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I UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA SEMIOQUÍMICOS PRODUZIDOS POR BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS E OPILIÕES BRASILEIROS ARMANDO MATEUS POMINI Dissertação de Mestrado Orientadora Dra. Anita Jocelyne Marsaioli Campinas – São Paulo Fevereiro/2006

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I

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

SEMIOQUÍMICOS PRODUZIDOS POR BACTÉRIAS

FITOPATOGÊNICAS E OPILIÕES BRASILEIROS

ARMANDO MATEUS POMINI

Dissertação de Mestrado

Orientadora

Dra. Anita Jocelyne Marsaioli

Campinas – São Paulo

Fevereiro/2006

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II

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP

Pomini, Armando Mateus. P771s Semioquímicos produzidos por bactérias

fitopatogênicas e opiliões brasileiros / Armando Mateus Pomini. -- Campinas, SP: [s.n], 2005.

Orientadora: Anita Jocelyne Marsaioli. Dissertação – Universidade Estadual de

Campinas, Instituto de Química. 1. Quorum-sensing. 2. Lactonas. 3. Opiliões.

4. Defesa química. I. Marsaioli, Anita Jocelyne. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de

Química. III. Título.

Título em inglês: Semiochemicals produced by phytopathogenic bacteria and Brazilian opilionids Palavras-chaves em inglês: Quorum-sensing, Lactones, Harvestmen, Chemical defense Área de concentração: Química Orgânica Titulação: Mestre em Química na área de Química Orgânica Banca examinadora: Dra. Anita Jocelyne Marsaioli (Orientadora); Dra. Raquel Marques Braga (Titular); Dr. Roberto Gomes de Souza Berlinck (Titular); Dr. Paulo M. Imamura (Suplente); Dr. Lauro E. Soares Barata (Suplente); Dr. Wellington L. Araújo (Suplente) Data de defesa: 23/02/2006

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V

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais

Armando e Shirley, à minha irmã

Juliana e à minha namorada Adriana.

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VII

AGRADECIMENTOS

Agradeço muito a Deus por iluminar meu caminho e me dar forças para

perseverar.

Aos meus pais Armando e Shirley e minha irmã Juliana, pelo carinho e

amor de toda uma vida e incentivos aos meus sonhos.

À minha namorada Adriana pelo companheirismo, amizade e amor que

dão à minha vida, a cada dia, aquilo que faltava para me sentir completo. Aos

seus pais Alceu e Marta e irmãs Valéria e Priscila, o meu muito obrigado pela

amizade e atenção.

À Profa. Anita pela orientação, compreensão e amizade ao longo destes

dois anos. Muito obrigado por estar presente tanto dentro quanto fora do

laboratório, principalmente nas horas de maior necessidade.

Ao meu tio José que sempre me acompanha e que me ajuda nas horas

de dúvida. À Tata, Luana, Nena, Joel, Raquel, Dico, Adilson, Adriane, Rúbis

e todos os meus outros tios, tias, primos e primas, aos meus avós José (in

memoriam) e Hilda, muito obrigado!

Ao amigo Milton, pela amizade que se estende e pelos conhecimentos

transmitidos, hoje essenciais. Aos professores da UEL Dra. Dalva, Dr. César e

Dra. Terezinha, pelos bons tempos de convivência, sempre lembrados.

Aos colegas de laboratório Lu Chen, Lucimar, Sérgio, Isis, Marcela,

Simone, Cabeça, Letícia, Diego, Georgiana, Suzan, Milena e aos que já estão

longe Fernando, Luiz Antônio, Luciana, Mirele, Adriana, Carla, Mariza e

Eduardo. Muito obrigado pela amizade e auxílio.

Agradeço também aos colaboradores Dr. Welington Araújo (Esalq), Dr.

Gilson Manfio (Natura), Dr. Glauco Machado (IB-Unicamp) e Dra. Luzia

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VIII

Paccola-Meirelles (UEL), sem os quais este trabalho não poderia ter sido

realizado.

Aos colegas de outros laboratórios e instituições Tarcísio (UnB), Luiz e

Luciana (USP), Marinaldo, Cíntia, Umberto, Sérgio, Inês, Fernando (Esalq),

Mary Ângela, André, Carlos, Lucas, Fabrício, Liliane, Mayra, Gabriela,

Regina, Philip (UEL) e Eugênia (UEL). Aos sempre amigos Dr. Ricardo Faria

(UEL) e Geraldo (UEL), muito obrigado por tudo.

Ao todo poderoso Instituto de Química, na figura de seus funcionários e

professores. Agradeço especialmente à Sônia, Soninha, Paula, Cláudia e

Daniel pela aquisição de diferentes espectros; à Dona Maria, Juliana e

Andréia, pelos auxílios nos laboratórios e ao Everaldo pelos painéis. Ao

Pimpim pela ajuda com os gases, Seu Fontana e Cláudio pelos serviços de

vidraria. Agradeço à Bel pelas orientações na CPG. Expresso minha gratidão

aos professores Dra. Raquel Braga, Dr. Antônio Herrera Braga, Dr. Paulo

Imamura, Dr. Sebastião Fonseca, Dra. Eva Magalhães e Dr. Aderbal

Magalhães, pelo conhecimento transmitido e agradável convivência. Agradeço

à Dra. Carol Collins pelas revisões dos artigos. Agradeço ao Dr. Roberto

Berlinck (USP – São Carlos) por aceitar participar na banca de defesa desta

dissertação, além dos outros membros já citados.

Agradeço à Fapesp (processo 03/09357-7) pelo auxílio financeiro ao

projeto e pela bolsa de estudos concedida.

A todos que de uma forma ou de outra contribuíram para minha

formação ou que desejaram o bem em minha vida, que Deus lhes retribua em

dobro.

Armando Mateus Pomini

23-02-2006

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IX

Curriculum Vitae

1. Dados pessoais Nome: Armando Mateus Pomini; Data de Nascimento: 19/06/1982; Nacionalidade: Brasileira; Cidade: Cambé – Estado do Paraná; Filiação: Pai: Armando Pomini; Mãe: Shirley Clélia da Conceição Bailoni Pomini; Estado Civil: Solteiro; RG: 8257223-6 – SESP – PR. Endereço: Rua Planalto, 120. CEP 86191-240, Cambé, Paraná. [email protected]

2. Formação Acadêmica 2.1. Graduação em Química Bacharelado e Tecnológica. Universidade Estadual de Londrina, UEL,

Londrina, Paraná (2000-2004). Título da monografia: “Síntese e teste antimicrobiano de asperfenamato, metabólito isolado de Zeyhera digitalis (Bignoniaceae)”. Orientador: Dr. Milton Faccione. Bolsista da Coordenadoria de Pesquisa e Pós Graduação da UEL, CPG/UEL.

2.2. Mestrado em Química Orgânica. Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Campinas, São Paulo (2004-2006). Título da dissertação: “Semioquímicos produzidos por bactérias fitopatogênicas e opiliões brasileiros”. Orientadora: Dra. Anita Jocelyne Marsaioli. Bolsista da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 03/09357-7).

3. Prêmios e distinções 3.1. Láurea Acadêmica, Universidade Estadual de Londrina (2004). 3.2. Primeiro colocado, exame de admissão ao mestrado, Universidade Estadual de Campinas (2003). 3.3. Primeiro colocado no Estado do Paraná, Exame Nacional de Cursos (Química), MEC (2003).

4. Artigos publicados em periódicos internacionais 4.1. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; SARIDAKIS, H. O. ; SCHIMITZ, V. O. ;

BRAZ FILHO, R. A new method for asperphenamate synthesis and its antimicrobial activity evaluation. Natural Product Research, Reino Unido, 2006, no prelo.

4.2. POMINI, A. M. ; ARAÚJO, W. L. ; MARSAIOLI, A. J. Structural elucidation and biological activity of acyl-homoserine lactones from the phytopathogen Pantoea ananatis Serrano 1928. Journal of Chemical Ecology, EUA, 2005, submetido.

4.3. POMINI, A. M. ; MANFIO, G. P. ; ARAUJO, W. L. ; MARSAIOLI, A. J. Acyl-homoserine lactones from Erwinia psidii R. IBSBF 435T, a guava phytopathogen (Psidium guajava L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, EUA, v. 53, p. 6262-6265, 2005.

4.4. MACHADO, G. ; POMINI, A. M. ; MARSAIOLI, A. J. ; CARRERA, P. C. Chemical defense in harvestmen (Arachnida, Opiliones): Do benzoquinone secretions deter invertebrate and vertebrate predators? Journal of Chemical Ecology, EUA, v. 31, p. 2519-2539, 2005.

4.5. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZ FILHO, R. Synthesis of asperphenamate and aurantiamide benzoate for structural revision. Revista Latinoamericana de Química, México, v. 32, p. 49-56, 2004.

4.6. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZ FILHO, R. ; SOEIRA, L. S. ; ZANOLLI FILHO, L. A. . Synthesis and cytotoxicity of N-Benzoyl-S-phenylalaninol against Artemia salina and eight human tumor cell lines. Revista Latinoamericana de Química, México, v. 32, p. 87-92, 2004.

5. Trabalhos apresentados em eventos 5.1. POMINI, A. M.; ARAÚJO, W. L.; MARSAIOLI, A. J. Caracterização química das acil-

homosserina lactonas produzidas pela bactéria fitopatogênica Pantoea ananatis S. CCT 6481. In: 4o Encontro Brasileiro de Ecologia Química, Piracicaba – SP, Programação e Livro de Resumos p. 68, 2005. Painel 05.

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X

5.2. POMINI, A. M. ; MANFIO, G. P. ; ARAUJO, W. L. ; MARSAIOLI, A. J. Acil-homosserina lactonas: A química da comunicação bacteriana em Erwinia psidii IBSBF 435, um fitopatógeno da goiabeira. In: 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas. 28a Reunião Anual da SBQ - Livro de Resumos, 2005.

5.3. POMINI, A. M. ; MACHADO, G. ; MARSAIOLI, A. J. Defesa química no opilião Goniosoma longipes (Arachnida: Opiliones). In: 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas. 28a Reunião Anual da SBQ - Livro de Resumos, 2005.

5.4. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZ FILHO, R. Synthesis of asperphenamate and aurantiamide benzoate for structural revision. In: II Workshop de Biocatálise - BIOCAT II, 2004, Campinas. BIOCAT II, 2004.

5.5. POMINI, A. M. Acil-homosserina lactonas: A química da comunicação bacteriana em Erwinia psidii, um fitopatógeno da goiabeira. In: 28a Reunião Anual da SBQ, 2005, Poços de Caldas. Exposição oral do trabalho na seção coordenada de Produtos Naturais "Raimundo Braz-Filho", 2005.

5.6. POMINI, A. M. ; FERREIRA, D. T. ; SARIDAKIS, H. O. ; BRAZ FILHO, R. ; SCHIMITZ, V. O. ; ISHIKAWA, N. K. ; FACCIONE, M. Síntese e teste antimicrobiano de asperfenamato, metabólito isolado de Zeyhera digitalis (Bignoniaceae). In: 27 Reunião anual da SBQ e XXVI Congresso Latinoamericano de Química, 2004, Salvador. Livro de Resumos - Congresso Latinoamericano de Química, 2004. p. QO115.

5.7. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZ FILHO, R. ; SARIDAKIS, H. O. ; SCHIMITZ, V. O. Síntese e teste antimicrobiano de asperfenamato, metabólito isolado de Zeyhera digitalis. In: Encontro Anual de Iniciação Científica, 2003, Foz do Iguaçu. EAIC 2003 - Resumos, 2003.

5.8. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZFILHO, R. . Synthesis of (S)-N-benzoylphenylalaninyl-(S)-phenylalaninol benzoate and its isomer (S)-N-benzoylphenilalanine-(S)-2-benzamide-3-phenylpropyl ester - revised structure of natural product isolated from Zeyhera digitalis. In: X Encontro de Química da região Sul, 2002, Joinville. Livro de Resumos - X SBQ Sul., 2002.

5.9. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZFILHO, R. . Synthesis of (S)-N-benzoylphenylalaninyl-(S)-phenylalaninol benzoate and its isomer (S)-N-benzoylphenilalanine-(S)-2-benzamido-3-phenylpropyl ester - revised structure of natural product isolated from Zeyhera digitalis. In: 17 th Internacional symposium on Medicinal Chemistry, 2002, Barcelona. Prous Science, Adici-Adici., 2002.

5.10. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. Síntese de asperphenamate isolado de Zeyhera digitalis. In: XI EAIC - Encontro anual de iniciação científica, 2002, Maringá. Publicado em CD/Room., 2002.

6. Produto tecnológico com registro 6.1. Produção do híbrido entre as orquídeas Miltonia regnellii x Oncidium crispum. Registro na “Royal

Horticultural Society”, Inglaterra, maio 2005.

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XI

Dissertação de Mestrado

Semioquímicos Produzidos por Bactérias Fitopatogênicas e

Opiliões Brasileiros

Resumo

Armando Mateus Pomini

Profa. Dra. Anita Jocelyne Marsaioli

Este trabalho abordou dois tópicos relacionados à comunicação química

inter e intraespecífica. O primeiro tópico descreveu a produção de

sinalizadores químicos da classe das acil-homosserina lactonas (acil-HSLs)

por bactérias Gram-negativas fitopatogênicas, em mecanismos comunicativos

conhecidos como quorum-sensing. Foram estudadas três espécies: Erwinia

psidii RODRIGUES, que causa a principal bacteriose da goiabeira no Brasil;

Pantoea ananatis SERRANO, um fitopatógeno de distribuição mundial e que

causa perdas em diversas culturas agrícolas e Pantoea agglomerans EWING &

FIFE, isolada da doença da “pinta branca do milho”. O estudo propiciou a

identificação de diversos metabólitos da classe das acil-HSLs, sendo que os

produtos majoritários tiveram suas configurações absolutas estabelecidas.

Avaliou-se ainda a atividade biológica de extratos, frações e produtos

sintéticos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), em

ensaios de expressão de enzimas β-galactosidase. Trata-se de um trabalho

pioneiro no Instituto de Química da Unicamp.

Na segunda linha de pesquisas desenvolvida, o enfoque recaiu sobre

alomônios produzidos por opiliões (Arachnida: Opiliones) e utilizados em

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XII

mecanismos de defesa química contra predadores e na defesa territorial.

Estudou-se as secreções de defesa das espécies Goniosoma longipes ROEWER

e Camarana flavipalpi SOARES, nativas do Estado de São Paulo. Este trabalho

rendeu a identificação de benzoquinonas substituídas e um fenol, inclusive

com a caracterização de um produto natural inédito (2-etil-3-metil-1,4-

benzoquinona).

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XIII

Semiochemicals Produced by Phytopathogenic Bacteria and

Brazilian Opilionids

Abstract

Armando Mateus Pomini

Prof. Dr. Anita Jocelyne Marsaioli

This work encompasses two different topics, both related to the intra

and interspecific chemical communication. The first part concerns to the

production of acyl-homoserine lactones (acyl-HSLs), which are signalling

substances of Gram-negative, plant pathogenic bacteria. These substances are

responsible for their chemical communication, in a process known as quorum-

sensing. Three species were studied: Erwinia psidii RODRIGUES, which causes

the most important bacteriosis in Brazilian guava crops; Pantoea ananatis

SERRANO, a worldwide-spread phytopathogen, which causes crop losses in

different plant species and Pantoea agglomerans EWING & FIFE, isolated from

the “white spot disease” of maize in Brazil. This study allowed the

identification of four acyl-HSLs, and the absolute configurations of the most

abundant substances were established. The activities of the extracts, fractions

and synthetic products were evaluated using the bioreporter Agrobacterium

tumefaciens NTL4(pZLR4), in β-galactosidase expression assays. This is a

pioneer work at the Chemistry Institute at Unicamp.

The second research topic was on the opilionids allomones (Arachnida:

Opiliones), employed in chemical defense mechanisms against predators and

in territorial defense. The exudates of Goniosoma longipes ROEWER and

Camarana flavipalpi SOARES, both native from São Paulo State (Brazil), were

chemically characterized, allowing the identification of a known substituted

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benzoquinone and a phenol, including a new natural product (2-ethyl-3-

methyl-1,4-benzoquinone).

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XV

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

δ Deslocamento químico (em partes por milhão, ppm)

Acil-HSL Acil-homosserina lactona

ACP Acyl carrier protein (Proteína carreadora de acila)

CC Cromatografia em coluna

CCD Cromatografia em camada delgada

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CG(quiral)-FID Cromatografia gasosa acoplada a detecção por ionização

em chama e fase estacionária quiral

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de

massas

CoA Co-enzima A

COSY Correlation Spectroscopy (1H, 1H 3J)

EMAR Espectrometria de massas de alta resolução

eV Elétron-volt

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation (correlação

heteronuclear de 1H, 13C a múltiplas ligações)

HSQC Heteronuclear single quantum coherence (correlação

heteronuclear de 1H, 13C a uma ligação)

Hz Hertz

LB Meio de cultivo Luria Bertani

m/z Relação massa por carga

NB Meio de cultivo caldo nutriente

NOE Efeito Overhouser nuclear

Ppm Parte por milhão

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XVI

RMN Ressonância magnética nuclear

SAM S-adenosilmetionina

TMS Tetrametilsilano

X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo

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XVII

ÍNDICE

Introdução geral 01 CAPÍTULO 1 – A QUÍMICA DA COMUNICAÇÃO BACTERIANA

07

1.1. Introdução 091.1.1. Quorum-sensing: Um mecanismo de regulação da expressão gênica

14

1.1.1.1. Mecanismo de regulação da expressão de bioluminescência em V. fischeri

20

1.1.2. Quorum sensing no gênero Erwinia 221.1.3. Erwinia psidii, um fitopatógeno da goiabeira 281.1.4. Pantoea ananatis, um fitopatógeno de distribuição mundial

32

1.1.5. Pantoea agglomerans isolada da doença da “pinta branca do milho”

32

1.2. Objetivos 351.3. Resultados e discussão – A química da comunicação bacteriana

36

1.3.1. Testes biológicos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)

37

1.3.2. Caracterização química das acil-HSLs produzidas por E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans

42

1.3.3. Análise do branco para acil-homosserina lactonas por CG-EM

49

1.3.4. Síntese de acil-homosserina lactonas 501.3.5. Avaliação da atividade biológica de frações e produtos sintéticos com o biossensor A. tumefaciens NTL4(pZLR4)

56

1.3.6. Determinação da configuração absoluta das acil-homosserina lactonas majoritárias identificadas

57

1.3.7. N-heptanoil-HSL, um metabólito de rara ocorrência 621.3.8. Avaliação da atividade biológica das espécies P. ananatis e P. agglomerans contra folhas de milho (Zea mays)

64

1.3.9. Avaliação da presença de acil-homosserina lactonas em folhas de milho infectadas pela cepa P. agglomerans CBMAI 732

65

1.4. Conclusões – A Química da Comunicação Bacteriana 69

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XVIII

CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES 71

2.1. Introdução 732.1.1. Gonisoma longipes Roewer e Camarana flavipalpi Soares (Gonyleptidae)

77

2.2. Objetivos 792.3. Resultados e Discussão 80

2.3.1. Estudo químico da secreção de defesa do opilião C. flavipalpi (Laniatores: Gonyleptidae)

80

2.3.2. Estudo químico da secreção de defesa do opilião G. longipes (Laniatores: Gonyleptidae)

84

2.4. Conclusões – Defesa Química em Opiliões 92 CAPÍTULO 3 – CONCLUSÕES FINAIS 93 CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL 97

4.1. Materiais e Equipamentos 994.1.1. Equipamentos 994.1.2. Meios de cultivo para microrganismos 1024.1.3. Reagentes e solventes 1034.1.4. Cepas bacterianas 103

4.2. Bioensaio com Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) in vivo

105

4.3. Avaliação da atividade biológica com extratos dos meios de cultivo de E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans

107

4.4. Cultivo das bactérias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans para extração de acil-homosserina lactonas

108

4.5. Detecção de acil-homosserina lactonas por CG-EM 1094.6. Análise do branco para acil-homosserina lactonas identificadas por CG-EM

112

4.7. Síntese de acil-homosserina lactonas 1124.8. Co-injeção de produtos naturais e sintéticos em CG-EM 1174.9. Avaliação da atividade biológica de produtos sintéticos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)

117

4.10. Determinações de configurações absolutas de produtos naturais por CG-FID com fase estacionária quiral

117

4.11. Avaliação da atividade patogênica das cepas P. ananatis CCT 6481T e P. agglomerans CBMAI 732 em folhas jovens de milho (Zea mays)

118

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XIX

4.12. Avaliação da presença de acil-homoserina lactonas em folhas de milho infectadas pela cepa P. agglomerans CBMAI 732 e folhas de milho provenientes de campo

119

4.13. Determinação da constituição química da secreção de defesa dos opiliões Goniosoma longipes e Camarana flavipalpi

121

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 125

ANEXOS: ESPECTROS 137

ANEXOS: ARTIGO 165

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INTRODUÇÃO GERAL

1

____________________ INTRODUÇÃO GERAL

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INTRODUÇÃO GERAL

3

INTRODUÇÃO GERAL

A utilização de substâncias químicas como carreadoras de informações

entre organismos de uma mesma espécie ou até mesmo entre espécies

diferentes é amplamente difundida e pode ser encontrada em vertebrados,

invertebrados, plantas e microrganismos. Estes mecanismos de comunicação

são mediados por substâncias denominadas semioquímicos (do Grego

“simeon”, sinal), que podem estar envolvidos em atividades comportamentais

diversas como procura por alimento, reprodução, sinal de alerta na presença

de predadores e como substâncias de defesa química, por exemplo (Mori,

1998).

As substâncias semioquímicas são divididas em duas grandes classes, os

feromônios e aleloquímicos. Feromônios são substâncias secretadas por um

organismo com o objetivo de causar uma reação específica em outro indivíduo

da mesma espécie. As finalidades mais comuns dos feromônios são a atração

para fins reprodutivos, marcação territorial e sincronização de atividades em

populações, incluindo dispersão e agregação (Nordlund e Lewis, 1976).

As substâncias aleloquímicas são aquelas empregadas na transmissão de

informações entre espécies distintas, pertencentes ou não ao mesmo nível

trófico. Os aleloquímicos são divididos em três sub-grupos (Nordlund e

Lewis, 1976):

1. Alomônio: substância química produzida por um organismo que,

quando em contato com um indivíduo de outra espécie no contexto

natural, provoca no receptor uma reação comportamental ou fisiológica

favorável ao organismo emissor. Esta classe inclui uma grande

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INTRODUÇÃO GERAL

4

variedade de substâncias, incluindo venenos e secreções de repelência

em animais e plantas.

2. Cairomônio: substância química produzida por um organismo que,

quando em contato com um indivíduo de outra espécie no contexto

natural, provoca no receptor uma reação comportamental ou fisiológica

favorável ao organismo receptor, mas não ao organismo emissor. Pode-

se citar nesta classe as substâncias emitidas por uma presa que atraem o

predador.

3. Sinomônio: substância química produzida por um organismo que,

quando em contato com um indivíduo de outra espécie no contexto

natural, provoca no receptor uma reação comportamental ou fisiológica

favorável a ambos organismos, receptor e emissor. Isto ocorre por

exemplo durante a polinização, onde a flor libera ao meio substâncias

químicas capazes de atrair o polinizador; a flor ganha em seu processo

reprodutivo e o polinizador é recompensado com essências, óleos florais

e néctar.

O presente trabalho se concentrou em dois tópicos, ambos relacionados

com os semioquímicos. Um destes é a atração feromonal intraespecífica em

bactérias. Atualmente, sabe-se que estes microrganismos são capazes de

coordenar diversas atividades biológicas, como a síntese de metabólitos

secundários e exoenzimas, através da liberação ao meio de substâncias de

auto-percepção. Utilizando-se destes mecanismos comunicativos as bactérias

conseguem fazer com que toda a população inicie atividades patogênicas de

modo sincronizado, constituindo assim um artifício de sobrevivência

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INTRODUÇÃO GERAL

5

extremamente importante. O segundo tópico versará sobre alomônios,

especificamente as substâncias químicas produzidas pelas glândulas de defesa

de aracnídeos conhecidos como opiliões; estes animais utilizam-se de

alomônios, por exemplo, na defesa territorial, defesa de ovos e contra

predadores.

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________________________CAPÍTULO 1 – A QUÍMICA DA COMUNICAÇÃO BACTERIANA

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____________________________ CAPÍTULO 1

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________________________CAPÍTULO 1 – A QUÍMICA DA COMUNICAÇÃO BACTERIANA

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CAPÍTULO 1. A QUÍMICA DA COMUNICAÇÃO BACTERIANA

1.1. Introdução

A comunicação entre organismos vivos, que outrora pensava-se ser

restrita ao mundo macroscópico, sabe-se hoje ser amplamente difundida até no

mundo microscópico. Assim, as bactérias não existem como células solitárias,

mas sim como microrganismos coloniais que exploram sistemas elaborados de

comunicação intercelular para facilitar sua adaptação às mudanças das

condições ambientais (Whitehead et al., 2001).

