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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
RAFAEL DA SILVA FERNANDES
POLÍMEROS MOLECULARMENTE IMPRESSOS COM ESTRUTURA
CAROÇO-CASCA PARA EXTRAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO,
CAFEÍNA E VANILINA
CAMPINAS
2018
RAFAEL DA SILVA FERNANDES
POLÍMEROS MOLECULARMENTE IMPRESSOS COM ESTRUTURA
CAROÇO-CASCA PARA EXTRAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO,
CAFEÍNA E VANILINA
Tese de Doutorado apresentada ao
Instituto de Química da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do
título de Doutor em Ciências
Orientador: prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Junior
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
PELO ALUNO RAFAEL DA SILVA FERNANDES E ORIENTADA PELO PROF. DR.
IVO MILTON RAIMUNDO JUNIOR
CAMPINAS
2018
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES
ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6797-9119
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de Química
Camila Barleta Fullin - CRB 8462
Fernandes, Rafael da Silva, 1988-
F391p FerPolímeros molecularmente impressos com estrutura caroço-casca para
extração de ácido ascórbico, cafeína e vanilina / Rafael da Silva Fernandes. –
Campinas, SP : [s.n.], 2018.
FerOrientador: Ivo Milton Raimundo Junior.
FerTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Química.
Fer1. Polímeros de impressão molecular. 2. Caroço-casca. 3. Microesferas. 4.
Extração seletiva. 5. Adsorção. I. Raimundo Júnior, Ivo Milton, 1961-. II.
Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Molecularly imprinted polymers with core-shell structure for
extraction of ascorbic acid, caffeine and vanillin Palavras-chave em inglês:
Molecularly imprinted polymer
Core-shell
Microspheres
Selectivity extraction
Adsorption
Área de concentração: Química Analítica
Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora:
Ivo Milton Raimundo Junior [Orientador]
Italo Odone Mazali
Susanne Rath
Claudete Fernandes Pereira
Maria Del Pilar Taboada Sotomayor
Data de defesa: 23-02-2018
Programa de Pós-Graduação: Química
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Junior (Orientador)
Profa. Dra. Maria Del Pilar Taboada Sotomayor (UNESP)
Profa. Dra. Claudete Fernandes Pereira (UFPE)
Prof. Dr. Italo Odone Mazali (IQ-UNICAMP)
Profa. Dra. Susanne Rath (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da Tese de
Doutorado defendida pelo aluno RAFAEL DA SILVA
FERNANDES, aprovada pela Comissão Julgadora em
23 de fevereiro de 2018.
DEDICATÓRIA
A minha família, por todo amor
incondicional, dedicação, carinho e
ensinamentos. Em especial aos meus pais
(Francisco de Assis e Antônia Maria), a
minha esposa (Fernanda Karoline) e ao
meu filho (Luiz).
AGRADECIMENTOS
A Deus pela oportunidade de ter chegado onde estou, pelas pessoas que
existem na minha vida e pela força e coragem para viver longe da minha família.
Aos meus pais Francisco e Antônia, como também aos meus demais familiares
por todo amor, atenção, carinho e incentivo.
A minha esposa e amiga Fernanda, por todo amor, paciência e companheirismo.
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Jr., pela orientação,
confiança e oportunidade de desenvolver este trabalho.
Aos professores Jarbas Rohwedder e Celio Pasquini, por suas respectivas
contribuições no andamento desse projeto.
Ao Prof. Dr. Boris Mizaikoff e os demais membros do Institut für Analytische und
Bioanalytische Chemie (IABC) da Universidade de Ulm/Alemanha pela orientação,
apoio científico e excelente ambiente de trabalho.
A todos os meus amigos dos grupos GIA, LQA e GEATOM, pelo apoio e amizade
ao longo do mestrado e doutorado.
Aos técnicos e demais funcionários do IQ-UNICAMP, por todo empenho, que
permitiram o desenvolvimento desse trabalho, em especial ao técnico e amigo Diego
Campaci por toda sua dedicação e eficiência no auxílio de algumas etapas.
Às instituições CNPq, INCTAA e IQ-UNICAMP, sem as quais não seria possível
desenvolver este trabalho.
Aos professores do IQ-UNICAMP e do IQ-UFRN, que contribuíram imensamente
para a minha formação profissional e pessoal.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
bolsa concedida.
Ao meu amigo Sergio Ruschi por todo companheirismo criado durante esse
período dentro e fora da universidade.
RESUMO
Este trabalho descreve a síntese de três polímeros molecularmente impressos
(MIP) com estrutura caroço-casca para extração de ácido ascórbico, cafeína e vanilina
por meio de extração em fase sólida e método de incubação. Objetivando identificar,
compreender e controlar os parâmetros envolvidos na síntese dos polímeros
impressos, foram desenvolvidos diversos MIP a partir de partículas porosas e não
porosas, funcionalizadas e não funcionalizadas, em dimensões nano- e
micrométricas. Os caroços inorgânicos compostos por nano- e micromateriais foram
sintetizados com base nos métodos de Stöber e de macroemulsão de água em óleo,
respectivamente. A camada polimérica impressa (casca) foi produzida na superfície
das partículas inorgânicas (caroço) de três formas distintas, apresentando em comum
o uso de monômero funcional, agente de reticulação, iniciador e solvente porogênico,
além da molécula molde. A camada polimérica não impressa (NIP) foi fabricada
igualmente ao MIP, mas sem a presença da molécula molde. Além disso, foram
realizados cálculos teóricos das condições de espontaneidade de síntese baseado na
teoria do funcional da densidade. Os materiais sintetizados foram caracterizados por
MIR-ATR, SEM, EDX e isoterma de adsorção-dessorção. As propriedades de ligação
foram demonstradas pela capacidade de adsorção e o fator de impressão obtido com
base nas medidas de absorção UV-VIS. Além disso, as condições de síntese foram
otimizadas de modo que a eficiência de impressão e a capacidade de adsorção
fossem maximizadas. Finalmente, foi demonstrado que os métodos propostos
geraram microesferas híbridas com estrutura caroço-casca capazes de fornecer
rápida adsorção, expressiva capacidade de ligação (até 5,64 mg g-1), excelentes
fatores de impressão (até 2,37) e um número significativo de reutilizações (> 20). Dois
estudos comparativos envolvendo a extração simultânea de ácido ascórbico e ácido
cítrico, vanilina e etilvanilina, permitiram verificar a seletividade dos MIP em soluções
padrão, que apresentou um fator de impressão de até 2,27. O MIP desenvolvido para
extração de vanilina apresentou um fator de impressão de 1,34 para amostras
comerciais contendo vanilina a e etilvanilina.
ABSTRACT
This work describes the synthesis of three molecularly printed polymers (MIP)
with core-shell structure for extraction of ascorbic acid, caffeine and vanillin, by means
of solid phase extraction and incubation method. In order to identify, understand and
control the parameters involved in the synthesis of the imprinted polymers, several MIP
were developed based on porous and non-porous, functionalized and non-
functionalized particles, with nano- and micrometer dimensions. The inorganic core
comprised of nano- and micromaterials were synthesized based on the Stöber and
water-in-oil macroemulsion methods, respectively. The imprinted polymeric layer
(shell) was produced on the surface of the inorganic particles in three distinct ways,
exhibiting in common the use of functional monomer, crosslinking agent, initiator and
porogenic solvent, besides the template molecule. In addition, theoretical calculation
of spontaneity conditions for the synthesis based on the density functional theory was
performed. The synthesized materials were characterized by MIR-ATR, SEM, EDX
and adsorption-desorption isotherm. The binding properties were demonstrated by the
adsorption capacity and the imprinting factor obtained by means of UV-Vis
measurements. In addition, the synthesis conditions were optimized so that imprinting
efficiency and adsorption capacity were maximized. Finally, it was demonstrated that
proposed methods of generating hybrid microspheres with core-shell structure capable
of providing fast adsorption, expressive binding capacity (up to 5.64 mg g-1), excellent
imprinting factors (up to 2.37) and a significant number of reuse (> 20). Two
comparative studies involving the simultaneous extraction of ascorbic acid and citric
acid, vanillin and ethylvanillin allowed to verify the excellent selectivity of MIP in
standard solutions, which presented imprinting factor of up to 2.27. The MIP developed
for vanillin extraction showed imprinting factor of 1.34 for commercial samples
containing vanillin and ethylvanillin.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - 1. Número de publicações sobre polímeros impressos de 1995 a 2018 de
acordo com o mecanismo de busca Web of Science usando o termo "polímero de
impressão molecular". ............................................................................................... 23
Figura 1 - 2. Representação esquemática da decomposição do iniciador (AIBN) (I) e
passo de adição do monômero (Ácido acrílico) (II). .................................................. 29
Figura 1 - 3. Representação esquemática do passo de propagação do monômero
(Ácido acrílico). .......................................................................................................... 30
Figura 1 - 4. Representação esquemática do passo de propagação do monômero
(Ácido acrílico). .......................................................................................................... 31
Figura 1 - 5. Representação esquemática do mecanismo de ativação/desativação por
polimerização RAFT. ................................................................................................. 32
Figura 1 - 6. Monômeros funcionais comuns utilizados na síntese de polímeros
impressos. ................................................................................................................. 34
Figura 1 - 7. Estruturas químicas dos agentes de reticulação. .................................. 35
Figura 1 - 8. Estrutura química de iniciadores comuns utilizados na impressão
molecular não covalente. .......................................................................................... 49
Figura 2 - 1. Ilustração esquemática da preparação do MSF@MIP. O MSF@NIP
correspondente foi preparado com a mesma rota de síntese na ausência da molécula
molde. ....................................................................................................................... 57
Figura 2 - 2. Micrografias das (a) MS, (b) MSF, (c) MSF@MIP, (d) MSF@NIP, (e) e (f)
MSF@MIP colapsado. .............................................................................................. 63
Figura 2 - 3. Os espectros de IR-ATR das (a) MSF@NIP, (b) MSF@MIP, (c) MS e (d)
MSF. .......................................................................................................................... 64
Figura 2 - 4. Interação das MSF com a ninidrina em solução alcoólica. ................... 65
Figura 2 - 5. Capacidade de adsorção do MSF@MIP e do MSF@NIP em função da
concentração de AA usando o método (a) SPE e o (b) método incubação. ............. 66
Figura 2 - 6. Recuperação de AA usando MSF@MIP reutilizado.............................. 68
Figura 2 - 7. Estudo da seletividade do MSF@MIP e do MSF@NIP para extração do
AA e do CA. .............................................................................................................. 69
Figura 2 - 8. Geometria do AA e dos monômeros otimizadas pelo método B3LYP/6-
31G (d,p), no vácuo. Na molécula de AA, quanto mais intenso a cor, menor a carga
.................................................................................................................................. 70
Figura 2 - 9. Cálculo teórico no vácuo dos possíveis sítios de ligação da molécula de
AA com diferentes monômeros. ................................................................................ 71
Figura 2 - 10. Cálculo teórico para avaliação do efeito do solvente sobre a energia
envolvida na interação entre molécula molde e monômero.. .................................... 72
Figura 2 - 11. Relação entre a distância do oxigênio e hidrogênio nos monômeros e a
espontaneidade das interações entre monômero e molécula molde..........................73
Figura 2 - 12. Estimativa energética sobre o efeito causado pela modificação do
monômero ácido metacrílico com espécies eletronegativas.......................................74
Figura 3 - 1. Esquema representativo da preparação do MIP e do NIP. ................... 79
Figura 3 - 2. Espectros de IR-ATR das (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS1F@MIP e (d)
MS1F@NIP. .............................................................................................................. 83
Figura 3 - 3. Micrografias de (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS2, (d) MS2F, (e) MS1@MIP,
(f) MS1F@MIP, (g) MS2@MIP, (h) MS2F@MIP, (i) MS1@NIP, (j) MS1F@NIP, (l)
MS2@NIP e (k) MS2F@NIP. .................................................................................... 84
Figura 3 - 4. Micrografias de (a) MS1@MIP colapsada e (b MIPs tradicionais sem
morfologia definida. ................................................................................................... 85
Figura 3 - 5. Capacidade de adsorção do MS1@MIP em (a) função do tempo e (b) do
pH. ............................................................................................................................. 88
Figura 3 - 6. Capacidade de adsorção do MS1@MIP e MS1@NIP em função da
concentração de vanilina usando o (a) método SPE e o (b) método da incubação. . 88
Figura 3 - 7. Capacidade de adsorção do MS2@MIP e MS2F@NIP em função da
concentração de vanilina usando o método da incubação. ....................................... 89
Figura 3 - 8. Capacidade de adsorção do (a) MS1F@MIP, MS1F@NIP, (b)
MS2F@MIP e MS2F@NIP em função da concentração de vanilina usando o método
da incubação. ............................................................................................................ 90
Figura 3 - 9. Estudo da seletividade do MS1F@MIP e do MS1F@NIP para extração
de vanilina e etilvanilina. ........................................................................................... 93
Figura 3 - 10. Estudo da seletividade do MS1F@MIP e do MS1F@NIP para extração
de vanilina e etilvanilina de amostras reais. .............................................................. 94
Figura 4 - 1. Espectro no infravermelho médio das NPSA, NPS, NPSA@MIP e
NPSA@NIP. ............................................................................................................ 101
Figura 4 - 2. Micrografias das NPS (a), NPSA (b), NPSA@MIP (c) e NPSA@NIP (d).
................................................................................................................................ 102
Figura 4 - 3. Medidas de tamanho de partícula e potencial zeta das NPS, NPSA,
NPSA@MIP e NPSA@NIP em suspensão obtidas por DLS. ................................. 103
Figura 4 - 4. Avaliação do solvente na capacidade de ligação. (A) 25/75 % v/v
H2O/ACN, (B) 50/50 % v/v H2O/ACN, (C) 75/25 % v/v H2O/ACN, (D) 85/15% v/v
H2O/ACN, (E) 90/10 % v/v H2O/ACN, (F), 5/95 % v/v H2O/ACN. ............................ 104
Figura 4 - 5.Capacidade de ligação do NPSA@MIP em função do tempo ............. 105
Figura 4 - 6. Capacidade de adsorção do NPSA@MIP e do NPSA@NIP em função da
concentração de cafeína usando o método da incubação. ..................................... 106
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - 1. Resumo dos diferentes métodos de preparação dos MIPs. ................. 27
Tabela 1 - 2. Lista de isotermas de adsorção com as suas respectivas equações
linearizadas e não linearizadas. ................................................................................ 48
Tabela 2 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial, tamanho e
volume de poros e tamanho de partícula obtidas a partir do BET, BJH e MEV,
respectivamente. ....................................................................................................... 79
Tabela 2 - 2. Parâmetros das isotermas para adsorção de AA utilizando MSF@MIP e
MSF@MIP.. ............................................................................................................... 81
Tabela 3 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial e de tamanho de
partícula. Na determinação da área superficial o método BET foi utilizado. ........... 101
Tabela 3 - 2. Parâmetros das isotermas para ajuste dos dados. .......................... 1048
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AA Ácido ascórbico
AC Ácido cítrico
AIBN 2,2’-azobisisobutironitrilo
AM1 Austin model 1
APTES Aminopropiltrietoxisilano
APTMS Aminopropiltrimetoxisilano
ATRP Atom Transfer Radical Polymerization (Polimerização radicalar por
transferência de átomos
BET Brunauer, Emmett e Teller
BJH Brunauer, Joyner e Halenda
DFT Density Functional Theory (Teoria do funcional da densidade)
EDX Energy-dispersive X-ray spectroscopy (Espectroscopia de Raios X por
Dispersão em Energia)
EGDMA Etilenoglicol dimetacrilato
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorção
Enzimática)
EMQ Erro Médio Quadrático
HPC Hydroxypropyl Celulose (Hidroxipropilcelulose)
HPLC High performace liquid chromatography (Cromatografia líquida de alta
eficiência)
LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (Cromatografia líquida com
espectrômetro de massa)
LPE Liquid Phase Extraction (Extração em fase líquida)
MAE Microwave-assisted extraction (Extração assistida por micro-ondas)
MIP Molecularly imprinted polymer (Polímero molecularmente impresso)
MIR - ATR Mid-infrared attenuated total reflectance (Infravermelho médio com
reflectância total atenuada)
MISPE Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida
Impressa Molecularmente)
MIT Molecularly Imprinted Technology (Tecnologia de Impressão Molecular)
NMP Nitrogen-mediated polymerization (Polimerização mediada por
nitróxido)
NMP Nitroxide-mediated polymerization (polimerização mediada por nitróxido)
NMR Nuclear magnetic resonance (Ressonância magnética nuclear)
QDs Quantum dots (Pontos quânticos)
RAFT Reversible addition-fragmentation chain transfer (Transferência
reversível de cadeia por adição-fragmentação)
SEM Scanning eletronic microscopy (Microscopia eletrônica de varredura)
SERS Surface-enhanced Raman spectroscopy (Espectroscopia Raman
amplificada por superfície)
SPE Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida).
TEM Transmission eletronic microscopy (Microscopia eletrônica de
transmissão)
TEOS Tetraetoxissilano
UAE Ultrasonic Assisted Extraction (Extração Assistida por Ultrassom)
UV/VIS Ultravioleta/Visível
SUMÁRIO
PREFÁCIO ................................................................................................................ 19
CAPÍTULO 1 ............................................................................................................. 21
1. Polímero Molecularmente Impresso ................................................................ 21
1.1. Introdução ................................................................................................. 22
1.2. Métodos de Impressão Molecular ............................................................. 25
1.2.1. Síntese dos MIPs ................................................................................... 25
1.2.2. Mecanismo de Polimerização ................................................................. 28
1.2.2.1. Polimerização por Radicais Livres ................................................ 28
1.2.2.1.1. Iniciação ............................................................................... 29
1.2.2.1.2. Propagação ......................................................................... 29
1.2.2.1.3. Término ................................................................................ 30
1.2.2.2. Polimerização Radicalar Controlada............................................. 31
1.2.3. Reagentes e Condições Utilizados em Impressão Molecular................. 33
1.2.3.1. Molécula Molde ............................................................................ 33
1.2.3.2. Monômero Funcional .................................................................... 34
1.2.3.3. Agente de Reticulação .................................................................. 35
1.2.3.4. Iniciador ........................................................................................ 36
1.2.3.5. Solvente Porogênico ..................................................................... 37
1.2.4. Caracterização dos MIPs ....................................................................... 37
1.2.4.1. Caracterização Química ............................................................... 38
1.2.4.2. Caracterização Morfológica .......................................................... 39
1.2.4.3. Caracterização dos Sítios de Ligação .......................................... 39
1.2.4.3.1. Método de Incubação .......................................................... 40
1.2.4.3.2. Método MISPE ..................................................................... 40
1.2.5. Adsorção ................................................................................................ 41
1.2.5.1. Cinética de Adsorção .................................................................... 42
1.2.5.1.1. Modelo de Pseudo–Primeira Ordem .................................... 42
1.2.5.1.2. Modelo de Pseudo–Segunda Ordem ................................... 43
1.2.5.1.3. Difusão Intrapartícula ........................................................... 44
1.2.5.2. Isotermas de adsorção ................................................................. 44
1.2.5.2.1. Modelo de Langmuir ............................................................ 45
1.2.5.2.2. Modelo de Scatchard ........................................................... 46
1.2.5.2.3. Modelo de Freundlich .......................................................... 46
1.2.5.2.4. Modelo de Sips .................................................................... 47
1.2.6. Funções de erro ..................................................................................... 47
1.2.6.1. Coeficiente de Determinação (R2) ................................................ 48
1.2.6.2. Erro Médio Quadrático (EMQ) ...................................................... 49
1.2.7. Aplicações .............................................................................................. 49
1.3. Objetivos ................................................................................................... 51
CAPÍTULO 2 ............................................................................................................. 52
2. Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-
Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico ................................. 52
2.1. Introdução ................................................................................................. 53
2.2. Parte Experimental ................................................................................... 55
2.2.1. Reagentes .............................................................................................. 55
2.2.2. Fabricação do MIP na Superfície das Partículas .................................... 55
2.2.2.1. Síntese de Microesferas de Sílica (MS) ........................................ 55
2.2.2.2. Funcionalização das MS (MSF) .................................................... 56
2.2.2.3. Preparação do MIP para AA ......................................................... 56
2.2.3. Caracterização ....................................................................................... 58
2.2.4. Avaliação das Características de Ligação e Capacidade de Adsorção .. 58
2.2.4.1. Estudo de Incubação .................................................................... 58
2.2.4.2. Estudo de SPE ............................................................................. 59
2.2.4.3. Reconhecimento Específico do MSF@MIP e MSF@NIP ............. 60
2.2.5. Método de Cálculo ................................................................................. 60
2.3. Resultados e Discussão............................................................................ 61
2.3.1. Síntese das MS e do MIP com Estrutura Caroço-Casca ........................ 61
2.3.2. Caracterização ....................................................................................... 62
2.3.3. Estudo de Adsorção ............................................................................... 66
2.3.4. Otimização Estrutural do Monômero e Molécula Molde ......................... 69
2.3.1. Seleção Teórica do Monômero Funcional e do Solvente ....................... 70
CAPÍTULO 3 ............................................................................................................. 75
3. Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-
Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina ......................................................... 75
3.1. Introdução ................................................................................................. 76
3.2. Parte Experimental ................................................................................... 78
3.2.1. Reagentes .............................................................................................. 78
3.2.2. Preparação do MIP para Extração de Vanilina ....................................... 78
3.2.2.1. Síntese das MS ............................................................................ 78
3.2.2.2. Fabricação do MIP ........................................................................ 78
3.2.3. Avaliação das Características e da Capacidade de Adsorção ............... 79
3.2.3.1. Estudo de Adsorção – Método da Incubação ............................... 79
3.2.3.2. Estudo de Adsorção – SPE .......................................................... 80
3.2.3.3. Reconhecimento Específico ......................................................... 81
3.2.3.4. Aplicação em Amostras Reais ...................................................... 81
3.3. Resultados e Discussão............................................................................ 81
3.3.1. Síntese das Partículas de Sílica e do MIP com Estrutura Caroço-Casca ..
............................................................................................................... 81
3.3.2. Caracterização ....................................................................................... 82
3.3.3. Estudo de Adsorção ............................................................................... 87
3.3.3.1. Estudo de Recuperação ............................................................... 92
3.3.3.2. Estudo de Seletividade e Aplicação em Amostra Real ................. 92
CAPÍTULO 4 ............................................................................................................. 95
4. Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração
Seletiva de Cafeína ................................................................................................ 95
4.1. Introdução ................................................................................................. 96
4.2. Parte Experimental ................................................................................... 97
4.2.1. Reagentes .............................................................................................. 97
4.2.2. Síntese de Nanopartículas de Sílica Amino-Funcionalizadas (NPSA) ... 97
4.2.3. Síntese do MIP de Superfície em Nanopartículas de Sílica Amino-
Funcionalizadas (NPSA) ................................................................................. 98
4.2.4. Caracterização ....................................................................................... 98
4.2.5. Estudo de Adsorção ............................................................................... 99
4.3. Resultado e Discussão ............................................................................. 99
4.3.1. Síntese das NPSA e do NPSA@MIP ..................................................... 99
4.3.2. Caracterização ..................................................................................... 100
4.3.3. Estudo da Capacidade de Adsorção .................................................... 103
CAPÍTULO 5 ........................................................................................................... 107
5. Conclusões e Perspectivas ........................................................................... 107
Referências .......................................................................................................... 111
Prefácio 19
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
PREFÁCIO
Este trabalho tem como propósito descrever a síntese e aplicação de três
polímeros impressos, com estrutura caroço-casca, para extração seletiva de ácido
ascórbico, cafeína e vanilina. Essa tecnologia foi desenvolvida em parceria com o
Instituto de Analítica e Bioanalítica da Universidade de Ulm, Alemanha, sob a
supervisão do professor Dr. Boris Mizaikoff.
