UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E

BIOLOGIA MOLECULAR

DESENVOLVIMENTO DE SSR PARA Senna multijuga Rich.

(LEGUMINOSAE): UMA ESPÉCIE PIONEIRA DA FLORESTA

ATLÂNTICA BRASILEIRA.

JOSIANE DOS SANTOS AMORIM

ILHÉUS-BAHIA-BRASIL

Julho de 2012

JOSIANE DOS SANTOS AMORIM

DESENVOLVIMENTO DE SSR PARA Senna multijuga Rich. (LEGUMINOSAE):

UMA ESPÉCIE PIONEIRA DA FLORESTA ATLÂNTICA BRASILEIRA.

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Área de Concentração: Genética e Biologia Molecular.

ILHÉUS-BAHIA-BRASIL

Julho de 2012

JOSIANE DOS SANTOS AMORIM

DESENVOLVIMENTO DE SSR PARA Senna multijuga Rich. (LEGUMINOSAE):

UMA ESPÉCIE PIONEIRA DA FLORESTA ATLÂNTICA BRASILEIRA.

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Área de Concentração: Genética e Biologia Molecular.

APROVADA: 20 de julho de 2012

Prof. Dra. Ana Yamaguishi Ciampi Prof. Dra. Romari Martinez

(Embrapa) (UESC)

Prof. Dr. Ronan Xavier Corrêa Prof. Dra. Fernanda Amato Gaiotto

(UESC) (UESC - Orientadora)

ii

A524 Amorim, Josiane dos Santos. Desenvolvimento de SSR para Senna multi- juga Rich. (Leguminosae): uma espécie pioneira da floresta atlântica brasileira / Josiane dos Santos Amorim. – Ilhéus, BA: UESC, 2012. xv, 45f. : Il. Orientadora: Fernanda Amato Gaiotto. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. Inclui bibliografia.

1. Genética vegetal. 2. Microssatélites (Gené- tica). 3. Leguminosa. I. Título. CDD 581.35

ii

Aos meus pais, Rosário e Juscelita, pelo exemplo de vida

e por serem os melhores pais que eu poderia ter, a minha irmã Juliane que

nunca mediu esforços e incentivos para que todos os meus

anseios e objetivos pudessem ser alcançados, ao meu filho Felipe

que de uma maneira inocente me deu estímulos para não desistir, e ao meu

namorado Ciro André que sempre esteve ao meu lado.

DEDICO

iii

AGRADECIMENTO

À DEUS, pelo mais belo dos presentes, a vida.

À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), pela realização de

minha formação profissional, ao Programa de Pós-Graduação em Genética e

Biologia Molecular, pela oportunidade concedida, e por alguns dos melhores

anos de minha vida.

Agradeço a todas as pessoas que, de forma direta ou indiretamente,

contribuíram para a realização desse trabalho, especialmente:

À Prof. Dra. Fernanda Amato Gaiotto, pela orientação, pelo apoio,

confiança, paciência e incentivo na realização desse projeto e acima de tudo

pelo exemplo de profissional que é, não só meu agradecimento, mas toda

minha admiração.

Ao meu co-orientador Dr. Roberto Tarazi pelas sugestões,

disponibilidade e aprendizado obtido durante a realização da pesquisa.

À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), e em especial ao

Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, pela

oportunidade concedida e imensa contribuição na aquisição de novos

conhecimentos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.

Aos funcionários da Universidade Estadual de Santa Cruz e deste

programa de pós-graduação, em especial a Fabrícia e Dona Gilda, pela

amizade e pelo carinho no atendimento.

Aos professores do Programa de Pós Graduação em Genética e

Biologia Molecular, em especial Leandro e Romari, pelos ensinamentos e pela

iv

convivência harmoniosa durante este período e principalmente pela

competência no exercício da docência.

Às quatro pessoas mais importantes da minha vida, que amo

incondicionalmente, meu filho Felipe, meu pai Rosário, minha mãe Juscelita e

minha irmã Juliane, pelo incentivo, confiança, amizade e por tudo que

significam para mim, vocês são meu porto seguro, essa conquista não é

somente minha, mas de vocês família, obrigada.

Ao meu bb (Ciro André Freitas dos Santos) meu namorado, amigo e

parceiro de todas as horas. Obrigada pela paciência, conselhos e incentivo

constante, desde a seleção, até o final de todas as etapas, valeu pelos puxões

de orelha, afinal você me mostrou o quanto é importante sonhar alto, e estudar

para que a realização do sonho aconteça, está é a lógica (lembra?). Obrigada

por todas as transformações que trouxe pra minha vida, e está vitória também

a ti pertence. Te amo!

Aos amigos Angela, Vinicius, Dayse, Jhonatan, Bernard, Elisa, Beth,

Thiago, Karin, Americo, Luciano, Isaac, Dayane, Drika, Dani, Louise, Raquel,

Pabliane, Marla, Marilia, Igor, Thiago (Panguão), Everson, Nando, Roberta,

Sara, que conheci durante este período importante de minha vida e que de

alguma maneira contribuíram para este trabalho, valeu pelos incentivos, pela

agradável convivência, amizade e por todos os momentos de descontração que

me proporcionaram.

Aos colegas do Grupo de Pesquisa e Laboratório de Genética

Molecular Aplicada, Gisa, Jeiza, Ivandilson, Kátia, Joseane, Fernanda

Ancelmo, Caio (popular Vini), Ramires (Ramirão), Alessandro (Leleu), Rodrigo

(das meninas), Dani, Flora, Marília, Ácacia (Uni), Allan, Eullaysa, obrigada por

todos os momentos de descontração, bagunça e alegria no laboratório, e

principlamente pelo apoio nas horas mais difíceis.

Em especial a Seu Chico (mateiro), e a todos os meninos que me

ajudaram nas coletas, pois a ajuda de vocês em campo foram essenciais.

À minha grande parceira Beth a qual tenho um carinho especial pela

dedicação e esforço com qual desenvolve seu projeto de Iniciação Científica,

muito obrigada por estar ao meu lado em todas as coletas.

Aos amigos que deixei em Paranavaí, Vanclei, Priscila, Taíla, Gleici,

Fabi, Néia, Jeise, Maykon, Fábio, Jorginho, Aline, Ana Lúcia, Duda que não

v

estiveram fisicamente próximos, mas que de alguma forma contribuíram para

este trabalho e em especial minha grande amiga de graduação Gislaine, pois

foi através dela que aqui cheguei.

À professora Dr. Mariza Barion Romagnolo, minha primeira orientadora,

obrigada pela amizade, estímulo e confiança, que muito contribuiu para minha

formação científica.

Agradeço desde já aos membros da banca de defesa pela leitura e

pelas futuras contribuições críticas no aperfeiçoamento de minhas idéias.

“A todos, obrigada por tornar concreto, mais um passo para minhas

realizações”.

vi

“Não é o mais forte da espécie que sobrevive, nem o mais inteligente,

é o que melhor se adapta à mudança.”

Charles Darwin

vii

ÍNDICE

EXTRATO .................................................................................................................. ix

ABSTRACT ............................................................................................................... xii

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ xiv

LISTA DE TABELAS ............................................................................................... xvi

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 4

2.1 Mata Atlântica .................................................................................................. 4

2.2 Restauração ..................................................................................................... 6

2.3 Família Leguminosa na Mata Atlântica ......................................................... 7

2.4 Subfmília Caesalpinioideae ............................................................................ 9

2.5 A espécie Senna multijuga (Rich.) ............................................................... 10

2.6 Marcadores SSR ............................................................................................ 14

2.7 Estratégias de desenvolvimento SSR ......................................................... 16

3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 18

3.1 Coleta de Material Vegetal e Extração de DNA ........................................... 18

3.2 Construção da Biblioteca Genômica Enriquecida ..................................... 18

3.3 Seleção e Seqüenciamento dos Clones Positivos ..................................... 23

3.4 Desenho dos Primers e Otimização ............................................................ 24

3.5 Caracterização dos Locos ............................................................................ 26

viii

3.6 Estimativas dos parâmetros Genéticos ...................................................... 26

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 27

4.1 Extração de DNA ........................................................................................... 27

4.2 Construção da Biblioteca, Seqüenciamento e Desenho dos

Primers ................................................................................................................. 28

4.3 Caracterização dos locos microssatélites .................................................. 34

5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 38

6. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 39

ix

EXTRATO

AMORIM, Josiane dos Santos, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,

Ilhéus, julho de 2012. Desenvolvimento de SSR para Senna multijuga Rich.

(Leguminosae): uma espécie pioneira da floresta Atlântica brasileira.

Orientadora: Fernanda Amato Gaiotto. Co-orientador: Roberto Tarazi.

O Brasil detém a maior biodiversidade do mundo. Apesar da Mata Atlântica ser

um dos biomas mais ameaçados do planeta, ainda há carência de estudos

sobre a diversidade genética de muitas espécies arbóreas, para fornecer

informações úteis para o desenvolvimento de práticas de conservação e

manejo. O sul da Bahia compreende grande parte desta biodiversidade, tendo

um número elevado de espécies arbóreas por hectare, destacando-se no

contexto mundial. Entre as diversas espécies arbóreas encontradas, Senna

multijuga Rich. possui ampla distribuição e ocorrência em formações abertas

da Mata Atlântica. Pioneira e bastante adaptada aos solos pobres, possui um

ciclo de vida muito rápido comparado a outras arbóreas. Graças a esse

aspecto, é muito comum em processos de regeneração de áreas degradadas.

O número de estudos de biodiversidade recorrendo à genética de populações e

sistemática molecular tem aumentado consideravelmente. O uso de

marcadores moleculares se torna uma opção viável para se compreender os

padrões genéticos e espaciais, além de fornecer informações importantes para

o manejo da espécie, bem como a possibilidade de transferência para espécies

relacionadas. Por serem altamente polimórficos, e permitirem diferenciar

x

genótipos homozigotos de heterozigotos devido a sua herança codominante, os

marcadores microssatélites têm sido considerados uma eficiente ferramenta

para estudos de genética populacional. Assim, foram desenvolvidos 11

marcadores microssatélites polimórficos para S. multijuga a partir de uma

biblioteca genômica enriquecida. O material vegetal foi coletado num fragmento

de Mata Atlântica, no município de Jussari, na RPPN Serra do Teimoso-BA. A

construção da biblioteca genômica foi realizada através das seguintes etapas:

digestão do DNA genômico com a enzima RsaI; ligação dos adaptadores

Rsa21 e Rsa25; pré-amplificação com o primer Rsa21; seleção de fragmentos

contendo SSR por hibridização de sondas biotiniladas (CT)n e (GT)n e

magnetização; amplificação dos fragmentos selecionados, clonagem e

transformação; amplificação dos insertos clonados contendo SSRs, seleção e

seqüenciamento dos clones positivos. Após analises das 192 seqüências com

o programa SSRLocator, 16 primers foram desenhados com auxilio do

aplicativo Primer 3. Destes 16 primers, 12 foram otimizados e caracterizados.

