UNIVERSIDADE ESTADUAL DE...
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i UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA CÁSSIA MARIA TOLEDO SACCON “ALTERAÇÕES NAS VIAS PROTEOLÍTICAS ENDÓGENAS CAUSADAS PELA PEÇONHA DE Bothrops jararacussu EM MÚSCULO ESQUELÉTICO” Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia para obtenção do Título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular, na área de Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Stephen Hyslop Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes Campinas, 2008
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i
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CÁSSIA MARIA TOLEDO SACCON
“ALTERAÇÕES NAS VIAS PROTEOLÍTICAS ENDÓGENAS
CAUSADAS PELA PEÇONHA DE Bothrops jararacussu EM
MÚSCULO ESQUELÉTICO”
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biologia para obtenção do Título
de Mestre em Biologia Funcional e
Molecular, na área de Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Stephen Hyslop
Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes
Campinas, 2008
ii
iii
iv
Dedicatória
“A TODOS OS ANIMAIS QUE SÃO SACRIFICADOS EM NOME DA CIÊNCIA,
EU DEDICO ESTE TRABALHO.
QUE ESSA VIDA TENHA ABERTO NOVOS CAMINHOS E EXISTÊNCIAS PARA ELES, E QUE O
CONHECIMENTO CIENTÍFICO POSSA VIR A BENEFICIAR MUITOS OUTROS SERES,
TORNANDO ESSAS VIDAS ETERNAMENTE LEMBRADAS.”
v
Agradecimentos
Agradeço a Deus em primeiro lugar e sempre por toda força, generosidade, luz e saúde.
Ao meu pai e à minha mãe pelo amor imenso, dedicação, força e compreensão; pelo
exemplo de simplicidade e dignidade. Aos meus irmãos queridos Vinicius e Lucas, pelo apoio e
por tornarem meus dias mais leves e alegres... não esquecendo o Bill, presença especial no nosso
dia-a-dia. Meu eterno agradecimento, carinho e admiração à minha família.
Ao meu orientador Prof. Dr. Stephen Hyslop pela oportunidade de crescimento, pelos
ensinamentos acadêmicos e pela rica contribuição na minha vida.
À minha co-orientadora Profa. Dra. Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes por toda
ajuda na realização dos ensaios enzimáticos, disponibilidade nos aparelhos e reagentes e pela
força e compreensão nos momentos importantes.
À Renata, minha irmã (gêmea!) do coração, companheira especial neste mestrado.
Por toda sabedoria que te cerca, pela colaboração, amizade e incentivo em todos os momentos.
Aos técnicos: José Ilton, Rafaela e Maiara por toda disponibilidade e ajuda. Agradeço à
contribuição e atenção de cada um neste trabalho: vocês são fundamentais para a pesquisa!
À minha amiga Andressa, por estar presente nos momentos importantes, pela
disponibilidade em ajudar sempre e principalmente pelo exemplo de força e dedicação. Agradeço
muito à ajuda no primeiro blotting que finalmente deu certo!
À minha querida amiga Paula, por me apresentar o laboratório do Prof. Stephen, pela
força e incentivo e pelos anos de lealdade e amizade.
Agradeço a toda minha família de Tietê, São Paulo e Belo Horizonte e à Juliane, presente
em todos os momentos e sempre pronta a ajudar!
Agradeço especialmente à minha querida avó Dona Cacilda exemplo supremo de força,
alegria, e superação em vida. Meu eterno orgulho e admiração...
vi
Aos amigos queridos pela força, apoio e por fazerem toda a diferença na minha vida!
Especialmente: Ana, Andrea, Bruna, Camila, Carolina, Fábio, Felipe, Juliana, Lídia, Mirian,
Rafaelle, Renata, Sylvie, Thori e família Higaki.
Aos amigos do laboratório de Farmacologia Bioquímica pela convivência, ajuda e
amizade: André, Adriana, Alessandra, Christiane, Delano, Elionai, Érica, Fernanda, Gustavo,
Juliana, Igor, Kiara, Lourdes, Mariana, Norma, Rafael, Raquel, Renata, Sueli e Thomaz.
Obrigada pelo carinho e paciência. Agradeço especialmente à Juliana, Cristiane e Adriana.
Aos amigos do departamento: Carol, Daniel, Enilton, Letícia, Nádia, Paula, Sandro,
Tatiana e aos funcionários: Bruna, Elaine, Fran e Wanderlei pela ajuda e convivência.
Aos colegas do Biotério: Marcos e “Seu” Miguel pelo auxílio e respeito aos animais e ao
técnico Gildo por ceder seus animais em momentos importantes.
À Priscila pela confiança e disponibilidade do micrótomo.
Aos colegas do Departamento de Fisiologia principalmente à Tatiane e Estella pela
disponibilidade em ajudar e ensinar.
Aos professores da minha banca de qualificação Dra. Carmen Veríssima, Dra. Maria
Alice da Cruz-Höfling e Dr. Sérgio Marangoni pelas valiosas sugestões.
Agradeço a gentileza e as contribuições dos pesquisadores participantes da banca
examinadora Dr. Paulo Flávio Silveira e Dra. Maria Alice da Cruz-Höfling.
A compreensão e carinho dos colegas das Escolas Padre Melico e Leonor Savi Chaib.
À Unicamp e ao curso de Pós-graduação em Biologia Funcional e Molecular pela
oportunidade, e à secretária Andréia pela ajuda e compreensão durante todo mestrado.
À FAPESP e CNPq pelo auxílio financeiro.
E finalmente, a todos que colaboraram de alguma forma para a minha formação pessoal e
profissional.
vii
"A coisa mais bela que podemos experimentar é o mistério.
Essa é a fonte de toda a arte e ciências verdadeiras."
Albert Einstein
“Seremos tão sábios?
Acreditamos que somos muito mais...
Até nos batizamos como Homo sapiens, título de nobreza e presunção.
No fundo, afirmamos que as outras espécies padecem de certa estupidez: não escrevem
livros nem fazem bombas.
Tenho dúvidas. Tubarões, besouros, lagartixas, formigas... Todos eles carregam em
silêncio, nos seus corpos, uma sabedoria, toda ela a serviço da sua sobrevivência...”
Rubens Alves
viii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................................
x
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................................
xi
RESUMO........................................................................................................................................
xiii
ABSTRACT....................................................................................................................................
.
xiv
INTRODUÇÃO.............................................................................................................................
Homeostase protéica..............................................................................................................
Proteases lisossomais.............................................................................................................
Proteases dependentes de cálcio............................................................................................
Sistema ubiquitina-proteossomo............................................................................................
Dano local causado por peçonhas botrópicas.........................................................................
Miotoxinas fosfolipásicas......................................................................................................
Hemorraginas (metaloproteinases)........................................................................................
Degradação de proteínas endógenas por peçonha..................................................................
Regeneração muscular...........................................................................................................
Bothrops jararacussu.............................................................................................................
1
2
2
4
5
8
9
10
12
13
15
OBJETIVOS.................................................................................................................................... 16
MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................................................
Reagentes e peçonha..............................................................................................................
Animais..................................................................................................................................
16
16
17
Procedimento experimental (mionecrose)..............................................................................
Peso dos músculos.................................................................................................................
17
17
Creatina quinase (CK)............................................................................................................ 18
ix
Aminoácidos livres................................................................................................................
18
Análise histológica.................................................................................................................
Atividades enzimáticas proteolíticas......................................................................................
Western blotting do sistema proteossômico...........................................................................
Tratamento com inibidor proteossômico...............................................................................
Análise estatística...................................................................................................................
19
19
21
22
23
RESULTADOS...............................................................................................................................
1. Caracterização do envenenamento experimental com a peçonha de B. jararacussu...........
1.1. Creatina quinase (CK)....................................................................................................
1.2. Peso dos músculos..........................................................................................................
1.3. Concentração de aminoácidos livres nos músculos........................................................
1.4. Perfil de dano e regeneração muscular (histologia)........................................................
1.4.1. Coloração com Hematoxilina-eosina................................................................
1.4.2. Coloração com Vermelho de picrosirius...........................................................
2. Sistema proteossômico...............................................................................................................
2.1. Atividade e expressão do proteossomo...........................................................................
2.2. Tratamento com inibidor proteossômico (atividade e histologia)...................................
3. Proteases lisossomais e protease dependente de cálcio...........................................................
3.1. Atividade das catepsinas (via lisossomal) e da calpaína (protease dependente de
cálcio)..........................................................................................................................................
24
24
24
24
25
28
28
29
38
38
43
48
48
DISCUSSÃO...................................................................................................................................
52
CONCLUSÕES..............................................................................................................................
63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................................
63
ANEXO........................................................................................................................................... 82
x
LISTA DE ABREVIATURAS
aa: Aminoácidos livres
ANOVA: Teste de análise de variância
ATP: Adenosina trifosfato
Ca2+
: Íon cálcio
CK: Creatina quinase
DMSO: Dimetilsulfóxido
DUBs: Enzimas desubiquitinadoras
E1: Enzima 1 (enzima ativadora de ubiquitina)
E2: Enzima 2 (enzima conjugadora)
E3: Enzima 3 (proteína ubiquitina ligase)
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético
HE: Hematoxilina-eosina
i.m.: Intramuscular
i.p.: Intraperitoneal
kDa: kilodaltons
MDa: megadaltons
MG-132: Carbobenzoxi-L-leucil-L-leucil-L-leucinal (inibidor proteossômico)
MMPs: Metaloproteinases de matriz
PBS: Tampão fosfato-salina
PLA2: Fosfolipase A2
PVDF: Membrana polivinilideno difluoreto
SDS: Dodecil sulfato de sódio
Tween 20: Polioxietileno (20) sorbato monolaurato
Ub: Ubiquitina
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Processo de ubiquitinização de uma proteína (substrato) pelas enzimas E1, E2 e
E3.....................................................................................................................................
6
Figura 2: Atividade de CK em plasma de camundongos tratados com a peçonha de
B. jararacussu.................................................................................................................
26
Figura 3: Variação do peso em músculo gastrocnêmio de camundongos injetados com a
peçonha de B. jararacussu..............................................................................................
26
Figura 4: Concentração de aminoácidos livres em músculo gastrocnêmio de camundongos
em diferentes períodos após a injeção da peçonha de B. jararacussu.........................
27
Figura 5: Análise histológica de secções de músculo gastrocnêmio injetado com a peçonha
de B. jararacussu (coloração hematoxilina-eosina)........................................................
30/35
Figuras 6/7: Análise histológica de secções de músculo gastrocnêmio injetado com a
peçonha de B. jararacussu (coloração vermelho de picrosirius)................................
36/37
Figura 8: Atividade quimiotripsina proteossômica em músculo gastrocnêmio em diferentes
períodos após a injeção da peçonha de B. jararacussu..................................................
39
Figura 9: Atividade caspase proteossômica em músculo gastrocnêmio em diferentes
períodos após a injeção da peçonha de B. jararacussu...................................................
40
Figura 10: Atividade tripsina proteossômica em músculo gastrocnêmio em diferentes
períodos após a injeção da peçonha de B. jararacussu...................................................
40
Figura 11: Expressão da subunidade 20Sα proteossômica em músculo gastrocnêmio em
diferentes períodos após a injeção da peçonha de B. jararacussu..................................
41
Figura 12: Expressão Expressão da subunidade 11S proteossômica em músculo gastrocnêmio em
diferentes períodos após a injeção da peçonha de B. jararacussu...................................................
41
Figura 13: Expressão da subunidade 19S reguladora de ATPase proteossômica em músculo
gastrocnêmio em diferentes períodos após a injeção da peçonha de B.
jararacussu......................................................................................................................
42
Figura 14:
Expressão da α-actina em músculo gastrocnêmio em diferentes períodos após a
injeção da peçonha de B. jararacussu.............................................................................
42
xii
Figura 15: Western blotting das subunidades 20Sα, 19S e 11S do proteossomo e da α-actina
em músculo gastrocnêmio de camundongos em diferentes períodos após a injeção
da peçonha de B. jararacussu.........................................................................................
43
Figura 16: Efeito do tratamento com o inibidor proteossômico MG-132 na atividade da
quimiotripsina proteossômica e na análise histológica morfométrica de músculo
gastrocnêmio injetado com a peçonha de B. jararacussu...........................................
45
Figura 17: Variação do peso muscular no tratamento com o inibidor proteossômico MG-132
de músculo injetado com a peçonha de B. jararacussu...........................................
45
Figura 18: Aspecto histológico de secções de músculo tratado com o inibidor proteossômico
MG-132 (coloração hematoxilina-eosina)...................................................................
46
Figura 19: Aspecto histológico de secções de músculo tratado com o inibidor proteossômico
MG-132 (coloração vermelho de picrosirius).................................................................
47
Figura 20: Atividade da calpaína em músculo gastrocnêmio em diferentes períodos após a
injeção da peçonha de B. jararacussu..........................................................................
49
Figura 21: Atividade da catepsina B lisossomal em músculo gastrocnêmio em diferentes
períodos após a injeção da peçonha de B. jararacussu.................................................
50
Figura 22: Atividade da catepsina H lisossomal em músculo gastrocnêmio em diferentes
períodos após a injeção da peçonha de B. jararacussu...................................................
51
Figura 23: Esquema indicando a ativação e inibição das atividades proteolíticas relacionadas
às alterações histológicas deste estudo........................................................................
62
Figura 24: Esquema hipotético indicando as principais alterações teciduais que ocorrem no
envenenamento botrópico e as possíveis relações com as vias proteolíticas
analisadas neste estudo................................................................................................