Para melhor entendimento, essa Tese foi dividida em 5 capítulos visando facilitar
a compreensão das metodologias utilizadas, bem como os resultados obtidos,
seguindo uma ordem cronológica.
O capítulo 1 contém uma introdução geral sobre polímeros impressos,
convencionais e com estrutura caroço-casca, abordando aspectos relevantes, cujo
objetivo é apresentar informações básicas relevantes, para facilitar a interpretação dos
resultados obtidos.
Nos capítulos 2 e 3 são descritas a síntese, a caracterização e a aplicação dos
polímeros impressos para ácido ascórbico e vanilina, respectivamente, a partir de
microesferas de sílica funcionalizadas, porosas e não-porosas, produzidas pelo
método da macroemulsão. Ainda nesses capítulos, são descritos o estudo
comparativo entre o método de extração em fase sólida e o método de incubação,
ambos avaliados através da espectrofotometria UV/VIS. A tecnologia de impressão
molecular descrita no capítulo 2 apresenta alguns aspectos científicos inéditos que
foram fundamentais para o desenvolvimento dos demais capítulos. O capítulo 2 é
descrito também o uso de cálculo teórico baseado na teoria do funcional da densidade
envolvendo o polímero impresso para ácido ascórbico. Os cálculos teóricos permitem
identificar a espontaneidade da interação monômero-molécula molde em diferentes
solventes, sendo possível selecionar o melhor sistema para o desenvolvimento do
polímero impresso. Além disso, o estudo teórico auxilia na compreensão de alguns
resultados experimentais obtidos
Semelhantemente aos capítulos 2 e 3, o capítulo 4 apresenta o desenvolvimento
de um polímero impresso para cafeína, a partir de nanoesferas de sílica
funcionalizada, sintetizadas com base no método de Stöber. O objetivo principal deste
Prefácio 20
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
capítulo 4 foi comprovar que a tecnologia utilizada para fabricação dos polímeros
impressos a partir de micropartículas (capítulos 2 e 3) é igualmente eficiente em
nanoescala. Os resultados preliminares apresentados neste capítulo indicam
aspectos promissores para este polímero em nanoescala.
. Por fim, no capítulo 5, são apresentadas as conclusões e perspectivas da Tese.
CAPÍTULO 1
1. Polímero Molecularmente Impresso
RESUMO GRÁFICO
(Adaptado de Gongke Li et. al., 2015)
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 22
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
1.1. Introdução
A tecnologia de impressão molecular (MIT, do inglês molelularly imprinted
technology) consiste no planejamento e desenvolvimento de materiais sintéticos, com
cavidades feitas sob medida, que demonstram seletividade comparada à de
receptores naturais (Alexander et al., 2006; Poma, Turner e Piletsky, 2010). O conceito
de impressão molecular surgiu com base na teoria proposta por Pauling para
descrever a formação dos anticorpos (Ye e Mosbach, 2008). Assim, com base neste
mecanismo, surgiu a ideia de produzir uma estrutura tridimensional rígida polimérica
ao redor de uma molécula molde, que tivesse a capacidade de mimetizar os materiais
biológicos, tais como as interações antígeno-anticorpo, as interações enzima-
substrato, mantendo a elevada especificidade e seletividade. Nestes sistemas, as
macromoléculas biológicas possuem locais de ligação específicos, os quais
apresentam capacidade para reterem de forma seletiva uma dada molécula, mesmo
em presença de outras com estruturas químicas muito semelhantes (Hansen, 2007).
Usualmente, estes materiais são denominados de polímeros molecularmente
impressos, ou somente pela sigla MIP que advém do inglês Molecularly Imprinted
Polymers.
Os polímeros de impressão molecular (MIP) são materiais sintéticos com sítios
de reconhecimento específicos produzidos em uma síntese polimérica, onde uma
molécula alvo é utilizada como molde (Turiel e Martín-Esteban, 2010). Para a
produção deste material são necessárias uma molécula molde, um monômero
funcional, um solvente porogênico, um iniciador e um agente de reticulação. O
processo de fabricação inicial do MIP começa com a formação do complexo entre o
monômero, portador de certos grupos funcionais, e a molécula molde, através de
interações covalentes ou não-covalentes. Subsequentemente, o agente de
reticulação, responsável pela estabilização dos sítios de ligação, e o iniciador,
responsável por iniciar a reação de polimerização, são adicionados ao sistema. Após
a polimerização, a molécula molde é removida da matriz polimérica, produzindo um
polímero com cavidades complementares à molécula molde em termos de tamanho,
forma e disposição de grupos funcionais (Roland e Bhawani, 2016). Em outras
palavras, as interações entre a molécula molde e a matriz polimérica são memorizadas
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 23
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
durante a impressão molecular, possibilitando o reconhecimento específico no
processo de extração da molécula alvo.
Desde 1930, quando em seu trabalho pioneiro Polyakov produziu um polímero
impresso a base de sílica para o reconhecimento específico de benzeno (Polyakov,
1930), os MIPs vêm evoluindo em aspectos relacionados à síntese, caracterização e
aplicação, o que demonstra uma maturação gradual da MIT e o amplo interesse da
comunidade científica em geral. O número de artigos científicos publicados entre os
anos de 1998 a 2017 divulgado pelo site de busca científica Web of Science (Figura 1
- 1) já ultrapassa os 3000, o que reflete diretamente o rápido e contínuo
desenvolvimento das tendências e áreas atuais.
Figura 1 - 1. Número de publicações sobre polímeros impressos de 1995 a 2017 de
acordo com o mecanismo de busca Web of Science (acesso em 06 jan. 2018) usando
o termo "molecularly imprinted polymer" no título.
Em comparação com outros sistemas de reconhecimento, como por exemplo os
anticorpos, os MIPs apresentam vantagens em relação à estabilidade, ao baixo custo,
ao reconhecimento específico e a universalidade de aplicações, tornando-se atraentes
em muitos campos, tais como purificação (Kowalski et al., 2004), separação (Iskierko
et al., 2016), pré-concentração (Sheykhaghaei et al., 2016), sensores (Shimizu e
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 24
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
Stephenson, 2010), catálise (Mirata e Resmini, 2015) e entrega de fármacos (Alvarez-
Lorenzo e Concheiro, 2004). Outra característica atraente da impressão molecular é
a impressão de uma ampla variedade de moléculas ou íons, incluindo cátions e ânions
(por exemplo, Ca2+, Cu2+, Pb2+, Fe3+, F- e NO3-), moléculas pequenas (por exemplo,
fármacos, pesticidas, aminoácidos, peptídeos, bases nucleotídicas, esteroides e
açúcares), moléculas orgânicas grandes e bioanalitos (por exemplo, vírus,
imunoglobulinas e eritrócitos). Além disso, os MIPs podem ser usados como materiais
feitos sob medida quando os receptores biológicos não estão disponíveis (Menger et
al., 2016).
Na impressão molecular, duas abordagens, covalente e não-covalente, são
empregadas para descrever as interações entre molécula molde e os monômeros. A
abordagem covalente foi introduzida pela primeira vez por Wulff e Sarhan (1972)
(Wulff e Sarhan, 1972), que envolve a formação de ligações covalentes reversíveis
entre a molécula molde e o monômero antes da polimerização. A vantagem óbvia
deste procedimento é que os sítios de ligação são mais homogêneos e estáveis e,
consequentemente, mais seletivos. No entanto, a cinética de ligação é lenta e a
remoção da molécula molde da matriz polimérica torna-se mais complexa, pois tanto
a formação como a clivagem da ligação covalente devem ocorrer em condições
brandas. Em contraste, Arshady e Mosbach (1981) (Arshady e Mosbach, 1981)
desenvolveram uma abordagem não-covalente que combina a molécula molde e o
monômero por interações não-covalentes, como forças eletrostáticas, forças de van
der Waals, interações iônicas ou ligações de hidrogênio. A vantagem de possuir uma
rápida cinética de ligação e remoção, além de um grande número de monômeros
capazes de interagir com uma ampla variedade de moléculas molde disponíveis no
mercado, tem tornado essa abordagem a mais utilizada na preparação dos MIPs
(Vasapollo et al., 2011). No entanto, essa abordagem apresenta como desvantagens
a baixa seletividade, que ocorre devido a heterogeneidade dos sítios de ligação e uma
maior influência da polaridade do solvente utilizado no processo de pré-polimerização.
A literatura apresenta uma terceira abordagem, que descreve um duplo modo de
ligação, onde a molécula molde e o monômero interagem covalentemente na etapa
de pré-polimerização e interagem de forma não covalente na etapa de religação. Essa
abordagem é conhecida como semi-covalente (Caro et al., 2002).
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 25
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
1.2. Métodos de Impressão Molecular
1.2.1. Síntese dos MIPs
Os MIPs podem ser sintetizados empregando-se várias técnicas diferentes, tais
como polimerização em massa, em suspensão, de precipitação e sobre a superfície
de partículas inorgânicas (Tabela 1 - 1). A seleção do método de impressão depende
do tamanho e da forma do MIP desejado (isto é, material denso ou microporoso, filmes
finos, nanopartículas, etc.), do tipo de molécula molde e do tipo aplicação. Por
exemplo, na preparação de amostras de alimentos, os MIPs são muitas vezes
sintetizados empregando-se o método de polimerização em massa antes de serem
enxertados em um suporte de fase sólida, enquanto que em biossensores baseados
em MIP, os filmes finos são mais comumente enxertados na superfície do sensor (Kriz
e Mosbach, 1995; Pillay et al., 2013). Para ambas aplicações, os MIPs com alta área
superficial e grande número de locais de ligação são desejáveis, enquanto a
quantidade de ligações não específicas deve ser mantida ao mínimo.
Cronologicamente, o primeiro método de polimerização empregado para
sintetizar o MIP baseou-se na polimerização em massa, seguida de moagem e
peneiramento para obter pequenas partículas de tamanho micrométrico adequadas
para utilização em aplicações cromatográficas (Zu et al., 2010). Neste processo, o
monômero funcional é espacialmente organizado em torno de uma molécula molde
na presença de um solvente orgânico. O complexo resultante da interação entre a
molécula molde e o monômero é copolimerizado com um excesso de agente de
reticulação na presença de um iniciador, sob condições térmicas ou fotoquímicas. O
bloco polimérico resultante é então moído e peneirado para produzir partículas de um
tamanho apropriado. Por fim, a molécula molde é removida da matriz polimérica
deixando sítios de ligação complementares em locais de ligações e em forma. Embora
este método seja o mais popular, por ser simples e universal, apresenta algumas
desvantagens, tais como preparação demorada e menos locais de reconhecimento
específicos, o que, consequentemente, provoca uma cinética de ligação lenta e baixa
capacidade de ligação (Wu et al., 2016).
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 26
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Outro método aplicado é o da polimerização por suspensão (Mayes e Mosbach,
1996). Neste método, a polimerização ocorre dentro de gotículas de monômeros que
funcionam como mini-reatores, permitindo a produção de partículas esféricas em uma
ampla faixa de tamanho, começando em alguns micrômetros até milímetros. O
processo de síntese inicia-se com a solubilização de todos reagentes em solvente
orgânico, seguido da adição de um solvente imiscível, geralmente água ou óleo
mineral, contendo um agente tensoativo, formando uma emulsão. O controle do grau
de agitação e da quantidade de tensoativo, bem como da temperatura, torna-se
fundamental para determinar o tamanho médio e a distribuição de tamanho das
partículas. Em comparação com o método de polimerização em massa, as partículas
formadas não necessitam de moagem mecânica, apresentam tamanhos mais
uniformes e são separadas da fase imiscível com maior facilidade. No entanto, mesmo
uma pequena quantidade de água difundida na fase orgânica é suficiente para destruir
as ligações de hidrogênio entre os monômeros e as moléculas moldes. Além disso,
em situações onde monômeros e moléculas molde possuem elevada solubilidade em
água, existe a possibilidade de ocorrer partição dos constituintes reacionais da fase
orgânica com a fase aquosa, resultando em um baixo fator de reconhecimento
molecular (Martin-Esteban, 2001).
O método de polimerização por precipitação é análogo ao método de
polimerização em massa e baseia-se no crescimento de cadeias de polímero, que
precipita durante a reação quando um determinado comprimento de cadeia é atingido,
tornando-se insolúvel no solvente orgânico, com consequente precipitação. A rigidez
proporcionada pelo agente de reticulação é suficiente para impedir a coalescência das
partículas, dispensando o uso de tensoativo. As vantagens desse método consistem
na obtenção de partículas monodispersas com diâmetros inferiores a 100 nm, não
sendo necessária a fase de moagem, além de rendimentos superiores em relação à
polimerização em massa. A principal desvantagem consiste no uso de elevadas
quantidades de solvente orgânico, chegando a ser 8 vezes maior que o método de
polimerização em massa. Além disso, pode ser necessário o uso de centrífugas de
alta rotação para recolher as partículas obtidas em nanoescala (Tamayo, Casillas e
Martin-Esteban, 2003).
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 27
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Tabela 1 - 1. Resumo dos diferentes métodos de preparação dos MIPs.
MIP Vantagens Desvantagens
Polimerização
em massa
- Simplicidade
- Universalidade da polimerização
- Procedimentos tediosos de
moagem e peneiramento
Polimerização
em suspensão
- Síntese altamente reprodutível
- Partículas esféricas
- Não necessidade de moagem.
- Partição dos constituintes
reacionais
- Incompatibilidade com água
Polimerização
de precipitação
- Partículas monodispersas
- Elevados rendimentos
- Elevadas quantidades de
solvente orgânico e molécula
molde
Polimerização
em superfície
- Morfologia definida
- Alta capacidade de ligação
- Rápida transferência de massa
- Processo demorado
- Sistema mais complexo
Outro método recente de preparo do MIP consiste na polimerização sobre a
superfície de partículas. Neste método, a polimerização é realizada sobre uma
partícula inorgânica, geralmente esférica (caroço), de modo que os materiais
impressos formem uma camada fina (casca) na superfície das esferas, obtendo-se
uma estrutura do tipo caroço-casca. Esse método apresenta algumas vantagens em
relação aos MIPs já descritos, tais como morfologia definida, alta capacidade de
ligação e rápida transferência de massa. Além disso, as partículas obtidas assumem
características uniformes e mecanicamente estáveis (Miao et al., 2015). No entanto,
dentre os métodos citados, esse é considerado o mais complexo, isso porque o
controle da uniformidade e do tamanho da camada polimérica ainda não está bem
estabelecido.
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 28
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Os núcleos do MIP com estrutura caroço-casca podem ser compostos de
diversos materiais, tais como partículas de sílica (Cheng, Liu e Wang, 2013), partículas
magnéticas de óxido de ferro (Fan et al., 2015), partículas metálicas e pontos
quânticos (Ren e Chen, 2015). A vantagem de aplicar esferas de sílica na fabricação
do MIP com estrutura caroço-casca está associada com a fotoestabilidade, a
estabilidade química, a biocompatibilidade, a fácil modificação e ao fato da sílica ser
uma matriz inerte. Além disso, as partículas de sílica podem ser desenvolvidas com
diferentes tamanhos e porosidade. O método desenvolvido por Stöber, por exemplo,
é capaz de produzir partículas monodispersas de até 2 µm (Stöber, Fink e Bohn,
1968). No entanto, quando se objetiva sintetizar partículas em microescala, o método
de Stöber geralmente é substituído pelo método da macroemulsão. A macroemulsão
produz partículas polidispersas, não aglomeradas, porosas ou não-porosa, e que
devido ao tamanho em microescala podem ser facilmente manuseadas e recuperadas
(Darbandi, Thomann e Nann, 2005).
1.2.2. Mecanismo de Polimerização
1.2.2.1. Polimerização por Radicais Livres
A polimerização por radicais livres é o método sintético mais importante
disponível hoje para a conversão de monômeros em polímero, sendo amplamente
explorada na indústria para a produção, em escala de várias toneladas, de uma série
de plásticos comercialmente importantes. Essa polimerização ocorre através da
quebra de uma ligação dupla da unidade monomérica, convertendo-a em um radical
de propagação ativo (Daoud Attieh et al., 2017). Uma das principais vantagens desse
processo consiste no uso de condições brandas de reação, como, por exemplo,
temperatura ambiente e pressão atmosférica. Apesar de seus muitos benefícios e uso
amplamente difundido, o rápido crescimento da cadeia polimérica e a reação de
terminação irreversível impõem algumas limitações sobre o grau de distribuição do
peso molecular da estrutura polimérica. Os passos básicos na polimerização por
radicais livres são caracterizados por três estágios: iniciação, propagação e término,
podendo ser composto por mais estágios dependendo do processo (transferência de
cadeia). Em geral, a etapa de propagação é o estágio mais rápido da polimerização,
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 29
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
sendo o iniciador ativo durante todo o processo da polimerização (George Odian,
2004).
1.2.2.1.1. Iniciação
Esta etapa envolve a criação do centro ativo de radicais livres e geralmente
ocorre em duas etapas. A primeira é a formação de radicais livres a partir de uma
decomposição do iniciador, que pode ser térmica ou por radiação, e a segunda é a
adição de um desses radicais livres a uma molécula de monômero (Figura 1 - 2) (Su,
2013).
Figura 1 - 2. Representação esquemática da decomposição do iniciador 2,2’-
azobisisobutironitrilo (AIBN) (I) e passo de adição do monômero (ácido acrílico) (II).
1.2.2.1.2. Propagação
O segundo estágio envolve o crescimento da cadeia polimérica por adição rápida
e sequencial do monômero para o centro ativo (Figura 1 - 3). O tempo necessário para
cada adição de monômero normalmente de alguns milissegundos e, portanto,
milhares de adições podem ocorrer em poucos segundos (Su, 2013).
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 30
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Figura 1 - 3. Representação esquemática do passo de propagação do monômero
(ácido acrílico).
1.2.2.1.3. Término
Nesta fase, o centro ativo é destruído de forma irreversível e a propagação
cessa. A terminação ocorre através de reações de acoplamento (etapa designada
como combinação) ou transferência atômica entre cadeias ativas (etapa designada
desproporção). A combinação envolve o acoplamento entre duas cadeias em
crescimento para formar uma única molécula de polímero. A desproporção envolve a
transferência de um átomo de hidrogênio de uma cadeia polimérica em crescimento
para outra, formando diferentes grupos finais sem uma cadeia interligada (Figura 1 -
4) (Su, 2013).
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 31
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Figura 1 - 4. Representação esquemática do passo de término da polimerização.
1.2.2.2. Polimerização Radicalar Controlada
A polimerização radicalar controlada tem chamado atenção por possuir potencial
para superar as limitações da polimerização por radicais livres. Embora mais flexível
em termos de pureza do reagente, condições experimentais e escolha de monômeros,
a polimerização por radicais livres apresenta como desvantagem o não controle da
massa molar do polímero sintetizado, que ocorre devido à alta reatividade dos radicais
produzidos constantemente durante o processo de polimerização.
A polimerização radicalar cessa somente quando não há mais monômeros,
podendo continuar após a adição de mais monômero, comprovando que o processo
pode ser interrompido e reiniciado a qualquer momento. Diferentemente, a
polimerização radicalar controlada (Figura 1 - 5) permite a síntese de polímeros com
dispersão e massa molar sob controle e, embora não seja um processo trivial,
possibilita no mínimo um controle parcial da massa molar e dispersão (Dragutan et al.,
2015). Atualmente, os três métodos mais eficazes de polimerização controlada
incluem polimerização mediada por nitróxido (NMP, do inglês nitroxide-mediated
polymerization), polimerização radicalar por transferência de átomos (ATRP, do inglês
Atom-transfer radical-polymerization) e transferência reversível de cadeia por adição-
fragmentação (RAFT, do inglês Reversible addition−fragmentation chain-transfer).
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 32
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Figura 1 - 5. Representação esquemática do mecanismo de polimerização via
transferência reversível de cadeia por adição-fragmentação (RAFT).
Nos últimos anos, a RAFT tem sido considerada uma das técnicas mais
eficientes para o controle da polimerização radicalar, mostrando-se versátil e robusto
a diversas condições de síntese, resultando em polímero com estrutura controlada. A
versatilidade da polimerização RAFT possibilita o uso de agentes que transportam
muitos grupos finais reativos úteis, possibilitando a polimerização de diversos
monômeros que são inerentemente problemáticos em outras técnicas de
polimerização. A polimerização RAFT assemelha-se à polimerização por radicais
livres nos mecanismos básicos, ou seja, na iniciação e propagação. A minimização
das reações de terminação e de transferência é uma etapa crítica neste contexto. Na
prática, a principal diferença entre os métodos é a adição do agente RAFT (por
exemplo, ditiobenzoato) na mistura de reação inicial. A inclusão do agente RAFT
garante os passos reversíveis para ativação/desativação do radical, conforme
ilustrado na Figura 1 - 5.
