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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ AISLA NASCIMENTO DA SILVA CONFIRMAÇÃO DA EXPOSIÇÃO POR Neospora spp. EM EQUÍDEOS DA MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA PELA TÉCNICA DO WESTERN BLOTTING ILHÉUS– BAHIA 2016
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
AISLA NASCIMENTO DA SILVA
CONFIRMAÇÃO DA EXPOSIÇÃO POR Neospora spp. EM EQUÍDEOS DA
MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA PELA TÉCNICA DO WESTERN BLOTTING
ILHÉUS– BAHIA
2016
AISLA NASCIMENTO DA SILVA
CONFIRMAÇÃO DA EXPOSIÇÃO POR Neospora spp. EM EQUÍDEOS DA
MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA PELA TÉCNICA DO WESTERN BLOTTING
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz como exigência para
obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal.
Área de concentração: Clínica e Sanidade
Animal.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Dias Munhoz
ILHÉUS – BAHIA
2016
AISLA NASCIMENTO DA SILVA
CONFIRMAÇÃO DA EXPOSIÇÃO POR Neospora spp. EM EQUÍDEOS DA
MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA PELA TÉCNICA DO WESTERN BLOTTING
Ilhéus – BA, 26/02/2016
___________________________________
Alexandre Dias Munhoz – DSc
UESC/DCAA
(Orientador)
____________________________________
Carlos Priminho Pirovani – DSc
UESC/DCB
___________________________________
Amanda Brito Wardini – DSc
UFMG
ILHÉUS – BAHIA
2016
S586 Silva, Aisla Nascimento da. Confirmação da exposição por Neospora spp. em equídeos da microrregião Ilhéus – Itabuna pela técnica do western blotting / Aisla Nascimento da Silva. – Ilhéus, BA: UESC, 2016. 74f. : il.; anexos. Orientador: Alexandre Dias Munhoz. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Inclui referências e apêndice.
1. Equino – Doenças. 2. Parasitologia vete- rinária. 3. ImmunoblottingI. Título. CDD 636.108971
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ser tão maravilhoso e abençoar cada um dos meus
passos! Por ter me dado força pra superar os desafios, me amparar quando eu
precisei e por ter me permitido chegar até aqui.
Aos meus pais Elson Souza e Marilene Santos, que sempre me apoiaram, me
protegeram e me ensinaram em tão pouco tempo, o que eu ainda não tinha
aprendido em toda a minha vida. Amo vocês!
Aos meus irmãos, que longe ou perto, estamos unidos por um amor único!
Aos meus sobrinhos que são meus sorrisos, minha calmaria! Titia ama, titia
cuida, titia não vive sem vocês!
Ao meu esposo Clebson Almeida. Obrigado por ser meu ombro amigo, meu
parceiro, meu cúmplice e por ter tolerado minha ausência durante a execução desse
projeto. Te amo! Te amamos!!
À minha sogra Maria Shirlei e ao meu cunhado João Matos por ter
compreendido a minha ausência em um momento tão complicado. Dou graças a
Deus pela vida de vocês!
Ao meu orientador Alexandre Dias Munhoz pelos ensinamentos, apoio e
principalmente pela paciência comigo durante esses dois anos de mestrado.
A Luciana Lacerda e Sonia Lopo, pelo carinho, cuidado, conselhos, incentivos
e companheirismo de sempre!
A Gabriela Mota, Rebeca Dálety, Jéssica Freitas, Fabiana Barbosa e Vanessa
Fonseca por serem essas lindas que nos divertem sempre! E também, pelo apoio
meninas!
A Monia Andrade, por compartilhar os dados.
A Ivanildo dos Anjos que tanto nos ajudou em diversas situações!
A Ítala Felhberg, por ser essa pessoa maravilhosa e por ter me acolhido tão
carinhosamente durantes dois longos meses!
Ao Professor Luiz Fernando Pita Gondim, por ter cedido o laboratório e ter
compartilhado um pouco dos seus conhecimentos comigo.
À equipe do LDPA-UFBA, Gabriel Rodrigues, Maria Laís Moura e Rogério de
Jesus pelo auxílio constante na minha breve passagem por Salvador e por me
ajudarem sempre
A Mariana Gondim (LDPA) por todo carinho, atenção e auxílio. Ah, também a
Cecília por ter permitido que a mamãe dela continuasse me ajudando mesmo com
um barrigão lindo!
Ao professor Alexandre Moraes Pinheiro pela concessão dos equipamentos,
pelo cuidado, pelos ensinamentos, pela paciência de conversar e orientar todas as
vezes que os testes deram errado e também quando deram certo!!
A Guilherme por ter alegrado algumas das minhas manhãs e também por ter
desistido da cambalhota !
A Caroline Primo pelo carinho, por ter compartilhado os bons e os maus
momentos do Western blot e por mais uma amizade iniciada!
As meninas e meninos do laboratório de Bioquímica e veterinária da UFRB
pelo auxílio: Sandra Carvalho, Cleusa Almeida, Cíntia Santana, Antônio Wesley e
Wellisson.
A Dona Conceição e Sr. Roberto que me recebiam de braços abertos todos
os dias quando eu retornava da UFRB e de alguma forma, sempre conseguiam me
fazer rir mesmo nos dias mais difíceis!
Aos amigos Luciel Fernandes, Érica Rocha e Uillians Volkart, pelo apoio de
sempre!
Helen Ferraz e Amanda Lopes, mais uma vez juntas! Obrigada por todo
apoio, pelas resenhas, pelos sorrisos, pela internet... e por sempre deixar meu
cantinho reservado !
Aos proprietários e funcionários que nos permitiram realização das coletas.
Aos animais que representam a parte fundamental na realização desse
projeto.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pela
concessão da bolsa de mestrado.
E mais uma vez a Deus, por ter me dado a graça de conhecer e conviver com
todos vocês e compartilhar a mais bela de todas as realizações: estar gerando uma
vida! Com certeza uma criança linda!!!
“Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes, mas não
esqueço de que minha vida é a maior empresa do mundo. E que posso evitar que
ela vá à falência.
Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver, apesar de todos os desafios,
incompreensões e períodos de crise.
Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e se tornar autor da própria história.
É atravessar desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um oásis no recôndito
da sua alma.
É agradecer a Deus a cada manhã, pelo milagre da vida.
Ser feliz é não ter medo dos próprios sentimentos.
...”
Augusto Cury
CONFIRMAÇÃO DA EXPOSIÇÃO POR Neospora spp. EM EQUÍDEOS DA
MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA PELA TÉCNICA DO WESTERN BLOTTING
RESUMO
Objetivou-se com este estudo confirmar a exposição por Neospora spp através da
técnica de western blotting em equídeos da microrregião Ilhéus-Itabuna. Das 516
amostras testadas na RIFI, 80 foram selecionadas para a realização do western
blotting. Nove amostras foram positivas para Neospora spp., seis apresentaram
infecção simultânea a N. caninum e T. gondii, 33 foram positivas apenas para T.
gondii e 32 amostras negativas para ambos parasitos. Taquizoítos da cepa Nc-Bahia
foram cultivados em monocamadas de células Vero, mantidos com meio RPMI
suplementado com soro fetal bovino e com adição de antibiótico e antimicótico. Para
cada reação de western blotting utilizou-se um volume de 100 µL de solução tampão
de amostra e antígeno purificado (4x107 de taquizoítos). As proteínas foram
separadas por eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 12%, transferidas para a
membrana de PVDF que foram bloqueadas, cortadas em tiras, incubadas com os
anticorpos primário e secundário e reveladas. A migração das bandas na membrana
foi medida e os dados tabulados em uma planilha do software Excel® Microsoft,
onde foi estimado o peso molecular das proteínas. Dezoito amostras foram positivas
(3,48% - 18/516), das quais dezessete foram oriundas da espécie equina e apenas
uma asinina, reconhecendo pelo menos um dos antígenos de 17, 35, 37 e 43 KDa.
As proteínas de 35 e 37KDa foram reconhecidas em maior frequência (83,3% -
15/18). Com base nos resultados, conclui-se que equideos da microrregião Ilhéus-
Itabuna são expostos ao Neospora spp., com infecção diagnosticada em maior
proporção na espécie equina em comparação com a asinina.
Palavras-chave: Equídeos. Neosporose. Imunobloting.
CONFIRMATION OF EXPOSURE Neospora spp. IN HORSES IN THE
MICROREGION ILHÉUS-ITABUNA BY TECHNICAL WESTERN BLOTTING
ABSTRACT
The objective of this study was to confirmed exposure Neospora spp. by western
blotting technique in equines of Ilheus-Itabuna micro. Of the 516 samples tested in
IFA, 80 were selected to conduct the western blotting. Nine samples were positive for
Neospora spp., Six had concurrent infection with N. caninum and T. gondii, only 33
were positive for T. gondii and 32 samples negative for both parasites. Tachyzoites
of Nc-Bahia strain were cultivated in Vero cell monolayers maintained in RPMI
supplemented with fetal bovine serum and with the addition of antibiotic and
antimycotic. For each western blotting was used a reaction volume of 100 uL sample
buffer and purified antigen (for 4x107 tachyzoites). Proteins were separated by
vertical electrophoresis in 12% polyacrylamide gel, transferred to the PVDF
membrane which were blocked, cut into strips, incubated with the primary and
secondary antibodies and developed. The migration of the bands on the membrane
was measured and the data tabulated in Microsoft Excel® spreadsheet software,
where the molecular weight of protein was estimated. Eighteen samples were
positive (3.48% - 18/516), of which seventeen were from the equine species and only
one asinine, recognizing at least one of the antigens of 17, 35, 37 and 43 KDa. The
35 and 37KDa proteins were recognized at higher frequency (83.3% - 15/18).Based
on the results, it is concluded that there is exposure of the equine Ilheus-Itabuna
micro to Neospora spp., Diagnosed infection with a greater proportion of the equine
species.
Keywords: Horses, neosporosis, immunoblotting
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Classificação taxonômica de N. caninum e Toxoplasma gondii
19
Figura 2 Ilustração do Ciclo biológico de Neospora caninum 23
Figura 3 Local de estudo 34
Figura 4 Cultivo celular de N. caninum 36
Figura 5 Sistema de eletroforese vertical 37
Figura 6 Distancia de migração do antígeno a partir da origem 38
Figura 7 Ilustração do sanduíche de transferência 38
Figura 8 Sanduíche parcialmente montado na cuba de transferência 39
Figura 9 Visualização do padrão de peso molecular na membrana de PVDF após transferência
39
Figura 10 Gel corado com Comassie Briliant Blue G 250 após eletrotransferência 40
Figura 11 Incubação das amostras 41
Figura 12 Kit revelador (Bio-Rad 170-6431) 41
Figura 13 Amostra controle positivo de Toxoplasma gondii no western blot 45
Figura 14 Reação de Imunoblotting em membrana de PVDF após revelação 45
Figura 15 Reconhecimento antigênico dos soros equinos ao N. caninum 46
Figura 16 Frequência das proteínas de N. caninum nas amostras analisadas 46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Isolados de N. caninum no Brasil 18
Tabela 2 Soroprevalência de N. caninum em humanos 24
Tabela 3 Estudos soroepidemiológicos da infecção por Neospora spp. em
cavalos em diferentes países 28
Tabela 4 Estudos soroepidemiolóicos da infecção por Neospora spp. no
Brasil 29
Tabela 5 Western blotting como técnica de confirmação de Neospora spp.
