalence of type 1 and type 2 diabetes in a
population of African Americans with diabetes mellitus. Am J Epidemiol; 149:55–63,
1999.
21. BROCK, T. PPARs: Proliferating Roles in Endocrinolog By Tom Brock, Ph.D. 2015
CAYMAN CHEMICAL 1180 East Ellsworth Road Ann Arbor, Michigan 48108 USA.
22. BRUNO, G.; RUNZO, C.; CAVALLO-PERIN, P.; MERLETTI, F.; RIVETTI, M.; PINACH,
S. et al. Incidence of type 1 and type 2 diabetes in adults aged 30-49 years: the
population-based registry in the province of Turin, Italy. Diabetes Care; 28:2613–9, 2005.
23. CHAWLA, A.; BARAK, Y.; NAGY, L.; LIAO, D.; TONTONOZ, P.; EVANS, R.M. PPAR-
gamma dependent and independent effects on macrophage-gene expression in lipid
metabolism and inflammation. Nat Med. v. 7(1):48-52, 2001.
24. CHAWLA, A.; REPA, J.J.; EVANS, R.M.; MANGELSDORF, D.J. Nuclear receptors and
lipid physiology: opening the X-files. Science. v. 30;294(5548):1866-70, 2001.
25. CHAWLA, A.; REPA, J.J.; EVANS, R.M.; MANGELSDORF, D.J.; Nuclear receptors and
lipid physiology: opening the X-files. Science. 294: 1866-1870, 2001b.
26. CHOI, H.S.; ASHITATE,Y.; LEE, J.H.; KIM, S.H.; MATSUI, A.; INSIN, N.; BAWENDI,
M.G.; SEMMLER-BEHNKE, M.; FRANGIONI, J.V.; TSUDA, A. Rapid Translocation of
Nanoparticles from the Lung Airspaces to the Body. Nature Biotechnology. v. 28: 1300-
1303, 2011.
27. CHOI, J.H.; BANKS, A.S.; ESTALL, J.L.; KAJIMURA, S.; BOSTROM, P.; LAZNIK, D.;
RUAS, J.L.; CHALMERS, M.J.; KAMENECKA, T.M.; BLUHER, M.; GRIFFIN, P.R.; AND
SPIEGELMAN, B.M. Anti-diabetic drugs inhibit obesity-linked phosphorylation of
PPARgamma by Cdk5. Nature, v. 466, 451-456, 2010.
102
28. CHOI, J.H.; BANKS, A.S.; KAMENECKA, T.M.; BUSBY, S.A.; CHALMERS, M.J.;
KUMAR, N.; KURUVILLA, D.S.; SHIN, Y.; HE, Y.; BRUNING, J.B.; MARCIANO, D.P.;
CAMERON, M.D.; LAZNIK, D.; JURCZAK, M.J.; SCHURER, S.C.; VIDOVIC, D.;
SHULMAN, G.I.; SPIEGELMAN, B.M.; AND GRIFFIN, P.R. Antidiabetic actions of a non-
agonist PPARgamma ligand blocking Cdk5-mediated phosphorylation. Nature, v. 477,
477-481, 2011.
29. CRUZ, M.; VALLADARES-SALGADO, A.; GARCIA-MENA, J.; ROSS, K.; EDWARDS,
M.; ANGELES-MARTINEZ, J. et al. Candidate gene association study conditioning on
individual ancestry in patients with type 2 diabetes and metabolic syndrome from Mexico
City. Diabetes Metab Res Rev. 26(4):261-70, 2010.
30. CUNARD, R.; ETO, Y.; MULJADI, J.T.; GLASS, C.K.; KELLY, C.J.; RICOTE,
M. Repression of IFN-gamma expression by peroxisome proliferator-activated receptor
gamma. J Immunol 172: 7530–7536, 2004.
31. DALL, T.M.; NARAYAN, K.M.V.; GILLESPIE, K.B.; GALLO, P.D.; BLANCHARD, T.D.;
SOLCAN, M. et al. Detecting type 2 diabetes and prediabetes among asymptomatic
adults in the United States: modeling American Diabetes Association versus US
Preventive Services Task Force diabetes screening guidelines. Popul Health Metr;
12:12. doi:10.1186/1478-7954-12-12, 2014.
32. DOWELL, P.; ISHMAEL, J.E.; AVRAM, D.; PETERSON V, J.; NEVRIVY, D.J.; LEID, M.
Identification of nuclear receptor corepressor as a peroxisome proliferator-activated
receptor alpha interacting protein. J Biol Chem. v. 28;274(22):15901-7, 1999.
33. DUVAL, A.; BUSSON-LECONIAT, M.; BERGER, R.; HAMELIN, R. Assignment of the
TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3. Cytogenet Cell Genet.
88(3-4):264-5, 2000.
34. ECKEL, R.H.; GRUNDY, S.M.; ZIMMET, P.Z. The metabolic syndrome. Lancet. 16-
22;365(9468):1415-28, 2005.
35. ECKEL, R.H.; GRUNDY, S.M.; ZIMMET, P.Z.; The metabolic syndrome. Lancet, v. 365:
1415-1428, 2005.
