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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E

BIOLOGIA MOLECULAR

RESPOSTAS FISIOLÓGICAS E EXPRESSÃO GÊNICA DE AQUAPO RINA EM

GENÓTIPOS CLONAIS DE CACAU SUBMETIDOS AO SOMBREAMEN TO E AO

ALAGAMENTO DO SOLO

MÁRCIA CHRISTINA DA SILVA BRANCO

ILHÉUS-BAHIA-BRASIL

Agosto de 2010

ii


RESPOSTAS FISIOLÓGICAS E EXPRESSÃO GÊNICA DE AQUAP ORINAS EM GENÓTIPOS CLONAIS DE CACAU SUBMETIDOS AO SOMBREAMEN TO E AO

ALAGAMENTO DO SOLO

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Agosto de 2010

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Área de concentração: Genética e Biologia Molecular

Orientador: Prof. Dr. Alex- Alan Furtado de Almeida

iii


RESPOSTAS FISIOLÓGICAS E EXPRESSÃO GÊNICA DE AQUAP ORINAS EM GENÓTIPOS CLONAIS DE CACAU SUBMETIDOS AO SOMBREAMEN TO E AO

ALAGAMENTO DO SOLO

APROVADA: 31 de Agosto de 2010

Prof. Dr. Raul Rene Melendez Valle

CEPEC/CEPLAC

Prof. Dr. Márcio Gilberto Cardoso Costa

UESC

Prof. Dr. Dario Ahnert

CEPEC/CEPLAC

Prof. Dr. Alex -Alan Furtado de Almeida

UESC-Orientador

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

iv

DEDICATÓRIA

À minha mãe Edna Lúcia e minha avó Argentina, pelo amor incondicional, dedico.

Ao meu namorado Felipe, por estar sempre ao meu lado, ofereço.

v

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Santa Cruz e ao Programa de pós-graduação em Genética e Biologia Molecular pela oportunidade de realizar este curso.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa.

À United States Department of Agriculture (USDA), na pessoa de Virupax C. Baligar, pelo apoio financeiro ao projeto de pesquisa.

Ao Professor Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida pela orientação, pela confiança depositada em mim, pelos conhecimentos transmitidos e incentivos.

Ao Professor Dr. Ronan Xavier Corrêa pela co-orientação e pela oportunidade de iniciação na pesquisa científica.

Ao Professor Dr. Fábio Pinto Gomes pela colaboração e sugestões.

Ao Emerson pela paciência e grande colaboração nas análises estatísticas.

Ao Stênio Carvalho pela indispensável ajuda nas análises de Expressão Gênica.

À Renata Silveira pelo auxílio na coleta dos dados e nas análises de teor de carboidratos.

À Seção de Fisiologia Vegetal (SEFIS) do Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC/CEPLAC) pelo suporte nas análises de teor de carboidratos.

À minha mãe, Edna Lúcia, pelo esforço sem medida para que eu chegasse até aqui.

À minha família por apoiarem e por entenderem a minha ausência ou minha presença “relâmpago”.

vi

Ao meu namorado Felipe, companheiro de todas as horas, por todo amor, dedicação, incentivo e por compreender a minha chatice quando estou em fases críticas.

Aos colegas e amigos do Centro de Biotecnologia e Genética pelos momentos de descontração em meio ao trabalho.

Aos colegas do curso de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular pela alegre convivência.

À Bruna, Vânia, Josie e Fabiana pela amizade, companhia e pelas risadas juntas.

Enfim, a todos que colaboraram de alguma maneira para a realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.

vii

ÍNDICE

EXTRATO .................................................................................................................. ix

ABSTRACT ............................................................................................................... xii

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. xv

LISTA DE TABELAS .............................................................................................. xxvii

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 5

2.1. Respostas fisiológicas das plantas à variação da irradiância ........................... 5

2.2. Respostas fisiológicas das plantas ao alagamento do solo .............................. 8

2.3. Efeitos isolados da irradiância e do alagamento do solo no cacaueiro ........... 11

2.4. As aquaporinas ............................................................................................... 15

3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 21

3.1. Material vegetal e condições de cultivo .......................................................... 21

3.2. Parâmetros micrometeorológicos ................................................................... 22

3.3. Medições de trocas gasosas foliares ............................................................. 22

3.4. Medições de fluorescência da clorofila a ........................................................ 22

3.5. Determinação do teor de clorofila a, b, total e carotenóides ........................... 23

3.6. Extravasamento de eletrólitos ......................................................................... 24

3.7. Parâmetros de crescimento ............................................................................ 24

3.8. Teor de carboidratos ....................................................................................... 25

3.8.1. Obtenção do extrato ................................................................................. 25

viii

3.8.2. Quantificação ........................................................................................... 26

3.9. Expressão gênica de aquaporina ................................................................... 26

3.10. Análise estatística ......................................................................................... 27

4. RESULTADOS ...................................................................................................... 28

4.1. Variáveis microclimáticas ................................................................................ 28

4.2. Observações visuais ....................................................................................... 30

4.3. Trocas gasosas foliares .................................................................................. 31

4.4. Emissão de fluorescência da clorofila a .......................................................... 40

4.5. Teores de pigmentos cloroplastídicos ............................................................. 46

4.6. Extravasamento de eletrólitos ......................................................................... 51

4.7. Biomassa seca ............................................................................................... 52

4.8. Teor de carboidratos ....................................................................................... 67

4.8.1. Açúcares solúveis totais ........................................................................... 68

4.8.2. Amido ....................................................................................................... 71

4.9. Expressão gênica da aquaporina PIP1;3 ........................................................ 74

5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 76

5.1. Parâmetros fisiológicos ................................................................................... 76

5.2. Expressão gênica da aquaporina PIP1;3 em plantas submetidas ao

sombreamento e ao alagamento do solo ............................................................... 90