em equinos 33
Tabela 6 Amostras positivas para Neospora spp. no western blot 44
LISTA DE ANEXOS E APÊNDICES
Anexo A Purificação do parasito 65
Anexo B Protocolo do Western Blot 66
Anexo C Calculo dos Pesos Moleculares 70
Apêndice A Proteínas de Neospora spp. reconhecidas pelos soros
de equinos, asininos e muares no western blot 71
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome - Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida
ELISA – Enzyme linked Immunosorbent Assay - Imunoensaio enzimático
EPM – Mieloencefalite Protozoária Equina
HD - Hospedeiros Definitivos
IB - Imunoblotting
IGg -Imunoglobulina G
IHQ - Imunohistoquímica
MAT - Teste de aglutinação modificado
PCR - Reação pela cadeia da polimerase
RIFI – Reação de Imunofluorescência Indireta
SAG - Surface antigen - Antígeno de Superfície
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SRS - Related sequences– Sequência relacionada
WB – Western blot
Sumário
RESUMO ....................................................................................................... viii
ABSTRACT ...................................................................................................... ix
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 16
2 OBJETIVOS .............................................................................................. 18
2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................. 18
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 18
3 REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................... 18
3.1 NEOSPORA CANINUM ........................................................................... 18
3.1.1 Histórico ............................................................................................... 18
3.1.2 Taxonomia e biologia de Neospora caninum ....................................... 20
3.1.3 Aspectos zoonóticos de N. caninum .................................................... 25
3.2 NEOSPOROSE EM EQUINOS................................................................ 25
3.2.1 Histórico e aspectos biológicos ........................................................... 25
3.2.2 Vias de transmissão ............................................................................ 27
3.2.3 Patogenia da neosporose em equinos ................................................ 27
3.2.4 Fatores de risco associados a infecção de equinos por Neospora spp.
............................................................................................................... 28
3.2.5 Prevalência de neosporose equina...................................................... 29
3.3 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR N. caninum .............................. 31
3.3.1 Exames histopatológicos e imunohistoquímicos ................................. 31
3.3.2 Reação pela cadeia da polimerase (PCR) ........................................... 32
3.3.3 Reação de imunofluorescência indireta ............................................... 32
3.3.4 Enzyme-linked Immunosorbent Assay ................................................. 32
3.3.5 Dot-ELISA ............................................................................................ 33
3.3.6 Teste de aglutinação modificado (MAT) .............................................. 33
3.3.7 Western blot (WB) ............................................................................... 33
4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 34
4.1 LOCAL DE ESTUDO ............................................................................... 34
4.2 DIRETRIZES ÉTICAS .............................................................................. 35
4.3 OBTENÇÃO E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS .......................... 35
4.5.1 Separação dos grupos para a realização do WESTERN BLOT .......... 36
4.5.2 PRODUÇÃO DO ANTÍGENO PARA WESTERN BLOT ...................... 37
4.5.3 A técnica de WESTERN BLOT ............................................................ 38
5 RESULTADOS ........................................................................................ 43
6 DISCUSSÃO............................................................................................ 48
7 CONCLUSÃO ............................................................................................ 50
REFERÊNCIAS ......................................................................................... 52
ANEXOS .................................................................................................... 67
APÊNDICE ................................................................................................ 73
16
1 INTRODUÇÃO
Atualmente, o Brasil possui o terceiro maior rebanho mundial de equinos
e o primeiro da América Latina, movimentando cerca de R$ 7 milhões com
atividades diretas e indiretas da criação. A nível nacional, o nordeste brasileiro
ocupa a segunda colocação, com destaque para a maior concentração de
asininos (90% da população de asininos nacional) e muares nessa região
(IBGE, 2011; MAPA, 2016). A relevância desses animais no Nordeste brasileiro
está atrelada a sua utilização, seja ela para esporte, lazer, terapia de pacientes
humanos (equoterapia), porém, prevalecendo como atividade principal, o
trabalho em atividades agropecuárias (MAPA, 2016).
A cultura do consumo da carne de equinos no País ainda é incipiente em
relação à bovina, sendo quase toda produção interna destinada a exportação,
colocando o País na oitava posição no ranking mundial da atividade. Em 2012
a comercialização da carne equina para outros países gerou uma receita de
aproximadamente 6.772 milhões de dólares (BATISTA;FROES, 2013), tendo a
Bélgica, Holanda, Itália, Japão e França como principais importadores da
carne equina brasileira (MAPA, 2014).
Neospora caninum e N. hughesi são protozoários intracelulares
obrigatórios e estão entre os principais coccídios que infectam equinos
(DUBEY et al., 2002). Até o momento, N. hughesi foi relatada apenas em
equinos, apresentando patogenia associada a ocorrência de abortamentos e
outras alterações reprodutivas (VILALOBOS et al., 2006), enfermidades
neonatais e quadros neurológicos em equinos, incluindo-o como um dos
agentes etiológicos da mieloencefalite protozoária equina ( LINDSAY, 2001).
Asininos parecem ser fortes candidatos a servirem como hospedeiros de
Neospora spp. pois são muito próximos filogeneticamente dos eqüinos
(CHOWDHARY; RAUDSEPP, 2008).
Os testes sorológicos para diagnóstico de Neospora spp. nos animais
apresentam sensibilidade e especificidades aceitas, contudo, ainda são
incapazes de permitir a diferenciação das duas espécies do Gênero. Embora
os estudos de Gondim et al. (2009) revelem titulações mais baixas na Reação
17
de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para N. hughesi em comparação com N.
caninum, não é suficiente para permitir a distinção entre ambos.
O western blot é um teste considerado altamente específico, sendo
normalmente utilizado como teste confirmatório da infecção por Neospora spp.
nos animais(STELMAN et al., 2010). Embora a distinção entre as duas
espécies no WB só seja possível utilizando anticorpos monoclonais
direcionados a proteínas específicas do parasito (MARSH et al., 1999), a alta
especificidade do teste impede a ocorrência de reações cruzadas com outros
protozoários similares ao Neospora spp..
Na Bahia estudos prévios em diversas espécies de animais têm
identificado a exposição ao Neospora spp. e caracterizado a relevância da
dessa infecção nos animais. Contudo, estudos envolvendo o isolamento e
caracterização genética destes parasitos em equídeos são escassos no
Brasil e ausentes no estado.
Mais estudos acerca da neosporose equina são necessários, a fim de
elucidar os aspectos biológicos, epidemiológicos e suas implicações na
sanidade dos animais, permitindo assim adoções de medidas eficazes no
controle da enfermidade.
O desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas se faz
necessário, buscando aplicação uniformizada às diferentes espécies
hospedeiras bem como diferenciação das espécies de Neospora sp. que
acometem os equídeos. A implementação de uma ferramenta diagnóstica com
alta sensibilidade na região contribui para que novos estudos sejam realizados,
fornecendo assim maior numero de informações acerca da infecção por
Neospora spp. em equídeos e consequentemente, auxiliando na compreensão
das questões ainda não elucidadas.
18
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Confirmar a exposição por Neospora spp. através da técnica de western
blot em equídeos da microrregião Ilhéus-Itabuna.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar marcadores compatíveis com a infecção por Neospora spp.
em equinos, asinininos e muares da microrregião Ilhéus-Itabuna.
Avaliar os títulos de anticorpos das amostras testadas na Reação de
Imunofluorescência Indireta com os resultados obtidos no western blot.
Avaliar o perfil de reatividade de soros equinos, asininos e muares
testados no western blot.
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 NEOSPORA CANINUM
3.1.1 Histórico
O primeiro relato de neosporose em cães data de 1884 na Noruega,
quando Bjerkas e colaboradores identificaram um protozoário formador de
cisto, distinto do já descrito Toxoplasma gondii causando sintomatologia
neurológica com evolução para paralisia de membros posteriores em uma
ninhada de seis cães da raça Boxer, clinicamente sadios até o sexto mês de
vida. Os animais apresentaram lesões inflamatórias na musculatura esquelética
e no Sistema Nervoso Central onde também foram encontrados vários cistos
com parasitos. Na avaliação inicial esses parasitos foram descritos como
morfologicamente semelhantes e antigenicamente distintos de T. gondii.
Um estudo posterior avaliando a sintomatologia incomum aos quadros
de toxoplasmose (paralisia de membros), bem como as características
ultraestruturais do parasito, associado ao resultado das análises
imunohistoquímicas, confirmou se tratar de uma nova espécie
(BJERKAS;PRESTHUS,1988). No mesmo ano, o parasito foi caracterizado
19
como Neospora caninum (DUBEY et al., 1988a) e isolado in vitro apartir de
cinco cães jovens naturalmente infectados, apresentando polirradiculoneurite e
polimiosite granulomatosa (DUBEY et al., 1988b), dando inicio ao
desenvolvimento de testes diagnósticos específicos para N. caninum.
Segundo Bjerkas;Presthus, (1988), embora o protozoário tenha sido
isolado em 1988, a ocorrência de parasitos com morfologia semelhante a N.
caninum e com imunocoloração negativa para T. gondii em tecidos cerebrais já
havia sido relatada em um cão necropsiado em 1967. Já Dubey et al.(1990),
utilizando amostras teciduais fixadas em formalina, provenientes de um grupo
de cães com sintomas acima citados, conclui que houve ocorrência da
enfermidade desde 1957 nos Estados Unidos.
De acordo com Al-Qassab et al.(2010), há aproximadamente 80 isolados
de N. caninum em diferentes hospedeiros e diferentes partes do mundo, dos
quais, seis foram isolados no Brasil (Tabela 1). O primeiro isolado de N.
caninum no Brasil foi realizado por Gondim et al.(2001) a partir de um cão
macho da raça colie, com 7 anos de idade, apresentando incordenação e
paresia de membros posteriores. Amostras sorológicas foram coletadas in vivo
e o líquido cerebroespinhal coletados no post mortem para serem testadas pela
RIFI. Tecidos cerebrais desse animal foram preparados e inoculados em nove
fêmeas de gerbis (Meriones unguiculatus), das quais foi possível isolamento e
manutenção do parasito in vitro. Exames histológicos, imunohistoquímicos e
reação em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas a fim de confirmar e
caracterizar o novo isolado – NC-Bahia.
Tabela 1: Isolados de N. caninum no Brasil
Isolado Fonte Estado Referência
NC-Bahia Cérebro de um cão adulto naturalmente infectado
Bahia (GONDIM et al.,2001)
BNC-PRI Cérebro de um bezerro cego com infecção congênita
Paraná
(LOCATELLI-DITTRICH et al., 2003)
BCN-PR3 Cérebro de feto bovino abortado (LOCATELLI-DITTRICH
et al., 2004)
NcBrBuf-1, 2, 3, 4, 5
Cérebro de búfalos naturalmente infectados São
Paulo
(RODRIGUES et al., 2004)
Não nomeado
Cérebro de ovinos naturalmente infectados
(PENA et al., 2007)
Nc-Goiás 1 Cérebro de bezerro clinicamente saudável
Goiás (GARCIA-MELO et al.,
2009)
Fonte: Traduzido e adaptado de Al-Qassab et al.(2010).
20
3.1.2 Taxonomia e biologia de Neospora caninum
Neospora caninum é um protozoário intracelular obrigatório, pertencente
ao filo Apicomplexa, família Sarcocystidae e submafamília Toxoplasmatinae
(DUBEY et al., 1988), pertencendo a mesma família dos coccídios Toxoplasma
gondii (Figura 1), Hammondia heydorni e H. hammondi. Com distribuição
cosmopolita, acomete uma gama de hospedeiros (DUBEY et al., 2007), tendo
como hospedeiros definitivos os cães (McALLISTER et al., 1998), coiotes
(GONDIM et al., 2004), dingo australiano (KING et al, 2010) e o lobo cinza
(DUBEY et al., 2011). De acordo com Dubey, (2003), vários autores
comprovaram, com diferentes técnicas diagnósticas, a ocorrência de anticorpos
contra N. caninum em diferentes espécies que atuam como hospedeiras
intermediárias, tais como bovinos, búfalos, cães, gatos, ovinos, caprinos,
equinos e alguns animais selvagens.