62
xiii
RESUMO
O acidente causado por serpentes botrópicas produz intensa hemorragia e mionecrose local, com
perda e degradação tecidual. Neste trabalho, investigamos as atividades do proteossomo (via seletiva
da degradação protéica), catepsinas (proteases lisossomais) e calpaína (protease neutra dependente
de cálcio) no envenenamento causado por peçonha de Bothrops jararacussu. Também analisamos a
capacidade do MG-132, inibidor proteossômico, em atenuar os efeitos causados pela peçonha. A
peçonha (25 µg e 75 µg) foi injetada em músculo gastrocnêmio de camundongos, que foram
sacrificados 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 h e 7, 14, 21, 28 dias após o envenenamento. Os músculos
tratados e contralaterais foram retirados e processados para histologia e para ensaios fluorimétricos e
colorimétricos das enzimas e o sangue foi coletado para quantificação da creatina quinase (CK,
indicador da mionecrose). A peçonha de B. jararacussu causou hemorragia e mionecrose (fase 1, até
6 h a 12 h pós-envenenamento - p.e.), a presença de infiltrado inflamatório e desencadeou a
formação de miotubos e mioblastos (fase 2, de 12 h a 72 h p.e.) e o aparecimento de células
regenerativas com maior deposição de colágeno ao redor dessas células (fase 3, 7-28 dias p.e.). De
modo geral, as alterações mais marcantes ocorreram com a dose maior da peçonha. O dano tecidual
agudo foi confirmado pelo aumento nos níveis plasmáticos de CK entre 1 h e 6 h p.e., com pico em
3 h. Houve redução na concentração de aminoácidos livres do músculo durante as primeiras 24 h,
seguida por retorno a níveis normais. Também houve redução significativa na atividade
proteossomal (até 48 h) nos músculos envenenados seguida por recuperação e aumento significativo
em alguns períodos da regeneração. Nesses períodos de regeneração, houve aumento da expressão
das subunidades 20Sα e 11S do proteossomo, principalmente com a dose maior da peçonha. O
inibidor proteossômico diminuiu a atividade quimiotripsina e o número de células regenerativas,
mas esses efeitos também foram observados no grupo que recebeu apenas o veículo do inibidor
(DMSO). A calpaína foi ativada nas primeiras 6 h após o envenenamento somente com a dose maior
da peçonha. As catepsinas (B e H) exibiram ativação significativa no período de regeneração (de 48
h até 28 dias) nas duas doses aplicadas. Esses resultados indicam que a peçonha de B. jararacussu
afetou diferencialmente as vias proteolíticas estudadas. É possível que a calpaína esteja envolvida na
fase 1 do dano tecidual e que as catepsinas estejam relacionadas à presença de infiltrado
inflamatório (fase 2) ou à regeneração (fase 3). O proteossomo parece não estar relacionado à fase
aguda de degradação tecidual, mas pode estar envolvido na regeneração muscular embora isso ainda
precise ser confirmado.
xiv
ABSTRACT
Bites by Bothrops snakes produce intense local hemorrhage and myonecrosis, often with extensive
tissue degradation. In this work, we investigated the activities of the proteasome (pathway for
selective protein degradation), cathepsins (lysosomal proteinases) and calpains (neutral, calcium-
dependent proteinases) in envenoming by Bothrops jararacussu. We also examined the ability of
MG-132, a proteasome inhibitor, to attenuate the venom-induced effects. Mice were injected with
venom (25 µg or 75 µg) in the left gastrocnemius muscle and then killed 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 h and
7, 14, 21 and 28 days post-venom. The venom-injected and contralateral muscles were removed and
processed for histological analysis or enzymatic assays using fluorimetric or colorimetric substrates.
Blood was also collected for the quantification of plasma creatine kinase (CK, an indicator of
myonecrosis). Bothrops jararacussu venom caused hemorrhage and necrosis (phase 1, up to 6-12 h
post-venom), an inflammatory cell infiltrate and it generated the formation of myotubes and
myoblasts (phase 2, 12-72 h post-venom), and the appearance of regenerative cells with increase of
collagen deposition around these cells (phase 3, 7-28 days post-venom). The alterations were
generally more marked with the higher dose of venom. The early tissue damage was confirmed by
an increase in plasma CK levels 1-6 h post-venom, with a peak at 3 h. The muscle content of free
amino acids decreased during the first 24 h, followed by a return to normal levels. Proteasomal
activity was significantly inhibited for up to 48 h post-venom, followed by recuperation and a
significant increase during muscle regeneration. During regeneration, there was also an increase in
the expression of the 20Sα and 11S proteasomal subunits, mainly with the highest dose of venom.
The proteasomal inhibitor reduced the chymotrypsin activity of the proteasome and the number of
regenerating cells, but these effects were also seen in mice that received vehicle (DMSO) alone. The
highest dose of venom caused an increase in calpain activity in the first 6 h whereas both of the
venom doses significantly increased the activities of cathepsins B and H during the regeneration
phase (48 h–28 days post-venom). These results indicate that B. jararacussu venom differentially
affects the proteolytic activities studied. Calpain may be involved in phase 1 of tissue damage and
cathepsin activity may be related to the presence of an inflammatory infiltrate (phase 2) and/or
regeneration (phase 3). The lack of proteasomal activation in the early stages of envenoming
suggests that this proteolytic pathway is not involved in early venom-induced muscle damage.
However, the involvement of proteasomal activity during muscle regeneration remains to be
established.
1
INTRODUÇÃO
Estudos dos danos locais causados pelo envenenamento botrópico, além dos mecanismos
que atenuam tais danos, têm grande relevância clínica, pois podem resultar em terapias que
reduzem a perda de tecido muscular e as seqüelas no indivíduo acidentado (Rosenfeld, 1971; Fan
e Cardoso, 1995; França e Málaque, 2003). Além disso, a ineficiência em neutralizar totalmente
esses danos locais, seja através da soroterapia ou de outros recursos farmacológicos, conduz para
a busca de novas alternativas de tratamento (Escalante et al., 2000; Rucavado et al., 2000). Sendo
assim, é importante e necessário mais conhecimento e informações sobre os mecanismos
envolvidos nas alterações locais do envenenamento botrópico (Teibler et al., 2001; Teixeira et
al., 2003b). Apesar do avanço nessa área, pouco se sabe sobre as mudanças que ocorrem na
célula e os sinais celulares que estão envolvidos no dano local ou que influenciam processos
celulares associados ao envenenamento como a inflamação, ativação da miogênese e
regeneração. As vias de proteólise são estudadas em diversas patologias em que há intensa
degradação de proteínas (Matthews et al., 1989; Mitch e Goldberg, 1996; Solomon e Goldberg,
1996; Voisin et al., 1996; Lecker et al., 1999; Kumamoto et al., 2000; Costelli e Baccino, 2003;
Tisdale, 2005; Argiles et al. 2006). No envenenamento botrópico, há elevada degradação protéica
já que a peçonha botrópica provoca perda de massa muscular, que é verificada tanto experimental
quanto clinicamente (da Silva et al., 2003; Santo Neto et al., 2004). Sendo assim, neste estudo
investigamos a relação entre o envenenamento botrópico e as três principais vias proteolíticas
intracelulares (via proteossômica, via lisossomal e protease dependente de cálcio).
2
Homeostase proteíca
Na vida celular normal, as proteínas intracelulares são continuamente hidrolisadas em
seus aminoácidos constituintes e substituídas por novas proteínas recém-sintetizadas em um
processo denominado turnover protéico (Lecker et al., 1999). Embora essa destruição das
proteínas pareça dispendiosa, esse processo é muito importante para homeostase celular. A rápida
remoção de proteínas representa um processo irreversível de regulação, sendo importante para o
controle do crescimento e do metabolismo celular, e também para a adaptação a novas condições
fisiológicas (Mitch e Goldberg, 1996; Lecker et al., 1999). Além disso, o turnover protéico
fornece um mecanismo importante de controle de qualidade que seletivamente elimina proteínas
com mutações ou com conformações anormais (Lecker et al., 1999; Schubert et al., 2000).
Existem três vias principais para a degradação de proteína celular: 1) proteólise pelas
proteases dos lisossomos, 2) proteólise pelas proteases dependentes de cálcio (calpaínas) e 3)
proteólise por peptidases de um complexo multicatalítico conhecido como via ubiquitina-
proteossomo (Mitch e Goldberg, 1996; Voisin et al., 1996; Bonuccelli et al., 2003; Costelli et al.,
2005).
Proteases lisossomais
O lisossomo é um compartimento membranoso denso e ácido (pH 4-5) que contém
aproximadamente 50 enzimas hidrolíticas e representa o principal compartimento intracelular
degradativo das células de mamíferos (Duve, 1983; Kirschke e Barret, 1987; Bechet et al., 2005).
O lisossomo é mantido em pH ácido (4-5) devido às bombas ATP-dependente na membrana
lisossomal que acoplam a hidrólise de ATP à translocação de prótons do citoplasma para o
interior do lisossomo (Duve, 1983; Forgac, 1999). O pH ácido favorece a atividade enzimática
das hidrolases lisossomais e também promove a quebra das interações intramoleculares causando
3
o desdobramento dos substratos que foram entregues ao lisossomo (Bechet et al., 2005). As
enzimas lisossomais, responsáveis pela degradação de uma variedade de macromoléculas e até
mesmo de organelas, abrangem proteases, glicosidases, lipases, nucleases e fosfatases (Duve,
1983; Bechet et al., 2005).
Dentre as proteases, as principais representantes são as catepsinas, uma família de
proteases ácidas com baixa especificidade de substrato cuja função é degradar proteínas
intracelulares e extracelulares, via endocitose (Kirschke et al., 1998; Dickinson, 2002; Bechet et
al., 2005). A maioria é cisteíno-peptidase, isto é, possui resíduo de cisteína no sítio ativo, embora
exista uma aspartato-peptidase (catepsina D) (Kirschke et al., 1998; Turk et al., 2001; Dickinson,
2002). Atualmente, existem pelo menos 11 catepsinas caracterizadas, as quais se distinguem com
relação à estrutura e ao substrato (Dickinson, 2002; Bechet et al., 2005). As catepsinas L, B, D e
H são as principais proteases lisossomais e determinam primariamente a capacidade proteolítica
do lisossomo (Kominami et al., 1991; Bechet et al., 2005).
As catepsinas lisossomais abrangem endopeptidases e exopeptidases; as primeiras clivam
ligações peptídicas internas das proteínas e as segundas hidrolisam aminoácidos presentes nas
extremidades C (carboxipeptidases) ou N (aminopeptidases) terminais. A maioria das proteases
de cisteína são somente endopeptidases (catepsinas F, K, L, S e V), mas as catepsinas B e H são
também exopeptidases (carboxipeptidase e aminopeptidase, respectivamente) (Bechet et al.,
2005). No lisossomo, as endopeptidases estão pelo menos 10 vezes mais concentradas que as
exopeptidases e provavelmente iniciam a proteólise lisossomal, pois conforme a atividade das
endopeptidases procede, novos resíduos de C- e N-terminal são formados e servem de substrato
para as exopeptidases (Bechet et al., 2005).
Embora comumente expressas em todos os tecidos, as catepsinas lisossomais revelam
uma distribuição tecido-dependente (Kominami et al., 1985; Bando et al., 1986). Tecidos com
4
alta taxa de turnover protéico (rim, baço, fígado e placenta) apresentam alta taxa da expressão de
catepsinas, enquanto baixas concentrações de catepsinas prevalecem em tecido de turnover lento,
como músculos esqueléticos (Bechet et al., 2005). Porém, muitos estudos têm enfatizado a
presença e a importância dessas proteases na homeostase muscular (Kirschke et al., 1983; Takeda
et al., 1992; Belkhou et al., 1994; Bechet et al., 1996, 2005). As catepsinas já foram
caracterizadas em células musculares isoladas (Kirschke et al., 1983; Tassa et al., 2003) e em
células satélites adultas (Jane et al., 2002).
In vitro, todas as proteases lisossomais degradam proteínas miofibrilares purificadas
(Katunuma et al., 1983; Dufour et al., 1989), sendo que a especificidade da hidrólise varia de
uma catepsina para outra. A catepsina H degrada principalmente troponina T (Katunuma et al.,
1983) e a catepsina B hidrolisa principalmente a cadeia pesada de miosina (Schwartz e Bird,
1977) troponina T, e mais lentamente, troponina I e tropomiosina (Noda et al., 1981).
Proteases dependentes de cálcio
A proteólise dependente de cálcio é mediada pelas calpaínas, uma família de cisteíno-
proteases neutras (Guroff, 1964) cuja regulação é complexa e não completamente elucidada
(Costelli et al., 2005). A maioria dos estudos divide essas enzimas em duas isoformas: as μ-
calpaínas e as m-calpaínas, por serem respectivamente ativadas por concentrações μM e mM de
cálcio in vitro (Costelli et al., 2005). As μ-calpaínas e m-calpaínas, que compartilham 50-60% de
homologia, são constituídas por heterodímeros formadas por duas subunidades de 80 kDa e 30
kDa. A primeira contém o sítio catalítico, e a segunda possui funções regulatórias (Carafoli e
Molinari, 1998).
As calpaínas estão normalmente presentes no citoplasma em seu estado inativo. Quando
as concentrações intracelulares de cálcio aumentam, a forma inativa das calpaínas migra para a
5
membrana onde é ativada por cálcio, resultando na dissociação dos dímeros e liberação da
subunidade catalítica (Suzuki et al., 1995; Costelli et al., 2005).
Devido à sua especificidade restrita, as calpaínas somente exercem uma proteólise
limitada em seus substratos resultando em alterações irreversíveis, que levam à modificação da
atividade do substrato ou à degradação por outros sistemas proteolíticos (Saido et al., 1994;
Williams et al., 1999; Dickinson, 2002; Costelli et al., 2005). As calpaínas estão envolvidas em
processos importantes como proliferação celular, diferenciação, migração, apoptose e expressão
gênica (Carafoli e Molinari, 1998; Nixon, 2003; Suzuki et al., 2004).
Sistema ubiquitina-proteossomo
A via ubiquitina-proteossomo representa o principal sistema proteolítico do citosol e do
núcleo de todas as células eucarióticas e acredita-se que tenha papel crucial na degradação de
proteínas musculares (Costelli et al., 2005). A via ubiquitina-proteossomo foi descoberta há mais
de 30 anos (Etlinger e Goldberg, 1977; Hershko, 1996), e seu envolvimento nos processos
degradativos foi demonstrado no final da década de 80 (Matthews et al., 1989). A importância
dessa via mereceu o prêmio Nobel de Química em 2004 pelos cientistas Aaron Ciechanover,
Avram Hershko and Irwin Rose (http://nobelprize.org/chemistry/laureates/2004/ public.html).
A degradação de uma proteína pela via ubiquitina-proteossomo envolve dois passos
distintos: a sinalização pela ubiquitina e a degradação dessa proteína pelo proteossomo, com
liberação da ubiquitina livre e reutilizável (Voisin et al., 1996). A ubiquitinização consiste da
ligação covalente de múltiplas moléculas de ubiquitina (Ub), uma proteína de 8 kDa. Essa ligação
é feita por três enzimas diferentes (E1, E2 e E3) (Kisselev e Godberg, 2001). Inicialmente, a E1
ativa a ubiquitina, em uma reação dependente de ATP e transfere-a para a E2, uma enzima
carregadora de ubiquitina. Essa ubiquitina é transferida para um substrato protéico pela E3, uma
6
ligase de ubiquitina proteína (Kisselev e Goldberg, 2001; Glickman e Ciechanover, 2002). Isso
permite as proteínas serem reconhecidas e degradadas pelo 26S proteossomo (Kisselev et al.,
1998; Voges et al., 1999). (Figura 1).