36. EFTINK, M. R.; ROSS, J. B. A.; LUCK, L. A.; ROUSSLANG, K. W.; SUBRAMANIAM, V.;
STELL D. G.; GAFNI, A. Topics in Fluorescence Spectroscopy: Protein Fluorescence; J.
R. Lakowicz, ed.; Kluwer Academic Publishers, New York, v. 6, cap. 1 – 3, 2000.
37. EGEA, P.F.; MORAS, D.D. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57: 434-437. 2001.
38. Endocrine Society. "People with metabolic syndrome face higher cardiovascular death
risk." ScienceDaily. ScienceDaily, 20 May 2015.
<www.sciencedaily.com/releases/2015/05/150520131705.htm>.
39. ERVIN, R.B. Prevalence of Metabolic Syndrome Among Adults 20 Years of Age and
Over, by Sex, Age, Race and Ethnicity, and Body Mass Index: United States, 2003–
2006. National Center for Health Statistics 2009. v. 13, 2009.
40. EUROPEAN MEDICINES AGENCY. European Medicines Agency recommends
suspension of Avandia, Avandamet and Avaglim.
⟨http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/news_and_events/news/2010/0
9/news_detail_001119.jsp⟩ (2010). Acesso em: fevereiro de 2016.
103
41. EVANS, J.M.; NEWTON, R.W.; RUTA, D.A.; MACDONALD, T.M.; MORRIS, A.D. Socio-
economic status, obesity and prevalence of type 1 and type 2 diabetes mellitus. Diabet
Med J Br Diabet Assoc;17:478–80, 2000.
42. EVANS, R.M.; BARISH, G.D.; WANG, Y.X., PPARs and the complex journey to obesity.
Natures Medicine. v. 10: 355-361, 2004.
43. FAJAS L, AUBOEUF D, RASPE E. The organization, promoter analysis, and expression
of the human PPARγ gene. J Biol Chem. v. 272:18779-89, 1997.
44. FAJAS L, FRUCHART JC, AUWERX J. PPARγ3 mRNA: a distinct PPARγ mRNA
subtype transcribed from an independent promoter. Febs Letts. v. 438:55-60, 1998.
45. FATTORI, J.; INDOLFO, N.C.; CAMPOS, J.C.L.O; VIDEIRA, N.B.; BRIDI, A.V.;
DORATIOTO, T.R.; ASSIS, M.A.; FIGUEIRA, A.C.M. Investigation of Interactions
between DNA and Nuclear Receptors: A Review of the Most Used Methods. Nuclear
Receptor Research. v. 1, p. 1-20, 2014.
46. FEIGE, J.N.; GELMAN, L.; TUDOR, C.; ENGELBORGHS, Y.; WAHLI, W.;
DESVERGNE, B. Fluorescence imaging reveals the nuclear behavior of peroxisome
proliferatoractivated receptor/retinoid X receptor heterodimers in the absence and
presence of ligand. J Biol Chem. v. 6;280(18):17880-90, 2005.
47. FINAN, B. et al. Targeted estrogen delivery reverses the metabolic syndrome. Nature
Medicine. 18, 1847–1856, 2012.
48. FIUME, R.; RAMAZZOTTI, G.; FAENZA, I.; PIAZZI, M.; BAVELLONI, a.; † BILLI, A.M.
AND COCCO, L. Nuclear PLCs affect insulin secretion by targeting PPAR in pancreatic
β cells. The FASEB Journal. 204 v. 26, 2012.
49. FORMAN, B.M., et al. 15-deoxy-delta 12, 14-prostaglandin J2 is a ligand for the
adipocyte determinations factor PPAR gamma. Cell, v.83, n.5, p.803-12, Dec 1. 1995.
50. FOTI, D.; CHIEFARI, E.; FEDELE, M. et al., Lack of the architectural
factorHMGA1causes insulin resistance and diabetes in humans and mice. Nature
Medicine, v. 11, no. 7, pp. 765–773, 2005.
51. FROGUEL, P.; ZOUALI, H.; VIONNET, N.; VELHO, G.; VAXILLAIRE, M.; SUN, F.; et al.
Familial hyperglycemia due to mutations in glucokinase: definition of a subtype of
diabetes mellitus. N Engl J Med. v. 328:697-702, 1993.
52. GARVEY, W. T.; OLEFSKY, J. M. AND MARSHALL, S. Insulin induces progressive
insulin resistance in cultured rat adipocytes: sequential effects at receptor and multiple
postreceptor sites. Diabetes, v. 35, no. 3, pp. 258–267, 1986.
53. GLASS, C.K. Going nuclear in metabolic and cardiovascular disease. J Clin Invest. v.
116, n. 3, 2006.
54. GRAHAM, D.J. et al. Risk of acute myocardial infarction, stroke, heart failure, and death
in elderly Medicare patients treated with rosiglitazone or pioglitazone. J. Am. Med. Assoc.
v. 304, 411–418, 2010.
55. GREEN, H.; KEHINDE, O. An established preadipose cell line and its differentiation in
culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell 5 (1): 19–27, 1975.