Um mostrou-se monomórfico e 11 apresentaram polimorfismo. Com base nos

genótipos estimou-se uma média de 4,58 alelos por loco. Foi encontrada, a

variação para a heterozigosidade observada que ficou entre 0,00 e 0,61,

enquanto que para a heterozigosidade esperada, os valores variaram de 0,00 a

0,87. Com estes resultados, foi possível verificar que a média de HE foi mais

elevada do que a de HO, indicando que possivelmente está ocorrendo

acasalamento entre indivíduos aparentados, ou trata-se de uma conseqüência

da biologia reprodutiva da espécie que possui um sistema misto de cruzamento

com taxas autofecundação de 50%. O software MicroChecker, foi utilizado para

verificar a presença de alelos nulos, indicando a presença em alguns locos.

Além disso, a probabilidade de exclusão de paternidade combinada foi de

0,929, o que demonstra o poder destes primers para testes de paternidade. A

probabilidade de identidade foi de 1,6x10-8 apontando um valor considerável

para a identificação individual de individuos. Assim, conclui-se que o conjunto

de marcadores desenvolvidos pode ser útil para estratégias de restauração

com essa espécie e também para estudos de conservação da Mata Atlântica.

xi

Palavras-chave: Microssatélites, primers, caracterização, regeneração,

Leguminosae.

xii

ABSTRACT

AMORIM, Josiane dos Santos, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,

Ilhéus, julho de 2012. Development of SSR for Senna multijuga Rich.

(Leguminosae): a pioneer species of the Brazilian Atlantic Forest. Advisor:

Fernanda Amato Gaiotto. Advisor Committe Member: Roberto Tarazi.

Brazil has the highest biodiversity in the world. Despite the Atlantic Forest is

one of the most threatened biomes of the planet, there is few studies about

genetic diversity of many tree species, to provide useful information for

developing conservation practices and management. Southern Bahia comprises

much of this biodiversity, with a large number of tree species per hectare,

especially in the global context. Among the various species observed, Senna

multijuga Rich. has wide distribution and occurrence in open Atlantic Forest.

Pioneer and quite adapted to poor soils, has a life cycle very fast compared to

other trees. Thanks to this aspect, it is very common in the regeneration

process of damaged areas. The number of biodiversity studies using the

population genetics and molecular systematics has increased considerably. The

use of molecular markers becomes a viable option for understanding the

genetic and spatial patterns, and provides important information for the

management of the species, as well as the possibility of transfer to related

species. Because they are highly polymorphic, and allow to differentiate

homozygous heterozygous genotypes due to their codominant inheritance,

microsatellite markers have been considered an efficient tool for studies of

xiii

population genetics. Thus, we developed 11 polymorphic microsatellite markers

for S. multijuga from an enriched genomic library, where the plant material was

collected in a fragment of Atlantic Forest in the town of Jussari in the PRNP

Sierra Stubborn-BA. Construction of genomic library was performed using the

following steps: digestion of genomic DNA with the enzyme RsaI, connecting

adapters and Rsa21 Rsa25, pre-amplification with the primer Rsa21; selection

of SSR-containing fragments by hybridization of biotinylated probes (CT) n (GT)

n and magnetization; amplification of selected fragments, cloning and

transformation, amplification of cloned inserts containing SSRs, selection and

sequencing of positive clones. After analysis of 192 sequences with the

program SSRLocator, 16 primers were designed with the aid of Primer 3

application. Of these 16 primers, 12 were optimized and characterized. One

proved to be monomorphic and 11 showed polymorphism. Genotypes based on

the estimated to an average of 4.58 allele per locus. We found the variation to

that observed heterozygosity was between 0.00 and 0.61, while for the

expected heterozygosity values ranged from 0.00 to 0.87. With these results,

we found that the average HE was higher than that of HO, indicating that

possibly is occurring mating between related individuals, or it is a consequence

of the reproductive biology of the species that has a mixed mating system self-

fertilization rates of 50%. MicroChecker software was used to verify the

presence of null alleles, indicating the presence of some loci. Furthermore, the

probability of paternity exclusion combined was 0.929, which shows the power

of these primers for paternity testing. The probability of identity was 1.6 x10-8

indicating a considerable value to the individual identification of individuals.

Thus, we conclude that the set of markers can be useful for developing

strategies to restore this species and also for studies of the Atlantic Forest.

Key-words: Microsatellite primers, characterization, regeneration, Leguminosae.

xiv

LISTA DE FIGURA

Figura 1 - Mapa dos remanescentes florestais da Mata Atlântica no Brasil. (A)

A área em verde representa a cobertura florestal por volta do ano de 1500. (B)

Em amarelo, áreas onde existia Mata Atlântica e em verde os remanecentes

que sobraram representam os desmatamentos até 2007. (Fonte: Fundação

SOS Mata Atlântica, 2011). ......................................................................................... 4

Figura 2 – Mapa dos locais identificados de ocorrência natural de Senna

multijuga Rich. no Brasil. (Fonte: Embrapa Florestas, 2004). ................................... 11

Figura 3 – Senna multijuga Rich. (A) Árvore adulta de aproximadamente 20 m

de altura, presente na RPPN Serra do Teimoso, município de Jussari, Bahia;

(B) Tronco: presença de manchas claras em uma árvore adulta de Cobi. ................ 12

Figura 4 – Fotos (A) Folha de S. multijuga Rich., (B) Copa da árvore com suas

flores dispostas em cachos, flor exuberante que se destaca. ................................... 13

Figura 5 – Fotos (A) Indivíduo adulto de S. multijuga Rich. mostrando a perda

de suas folhas periodicamente (árvore caducifólia), (B) Frutos. (Fontes: Foto (A)

AMORIM, J. S.; Foto (B) http://w3.ufsm.br/herbarioflorestal). ................................... 14

Figura 6 - Esquema ilustrando a reação de clivagem do DNA pela enzima

RsaI. A) Nucleotídeos em vermelho representam o sítio de clivagem, N

representa um nucleotídeo qualquer. B) Setas amarelas representam o local de

corte da enzima. C) Resultado da clivagem: moléculas com extremidades

coesivas. ................................................................................................................... 19

Figura 7 – Ilustração esquemática mostrando preparação do complexo sonda-

beads, (A) Biotina, (B) Oligos, (C) Sonda (GT)8, (D) Bead, (E) Estreptavidin, (F)

Complexo sonda-beads. ........................................................................................... 21

xv

Figura 8 – Fotos de fragmentos contendo as repetições selecionadas sendo

recuperados por estreptavidina ligada a microesferas magnéticas “beads”. ............. 22

Figura 9 – Extração de DNA de 36 indivíduos de Senna multijuga Rich. pelo

protocolo de Ferreira e Grattapaglia (1998). Análise da qualidade e

concentração de DNA pela comparação com padrões de 10 ng (λ1) e 30 ng (λ2)

de DNA do fago λ, atráves de eletroforese em gel de agarose 0,8% TBE 1X

(120 V), corado com Brometo de etídio. .................................................................... 28

Figura 10 – Produto da clivagem do DNA de S. multijuga Rich. utilizando a

enzima RsaI, mostrando a faixa dos fragmentos obtidos após a restrição. .............. 29

Figura 11 – Proporção dos motivos SSR encontrados na biblioteca genômica

enriquecida construída para Senna multijuga Rich. .................................................. 31

Figura 12 – Fluxograma das etapas da obtenção de microssatélites para o

desenho dos primers. ................................................................................................ 32

Figura 13 - Produtos amplificados detectados para os 8 locos dos 12

microssatélites de S. multijuga Rich. em gel de agarose 2%, após otimização

das condições de amplificação dos locos. Ladder 1kb Fermentas. ........................... 33

Figura 14 – Número de alelos por loco polimórfico do presente estudo. .................. 35

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Caracterização dos 12 locos microssatélites de Senna multijuga

Rich. Demonstrando para cada loco o motivo de repetição, a seqüência

Forward e Reverse, a Temperatura de anelamento (Ta°C) e a variação do

tamanho (pb) dos alelos encontrados. ...................................................................... 34

Tabela 2. Caracterização dos 12 locos microssatélites para Senna multijuga

Rich.. A tabela apresenta: Na: número de alelos; HO: heterozigosidade

observada; HE: Diversidade Gênica; Q: Coeficiente de exclusão dos locos; I:

Coeficiente de Identidade; F: Índice de fixação e Alelos Nulos. ................................ 36

Tabela 3 – Comparação das características de locos microssatélites isolados

para espécies arbóreas. N: número de indivíduos; L: locos desenvolvidos; A:

média de alelos por loco, HE: heterozigosidade média encontrada, e HO:

heterozigosidade média observada, e respectivos autores. ...................................... 37

1

1. INTRODUÇÃO

A partir da década de 90 aumentou-se o número de pesquisas

desenvolvidas para trabalhar com conservação e o comportamento de diversas

espécies nativas. Este fato se deu por causa de uma serie de fatores, sendo

principalmente pela necessidade de recuperação e conservação dos

ecossistemas (DAVIDE et al., 2006). Mas mesmo assim ainda hoje é pouco o

que se sabe sobre a biodiversidade brasileira, as informações que temos

disponíveis ainda são raras se comparadas ao grande numero de espécies que

temos (CARVALHO et al., 2006).

São importantes e necessários os estudos que estejam associados à

priorização de áreas para conservação e sobre a biodiversidade neste grande

bioma. Devido, não somente ao histórico de degradação que vem ocorrendo,

mas principalmente pela biodiversidade ainda existente. A Mata Atlântica do

Brasil é considerada um dos biomas mais ameaçados, visto como zona de

prioridade de conservação no mundo, principalmente pela previsão de extinção

de várias espécies que nele se encontram (MYERS et al., 2000).

A quantidade de variação genética existente em uma população amplia

condições para que as espécies sobrevivam por longo tempo, sendo então a

diversidade biológica considerada fundamental para a manutenção das espécies

na natureza. Assim se torna necessário conhecer esta distribuição entre e dentro

das populações, principalmente se levar em consideração a perda constante que

estes ambientes vêm sofrendo, pois devido ao impacto das atividades humanas

muito tem se perdido em termos de diversidade genética (RIBEIRO & LOVATO,

2004). Assim torna-se necessário o desenvolvimento de ferramentas que

2

possam auxiliar na conservação e manejo (LACERDA & KAGEYAMA, 2003;

LKAGEYAMA et al., 2003; MORAES et al., 2005), visto que é fundamental

conhecer sobre a diversidade e variabilidade existente para manutenção das

espécies. (RAJORA et al., 2000).

Senna multijuga L.C. Rich. (localmente conhecida como Aleluia, Pau-

cigarra ou Cobi) pertence à família Leguminosae e à subfamília

Caesalpinioideae. Sendo pouco conhecida principalmente em relação aos seus

aspectos biológicos, não há relatos na literatura acerca de sua diversidade,

tornando-se necessário o desenvolvimento de uma ferramenta molecular para

analisar parâmetros populacionais.