Figura 1. Processo de ubiquitinização de uma proteína (substrato) pelas enzimas E1, E2 e E3, o
que possibilita a degradação dessa no complexo multicatalítico 26S proteossomo representado
pela suas subunidades 19S e 20S. Na subunidade 20S, estão evidenciados os anéis exteriores e
interiores ß. A proteína é prontamente degradada em oligopeptídeos e a ubiquitina reciclada para
ser utilizada em posteriores sinalizações (Fonte: Zolk et al., 2006).
O 26S proteossomo (2.5 MDa) consiste de uma partícula central 20S (720 kDa) que é um
cilindro com atividade catalítica, mais dois complexos regulatórios 19S (890 kDa) (Coux et al.,
1996; Baumeister et al., 1998; Stefanelli et al., 1998; Voges et al., 1999). A partícula 19S
controla o acesso dos substratos à subunidade proteolítica 20S (Kisselev e Goldberg, 2001),
reconhecendo as proteínas ubiquitinizadas e permitindo sua entrada através da abertura de um
orifício, em um processo dependente de ATP. A subunidade 19S contém seis subunidades de
ATPase que fornecem energia para seu funcionamento (Soucy et al., 1999). No momento em que
7
os substratos ubiquitinizados entram nos canais estreitos do 20S proteossomo, a subunidade 19S
desdobra os substratos protéicos, dissociando-os da ubiquitina com a ajuda de enzimas
desubiquitinadoras (DUBs) e inserindo-os na subunidade 20S (Osna and Donohue, 2007). A
subunidade catalítica 20S é composta de quatro anéis empilhados: dois anéis exteriores
idênticos e dois anéis interiores ß também idênticos (Figura 1). Os seis sítios de peptidases, que
estão localizados na subunidade ß, atuam juntos para clivar a proteína em diversos oligopeptídeos
(Glickman e Ciechanover, 2002; Rock et al., 2004). Dois sítios com atividade semelhante à da
quimiotripsina clivam preferencialmente depois de resíduos hidrofóbicos, dois sítios tipo tripsina
clivam depois de resíduos básicos e dois sítios tipo caspase clivam preferencialmente após
resíduos ácidos (Dick et al., 1998; Nussbaum et al., 1998). Nas células de mamíferos,
encontramos também a subunidade 11S que está envolvida na hidrólise de proteínas
independente de ATP (Kisselev e Goldberg, 2001). Coux e colaboradores (1996) sugerem que a
subunidade 11S se associa a 20S para estimular a atividade peptidásica e pode estar envolvida na
quebra final de peptídeos derivados da degradação protéica.
Com o desenvolvimento de inibidores proteossômico, foi possível verificar que o
proteossomo catalisa a degradação não somente das proteínas de vida curta, mas também de vida
longa, que inclui a grande maioria das proteínas nas células de mamíferos (Rock et al., 1994;
Mitch e Goldberg, 1996; Craiu et al., 1997). Evidências recentes sugerem que o aumento da
degradação de proteína pela via ubiquitina-proteossomo esteja envolvido em diversos transtornos
catabólicos como traumas, acidoses metabólicas, caquexias, queimaduras e jejum (Mitch e
Goldberg, 1996; Voisin et al., 1996; Lecker et al., 1999; Costelli e Baccino, 2003; Tisdale, 2005;
Argiles et al. 2006) e também na patogenia de doenças como atrofia e distrofia muscular
(Matthews et al., 1989; Solomon e Goldberg, 1996; Mitch e Goldberg, 1996; Tawa et al., 1997;
8
Gao et al., 2000; Kumamoto et al., 2000; Bonuccelli et al., 2003). Dessa forma, os inibidores
podem ter aplicações importantes in vivo no tratamento farmacológico dessas patologias
(Kisselev e Goldberg, 2001; Bonuccelli et al., 2003). Dentre os inibidores disponíveis
atualmente, o MG-132 é um inibidor potente e seletivo, sendo freqüentemente usado para inibir o
proteossomo (Kisselev and Goldberg, 2001; Elliott et al., 2003).
Dano local causado por peçonhas botrópicas
O envenenamento causado por peçonhas de serpentes do gênero Bothrops é caracterizado
por alterações patológicas no local da picada (hemorragia, edema e necrose tecidual) que
progridem rapidamente depois do acidente (Gutiérrez e Lomonte, 2003; Gutiérrez e Ownby,
2003) e freqüentemente resultam em seqüelas permanentes, com proeminente dano tecidual local,
podendo implicar na perda da função ou até mesmo na amputação do membro afetado
(Rosenfeld, 1971; Fan e Cardoso, 1995; França e Málaque, 2003; Warrell, 2004).
A mionecrose induzida por peçonhas botrópicas é um fenômeno complexo e explicado
por dois mecanismos fundamentais: (1) primeiramente, pela ação miotóxica direta das miotoxinas
fosfolipásicas (PLA2) que podem provocam lesões celulares irreversíveis nas fibras musculares
(Gutiérrez e Lomonte, 1995, 2003; Gutiérrez e Ownby, 2003) e, (2) secundariamente, pela
isquemia tecidual causada por toxinas hemorrágicas (hemorraginas) da peçonha (Gutiérrez et al.,
1995; Kamiguti et al., 1996; Gutiérrez e Rucavado, 2000; Gutiérrez et al., 2005). A isquemia
tecidual pode ser agravada por outros distúrbios como alterações inflamatórias, problemas de
coagulação, síndrome compartimental e compressão tecidual (Fan e Cardoso, 1995; Russell et al.,
1997; França e Málaque, 2003).
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Miotoxinas fosfolipásicas
Diversas miotoxinas já foram isoladas e caracterizadas do gênero Bothrops (Gutiérrez et
al., 1984a; Gutiérrez e Lomonte, 1995; Gutiérrez e Ownby, 2003). Elas são geralmente básicas,
com massas moleculares de ~15 kDa, podendo existir como monômeros ou dímeros, e suas
propriedades estruturais permitem classificá-las como PLA2 (Gutiérrez e Lomonte, 1995,
Lomonte et al., 2003). Embora todas essas miotoxinas apresentem a estrutura de PLA2, algumas
são isentas da atividade fosfolipásica, responsável pela hidrólise dos glicerolfosfolipídios de
maneira dependente de cálcio (Gutiérrez e Ownby, 2003). Essa diferença na atividade enzimática
está relacionada à alteração no resíduo 49 de algumas miotoxinas, com lisina (Lys49) em lugar de
aspartato (Asp49), o que afeta a capacidade dessas proteínas para ligar cálcio, influenciando
assim sua atividade enzimática (Holland et al., 1990; Scott et al., 1992; Arni et al., 1995; Ownby
et al., 1999). Entretanto, ambos os tipos de miotoxinas (Asp49 e Lys49) induzem mionecrose
quando injetadas em animais (Gutiérrez e Lomonte, 1995, 2003; Gutiérrez e Ownby, 2003).
A patogênese da necrose muscular induzida por algumas dessas miotoxinas tem sido
investigada com o uso de técnicas histológicas e de microscopia eletrônica. As diferentes
miotoxinas promovem um padrão similar de alterações patológicas, independente de
apresentarem ou não atividade enzimática. Inicialmente, são produzidas pequenas alterações nas
fibras musculares denominadas lesões delta (espaços triangulares nas fibras transversais, com a
base do triângulo na membrana plasmática). Posteriormente, essas lesões se tornam maiores e
também é observado hipercontração dos miofilamentos e alterações mitocondriais (ruptura das
membranas e formação de densidades floculentas). Os núcleos adquirem aspecto picnótico e as
membranas intracelulares se alteram, com formação de múltiplas vesículas no interior do espaço
celular (Gutiérrez et al., 1984a, 1989, 1991).
10
O mecanismo de ação dessas miotoxinas não se encontra plenamente elucidado do ponto
de vista molecular. Diversos estudos indicam que essas miotoxinas lesam diretamente a
membrana plasmática (Brenes et al., 1987; Diaz et al., 1991; Butron et al., 1993a, b; Lomonte et
al., 1994; Gutiérrez e Ownby, 2003; Harris, 2003), desestabilizando a sua estrutura fosfolipídica
e alterando sua permeabilidade para íons e moléculas. O estágio final da degeneração é
provavelmente dependente de Ca2+
, devido à entrada maciça de Ca2+
que segue o gradiente
eletroquímico que normalmente existe através da membrana plasmática (1 mM no fluido
extracelular e 0,1 mM no citosol). Essa entrada maciça provoca a ativação direta de enzimas
dependentes de Ca2+
, como proteases citosólicas, e o colapso da respiração mitocondrial pela
sobrecarga de Ca2+
(Gutiérrez et al., 1984b, 1989; Gutiérrez e Lomonte, 1995; Harris, 2003). A
ativação das proteases citosólicas é responsável pela degradação e perda de diversas proteínas
musculares estruturais (Harris et al., 2003), promovendo a desestabilização do aparelho contráctil
e perda das linhas Z e das bandas A e I (Ishiura et al., 1984; Gutiérrez et al., 1984a, 1990; Harris,
2003). Adicionalmente, a contração das miofibrilas, que é a conseqüência histológica mais
evidente da ação das miotoxinas nas células musculares, ocorre também devido ao influxo de
Ca2+
(Gutiérrez et al., 1984a, 1990; Harris, 2003).
Hemorraginas (metaloproteinases)
As hemorraginas presentes em peçonhas botrópicas são classificadas como
metaloproteinases e inclui uma série de enzimas zinco-dependente de diferentes massas
moleculares que são responsáveis principalmente pelo efeito hemorrágico (Bjarnason e Fox,
1994; Kamiguti et al., 1998; Haiti et al., 1999; Gutiérrez e Rucavado, 2000; Gutiérrez et al.,
2005; Fox e Serrano, 2005). Além de serem responsáveis pela hemorragia, também estão
11
envolvidas em alterações patológicas como mionecrose local, danos na pele, edema e outras
reações associadas com a inflamação (Gutiérrez e Rucavado 2000; Gutiérrez et al., 2005).
Essas enzimas são inibidas por agentes quelantes, como o ácido etilenodiaminotetracético
(EDTA), que seqüestram o zinco requerido para sua atividade; tanto a atividade enzimática como
a hemorrágica é inibida por esses agentes (Borkow et al., 1997). De fato, as metaloproteinases
exercem o efeito hemorrágico principalmente através de sua ação proteolítica, que consegue
romper a integridade das paredes vasculares através da degradação dos componentes proteícos da
lâmina basal como laminina, fibronectina e colágeno tipo IV (Baramova et al., 1991; Maruyama
et al., 1992; Rucavado et al., 1995; Gutiérrez e Rucavado, 2000; Gutiérrez et al., 2005; Fox e
Serrano, 2005).
Diversos estudos têm evidenciado que as hemorraginas estão também envolvidas na
patogenia da mionecrose (Queiróz et al., 1985; Gutiérrez et al., 1995; Gutiérrez e Lomonte,
2003). Porém, os mecanismos pelos quais as metaloproteinases de peçonha induzem o dano
muscular não foram plenamente elucidados. Gutiérrez e colaboradores (1995) sugeriram que a
mionecrose ocorre secundariamente à isquemia que se sucede no músculo esquelético, já que as
metaloproteinases alteram drasticamente o fluxo sanguíneo local (Gleason et al., 1983) e muitos
estudos corroboram essa hipótese (ver revisão de Gutiérrez et al., 2005).
As metaloproteinases da peçonha também parecem ser responsáveis pela ativação das
metaloproteinases de matriz (MMPs) endógenas (Rucavado et al., 1998, 2002; Saravia-Otten et
al., 2004) que têm papel importante na degradação controlada de componentes da matriz
extracelular e na remodelagem tecidual que ocorre durante a cicatrização (Saravia-Otten et al.,
2004). As MMPs são sintetizadas e secretadas fisiologicamente como zimógenos (Sternlicht e
Werb, 2001) por células do tecido conectivo e algumas células hematopoiéticas (Brown et al.,
1989; Bierkedal-Hansen et al., 1993). Com o aumento da expressão de MMPs na inflamação
12
induzida pela peçonha, ocorre maior degradação da matriz extracelular (Gutiérrez e Rucavado,
2000) permitindo maior distribuição da peçonha, agravando assim o dano tecidual. Além disso, a
degradação da matriz extracelular tem efeitos profundos no comportamento das células próximas
à lesão (Streulli, 1999), ativando ou inativando vias de sinalização celular que interferem no
processo de reparo tecidual, regeneração muscular e angiogênese. Essas alterações podem
contribuir para a perda permanente de tecido característico do envenenamento (Saravia-Otten et
al., 2004).
Devido ao amplo dano tecidual ocasionado pelas metaloproteinases de peçonha e MMPs
endógenas e considerando que a soroterapia não é eficiente na neutralização do efeito local
(Warrell, 1992; Gutiérrez et al., 1998; Escalante et al., 2000; Rucavado et al., 2000), algumas
terapias alternativas já foram propostas para minimizar os danos causados pelas
metaloproteinases. A injeção de CaNa2EDTA e batimastat (um inibidor sintético de MMPs) in
situ atenuou a hemorragia e necrose em animais experimentais (Escalante et al., 2000; Rucavado
et al., 2000). Porém, para uma redução efetiva da mionecrose observada no envenenamento serão
necessários inibidores para as miotoxinas PLA2 (Guitérrez e Ownby, 2003) e para outros
componentes da peçonha que contribuam com a degradação de proteínas musculares estruturais.
Degradação de proteínas endógenas por peçonha
Existe uma bibliografia escassa sobre a degradação de proteínas endógenas por peçonhas.
Porém, utilizando-se a peçonha de Notechis scutatus e as técnicas de imunohistoquímica e
immunoblotting verificou-se uma rápida degradação das proteínas desmina e titina, e uma
degradação mais lenta de distrofina, seguida da miosina e actina (Vater et al., 1992; Harris et al.,
2003). A perda de desmina e titina provavelmente está relacionada à elevação de Ca2+
no citosol
das fibras musculares, o que, por sua vez, ativaria as proteases não-lisossomais que degradam
13
essas duas proteínas (Harris et al., 2003) importantes principalmente na manutenção da
estabilidade estrutural do sarcômero (Minajeva et al., 2001). Como conseqüência da perda de
desmina e titina, ocorre uma desagregação das bandas A e I, seguida de liberação de filamentos
de miosina e actina para dentro do citosol onde eles seriam degradados por mecanismos não
conhecidos (Harris et al., 2003). Ishiura et al. (1984) sugeriram que essas proteínas com
degradação tardia sejam substratos de proteinases de macrófagos.