56. GREENE, M.F., BLUMBERG, B., MCBRIDE, O.W., YI, A.F., KRONQUIST, K., KWAN,
K., et al. Isolation of the human peroxisome proliferators activated receptor gamma
104
cDNA: expression in hematopoietic cell, and chromosomal mapping. Gene Expr. v.
4:281-99, 1995.
57. GRESCHIK, H.; WURTZ, J.M.; SANGLIER, S.; BOURGUET, W.; VAN DORSSELAER,
A, et al. Structural and functional evidence for ligand-independent transcriptional
activation by the estrogen-related receptor 3. Mol Cell. v. 9:303–13, 2002.
58. GREY A, BOLLAND M, GAMBLE G, WATTIE D, HORNE A, DAVIDSON J, ET AL. The
peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist rosiglitazone decreases bone
formation and bone mineral density in healthy postmenopausal women: a randomized,
controlled trial. J Clin Endocrinol Metab. v. 92(4):1305-10, 2007.
59. GREY, A. Skeletal consequences of thiazolidinedione therapy. Osteoporos Int. v.
19(2):129-37, 2008.
60. GRONEMEYER, H., GUSTAFSSON, J-K, LAUDET, V. Principles for modulation of the
nuclear receptor superfamily. Nature. v. 3, p. 950-965, 2004.
61. GRONEMEYER, H.; GUSTAFSSON, J.A.; AND LAUDET, V. Principles for modulation
of the nuclear receptor superfamily. Nat Rev Drug Discov 3, 950-964, 2004.
62. GRONEMEYER, H.; GUSTAFSSON, J.A.; LAUDET, V. Principles for modulation of the
nuclear receptor superfamily. Nat Rev Drug Discov. V. 3: 950-964, 2004.
63. GUNNING, P.W., GHOSHDASTIDER, U.; WHITAKER, S.; POPP, D.; ROBINSON, R.C.
Jun 2015. "The evolution of compositionally and functionally distinct actin
filaments". Journal of Cell Science 128 (11), 2015.
64. GUPTA, D.; KONO, T.; AND EVANS-MOLINA, C. The role of peroxisome proliferator-
activated receptor gamma in pancreatic beta cell function and survival: therapeutic
implications for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes Obes. Metab.
12,1036–1047, 2010.
65. GUSMÃO, D.F.H.O. Chalcona como Modelo de Estudo no Receptor Ativado por
Proliferador Peroxissomal (PPAR). (Mestrado). Universidade de Brasília, Faculdade de
Ciências da Saúde. Brasília, 2008.
66. HABER, E.P. et al. Secreção da insulina: efeito autócrino da insulina e modulação por
ácidos graxos. Arq Bras Endocrinol Metab, São Paulo, v. 45, n. 3, p. 219-227, 2001.
67. HAINES, J.L.; TER-MINASSIAN, M.; BAZYK, A.; GUSELLA, J.F.; KIM, D.J.;
TERWEDOW, H.; PERICAK-VANCE, M.A.; RIMMLER, J.B.; HAYNES, C.S.; ROSES,
A.D.; LEE, A.; SHANER, B.; MENOLD, M.; SEBOUN, E.; FITOUSSI, R.P.; GARTIOUX,
C.; REYES, C.; RIBIERRE, F.; GYAPAY, G.; WEISSENBACH, J.; HAUSER, S.L.;
GOODKIN, D.E., LINCOLN, R., USUKU, K.; OKSENBERG, J.R. et al. A complete
genomic screen for multiple sclerosis underscores a role for the major histocompatability
complex. The Multiple Sclerosis Genetics Group. Nat Genet. v. 13(4):469-71, 1996.
68. HALL, J.M.; MCDONNELL, D.P. The molecular mechanisms underlying the
proinflammatory actions of thiazolidinediones in human macrophages. Mol Endocrinol.
v. 21(8):1756-68, 2007.
69. HAMPEL, A.; LABANANSKAS, M.; CORNNERS, P. G.; KIRKEGARD, L.;
RAJBHANDARY, U. L.; SIGLER, P. B.; BOCK, R. M. Science, 162, 1384, 1968.
105
70. HANUKOGLU, I.; TANESE, N.; FUCHS, E. "Complementary DNA sequence of a human
cytoplasmic actin. Interspecies divergence of 3' non-coding regions". Journal of
Molecular Biology 163 (4): 673–8, 1983.
71. HEIKKINEN, S.; AUWERX, J.; ARGMANN, C.A. PPAR gamma in human and mouse
physiology. Biochim Biophys Acta. v. 1771(8):999-1013, 2007.
72. HOLMAN, N.; YOUNG, B.; GADSBY, R. Current prevalence of type 1 and type 2
diabetes in adults and children in the UK. Diabet Med J Br Diabet Assoc 32:1119–20,
2015.
73. HORIKAWA, Y.; IWASAKI, N.; HARA, M.; FURUTA, H.; HINOKIO, Y.; COCKBURN,
B.N. et al. Mutation in hepatocyte nuclear
Nature Genet. v. 17:384-5, 1997.