Figura 1. Classificação taxonômica de N. caninum e Toxoplasma gondii.
Fonte: Adaptado de Goodswen et al. (2013) e Marsh et al. (1998).
O ciclo de vida de N. caninum compreende três fases infectantes:
taquizoítos, bradizoítos e oocistos, das quais, as duas primeiras ocorrem no
meio intracelular e são encontradas nos hospedeiros intermediários, enquanto
a ultima, corresponde a etapa de reprodução sexuada do parasito é eliminada
apenas nas fezes dos hospedeiros definitivos. Os três estágios são infectantes,
estando os taquizoítos associados a infecção transplacentária durante a
gestação, os bradizoítos como fonte de infecção para os carnívoros e por
ultimo, os oocistos após esporulação tornam-se infectantes para os herbívoros
(DUBEY et al., 2007).
21
3.1.2.1 Aspectos morfológicos dos estágios infectantes de N. caninum
3.1.2.1.1 Taquizoítos
Os taquizoítos de N. caninum são ovoides ou globulares e possuem
tamanho médio de 7x2 µm, dependendo da fase de divisão. Localizam-se no
vacúolo parasitóforo de diversos tipos de células hospedeiras e possuem
entre 6 e 16 roptrias com conteúdos eletrodensos e raros microporos (SPEER
et al., 1999; DUBEY et al., 2002;1999b).
O processo de invasão celular ocorre em um período de
aproximadamente 5 minutos após o contato inicial do taquizoíto com a célula.
Após esse período, o taquizóito atinge o meio intracelular onde rapidamente
se multiplica por endodiogenia (DUBEY;LINDSAY 1996). Na ausência ou
baixa resposta imune do hospedeiro, essa multiplicação causa lesões e
rompimento da célula hospedeira. Quando a resposta imune é desencadeada,
os taquizoítos diferenciam-se em bradizoítos, mantendo a infecção
persistente (LYOSNS et al., 2002).
3.1.2.1.2 Bradizoítos
Os bradizoítos são alongados e possuem tamanho médio de 8x2µm.
Possuem de 6 a 12 roptrias preenchidas com conteúdo eletrodenso, grânulos
de amilopectina e , assim como os taquizoítos, também possuem organelas
comuns a outros coccídeos, tais como grânulos densos de tamanhos variados
e micronemas que normalmente permanecem dispostas perpendicularmente a
membrana plasmática. São envoltos por um tecido cístico cuja parede é de
aproximadamente 4 mm de espessura e encontrados principalmente no
sistema nervoso central dos hospedeiros (DUBEY, 2003) e músculos de
animais naturalmente infectados (PETERS et al., 2001).
De acordo com Hemphill (1996), os bradizoítos podem permanecer no
tecido infectado por vários anos sem causar alterações clínicas no hospedeiro.
Tal fato ocorre em função da multiplicação lenta dos bradizoítos, normalmente
atrelada ao desenvolvimento de respostas imunes pelo hospedeiro (LYONS et
al., 2002).
22
3.1.2.1.3 Oocistos
Os oocistos de N. caninum são originários da reprodução sexuada
(gametogonia) que ocorre apenas nos hospedeiros definitivos. Quando
eliminados nas fezes dos cães não estão esporulados e possuem tamanho
variando entre 10,6 - 12,4 x 10,6 - 12 μm. São revestido por uma parede incolor
de 0,6 a 0,8mm e, após esporulação, contém em seu interior dois esporocistos
(8,4 x 6,1mm) que por sua vez possuem quatro esporozoítos alongados em
cada um (6,5x2mm) (DUBEY et al., 1999a;2002). O processo de esporulação
dos oocistos ocorre no ambiente em aproximadamente 24 horas após
eliminação (LINDSAY et al., 1999). Nesse estágio, foram considerados
morfologicamente indistinguíveis de H. heydorni, H. hammondi e Toxoplasma
gondii (DUBEY, 1999). Entretanto, estudos realizados por Schares et
al.,(2001) entre os anos de 2001 a 2004 diferem-nos, uma vez que os oocistos
de N. caninum apresentavam-se mais curtos e com menor relação
comprimento-largura.
3.1.2.2 Ciclo biológico e vias de transmissão
N. caninum possui ciclo heteroxeno obrigatório (Figura 2), necessitando
de dois hospedeiros (DUBEY; LINDSAY, 1996).Os cães participam tanto como
hospedeiros definitivos quanto intermediários no ciclo biológico de N. caninum
(DUBEYet al., 2002).
3.1.2.2.1 Transmissão horizontal
Os canídeos se infectam através da ingestão de cistos presente nos
tecidos dos hospedeiros intermediários. As enzimas gástricas não possuem
ação capaz de destruir os cistos, permitindo assim a liberação dos bradizoítos
no intestino dos hospedeiros definitivos (HD), dando início à fase de
reprodução sexuada (DUBEY, 1999; WOUDA, 2007). A gametogonia
provavelmente é o estágio que culmina na formação dos oocistos, entretanto,
ainda não foram documentadas (WOUDA, 2007). Os oocistos não esporulados
são liberados junto com as fezes do HD (DUBEY et al., 1999a; 2002; LINDSAY
23
et al., 1999; WOUDA, 2007) e podem tornar-se infectantes em um período de
24 horas (LINDSAY et al., 1999). De acordo com Bandini et al, (2011), Os cães
também podem se infectar através da ingestão de oocistos, sendo essa via
pouco importante na transmissão do patógeno.
Os hospedeiros intermediários acabam por ingerir os oocistos
juntamente com a água ou alimentos contaminados. A passagem pelo trato
intestinal causa degradação da parede do oocisto com liberação dos
esporozoítos no intestino. Já no intestino, os esporozoítos são convertidos a
taquizoítos e atingem a circulação, aderindo-se aos tecidos onde encistarão
(DUBEY, 2003).
3.1.2.2.2 Transmissão vertical
Tem sido descrito como a principal fonte de infecção e manutenção da
infecção em rebanhos bovinos (TRESS et al., 1999), com eficiência estimada
entre 81 a 95% (DAVISON et al., 1999). Por ocorrer em duas situações
diferentes: recrudescência da infecção em vacas prenhas ou primo infecção, o
termo transmissão vertical foi considerado inadequado e tem sido substituído
por: infecção transplacentária endógena (TPI endógena) e infecção
transplacentária exógena (TPI exógena) (TREES; WILLIAMS, 2005).
A TPI endógena ocorre quando uma fêmea persistentemente infectada
trasmite a infecção ao feto, após reativação da infecção(TREES; WILLIAMS,
2005). As fêmeas com infecção congênita continuam a transmitir a infecção
aos fetos, mantendo assim o parasito na propriedade sem que
necessariamente, haja contato com um hospedeiro intermediário (DAVISON et
al., 1999).Já a TPI exógena ocorre quando uma fêmea gestante não infectada
ingere oocistos do parasito, que, quando não induz ao aborto, resulta em
infecção fetal (TREES; WILLIAMS, 2005).
3.1.2.2.3 Outras vias de transmissão
Até 1996, a transmissão transplacentária era a única via conhecida de N.
caninum (DUBEY; LINDSAY, 1996) ). Estudos feitos por Yaniz et al.(2007)
demonstram que fêmeas gestantes inoculadas com taquizoítos de N. caninum
24
por via conjutival desenvolveram anticorpos sistêmicos específicos contra o
parasito, com soroconversão negativa ao final da gestação.
Serrano-Martínez et al. (2007) também detectaram IgG em novilhas
após inseminação artificial com sêmen contaminado com taquizoítos da cepa
NC-1 de N. caninum, havendo nesse caso uma relação dose-dependente para
desencadeamento da resposta imunológica. Já os resultados do estudos de
Masuda et al.(2007) com duas linhagens de camundongos indicam a
ocorrência da transmissão venérea quando há acasalamento de fêmeas
imunodeficientes com um macho também imunodeficiente infectado por N.
caninum, com consequente infecção transplacentária dos fetos.
A via lactogênica foi relatada experimentalmente em bezerros
(DAVISON et al., 2001). Anticorpos anti-Neospora sp. também já foram
encontrados no leite de vacas lactantes soropositivas (MOSKAWA et al., 2006)
e em bezerros de vacas naturalmente infectadas (MORÉ et al 2009), não
representando grande importância na epidemiologia da doença (DAVISON et
al., 2001).
Geneticamente há uma similaridade entre os isolados caninos e bovinos
de Neospora, o que pode representar uma importante relação epidemiológica
na ocorrência da enfermidade (SCHOKE et al., 2001).
Figura 2: Ilustração do Ciclo biológico de Neospora caninum. Fonte: Dubey,
(2003).
25
3.1.3 Aspectos zoonóticos de N. caninum
Embora infecções experimentais com N. caninum realizadas por Barr et
al.(1994) tenham promovido quadros patológicos em fêmeas gestantes e fetos
de macaco Rhesus (Macaca mulatta), indicando susceptibilidade de primatas
não humanos a infecção pelo agente, Dubey et al. (2007) afirmaram que ainda
não existiam evidências confiáveis de que os seres humanos possam ser
infectados por N. caninum, uma vez que estudos prévios detectaram baixos
níveis de anticorpos nas populações estudadas (Tabela 2) e ainda não há
relatos de infecções acidentais em manipuladores de parasitos viáveis.
Tabela 2: Soroprevalência de N. caninum em humanos
País Fonte da amostra Nº de
amostras Teste
% Positivos
Referência
Brasil
AIDS 61
RIFI (1:50) a ELISA
IB
38
(LOBATO et al., 2006)
Desordens neurológicas
50 18
Recém nascidos 91 5
Controles 54 6
Dinamarca
Abortos repetidos 76 ELISA
RIFI (1:640) IB
0 (PETERSEN et al.,1999)
Coréia Doadores de
sangue 172
RIFI (1:100) ELISA
IB 6.7
(NAM et al., 1998)
Irlanda do Norte
Doadores de sangue
247 RIFI (1:160) 8 (GRAHAM et
al., 1999)
Reino Unido
Trabalhadores agrícolas e
mulheres com aborto espontâneo
400 RIFI (1:400) 0 (TREES et al.,
2000)
Estados Unidos
RIFI (1:100 6.7 (TRANAS et
al., 1999) Doadores de
sangue 1029 (1:200), 0
IBb +
Fonte: Traduzida de Dubey et al.(2007).
3.2 NEOSPOROSE EM EQUINOS
3.2.1 Histórico e aspectos biológicos
A neosporose em equinos é uma enfermidade causada pelos
protozoários Neospora caninum e N. hughesi (STELMAN et al.,2011). Foi
26
diagnosticado pela primeira vez em 1986 como sendo Toxoplasma-like em um
feto equino abortado apresentando taquizoítos em cortes histológicos do
pulmão, com reação negativa para T. gondii (DUBEY; PORTERFIELD, 1986),
sendo mais tarde confirmado tratar-se do protozoário N. caninum (DUBEY;
PORTERFIELD, 1990).
O primeiro relato de N. hughesi data de 1996 na Califórnia, quando
Marsh et al. diagnosticaram através do isolamento in vitro associado com
análises imunohistoquímicas, moleculares e estruturais, um quadro de
neosporose em um equino adulto apresentando sinais clínicos e laboratoriais
presuntivos de mieloencefalite protozoária equina (EPM) por Sarcocystis
neurona (MARSH et al., 1996). A partir de então, três novos isolados são
descritos: um no Alabama (EUA) (CHEADLE et al., 1999), outro no Oregon
(DUBEY et al., 2001b) e por ultimo, no Canadá (WOBESER et al., 2009).
O isolamento a partir de tecidos permitiu que Marsh et al. (1998)
realizasse exames de caracterização antigênica e molecular com base em dois
antígenos imunodominantes de superfície (SAG1 e SRS2), concluindo que os
novos isolados então denonimados Neospora hughesi apresentavam 6% de
diferença em SAG1 e 9% em SRS2 em comparação a N. caninum.