Os microrganismos são constantemente sujeitos a diversos estímulos

ambientais. Tais estímulos englobam alterações de temperatura, osmolaridade,

pH, disponibilidade de nutrientes, presença de substâncias químicas que

interferem em seu desenvolvimento e até mesmo a presença de outros

organismos. Desta forma, as bactérias têm desenvolvido ao longo de milhares

de anos de evolução mecanismos adaptativos em resposta à estas flutuações

do ambiente, bem como nas interações ecológicas com outras espécies, seja de

modo simbiótico ou até mesmo patogênico (Whitehead et al., 2001).

Recentemente, foi dado um passo importante na elucidação dos

mecanismos de percepção e resposta empregados pelas bactérias. Esta

linguagem apresenta a forma de sinais químicos secretados a partir das células

e que podem induzir diversas alterações na fisiologia bacteriana. Ao contrário

do que se imaginava, não se trata de um fenômeno raro: a auto-percepção

(“quorum sensing”) é um processo altamente difundido entre os mais diversos

gêneros de bactérias, mostrando sua habilidade em perceber e responder à

presença de populações microbianas vizinhas (Whitehead et al., 2001).

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O processo quorum-sensing se baseia na produção de uma substância

sinalizadora de baixa massa molecular, cuja concentração extracelular está

relacionada com a densidade populacional do microrganismo que a produziu.

A substância sinalizadora pode ser detectada pelas células e isto permite a

população como um todo iniciar uma ação coordenada, uma vez atingida uma

densidade populacional crítica. Isto pode ser de vital importância, por

exemplo, em infestações patogênicas, onde a produção de fatores de virulência

prematuramente (em baixas densidades celulares) pode alertar os sistemas de

defesa do hospedeiro (Fast, 2003).

Diversas classes químicas de substâncias sinalizadoras foram

identificadas em bactérias. De forma geral, elas podem ser divididas nas

seguintes categorias: (1) aminoácidos e peptídeos de baixa massa molecular,

empregados principalmente em bactérias Gram-positivas e (2) derivados de

ácidos graxos, freqüentemente utilizados por bactérias Gram-negativas

(Whitehead et al., 2001).

Dentre as bactérias Gram-negativas, as substâncias sinalizadoras melhor

caracterizadas são as acil-homosserina lactonas (acil-HSLs). A estrutura

genérica destes metabólitos é uma lactona (porção homosserina) ligada à uma

cadeia acila saturada ou insaturada, que pode conter substituintes (carbonila

ou hidroxila na posição 3) (Figura 1).

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(CH2)n NH

O

O

O

(CH2)n NH

O

O

O

O

(CH2)n NH

O

O

O

OH(CH2)n

(CH2)n NH

O

O

O

(CH2)n(CH2)n NH

O

O

O

O(CH2)n

(CH2)n NH

O

O

O

OH

Figura 1. Acil-homosserina lactonas. Substituições na cadeia acila, como

carbonila ou hidroxila na posição 3, além de insaturações, são comuns.

O primeiro relato de controle da expressão fenotípica por acil-HSLs foi

reportado na bactéria Vibrio fischeri (Eberhard et al., 1981). Quando esta

bactéria se desenvolve livremente na água do mar, não se observa a formação

de luz (bioluminescência). No entanto, quando crescida até altas

concentrações celulares, V. fischeri produz bioluminescência com luz azul-

esverdeada. Normalmente, este microrganismo é encontrado em interações

simbióticas com peixes e moluscos, especialmente com a espécie Euprymna

scolopes (Figura 2).

Euprymna scolopes é um pequeno molusco que habita as águas rasas

dos recifes de corais no arquipélago havaiano. Trata-se de um predador de

hábitos noturnos, que se beneficia do fenômeno de bioluminescência gerada

pela bactéria V. fischeri para confundir suas presas. O animal possui um órgão

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específico onde a bactéria se desenvolve até altas concentrações celulares, o

que leva à formação de luz. A bactéria se beneficia na relação simbionte, uma

vez que recebe do molusco nutrientes que propiciam o seu desenvolvimento

(Graft e Ruby, 1998).

A geração de bioluminescência pela espécie V. fischeri ocorre através

da ação de uma enzima denominada luciferase, que catalisa a reação de

oxidação de aldeídos via flavina mononucleotídeo reduzida (FMNH2)

(Hastings, 1978). Os produtos são principalmente ácidos graxos de cadeia

longa, água e um excesso de energia livre que é emitida ao meio sob a forma

luminosa, conforme a equação abaixo:

O2 + RCHO + FMNH2 Luciferase

RCOOH + FMN + H2O + hv

Tanto a síntese quanto a atividade da luciferase podem ser ativadas ou

desativadas pela bactéria através da secreção de um sinalizador, que induz a

síntese de luciferase quando sua concentração atinge um determinado valor

crítico. Inicialmente, a identificação química deste sinalizador foi dificultada

pela baixa concentração presente e pela complexidade do meio de cultivo

empregado para o crescimento da bactéria. Assim, o isolamento do metabólito

tornou-se possível com a utilização de um grande volume de meio de cultivo

(6 litros) e com o uso de uma cepa super-produtora de luminescência que

conseqüentemente forneceu uma maior concentração da substância

sinalizadora (Vibrio fischeri MJ-1). A purificação bioguiada (por testes de

bioluminescência com cepas mutantes) levou à elucidação estrutural desta

substância, cuja análise de dados espectroscópicos (RMN de 1H,

espectroscopia no infravermelho e espectrometria de massas) conduziram à N-

(3-oxo-hexanoil)-homosserina lactona (Figura 3), cuja ocorrência foi

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confirmada pela comparação de seus dados espectroscópicos com um padrão

sintético (Eberhard et al., 1981).

Figura 2. Espécie hawaiana de molusco (Euprymna scolopes) com a qual a

bactéria V. fischeri interage simbioticamente. À direita observa-se na

penumbra uma bioluminescência azulada no animal.1

NH

O

O

O

O

NH

O

O

O

N-(3-oxo-hexanoil)-HSL N-octanoil-HSL

Figura 3. Substâncias de comunicação bacteriana produzidas por V. fischeri.

1 Imagens retiradas de http://radio.weblogs.com/0105910/images/bobtailsquid.jpg e

http://digilander.libero.it/atreliu/relazioni/images/fotobatteri/Euprimnya. Acesso em 17 de novembro de 2004.

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1.1.1. Quorum-sensing: Um mecanismo de regulação da expressão gênica

A utilização de processos comunicativos mediados por acil-HSLs

permite à espécie V. fischeri regular a expressão de um fator fenotípico

(bioluminescência) muito importante em suas relações ecológicas e para a

sobrevivência da espécie. Estudos mostraram que o processo de comunicação

bacteriana é, ao nível molecular, um mecanismo de regulação da expressão

gênica.

Um genoma bacteriano típico contém aproximadamente 4000 genes.

Porém, apenas uma fração destes genes é expressa num dado momento no

ciclo de vida celular. Alguns produtos gênicos têm funções que demandam sua

presença em quantidades muito grandes. Por exemplo, a síntese de enzimas

relacionadas com as vias metabólicas centrais (como o ciclo de Krebs) é

extremamente ativa em todo o período de desenvolvimento bacteriano e os

genes que codificam estas proteínas possuem uma alta taxa de transcrição.

Estes genes são freqüentemente referidos como genes da economia

doméstica. A expressão gênica constante é denominada constitutiva

(Lehninger et al. 1995).

Outros genes, porém, são transcritos com pequena freqüência, como por

exemplo aqueles que codificam a síntese de enzimas que reparam lesões raras

no DNA. Produtos gênicos, que aumentam sua concentração sob

circunstâncias moleculares prescritas, são referidos como induzíveis e o

processo de aumento da expressão do gene é chamado de indução.

Contrariamente, os produtos gênicos que diminuem sua concentração em

resposta a um sinal molecular são referidos como reprimíveis e o decréscimo

na expressão gênica é chamado de repressão (Lehninger et al. 1995).

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15

As necessidades para um certo produto gênico podem também se alterar

com o tempo. A necessidade das enzimas em certas vias metabólicas pode

crescer ou diminuir, à medida que as fontes de alimentos se alteram ou se

esgotam. Portanto, é extremamente importante para o desenvolvimento

bacteriano regular quais genes serão expressos e fazer com que estes sejam

expressos no momento certo (Lehninger et al. 1995).

A regulação da expressão gênica é um componente crítico na regulação

do metabolismo celular. Dado o alto custo da síntese de proteínas, a regulação

da expressão gênica é essencial para a célula fazer o melhor uso da energia

disponível (Lehninger et al. 1995).

Regular a concentração de uma proteína celular envolve um equilíbrio

concatenado de muitos processos. Há pelo menos seis pontos potenciais onde

a quantidade de proteína pode ser regulada:

1. A síntese do transcrito primário de mRNA;

2. O processamento pós-transcrição do mRNA;

3. A degradação do mRNA;

4. A síntese protéica (tradução);

5. Modificações na proteína após a tradução e

6. Degradação da proteína.

A concentração de uma determinada proteína é controlada por

mecanismos reguladores em qualquer um ou em todos estes pontos. Porém, de

todos estes pontos, a regulação ao nível da iniciação da transcrição é a melhor

documentada e a mais comum. Isto pela simples razão de ser o primeiro passo

da via. Desta forma, biossínteses desnecessárias podem ser interrompidas no

início, sem que ocorra um gasto energético elevado.

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A transcrição é efetuada por uma enzima denominada RNA polimerase.

A RNA polimerase liga-se ao DNA e inicia a transcrição em sítios específicos,

chamados de promotores. Os promotores se localizam muito próximos da

posição onde a síntese do RNA começa a partir do DNA molde. O início da

transcrição é regulado pela interação da RNA polimerase com o seu promotor.

A transcrição nos promotores de muitos genes que não caem na categoria da

econômica doméstica é regulada por sinais moleculares e seus respectivos

complexos formados com proteínas reguladoras (Lehninger et al. 1995).

Pelo menos três tipos de proteínas regulam o início da transcrição pela

RNA polimerase:

1. Fatores de especificidade alteram a especificidade da RNA polimerase

para um certo promotor ou conjunto de promotores.

2. Repressores ligam-se a um promotor, bloqueando o acesso da RNA

polimerase ao promotor.

3. Ativadores ligam-se próximos de um promotor, aumentando as

interações RNA polimerase-promotor.

Nos mecanismos de comunicação bacteriana mediados por acil-HSLs,

as proteínas repressoras e ativadoras são as classes mais importantes de

proteínas reguladoras.

Os repressores ligam-se a sítios específicos no DNA. Nos procariotos os

sítios de ligação para os repressores são denominados operadores. Sítios

operadores estão geralmente próximos e freqüentemente se sobrepõem ao

promotor, de forma tal que a ligação da RNA polimerase, ou a sua

movimentação ao longo do DNA após a sua ligação, seja bloqueada toda vez

que o repressor esteja presente. A regulação por meio de uma proteína

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repressora que se liga ao DNA e bloqueia a transcrição é referida como

regulação negativa. A ligação do repressor é regulada por um sinal

molecular, usualmente uma pequena molécula específica que se liga e induz

uma alteração conformacional no repressor. A interação entre o repressor e a

molécula sinal pode levar tanto a um aumento quanto a uma diminuição na

transcrição. Em alguns casos a alteração conformacional resulta na

dissociação de um repressor ligado ao operador no DNA. A iniciação da

transcrição pode, então, prosseguir sem interrupções. Em outros casos a

interação entre um repressor inativo e a molécula sinal força o repressor se

ligar ao operador, impossibilitando a transcrição (Figura 4) (Lehninger et al.

1995).

Os ativadores fornecem um contraponto molecular aos repressores. A

regulação mediada por um ativador é chamada de regulação positiva.

Ativadores ligam-se a sítios adjacentes a um promotor e aumentam a ligação e

a atividade da RNA polimerase naquele promotor. Os sítios de ligação para os

ativadores são freqüentemente encontrados próximos aos promotores. A

transcrição nestes genes é praticamente negligenciável na ausência do

ativador. Algumas vezes, o ativador está ligado normalmente ao DNA e

dissocia-se quando se liga à molécula sinal, freqüentemente uma molécula

pequena específica ou uma outra proteína. Quando ligada ao DNA, a proteína

ativadora facilita a ligação da RNA polimerase e aumenta a velocidade da

iniciação da transcrição. Em outros casos o ativador não se liga ao DNA até

que ele também se ligue a uma molécula sinal (Figura 5) (Lehninger et al.

1995).

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a. b.

Figura 4. Mecanismos de regulação negativa. a. Sinal molecular promove a

saída do repressor do sítio operador e início da transcrição. b. Sinal

molecular promove a ligação do repressor no sítio operador, impedindo a

transcrição (Lehninger et al. 1995).

a. b.

Figura 5. Mecanismos de regulação positiva. a. Sinal molecular promove a

saída do ativador do seu sítio de ligação, reprimindo a transcrição. b. Sinal

molecular promove a ligação do ativador no seu sítio de ligação, estimulando

a transcrição (Lehninger et al. 1995).

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As bactérias possuem um mecanismo geral simples para a coordenação

da regulação de genes cujos produtos estão envolvidos em processos

relacionados, como por exemplo a expressão de um fator fenotípico. Este

mecanismo se baseia no agrupamento de genes em seqüência no cromossomo,

o que leva a sua transcrição conjunta, gerando um mRNA que contém as

seqüências transcritas de múltiplos genes. Estes mRNAs são denominados

policistrônicos. O promotor único requerido para iniciar a transcrição do

agrupamento é o único ponto onde a expressão dos genes é regulada. O

agrupamento dos genes, o promotor e as seqüências adicionais que funcionam

na regulação são chamados no seu conjunto de um operon. São comuns

operons que incluam de 2 a 6 genes transcritos como uma unidade; alguns

operons contêm 20 genes ou mais (Lehninger et al. 1995; Berg et al., 2002).

Figura 6. Um operon. Os genes A, B e C são transcritos num mRNA único

(policistrônico). Seqüências reguladoras típicas incluem os sítios de ligação

para proteínas que ou ativam ou reprimem a transcrição a partir do promotor

(Lehninger et al., 1995).

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1.1.1.1. Mecanismo de regulação da expressão de bioluminescência em V.

fischeri

Ao nível molecular, a atuação das acil-HSLs em V. fischeri pode ser

explicada da seguinte maneira: inicialmente, um gene luxI codifica uma

enzima LuxI responsável pela síntese de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL; à medida

que a concentração desta substância atinge níveis superiores, ela passa a

interagir com o receptor LuxR (codificado inicialmente por um gene luxR). O

complexo (acil-HSL)-LuxR passa a controlar através de um mecanismo de

regulação positiva (Figura 5, b) a transcrição dos genes luxA e luxB, que

codificam a síntese das duas subunidades da enzima luciferase. Além disso,

outros genes (luxC e luxE, que codificam a síntese de um complexo

multienzimático responsável pela síntese do substrato aldeído e luxG, que

provavelmente codifica a síntese de uma flavina redutase) também estão sob o

controle do receptor LuxR. Além de iniciar a síntese de luciferase, a

substância sinalizadora N-(3-oxo-hexanoil)-HSL também induz sua auto-

produção, de maneira progressiva (Figura 7). Portanto, em V. fischeri os genes

envolvidos na expressão de bioluminescência estão reunidos num operon, o

luxICDABEG. Observações têm mostrado que a concentração crítica de N-(3-

oxo-hexanoil)-HSL necessária para o início da produção de bioluminescência

está na ordem de nanomolares (Eberhard et al, 1981; Engebrecht e Silverman,

1984).

Os avanços nos estudos de quorum-sensing em V. fischeri mostraram

ainda a ocorrência de uma segunda molécula sinalizadora, a N-octanoil-HSL

(Figura 3) (Kuo et al, 1994). A descoberta desta molécula permitiu reconhecer

uma segunda forma de interação com o receptor LuxR: acredita-se que, em

baixas densidades celulares, a substância N-octanoil-HSL compete com a N-

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(3-oxo-hexanoil)-HSL pelo receptor LuxR, reduzindo a ativação deste

receptor e assim prevenindo a emissão de bioluminescência prematura. A

substância N-octanoil-HSL é sintetizada por uma proteína AinS, que é

codificada por um gene ainS que não possui identidade com luxI. Acredita-se

que AinS constitua, portanto, uma nova classe de proteínas sintetizadoras de

acil-HSL. Este fenômeno de modulação da bioluminescência mostrou que a

própria bactéria interfere quimicamente no processo coordenado pela N-(3-

oxo-hexanoil)-HSL (Hanzelka et al, 1999; Gilson et al., 1995).

Figura 7. Modo de ação da N-(3-oxo-hexanoil)-HSL em V. fischeri. a. em

baixas densidades celulares, a transcrição dos genes para bioluminescência

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(luxICDABEG) é fraca e insuficiente para emissão de luz, devido aos baixos

níveis de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL. b. em altas densidades celulares, uma

concentração crítica da substância sinalizadora é alcançada; ela se liga ao

receptor LuxR e estimula a transcrição de luxICDABEG, levando à emissão

de luz (Whitehead et al., 2001).

A produção da substância sinalizadora N-(3-oxo-hexanoil)-HSL é

diretamente proporcional ao número de indivíduos numa população de V.

fischeri. Assim, o operon luxICDABEG só será expresso quando uma

concentração adequada da substância sinalizadora estiver presente, o que é

definido pela constante de complexação entre a substância sinalizadora e a

proteína receptora LuxR. Isto garante que a expressão da bioluminescência só

ocorrerá em altas concentrações celulares, o que se reflete diretamente numa

maior intensidade da luz emitida. Isto evita que a energia celular seja gasta

expressando luminescência em baixas densidades celulares, onde a

intensidade luminosa seria pequena e inadequada (Whitehead et al., 2001).

1.1.2. Quorum sensing no gênero Erwinia

O gênero Erwinia é constituído por bactérias Gram-negativas que atuam

como fitopatógenos. A doença da “podridão mole” causada por estes

patógenos, que atinge uma grande diversidade de hospedeiros, é caracterizada

por uma degradação extensiva dos tecidos através de enzimas que são

fundamentais para a sobrevivência dos fitopatógenos (Pirhonen et al., 1993).

A importância das exoenzimas é demonstrada pela grande variedade

enzimática encontrada, por exemplo, na espécie E. carotovora subsp.

carotovora (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum). As enzimas

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degradadoras incluem pectato liase (Pel), pectina liase (Pnl), poligalacturonase

(Peh), celulase (Cel) e proteases (Prt) (Py et al., 1998; Thomson et al., 1999).

Em E. carotovora, a produção de enzimas degradadoras da parede

celular das plantas é um processo regulado e que depende de estímulos tanto

metabólicos quanto ambientais. Além disso, esta espécie produz um

antibiótico β-lactâmico, carbapenem (ácido 1-carbapen-2-en-3-carboxílico,

Figura 8), caracterizado por uma potente atividade antibacteriana, além de ser

capaz de inibir a ação de β-lactamases. Este antibiótico constitui também um

dos fatores de virulência desta espécie (Axelrood et al., 1988).

O controle da produção de carbapenem está condicionado à presença de

um sinalizador, a N-(3-oxo-hexanoil)-HSL. Este metabólito foi isolado a

partir de culturas de E. carotovora, e identificado com base em dados de

espectrometria de massas e espectroscopia de ressonância magnética nuclear

de hidrogênio. A comparação dos dados espectroscópicos do produto natural

com os do produto sintético confirmou a estrutura da substância. Além disso, a

síntese dos enantiômeros (R) e (S) permitiu comparar os dados de

espectroscopia de dicroísmo circular com o produto natural, indicando que

este se tratava do enantiômero (S) (Bainton et al., 1992). O estudo de diversas

cepas mutantes não produtoras de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL demonstrou a

correlação entre sua concentração crítica no meio e a síntese de carbapenem,

mostrando ainda que o enantiômero (S) era muito mais eficiente na ativação

da síntese do antibiótico que o enantiômero (R) (Chhabra et al., 1993).

Testes biológicos em tubérculos de batata mostraram ainda que cepas

mutantes de E. carotovora, incapazes de produzir a N-(3-oxo-hexanoil)-HSL,

não colonizavam com sucesso os tecidos da planta. Porém, a administração

externa da substância sintética N-(3-oxo-hexanoil)-HSL propiciava a ativação

da síntese de exoenzimas e conseqüentemente a virulência da cepa. Assim, o

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24

acúmulo deste metabólito no meio também induz a produção de enzimas

degradadoras (Figura 9) (Jones et al., 1993).

NO

COOH

ácido (5R)-carbapen-2-en-3-carboxílico

Figura 8. O antibiótico ácido (5R)-carbapen-2-en-3-carboxílico é produzido

em E. carotovora sob controle do sinalizador N-(3-oxo-hexanoil)-HSL.

Figura 9. Avaliação da atividade biológica de cepas de E. carotovora em

batata. a. Cepa selvagem E. carotovora subsp. carotovora SCRI193,

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mostrando necrose dos tecidos vegetais. b. Cepa mutante Rex-, incapaz de

produzir a N-(3-oxo-hexanoil)-HSL, com atividade patogênica reduzida. c.

Restauração da virulência da cepa Rex- mediante co-inoculação com o

produto sintético N-(3-oxo-hexanoil)-HSL. d. Branco com o produto sintético

N-(3-oxo-hexanoil)-HSL (Bainton et al., 1992).

Metabólitos secundários produzidos por plantas podem influenciar na

comunicação bacteriana em Erwinia carotovora. Demonstrou-se que

furanonas halogenadas produzidas pela alga marinha Delisea pulchra são

capazes de antagonizar a ação da N-(3-oxo-hexanoil)-HSL, inibindo a

produção de enzimas e antibiótico carbapenem (Figura 10) (Manefield et al.,

2001).

OH

O

O

Br BrH

Figura 10. Furanona halogenada produzida por D. pulchra, capaz de inibir o

processo de comunicação bacteriana em E. carotovora.

Outra bactéria importante sob o ponto de vista econômico é a Erwinia

stewartii. Esta espécie é responsável pela doença da murcha bacteriana do

milho (conhecida como “Stewart’s wilt”). Nesta bactéria, identificou-se nos

seus caldos de crescimento a mesma substância sinalizadora produzida por E.

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carotovora, a N-(3-oxo-hexanoil)-HSL. Demonstrou-se ainda que esta

substância é responsável pelo controle em quorum-sensing da biossíntese de

um polissacarídeo extracelular (EPS), um fator fenotípico responsável pela

proteção das células e que contribui para a virulência da espécie. Este EPS

forma uma barreira à volta da célula bacteriana, protegendo-a dos mecanismos

de defesa do hospedeiro. Além disso, o EPS obstrui a circulação de água pelo

sistema vascular do milho, causando necrose e murcha durante a fase

sistêmica da infecção. A avaliação da atividade biológica de necrose em folhas

de milho com cepas não produtoras de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL e EPS

demonstrou uma grande redução da virulência. Porém, o crescimento do

mutante não produtor de EPS na presença de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL

sintética propiciou a retomada da atividade biológica, sendo mais uma prova

da importância desta substância na patogenicidade de E. stewarti. (Figura 11)

(Beck von Bodman et al., 1995).

Erwinia chrysanthemi (Pectobacterium chrysanthemi) é uma bactéria

fitopatogênica que causa uma doença semelhante àquela produzida por E.

carotovora (podridão mole). Esta espécie se caracteriza por produzir uma

grande variedade de exoenzimas degradadoras, como celulases, proteases e

principalmente, pectato liases. O estudo químico dos caldos de cultivo desta

bactéria mostraram que ela produz três acil-homosserina lactonas: N-(3-oxo-

hexanoil)-HSL (identificada previamente em E. carotovora), N-hexanoil-HSL

e N-decanoil-HSL. Porém, demonstrou-se que nenhuma destas acil-

homosserina lactonas era capaz de controlar completamente a biossíntese de

pectinases. Apenas 2 tipos de pectinases, o que corresponde a 15 % das

enzimas deste tipo produzidas por esta espécie, se mostraram sob controle das

acil-HSLs (Nasser et al., 1998).

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Figura 11. Teste biológico de inoculação de diferentes cepas de E. stewartii

em folhas de milho. Cepa selvagem (DC283) produziu necrose clara no meio

da folha. Cepa ESVB51 esaI, incapaz de produzir N-(3-oxo-hexanoil)-HSL,

não produziu necrose. Cepa ESVB51 contendo plasmídeo pSVB2 (produtora

de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL) mostrou o sintoma da necrose. Cepa ESVB51

não produtora de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL porém suplementada com o

autoindutor sintético, mostrou forte atividade fitopatogênica (Beck von

Bodman et al., 1995).

A espécie Erwinia amylovora se caracteriza por produzir doenças em

plantas da família Rosaceae, especialmente em maçã e ervilha (Eastgate,

2000). Os principais fatores fenotípicos de virulência da espécie são proteínas

e exopolissacarídeos (Wei et al., 2000). Um estudo recente demonstrou que a

espécie E. amylovora também produz acil-HSLs. Entretanto, não foi possível

determinar a natureza química das substâncias sinalizadoras identificadas,

uma vez que apenas ensaios de cromatografia em camada delgada com

bioreveladores foram empregados. Foram relatadas ainda evidências de que

tecidos de ervilha infectados pela bactéria também apresentam acil-

homosserina lactonas, fornecendo indícios da presença de mecanismos de

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comunicação bacteriana durante a infecção do hospedeiro (Venturi et al.,

2004).