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 33
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1.2.3. Reagentes e Condições Utilizados em Impressão
Molecular
A síntese dos MIPs exige uma boa compreensão sobre equilíbrio químico, teoria
de reconhecimento molecular, termodinâmica e química de polímeros, a fim de
compreender os parâmetros de síntese, incluindo a molécula molde, uma vez que
podem influenciar a morfologia, as propriedades e o desempenho dos polímeros. O
desafio de projetar e sintetizar um MIP pode ser uma perspectiva desalentadora diante
do grande número de variáveis experimentais envolvidas, tais como a molécula molde,
monômero funcional, agente de reticulação, iniciador e solvente porogênico. O
conhecimento sobre as variáveis de síntese permite prever de forma racional se o
polímero será rígido, flexível ou os dois, por exemplo.
1.2.3.1. Molécula Molde
A molécula molde é o composto alvo em um processo analítico, que geralmente
é selecionada com base em sua disponibilidade, custo e funcionalidade química. Uma
molécula molde ideal deve satisfazer três requisitos: Primeiro, não deve conter grupos
envolvidos ou impedindo a reação de polimerização. Segundo, deve ser estável em
temperaturas moderadamente elevadas (> 60 °C) ou durante a exposição à luz
ultravioleta. Finalmente, deve conter grupos funcionais capazes de interagir
fortemente com os monômeros funcionais. Embora a maior parte das publicações
envolvendo MIPs utilize uma única molécula molde no sistema, um número crescente
de trabalhos que descrevem a síntese de MIP para mais de uma molécula molde tem
sido relatado (Sun et al., 2017). Além disso, dependendo do método de síntese, um
polímero fabricado usando uma única molécula molde pode extrair mais de uma
molécula presente. Geralmente, essas moléculas apresentam uma estrutura análoga
a outras estruturas (geralmente compostos de uma mesma classe), variando apenas
um grupo funcional ou posição de ligação, através de um efeito conhecido como
seletividade cruzada (Barros, Custodio e Rath, 2016). Por exemplo, Esteban e
Tamayo desenvolveram um polímero impresso para fenuron, inuron, metoxuron,
clortoluron, isoproturon, metobromuron, todos pertencentes à classe dos herbicidas
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 34
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de feniluréia, para extração em baixos níveis de concentração diretamente de extratos
de amostras de vegetais (Tamayo e Martin-Esteban, 2005).
1.2.3.2. Monômero Funcional
Na Figura 1 - 6 são apresentadas as estruturas químicas moleculares dos
monômeros mais comumente usados para fabricação dos polímeros impressos.
Observa-se que como característica em comum, a maioria das moléculas possui um
grupo vinil e grupo capaz de realizar ligações de hidrogênio. A escolha cuidadosa do
monômero funcional é de extrema importância para fornecer grupos funcionais que
podem formar um complexo com a molécula molde através de interações covalentes
ou não covalentes.
Figura 1 - 6. Monômeros funcionais comumente utilizados na síntese de polímeros
impressos.
Normalmente, os monômeros são polimerizados resultando em macromoléculas
lineares que são solúveis e quimicamente compatíveis com diferentes solventes. A
razão molar entre a quantidade de monômero e de molécula molde é, geralmente,
maior que a unidade, favorecendo a formação da cavidade da molécula alvo. A força
das interações entre a molécula molde e o monômero afeta a afinidade, a estabilidade
e a seletividade. Dependendo do tipo de molécula molde, pode-se utilizar dois ou mais
monômeros para formar o complexo, resultando no aumento na capacidade de
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 35
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extração e seletividade. No entanto, vale ressaltar que um excesso de monômero
pode aumentar a quantidade de sítios de ligação não específicos, promovendo a
diminuição da seletividade do MIP (Alenazi, Manthorpe e Lai, 2016).
1.2.3.3. Agente de Reticulação
Durante a síntese dos MIPs, os agentes de reticulação desempenham papéis
essenciais, tais como controlar a morfologia da matriz polimérica, estabilizar os sítios
de ligação do MIP e dar estabilidade mecânica à matriz polimérica para manter sua
capacidade de reconhecimento molecular. Na Figura 1 - 7 são apresentadas as
estruturas químicas moleculares de alguns agentes de reticulação mais utilizados.
Figura 1 - 7. Estruturas químicas dos agentes de reticulação.
O tipo e a quantidade de agente reticulante têm influências profundas na
seletividade e na capacidade de ligação dos MIPs. Geralmente, uma quantidade muito
baixa de agente reticulante resultará em propriedades mecânicas instáveis devido ao
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 36
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baixo grau de reticulação, e uma quantidade extremamente alta do agente reticulante
reduzirá o número de sítios de reconhecimento por unidade de massa de polímero. A
literatura apresenta uma série de reticulantes compatíveis com a impressão molecular,
alguns dos quais são capazes de complexar simultaneamente a molécula molde e,
assim, atuar como monômero funcional (Yan e Ho Row, 2006).
1.2.3.4. Iniciador
O iniciador funciona como um gatilho que possibilita o início e a manutenção da
reação de polimerização. Normalmente, eles são usados em níveis baixos em
comparação com a quantidade de monômero (1% em massa). A grande maioria dos
MIPs é comumente preparada por meio de polimerização por radicais livres,
fotopolimerização e eletropolimerização, podendo ser iniciado térmica ou
fotoquimicamente para uma ampla faixa de grupos funcionais e moléculas molde
(Chen et al., 2016). Além do peróxido, os azo-compostos são amplamente utilizados
como iniciadores, sendo o 2,2’-azobisisobutironitrilo (AIBN) mais comumente utilizado,
podendo iniciar a reação de polimerização via radical livre ou termólise ou fotólise
(Figura 1 - 8).
Figura 1 - 8. Estrutura química de iniciadores comuns utilizados na impressão
molecular não covalente.
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 37
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A utilização da radiação ultravioleta (UV) permite obter tempos de polimerização
bastante inferiores em relação à temperaturas moderadas (> 60ºC); no entanto, é
necessário conhecer a fotossensibilidade dos demais reagentes envolvidos na reação.
Em alguns casos, como na fabricação de MIPs para proteína, utiliza-se um iniciador
que desencadeie a reação de polimerização a uma temperatura ambiente e sem
fotólise; por exemplo, o persulfato pode produzir radicais livres na presença do ânion
bisulfito ou na presença de metais de transição (Fe2+). A remoção do oxigênio
presente no ambiente de síntese do polímero, a qual pode ser feita pela saturação
usando nitrogênio, é um passo importante para evitar a formação de um excesso de
radicais que prejudiquem o processo de polimerização e, consequentemente, a
formação dos sítios de ligação.
1.2.3.5. Solvente Porogênico
O solvente porogênico desempenha um papel importante na polimerização,
atuando não só como meio de dispersão, mas também como agente formador de
poros. O solvente, com a quantidade e a natureza adequada, fornece porosidade à
matriz polimérica alterando as propriedades e a morfologia, o que facilita a
transferência de massa do analito para os sítios de ligação. Além disso, também
influência a força de interação envolvida no complexo formado entre a molécula molde
e o monômero, especialmente se a interação for do tipo não covalente. Solventes
orgânicos apróticos e de baixa polaridade, tais como tolueno, acetonitrila e clorofórmio
são frequentemente utilizados em processos de polimerização não covalentes para
obter boas eficiência de impressão e capacidade de adsorção. A literatura apresenta
diversos resultados que comprovam que a “memória do solvente” influência o
desempenho do MIP, ou seja, um MIP apresenta melhores resultados quando
aplicados usando o mesmo solvente de síntese (Chen et al., 2016).
1.2.4. Caracterização dos MIPs
A caracterização física, química e funcional dos polímeros impressos geralmente
envolve uma variedade de técnicas analíticas. Dentre as técnicas mais utilizadas
estão a microscopia eletrônica de varredura (SEM, do inglês scanning eletronic
microscopy) e de transmissão (TEM, do inglês transmission eletronic microscopy),
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 38
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adsorção-dessorção de nitrogênio, análise termogravimétrica, espectroscopia de
ressonância magnética nuclear (NMR, do inglês nuclear magnetic resonance),
espectroscopia no infravermelho médio por refletância total atenuada (MIR-ATR, do
inglês mid-infrared attenuated total reflectance), espectroscopia ultravioleta-visível
(UV-Vis), espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDX, do inglês energy-
dispersive X-ray spectroscopy), dentre outras (Cormack e Elorza, 2004). Os métodos
de caracterização podem ser divididos em três partes complementares:
caracterização química, morfológica e de sítios de ligação.
1.2.4.1. Caracterização Química
A etapa de pré-polimerização, onde um complexo é formado entre a molécula
molde e o monômero, é determinante para o desempenho analítico do MIP. A NMR
de hidrogênio foi introduzida nos processos de caracterização dos polímeros
impressos para investigar a extensão da interação envolvendo monômero e molécula
molde na solução de pré-polimerização. Assim, a avaliação do deslocamento de um
sinal de próton, proveniente da ligação de hidrogênio, pode ser utilizado como critério
de seleção do monômero funcional e a da molécula molde.
A espectroscopia MIR-ATR tem sido rotineiramente empregada como técnica de
caracterização dos polímeros impressos, seja ele tradicional ou com estrutura caroço-
casca. Essa técnica permite identificar uma modificação na superfície das partículas,
bem como no produto final da polimerização. Além disso, também é possível monitorar
o processo de lavagem do polímero, certificando a remoção por completo da molécula
molde. A vantagem do MIR-ATR é ser uma técnica rápida e não destrutiva, o que pode
ser extremamente útil, uma vez que algumas sínteses possuem baixo rendimento e a
quantidade de material produzida é pequena.
A EDX é uma técnica espectroscópica quantitativa que permite determinar a
composição elementar da superfície e da estrutura interna do polímero. A EDX usa
raios-X para expulsar elétrons dos orbitais internos que podem ser usados para
detectar a composição química de superfícies químicas dentro de uma profundidade
de 5 – 100 nm, dependendo da potencia utilizada, dependendo da aceleração e da
densidade utiliza. A EDX acoplada em microscópios eletrônicos é ainda mais eficiente,
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 39
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
uma vez que possui um poder maior de resolução, tornando o mapeamento sobre a
camada polimérica e seu núcleo, se existir, mais eficiente, obtendo resultados mais
confiáveis.
1.2.4.2. Caracterização Morfológica
A morfologia de um polímero é um aspecto importante que influencia a
estabilidade, a capacidade de adsorção e a seletividade. O estudo da morfologia traz
informações relacionadas a porosidade, como tamanho e volume dos poros, área
superficial e, em sistema caroço-casca, o tamanho e forma do caroço e a espessura
da casca polimérica. Os parâmetros relacionados a porosidade geralmente são
determinados pela isoterma adsorção-dessorção de nitrogênio, sendo a área
superficial e o volume de poros determinados usando o modelo BET (Brunauer,
Emmett e Teller) e BJH (Barret, Joyner e Halenda), respectivamente. A microscopia
eletrônica permite obter mais detalhes da superfície do polímero, determinar o
tamanho das partículas e sua dispersão morfológica. Além disso, através das
micrografias é possível estimar se o material produzido possui boa estabilidade
mecânica, uma vez que, pode ter ocorrido o colapso de algumas partículas durante o
processo de lavagem e peneiramento.
1.2.4.3. Caracterização dos Sítios de Ligação
A quantificação da intensidade e da capacidade de adsorção, bem como a
especificidade da matriz polimérica é essencial para uma compreensão do
desempenho analítico do MIP. Esses parâmetros são normalmente alcançados pela
obtenção de dados de adsorção, usando absorção no UV-VIS de soluções padrão da
molécula molde, para um polímero em um intervalo de concentração especificado,
onde as concentrações de analito (molécula molde) ligado e livre são medidas. Um
dos principais pressupostos para a análise de dados de ligação é que os dados são
coletados após o equilíbrio entre a molécula molde e o polímero. Ao caracterizar as
propriedades de ligação, existem três propriedades pertinentes: afinidade,
seletividade e cinética. A afinidade e a cinética indicam a estabilidade e intensidade
das ligações, e se o processo pode ou não ocorrer em um determinado tempo. A
especificidade discrimina qualidade dos sítios de ligação, ou seja, se monômero e
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 40
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
molécula molde interagem de forma adequada para produzir seletividade (Yan et al.,
2013). Normalmente, esses estudos são realizados utilizando o método de incubação
ou o método da extração em fase sólida (SPE, do inglês Solid Phase Extraction).
1.2.4.3.1. Método de Incubação
O método de incubação consiste na dispersão do polímero em uma solução (em
um tubo de centrifuga, por exemplo), orgânica ou aquosa, contendo a molécula molde
ou similar, sob agitação moderada durante um determinado período de tempo. O
tempo de incubação para a maioria dos ensaios é o tempo necessário para que 90%
da quantidade de molécula molde em solução se ligue ao polímero. Uma vez que o
equilíbrio é alcançado, o polímero é separado por filtração ou centrifugação, e o
sobrenadante é cuidadosamente removido para determinar a quantidade de molécula
molde livre e, consequentemente, a quantidade adsorvida ao polímero (Fernandes et
al., 2017). Para tal determinação, é necessário a construção de uma curva de
calibração da concentração de molécula molde versus absorção no UV-VIS, utilizando
o mesmo solvente da etapa de incubação.
1.2.4.3.2. Método MISPE
No método MISPE, os analitos contidos numa matriz aquosa são extraídos,
juntamente com os compostos interferentes, após passarem por um cartucho ou uma
coluna contendo entre 100 e 1000 mg de sorvente, que pode ser um polímero
impresso, com tamanho de partícula variando de 20 a 60 µm, fixado no tubo por meio
de dois filtros de tamanho de poros de 20 µm (Fernandes et al., 2017). As etapas
envolvidas na SPE são: o condicionamento, necessário para ativar a fase extratora,
a extração, onde analitos semi-voláteis e não voláteis são extraídos de amostras
líquidas, a limpeza (clean-up), para retirar os interferentes menos retidos que o analito,
e a eluição, que recupera o analito de interesse (Ötles e Kartal, 2016). Apesar da SPE
apresentar vantagens com relação aos métodos mais clássicos, tais como praticidade
e maior sensibilidade, esta técnica tem algumas limitações. Uma delas refere-se à
etapa de eluição do analito retido no cartucho de SPE que necessitam geralmente do
uso de solventes tóxicos. Além disso, apresenta altos custos dos cartuchos e dos
dispositivos comerciais multivias (manifolds). O método SPE quando utiliza como
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 41
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
sorvente um polímero impresso recebe a denominação de MISPE (do inglês,
Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction).
1.2.5. Adsorção
A adsorção é um fenômeno superficial, presente em processos físicos, químicos
e biológicos, que surge devido a interações entre átomos, íons ou moléculas de um
adsorbato e os presentes na superfície do adsorvente. A adsorção é um processo que
ocorre quando um componente em uma fase gasosa ou líquida (adsorbato) se
acumula na superfície de um sólido ou líquido (adsorvente), formando uma película
molecular ou atômica. O processo envolve uma série de fenômenos que podem alterar
a distribuição do soluto entre as fases constituintes e nas interfaces (Weber, McGinley
e Katz, 1991). O processo é acompanhado por separação do soluto de uma fase para
outra após sua acumulação na superfície do último. Dependendo dos tipos de fases
em contato, podemos considerar este processo nos seguintes sistemas: gás-líquido,
líquido-líquido, sólido-líquido e sólido-gás.
A adsorção pode ocorrer com dois processos diferentes, nominalmente
conhecidos como quimissorção (adsorção química) e fisissorção (adsorção física). Os
dois processos são facilmente distinguíveis na maioria dos casos devido às diferenças
tanto na escala de energia de interação quanto na escala de tempo de dessorção. A
adsorção química envolve fortes interações adsorbato-adsorvente, resultando numa
alteração na forma química adsorvente. Por exemplo, as moléculas ou átomos de gás
são mantidos na superfície sólida por ligações químicas como uma monocamada. Na
quimissorção a ligação resultante é geralmente mais forte que forças de van der Waals
e é muito similar em intensidade a uma ligação covalente (Calvi et al., 2016). Além
disso, é altamente específica e ocorre apenas se houver alguma possibilidade de
ligação química entre o adsorbato e o adsorvente. Na fisissorção, a molécula
adsorvida fisicamente mantém sua identidade, pois a energia é insuficiente para
romper a ligação, embora possam ocorrer mudanças conformacionais. Como regra
geral, é um processo reversível que ocorre a uma temperatura inferior ou próxima da
temperatura crítica de uma substância adsorvida. Este tipo de adsorção não é
específica, isto é, o adsorvente não tem preferência por nenhuma molécula em
particular (Calvi et al., 2016). Termodinamicamente, na adsorção, forças atrativas
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 42
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atuam de modo a permitir a adsorção sobre uma dada superfície (adsorvente), de
modo a haver sempre liberação de energia. Assim, sempre que a uma dada
temperatura a variação da energia de Gibbs relativa ao processo de adsorção for
negativa, o processo ocorrerá espontaneamente, embora nada se possa prever sobre
a cinética do processo (Ferreira et al., 2014).
1.2.5.1. Cinética de Adsorção
Quando se trata de adsorção, os aspectos termodinâmicos e cinéticos devem
ser considerados para se obter mais detalhes sobre seu desempenho e mecanismos.
A partir da análise cinética, pode-se estabelecer a taxa de adsorção do soluto e,
portanto, alcançar o equilíbrio em um período razoável. Os estudos cinéticos
produzem informações sobre o possível mecanismo de adsorção e os diferentes
estados de transição no caminho para a formação do equilíbrio adsorbato-adsorvente
e ajudam a desenvolver modelos matemáticos adequados para descrever as
interações. Para isso, são sugeridos modelos cinéticos como o de pseudo-primeira
ordem, pseudo-segunda ordem, difusão, entre outros (Liu e Shen, 2008). Uma vez
que os fatores que influenciam a cinética de adsorção são, inequivocamente,
conhecidos, é possível calcular a velocidade de adsorção, capacidade de adsorção
de um adsorvente, além de descrever o tempo necessário para adsorção.
1.2.5.1.1. Modelo de Pseudo–Primeira Ordem
A equação de Lagergren (1898) (Equação 1) é provavelmente o primeiro
exemplo conhecido descrevendo o processo cinético de adsorção em superfícies
sólidas em um sistema sólido/líquido (Tseng, Wu e Juang, 2010). Essa equação tem
sido uma das mais usadas, especialmente para cinética de pseudo-primeira ordem:
dqt
dt= k1 (qe − qt) Equação (1)
onde qe e qt (mg g-1) são as capacidades de adsorção em equilíbrio e em um tempo t
(min), respectivamente, k1 (min-1) é a constante de velocidade de adsorção de pseudo-
primeira ordem. Integrando a Equação 1 com as condições limite de qt = 0 em t = 0 e
qt = qt em t = t, obtém-se a Equação 2:
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 43
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ln (qe
qe − qt) = k1t Equação (2)
a qual pode ser rearranjada para Equação 3:
log (qe − qt) = log qe − k1
2,303t Equação (3)
Os valores de k1 podem ser determinados a partir da inclinação do gráfico linear
obtido da regressão de log (qe – qt) vs t. Em alguns casos, o modelo de pseudo-
primeira ordem não se ajusta a toda faixa de tempo, sendo considerado adequado
somente para os 20 a 30 minutos iniciais de interação. O teste de validade do modelo
decorre de uma comparação entre os valores qe determinados experimentalmente e
aqueles obtidos a partir do gráfico linear de log (qe – qt) vs t. Caso haja uma
discrepância nos valores de qe, então um modelo cinético de ordem maior é
necessário para explicar a cinética de adsorção.
1.2.5.1.2. Modelo de Pseudo–Segunda Ordem
Quando a aplicabilidade do modelo de pseudo-primeira ordem torna-se
insustentável, a adsorção pode seguir a cinética de pseudo-segunda ordem (Equação
4). Esse modelo também é baseado na capacidade de adsorção e descreve a relação
do adsorbato com adsorvente em uma ampla faixa de tempo (Ho e McKay, 1999). A
cinética de pseudo-segunda ordem pode ser testada com base na equação:
dqt
dt= k2 (qe − qt)2 Equação (4)
Onde k2 (g mg-1 min-1) é o coeficiente de velocidade de adsorção. A separação das
variáveis seguida pela integração e aplicação das condições de contorno (qt = 0 em t
= 0 e qt = qt em t = t) produz a seguinte expressão linear:
t
qt=
1
k2𝑞𝑒2
+1
qet Equação (5)
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 44
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A Equação 5 prevê que a relação t/qt deve ser linear em função do tempo, sendo
possível a obtenção do valor de k2 através do coeficiente linear da reta. Além disso, a
equação de pseudo-segunda ordem tem sido interpretada como um tipo especial de
cinética de Langmuir. Esta linha de interpretação assume que (i) a concentração de
adsorvente é constante no tempo e (ii) o número total de sítios de ligação depende da
quantidade de adsorbato adsorvido no equilíbrio.
1.2.5.1.3. Difusão Intrapartícula
Desenvolvido para adsorventes porosos, este modelo baseia-se na teoria de
difusão intrapartícula, derivada da Lei de Fick, que assume que a difusão do filme
líquido que cerca o adsorvente é desprezível e a difusão intrapartícula é a única taxa
que controla as etapas do processo de adsorção (Wu, Tseng e Juang, 2009). Em
muitos casos, a difusão intrapartícula pode controlar a velocidade de adsorção de um
adsorvente, que é representado pela equação descrita por Weber e Morris em 1963
(Weber e Morris, 1963) (Equação 6):
qt = ki t12 + 𝐶 Equação (6)
onde ki (mg g-1 min-1/2) é o coeficiente de velocidade de difusão intrapartícula e C é a
espessura da camada. A característica significativa desta expressão é que se o
gráfico entre qt vs t1/2 apresentar uma relação linear o processo de adsorção ocorre
por difusão intrapartícula. Além disso, através do coeficiente angular e linear é
possível obter os valores de Ki e de C, respectivamente, identificando que quanto
maior o coeficiente linear maior será o efeito da espessura da camada.