O ciclo biológico do N. hughesi ainda não foi caracterizado (MARSH et
al., 1998; HOANE et al., 2006), tendo os equinos como únicos hospedeiros
intermediários conhecidos (HOANE et al., 2006). Experimentalmente, o referido
patógeno mostrou-se patogênico para camundongos da linhagem KO e não
patogênico para gerbis (WALSH et al., 2000; DUBEY et al., 2001b) e cães
(WALSH et al., 2000), não sendo possível detecção sorológica ou de formas
parasitárias nos referidos tecidos.
Estruturalmente, foi evidenciado maior número de roptrias (13-27) e, os
taquizoítos, assim como os bradizoítos de N. hughesi são menores que os de
N. caninum. Os cistos possuem ainda parede mais delgada, localizando-se
preferencialmente no SNC e nervos periféricos (MARSH et al., 1998) com um
relato de ocorrência em músculo ocular (LINDSAY et al., 1996).
As técnicas diagnósticas sorológicas atualmente empregadas não são
suficientes para diferenciar a infecção por N. caninum e N. hughesi (WALSH et
al., 2000). A associação das características estruturais associado a análises
moleculares permite a diferenciação entre esses dois agentes (MARSH et al.,
27
1998). Analises do DNA ribossomal através da região ITS1 revelaram a
existência de 7 nucleotídeos diferentes em N. hughesi (posições 44, 64, 73, 96,
247, 343 e 397), o que representa 98% de similaridade quando comparada as
duas espécies (MARSH et al., 1998).
Antigenicamente, Marsh et al. (1999) identificaram 94 % de semelhança
entre os aminoácidos constituintes das proteínas NcSAG1 (expressa em N.
caninum) e NcSAG1(expressa em N. hughesi). Quando comparadas NcSRS2
com NhSRS2, esse semelhança caiu para 91% (MARSH et al., 1999).
3.2.2 Vias de transmissão
As vias de transmissão de N. caninum em equinos são semelhantes ao
que acontece nas outras espécies, entretanto, tratando-se de N. hughesi, a
infecção por via horizontal ainda não foi confirmada (TOSCAN et al., 2010).
Estudos pesquisando a ocorrência de anticorpos anti-Neospora spp.e
associação entre éguas e suas respectivas crias, encontraram crias
soropositivas filhas de éguas soronegativas, abrindo a possibilidade da
infecção horizontal sem descartar a vertical com fêmeas apresentando níveis
de anticorpos séricos não detectáveis na RIFI (TOSCAN et al., 2010).
A infecção transplacentária de Neospora spp. em equinos tem sido
sugerida desde 1986, quando isolado (DUBEY;PORTERFIELD, 1986). Desde
então, diverso estudos foram realizados (LINDSAY et al., 1996; PITEL et al.,
2003b; VILLLABOS et al., 2006; HOFFMAN, 2007; TOSCAN et al., 2010;
PUSTERLA et al., 2011; PIVOTO et al., 2010; 2012; QUEVEDO et al., 2015)
comprovando a ocorrência e confirmando relevância na manutenção e
disseminação do parasito e consequentemente, aumento da soropositividade
no rebanho equino (TOSCAN et al., 2010; ANTONELLO et al., 2012), podendo
ocorrer mesmo em casos de infecção latente (PUSTERLA et al., 2014a).
3.2.3 Patogenia da neosporose em equinos
Em bovinos, a patogênese da neosporose encontra-se bem estabelecida
(BLANCO et al., 2014). Em bovinos, ovinos e caprinos a neosporose é
responsável por problemas reprodutivos que variam de abortos, nascimento de
bezerros natimortos, com sintomatologia neurológica ou mesmo clinicamente
saudáveis, levando a impactos econômicos diretos e indiretos (DUBEY, 2003),
28
estimados, a nível nacional, em 51 milhões de dólares na indústria leiteira (50
% das perdas totais) e aproximadamente 100 milhões na industria de carne
(REICHEL et al., 2013).
De acordo com Lindsay (2001), Neospora spp. está associado com a
ocorrência de abortos, doenças neonatais e encefalites em cavalo. Trabalhos
realizados por Vilalobos et al. (2006) apontam uma associação positiva entre a
ocorrência de distúrbios reprodutivos em éguas e a infecção por Neospora spp.
Estudos realizados por Pittel et al. (2003b) na França também encontraram
indícios de abortamentos como consequência da neosporose equina.
Dentre os casos de encefalite, vários casos associados a neosporose
foram descritos nos EUA, envolvendo animais jovens e velhos: um potro com
cegueira unilateral (LINDSAY et al., 1996), uma égua com paraplegia e
decúbito lateral (DAFT et al., 1996), um cavalo apresentando sinais de
alteração neurológica (MARSH et al., 1996) e um cavalo apresentando ataxia
severa, reagindo a presença de anticorpos anti-Neospora spp. e anti-
Sarcocystis neurona (HAMIR et al., 1998). Em 2009, Wobeser et al.
Confirmaram, através de seqüenciamento e das semelhanças existente na
região ITS-1 do isolado de N. hughesi do Óregon, um caso de EPM por N.
hughesi no Canadá, sendo esse talvez o primeiro caso confirmado fora dos
EUA. Em2001, Lindsay et al. consideraram N. hughesi como o segundo agente
da mieloencefalite protozoária equina (EPM), uma vez que o S. neurona é o
principal agente etiológico da enfermidade (LINDSAY, 2001).
Embora a maioria dos casos relatados de neosporose causando EPM
tenham sido reportados nos EUA, (WOBESER et al., 2009), no Brasil,
Neospora spp. ainda não foi incluído como rotina de pesquisa para diagnóstico
da EPM em equinos (LOCATELLI-DITTRICH et al., 2006).
3.2.4 Fatores de risco associados a infecção de equinos por Neospora spp.
Talafha et al.(2015) avaliando os fatores de risco para a infecção de
equinos por Neospora spp., não encontraram relação entre Idade, sexo, raça,
escore corporal, pastagem, convívio com outros animais e histórico de doenças
anteriores na ocorrência da enfermidade. Esses dados diferem dos
encontrados por Valença et al. (2015) estudando ocorrência de anticorpos
contra Neospora spp. cujos fatores acesso de outras espécies a fonte de água
29
dos cavalos, não consumo de feno, aquisição informal de animais e ausência
de gerenciamento de quarentena foram associados a ocorrência da infecção.
3.2.5 Prevalência de neosporose equina
Estudos soroepidemiológicos sobre Neospora spp. em equinos no Brasil
são escassos (GALVÂO, 2013) e os dados apresentados são considerados
contraditórios por Piazzeta (2012), em função das heterogeneidade dos grupos
amostrais e das discrepâncias entre os resultados. As diferenças no manejo
dos animais bem como utilização de testes diversos dificultam a comparação
dos estudos. Dados de estudos soroepidemiológicos de Neospora spp. no
mundo estão listados na tabela 3. No âmbito nacional, os estudos existentes
são baseados na presença ou ausência de anticorpos anti-Neospora spp. e
estão listados na tabela 4.
Tabela 3. Estudos soroepidemiológicos da infecção por Neospora spp. em equinos em diferentes países.
País/Estado N
amostral Teste Agente
% Positivos
Referências
Argentina 76 MAT Neospora
spp 0 (DUBEY et al., 1999a)
Califórnia Florida Missouri Montana Nova Zelândia
93 40 39 15 21
RIFI WB
N. hughesi
3,2 0
5,1 0 0
(VARDELEON et al., 2001)
Wyoming a 276 MAT Neospora
spp 31,1 (DUBEY et al., 2003)
Chile 145 RIFI MAT 32 (PATITUCCI et al.,
2004)
Suécia 414 ELISA
WB N. caninum 1 (JAKUBEK et al., 2006)
EUA (Alabama)a
536 RIFI WB
Neospora spp.
11,5 (CHEADLE et al.,
1999)
EUA, Canadá 1917 ELISA
WB N. hughesi 0,93 (HOANE et al., 2005a)
EUAa 3123 RIFI N. hughesi 2 (PUSTERLA et al.,
2014b)
Sul do Iran 200 N-MAT N. caninum 32 (MORAVEJI et al.,
2011)
Costa Rica 315 ELISA MAT WB
Neospora spp.
0,3 (DANGOUDOUBIYAM
et al., 2011)
México 495 ELISA
WB N. hughesi 0,3 (YEARGAN et al.,2013)
30
Tabela 3. Estudos soroepidemiológicos da infecção por Neospora spp. em equinos em diferentes países.
(CONTINUAÇÃO)
País/Estado N
amostral Teste Agente
% Positivos
Referências
Sul da Itáliac 238 ELISA Neospora
spp 11,8
(MACHAČOVÁ et al.,2013)
Colômbiac 56 Dot-
ELISA Neospora
spp. 19,6 (BLANCO et al., 2014)
Peru 163 RIFI N. caninum 12 (LUZA et al., 2013)
Norte da Califórniab
8 RIFI N. hughesi 100 (PUSTERLA et al.,
2014a)
Itália a 643 RIFI
cELISA Neospora
spp. 10,8
(BARTOVA et al., 2015)
Jordânia 227 ELISA N. hughesi 3 (TALAFHA et al., 2015) aPrevalência. b Potros. cJumentos
Tabela 4. Estudos soroepidemiológicos da infecção por Neospora spp. no
Brasil.
Estado/Cidade N
amostral
Teste Agente %
Positivos Referências
Brasil-diferentes regiões
101 MAT N. caninum 0 DUBEY et al., 1999b)
Brasil-diferentes regiões
961 ELISA
WB N. hughesi 2,5 (HOANE et al., 2006)
Sudoeste do Rio Grande do Sul a
203 RIFI Neospora
spp. 9,9 (PIVOTO et al., 2012)
Santa Catarina 615 RIFI Neospora
spp. 4,1 (MOURA et al., 2013)
Paraná 764 ELISA
WB N. hughesi 14,4 (PIAZZETA, 2012)
Alagoas 427 RIFI N. caninum 18 (VALENÇA et al., 2015)
São Paulo 38 RIFI Neospora
spp. 57,6 (STELMAN et al., 2011)
Bahia b 500 RIFI WB
Neospora spp.
0,4 (GALVÃO et al.,2015)
Rio Grande do Sul
91 RIFI Neospora
spp. 15,4 (SANGIONI et al., 2001)
Região Sul do Brasil
203a 203
RIFI Neospora
spp. 63,5 25,1
(ANTONELLO et al., 2012)
Nordeste Brasileiro
453 RIFI N. caninum 1,75 (ESMERINI et al., 2012)
Microrregião Ilhéus-Itabuna, BA
516 RIFI Neospora
spp. 8,3 (SOUZA et al., 2014)
aPotros. bJumentos
31
3.2.6 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR N. caninum
Atualmente, as técnicas de rotina empregadas no diagnostico de N.
caninum são sorológicas, destacando-se a RIFI, o ELISA e o Dot-ELISA.
Outros métodos incluem o teste de aglutinação modificado (MAT), exame
histopatológico, imunohistoquímico, reação em cadeia da polimerase (PCR),
western blot e 2D PAGE (Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida).
A sensibilidade e a especificidade dos testes sorológicos são
influenciadas pelo ponto de corte: aumento do ponto de corte resulta em maior
especificidade e menor sensibilidade, enquanto que a diminuição desse ponto
gera resultados menos específicos, porém mais sensíveis (BJORKMAN;
UGGLA, 1999), influindo diretamente no resultado final. Além disso, a reação
positiva de amostras séricas não caracteriza uma infecção ativa e sim,
expressa a presença de anticorpos ao respectivo antígeno, indicando que em
algum momento o animal foi exposto ao patógeno (VARDELEON et al., 2001).