6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 92

7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 93

ix

EXTRATO

BRANCO, Márcia Christina da Silva, M. S., Universidade Estadual de Santa Cruz,

Ilhéus, agosto de 2010. Respostas fisiológicas e expressão gênica de

aquaporinas em mudas clonais de cacau submetidas ao sombreamento e

alagamento do solo. Orientador: Alex-Alan Furtado de Almeida. Co-orientador:

Ronan Xavier Corrêa. Colaborador: Fábio Pinto Gomes.

O crescimento e desenvolvimento das plantas são freqüentemente limitados por

estresses múltiplos que ocorrem simultaneamente no ambiente. O estudo das

respostas fisiológicas tem-se mostrado como um eficiente meio de elucidar os

efeitos de variáveis ambientais, como a luz e o alagamento do solo, sobre o

crescimento das plantas. O alagamento é um fator estressante, visto que este tipo

de estresse abiótico promove a diminuição do oxigênio disponível no solo para as

raízes e provoca uma série de danos nas plantas, cujas respostas dependem da

espécie, condições fisiológicas e duração do estresse. Por outro lado, a luz é um dos

fatores ambientais que mais influencia o crescimento e a distribuição das espécies

vegetais em diversos ecossistemas. Espécies arbóreas podem diferir grandemente

na maneira com que respondem às variações da irradiância. O presente trabalho

teve como objetivo principal avaliar as características fisiológicas e a expressão da

aquaporina PIP1;3 em dois genótipos clonais de cacau, contrastantes para a

resistência ao alagamento do solo (TSA-792 - resistente e TSH-774 - susceptível),

submetidos a diferentes níveis de sombreamento e a dois regimes hídricos (alagado

e não-alagado), visando elucidar os possíveis mecanismos de sobrevivência ao

sombreamento e a sua interação com o alagamento. As plantas clonais de ambos os

x

genótipos foram crescidas em vasos plásticos com 25 L de solo sob diferentes níveis

de sombreamento [não-alagado (T0), 25% (T25), 50% (T50) e 75% (T75)] em casa

de vegetação por quatro meses. Logo após, parte das plantas foi submetida ao

alagamento do solo, vedando o fundo dos vasos e adicionando água até 2 cm acima

do nível do solo, por um período de 85 dias, e parte mantida com a umidade do solo

próxima à capacidade de campo. Coletaram-se folhas de todos os tratamentos 24 h

após o alagamento do solo para análise de expressão gênica da aquaporina PIP1;3

por meio da qRT-PCR. Fez-se medições simultâneas de fluorescência da clorofila e

de trocas gasosas em nível foliar aos 0, 8, 16, 24, 32, 40 e 48 dias, entre 8 e 12h,

utilizando um medidor portátil de fotossíntese (Licor LI-6400). No final do

experimento, avaliou-se a estabilidade das membranas celulares por meio da

técnica do extravasamento de eletrólitos e determinou-se o teor de pigmentos

cloroplastídicos. Todas as plantas sobreviveram ao período de alagamento, porém

com sintomas visuais de estresse como clorose foliar e lenticelas hipertrofiadas na

base do caule. Os resultados mostraram efeitos significativos (P< 0,05) para

interação dupla (alagamento x sombreamento), em relação à emissão de

fluorescência da clorofila, somente para as variáveis fluorescências inicial e máxima

e eficiência quântica do fotossistema II. Nas trocas gasosas foliares foi observada

interação tripla (genótipo x alagamento x sombreamento) para as variáveis

fotossíntese líquida por unidade de área foliar, condutância estomática ao vapor de

água e eficiência intrínseca do uso de água. Verificaram-se efeitos isolados do

sombreamento nas trocas gasosas foliares das plantas não alagadas. Não se

observou alterações inter e intragenotípicas no extravasamento de eletrólitos para os

tratamentos de alagamento e sombreamento. As estimativas do teor de clorofila

variaram significativamente (p<0,05) entre os níveis de sombreamento e entre os

tratamentos não-alagado e alagado, sem variação intergenotípica. Para as variáveis

de crescimento, não houve interação tripla significativa (p<0,05), contudo observou-

se a interação entre sombreamento e alagamento do solo foi significativa (p<0,05)

para a área foliar total, biomassa seca da raiz, do caule, da folha, total e área foliar

específica. Variações significativas (p<0,05) no teor de açúcares solúveis totais