1.2.5.2. Isotermas de adsorção
A isoterma de adsorção pode ser definida como uma expressão gráfica usada
para descrever a relação, a uma temperatura constante, entre massa do soluto
adsorvido e a concentração de soluto na solução, uma vez alcançado o equilíbrio. Ao
longo dos anos, uma grande variedade de modelos matemáticos foi formulada para
descrever o processo de adsorção e, com auxílio da estatística, tem possibilitado um
melhor ajuste e, consequentemente, a obtenção dos parâmetros físico-químicos. Os
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 45
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
parâmetros físico-químicos, juntamente com os pressupostos termodinâmicos,
fornecem informações sobre mecanismo de adsorção, propriedades da superfície
(homogênea e heterogênea), bem como o grau de afinidade dos adsorventes
(Belhachemi e Addoun, 2011). Os modelos mais utilizados incluem as isotermas de
Freundlich, Langmuir e Sips (Langmuir – Freundlich). A modelagem é feita ajustando-
se os dados obtidos a uma variedade de isotermas e, com auxílio de um conjunto de
testes estatísticos, pode-se comparar a qualidade dos ajustes com base nos valores
do erro médio quadrático (EMQ) e coeficiente de determinação (R2).
1.2.5.2.1. Modelo de Langmuir
O modelo de Langmuir tem sido utilizado para descrever modelos que assumem
a adsorção em monocamada, ou seja, uma adsorção que ocorre em um número finito
de sítios de ligação idênticos ou equivalentes (quimissorção), sem interações
adjacentes entre as moléculas adsorvidas (atrativas ou repulsivas) (Belhachemi e
Addoun, 2011). Graficamente, esse modelo é caracterizado por apresentar um platô,
que indica a saturação dos sítios de ligação, não sendo possível a adsorção de
nenhuma outra molécula. A expressão matemática do modelo de Langmuir pode
descrever um comportamento linear (Equação 7) ou não-linear (Tabela 1 - 2), sendo
o modo linear representado por quatro equações.
qe = QmKLCe
1 + KLCe Equação (7)
Onde Ce é a concentração da solução em equilíbrio (mg L-1), Qm é a capacidade
máxima de adsorção do polímero (mg g-1) e KL é a constante relacionada à energia
livre de adsorção (L mg-1). Além disso, uma constante adimensional, comumente
conhecida como fator de separação (RL) é descrita pela Equação 8, foi desenvolvida
por Webber e Chakravorti (Weber e Chakravorti, 1974) e usada para indicar se o
processo de adsorção é favorável ou não.
RL = 1
1 + KLC0 Equação (8)
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 46
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
onde C0 é concentração inicial do adsorbato (mg L-1). Os processos podem ser
desfavoráveis (RL> 1), linear (RL = 1), favorável (0 <RL <1) ou irreversível (RL = 0).
1.2.5.2.2. Modelo de Scatchard
O modelo de Scatchard foi desenvolvido para avaliar o número total de sítios de
ligação e a afinidade entre as ligações entre adsorbato e adsorvente (Kowalski, 1988).
Os parâmetros podem ser obtidos a partir da regressão entre Q/Ce versus Q. A
equação de Scatchard (Equação 9) é dada:
Q
Ce=
(Qm − Q)
Kd Equação (9)
O gráfico obtido a partir da equação de Scatchard revela informações úteis a
respeito dos sítios de ligação, isso porque, se graficamente apenas uma reta for
suficiente para descrever o comportamento dos dados, um único sítio de ligação está
envolvido. No entanto, se mais de uma reta for necessária, o sistema apresenta mais
de um sítio de ligação. Além disso, através do modelo de Scatchard é possível obter
a constante de afinidade e a capacidade de máxima adsorção.
1.2.5.2.3. Modelo de Freundlich
O modelo de Freundlich descreve a adsorção como sendo um processo
reversível e não restrito à formação de monocamada que considera as interações
entre as moléculas adsorvidas na superfície do adsorvente (Belhachemi e Addoun,
2011). Este modelo pode ser aplicado a adsorção multicamada, com distribuição não
uniforme sobre uma superfície heterogênea, demonstrando que os sítios de ligação
não são homogêneos. Nesta perspectiva, a quantidade adsorvida é, na verdade, o
somatório da adsorção em todos os sítios de ligação (cada um com energia de
ligação), sendo os sítios com maior energia de ligação preenchidos primeiro. O
modelo de Freundlich é expresso matematicamente de acordo com a Equação 10:
qe = KFCe
1n Equação (10)
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 47
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
onde Ce é a concentração de equilíbrio do soluto na solução (mg L-1), KF é a constante
de Freundlich (constante que indica a capacidade relativa de adsorção de o
adsorvente (mg g-1)) e n é intensidade de adsorção, bem como a distribuição relativa
da energia e a heterogeneidade dos sítios adsorvidos. Por exemplo, se o valor
resultante de 1/n é menor que 1 ou perto de zero, os sítios de ligação são
heterogêneos, e se o valor de 1/n for igual ou maior que 1, a adsorção ocorre em
monocamada através dos sítios homogêneos.
1.2.5.2.4. Modelo de Sips
O modelo de Langmuir-Freundlich, conhecido também como modelo de Sips, é
derivado do comportamento limitante das isotermas de Langmuir e Freundlich (Sips,
1948). Esse modelo contorna a limitação da crescente concentração de adsorvente
associada ao modelo Freundlich. Com baixas concentrações de adsorvente, o modelo
de Sips reduz-se ao modelo de Freundlich, enquanto que em altas concentrações,
onde prevê uma capacidade de adsorção em monocamada, reduz-se ao modelo de
Langmuir. Como regra geral, os parâmetros da equação são regidos principalmente
pelas condições operacionais, como a alteração do pH, temperatura e concentração.
O comportamento não linear do modelo Sips pode ser expresso pela Equação 11:
qe = QsKsC𝑒
𝑛
1 + KsC𝑒𝑛 Equação (11)
Onde KS é constante de afinidade, n o índice de heterogeneidade e Qs a capacidade
de máxima adsorção. Se o valor de n for igual a 1, esta equação se reduzirá à equação
de Langmuir. Alternativamente, quando Ce ou KS se aproximam de 0, essa isoterma
se reduz à isoterma de Freundlich. A Tabela 1 - 2Error! Reference source not found.
contém as equações linearizadas e não-linearizadas dos modelos descritos nesta
seção.
1.2.6. Funções de erro
Atualmente, o método de regressão é a melhor maneira de selecionar a isoterma
ideal. O método de regressão envolve o passo de minimizar a distribuição de erro
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 48
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
entre os dados experimentais e a isoterma prevista. A distribuição de erros entre os
dados de equilíbrio experimental e as isotermas previstas é minimizada, minimizando
a função de erro. O coeficiente de determinação (R2) e o erro médio quadrático (EMQ)
são as funções de erro mais amplamente utilizadas para selecionar o modelo com
melhor ajuste. (Sreńscek-Nazzal et al., 2015).
Tabela 1 - 2. Lista de isotermas de adsorção com as suas respectivas equações
linearizadas e não linearizadas.
Isotermas Expressão
Não Linear Expressão Linear Plot
Langmuir I
qe = Qm KL Ce
1 + KL Qm
Ce
qe=
1
QmCe +
1
KL Qm Ce vs
Ce
qe
Langmuir II 1
qe= (
1
KLQm)
1
Ce+
1
Qm
1
Ce vs
1
qe
Langmuir III qe = Qm − (1
KL)
qe
Ce
qe
Ce vs qe
Langmuir IV qe
Ce= QmKL − QeKL qe vs
qe
Ce
Freundlich qe = KFCe1/n
log qe = log KF + (1
n) log Ce log Ce vs log qe
Sips qe = QsKsC𝑒
𝑛
1 + KsC𝑒𝑛 n ln (Ce) = − ln (
Qs
qe) + ln(Ks) ln (
Qs
qe) vs ln (Ce)
1.2.6.1. Coeficiente de Determinação (R2)
O coeficiente de determinação representa a porcentagem de variabilidade na
variável dependente que foi explicada pela linha de regressão. O valor do coeficiente
de determinação, calculado a partir da Equação 12, pode variar de 0 a 1.
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 49
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R2 = ∑ (qest − q
exp)
2
∑ (qest − qexp
)2
+ ∑(qest − qexp)2
Equação (12)
onde qexp e qest (mg g-1) representam as capacidades de adsorção no equilíbrio
estimados pelo modelo e experimental. Os valores de R2 devem ser superiores a 0,9,
conferindo confiabilidade aos dados.
1.2.6.2. Erro Médio Quadrático (EMQ)
O EMQ é o desvio padrão dos resíduos (erros de previsão) e medem o quão
longe os pontos medidos estão da linha de regressão. Em outras palavras, avalia
como está a distribuição dos dados em torno da linha de melhor ajuste. O erro médio
quadrático é calculado pela seguinte equação:
EMQ = √∑[(qexp − qest)/qexp]2
N Equação (13)
Onde N é o número de amostras. A vantagem de utilizar essa função de erro consiste
em ter um resultado imparcial que segue uma distribuição normal. Assim, ao usar o
EMQ tem-se uma imagem completa da distribuição dos erros.
1.2.7. Aplicações
Nos últimos anos, as nanopartículas tornaram-se peças chaves no
desenvolvimento de metodologias analíticas. As modificações e combinações
envolvendo nanopartículas têm produzido materiais híbridos, com propriedades
específicas, capazes de obter resultados até então inalcançáveis. A combinação
sinérgica das propriedades das partículas com os méritos da impressão molecular
pode melhorar significativamente a seletividade em processos de extração, pré-
concentração e detecção. Os MIPs inspiram pesquisadores a melhorar as
propriedades das superfícies, introduzindo capacidade de reconhecimento e isolando
a superfície do substrato, o que, consequentemente, produz maior estabilidade. Por
exemplo, Willner e colaboradores (Riskin et al., 2008) desenvolveram um polímero
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 50
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impresso na superfície de nanopartículas de ouro para determinação do explosivo
TNT usando ressonância de plasma de superfície (SPR). Em outro trabalho, Chang e
colaboradores (Chang, Ding e Li, 2013) propuseram uma via de síntese simples para
um substrato híbrido de nanopartículas de prata com polímero impresso na superfície
(caroço-casca) para detecção seletiva do ácido 4-mercaptobenzóico usando SERS
(do inglês, Surface-enhanced Raman spectroscopy). Os resultados obtidos revelaram
que o material híbrido pode ser utilizado como plataforma analítica ultra-sensível com
limites de detecção no nível femtomolar.
Os polímeros de impressão molecular magnéticos (MMIPs, do inglês Magnetic
Molecularly Imprinted Polymers) com estrutura caroço-casca, sendo o caroço
magnético, são uma espécie de ferramenta analítica poderosa que combina a
propriedade de adsorção seletiva do MIP com a separação magnética. A aplicação
destes polímeros magnéticos como sorventes permite não só a pré-concentração e
limpeza da amostra, mas também a extração seletiva do analito alvo. Assim, os MMIPs
são particularmente adequados para lidar com amostras biológicas que estão
fortemente sujeitas à interferência da matriz. Várias drogas têm sido usadas como
molécula molde para a preparação de MMIPs, como antibióticos, por exemplo. Kong
e colaboradores (Kong et al., 2012) prepararam um MIP com estrutura caroço-casca
utilizando sulfametazina como molécula molde para extração e determinação de
sulfonamidas na alimentação de aves. Esses MMIPs apresentaram características
adsorventes eficientes amostras de carne. As inúmeras publicações envolvendo MIP
demonstram a versatilidade da tecnologia de impressão molecular e baixa restrição
de uso, o que tem atraído ainda mais o interesse dos pesquisadores. Na sequência
são apresentadas outras aplicações dos MIPs.
Ton e colaboradores (Ton et al., 2012) desenvolveram biossensores baseados
em MIP para detecção rápida de antibióticos de fluoroquinolona em amostras de água
e leite através de medidas de fluorescência. Eles relataram resultados muito
promissores com limite de detecção de 0,1 nmol L-1 para enrofloxacina, que está
abaixo do limite permitido em águas subterrâneas de 0,28 nmol-1. Concluíram que o
ensaio era simples, sem etapas de centrifugação e separação demoradas. Reddy e
colaboradores (Reddy et al, 2013) usaram MIPs para criar bioconjugação nos canais
Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 51
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sensores de um interferômetro de polarização dupla. Eles observaram que a camada
polimérica mostrou seletividade para proteínas mesmo após interagir com amostras
de soro biológico diluídas 1:100. Eles concluíram que os MIPs desempenharam um
papel significativo no reconhecimento seletivo e tiveram potencial para a detecção de
drogas, vírus, pesticidas, toxinas e bactérias, usando medidas simples de adsorção.
Outro estudo interessante na área de novos MIPs, que catalisam a hidrólise de
substratos , foi relatado por Striegler e colaboradores (Striegler, Barnett e Dunaway,
2012). O trabalho centrou-se na hidrólise do glicósido usando microgels catalíticos
impressos com carbonatos. Em um artigo anterior, os autores mostraram que a
hidrólise de p-nitrofenil-a-D-galactopiranósido pode ser acelerada 11.000 vezes ao
longo da reação usando o MIP como catalisador. Kobayashi e colaboradores
(Sreenivasulu Reddy et al., 2002) desenvolveram um MIP baseado em Nylon-6 em
uma barra magnética para reconhecimento quiral diferencial de enantiômeros de
glutamina. A camada polimérica mostrou uma enantio-seletividade notável para a L-
glutamina. Por exemplo, a concentração de L-glutamina foi de 9,64 μmol/L e a da D-
glutamina, 24,1 μmol/L, após o equilíbrio de adsorção a partir de uma solução de 25,0
μmol/L.
1.3. Objetivos
O objetivo desta Tese é o desenvolvimento de polímeros molecularmente
impressos (MIP) com estrutura caroço-casca à base de micro e nanoesferas de sílica
funcionalizadas, porosas e não porosas, para extração seletiva de ácido ascórbico,
cafeína e vanilina usando os métodos de incubação e SPE.
CAPÍTULO 2
2. Polímeros Impressos em Superfície
de Microesferas de Sílica Porosa
Amino-Funcionalizadas para Extração
Seletiva de Ácido Ascórbico
RESUMO GRÁFICO
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 53
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
2.1. Introdução
O ácido ascórbico (AA), também chamado de vitamina C, é um ácido carboxílico
denominado de (5R)-[(1S)-1,2-Di-hidroxietil]-3,4-di-hidroxifuran-2(5H)-ona (C6H8O6),
tem uma massa molar de 176,1 g mol-1, ponto de fusão de 193 °C, pKa 4,72 e
solubilidade moderada em diversos solventes. O AA desempenha um papel
importante nos processos bioquímicos e na manutenção da saúde humana e está
presente em várias frutas e legumes frescos, em diferentes quantidades (5 – 150
mg/kg), atuando como um antioxidante natural que evita danos de macromoléculas
no corpo devido aos radicais livres, provenientes de espécies reativas de oxigênio e
de nitrogênio (Chambial et al., 2013). Níveis anormais de AA estão relacionados a
muitas doenças, como o resfriado comum, escorbuto, doença mental, arteriosclerose,
câncer e catarata. Além disso, o AA é essencial na síntese de colágeno para
cicatrização eficiente de feridas, na síntese dos neurotransmissores e na prevenção
do escorbuto. Portanto, a determinação de AA torna-se importante no diagnóstico de
doenças, segurança alimentar e aplicações cosméticas.
Alguns métodos tradicionais, incluindo cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC, do inglês high-performance liquid chromatography), eletroquímica,
eletroforese capilar e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA, do inglês Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay) têm sido propostos para detecção de AA (Chambial et
al., 2013). Apesar dos resultados de detecção bem-sucedidos, a maioria desses
métodos necessitam de um pré-tratamento de amostra. Nos últimos anos, estudos
têm relatado as aplicações de diversas técnicas, tais como a extração em fase líquida
(LPE, do inglês liquid phase extraction), extração em fase sólida (SPE), extração
assistida por ultrassom (UAE, do inglês ultrasonic assisted extraction) e extração
assistida por micro-ondas (MAE, do inglês microwave-assisted extraction) (Nojavan et
al., 2008). Esses métodos podem ser caros, complicados e demorados, além de não
seletivos, indicando que um método altamente seletivo, de baixo custo, e de fácil e
rápida operação é realmente necessário.
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 54
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A descrição sobre o desempenho e os diversos tipos de aplicações já
mencionadas nesta tese ilustra claramente que a impressão molecular é uma
tecnologia em constante crescimento e que pode ser uma alternativa para a extração
seletiva de ácido ascórbico a partir de frutas. O domínio sobre os processos de síntese
e aplicação de um MIP é fundamental para se obter um método reprodutível,
otimizado, econômico e confiável.
Com o rápido desenvolvimento da química computacional, o uso dos cálculos
quânticos tornaram-se frequentemente utilizados para a otimização do processo de
síntese do MIP. Nos últimos anos, algumas publicações têm apresentado resultados
que demonstram a eficiência dos cálculos teóricos para compreender as interações
entre a molécula molde e o monômero antes da síntese do MIP, assegurando assim
a relação adequada entre pares de monômero-molécula molde para produzir um
polímero com elevada especificidade e seletividade (Barros, Custodio e Rath, 2016).
Nesse sentido, o cálculo da teoria do funcional da densidade (DFT, do inglês Density
Functional Theory) tem sido o mais utilizado por fornecer informações detalhadas com
maior confiabilidade (Huang e Zhu, 2015). Devido à sua maior velocidade
computacional e a sua precisão química aceitável, esse método é mais atraente
quando comparado com cálculos Hartree-Fock (Jacob et al., 2008).
A abordagem computacional é composta pela otimização separada das
conformações da molécula molde e o monômero funcional, seguido do cálculo da
energia (E) de cada molécula. O mesmo processo é repetido para o complexo entre
as duas moléculas e, finalmente, a energia de ligação (ΔE) é obtida a partir da
equação 14:
ΔE = EComplexo − EMolécula molde − EMonômero Equação (14)
Esta metodologia tem sido empregada em diversos estudos descritos na
literatura. No entanto, desde 1990 o uso da energia livre de Gibbs (ΔG) também tem
sido considerado para estimar as energias de ligação entre as duas moléculas. A
vantagem de utilizar a energia livre está na abrangência do parâmetro, uma vez que
envolve os valores de entalpia, entropia e temperatura. Além disso, ΔG é o critério
termodinâmico determinante para avaliar a espontaneidade do processo.
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 55
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Diante disso, o objetivo desta etapa do trabalho foi desenvolver um novo método
de síntese de MIP com estrutura de caroço–casca, com base em microesferas de
sílica amino-funcionalizadas, para a extração seletiva de AA. Além disso, objetivou (i)
avaliar, usando os cálculos DFT de estruturas e parâmetros energéticos, se o
monômero funcional e o solvente utilizados foram os mais adequados para o
desenvolvimento do MIP para AA, (ii) identificar os possíveis sítios de ligação, (iii)
avaliar uma possível modificação do monômero funcional.
2.2. Parte Experimental
2.2.1. Reagentes
Acrilamida (AM), ácido acético, metanol, etanol, ácido cítrico (AC), monooleato
de sorbitano (Span 80) e tetraetilortosilano (TEOS) foram adquiridos da Merck. 1-
octanol, etilenoglicol dimetacrilato (EGDMA), hidroxipropilcelulose (HPC),
poli(etilenoglicol)-bloco-poli(propileno glicol)-bloco-poli(etilenoglicol) (P-123) e 2,2-
azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN) foram adquiridos da Sigma Aldrich. Hidróxido de
amônia (NH3, >25%) foi adquirido da VWR International. L (+) - ácido ascórbico (AA),
tolueno e acetonitrila foram adquiridos da Carlroth. (3-aminopropil)trimetoxisilano
(APTMS) e (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) foram adquiridos da Alfa Aesar.
Todos os reagentes foram utilizados sem purificação adicional. A água utilizada neste
estudo foi deionizada (≥ 18 MΩ cm-1) produzida utilizando um sistema de purificação
Milli-Q.
2.2.2. Fabricação do MIP na Superfície das Partículas
2.2.2.1. Síntese de Microesferas de Sílica (MS)
As MS foram sintetizadas a partir da otimização do método de co-condensação
do TEOS e APTMS em uma macroemulsão de água em óleo com base no
procedimento descrito por C.Oh e colaboradores (C.Oh et al., 2006). A fase oleosa foi
preparada dissolvendo 3,8 g de HPC em 300 mL de 1-octanol sob agitação constante
a 80 ºC durante 5 h. A solução foi arrefecida a 40 ºC e, em seguida, 10 g de Span 80,
um surfactante não iônico, foi misturado na fase óleo. A fase aquosa foi preparada
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 56
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dissolvendo-se 2,52 g de P-123 em 28 mL de água deionizada. Após 30 minutos de
agitação, 0,6 mL da solução de amônia, utilizada como catalisador, foi adicionada à
fase aquosa. Depois da dissolução do P-123, a fase aquosa foi adicionada à fase óleo
e mantida sob agitação moderada. Em seguida, adicionou-se uma mistura de 32,4 g
de TEOS e 2,7 g de APTMS à emulsão para a síntese de MS porosas. A emulsão foi
agitada a 400 rpm durante 16 h, a 40 ºC. Ao término da reação, objetivando diminuir
a viscosidade, adicionou-se 100 mL de etanol à mistura e agitou-se durante mais 10
minutos. Posteriormente, a emulsão foi centrifugada a 1300 rpm (190 G) durante 14
minutos para recolher as MS porosas sintetizadas. As MS recolhidas foram re-
dispersas em etanol, utilizando-se um banho ultrassônico durante 60 minutos. Após
uma nova centrifugação, 900 rpm (90 G) durante 10 minutos, as MS foram recolhidas
e secas a vácuo durante 24 h, a 50 ºC. Por fim, o material produzido foi peneirado a
fim de coletar as MS porosas com um diâmetro maior que 20 µm.
2.2.2.2. Funcionalização das MS (MSF)
A síntese das MS produz partículas porosas e com poucos grupos amino em sua
superfície. O aumento da quantidade de grupos amino na superfície das MS foi
realizado pelo método de pós-enxerto, usando-se APTES como fonte de grupos
amino. Em primeiro lugar, as MS foram dispersas em tolueno anidro (75 mL por grama
das MS) em atmosfera inerte. Em seguida, adicionou-se o APTES (4 mL por grama
das MS) à mistura, sob agitação moderada, deixando-se sob refluxo a 120 ºC por 5 h.