Uma grande porcentagem dos estudos direcionados à genética da

conservação, está focado em populações que estejam ameaçadas a fim de

fornecer informações importantes para o manejo (THOMSON, 2005). Contudo a

escolha desta espécie para o estudo de diversidade genética se deu em função

de sua ocorrência no local de estudo e, principalmente por ser uma espécie

pioneira e bastante adaptada aos solos pobres o que a torna adequada para a

regeneração de áreas degradadas (LACERDA, et al., 2004).

Espécies da família Leguminosae costumam estabelecer relações

simbióticas eficientes conferindo-lhes vantagens adicionais para plantios de

reabilitação, se considerar que em determinados ambientes o nitrogênio é

extremamente escasso e que algumas espécies facilitadoras como as

leguminosas, fixadoras de N2 podem funcionar como condicionadores do

substrato (FRANCO et al., 1995; FRANCO & FARIA, 1997) plantios de espécies

pertencentes a esta família podem auxiliar posteriormente como ótimas espécies

para a sucessão natural.

Espécies arbóreas como S. multijuga possuem características que se

assemelham a espécies facilitadoras por apresentar um ciclo de vida curto de

aproximadamente 20 anos. Ocorrem de maneira agregada, com dispersão de

sementes de curta distância, e alta densidade, podendo servir como espécies-

modelo para representar parte da comunidade arbórea em programas de

conservação e recuperação de áreas degradadas. Assim a amostragem de

espécies-modelo de diferentes grupos sucessionais utilizando marcadores

genéticos pode permitir avanços no entendimento da dinâmica do ecossistema,

para futuros delineamentos de estratégias de manejo sustentado e conservação

3

(PRIMACK, & RODRIGUES, 2001). O número de estudos de biodiversidade

recorrendo à genética de populações e sistemática molecular tem aumentado

consideravelmente (AVISE, 2000). O uso de marcadores moleculares se torna

uma opção viável para se compreender os padrões genéticos, alem de fornecer

informações importantes para o manejo da espécie, bem como a possibilidade

de transferência para espécies relacionadas (BORÉM, 2007).

Seguindo esta linha de estudo, este trabalho teve como objetivo o

desenvolvimento e validação de marcadores microssatélites polimórficos

específicos para S. multijuga a partir de uma biblioteca genômica enriquecida.

Os primers SSR testados contribuirão para o desenvolvimento de outro projeto

que apresenta recursos do CNPq, MCT e CAPES. Sendo este o projeto guarda-

chuva “FLUXO GÊNICO DE Eschweilera ovata, Plathymenia foliolosa e Senna

multijuga EM ÁREAS FRAGMENTADAS DA MATA ATLÂNTICA COM

SISTEMAS AGROFLORESTAS – CABRUCAS – NO SUL DA BAHIA”

coordenado pela professora Dra.Fernanda Amato Gaiotto e vice-coordenado

pelo co-orientador Dr. Roberto Tarazi, que visa futuramente estudar alguns

parâmetros populacionais de três espécies vegetais nativas da mata atlântica

(E.ovata, P. foliosa e S. multijuga) utilizando marcadores SSR em áreas com e

sem cabruca no sul da Bahia.

4

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Mata Atlântica

O que existe hoje em termos de floresta no mundo é o que sobrou após

intenso processo de degradação antrópica. A Mata Atlântica existente mostra-se

como resultado dessa presença perturbadora, restando apenas poucos lugares

intactos (Figura 1). As marcas da ação humana deixadas na paisagem ocorrem

impedindo certos progressos evolutivos, e as conseqüências deixadas pela

degradação, tem sido alvo de tantas preocupações nos últimos anos, pois com a

perda de habitats e com as constantes fragmentações, perde-se grande parte da

biodiversidade (OLIVEIRA et al., 2007).

Figura 1 - Mapa dos remanescentes florestais da Mata Atlântica no Brasil. (A) A área em verde

representa a cobertura florestal por volta do ano de 1500. (B) Em amarelo, áreas onde existia

5

Mata Atlântica e em verde os remanescentes que sobraram representam os desmatamentos até

2007. (Fonte: Fundação SOS Mata Atlântica, 2011).

Mesmo com toda essa perda fazendo com que a Mata Atlântica atinja

níveis críticos e alarmantes, ela continua sendo um dos biomas mais diversos do

mundo. Manter esta diversidade é uma questão prioritária, pois os

remanescentes desse bioma constituem-se em verdadeiros laboratórios naturais

para pesquisas e desenvolvimento de atividades para sua própria conservação

(CAPOBIANCO, 2001).

Com todas as transformações ambientais e sociais no decorrer dos

anos, houve uma mudança brusca do que era a paisagem original, fazendo com

que um continuo de floresta se dividisse em fragmentos, restando atualmente

uma minoria dessas parcelas que represente porções intactas, ou então pouco

modificadas pelo homem (FERNANDEZ, 2004).

Do ponto de vista genético não há como mensurar os efeitos causados

com os excessivos processos de degradação e fragmentação que envolve as

populações naturais, pois estes efeitos alteram sua estrutura, a distribuição e

funcionamento dos ecossistemas, o que torna muito destas perdas irreversíveis

(PERES & TERBORGH, 1995).

Estratégias para minimizar as perdas de diversidade vêm sendo

realizadas, pois fragmentos muito pequenos podem se tornar inviáveis para

sustentar as populações, uma vez que a redução da diversidade diminui a

capacidade destas populações em responder a possíveis alterações ambientais,

e com isso aumenta a probabilidade de extinções e conseqüentemente pode

ocorrer limitação da capacidade em responder as novas adaptações

(CHIARELLO, 1999).

Vale lembrar que nem todos os episódios de fragmentação resultam em

erosão genética, a perda da variabilidade também pode acontecer de forma

natural (ANDREN, 1994). Conservar a biodiversidade é algo necessário

tornando-se assim indispensável ações e estratégias que visem à conservação

da diversidade genética encontrada na natureza, de modo a minimizar estes

impactos sobre a perda biológica (LANGE, 2005).

Em termos de biodiversidade, o Brasil desponta como um dos principais

países detentores de uma grande porcentagem desta variabilidade, quando

6

comparado com outros. A Mata Atlântica aqui existente é um dos biomas

responsáveis por este destaque, e devido à grande diversidade de organismos

existentes, ela é considerada como “Hot Spot” da biodiversidade, que está em

evidência pela grande importância de sua conservação (MYERS et al., 2000).

Estima-se que a diversidade de espécies existentes no país supera as que já

foram identificadas e catalogadas ate agora (LEWINSOHN, 2005).

Há, portanto, uma grande necessidade de se proteger a biodiversidade

local, independente das estratégias de conservação a serem utilizadas. Pois,

apesar de sua vasta riqueza biológica, as repercussões nesses processos de

intensa ação humana, se torna ainda mais agravadas considerando que a

regeneração e a fragilidade nos processos de recuperação, podem levar séculos

para se processar ou dependendo pode ser tornar impossível de ocorrer por

meio de ações naturais (ALBAGLI, 2001).

Sendo assim, torna-se necessário colocar em pratica ações que

permitam valorizar as espécies brasileiras, a fim de preservá-las em um dos

principais biomas que é a Mata Atlântica e, contudo lançar mão de estratégias

que possam ser utilizadas em pesquisas que nos auxiliem na manutenção e no

uso da biodiversidade.

2.2. Restauração

A conservação da biodiversidade assim como a restauração do mesmo

se torna indispensável. No entanto, são duas vertentes diferentes, a primeira

permite o auxilio para manter o pouco que resta, e a segunda funciona como

uma ferramenta para se reverter a situação de degradação. Contudo a

restauração de uma área não é algo tão simples. Reverter a situação de um

ambiente que tenha sofrido com alguns processos impactantes requer

planejamento e manejo adequado, uma vez que antes de realizar qualquer

processo é fundamental o entendimento do funcionamento dos ecossistemas

(RODRIGUES & GANDOLFI, 1998).

Todo e qualquer processo de transformação e degradação ambiental

não pode ser considerado isolado, todos esses fatores fizeram parte de um

contexto historio do nosso passado e ainda hoje continuam persistindo no

presente. Recuperar as áreas degradadas aos poucos tem começado a fazer

parte do nosso cotidiano e não apenas pela necessidade de se recuperar

7

visualmente o que se perdeu em quantidade, mas também para se recuperar a

qualidade do que está sendo perdido (AMADOR, 1999).

É importante saber diferenciar que o processo de degradação consiste

em um ambiente que perdeu sua capacidade de regeneração natural e como

conseqüência disso ocorre a diminuição da sua diversidade, a perda de sua

estabilidade e com isso sua resiliência, que significa a capacidade do

ecossistema em superar os obstáculos ou resistir à pressão após alguma

alteração natural ou antrópica, e não no simples fato da perda ambiental em si

(ARONSON et al., 1993).

Todo o processo de restabelecimento de um ambiente natural demanda

tempo e estratégias bem definidas, pois a cobertura vegetal passa por vários

estágios. É necessário aprimorar esses estágios para que através das

estratégias lançadas o manejo acompanhe e acelere o processo da dinâmica

natural dos ecossistemas. Para isso é preciso dar condições para o

estabelecimento de diversas espécies, através do banco de sementes e também

com a introdução de espécies facilitadoras (herbáceas, arbustivas ou arbóreas)

de crescimento rápido – como as pioneiras, que posteriormente contribuíram

para que aos poucos se restabeleça a biodiversidade perdida (GÖTSCH, 1995).

Quando se conhece melhor a ecologia das espécies criam-se condições

para que o processo de regeneração se torne mais eficiente na sua

aplicabilidade, sendo importante dar condições para que as espécies escolhidas

consigam propiciar um ambiente sucessional onde aconteçam melhorias nas

condições do ambiente e no próprio desenvolvimento das mesmas, para que

consigam recolonizar o espaço pretendido (REIS & KAGEYAMA, 2003).

No entanto, apesar algumas iniciativas importantes desencadeadas nos

últimos anos, as medidas de recuperação nas áreas degradas tem sido restritas.

É importante que se consiga conciliar o uso de ferramentas como os estudos

sobre a composição floristíca e genética de algumas espécies pioneiras, a

estrutura de comunidade bem como sua distribuição espacial, a fim de que

auxiliem no processo sucessão em áreas que se encontram degradadas

(RODRIGUES & GANDOLFI, 2000).

2.3. Família Leguminosa na Mata Atlântica

8

A família Leguminosae Juss. é considerada uma das famílias mais

abundantes, também chamada por Fabaceae Lindl., tem uma ampla

distribuição geográfica por todo território nacional, é a terceira maior família de

angiospermas, compreendendo cerca de 727 gêneros e 19.325 espécies

aproximadamente já descritas. Uma característica marcante das espécies

pertencentes a esta família é o fato de possuírem fruto do tipo legume, também

conhecido como vagem, exclusivo desse grupo (LEWIS et al., 2005).