3.2.7 Exames histopatológicos e imunohistoquímicos
Os exames histopatológicos são comumente empregados em casos de
abortos por N. caninum,onde tecidos de fetos abortados e placentas são
analisados quanto a presença ou ausência do parasito e prováveis lesões. Na
maioria das vezes, cistos e taquizoítos de Neospora spp. são demonstrados
em tecido cerebrais e cardíacos, podendo estar evidentes com menor
incidência em outros órgãos (DUBEY; SCHARES, 2006).
A IHQ, realizada após evidencias de lesão no histopatológico (VAN
MAANEN et al., 2004), combina reações químicas e imunológicas, permitindo
a localização do antígeno associado a lesões nos tecidos, aumentando a
acurácia do diagnóstico (RAMOS-VARA et al., 2008). É utilizada desde 1989
quando então foi descrita pela primeira vez como ferramenta diagnóstica de N.
caninum (LINDSAY;DUBEY, 1989). A especificidade está atrelada ao uso dos
anticorpos monoclonais ou policlonais, sendo o primeiro mais específico. Até
2003, Dubey considerou os resultados da IHQ como a melhor evidência para
caracterização de abortos por N. caninum
32
3.2.8 Reação pela cadeia da polimerase (PCR)
A PCR desempenha um papel importante no diagnóstico da infecção de
N. caninum (QASSAB et al.,2010; DUBEY;SCHARES, 2006), podendo ser
realizados em vários tecidos e fluidos corporais. Permite a detecção (PCR
convencional), quantificação do DNA parasitário e determinação da carga
parasitária (PCR em tempo real). A sensibilidade e especificidade dessa
técnica é influenciada pela escolha do DNA alvo e iniciadores apropriados,
pelos protocolos de extração e purificação do DNA e uso de aparelhos e
reagentes apropriados (DUBEY;SCHARES, 2006).
3.2.9 Reação de imunofluorescência indireta
A RIFI para N. caninum foi realizada pela primeira vez por Dubey et al.
(1988b), com titulação mínima estabelecida em 1:50 em cães. Baseia-se na
utilização de taquizoítos íntegros cultivados in vitro como antígeno na reação.
Embora a existência de variações visuais individuais na interpretação dos
resultados reflitam um certo grau de subjetividade, a RIFI apresenta boa
sensibilidade e especificidade, sendo considerado teste de referência quando
comparado a outros testes (BJORKMAN; UGGLA, 1999).
3.2.10 Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Consiste na ligação de um antígeno com um anticorpo, seguido da
adição de um conjugado dirigido ao agente e então adição de um substrato que
reage com o conjugado causando uma reação de cor quantificada no
espectofotômetro (BJORKMAN; UGGLA, 1999). ELISA para detecção de
anticorpos anti N. caninum foi descrito por Bjorkman et al. (1994), com a
utilização de proteínas extraídas de taquizoítos. Desde então, várias
adaptações foram feitas e os testes passaram a ser realizados também com o
antígeno bruto (taquizoítos inteiros), taquizoítos fixados em formalina,antígenos
solúveis em água ou detergente, antígenos nativos ou recombinantes e
taquizoítos purificados por afinidade (BJORKMAN; UGGLA, 1999;
DUBEY;SCHARES, 2006). Lasri et al.(2004), ao desenvolveram um teste
33
ELISA para determinar a prevalência de N. caninum em cães na Bélgica,
compararam-no com outros dois testes: Um ELISA comercial competitivo (C-
ELISA) e o teste de Imunofluorescência indireta. Os resultados demonstraram
uma margem de concordância confiável entre o ELISA desenvolvido e a RIFI, e
moderada correlação com o C-ELISA, sugerindo assim a possibilidade de
substituição da RIFI pelo ELISA para triagem de um grande numero de
amostras sorológicas de cães na rotina local.
3.2.11 Dot-ELISA
Usado com menor frequência para o diagnóstico da neosporose
(BLANCO et al, 2014), semelhante ao ELISA, porém não requer uso de
aparelhos sofisticados. Tem como princípio a utilização de uma membrana de
nitrocelulose sensibilizada com o antígeno, onde serão adicionadas as
amostra, um anticorpo conjugado marcado com peroxidase e a solução
reveladora respectivamente. Quando comparado com a RIFI com ponto de
corte 1:50, o dot-ELISA apresentou 94% de sensibilidade e 73% de
especificidade (PINHEIRO et al,. 2005).
3.2.12 Teste de aglutinação modificado (MAT)
O MAT, quando corretamente padronizados, pode ser empregado na
realização de testes em diferentes espécies animais (BJORKMAN; UGGLA,
1999; PACKHAM et al., 1998), apresentando alta sensibilidade e baixa
especificidade quando comparados a RIFI (PACKHAM et al., 1998).
3.2.13 Western blotting (WB)
Considerando um teste com alta sensibilidade e especificidade, permite
identificação de uma fração protéica (GALVÃO, 2012) específicas em uma
determinada amostra (ABCAM, 2015) mesmo que estas estejam pouco
abundantes (KURIEN; SCOFIELD, 2006). Tem sido utilizado como teste
confirmatório para diagnóstico da infecção por Neospora spp. em várias
espécies animais (LOCATELLI-DITTRICH et al., 2006). Consiste na separação
34
das proteínas em gel de Acrilamida submetidos a uma eletroforese vertical,
seguido de transferência dessas proteínas para uma membrana de
nitrocelulose ou Fluoreto de Polivinilideno (PVDF). Essa membrana é então
bloqueada, cortada em tiras, incubadas com anticorpos primários (soros
testados) e secundários (marcado com peroxidase) e reveladas através de uma
reação colorimétrica (MAHMOOD;YANG, 2012; ABCAM, 2015).
A tabela 5 apresenta alguns dados de positividade e diluições adotadas
em estudos utilizando o WB como teste confirmatório após sorologia
convencional.
Tabela 5. Western blotting como técnica de confirmação de Neospora spp. em
equinos
N Diluição do soro
Diluição do Conjugado
+ na Sorologia
+ Blot Referência
1917 1:500 HRP-conjugated goat anti-horse 1:10.000
66 18 (HOANE et al 2005a)
315 1:500 -- 11 1 (DANGOUDOUBIYAM et al., 2011)
414 1:100 HR- labeled
rabbit-anti-horse 1:16.000
39 4 (JAKUBEK et al., 2006)
495 1:500 -- 15 13 (YERGAN et al.,2013)
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 LOCAL DE ESTUDO
Cinco dos 41 municípios que compõem a microrregião Ilhéus-Itabuna,
Bahia, foram selecionados: municípios: Itapé (14º52’S 39º25’O), Ibicaraí
(14º51’S 39º35’O), Itaju do Colônia (15º08’S 39º43’O), Santa Cruz da Vitória
(14º57’S 39º48’O) e Floresta Azul (14º50’S 39º39’O) (Figura 3) . Juntos, esses
municípios albergam a maior concentração de equídeos da microrregião
(17.214 animais), correspondendo a 18,9% da população de equídeos da
microrregião (90.974 animais) (IBGE, 2010).
35
Figura 3. Local de estudo. A (Ibicaraí); B (Santa Cruz da Vitória); C (Itaju do
Colônia); D (Itapé); E (Floresta Azul). (Google maps, 2014).
4.2 DIRETRIZES ÉTICAS
O presente estudo foi realizado dentro dos padrões estabelecidos pelo
Colégio Brasileiro de Ética e Bem-Estar Animal, submetido e aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa com Uso de Animais (protocolo 002/2013), da
Universidade Estadual de Santa Cruz.
4.3 OBTENÇÃO E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
Amostras sanguíneas de 516 equídeos (475 equinos, 33 asininos e 8
muares), selecionados por conveniência em 20 propriedades, foram obtidas
através da punção da veia jugular externa, utilizando-se agulhas descartáveis
(25 X 8 mm) acopladas em tubos a vácuo sem anticoagulante. As amostras
foram mantidas em caixas isotérmicas e transportadas ao laboratório de
Análises Clínicas veterinária da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC)
onde foram processadas.
Os tubos foram centrifugados a 700g por 10 minutos, sendo os soros
separados por aspiração, acondicionados em microtubos e congelados em
triplicatas, a -20º C até a realização dos testes sorológicos.
36
4.4 SOROLOGIA
As amostras foram testadas para detecção de anticorpos contra N.
caninum e T. gondii através da Reação de Imunofluorescência indireta (RIFI),
com ponto de corte 1:50 e 1:64, respectivamente.
Para detecção dos anticorpos contra N. caninum, lâminas para RIFI
foram sensibilizadas com taquizoítos da cepa Nc-Bahia, provenientes da
Universidade Federal da Bahia (UFBA). Para detecção de anticorpos contra T.
gondii, as lâminas foram sensibilizadas com taquizoítos da cepa RH,
provenientes da Universidade Estadual Paulista Júnior Mesquita Filho
(UNESP),Campus Jaboticabal. O conjugado anti IgG equino Sigma (Anti-Horse
IgG – F7759, Sigma-Aldrich ®) na diluição de 1:32 foi utilizado nas reações. A
leitura das lâminas foi realizada no microscópio com sistema de
epifluorescência (OLYMPUS, BX 51), com reações consideradas positivas
apenas as que apresentaram completa fluorescência na circunferência dos
taquizoítos. Os controles (positivo e negativo) foram provenientes do
Laboratório de Diagnóstico de Parasitoses animais da Universidade Federal da
Bahia (UFBA).
Foram consideradas positivas apenas as reações cuja fluorescência era
total nos taquizoítos (PARÉ et al., 2015; STELMAN et al., 2011; GALVAO et al.,
2015). Reações apicais ou com fluorescência incompleta foram consideradas
negativas (PARÉ et al., 1995).
4.5 WESTERN BLOTTING
4.5.1 Separação dos grupos para a realização do WESTERN BLOTTING
Das 516 amostras testadas na RIFI, foram selecionadas, para o WB
todas as amostras positivas apenas para Neospora spp., todas as amostras
com infecção concomitante entre Neospora spp e T. gondii amostras positivas
apenas para Toxoplasma gondii e por fim amostras negativas para ambos os
agentes.
O resultado final da sorologia para Neospora spp. ocorreu mediante a
realização de pelo menos duas reações de Imunofluorescência realizadas por
diferentes observadores, a fim de evitar que amostras com reação apical ou
37
fluorescência incompleta fossem classificadas como positivas (Galvão et al.,
2015).
As amostras sorológicas foram transportadas em caixas isotérmicas
contendo gelo reciclável até a Universidade Federal do Recôncavo da Bahia –
Cruz das Almas Bahia- onde foram testadas através da técnica de western
blotting.
4.5.2 PRODUÇÃO DO ANTÍGENO PARA WESTERN BLOTTING
4.5.2.1 Cultivo de taquizoítos de Neospora caninum
Taquizoítos da cepa Nc-Bahia de N. caninum foram mantidos em
passagens contínuas em cultivo de células Vero, suplementados com meio
RPMI 1640 Medio com HEPES +L-Glutamina (GIBCO®), 10% desoro fetal
bovino e 5% de antibiótico/antimicótico 100x (10.000 unidades/mL de
penicilina, 10.000 µg/mL de streptomicina e 25 µg/mL de anfotericina B)
(Gibco®). O cultivo foi mantido em estufa a 37°C e 5 atm de CO2 e trocas de
meio realizadas a cada 48 horas. Todos os procedimentos de manipulação das
garrafas de cultivo, exceto a observação ao microscópio, ocorreram dentro da
capela de fluxo laminar. Na imagem 4 é possível visualização de focos de
destruição celular, com taquizoítos no meio extracelular e células Vero
parasitadas.
Figura 4. Cultivo celular de N. caninum. ASeta curta: Taquizoítos de N.
caninum. Seta longa: Diversas células Vero infectadas por N. caninum. B:
Imagem aproximada. Aumento 200x. Fonte: Arquivo pessoal.