O estudo da espécie E. carotovora subsp. atrosepticum (Pectobacterium

atrosepticum) também mostrou evidências da produção de acil-HSLs através

de análises por CCD e biorevelação. A natureza química das acil-HSLs

detectadas não foi estabelecida. Estudos com mutantes também revelaram

menor patogenicidade contra folhas de tabaco e tubérculos de batata para

mutantes que apresentavam genes capazes de hidrolisar acil-HSLs, clonados a

partir da espécie Bacillus sp. A24 (Smadja et al., 2004).

Os exemplos mostrados acima mostram o quão importante é o sistema

quorum-sensing no gênero Erwinia, principalmente por controlar a ação de

genes que codificam fatores de virulência das espécies. Ainda, a produção de

substâncias pela alga D. pulchra com atividade antagonista à das acil-HSLs

abre possibilidades para interferências nos processos de comunicação

bacteriana. Assim, conhecer este sistema comunicativo pode fornecer

maneiras de controlar a ação destes fitopatógenos, o que representaria um

grande avanço no controle de pragas importantes na agricultura.

1.1.3. Erwinia psidii, um fitopatógeno da goiabeira

O Brasil é o maior produtor mundial de goiaba (Psidium guajava L.),

sendo a área ocupada com esta cultura de aproximadamente 11500 hectares.

Os principais estados produtores são Pernambuco e São Paulo, mas a cultura

também é explorada comercialmente de forma expressiva nos estados do Rio

Grande do Sul, Minas Gerais e Distrito Federal (Coelho et al., 2002).

Entre os fatores que limitam a produção de goiaba no país está a

ocorrência da bacteriose, também conhecida como seca dos ponteiros, causada

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por Erwinia psidii. Esta doença foi descrita em 1982 nos municípios de

Valinhos e Pindamonhangaba, estado de São Paulo (Neto et al., 1983).

Posteriormente, sua ocorrência foi relatada nos estados de Minas Gerais (Zona

da Mata) (Romeiro et al., 1994), Espírito Santo (Oliveira et al., 2000), no

Distrito Federal, no Paraná e em Goiás (Figura 12) (Neto et al., 1983).

Figura 12. Distribuição geográfica da seca dos ponteiros da goiaberia

(Erwinia psidii) (Coelho et al., 2002).

Embora a seca dos ponteiros da goiabeira esteja restrita a ramos jovens

da planta e aos frutos e não causar infecção sistêmica ou morte das plantas, a

doença tem provocado perdas elevadas na colheita e prejudicado

extensivamente a exploração comercial da fruta (Coelho et al., 2002).

Entre os principais sintomas da seca dos ponteiros, estão: 1. seca de

ramos e brotos, os quais murcham e adquirem coloração pardo-escura ou

negra; 2. amarelecimento e lesão em folhas, apresentando, muitas vezes,

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tecidos com aspecto encharcado próximo às nervuras; 3. necrose e

mumificação de flores e frutos imaturos (Figura 13) (Coelho et al., 2002).

Em geral, esta doença é introduzida nos pomares através de mudas

contaminadas. A bactéria pode ainda penetrar em aberturas naturais ou

ferimentos produzidos na planta, durante o processo de poda. Atualmente, não

existe uma medida efetiva para o controle da doença. Sabe-se apenas que a

poda ou colheita realizada em condições de alta umidade aumenta a sua

incidência (Coelho et al., 2002).

Além disso, testes biológicos mostraram que E. psidii é capaz de

infectar outras plantas como o araçá (Psidium cattleianum), jambo vermelho

(Eugenia jambolana) e melaleuca (Melaleuca viridiflora) (Neto et al., 1987).

A E. psidii é classificada como não-pectolítica. Esta cepa forma

colônias de coloração esbranquiçada em meios de cultura não seletivos. Trata-

se de uma bactéria dotada de flagelos e mobilidade. Dados bioquímicos de

concentração de GC (guanina-citosina) no DNA mostram uma alta

semelhança com as espécies E. tracheiphila (um fitopatógeno do pepino) e E.

rubrifaciens. Porém, testes bioquímicos permitiram distinguir claramente as

espécies (Neto et al., 1987).

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Figura 13. Sintomas do ataque de E. psidii em diferentes partes da goiabeira

(Coelho et al., 2002).

Tratando-se de um fitopatógeno de ocorrência exclusivamente

brasileira, a E. psidii apresenta-se como um excelente exemplo para as

pesquisas em química da comunicação bacteriana (quorum-sensing) no Brasil,

principalmente por levantar uma nova possibilidade de tratamento futuro para

a principal bacteriose da goiabeira.

A. Primórdio foliar da goiabeira infectado por E. psidii

B. Frutos jovens de goiaba enegrecidos pelo ataque de E.

psidii

C. Fruto maduro de goiaba enegrecido pelo ataque de E. psidii D. Ramo de goiabeira morto

pelo ataque de E. psidii

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1.1.4. Pantoea ananatis: um fitopatógeno de distribuição mundial

A espécie Pantoea ananatis (Erwinia ananas) foi inicialmente descrita

como um fitopatógeno do abacaxi (Serrano, 1928). Atualmente, um dos

principais focos de ocorrência da espécie são as plantações de cebola nos

Estados Unidos, no estado da Geórgia, onde tem causado sérias perdas

(Walcott et al., 2002). A espécie também foi relatada como fitopatogênica ao

arroz na Austrália, ao eucalipto na África do Sul (Figura 14) e à forrageira

Sorghum sudanense no estado da Califórnia, Estados Unidos (Cother et al.,

2004; Coutinho et al., 2002; Azad et al., 2000).

Figura 14. Pantoea ananatis atacando mudas jovens de eucalipto na África do

Sul (Coutinho et al., 2002).

1.1.5. Pantoea agglomerans isolada da doença da “pinta branca do milho”

No início da década de 1980, descreveu-se no Brasil a ocorrência de

uma doença foliar no milho que foi inicialmente atribuída ao fungo

Phaeosphaeria maydis (Fantin, 1994). A incidência e severidade da doença

aumentaram no país ao decorrer da década seguinte e hoje em dia é

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encontrada em praticamente todas as regiões produtoras de milho no país

(Fernandes e Oliveira, 1997). A doença em condições favoráveis pode levar à

senescência das folhas, um ciclo vegetativo reduzido e perdas na produção dos

grãos. Em cultivares suscetíveis, as perdas podem chegar a 63 % no

rendimento dos grãos (Pinto, 1995). Os sintomas iniciais da doença são lesões

aquosas que evoluem para um estado necrótico (Figura 15). O número e

tamanho das lesões varia de acordo com a variedade de milho. A severidade

da doença aumenta em condições de alta umidade e temperaturas amenas,

principalmente quando há um forte decréscimo na temperatura ambiente após

as chuvas, o que é comum durante o cultivo de milho no Brasil (Paccola-

Meirelles et al., 2001).

Inicialmente, a doença foi atribuída ao fungo P. maydis. Diversas

controvérsias existiam a respeito do agente causador, uma vez que nos

estágios iniciais de desenvolvimento da doença não eram observadas

estruturas típicas de fungos. Estudos mostraram que uma bactéria era

responsável pela colonização inicial dos tecidos do milho. As lesões eram, em

seguida, invadidas pelo fungo. Uma das cepas foi identificada como Pantoea

ananatis (Paccola-Meirelles et al., 2001).

Numa colaboração do nosso grupo de pesquisas com a Profa. Luzia

Doreto Paccola-Meirelles, da Universidade Estadual de Londrina, Paraná,

identificou-se uma segunda espécie a partir de lesões em folhas de milho. Esta

espécie foi identificada como Pantoea agglomerans, que é filogeneticamente

muito próxima à P. ananatis.

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Figura 15. Doença da pinta branca do milho. Fotos: Dra. L. D. Paccola-

Meirelles.

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1.2. Objetivos

O objetivo deste capítulo é caracterizar quimicamente as acil-homosserina lactonas

produzidas pelas bactérias fitopatogênicas E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans,

incluindo sínteses, determinações de configurações absolutas e avaliações de atividades

biológicas.

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1.3. Resultados e discussão – A química da comunicação bacteriana

As pesquisas relacionadas aos mecanismos de comunicação bacteriana

se desenvolveram muito nos últimos anos graças aos avanços na área de

biologia molecular e nas técnicas analíticas em micro-escala.

Sob o ponto de vista ecológico, estes mecanismos comunicativos são

interessantes pois denotam a capacidade destes microrganismos em realizar

ações de modo coordenado, atuando como verdadeiros organismos coloniais.

Apesar das pesquisas terem se desenvolvido em sua maior parte in vitro,

evidências sugerem que os mecanismos comunicativos são de extrema

importância para as bactérias durante suas interações com outros

microrganismos, na disputa pelo nicho ecológico. Ainda, acredita-se que a

expressão coordenada de fatores fenotípicos constitua um fator evolutivo

importante durante as interações entre as bactérias e seus hospedeiros, seja de

modo simbionte ou até mesmo patogênico (Middleton et al., 2002; Brelles-

Mariño et al., 2001).

O estudo dos mecanismos comunicativos utilizados por bactérias não se

restringe apenas ao enfoque ecológico. Está sendo reconhecido que estes

mecanismos podem constituir uma maneira interessante de combater

bacterioses, ou ainda estimular o metabolismo bacteriano no sentido de

otimizar a produção de algum metabólito ou enzima de interesse. Estas

potenciais aplicações biotecnológicas têm sido cada vez mais evidentes com

os avanços nas pesquisas na área (Robson et al., 1997).

Em vista da importância do assunto, decidiu-se estudar três

fitopatógenos brasileiros (Erwinia psidii, Pantoea ananatis e Pantoea

agglomerans) quanto à produção de substâncias da classe das acil-

homosserina lactonas, notoriamente os metabólitos mais empregados por

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bactérias Gram-negativas em processos de sinalização intercelular. Em alguns

casos, estes fitopatógenos constituem um fator crítico nos cultivares agrícolas

em que se estabelecem, levando a perdas econômicas expressivas em

determinadas condições.

1.3.1. Testes biológicos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens

NTL4(pZLR4)

Uma consulta na literatura disponível sobre a produção de feromônios

por bactérias revelou que, normalmente, estes microrganismos produzem

apenas pequenas quantidades de substâncias sinalizadoras. Este fato é

atenuado nos casos de microrganismos selvagens (Eberhard et al., 1981).

Cientes da problemática envolvida na investigação de compostos

produzidos em quantidades traços considerou-se apropriado estabelecer um

teste muito sensível e visual que indicasse a presença das acil-HSLs em

organismos não estudados anteriormente. Uma avaliação da literatura

disponível sobre o assunto indicou que o teste de expressão de enzimas β-

galactosidase com cepas mutantes de Agrobacterium tumefaciens é

normalmente utilizado para detectar a presença destes compostos, de maneira

rápida e simples. Entre diversos biossensores construídos para esta finalidade,

o mutante A. tumefaciens NTL4(pZLR4) apresenta-se como um dos que

apresentam a maior faixa de sensibilidade para acil-HSLs com diferentes

comprimentos de cadeia acila e substituintes do tipo oxo e hidroxi (Cha et al.,

1998).

A espécie A. tumefaciens selvagem produz a N-(3-oxo-octanoil)-HSL,

que coordena a expressão de fatores de virulência deste fitopatógeno (Zhang

et al., 1993; Pierson III et al., 1998). O mutante NTL4(pZLR4) é incapaz de

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produzir a substância sinalizadora pela supressão do gene que codifica a

enzima TraI. Além disso, esta cepa recebeu um plasmídeo pTiC58 que contém

uma fusão traG::lacZ e o gene traR. Assim, o gene traR codifica a síntese da

proteína receptora TraR, que é capaz de se complexar à acil-HSLs exógenas.

O complexo assim formado [TraR-(acil-HSL)] regula positivamente a

expressão do gene lacZ, responsável pela síntese de uma enzima β-

galactosidase capaz de degradar o reagente 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-

galactopiranosídeo (X-Gal). Assim, observa-se uma coloração azul no meio

caso exista alguma acil-HSL em concentração suficiente para ativar o

biossensor (Figuras 16 e 17) (Ravn et al., 2001; Cha et al., 1998).

Figura 16. Mecanismo de atuação do biossensor A. tumefaciens

NTL4(pZLR4).

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39

NH

Cl

BrOO

CH2OH

OH

OH

OH

Galactosidase2NH

Cl

BrOH

Galactose

2

NH

NHBr

Cl O

O Cl

Br

Coloração azul

X-Gal

Figura 17. Reação de degradação do reagente X-Gal e formação do derivado

de índigo de coloração azul por ação da enzima β-galactosidase (Berg et al.,

2002).

Inicialmente, foram realizados bioensaios com as cepas E. psidii e P.

ananatis in vivo, através do co-cultivo destas bactérias com o biossensor A.

tumefaciens NTL4(pZLR4), na presença de X-Gal, em tubos de ensaio. Como

controle positivo, utilizou-se o co-cultivo com a espécie Pseudomonas

aeruginosa, que reconhecidamente produz acil-HSLs (Pearson et al., 1994;

Pearson et al., 1995). O ensaio in vivo é interessante uma vez que permite uma

visualização do processo comunicativo de maneira mais próxima à realidade,

isto é, células vivas que produzem metabólitos que incitam fatores fenotípicos

em células vizinhas.

O teste biológico mostrou uma atividade positiva para ambas espécies

E. psidii e P. ananatis. O teste branco feito com o cultivo da espécie E. psidii

na presença de X-Gal não mostrou qualquer atividade, fornecendo portanto

indícios de que o biossensor foi ativado por substâncias produzidas pela

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bactéria. Porém, o branco feito com a espécie P. ananatis apresentou atividade

biológica positiva. Isto foi justificado pelo fato da espécie P. ananatis

produzir enzimas β-galactosidase constitutivamente, que degradam o reagente

X-Gal mesmo na ausência do biossensor (Figura 18) (Paccola-Meirelles et al.,

2001).

Para evitar que enzimas produzidas pelas bactérias pudessem

influenciar nos resultados obtidos nos ensaios biológicos, os testes foram em

seguida realizados com extratos obtidos a partir dos cultivos das bactérias.

Estes extratos foram previamente cromatografados em coluna de sílica gel

filtrante, para garantir um enriquecimento em metabólitos secundários na

fração acetato de etila e remover quaisquer enzimas ou polímeros biológicos.

Um fato que deve ser levado em consideração é a complexidade do

meio de cultivo empregado para o desenvolvimento das bactérias. Poder-se-ia

supor que os metabólitos que ativam o biossensor nos testes biológicos são

provenientes do meio e não do metabolismo bacteriano. Portanto, realizou-se

também um ensaio biológico com extrato proveniente do meio de cultivo

caldo nutriente (NB), obtido nas mesmas condições.

Os testes biológicos mostraram que os extratos provenientes de todos os

microrganismos eram capazes de ativar o biossensor A. tumefaciens

NTL4(pZLR4), o que foi observado pelo desenvolvimento de uma coloração

verde-azulada nos respectivos ensaios. Não foram observadas atividades

biológicas em testes realizados com o extrato do meio de cultivo caldo

nutriente. As atividades biológicas positivas são indicativas da possível

produção de substâncias da classe das acil-HSLs pelas bactérias, o que

estimulou um estudo químico mais aprofundado (Figura 18). Destacamos

ainda que o protocolo de uso de tubos de ensaio neste tipo de teste biológico é

inédito na litetatura.

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Figura 18. Avaliação da atividade biológica, em duplicata, de expressão de enzimas β-galactosidase com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4) na presença de X-Gal. Legenda:

Fig. Componentes Resultado a. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal A bactéria biossensora não produziu enzimas β-galactosidase na

ausência de acil-HSL, verificando-se ausência de coloração azul-esverdeada.

b. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Pseudomonas aeruginosa CCT 1987.

A bactéria P. aeruginosa produziu acil-HSL, ativando o biossensor.

c. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Erwinia psidii IBSBF 435T.

A bactéria E. psidii produziu acil-HSL, ativando o biossensor e gerando coloração.

d. Erwinia psidii IBSBF 435T + X-Gal A bactéria E. psidii não produz enzima β-galactosidase. e. P. aeruginosa CCT 1987 + X-Gal A bactéria P. aeruginosa não produziu enzima β-galactosidase. f. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + P.

ananatis CCT 6481T. A bactéria P. ananatis produz acil-HSL ativando o biossensor.*

g. P. ananatis CCT 6481T + X-Gal A bactéria P. ananatis produz enzima β-galactosidase, degradando o X-Gal e fornecendo um falso positivo (branco). A atividade na figura f. não pode ser atribuída à ativação do biossensor por acil-

HSL.* h. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal +

Extrato do meio de cultivo P. ananatis CCT 6481T

O extrato livre de enzimas ativou o biossensor, o que é atribuído à produção de acil-HSLs pela bactéria P. ananatis CCT 6481T.

i. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Fração FRA43, proveniente do cultivo de P.

ananatis CCT 6481T.

Uma das frações purificadas do cultivo de P. ananatis CCT 6481T onde foram identificadas acil-HSLs por CG-EM apresentou

atividade positiva. j. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal +

Extrato do meio de cultivo caldo nutriente (NB).

O extrato do meio de cultivo caldo nutriente não ativou o biossensor. Logo, o meio de cultivo não contém acil-HSLs.

k. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Extrato do meio de cultivo E. psidii IBSBF

435T

O extrato livre de enzimas ativou o biossensor, o que é atribuído à produção de acil-HSLs pela bactéria E. psidii IBSBF 435T.

l. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Fração FRA33-35, proveniente do cultivo de

E. psidii IBSBF 435T.

Uma das frações purificadas do cultivo de E. psidii IBSBF 435T onde foram identificadas AHSL por CG-EM apresentou atividade

positiva. m. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal +

Fração acetato de etila proveniente do cultivo de Pantoea agglomerans 732.

O extrato livre de enzimas ativou o biossensor, o que é atribuído à produção de acil-HSLs pela bactéria P. agglomerans 732.

a. b. c. d. e.

f. g. h. i. j. k. l.

j. k. m.

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________________________CAPÍTULO 1 – A QUÍMICA DA COMUNICAÇÃO BACTERIANA

42

1.3.2. Caracterização química das acil-HSLs produzidas por E. psidii, P.

ananatis e P. agglomerans

Normalmente, o estudo químico de substâncias sinalizadoras requer um

grande volume de meio de cultivo, dada a baixa concentração destes

metabólitos. Além disso, a complexidade do meio de cultivo também é um

fator restritivo, sendo necessário aplicar metodologias de enriquecimento de

amostras contendo os metabólitos de interesse. Desta forma, as bactérias E.

psidii, P. ananatis e P. agglomerans foram cultivadas em l litro de meio caldo

nutriente, que foi em seguida centrifugado (evitando-se, portanto, a lise celular

e o possível aumento da complexidade do meio com substâncias

intracelulares) e extraído com acetato de etila. Este procedimento foi repetido

para as bactérias E. psidii e P. ananatis, totalizando-se 8 litros de meio de

cultivo.

Os extratos foram purificados através de cromatografia em coluna de

sílica gel com os solventes hexano, diclorometano e acetato de etila, em ordem

crescente de polaridade. As frações foram reunidas por semelhança em CCD e

analisadas por CG-EM, onde foram monitorados os sinais com padrões de

fragmentação característicos das acil-HSLs, como m/z 185, 143, 128, 102,

101, 100 e 85 (Figuras 19 e 20) (Chhabra et al., 1993). Em todas as bactérias

estudadas foram observados sinais em frações eluídas na polaridade

CH2Cl2:AcEt 4:1.

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43

m/z 85 m/z 100

O

ONH2

m/z 101

O

O

+NH3

m/z 102 m/z 128

O

ONH+O

O

O

O

HN

O+

NH

O

O

OH

NH

O

O

OOH

NH

O

O

OH

m/z 143

NH

O

O

OOH

NH

O

O

OO

m/z 185

H

Figura 19. Proposta de racionalização de alguns fragmentos característicos

das acil-HSLs por CG-EM (IE, 70 eV).

Na espécie E. psidii IBSBF 435T, dois sinais com padrões de

fragmentação (EM) característicos foram identificados na fração FRA33-35

(Figura 21). O sinal mais intenso apresentou um espectro de massas coerente

com o esperado para a N-hexanoil-HSL (1) (M.+ m/z 199) (Chhabra et al.,

1992). O pico base apresentou m/z 143, resultante do rearranjo de McLafferty

com a carbonila da cadeia acila. Os sinais m/z 156 (12 %) e 170 (5 %)

apresentaram um decréscimo na abundância relativa, característico de

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44

fragmentação em cadeia acila não substituída, com perdas de –CH2CH2CH3 e

–CH2CH3, respectivamente. Outros sinais característicos são m/z 125 (21 %)

(m/z 143 – H2O), m/z 128 (5 %) (fragmentação α a carbonila da cadeia acila),

m/z 100 (8 %) e suas formas protonadas m/z 101 (15 %) e 102 (12 %)

correspondentes ao fragmento homosserina lactona. Destaca-se ainda o sinal

m/z 99 (22 %), resultante da perda do grupo homosserina lactona (M+. –

C4H6NO2) (Figura 22).

Uma segunda substância foi identificada na fração FRA33-35 de E.

psidii, tratando-se da N-heptanoil-HSL (2) (Figura 21). Porém, este metabólito

apresentou-se em concentração extremamente baixa na fração (traço),

utilizando-se portanto o modo de detecção single ion monitoring (SIM) que

confere uma maior sensibilidade às análises por CG-EM. Basicamente, o

padrão de fragmentação observado é similar ao da N-hexanoil-HSL. Neste

caso, a perda do grupo homosserina lactona dá origem ao fragmento m/z 113

(15 %) (M+. - C4H6NO2) (Figura 22).

A análise por CG-EM das amostras obtidas do fracionamento do extrato

em acetato de etila do cultivo de P. ananatis CCT 6481T também levou à

identificação de acil-HSLs (Figura 23). Além da N-hexanoil-HSL (1)

(majoritária) e N-heptanoil-HSL (2) (minoritária), previamente identificadas

em E. psidii, foi observada a ocorrência de quantidade traço de N-octanoil-

HSL (3) na fração FRA35-38. Para esta substância, a perda do grupo

homosserina lactona dá origem ao fragmento m/z 127 (10 %) (M+. -

C4H6NO2). Esta substância também foi monitorada utilizando o modo SIM de

detecção (Figura 24).

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45

NH

O

O

O

m/z 99

m/z 170m/z 156

NH

O

O

O

m/z 113

m/z 184m/z 170

m/z 156

NH

O

O

O

m/z 127

m/z 184m/z 170

m/z 156

m/z 198

NH

O

O

O

m/z 71

(1) (2)

(3) (4)

Figura 20. Fragmentação característica de cada acil-HSL identificada nos

cultivos das bactérias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans.

Figura 21. Cromatograma de íons totais (CG-EM, IE, 70 eV) da fração

FRA33-35 (2,5 mg) de E. psidii. Condições de análise: coluna HP-5 (30 m,

0,25 mm, 0,25 μm), programa de temperaturas 100ºC-(10ºC/min)-290ºC-(10

min).

(1) (2)

(1) (2)

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46

Figura 22. Espectros de massas (IE, 70 EV) da (a) N-hexanoil-HSL (1) e (b)

N-heptanoil-HSL (2) (modo SIM), identificadas na fração FRA33-35

proveniente do cultivo de E. psidii.

Figura 23. Cromatograma de íons totais (CG-EM, IE, 70 eV) da fração

FRA35-38 (2,4 mg) de P. ananatis. Condições de análise: coluna HP-5 (30 m,

0,25 mm, 0,25 μm), programa de temperaturas 70ºC-(5ºC/min)-290ºC-(10

min).

(1)

(2)

(3)

N

O

H

O

O

N

O

H

O

O

a.

b.

(1)

(2)

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47

Figura 24. Espectro de massas (IE, 70 eV, SIM) da N-octanoil-HSL (3)

detectada na fração FRA35-38 proveniente do cultivo de P. ananatis.

Figura 25. Cromatograma de íons totais (CG-EM, IE, 70 eV) da fração

acetato de etila (26,4 mg) de P. agglomerans. Condições de análise: coluna

HP-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm), programa de temperaturas 100ºC-

(10ºC/min)-290ºC-(10 min).

(4)

N

O

H

O

O

(3)

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Figura 26. Espectro de massas (IE, 70 eV) da N-butanoil-HSL (4) detectada

na fração acetato de etila proveniente do cultivo da bactéria P. agglomerans.

Figura 27. Cromatograma (CG-EM) da fração FRA56-58 de P. agglomerans.

Condições de análise: coluna HP-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm), programa de

temperaturas 100ºC-(10ºC/min)-290ºC-(10 min).