Leguminosae é considerada como detentora da maior riqueza arbórea

nas florestas neotropicais, existindo a presença de muitos táxons endêmicos.

Ocorre em quase todas as regiões do mundo, exceto nas regiões

árticas e antárticas e em algumas ilhas, e mesmo assim são consideradas

cosmopolitas. No território nacional, em alguns biomas, pode-se encontrar

centros de diversidade para o grupo, pois muitas das espécies são exclusivas

destes ambientes. No Brasil existem cerca de 220 gêneros e 2736 espécies

(POLHILL & RAVEN, 1981).

Possui uma acentuada variedade em termos de importância, tanto

econômica, no ramo alimentício, medicinal, madeireiro, entre outros como

ornamentação, produção de fibras e óleos, além, é claro, de sua contribuição

agronômica. Contudo a riqueza dos legumes não pode ser resumida somente

pelo grande número e distribuição, ou por sua importância econômica, deve-se

levar em consideração principalmente o valor biológico e ecológico que esta

família proporciona através de interações ecológicas importantes. As espécies

dessa família se destacam por desempenharem um papel fundamental nos

ciclos biogeoquímicos, através da simbiose de suas raízes com bactérias do

gênero Rhizobium e semelhantes, que fixam o nitrogênio da atmosfera

(MYIAZAKA & CAMARGO, 1984).

As leguminosas possuem em suas raízes nodosidades conferindo-lhes

simbiose com algumas bactérias, sendo que alguns gêneros possuem a

capacidade de fixar o nitrogênio, através da quimiossíntese. As plantas dessa

família aproveitam-se também desta característica, afinal o nitrogênio será

utilizado na formação de suas moléculas de proteínas. Assim as bactérias

nutrem-se através dos açucares produzidos pelas leguminosas durante a

fotossíntese. Esta interação de simbiose é harmônica e permite vantagens

recíprocas para ambos os organismos envolvidos, assim mesmo em solos com

9

baixa concentração de nitrogênio os vegetais dessa família conseguem se

sobressair sobre os demais (RESENDE & KONDO, 2001).

Por possuir um habito de vida bastante diversificada encontra-se na

família leguminosa desde ervas muito pequenas, arbustos, trepadeiras, até

arbóreas de grande porte. Vegetam em diferentes ambientes: campos, matas,

desertos, neves, brejos, etc. Utilizada de várias formas, tem grande importância

na economia, através da produção e utilização como alimentos a exemplo

temos: feijão (Phaseolus vulgaris), a soja (Glycinemax), etc. Possuem um

grande potencial ornamental, destacando algumas espécies como Cobi (Senna

multijuga), o sombreiro (Clitoria fairchildiana), o flamboyant (Delonix regia) na

arborização de muitas cidades brasileiras. Destaque também deve ser dado na

produção de madeiras de qualidade como o Jacarandá (Dalbergia nigra),

o angelim (Hymenolobium spp), o jatobá (Hymenaea spp), e

a cerejeira (Amburana cearensis) que possuem aplicação no ramo da

manufatura de móveis e afins. Devido à presença de alguns compostos

secundários e metabólitos que as leguminosas possuem, a indústria se beneficia

com sua utilização através da fabricação de gomas, resinas, espessantes,

corantes, medicamentos (SOUZA, 2008).

Atualmente a circunscrição mais aceita é que a família Leguminosae é

formada por três subfamílias, divisão obtida através de um consenso com dados

moleculares e não-moleculares, sendo: Mimosoideae, Caesalpinioideae e

Papilionoideae (Faboideae). Possuindo maior numero de representantes com

476 gêneros e aproximadamente 14.000 espécies têm a subfamília

Papilionoideae (LEWIS, et al., 2005); subseqüentemente se tem a

Mimosoideae, com 77 gêneros e aproximadamente 3.000 espécies (APG II,

2003; LUCKOW, 2003); e a Caesalpinioideae com a presença de 150 gêneros e

cerca de 2.700 espécies (DOYLE et al., 2000).

2.4. Subfamília Caesalpinioideae

Caesalpinioideae compreende quatro tribos que resultam em um número

aproximado de 2.700 espécies (LEWIS et al., 2005). Tendo uma amplitude de

distribuição geográfica bastante extensa, principalmente nas regiões

paleotropical e neotropical, subtropical e tropical, na maioria das ocorrências,

tropical e subtropical (WATSON & DALLWITZ, 2008). Na Mata Atlântica

10

brasileira, a família ocupa lugar de destaque na composição florística dos

diversos tipos vegetacionais, tornando elemento dominante na flora regional

(SILVA et al., 1989).

As plantas que pertencem a este grupo encontram-se distribuídas em

grande parte na América do Sul, algumas na África Tropical e Sudoeste da Ásia

(COWAN, 1981). Segundo Lewis et al. (2005), as espécies dessa subfamília

estão distribuídas em 150 gêneros, sendo os mais representativos Chamaecrista

(c. 330 spp.) e Senna (c 300 spp.).

Como dito anteriormente, a subfamília Caesalpinioideae encontra-se

dividida em quatro tribos: Cercideae, Detarieae, Cassieae e Caesalpinieae. A

primeira tribo com um ramo filogenético primitivo abrange cinco gêneros

divididos em duas subtribos. A tribo Detarieae e a tribo Cassieae abrigam

diversos gêneros, 82 e 20 respectivamente. E a ultima tribo Caesalpinieae

atualmente compreendem 56 gêneros (LEWIS, et al., 2005). Posterior ao

estabelecimento dessa divisão, o gênero Cassieae foi dividido em: Cassia,

Senna e Chamaecrista (IRWIN, 1982; LEWIS, et al., 2005).

2.5. A espécie Senna multijuga (Rich.)

Senna multijuga uma espécie pioneira e bastante adaptada aos solos

pobres. Possui um ciclo de vida muito rápido comparado a outras arbóreas. Por

ter esse aspecto de colonização e recolonização muito rápido, é muito utilizada

em processos de regeneração de áreas degradas o que a torna adequada para

a recuperação destas áreas (LARCERDA et al., 2004).

Por apresentar grande agressividade, ocorrendo na vegetação

secundária como capoeiras e capoeirinhas, onde aparece abundantemente,

formando, às vezes, uma vegetação homogênea, a espécie foi escolhida para o

estudo. Além disso, proporciona ambiente de sombra adequado para abrigar

outras arbóreas que estão em extinção como Plathymenia foliosa (Vinhático),

Manilkara multifida (Maçaranduba), Cariniana legalis (Jequitibá Rosa), entre

outras.

A presença de Senna multijuga em muitos ambientes de floresta como

na Floresta Ombrófila Densa (Floresta Atlântica), na Floresta Estacional

Semedecidual, Ombrófila Mista (Floresta com Araucária), e na restinga (DE

11

GRANDE, 1981; MANTOVANI, 1992), ocorrendo desde o estado do Pará até

Santa Catarina como mostra a figura 2, só confirma sua ampla distribuição.

Figura 2 – Mapa dos locais identificados de ocorrência natural de Senna multijuga Rich. no

Brasil. (Fonte: Embrapa Florestas, 2004).

A espécie S. multijuga pertence à família Leguminosae e a subfamília

Caesalpinioideae, que abriga cerca de 19 mil espécies (POLHILL et al., 1981),

distribuídas por todo mundo, sendo de comum acordo entre os que estudam a

família que esta seja dividida em três subfamílias: Papilionoideae, Mimosoideae

e Caesalpinioideae. A subfamília Caesalpinioideae compreende 150 gêneros e

2.700 espécies, com distribuição cosmopolita (POLHILL et al., 1981; JUDD et

al., 1999). A família a qual pertence S. multijuga (Caesalpinioideae) é a menos

estudada e entendida (HERENDEEN, 2000), foi considerada por Burkart (1987)

como a mais primitiva, dando origem as subfamílias Papilionoideae e

Mimosoideae (LEWIS & POLHILL, 1998).

Muitas espécies florestais nativas compreendem essa subfamília

(Caesalpinioideae) a qual pertence à espécie S. multijulga que pela sua beleza

exuberante é bastante utilizada como ornamental e na arborização urbana

(SANTOS & TEIXEIRA, 1990) assim como na recuperação de áreas degradadas

(RESENDE & KONDO, 2001), como é o caso de Senna macranthera e S.

multijuga, que interagem com outras espécies propiciando relações ecológicas

importantes com um alto nível de relações com outros organismos. Por ser uma

12

planta micorrizada, confere ao fungo simbionte uma interação e a uma

capacidade resistirem mais facilmente aos estresses ambientais.

Sobre a biologia reprodutiva desta espécie, sabe-se que ela possui um

sistema de cruzamento misto, a população pratica tanto a alogamia (fecundação

cruzada), quanto à autofecundação (RIBEIRO & LOVATO, 1999), que pode

levar a uma deficiência de heterozigotos na população, além disso o

conhecimento a cerca da reprodução, pode auxiliar na determinação da

variabilidade genética das espécies (HAMRICK, 1987).

A etimologia do nome Senna multijuga é devido ao fato das folhas

apresentam grande número de jugas (foliólulos), é classificada como arvoreta a

árvore, tendo exemplares com 2 a 10 m de altura, a variação do diâmetro à

altura do peito (DAP) entre 20 a 30 cm, e em indivíduos com idade adulta chega

em torno de 20 m de altura e por conseqüência um DAP de ~ 60 cm. Possui

tronco não muito extenso, pouco tortuoso, de aspecto retilíneo, a casca

considerada levemente espessa de até 5 mm, não muito áspera possui um

aspecto mais liso com presença de liquens que faz aparecer manchas claras

(Figura 3) (CARVALHO, 2004).

Figura 3 – Senna multijuga Rich. (A) Árvore adulta de aproximadamente 20 m de altura,

presente na RPPN Serra do Teimoso, município de Jussari, Bahia; (B) Tronco: presença de

manchas claras em uma árvore adulta de Cobi.

13

As folhas de S. multijuga são compostas e possuem raquis de até 30 cm

ou mais, reunidas em folíolos opostos. A espécie possui flores atraentes e

exuberantes, de cor amarelo-vivo ou amarelo-ouro, perfumadas, com 4 cm de

diâmetro, dispostas em panícula terminal variada com até 30 cm de

comprimento, revestindo inteiramente a copa (Figura 4).

Figura 4 – Fotos (A) Folha de S. multijuga Rich., (B) Copa da árvore com suas flores dispostas

em cachos, flor exuberante que se destaca.

A dispersão de frutos e sementes se dá através da autocória

(mecanismo em que a própria planta dispersa suas sementes). No caso de S.

multijuga a autocoria ocorre principalmente por barocoria ou seja, por gravidade.