38
4.5.2.2 Purificação do parasito
Quando aproximadamente 70% ( ) da camada de células vero
estavam rompidas pela ação dos taquizoitos, o conteúdo da garrafa foi
removido com o auxílio de um raspador de células “cell scraper” e de pipetas
de vidro. Os taquizoítos foram purificados conforme descrito no Anexo 1 e o
“pellet” resultante foi congelado a -20°C até o momento do uso.
4.5.3 A técnica de WESTERN BLOTTING
4.5.3.1 Eletroforese em gel de Acrilamida
Um volume de 4x107 de taquizoítos purificados foi ressuspenso em
tampão de amostra contendo glicerol, SDS e azul de bromofenol, aquecidas a
97°C por 10 minutos e em seguida, aplicados em um gel de Acrilamida/Bis
acrilamida 12% (LAEMMLI, 1970), imerso em tampão Tris/glicina/SDS em
sistema de eletroforese vertical (LCV 10x10-LOCCUS biotecnologia) (Figura 5)
e fonte PEQLAB Power Supplies EV200. O padrão de peso molecular utilizado
foi o Kaleidoscope Prestained Standards (BioRad). A eletroforese ocorreu com
duração média de 2 horas, a 200V,30mA e 150W e acompanhamento visual da
corrida. Ao final da corrida, a distância de migração das proteínas foi medida
conforme figura 6.
Figura 5. Sistema de eletroforese vertical. A: Sistema de eletroforese vertical
desmontado. B: Sistema de eletroforese vertical montado com gel de
Acrilamida/Bis Acrilamida 12%. Seta: Marcador de Peso Molecular corado.
Seta curva: Antígeno e tampão de amostra. Fonte:Arquivo pessoal.
39
Figura 6. Distância de migração do antígeno a partir da origem. Fonte: Arquivo
pessoal
4.5.3.2 Transferência para membrana
Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para a membrana de
PVDF 0,45µm (Bio Rad) em um sistema semi-seco de transferência
(PerfectBlue™ SEDEC 'Semi-Dry'- Peqlab Biotechnologie GmbH). Para tanto,
foi montado um sanduíche (Figuras 7 e 8) com 3 folhas de papel filtro, seguido
pela membrana de PVDF, gel (aproximadamente 56cm2) e mais três folhas de
papel filtro, todos umedecidos com o tampão de transferência
(Tris/glicina/metanol) e respeitando o sentido de migração das proteínas (polo
positivo para polo negativo).
Figura 7. Ilustração do sanduíche de transferência. Fonte:
https://imunologiahematologia.files.wordpress.com/2010/06/transferencia-
para-membrana-2-copy.jpg
40
Figura 8. Sanduíche parcialmente montado na cuba de transferência. Fonte:
Arquivo pessoal
Após transferência, as membranas foram lavadas com PBS-Tween, a
tira correspondente ao marcador removida (Figura 9) e as membranas
restantes bloqueadas overnight em solução contendo 5% de leite em pó
desnatado. Algumas membranas foram coradas com Ponceau 5% antes do
bloqueio. O gel eletrotransferido foi corado overnight com Comassie Blue
Brilliant G 250, para fins de monitoramento da transferência das proteínas de
N. caninum (Figura 10).
Figura 9. Visualização do padrão de peso molecular na membrana de PVDF
após transferência. A: Gel de Acrilamida/Bis Acrilamida após transferência para
a membrana. B: Membrana de PVDF após transferência. Fonte: Arquivo
pessoal.
41
Figura 10. Gel corado com Comassie Briliant Blue G 250 após
eletrotransferência. Fonte: Arquivo pessoal
.
4.5.3.3 Realização do Imunoblotting
A membrana foi cortada em tiras de aproximadamente 0,25cm de
largura e em seguida, colocadas em tubos de ensaio identificados (Figura 11),
com a amostra de soro diluído em PBS-T(1:100) acrescido de 1% de leite em
pó desnatado, incubadas durante duas horas em temperatura ambiente e
agitação contínua no agitador orbital Kline (Orbital stirrer Kline mod. 255B).
Após incubação, as tiras passaram por cinco lavagens de três minutos cada,
com PBS-T. Posterior as lavagens, as membranas foram incubadas com o
anticorpo conjugado marcado com peroxidase (Anti-Horse IgG (H+L)-
Peroxidase antibody produced in goat - Sigma Aldrich) com diluição de 1:5000
e novamente lavadas com PBS-T (5 lavagens/3 minutos cada) nas mesmas
condições acima citadas.
Realizadas todas as incubações, as membranas foram reveladas com o
Kit revelador da Bio-Rad (170-6431) (Figura 12), preparados de acordo com as
recomendações do fabricante. As membranas foram imersas na solução
reveladora e observadas até a completa identificação das bandas. A reação foi
parada com adição de água destilada quando as marcações estavam visíveis
na amostra controle positivo. O tempo médio de revelação completa foi de 17
42
segundos. Amostras com revelação em tempo superior a 30 segundos, em
comparação com o controle positivo, foram repetidas.
Figura 11. Incubação das amostras. A: Adição das tiras nos tubos contendo
soro. B: Disposição dos tubos na bandeja durante incubação. Fonte: Arquivo
pessoal.
Figura 12. Kit revelador (Bio-Rad 170-6431). Fonte: Arquivo pessoal
4.5.3.4 Identificação do peso molecular das proteínas reativas no western blot
Após revelação, as membranas foram secas em temperatura ambiente,
fotografadas e a migração das bandas medida com régua milimetrada. Os
43
valores foram armazenados no software Excel® Microsoft para calculo do peso
molecular das proteínas encontradas.
Os pesos moleculares das proteínas de Neospora spp. nas amostras
testadas foram determinados através da curva padrão com a distância de
migração das proteínas padrões, obedecendo o seguinte cálculo:
RF = Distancia de migração da proteína a partir da origem
Distancia de migração do bromofenol a partir da origem
Os valores do Rf foram plotados em gráficos, seguidos da adição de
uma linha de tendência. A equação da reta que apresentou maior precisão (R2)
em comparação ao padrão foi utilizada para determinação do peso molecular
das proteínas marcadas na reação.
Foram consideradas positivas as amostras que reagiram com pelo
menos um dos antígenos imunodominantes de Neospora spp. 17, 29
(NhSAG1), 35 (NhSRS2) e 37 KDa (HOWE et al., 1998; SCHARES et al., 1998;
MARSH et al., 1999; HOANE et al.,2005a) e ainda proteínas de 43 KDa
conforme Howe et al. (1998), sendo esses os marcadores da infecção pelo
agente no western blot.
5 RESULTADOS
Inicialmente, foram detectados na RIFI, anticorpos contra Neospora spp.
em 44 amostras sorológicas de equídeos (8,7 %), das quais 15 (2,9%) também
foram consideradas positivas para o protozoário T. gondii. Após a segunda
observação, foram consideradas como positivas apenas 15 amostras, das
quais seis amostras apresentavam reatividade simultânea a T. gondii.
Assim, após o resultado da sorologia o número de amostras testadas no
WB por grupo foi: 9 (nove) amostras positivas apenas para Neospora spp
(grupo 1), 6 (seis) amostras positivas para Neospora spp e T. gondii (grupo 2),
33 amostras positivas apenas para T. gondii (grupo 3) e 32 amostras negativas
para ambos os parasitos (grupo 4). Estão inclusas nove amostras no grupo 3 e
20 amostras no grupo 4 que apresentaram reação apical ou fluorescência
incompleta para Neospora spp..
44
Estas 80 amostras foram testadas por western blotting, das quais 18
foram positivas, reagindo a pelo menos uma banda imunodominante de N.
caninum, 15 não reagiram a nenhum antígeno e 47 apresentaram reações a
proteínas de pesos mais altos (a maioria) ou mais baixos que os considerados
para diagnóstico de N. caninum no presente estudo (Apêndice A).
Das nove amostras positivas na RIFI apenas para Neospora spp.
(Grupo 1), sete foram confirmadas no WB, com apenas uma amostra reagindo
ao antígenos de 17KDa e os demais, reconhecendo 35-37 e 43KDa (Tabela 6).
Duas amostras com reação positiva na RIFI não reagiram com as proteínas
imunodominantes de Neospora spp., com uma amostra reconhecendo apenas
a proteína de 55KDa e a outra, não reconheceu nenhum antígeno. Todas as
amostras positivas no WB também foram reativas a outras proteínas com
diferentes pesos moleculares, variando entre 11 e 119KDa.
Das amostras positivas para T. gondii e Neospora spp. na RIFI (Grupo 2)
, cinco foram consideradas positivas no WB, com bandas reativas em 35-37 e
43 KDa (Tabela 6) e uma amostra negativa, com reatividade a proteínas de 60,
44 e 40KDa Assim como nas amostras do grupo 1, também houve
reconhecimento de outras proteínas, com pesos moleculares variando entre 26
e 123 KDa.
No grupo de amostras positivas apenas para Toxoplasma (Grupo 3),
cinco amostras com titulação variando de 1:64 a 1:512 foram consideradas
positivas no WB, com reação ao antígeno de 35-37 KDa (Tabela 6) e outras
nove não reagiram a nenhuma banda. Dentre as nove amostras que
apresentaram reação apical ou fluorescência parcial para Neospora spp. sete
reagiram a proteínas com pesos entre 33 e 112 KDa, todas distintas das
imunodominantes. Cabe ressaltar que uma amostra de T. gondii titulada em
1:2024 apresentou uma forte marcação ao antígeno de peso 15 KDa (Figura
13).
Das 32 amostras negativas na RIFI, 31foram negativas também no WB,
entretanto, 24 delas reagiram a antígenos que não os descritos como alvos no
diagnóstico de Neospora spp. (31 a 107 KDa) e outras sete não reagiram a
nenhuma proteína de N. caninum . As amostras desse grupo que apresentaram
reação apical ou fluorescência incompleta para Neospora spp. na RIFI
reconheceram antígenos com pesos entre 53 e 107 KDa.
45
A proteína de 35KDa foi reconhecida pela maioria das amostras, já para
a de 29KDa, não houve reconhecimento por nenhum dos soros testados. A
única amostra sorológica proveniente de asinino considerada positiva no WB
reconheceu antígenos de pesos semelhante as reconhecidos pelos soros de
equinos, incluindo a p35 considerada como marcador da infecção por
Neospora spp. nesses animais.
Tabela 6. Amostras positivas para Neospora spp. no western blot
ID Agente Titulação na RIFI 43 35 – 37 29 17
39 +Nc 1:50 + + - -
54 +Nc 1:50
+
105 +Nc 1:50 - + - -
118 +Nc 1:50 - - - +
119 +Nc 1:50 - + - -
264 +Nc 1:50 - + - -
244 +Nc 1:200 + - - -
12 +Nc/+Tg 1:50 / 1:128 + + - -
28 +Nc/+Tg 1:50 / 1:128 + - -
45 +Nc/+Tg 1:50 / 1:128 - + - -
373 +Nc/+Tg 1:50 / 1:64 + - - -
395* +Nc/+Tg 1:50 / 1:128 - + - -
70 +Tg 1:512 - + - -
109 +Tg 1:128 - + - -
218 +Tg 1:64 - + - -
384 +Tg 1:512
+ - -
486 +Tg 1:512 - + - -
90 Negativo - - + - -
+Nc= Positivo para Neospora caninum. +Tg: Positivo para Toxoplasma gondii. *Asinino
A figura 14 ilustra uma membrana completa após revelação, com duas
amostras positivas para Neospora spp., com reatividade a proteínas de
aproximadamente 35-37 KDa e diversas amostras reativas a proteínas com
pesos moleculares diversos.