foram observadas entre os níveis de sombreamento, regime hídrico, órgão e para a

interação nível de sombreamento x regime hídrico, ao passo que, para o teor de

amido, apenas os fatores genótipo, regime hídrico, órgão e a interação regime

xi

hídrico e órgão foram significativos. Verificou-se que o alagamento do solo foi o

principal fator estressor para a maioria das respostas fisiológicas observadas

durante a interação entre sombreamento e alagamento, cujos ajustes fisiológicos

foram distintos entre os genótipos clonais de cacau avaliados. Essas respostas

foram atenuadas para o genótipo clonal TSA-792, que apresentou crescimento e

desenvolvimento superiores em relação ao genótipo clonal TSH-774. A relação

observada entre os níveis de expressão gênica e os parâmetros de trocas gasosas

foliares permitiu afirmar que a expressão do gene PIP1;3 é modulada por anoxia,

principalmente para o genótipo clonal de cacau TSA-792, considerado resistente ao

alagamento do solo.

Palavras-chave: sombreamento, estresse abiótico, Theobroma cacao, aquaporinas,

RT-PCR.

xii

ABSTRACT

BRANCO, Márcia Christina da Silva, M. S., Universidade Estadual de Santa Cruz,

Ilhéus - BA, August, 2010. Physiological responses and gene expression of

aquaporin in cocoa clonal genotypes submitted to th e shading and soil

flooding. Advisor: Alex-Alan Furtado de Almeida. Co-advisor: Ronan Xavier Corrêa.

Collaborator: Fábio Pinto Gomes.

Growth and development of plants frequently are limited by multiple stresses that

occur simultaneously in the environment. Physiological responses have been used

as an efficient tool to elucidate the effect of environment variables, as the light and

the flooding of soil, on the growth in plants. Flooding is a stressing factor because

promotes the reduction of available oxygen from the soil to the roots and provokes a

series of damages to which depends on the species, plants physiological conditions

and duration of the stress. On the other hand, the light is one of the environment

factors that more influence the growth and the distribution of the plant species in

ecosystems. Woody plants can differ greatly in the way with that they answer to the

variations of the irradiance. The present work had as objective to evaluate the

physiological characteristics and the gene expression of aquaporin PIP1;3 in two

clonal genotypes of cacao, contrasting the resistance to soil flooding (TSA-792 -

resistant and TSH-774 - susceptible), submitted to different levels of shading and

water regime, flooded and not flooded, to elucidate the mechanisms of survival to

shading and its interaction with flooding. The clonal plants were grown in plastic

vases each with 25 liters of soil under different levels of shading [(T0), 25% (T25),

50% (T50) e 75% (T75)], in greenhouse, during 85 days. After, part of the plants

were submitted to flooding adding water up to 2 cm above of the level of the ground,

for a period of 85 days. In the other part of the plants, the soil humidity was

xiii

maintained next to the field capacity. Leaves were harvested of all treatments after

24 h of flooding for the gene expression analysis by Real Time qRT-PCR. Gas

exchange and fluorescence chlorophyll at leaf level measurements were made at 0,

8, 16, 24, 32, 40 and 48 days, between 8h and 12h a.m. using a photosynthesis

portatil measurer (Li-Cor 6400). At the end of the experiment, the plasmatic

membrane stability was assessed by electrolytes leakage technique and the

chloroplastidic pigments contents. All the plants survived the period of flooding

however, with stress visual symptoms like leaf chlorosis and lenticels hypertrophied

on the stem base. The results show significant effects (p<0,05) for the double

interaction (flooding x shading) regarding to fluorescence emission only to the

variables minimal and maximal fluorescence and maximum quantum efficiency of

PSII. For the leaf gas exchange was observed triple interaction (genotype x shading

x flooding) for the net photosynthesis per leaf area unit, stomatic conductance to

water vapour, intrinsic water use efficiency. Isolated effects of shading acting on the

leaf gas exchange were observed. No inter- and intragenotypics changes were

observed in the leakage electrolytes in the flooded and shading treatments (p<0, 05).

There was variation in the contents of chlorophylls (p<0,05) among the shading

levels and between the flooded and not flooded treatments but, there was not

variation intragenotypics. Significant double interaction between shading level and

flooded of the soil was observed for the following variables: total and specific leaf

area; root, stem, leaf and total dry biomass. Difference (p<0,05) among the shading

level, water regime, organ and for the interaction shading level x flooding were

observed in the contents of total soluble sugars while in starch, only the factors

genotype, water regime, organ and the interaction between water regime and organ

was significant (p<0,05). Flooding was the main stressor factor for the most

physiological responses observed during the interaction between shading and

flooded soil whose physiological adjustments were different on the clonal cocoa

genotypes assessed. These responses were attenuated for the clonal genotype TSA-

792 that showed the highest grown and development regarding the clonal genotypes

TSH-774. The relationship observed among the levels of gene expression and leaf

gas exchange allowed concluding that the gene expression of PIP1;3 is modulated

by anoxic stress mainly to the clonal genotype of cocoa TSA-792, assumed resistant

to soil flooding.

xiv

Keywords: shade, abiotic stress, Theobroma cacao, aquaporin, Real Time qRT-PCR.

xv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Efeitos do sombreamento e de fertilizantes sobre o rendimento

do cacaueiro “Amelonado”em Gana (AKENORAH et al.,

1974).........................................................................................