Após a reação, a dispersão (MSF) foi centrifugada, lavada várias vezes com etanol e
seca a vácuo durante 24 h a 50 ºC.
2.2.2.3. Preparação do MIP para AA
Conforme ilustrado na Figura 2 - 1, o MIP com estrutura caroço–casca para
extração de AA (molécula molde) foi desenvolvido via co-polimerização, otimizando-
se o procedimento descrito por Su e colaboradores (Su et al., 2015). Inicialmente,
misturou-se 0,352 g de AA e 0,5768 g AM em 120 mL de acetonitrila e, em seguida, a
mistura foi deixada em repouso durante 5 horas para formação de um complexo entre
a molécula molde e o monômero. Na sequência, 0,400 g de MSF foram adicionados
à mistura e deixada em banho ultrassônico durante 30 minutos e, em seguida, a
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mistura resultante foi colocada no escuro por mais 16 h. Depois, 7,52 mL de EDGMA
e 0,400 g de AIBN foram adicionados à mistura e homogeneamente dispersas,
utilizando-se um banho ultrassônico por 15 minutos. A mistura resultante foi
transferida para um balão de 500 mL e foram adicionados 140 mL de acetonitrila. A
mistura reacional foi submetida a refluxo sob agitação durante 6 h a 60 ºC, seguido de
2 h adicionais a 75 ºC. O MSF@MIP foi lavado várias vezes com acetonitrila, seguido
de centrifugação a 5000 rpm durante 15 minutos. Após centrifugação, a molécula
molde foi removida da matriz polimérica por meio de agitação vigorosa durante 16
horas, usando-se uma mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v). Finalmente, o
produto foi lavado com metanol até a neutralização e, em seguida, seco a vácuo
durante 24 h a 40 ºC. O polímero não impresso (MSF@NIP) foi sintetizado de forma
idêntica, mas sem a adição da molécula molde.
Figura 2 - 1. Ilustração esquemática da preparação do MSF@MIP. O MSF@NIP
correspondente foi preparado com a mesma rota de síntese na ausência da molécula
molde.
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2.2.3. Caracterização
A morfologia e a composição das partículas foram investigadas utilizando-se um
microscópio eletrônico de varredura (SEM Quanta 3D FEG) equipado com um feixe
de íons de gálio focalizado (FIB) (FEI Corp., Eindhoven, Holanda) e um raio-X de
energia dispersiva (Detector EDX) (Apollo XV SDD, EDAX). A área superficial, o
tamanho e o volume dos poros das partículas foram determinados pela isoterma de
adsorção/dessorção de nitrogênio usando um QuadraSorb Station SI (Quantachrome
GmbH e Co. KG). As isotermas de adsorção/dessorção de nitrogênio foram coletadas
após a desgaseificação das amostras a 140 °C sob vácuo durante 3h. A área
superficial e o tamanho e volume dos poros foram calculados usando os métodos BET
e BJH, respectivamente. As medidas espectroscópicas no infravermelho (MIR-ATR)
foram realizadas utilizando-se um espectrômetro Bruker Alpha FTIR (Bruker Optics
GmbH, Ettlingen, Alemanha). Os espectros (média de 50 varreduras) foram coletados
na faixa espectral de 4000 a 400 cm-1, com uma resolução espectral de 2 cm-1. Por
fim, as quantidades de analito (molécula molde) extraída e eluída pelo MSF@MIP e
MSF@NIP foram determinadas com a ajuda de um espectrofotômetro Specord S600
UV/VIS (Analytik Jena), empregando-se uma cubeta com 10 mm de caminho óptico.
2.2.4. Avaliação das Características de Ligação e
Capacidade de Adsorção
2.2.4.1. Estudo de Incubação
Os testes de religação foram realizados em metanol à temperatura ambiente.
Para avaliar a capacidade de adsorção, 10 mg de MSF@MIP e MSF@NIP foram
adicionados separadamente em tubos de centrífuga contendo 8 mL da solução de AA
com concentrações variando de 5 a 33 mg L-1 e deixadas sob agitação durante 180
minutos. Em seguida, o MSF@MIP e MSF@NIP foram separados por centrifugação
e o sobrenadante foi analisado medindo-se a absorbância em 246 nm. A quantidade
de AA adsorvida ao MSF@MIP foi calculada a partir da diferença entre as
concentrações iniciais e finais em solução. Após a incubação, o AA foi eluído
utilizando-se 8 mL da mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v) e a quantidade de
AA eluída foi determinada medindo-se a absorbância em 248 nm. Para estes fins,
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foram estabelecidas curvas de calibração em metanol e em metanol/ácido acético
(8:2, v/v).
A capacidade de adsorção (Q), definida como a quantidade de analito em mg
ligado por g de polímero, foi calculada pela Equação 13:
Q = (Ce − Cf
m) x V Equação 14
Onde Ce (mg L-1) e Cf (mg L-1) são as concentrações da solução de molécula molde
antes e após o processo de adsorção, respectivamente. V (L) é o volume da solução
de AA e m (g) a massa de polímero. A Equação 14 calcula a recuperação (R), definida
como a porcentagem de molécula molde recuperada após o passo de eluição, onde
Cs é a concentração na solução eluída (Ce):
R = (Cs
Ce − Cf ) x 100% Equação 15
As propriedades de reconhecimento específico do MIP foram avaliadas a partir
do fator de impressão (FI), que é definido como a razão das capacidades de adsorção
do MSF@MIP e MSF@NIP (Equação 15):
FI =QMIP
QNIP Equação 16
QMIP e QNIP são as capacidades de adsorção do MSF@MIP e MSF@NIP para AA,
respectivamente.
2.2.4.2. Estudo de SPE
A preparação do sorvente para extração de AA usando o cartucho SPE foi
realizado pesando-se uma alíquota de 100 mg do MSF@MIP e MSF@NIP em um
cartucho vazio, mantendo-se o material entre dois discos de lã de vidro. Antes da
extração, os cartuchos contendo MSF@MIP e MSF@NIP foram tratados inicialmente
com 6 mL da mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v) para garantir a ausência de
AA e, na sequência, condicionados com 6 mL de metanol. Posteriormente, para
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avaliar a capacidade de adsorção do MSF@MIP e MSF@NIP, 25 mL de soluções de
AA em metanol com concentrações variando de 5 a 33 mg L-1 foram percolados
através dos cartuchos SPE. Em seguida, os cartuchos foram lavados com 6 mL de
acetonitrila para eliminação de interferentes. Por fim, o AA foi eluído com 25 mL da
mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v). As quantidades de AA extraídas e eluídas
foram determinadas como descrito no item 2.2.4.1.
2.2.4.3. Reconhecimento Específico do MSF@MIP e
MSF@NIP
Para estudar a seletividade do MSF@MIP e MSF@NIP, 10 mg desses materiais
foram transferidos para diferentes tubos de centrífuga, seguidos de 8 mL da solução
de AC e 8 mL da solução de AA em metanol, simultaneamente, com concentrações
de 28 mg L-1. Após 180 minutos, os polímeros foram separados por centrifugação e
as quantidades de AA e AC no sobrenadante foram determinadas por espectroscopia
UV-Vis. Assim como o AA, uma curva analítica, utilizando a absorbância em 246 nm,
foi construida para quantificar o AC em metanol. A seletividade foi avaliada a partir do
fator de seletividade (FS), que é definido como a razão entre o fator de impressão para
o AA e para o AC (Equação 16):
FS =FIAA
FIAC Equação 17
2.2.5. Método de Cálculo
A estratégia computacional desenvolvida baseou-se no método semi-empírico
AM11 e na DFT para localizar os complexos monômero-molécula molde mais estáveis
em diferentes solventes. O desenho estrutural e as simulações de modelagem
molecular foram realizadas usando o software Gaussian 09 e GaussView,
respectivamente (Frisch et al.,2003). Após o desenho estrutural, a geometria das
moléculas foi otimizada através do cálculo semi-empírico AM1. Na sequência, todas
1AM1 ou Austin Model 1 é um método semi-empírico para o cálculo quântico da estrutura eletrônica em
química computacional. Esses métodos substituem o maior número de cálculos possível com dados
pré-calculados embutidos no software sobre distância de ligação e outras propriedades.
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as estruturas foram minimizadas para a conformação de menor energia no nível
B3LYP/6-31G (d,p)2 no vácuo, e posteriormente, na presença do solvente. A
otimização foi realizada de forma individual, ou seja, primeiro foi otimizado a estrutura
da molécula molde, depois o monômero e, por último, o complexo formado entre os
dois. Os solventes escolhidos para teste foram água, tetraidrofurano (THF),
acetonitrila (ACN), metanol (MeOH), dimetilsulfóxido (DMSO) e diclorometano (DClM).
Já os monômeros testados foram acrilamida, ácido metacrílico e metacrilamida. Para
calcular a energia livre de Gibbs, as geometrias das moléculas envolvidas foram
totalmente otimizadas. As energias (E) dos compostos em unidades atômicas
(Hartrees) foram convertidas em Kcal mol-1 multiplicando o valor por um fator de
627,51 Kcal mol-1 Hartrees-1. A partir das geometrias otimizadas, as frequências de
vibração harmônicas de cada composto foram calculadas.
2.3. Resultados e Discussão
2.3.1. Síntese das MS e do MIP com Estrutura Caroço-
Casca
Em contraste com os métodos para síntese de nanopartículas de sílica
monodispersas, o método da macroemulsão de água em óleo tem sido aplicado para
síntese de partículas em microescala (> 1 μm). Neste estudo, a macroemulsão é
composta de um surfactante não iônico (Span 80), de água, de uma fase óleo, de um
polímero (HPC) e de um copolímero (P-123). No mesmo sistema, uma fase aquosa
alcalina, contendo amônia como catalisador, foi utilizada para aumentar a taxa de
hidrólise e de condensação do TEOS e do APTMS. Embora o TEOS e APTMS sejam
solúveis na fase óleo (isto é, 1-octanol), as reações de hidrólise e de condensação
ocorrem na interface entre a fase água e a fase óleo. Com o tempo, mais e mais
moléculas de TEOS e APTMS são hidrolisadas e acumuladas na interface água/óleo,
permitindo que o sistema possa ser considerado como composto de micro-reatores,
em que a concentração de um reagente aumenta progressivamente durante a síntese.
Como consequência, as partículas de sol primárias altamente reticuladas são obtidas
2É um método híbrido contendo elementos da DFT e da teoria de Hartree-Fock. Uma de suas vantagens é que ele consegue simular espectros com sucesso (Tirado-Rives e Jorgesen, 2008).
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dentro de uma gotícula água, as quais se ligam para formar partículas esféricas
secundárias, semelhante à forma e ao tamanho das gotas de água. O HPC e o Span
80 foram empregados nessa síntese com o objetivo de estabilizar a macroemulsão,
de evitar a separação das fases e de controlar a distribuição dos poros das
microesferas de sílica durante a reação. O polímero HPC também aumentou a
viscosidade do sistema, o que limitou a rápida penetração de moléculas de TEOS e
APTES pela interface água/óleo. Já o copolímero P-123 tem um papel fundamental
no controle da morfologia das micropartículas. Isso porque o copolímero, em meio
alcalino, inibe a condensação inter-gotas e a modificação da estrutura esféricas das
gotas de água na fase óleo.
A síntese das MS pelo método da macroemulsão utilizando a mistura
TEOS/APTMS produz partículas funcionalizadas. No entanto, a quantidade de grupos
amino na superfície é muito pequena, uma vez que a superfície está preenchida
predominantemente por grupos silanois. O método do pós-enxerto permitiu através da
condensação de grupos silanois e APTES o aumento dos grupos amino. Após a
síntese e funcionalização das MSF, os MIPs com estrutura caroço-casca foram
desenvolvidos na superfície MSF pela co-polimerização dos grupos amino com o
monômero funcional AM, usando EGDMA como agente de reticulação e AIBN como
iniciador. O complexo formado entre AM e AA apresenta uma forte interação não
covalente, que é essencial para o processo de impressão molecular. O AM interage
com a molécula do modelo (Figura 2 - 1) para formar um complexo através de ligação
de hidrogênio entre o oxigênio do AM e o hidrogênio do AA. Depois de interagir com
a molécula molde, os monômeros funcionais foram polimerizados pelo reticulador,
formando uma camada polimérica na superfície das MSF. Finalmente, a molécula
molde foi removida da matriz polimérica, deixando cavidades com sítios e dimensões
complementares para reconhecimento específico de AA.
2.3.2. Caracterização
A macroemulsão é uma suspensão estável de partículas de um líquido, de um
determinado tamanho, dentro de um segundo líquido imiscível. Através de medidas
de MEV foi possível observar a morfologia e o tamanho das partículas sintetizadas
usando o método da macroemulsão e sua respectiva funcionalização. As imagens de
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MEV ilustradas na Figura 2 - 2 demonstram que as partículas são esféricas,
polidispersas e porosas, e que a etapa de funcionalização não as modificou
morfologicamente. Além disso, nota-se a presença de partículas colapsadas
resultante da baixa estabilidade física e da elevada agitação durante a síntese.
Figura 2 - 2. Micrografias das (a) MS, (b) MSF, (c) MSF@MIP, (d) MSF@NIP, (e) e (f)
MSF@MIP colapsado.
As micrografias das MS e MSF na Figura 2 - 2 (a) e (b), respetivamente,
apresentam tamanho acima de 2 μm e porosidade semelhante. Através das Figura 2
- 2 (c) e (d) correspondentes ao MSF@MIP e MSF@NIP, respetivamente, observa-se
a formação de uma camada polimérica rugosa na superfície das MSF com elevada
rugosidade. Através da micrografia de um MIP colapsado (Figura 2 - 2 (e) e (f)) foi
possível confirmar a produção do MIP com estrutura caroço-casca possuindo uma
camada polimérica de 1 μm. As micrografias comprovaram que MIP sem a estrutura
caroço-casca também foram formados, contudo, o uso de peneiras de 10 μm
garantiram que apenas MIP com estrutura caroço-casca fossem utilizados.
A espectroscopia MIR-ATR foi empregada para estudar as estruturas químicas
do MS, MSF, MSF@MIP e MSF@NIP. As bandas em 432, 788 e 1033 cm-1 mostrada
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na Figura 2-3 são correspondentes às vibrações de alongamento O–Si–O e Si–OH, e
estiramento assimétrico Si–O–Si, respectivamente. Essas três bandas são
observadas em todos os espectros e estão associadas as MS (Figura 2-3 (c)).
Figura 2 - 3. Espectros de MIR-ATR das (a) MSF@NIP, (b) MSF@MIP, (c) MS e (d)
MSF.
O MSF@MIP (Figura 2-3 (a)) e MSF@NIP (Figura 2-3 (b)) apresentam bandas
em 1408 e 1542 cm-1 relacionadas as vibrações de deformação do grupo – C–H. Por
fim, observar-se uma banda em 1708 cm-1 correspondente as vibrações de
estiramento do grupo C=O. A banda em 1708 cm-1 é característica da MSF@MIP,
demonstrando que a estrutura do MSF@MIP e do MSF@NIP são distintas. Através
dos espectros de MIR-ATR das MS e MSF não é possível distinguir as partículas
funcionalizadas e não funcionalizadas. Para confirmar a funcionalização, utilizou-se a
ninidrina (Figura 2 - 4), um indicador que ao reagir com grupos amina produz o
surgimento de uma cor azul em meio alcoólico. Quanto mais intensa é a cor azul, mais
grupos amino estão presentes, o que indica que o método utilizado para
funcionalização se mostrou eficiente. A funcionalização também foi confirmada pelo
surgimento do sinal de nitrogênio e diminuição do sinal do oxigênio no EDX.
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Figura 2 - 4. Interação das MSF com a ninidrina em solução alcoólica.
Os resultados das medidas de adsorção-dessorção de nitrogênio são
apresentados na Tabela 2 - 1. De acordo com o diâmetro dos poros das partículas
sintetizadas neste estudo, variando de 3 – 45 nm, as partículas são classificadas como
mesoporosas. Comparando-se os valores de área superficial, tamanho de poro e
volume de poro da MS (40 m2/g, 4,86 nm e 0,24 cm3/g) e MSF (31 m2/g, 3,80 nm e
0,26 cm3/g), antes e depois da funcionalização, foi possível observar que a
funcionalização não alterou significativamente as propriedades morfológicas das
partículas.
Tabela 2 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial, tamanho e
volume de poros e tamanho de partícula obtidas a partir do BET, BJH e MEV,
respectivamente.
No caso do MSF@MIP, a camada polimérica é produzida na superfície das
MSF, deixando um espaço entre a superfície das partículas e a camada polimérica
(Figura 2 - 2 (f)), o que provavelmente promoveu um aumento na área superficial de
31 m2/g a 36 m2/g. Finalmente, observou-se que o tamanho de poro do MSF@MIP é
5 vezes maior do que o MSF@NIP, que pode ser atribuído a presença não apenas de
Partículas
Área superficial
(m2/g)
Tamanho de
poro (nm)
Volume de
poro (cm3/g)
Tamanho de
partícula (μm)
MS 40 4,86 0,24 > 2
MSF 31 3,80 0,26
MSF@MIP 36 45,86 0,50 > 10
MSF@NIP 7 9,32 0,013
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poros estruturais, mas também pela aparência de espaços entre a camada polimérica
e a sílica. Além disso, a diferença de tamanho de poro entre o MIP e NIP está
associada à presença da molécula molde durante à fabricação do MIP, gerando um
material híbrido com estrutura diferente do NIP. Por fim, verifica-se que todos os
resultados obtidos pela isoterma de adsorção-dessorção de nitrogênio são
concordantes com a morfologia das partículas de sílica observadas nas micrografias.
2.3.3. Estudo de Adsorção
Para avaliar a capacidade de adsorção do MSF@MIP e MSF@NIP foram
construidas isotermas de adsorção no intervalo de concentração de 5 – 33 mg L-1
(concentrações iniciais) e os resultados são mostrados na Figura 2 - 5.
Figura 2 - 5. Capacidade de adsorção do MSF@MIP e do MSF@NIP em função da
concentração de AA usando o método (a) SPE e o (b) método incubação.
Os resultados indicaram que a capacidade de adsorção cresce rapidamente em
função do aumento da concentração de AA. A quantidade de AA adsorvida ao
MSF@MIP foi significativamente maior do que para a MSF@NIP na mesma
concentração inicial. Além disso, a saturação foi alcançada quando a concentração
inicial foi de 20 mg L-1 para ambos os métodos, mantendo-se constante nas
concentrações acima desse valor. Embora a SPE (Figura 2 - 5 (a)) e os métodos de
incubação (Figura 2 - 5 (b)) mostraram propriedades de adsorção similares, a SPE
proporcionou maior fator de impressão sendo, portanto, mais seletivo. Quando
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comparado com outros tipos de polímeros impressos, o polímero MSF@MIP tem alta
eficiência devido aos sítios de ligação específicos estarem na superfície das
partículas.
Os parâmetros dos modelos obtidos a partir das três isotermas utilizadas estão
listados na Tabela 2-2. Com base nos valores de R2 e EMQ identificou-se que o
modelo com melhor ajuste aos dados experimentais foi o de Sips. Esse modelo
apresentou R2 e EMQ de 0,966 e 2,63, respectivamente.
Tabela 2 - 2. Parâmetros das isotermas para adsorção de AA utilizando MSF@MIP e
MSF@MIP.
A capacidade máxima de adsorção do polímero estimada pelo modelo de Sips
(5,19 mg g-1) foi próxima do máximo valor experimental (5,08 mg g-1), indicando que
Isotermas Parâmetros
SPE Incubação
MSF@MIP MSF@NIP MSF@MIP MSF@NIP
Langmuir
Qm (mg g-1) 7,529 2,659 6,379 2,659
RL 0,926 0,966 0,968 0,966
KL (L mg-1) 0,068 0,073 0,070 0,073
EMQ 4,818 8,136 5,562 10,59
R2 0,885 0,729 0,853 0,695
Freundlich
n 2,039 2,120 2,049 2,120
KF (mg g-1) 0,959 0,370 0,833 0,370
EMQ 6,217 9,323 6,846 10,87
R2 0,808 0,644 0,777 0,679
Sips
Qm (mg g-1) 5,190 1,838 4,167 1,937
ns 0,422 0,353 0,309 0,408
Ks (mg L-1)-1/n 0,121 0,123 0,135 0,087
EMQ 2,635 6,110 2,448 7,485
R2 0,966 0,847 0,971 0,848
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 68
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a condição de extração utilizada foi satisfatória e o material desenvolvido encontra-se
entre os melhores adsorventes para extração de forma seletiva de ácido ascórbico,
uma vez que a literatura descreve adsorventes não seletivos com capacidade de
adsorção variando entre 4,21 mg g-1 (Kamran et al., 2014) e 5,71 mg g-1 (Azin
Dehmolaei e Mehdi Vadi, 2013). Por fim, o valor de n (índice de heterogeneidade)
próximo de 0,500 indica uma superfície com características homogênea e
heterogênea. A regressão obtida entre Q/Ce versus Q da equação de Scatchard
apresentou um coeficiente de determinação 0,9997 (Q/Ce = 0,5096 – 0,0833Q),
indicando que apenas uma reta descreve o comportamento dos dados e,
consequentemente, levando-se à conclusão de que o AA se liga ao polímero apenas
por um sítio na forma de dímeros (ligação de hidrogênio). Para avaliar a estabilidade
do MSF@MIP no decorrer das reutilizações, bem como os processos de lavagem do
material, cinco ciclos de adsorção/remoção foram realizados.
Os experimentos demonstraram que a recuperação do AA após a eluição não
mudou significativamente com o reaproveitamento do MSF@MIP (Figura 2-6), o que
mostra um avanço em relação ao trabalho do Kamran e colaboradores (Kamran et al.,
2014) por exemplo, uma vez que o material utilizado para extrair o AA limitou-se a três
reutilizações. Além disso, a recuperação foi mantida superior a 90%, o que sugeriu
que MSF@MIP tem boa estabilidade, não apresenta lixiviação, não perde seletividade
e mantem sua capacidade de reutilização.