É uma espécie caducifólia, ou seja, em uma determinada época do ano perde

totalmente suas folhas. Do tipo legume, seu fruto possui o formato reto,

lateralmente achatado, de cor castanho escuro, deiscente, contendo 20 a 32

sementes (MALUF, 1992), sendo estas lustrosas e unisseriadas (Figura 5). As

sementes desta espécie compõem o banco de sementes no solo. Um

reservatório viável de sementes não germinadas da espécie, que possivelmente

possam vir a substituir as plantas adultas. Uma vez que a recolonização da

vegetação em um ambiente perturbado acontece através do banco de sementes

presentes no solo, tornando esta espécie muito importante para programas de

manejo.

14

Figura 5 – Fotos (A) Indivíduo adulto de S. multijuga Rich. mostrando a perda de suas folhas

periodicamente (árvore caducifólia), (B) Frutos. (Fontes: Foto (A) AMORIM, J. S.; Foto (B)

http://w3.ufsm.br/herbarioflorestal).

Considera uma pioneira, tem uma maior capacidade de absorver certos

nutrientes, como estratégias de estabelecimento rápido, característica esta que

esta relacionada com o potencial de crescimento independente da disposição de

nutrientes, pois têm um sistema radicular mais desenvolvido e com muitas raízes

finas, que lhe proporcionam um aumento significativo nas taxas de crescimento

e absorção de nutrientes que outras arbóreas (DUBOC & GUERRINI, 2007).

2.6. Marcadores SSR

O número de estudos de biodiversidade, recorrendo a abordagens

moleculares, como a genética de populações e a sistemática molecular têm

aumentado consideravelmente (AVISE, 2000). A análise genética permite

compreender sobre a diversidade e a variabilidade do que se está sendo

mantido (SEOANE et al., 2005). Os recursos genéticos referentes às espécies

nativas estão seriamente ameaçados pela progressiva destruição de seu habitat,

tornando se necessária a utilização de uma técnica eficiente para se obtenção

de informações sobre disposição da variação genética nas populações destas

espécies. Sendo assim o uso de marcadores moleculares, se torna uma opção

15

viável para atingir estes objetivos, além de gerar informações importantes para

um eficiente plano de conservação e manejo (FERREIRA & GRATTAPAGLIA,

1996; HAIG, 1998).

As análises com DNA têm sido muito utilizadas. Assim que se obtém

uma quantidade satisfatória de marcadores genéticos vários aspectos

importantes para conservação, podem ser verificados, representando uma

poderosa ferramenta de estimação de parâmetros genéticos como dispersão,

fluxo gênico, tamanho efetivo populacional, diversidade genética, número de

alelos presentes nas populações, endogamia e identificação de alelos

exclusivos, além de poder estimar a área mínima viável, a divergência genética

entre as populações, para futuramente aferir sobre a história evolutiva das

mesmas (ROED, 1998).

Sabe-se que no genoma dos eucariotos existe a presença de

seqüências de DNA repetitivo. Os microssatélites ou SSR (Simple Sequence

Repeats) são pequenas seqüências de DNA repetidas em tandem compostas de

número variável de motivos com 1 a 6 pb encontrados no genoma, e estão

presentes tanto em regiões codificadas como não codificadas

(CHARLESWORTH, 1995). São consideradas regiões instáveis do genoma,

estando sob alterações mutacionais, com taxas mais elevadas que as

observadas nas regiões de DNA não repetitivo. Esta instabilidade gera um

grande número de locos, altamente polimórficos e multiálelicos, que representam

a classe mais polimórfica de marcadores moleculares atualmente disponíveis,

podendo ser isolados através do enriquecimento de bibliotecas genômicas

(FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996).

Através da técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) é possível

amplificar os mais variados tamanhos de fragmentos, utilizando primers que

flanqueiam estas regiões. Assim, a variabilidade existente pode ser analisada.

Um fator determinante para a variação dos microssatélites é a quantidade de

repetições em um loco. O número pode variar e, com isso, alguns locos podem

demonstrar uma maior quantidade de alelos (ENGEL et al., 1996). Assim, esses

marcadores são tidos como ideais, por demonstrarem através de suas variações

o polimorfismo, principalmente por possuírem herança codominante. Além disso,

são constantemente encontrados no genoma, visando solucionar responder

questões referentes a estudos genéticos.

16

Os marcadores microssatélites têm sido empregados em diferentes

situações, incluindo variedades e culturas agrícolas. Isso se estende também

para as espécies florestais, ampliando o conhecimento na elaboração de

estratégias de conservação, através de estudos de genéticas de população

realizados com aplicação a longos prazos (BORÉM, 2007).

Alem de serem baseados em PCR e, portanto necessitarem de uma

pequena quantidade de DNA são reproduzíveis e estão dispersos no genoma.

Contudo, todas as facilidades deste marcador dependem da disponibilidade das

seqüências de DNA que flanqueiam o microssatélites: os primers. Tornando

assim o uso de marcadores microssatélites em espécies nativas um tanto quanto

limitadas devido às escassas informações sobre as seqüências de DNA de

espécies tropicais e em geral também devido ao alto custo de trabalhos

envolvidos na construção de bibliotecas genômicas, clonagens e

seqüenciamentos necessários para o isolamento de microssatélites e o

desenvolvimento dos primers. Porém este custo é totalmente compensado pela

ampla gama de pesquisas que se podem ser feitas a partir do momento que se

obtém tal tecnologia para uma determinada espécie. (GRATTAPAGLIA, 2001).

2.7. Estratégias de desenvolvimento SSR

A utilização de SSRs se mostra como uma boa perspectiva para estudos

genéticos. A alta reprodutibilidade desta técnica, garantida pelas regiões

flanqueadoras (conservadas), que fornecem primers que se anelam nestas

regiões garantem que o polimorfismo de uma determinada espécie seja

analisado, tornando a utilização destes marcadores em análises genéticas, um

sucesso.

Uma questão limitante para o uso dos microssatélites está relacionada

ao seu desenvolvimento. A estratégia tradicional de desenvolvimento é bastante

complexa e cara, pois demanda tempo e envolve a construção de uma biblioteca

genômica, hibridização com sondas repetitivas, clonagem, transformação,

seqüenciamento, seleção desenho e síntese de primers (OLIVEIRA, 2006).

Várias metodologias relacionadas à obtenção de primers têm sido

desenvolvidas. As mais comuns se baseiam em clonagem, outras em PCR

(COOPER et al., 1997), outras ainda se baseiam em enriquecimento com

insertos contendo microssatélites que tem se sido muito utilizada devido ao

17

sucesso com os resultados encontrados (OSTRANDER et al., 1992; GLENN,

1997; DAWSON et al., 1997). Outra estratégia que também tem sido usada para

minimizar os custos e atenuar os gastos relacionados a realização dos primers

tem sido a NGS (next-generation sequencing) uma tecnologia que auxilia a

rápida identificação de numero significativo de motivos SSR, em um tempo

menor sendo mais eficiente comparada com outras ações de localização dessas

seqüências, conferindo-lhes vantagens deste método em relação aos outros. A

sua capacidade de produzir inúmeras quantidades de seqüências contendo

motivos SSR, que posteriormente serão utilizadas para o desenho dos primers,

torna esta metodologia vantajosa com a possibilidade da rápida aplicação e do

baixo custo para a descoberta de seqüências repetidas simples (ZALAPA et al.,

2012).

Outra questão que merece destaque é a possibilidade que os iniciadores

para uma determinada espécie, fornecem ao amplificar segmentos de DNA

desenvolvidos em outra(s) espécie(s), o que é entendido por transferibilidade.

Por ser uma das etapas bastante onerosas a aquisição de novos SSR para uma

determinada espécie, fazer o teste de primers já publicados na literatura, para

plantas de táxons relacionados tem sido uma das formas de tornar mais barata,

a detecção de polimorfismo em novas espécies, considerando que uma vez que

não existem primers desenvolvidos atualmente e comercialmente disponíveis

para todas as espécies vegetais (ECHT et al., 1996).

Mesmo diante de algumas limitações para o desenvolvimento prévio das

seqüências (primers) específicas para cada espécie a ser trabalhada, as suas

vantagens são bastante atrativas, tornando este marcador ainda assim

freqüentemente requisitado para trabalhos de genética molecular, melhorando a

qualidade dos resultados e proporcionando eficiência em relação aos dados

genéticos gerados nestes estudos (SOUZA, 2001).

18

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Coleta de Material Vegetal e extração de DNA

Para o desenvolvimento e caracterização dos locos de DNA

microssatélites foram coletadas amostras de folhas de 32 indivíduos adultos de

S. multijuga provenientes de uma população localizada na RPPN Serra do

Teimoso no município de Jussari – Bahia.

Para a construção da biblioteca genômica foi utilizado o DNA genômico

total extraído de um único indivíduo de S. multijuga, coletado nas dependências

da Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC, sendo que os demais

indivíduos amostrados foram utilizados na etapa de caracterização dos locos

microssatélites.

O DNA genômico total foi extraído pelo método CTAB (DOYLE &

DOYLE, 1990) utilizando protocolo otimizado por Ferreira e Grattapaglia (1998),

com auxílio de um homogenizador de tecido celular (Precellys 24) para a

maceração das amostras. A quantificação do DNA extraído foi feita por método

comparativo utilizando padrões de peso molecular conhecido (DNA fago

Lambda), em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo.

3.2. Construção da Biblioteca Genômica Enriquecida

O isolamento e identificação dos locos microssatélites do genoma

nuclear de S. multijuga se deu a partir da construção de uma biblioteca

genômica enriquecida para dinucleotideos CA e GA, conforme protocolo

previamente descrito por Billotte et al.(1999).

19

a) Restrição do DNA

Para a construção da biblioteca genômica utilizou-se aproximadamente

10 μg de DNA genômico, extraído de um único individuo de S. multijuga. Em

seguida, o DNA foi clivado pela ação da enzima RsaI visando obter fragmentos

entre 200 e 800 pb. A enzima RsaI possui como sítio de restrição a seqüência

GT’AC, sendo um sítio palindrômico e que resulta em moléculas de DNA com

extremidades abruptas (Figura 6). A reação de clivagem constituiu de 25 μL de

DNA (250 ng/ μL), 5 μL de enzima RsaI (10 u/ μL), 10 μL de tampão de reação

(50 mM Tris-HCl - pH 7,8; 10 mM MgCl2; 10 mM DTT; 25 µg/ml BSA) e água

MiliQ autoclavada até completar 100 μL de reação que foi incubada a 37 °C por

3 horas.

Figura 6 - Esquema ilustrando a reação de clivagem do DNA pela enzima RsaI. A) Nucleotídeos

em vermelho representam o sítio de clivagem, N representa um nucleotídeo qualquer. B) Setas

amarelas representam o local de corte da enzima. C) Resultado da clivagem: moléculas com

extremidades abruptas.