13

Figura 2. Estrutura das aquaporinas, mostrando as seis α-hélices e as

regiões de duplicação gênica (primeira e segunda metade).

NH2 = região aminoterminal; COOH = região carboxiterminal;

A, C, D = loops hidrofílicos; B e E = loops hidrofóbicos; NPA =

Box asparigina–prolina-alanina; SH = local de inibição por

mercúrio (Hg2+); Ser256 = serina 256, local de fosforilação

por proteínas quinases A (PKA) (VERA-ESTRELLA et al.,

2005)...........................................................................................

17

Figura 3. Variáveis microclimáticas medidas no interior da casa de

vegetação. (A) Temperatura (°C) do ar; (B) Umidade relativa

(%) do ar; (C) Valores médios diários (7h – 17h) de radiação

fotossinteticamente ativa (RFA) em cada nível de

sombreamento (NS, %); (▲) T0; (○) T25; (��)T50 e

(��)T75........................................................................................

29

Figura 4. Morfologia externa de plantas dos genótipos clonais de cacau

TSA-792 e TSH-774 submetidos ao sombreamento por quatro

meses e ao sombreamento + alagamento do solo por um

período de 85 dias. (A) Clorose foliar aos oito dias (TSH-774)

xvi

e (B) aos 85 dias após o alagamento do solo (TSA-792); (C)

Lenticelas hipertrofiadas na base do caule oito dias após o

alagamento do

solo.............................................................................................

30

Figura 5. Condutância estomática ao vapor de água (gs) em nível foliar

em genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento

por quatro meses e ao sombreamento + alagamento do solo

por um período de 48 dias. (A) TSA-792 não-alagado

(y=1,097 – 0,307T - 0,106NS – 0,0875T2 – 0,0047NS2 –

0,0685TNS / R2 = 0,16); alagado (y=1,173 – 1,314***T –

0,3531NS + 0,385*T2 + 0,2806*NS2 + 0,2123TNS/ R2= 0,86);

(B) TSH-774 não-alagado (y= 1,151 – 0,64*T + 0,695NS –

0,239T2 – 0,173NS2 – 0,182TNS / R2 = 0,36); alagado (y=

0,586 – 0,931***T + 0,552*NS + 0,421**T2 – 0,156NS2 –

0,171TNS / R2 = 0,77..................................................................

32

Figura 6. Taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar (A) em

genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento por

quatro meses e ao sombreamento + alagamento do solo por

um período de 48 dias. (A) TSA-792 não-alagado (y=9,95 –

0,172 T + 0,012NS – 0,04T2 – 0,0001NS2 – 0,0015TNS / R2 =

0,80); alagado (y=12,11 – 2,394***T – 0,05*NS + 0,135*T2 +

0,0006*NS2 + 0,0053 TNS/ R2= 0,97); (B) TSH-774 não-

alagado (y= 1,22 – 0,35*T + 0,087NS – 0,037T2 – 0,175NS2 –

0,195TNS/ R2 = 0,70); alagado (y= 0,70 – 0,842*T + 0,63*NS –

0,22T2 – 0,24NS2 – 0,092TNS / R2 =

0,82)............................................................................................

34

Figura 7. Taxa transpiratória foliar (E) em genótipos clonais de cacau

submetidos ao sombreamento por quatro meses e ao

sombreamento + alagamento do solo por um período de 48

dias. (A) TSA-792 não-alagado (y= 1,104 – 0,606*T +

xvii

0,082NS – 0,3108T2 – 0,1765NS2 – 0,166TNS / R2 = 0,14);

alagado (y=1,192 – 1,446***T – 0,374NS + 0,505**T2 +

0,394*NS2 + 0,1365TNS/ R2= 0,86); (B) TSH-774 não-alagado

(y= 1,058 – 0,567*T + 0,4177NS – 0,276T2 – 0,397*NS2 –

0,139TNS/ R2 = 0,29); alagado (y= 0,832 – 1,278***T +

0,4621*NS – 0,552*T2 – 0,223NS2 – 0,020TNS / R2 = 0,

80)...............................................................................................

35

Figura 8. Eficiência intrínseca do uso da água (A/gs) em genótipos

clonais de cacau submetidos ao sombreamento por quatro


período de 48 dias. (A) TSA-792 não-alagado (y= 0,4465 –

0,252T + 0,949**NS – 0,283T2 – 0,6273**NS2 – 0,16TNS / R2

= 0,60); alagado (y=0,8542 – 0,053T – 0,4074NS - 0,1648T2 +

0,19NS2 + 0,147TNS/ R2= 0,16); (B) TSH-774 não alagado (y=

0,906 – 0,1374T - 0,842**NS – 0,289*T2 + 0,5532**NS2 –

0,163TNS/ R2 = 0,53); alagado (y= 0,6112 – 0,382T + 0,635NS

– 0,523*T2 – 0,6904*NS2 – 0,1255TNS / R2 =

0,51)............................................................................................