74. HOUTKOOPER, R.H. & JOHAN, A. OBESITY, New life for anti-diabetic drugs. Nature.
466(7305): 10.1038/466443a, 2010.
75. IDF DIABETES ATLAS Seventh Edition 2015
76. IN'T VELD, P.; LIEVENS, D.; DE GRIJSE, J.; et al. Screening for insulitis in adult
autoantibody-positive organ donors. Diabetes [S.l.: s.n.] 56 (9): 2400–4, 2007.
77. ISSEMANN, I.; GREEN, S. Activation of a member of the steroid hormone receptor
superfamily by peroxisome proliferators. Nature (Lond) 347: 645-650. 1990.
78. JEANNIN, E.; WAHLI, W.; DESVERGNE, B. Polarity and specific sequence
requirements of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)/retinoid X receptor
heterodimer binding to DNA. A functional analysis of the malic enzyme gene PPAR
response element. J Biol Chem. v. 8;272(32):20108-17, 1997.
79. JONES, D. Potential remains for PPAR-targeted drugs. Nature Reviews Drug
Discovery 9, 668-669, 2010
80. JONES, J.R.; BARRICK, C.; KIM, K.A.; LINDNER, J.; BLONDEAU, B.; FUJIMOTO, Y.;
SHIOTA, M.; KESTERSON, R.A.; KAHN, B.B.; AND MAGNUSON, M.A. Deletion of
PPARgamma in adipose tissues of mice protects against high fat diet-induced obesity
and insulin resistance. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 6207-6212, 2005.
81. KERN, P.A. High adipose tissue lipoprotein lipase activity plays a causai role in the
etiology of obesity. 1996.
82. KIM, S.H.; YOO, C.I.; KIM, H.T.; PARK, J.Y.; KNOW, C.H.; KIM, Y.K. Activation of
peroxisome proliferator-activated recptor-gamma (PPARgamma) induces cell death
through MAPK-dependent mechanism in osteoblastic cells. Toxicol Appl Pharmacol. v.
1;215(2):198-207, 2006.
83. KLEIN, K.; ALLISON, D.B.; HEYMSFIELD, S.B.; KELLEY, D.E.; LEIBEL, R.L.; NONAS,
C.; KAHN, R. Waist Circumference and Cardiometabolic Risk: A Consensus Statement
from Shaping America's Health: Association for Weight Management and Obesity
Prevention. NAASO, Diabetes Care, v. 30:1647-1652, 2007.
84. KLINGE, C.M. Review article Estrogen receptor interaction with co-activators and co-
repressors. Steroids. v. 227–251, 2000.
106
85. KNOUFF, C. & AUWERX, J. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
calls for activation in moderation: lessons from genetics and pharmacology.
Endocr Rev. 25(6):899-918, 2004.
86. KOSHLAND, D.E. Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 44 (2):
98–104, 1958.
87. KUBOTA, N; TOBE, K.; TERAUCHI, Y. et al., Disruption of insulin receptor substrate 2
causes type 2 diabetes because of liver insulin resistance and lack of compensatory 𝛽-
cell hyperplasia. Diabetes, v. 49, no. 11, pp. 1880–1889, 2000.
88. KULKARNI, R.N.; BRUNING, J.C.; WINNAY, J.N.; POSTIC, C.; MAGNUSON, M.A.;
KAHN, C.R. Tissue-specific knockout of the insulin receptor in pancreatic beta cells
creates an insulin secretory defect similar to that in type 2 diabetes. Cell. v. 96:329-39,
1999.
89. KUMAR, R.; THOMPSON, E.B. The stucture ofthe nuclear hormone receptors. Steroids.
v.64, p. 310-319, 1999.
90. KUNG, J. & HENRY, R.R. Thiazolidinedione safety. Expert Opin. Drug Saf. 11,565–579,
2012.
91. LANGE, E.M.; SUN, J.; LANGE, L.A.; ZHENG, S.L.; DUGGAN, D.; CARPTEN, J.D.; et
al. Family-based samples can play an important role in genetic association studies.
Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. v. 17(9):2208-14, 2008.
92. LANGERHANS P. Beiträge zur mikroskopischen Anatomie der Bauchspeicheldruse.
Med. Dissertation, Thesis, Gustav Lange, Berlin, 1869.
93. LAUDET, V.; GRONEMEYER, H. The Nuclear receptor Facts. Book Academic Press,
San Diego. 2002.
94. LAZAR, M.A. Mechanisms of action of hormones that act on nuclear receptors. In:
Larsen PR, Kronenberg HM, Melmed S, Polonsky KS, editors. Williams Textbook of
Endocrinology. Philadelphia: W.B. Saunders Company. p.35-44, 2003.
95. LEBOVITZ, H.E.; DOLE, J.F.; PATWARDHAN, R.; RAPPAPORT, E.B.; FREED; M.I.
Rosiglitazone monotherapy is effective in patients with type 2 diabetes. J Clin Endocrinol
Metab. 86:280–288, 2001.
96. LECKA-CZERNIK, B. et al. Divergent effects of selective peroxisome
proliferatoractivated receptor-gamma 2 ligands on adipocyte versus osteoblast
differentiation. Endocrinology 143, 2376–84, 2002.