Regeneração muscular
O fenômeno de regeneração muscular que se segue à necrose local tem sido motivo de
numerosos estudos experimentais (Queiróz et al., 1984; Gutiérrez et al., 1991; Arce et al., 1991;
para revisões ver Harris e Cullen, 1990, e Harris, 2003). O passo prévio ao processo de
regeneração muscular é uma reação inflamatória celular com a presença de neutrófilos e
macrófagos (Gutiérrez et al., 1984a, b, 1990) que são responsáveis pela remoção do tecido
necrótico. Depois disso, o músculo esquelético pode se regenerar devido principalmente à
atuação das células satélites, que são células miogênicas localizadas entre a membrana plasmática
e a lâmina basal de fibras musculares adultas (Mauro, 1961; Allbrook, 1981; Grounds, 1991;
Gutiérrez e Rucavado, 2000; Harris, 2003). Durante o processo degenerativo, as células satélites
tornam-se ativadas, diferenciam-se em mioblastos, proliferam-se e fundem-se para formar os
miotubos. Os miotubos, que são células multinucleadas com núcleos centrais enfileirados,
diferenciam-se com o passar do tempo em fibras musculares multinucleadas (Snow, 1977;
Gutiérrez e Ownby, 2003; Harris, 2003; Chargé and Rudnicki, 2004; Tidball, 2005).
Após a necrose muscular induzida pela injeção de frações miotóxicas de peçonhas que
afetam somente as fibras musculares, há progressiva regeneração muscular, com abundantes
células que apresentam núcleo em posição central, aspecto típico de células musculares
14
regenerativas (Gutiérrez et al., 1984c, 1989, 1991; Brenes et al., 1987; Diaz et al., 1991; Santo
Neto et al., 2004). O diâmetro, número e morfologia das fibras são normais, exceto pelo núcleo
central (Gutiérrez et al., 1991; Santo Neto et al., 2004). Por outro lado, quando se utiliza
peçonhas brutas que, além de afetarem as células musculares, induzem também hemorragia, a
regeneração muscular é parcial e incompleta, observando-se o aparecimento de tecido de
granulação, fibrose e células regenerativas de tamanho reduzido (Gutiérrez et al., 1984c; Queiróz
et al., 1984; Arce et al., 1991; Salvini et al., 2001). A peçonha bruta, mediante suas
hemorraginas, leva à necrose dos vasos da microcirculação, impedindo a adequada regeneração
muscular devido à isquemia e acentuadas distorções do microambiente (Gutiérrez e Lomonte,
1995, 2003). A regeneração parcial também poderia estar relacionada a um decréscimo no
número de fibras musculares decorrente da morte de células satélites (Santo Neto et al., 2004),
embora, em muitos casos, as células satélites são notavelmente resistentes à peçonha ofídica e
miotoxinas (Harris et al., 2003).
Acredita-se que a preservação do leito vascular, dos fascículos nervosos motores e da
lâmina basal das células musculares, no caso da lesão produzida pelas miotoxinas purificadas,
torne possível a regeneração muscular completa (Allbrook, 1981; Grounds, 1990, 1991; Gutiérrez
et al., 1991; Gutíerrez e Rucavado, 2000). Nesse contexto, uma adequada vascularização permite
a chegada de macrófagos, nutrientes e oxigênio contribuindo com a síntese e a reorganização das
miofibrilas na fase de regeneração (Queiroz et al., 2002; Harris et al., 2003; Santo-Neto e
Marques, 2005). Os macrófagos produzem fatores pró-celulas satélites (citocinas e moléculas
sinalizadoras) que contribuem na ativação da miogênese para que ocorra regeneração (Cantini et
al., 2002; Teixeira et al., 2003a, b; Charge e Rudnicki, 2004; Santo Neto et al., 2004).
15
Bothrops jararacussu
A serpente B. jararacussu („jararaca grande‟, no idioma indígena) é encontrada no Brasil,
Bolívia, Paraguai e Argentina (Campbell e Lamar, 2004) e conhecida pela elevada quantidade de
peçonha que produz (Rosenfeld, 1971). A peçonha de B. jararacussu tem alta atividade
hemorrágica e miotóxica (Ferreira et al., 1992), causando mionecrose (Queiróz et al., 1984;
Milani et al., 1997; Ribeiro e Jorge, 1997; Jorge et al., 1999; da Silva et al., 2003; Santo Neto et
al., 2004) acompanhada da liberação de creatina quinase (Melo e Suarez-Kurtz, 1988; Gutiérrez
et al., 1991), efeitos que também são vistos em humanos envenenados por essa espécie (Milani et
al., 1997). Em animais experimentais, a regeneração muscular após a inoculação dessa peçonha é
incompleta, com evidente perda de função e massa muscular, advindo possivelmente do extenso
dano vascular (Queiróz et al., 1984; Gutiérrez et al., 1991; Santo Neto e Marques, 2005), porém a
causa dessa deficiência na regeneração ainda não foi totalmente esclarecida (Santo Neto et al.,
2004).
A mionecrose causada por B. jararacussu está relacionada à ação de duas miotoxinas
principais, a bothropstoxin-I (Lys-49) (Cintra et al., 1993) e a bothropstoxin-II (Asp-49) (Homsi-
Brandeburgo et al., 1988). Ambas possuem estrutura PLA2, sendo que a primeira é desprovida de
atividade fosfolipásica (Rodrigues-Simioni et al., 1995) e a segunda apresenta uma baixa
atividade (Homsi-Brandeburgo et al., 1988), mesmo assim, ambas induzem mionecrose.
Entretanto, não se pode descartar a ação concomitante de metaloproteinases tanto na ação
necrótica quanto na regeneração incompleta. Uma metaloproteinase hemorrágica, nomeada
Bjussu MP-І (60 kDa), foi isolada da peçonha de B. jararacussu (Mazzi et al., 2004). Ainda que
a atividade dessa toxina seja mais baixa que a da peçonha, ela pode ter um papel relevante na
hemorragia local e sistêmica (Mazzi et al., 2004).
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OBJETIVOS
Este estudo teve por objetivos:
1. Investigar as alterações na atividade e expressão do sistema proteossômico em músculo
de camundongos injetados com a peçonha de B. jararacussu.
2. Investigar as alterações nas atividades proteolíticas lisossomais (catepsinas) e protease
dependente de cálcio (calpaína) em músculo de camundongos injetados com a peçonha de
B. jararacussu.
3. Investigar, qualitativamente, a relação entre a atividade dessas vias proteolíticas e o dano
e regeneração muscular em camundongos injetados com a peçonha de B. jararacussu.
MATERIAIS E MÉTODOS
Reagentes e peçonha
Os reagentes para histologia, western blotting e para os ensaios bioquímicos foram
obtidos da Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, EUA), Calbiochem (La Jolla, CA, EUA),
Leica (Nussloch, Alemanha), Affinity (Newcastle, UK), Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz,
CA, EUA), Sigma (St. Louis, MO, EUA) e fornecedores locais.
A peçonha liofilizada de B. jararacussu, extraída de exemplares adultos de ambos os
sexos, foi obtida do Centro de Extração de Toxinas Animais (CETA, Morungaba, SP) e estocada
a -20ºC (lote 04/06).
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Animais
Camundongos machos Swiss (18-25 g), obtidos do Centro Multidisciplinar de
Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP, foram mantidos a 22ºC em gaiolas plásticas
(5/gaiola) sob ciclo de luz/escuro de 12 horas com acesso livre à água e ração (Nuvital®). Os
protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal
(CEEA) do Instituto de Biologia da UNICAMP (protocolo no
1002-1) e realizados de acordo com
as recomendações éticas gerais do Colégio Brasileiro para Experimentação Animal (COBEA).
Procedimento experimental (mionecrose)
O envolvimento das vias proteolíticas na mionecrose foi avaliado injetando-se a peçonha
de B. jararacussu no músculo gastrocnêmio esquerdo de camundongos anestesiados levemente
com halotano, seguido de sacrifício 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 horas e 7, 14, 21 e 28 dias após a
injeção (i.m.) (n=6 para cada intervalo de tempo). As doses da peçonha de B. jararacussu
utilizadas neste estudo foram 25 µg e 75 µg, ambas diluídas em 50 µL de tampão fosfato-salina
50 mM, pH 7,4 (PBS). Os animais controle receberam injeções de 50 µL de PBS, nas mesmas
condições experimentais. Após o sacrifício com overdose de anestésico (halotano), os músculos
esquerdo (tratado) e direito (contralateral, não injetado) foram dissecados, pesados e processados
para análise histológica ou congelados imediatamente em nitrogênio líquido e armazenados em
biofreezer a -80ºC para análises posteriores (enzimáticas, aminoácidos livres e western blotting).
Peso dos músculos
Alterações no peso úmido dos músculos gastrocnêmio esquerdo injetados com peçonha
foram expressas em porcentagem relativas ao peso dos músculos contralaterais (não injetados,
considerados como 100%) (Gutiérrez et al., 1986b).
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Creatina quinase (CK)
Os níveis de CK na circulação (parâmetro freqüentemente usado como indicador da
mionecrose) foram determinados através da dosagem de CK em amostras de sangue dos
camundongos injetados no músculo gastrocnêmio com as doses de 25 µg e 75 µg da peçonha de
B. jararacussu. Os camundongos controle receberam injeções de 50 µL de PBS, nas mesmas
condições experimentais. Nos intervalos de sacrifício citados anteriormente, o sangue foi
coletado da veia caudal em tubos capilares heparinizados. Após centrifugação dos capilares em
centrífuga para hematócrito durante 5 min, o plasma foi usado para determinação da atividade de
CK a partir de kits comerciais (Bioclim, Belo Horizonte, MG, Brasil). A leitura foi feita em leitor
de microplacas SpectraMax340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA), no comprimento de
onda de 340 nm. O resultado foi expresso em unidade de CK/L (U/L), em que uma unidade
corresponde à fosforilação de 1 nmol de creatina por minuto, a 37ºC.
Aminoácidos livres
Os aminoácidos livres foram determinados de acordo com o método de Copley (1941).
Neste ensaio, foram utilizados músculos previamente homogeneizados em tampão fosfato de
potássio 0,1 M, pH 7,4, contendo NaCl 0,15 M (KPBS) e centrifugados (18.000 x g, 15 min,
4ºC). Uma alíquota do sobrenadante (25 μL) foi transferida para um tubo, completado com água
destilada (volume final de 200 μL) e em seguida foi adicionado 2 mL de ninhidrina 0,1% diluída
em álcool isopropílico. Os tubos foram vedados para evitar evaporação e então colocados em
banho-Maria a 40ºC, por 45 min. Após este período, as amostras foram centrifugadas (1900 x g,
2 min) e a leitura óptica foi feita em espectrofotômetro (Beckman Coulter DU 800), no
comprimento de onda de 570 nm. A concentração de aminoácidos foi calculada utilizando-se um
19
padrão contendo 100 nmol de ácido aminoacético (glicina). Os resultados foram expressos em
micromols de aminoácidos livres/micrograma de proteína (µmols aa/µg de proteína).
Análise histológica
Após o sacrifício dos camundongos nos intervalos de tempo descritos anteriormente, o
músculo gastrocnêmio foi dissecado e colocado imediatamente no fixador paraformaldeído 4%
(preparado em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4) durante 12 h e processado para microscopia de luz.
Para desidratação dos fragmentos dos tecidos, foram utilizados gradientes crescentes de alcoóis
(etanol), seguido de diafanização em xilol, e embebição e inclusão em parafina (Histosec-Merck).
Secções de 5 m de espessura foram obtidas usando um micrótomo (Leica RM 2245, Alemanha),
e as lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) ou vermelho de picrosirius para
análise posterior das alterações histológicas (Boer-Lima et al., 1999, 2002). As lâminas foram
examinadas em microscópio Leica DM 5000 B e as imagens foram capturadas, processadas e
analisadas usando uma câmara CCD LEICA CTR 5000 e softwares de processamento e análise
de imagem LEICA Q Win Plus v.3.2.0. As lâminas coradas com vermelho de picrosirius também
foram examinadas em luz polarizada utilizando o mesmo microscópio.
Atividades enzimáticas proteolíticas
O tecido muscular foi inicialmente homogeneizado em tampão de homogeneização (20
mM Tris, pH 7,5, 1 mM ditiotreitol, 2 mM ATP e 5 mM MgCl2) (Ventrucci et al., 2004) e
centrifugado (9.300 x g, 10 min, 4ºC). O sobrenadante foi utilizado para análise de proteínas
totais segundo o método de Bradford (1976) usando albumina bovina sérica como padrão.
20
O sobrenadante também foi utilizado para determinação das seguintes atividades enzimáticas:
quimiotripsina, caspase e tripsina proteossômica, catepsina B e H e calpaína.
A atividade da quimiotripsina proteossomal foi determinada utilizando o substrato
fluorogênico succinil-Leu-Leu-Val-Try-7-amino-4-metilcoumarina (0,167 µg de Suc LLVY-
AMC/µL de Tris-HCl 100 mM, pH 8,0), com excitação em 365 nm e emissão em 460 nm, de
acordo com o método de Orino et al. (1991). A atividade foi avaliada incubando-se 10 μL do
sobrenadante muscular com o substrato em volume total de 100 μL de Tris-HCl 100 mM, pH 8,0.
A atividade enzimática foi medida a cada 1 min durante 25 min, em fluorímetro usando placas
escuras multipoços (leitor de placas Fusion, Perkin Elmer). A atividade foi calculada a partir da
diferença na fluorescência dos tempos zero e após 25 min, e foi expressa como unidades de
fluorescência/μg de proteína/min (U/μg de proteína/min). As atividades tripsina e caspase do
proteossomo foram realizadas de forma semelhante à da quimiotripsina. Porém, os substratos
fluorogênicos utilizados foram Ac-Arg-Leu-Arg-AMC para a tripsina e Ac-Nle-Pro-Nle-Asp-
AMC para a caspase, ambos com excitação em 365 nm e emissão em 460 nm. A diluição, o
tempo de incubação e os cálculos foram exatamente os mesmos utilizados para a análise de
quimiotripsina (Kisselev e Goldberg, 2005) e o resultado também foi expresso como unidades de
fluorescência/μg de proteína/min (U/μg de proteína/min).