20

Para obter apenas os fragmentos de DNA desejados todo o produto da

clivagem foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1% por duas horas a

uma potencia de 70 V, utilizando marcador de peso molecular Ladder 1kb plus

(Invitrogen) para a identificação dos tamanhos dos fragmentos. E como

resultado deve ser observado um smear uniforme. Após a identificação dos

fragmentos desejados (entre 200 e 800pb), foi feito um corte no gel de agarose,

correspondente à região que continha estes fragmentos, e em seguida

procedeu-se à purificação do DNA.

b) Ligação dos adaptadores

Os fragmentos selecionados e purificados foram posteriormente ligados

a adaptadores ou linkers Rsa21 (5’ - CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA - 3’);

Rsa25 (5’ TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A - 3´). Os adaptadores

usados sempre são complementares aos sítios de corte da enzima usada na

digestão. Desta forma, reconstituindo o sítio de corte.

A ligação dos adaptadores aos fragmentos digeridos de extremidade

abrupta com a enzima T4 DNA ligase (Amershan Pharmacia Biotech) foi

realizada por meio de uma reação contendo 1,5 µL do adaptador Rsa21 (10 µM)

e 1,5 µL do adaptador Rsa25 (10 µM), 3,0 µL do DNA genômico digerido no

passo anterior, 5,0 µL do tampão 5X (50 mM Tris-HCl, pH 7,8; 10 mM MgCl2;

10 mM DTT; 25 µg/ml BSA), 2,0 µL de T4 DNA ligase (1 u/μL, Promega) e água

milliQ autoclavada para completar 50,0 µL. Esta reação foi incubada a 20°C por

2 horas.

c) Pré-Amplificação

Para gerar uma maior quantidade de DNA para a seleção, os

fragmentos digeridos foram submetidos a uma PCR utilizando como primer a

seqüência complementar aos adaptadores Rsa21 e Rsa25. Após a ligação os

fragmentos foram amplificados utilizando 5 µL do produto da ligação; 2,0 µL do

primer Rsa21 e Rsa 25 (10 µM); 5,0 µL de tampão 10 X (50 mM KCl; 10 mM de

Tris-HCl, pH 8,9); 1,5 µL de MgCl2 (50,0 mM); 4µL de dNTP (2,5 mM), 5 µL de

Taq DNA polimerase (3 U/μL) e água milliQ autoclavada para completar 50,0 µL.

A reação foi submetida PCR com etapa inicial de desnaturação a 95°C por 4

21

minutos, seguida de 20 ciclos de 94°C por 30 segundos, anelamento a 60°C por

1 minuto e extensão 72°C por 1 minuto, com uma extensão adicional a 72°C por

8 mim. Os fragmentos amplificados foram purificados utilizando o Kit “Quiaquick

PCR purification Kit” (Qiagen cat. #28104) seguindo as especificações do

fabricante.

d) Seleção dos fragmentos contendo SSR

O processo de enriquecimento foi realizado através da hibridização de

oligonucleotídeos conjugados à biotina. As sondas utilizadas foram: (GT)8 e

(CT)8, complementares a seqüências repetitivas CA, e GA respectivamente

(Figura 7). A fração contendo os fragmentos de DNA previamente ligados aos

adaptadores foi incubada a 95°C por 15 minutos para a desnaturação da dupla

fita. Ao DNA desnaturado foi adicionado 3 µL de cada oligonucleotídeo

biotinilado.

Figura 7 – Ilustração esquemática mostrando preparação do complexo sonda-beads, (A) Biotina,

(B) Oligos, (C) Sonda biotiniladas, (D) Bead, (E) Estreptavidina, (F) Complexo sonda-beads.

Os fragmentos contendo as repetições selecionadas foram recuperados

por estreptavidina ligada a micro esferas magnéticas “beads” (Figuras 7 e 8). As

22

esferas magnetizadas ligadas aos fragmentos de interesse foram atraídas por

imã acoplado a um rack, posicionado lateralmente ao tubo. Posteriormente, os

fragmentos selecionados foram lavados com 250 µL de água milliQ autoclavada.

Figura 8 – Fotos de fragmentos contendo as repetições selecionadas sendo recuperados por

estreptavidina ligada a microesferas magnéticas “beads”.

A solução de hibridização foi incubada em temperatura ambiente sob

constante agitação e, após 20 minutos, foram adicionadas as beads magnéticas

previamente lavadas seguindo as recomendações do fabricante. Magnetizou-se

por 30 segundos, e sem retirar do magnetizador, aspirar e descartar o

sobrenadante; Homogeneíza por inversão, suavemente, em 300 μL de SSC

(Solução Padrão de Citrato Salino, do inglês Standard Saline Citrate) 0,1X. Em

seguida foi repetida as duas etapas anteriores 3 vezes; Após ressuspendeu-se

em 100 μL de água MilliQ, magnetizou e esperou por 30 segundos; Transferiu-

se o sobrenadante para um novo tubo, devidamente identificado, e em seguida,

ressuspendeu-se mais uma vez com 150 μL de água MilliQ. De forma que no

final teremos 250 μL de fragmentos selecionados; que foi conservado a -20°C.

e) Amplificação dos fragmentos selecionados via PCR

Após a seleção dos fragmentos enriquecidos, a amplificação ocorre via

PCR utilizando os fragmentos selecionados como DNA molde. Logo, objetiva-se

aumentar exponencialmente os fragmentos selecionados pelas sondas para

serem usados na clonagem, utilizando como primer os adaptadores Rsa21 e

Rsa25. A amplificação foi realizada contendo 20 µL do produto da ligação; 4,0

µL do primer Rsa21 e Rsa25 (10 µM); 10 µL de tampão 10 X (50 mM KCl; 10

mM de Tris-HCl pH 8,9); 6,0 µL de MgCl2 (25 mM); 8 µL de dNTP (2,5 mM), 0,5

23

μL de Taq polimerase (Invitrogen) e água milliQ autoclavada para completar

100,0 µL. Esta reação foi submetida a uma etapa inicial de desnaturação a 95°C

por 1 minuto, seguida de 25 ciclos de 94°C por 40 segundos, 60°C por 1 minuto

e 72°C por 2 minutos. Um último passo de extensão à 72°C por 5 minutos foi

adicionado após o último ciclo. Para controle aplicou-se 10 μL da reação de

amplificação mais 2 μL de stop (tampão de carregamento contendo azul de

bromofenol) em gel de agarose a 1% a uma potencia de 70V. Corado em

brometo de etídeo por 20 minutos.

f) Clonagem em vetor pGEM-T e transformação em células competentes

Após a amplificação, os fragmentos ricos em repetições foram inseridos

no vetor de clonagem, 6 µL do produto da PCR foram ligados a 1 µL do vetor

pGEM-T Easy (Promega), segundo o protocolo fornecido pelo fabricante, e

foram transformados em células XL1-Blue competentes. Esse vetor foi utilizado

para transformar, através de choque térmico, bactérias Escherichia coli, que

foram posteriormente cultivadas em meio de cultura sólido LB (25 g/L) contendo

ampicilina (100 μg/ml), 60 µL IPTG (24 mg/ml) e 60 µL X-Gal (20 mg/ml), em

placas de petri visando selecionar apenas os clones positivos (brancos). As

placas foram incubadas invertidas a 37 °C por 18 horas em estufa, para o

crescimento de colônias.

3.3. Seleção e seqüenciamento dos clones positivos

a) Amplificação dos insertos clonados

Após o crescimento, foram feitas reações de PCR de cada colônia

positiva utilizando o par de primer M13 próprio para o vetor pGEM-T Easy

(Promega), seguindo o seguinte protocolo: 13,25 μL de H2O, 2,0 μL de MgCl2

(25mM), 2,5 µL de tampão 10X (50 mM KCl; 10mM de Tris-HCl, pH 8,9), 2,0 μL

de dNTP (2,5 mM), 1,25 µL de Rsa21 (10 µM), 2,0 μL de Taq DNA polimerase e

2,0 μl de DNA (clone positivo). Esta reação foi submetida a um passo inicial de

desnaturação a 95ºC por 4 minutos, seguido de 30 ciclos (94ºC por 30

segundos, 52ºC por 45 segundos, 72ºC por 1 minuto e 30 segundos) e um

passo final de extensão a 72ºC por 8 minutos. Para checagem, 5 µL do volume

da reação mais 3 µL de “tampão de carregamento” foi utilizado na eletroforese

24

em gel de agarose 1,5% (p/v) tamponado em TBE 1X a 100V por uma hora e 30

minutos.

b) Purificação e seqüenciamento

Os produtos da PCR foram então purificados, posterior a isso as

amostras foram preparadas para a reação de seqüenciamento para isso aplicou-

se em cada reação 125 μL de isopropanol 75% (4:1), 100 μL de isopropanol +

25 μL de água MilliQ, e deixa overnight; Centrifugou-se por 90 mim na rotação

máxima e desaceleração de 30 em 30 rpm; Descartou-se o sobrenadante

(inverter a placa no descarte) e deixou-se secar em papel e depois dar um spin

de até 500 rpm; Aplicou-se 150 μL de álcool 70% e centrifuga-se por 90 mim;

Descartou-se o sobrenadante (inverter a placa no descarte) e deixou-se secar

em papel e depois dar um spin de até 500 rpm; Secaram-se as amostras no

termociclador a 40°C por 10 mim; Ressuspendeu-se cada amostra em 25 μL de

água MilliQ.

Depois de feita a purificação, a seqüência de cada clone selecionado foi

determinada através da análise em um seqüenciador automático modelo ABI

3100 (Applied Biosystem).

A reação de seqüenciamento, foi realizada apenas para uma das fitas,

com 1 μL DNA purificado, utilizando o primer Rsa21, com o kit de reação de

seqüenciamento Dyenamic de acordo com as instruções do fabricante. As

seqüências foram analisadas e editadas utilizando o programa Bioedit (HALL,

1999) e a detecção dos locos microssatélites foi realizada com auxilio do

programa SSRLocator (MAIA et al. 2008).

3.4. Desenho dos primers e otimização dos locos

Os pares de primers para as regiões ricas em microssatélites foram

desenhados a partir da análise das seqüências de DNA obtidas, utilizando o

programa PRIMER 3 Web (ROZEN & SKALETSKY, 2000), o qual considera os

seguintes critérios: temperatura de melting, percentual de GC, possibilidades de

formação de dímeros, runs e tamanho dos primers, bem como o tamanho do

produto de PCR

Foram adotados parâmetros para identificação das regiões de interesse,

e em virtude destes parâmetros algumas seqüências foram excluídas da análise.

25

Para desenho dos pares de primers referentes às seqüências selecionadas,

algumas opções pré-estabelecidas pelo programa foram alteradas, buscando

assim primers com:

a) Porcentagem de GC entre 40 e 60%;

b) Temperatura de “melting” Tm entre 50 e 65°C;

c) Comprimento de 17 a 22pb;

d) Exclusão de iniciadores com três ou mais bases – “runs” na porção

3’;

e) Exclusão de iniciadores com mais do que sete bases “runs” em

qualquer outra posição;

f) Exclusão de estruturas secundárias (Harpins e loops);

g) Produto de amplificação entre 100 e 250 pb.