A cepa P. agglomerans CBMAI 732 foi cultivada em 1 litro de meio

caldo nutriente, como descrito anteriormente. O extrato acetato de etila obtido

do sobrenadante centrifugado foi cromatografado em coluna flash de sílica-

gel. A análise em CG-EM da fração acetato de etila revelou a presença de um

sinal com padrão de fragmentação característico das acil-HSLs (Figura 25),

resultado que não havia sido obtido previamente com esta pequena quantidade

de extrato em modo SCAN com as cepas P. ananatis CCT 6481T e E. psidii

(1)

NH

OO

O(4)

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IBSBF 435T. O padrão de fragmentação em CG-EM sugeriu a ocorrência de

N-butanoil-HSL (4) nos caldos de cultivo desta cepa. Como fragmentos

característicos, além daqueles típicos em m/z 143, 102, 101 e 100, destacam-se

os fragmentos de m/z 171 (M+, 7 %) e de m/z 71 em alta intensidade (64 %),

resultante da perda do fragmento homosserina lactona (M+. - C4H6NO2)

(Figuras 26 e 27). A substância (4) foi posteriormente purificada por

cromatografia em coluna. Identificou-se ainda uma quantidade traço de N-

hexanoil-HSL (1), que foi detectada utilizando-se o modo SIM de detecção

(Figura 27).

1.3.3. Análise do branco para acil-homosserina lactonas por CG-EM

Devido à complexidade do meio de cultivo empregado para o

crescimento das bactérias, é extremamente importante averiguar se os

metabólitos identificados são provenientes do metabolismo bacteriano e não

do próprio meio de cultivo. Resultados prévios obtidos em bioensaios com o

repórter A. tumefaciens NTL4(pZLR4) mostraram que o extrato do meio de

cultivo caldo nutriente não era capaz de ativar a expressão de enzimas β-

galactosidase (Tópico 1.3.1). A confirmação química foi feita através da

análise dos extratos obtidos a partir de 1 L de cultivo de cada bactéria

utilizando-se a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas.

Utilizou-se o modo SIM de detecção, varrendo-se os íons característicos das

acil-HSLs majoritárias identificadas em cada espécie bacteriana. Os

resultados mostraram que as substâncias são provenientes do metabolismo

bacteriano (Figura 28).

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50

Figura 28. Análise por CG-EM (IE, 70 eV) dos extratos semi-purificados de a.

E. psidii; b. P. agglomerans; c. meio de cultivo caldo nutriente; d. P. ananatis.

As acil-HSLs majoritárias foram identificadas em todos os cultivos

provenientes das bactérias. Condições de análise: coluna HP-5 (30 m, 0,25

mm, 0,25 μm), programa de temperaturas 100ºC-(10ºC/min)-290ºC-(10 min).

1.3.4. Síntese de acil-homosserina lactonas

No estudo das bactérias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans, foram

detectadas pequenas quantidades de acil-HSLs, o que não permitiu na maior

parte dos casos isolar os metabólitos de interesse. Com isso, a confirmação da

ocorrência dos mesmos foi feita através da co-injeção em CG-EM dos

produtos naturais com produtos sintéticos, obtidos a partir da acilação do

bromidrato de α-amino-γ-butirolactona com os respectivos ácidos graxos, na

presença de um derivado de carbodiimida solúvel em água. O fato de todos os

reagentes serem solúveis em água facilitou o processo de purificação, que

consistiu apenas numa extração das acil-HSLs produzidas com solvente

orgânico (acetato de etila), seguida de extração ácido-base amena (Figura 29).

(1)

Ausente

(4)

(1)

a. b.

c. d.

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R O-

O N C N

N+

HCl-

+Et3N

H2OCl-

N C N

N+

H

H

O

O

R -O R

O

Et3N

Cl-

N C N

N+

H

O

HH+

R O R

O O

R O R

O O+ O

NH2

OEt3N

H2O O

NHOO

R+

HO R

O

Figura 29. Mecanismo de síntese de acil-HSLs (March, 1965).

Uma revisão bibliográfica mostrou a ausência de dados

espectroscópicos publicados para a N-heptanoil-HSL (2). O espectro de

infravermelho da substância (2) (Anexo E10) mostrou uma banda

característica de distensão axial de hidrogênio de amida monossubstituída em

3315,8 cm-1. As distensões axiais dos hidrogênios ligados a carbonos

alifáticos foram observadas mais intensamente em 2929,5 e 2858,8 cm-1. A

distensão axial de carbonila de lactona foi observada como uma banda

proeminente em 1776,7 cm-1 (νC=O); a banda apareceu em região de maior

energia do que o esperado para uma carbonila de éster convencional (~1720

cm-1), por fazer parte de um anel de cinco membros, tensionado. A banda

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52

correspondente à carbonila de amida da cadeia lateral foi observada em

1646,4 cm-1. São proeminentes ainda os sinais correspondentes às distensões

axiais da ligação C-O de éster, em 1173,6 e 1013,6 cm-1.

A análise do espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio

da substância (2) (Anexo E11) permitiu distinguir os sinais dos hidrogênios

diastereotópicos H-4 em δH 2,14 e 2,84. Os hidrogênios diastereotópicos H-5

apareceram em região mais desprotegida, em δH 4,28 e 4,47, por pertencerem

ao carbono ligado ao heteroátomo na porção lactona. O sinal do hidrogênio

ligado ao nitrogênio apareceu sob a forma de um dubleto largo, em δH 6,15.

A análise do espectro de ressonância magnética nuclear de carbono da

substância (2) (Anexo E 12) mostrou a presença de onze sinais. A

diferenciação dos sinais das carbonilas foi feita utilizando-se a técnica

bidimensional de correlações 1H, 13C a múltiplas ligações (gHMBC) (Anexo

E16). O sinal do carbono em δC 175,5 apresentou correlações a longa distância

com os hidrogênios em δH 2,84 (H-4), 4,47 (H-5) e 4,56 (H-3), sendo portanto

atribuído o sinal como o carbono carbonílico da porção lactona (C-2). O sinal

de carbono em δC 173,7 apresentou correlações a longa distância com os

hidrogênios δH 2,25 (H-2’) e 1,64 (H-3’), sendo portanto atribuído ao carbono

carbonílico da cadeia acila lateral (C-1’).

A diferenciação dos sinais dos carbonos metilênicos da cadeia acila C-

4’, C-5’e C-6’ foi inicialmente feita com o uso do espectro de ressonância

magnética nuclear bidimensional de correlações 1H, 13C a uma ligação

(HSQC) (Anexo E15). Os sinais de carbonos em δc 22,43; 28,83 e 31,44

apresentaram correlações a uma ligação com o multipleto de 6 hidrogênios em

δH 1,29. A diferenciação destes sinais foi feita com o auxílio do mapa de

correlações 1H, 13C a múltiplas ligações (gHMBC) (Anexo E16). O sinal de

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53

carbono em δC 22,43 apresentou correlação a longa distância com o sinal dos

hidrogênios da metila terminal em δH 0,88, sendo portanto este carbono

assinalado como C-6’. O sinal em δC 31,44 apresentou correlações com os

hidrogênios vicinais em δH 0,88 (H-7’), 1,29 (H-4’ e H-6’) e 1,64 (H-3’),

sendo portanto atribuído ao carbono C-5’. Finalmente, o sinal de metileno em

δC 28,83 apresentou correlações a longa distância com o sinal do H-3’ em δ

1,64 e com o sinal do metileno H-2’ em δ 2,25, e foi atribuído ao carbono C-

4’. Técnicas adicionais de ressonância magnética nuclear como DEPT 135 e

DEPT 90 (Anexo E13), além das correlações 1H, 1H 3J (gCOSY) (Anexo E14)

foram utilizadas nas assinalações de deslocamentos químicos para a

substância (2). Os resultados são mostrados na Tabela 1.

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54

NH

OO

O

43 2

15

1'2'

3'

4'

5'

6'

7'

Tabela 1. Assinalação dos deslocamentos químicos em RMN de 1H e 13C da N-heptanoil-

HSL (2) (CDCl3, TMS, 499,88 MHz para RMN de 1H e 125,71 MHz para RMN de 13C).

No. δC δH (1H, 1H 3J) gCOSY

(1H, 13C nJ) gHMBC DEPT

1’ 173,7 - - 1,64 (3J); 2,55 (2J); 6,15 (2J)

C

2’ 36,1 2,25 (t, 2H, J 8,9 Hz)

1,64 1,64 (2J) CH2

3’ 25,3 1,64 (quinteto, 2H, J 7,6 Hz)

1,29; 2,25 2,25 (2J) CH2

4’ 28,8 1,29 (m, 2H) 0,88; 1,64 1,64 (2J); 2,25 (3J) CH2 5’ 31,4 1,29 (m, 2H) 0,88; 1,64 0,88 (3J); 1,64 (3J) CH2 6’ 22,4 1,29 (m, 2H) 0,88; 1,64 0,88 (2J) CH2 7’ 14,0 0,88 (t, 3H, J

7,3 Hz) 1,29 1,29 (2J) CH3

1 - - - - - 2 175,6 - - 2,84 (3J); 4,47 (4J); 4,55

(2J) C

3 49,2 4,56 (ddd, 1H, J 5,8; 11,6 e

8,6 Hz)

2,14; 2,84; 6,15

2,14 (2J); 2,84 (2J); 4,47 (3J)

CH

2,14 (m, 1H) 2,84; 4,28; 4,47; 4,55

4 30,5

2,84 (m, 1H) 2,14; 4,28; 4,56

4,47 (2J); 4,55 (2J) CH2

4,28 (ddd, 1H, J 5,8; 11,3 e

9,5 Hz)

2,14; 2,84; 4,47

5 66,1

4,47 (t, 1H, J 8,9 Hz)

2,14; 4,28

2,14 (2J) CH2

NH - 6,15 (d, NH, J 3,7 Hz)

4,56 - -

d: dubleto; dd: duplo dubleto; ddd: duplo-duplo-dubleto; m: multipleto; t: tripleto.

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55

Figura 30. Espectros de RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da N-

butanoil-HSL sintética (a) e natural (b), isolada de P. agglomerans.

NH

OO

O

43 2

15

1'2'

3'

4'

NH

OO

O

43 2

15

1'2'

3'

4'

a.

b.

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56

O estudo dos caldos de cultivo da bactéria P. agglomerans permitiu

isolar a N-butanoil-HSL, tornando possível a comparação dos espectros de

ressonância magnética nuclear de hidrogênio do produto natural e sintético

(Figura 30).

1.3.5. Avaliação da atividade biológica de frações e produtos sintéticos

com o biossensor A. tumefaciens NTL4(pZLR4)

Assim como os extratos obtidos dos cultivos das bactérias E. psidii, P.

ananatis e P. agglomerans, as frações provenientes da purificação dos extratos

onde foram identificadas as acil-HSLs por CG-EM foram bioensaidas com o

repórter A. tumefaciens NTL4(pZLR4). Os produtos sintéticos também foram

ensaiados. As atividades biológicas positivas de todas as frações e produtos

sintéticos corroboraram com os resultados obtidos com os extratos (Figura 31

e Figura 18, página 37).

Figura 31. Avaliação da atividade biológica de expressão de enzimas β-

galactosidase com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4) na presença de X-Gal

a. b. c. d. e.

a. f. g. h.

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57

a. Etanol (20 μL, controle negativo). b. (±)-N-hexanoil-HSL. c. (S)-(-)-N-

hexanoil-HSL. d. (±)-N-heptanoil-HSL. e. (±)-N-octanoil-HSL. f. (±)-N-

butanoil-HSL. g. (S)-(-)-butanoil-HSL. h. Fração F59-64 do cultivo de P.

agglomerans, contendo a N-butanoil-HSL natural purificada.

1.3.6. Determinação da configuração absoluta das acil-homosserina

lactonas majoritárias identificadas

Como reportado na literatura, a configuração absoluta é de extrema

importância para a atividade biológica das substâncias sinalizadoras. No

primeiro trabalho químico reportando o isolamento de uma substância desta

classe, demonstrou-se que a mistura racêmica (sintética) (±)-N-(3-oxo-

hexanoil)-HSL era menos eficiente na ativação da bioluminescência na

bactéria Vibrio fischeri que o produto natural, o que foi atribuído a uma

possível atividade reduzida de um dos enantiômeros na mistura racêmica

(Eberhard et al., 1981). No estudo realizado com o fitopatógeno

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (ex Erwinia carotovora

subsp. carotovora), demonstrou-se que a forma natural (S)-(-)-N-(3-oxo-

hexanoil)-HSL é 90 % mais ativa na regulação da biossíntese do antibiótico

carbapenem que o enantiômero (R)-(+) (Chhabra et al., 1993). Desta forma,

compreendemos a necessidade de determinar a configuração absoluta das acil-

HSLs identificadas nas bactérias em estudo.

No presente trabalho, em ambas espécies E. psidii e P. ananatis, a N-

hexanoil-HSL apresentou-se como o metabólito sinalizador predominante,

tornando possível a determinação de sua configuração absoluta. Na espécie E.

psidii, o metabólito foi encontrado com abundância relativa (CG-EM) de 6 %

na fração FRA32 (massa total de 2,0 mg), a mais pura obtida. Esta quantidade

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________________________CAPÍTULO 1 – A QUÍMICA DA COMUNICAÇÃO BACTERIANA

58

extremamente pequena de material requisitava uma metodologia sensível o

suficiente para determinar a configuração absoluta da substância. A

metodologia escolhida foi a cromatografia em fase gasosa com detecção por

ionização em chama e coluna com fase estacionária quiral da Chrompack

(chirasil ciclodextrina CB). As condições analíticas foram otimizadas

utilizando a mistura racêmica sintética [enantiômero (R) em 56,72 min e

enantiômero (S) em 56,89 min]. A eluição do estereoisômero sintético (S)-(-)-

N-hexanoil-HSL (93 % ee) nas mesmas condições, forneceu o tempo de

retenção de 56,93 min. Análise da fração FRA32 obtida do cultivo de E. psidii

mostrou um sinal com tempo de retenção (56,97 min) muito próximo do

observado para o enantiômero (S) sintético. A co-injeção do produto natural

FRA32 com o produto racêmico sintético resultou numa perfeita sobreposição

de sinais, com um incremento na abundância relativa do enantiômero (S)

(56,96 min) em comparação com a do (R) (56,79 min). Desta forma, o produto

natural foi identificado como a (S)-(-)-N-hexanoil-HSL (Figura 32).

A purificação dos extratos provenientes do cultivo de P. ananatis

rendeu uma quantidade maior de N-hexanoil-HSL do que aquela observada

com a bactéria E. psidii. A fração FRA43 (1,3 mg) apresentava este

metabólito como sinal majoritário, com 50 % de abundância relativa em CG-

EM. A análise por CG(quiral)-FID com fase estacionária quiral Chrompack

chirasil ciclodextrina CB da fração FRA43 mostrou um sinal com tempo de

retenção (56,93 min) muito próximo do observado para o enantiômero (S)

sintético. A co-injeção do produto natural FRA43 com o produto racêmico

sintético resultou numa perfeita sobreposição de sinais, com um incremento na

abundância relativa do enantiômero (S) (56,95 min) em comparação com a do

enantiômero (R) (56,78 min). Desta forma, o produto natural proveniente do

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59

cultivo de P. ananatis também foi identificado como sendo a (S)-(-)-N-

hexanoil-HSL (Figura 32).

Figura 32. Determinação da configuração absoluta da S-(-)-hexanoil-HSL,

utilizando a técnica CG(quiral)-FID. a. (±)-N-hexanoil-HSL sintética. b. S-(-

)-N-hexanoil-HSL sintética. c. Fração FRA33-35 do cultivo de E. psidii. d.

Co-injeção da fração FRA33-35 natural com o produto sintético (±)-N-

hexanoil-HSL. e. Fração FRA43 proveniente do cultivo de P. ananatis. f. Co-

injeção da fração FRA43 natural com o produto sintético (±)-N-hexanoil-

HSL. Condições de análise: coluna Chrompack chirasil dex (25 m, 0,25 mm,

0,25 μm), programa de temperatura 50ºC-(2ºC)-180ºC-(5 min).

R S S S

S R

SSR

a. b. c.

d. e. f.

Ab u n d â n c i a

Tempo (min)

( ) ( )

( )

( ) ( )

( ) ( )

( ) ( )

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60

A determinação da configuração absoluta da N-butanoil-HSL isolada de

P. agglomerans também foi feita por CG(quiral)-FID. A coluna quiral

Chrompack chirasil ciclodextrina não foi eficiente na discriminação da

mistura racêmica de (±)-N-butanoil-HSL. Desta forma, a configuração

absoluta deste metabólito foi determinada a partir de análises cromatográficas

com a coluna quiral heptakis-(2,3-dimetil-6-pentil)-β-ciclodextrina. A mistura

racêmica foi desdobrada em dois sinais [enantiômero (R) em 50,79 e

enantiômero (S) em 50,95 minutos]. A identificação do tempo de retenção do

enantiômero (S) foi feita pela análise do produto sintético (S)-(-)-N-butanoil-

HSL (51,01 minutos). A análise do produto natural (FRA59-64) isolado de P.

agglomerans revelou a presença de um sinal com tempo de retenção muito

próximo ao do produto sintético (S) (50,90 minutos). A co-injeção do produto

natural e do produto sintético racêmico resultou num incremento na

abundância relativa do sinal em 50,90 minutos. O produto natural era portanto

a (S)-(-)-N-butanoil-homosserina lactona (Figura 33).

Figura 33. Determinação da configuração absoluta da (S)-(-)-N-butanoil-

HSL, utilizando a técnica CG(quiral)-FID. a. (±)-N-butanoil-HSL sintética. b.

(S)-(-)-N-butanoil-HSL sintética. c. Fração FRA59-64 do cultivo de P.

R S S S R S a. b. c. d.

A b u n d.

Tempo (min)

( ) ( ) ( )

( ) ( )( )

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61

agglomerans. d. Co-injeção da fração FRA59-64 natural com o produto

sintético (±)-N-butanoil-HSL. Condições de análise: coluna heptakis-(2,3-

dimetil-6-pentil)-β-ciclodextrina (25 m, 0,25 mm, 0,25 μm), programa de

temperatura 50ºC-(2ºC)-180ºC-(5 min).

A utilização da metodologia CG-FID com fase estacionária quiral

provou ser conveniente para a determinação da configuração absoluta das acil-

HSLs, principalmente devido à pequena quantidade destes metabólitos

produzida pelas bactérias e ainda devido ao fato de estarem presentes em

misturas complexas nos casos das espécies E. psidii e P. ananatis. Esta

metodologia é pioneira no estudo de substâncias sinalizadoras identificadas

em bactérias Gram-negativas.

Em todos os casos reportados no presente trabalho, as acil-HSLs mais

abundantes apresentaram centro estereogênico na porção lactônica com

configuração absoluta (S). Uma revisão bibliográfica mostrou um número

extremamente reduzido de trabalhos onde substâncias desta classe foram

caracterizadas quanto à configuração absoluta. A bactéria P. carotovorum

produz a (S)-(-)-N-(3-oxo-hexanoil)-HSL (Bainton et al., 1992) e a espécie

Sinorhizobium leguminosarum sintetiza a N-[(3R)-hidroxi-7-cis-

tetradecenoil]-(S)-HSL (Schripsema et al., 1996).

A configuração absoluta (S) pode ser explicada analisando-se a provável

origem biossintética destes metabólitos. Estudos realizados com a bactéria

Vibrio fischeri possibilitaram a purificação da enzima LuxI responsável pela

síntese de acil-HSLs nesta bactéria. Os substratos para a síntese de N-

hexanoil-HSL são o hexanoil-ACP (acyl carrier protein, proteína carreadora

de acila), que fornece a porção acila da molécula, e a S-adenosil metionina

(SAM), cuja porção aminoácido é o bloco construtor da porção homosserina

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62

lactona no produto final (Schaefer et al., 1996). Portanto, a origem da

estereoquímica (S) no produto (S)-(-)-N-hexanoil-HSL poderia ser derivada da

estereoquímica (S) da posição α-aminoácido na SAM (Figura 34).

Figura 34. Esquema biossintético da N-hexanoil-HSL em V. fischeri.

1.3.7. N-heptanoil-HSL, um metabólito de rara ocorrência

Um fato interessante observado neste trabalho é a ocorrência do

metabólito N-heptanoil-HSL (2) nas espécies E. psidii IBSBF 435T e P.

ananatis CCT 6481T. Trata-se do primeiro relato desta substância nos gêneros

Erwinia e Pantoea. A substância (2) já havia sido reportada na espécie

Sinorhizobium leguminosarum, onde participa do controle da expressão de

genes envolvidos nos fenômenos de formação de nódulos em leguminosas

N

NN

N

NH2

O

OHHO

S+

CH3

-O

O

H NH2

N

NN

N

NH2

O

OHHO

S

CH3

NH

OO

OH

S

OACP

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63

simbiontes e na espécie Serratia marcescens, controlando a expressão do

antibiótico prodigiosina, que confere coloração vermelha às colônias desta

bactéria (Horng et al., 2002; Lithgow et al., 2000). Nestas espécies

bacterianas, a substância (2) foi identificada por técnicas espectroscópicas

como CG-EM e CLAE-EM-EM, por comparação do padrão de fragmentação

e co-injeção com produtos sintéticos. Em adição, indícios da ocorrência deste

metabólito também foram detectados nos caldos de cultivo da bactéria

Edwardsiella tarda, onde participaria do controle da expressão de genes que

levam à fatores de patogenicidade contra algumas espécies de peixes. No

entanto, em E. tarda a substância (2) foi identificada apenas por cromatografia

em camada delgada, por biorevelação com a cepa biossensora

Chromobacterium violaceum CV026, e os próprios autores relatam a incerteza

a respeito da identidade da molécula (Morohoshi et al., 2004).

SCoA

O

-O SCoA

O O

Ácido graxo sintase (AGS)

S

O O

EnzAGS

1. Redução (NADPH)2. Eliminação

3. Redução (NADPH)

S

O

Enz

1. Novo ciclo AGS2. ACP

O

ACP

Enzima homóloga LuxI

SAM

O

NH

O

O(2)

Figura 35. Provável origem biossintética da substância (2) a partir do

propionil-CoA.

O que chama a atenção ao metabólito (2) é a presença do grupo

heptanoíla, um derivado de ácido graxo com número ímpar de carbonos. As

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64

formas mais comuns de ocorrência de ácidos graxos são aqueles formados por

números pares de carbonos, o que está relacionado com a sua origem

biossintética. Dentre os microrganismos procariontes, a biossíntese desta

classe de metabólitos é melhor compreendida em Escherichia coli, no

complexo ácido graxo sintase (Lehninger et al., 1995). O iniciador da cadeia

acila é normalmente grupo acetato (unidade C2), ao qual são inseridos novas

unidades acetato através do ataque nucleofílico de malonato, ativado por

descarboxilação. Assim são gerados os ácidos graxos com número par de

carbonos na cadeia acila. No caso de ácidos graxos com número ímpar de

carbonos, o iniciador das diversas etapas biossintéticas é o propionato

(unidade C3), ao qual são inseridas as demais unidades de acetato. A literatura

aponta esta via metabólica como a provável origem da porção acila da N-

heptanoil-HSL (Figura 35) (Whithers et al., 2001).

1.3.8. Avaliação da atividade biológica das espécies P. ananatis e P.

agglomerans contra folhas de milho (Zea mays)

As espécies P. agglomerans e P. ananatis são filogeneticamente muito

próximas entre si e por vezes confundidas (Walcott et al., 2002; Azad et al.,

2000). No presente trabalho, a cepa P. agglomerans CBMAI 732 era

proveniente de lesões em folhas de milho, enquanto que a cepa P. ananatis

CCT 6481T foi isolada como fitopatógeno em abacaxi. Num trabalho em

colaboração com a Dra. Luzia D. P. Meirelles (Depto. de Biologia Geral,

UEL, Londrina-Paraná), avaliou-se a atividade patogênica de ambas espécies

contra folhas de milho.

Duas metodologias distintas de inoculação das bactérias foram

utilizadas. Na primeira, uma suspensão bacteriana foi espalhada sobre as

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65

folhas de milho sem causar injúrias. Na segunda, as folhas de milho foram

previamente injuriadas com esponja e as suspensões bacterianas foram

depositadas na forma de gotas, com o auxílio de um molde. Ao final dos

experimentos, em ambos os casos a espécie P. ananatis não mostrou atividade

patogênica, ao contrário da espécie P. agglomerans, que apresentou atividade,

sob a forma de manchas brancas nas folhas. Isto comprovou a atividade

patogênica da cepa P. agglomerans isolada.

1.3.9. Avaliação da presença de acil-homosserina lactonas em folhas de

milho infectadas pela cepa P. agglomerans CBMAI 732

A observação in vitro da ocorrência de (S)-(-)-N-butanoil-HSL (6) na

cepa P. agglomerans estimulou-nos a averiguar a produção destes

metabólitos em folhas de milho infectado pela doença em casa de vegetação.

Também avaliou-se a presença de acil-HSLs em folhas de milho naturalmente

infectados, provenientes de campo (Embrapa Soja, Londrina - PR).