As atividades das catepsinas lisossomais foram determinadas utilizando o método
fluorogênico descrito por Barrett (1980). Para a catepsina H, foi utilizado o substrato L-arginina-
AMC HCl e para a catepsina H, Z-Phe-Arg-AMC HCl, ambos com excitação em 365 nm e
emissão em 460 nm. As atividades foram avaliadas incubando-se 10 μL do sobrenadante com os
respectivos substratos, em volume total de 100 μL de tampão de ensaio (200 mM KH2PO4/200
mM Na2HPO4, pH 6,8) para catepsina H (38,5 mM) e em volume total de 100 μL de solução Brij
0,1% para a catepsina B (75,4 mM). O aumento na fluorescência foi medida a cada 1 min durante
21
25 min, em fluorímetro para placas escuras multipoços. As atividades foram calculadas a partir
da diferença na fluorescência dos tempos zero e após 25 min, e o resultado foi expresso em
unidades de fluorescência/μg de proteína/min (U/μg de proteína/min).
A calpaína foi avaliada conforme descrita por Jiang et al. (1997), incubando-se 30 μL do
sobrenadante muscular em 150 μL de substrato de reação (imidazol 50 mM, pH 7,5, β-
mercaptoetanol 10 mM, 4 mg de caseína/mL e ázida sódica 1 mM) por 5 min, e posteriormente
adicionando-se 20 μL de CaCl2 50 mM. A leitura foi realizada em leitor de placas multipoços em
filtro de 540 nm. O aumento na absorbância foi medido durante 25 min e a atividade foi
calculada a partir da leitura final e expressa em mili unidades de absorbância/μg de proteína/min
(mU/μg de proteína/min).
Western blotting do sistema proteossômico
Alíquotas (15 µg de proteína/poço) do sobrenadante obtido conforme descrito
anteriormente foram corridas em géis de acrilamida de 12% contendo SDS (Laemmli, 1970),
seguida de western blotting. A eletroforese foi realizada em sistema eletroforético Mighty Small
SE260 (Hoefer-Pharmacia) a 100 V constantes e o marcador molecular (Kaleidoscope, Bio-Rad)
correu paralelo às amostras. Em seguida, as proteínas foram transferidas para membranas de
PVDF 0,45 m (Millipore) (Towbin et al., 1979) em cuba de transferência Mighty Small TE22
(Hoefer-Pharmacia) para a detecção das bandas imunorreativas. Após a transferência, sítios não
específicos na membrana foram bloqueados overnight a 4ºC com 5% de leite desnatado em
solução basal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM e 0,5% Tween 20). As subunidades do
proteossomo foram analisadas com anticorpos contra as subunidades 20S (anti-camundongo
conjugado à horseradish peroxide – HRP), 19S MSSI reguladora de ATPase (anti-coelho
22
conjugado à HRP) e 11S (anti-coelho conjugada à HRP) (todos da Affinity, Newcastle, UK). O
anticorpo anti-actina foi utilizado como controle interno para analisar a quantidade de proteína
aplicada por poço. Todos os anticorpos primários foram diluídos 1:1000 em solução basal
contendo 3% de albumina bovina e foram incubados overnight a 4ºC. Após lavagens em solução
basal, as membranas foram incubadas com um conjugado IgG-peroxidase anti-coelho ou anti-
camundongo, diluído 1:20.000 e 1:30.000, respectivamente, em solução basal. Ao final de 1,5 h a
4ºC, as membranas foram lavadas e as bandas imunorreativas foram detectadas utilizando um kit
de quimioluminescência (Millipore, USA) e documentadas em filme fotográfico (Kodak, São
José dos Campos, SP, Brasil). As imagens foram capturadas (OfficeJet G85, Hewlett Packard) e
analisadas por densitometria óptica da banda utilizando-se o software UN-SCAN-IT gel 6.1 (Gel
& Graph Digitizing Software, Version 6.1, Silk Scientific Corporation, UT, EUA).
Tratamento com inibidor proteossômico
Nestes experimentos, a peçonha de B. jararacussu (75 μg) foi injetada no músculo
gastrocnêmico esquerdo (i.m.) e no quinto dia e no sexto dia após o envenenamento foi injetado o
inibidor protessômico MG-132 (10 μg/g de peso corporal, i.p., em 150 L) (Holecek et al., 2006)
ou o mesmo volume de veículo (DMSO). O inibidor MG-132 foi dissolvido em DMSO
(dimetilsulfóxido) na proporção de 2 μg MG-132/μL de DMSO. No sétimo dia após a injeção da
peçonha, os camundongos foram sacrificados e os músculos gastrocnêmio esquerdo (tratado)
foram retirados e congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80ºC ou processados para
histologia para análises posteriores. (Esse protocolo de tratamento foi utilizado devido à ativação
proteossômica ter ocorrido somente na fase tardia de pós-envenenamento; ver resultados). Os
grupos experimentais utilizados foram (n=6 para cada grupo): controle (injetados i.m. com PBS),
23
controle + veículo (injetados i.m. com PBS e i.p. com veículo), peçonha (injetados i.m. com
peçonha), peçonha + veículo (injetados i.m. com peçonha e i.p. com veículo) e peçonha +
inibidor (injetados i.m. com peçonha e i.p. com inibidor).
Para a análise enzimática, os músculos foram homogeneizados, centrifugados e o
sobrenadante foi utilizado para determinação da atividade quimiotripsina proteossômica da
mesma forma descrita anteriormente. Para a análise histológica, os músculos também foram
processados para microscopia de luz conforme já descrito. Para a análise histológica
morfométrica nos grupos deste experimento, foram analisadas duas lâminas (cortes não
sucessivos) coradas com hematoxilina-eosina para cada camundongo. Cada lâmina continha três
cortes sucessivos de tecido muscular, sendo analisados nove campos escolhidos aleatoriamente,
totalizando dezoito campos para cada animal. A análise foi feita em cortes transversais contando
o número de células regenerativas em relação ao número total de células por campo, e o valor foi
expresso em porcentagem. As lâminas coradas com vermelho de picrosirius foram analisadas
apenas qualitativamente.
Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). As
comparações estatísticas foram feitas usando análise de variância (ANOVA) de uma via (Zar,
1996) seguido do teste de Dunnett para comparação dos grupos com seu respectivo controle ou
teste de Tukey para comparação entre grupos, através do software Prism, v. 4.0 (GraphPad Inc.,
San Diego, CA, EUA). Um valor de p<0,05 foi considerado significativo.
24
RESULTADOS
Apresentamos os resultados deste trabalho na seguinte ordem: (1) Caracterização
histológica e bioquímica do envenenamento experimental com a peçonha de B. jararacussu, (2)
Atividade e expressão do sistema proteossômico, e o tratamento com o inibidor proteossômico e
(3) Atividades proteolíticas do lisossomo (catepsinas) e da protease dependente de cálcio
(calpaína).
1. Caracterização do envenenamento experimental com a peçonha de B. jararacussu
As doses de 25 g e 75 g da peçonha B. jararacussu utilizadas neste estudo foram
semelhantes ao estudo de Queiroz et al. (1984).
1.1. Creatina quinase (CK)
A Figura 2 mostra a atividade de CK (indicador de lesão muscular) de camundongos
injetados com 25 g e 75 g de peçonha de B. jararacussu no músculo gastrocnêmio. Níveis
plasmáticos elevados de CK foram observados entre 1 h e 6 h após o envenenamento, com o pico
em 3 h, sendo as alterações mais marcantes com a dose maior de peçonha.
1.2. Peso dos músculos
A Figura 3 mostra a variação do peso úmido dos músculos injetados com peçonha. Nas
primeiras 48 h após o envenenamento (fase de dano tecidual, quando ocorre edema) houve
aumento variável no peso dos músculos enquanto que na fase tardia (regeneração, sete dias para
frente) houve redução na massa muscular que foi mais marcante com a dose de 75 g.
25
1.3. Concentração de aminoácidos livres nos músculos
A Figura 4 mostra a concentração de aminoácidos livres em músculos gastrocnêmio de
camundongos após injeção da peçonha nas doses de 25 µg e 75 µg. Houve redução significativa
dos aminoácidos livres nos músculos injetados com peçonha nas primeiras horas pós-
envenenamento (primeiras 24 horas), sendo essa redução mais marcante na dose maior. Nos
períodos tardios (sete dias para frente), houve restabelecimento da concentração de aminoácidos
nos músculos injetados.
26
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
1000
2000
3000
4000
500025 g peçonha
75 g peçonha
*
*
**
*
*
Tempo
Ativ
idad
e C
K (
U/L
)
Figura 2. Atividade de CK em plasma de camundongos tratados com 25 μg e 75 μg da peçonha
de B. jararacussu. Os níveis de CK na circulação foram determinados a partir de kits comerciais.
Os resultados foram expressos em unidade de CK/L (U/L), em que uma unidade corresponde à
fosforilação de 1 nmol de creatina por minuto, a 37ºC. Os pontos representam a média EPM
(n=6). *p<0,05 comparado com o controle (C, injetado somente com PBS 50 mM, pH 7,4)
(ANOVA seguida pelo teste de Dunnett).
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
50
100
150
* *
A
Tempo
% d
e m
udança d
e p
eso
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
50
100
150 *
*
B
Tempo
% d
e m
udança d
e p
eso
* *
** *
Figura 3. Variação do peso em músculo gastrocnêmio de camundongos injetado com 25 g (A) e
75 g (B) da peçonha de B. jararacussu. A variação do peso (%) foi expressa em relação ao peso
do músculo contralateral (não injetado), considerado como 100%. As colunas representam a
média ± EPM (n=12). *p<0,05 comparado com o controle (C, injetado com PBS 50 mM pH, 7,4)
(ANOVA seguida pelo teste de Dunnett).
27
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Músculo injetado
Músculocontralateral
A
* *
Tempo
Concentr
ação d
e a
min
oácid
os li
vre
s
(m
ol a
a/
g d
e p
rote
ina)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
*
Músculo injetado
Músculocontralateral
B
* * * * *
Tempo
Concentr
ação d
e a
min
oácid
os liv
res
(m
ol aa/
g d
e p
rote
ina)
Figura 4: Concentração de aminoácidos livres (aa) em músculo gastrocnêmio de camundongos
em diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B. jararacussu. A
concentração de aminoácidos foi determinada pelo método de Copley (1941) utilizando-se um
padrão contendo 100 nmol de glicina. Os resultados foram expressos em µmol aa/µg de proteína.
As colunas representam a média EPM (n=6). *p<0,05 comparado com o controle (C, injetado
com PBS 50 mM pH, 7,4) (ANOVA seguida pelo teste de Dunnett).
28
1.4. Perfil de dano e regeneração muscular (histologia)
1.4.1. Coloração com Hematoxilina-eosina
A Figura 5(A-U) mostra as alterações histológicas que ocorreram no músculo
gastrocnêmio de camundongo após a injeção da peçonha de B. jararacussu, nas doses de 25 μg e
75 μg. Os músculos controle (injetados com PBS 50 mM, pH 7,4) apresentaram um padrão
histológico típico de músculo esquelético normal, ou seja, sem nenhum sinal de alteração nas
fibras musculares. Os núcleos das fibras estavam localizados na periferia dessas células (Fig.
5A,B,P,R).
Nos músculos injetados com peçonha, foi possível distinguir três fases características de
alterações histológicas. A fase 1 compreendeu os períodos 1, 3 e 6 h na dose de 25 µg (Fig. 5C,E)
e 1, 3, 6 e 12 h na dose de 75 µg (Fig. 5D,F) e foi caracterizada principalmente por hemorragia
acentuada e mionecrose (lesões delta, hipercontração dos filamentos alternando com espaços
celulares desprovidos de miofibrilas, fibras com vacúolos e sem núcleo) (para mionecrose vide
Fig. 5C-F e Q). Algumas áreas apresentaram infiltrados inflamatórios localizados.
A fase 2 incluiu os períodos 12, 24, 48 e 72 h na dose menor (Fig. 5G,I) e 24, 48 e 72 h na
dose maior (Fig. 5H,J) e foi caracterizada principalmente pela presença de infiltrado inflamatório,
mioblastos e miotubos (Fig. 5G-J). Devido à grande quantidade de núcleos desses tipos celulares,
o tecido muscular adquiriu aspecto basófilo (principalmente em 72 h) (Fig. 5I,J). Havia ainda a
presença de hemorragia e de lesões mionecróticas.
A fase 3 compreendeu os períodos de 7, 14, 21 e 28 dias em ambas as doses (Fig. 5L,N
para a dose de 25 g e Fig. 5M,O para a dose de 75 g) e foi caracterizada principalmente por
células regenerativas (núcleo centralmente localizado) (Fig. 5S). A primeira semana (7 dias)
dessa fase continuou marcada pela presença de infiltrado celular, mioblastos e miotubos e
29
porções localizadas de células regenerativas (Fig. 5L,M). Nas outras semanas (14, 21 e 28 dias),
predominaram principalmente as células regenerativas (Fig. 5N,O) (para aspectos regenerativos
vide Fig. 5L-O e S).
No músculo contralateral (não injetado com peçonha) houve presença de infiltrado
inflamatório nos seguintes períodos pós-envenenamento: 12, 24, 48 e 72 horas e 7, 14, 21 e 28
dias (dose de 25 μg) e 48 e 72 horas e 7, 14, 21 e 28 dias (dose de 75 μg) (Fig. 5T,U).
1.4.2. Coloração com Vermelho de picrosirius
A figura 6 mostra as alterações na deposição de colágeno em secções de músculo coradas
com vermelho de picrosirius (corante usado para detectar colágeno). Os músculos controle
(injetados com PBS 50 mM, pH 7,4) apresentaram fibras de colágeno no endomísio, perimísio e
epimísio. No epimísio e perimísio, as fibras de colágeno encontravam-se mais abundantes,
tornando o tecido conjuntivo espesso e contínuo. Ao redor das fibras musculares (endomísio), o
colágeno apresentou-se fino (Fig. 6A,B). Nas primeiras horas após a injeção da peçonha (1 e 3 h)
não foi possível detectar alteração na quantidade de colágeno, porém entre 6 e 12 h
principalmente, alguns feixes de colágeno pareciam estar mais finos em algumas porções (Fig.
6C,D). A partir de 24 h pós-envenenamento, iniciou-se um processo de deposição do colágeno no
músculo envenenado, sendo que essa produção foi mais marcante no período de 28 dias (Fig.
6E,F). A figura 7 mostra detalhadamente o processo de deposição das fibras de colágenos que
envolveram primeiramente o infiltrado celular (Fig. 7A,B) e posteriormente as células
regenerativas (Fig. 7C,D). Nesta coloração, foram avaliadas apenas as alterações causadas pela
dose de 75 g.
30
Figura 5. Aspecto histológico de secção transversal de músculo gastrocnêmio controle de camundongo (injetado com PBS
50 mM, pH 7,4). Coloração: Hematoxilina-eosina (HE).