Os primers selecionados após estes critérios foram então sintetizados

pela empresa Sinapse. Para cada par de primer sintetizado, foram realizadas

testes de amplificações visando alcançar as melhores condições para

amplificação dos locos.

Para as reações de amplificação foi utilizado: 3 μL de DNA (2,5 ng), 4,3

μL de primer (0,9 μM), 0,4 μL de Taq DNA polimerase, 1,3 μL dNTP (2,5mM),

1,3 μL tampão de reação 10X, 1,3 μL de BSA (2,5 mg/ml), 0,8 μL de MgCl2 (25

mM) e 0,6 μL de água MiliQ, totalizando 13 μL de reação. As reações de PCR

foram realizadas em termociclador GeneAmp ® PCR System 9700 da Applied

Biosystems, utilizando as seguintes condições: 94ºC – 5 minutos, 30 ciclos de 94

ºC - 1’, temperatura de anelamento sugerida pelo programa PRIMER 3 - 1’ e 72

ºC - 1’, finalizando com 72 ºC - 5 minutos. Os produtos amplificados foram

analisados em gel de agarose 2% e comparados ao padrão 1Kb DNA ladder

(Fermentas) para a estimativa dos tamanhos em pares de base. Os locos que

não apresentaram, em gel de agarose, mais a presença de uma banda foram re-

amplificados, modificando-se a temperatura de anelamento dos primers até se

alcançar a temperatura ótima. Assim, após a otimização das condições de

amplificação, os locos que apresentaram como produtos de amplificação bandas

bem definidas e robustas em gel de agarose 2%, foram selecionados para

análise de polimorfismos. As amplificações foram padronizadas para cada loco,

variando a temperatura de anelamento. Alguns primers sintetizados não

26

apresentaram amplificação satisfatória independentemente das condições

testadas, sendo então excluídos das análises posteriores.

3.5. Caracterização dos Locos Microssatélites

Para a análise de polimorfismos em foram utilizados 32 indivíduos de S.

multijuga. As estimativas dos tamanhos dos alelos foram feitas utilizando-se

padrão de DNA Ladder 10 bp (Invitrogen). Posteriormente, para cada loco

polimórfico selecionado, foi realizada a reação de PCR seguindo o procedimento

citado anteriormente item 3.4.

Após a otimização, os produtos amplificados fluorescentes foram

diluídos e analisados em seqüenciador automático de DNA ABI 3100 (Applied

Biosystems). Para a estimativa do tamanho dos alelos foi utilizado o padrão

interno de peso molecular (Applied Biosystems). A genotipagem foi realizada

utilizando o programa GeneMarker.

3.6. Estimativas dos parâmetros genéticos

As estimativas dos parâmetros genéticos para a caracterização dos

locos microssatélites foram realizadas com base na genotipagem dos 32

indivíduos amostrados de S. multijuga. Foram estimados os seguintes

parâmetros de diversidade genética: Número de alelos por loco (Na); a

heterozigosidade observada (HO); diversidade gênica (HE) (WEIR, 1996); a

probabilidade de exclusão de paternidade (Q), que indica a probabilidade de um

indivíduo, amostrado ao acaso na população, não possuir o mesmo perfil

genético que o pai de uma determinada progênie; a probabilidade de identidade

genética (I) (PAETKAU et al.,1995), que corresponde à probabilidade de dois

indivíduos amostrados ao acaso, em uma mesma população, apresentarem um

mesmo perfil genético; índice de fixação (F) e a presença de alelos nulos (Null

Alleles), usando os programas Cervus (MARSHALL et al., 1998), Fstat293

(GOUDET, 2002) e Micro-Checker (VAN OOSTERHOUT et al., 2004).

.

27

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Existem espécies que facilitam o restabelecimento dos ecossistemas

florestais, recuperando-os de forma mais eficiente. Segundo Ricklefs (1996)

essas espécies propiciam ambiente agradável fornecendo o estabelecimento de

outras. Como S. multijuga é uma espécie com essas características, os

resultados gerados neste trabalho, auxiliarão, em médio prazo, estudos

populacionais com vistas a ampliação do conhecimento genético acerca de S.

multijuga para usá-la em estratégias de restauração de áreas degradadas.

4.1. Extração de DNA

A extração de DNA garantiu que o procedimento posterior de

desenvolvimento da biblioteca enriquecida fosse executado, contudo o

precipitado final apresentou-se sempre com uma coloração marrom escuro,

sendo notável ainda a presença de alguns compostos fenólicos e

polissacarídeos, juntamente com uma viscosidade, comumente presentes nas

espécies do gênero. Somente para efeito ilustrativo, a qualidade e a

concentração do DNA extraído dos 32 indivíduos podem ser verificadas na figura

9.

28

Figura 9 – Extração de DNA de 36 indivíduos de Senna multijuga Rich. pelo protocolo de

Ferreira e Grattapaglia (1998). Análise da qualidade e concentração de DNA pela comparação

com padrões de 10 ng (λ1) e 30 ng (λ2) de DNA do fago λ, atráves de eletroforese em gel de

agarose 0,8% TBE 1X (120 V), corado com Brometo de etídio.

4.2. Construção da Biblioteca, Seqüenciamento e Desenho dos Primers

Com a finalidade de obter uma biblioteca genômica enriquecida para

locos SSR todas as etapas foram realizadas com êxito. A clivagem do DNA

genômico total de S. multijuga utilizando a enzima RsaI ocorreu de forma

satisfatória. A figura 10 mostra o resultado da clivagem do DNA com RsaI

demonstrando a faixa de fragmentos obtidos entre 200 e 800pb, produzindo um

perfil adequado para a construção da biblioteca.

29

Figura 10 – Produto da clivagem do DNA de S. multijuga Rich. utilizando a enzima RsaI,

mostrando a faixa dos fragmentos obtidos após a restrição.

O uso de adaptadores conhecidos garantiu que cada fragmento tivesse

uma terminação comum. A ligação dos adaptadores foi confirmada através da

pré-amplificação, obtendo uma maior quantidade de DNA para a seleção.

Cada etapa desenvolvida foi realizada com sucesso, desde o

enriquecimento, passando pela transformação e clonagem, até o

seqüenciamento, assim sendo foi possível evidenciar um bom número de clones

positivos isolados contendo os elementos de repetição. Através do

enriquecimento com os motivos SSR, (CT) e (GT), para o desenvolvimento da

biblioteca genômica de S. multijuga resultou no isolamento de 192 clones

positivos, dos quais 140 evidenciaram, após seqüenciamento, regiões ricas em

microssatélites, correspondendo a (72,91%) dos clones positivos identificados, o

que representa um ótimo índice de enriquecimento das colônias.

No total foram identificados 140 microssatélites, sendo 17

dinucleotídeos, 83 trinucleotídeos e 40 tetranucleotídeos de acordo com a

classificação proposta por Powell et al. (1996), como pode ser observado na

figura 11. Além disso, os microssatélites também podem ser classificados

através de seus motivos, pelos tipos de seqüências repetitivas, como perfeitos,

30

imperfeitos ou compostos (WEBER, 1990), neste caso 100% os motivos foram

classificados como sendo compostos, persistindo a existência de repetição de

mais de um tipo de motivo. E em outra classificação, quanto ao número de pares

de bases encontrados (TEMNYKH et al., 2001), foi possível verificar que entre

os SSRs desenvolvidos, 36,36% foram classificadas como Classe I (>20pb),

45,45% como Classe II (entre 12 a 20 pb) e 18,18% não se incluíram em

nenhuma das duas classes.

É sabido que os locos SSR dinucleotídeos perfeitos, com maior número

de repetições, são considerados ideais para obtenção de marcas altamente

informativas por apresentarem níveis de polimorfismo maior, em decorrência da

taxa de mutação ser superior aos tri e tetranucleotídeos, por isso são

amplamente utilizados em estudos genéticos (ELLEGREN, 2004).

Geralmente primers com poucos motivos, com apenas duas repetições

são descartados, pois são considerados pouco práticos na discriminação de

acessos (WEBER, 1990; STRASSMANN et al., 1996; SCHLÖTTERER & HARR,

2000; ZHU et al., 2000; SIGRIST et al., 2009), uma vez que quanto maior o

número de repetições, maior a chance de detecção de polimorfismo. Contudo

mesmo com a presença de protomicrossatélites, ou seja repetição de poucas

bases, foi possível uma detecção satisfatória do polimorfismo encontrado para

os locos caracterizados, já que os locos com números mínimos de repetições

ocorrem por erros da DNA polimerase e participam efetivamente na evolução

dessas seqüências.

Microssatélites Complexos também foram identificados em grande

número neste estudo. Estes se caracterizam pela presença de mais de duas

unidades de repetição justapostas, como por exemplo:

(TAT)2(TAG)2(AAAT)3(AC)6.

31

Figura 11 – Proporção dos motivos SSR encontrados na biblioteca genômica enriquecida

construída para Senna multijuga Rich.

A porcentagem obtida de microssatélites puros foi baixa comparada às

observadas em bibliotecas do genoma humano (WEBER, 1990), de pato

(HUANG et al., 2006) e de outras arbóreas (BRAGA et al., 2006, COLLEVATTI

et al., 1999, GAIOTTO et al., 2001).

Repetições abaixo de seis unidades foram mais abundantes do que

aquelas com o número acima de seis. Dentre os 16 microssatélites desenhados

somente 2 apresentaram tamanho maior que 6 unidades de repetição,

caracterizando 12,5% do total de microssatélites. A intensa presença de

protomicrossatélites conseqüentemente fez com que das 140 seqüências

selecionadas contendo motivos SSR, 124 fossem posteriormente descartadas,

além disso, algumas seqüências tinham a presença dos microssatélites nas

extremidades do inserto, não apresentando, portanto a região flanqueadora para

desenho dos primers, ou então o número de repetições eram muito baixos.

Neste trabalho foi obtido cerca de 400 colônias contendo inserto. A partir

dessas colônias 192 clones foram seqüenciados deste total, 140 apresentaram

seqüências microssatélites (72,91%) (Figura 12 ). Com base nessas seqüências

que continham SSR, foram desenhados 16 pares de primers (11,42%) (Figura

12), as demais 124 seqüências que continham microssatélites não foram

32

utilizados, pois não estavam adequados para desenho do primer. Desta forma o

rendimento total de seqüências que puderam ser utilizadas para desenho de

primers a partir do total de clones seqüenciados foi de 8,33%.

Embora relativamente baixo o valor, devemos considerar que a

construção de uma biblioteca enriquecida independente do dinucleotídeo de

enriquecimento, cada etapa, por ser dispendiosa, apresenta uma potencial perda

de regiões que contenha SSR. O sucesso para o desenvolvimento desta

ferramenta envolve diversos passos desde a obtenção até o desenvolvimento de

primers funcionais, e sem dúvida em cada etapa existe a possibilidade de perda,

sendo o numero final de locos que irá propiciar um numero suficientes de

fragmentos amplificados significando apenas uma porção dos clones

originalmente seqüenciados da biblioteca (SQUIRRELL, 2003).