97. LEFERS, M. and HOLMGREN. Introducing dose response curves, Graphpad Software
Website created and maintained by: IRIS, L.G.; SCHMICKEL, R.D. The Human 18S
Ribosomal RNA Gene: Evolution and Stability, 1986, 38:419-427, 2004.
98. LEHMANN et al An antidiabetic thiazolidinedione is a high affinity ligand for peroxisome
proliferator-activated receptor gamma (PPAR gamma). J.Biol.Chem. 270 12953, 1995.
99. LEHMANN, J.M.; MOORE, L.B.; SMITH-OLIVER, T.A.; WILKISON, W.O.; WILLSON,
T.M.; KLIEWER, S.A. An antidiabetic thiazolidinedione is a high affinity ligand
peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR gamma). J. Biol. Chem., 270:
12953-12956, 1995.
107
100. LESK, A.M. Introduction to Bioinformatics (em inglês) 3ª ed. (Oxford: Oxford University
Press). p. 308-318, 2008.
101. LIBERATO, M.V., NASCIMENTO, A.S., AYERS, S.D., LIN, J.Z., CVORO,
A., SILVEIRA, R.L., MARTÍNEZ, L., SOUZA, P.C., SAIDEMBERG, D., DENG,
T., AMATO, A.A., TOGASHI, M., HSUEH, W.A., PHILLIPS, K., PALMA, M.S., NEVES,
F.A., SKAF, M.S., WEBB, P., POLIKARPOV, I. Medium chain fatty acids are selective
peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) γ activators and pan-PPAR partial
agonists. PLoS One, 2012, 7(5):e36297.
102. LIU, R.Z.; LI, X.; GODBOUT, R. A novel fatty acid-binding protein (FABP) gene resulting
from tandem gene duplication in mammals: transcription in rat retina and testis.
Genomics; 92:436-45, 2008.
103. LOA, M.; AULABAUGHA, A.; JINA, G.; COWLINGA, R.; BARDB, J.; MALAMASC,
M.; ELLESTADA, G. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit
identification in drug discovery. Analytical Biochemistry. Elsivier, 332:153-159, 2004.
104. LOHR, A.; GINGERY, J.G. Endocrine Society. "People with metabolic syndrome face
higher cardiovascular death risk." ScienceDaily. ScienceDaily, 20 May 2015.
<www.sciencedaily.com/releases/2015/05/150520131705.htm>.
105. LORENZO, C.; WILLIAMS, K.; HUNT, K.J.; HAFFNER, S.M. International Diabetes
Federation, and World Health Organization Definitions of the Metabolic Syndrome as
Predictors of Incident Cardiovascular Disease and Diabetes. American Diabetes
Association, San Antonio, TX. v. 30: 8–13, 2007.
106. MACHADO, U.F.; SCHAAN, B.D.; SERAPHIM, P.M. Transportadores de glicose na
síndrome metabólica. Arq Bras Endocrinol Metab, São Paulo. v. 50, n. 2, p. 177-189,
2006.
107. MAHTANI, M.M.; WIDÉN, E.; LEHTO, M.; THOMAS, J.; MCCARTHY, M.; BRAYER, J.;
BRYANT, B.; CHAN, G.; DALY, M.; FORSBLOM, C.; KANNINEN, T.; KIRBY, A.;
KRUGLYAK, L.; MUNNELLY, K.; PARKKONEN, M.; REEVE-DALY, M.P.; WEAVER, A.;
BRETTIN, T.; DUYK, G.; LANDER, E.S.; GROOP, L.C. Mapping of a gene for type 2
diabetes associated with an insulin secretion defect by a genome scan in Finnish
families. Nat Genet. 14(1):90-4, 1996.
108. MALECKI, M.T.; JHALA, U.S.; ANTONELLIS, A.; FIELDS, L.; DORIA, A.; ORBAN, T. et
al. Mutations in NEUROD1 are associated with the development of type 2 diabetes
mellitus. Nature Genet. v. 23:323-8, 1999.
109. MATILIS, D.; LOVRIEN, R. 8-Anilino-1-naphthalene sulfonate anion-protein binding
depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal, 74:422-9, 1998.
110. MICHALIK, L.; AUWERX, J.; BERGER, J.P.; CHATTERJEE, V.K.; GLASS, C.K.;
GONZALEZ, F.J.; et al. International Union of Pharmacology. LXI. Peroxisome
proliferator-activated receptors. Pharmacol Rev. v. 58(4):726-41, 2006.
111. MICHALIK, L.; DESVERGNE, B.; DREYER, C.; GAVILLET, M. ; LAURINI, R.N.; WAHLI,
W. PPAR expression and function during vertebrate development. Int. J. Dev.Biol., v. 46:
105-114, 2002.