31
Figura 5. Aspecto histológico de secção de músculo gastrocnêmio de camundongo na fase 1 após injeção da peçonha de
B. jararacussu, nas doses de 25 µg (C,E) e 75 µg (D,F). Setas – hemorragia, m – mionecrose. Fase 1 compreende os períodos
de 1-6 h (25 µg) e 1-12 h (75 µg). Coloração: Hematoxilina-eosina (HE).
32
Figura 5. Aspecto histológico de secção de músculo gastrocnêmio de camundongo na fase 2 após injeção da peçonha de
B. jararacussu, nas doses de 25 µg (G,I) e 75 µg (H,J). Seta preta – infiltrado inflamatório, seta vermelha - miotubos.
Fase 2 compreende os períodos de 12- 72 h (25 µg) e 24- 72 h (75 µg). Coloração: Hematoxilina-eosina (HE).
33
Figura 5. Aspecto histológico de secção de músculo gastrocnêmio de camundongo na fase 3 após injeção da peçonha de B.
jararacussu, nas doses de 25 µg (L,N) e 75 µg (M,O). Setas – infiltrado inflamatório, r – células regenerativas (núcleo
centralizado). Fase 3 compreende os períodos de 7-28 dias em ambas as doses. Coloração: Hematoxilina-eosina (HE).
34
Figura 5. Aspecto histológico de secção transversal de músculo controle (P e R) e injetado com peçonha de B. jararacussu (75 µg)
(Q e S). Note lesões delta (indicado por D), infiltrado celular (indicado por seta vermelha), hemorragia (indicado por seta preta) e
células regenerativas (indicado por r). Coloração: Hematoxilina-eosina (HE).
35
Figura 5. Aspecto histológico de secção transversal de músculo controle (T) e músculo contralateral 72 horas após a injeção da
peçonha de B. jararacussu (75 µg) (U) mostrando a presença de infiltrado inflamatório (indicado por setas). Coloração:
Hematoxilina-eosina (HE).
36
Figura 6. Aspecto histológico de secção de músculo gastrocnêmio injetado com 75 µg da
peçonha de B. jararacussu e corado com vermelho de picrosirius (para detecção de colágeno). A
e B mostram o colágeno no músculo controle, C e D mostram o colágeno entre 6 e 12 h após o
envenenamento, e E e F mostram o colágeno no período de regeneração muscular (7-28 dias pós-
envenenamento). c = colágeno. A,C,E – luz normal, B,D,F – luz polarizada.
37
Figura 7. Deposição do colágeno em músculo gastrocnêmio injetado com peçonha de B. jararacussu (75 µg). A e B: ocorrência do
colágeno (seta) próximo ao infiltrado inflamatório (24 h a 72 h). C e D: presença do colágeno (c) ao redor das células regenerativas
(r), a partir do sétimo dia. Luz normal em todos os painéis. Coloração: Vermelho de picrosirius.
38
2. Sistema proteossômico
2.1. Atividade e expressão do proteossomo
O proteossomo, que é a principal via catabólica de mamíferos, foi analisado nas suas
atividades proteolíticas constituintes (quimiotripsina, caspase e tripsina) (Figs. 8-10) e também na
expressão das subunidades que compõem o proteossomo (20Sα, 11S e 19S) (Figs. 11-13). Nas
duas doses de peçonha aplicada, as atividades proteossomais exibiram o mesmo perfil: inibição
nas primeiras 48 h pós-envenenamento e depois disso a atividade se restabeleceu, alcançando em
alguns períodos aumento significativo. Esses períodos em que houve aumento significativo
foram: 7, 14, 21 e 28 dias na dose menor e 7, 14 e 21 dias na dose maior (Figs. 8-10).
A subunidade 20Sα proteossômica (duas bandas de 29 kDa e 32 kDa) encontrou-se
significativamente mais expressa em 7 dias na dose de 25 μg e em 7 e 14 dias na dose de 75 μg
(Fig. 11). A subunidade 11S proteossômica (banda única de 30 kDa) apresentou-se
significativamente mais expressa no período de 72 h a 14 dias na dose de 75 μg, enquanto na
dose menor não houve diferenças significativas em relação ao controle (Fig. 12). A subunidade
19S (banda única de 46 kDa) não apresentou diferença significativa em relação ao controle,
embora se verifique, na dose de 75 μg, uma tendência de aumento da expressão dessa banda no
período de regeneração (principalmente 7 e 14 dias) (Fig. 13). A proteína actina, que foi
analisada para controle da quantidade de proteína por poço, não apresentou diferença
significativa em relação ao controle, embora também se verifique uma tendência de diminuição
(no dano tecidual) e posterior elevação (na regeneração) na dose maior da peçonha aplicada (Fig.
14).
39
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
1
2
3
4
5
6
7
**
* * **
*
Músculo injetado
Músculocontralateral
A
*
Tempo
Ativid
ad
e q
uim
iotr
ipsin
a
(U/
g d
e p
rote
ína
/min
)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
1
2
3
4
5
6
7
* ** * * *
Músculo injetado
Músculocontralateral
B
Tempo
Ativid
ad
e q
uim
iotr
ipsin
a
(U/
g d
e p
rote
ína
/min
)
**
Figura 8. Atividade quimiotripsina proteossômica em músculo gastrocnêmio de camundongos
em diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B. jararacussu. A
atividade da quimiotripsina foi determinada utilizando substrato fluorogênico e expressa em
unidades de fluorescência/μg de proteína/min (U/μg de proteína/min). As colunas representam a
média EPM (n=6). *p<0,05 comparado com os respectivos controles (ANOVA seguida pelo
teste de Dunnett).
40
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.0
0.2
0.4
0.6
0.8* *
A
*
* *
Tempo
Ativid
ade c
aspase
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
* * * *
*
B
Tempo
Ativid
ade c
aspase
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
Figura 9. Atividade caspase proteossômica em músculo gastrocnêmio de camundongos em
diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B. jararacussu. A
atividade da caspase foi determinada utilizando substrato fluorogênico e expressa em unidades de
fluorescência/μg de proteína/min (U/μg de proteína/min). As colunas representam a média
EPM (n=6). *p<0,05 comparado com o controle (C, injetado com PBS 50 mM pH, 7,4) (ANOVA
seguida pelo teste de Dunnett).
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
* * **
*
**
A
Tempo
Ativid
ade t
ripsin
a
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
* * ** *
* *
B
Tempo
Ativid
ade t
ripsin
a
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
Figura 10. Atividade tripsina proteossômica em músculo gastrocnêmio de camundongos em
diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B. jararacussu. A
atividade da tripsina foi determinada utilizando substrato fluorogênico e expressa em unidades de
fluorescência/μg de proteína/min (U/μg de proteína/min). As colunas representam a média
EPM (n=6). *p<0,05 comparado com o controle (C, injetado com PBS 50 mM pH, 7,4) (ANOVA
seguida pelo teste de Dunnett).
41
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
3
6
9
12
15
*
A
Tempo
Expre
ssão 2
0S
(% p
ixel)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
3
6
9
12
15* *
B
Tempo
Expre
ssão 2
0S
(% p
ixel)
Figura 11. Expressão da subunidade 20Sα proteossômica em músculo gastrocnêmio de
camundongos em diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B.
jararacussu. Os painéis superiores mostram as bandas da subunidade 20S e os painéis inferiores
mostram a densitometria das bandas expressa em % pixel (unidade arbitrária de expressão). As
colunas representam a média EPM (n=5). *p<0,05 comparado com o controle (C, injetado com
PBS 50 mM pH, 7,4) (ANOVA seguida pelo teste de Dunnett).
C 1 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
2
4
6
8
10
12
14
A
Tempo
Expre
ssão 1
1S
(% p
ixel)
C 1 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
2
4
6
8
10
12
14
**
*
B
Tempo
Expre
ssão 1
1S
(% p
ixel)
Figura 12. Expressão da subunidade 11S proteossômica em músculo gastrocnêmio de
camundongos em diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B.
jararacussu. Os painéis superiores mostram as bandas da subunidade 11S e os painéis inferiores
mostram a densitometria das bandas expressa em % pixel (unidade arbitrária de expressão). As
colunas representam a média EPM (n=5). *p<0,05 comparado com o controle (C, injetado com
PBS 50 mM pH, 7,4) (ANOVA seguida pelo teste de Dunnett).
42
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
5
10
15
20
A
Tempo
Expre
ssão 1
9S
(% p
ixel)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
5
10
15
20
B
Tempo
Expre
ssão 1
9S
(% p
ixel)
Figura 13. Expressão da subunidade 19S reguladora de ATPase proteossômica em músculo
gastrocnêmio de camundongos em diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da
peçonha de B. jararacussu. Os painéis superiores mostram as bandas da subunidade 19S e os
painéis inferiores mostram a densitometria das bandas expressa em % pixel (unidade arbitrária de
expressão). As colunas representam a média EPM (n=5).
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
3
6
9
12
15
A
Tempo
Expre
ssão a
ctina
(% p
ixel)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0
3
6
9
12
15
B
Tempo
Expre
ssão a
ctina
(% p
ixel)
Figura 14. Expressão da α-actina em músculo gastrocnêmio de camundongos em diferentes
períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B. jararacussu. Os painéis
superiores mostram as bandas da actina e os painéis inferiores mostram a densitometria das
bandas detectadas em % pixel (unidade arbitrária de expressão). As colunas representam a média
EPM (n=5).
43
A C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d
B C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d
Figura 15: Western blotting das subunidades 20Sα, 19S e 11S do proteossomo e da α-actina em
músculo gastrocnêmio de camundongos em diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75
μg (B) da peçonha de B. jararacussu. A seqüência horizontal das bandas representa os intervalos
de pós-envenenamento, conforme indicado no topo de cada painel.
2.2. Tratamento com inibidor proteossômico (atividade e histologia)
Tendo em vista o perfil apresentado pela atividade proteossômica (ativada somente na
fase tardia pós-envenenamento), utilizamos um protocolo de tratamento com o inibidor em que
tentamos inibir o aumento da atividade proteossômica no 7º dia após o envenenamento, período
considerado crítico no que se refere às modificações histológicas e bioquímicas. A escolha da
44
dose de inibição e a via de administração (10 μg/g de peso corporal, i.p.) baseou-se na literatura
(Holecek et al., 2006) e em testes piloto.
A atividade quimiotripsina proteossômica do músculo envenenado apresentou-se
significativamente diminuída após o tratamento com o inibidor proteossômico MG-132 quando
comparado ao grupo controle e ao grupo que recebeu somente a peçonha. Entretanto,
considerando que a redução observada foi semelhante àquela obtida no grupo controle + veículo,
parece que o inibidor não teve efeito significativo neste experimento (Fig. 16). De modo
semelhante, na análise histológica morfométrica os camundongos tratados com inibidor
mostraram redução na porcentagem de células regenerativas, porém uma redução igual também
foi observada no grupo peçonha + veículo, sugerindo mais uma vez que a diminuição ocorreu
pela ação do veículo (DMSO) (Figs. 16 e 18). Através da análise histológica qualitativa das
lâminas coradas com vermelho de picrosirius, foi observado que os grupos peçonha + veículo e
peçonha + inibidor apresentaram aumento na deposição do colágeno (Fig. 19), reforçando
novamente o efeito do veículo (DMSO) na regeneração muscular. A redução no peso dos
músculos observada nos camundongos tratados com peçonha não foi alterada pelo veículo ou
pelo inibidor (Fig. 17).
O MG-132 tem sido utilizado em diversos estudos tanto in vitro como in vivo, pela sua
potência e especificidade (Kisselev and Goldberg, 2001; Bonuccelli et al., 2003; Elliott et al.,
2003, Holecek et al., 2006). Por causa da interferência do DMSO, foram testados outros veículos
(PBS, Tris, azeite de oliva, Nujol®, -hidróxi- -ciclodextrina) para dissolver o inibidor
proteossômico MG-132, porém sem sucesso, pois o inibidor precipitava. Essas observações
indicam que para avaliar o papel do proteossomo na regeneração há necessidade de usar
inibidores com melhor solubilidade.
45
C C +Veic Peç Peç + Veic Peç + Inib0
1
2
3
4
5
*
A
Tratamento
Ativid
ade q
uim
iotr
ipsin
a
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
C C + Veic Peç Peç + Veic Peç + Inib0
15
30
45
60
75
B
**
Tratamento
% c
élu
las r
egenera
tivas
Figura 16. Efeito do tratamento com o inibidor proteossômico MG-132 na atividade da
quimiotripsina proteossômica (A) e na análise histológica morfométrica (B) de músculo
gastrocnêmio injetado com a peçonha de B. jararacussu (75 μg) ou PBS. O inibidor MG-132 (10
μg/g de peso corporal) ou o veículo (DMSO) foi aplicado i.p. no quinto e no sexto dia após a
injeção de peçonha (ou PBS) e no sétimo dia os camundongos foram sacrificados. A análise
histológica morfométrica foi feita contando o número de células regenerativas em relação ao
número total de células por campo (dezoito campos/camundongo) e o resultado foi expresso em
porcentagem. As colunas representam a média ± EPM (n=6). *p<0,05 comparado com o controle
(C) e com a peçonha (Peç.) (painel A) e *p<0,05 comparado com o controle (C), controle +
veículo (C + Veic.) e com peçonha (Peç.) (painel B) (ANOVA seguida pelo teste de Tukey).
C C+Veic Peç Peç + Veic Peç + Inib0
25
50
75
100
125
** *
Tratamento
% m
udança d
e p
eso
Figura 17. Variação do peso muscular no tratamento com o inibidor proteossômico MG-132 de
músculo injetado com a peçonha de B. jararacussu (75 μg) ou PBS. A variação de peso (%) foi
expressa em relação ao peso do músculo contralateral considerado como 100%. As colunas
representam a média ± EPM (n=6). *p<0,05 comparado com o controle (C) e controle + veículo
(C + Veic.) (ANOVA seguida pelo teste de Tukey).
46
Figura 18. Aspecto histológico de músculo tratado com o inibidor proteossômico MG-132. (A) Controle: camundongos que
receberam PBS i.m. e veículo i.p., (B) músculo tratado com peçonha (75 μg), (C) peçonha + veículo, (D) peçonha + inibidor
proteossômico. r – células regenerativas. Coloração: Hematoxilina-eosina.
47
Figura 19. Aspecto histológico de músculo tratado com o inibidor proteossômico MG-132. (A) Controle: camundongos que
receberam PBS i.m. e veículo i.p., (B) músculo tratado com peçonha (75 μg), (C) peçonha + veículo, (D) peçonha + inibidor
proteossômico. c – colágeno. Coloração: Vermelho de picrosirius.