Figura 12 – Fluxograma das etapas da obtenção de microssatélites para o desenho dos primers.

De todos os fragmentos que apresentaram repetições SSR, 16

possibilitaram o desenho dos primers sob as condições estabelecidas. Destes

locos microssatélites isolados cujos pares de primers foram desenhados e

sintetizados, otimizou-se as condições de amplificação de 12 locos, todos

33

apresentaram amplificação facilmente interpretável à temperatura de anelamento

igual a 56°C, dos quais 8 estão dispostos para visualização na figura 13.

Figura 13 - Produtos amplificados detectados para os 8 locos dos 12 microssatélites de S.

multijuga Rich. em gel de agarose 2%, após otimização das condições de amplificação dos

locos. Ladder 1kb Fermentas.

O conjunto desses 12 locos que apresentaram produtos de PCR

robustos e claramente interpretáveis em gel de agarose 2% foi utilizado para

avaliação de polimorfismo. Assim, os locos foram identificados utilizando o

prefixo “SM” (de Senna multijuga) em ordem crescente conforme observado na

tabela 1.

34

Tabela 1 - Locos microssatélites de Senna multijuga Rich. com o motivo de repetição, a sequência Forward

e Reverse, a Temperatura de anelamento (Ta°C) e a variação do tamanho (pb) dos alelos encontrados.

Loco Motivo de repetição Sequencia do Primer (5’ – 3’) Ta (°C)

Variação de tamanho (pb)

SM06 (AGA)2(GAT)2(CTT)2(TTAG)3 F:TCGATCTCTCGCAGAGTCCT

R: CGGTCGCCTAGGTTACAATC

56 236 – 288

SM08 (GTTG)2(AGG)2 F:GACTGCTCAACTTGCCTTCA

R:TCCGATAATCCTCGACGGTA

56 159 – 187

SM18 (TAT)2(TAG)2(AAAT)3(AC)6 F:AGCCCAGGAGATGTCATTGT

R:ATTGGCAAACAATCCCTTTG

56 196 – 212

SM21 (TAC)2(TAC)2(TCTT)2(AAC)7 F:TCAGCTGGCTATAGTCTAGTTTTGA

R: CTACAGCCAACCCCACCTAA

56 146 – 204

SM22 (AGGC)2(AGG)2 F:GCATCCAGGAGGACCTACAA

R:TTCGATCTCCACGATCATCA

56 236 – 258

SM24 (GCAA)2(ATGC)2(ATC)2(TA)4 F:GCAACAATGGAAACGGCTAT

R:CCACCGTTCTTAAACGGAAA

56 277 – 295

SM25 (CTT)2(TTAG)4(GGTT)2(CAA)2

(TAATT)2(CTAT)2

F:TCCTAGCCCTTCTTGGGATT

R:CCGAGATGGACGCTATACCT

56 253 – 267

SM31 (TA)5(GTG)2(GCG)2 F:TGCATGTATATGATACTGCGTGTG

R:GCCACCTCACATCAACACC

56 119 – 131

SM39 (AGA)2(TAG)2(GAT)2(CTT)2(TTAG)3 F:TCGACGGAGCCTCTAGCTTA

R:AAGCAGTCGCCTAGGTTACAA

56 230 – 254

SM75 (TTC)2(GAG)2(GTG)3 F:GAGCACCTGAACGCAATACA

R:TTGGTGCAGTGGAAGTTGAG

56 177 – 197

SM81 (CTAA)3(AAG)2(ACT)2(TCT)2 F:AGCGGTCGCCTAAGTTACAA

R:GACCTCTCATGGAGCCTCTG

56 233 – 251

SM151 (CGC)5 (AC)7 (AT)7

F: ACCACCACCGTCGTCACTA

R:AAGTTCCATTGTCCGCAATAA

56 240-264

4.3. Caracterização dos locos microssatélites

Do total de 12 locos obtidos somente o loco SM18 apresentou-se como

monomórfico para os 32 indivíduos analisados. Todos os demais foram

polimórficos nas análises realizadas em sistema multiplex. Os 12 locos

analisados apresentaram um número de alelos, variando entre dois (locos SM21,

75 e 81) e dez (loco SM151) (Figura 14), os quais geraram a média de alelos de

4,58 (Tabela 2).

35

Figura 14 – Número de alelos por loco polimórfico do presente estudo.

Mesmo com estes locos possuindo um baixo número de alelos, foi

possível observar um alto índice de polimorfismo quando analisamos os 16

pares de primers inicialmente sintetizados, pois destes 11 mostraram-se

polimórficos ao final da construção da biblioteca enriquecida para S. multijuga,

tendo uma eficiência de 68,75%.

Para a obtenção de um número relevante de primers microssatélites

polimórficos, é necessário que um grande número de clones positivos seja

seqüenciado. Considerando a biblioteca neste estudo, foram seqüenciados 192

clones positivos a partir dos quais foram obtidos 140 (72,91%) fragmentos que

apresentaram repetições SSR. Desses 140 fragmentos, foram obtidos 16

(11,42%) pares de primers viáveis, dos quais 11(68,75%) mostraram-se

polimórficos entre os indivíduos testados.

A eficiência encontrada no presente trabalho foi superior a encontrada

em alguns estudos para outras espécies arbóreas, Collevatti et al. (2001), a

partir de uma biblioteca enriquecida obtiveram 28 locos microssatélites dos quais

35% dos pares de primers apresentaram-se polimórficos para a espécie

Caryocar brasiliense. Dutech et al. (2000) obtiveram 16 locos microssatélites

para a espécie Vouacapoua americana, dos quais 9 locos mostrara-se

polimórficos, ou seja 56%. Analisando os dados acima, nota-se que os

resultados obtidos no presente trabalho está de acordo com a maioria dos

36

trabalhos encontrados na literatura que utilizaram a mesma estratégia de

biblioteca enriquecida.

Os tamanhos dos alelos variaram entre 88 pb (loco SM31) e 270 pb

(loco SM25). A heterozigosidade observada variou entre 0,00 (loco SM18) e 0,61

(loco SM39) e a heterozigosidade esperada, os valores variaram de 0,00 (loco

SM18) a 0,87 (loco SM151). Com estes resultados, foi possível verificar que a

média de HE foi mais elevada que a de HO (Tabela 2), indicando que

possivelmente isto ocorre por conseqüência da biologia reprodutiva da espécie

já que, segundo Ribeiro & Lovato (1999), possui um sistema misto de

cruzamento com taxas autofecundação de 50%.

Tabela 2. Caracterização de 12 locos microssatélites para Senna multijuga Rich. Na: número de

alelos; HO: heterozigosidade observada; HE: Diversidade Gênica; Q: Coeficiente de exclusão dos

locos; I: Probabilidade de Identidade; F: Índice de fixação e Alelos Nulos.

Locos Na HE HO Q I F Alelos Nulos

SM06 8 0,85 0,30 0,53 0,94 0,46 Sim

SM08 6 0,19 0,13 0,98 0,33 0,15 Sim

SM18 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Não

SM21 2 0,36 0,30 0,93 0,52 0,07 Não

SM22 7 0,78 0,33 0,63 0,90 0,38 Sim

SM24 6 0,57 0,37 0,82 0,75 0,18 Sim

SM25 4 0,53 0,35 0,85 0,71 0,18 Sim

SM31 4 0,41 0,07 0,91 0,61 0,72 Sim

SM39 3 0,47 0,61 0,89 0,66 -0,16 Não

SM75 2 0,17 0,11 0,98 0,30 0,20 Não

SM81 2 0,50 0,00 0,87 0,62 0,99 Sim

SM151 10 0,87 0,13 0,45 0,96 0,73 Sim

Média 4,58 0,47 0,22 0,929* 1,6x10-8* 0,32 - *

Probabilidade combinada excluindo-se o loco SM18

Resultados como este em que a média das heterozigosidades

esperadas são maiores que as médias das heterozigosidade observadas

também foram encontrados para outras espécies arbóreas, como pode ser visto

para a maioria dos estudos listados na tabela 3, considerando que valores

próximos a 1,0 indicam um alto nível de indivíduos heterozigotos na

amostragem.

Além disso, a probabilidade de exclusão de paternidade combinada foi

de 0,929 o que demonstra o poder destes primers para testes de paternidade. O

37

coeficiente de identidade alélica foi de 1,6x10-8 apontando um valor considerável

para a identificação de individuos.

O software MicroChecker (VAN OOSTERHOUT et al., 2004), indicou a

presença de alelos nulos em alguns locos. Acredita-se que estes resultados

foram gerados pelo excesso de homozigotos na amostra. Variações (mutações)

são descritos em diversos sistemas de desenvolvimento de primers, ou seja são

freqüentes nos locos microssatélites. Essas mutações podem afetar a eficiência

da ligação primer/DNA molde, resultando em alelos não detectáveis,

denominados de alelos nulos ou silenciosos, que são resultado de mutações

como substituição, inserção e deleção, fazendo com que indivíduos

heterozigotos sejam falsamente designados como homozigotos (CALLEN et al.,

1993). Mas no caso da S. multijuga a detecção de alelos nulos encontrados na

amostra, possivelmente se deve ao fato do sistema reprodutivo da especie, que

alem de possuir uma baixa taxa de cruzamento, possui uma distribuição espacial

do tipo agregada, que permite a facilidade de indivíduos aparentados se

cruzarem entre si.

Tabela 3 – Comparação das características de locos microssatélites isolados para espécies

arbóreas. N: número de indivíduos; L: locos desenvolvidos; A: média de alelos por loco, HE:

heterozigosidade média encontrada, e HO: heterozigosidade média observada, e respectivos

autores.

Espécie N L A Ho He Referencia

Swietenia humilis 88 10 9,7 0,41 0,55 White & Powell, 1997

Caryocar brasiliense 123 10 16,0 0,73 0,83 Collevatti et al., 1999

Ceiba pentandra 74 10 14,0 0,68 0,84 Brondani et al., 2003

Oenocarpus bacaba 33 10 9,6 0,62 0,80 Lepsch-Cunha et al., 2003

Manilkara huberi 12 12 6,43 0,68 0,81 Azevedo et al., 2007

Tabebuia áurea 36 21 18,7 0,58 0,91 Braga et al., 2006

Acrocomia aculeata 47 8 5 0,26 0,75 Nucci, 2007

Lychnophora pinaster 37 13 6,6 0,48 0,57 Haber et al., 2008

Anacardium occidentale 35 14 7 0,47 0,64 Lamas et al., 2010

Senna multijuga 32 12 4,58 0,22 0,47 -

38

5. CONCLUSÕES GERAIS

A metodologia de construção de bibliotecas genômicas enriquecidas

para Senna multijuga Rich. foi eficiente para o isolamento de locos

microssatélites polimórficos úteis para o desenvolvimento de pesquisas

relacionadas a estratégias de restauração florestal, genética populacional e de

conservação.

39

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