46
Figura 13. Amostra controle positivo de Toxoplasma gondii no imunoblotting.
A: Durante a revelação. B: Membrana seca após revelação. Fonte: Arquivo
pessoal.
9 Figura 14. Reação de Imunoblotting em membrana de PVDF após revelação.
1: Controle negativo; 2: Controle Positivo; 3 a 15: amostras testadas; 8 e 12:
amostras positiva com fraca marcação; 13: amostra positiva com forte
marcação. Fonte: Arquivo pessoal.
As faixas de reconhecimento antigênico dos soros equinos ao N.
caninum encontram-se expressos na figura 15.
BA
80kDa
56kDa64kDa
15kDa
80kDa64kDa
56kDa
15kDa
127,69 kDa
83,76 kDa
40,18 kDa
32,18 kDa
17,18 kDa
195,53 kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
6,99 kDa
47
Figura 15: Reconhecimento antigênico dos soros equinos ao N. caninum
Bandas de alto peso molecular foram reconhecidos em quatro amostras
apresentando coinfecção (108, 119, 123 e 131, KDa), duas amostras positivas
para Neospora spp. (105, 112, e 119 KDa), sete amostras positivas apenas
para T. gondii ( 105, 112, 114, 122 e 133 KDa) e duas amostra negativas (107
e 132KDa). As proteínas identificadas com maior freqüência nas amostras
analisadas foram as de peso de 58 e 63 KDa, que apareceram cada uma 12
vezes e as de 55, 56, 61, 69 e 90 KDa, que apareceram 7 vezes cada uma
(Figura 16).
Figura 16: Frequência das proteínas de Neospora spp. nas amostras
analisadas.
Os dados de positividade encontrados no presente estudo indicam que a
frequência de Neospora spp. nos equídeos estudados na microrregião Ilhéus-
Itabuna é de 3,49% (18/516). Quando comparado por espécie, 17 amostras
positivas são oriundas de equinos (3,3%), apenas uma da espécie asinina
(0,19%) e nenhuma de muar.
7,98% 6,57%
13,15%
8,92% 7,51%
3,29%
8,45%
1,88% 1,88%
4,69%
7,04%
4,23%
0,00%
2,35% 0,47%
1,88%
0 2 4 6 8
10 12 14 16 18
va
lor
em
%
Peso em KDa
Faixa de pesos moleculares de N. caninum reconhecidos por soros equinos no western blot
0
2
4
6
8
10
12
14
11
17
21
30
33
36
39
43
46
53
56
60
64
67
70
73
77
81
85
90
99
10
8
11
9
13
1
Fre
qu
ên
cia
PM em KDa
Frequência de proteínas de Neospora spp.identificadas no WB
FR
48
6 DISCUSSÃO
O presente estudo evidencia uma baixa frequência de Neospora spp.
nos equideos estudados e é similar a outros estudos realizados em diferentes
regiões do Brasil: Dubey et al. (1999b), Hoane et al., (2006), Galvão et al.
(2013), Pivoto et al. (2012a)sugerindo que a infecção por Neospora spp. em
equinos brasileiros seja relativamente incomum (HOANE et al.,2006).
A baixa frequência observada para asininos corrobora com os achados
de Galvão et al. (2015), entretanto, não podemos descartar a possibilidade
que,o número reduzido de amostras em comparação a espécie equina possa
ter influenciado nos resultados.
Com base no estudo de Galvão et al. (2015) repetimos nossas amostras
inicialmente positivas e também verificamos uma considerável inconsistência
com a nova sorologia realizada por um 2º observador. Houve uma redução na
positividade de 8,5% para 2,9%. As amostras inicialmente positivas
apresentavam uma marcante reação apical e ou fluorescência parcial dos
taquizoítos, o que gerou a interpretação equivocada do 1º observador. Desta
forma parece prudente um cuidado especial na RIFI para diagnóstico de
Neospora spp. em equídeos.
Segundo Paré et al. (1995), a existência de reações apicais ou com
fluorescência incompleta são indícios da existência de reações cruzadas com
outros parasitos do filo Apicomplexa, principalmente para coccídios formadores
de cistos (Galvão et al., 2015), é possível que este tipo de reação possa ser
mais intensa em equídeos, o que pode justificar os resultados. Ainda de acordo
com Paré et al. (1995) em casos onde existam altos títulos de anticorpos anti-
Neospora spp. nas amostras, a reação apical pode vim a ser interpretada como
positiva, porém inespecíficas.
De acordo com Bjerkas et al.(1994) e Barta, Dubey (1992), os antígenos
de pesos 29 e 35 (também reconhecidas como 36 e 43 em condições
redutoras) são antígenos de superfície (HOWE et al., 1998). Já o antígeno de
17KDa está associado as roptrias de N. caninum, sendo reconhecidos no WB
quando existem quadros de infecção aguda ou ainda, reativação da infecção
(ALVAREZ-GARCIA et al., 2002).
49
Diferenças antigênicas entre os isolados são sugeridas em função do
peso da proteína. A utilização da cepa Nc-Bahia de N. caninum pode permitir a
identificação de proteínas imunodominantes com pesos diferentes das
expressas por Nc-1 e Nc-Liverpool, sendo essa comumente utilizadas nos
estudos com WB. No presente estudo, duas proteínas com pesos de
aproximadamente 58 e 63KDa apresentaram características imunodominantes
nas amostras testadas, sugerindo que essas possam ser importantes
marcadores da infecção por Neospora spp. nos equinos, quando trabalhando
com antígenos da cepa Nc-Bahia.
Não identificamos a p29 como uma proteína imunodominante compatível
com a infecção por Neospora spp. no nosso estudo, dada pela ausência de
reconhecimento destas em todas as amostras testadas. Uma vez que esta
aproteína foi reconhecida em outros estudos envolvendo equinos (MARSH et
al., 1998; HOANE et al., 2005a;PIAZZETA, 2012), é possível que a ausência do
reconhecimento possa estar vinculada a uma característica da cepa Nc-Bahia,
uma vez que a maior parte dos estudos são realizados com cepas Nc-1 e Nc-
Liverpool de N. caninum e antígenos de N. hughesi.
A ocorrência de amostras negativas para Neospora spp. na RIFI e
positiva no WB pode ser atribuída a uma maior sensibilidade deste último. Esta
situação é descritas em infecções por Leishmania sp. (FERREIRA et al., 2013)
e pode estar relacionada a precoce detecção de anticorpos da classe IgM
(SCOLA;RAOULT, 1997). Além disso, em 11 (91,7%) das 12 amostras
positivas para Neospora spp., o título máximo observado foi de 50,
demonstrando que a exposição ao agente não parece induzir elevados títulos
de anticorpos.
Das amostras negativas na RIFI para Neospora spp. e positivas no WB,
cinco eram positivas para T. gondii. Entretanto, essa reatividade no WB não
condiz com a presença de reações cruzadas, considerando que uma amostra
apresentou forte reação apical quando no ponto de corte 1:50 enquanto que
nas quatro, observou-se títulos de anticorpos de 25 (ou seja abaixo do ponto de
corte) o que pode em parte evidenciar que a escolha do ponte de corte para
RIFI pode ter diminuído a sensibilidade da técnica.
Das amostras que não reagiram no WB, três foram positivas na RIFI
(retestadas três vezes), corroborando com Vardeleon et al. (2011), onde
50
observaram que amostras com baixa titulação de anticorpos contra Neospora
spp. na RIFI nem sempre apresentavam reatividade no imunoblotting. Uma
dessas amostras reagiu apenas ao antígeno de 55KDa. Essa proteína foi
considerada por Pinheiro et al. (2005) como critério diagnóstico da infecção por
N. caninum em cães. Outras seis amostras, incluindo amostras positivas no
WB também reconheceram a referida proteína, indicando que essa possa ser
uma importante proteína a ser usada como marcador compatível da infecção
por N. caninum em equídeos.
Embora a reatividade cruzada entre N. caninum e N. hughesi seja
relatada (GONDIM et al,. 2009), Yergan et al. (2013) consideraram a p29 como
marcador da infecção por N. hughesiem equinos naturalmente infectados no
México, enquanto que Hoane et al. (2005a) utilizaram a mesma proteína para
desenvolvimento de um ELISA também para diagnóstico de N. hughesi,
obtendo sensibilidade e especificidade de 94 e 95% respectivamente. Esses
estudos, somadas aos de Dubey et al. (2001) reforçam que esse possa ser um
provável critério de diferenciação da infecção pelas espécies no western
blotting, contudo pouco se sabe quando o antígeno do WB é de N. caninum é
incubado com anticorpos de N. hughesi..
Logo, A infecção por N. hughesi não deve ser descartada, nos animais
estudados, uma vez que o parasito é muito semelhante a N. caninum (MARSH
et al., 1999) principalmente nas amostras positivas na RIFI e negativas no WB.
Diante do exposto, reforça-se a necessidade de um teste diagnóstico
sorológico padronizado que permita a diferenciação entre as duas espécies de
Neospora que acometem equinos.
7 CONCLUSÃO
Equideos da microrregião Ilhéus-Itabuna estão expostos ao Neospora
spp.
As proteínas de 17, 35-37 e 43KDa são compatíveis com a infecção por
Neospora spp. em asininos e equinos da microrregião Ilhéus-Itabuna.
A p55 pode ser uma proteína com potencial diagnóstico da infecção por
N. caninum em equídeos.
51
Não foi possível comparar os títulos de anticorpos anti-Neospora spp.
encontrados na RIFI com o perfil de reatividade obtidos do western blotting.
O perfil de reatividade do soro asinino foi semelhante ao apresentado
pelos equinos no western blotting.
52
REFERÊNCIAS
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67
ANEXOS Anexo A
Purificação do parasito
1. Transferir o meio da garrafa de parasito para um tubo falcon
2. “Raspar” a garrafa de parasito com cell scraper e adicionar ao tubo
falcon anterior.
3. Passa todo o conteúdo na seringa com agulha 22g
4. Filtrar o conteúdo em filtro de poro 5µm
5. Centrifugar a 1500 RPM, 4°C, durante 10 minutos.
6. Descartar o sobrenadante e ressuspender o conteúdo em PBS 1X.
7. Centrifugar a 1500 RPM, 4°C, durante 10 minutos
8. Ressuspender em PBS 1X.
9. Descartar o sobrenadante e ressuspender o conteúdo em PBS 1X
10. Centrifugar a 1500 RPM, 4°C, durante 10 minutos
11. Descartar o sobrenadante, deixando aproximadamente 1mL.
12. Transferir o conteúdo para um eppendorf.
13. Centrifugar com PBS e contar os parasitos utilizando a câmara de
neubauer.
68
Anexo B
Protocolo do western Blot
1. Preparo da amostra (VF= 100 µL) – Antígeno bruto
80 µL de antígeno + PBS (mínimo de 4x107de taquizoítos)
20µL do tampão da amostra 5x
Aquecer a 97ºC durante 10 minutos. Se o volume preparado for
superior ao utilizado no dia, congelar o restante e no momento do uso, colocar
a 97ºC durante 3 minutos.