Inicialmente, prepararam-se extratos de folhas de milho BR HS200

cultivado em casa de vegetação. Duas folhas foram coletadas: uma inoculada

pela cepa P. agglomerans e com sinais de necrose e outra não inoculada, sadia

(controle). As folhas foram segmentadas e extraídas com acetato de etila. Os

extratos foram em seguida submetidos à filtração em coluna de sílica-gel com

acetato de etila como eluente e a partir dos sólidos obtidos por evaporação

foram preparadas soluções estoque em etanol absoluto de cada extrato. Os

extratos foram bioensaiados com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4). Como

controle positivo, utilizou-se (±)-N-hexanoil-HSL e como controle negativo,

etanol absoluto. Um segundo tipo de controle foi feito com o objetivo de

distinguir a coloração do meio de cultivo contendo apenas os extratos e os

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66

meios de cultivo onde foram realizados os testes. Os meios de cultivo

contendo extratos apresentaram coloração amarela, claramente distinta do

azul-esverdeado formado nos casos de atividade biológica positiva. Após 24 h,

tanto o extrato proveniente da planta contaminada quanto o extrato

proveniente da planta não contaminada apresentaram atividade biológica

positiva (Figura 36).

O mesmo procedimento descrito acima foi aplicado com folhas de

milho oriundas de cultivo em campo. Todas as plantas apresentavam 100 dias

de cultivo (plantio em dezembro de 2004), já no final do ciclo vegetativo do

milho. Os seguintes extratos em acetato de etila foram preparados:

1. Milho BRS1010 resistente à doença e sem sintomas;

2. Milho de variedade desconhecida infectado pela doença e com sinais de

necrose;

3. Milho de variedade desconhecida infectado pela doença (dos mesmos

vegetais de onde foram coletadas as folhas necrosadas), porém sem sinais de

necrose.

Foram preparadas soluções estoque em etanol absoluto de cada extrato,

e estas foram bioensaiadas da mesma maneira descrita para o milho

proveniente do cultivo em casa de vegetação, incluindo os controles positivo e

negativos. Foram observadas atividades positivas em todos os extratos,

inclusive naquele proveniente de plantas não infectadas e resistentes (milho

BRS1010) (Figura 37).

As atividades biológicas positivas observadas em todos os extratos,

mesmo nos controles não-infectados pelos patógenos, deve ter ocorrido devido

à presença de outras bactérias endofíticas, não patogênicas, que podem estar

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67

presentes em todos os tecidos e que também poderiam sintetizar acil-HSLs,

ativando o biossensor. Outra possibilidade seria a possível produção pelo

milho de substâncias com atividade agonista à das acil-HSLs e que também

poderiam ativar o biossensor. Na literatura, foram reportados casos onde

plântulas de ervilha (Pisum sativum) cultivadas em condições estéreis

propiciaram ativação do biossensor Chromobacterium violaceum CV026,

numa clara indicação da produção de substâncias com atividades homólogas

às das acil-HSLs no vegetal livre da presença de microrganismos em seus

tecidos. O fenômeno também foi observado com seedlings de arroz, alface,

soja, tomate e outros vegetais (Teplitski et al., 2000).

Figura 36. Avaliação da atividade biológica de expressão de enzimas β-

galactosidase com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4) na presença de X-

Gal. a. Etanol (branco). b. (±)-N-hexanoil-HSL sintética (controle +). c.

Extrato de milho HS200 infectado pela bactéria P. agglomerans, com o

respectivo controle do extrato à direita. d. Extrato de milho HS200 não

infectado, com o controle do extrato à direita. Soluções preparadas em etanol.

a. b. c. d.

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68

Figura 37. Avaliação da atividade biológica de expressão de enzimas β-

galactosidase com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4) na presença de X-

Gal. Amostras: extratos em acetato de etila obtidos a partir de folhas de milho

coletado em campo. a. Etanol (controle negativo). b. (±)-N-hexanoil-HSL

(controle positivo). c. Extrato de milho BRS1010 não infectado, com o

respectivo controle do extrato à direita. d. Extrato de milho de variedade

desconhecida com folhas doentes apresentando necrose, e o respectivo

controle do extrato à direita. e. Extrato de milho de variedade desconhecida

com folhas coletadas de plantas doentes, mas as folhas não apresentavam

necrose, e o respectivo controle do extrato à direita. As soluções estoque

foram preparadas em etanol.

a. b. c. d. e.

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________________________CAPÍTULO 1 – A QUÍMICA DA COMUNICAÇÃO BACTERIANA

69

1.4. Conclusões – A Química da Comunicação Bacteriana

O estudo químico dos caldos de cultivo das bactérias E. psidii, P.

ananatis e P. agglomerans rendeu a identificação de diversas substâncias da

classe das acil-homosserina lactonas, reconhecidamente empregadas em

mecanismos de comunicação intercelular.

Este trabalho reporta as primeiras ocorrências da substância N-

heptanoil-HSL (2) nos gêneros Pantoea e Erwinia, sendo uma substância

sinalizadora de rara ocorrência. O diferencial estrutural desta substância está

em sua cadeia acila com número ímpar de carbonos, suja origem biossintética

está associada provavelmente ao ácido propiônico.

Sob o ponto de vista quimiotaxonômico, as acil-HSLs identificadas

neste trabalho correspondem estruturalmente ao que têm sido reportado na

literatura sobre esta classe de substâncias para o gênero Erwinia, sendo

observados principalmente compostos com cadeias acila curtas.

Reportou-se pela primeira vez o uso da metodologia de CG-FID com

coluna quiral para determinar a configuração absoluta de acil-HSLs naturais.

A metodologia provou ser eficiente em casos onde a quantidade de substância

era pequena ou ainda quando a substância de interesse estava presente em

misturas complexas.

Acredita-se que este seja o primeiro trabalho de identificação química

de acil-HSLs produzidas por bactérias brasileiras. Uma vez que os

microrganismos estudados possuem destacada importância econômica, espera-

se que um aprofundamento nos estudos sobre os fatores fenotípicos

controlados pelas acil-HSLs possa fornecer maneiras de controlar estas

bacterioses. Este aprofundamento está relacionado principalmente ao

sequenciamento dos genes homólogos de luxI e luxR, responsáveis pela

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________________________CAPÍTULO 1 – A QUÍMICA DA COMUNICAÇÃO BACTERIANA

70

síntese e detecção das substâncias sinalizadoras; obtenção de mutantes

incapazes de produzir as acil-HSLs e verificar quais fatores fenotípicos são

afetados; e finalmente, obter compostos com atividades antagonistas, que uma

vez administrados podem reduzir a virulência das cepas interferindo nos

mecanismos comunicativos. Abre-se, portanto, uma vasta área de pesquisas a

partir dos resultados apresentados neste trabalho.

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____________________________ CAPÍTULO 2

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

73

Capítulo 2 – Defesa Química em Opiliões

2.1. Introdução

Opiliões (ordem Opiliones) são animais pertencentes à classe

Arachnida. Estes aracnídeos vivem em locais úmidos e sombreados, sendo

ativos principalmente à noite. Durante o dia eles normalmente se escondem

sob toras, cavernas, pedras, no folhiço ou em vegetações densas. Sua

alimentação consiste basicamente de insetos vivos, porém podem se alimentar

ocasionalmente de animais mortos ou seiva de plantas (Eisner et al., 1978).

Todas as subordens da ordem Opiliones – Cythophthalmi, Laniatores,

Eupnoi e Dyspnoi – possuem glândulas de defesa. Estes órgãos consistem de

um par de sacos compressíveis, situados no dorso do animal e com saídas

situadas próximo das margens de sua carapaça (Eisner et al., 1978).

Assim como as outras glândulas exócrinas de artrópodes, estas são

invaginações na parede corporal, consistindo de um epitélio glandular e canais

membranosos. A presença ou ausência de músculos especializados na

compressão destas glândulas varia de acordo com a subordem. Nas espécies

onde o músculo compressor é ausente, este papel é realizado pelos órgãos

adjacentes (Eisner et al., 1978).

O estudo químico da secreção de defesa dos animais da subordem

Laniatores têm revelado principalmente a presença de quinonas e fenóis.

Quinonas são substâncias químicas altamente empregadas como defesa em

artrópodes, notoriamente insetos e centopéias. Entretanto, as benzoquinonas

alquiladas presentes em opiliões possuem ocorrência mais restrita (Eisner et

al., 1978).

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

74

Estas secreções são utilizadas pelos animais na defesa contra

predadores. Em laboratório, as substâncias repelem eficientemente formigas e

aranhas. A forma de disposição do fluído pode ser por spray (raramente) ou de

modo mais comum, simplesmente saindo da glândula e formando gotículas

nas laterais do animal. O fluído pode então ser espalhado por toda a carapaça

através de canais externos, ou ainda ser “pincelado” pela pata do animal e

esfregado sobre o predador (Eisner et al., 1978).

Apesar da grande diversidade de espécies da subordem Laniatores (mais

de 3000 espécies), poucas foram estudadas sob o ponto de vista químico

(Bragagnolo e Pinto-da-Rocha, 2005). Na subordem Laniatores as secreções

de defesa de apenas 13 espécies foram estudadas, revelando a presença de 5

tipos de benzoquinonas alquiladas (Figura 38), além de fenóis alquilados.

A primeira espécie estudada na subordem Laniatores foi Vonones sayi

(Cosmetidae). Esta espécie administra a substância repelente com as patas. O

animal produz quinonas, que são estocadas na forma não diluída. Quando

perturbado, ele libera um fluído entérico (constituído principalmente por água)

através da boca e que escorre através de canais até a abertura da glândula. Em

seguida, as quinonas são expulsas da glândula e se diluem no fluído entérico,

formando gotas amareladas nas laterais do animal. A análise da secreção

glandular por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas e

espectroscopia no infravermelho permitiu identificar as substâncias como a

2,3-dimetil-1,4-benzoquinona e 2,3,5-trimetil-1,4-benzoquinona, o que foi

confirmado por comparações com dados de padrões autênticos (Eisner et al.,

1971).

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

75

OHOHOH

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Figura 38. Benzoquinonas e fenóis identificados nas secreções de defesa de

opiliões da subordem Laniatores.

O estudo químico da secreção glandular da espécie Stygnomma

spinifera (Stygnommatidae), uma espécie de opilião que habita a Flórida

(Estados Unidos), demonstrou ser formada de diversas substâncias voláteis: 2-

metil-5-etil-fenol, 2,3-dimetil-fenol e 2,3-dimetil-5-etil-fenol (Duffield et al.,

1981).

O estudo de quatro espécies da América Central (nativas das

proximidades do Canal do Panamá) permitiu a identificação de quinonas em

sua secreção glandular. Da espécie Paecilaemella eutypa (Cosmetidae) foram

identificadas a 2,5-dimetil-1,4-benzoquinona, 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona e

2,3,5-trimetil-1,4-benzoquinona. Paecilaemella quadripunctata (Cosmetidae)

utiliza-se da 2,3,5-trimetil-1,4-benzoquinona e 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona

como defesa química. Cynorta astora (Cosmetidae) utiliza-se de 2,3-dimetil-

fenol e 2-metil-5-etil-fenol. Por fim, a espécie Zygopachylus albimarginis

(Gonyleptidae) utiliza-se da 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona e um segundo

componente não identificado como secreção de defesa (Eisner et al., 1977).

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

76

Na espécie argentina Pachyloidellus goliath (Gonyleptidae),

identificou-se os fenóis 2,3-dimetilfenol, 2-metil-5-etilfenol e 2,3-dimetil-5-

etilfenol. Também foram identificadas as quinonas 2,3,5-trimetil-1,4-

benzoquinona, 2,3-dimetil-5-etil-1,4-benzoquinona e 2,3-dimetil-1,4-

benzoquinona (Acosta et al., 1993).

Outras espécies estudadas foram a Nesopachylus monocerus

(Gonyleptidae), onde identificou-se a 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona e 2,3,5-

trimetil-1,4-benzoquinona; Cynorta nannacornuta (Cosmetidae),

identificando-se os mesmos metabólitos; e Eucynortula albipunctata

(Cosmetidae) que se utiliza dos fenóis 2,3-dimetil-fenol e 2-metil-5-etil-fenol

como defesa química (Roach et al., 1980).

Recentemente, a espécie Acanthopachylus aculeatus (Gonyleptidae) foi

re-estudada (Figura 39), confirmando-se a presença de 2,3-dimetil-1,4-

benzoquinona, 2,5-dimetil-1,4-benzoquinona e 2,3,5-trimetil-1,4-

benzoquinona, identificadas na década de 1950 através de técnicas clássicas

de elucidação química (Figura 39) (Eisner et al, 2004; Estable et al., 1955).

Figura 39. Acanthopachylus aculeatus (Gonyleptidae). À esquerda, fluído

entérico aquoso indicado por seta; à direita, o fluído entérico está misturado

com as benzoquinonas, que conferem coloração amarela à secreção de defesa

(Eisner et al, 2004).

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77

A única espécie do gênero Goniosoma cuja composição química da

glândula de defesa foi descrita é a Goniosoma spelaeum (Gonyleptidae). Esta

espécie brasileira ocorre na região do Vale do Ribeira, São Paulo. Nesta

espécie, identificou-se a 2-etil-1,4-benzoquinona e 2,3,5-trimetil-1,4-

benzoquinona como substâncias de defesa (Gnaspini e Cavalheiro, 1998).

2.1.1. Goniosoma longipes ROEWER e Camarana flavipalpi SOARES

(Gonyleptidae)

Goniosoma longipes é um opilião pertencente à família Gonyleptidae,

que ocorre no Estado de São Paulo, especificamente no Parque Florestal

Itapetinga, município de Atibaia. Esta espécie possui hábitos noturnos e

cavernícolas, exibindo ainda cuidados maternos com os ovos (Figura 40). Este

animal tem sido extensivamente estudado pelo Dr. Glauco Machado, do

Instituto de Biologia da Unicamp (Machado e Silveira, 1998). Assim, num

trabalho de colaboração, realizamos o estudo químico da secreção de defesa

desta espécie.

Figura 40. G. longipes em habitat natural. Esquerda: agrupamento de

animais; Centro: fêmea cuidando dos ovos, na parede da caverna. Direita:

fêmea em destaque.

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

78

A espécie Camarana flavipalpi é nativa do litoral paulista. Não existem

relatos na literatura do estudo da secreção de defesa de opiliões do gênero

Camarana (Figura 41).

Figura 41. C. flavipalpi em habitat natural.

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

79

2.2. Objetivos

Os objetivos deste capítulo são caracterizar quimicamente as secreções

de defesa dos opiliões G. longipes e C. flavipalpi, através de técnicas como

espectrometria de massas e espectroscopia de ressonância magnética nuclear

de hidrogênio e carbono uni e bidimensionais.

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

80

2.3. Resultados e Discussão – Defesa química em opiliões

Os opiliões são aracnídeos que se utilizam de substâncias químicas para

se defenderem contra predadores. A elucidação da composição química dessas

secreções é importante, pois fornece pistas sobre seu modo de ação.

2.3.1. Estudo químico da secreção de defesa do opilião C. flavipalpi

(Laniatores: Gonyleptidae)

A coleta da secreção de defesa do opilião Camarana flavipalpi foi feita

pressionando as glândulas produtoras (situadas nas laterais do animal) com

algodão tratado, ou seja, sucessivamente lavado com acetato de etila

bidestilado. Uma quantidade extremamente pequena (~0,3 mg) de secreção foi

coletada de um indivíduo. A secreção era incolor e apresentava odor

desagradável. A secreção foi extraída do algodão com acetato de etila. A fase

orgânica foi analisada inicialmente por CCD, revelando a presença de uma

única substância, o que foi confirmado por CG-EM (Figura 42). O padrão de

fragmentação da substância era coerente com o reportado na literatura para o

etil-metil-fenol (Figura 43) (McLafferty e Stauffer, 1992). O íon molecular

intenso em m/z 136 (42 %) e outros sinais característicos como m/z 121 (100

%) (resultante da perda de metila e formação de um íon-radical derivado de

benzila, altamente estável), m/z 91 (9 %, íon tropílio) e 77 (16 %, íon fenila)

eram sugestivos da presença de uma estrutura aromática. Porém, a partir do

espectro de massas seria arriscado definir o padrão de substituição do anel

aromático.

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81

Figura 42. Cromatograma de íons totais (CG-EM, IE, 70 eV) da secreção do

opilião C. flavipalpi (Gonyleptidae). Condições de análise: coluna HP-5 (30

m, 0,25 mm, 0,25 μm), programa de temperaturas 50ºC-(10ºC/min)-200ºC-

(16ºC/min)-290ºC.

Figura 43. Espectro de massas (IE, 70 eV) da substância (5) identificada na

secreção de defesa do opilião C. flavipalpi.

Devido à pequena quantidade de substância secretada pelos indivíduos,

as análises de ressonância magnética nuclear só puderam ser realizadas

mediante extração da secreção de defesa de diversos animais. Desta forma, 7

animais foram utilizados, totalizando aproximadamente 2,1 mg de secreção,

que foi diretamente extraída do algodão com CDCl3/TMS. A análise de

OH

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82

ressonância magnética nuclear de hidrogênio mostrou uma amostra menos

pura do que o observado por CG-EM, muito provavelmente devido ao maior

número de indivíduos de onde a secreção foi extraída; não está descartada a

possibilidade de contaminação por fluído entérico. Porém, a amostra

apresentava um componente majoritário, passível de ser identificado (Figura

44). A região aromática apresentou um padrão de substituição 1, 2, 5 evidente,

com um dubleto em δ 7,03 (H-3, 3J 7,6 Hz), um duplo-dubleto em δ 6,70 (H-

4, 3J 7,6 Hz; 4J 1,5 Hz) e um dubleto com acoplamento meta (H-6, 4J 1,5 Hz)

em δ 6,40, cada sinal integrando para um hidrogênio.

Figura 44. Espectro de RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substância

(5), identificada na secreção de defesa do opilião C. flavipalpi.

OH

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83

O espectro de diferença de NOE mostrou 0,53 % de incremento no sinal

do hidrogênio H-3 quanto o grupo metila (singleto) em δ 2,22 foi irradiado

(Figura 45). Não foram observados incrementos em sinais correspondentes ao

grupo etila em δ 2,57 (CH2, quarteto, 2H, J 7,6 Hz) e 1,22 (CH3, tripleto, 3H,

J 7,6 Hz). Portanto, inferiu-se que o grupo etila estava ligado ao carbono 5, e o

composto foi identificado como 2-metil-5-etil-fenol (5). Esta substância foi

previamente descrita nas secreções de defesa dos opiliões Strygnomma

spinifera (Duffield et al., 1981), Cynorta astora (Eisner et al., 1977),

Pachyloidellus goliath (Acosta et al., 1993) e Eucynortula albipunctata

(Roach et al., 1980). Porém, trata-se do primeiro caso onde o metabólito (7)

aparece como a única substância de defesa, e não como um componente em

misturas com outros fenóis ou quinonas.

Figura 45. Espectro de RMN de 1H (NOESY 1D) (499,88 MHz, CDCl3, TMS)

da substância (5), obtido por irradiação do singleto em δ 2,22 (CH3).

0,53 %

OH

Hδ H 7,1

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84

2.3.2. Estudo químico da secreção de defesa do opilião G. longipes

(Laniatores: Gonyleptidae)

O opilião Goniosoma longipes (Laniatores: Gonyleptidae) é nativo do

Parque Florestal Itapetinga, município de Atibaia (23º15’S; 46º45’W), São

Paulo. Os animais são encontrados habitando principalmente paredes de

cavernas. A coleta da secreção de defesa desta espécie também foi feita

utilizando-se algodão tratado, pressionando as glândulas laterais do animal.

Para análises em CCD e CG-EM, a secreção de um indivíduo macho (~12 mg)

foi coletada e extraída com acetato de etila. A secreção apresentava coloração

marrom e odor extremamente forte, além de uma alta volatilidade que

dificultava a manipulação da amostra. A análise em CCD mostrou a presença

de uma única mancha. Porém, a análise por CG-EM revelou a presença de

duas substâncias de alta volatilidade (Figura 46a). O padrão de fragmentação

de um dos compostos era idêntico ao reportado da 2,3-dimetil-1,4-

benzoquinona (6) (Figura 46b) (Budzikiweicz et al., 1967). Uma pequena

quantidade do composto puro (6) pôde ser obtida por cromatografia em

camada delgada. Devido à simetria molecular, o composto (6) mostrou dois

singletos no espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio, em δ

2.05 para 6 prótons de metilas e em δ 6.72 para os outros 2 prótons

aromáticos (Figura 47). A fórmula molecular C8H8O2 foi confirmada por

espectrometria de massas de alta resolução (calculado: 136,05244; observado:

136,05392) (Anexo E42). Em seguida, o mapa de contornos de ressonância

magnética nuclear bidimensional de correlações 1H, 13C 1J (HSQC) (Anexo

E35) foi utilizado na assinalação dos deslocamentos químicos dos carbonos

ligados a hidrogênio nesta substância, permitindo diferencia-los dos outros

sinais dos carbonos do segundo componente da amostra. Técnicas adicionas

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85

de RMN de correlações 1H, 13C nJ (gHMBC) (Anexo E38), correlações 1H, 1H

(gCOSY) (Anexo E34), RMN de 13C DEPT-135 e DEPT-90 (Anexo E32)

permitiram a assinalação total dos deslocamentos químicos em RMN para

esta substância.

Figura 46. a. Cromatograma de íons totais (CG-EM) da secreção de defesa

do opilião G. longipes macho. b. Espectro de massas (IE, 70 eV) da 2,3-

dimetil-1,4-benzoquinona (6). c. Espectro de massas (IE, 70 eV) da 2-etil-3-

metil-1,4-benzoquinona (7). Condições de análise: coluna HP-5 (30 m, 0,25

(6)

(7) a.

b.

c.

O

O

O

O

(6)

(7)

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86

mm, 0,25 μm), programa de temperaturas 50ºC-(10ºC/min)-200ºC-

(16ºC/min)-290ºC.

Figura 47. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, TMS, 300,07 MHz) da substância

(6) isolada da secreção de defesa de G. longipes.

Figura 48. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, TMS, 300,07 MHz) das

substâncias (6) e (7) da secreção de defesa de G. longipes. Os sinais da

substância (6) estão indicados.

O

O

O

O

O

O

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87

A simplicidade espectral da substância (6) permitiu a identificação do

segundo componente da mistura sem purifica-la. Este fato foi aproveitado,

uma vez que diversas tentativas de purificar grandes quantidades da secreção

por CCD e CC falharam, principalmente devido à não separação dos

componentes em diversas misturas eluentes e devido à alta volatilidade da

amostra, que ocasionava grandes perdas de material.

O padrão de fragmentação por CG-EM (IE) do segundo componente da

amostra não coincidia com nenhuma fragmentação de 1,4-benzoquinonas

identificadas em artrópodes (Figura 46c). O uso das técnicas de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais permitiu a assinalação dos deslocamentos químicos

deste composto, que foi identificado como a 2-etil-3-metil-1,4-benzoquinona

(7). A fórmula molecular C9H10O2 foi confirmada por espectrometria de

massas de alta resolução (calculado: 150,06810; observado: 150,06824)

(Anexo E42). Um substituinte CH2CH3 foi facilmente caracterizado pelo

sistema de spin A3X2 (δ 2.51 para 2H e δ 1.06 para 3H) no espectro de RMN

de 1H (Figura 48), o que foi posteriormente confirmado pelo espectro de

correlações 1H, 1H homonucleares (gCOSY) (Anexo E34). O padrão de

substituição do composto (7) foi inicialmente sugerido pela presença de um

intenso fragmento m/z 54 no espectro de massas de baixa resolução, atribuível

ao fragmento ciclopropenona e posteriormente confirmado por espectrometria

de massas de alta resolução (C3H2O+ observado: m/z 54,01036; calculado: m/z

54,01056) (Figura 49). Esta hipótese foi posteriormente confirmada pelas

correlações 3J H-7/C-3, H-7/C-1, H-9/C-2 e H-9/C-4 observadas pelo

espectro de correlações heteronucleares 1H, 13C a longa distância (gHMBC)

(Anexo E38). Outros métodos espectroscópicos como gHSQC (1H,13C 1J)

(Anexo E35), DEPT-135 e DEPT-90 (Anexo E32) também foram utilizados

na assinalação dos deslocamentos químicos do composto (7).

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A análise por CG-EM de secreções de defesa de indivíduos macho,

fêmea, fêmea ovígera e fêmea após postura não revelou diferenças em sua

composição química. Observou-se apenas pequenas variações na proporção

dos componentes. A substância (7) sempre se manteve em proporção pouco

menor que a substância (6) (Tabela 2).

8

76

54

3

21

O

O

8

O

O

12

3

45

67

9

(6) (7)

m/z 54 (22%)m/z 54 (50%)

Figura 49. Origem do fragmento m/z 54 nos espectros de massas das

substâncias (6) e (7).