37

Figura 9. Eficiência instantânea do uso da água (A/E) em genótipos

clonais de cacau submetidos ao sombreamento por quatro


período de 48 dias. (A) TSA-792 não-alagado (y= 0,707 –

0,0617T + 1,024**NS – 0,1764T2 – 0,808**NS2 – 0,0075TNS /

R2 = 0,60); alagado (y=0,355 – 0,0862T – 1,121**NS -

0,1145T2 - 0,83**NS2 - 0,1806TNS/ R2= 0,50); (B) TSH-774

não-alagado (y= 0,3822 + 0,0466*T + 0,751**NS – 0,396*T2 -

0,609**NS2 – 0,1455TNS/ R2 = 0,56); alagado (y= 0,6217 +

0,219T + 0,536NS – 0,455T2 – 0,56NS2 – 0,1717TNS / R2 =

0,46.............................................................................................

38

Figura 10. Fluorescência mínima (Fo) foliar em genótipos clonais de

xviii

cacau submetidos ao sombreamento por quatro meses e ao


dias. (A) TSA-792 não-alagado (y= 264,04 – 10,19T +

1,63**NS + 1,017T2 + 0,013*NS2 – 0,039TNS / R2 = 0,42);

alagado (y= 241,37 + 15,40T – 1,80*NS – 1,123 T2 +

0,015*NS2 - 0,006TNS/ R2= 0,50); (B) TSH-774 não-alagado

(y= 235,81 + 7,55T - 0,624NS – 1,114T2 + 0,003NS2 –

0,036TNS/ R2 = 0,50); alagado (y= 251,16 + 28,04T –

2,56**NS – 2,10T2 + 0,027**NS2 – 0,141TNS / R2 = 0,63).........

41

Figura 11. Figura 11. Fluorescência máxima (Fm) em nível foliar de

genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento


por um período de 48 dias. (A) TSA-792 não-alagado (y=

1070,18 + 45,04**T + 1,47NS - 2,94T2 - 0,012NS2 –

0,170TNS / R2 = 0,67); alagado (y= 1106,48 + 38,1T +

2,54NS – 6,41*T2 - 0,041*NS2 + 0,335TNS/ R2= 0,46); (B)

TSH-774 não-alagado (y= 1097,71 + 33,84*T + 2,081*NS –

1,77T2 - 0,0155NS2 – 0,308**TNS/ R2 = 0,54); alagado (y=

1120,7 – 10,16T + 3,99*NS + 1,014T2 – 0,05**NS2 +

0,192TNS / R2 =

0,42)..........................................................................................

42

Figura 12. Rendimento quântico máximo de PS2 (Fv/Fm) em folhas de



por um período de 48 dias. (A) TSA-792 não-alagado (y=

0,7548 + 0,017T + 0,0016**NS – 0,0015T2 - 0,00001*NS2 –

0,0007TNS / R2 = 0,48); alagado (y= 0,782 – 0,008T +

0,002**NS + 0,00005T2 - 0,00002**NS2 + 0,00006TNS/ R2=

0,65); (B) TSH-774 não-alagado (y= 0,7860 – 0,0006T +

0,00085NS + 0,0006T2 - 0,00001NS2 – 0,00002TNS/ R2 =

0,44); alagado (y= 0,7753 – 0,032T + 0,0033**NS + 0,003T2

xix

– 0,00004**NS2 + 0,0001TNS / R2 = 0,63)............................... 44

Figura 13. Teor de clorofila a em genótipos clonais de cacau submetidos

ao sombreamento por quatro meses e ao sombreamento +

alagamento do solo por um período de 48 dias. (A)

Tratamento não-alagado; (B) Tratamento alagado; (�)

genótipo TSA-792; (�) genótipo TSH-774. Médias intra e

intergenotípica com as mesmas letras minúsculas e

maiúsculas, respectivamente, não diferem entre si pelo teste

de Tukey (p<0,05).......................................................................

46

Figura 14. Teor de clorofila b foliar em genótipos clonais de cacau



dias. (A) Tratamento não-alagado; (B) Tratamento alagado;

(�) genótipo TSA-792; (�) genótipo TSH-774. Médias intra e



de Tukey (p<0,05). .....................................................................

47

Figura 15. Teor de clorofila total (a + b) foliar em genótipos clonais de







de Tukey (p<0,05). .....................................................................

48

Figura 16. Teor de carotenóides foliar em plantas de genótipos clonais

de cacau submetidos ao sombreamento por quatro meses e

ao sombreamento + alagamento do solo por um período de 48


xx




de Tukey (p<0,05). .....................................................................

49

Figura 17. Razão clorofila a/b em folhas de genótipos clonais de cacau







de Tukey (p<0,05). .....................................................................