112. MITSUTAKA, I.A.; TAKAAKI, O.A.; WATARU MOTOMURA AM.A.; NOBUHIKO,T.B.;
YAYOI H.A.; SHIGEKI, M.A.; YASUAKI, S.A.; HIROYUKI, S.A.; YUTAKA, K.A.;
108
TOSHIKATSU, O. Increased expression of PPARc in high fat diet-induced liver steatosis
in mice. Biochemical and Biophysical Research Communications, 336, 215–222, 2005.
113. MORAES, C.S. et al. Métodos experimentais no estudo de proteínas. Rio de Janeiro.
p.84. 2013.
114. MORAN, Y.; LABRADOR, L.; CAMARGO, M.E.; FERNÁNDEZ, D.; CHIURILLO, M.A.
Design of an allele-specific PCR assay to genotype the rs12255372 SNP in a pilot study
of association between common TCF7L2 polymorphisms and type 2 diabetes in
Venezuelans. Arch Endocrinol Metab. 2015.
115. MORAS, D.; GRONEMEYER, H. The nuclear receptor ligand-binding domain: structure
and function. Curr Opin Cell Biol. v.10:384–91, 1998.
116. MUELLER, E.; SARRAF, P.; TONTONOZ, P.; EVANS, R.M.; MARTIN, K.J.; ZHANG,
M.; FLETCHER, C.; SINGER, S.; and SPIEGELMAN, B.M. Terminal differentiation of
human breast cancer through PPAR. Mol Cell 1:465–470. 1998.
117. NATHAN, D.M.; BUSE, J.B.; DAVIDSON, M.B.; et al. Management of hyperglycemia in
type 2 diabetes: a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy: a
consensus statement from the American Diabetes Association and the European
Association for the Study of Diabetes. Diabetes Care. 29:1963–1972. 2006.
118. NETTLES, K.W. Insights into PPARγ from structures with endogenous and covalently
bound ligands. Nature Structural & Molecular Biology, v. 15, n. 9, 2008.
119. NEWSHOLME, P.; CRUZAT, V.; ARFUSO, F. AND KEANE, K. “Nutrient regulation of
insulin secretion and action,” The Journal of Endocrinology, vol. 221, no. 3, pp. R105–
R120, 2014.
120. NIESEN, F. Excel script for the analysis of protein unfolding data acquired by differential
scanning fluorimetry (DSF). Structural Genomics Consortium, Oxford ORCRB,UK.
Manual, v3.0, 2010.
121. NISSEN, S.E., AND WOLSKI, K. Rosiglitazone revisited: an updated meta-analysis of
risk for myocardial infarction and cardiovascular mortality. Arch Intern Med. v. 170, 1191-
1201, 2010.
122. NISSEN, S.E.; WOLSKI, K., Effect of rosiglitazone on the risk of myocardial infarction
and death from cardiovascular causes. N. Engl. J. Med., 356, 2457–2471, 2007.
123. NTZANI, E.E.; KAVVOURA, F.K. Genetic risk factors for type 2 diabetes: insights from
the emerging genomic evidence. Curr Vasc Pharmacol. v. 10(2):147-55, 2012.
124. OLEFSKY, J.M. Nuclear receptor mini review series. J Biol Chem. v. 5;276(40):36863-
4, 2001.
125. PARK, S. et al. Increased Cardiovascular Mortality in Metabolic Syndrome Is Largely
Attributable to Diabetes and Hypertension. Journal of Clinical Endocrinology &
Metabolism, v. 403, 2015.
126. PASCUAL, G.; GLASS, C.K. Nuclear receptors versus inflammation: mechanisms of
transrepression. Trends Endocrinol Metab. v. 17(8):321-7, 2006.
127. PORETSKY, L. Principles of diabetes mellitus. Springer. New York, 2nd ed. 2010.
109
128. POULSEN, L.; SIERSBAEK, M.; MANDRUP, S., PPARs: fatty acid sensors controlling
metabolism. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 631–639, 2012.
129. RASTINEJAD, F. Retinoid X receptor and its partners in the nuclear receptor family. Curr
Opin Struct Biol. 11:33–38, 2001.
130. REIS, A.F.; VELHO, G. Bases Genéticas do Diabetes Mellitus Tipo 2. Arq Bras
Endocrinol Metab, São Paulo. v. 46, n. 4, p. 426-432, 2002 .
131. RICOTE, M.; GLASS, C.K. PPARs and molecular mechanisms of transrepression.
Biochim Biophys Acta. v. 1771(8):926-35, 2007.
132. RICOTE, M.; GLASS, C.K. PPARS and molecular mechanisms of transrepression.
Biochim Biophys Acta. v. 1771(8):926-35, 2007.
133. RICOTE, M.; LI, A.C.; WILLSON, T.M.; KELLY, C.J.; GLASS, C.K. The peroxisome
proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation.
Nature. 391:79-82.1998.
134. ROBINSON-RECHAVI, M. ESCRIVA GARCIA H, LAUDET V. The nuclear receptor
superfamily. J Cell Sci. 2003 Feb 15;116(Pt 4):585-6.
135. ROSEN, E.D.; SPIEGELMAN, B.M. PPAR gamma: a nuclear regulator of metabolism,
differentiation, and cell growth. J Biol Chem. v. 12;276(41):37731-4, 2001.