Tabela 2. Abundâncias relativas obtidas por CG-EM (IE, 70 eV) das

substâncias identificadas nas secreções de defesa de diferentes indivíduos de

G. longipes.

Animal Abundância relativa de

2,3-dimetil-1,4-

benzoquinona (6)

Abundância relativa de 2-

etil-3-metil-1,4-

benzoquinona (7)

Macho 60,65 % 39,35 %

Fêmea 57,01 % 42,99 %

Fêmea ovígera 53,09 % 46,90 %

Fêmea após

postura

57,65 % 42,35 %

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89

A substância 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona já havia sido reportada para

diversas espécies de opiliões da subordem Laniatores. No entanto, a

substância 2-etil-3-metil-1,4-benzoquinona nunca havia sido reportada nesta

subordem. Buscas no Chemical Abstracts e Scifinder com a fórmula molecular

C9H10O2 realizada entre os anos 1907 e 2005 mostram que esta substância é

um produto natural inédito.

Tabela 3. Deslocamentos químicos em RMN para a substância 2,3-dimetil-

1,4-benzoquinona (6) (CDCl3, TMS, 499,88 MHz para RMN de 1H e 125,71

MHz para RMN de 13C).

C δH δC HSQC 1H, 13C (1J)

gHMBC 1H, 13C (nJ) DEPT

1 - 187,39 - - - 2 - 140,99 - - - 3 - 140,99 - - - 4 - 187,39 - - - 5 6,72 (s,

1H) 136,04 136,24 (C5) 187,39 (C4) CH

6 6,72 (s, 1H)

136,04 136,24 (C6) 187,39 (C1) CH

7 2,05 (s, 3H)

12,18 12,18 (C7) 140,90 (C2); 187,39 (C1)

CH3

8 2,05 (s, 3H)

12,18 12,18 (C8) 140,90 (C3); 187,39 (C4)

CH3

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Tabela 4. Deslocamentos químicos em RMN para a substância 2-etil-3-metil-

1,4-benzoquinona (7) (CDCl3, TMS, 499,88 MHz para RMN de 1H e 125,71

MHz para RMN de 13C).

C δH gCOSY 1H, 1H

δC HSQC 1H, 13C

(1J)

gHMBC 1H, 13C (nJ)

DEPTc

1 - - 187,10 - - - 2 - - 146,15 - - - 3 - - 140,37 - - - 4 - - 187,90 - - - 5 6,71(s largo,

1H) - 136,19a 136,19

(C5)b 187,90 (C4) CH

6 6,71(s largo, 1H)

- 136,37a 136,37 (C6)b

187,10 (C1) CH

7 2,51 (q, J 7.6 Hz, 2H)

1,06 19,73 19,73 (C7)

12,84 (C8); 140,37 (C3); 146,15 (C2);

187,10 (C1)

CH2

8 1,06 (t, J 7.6 Hz, 3H)

2,51 12,84 12,84 (C8)

19,73 (C7); 146,15 (C2)

CH3

9 2,05 (s, 3H) - 11,63 11,63 (C9)

140,37 (C3); 146,15 (C2); 187,90 (C4)

CH3

a,b os δC com a mesma letra podem ser intercambiados.c Experimentos DEPT-

135 e DEPT-90

A caracterização química da secreção de defesa de G. longipes revelou,

com isso, a presença de duas benzoquinonas substituídas. As estruturas das

substâncias identificadas é coerente com a alta volatilidade da secreção de

defesa. Esta volatilidade é importante, uma vez que permite uma maior

efetividade de dispersão sobre o animal que porventura ataque o opilião.

Existem evidências de que a secreção de defesa possa ser utilizada também

como feromônio de alarme, numa situação onde a volatilidade e

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

91

dispersibilidade são fatores importantes. Num trabalho recente, verificou-se

que a secreção de defesa de G. longipes é efetiva na repelência de formigas,

aranhas, grilos e sapos (Machado, 2002; Machado et al., 2005).

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___________________________________CAPÍTULO 2 – DEFESA QUÍMICA EM OPILIÕES

92

2.4. Conclusões – Defesa Química em Opiliões

Reportou-se neste capítulo o estudo químico inédito de duas espécies de

opiliões brasileiros, G. longipes e C. flavipalpi. Em ambas as espécies foram

identificadas substâncias de alta volatilidade e irritabilidade, utilizadas em

mecanismos de defesa territorial e contra predadores.

O estudo da espécie G. longipes rendeu a identificação de duas

benzoquinonas substituídas, uma das quais é um produto natural inédito (2-

etil-3-metil-1,4-benzoquinona). A espécie C. flavipalpi utiliza-se de um fenol

substituído como secreção de defesa.

Além de serem interessantes sob o ponto de vista quimiotaxonômico, os

resultados obtidos colaboram com a pesquisa desenvolvida pelo Dr. Glauco

Machado, do Instituto de Biologia da Unicamp, provendo uma melhor

compreensão dos mecanismos de defesa dos opiliões.

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____________________________________________CAPÍTULO 3 – CONCLUSÕES FINAIS

93

____________________________ CAPÍTULO 3

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____________________________________________CAPÍTULO 3 – CONCLUSÕES FINAIS

95

Capítulo 3 – Conclusões Finais

O presente trabalho abordou dois temas relacionados às substâncias

carreadoras de informações entre indivíduos, os semioquímicos.

O estudo de substâncias sinalizadoras produzidas por bactérias Gram-

negativas brasileiras rendeu a identificação de quatro acil-homosserina

lactonas distintas. O trabalho de identificação química foi acompanhado por

testes biológicos com um repórter construído especificamente para detectar

esta classe de compostos, além de sínteses das substâncias identificadas.

Os microrganismos estudados são economicamente importantes no

Brasil pois afetam a produção de diversas culturas como a goiaba, o abacaxi e

o milho. As acil-homosserina lactonas representam a principal classe de

substâncias comunicadoras produzidas por bactérias Gram-negativas. É

notória na literatura a importância destas substâncias no controle da expressão

de diversos fatores de patogenicidade em diferentes microrganismos. Portanto,

acredita-se que uma melhor compreensão de como estes mecanismos

comunicativos atuam nas bactérias em questão possa fornecer maneiras de

controlar estas doenças.

Vale a pena destacar o uso da metodologia de cromatografia gasosa

acoplada com detecção por ionização em chama e fase estacionária quiral para

determinar a configuração absoluta das acil-homosserina lactonas. A técnica

se mostrou eficiente, uma vez que requer pequenas quantidades de amostras,

já que as substâncias sinalizadoras são produzidas pelas bactérias em pequenas

concentrações.

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____________________________________________CAPÍTULO 3 – CONCLUSÕES FINAIS

96

Além dos feromônios produzidos por bactérias, estudou-se também os

alomônios produzidos por duas espécies de opiliões brasileiros não estudadas

anteriormente. Esta seção do trabalho rendeu a identificação de três

metabólitos, um dos quais inédito na natureza, além de contribuir para uma

melhor compreensão dos mecanismos defensivos em opiliões.

Além dos avanços científicos alcançados, vale a pena destacar o

aprendizado de diversas técnicas e metodologias laboratoriais descritos ao

longo do texto, que enriqueceram o mestrando em duas áreas distantes da

Ecologia Química, tendo como objetos de estudos desde bactérias até

aracnídeos. Acredita-se também que este constitua o primeiro trabalho de

identificação química de substâncias sinalizadoras produzidas por bactérias no

Brasil.

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

97

____________________________ CAPÍTULO 4

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

99

CAPÍTULO 4 - PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Materiais e Equipamentos

4.1.1. Equipamentos

• Cromatografia a gás-espectrometria de massas (CG-EM)

As análises de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de

massas (CG-EM) foram feitas em cromatógrafo a gás marca Agilent modelo

6890, acoplado a um detector seletivo de massas operando por impacto de

elétrons a 70 eV marca Hewlett Packard modelo 5973. O cromatógrafo

operava com coluna capilar de sílica fundida do tipo HP-5 (30 m x 0,25 mm x

0,25 μm). Empregou-se hélio de alta pureza como gás de arraste, com fluxo de

1 mL/min. As análises foram realizadas com injetor operando a 250ºC e

interface a 280ºC. Os volumes injetados foram de 1 μL de solução, sem

divisão de fluxo. Utilizou-se os seguintes programas de desenvolvimento

cromatográfico:

Programa 1: Forno inicialmente a 70ºC, com incremento de temperatura

de 5ºC/min até 290ºC, e 10 minutos isotermicamente à 290ºC. Detecção por

varredura de íons com intervalo de massas entre m/z 50-550.

Programa 2: Forno inicialmente a 100ºC, com incremento de

temperatura de 10ºC/min até 290ºC, e 10 min isotermicamente à 290ºC.

Detecção por varredura de íons com intervalo de massas entre m/z 40-450.

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

100

Programa 3: Forno inicialmente a 50ºC, com incremento de temperatura

de 10ºC/min até 200ºC, e 16ºC/min até 290ºC. Detecção por varredura de íons

com intervalo de massas entre m/z 40-450.

• Cromatografia a gás-detecção por ionização em chama (CG-FID)

As análises de cromatografia gasosa acoplada à detecção por ionização

em chama e fase estacionária quiral [CG(quiral)-FID] foram feitas em

cromatógrafo a gás marca AGILENT modelo 6890. O cromatógrafo operava

com coluna do tipo Chrompack chirasil ciclodextrina CB (25 m x 0,25 mm x

0,25 μm) ou com coluna do tipo heptakis-(2,3-dimetil-6-pentil)-β-

ciclodextrina (25 m x 0,25 mm x 0,25 μm), fabricante Universidade de

Hamburg, Alemanha. Empregou-se hidrogênio de alta pureza como gás de

arraste, com fluxo de 1 mL/min. As análises foram realizadas com injetor

operando a 220ºC. Os volumes injetados foram de 1 μL com concentração de

solutos a 1 mg/mL, com divisão de fluxo de 1/100. O forno foi inicialmente

mantido a 50ºC, com incremento de temperatura de 2ºC/min até 180ºC, e 5

min isotermicamente à 180ºC.

• Ressonância magnética nuclear (RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio foram

obtidos em equipamento Varian Inova-500, operando a 499,88 MHz ou em

equipamento Varian Gemini-300, operando a 300,06 MHz. Utilizou-se CDCl3

como solvente e tetrametilsilano (TMS) como referência interna (δ 0,0). As

análises foram realizadas à temperatura ambiente. Os valores de

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

101

deslocamentos químicos foram obtidos em ppm e as constantes de

acoplamento em Hertz (Hz). Em alguns casos, dados adicionais foram obtidos

pelo uso da técnica gCOSY, permitindo verificar em mapas de contorno o

acoplamento entre hidrogênios a três ligações.

Os espectros de ressonância magnética nuclear de carbono foram

obtidos em equipamento Varian Inova, operando a 125,71 MHz ou em

equipamento Bruker Gemini, operando a 75,45 MHz. Utilizou-se CDCl3 como

solvente e tetrametilsilano (TMS) como referência interna (δ 0,0). As análises

foram realizadas à temperatura ambiente. Os valores de deslocamentos

químicos foram obtidos em ppm e as constantes de acoplamento em Hertz

(Hz). Como dados auxiliares, em alguns casos foram obtidos espectros pela

técnica DEPT 135º onde: CH3 e CH aparecem como sinais positivos, CH2

como sinais negativos e carbonos quaternários com intensidade zero. A

técnica DEPT 90º mostra apenas sinais de CH. Além disso, espectros

bidimensionais de correlações 1H, 13C a uma ligação (HSQC) e múltiplas

ligações (gHMBC) foram utilizados nas assinalações dos dados

espectroscópicos.

• Espectroscopia no infravermelho (IV), expectrometria de massas de

alta resolução (EMAR) e rotação ótica específica [α]D

As análises polarimétricas foram feitas em equipamento Perkin-Elmer

341 a 17ºC e os resultados foram convertidos para 20ºC através de equações

indicadas pelo fabricante. Utilizou-se metanol grau HPLC de pureza como

solvente nas análises polarimétricas. As análises de espectrometria de massas

de alta resolução foram feitas em equipamento Micromass VG AutoSpecE

(IE, 70 eV). As análises de espectroscopia no infravermelho foram feitas em

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

102

equipamento Bomem Michelson MB, utilizando pastilhas de KBr para suporte

das amostras.

• Manipulação de microrganismos

A manipulação e cultivo dos microrganismos utilizou capela de fluxo

laminar VECO modelo VLF 509, BOD marca QUIMIS, incubadora Shaker

MARCONI modelo MA 420, centrífuga marca HARRIER MSE 18/80 e

autoclave marca PHOENIX modelo LV30.

• Outros equipamentos

Outros equipamentos: geladeira marca ELECTROLUX, freezer

ELECTROLUX, balança analítica SARTORIUS BL1205, estufa de secagem,

agitador magnético THERMOLYNE Cimarec 2 e evaporador rotativo marca

BÜCHI B-480.

4.1.2. Meios de cultivo para microrganismos

O meio de cultivo Caldo Nutriente (NB) era proveniente da OXOID. O

meio NB líquido foi preparado a partir de 20 g de meio NB para 1000 mL de

água destilada. O meio sólido NB foi produzido pela adição de 2 % de ágar

bacteriológico marca SIGMA. O meio de cultivo Luria-Bertani (LB) possui a

seguinte constituição: 1 % peptona (OXOID), 0,5 % NaCl, 0,5 % extrato de

levedura (OXOID). Para o meio sólido, adicionou-se 2 % de ágar (SIGMA)

(Ravn et al., 2001). O meio TSB era proveniente da Biobrás e foi preparado

como descrito para o meio de cultivo caldo nutriente.

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

103

4.1.3. Reagentes e solventes

Todos os solventes utilizados eram da marca SYNTH, grau P.A. de

pureza. Estes foram destilados ou bidestilados antes do uso. Os reagentes

bromidrato de (±)-α-amino-γ-butirolactona, bromidrato de (S)-(-)-α-amino-γ-

butirolactona, ácido hexanóico, ácido heptanóico, ácido butanóico e ácido

octanóico eram provenientes da ALDRICH. O reagente cloridrato de 1-etil-3-

(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida era proveniente da SIGMA. Estes são

conservados sob refrigeração (-20ºC). A trietilamina era proveniente da

MERCK, foi destilada e mantida sob KOH (SYNTH).

A sílica para cromatografia em coluna era proveniente da MERCK, com

granulometria 0,035-0,070 mm. As análises em cromatografia em camada

delgada foram feitas em placas de sílica suportadas sobre alumínio Sílica gel

60 F254 (MERCK). Como reveladores, utilizou-se a técnica física de exposição

à luz ultravioleta (254 nm) e revelação química, através da aspersão ou

mergulho das placas em solução de p-anisaldeído (5 %), ácido acético glacial

(50 mL) e ácido sulfúrico concentrado (1 mL), seguida de aquecimento até

aparecimento de manchas coloridas.

4.1.4. Cepas bacterianas

A cepa Erwinia psidii RODRIGUES-NETO IBSBF 435 tipo foi

gentilmente cedida pelo Dr. Júlio Rodrigues Neto, curador da coleção de

culturas do Instituto Biológico de São Paulo, subestação Campinas. Isolado de

Psidium guajava (goiabeira) em 1982, Brasil (=ICMP 8426, NCPPB 3555;

LMG 7039; ATCC 49406). A reativação do cultivo liofilizado foi

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

104

realizada segundo instruções próprias da Coleção de Culturas IBSBF que

forneceu a cepa. Basicamente, a cepa foi re-hidratada por 20 minutos com

meio líquido caldo nutriente (NB) com agitações aleatórias com o pipetador.

Alíquotas de 100 μL da suspensão celular foram transferidas para placas de

petri contendo meio NB sólido, e espalhadas com alça de Drigalski estéril. As

placas foram levadas para incubação em BOD a 30ºC por 45 horas. Após este

período, as colônias esbranquiçadas foram transferidas para tubos slant

contendo meio NB sólido. A pureza da cepa foi atestada mediante lâminas de

Gram e observações ao microscópio (Instituto de Biologia, Unicamp).

A cepa Pantoea ananatis SERRANO CCT 6481T (= IBSBF 860, NCPPB

1846, ICMP 1850, ATCC 33244), linhagem tipo, foi adquirida da Coleção de

Culturas Tropical, da Fundação André Tosello (Campinas, São Paulo). A

bactéria foi mantida em meio NB sólido. A bactéria foi isolada no Brasil a

partir de uma infecção em abacaxi (Ananas comosus) em 1965.

A bactéria Pantoea agglomerans EWING & FIFE CBMAI 732 foi isolada

a partir de lesões do tipo anasarca em folhas de milho infectado pela doença

da “pinta branca do milho”, pela Dra. Luzia D. Paccola-Meirelles, da

Universidade Estadual de Londrina (UEL), Paraná. O milho foi coletado num

cultivo de campo realizado na Fazenda Escola da UEL em dezembro de 2003.

O procedimento de isolamento da cepa está descrito na literatura (Paccola-

Meirelles et al., 2001). A identificação da cepa foi feita mediante

seqüenciamento e análise filogenética de fragmentos do gene rRNA 16S. A

metodologia consistiu na amplificação do DNA ribossomal 16S pela

metodologia PCR, utilizando como molde o DNA genômico extraído

diretamente da amostra. Os primers (oligonucleotídeos sintéticos) utilizados

para a reação de PCR foram p27f e p1401r, homólogos às extremidades

conservadas do gene rRNA 16S de bactérias. Em seguida, os fragmentos de

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

105

rDNA 16S amplificados foram purificados e submetidos diretamente ao

sequenciamento em seqüenciador automático MegaBACE 1000 (Amersham

Biosciences). Os primers utilizados para o sequenciamento foram p10f, 765f,

782r e 1100r. As seqüências parciais de rDNA 16S obtidas com os diferentes

primers foram montadas em um contig (seqüência única combinando os

diferentes fragmentos obtidos) e comparadas com as seqüências de rDNA 16S

de organismos representados nas bases de dados do RDP (Ribosomal

Database Project, Wiscosin, USA)2 e Genbank3 . Foram então selecionadas

seqüências de organismos relacionados à seqüência do organismo

desconhecido para realização das análises filogenéticas. Esta metodologia

permitiu identificar a bactéria como sendo da espécie Pantoea agglomerans.

Um repique da cepa foi depositado na Coleção Brasileira de Microrganismos

do Meio Ambiente e Indústria (CBMAI), do CPQBA, UNICAMP (Campinas

– São Paulo), sob código CBMAI 732.

4.2. Bioensaio com Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) in vivo

Realizou-se o teste biológico in vivo com as cepas E. psidii IBSBF

435T e P. ananatis CCT 6481T através do biorepórter Agrobacterium

tumefaciens NTL4(pZLR4) para produção de acil-homosserina lactonas.

Os inóculos dos microrganismos Pseudomonas aeruginosa CCT 1987,

Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), E. psidii IBSBF 435 e P. ananatis

CCT 6481 foram preparados em tubos de ensaio contendo 2 mL de meio

líquido LB. Um repique de cada microrganismo foi realizado, e os cultivos

permaneceram por 24 h à 28ºC para crescimento em BOD. Diversos tubos de 2 http://www.cme.msu.edu/RDP/html/index.html 3 http://www.ncbi.nlm.nih.gov

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

106

ensaio receberam 2 mL de meio líquido LB. Os tubos foram numerados de 1 a

6, com duplicatas. À cada tubo foram adicionados:

* Tubo 1 (Branco): 20 μL do inóculo de A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 μL

X-Gal (estoque 50 mg/mL em dimetilformamida).

* Tubo 2 (Controle positivo): 20 μL do inóculo de A. tumefaciens

NTL4(pZLR4), 20 μL X-Gal, 20 μL do inóculo de P. aeruginosa.

* Tubo 3 (Teste): 20 μL do inóculo de A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 μL

X-Gal, 20 μL do inóculo de E. psidii.

* Tubo 4 (Branco): 20 μL X-Gal, 20 μL do inóculo de E. psidii.

* Tubo 5 (Teste): 20 μL do inóculo de A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 μL

X-Gal, 20 μL do inóculo de P. ananatis.

* Tubo 6 (Branco): 20 μL X-Gal, 20 μL do inóculo de P. ananatis.

Após as adições, os tubos foram agitados e mantidos sob incubação em

BOD a 28ºC. Após 18 horas, avaliou-se visualmente a coloração das soluções.

O tubo 1 (branco) apresentou apenas turbidez incolor. O tubo 2 (controle

positivo) apresentou forte coloração azul; o tubo 3 (teste) também apresentou

coloração azul. O tubo 4 (branco) apresentou turbidez incolor. Os tubos 5

(teste) e 6 (branco) apresentaram atividade biológica positiva, com forte

coloração azul.

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

107

4.3. Avaliação da atividade biológica com extratos dos meios de cultivo de

E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans

Prepararam-se inóculos dos microrganismos E. psidii, P. ananatis e P.

agglomerans em tubos de ensaio contendo 10 mL de meio líquido NB. Os

tubos foram mantidos sob incubação a 30ºC, sem agitação, em BOD. Após 24

horas, os inóculos foram transferidos a erlenmeyers (2 L) contendo 1 L de

meio de cultivo NB líquido. Os cultivos foram então incubados sob agitação.

A bactéria E. psidii foi cultivada a 30ºC e sob agitação orbital de 100 rpm,

enquanto que os demais microrganismos foram incubados a 28ºC e 150 rpm.

Após 24 horas, os meios de cultivo foram centrifugados, sob refrigeração

(5ºC), à 5000 rpm por 20 minutos. Os sobrenadantes reunidos (1 L) foram

extraídos com acetato de etila (previamente destilado), 3 x 500 mL. As fases

orgânicas reunidas (1,5 L) foram extraídas com água destilada (1 x 500 mL),

secas sob sulfato de sódio anidro e evaporadas sob pressão reduzida a 40-

45ºC.

O branco foi feito a partir de 1 L de meio de cultivo NB estéril. O meio

de cultivo foi extraído com acetato de etila e o extrato foi preparado como

descrito acima.

Os extratos assim obtidos foram cromatografados em coluna flash de

sílica (coluna com 1 cm de diâmetro; 2 g de sílica 0,035-0,070 mm de

granulometria). Foram recolhidas três frações: 1. hexano; 2. acetato de etila ;

3. metanol, com 50 mL cada. As frações foram evaporadas sob pressão

reduzida.

As frações acetato de etila provenientes dos cultivos dos

microrganismos foram bioensaiadas em testes de expressão de enzimas β-

galactosidase com o repórter Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) como

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

108

descrito no tópico anterior. As frações foram solubilizadas em etanol, na

concentração de 2 mg/mL. Utilizou-se 20 μL de cada solução. Como controle

branco, utilizou-se a fração acetato de etila proveniente do meio de cultivo

caldo nutriente (NB).

Todas as frações acetato de etila provenientes dos cultivos dos

microrganismos apresentaram respostas positivas frente ao teste biológico. A

fração proveniente do meio de cultivo caldo nutriente apresentou resposta

negativa.

4.4. Cultivo das bactérias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans para

extração de acil-homosserina lactonas

Prepararam-se inóculos dos microrganismos E. psidii, P. ananatis e P.

agglomerans em tubos de ensaio contendo 10 mL de meio líquido NB. Os

tubos foram mantidos sob incubação a 30ºC, sem agitação, em BOD. Após 24

horas, os inóculos foram transferidos a erlenmeyers (2 L) contendo 1 L de

meio de cultivo NB líquido. Os cultivos foram então incubados sob agitação.

A bactéria E. psidii foi cultivada a 30ºC e sob agitação orbital de 100 rpm,

enquanto que os demais microrganismos foram incubados a 28ºC e 150 rpm.

Após 24 horas, os meios de cultivo foram centrifugados, sob refrigeração

(5ºC), à 5000 rpm por 20 minutos. Os sobrenadantes reunidos (1 L) foram

extraídos com acetato de etila (previamente destilado), 3 x 500 mL. As fases

orgânicas reunidas (1,5 L) foram extraídas com água destilada (1 x 500 mL),

secas sobre sulfato de sódio anidro e evaporadas sob pressão reduzida a 40-

45ºC.

O procedimento global descrito acima foi repetido, perfazendo-se 8

litros de cultivo nos casos das bactérias E. psidii e P. ananatis. Obteve-se

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109

assim a quantidade total de 0,728 g de extrato para a bactéria E. psidii e 0,705

g para a bactéria P. ananatis. Estes extratos foram cromatografados em coluna

de sílica (15 g sílica, coluna com 2 cm de diâmetro), com os solventes hexano,

diclorometano e acetato de etila, em ordem crescente de polaridade,

coletando-se frações de 50 mL. O acompanhamento da eluição foi realizado

via CCD em placas de sílica suportadas sobre alumínio e revelação com

anisaldeído sulfúrico, seguida de aquecimento a 120ºC por 2 minutos. Foram

tomadas frações de 50 mL, evaporadas sob pressão reduzida. Foram retiradas

84 frações no caso da bactéria E. psidii e 80 frações com o extrato da bactéria

P. ananatis. As frações foram reunidas por semelhança em CCD.

O extrato de 1L de cultivo (228,0 mg) da espécie P. agglomerans foi

fracionado por cromatografia flash em coluna de sílica (coluna com 1 cm de

diâmetro; 2 g de sílica 0,035-0,070 mm de granulometria). Foram recolhidas

três frações: 1. hexano; 2. acetato de etila ; 3. metanol, com 50 mL cada. As

frações foram evaporadas sob pressão reduzida. A fração acetato de etila (26,4

mg) foi fracionada em coluna de sílica (6,5 g de sílica; coluna com 1,0 cm de

diâmetro), eluída com os solventes hexano, diclorometano, acetato de etila e

metanol, em ordem crescente de polaridade. Foram recolhidas 81 frações, com

8 mL cada. As frações foram reunidas por semelhança em CCD.