48
3. Proteases lisossomais e protease dependente de cálcio
3.1. Atividade das catepsinas (via lisossomal) e da calpaína (protease dependente de cálcio)
Outras vias representativas do catabolismo proteíco também foram analisadas neste
trabalho. As atividades das enzimas calpaína, catepsina B e catepsina H do músculo gastrocnêmio
tratado com 25 μg e 75 μg da peçonha de B. jararacussu estão representadas, respectivamente,
nas figuras 20 a 22.
Nos períodos iniciais (1, 3 e 6 h) após a injeção intramuscular da peçonha de B.
jararacussu, a única via ativada significativamente foi da protease dependente de cálcio
(calpaína) e somente na dose de 75 μg (Fig. 20). Nos períodos iniciais pós-envenenamento, as
catepsinas lisossomais não estavam ativadas e na dose maior principalmente, a catepsina H
apresentou-se inibida (Figs. 21 e 22).
Nas duas doses da peçonha, houve uma expressiva ativação das catepsinas B e H nos
períodos mais tardios de pós-envenenamento (48 h até 28 dias) (Fig. 21 e 22). Nos períodos de
ativação, a atividade da catepsina B mostrou-se duas vezes menor na dose de 75 μg em relação à
de 25 μg e o início da ativação ocorreu mais precocemente na dose menor (início da ativação em
48 h na dose menor e em 72 h na dose maior). Além disso, verificou-se certa ativação da
catepsina B nos músculos contralaterais na dose de 75 μg anteriormente à ativação do músculo
tratado (Fig. 21). Nos períodos de ativação, a atividade da catepsina H aumentou 1,5 vezes na
dose de 75 μg em relação à de 25 μg, sendo que o início da ativação também foi mais precoce na
dose menor (início da ativação em 72 h na dose menor e em 7 dias na dose maior). Na dose de 75
μg, a atividade da catepsina H apresentou-se inibida nas primeiras 48 h pós-envenenamento.
Adicionalmente, verificou-se certa ativação da catepsina H nos músculos contralaterais
anteriormente à ativação do músculo tratado, nas duas doses aplicadas (Fig. 22). Em todas as
49
atividades proteolíticas analisadas, os músculos contralaterais dos animais controle e os músculos
controle injetados com PBS não apresentaram diferenças significativas (Figs. 20-22).
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
* **
Músculo injetado
Músculocontralateral
A
Tempo
Ativid
ade c
alp
aín
a
(mU
/g d
e p
rote
ína/m
in)
*
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
**
*
* *
Músculo injetado
Músculocontralateral
B
* * *
Tempo
Ativid
ade c
alp
aín
a
(mU
/g d
e p
rote
ína/m
in)
Figura 20. Atividade da calpaína em músculo gastrocnêmio de camundongos em diferentes
períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B. jararacussu. A atividade da
calpaína foi expressa em miliunidades de absorbância/μg de proteína/min (mU/μg de
proteína/min). As colunas representam a média EPM (n=6). *p<0,05 comparado com os
respectivos controles (ANOVA seguida pelo teste de Dunnett).
50
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Músculo injetado
Músculocontralateral*
**
*
A
* * *
Tempo
Ativid
ade c
ate
psin
a B
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Músculo injetado
Músculocontralateral
* **
**
B
Tempo
Ativid
ade c
ate
psin
a B
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
****
*
Figura 21. Atividade da catepsina B lisossomal em músculo gastrocnêmio de camundongos em
diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B. jararacussu. A
atividade da catepsina B foi determinada utilizando substrato fluorogênico e expressa em
unidades de fluorescência/μg de proteína/min (U/μg de proteína/min). As colunas representam a
média EPM (n=6). *p<0,05 comparado com os respectivos controles (ANOVA seguida pelo
teste de Dunnett).
51
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
*
* * * * *
Músculo injetado
Músculocontralateral
A
* * * * * * * *
Tempo
Ativid
ade c
ate
psin
a H
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
C 1h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 7d 14d 21d 28d0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
* *
* ** *
Músculo injetado
Músculocontralateral
** * *
B
* *
** * *
Tempo
Ativid
ade c
ate
psin
a H
(U/
g d
e p
rote
ína/m
in)
Figura 22. Atividade da catepsina H lisossomal em músculo gastrocnêmio de camundongos em
diferentes períodos após a injeção de 25 μg (A) e 75 μg (B) da peçonha de B. jararacussu. A
atividade da catepsina H foi determinada utilizando substrato fluorogênico e expressa em
unidades de fluorescência/μg de proteína/min (U/μg de proteína/min). As colunas representam a
média EPM (n=6). *p<0,05 comparado com os respectivos controles (ANOVA seguida pelo
teste de Dunnett).
52
DISCUSSÃO
O envenenamento por B. jararacussu é caracterizado por perda de massa muscular com
conseqüente deficiência funcional muscular (atrofia muscular) (Queiróz et al., 1984; Ribeiro e
Jorge, 1990; Milani et al., 1997; Ribeiro e Jorge, 1997; Jorge et al., 1999; Queiróz et al., 2002; da
Silva et al., 2003; Santo Neto et al., 2004). Embora diversos mecanismos tenham sido sugeridos
para explicar essa perda muscular, a causa exata ainda não foi estabelecida (Santo Neto et al.,
2004).
Em nossas condições experimentais, foi verificada diminuição no peso dos músculos
gastrocnêmio no período de regeneração (7-28 dias), sendo isso mais acentuado na dose maior da
peçonha injetada. Esses resultados, juntamente com as observações macroscópicas neste período
(musculatura reduzida e frágil), apontam para a perda de tecido muscular funcional. Apesar da
porcentagem de peso muscular não diferenciar tecido funcional de tecido fibroso e adiposo, ou
seja, não caracterizar a regeneração de maneira tão precisa como técnicas histológicas, é um
instrumento útil para verificar alterações na massa total do músculo (Gutiérrez et al., 1986b).
Por outro lado, a enzima creatina quinase (CK), que é abundante no citosol de fibras
musculares esqueléticas, é um indicador da lesão muscular do ponto de vista bioquímico. Após o
envenenamento, a membrana plasmática das fibras afetadas perde a capacidade de reter essa
enzima, liberando-a para a circulação sanguínea (Gutiérrez et al., 1991). O perfil da atividade
sérica de CK visto aqui, com pico em 3 h, está de acordo com outros estudos de peçonhas
botrópicas (Gutiérrez et al., 1991, 1995; Costa et al., 1999; Elias et al., 2002) e confirmou a
ocorrência de lesão na fibra muscular.
A análise histológica qualitativa neste estudo mostrou que a hemorragia e a mionecrose
são os eventos iniciais após a injeção da peçonha (Fase 1), devido provavelmente à ação direta de
53
componentes da peçonha sobre a microvasculatura e sobre as fibras musculares, respectivamente.
As primeiras alterações observadas como indícios de mionecrose foram as lesões delta (espaços
triangulares nas fibras transversais, com a base do triângulo na membrana plasmática) seguida de
hipercontração dos filamentos (talvez em decorrência do rápido e incontrolado influxo de cálcio)
(Ownby e Colberg, 1988; Gutiérrez et al., 1991). Respostas semelhantes a essas já foram
descritas por outros autores (Queiróz et al., 1984; Gutiérrez et al., 1991; Gutérrez e Lomonte,
1995). Nas primeiras horas (1, 3 e 6 h), a hemorragia foi acentuada devido ao extenso dano que
essa peçonha provoca na microvasculatura local, mediante principalmente metaloproteinases
hemorrágicas (Queiróz et al., 1984; Gutiérrez et al., 1991; Santo Neto et al., 2004; Santo Neto e
Marques, 2005).
Na Fase 2, houve uma intensa reação inflamatória (na dose de 25 µg a partir de 12 h e na
de 75 µg a partir de 24 h) sendo de suma importância para a retirada do material necrosado
(Gutiérrez et al., 1991). Diversos autores destacam a presença de leucócitos polimorfonucleados
(principalmente neutrófilos) e posteriormente de macrófagos (Gutiérrez et al., 1984a, c; Gutiérrez
et al., 1990; Teibler et al., 2001; Teixeira et al., 2003b; Tidball, 2005). Gutiérrez e colaboradores
(1995) observaram massas de miofilamentos nos fagossomos dos macrófagos. Neutrófilos e
macrófagos são importantes para a regeneração muscular pois retiram o tecido necrótico que é
um pré-requisito para que ocorra regeneração e também liberam fatores miogênicos necessários
para a ativação das células satélites (Teibler et al., 2001; Teixeira et al., 2003b). Os mioblastos e
os miotubos encontrados nesta fase possuem a função de promover a miogênese e iniciar a
regeneração muscular (Godinho, 2006). A partir do sétimo dia (Fase 3), em ambas as doses, foi
possível observar a presença de células com o núcleo localizado centralmente, aspecto típico de
células regenerativas. Em todas as considerações citadas acima, o nosso modelo experimental de
envenenamento apresentou alterações histológicas e bioquímicas compatíveis com outros estudos
54
com peçonhas botrópicas (Queiróz et al., 1984; Gutiérrez et al., 1991; Gutiérrez e Lomonte,
2003). Segundo Queiroz et al. (1984), a regeneração muscular depende da dose aplicada e, nos
nossos experimentos verificamos alterações teciduais mais marcantes com a dose de 75 µg da
peçonha, principalmente no que se refere a maior extensão da hemorragia e necrose, o que
poderia, de fato, prejudicar a regeneração (Gutiérrez et al., 1991; Santo Neto et al., 2004; Santo
Neto e Marques, 2005).
Neste estudo, também avaliamos as alterações nas fibras de colágeno nos músculos
tratados com 75 µg da peçonha de B. jararacussu, através da coloração com vermelho de
picrosirius. As alterações mais importantes no colágeno de músculos envenenados foram
observadas a partir de 24 h, quando se iniciou uma deposição dessa proteína próxima ao
infiltrado inflamatório (24 h a 72 h). É possível que essa deposição de colágeno esteja
relacionada à proliferação e ativação dos fibroblastos que são responsáveis pela biossíntese de
colágeno (Gutiérrez et al., 1984b; Teibler et al., 2001). O aumento expressivo na deposição de
colágeno a partir do sétimo dia pós-envenenamento provavelmente ocorreu devido à regeneração
parcial ocasionada pela peçonha e caracterizada pela presença de áreas com tecido fibroso, com
abundância de colágeno (Queiroz et al., 1984; Gutiérrez et al., 1985; Teibler et al., 2001). A
peçonha de B. jararacussu diminui o diâmetro de células regenerativas (Teibler et al., 2001), o
que poderia explicar a deposição de colágeno ao redor das células regenerativas, em uma
tentativa de reposição do tecido muscular, com conseqüente redução de sua capacidade funcional.
Pouco se sabe sobre a ativação de vias catabólicas endógenas que podem comprometer ou
beneficiar a lesão tecidual ou a regeneração completa do tecido. Diversas condições catabólicas
(septicemia, jejum, traumas, câncer e distrofias) têm como conseqüência o desgaste muscular
através do aumento excessivo da degradação de proteínas intracelulares (Jepton et al., 1986;
Hasselgren et al., 1986, 1989; Tiao et al., 1994; Voisin et al., 1996; Costelli e Baccino, 2003;
55
Costelli et al., 2005). A estimulação das vias catabólicas lisossomal, proteossomal e das proteases
neutras dependentes de cálcio parecem prevalecer de diferentes maneiras nesses modelos de
desgaste (Wing e Goldberg, 1993; Combaret et al., 1996; Voisin et al., 1996). Entretanto, há
fortes evidências que a via proteolítica ubiquitina-proteossomo é a principal via responsável pela
degradação de proteínas intracelulares em mamíferos, incluindo as proteínas musculares de longa
vida, como a actina e a miosina (Furuno et al., 1990; Tiao et al., 1994; Attaix et al., 1998;
Hasselgren et al., 2002; Wyke et al., 2004; Tisdale 2005; Grillari et al., 2006), que representam
80% do total de proteínas musculares (Taillandier et al., 1996).
Ao investigar a atividade e expressão do proteossomo no envenenamento botrópico, nossa
hipótese inicial era de que a ativação desse sistema na fase crítica (aguda) de dano tecidual
pudesse contribuir para a perda de massa muscular observada no envenenamento botrópico. Essa
hipótese inicial baseou-se no fato de que a peçonha botrópica possui a capacidade de ativar
MMPs endógenas que degradam componentes da matriz extracelular, exacerbando o dano
tecidual (Saravia-Otten et al., 2004). Da mesma forma que a matriz extracelular sofre degradação
proteolítica durante o envenenamento, esse mesmo efeito é verificado nas fibras musculares.
Caso fosse comprovado o envolvimento do proteossomo, o uso clínico de inibidores dessa via
poderia contribuir no tratamento local do envenenamento botrópico, já que atualmente esses
inibidores estão sendo utilizados para o tratamento de diversas condições em que há uma
degradação excessiva de proteínas intracelulares (Kisselev e Goldberg, 2001; Bonuccelli et al.,
2003).
Entretanto, conforme demonstrado, as atividades proteossomais (caspase, tripsina e
quimiotripsina) apresentaram inibição no período de dano agudo (até 48 h após o
envenenamento) e aumento na fase de regeneração (7, 14, 21 e 28 dias). A redução na atividade
proteossômica nas primeiras 48 h pós-envenenamento nas duas doses testadas mostra que o
56
proteossomo não é ativado pela peçonha botrópica, ao contrário da nossa hipótese inicial e do que
ocorre, por exemplo, com as metaloproteinases de matriz (MMPs) (Rucavado et al., 1998, 2002;
Saravia-Otten et al., 2004). A inibição proteossômica observada pode estar relacionada ao dano e
ruptura celular que comprometeriam a capacidade da célula em sinalizar proteólise
proteossômica. De fato, o proteossomo parece ter sua atividade inibida em outras situações
semelhantes a essa, como desordens inflamatórias e senescência em que há excesso de proteínas
danificadas e oxidadas (Kelvin et al., 2006). Um decréscimo na atividade do proteossomo
também ocorre quando há acúmulo de agregados de proteínas oxidadas insolúveis que não podem
ser degradadas pelo proteossomo e que inibem sua função (Osna e Donohue, 2007).