136. ROSENFELD, M.G.; LUNYAK, V.V.; GLASS, C.K. Sensors and signals: a
coactivator/corepressor/epigenetic code for integrating signal-dependent programs of
transcriptional response. Genes Dev. v. 1;20(11):1405-28, 2006.
137. ROSENSTOCK, J.; SAMOLS, E.; MUCHMORE, D.B. SCHNEIDER, J.; GLIMEPIRIDE.
A new once-daily sulfonylurea. A double-blind placebo- controlled study of NIDDM
patients. Glimepiride Study Group. Diabetes Care. 19:1194–1199, 1996.
138. RUBENSTRUNK, A.; HANF, R.; HUM, D.W.; FRUCHART, J.C.; STAELS, B. Safety
issues and prospects for futures generations of PPAR modulators. Bioochim Biophys
Acta. v. 1771(8):1065-81, 2007.
139. SAINI, V. Molecular mechanisms of insulin resistance in type 2 diabetes mellitus. World
Journal of Diabetes, v. 1, no. 3, pp. 68–75, 2010.
140. SAKAMOTO, J.; KIMURA, H.; MORIYAMA, S.; ODAKA, H.; MOMOSE, Y.; SUGIYAMA,
Y.; et al. Activation of human peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)
subtypes by pioglitazone. Biochem Biophys Res Commun. v. 30;278(3):704-11, 2000.
141. SAKASHITA, A.; KAWABATA, Y.; JINCHO, Y.; TAJIMA, S.; KUMAMOTO, S.;
KOBAYASHI, H. et al. Sex Specification and Heterogeneity of Primordial Germ Cells in
Mice. PLoS ONE. V.10(12): e0144836, 2015.
142. SCHADE, D.S.; JOVANOVIC, L.; SCHNEIDER, J. A placebo-controlled, randomized
study of glimepiride in patients with type 2 diabetes mellitus for whom diet therapy is
unsuccessful. J Clin Pharmacol. 38:636–641, 1998.
143. SEMPLE, R. K.; CHATTERJEE, V. K. & O’RAHILLY, S. PPAR gamma and human
metabolic disease. J Clin Invest 116, 581–9, 2006.
110
144. SHU, L.; SAUTER, N.S.; SCHULTHESS, F.T.; MATVEYENKO, A.V.; OBERHOLZER,
J.; MAEDLER, K. Transcription factor 7-like 2 regulates beta-cell survival and function in
human pancreatic islets. Diabetes. 57(3):645-53.13, 2008.
145. SHU, L.; ZIEN, K.; GUTJAHR, G.; OBERHOLZER, J.; PATTOU, F.; KERR-CONTE, J.
et al. TCF7L2 promotes beta cell regeneration in human and mouse pancreas.
Diabetologia. 55(12):3296-307, 2012.
146. SILVIO R.A. Einstein e a teoria do movimento browniano. Revista Brasileira de Ensino
de Física. Salinas, 2005v. 27, n. 2, p. 263 – 269.
147. SLADEK, R.; ROCHELEAU, G.; RUNG, J.; DINA, C.; SHEN, L.; SERRE, D. et al. A
genome-wide association study identifies novel risk loci for type2 diabetes. Nature.
445(7130):881-5, 2007.
148. SONODA, J.; PEI, L.; EVANS, R.M. Nuclear receptors: decoding metabolic disease.
Howard Hughes Medical Institute and Gene Expression Laboratory, The Salk Institute
for Biological Studies, California. 582(1): 2–9, 2008.
149. STOFFERS, D.A.; FERRER, J.; CLARKE, W.L.; HABENER, J.F. Early-onset type 2
diabetes mellitus (MODY4) linked to IPF1.Nature Genet. v. 17:138-9, 1997.
150. STUMVOLL, M.; GOLDSTEIN, B.J.; VAN HAEFTEN, T.W. Type 2 diabetes: principles
of pathogenesis and therapy. Lancet. v. 365(9467):1333-46, 2005.
151. TANNER, R.E., HERPIGNY,B., CHEN, S.H., RHA, C.K. Conformational Change of
Protein Sodium Dodecyl-Sulfate Complexes in Solution – a Study of Dynamic Light-
Scattering. Journal of Chemical Physics,1982, 76:3866-3872.
152. TAVARES, V., ROSARIO D.M.H.H., HIRATA, C. Programa de Pós-Graduação em
Farmácia – Área de Análises Clínicas (VT), e Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas (MHH & RDCH), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de
São Paulo, SP. Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma Gama (PPARγ):
Estudo Molecular na Homeostase da Glicose, Metabolismo de Lipídeos e Abordagem
Terapêutica Arq Bras Endocrinol Metab; 51/4, 2007.
153. TONTONOZ, P.; AND SPIEGELMAN, B.M. Fat and beyond: the diverse biology of
PPARgamma. Annu Rev Biochem 77, 289-312, 2008.