Figura 2 - 6. Recuperação de AA usando MSF@MIP reutilizado.
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 69
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
A seletividade do MSF@MIP para AA foi avaliada em um teste com ácido cítrico
(AC), usando uma solução contendo ambos os compostos na mesma concentração.
A Figura 2-7 indica que os fatores de impressão do MSF@MIP para AA e AC são 2,30
e 0,88, respectivamente, obtendo um fator de seletividade de 2,64. Esses resultados
indicaram que o MSF@MIP exibe alta capacidade de reconhecimento específico para
AA, o que pode ser explicado com base nas diferenças estruturais entre AA e CA, que
causaram uma incompatibilidade na forma e sítios de ligação. Tais resultados indicam
a eficiência de impressão do MSF@MIP, e que o método de síntese do polímero, bem
como o processo de extração, foi executado com sucesso.
Figura 2 - 7. Estudo da seletividade do MSF@MIP e do MSF@NIP para extração do
AA e do CA.
2.3.4. Otimização Estrutural do Monômero e Molécula Molde
A otimização estrutural das moléculas é o primeiro passo para se calcular e,
consequentemente, estimar a energia livre das moléculas envolvidas no processo de
polimerização. A Figura 2-8 mostra a geometria otimizada do AA juntamente com os
monômeros, onde é possível verificar que os sítios de ligação dos monômeros
possuem características para formar ligações de hidrogênio na forma de dímero com
o AA.
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 70
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
Figura 2 - 8. Geometria do AA e dos monômeros otimizadas pelo método B3LYP/6-
31G (d,p), no vácuo. Na molécula de AA, quanto mais intensa a cor, menor a carga.
Observando a molécula de AA (Figura 2-8), sua estrutura química compreende
uma coleção de sítios de ligações heterogêneos capazes de formar interações de
hidrogênio com diversos monômeros funcionais, em diferentes níveis de afinidade.
Nesse sentido, para obter os locais de interação mais fortes, dividimos a molécula em
5 regiões e calculamos a energia de ligação da molécula molde com os monômeros
estudados (Figura 2-8).
2.3.1. Seleção Teórica do Monômero Funcional e do
Solvente
O primeiro passo na síntese de um MIP para AA envolve a formação de um
complexo na etapa de pré-polimerização entre o monômero e a molécula molde (AA).
O monômero que for capaz de interagir mais fortemente com a molécula molde irá
fornecer um complexo com a maior estabilidade. Na Figura 2-9, o cálculo teórico no
vácuo indica que o sítio de ligação mais favorável é a região 1 (Figura 2-8). Além disso,
dentre os monômeros estudados, apenas a 2-vinilpiridina não mostrou
espontaneidade na formação do complexo.
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 71
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Figura 2 - 9. Cálculo teórico no vácuo dos possíveis sítios de ligação da molécula de AA com diferentes monômeros.
As energias de interação (energia de Gibbs) obtidas de diferentes solventes
apresentam uma diminuição em relação à interação da fase gasosa (Figura 2-10).
Esta observação foi consistente porque a solvatação das diferentes espécies também
envolveu interações intermoleculares da mesma natureza que a molécula molde e o
monômero, portanto, o solvente atuou como concorrente na formação do complexo.
A interação entre monômero e AA é realizada através de ligações de hidrogênio,
assim, um solvente não polar com uma constante dielétrica baixa é o mais
recomendado. O MIP também pode ser fabricado utilizando um solvente com elevada
constante dielétrica, no entanto, o MIP obtido terá um menor desempenho analítico.
Para solventes próticos, tais como água e metanol, pode haver liberação de íons
hidrogênio, que competirão na formação de ligações de hidrogênio entre molécula
molde e monômero e, assim, comprometer a funcionalidade do polímero. O cálculo
envolvendo o efeito do solvente foi realizado igualmente ao feito no vácuo,
considerando apenas a constante dielétrica. Devido aos baixos valores energéticos, o
monômero utilizado para os cálculos foi o ácido metacrílico.
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 72
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Figura 2 - 10. Cálculo teórico para avaliação do efeito do solvente sobre a energia
envolvida na interação entre molécula molde e monômero.
A Figura 2-10 demonstra que o THF e DCIM seriam os melhores solventes para
o desenvolvimento desse MIP, e os demais solventes seriam equivalentes entre si.
Apesar do cálculo teórico indicar que o THF e DCIM seriam os melhores solventes
para síntese do MIP, as quantidades de AA utilizadas neste trabalho para desenvolver
o MIP, ultrapassam a solubilidade da molécula molde nesses solventes, ou seja, para
usar um desses solventes seria necessário usar proporções menores de AA. Por fim,
a escolha do metanol para a síntese é considerada adequada.
Ao considerar os monômeros como ligantes bidentados e avaliar as distâncias
entre oxigênio e hidrogênio nos monômeros, nota-se que a menor distância existente
é a do ácido metacrílico e, consequentemente, a menor energia. A região 1 da
molécula de ácido ascórbico, a qual mostrou ser o melhor sítio de ligação, tem a
distância entre hidrogênio e oxigênio de 2,32 Â, a qual sugere que o melhor encaixe
(interação) monômero-molécula molde ocorre usando-se ácido metacrílico. (Figura 2-
11). Diante disso, pode se afirmar que quanto maior for a diferença de tamanho nas
zonas de interação, menos favorável será a interação. Esses resultados ratificam os
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 73
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dados apresentados na Figura 2-9 e indicam que a substituição da acrilamida pelo
ácido metacrílico produziria um MIP para AA com desempenho analítico melhor.
Figura 2 - 11. Relação entre a distância do oxigênio e hidrogênio nos monômeros e a
espontaneidade das interações entre monômero e molécula molde.
Na tentativa de compreender o efeito real da carga presente nos sítios de
ligação, simulou-se uma interação entre a molécula molde com um monômero
modificado (ácido metacrílico) com um elemento altamente eletronegativo. A Figura
2-12 mostra o efeito da adição do flúor, o qual substituiu um hidrogênio ligado ao
carbono, sobre a energia de interação entre molécula molde e monômero. Observa-
se que a substituição do hidrogênio pelo flúor não favorece significativamente a
interação entre molécula molde e monômero. No entanto, a interação entre monômero
e molécula molde é desfavorecida com aumento da quantidade de flúor. Isso ocorre
devido ao efeito indutivo do flúor, que tende a deslocar a densidade eletrônica à
medida que a quantidade de flúor aumenta, aumentando a distância de ligação entre
monômero e molécula molde e, consequentemente, enfraquecendo a interação.
Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 74
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Figura 2 - 12. Estimativa energética sobre o efeito causado pela modificação do
monômero ácido metacrílico com espécies eletronegativas.
A literatura atualmente não apresenta um trabalho relacionado ao uso de cálculos
químicos para a predição ou confirmação das melhores condições de síntese para a
produção de um polímero impresso para AA. Observando outros trabalhos na mesma
temática, apenas com uma molécula molde distinta, nota-se que o estudo sobre o efeito
solvente e o tipo de monômero são majoritários (Regan et al., 2006). Esse trabalho trouxe
como ponto inovador o estudo de diversas regiões ao entorno da molécula molde,
identificando as regiões envolvidas na interação molécula molde monômero. Além disso,
a identificação de que a energia de interação está relacionada a uma distância
intermolecular permite explorar uma série de novas moléculas como monômero funcional.
Por fim, os resultados obtidos nesta seção indicam que alguns dos reagentes
utilizados para síntese do polímero impresso para extração seletiva de ácido ascórbico
podem ser substituídos a fim de otimizar o desempenho analítico.
CAPÍTULO 3
3. Impressão Molecular Superficial em
Microesferas de Sílica, Porosas e Não-
Porosas, para Extração Seletiva de
Vanilina
RESUMO GRÁFICO
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 76
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3.1. Introdução
A vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldeido) é um aldeído fenólico de massa molar
igual a 152,14 g mol-1, principal componente da baunilha natural. É amplamente
utilizada como agente aromatizante em alimentos, perfumes, bebidas e produtos
farmacêuticos e pode ser obtida a partir da vagem de uma orquídea tropical (Mohamad
Yusof, Tanioka e Kobayashi, 2014). A vanilina, que já era cultivada e extraída da
Vanilla planifolia pelos astecas em meados de 1520, foi introduzida junto com o cacau
e o corante cochonilha no mercado Europeu. Devido a questões climáticas, o cultivo
dessa orquídea não foi realizado com sucesso em clima europeu e, ainda hoje, são
consideradas plantas de cultivo difícil. Acredita-se que esse insucesso está associado,
principalmente, ao fato da polinização ser realizada por insetos que não existem na
Europa. Atualmente, os principais produtores de vanilina natural são a Malásia,
México, Madagascar, Taiti e a Indonésia, todos com características tropicais.
A vanilina, além de ter um aroma atraente, traz vários benefícios à saúde por
apresentar atividade antioxidante, potencial antimicrobiano e ser um conservante de
alimentos natural (Singh et al., 2015) Essas propriedades têm proporcionado um
aumento no uso da vanilina em diversos produtos comerciais, tais como sorvete, leite,
refrigerante e açúcar, todos de baunilha, além dos sucos de frutas em caixa, com
concentração variando de 0,20 a 2000 mg L-1 (Passos e Ribeiro, 2009). Devido ao alto
custo dos extratos de baunilha naturais, a vanilina sintética tem sido frequentemente
utilizada como agente flavonoide. Os aromas artificiais de baunilha geralmente contêm
a vanilina sintética e/ou etilvanilina dissolvida em álcool, propilenoglicol e glicerina,
solventes da síntese (Jager, de, Perfetti e Diachenko, 2007).
Dados referentes as vendas globais relevaram que após o ano de 2010 cerca 15
mil toneladas de vanilina são vendidas por ano, com menos de 1% sendo extraída da
planta. O isolamento da vanilina a partir das vagens da orquídea é um processo
laborioso e dispendioso. A produção de 1kg de vanilina requer aproximadamente 500
kg da vagem de baunilha, correspondendo a polinização de 40.000 orquídeas.
Embora o custo médio de mercado da vanilina natural seja imprevisível e dependente
das condições climáticas, recentemente tem atingido valores na faixa entre R$
1.200,00 e 4.000,00 reais, em contraste com o preço médio da vanilina sintética de
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 77
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R$ 15,00 por kg. Uma vez que o fornecimento das vagens de baunilha atingiu uma
espécie de platô em 2 milhões de kg, a demanda global por vanilina natural não
possibilita o uso da orquídea como única fonte (Gallage e Møller, 2015).
Os custos elevados e demanda por produtos naturais, somados aos pequenos
rendimentos da produção de vanilina natural, estimularam a pesquisa por rotas de
produção de vanilina sintética. A vanilina pode ser obtida através de vários métodos,
como a síntese química, a biotransformação, a degradação de licor residual de sulfito,
além da extração de vagens de baunilha naturais que contêm cerca de 2-3 % m/m de
vanilina. Além disso, a vanilina também foi relatada, em níveis de traços em muitas
plantas e produtos de frutas como laranja, toranja e tangerina (Goodner, Jella e
Rouseff, 2000).
O aumento na preferência dos consumidores por sabores naturais, os elevados
custos de produção da vanilina natural e a falsificação de extratos de baunilha,
demonstram a necessidade em desenvolver novos métodos para extração da vanilina
de fontes naturais. Recentemente, fabricantes de extratos de baunilha adulteraram
esses extratos com cumarina, intensificando o sabor da baunilha (Jager, de, Perfetti e
Diachenko, 2007). A cumarina, um fitoquímico encontrado em muitas espécies de
plantas, mostrou causar hepatotoxicidade em animais e foi banida para uso como
aditivo alimentar nos EUA desde 1956. Atualmente, a literatura descreve diversos
métodos para a extração de vanilina natural a partir de diferentes matrizes e em
diferentes níveis de concentração, tais como a extração assistida por ultrassom (UAE)
e a extração em fase sólida (SPE) (Płaszczyk e Kowalski, 2017). No entanto, esses
métodos são demorados, muitas vezes complicados, com alto consumo de solvente
orgânico e dispendiosos.
Os objetivos desta etapa do trabalho são desenvolver um novo método de
síntese do MIP com estrutura de caroço – casca, com base em microesferas de sílica
amino-funcionalizadas, porosas e não porosas, para a extração seletiva de vanilina;
identificar os parâmetros que influenciam a capacidade de adsorção (porosidade,
funcionalização, pH e tempo); avaliar o desempenho do MIP e NIP na extração de
vanilina de uma amostra comercial.
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 78
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3.2. Parte Experimental
3.2.1. Reagentes
Ácido acético, metanol, etanol, monooleato de sorbitano (Span 80),
tetraetilortosilano (TEOS) e vanilina foram adquiridos da Merck. 1-octanol,
hidroxipropilcelulose (HPC), poli(etilenoglicol)-bloco-poli(propileno glicol)-bloco-
poli(etilenoglicol) (P-123) e etilvanilina foram adquiridos da Sigma Aldrich. Hidróxido
de amônia (NH3, >25%) foi adquirida da VWR International. Tolueno e acetonitrila
foram adquiridos da Carlroth. (3-aminopropil)trimetoxisilano (APTMS) e (3-
aminopropil)trietoxisilano (APTES) foram adquiridos da Alfa Aesar. Todos os
reagentes foram utilizados sem purificação adicional. A água utilizada neste estudo foi
deionizada (≥ 18 MΩ cm-1) produzida utilizando um sistema de purificação Milli-Q.
3.2.2. Preparação do MIP para Extração de Vanilina
3.2.2.1. Síntese das MS
As MS porosas (MS1) utilizadas nesta seção foram desenvolvidas igualmente as
partículas porosas sintetizadas no item 2.2.2.1 deste manuscrito. No entanto, a
síntese das MS não porosas (SM2) utilizou quantidades de TEOS e APTES diferentes
das porosas. Para síntese das SM2 misturou-se 28,1 g de TEOS e 11,7 g APTMS, e
rapidamente adicionou-se à macroemulsão. As demais condições de síntese e
funcionalização foram mantidas igualmente aos itens 2.2.2.1 e 2.2.2.2,
respectivamente.
3.2.2.2. Fabricação do MIP
A Figura 3 - 1 ilustra o procedimento esquemático para a preparação do MIP
seletivo a vanilina baseando-se no método sol-gel a partir da otimização do
procedimento descrito por X.Ren e L.Chen (Ren e Chen, 2015). Inicialmente, 0,100 g
de vanilina foram dispersos em 100 mL de etanol. Em seguida, adicionou-se 5 mL de
APTES e agitou-se durante 30 minutos, seguido da adição de 10 mL de TEOS. Após
5 min, 0,190 g das MS (MS1, MS1F, MS2 e MS2F) e 5 mL de solução de amônia
concentrada foram adicionados à mistura, que foi deixada sob agitação durante 24 h
a 30 °C. Após a conclusão da síntese, os polímeros obtidos foram submetidos a três
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 79
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ciclos de centrifugação (1000 rpm durante 15 minutos cada), lavagem e ressuspensão
em etanol. Em seguida, a molécula molde foi removida da matriz polimérica utilizando
extração com solvente através de uma mistura de metanol:ácido acético (8:2, v/v) sob
agitação vigorosa durante 16 h. Finalmente, o produto foi lavado com metanol até
atingir pH neutro, centrifugado e seco a vácuo durante 24 h a 40 °C. Os MIPs híbridos
desenvolvidos usando as partículas MS1, MS1F, MS2 e MS2F foram denominados
como MS1@MIP, MS1F@MIP, MS2@MIP e MS2F@MIP, respectivamente. Os
polímeros não impressos (MS1@NIP, MS1F@NIP, MS2@NIP e MS2F@NIP) foram
fabricados igualmente ao MIP, mas sem a presença da molécula molde de vanilina.
Todas as partículas sintetizadas nesta seção foram caracterizadas igualmente ao
descrito no item 2.2.3.
Figura 3 - 1. Esquema representativo da preparação do MIP e do NIP.
3.2.3. Avaliação das Características e da Capacidade de
Adsorção
3.2.3.1. Estudo de Adsorção – Método da Incubação
Os ensaios de ligação da vanilina foram realizados em metanol à temperatura
ambiente. Para avaliar a cinética de adsorção do MIP, 10 mL de uma solução de
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 80
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vanilina 28 mg L-1 foram adicionados em vários tubos de centrífuga contendo 25 mg
de MIP ou NIP e deixados sob agitação durante um intervalo de tempo entre 30 e 300
minutos. Um procedimento semelhante foi realizado para avaliar a capacidade de
adsorção em função do pH. Para isso, 10 mL de uma solução de vanilina 28 mg L-1,
com pH variando de 1 a 11, foram adicionados em seis diferentes tubos de centrifuga
contendo 25 mg do polímero e deixados sob agitação durante 180 minutos. Para
avaliar a capacidade de adsorção, 25 mg do MS1@MIP, MS1F@MIP, MS2@MIP,
MS2F@MIP, MS1@NIP, MS1F@NIP, MS2@NIP e MS2F@NIPs foram adicionados
separadamente em tubos de centrífuga contendo 10 mL da solução de vanilina com
concentrações variando entre 5 – 28 mg L-1, e deixadas sob agitação durante 180
minutos. Em seguida, o MIP e o NIP foram separados por centrifugação (1300 rpm
por 10 minutos) e o sobrenadante foi analisado através da medição da absorbância
no UV em 278 nm. As quantidades de vanilina ligada ao MIP e ao NIP foram
calculadas a partir da Equação 13. Após a incubação, a vanilina foi eluída usando 10
mL da mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v) e a quantidade de vanilina eluída foi
determinada pela medição da absorbância no UV em 280 nm. Para este estudo,
também foram desenvolvidas curvas analíticas em metanol e metanol/ácido acético
(8:2, v/v).
3.2.3.2. Estudo de Adsorção – SPE
A preparação do sorvente para extração de vanilina foi feita igualmente a descrita
no item 2.2.4.2. Antes da extração, os cartuchos contendo os MIPs e os NIPs foram
tratados com 3 mL da mistura metanol/ácido acético (8:2, v/v) para assegurar a
ausência de qualquer analito restante e, na sequência, foram condicionados com 6
mL de metanol. Depois, para avaliar a capacidade de adsorção do MIP e do NIP, 10
mL de diferentes soluções de vanilina em metanol, com concentrações variando de 5
– 32 mg L-1, foram percoladas através dos cartuchos. Em seguida, os cartuchos foram
lavados com 3 mL de acetonitrila para a eliminação de interferentes. Por último, a
vanilina foi eluída com 10 mL da mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v). As
quantidades de vanilina extraída e eluída foram determinadas como descrito no item
3.2.3.1 deste manuscrito.
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 81
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3.2.3.3. Reconhecimento Específico
Para estudar a seletividade do MS1F@MIP e MS1F@NIP, 10 mg desses
materiais foram transferidos para diferentes tubos de centrífuga, seguidos de 10 mL
de uma solução de vanilina e etilvanilina em metanol, simultaneamente, com
concentrações de 28 mg L-1. Após 180 minutos, os polímeros foram separados por
centrifugação e as quantidades de vanilina e etilvanilina no sobrenadante foram
determinadas por espectroscopia UV/VIS. Assim como a vanilina, uma curva analítica,
utilizando a absorbância em 272 nm, foi desenvolvida para quantificar etilvanilina em
metanol. A seletividade foi avaliada a partir do fator de seletividade (FS), que é definido
como a razão entre o fator de impressão para a vanilina e etilvanilina (Equação 16).
3.2.3.4. Aplicação em Amostras Reais
Foram adquiridos 7 amostras do extrato de baunilha em lojas de varejo e pela
internet. A preparação das amostras consistiu em uma diluição de 1:100 do extrato
em metanol para atingir uma concentração em torno de 1 µg mL-1. A determinação foi
feita utilizando-se a cromatografia líquida de ultra eficiência com espectrômetro de
massa (UHPLC-MS/MS, do inglês, Ultra-high performance liquid chromatography
tandem mass spectrometry), o qual foi operado no modo SRM (do inglês, Monitoring
of Selected Reactions) e com fonte de ionização por eletrospray no modo positivo,
com fase móvel de ácido fórmico:metanol (35:65, v/v), voltagem do cone de 28 V e
temperatura de dessolvatação de 500 ºC. Uma vez estabelecidas as condições, foram
construídas curvas analíticas para vanilina e etilvanilina na faixa de concentração de
0,5 a 10 µg mL-1. As soluções padrões foram injetadas em triplicata e partir das
equações das retas foram determinadas as concentrações dos analitos nas amostras.
Todas as amostras foram medidas antes e após a passagem pelo MIP.
3.3. Resultados e Discussão
3.3.1. Síntese das Partículas de Sílica e do MIP com
Estrutura Caroço-Casca
Após a síntese das microesferas, o polímero impresso foi desenvolvido usando-
se APTES como o monômero funcional, TEOS como agente de reticulação e amônia
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como catalisador. O tempo de contato entre APTES e vanilina facilitou a formação das
interações não covalentes, que são essenciais na impressão molecular. O APTES
interage com a molécula modelo de modo que as ligações de hidrogênio no complexo
entre os grupos amino e a vanilina são formadas. Depois de interagir com a molécula
molde, os monômeros funcionais foram co-polimerizados na matriz por agente de
reticulação, estabelecendo-se assim uma camada polimérica na superfície das
microesferas. Finalmente, a molécula molde foi removida da matriz polimérica por
meio de extração usando solvente, deixando os locais de ligação com funcionalidade
complementares para religar especificamente a vanilina. Para fins de comparação,
polímeros não impressos também foram preparados utilizando um procedimento
idêntico, mas sem a adição da vanilina.
O uso de partículas porosas e não porosas, funcionalizadas ou não, para o
desenvolvimento dos MIPs, podem produzir materiais morfologicamente iguais, mas
estruturalmente diferentes. Por exemplo, o uso de partículas funcionalizadas permite
que o monômero funcional forme o complexo com a molécula molde e, por
condensação, adsorva-se quimicamente a superfície da partícula. Outro exemplo
consiste no uso de partículas não porosas, com área superficial menor, que teriam
uma menor quantidade de sítios de ligação, o que por outro lado poderiam ser sítios
mais específicos. O efeito de cada uma dessas variáveis será exposto e discutido na
sequência do texto.