50

Figura 18. Altura da planta em genótipos clonais de cacau submetidos

ao sombreamento por quatro meses e ao sombreamento +

alagamento do solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792

– não-alagado (y = 79,85 – 0,29*NS / R²= 0.94); (○) TSA-792

– alagado (y = 60,95 + 0,443NS + 0,0078NS2/ R²= 0.93); (▼)

TSH-774 – não-alagado (y = 80,43 + 0,252NS -0.006NS² /

R²= 0.76); (∆) TSH-774- alagado (y = 75,90+ 0,111NS –

0,0026NS² / R²= 0.55). ...........................................................

53

Figura 19. Diâmetro do coleto em plantas em genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 18,18 + 0,0825NS –

0,0007NS² / R²= 0,98); (○) TSA-792 – alagado (y = 15,16 +

0,0393NS - 0,0011NS² / R²= 0,42); (▼) TSH-774 – não-

alagado (y = 22.28 + 0,1112NS – 0,0008NS² / R²= 0,90); (∆)

TSH-774 alagado (y = 18,34 + 0,2187*NS - 0,0025*NS² / R²=

0,99). ........................................................................................

54

xxi

Figura 20. Número de folhas em plantas de genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 100,5**e-0,009(NS) / R²=

0,99); (○) TSA-792 – alagado (y = 50,3**e-0,009*(NS) / R²=

0,96); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 90,9e-0,008(NS)/ R²=

0,90); (∆) TSH-774- alagado (y = 24,3 + 26,93*e-0,102*(NS) /

R²= 0,99). .................................................................................

55

Figura 21. Biomassa seca da raiz em genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 21,73e-0,018*(NS) / R²=

0,95); (○) TSA-792 – alagado (y = 8,85 - 0,065*NS / R²=

0,95); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 26,80*** e-

0,015***(NS)/ R²= 0,99); (∆) TSH-774- alagado (y = 10,76 –

0,07ºNS / R²=

0,85).......................................................................................

56

Figura 22. Biomassa seca do caule em genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 32,94 + 0,5954*NS –

0,0044NS²/ R²= 0,99); (○) TSA-792 – alagado (y = 24,31+

0,0441NS – 0,0025*NS²/ R²= 0,99); (▼) TSH-774 – não-

alagado (y = 42,37 + 0,6568*NS – 0,0044*NS² / R²= 0,99);

(∆) TSH-774- alagado (y = 31,09 + 0,3727NS - 0,0024NS² /

R²= 0,97).................................................................................

57

Figura 23. Biomassa seca da folha em genótipos clonais de cacau


xxii


dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 38,70e-0,014*(NS)/ R²=

0,97); (○) TSA-792 – alagado (y = 18,5 – 0,14*NS / R²=

0,97); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 37,30 – 0,32*NS /

R²= 0,88); (∆) TSH-774 alagado (y = 22,63 + 0,5741*NS -

0,0053*NS² / R²= 0,99)...........................................................

58

Figura 24. Biomassa seca total em genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 92,4***e-0,015*(NS) /

R²= 0,97); (○) TSA-792 – alagado (y = 50,71+ 0,0564NS –

0,0039*NS² / R²= 0,99); (▼) TSH-774 – não-alagado (y =

106,46 e-0,013*(NS)/ R²= 0,99); (∆) TSH-774- alagado (y =

65,11 + 1,0914*NS + 0,0087NS² / R²=

0,99).......................................................................................

59

Figura 25. Proporção de biomassa seca de raiz, caule e folha em

relação à biomassa seca total em genótipos clonais de



dias. Tratamento não-alagado: 0C, 25C, 50C e 75C;

Tratamento alagado: 0A, 25A, 50A e 75A..............................

60

Figura 26. Área folia total em genótipos clonais de cacau submetidos ao

sombreamento por quatro meses e ao sombreamento +

alagamento do solo por um período de 85 dias. (●) TSA-

792 – não-alagado (y = 7272,25**e-0,012*(NS) / R²= 0,98); (○)

TSA-792 – alagado (y = 3073,40 + 0,5971NS – 0,3067NS² /

R²= 0,98); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 6033,8e-

0,01*(NS) / R²= 0,80); (∆) TSH-774 alagado (y = 2509,70 +

xxiii

36,179NS + 0,3207NS² / R²= 0,94)........................................ 61

Figura 27. Área foliar específica em genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 2,08*e0,01*(NS) / R²=

0,95); (○) TSA-792 – alagado (y = 3,6 e0,011***(NS)/ R²=

0,99); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 1,53 + 0,0654NS -

0.0005NS²/ R²= 0,81); (∆) TSH-774 alagado (y = 2.72+

0,2054NS - 0,0019*NS² / R²= 0,99)......................................

62

Figura 28. Razão de área foliar em genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 75,42 + 0,8279NS -

0,009 NS² / R²= 0,85); (○) TSA-792 – alagado (y = 59,85 +

0,1823NS – 0,0032NS²/ R²= 0,50); (▼) TSH-774 – não-

alagado (y = 54,58 + 0,7597NS – 0,0088NS²/ R²= 0,80); (∆)

TSH-774 - alagado (y = 40,867 + 0,0095NS + 0,0016NS² /

R²= 0,75)............................................................