154. TONTONOZ, P.; GRAVES, R.A.; BUDAVARI, A.I.; ERDJUMENT-BROMAGE, H.; LUI,
M.; HU, E.; TEMPST, P.; AND SPIEGELMAN, B.M. Adipocyte-specific transcription
factor ARF6 is a heterodimeric complex of two nuclear hormone receptors, PPAR
gamma and RXR alpha. Nucleic Acids Res, v. 22, 5628-5634, 1994a.
155. TONTONOZ, P.; HU, E.; AND SPIEGELMAN, B.M. Stimulation of adipogenesis in
fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell, v. 79, 1147-
1156, 1994b.
156. TONTONOZ, P.; SPIEGELMAN, B.M., Fat and beyond: the diverse biology of PPARγ.
Annu. Rev. Biochem. v. 77, 289–312, 2008.
157. TSCHIEDEL, B. 2013 ©2016 Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia –
SBEM. Disponível em: http://www.endocrino.org.br/historia-do-diabetes/> Acessado
em: 04/03/2016.
111
158. VERDILE, G.; KEANE, K.N.; CRUZAT, V.F.; MEDIC, S.; SABALE, M.; ROWLES, J.;
WIJESEKARA, N.; MARTINS, R.N.; FRASER, P.E. AND NEWSHOLME, P.
Inflammation and Oxidative Stress: The Molecular Connectivity between Insulin
Resistance, Obesity, and Alzheimer’s Disease. Hindawi Publishing Corporation
Mediators of Inflammation. v. 105828, 17 pages, 2015.
159. WAJCHENBERG, B.L. Tecido adiposo como glândula endócrina. Arq Bras Endocrinol
Metab. São Paulo, v. 44, n. 1, p. 13-20, 2000.
160. WHITE, M. F. Insulin signaling in health and disease. Science, vol. 302, no. 5651, pp.
1710–1711, 2003.
161. WILLSON, T. M.; LAMBERT, M. H. & KLIEWER, S. A.Peroxisome proliferator-activated
receptor gamma and metabolic disease. Annu Rev Biochem, 70, 341–67, 2001.
162. WITHERS, D.J.; GUTIERREZ, J.S.; TOWERY, H.; BURKS, D.J.; REN, J.M.; PREVIS,
S. et al. Disruption of IRS-2 causes type 2 diabetes in mice. Nature. v. 391:900-4, 1998.
163. World Health Organization, editor. Global health risks: mortality and burden of disease
attributable to selected major risks. Geneva, Switzerland: World Health Organization;
2009.
164. www.ncbi.nlm.nih.gov > Entrez Gene: CEBPA CCAAT/enhancer binding protein
(C/EBP), alpha.
165. YAGIHASHI, S.; INABA, W.; MIZUKAMI, H. Dynamic pathology of islet endocrine cells
in type 2 diabetes: β‐Cell growth, death, regeneration and their clinical implications. J
Diabetes Investig. 7(2): 155–165, 2016.
166. YALOW, R.S.; BERSON, S.A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J
Clin Invest. v. 39: 1157–1175, 1960.
167. YAMAGATA, K.; FURUTA, H.; ODA, O.; KAISAKI, P.J.; MENZEL, S.; COX, N.J. et al.
Mutations in the hepatocyte nuclear factor 4 alpha gene in maturity-onset diabetes of the
young (MODY1). Nature. v. 384:458-60, 1996.
168. YI, F.; BRUBAKER, P.L.; JIN, T. TCF-4 mediates cell type-specific regulation of
proglucagon gene expression by beta-catenin and glycogen synthase kinase-3beta. J
Biol Chem. 280(2):1457-64, 2005.
169. YKI-JARVINEN, H. The PROactive study: some answers, many questions. Lancet. v.
8;366(9493):1241-2, 2005.
170. YKI-JARVINEN, H. Thiazolidinediones. N Engl J Med. v. 9;351(11):1106-18, 2004.
171. YOUNG, P.W.; BUCKLE, D.R.; CANTELLO, B.C.; CHAPMAN, H.; CLAPHAM, J.C.;
COYLE, P.J.; HAIGH, D.; HINDLEY, R.M.; HOLDER, J.C.; KALLENDER, H.; LATTER,
A.J.; LAWRIE, K.W.; MOSSAKOWSKA, D.; MURPHY, G.J.; ROXBEE, C.O.X .L.;
SMITH, S.A. Identification of high-affinity binding sites for the insulin sensitizer
rosiglitazone (BRL-49653) in rodent and human adipocytes using a radioiodinated ligand
for peroxisomal proliferator-activated receptor gamma. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Feb;
284(2):751-9.
172. YU, J., LEUNG, W.K., CHEN, J., EBERT, M.P., MALFERTHEINER, P., AND SUNG, J.J.
Expression of peroxisome proliferator-activated receptor delta in human gastric cancer
and its response to specific COX-2 inhibitor. Cancer Lett 223, 11-17, 2005.
112
173. ZIMMET, P.; MAGLIANO, D.; MATSUZAWA, Y.; ALBERTI, G.; SHAW, J. The metabolic
syndrome: a global public health problem and a new definition. J Atheroscler Thromb. v.
12, 295–300, 2005.
113
1. Declaração de Bioética e Biossegurança
7. ANEXOS
114
2. Declaração de Direitos Autorais