3.3.2. Caracterização
As medidas de MIR-ATR foram usadas para estudar a estrutura química das
partículas de sílica, do MS1F@MIP (Figura 3 - 2 (c)) e do MS1F@NIP (Figura 3 - 2
(d)). No espectro das microesferas (Figura 3 - 2 (a) e (b)) foram observadas bandas
em 692, 790, 940 e 1010 cm-1 correspondentes às deformações Si-O-Si, vibrações de
O-Si-O, Si-OH, Si-O-Si, respectivamente. Exceto a banda em 940 cm-1, todas as
outras bandas também são observadas nos espectros do MS1F@MIP e do
MS1F@NIP. Além das bandas já mencionadas, o MS1F@MIP (c) e MS1F@NIP (d)
exibiram bandas em 1410, 1542 e 2952 cm-1 relativas a deformação angular de C –
H, ao estiramento e deformação do grupo OH da água (bandas de combinação) e ao
estiramento simétrico do grupo C – H, respectivamente. Os espectros semelhantes
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 83
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entre o MS1F@MIP e MS1F@NIP, além de demostrar que o processo de lavagem foi
feito com sucesso, demonstra que a composição da matriz polimérica é idêntica. Os
espectros dos demais polímeros mostraram resultados semelhantes aos da MS1,
MS1F, MS1F@MIP e MS1F@NIP, respectivamente, e por essa razão não são
mostrados na Figura 3 - 2.
Figura 3 - 2. Espectros de MIR-ATR das (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS1F@MIP e (d)
MS1F@NIP.
A Figura 3 - 3 mostra as micrografias dos materiais sintetizados pela
macroemulsão e pelo método sol-gel. A partir das micrografias foi possível observar a
morfologia, o tamanho e a porosidade das partículas, evidenciando que as partículas
são esféricas, polidispersas e com diferentes graus de porosidade. Na Figura 3 - 3 (a),
(b), (c) e (d) observar-se que as MS1, MS1F, MS2 e MS2F, respectivamente,
apresentaram porosidades diferentes, provando que o método proposto é eficaz para
a síntese de microesferas de sílica com porosidades diferentes. Além disso, observou-
se que a relação entre TEOS e APTES é um dos parâmetros relevantes para
determinar a porosidade e o tamanho final da partícula.
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 84
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Figura 3 - 3. Micrografias de (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS2, (d) MS2F, (e) MS1@MIP,
(f) MS1F@MIP, (g) MS2@MIP, (h) MS2F@MIP, (i) MS1@NIP, (j) MS1F@NIP, (l)
MS2@NIP e (k) MS2F@NIP.
A Figura 3 - 3 (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), e (l), correspondentes ao MS1@MIP,
MS1F@MIP, MS2@MIP, MS2F@MIP, MS1@NIP, MS1F@NIP, MS2@NIP e
MS2F@NIP, respectivamente, mostram a formação de uma camada polimérica na
superfície das MSP com espessura de aproximadamente de 200 nm. Ainda através
da análise morfológica, observou-se que os MIPs desenvolvidos usando-se partículas
porosas apresentaram uma camada polimérica menos áspera e homogênea com
relação ao MIP sintetizado usando partículas não porosas. Além disso, os MIPs
fabricados a partir de partículas funcionalizadas também apresentaram superfície
irregulares em relação ao uso de partículas não funcionalizadas.
As micrografias obtidas utilizando MEV evidenciaram as mudanças morfológicas
antes e após a polimerização, o que já seria suficiente para comprovar a formação do
polímero e da estrutura caroço-casca. No entanto, a partículas colapsadas do
MS1@MIP (Figura 3 - 4 (a)), resultantes da baixa estabilidade física das partículas e
da elevada agitação durante a síntese, permitiram confirmar visualmente a produção
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 85
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do MIP com estrutura de caroço-casca. Na Figura 3 - 4(b), observou-se que além do
MIP com estrutura caroço-casca também são produzidos MIPs tradicionais sem
morfologia definida. No entanto, o processo de peneiramento realizado após a síntese
permitiu separar as partículas inferiores a 10 μm, garantindo que só o MIP com
estrutura caroço-casca tenha sido utilizado para a extração seletiva de vanilina.
Figura 3 - 4. Micrografias de (a) MS1@MIP colapsada e (b) MIPs tradicionais sem
morfologia definida.
Os resultados das isotermas de adsorção-dessorção de nitrogênio das amostras
são apresentados na Tabela 3 - 1. Através da avaliação das isotermas também foi
possível comprovar que a RAT é um fator determinante na porosidade e na área
superficial das microesferas de sílica. As MS1 e MS2 foram produzidas quando se
utilizou uma RAT de 0,10 e 0,50, respectivamente, e apresentaram área superficial de
80,50 e 0,63 m2/g, respectivamente.
O MS1@MIP produzido usando-se partículas porosas apresentou uma área
superficial menor que as MS1 usadas como o núcleo, o que indica que a camada
polimérica foi produzida no interior dos poros, diminuindo a área superficial de 80,58
para 5,56 m2/g. O MS1F@MIP, produzido a partir das MS1F apresentou elevada área
superficial de 64,55 m2/g, diferentemente do MSF@MIP, indicando que a
funcionalização impede a formação do polímero dentro dos poros.
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 86
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Tabela 3 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial e de tamanho de
partícula. Na determinação da área superficial o método BET foi utilizado.
Partículas Área superficial (m2/g) Tamanho de partícula (µm)
MS1 80,58
> 4
MS1F 84,07
MS2 0,63
> 1
MS2F 1,83
MS1@MIP 5,56
> 10
MS1F@MIP 64,55
MS1@NIP 45,82
MS1F@NIP 29,65
MS2@MIP 9,84
> 4
MS2F@MIP 32,48
MS2@NIP 40,51
MS2F@NIP 37,96
No caso do MS2@MIP, a camada polimérica foi produzida na superfície da MS2,
porém, a ausência de porosidade das MSNP levou ao aparecimento de um espaço
entre a superfície das MS2 e a camada polimérica, o que provocou, provavelmente, o
aumento da área superficial de 0,63 m2/g a 9,84 m2/g. Além disso, observa-se que,
exceto nos NIPs, a funcionalização não promove um aumento na área superficial.
Finalmente, observar-se que embora haja uma variação área superficial dos NIPs, os
resultados indicam que a camada polimérica dos NIPs apresentaram elevada
rugosidade e porosidade. Todos os resultados obtidos pela isoterma de adsorção-
dessorção de nitrogênio são concordantes com os resultados observados nas
micrografias.
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 87
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3.3.3. Estudo de Adsorção
Durante os estudos de adsorção (religamento), a cinética de adsorção, os efeitos
do pH e o método de extração foram avaliados para otimizar a capacidade de
adsorção de vanilina pelos polímeros. A capacidade de adsorção, expressa em
miligrama de vanilina por grama de polímero, demonstra numericamente quanto de
analito o polímero impresso consegue extrair da mistura ou solução. A capacidade de
adsorção e o fator de impressão são os principais fatores para se avaliar o
desempenho analítico do MIP. Quanto maior o fator de impressão e a capacidade de
adsorção mais eficiente é o MIP. Na Figura 3 - 5 (a) observa-se que a capacidade de
ligação aumentou lentamente e atingiu seu máximo após 180 minutos (10 mL de uma
solução com 28 mg L-1 de vanilina e 25 mg do MIP). Devido aos sítios de ligação
estarem localizados na superfície da partícula com estrutura caroço-casca, o tempo
de equilíbrio observado neste estudo é significativamente mais curto em comparação
com os materiais impressos convencionais para a vanilina. Além disso, deve-se notar
que após 180 minutos a capacidade de ligação não se alterou, o que indica que todos
os sítios para reconhecimento específico estão saturados com vanilina. A cinética de
ligação dos MIPs sintetizados no presente estudo seguiu um mecanismo de pseudo-
primeira ordem, apresentando uma taxa constante de 0,00827 min-1, o que indica que
a interação vanilina e matriz polimérica não é um processo tão rápido, e uma
capacidade de adsorção no equilíbrio de 5,62 mg g-1 (capacidade de adsorção
calculada).
Os estudos de adsorção em função do pH para o MS1@MIP foram realizados
no intervalo de pH entre 1 a 11. A Figura 3 - 5 (b) mostra que a quantidade máxima
de vanilina ligada ao polímero foi obtida em pH 5. Para compreender as razões que
provocaram o melhor desempenho do polímero em pH 5 é necessário considerar a
estrutura do polímero e da vanilina em função do pH. A baixa capacidade de adsorção
em valores de pH maiores que 7 pode ser explicada pela desprotonação da vanilina,
enfraquecendo a ligação de hidrogênio entre a vanilina e o polímero. Em valores de
pH entre 1 e 3, o grupo amino na superfície das MS estão completamente protonados,
também enfraquecendo as ligações de hidrogênio. Entre pH 5 e 6, tanto a vanilina
quanto o MS1@MIP existem, principalmente, na forma neutra o que possibilita uma
maior formação de ligações de hidrogênio.
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 88
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Figura 3 - 5. Capacidade de adsorção do MS1@MIP em (a) função do tempo e (b) do
pH.
Após otimizar as condições de extração, as capacidades de adsorção da vanilina
investigando SM1@MIP e SM1@NIP foram avaliadas utilizando cartuchos SPE e
método de incubação, como mostrado na Figura 3 - 6 (a) e (b), respectivamente.
Figura 3 - 6. Capacidade de adsorção do MS1@MIP e MS1@NIP em função da
concentração de vanilina usando o (a) método SPE e o (b) método da incubação.
Os resultados demonstraram que a capacidade de adsorção do polímero,
usando ambos os métodos, aumenta com o aumento da concentração de vanilina, até
atingir a capacidade máxima de adsorção em uma concentração entre 28 – 32 mg L-
1. As quantidades máximas de vanilina adsorvidas pelo MS1@MIP usando o método
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 89
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de incubação e de SPE foram de 5,65 e 2,59 mg g-1, respectivamente. Essas
diferenças podem resultar do fato de que o tempo de contato entre a vanilina e a
SM1@MIP são determinadas pelo tempo de percolação através do cartucho (~ 30
min), enquanto a incubação foi realizada durante 180 minutos sob agitação, o que
favorece a quantidade adsorvida. Além disso, foi mostrado durante o estudo de
seletividade, usando SM1@ MIP em comparação com SM1@NIP, que em
concentrações de vanilina superiores a 15 mg L-1 fatores de impressão de FI = 2,26 e
FI = 1,35 foram alcançados para os métodos de SPE e incubação, respectivamente.
Os experimentos usando MS2@MIP e MS2@MIP revelaram uma maior
seletividade e capacidade de adsorção, em concentrações equivalentes de vanilina,
durante estudos de incubação Figura 3 - 7. A capacidade de adsorção do MS2@MIP
foi significativamente maior que o de MS2@NIP, apresentando um fator de impressão
de 2,37. A diferença estrutural entre MS1@MIP e MS2@MIP é a porosidade do
caroço, que aparentemente afeta as propriedades da casca polimérica produzida na
superfície das MS. Como anteriormente descrito, a camada polimérica do SM1@MIP
é formada dentro os poros das MS1, o que potencialmente limita a transferência da
massa em comparação com MS2@MIP. Além disso, o SM2@MIP tem uma área de
superfície maior em comparação com o SM1@MIP, favorecendo assim a interação
com a molécula alvo.
Figura 3 - 7. Capacidade de adsorção do MS2@MIP e MS2@NIP em função da
concentração de vanilina empregando-se o método da incubação.
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 90
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Os resultados da avaliação da funcionalização das partículas usadas como
casca no desenvolvimento dos polímeros podem ser observados na Figura 3 - 8. A
funcionalização das MS1 não alterou significativamente a seletividade do
SM1F@MIP, mas a funcionalização da MS produziu um polímero menos seletivo nas
mesmas condições (SM2F@MIP). Embora não tenha alterado a seletividade do
SM1F@MIP, o ganho na capacidade de adsorção foi significativo, isso porque a
quantidade adsorvida aproximadamente dobrou, ou seja, nas mesmas condições, a
funcionalização da partícula aumenta a capacidade de adsorção. Tal efeito pode estar
associado a heterogeneidade da superfície, como mostrado nas micrografias,
aumentando o número de sítios de ligação.
Na tentativa de descrever o comportamento dos dados de adsorção foram
desenvolvidos modelos matemáticos, com base nos valores de R2 e EMQ, para
identificar a isoterma com o melhor ajuste aos dados experimentais. Na Figura 3 - 8
observar-se que os polímeros com partículas não funcionalizadas se ajustaram ao
modelo de Langmuir. Como já mencionado, o modelo de Langmuir descreve uma
adsorção em monocamadas, possuindo sítios de ligação homogêneos.
Figura 3 - 8. Capacidade de adsorção do (a) MS1F@MIP, MS1F@NIP, (b)
MS2F@MIP e MS2F@NIP em função da concentração de vanilina usando o método
da incubação.
Também na Figura 3 - 8 (a) e (b) é possível observar que os polímeros fabricados
a partir de partículas funcionalizadas se ajustaram ao modelo de Sips, um modelo
Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 91
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intermediário entre Langmuir e Freundlich, capaz descrever superfícies parcialmente
heterogêneas e homogêneas. Correlacionando o ajuste de cada modelo com as
micrografias, é possível concluir que, assim como na morfologia, foi produzida uma
superfície heterogênea, com sítios de ligação heterogêneos.
As isotermas fornecem uma série de informações sobre os parâmetros de cada
modelo. A Tabela 3 - 2 apresenta de forma resumida todos parâmetros obtidos a partir
das isotermas de Sips e Langmuir. As capacidades de máxima adsorção foram mais
elevadas para o MS2@MIP e MS2@NIP, respectivamente. Além disso, no modelo de
Langmuir todos os polímeros apresentaram RL>1, indicando que o processo de
adsorção é favorável e próximo do linear, ou seja, a quantidade de vanilina adsorvida
pode ser otimizada. Através da equação de Scatchard conclui-se que a vanilina está
ligada ao polímero por dois sítios de ligação: um sítio de alta afinidade de ligação, com
alta energia de ligação, e outro de baixa afinidade, com baixa energia de ligação.
Tabela 3 - 2. Parâmetros das isotermas para ajuste dos dados.
Polímeros
Parâmetros – Isotermas
Langmuir
Qm RL KL EMQ R2
MS1@MIP 11,472 0,929 0,0327 4,929 0,918
MS1@NIP 10,235 0,910 0,0261 3,225 0,965
MS2@MIP 16,868 0,928 0,0154 3,191 0,974
MS2@NIP 4,775 0,954 0,0360 8,927 0,791
Sips
Qm n KS EMQ R2
MS1F@MIP 9,949 0,517 0,1140 4,128 0,915
MS1F@NIP 7,852 0,809 0,0981 2,200 0,968
MS2F@MIP 6,794 0,503 0,0732 4,209 0,951
MS2F@NIP 6,518 0,4418 0,0611 4,060 0,971
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3.3.3.1. Estudo de Recuperação
A eluição da vanilina extraída com os SM1@MIP e SM2@MIP nos cartuchos
SPE correspondentes foi realizada através de uma mistura de metanol:ácido acético
(8/2, v/v), apresentando uma taxa de recuperação entre 93 e 98%. Este resultado
indica que os polímeros desenvolvidos podem ser adequados para estudos
quantitativos de vanilina extraídos de diversas matrizes. Além disso, foi mostrado que
esses cartuchos podem ser regenerados e reutilizados por pelo menos 20 vezes para
procedimentos de extração, sem prejudicar seu desempenho. Avaliando-se as taxas
de recuperação, a seletividade, o número de reutilizações e a capacidade de
adsorção, prevê-se que a extração de vanilina de diferentes matrizes seja efetiva. Por
exemplo, a extração de vanilina de vagens de orquídeas usando MIPs pode ser
realizada dentro de algumas horas.
3.3.3.2. Estudo de Seletividade e Aplicação em Amostra Real
A seletividade do MS2@MIP para vanilina foi avaliada em um teste com
etilvanilina, usando uma solução contendo ambos os compostos na mesma
concentração. A Figura 3 - 9 indica que os fatores de impressão do MS2@MIP para
vanilina e etilvanilina são 1,22 e 0,94, respectivamente, obtendo-se um fator de
seletividade de 1,29. Estes resultados indicam que o MS2@MIP exibe alta capacidade
de reconhecimento específico para vanilina, o que pode ser explicado com base nas
diferenças estruturais entre moléculas, que causaram uma incompatibilidade na forma
e sítios de ligação. Embora exista uma seletividade cruzada entre vanilina e
etilvanilina, esses resultados são satisfatórios e indicam a eficiência de impressão do
MS2@MIP, e que o método de síntese do polímero, bem como o processo de
extração, foi executado com sucesso.
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Figura 3 - 9. Estudo da seletividade do MS2@MIP e do MS2@NIP para extração de
vanilina e etilvanilina.
A análise de várias amostras por espectrometria de massas permitiu identificar
que alguns extratos de baunilha, além de possuir vanilina, também continha
etilvanilina. As amostras A e B foram as únicas que apresentaram etilvanilina e vanilina
no mesmo extrato. A quantificação da amostra A revelou que a concentração de
etilvanilina e vanilina são equivalentes antes do processo de extração, e na amostra
B a concentração de etilvanilina é 9 vezes maior do que a concentração de vanilina.
Nas demais amostras (amostras C, D, E, F e G) apenas a vanilina foi encontrada e
quantificada, apresentando antes do processo de extração, uma faixa de
concentração variando de 3,26 (amostra G) até 7,34 µg mL-1 (amostra D). A
concentração de etilvanilina antes do processo de extração foi de 6,57 e 45,80 µg mL-
1 nas amostras A e B, respectivamente.
Após a quantificação das amostras usando o espectrômetro de massas, todas
soluções foram percoladas pelos cartuchos contendo o MS2@MIP, utilizando as
mesmas proporções volumétricas do item 2.2.4.2, e na sequência, a alíquota
resultante foi medidas novamente no espectrômetro de massas. A Figura 3 -10 mostra
todos os resultados obtidos em função da massa retida, ou seja, quanto de vanilina e
etilvanilina foram extraídas pelo MIP
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Figura 3 - 10. Estudo da seletividade do MS1F@MIP e do MS1F@NIP para extração
de vanilina e etilvanilina de amostras reais.
. Nas amostras contendo apenas vanilina (C a G), a massa retida foi diretamente
proporcional a concentração de vanilina na amostra. Nas amostras A e B, embora o
polímero desenvolvido continue apresentando uma seletividade cruzada, o polímero
mostrou-se eficiente para extração de vanilina. Os resultados de seletividade
demonstraram que o desempenho analítico do MIP foi satisfatório, uma vez que, o
polímero conseguiu extrair seletivamente a vanilina na presença de etilvanilina e
demais moléculas. Além disso, quando comparado com a literatura, o MIP
desenvolvido neste trabalho apresentou melhores índices de recuperação,
capacidade de adsorção e fator de impressão. Por exemplo, no trabalho Ning e
colaboradores (Ning et al., 2014), a recuperação e a capacidade de adsorção foram
83% e 4,56 mg g-1, respectivamente, e no trabalho de Su e colaboradores (Su et al.,
2014) o fator de impressão foi de 2,56, ambos os resultados obtidos a partir de um
MIP para extração de vanilina. Como conclusão pode-se afirmar que a metodologia
de síntese e aplicação promoveram um avanço nos polímeros impressos com
estrutura caroço-casca para vanilina.
CAPÍTULO 4
4. Síntese do MIP na Superfície de
Nanopartículas de Sílica Para Extração
Seletiva de Cafeína
RESUMO GRÁFICO
4.1. Introdução
A cafeína (1,3,7-trimetil-1H-purina-2,6(3H,7H)-diona) é um alcaloide pertencente
à classe das metilxantinas capaz de estimular o sistema nervoso, e que pode ser
encontrada naturalmente em alimentos como café, chá, chocolate e bebidas derivadas
da cola (Brenelli, 2003). Além de ser consumida através de alimentos, diversos
medicamentos analgésicos, principalmente para cefaleia, contêm cafeína associada
ao paracetamol ou aos anti-inflamatórios não hormonais (Tavares e Sakata, 2012).
Estima-se que 70 % da cafeína é proveniente do café, na qual apresenta um teor
médio de 100 mg de cafeína por xícara de 240 mL. Após ser consumida, a cafeína é
rapidamente absorvida e metabolizada, atingindo um máximo na corrente sanguínea
no intervalo de 1 a 2 horas (Lieberman et al., 2016). A sua liberação ocorre em até 48
horas, principalmente pela urina, sendo que até 5% da cafeína não é metabolizada,
fazendo com que concentrações significativas da cafeína apareçam no esgoto
sanitário bruto (290 μg L-1), contribuindo diretamente para quantidade final de cafeína
em mananciais de superfícies .
O resíduo de cafeína em mananciais de superfícies geralmente encontra-se na
faixa de concentração de ng L-1 para μg L-1, de modo que a pré-concentração é uma
etapa necessária para aumentar o limite de detecção da cafeína (Al-Quaim et al.,
2017). A SPE tem sido usada para isolar e/ou pré-concentrar diferentes analitos em
amostras complexas. Embora esta técnica seja relativamente rápida e simples, são
baseadas em extrações não específicas, que muitas vezes sofre algumas
deficiências, como baixa especificidade e seletividade (Baggiani et al., 2011). Nos
últimos anos, a SPE envolvendo polímeros impressos recebeu uma série de
aplicações bem sucedidas devido à sua alta seletividade, facilidade de síntese, baixo
custo para a preparação e aplicabilidade em diferentes condições, especialmente na
presença de solventes orgânicos (Al-Quaim et al., 2017).
O uso dos MIPs combinados com SPE tem-se mostrado vantajoso,
principalmente, quando o objetivo é realizar uma extração seletiva. Além disso, o MIP
combinado com SPE permite não só a pré-concentração do analito, mas também a
remoção de outros compostos presentes na matriz de amostra (Caro et al., 2002).