4.5. Detecção de acil-homosserina lactonas por CG-EM

A análise das frações reunidas, obtidas dos cultivos dos

microrganismos, foi feita por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria

de massas (CG-EM) nas condições descritas pelo Programa 2 de temperatura.

Em todas as espécies bacterianas estudadas, foram identificados sinais com

padrão de fragmentação característico das acil-HSLs em frações

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

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correspondentes à polaridade de eluição CH2Cl2:AcEt 4:1. Em alguns casos,

as acil-HSLs foram identificadas utilizando-se o modo SIM de detecção.

Na espécie E. psidii, foram identificadas duas acil-HSLs. A N-hexanoil-

HSL estava presente na fração FRA32 e na fração FRA33-35. Detectou-se

ainda uma quantidade traço de N-heptanoil-HSL na fração FRA32.

NH

O

O

O N-hexanoil-homosserina lactona (1): CG-EM (IE, 70 eV) m/z: 199 (M+, 2%),

170 (5%), 156 (12%), 143 (100%), 128 (5%), 125 (21%), 115 (6%), 102

(12%), 101 (15%), 100 (8%), 99 (22%), 85 (7%), 71 (23%), 57 (45%), 56

(18%), 55 (13%), 43 (47 %).

NH

O

O

O

N-heptanoil-homosserina lactona (2): CG-EM (IE, modo SIM, 70 eV) m/z:

213 (M+, 1%), 184 (1%), 170 (2%), 156 (10%), 143 (100%), 128 (5%), 125

(20%), 113 (15%), 102 (14%), 101 (15%), 100 (7%), 85 (16%), 83 (13%), 57

(44%), 43 (35%).

No estudo da bactéria P. ananatis, as frações reunidas FRA35-38 e

FRA39-41, FRA42 e FRA43 correspondentes à polaridade de eluição

CH2Cl2:AcEt 4:1 apresentaram sinais cromatográficos com padrão de

fragmentação característico das acil-HSL. Estes metabólitos foram

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

111

identificados como a N-hexanoil, N-heptanoil e N-octanoil-HSL. Os dados de

fragmentação por CG-EM obtidos para a N-hexanoil e N-heptanoil-HSL

foram idênticos aos reportados anteriormente no estudo da espécie E. psidii. A

N-octanoil-HSL foi identificada utilizando-se o modo SIM de detecção, sob as

condições de análise em CG-EM descritas pelo Programa 1 de temperaturas.

NH

O

O

O N-octanoil-homosserina lactona (3). CG-EM (IE, modo SIM, 70 eV) m/z: 227

(M+, 4%), 198 (4%), 184 (4%), 170 (4%), 156 (18%), 143 (100%), 128 (8%),

127 (10%), 125 (19%), 102 (12%), 101 (12%), 100 (5%), 85 (6%), 57 (48%).

A análise das frações provenientes do cultivo de P. agglomerans

revelou a presença de uma quantidade traço de N-hexanoil-HSL na fração

FRA56-58. Foi ainda possível obter 1,1 mg de N-butanoil-HSL pura (fração

FRA59-64) do cultivo desta bactéria.

NH

O

O

O

N-butanoil-homosserina lactona (4). CG-EM (IE, 70 eV) m/z: 171 (M+., 5%),

153 (4%), 143 (91%), 125 (9%), 113 (8%), 102 (6%), 101 (9%), 100 (9%), 85

(13%), 71 (60%), 57 (90%), 43 (100%). RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3,

TMS): δ 0,96 (H-4’, 3H, t, J 7,3 Hz), 1,69 (H-3’, 2H, m), 2,14 (H-4, 1H, m),

2,24 (H-2’, 2H, t, J 7,3 Hz), 2,87 (H-4, 1H, m), 4,19 (H-5, 1H, ddd, J 5,8; 11,3

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

112

e 9,2 Hz), 4,48 (H-5, 1H, t, J 9,5 Hz), 4,55 (H-3, 1H, ddd, J 5,9; 8,9 e 11,3

Hz), 6,03 ppm (NH, s largo).

4.6. Análise do branco para acil-homosserina lactonas identificadas por

CG-EM

O branco para as acil-HSLs majoritárias identificadas em cada bactéria

foi feito analisando-se por CG-EM as frações acetato de etila obtidas a partir

de 1 L de meio de cultivo de cada espécie, bem como o extrato acetato de etila

obtido do meio de cultivo caldo nutriente (Tópico 4.3). Utilizou-se o modo

SIM de detecção, selecionando-se os íons mais intensos em cada caso.

Identificou-se as acil-HSLs majoritárias em todos os cultivos das bactérias, o

que não foi observado para o meio de cultivo caldo nutriente. As análises

foram feitas utilizando-se o Programa 2 de temperaturas.

4.7. Síntese de acil-homosserina lactonas

C4H8NO2BrPM = 181 g/mol

Cl-N C N

NH

H2O, Et3Nt.a., 24 hBr-

O

ONH3

+

+ (CH2)nOH

O

(CH2)nNH

O

O

O

Num balão de ensaio de 5 mL, adicionou-se trietilamina (1,05x10-4

mol), bromidrato de (±)-α-amino-γ-butirolactona (1,05x10-4 mol) e ácido

butanóico, hexanóico, heptanóico ou octanóico (1,57x10-4 mol), dissolvidos

em 2,5 mL de água ultra pura (Milli-Q). Em seguida, adicionou-se cloridrato

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

113

de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (1,57x10-3 mol). A mistura

reacional permaneceu sob agitação magnética à temperatura ambiente. Após

24 horas, esta foi extraída com acetato de etila (3 x 10 mL) e a fase orgânica

combinada foi extraída com solução de bicarbonato de sódio 5% (2 x 6 mL),

bissulfato de sódio 1 M (1 x 6 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (1 x

6 mL). O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, formando um sólido

branco.

4'

3'

2'1'

51

234

NH

OO

O

(±)-N-butanoil-homoserina lactona (4). 19 % de rendimento.

CG-EM (IE, 70 eV). m/z 171 (M+, %), 153 (6%), 143 (90%), 125 (9%),

113 (9%), 102 (6%), 101 (9%), 100 (10%), 85 (12%), 71 (63%), 57 (93%), 43

(100%). Índice de Kóvats: 1523.

IV (KBr). 3311,7; 2961,2; 2871,6; 1776,1; 1646,3; 1550,2; 1383,8;

1175,2 cm-1.

RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): δ 0,98 (H-4’, 3H, t, J 7,3 Hz),

1,71 (H-3’, sexteto, 2H, J 7,3 Hz), 2,14 (H-4, 1H, m), 2,25 (H-2’, 2H, t, J 7,1

Hz), 2,88 (H-4, 1H, m), 4,30 (H-5, 1H, ddd, J 5,9; 11,4 e 9,2 Hz), 4,48 (H-5,

1H, t, J 8,1 Hz), 4,57 (H-3, 1H, ddd, J 5,9; 8,4 e 11,7 Hz), 6,04 ppm (NH, s

largo).

RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): δ 13,6 (C-4’), 18,9 (C-3’),

30,7 (C-4), 38,0 (C-2’), 49,3 (C-3), 66,1 (C-5), 173,6 (C-1’), 175,5 ppm (C-2).

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

114

6'

5'

4'

3'

2'1'

51

234

NH

OO

O

(±)-N-hexanoil-homosserina lactona (1). Rendimento da reação: 54 %.

CG/EM (IE, 70 eV) m/z: 199 (M+, 1%), 170 (4%), 156 (11%), 143

(100%), 128 (5%), 125 (21%), 115 (5%), 102 (12%), 101 (15%), 100 (8%), 99

(23%), 85 (7%), 71 (26%), 57 (52%), 56 (20%), 55 (17%), 43 (49 %). Índice

de Kóvats: 1731.

IV (KBr). 3316,2; 2961,7; 2865,1; 1777,5; 1645,0; 1547,9; 1383,9;

1173,8; 1015,0 cm-1.

RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): δ 0,89 (t, 3H, J 6,9 Hz, H-

6’), 1,31 (m, 4H, H-4’, H-5’), 1,65 (quinteto, 2H, J 7,6 Hz, H-3’), 2,14 (m,

1H, H-4), 2,25 (t, 1H, J 6,9 Hz, H-2’), 2,85 (m, 1H, H-4), 4,29 (ddd, 1H, J 5,9;

11,4 e 9,5 Hz, H-5), 4,47 (t, 1H, J 9,1 Hz, H-5), 4,56 (ddd, 1H, J 5,9; 11,4 e

8,4 Hz, H-3), 6,09 (s largo, NH).

RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): δ 13,9 (C-6’); 22,4 (C-5’);

25,1 (C-3’); 30,6 (C-4); 31,4 (C-4’); 36,1 (C-2’); 49,3 (C-3); 66,1 (C-5); 173,7

(C-1’); 175,5 (C-2).

NH

OO

O

43 2

15

1'2'

3'

4'

5'

6'

7'

(±)-N-heptanoil-homosserina lactona (2). Rendimento da reação: 64%.

CG/EM (IE, 70 eV) m/z: 213 (M+, 2%), 184 (2%), 170 (4%), 156 (15%), 143

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

115

(100%), 128 (5%), 125 (20%), 113 (13%), 102 (12%), 101 (16%), 100 (6%),

85 (16%), 83 (13%), 57 (50%), 43 (43%). Índice de Kóvats: 1841.

IV (KBr). 3315,8; 2955,4; 2858,8; 1776,7; 1646,4; 1545,7; 1384,2;

1173,6; 1013,6 cm-1.

RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): δ 0,88 (t, 3H, J 7,3 Hz, H-

7’), 1,29 (m, 6H, H-4’, H-5’, H-6’), 1,64 (quinteto, 2H, J 7,6 Hz, H-3’), 2,14

(m, 1H, H-4), 2,25 (t, 1H, J 8,9 Hz, H-2’), 2,84 (m, 1H, H-4), 4,28 (ddd, 1H, J

5,8; 11,3 e 9,5 Hz, H-5), 4,47 (t, 1H, J 8,9 Hz, H-5), 4,56 (ddd, 1H, J 5,8;

11,6; 8,6 Hz, H-3), 6,15 (d, NH, J 3,7 Hz).

RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): δ 14,0 (C-7’); 22,4 (C-6’);

25,3 (C-3’); 28,8 (C-5’); 30,5 (C-4); 31,4 (C-4’); 36,1 (C-2’); 49,2 (C-3); 66,1

(C-5); 173,7 (C-1’); 175,5 (C-2).

NH

OO

O

43 2

15

1'2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

(±)-N-octanoil-homoserina lactona (3). 53 % de rendimento.

CG-EM (IE, 70 eV). m/z 227 (M+, 2%), 198 (2%), 170 (3%), 156

(17%), 143 (100%), 128 (8%), 127 (10%), 125 (21%), 102 (13%), 101 (14%),

57 (76%), 43 (22%). Índice de Kóvats: 1947.

IV (KBr). 3316,3; 2954,1; 2856,3; 1777,3; 1644,9; 1549,3; 1383,4;

1173,7; 1013,7; 656,6 cm-1.

RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): δ 0,88 (H-8’, 3H, t, J 7,2 Hz),

1,29 (H-7’, H-6’, H-5’, m, 6H), 1,64 (H-3’, 2H, quinteto, J 7,2 Hz), 2,15 (H-4,

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

116

1H, m), 2,26 (H-2’, 2H, t, J 7,8 Hz), 2,83 (H-4, 1H, m), 4,28 (H-5, 1H, ddd, J

5,9; 11,1 e 9,2 Hz), 4,46 (H-5, 1H, t, J 9,0 Hz), 4,57 (H-3, 1H, ddd, J 5,7; 11,6

e 8,6 Hz), 6,23 ppm (NH).

RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): δ 14,0 (C-8’), 22,6 (C-7’),

25,4 (C-3’), 28,9 (C-4’), 29,1 (C-5’), 30,6 (C-4), 31,6 (C-6’), 36,1 (C-2’), 49,2

(C-3), 66,1 (C-5), 173,9 (C-1’), 175,6 (C-2).

As sínteses das acil-homosserina lactonas quirais foram feitas através do

mesmo procedimento descrito acima, porém utilizando-se como reagente o

bromidrato de S-(-)-α-amino-γ-butirolactona.

4'

3'

2'1'

51

234

NH

OO

OH

(S)-(-)-N-butanoil-homosserina lactona (4). Rendimento e dados de CG-EM,

RMN de 1H e 13C similares aos obtidos para a (±)-N-butanoil-homoserina

lactona. [α]D20 –23,68º (c. 0,38 MeOH).

NH

OO

OH

43 2

15

1'2'

3'

4'

5'

6'

(S)-(-)-N-hexanoil-homosserina lactona (1). Rendimento e dados de CG-EM,

RMN de 1H e 13C similares aos obtidos para a (±)-N-hexanoil-homosserina

lactona. [α]D20 –22,86º (c. 0,35 MeOH).

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__________________________________________CAPÍTULO 4 – PARTE EXPERIMENTAL

117

4.8. Co-injeção de produtos naturais e sintéticos em CG-EM

As frações contendo as acil-homosserina lactonas naturais identificadas

nos microrganismos E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans foram co-

injetadas em CG-EM com os produtos sintéticos correspondentes, segundo o

Programa 2 de temperaturas. No caso da N-octanoil-homosserina lactona

identificada nos cultivos de P. ananatis, a co-injeção foi feita seguindo o

Programa 1 de temperaturas.

4.9. Avaliação da atividade biológica de produtos sintéticos com o

biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)

Os produtos sintéticos foram bioensaiados com o repórter

Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), em ensaio de expressão de

enzimas β-galactosidase. Os produtos sintéticos foram diluídos em etanol

absoluto (2 mg/mL) e bioensaiados como descrito anteriormente para os

extratos (Tópico 4.3). Como controle negativo, utilizou-se etanol absoluto (20

μL). As colorações dos tubos foram avaliadas visualmente, após 24 horas de

incubação a 30ºC.

4.10. Determinações de configurações absolutas de produtos naturais por CG-FID

As análises foram feitas em cromatógrafo gasoso acoplado a um

detector por ionização em chama, utilizando-se colunas com fases

estacionárias quirais. Inicialmente, determinou-se a configuração absoluta da

N-hexanoil-HSL produzida por E. psidii, presente na fração FRA32 e

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118

produzida por P. ananatis, presente na fração FRA43. As condições analíticas

de separação na coluna Chrompack Chirasil ciclodextrina foram otimizadas

utilizando-se o produto racêmico (±)-N-hexanoil-HSL sintético. O tempo de

retenção do enantiômero (S) foi obtido pela análise do produto sintético (S)-(-

)-N-hexanoil-HSL. A configuração do produto natural proveniente de E. psidii

e posteriormente de P. ananatis (FRA43) foi feita pela injeção das respectivas

frações nas mesmas condições e por co-injeção com produto sintético

racêmico.

A determinação da configuração absoluta da N-butanoil-homosserina

lactona produzida por P. agglomerans foi feita da mesma maneira, porém

utilizando-se a fase estacionária quiral heptakis-β-ciclodextrina. As condições

de análise foram descritas na seção Materiais e Equipamentos (4.1).

4.11. Avaliação da atividade patogênica das cepas P. ananatis CCT 6481T

e P. agglomerans CBMAI 732 em folhas jovens de milho (Zea mays)

A avaliação da patogenicidade das cepas P. agglomerans CBMAI 732 e

P. ananatis CCT 6481T foi realizada através da inoculação artificial em folhas

de milho da variedade BR HS200, reconhecidamente suscetível à doença da

“pinta branca do milho”, em colaboração com a Dra. Luzia D. Paccolla-

Meirelles (UEL). As sementes do vegetal foram plantadas em vasos,

totalizando 3 plantas/vaso. As plantas se desenvolveram em casa de vegetação

úmida por 35 dias, quando foram feitas as inoculações. Um controle negativo,

não inoculado, foi mantido.

O inóculo foi preparado em meio TSB líquido (Tryptic Soy Broth). A

suspensão bacteriana foi espalhada sobre as folhas por spray, sem causar

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119

ferimentos e deixadas em câmara úmida, a temperatura ambiente (~30-35ºC)

durante 72 horas. A seguir, os vasos foram levados para choque térmico,

sendo mantidos por 24 horas a 20ºC. Após este período, os vasos retornaram

para o cultivo câmara úmida, onde permaneceram por mais 6 dias. Foi

avaliada a formação de manchas brancas nas folhas, características da doença.

Em um outro experimento de avaliação da patogenicidade, folhas de

milho BR HS200 de 35 dias de idade foram levemente injuriadas com esponja

e acopladas em moldes de acrílico contendo orifícios. Uma suspensão

bacteriana em solução salina (108 u.f.c.) foi pipetada nos orifícios do molde (1

gota/orifício). Após 72 horas de incubação à temperatura ambiente, o molde

foi desmontado e os sintomas observados. Para o controle negativo as folhas

receberam apenas solução salina.

4.12. Avaliação da presença de acil-homosserina lactonas em folhas de

milho infectadas pela cepa P. agglomerans e folhas de milho provenientes

de campo

Inicialmente, prepararam-se extratos de folhas de milho BR HS200

cultivado em casa de vegetação. Duas folhas foram coletadas: uma inoculada

pela cepa P. agglomerans (3,10 g de material biológico) com sinais de necrose

e outra não inoculada, sadia (controle, 4,74 g de material biológico). As folhas

foram segmentadas e extraídas com acetato de etila (50 mL). O sobrenadante

foi filtrado e evaporado sob pressão reduzida. Os extratos foram em seguida

submetidos à filtração em coluna de sílica-gel (2 g de sílica, coluna com 1 cm

de diâmetro) com acetato de etila como eluente (40 mL). A partir dos sólidos

obtidos por evaporação foram preparadas soluções estoque em etanol absoluto

(10 mg/mL) de cada extrato. Os extratos foram bioensaiados com a cepa A.

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120

tumefaciens NTL4(pZLR4), como descrito para os produtos sintéticos (Tópico

4.9). Como controle positivo, utilizou-se 20 μL de solução de (±)-N-hexanoil-

HSL em etanol (2 mg/mL) e como controle negativo, etanol absoluto (20 μL).

Um segundo tipo de controle foi feito com o objetivo de distinguir a coloração

do meio de cultivo contendo apenas os extratos e os meios de cultivo onde

foram realizados os testes. Os meios de cultivo contendo extratos

apresentaram coloração amarela, claramente distinta do azul-esverdeado

formado nos casos de atividade biológica positiva. Após 24 h, as colorações

das soluções foram avaliadas visualmente.

O mesmo procedimento descrito acima foi aplicado com folhas de

milho oriundas de cultivo em campo. Todas as plantas apresentavam 100 dias

de cultivo (plantio em dezembro de 2004), já no final do ciclo vegetativo do

milho. Os seguintes extratos em acetato de etila foram preparados:

1. Milho BRS1010 resistente à doença e sem sintomas (60,4 g de material

biológico).

2. Milho de variedade desconhecida infectado pela doença e com sinais de

necrose (130,3 g de material biológico).

2. Milho de variedade desconhecida infectado pela doença (dos mesmos

vegetais de onde foram coletadas as folhas necrosadas), porém sem sinais

de necrose (46,0 g de material biológico).

Aproximadamente 30 mg de cada extrato foram filtrados em coluna de

sílica-gel (2 g de sílica, coluna com 1 cm de diâmetro) utilizando-se de acetato

de etila (40 mL) como eluente. Foram preparadas soluções estoque a 10

mg/mL em etanol absoluto de cada extrato, e estas foram bioensaiadas da

mesma maneira como descrito para o milho proveniente do cultivo em casa de

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121

vegetação, incluindo os controles positivo e negativos. Após 24 h, as

colorações das soluções foram avaliadas visualmente.

4.13. Determinação da constituição química das secreções de defesa dos

opiliões Goniosoma longipes e Camarana flavipalpi

As secreções de defesa química da espécie G. longipes e C. flavipalpi

foram coletadas pressionando-se as glândulas produtoras com algodão tratado

(~50 mg), preparado através da lavagem de algodão comum com acetato de

etila bidestilado. O líquido absorvido foi extraído com acetato de etila (0,5-5

mL, bidestilado, SYNTH) para análises em CG-EM ou com CDCl3/TMS

(600 μL) para análises de ressonância magnética nuclear. Para a espécie G.

longipes, obteve-se aproximadamente 12 mg de secreção amarela de um

indivíduo macho. No caso da espécie C. flavipalpi, um indivíduo macho

rendeu apenas 0,3 mg de secreção incolor; em análises de ressonância

magnética nuclear, utilizou-se as secreções de 7 indivíduos da espécie C.

flavipalpi, totalizando aproximadamente 2,1 mg de secreção.

As amostras foram analisadas por cromatografia em camada delgada

utilizando-se acetato de etila como eluente. As análises das secreções de G.

longipes e C. flavipalpi por CG-EM foram feitas segundo o Programa 3 de

temperaturas. No caso da espécie G. longipes, realizou-se ainda a análise por

CG-EM das secreções produzidas por indivíduos macho, fêmea, fêmea

ovígera e fêmea após desova.

Substâncias identificadas na secreção de defesa de G. longipes:

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122

2,3-dimetil-1,4-benzoquinona (6).

EMAR (IE, 70 eV): 136,05392 (calculado: 136,05244; C8H8O2).

CG-EM m/z 136 (M+, 100%), 108 (57%), 107 (56%), 82 (44%), 79

(52%), 65 (5%), 54 (50%).

RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): δ 2,05 (s, 6H, H-7, H-8),

6,72 (s, 2H, H-5, H-6).

RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): δ 187,39 (C-1, C-4); 140,99

(C-2, C-3); 136,24 (C-5, C-6); 12,18 (C-7, C-8).

9

76

54

3

21

O

O

8

2-etil-3-metil-1,4-benzoquinona (7).

EMAR (IE, 70 eV): 150,06824 (calculado: 150,06810; C9H10O2).

CG-EM m/z 150 (M+, 100%), 135 (10%), 122 (37%), 121 (18%), 107

(79%), 82 (21%), 79 (38%), 67 (12%), 54 (22%).

RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): δ 6,71 (singleto largo, 2H,

H-5, H-6), 2,51 (q, J 7,6 Hz, 2H, H-7), 1,06 (t, J 7,6 Hz, 3H, H-8), 2,05 (s, 3H,

H-9).

O

O

12

3

45

67

8

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123

RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): δ 187,10 (C-1); 146,15 (C-

2); 140,37 (C-3); 187,90 (C-4); 136,19 (C-5); 136,37 (C-6); 19,73 (C-7);

12,84 (C-8); 11,63 (C-9).

Um fenol substituído foi identificado na secreção de defesa de

Camarana flavipalpi:

OH

1 2

3

45

67

8

9

2-metil-5-etilfenol (8).

CG-EM m/z 136 (M+, 42%), 121 (100%), 91 (9%), 77 (16%).

RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): δ 7,03 (d, 1H, J 7,6 Hz, H-3),

6,70 (dd, 1H, J 7,6 e 1,5 Hz, H-4), 6,40 (d, 1H, J 1,5 Hz, H-6), 2,57 (q, 2H, J

7,6 Hz, H-8), 2,22 (s, 3H, H-7), 1,22 (t, 3H, J 7,6 Hz, H-9).

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

137

_____________________ ANEXOS: ESPECTROS

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

139

E1. Espectro de massas (IE, 70 eV) da substância (1) sintética.

E2. Espectro no IV (KBr) da substância (1) sintética.

4000 3000 2000 1000

16

18

20

22

24

26

28

30

32

646.561225.76

1015.01

1173.811547.92

1644.971777.54

2865.06

2961.65

3316.20

Tran

smitâ

ncia

Número de onda (cm-1)

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

140

E3. Espectro de RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substância (1) sintética.

E4. Espectro de RMN de 13C (125,69 MHz, CDCl3, TMS) da substância (1) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

141

E5. Mapa de contornos de RMN 2D de correlações 1H, 1H gCOSY (499,88 MHz, CDCl3,

TMS) da substância (1) sintética.

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

142

E6. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC da substância (1) sintética.

E7. Espectro de RMN de 13C DEPT 135º e DEPT 90º (125,69 MHz, CDCl3, TMS) da substância (1) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

143

E8.Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substância (1) sintética.

E9. Espectro de massas (IE, 70 eV) da substância (2) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

144

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5008

10

12

14

16

18

20

22

24

26

1013.631545.71

1384.16

1173.56

656.568

1776.70

2858.77

2929.46

1646.42

3315.82

Tran

smitâ

ncia

Número de onda (cm-1)

E10. Espectro no IV (KBr) da substância (2) sintética.