63

Figura 29. Razão de massa foliar em genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 0,41 + 0,002NS -

0,0003 NS² / R²= 0,99); (○) TSA-792 – alagado (y = 0,34 –

0,006NS - 0,0006NS² / R²= 0,99); (▼) TSH-774 – não-

alagado (y = 0,36 + 0,0011NS + 0,00002NS² / R²= 0,15);

(∆) TSH-774 alagado (y = 0,34 - 0,0048NS + 0,00005NS² /

R²=0,97)..................................................................................

64

Figura 30. Razão raiz/parte aérea (R/PA) em genótipos clonais de cacau


xxiv


dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 0,32 - 0,003NS –

2,965NS² / R²= 0,92); (○) TSA-792 – alagado (y = 0,20 -

0,0002NS + 3,19NS²/ R²= 0,50); (▼) TSH-774 – não-

alagado (y = 0,33 - 0,0011NS + 7,74NS²/ R²= 0,35); (∆)

TSH-774 alagado (y = 0,21 + 0,0021NS - 2,30NS² / R²=

0,43).......................................................................................

65

Figura 31. Teor de açúcares solúveis totais na raiz de genótipos clonais

de cacau submetidos ao sombreamento por quatro meses e

ao sombreamento + alagamento do solo por um período de

85 dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 56,50 – 1,20NS +

0,012NS2/ R2= 0,99); (○) TSA-792 – alagado (y = 43,5 +

0,39***NS / R2= 0,99); (▼) TSH-774 – não-alagado (y =

44,77 – 0,47NS + 0,003 NS2/ R2= 0,60); (∆) TSH-774

alagado (y = 54,5 + 0,33 NS – 0,004 NS2/ R2= 0,83).............

67

Figura 32. Teor de açúcares solúveis totais no caule de plantas de


por quatro meses e ao sombreamento + alagamento do

solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792 – não-alagado

(y = 74,93 e-0,02*(NS)/ R2= 0,96); (○) TSA-792 – alagado (y =

78,25 + 0,81NS – 0,014NS2/ R2= 0,97); (▼) TSH-774 –

não-alagado (y = 48,85e- 0,013(NS)/ R2= 0,76); (∆) TSH-774

alagado (y = 75,03 + 0,243NS – 0,006NS2/ R2= 0,99)...........

68

Figura 33. Teor de açúcares solúveis totais em folhas de plantas de


por quatro meses e ao sombreamento + alagamento do

solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792 – não-alagado

(y = 74,93 e-0,02*(NS)/ R2= 0,96); (○) TSA-792 – alagado (y =

xxv

78,25 + 0,81NS – 0,014NS2/ R2= 0,97); (▼) TSH-774 –

não-alagado (y = 48,85e- 0,013(NS)/ R2= 0,76); (∆) TSH-774

alagado (y = 75,03 + 0,243NS – 0,006NS2/ R2= 0,83)...........

69

Figura 34. Teor de amido na raiz de genótipos clonais de cacau



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 12,41 – 0,0914NS +

0,0008 NS2/ R2= 0,95). (∆) TSH-774- alagado (y = 10,55 +

0,125NS – 0,002 NS2/ R2= 0,95)............................................

70

Figura 35. Teor de amido no caule de plantas de genótipos clonais de



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 55,30 – 1,40 NS +

0,0165 NS2/ R2= 0,80); (○) TSA-792 – alagado (y =

128,70e-0,0055*(NS)/ R2= 0,93); (▼) TSH-774 – não-alagado

(y = 46,00 – 0,796 NS + 0,0094 NS2/ R2= 0,96); (∆) TSH-

774 alagado (y = 91,08 + 1,06 NS – 0,018 NS2/ R2= 0,65)....

71

Figura 36. Teor de amido nas folhas de plantas de genótipos clonais de



dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 15,25 + 0,0561NS –

0,016 NS2/ R2= 0,70); (○) TSA-792 – alagado (12,36 – 0,21

NS + 0,0033 NS2/ R2= 0,90); (▼) TSH-774 – não-alagado (y

= 15,09 – 0,094 NS + 0,0007NS2/ R2= 0,85); (∆) TSH-774

alagado (y = 16,77 – 0,053 NS + 0,0013 NS2/ R2= 0,40).......

72

Figura 37 . Perfil da expressão do gene PIP1;3 em folhas de plantas de

dois genótipos clonais de T. cacao crescidas em quatro

níveis de sombreamento (T0, T25, T50 e T75) por um

período de quatro meses e submetidas ao alagamento por 24

xxvi

h. ( ) TSA-792 não-alagado; ( ) TSA-792 alagado; ( )

TSH-774 não-alagado; ( ) TSH-774 alagado. Os valores

expressos são relativos ao tratamento não-alagado no

interior da casa de vegetação (T0). Colunas representam os

valores médios ± erro padrão de três réplicas

biológicas..................................................................................

74

xxvii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Equações utilizadas na determinação das concentrações de

clorofilas a, b e total e de

carotenóides.............................................................................