É interessante notar que a concentração de aminoácidos livres em músculos injetados com
peçonha mostrou um perfil muito semelhante ao das atividades do proteossomo (inibição das
atividades do proteossomo até 48 h e redução da concentração dos aminoácidos livres até 24 h;
após esses intervalos, as atividades proteôssomica e a concentração de aminoácidos
restabeleceram-se). Tal semelhança de perfis faz sentido tendo em vista que a via proteossômica
é o primeiro passo na degradação de proteínas intracelulares em peptídeos, que por sua vez
servem de substratos para uma variedade de peptidases que os degradam em aminoácidos livres.
Assim, a redução na atividade proteossômica resultaria, em última análise, na redução na
quantidade de aminoácidos livres (Ferro et al., 2004). É possível também que tenha ocorrido uma
perda de aminoácidos livres nas primeiras horas após o envenenamento como conseqüência do
dano à membrana plasmática muscular, de modo semelhante ao que ocorre com a CK muscular.
Nesse caso, o restabelecimento da concentração de aminoácidos na fase de regeneração (sete dias
para frente) ocorreria em função da recuperação do tecido.
Tendo em vista essa redução da atividade proteossômica na fase inicial de
envenenamento, decidimos usar o inibidor MG-132 para investigar o papel do proteossomo na
57
regeneração muscular após injeção da peçonha de B. jararacussu. Neste caso, a hipótese era que,
na fase tardia, a ativação do proteossomo poderia atrapalhar a regeneração, por degradar
proteínas estruturais e contrácteis importantes para o metabolismo muscular, ou ainda, poderia ter
um papel benéfico na regeneração, permitindo a degradação de proteínas danificadas que
estariam atrasando esse processo. Conforme demonstrado pelos nossos resultados, o tratamento
com inibidor reduziu a atividade quimiotripsina, que é a principal atividade catalítica
proteossômica (Kisselev and Goldberg, 2001; Richardson et al., 2003), porém efeito semelhante
foi obtido também com o veículo (DMSO) sozinho. De modo semelhante, a análise das
alterações histológicas demonstrou que foi o veículo (DMSO) o responsável por diminuir a
porcentagem de células regenerativas e de aumentar a deposição de colágeno. O DMSO
contribuiu para a diminuição das células regenerativas possivelmente pela sua ação
antiinflamatória que atenuaria a liberação de citocinas e fatores pró-células satélites necessários
para a proliferação dessas células e a regeneração (Sojka et al., 1990; Cantini et al., 2002; Charge
e Rudnicki, 2004; Santo Neto et al., 2004). Da mesma maneira, ocorreria a reposição do tecido
muscular pela deposição de colágeno. Possivelmente o uso de outro inibidor proteossômico que
não dependa da solubilização em DMSO como, por exemplo, o PS-341 (Lucker et al., 2003;
Richardson et al., 2003), possa nos oferecer mais informações sobre a atuação do proteossomo na
regeneração muscular causada pelo envenenamento botrópico.
De acordo com a literatura, o aumento da atividade e expressão do proteossomo na fase
tardia pode estar relacionado ao seu papel regulador na proliferação e diferenciação dos
mioblastos (Ebisui et al., 1995; Duguez et al., 2003). Adicionalmente, a ativação poder estar
envolvida na degradação de miofibrilas danificadas ou na resposta imune de células inflamatórias
(Glickman e Ciechanover, 2002). Há também evidências indicando que o proteossomo é
responsável pela regulação e turnover de proteínas críticas envolvidas em grande variedade de
58
funções celulares como ciclo celular, proliferação, morte celular, angiogênese, diferenciação, etc.
(Elliott et al., 2003); muitas dessas funções são necessárias para o processo de regeneração. O
aumento na expressão das subunidades 11S e 20Sα nos períodos de regeneração sugere que a
proteólise seja predominantemente independente de ATP, pois somente a partícula 19S é que
possui as subunidades de ATPase que fornecem energia para seu funcionamento (Soucy et al.,
1999).
Dessa forma, até o momento, não conseguimos estabelecer precisamente o papel do
proteossomo na fase de regeneração, entretanto podemos sugerir que o proteossomo não exerce
papel degradativo na fase inicial do envenenamento, pelo menos não a ponto de danificar o
músculo e contribuir para a perda de massa muscular. Como a via proteossômica parece não estar
envolvida na espoliação muscular após o envenenamento, expandimos a investigação para avaliar
a atividade da via lisossomal e da protease dependente de cálcio.
A única via proteolítica ativada nos primeiros momentos de dano (até 6 h após o
envenenamento) foi a calpaína na dose de 75 μg. Essa ativação provavelmente ocorreu devido ao
influxo de íons cálcio que ocorre após o envenenamento (Gutiérrez et al., 1984b, 1989; Gutiérrez
e Lomonte, 1995; Harris, 2003). Essa entrada maciça e descontrolada de cálcio é responsável,
entre outras alterações, pela ativação de enzimas citosólicas dependentes de cálcio (Trump e
Berezesky, 1995), entre elas as calpaínas. De uma forma geral, as calpaínas exercem um papel
mais regulatório que digestivo (Goll et al., 2003), e só desempenham função degradativa quando
a homeostase de cálcio citosólica está pertubada (Anderson et al., 1998; Tidball e Spencer, 2000),
o que parece estar de acordo com o nosso modelo em que há elevação da atividade nos tempos
iniciais com a dose maior da peçonha. O aumento da atividade da calpaína nos períodos de 14
dias e 28 dias pode estar correlacionado ao recrutamento de células satélites (Raynaud et al.,
2004), embora ainda não se sabe ao certo o papel das calpaínas em processos regenerativos.
59
Da mesma forma que a via proteossômica, a via lisossomal (representada pelas catepsinas
B e H) também não foi ativada nos períodos iniciais após o envenenamento (até 24 h). Na
verdade, houve uma inibição da catepsina H lisossomal, principalmente na dose maior de
peçonha. As catepsinas possuem inibidores endógenos (cistatinas) que são capazes de inativar as
proteases que escaparam acidentalmente dos lisossomos (Turk et al., 2001). Devido aos danos
provocados pela peçonha, pode ter ocorrido a liberação de enzimas lisossomais que foram
prontamente inibidas pela célula para evitar mais danos, explicando assim a inativação da
catepsina H. Adicionalmente, componentes da peçonha poderiam inibir diretamente a atividade
lisossomal. Essa conclusão é apoiada pela descoberta de inibidores de serino e de cisteíno
proteases em peçonhas de elapídeos (conhecidos como cistatinas de peçonha), que poderiam
inibir as catepsinas lisossomais nessa fase inicial pós-envenenamento. Neste caso, as cistatinas
teriam a função de proteger as proteases da peçonha da inativação causada pelas proteases do
organismo envenenado (Mashiko e Takahashi, 2002). A presença de proteínas semelhantes em
peçonhas botrópicas ainda precisa ser confirmada.
Um evento bastante interessante foi a ativação das catepsinas B e H nos tempos tardios
(48 h até 28 dias). Em estudo semelhante ao nosso, com peçonha de Notechis scutatus (Faiz et
al., 1995), as catepsinas B e H também estiveram ativadas nestes períodos (catepsina B com pico
máximo em 48 h e catepsina H com pico em 72 h). É múltipla a origem celular dessas proteases
ácidas, podendo ser das fibras danificadas (Kominami et al., 1985), de células do infiltrado
inflamatório (Faiz et al., 1995; Teibler et al., 2001), ou até mesmo de células satélites (Kirschke
et al., 1983; Takeda et al., 1992). Alguns estudos de degeneração muscular induzida por toxinas
em que houve infiltração de neutrófilos e macrófagos indicaram que o aumento de proteases
ácidas está correlacionado com a liberação dessas enzimas por essas células fagocitárias (Pluskal
et al., 1978; Gutiérrez et al., 1986a; Gutiérrez e Lomonte, 1989; Faiz et al., 1995; Teibler et al.,
60
2001). Outros modelos de miopatias sustentam essa hipótese, destacando que as catepsinas (B e
H) derivam especificamente de macrófagos (Ishiura et al., 1983; Kominami et al., 1984, 1985;
Kiyoshima et al., 1993). Ao mesmo tempo, as catepsinas estão ativadas durante a diferenciação e
fusão das células satélites e no remodelamento tecidual que ocorre na miogênese (Kirschke et al.,
1983; Ebisui et al., 1995; Faiz et al., 1995; Bechet et al., 1991, 2005; Duguez et al., 2003), e a
catepsina B, especificamente tem papel importante na proliferação e diferenciação de células
satélites de camundongos (Jane et al., 2002).
A análise histológica revelou grande quantidade de infiltrado inflamatório e de células
regenerativas nos períodos de ativação das catepsinas B e H, o que poderia justificar o aumento
das catepsinas nesses períodos. Dessa forma, as catepsinas poderiam auxiliar na remoção do
tecido necrótico (no caso de estarem presente nas células inflamatórias) e na regeneração
(presentes nas células regenerativas e nas células inflamatórias), isto é, teriam um papel benéfico
no envenenamento, e não degradativo. De fato, células inflamatórias são importantes tanto na
retirada do tecido necrótico quanto na regeneração (Teibler et al., 2001; Teixeira et al., 2003b).
Em alguns casos, observamos efeitos inesperados no músculo contralateral, especialmente
um aumento em algumas atividades proteolíticas (quimiotripsina, catepsina B e H). Essa ativação
diferencial de enzimas proteolíticas na musculatura contralateral pode ser uma conseqüência da
ação sistêmica de peçonhas botrópicas (Rosenfeld, 1971; Fan e Cardoso, 1995; Russell et al.,
1997; França e Málaque, 2003). Fenômeno semelhante também foi verificado com a peçonha de
N. scutatus (Faiz et al., 1995). A análise histológica desses músculos contralaterais permitiu
correlacionar aumento de infiltrado inflamatório com aumento da catepsina H. Infiltrados
inflamatórios são ricos em enzimas lisossomais como a catepsina H (Ishiura et al., 1983;
Kominami et al., 1984, 1985; Kiyoshima et al., 1993; Faiz et al., 1995). Além disso, algumas
citocinas liberadas no envenenamento (TNF-α e IL-6) têm ação sistêmica e poderiam estimular as
61
atividades proteolíticas em outros tecidos, como normalmente verificado em situações como
queimados e septicemia (Tisdale, 2005; Argiles et al. 2006; Costelli et al., 2007).
Por fim, o conhecimento dos mecanismos envolvidos no dano provocado por peçonhas
botrópicas e do papel importante que as metaloproteinases e fosfolipases exercem nesse
fenômeno têm crescido muito nos últimos anos (Gutiérrez e Lomonte, 1995; Gutiérrez e
Rucavado, 2000; Gutiérrez e Lomonte, 2003; Gutiérrez e Ownby, 2003; Gutiérrez et al., 2005).
Por outro lado, o conhecimento do papel de algumas vias intracelulares, especialmente as
proteolíticas, no dano local ainda é restrito (Rucavado et al., 1998, 2002; Gutiérrez e Rucavado,
2000; Saravia-Otten et al., 2004). Conforme demostrado neste estudo, a peçonha de B.
jararacussu é capaz de alterar a atividade de várias vias proteolíticas, com perfis característicos.
Esta é a primeira demonstração de que essas vias proteolíticas estão relacionadas ao dano e à
regeneração muscular no envenenamento botrópico. A investigação da contribuição de cada uma
dessas vias poderá levar ao desenvolvimento de novas terapias para o tratamento do dano e/ou
regeneração local resultantes do envenenamento. A figura 23 mostra a relação das atividades
proteolíticas e as alterações histológicas encontradas neste estudo, enquanto a figura 24 sugere os
possíveis pontos de envolvimento dessas vias proteolíticas nas principais alterações causadas pelo
envenenamento botrópico.
62
A FASE 1 FASE 2 FASE 3
Alterações histológicas
Hemorragiae mionecrose
Infiltrado inflamatório, miotubos e mioblastos
Células regenerativas
+
Calpaína Ca2+
+ ++
Catepsinas
Proteossomo
B FASE 1 FASE 2 FASE 3
Alterações histológicas
Hemorragiae mionecrose
Infiltrado inflamatório, miotubos e mioblastos
Células regenerativas
-
Catepsina H
-
Proteossomo
Figura 23. Esquema indicando a ativação (+) (painel A) e inibição (-) (painel B) das atividades
proteolíticas relacionadas às alterações histológicas deste estudo.
Fosfolipases Metaloproteinases
Mionecrose Hemorragia
Perda de massa muscular
Peçonha botrópica
Dano tecidual local
Lesão da membrana plasmática e influxo de cálcio
Inflamação
Retirada do tecido lesado
Ativação da miogênese
Regeneração
Calpaínas
Catepsinas Proteossomo
+
+ +
Figura 24. Esquema hipotético indicando as principais alterações teciduais que ocorrem no
envenenamento botrópico e as possíveis relações com as vias proteolíticas analisadas neste
estudo. A ativação das calpaínas provavelmente ocorre devido ao influxo de cálcio nas primeiras
horas após o envenenamento. A ativação mais tardia das catepsinas pode estar relacionada à
retirada do tecido lesado pelas células inflamatórias e/ou à remodelagem tecidual que ocorre na
regeneração. Também na fase mais tardia, a ativação do proteossomo pode estar relacionada a
diversas funções (ativação dos mioblastos, degradação de miofibrilas danificadas, resposta imune
de células inflamatórias e turnover de proteínas reguladoras críticas para a regeneração). A causa
da perda de massa muscular observada no envenenamento botrópico ainda não está totalmente
elucidada e pode ser que essas proteases estejam de alguma forma relacionada a essa regeneração
parcial. (+) indica ativação na atividade proteolítica.
63
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos nesta investigação indicam que:
1. A peçonha de B. jararacussu provoca alterações musculares caracterizadas por três fases:
fase 1 em que há dano tecidual (caracterizado por hemorragia, mionecrose e aumento de
CK sérico), fase 2 caracterizada pela presença de infiltrado inflamatório, mioblastos e
miotubos, e fase 3 em que ocorre a presença de células regenerativas.
2. A ativação da atividade e expressão do proteossomo na fase tardia do envenenamento
sugere sua participação na regeneração muscular.
3. O aumento da atividade da calpaína na fase inicial pós-envenenamento pode estar
relacionado ao dano celular.
4. A ativação das catepsinas nas fases de inflamação (fase 2) e regeneração (fase 3), parece
estar relacionada a esses processos importantes de pós-envenenamento.
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ANEXO
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![UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASrepositorio.unicamp.br/jspui/bitstream/REPOSIP/254931/1/CarvalhoJ… · geográficas. [Lawreance e Shu, 1993].....37 Tabela 4.1 - Composição química](https://static.fdocumentos.com/doc/165x107/6089ccaaf024ed7969588020/universidade-estadual-de-geogrficas-lawreance-e-shu-199337-tabela-41.jpg)