Além dos MIPs tradicionais, a literatura apresenta alguns trabalhos com MIPs de
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 97
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estrutura caroço-casca para mesma finalidade, utilizando partículas em microescala
(Row e Jin, 2006). Esses polímeros para cafeína têm sido usados para pré-concentrar
(Tian et al., 2015), extrair (Theodoridis e Manesiotis, 2002) e quantificar (Alizadeh et.
al., 2010). No entanto, o uso dos MIPs com estrutura caroço-casca para extração de
cafeína usando nanopartículas ainda é uma incógnita, sendo mais utilizado como uma
espécie de sensor. Além disso, os resultados apresentados anteriormente revelam
que devido ao tempo de contato, o método de incubação produz um melhor
desempenho do MIP, em relação a SPE. Diante disso, o objetivo deste capítulo foi
desenvolver um MIP com estrutura caroço-casca para extração seletiva de cafeína
com base em sílica de Stöber, em nanoescala, adotando as mesmas metodologias de
síntese e aplicações descritas nos capítulos anteriores.
4.2. Parte Experimental
4.2.1. Reagentes
Ácido acético, clorofórmio, hidróxido de amônia (NH3, >25%) foram adquiridos
da Synth. Acetonitrila, ácido metacrílico (MAA), cafeína, persulfato de amônio (PSA),
tetraetilortosilano (TEOS) e (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) foram adquiridos da
Sigma Aldrich. Metanol, etanol e tolueno anidro foram adquiridos da JTBaker, Merck
e TEDIA, respectivamente. Todos os reagentes foram utilizados sem purificação
adicional e a água utilizada neste estudo foi deionizada (≥ 18 MΩ cm-1) produzida
utilizando um sistema de purificação Milli-Q.
4.2.2. Síntese de Nanopartículas de Sílica Amino-
Funcionalizadas (NPSA)
A síntese das nanopartículas de sílica (NPS) foi baseada no método de Stöber
com modificações (Stöber, Fink e Bohn, 1968). Para a síntese das partículas foram
preparadas duas soluções. A solução I foi preparada adicionando-se 230 mL de etanol
e 22 mL de amônia em um balão volumétrico. A solução II foi preparada dissolvendo
5 mL de TEOS em 20 mL de etanol. Ambas soluções foram agitadas separadamente
durante 15 minutos. Na sequência, a solução II foi adicionada a solução I e deixada
sob agitação durante 4 horas a temperatura ambiente. Após a reação, as partículas
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 98
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
foram submetidas a ciclos de centrifugação (3000 rpm (907 G) por 15 minutos),
lavagem e redispersão em etanol. Por fim, as partículas foram coletadas e secas em
estufa durante 12 h a 50 ºC. Na sequência, as partículas foram amino-funcionalizadas
igualmente ao descrito no item 2.2.2.2 desse manuscrito.
4.2.3. Síntese do MIP de Superfície em Nanopartículas de
Sílica Amino-Funcionalizadas (NPSA)
A preparação do MIP na superfície das NPSA para extração seletiva de cafeína
foi baseada na otimização do procedimento descrito por M. Fayazi e colaboradores.
(Fayazi et al., 2015). Inicialmente, 389 mg de cafeína foram dissolvidos em 20 mL de
clorofórmio. Na sequência, 1 mL de MAA e 300 mg de NPSA foram adicionados e
deixados sob agitação durante 5 minutos. Após esse período, foram adicionados 4 mL
de EGDMA e 100 mg de PSA. A mistura foi desgaseificada em um banho ultrassônico
durante 10 minutos e na sequência agitada sob atmosfera inerte durante 16 h a 40 ºC.
Após a síntese, o NPSA@MIP foi coletado e lavado diversas vezes com etanol para
eliminar o excesso de reagentes. Na sequência, a mistura de ácido acético/metanol
(8:2, %v/v) foi adicionada ao polímero e deixada sob agitação vigorosa durante 4 horas
para remoção da molécula molde. Finalmente, o produto foi lavado com água e seco
durante 16 horas a 50 ºC. O polímero não-impresso (NPSA@NIP) foi fabricado de
forma idêntica, mas sem a adição da molécula de cafeína.
4.2.4. Caracterização
A morfologia e o tamanho das partículas foram observados por microscopia
eletrônica de varredura usando um microscópio JEOL JSM - 360 - LV, operando a 10
kV no modo de imagem de elétrons secundários. As amostras foram analisadas sobre
um suporte de Cu/Zn, revestida com uma camada de ouro de 10 nm. O tamanho das
partículas foi determinado pelo espalhamento dinâmico de luz (DLS), utilizando um
Nanosizer da Malvern. Inicialmente, as partículas foram dispersas em água (0,05 mg
mL-1), utilizando-se ultrassom por 2 minutos. Após a sonicação, 2 mL da suspensão
foram transferidos para uma cubeta de quartzo (1 cm de caminho óptico) e a medida
foi feita com detector em um ângulo fixo de 157º e temperatura de 25 ºC. Os espectros
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 99
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de absorção no infravermelho das partículas foram coletados utilizando-se um
espectrômetro da marca MB100 Bomem com resolução de 4 cm-1, na faixa de 4000 a
400 cm-1 e acumulação de 20 varreduras. Foram feitas pastilhas com KBr com
concentração de 2 % (m/m) para realização das medidas.
4.2.5. Estudo de Adsorção
Neste estudo, as capacidades de adsorção do NPA@MIP e do NPA@NIP foram
avaliadas utilizando-se apenas o método da incubação. Para avaliar a capacidade de
adsorção em função do solvente utilizado, a água, a acetonitrila e diversas proporções
dos dois solventes foram testadas. Para avaliar a cinética de ligação do NPA@MIP, 2
mL de uma solução de cafeína 40 mg L-1 foi adicionada em vários eppendorf contendo
10 mg do NPA@MIP e deixados sob agitação durante um intervalo de tempo entre
0.5 – 24 h. Para avaliar a capacidade de adsorção em função da concentração de
cafeína, 10 mg do NPA@MIP e do NPA@NIP foram adicionados separadamente em
tubos eppendorf contendo 2 mL de uma solução de cafeína com concentrações
variando de 5 – 45 mg L-1 e deixados sob agitação durante 6 horas. Em seguida,
NPSA@MIP e NPSA@NIP foram separados por centrifugação e o sobrenadante foi
analisado por medidas de absorbância no UV a 267 nm, quantificando a cafeína
adsorvida ao polímero a partir da Equação 13.
4.3. Resultado e Discussão
4.3.1. Síntese das NPSA e do NPSA@MIP
As NPS foram sintetizadas através das reações de hidrólise e condensação do
TEOS em meio alcalino baseando-se no método de Stöber. No decorrer das reações
de hidrólise e condensação, a concentração do intermediário (Si(OC2H5)4-X(OH)X)
atinge a concentração de supersaturação, dando início a etapa de nucleação. A
nucleação reduz a concentração do intermediário a um nível abaixo de saturação,
interrompendo a nucleação e iniciando o crescimento das partículas. As condições de
síntese utilizadas neste trabalho foram otimizadas para que a etapa de nucleação
fosse menor que a etapa de crescimento, permitindo a produção de partículas maiores
que 100 nm. Além disso, a pré-diluição do TEOS mostrou-se fundamental para
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 100
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produção partículas monodispersas e não aglomeradas, isso porque as cinéticas de
hidrólise e de condensação são mais lentas em concentrações baixas de TEOS, o que
evita o início da etapa crescimento de partícula durante a etapa de nucleação.
Após a síntese e funcionalização das NPS, o polímero impresso foi desenvolvido
usando-se clorofórmio como solvente porogênico, PSA como iniciador, ácido
metacrílico como monômero funcional e cafeína como molécula molde.
Semelhantemente ao MIP para ácido ascórbico, o grupo amina se liga ao monômero
funcional, que, consequentemente, se liga a molécula molde (Yan et al., 2014). Após
a ligação do monômero funcional com a cafeína, iniciou-se a reação de polimerização
a partir do radical formado pelo PSA. Após a polimerização, a molécula molde foi
removida da camada polimérica, deixando sítios de reconhecimento específicos para
a cafeína. Diferentemente do NPSA@MIP, o NPSA@NIP, por não possuir cafeína
durante a síntese, deve apresentar a camada polimérica com uma estrutura aleatória.
4.3.2. Caracterização
Na Figura 4 -1 observa-se o espectro de absorção na região do infravermelho
médio das partículas sintetizadas e modificadas. As bandas em 795 e 1033 cm-1, 493
e 949 cm-1 são correspondentes as vibrações Si–O–Si, O–Si–O e Si–OH,
respectivamente. Essas três bandas são observadas em todos os espectros e estão
associadas as NPS. Além disso, todos os espectros apresentam bandas em 1646 cm-
1, o qual pode ser atribuído a vibração de flexão das moléculas de H2O. O NPSA@MIP,
o NPSA@NIP e as NPSA apresentaram uma banda em 1403 cm-1, relacionada às
vibrações de deformação do grupo – C–H. Essa banda pode ser atribuída ao grupo C
– H do APTES usado na funcionalização ou ao grupo C – H do monômero usado para
fabricação da camada polimérica. Observa-se que embora o infravermelho indique
sucesso no desenvolvimento dos materiais, outras análises complementares são
necessárias para reforçar as afirmações feitas nesta seção.
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 101
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
Figura 4 - 1. Espectro no infravermelho médio das NPSA, NPS, NPSA@MIP e
NPSA@NIP.
Através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi possível observar o
tamanho, a morfologia e a uniformidade das NPS e dos polímeros. As micrografias
(Figura 4 -2) demonstram que as condições utilizadas para a síntese da NPS ((Figura
4 -2 (a)) e para a funcionalização das NPSA ((Figura 4 -2 (a)) permitiram obter
partículas esféricas não-porosas, monodispersas e com uma leve diferença de
tamanho entre elas. Além disso, nota-se que o sistema não produziu partículas
aglomeradas, demonstrando que a pré-diluição do TEOS em etanol desempenha um
papel importante nas características finais das nanopartículas. Na (Figura 4 -2 (c) e
(d) é possível observar que o NPSA@MIP e NPSA@NIP, respectivamente,
apresentam as mesmas características morfológicas das NPSA. No entanto, através
dessas micrografias não é possível afirmar com precisão a presença de uma camada
polimérica sobre as NPSA, sendo necessárias medidas complementares para verificar
a existência ou não dessa camada (EDX e TEM).
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 102
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Figura 4 - 2. Micrografias das NPS (a), NPSA (b), NPSA@MIP (c) e NPSA@NIP (d).
As medidas em suspensão por DLS permitiram avaliar o tamanho médio e a
distribuição de tamanho das partículas. Os resultados demonstraram que o tamanho
médio e a polidispersão aumentaram de 397 nm para 464 nm e de 0,061 para 0,201,
respectivamente, após a funcionalização da superfície das NPS. Acredita-se que esse
aumento no tamanho médio ocorre devido ao aumento do tamanho hidrodinâmico das
nanopartículas em água. Após a polimerização, a partícula resultante apresentou um
tamanho médio de 674 nm e polidispersão de 0,318, sendo um indicativo de que esse
aumento é resultante da formação da camada polimérica sobre as NPSA
(NPSA@MIP). O aumento da polidispersão também pode ser um indicativo da
formação de camadas poliméricas de diferentes espessuras, bem como a não
formação do NPSA@MIP em algumas partículas. Por fim, as NPSA@NIP
apresentaram tamanho médio e polidispersão menores que o NPSA@MIP e maiores
que as NPSA, o que pode comprovar a diferença de estrutural entre o MIP e NIP.
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 103
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Figura 4 - 3. Medidas de tamanho de partícula e potencial zeta das NPS, NPSA,
NPSA@MIP e NPSA@NIP em suspensão obtidas por DLS.
4.3.3. Estudo da Capacidade de Adsorção
A primeira etapa do estudo de adsorção do NPSA@MIP foi avaliar qual o melhor
solvente para extrair seletivamente a cafeína de amostras ambientais. Inicialmente,
tentou-se aplicar o NPSA@MIP em meio aquoso através do método de incubação, no
entanto, a capacidade de adsorção foi muito baixa (0,18 mg g-1) quando comparado
com a literatura (Ting Tian et al., 2017). Na sequência, a extração foi realizada em
acetonitrila e a capacidade de adsorção foi consideravelmente melhor (0,59 mg g-1).
No entanto, um material que só extrai a cafeína presente em solventes orgânicos não
é analiticamente viável, uma vez que as maiores fontes de cafeína são soluções
aquosas. No intuito de otimizar a extração na presença de água, testou-se diversas
proporções volumétricas de H2O/ACN e o resultado está expresso na Figura 4 - 4.
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 104
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
Figura 4 - 4. Avaliação do solvente na capacidade de ligação. (A) 25/75 % v/v
H2O/ACN, (B) 50/50 % v/v H2O/ACN, (C) 75/25 % v/v H2O/ACN, (D) 85/15% v/v
H2O/ACN, (E) 90/10 % v/v H2O/ACN, (F), 5/95 % v/v H2O/ACN.
Nota-se que o aumento da razão H2O/ACN aumenta a capacidade de adsorção,
alcançando um máximo na proporção 75/25 % v/v H2O/ACN. Esse resultado pode
estar associado ao fato de que essa proporção de acetonitrila é suficiente para
condicionar o polímero (hidrofóbico) e permite a aproximação da molécula de cafeína.
Após identificar o solvente que otimiza a capacidade de adsorção do polímero,
realizou-se ensaios da cinética de adsorção do NPSA@MIP para investigar o
mecanismo envolvido entre polímero e a molécula molde. Como mostrado na Figura
4 – 5, a capacidade de adsorção aumentou lentamente, dando um salto entre 4 e 6
horas até atingir o equilíbrio após aproximadamente 8 horas, tornando-se
praticamente constante mesmo após 24 horas. Um dos motivos para um tempo de
ligação relativamente longo, porém menor que o descrito na literatura (Luo et al.,
2013), pode estar associado à ocupação das cavidades com locais de reconhecimento
na superfície do NPSA@MIP que foram rapidamente ocupadas pela molécula molde,
o que aumentou a dificuldade de ligação da cafeína aos locais interiores.
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 105
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
Figura 4 - 5. Capacidade de adsorção do NPSA@MIP em função do tempo.
Para estimar a capacidade de adsorção do NPSA@MIP e NPSA@NIP realizou-
se ensaios de adsorção utilizando diferentes concentrações iniciais da solução de
cafeína. A Figura 4-6 mostra que a quantidade de cafeína ligada ao NPSA@MIP e ao
NPSA@NIP aumentou com o aumento da concentração de cafeína. Além disso, a
quantidade de cafeína ligada ao NPSA@MIP foi muito superior ao NPSA@NIP,
apresentando um FI de aproximadamente 1,8, ou seja, comprovando que o material
desenvolvido é consideravelmente seletivo.
A equação de Scatchard (Equação 9) foi adotada para avaliar a capacidade de
adsorção máxima teórica e a constante de dissociação (kd). A equação da regressão
linear para o NPSA@MIP foi Q/Ce = 69,42 – 20,96Q. Calculados através da inclinação
e do coeficiente linear da regressão, os valores de Qmax e Kd foram de 3,47 mg g-1 e
de 0,05 L g-1, respectivamente, permitiram comprovar a afinidade do NPSA@MIP pela
cafeína. Além disso, observar-se que o modelo que melhor se ajustou ao conjunto de
dados foi o de Langmuir indicando uma adsorção em monocamada. Comparando
com resultados obtidos a partir do MIP usando micropartículas nota-se que o
desempenho do MIP com nanopartículas está abaixo da média, uma vez que a
capacidade máxima de adsorção e o tempo de extração obtidos por Tian e
colaboradores foi de 62 mg g-1 e 1 hora, respectivamente (Tian et al., 2015). No
Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 106
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
entanto, vale ressaltar que o fator de impressão na mesma faixa de concentração foi
equivalente (1,91 mg g-1) e o melhor ajuste dos dados foi obtido também pelo modelo
de Langmuir.
Figura 4 - 6. Capacidade de adsorção do NPSA@MIP e do NPSA@NIP em função da
concentração de cafeína com base no método da incubação.
CAPÍTULO 6
5. Conclusões e Perspectivas
Capítulo 5: Conclusões e Perspectivas 108
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
Nesta Tese foi desenvolvida uma nova metodologia de fabricação de polímeros
impressos com estrutura caroço-casca, utilizando sílica como suporte, para extração
seletiva de ácido ascórbico, cafeína e vanilina. A metodologia permitiu a obtenção de
materiais morfologicamente diversificados, com flexibilidade e características bem
definidas, capazes de serem adaptados a diversos sistemas. Por exemplo, o capítulo
2 trouxe a síntese e aplicação do MIP para ácido ascórbico a partir de sílica porosa e
funcionalizada. Embora as microesferas de sílica tenham sido produzidas por um
método de síntese simples e bem definido, a combinação dessas partículas com a
tecnologia de impressão molecular ainda era uma incógnita. A metodologia utilizada
para fabricação do MIP, bem como os métodos de caracterização adotados, permitiu
obter e identificar, respectivamente, um material com tamanho médio superior a 10
µm, composto por um caroço e uma casca de até 1 µm de espessura. Diante dos
dados já descritos na literatura, a espectroscopia MIR-ATR e EDX apenas
confirmaram que o polímero havia sido fabricado com sucesso.
Após a caracterização, a avaliação do desempenho analítico do MIP para ácido
ascórbico, foi baseada na capacidade de adsorção, seletividade, recuperação e
número de reutilizações. Os resultados mais relevantes foram obtidos utilizando o
método de SPE com índices de recuperação superiores a 90%, capacidade de
adsorção máxima de 5,09 mg g-1 e fator de impressão de 2,30, podendo ser reutilizado
por mais de 20 vezes sem perder significativamente o desempenho analítico.
As metodologias de síntese, caracterização e aplicação utilizadas para a
fabricação do MIP para AA foram levemente modificadas e utilizadas para o
desenvolvimento de um novo MIP para vanilina descrito no Capítulo 3. Os aspectos
como porosidade, pH, tempo de extração e funcionalização, não explorados no
capítulo anterior, foram estudados neste capítulo. Além disso, uma amostra real foi
utilizada a fim de testar a seletividade do MIP para vanilina. A otimização permitiu
identificar as condições ideais de aplicação do polímero, que para a vanilina são
necessários 180 minutos com pH 5 para se obter a máxima capacidade extração do
polímero. Após a otimização do tempo e do pH, o desempenho analítico dos polímeros
com partículas porosas e não porosas, com ou sem funcionalização, sintetizados de
forma inédita, foram avaliados e revelaram que o grau de porosidade e
funcionalização são fundamentais para melhorar o desempenho do MIP. A porosidade
Capítulo 5: Conclusões e Perspectivas 109
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das partículas foi controlada pela razão TEOS/APTES e, como resultado, observou-
se que os MIPs para vanilina fabricados a partir de partículas não porosas
(MS2@MIP) foram mais seletivos (FI=2,37). Já a funcionalização das partículas
produziu um aumento na capacidade de extração, mas consequentemente diminuiu a
seletividade (FI=1,89). Os índices de recuperação e reutilização foram semelhantes
aos obtidos para o MIP para ácido ascórbico.
O estudo da seletividade em soluções padrão de vanilina e etilvanilina
demonstraram uma seletividade cruzada do polímero, ou seja, uma pequena
quantidade de etilvanilina também é extraída pelo polímero. A análise de várias
amostras por espectrometria de massas revelou a concentração de vanilina e
etilvanilina em alguns extratos de baunilha, variando de 3,26 até 7,34 µg mL-1 e de
6,57 até 45,80 µg mL-1, respectivamente. Os estudos permitem concluir que o
polímero desenvolvido é capaz de extrair a vanilina (20% massa retida) de matrizes
complexas contendo etilvanilina, mesmo quando a concentração de etilvanilina é
superior.
No Capítulo 4, o domínio da tecnologia de impressão molecular expandido para
nanoescala demonstrou que a fabricação dos MIPs é possível em diversas condições
e faixas de tamanho. Os polímeros impressos e não impressos apresentaram
tamanhos médios de 594 e 674 nm, respectivamente, e foram sintetizados usando um
iniciador que funciona à temperatura ambiente e sem o uso de radiação UV, o que
tornou o processo de síntese ainda mais simples. Os resultados preliminares
revelaram a obtenção de um polímero seletivo e com excelente estabilidade
mecânica. No entanto, a capacidade de adsorção (3,47 mg g-1) e o tempo de extração
(entre 6 e 8 horas) estão distantes da média descrita na literatura.
Por fim, o cálculo teorico aplicado aos reagentes envolvidos no processo de
síntese descrito no capítulo 2, com base na teoria do funcional da densidade, permitiu
a otimização das estruturas e, consequentemente, permitiu também identificar os
possíveis sítios de ligação no ácido ascórbico, qual seria o melhor monômero e
solvente (com base na energia de interação), e identificar o efeito da carga e tamanho
de ligação na interação entre monômero e molécula molde. Os monômeros estudados
mostraram possuir interações energeticamente favoráveis com o AA, exceto a 2-
Capítulo 5: Conclusões e Perspectivas 110
Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP
vinilpiridina. Pode-se concluir que moléculas com a ausência de grupos similares aos
contidos em um agente quelante, os quais são capazes de interagir por dois ou mais
grupos, não são energeticamente favoráveis como monômero para interagir com o
AA. Ainda nessa espécie de quelante, quanto melhor encaixe, ou seja, quanto mais
próximo estiverem os grupos, mais favorável é a interação. Como conclusão, pode-se
criar diversos monômeros fixando-se apenas o grupo vinil e o grupo quelante. Pode-
se inferir, com base nos cálculos teóricos que o polímero descrito no Capítulo 2 terá
um melhor desempenho analítico se for substituída a acrilamida pelo ácido
metacrílico.
O levantamento bibliográfico desta TESE apresentou diversos métodos de
síntese e aplicação dos polímeros impressos em diferentes escalas. No entanto, os
métodos utilizados nesta Tese apresentam um avanço significativo em nível mundial,
uma vez que são inovadores e promissores, e o conhecimento adquirido é
fundamental para o desenvolvimento de outros materiais para extração seletiva. Como
perspectiva, pretende-se em etapas futuras aprofundar-se no desenvolvimento de
novos polímeros impressos, utilizando materiais luminescentes e magnéticos, para
aplicações bioanalíticas. Pretende-se também utilizar a análise por injeção em fluxo
no intuito de automatizar e, consequentemente, analisar amostras de rotina em grande
escala. Ainda como perspectiva, utilizar a química computacional para prever e
compreender outras etapas do processo de fabricação dos MIPs.
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