E11. Espectro de RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substância (2) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

145

E12. Espectro de RMN de 13C (125,69 MHz, CDCl3, TMS) da substância (2) sintética.

E13. Espectro de RMN de 13C DEPT 135º e DEPT 90º (125,69 MHz, CDCl3, TMS) da substância (2) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

146

E14. Mapa de contornos de RMN 2D de correlações 1H, 1H 1J (gCOSY) (499,88 MHz,

CDCl3, TMS) da substância (2) sintética.

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

147

E15. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC da substância (2) sintética.

E16. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substância (2) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

148

E17. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substância (2) sintética.

E18. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substância (2) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

149

E19. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substância (2) sintética.

E19. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substância (2) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

150

E20. Espectro de massas (IE, 70 eV) da substância (3) sintética.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

20

30

40

50

60

2928.31

2856.26

1777.321644.85

1549.30

656.57

1013.73

1173.73

3316.30Tran

smitâ

ncia

Número de onda (cm-1)

E21. Espectro no IV (KBr) da substância (3) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

151

E22. Espectro de RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substância (3) sintética.

E23. Espectro de RMN de 13C (125,69 MHz, CDCl3, TMS) da substância (3) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

152

E24. Mapa de contornos de RMN 2D de correlações 1H, 1H 1J (gCOSY) (499,88 MHz,

CDCl3, TMS) da substância (3) sintética.

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

153

E25. Espectro de RMN de 13C DEPT 135º e DEPT 90º (125,69 MHz, CDCl3, TMS) da substância (3) sintética.

E26. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC da substância (3) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

154

E27. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C

(125,70 MHz) nJ gHMBC da substância (3) sintética.

E28. Espectro de massas (IE, 70 eV) da substância (4) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

155

E29. Espectro de RMN de 13C (75,45 MHz, CDCl3, TMS) da substância (4) sintética.

E30. Espectro de RMN de 13C DEPT 135º e DEPT 90º (75,45 MHz, CDCl3, TMS) da substância (4) sintética.

NH

OO

O

NH

OO

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

156

E31. Espectro de RMN de 13C (125,69 MHz, CDCl3, TMS) das substâncias (6) e (7).

E32. Espectro de RMN de 13C DEPT 135º e DEPT 90º (125,69 MHz, CDCl3, TMS) das substâncias (6) e (7).

O

O

O

O

O

O

O

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

157

E33. Espectro de RMN de 13C DEPT 135º e DEPT 90º (125,69 MHz, CDCl3, TMS) das substâncias (6) e (7) – ampliado.

O

O

O

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

158

E34. Mapa de contornos de RMN 2D de correlações 1H, 1H 1J (gCOSY) (499,88 MHz,

CDCl3, TMS) das substâncias (6) e (7).

O

O

O

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

159

E35. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC das substâncias (6) e (7).

E36. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC das substâncias (6) e (7).

O

O

O

O

O

O

O

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

160

E37. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC das substâncias (6) e (7).

E38. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC das substâncias (6) e (7).

O

O

O

O

O

O

O

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

161

E39. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H

(499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC das substâncias (6) e (7).

E40. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H

(499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC das substâncias (6) e (7).

O

O

O

O

O

O

O

O

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_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS

162

E41. Expansão do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlações 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC das substâncias (6) e (7).

O

O

O

O

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E42. Espectro de massas de alta resolução das substâncias (6) e (7).

O

O

O

O

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________________________________ ARTIGO

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__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO

167

Journal of Agricultural and Food Chemistry, Volume 53, p. 6262-6265,

2005.

ACYL-HOMOSERINE LACTONES FROM Erwinia psidii R. IBSBF 435T, A

GUAVA PHYTOPATHOGEN (Psidium guajava L.).

ARMANDO M. POMINI†, GILSON P. MANFIO‡, WELINGTON L.

ARAÚJO§, AND ANITA J. MARSAIOLI†,*.

Chemistry Institute, State University of Campinas, CP 6154, CEP 13083-970,

Campinas - SP, Brazil; Natura Inovação e Tecnologia de Produtos Ltda. Rod.

Anhagüera s/n Km 30.5, CEP 07750-000, Cajamar – SP, Brazil and

Departamento de Genética, ESALQ, USP, CP 83, CEP 13400-970, Piracicaba

– SP, Brazil.

ABSTRACT

The phytopathogen Erwinia psidii R. IBSBF 435T causes rot in branches,

flowers and fruits of guava (Psidium guajava L.), being responsible for crop

losses and has no effective control. It was demonstrated that this strain

produces two compounds [S-(-)-N-hexanoyl and N-heptanoyl-homoserine

lactone], both belonging to the class of quorum-sensing signalling substances.

A protocol using gas chromatography-flame ionization detection with chiral * Author to whom correspondence should be addressed (telephone + 55 19 37883098; email: [email protected]). † Chemistry Institute, State University of Campinas. ‡ Natura Inovação e Tecnologia de Produtos Ltda. § Departamento de Genética, ESALQ, USP.

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__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO

168

stationary phase is described for the absolute configuration determination of a

natural acyl-homoserine lactone. Biological assays with specific reporter and

synthesis of identified substances are also described. This is the first report on

the N-heptanoyl-homoserine lactone occurrence in the Erwinia genus.

KEYWORDS: Acyl-homoserine lactones, Erwinia psidii R., Psidium

guajava L., GC-MS, quorum-sensing.

INTRODUCTION

The guava tree (Psidium guajava L.) is a perennial plant belonging to

the Myrtaceae family, popularly known in Brazil as “goiabeira”. It is

cultivated in ca. 11,500 hectares, being an important commercial culture

mainly for small farmers. Their fruits are appreciated in natura and as juices,

candies and jellies (1).

One of the major drawbacks to guava production is caused by the

phytopathogen Erwinia psidii R. This disease is characterized by wilt of new

branches (which become black or brown), lesions and cell death in leaves,

necrosis and mummification of flowers and fruits. The bacterium is introduced

into the orchards by contaminated shoots and spreads during the pruning

process (2).

It has become clear that bacteria do not survive as solitary

microorganisms, but exploit elaborate intercellular communication systems to

adapt themselves to the fluctuations of environmental conditions, by a process

known as quorum-sensing. This process is based on the production of low-

molecular weight diffusible substances, whose extra-cellular concentrations

are related to the microorganism population density. Upon reaching the

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__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO

169

critical concentration, the signalling substances can be detected by the cells,

inducing the population to initiate a concerted action (3). This control of

phenotypic expression may be of extreme importance in pathogenic

infestations, when the premature production of virulence factors can alert host

defense systems before a high population density is reached (4).

In Gram-negative bacteria, the main class of signalling substances is

acyl-homoserine lactones (acyl-HSL). The first study of phenotypic

expression control by these substances was reported for the marine

luminescent bacterium Vibrio fischeri B.. In the free-living bacterium, light

emission is not observed, however, in high cellular concentrations, V. fischeri

displays bioluminescence with blue-green light. During growth, this

microorganism releases an autoinducer, N-(3-oxo-hexanoyl)-HSL, which

regulates the expression of genes responsible for bioluminescence once its

critical concentration is reached. This control of phenotypic expression is

essential for this microorganism in ecological relationships with the squid

Euprymna scolopes B.. Genes controlling synthesis and detection of the

autoinducer are called luxI and luxR, respectively, and are well characterized

in this bacterium (5, 6).

Since its discovery, the quorum-sensing system has been demonstrated

in a great number of Gram-negative bacteria, many of which employ acyl-

HSL in intercellular communication. The structural diversity of these

metabolites relies on the acyl side chain, while the homoserine lactone moiety

is maintained. The most common structural variations are the chain length,

oxo and hydroxy substituents at the 3 position and unsaturations. This variety

can be illustrated by N-butanoyl-HSL (biofilm synthesis control in

Pseudomonas aeruginosa S.), N-(3-hydroxy-butanoyl)-HSL (bioluminescence

control in Vibrio harveyi J. and S.), N-(3-oxo-octanoyl)-HSL (plasmid

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__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO

170

conjugal transfer in Agrobacterium tumefaciens S. and T.) and N-(3-hydroxy-

7-cis-tetradecenoyl)-HSL (expression of rhizosphere genes in Rhizobium

leguminosarum F.) (7).

Many phytopathogens exploit acyl-homoserine lactone based

communication systems. Pectobacterium carotovorum H. (Erwinia

carotovora J.), which causes the soft rot disease, is one of the best-studied

examples. It has been demonstrated that the carbapenem antibiotic and plant-

cell-wall-degrading enzymes syntheses are under the control of the same

autoinducer, the N-(3-oxo-hexanoyl)-HSL (8). Furthermore, the

communication system can be disrupted by antagonists, such as halogenated

furanones from the red algae Delisea pulchra M., thus decreasing antibiotic

and exoenzyme production (9).

This example shows the importance of the quorum-sensing system

during development of some phytopathogenic bacteria in hosts. Suppression

of this mechanism is considered a new research field in order to control

bacteriosis (10). Therefore, it is important to understand how these biological

mechanisms occur, starting from the chemical nature of substances involved.

The current communication deals with the acyl-homoserine lactones produced

by Erwinia psidii, a particularly destructive phytopathogen of Brazilian guava

crops (P. guajava). The study of possible quorum-sensing signalling

substances from this bacterium was carried out employing the IBSBF 435T

type strain, isolated from infected guava trees.

MATERIALS AND METHODS

General Experimental Procedures. NMR spectroscopic data were

acquired from a Varian Inova spectrometer, operating at 499.88 MHz for 1H-

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__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO

171

NMR and 125.71 MHz for 13C-NMR. CDCl3 was used as solvent and TMS as

internal reference (δH and δC 0.0 ppm). Chemical shifts δ were recorded in

ppm and coupling constants J in Hertz (Hz). Optical rotation was measured

on a Perkin-Elmer 341 polarimeter at 17ºC and the results converted to 20ºC

by the usual equations. Fourier-transform infrared (FTIR) spectra were

obtained with a Bomem MB Michelson spectrometer, using KBr (Merck,

Darmstadt, Germany) as sample support. Silica-gel for CC (0.035-0.070 mm)

was from Merck. TLC analysis were made on silica gel 60 F254 plates (Merck)

and visualized under exposure to UV light (254 nm) or chemically with

solution of p-anisaldehyde (5 %), acetic acid (50 mL) and concentrated

sulfuric acid (1 mL), and heated to 90-100 ºC for 5 min.

GC-MS analysis. GC-MS analyses were carried out on a HP 6890/5973

instrument, equipped with a 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm i.d. HP5 fused silica

capillary column. Mass spectra were recorded over the 40-450 amu range at

3.54 scans/s, with an ionization energy of 70 eV. Helium was the carrier gas at

a flow rate of 1 mL/min. The injector temperature was maintained at 250ºC.

The initial oven temperature was 100ºC and programmed to increase to 290ºC

at 10ºC/min, then held for 10 min. 1 μL samples were injected, without

splitting.

Chiral GC-FID analyses. Chiral gas chromatography analyses were

carried out with a HP 6890 instrument with flame ionization detection (FID),

equipped with a 25.0 m x 250.0 μm x 25.0 μm chiral capillary column

Chrompack CP chirasil-dex coating 7502 (Chrompack International BV,

4330 EA Middelburg, The Netherlands). The initial oven temperature was

50ºC and programmed to increase at 2ºC/min to 180ºC, and then held for 5

min. Hydrogen was the carrier gas at a flow rate of 1 mL/min. The injector

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__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO

172

and detector (FID) temperatures were kept at 220ºC and 240ºC, respectively. 1

μL samples were injected, with a 1:100 split ratio.

Bacterial strains and cultivation media. The strain Erwinia psidii

IBSBF 435T (= ATCC 49406 type strain) was kindly provided by Dr. Júlio

Rodrigues Neto, curator of the collection of cultures of Instituto Biológico de

São Paulo, Campinas, Brazil. It was isolated from Psidium guajava L. 1982,

Brazil and maintained in solid nutrient broth (NB) medium. Indicator strain

Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) was maintained in Luria-Bertani

(LB) medium supplemented with gentamicin (50 μg/mL). Pseudomonas

aeruginosa CCT 1987 was maintained in solid NB medium. NB medium

(20g/L) was from Oxoid (Hampshire, England). LB medium is composed by

1% peptone (Oxoid), 0.5% NaCl and 0.5% yeast extract (Oxoid). Solid

medium was prepared with 2% agar (Oxoid). X-Gal (5-bromine-4-chloro-3-

indolyl-β-D-galactopyranoside) was purchased from Sigma (Aldrich Chemical

Co., Milwaukee, WI).

Bioassay with reporter Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4).

Inoculums of strains P. aeruginosa CCT 1987, A. tumefaciens NTL4(pZLR4)

and E. psidii IBSBF 435T were prepared in test tubes with LB liquid medium

(2 mL). These were maintained at 28ºC for 24 h. To four test tubes containing

LB liquid medium (2 mL) the following solutions were added: tube 1 (blank

control): 20 μL of inoculum of E. psidii and 20 μL of X-Gal (stock solution at

50 mg/mL in DMF); tube 2 (blank control): 20 μL of inoculum of A.

tumefaciens NTL4(pZLR4) and 20 μL of X-Gal; tube 3 (positive control): 20

μL of inoculum of A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 μL of X-Gal and 20 μL

of inoculum of P. aeruginosa CCT 1987; tube 4 (test): 20 μL of inoculum of

A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 μL of X-Gal and 20 μL of inoculum of E.

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__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO

173

psidii. The four tubes (in duplicate) were incubated at 28ºC and the colorations

were visually evaluated after 24 h.

Culture of E. psidii and detection of acyl-HSL. E. psidii IBSBF 435T

was grown in test tubes containing liquid NB medium (10 mL), incubated at

30ºC for 24 h, then transferred to NB medium (1L) to be incubated at 30ºC

under shaking at 100 rpm. After 24 h, the culture medium was centrifuged at

5000 rpm for 20 min, under refrigeration (5ºC). The aqueous medium was

extracted with ethyl acetate (3 × 500 mL). The combined organic phases (1.5

L) were washed with distilled water (1 × 500 mL), dried over anhydrous

sodium sulfate and evaporated under reduced pressure at 50ºC. The whole

procedure was repeated eight times yielding a crude extract (0.728 g), which

was separated by silica column chromatography (15 g) eluted with hexane,

dichloromethane and ethyl acetate, recovering 84 fractions of 50 mL,

monitored by TLC. Similar fractions were combined and analyzed by GC-MS.

Acyl-HSL were detected in fractions FRA32 (2.0 mg) and FRA33-35 (2.5

mg).

N-Hexanoyl-HSL: GC-MS (EI, 70 eV) m/z: 199 (M+, 2), 156 (12), 143 (100),

125 (21), 115 (6), 102 (12), 101 (15), 99 (22), 57 (45), 43 (47).

N-Heptanoyl-HSL: GC-MS (EI, 70 eV, SIM) m/z: 213 (M+, 1), 156 (10), 143

(100), 125 (20), 113 (15), 102 (14), 101 (15), 85 (16), 57 (52), 43 (40).

Acyl-HSL synthesis. General procedure: to a round bottom flask (5

mL) containing distilled water (2.5 mL), triethylamine (1.05×10-4 mol), α-

amino-γ-butyrolactone hydrobromide [racemic or S-(-), Aldrich Chemical Co.,

Milwaukee, WI] (1.05×10-4 mol) and hexanoic or heptanoic acids (1.57×10-4

mol) were added. To the stirred solution at room temperature, 1-ethyl-3-(3-

dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (1.57×10-3 mol) was

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174

added. The reaction was further stirred at r.t. for 24 h. Extraction with ethyl

acetate (3 × 10 mL), and the usual work-up yielded pure acyl-HSL.

(+/-)-N-Hexanoyl-homoserine lactone. 54 % yield. GC-MS (EI, 70 eV) data

were identical to the natural product. IR, 1H and 13C NMR data were

consistent with those previously reported (11, 12).

S-(-)-Hexanoyl-homoserine lactone. 54% yield. IR, GC-MS, 13C and 1H-

NMR, DEPT-135 and DEPT-90 data were identical to those obtained for the

racemic compound. [α]D20 -22.86º (c. 0.35 MeOH).

(+/-)-N-Heptanoyl-homoserine lactone. 64 % yield. GC-MS (IE, 70 eV) data

were identical to the natural product. IR (KBr) 3315 (m), 2955 (m), 1776 (s),

1646 (s), 1545 (m), 1173 (m), 1013 (m), 646 cm-1 (w). 1H-NMR (499.88

MHz, TMS, CDCl3) δH (ppm) 0.88 (t, 3, J = 7.3 Hz, H-7'), 1.29 (m, 6, H-4',

H-5', H-6'), 1.64 (quintet, 2, J = 7.6 Hz, H-3'), 2.14 (m, 1, H-4), 2.25 (t, 1, J =

8.9 Hz, H-2'), 2.84 (m, 1, H-4), 4.28 (ddd, 1, J = 5.8, 11.3, 9.5 Hz, H-5), 4.47

(t, 1, J = 8.9 Hz, H-5), 4.56 (ddd, H, J = 5.8, 11.6, 8.6 Hz, H-3), 6.15 (d, 1, J =

3.7 Hz, NH). 13C-NMR (125.71 MHz, TMS, CDCl3) δC (ppm) 14.0 (C-7');

22.4 (C-6'); 25.3 (C-3'); 28.8 (C-5'); 30.5 (C-4); 31.4 (C-4'); 36.1 (C-2'); 49.2

(C-3); 66.1 (C-5); 173.7 (C-1'); 175.5 (C-2).

Biological assays with extract, fractions and synthetic products.

Biological activities of the synthetic products, ethyl acetate extract and

fractions from E. psidii culture medium with biosensor A. tumefaciens

NTL4(pZLR4) were evaluated as described above. The tests were performed

using solutions (20 μL) of each synthetic product [(+/-)-N-hexanoyl-HSL, S-

(-)-N-hexanoyl-HSL and (+/-)-N-heptanoyl-HSL], ethyl acetate extract from

E. psidii cultivation medium and fraction FRA32 in ethanol (2 mg/mL). The

blank was performed with ethanol (20 μL).

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175

N-Hexanoyl-HSL absolute configuration: The optimum analytical

conditions for the enantiomeric discrimination were established using

synthetic (+/-)-N-hexanoyl-HSL (two peaks in an approximately 1:1 ratio),

according to the conditions described above. The identification of the R- and

S-N-hexanoyl-HSL retention times was obtained by analysis of the synthetic

S-(-)-N-hexanoyl-HSL. The absolute configuration of the natural product was

determined by comparing the retention times and relative abundances of the

R- and S-(-)-N-hexanoyl-HSL in the synthetic racemic standard, in FRA32 and

by co-injection of both samples (Table 1).

RESULTS AND DISCUSSION

Initially the production of acyl-homoserine lactones in E. psidii was

evaluated using Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) as reporter, by a

methodology adapted from the literature (13, 14). This bioassay has been

extensively employed in screenings of acyl-HSL producers, mainly due to its

simplicity, quickness and high sensitivity. This mutant cannot produce its own

acyl-HSL, by deletion of the traI gene. The detection system was inserted by

the pZLR4 plasmid, which contains the traR gene and the fusion traG::lacZ.

Exogenous acyl-HSL bind to the TraR receptor, and this complex regulates

the expression of lacZ gene, which codifies the synthesis of β-galactosidase

enzymes. Finally, the reagent X-Gal is metabolized by the β-galactosidase

enzymes, yielding a blue color. Bioassays with E. psidii and P. aeruginosa

(used as positive control) (15) exhibited blue coloration, furnishing evidence

of the presence of acyl-HSL in both strains.

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176

As previously reported (15, 16), acyl-HSL are usually synthesized in

low concentrations, requiring therefore large amounts of culture medium for

spectroscopic investigations. Consequently, E. psidii extracts from 8 L of

culture medium were purified by column chromatography and fractions were

analyzed by GC-MS. N-Hexanoyl-HSL was detected in 7 % of relative

abundance in fraction FRA32 (a mixture of 2.0 mg,) and in 1% in FRA33-35

(a mixture of 2.5 mg) and trace amounts of N-heptanoyl-HSL were identified

in fraction FRA33-35 (Figure 1). To improve the detection, some analyses

were carried out in the SIM mode. These substances were not detected in the

blank analyses with NB medium (data not shown).

N

O

H

O

OH

234 5

1'2'

3'

4'

5'

6'

1

S-(-)-N-hexanoyl-HSL

1

6'

5'

4'

3'

2'1'

543

2N

O

H

O

O

7'

N-heptanoyl-HSL

N

O

H

O

O

R H

N

O

H

O

O

H

m/z 143

Figure 1. Acyl-homoserine lactones identified in extracts from Erwinia psidii

IBSBF 435T culture medium and origin of the diagnostic base peak fragments

in MS spectra.

The final structural confirmation of both acyl-HSL was carried out by

co-injection and fragmentation pattern comparison of the natural products

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177

with synthetic ones in GC-MS. These synthetic standards were fully

characterized by FTIR, GC-MS, 1H and 13C NMR spectroscopy in one and

two-dimensions (1H, 1H gCOSY; 1H, 13C 1J HSQC; 1H, 13C nJ gHMBC, n = 2

and 3; 13C-NMR DEPT-135 and DEPT-90; data not shown). The synthetic

substances, ethyl acetate extract and fraction FRA32 from E. psidii cultivation

medium also exhibited positive bioassays with A. tumefaciens NTL4(pZLR4)

reporter, corroborating the biological activity observed with the strain E. psidii

IBSBF 435T in vivo.

The absolute configuration of acyl-homoserine lactones plays an

important role in communication systems (11). However, these substances are

produced in low amounts and their analysis requires appropriate

methodologies; in the present case, the chiral configuration of N-hexanoyl-

HSL was determined using gas chromatographic analyses with chiral

stationary phase and flame ionization detection. The optimum analytical

conditions for the enantiomeric separation were obtained using a synthetic

racemic mixture (R stereoisomer at 56.72 min and S stereoisomer at 56.89

min). Elution of synthetic stereoisomer S-(-)-N-hexanoyl-HSL (92% ee) under

the same conditions furnished the retention time (56.93 min) for the S

stereoisomer. Analysis of fraction FRA32, obtained from E. psidii culture

medium, displayed a signal with retention time (56.97 min) very close to that

of the synthetic S stereoisomer. Co-injection of the natural product and the

synthetic racemic mixture resulted in perfect signal overlap, with increase in

the relative abundance of the S stereoisomer (56.96 min) in comparison with

that of the R stereoisomer (56.79 min). Thus, the natural product was the S-(-

)-N-hexanoyl-HSL (Table 1). The N-heptanoyl-HSL is a minor constituent

(trace amounts), and the same procedure could not be applied. The

methodology proved to be very efficient in situations where the amount of

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substance is small and/or when they are present in complex mixtures.

Furthermore, chiral GC-FID is applied to determine the absolute configuration

of a natural acyl-homoserine lactone for the first time, providing an additional

tool in quorum-sensing researches.

Table 1. Results of chiral GC-FID analyses and absolute configuration

determination of natural S-(-)-N-hexanoyl-HSL. (+/-)-N-hexanoyl-

HSL S-(-)-N-hexanoyl-

HSL FRA32 from E.

psidii IBSBF435T

FRA32 + (+/-)-N-hexanoyl-

HSL Enantiomers R S S S R S

Retention times (min)

56.72 56.89 56.93 56.97 56.79 56.96

Relative abundances

(%)

~50.00 ~50.00 96.34 >99.00 42.16 57.83

In conclusion, it was demonstrated that Erwinia psidii IBSBF 435T

produces acyl-HSL, which are well-recognized substances of the bacterial

intercellular communication systems. N-hexanoyl-HSL is relatively common

in quorum-sensing of Gram-negative bacteria, e.g, controlling the violacein

production (17) in Chromobacterium violaceum B. and reported in trace

concentrations in the phytopathogen Pectobacterium chrysanthemi S. (18).

However N-heptanoyl-HSL, with an odd carbon number acyl side chain, is an

autoinducer of rare occurrence, previously reported in Serratia marcescens B.

(19) and Rhizobium leguminosarum (20). Therefore, this is the first report of

this substance in Erwinia genus. Odd-chain fatty acids are biosynthesized by a

route that exploits propionyl-CoA and malonyl-CoA as starter and extender of

the acyl chain, respectively. Possibly, this biosynthetic route is explored by

these microorganisms in the production of N-heptanoyl-HSL (21).

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179

Further work should be done to understand the role of these substances

in the intercellular communication system in E. psidii. As interferences in

quorum-sensing mechanisms are promising avenues for bacterial control, it is

expected that these studies could provide an alternative method to detain this

guava phytopathogen.

ABREVIATIONS

HSL: homoserine lactone.

X-Gal: 5-bromine-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside.

ACKNOWLEDGMENT

We whish to express our gratitude to Carol H. Collins (IQ/UNICAMP) for

revising the manuscript.

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The authors are indebted to FAPESP for financial support and a scholarship to

A.M. Pomini (grant proc. 03/09357-7).