2. PREPARAÇÃO DO GEL E MIGRAÇÃO
a. Montar as placas de vidro no suporte de migração (caso necessário
limpar as placas com álcool absoluto; após montada, testar com água
destilada pra verificar vazamento).
b. Preparar o gel de migração e depositá-lo entre as placas de vidro,
deixando o espaço para o gel de empilhamento.
c. Preencher o espaço restante com água destilada.
d. Aguardar polimerizar
PARA UM GEL DE MIGRAÇÃO
SOLUÇÃO 5% 7% 8% 10% 12%
H2O destilada 5,7mL 5,05 mL 4,7 mL 4,05 mL 3,4 mL
Tris HCl [1,5M, pH 8,9] 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL
SDS 10% 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL
Acrilamida/Bis-acrilamida 1,7mL 2,35ml 2,7mL 3,35mL 4,02mL
PSA (100mg/mL) 100µL
TEMED 5µL
PARA DOIS GÉIS DE MIGRAÇÃO
SOLUÇÃO 5% 7% 8% 10% 12%
H2O destilada 11,4mL 10,1 mL 9,4 mL 8,1 mL 6,8 mL
Tris HCl [1,5M, pH 8,9] 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
SDS 10% 200µL 200µL 200µL 200µL 200µL
Acrilamida/Bis-acrilamida 3,4mL 4,7ml 5,4mL 6,7mL 8,04mL
PSA (100mg/mL) 200µL
TEMED 10µL
PSA e o TEMED só devem ser adicionados no momento do uso
69
e. Preparar o gel de empilhamento
GEL DE EMPILHAMENTO
SOLUÇÃO 1 GEL 2 GÉIS
H2O destilada 3,635mL 7,27 mL
Tris HCl [0,5M] pH 6,8 0,625 mL 1,25 mL
SDS 10% 50µL 100µL
Acrilamida/Bis-acrilamida 0,65mL 1,3ml
PSA (100mg/mL) 50µL 100µL
TEMED 5µL 10µL
f. Retirar a água destilada e secar as placas com papel filtro.
g. Depositar o gel de empilhamento e colocar o pente para formação dos
poços.
h. Após polimerizar, retirar o pente e lavar cada poço com tampão de
migração.
i. Retirar a base do suporte de migração, preenchendo o orifício central
com o tampão de migração.
j. Depositar o marcador de peso molecular (5 a 10 µL ) e os extratos de
proteínas (preparado na etapa 1).
k. Adaptar o suporte na cuba de migração e preencher com o tampão de
migração.
l. Acoplar os fios [vermelho (+) e Preto (-)].
m. Correr com 200volts, 30Mili Amperes, 150 watts, durante 120
minutos..
É necessário acompanhamento visual da corrida uma vez que o
tempo varia em função da concentração do gel (parar a corrida quando
o azul de bromofenol corar o fundo do gel).
3. TRANSFERÊNCIA
a. Cortar a membrana de PVDF de acordo com o tamanho do gel.
(Não tocar na membrana sem luva).
b. Permeabilizar a membrana de PVDF em metanol [100%] por 15
segundos, em seguida colocadas em água destilada por 2 minutos e
então em tampão de transferência por 5 minutos.
70
c. Umedecer o papel e a esponja (não utilizada no sistema semi-seco) com
tampão de transferência.
d. Desmontar as placas de vidro com o gel e montar o sanduíche, evitando
bolhas entre as camadas e observando o sentido de migração (- para +).
e. Transferir com 10Volts, 150 Mili Ampere, 150 Watts, durante 95 minutos
f. Desmontar o sanduíche e Corar a membrana com Ponceau S.
g. Bloquear a membrana com a solução bloqueadora (PBS-T+Leite em pó)
manter sob agitação.
h. Lava com PBS-T manter sob agitação.
i. Cortar as membranas em tiras de aproximadamente 0,3cm, sempre
marcando a extremidade superior.
As membranas devem ser congeladas a -200C caso não seja pra uso
imediato.
j. Diluir o soro teste em PBS-T+1% de leite em pó e incubar a 370C por
duas hora, sob agitação.
k. Lava 5 vezes com PBS-T
l. Adicionar o conjugado na diluição recomendada e incuba novamente a
370C por duas hora, sob agitação.
m. Lava 5 vezes com PBS-T
n. Lava um única vez com Tris-HCl [0,05M] pH 7,2
4. Revelação (Bio-Rad 170-6431)protocolo recomendado pelo fabricante.
Colocar a membrana entre folhas plásticas
Em um tubo tipo Falcon, adicionar 1mL do reagente 10X HRP color
development buffer e 9 mL de água.
Adicionar 60µL do HRP color reagente B
Adicionar 2 mL do HRP color reagente A
Homogenizar e distribuir sobre as tiras, tendo o cuidado de cobrir toda a
tira (±300µL por tira).
Acionar o cronômetro.
Observar o surgimento das bandas.
71
Parar a reação com água destilada quando o controle positivo estiver
revelado.
Secar a membrana e capturar imagem.
Medir a distância de migração da proteína.
72
ANEXO C
Calculo dos Pesos Moleculares
1. Medir a distancia do bromofenol a partir da origem.
2. Medir a distancia de migração das proteínas padrões a partir da
origem.
3. Calcular o valor da migração relativa (Rf) das proteínas padrões.
Rf é definida por:
Rf = Dist ncia de migra ão da proteína a partir da origem
Dist ncia de migra ão do bromofenol a partir da origem
4. Construir a curva padrão: apresentação semiLog com Rf em abcissa e
o peso molecular.
5. Medir Rf das proteínas de PM desconhecidos e localizar na curva
padrão para estimar o peso molecular das mesmas.
73
APÊNDICE A
Proteínas de Neospora spp. reconhecidas pelos soros de equinos, asininos e muares no western blot
ID Agente Titulação na RIFI
105-134
90-100
80-89 70-78 60-69 56-59 55 47-54 44-46 43 38-42 35 - 37 30-34 29 18-26 17 11 a 16
Amostras reativas a proteínas com 17, 29, 35-37 e 43 KDa
39 +Nc 01:50 - - + ++ - + - - - + - + + - - - +
54 +Nc 01:50 + - - - + - - - - - - + - - - - -
105 +Nc 01:50 ++ ++ + - - + - - + - - + + - - - -
118 +Nc 01:50 - + ++ - - - - - - - + - - - - + -
119 +Nc 01:50 - - - - - - - - - - ++ + - - - - -
264 +Nc 01:50 - + - - + - - - - - - + - - - - -
244 +Nc 01:200 - - ++ - +++ - - - - + - - - - - - -
12 +Nc/+Tg 1:50 / 1:128
+ - + +++ + + - - - + + + + - - - -
28 +Nc/+Tg 1:50 / 1:128
+ - + + - + - + - - + + - - - - -
45 +Nc/+Tg 1:50 / 1:128 - + + - + - + - - - + + + - - - -
373 +Nc/+Tg 1:50 / 1:64 + + + - + - - + - + - - - - - - -
395 +Nc/+Tg 1:50 / 1:128
+ + + + - + - + - - - + - - + - -
70 +Tg 01:512 - - ++ + ++ + - - - - + + + - - - -
109 +Tg 01:128 - - - - - - - - - - - + - - - - -
218 +Tg 1:64 - - - - - - + + - - - + - - - - -
384 +Tg 1:512 + + - - - + - - - - - + - - - - -
486 +Tg 1:512 - + + - + - - + - - - + - - + - -
90 negativo - 199 - - - - - - - - - ++ + - - - - -
Amostras não reativas a proteínas com 17, 29, 35-37 e 43 KDa
216 +Nc 01:50 - - - - - - - - - - - - - - - - -
462 +Nc 01:50 - - - - - - + - - - - - - - - - -
490 +Nc/+Tg 1:50 / 1:256 - - - - + - - - + - + - - - - - -
74
Amostras não reativas a proteínas com 17, 29, 35-37 e 43 KDa - Continuação
ID Agente Titulação na RIFI
105-134 90-100 80-89 70-78 60-69 56-59 55 47-54 44-46 43 38-42 35 - 37 30-34 29 18-26 17 11 a 16
5 +Tg 01:2048 - - - + + - - + - - - - - - - - +
87 +Tg 01:64 - - - - - - - - - - - - - - ++ - -
141 +Tg 01:128 - - - - + - - - - - - - - - - - -
155 +Tg 01:128 - - - - - + - - - - - - - - - - -
160 +Tg 01:64 - - + + + + - - - - - - - - - - -
161 +Tg 01:256 - - - - - - - + - - - - - - - - -
165 +Tg 01:1024 - - - - + - - - - - - - - - - - -
172 +Tg 01:128 - - - + - - + - - - - - - - - - -
201 +Tg 01:256 + - - - + - - - - - - - - - - - -
222 +Tg 01:256 + + - - + - - - - - - - - - - - -
232 +Tg 01:64 - + - - - - - - - - - - - - - - -
236 +Tg 01:64 - - - - + - - - - - - - - - - - -
253 +Tg 01:64 - - - - + - - - + - - - - - - - -
367 +Tg 01:256 - - + - - - - + - - - - - - - - -
370 +Tg 01:1024 + - ++ + ++ + - - - - - - - - - - -
413 +Tg 01:256 + - - - + - - - - - - - - - - - -
474 +Tg 01:128 - - - - + - - - - - - - - - - - -
170 +Tg 01:64 ++ - + + ++ - - + - - - - + - - - -
519 +Tg 01:64 + - + + - - - + - - - - - - - - -
113 +Tg 01:128 - - - - - - - - - - - - - - - - -
132 +Tg 01:128 - - - - - - - - - - - - - - - - -
153 +Tg 01:128 - - - - - - - - - - - - - - - - -
249 +Tg 01:128 - - - - - - - - - - - - - - - - -
385 +Tg 01:512 - - - - - - - - - - - - - - - - -
412 +Tg 01:513 - - - - - - - - - - - - - - - - -
414 +Tg 01:256 - - - - - - - - - - - - - - - - -
472 +Tg 01:259 - - - - - - - - - - - - - - - - -
510 +Tg 01:64 - - - - - - - - - - - - - - - - -
75
Amostras não reativas a 17, 29, 35-37 e 43 KDa – Continuação
ID Agente Titulação na RIFI
105-134
90-100 80-89 70-78 60-69 56-59 55 47-54 44-46 43 38-42 35 - 37 30-34 29 18-26 17 11 a 16
9 Negativo Negativo - - - - + - - - - - - - - - - - -
25 Negativo Negativo - - - - - - - - - - - - - - - - -
117 Negativo Negativo - - - - - - - + - - - - - - - - -
138 Negativo Negativo - - - - ++ - - - - - - - - - - - -
145 Negativo Negativo + - + - - + - - - - - - - - - - - 171 Negativo Negativo - - - - ++ - - - - - - - - - - - -
182 Negativo Negativo - - - - - - - + - - - - - - - - - 205 Negativo Negativo - - - - + + - - - - - - - - - - -
221 Negativo Negativo - - + - - - - - - - - - - - - - -
229 Negativo Negativo - - - - + - - - - - - - - - - - -
267 Negativo Negativo - - - - + - - + - - - - - - - - -
277 Negativo Negativo - - - - - - + - - - - - - - - - -
300 Negativo Negativo - - ++ - + + - + + - - - + - - - -
324 Negativo Negativo - - - - - - + + - - - - - - - - -
325 Negativo Negativo - - - - ++ - - - - - - - - - - - -
342 Negativo Negativo - - - - + + - - - - - - + - - - -
374 Negativo Negativo - - - - + - - + - - - - - - - - -
381 Negativo Negativo - - ++ - - + - - - - - - - - - - -
382 Negativo Negativo - + - - - - - - - - - - - - - - -
383 Negativo Negativo - + - + - - - - - - - - - - - - -
512 Negativo Negativo + - - - - + - - - - - - - - - - - 515 Negativo Negativo - - - - ++ - - - - - - - - - - - -
400 Negativo Negativo - - - ++ - - + - - - - - - - - - - 227 Negativo Negativo - - + + - + - - - - - - - - - - -
116 Negativo Negativo - - - - - - - - - - - - - - - - -
186 Negativo Negativo - - - - - - - - - - - - - - - - -
215 Negativo Negativo - - - - - - - - - - - - - - - - -
259 Negativo Negativo - - - - - - - - - - - - - - - - -
275 Negativo Negativo - - - - - - - - - - - - - - - - -
293 Negativo Negativo - - - - - - - - - - - - - - - - -
506 Negativo Negativo - - - - - - - - - - - - - - - - -