24

Tabela 2. Valores de probabilidade da ANOVA para os efeitos de

genótipo (G), nível de sombreamento (NS), regime hídrico

(RH), tempo (T) e da interação entre GxNSxRHxT nas trocas

gasosas foliares. (*) p<0,05; (**) p<0,01; (***) p<0,001; (NS)

não significativo..........................................................................

31



(RH), tempo (T) e das interações NSxRH e GxNSxRHxT na

emissão de fluorescência da clorofila a. (*) p<0,05 de

probabilidade; (**) p<0,01; (***) p<0,001; (NS) não

significativo.................................................................................

39



(RH), tempo (T) e das interações entre NSxRH e GxNSxRS

no teor de pigmentos cloroplastídicos. (*) p<0,05, (**) p<0,01;

(***) p<0,001; (NS) não significativo. .......................................

45


xxviii


(RH), tempo (T) e das interações NSxRH e GxNSxRH no

extravasamento de eletrólitos. (*) p<0,05; (**) p<0,01; (***)

p<0,001; (NS) não significativo.................................................

51



(RH) e das interações NSxRH e GxNSxRH no

extravasamento de eletrólitos. (*) p<0,05; (**) p<0,01; (***)

p<0,001; (NS) não significativo.................................................

52



(RH), órgão e das interações NSxRH, RHxÓrgão,

NSxRHxÓrgão e GxNSxRHxÓrgão no teor de carboidratos.

AST= açúcares solúveis totais (*) p<0,05; (**) p<0,01; (***)

p<0,001; (NS) não significativo...................................................

72

1

1. INTRODUÇÃO

O cacau (Theobroma cacao L.), espécie lenhosa típica de clima tropical,

diplóide (2n = 20), preferencialmente alógama, perene, nativa da região de floresta

úmida da América. Pertencia anteriormente à família Sterculiaceae, mas foi

reclassificado e inserido na família Malvaceae (ALVERSON et al., 1999). A família

Malvaceae Juss. contém cerca de 75 gêneros, com aproximadamente 1.500

espécies, possui distribuição cosmopolita, predominando nos trópicos

(CRONQUIST, 1981), e compreende plantas de grande importância econômica.

Dentre as 22 espécies do gênero Theobroma, apenas T. cacao e Theobroma

grandiflorum (cupuaçu) são exploradas comercialmente em larga escala. O gênero

Theobroma é considerado como de origem exclusivamente neotropical com

dispersão natural em florestas úmidas, estendendo-se da bacia amazônica até o sul

do México, entre as latitudes 18° N e 15° S (CUATRECASAS, 1964).

Do seu provável centro de origem, nas nascentes do rio Amazonas e Orinoco

(ICCO, 2005), espalhou-se em duas principais direções, o que resultou nos dois

principais grupos raciais: o Criollo, cultivado em Venezuela, Colômbia, Equador,

norte da América Central e México; e o Forastero, no norte do Brasil e nas Guianas.

Um terceiro grupo, denominado Trinitário, também é apresentado por alguns autores

como originário de um cruzamento natural entre Criollo e Forastero (BARTLEY,

2005; ALMEIDA; VALLE, 2007). A maior parte (85%) da produção mundial de cacau

provém do grupo Forastero, sendo este predominante também nas plantações

brasileiras. A espécie T. cacao foi introduzida na Bahia em 1746, procedente do

estado do Pará, passando a ser plantado em vários municípios do sul do estado,

onde esses materiais genéticos receberam a denominação de “cacau comum da

Bahia” (LEAL, 2004).

2

A cacauicultura é uma atividade de grande importância econômica. O cacau é

uma importante commodity agrícola de exportação no mundo. Muitos países estão

envolvidos na sua produção, comercialização e consumo. A produção mundial

média, estimada em 3,3 milhões de toneladas (ICCO, 2007) é produzida por mais de

20 países, nas regiões tropicais da África, Américas do Sul e Central e Ásia.

No Brasil, o sul da Bahia é a principal região produtora de cacau onde,

praticamente, 100 municípios têm suas fontes de receitas baseadas no cacau, o

qual é cultivado em vinte e nove mil propriedades, em área superior a 700 mil

hectares (SOUZA; DIAS, 2001). Com a chegada do fungo Moniliophtora perniciosa,

causador da vassoura-de-bruxa, nas lavouras da Bahia em 1989, houve uma grande

mudança no cenário social da população local com perdas de 100% na produção em

algumas fazendas (PEREIRA et al., 1989). Mesmo adotando os métodos tradicionais

de controle houve pouca eficiência do processo, devido às condições climáticas

favoráveis para a disseminação rápida da doença fazendo com que muitos

agricultores abandonassem suas fazendas, provocando demissões em massa e

migrações de pessoas da zona rural para a zona urbana (TREVIZAN, 1996).

Em 1995, a Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC)

iniciou a distribuição de variedades produtivas e resistentes à vassoura-de-bruxa

com a liberação da variedade híbrida Theobahia. Em 1997 foi iniciado um programa

de liberação de variedades clonais que começou com cinco clones, sendo que, até

a presente data, já foram liberadas e, ou recomendadas cerca de 40 variedades

clonais. Entre essas variedades estão os clones, CCN–51, TSA–792, TSH–774 e

TSH–1188, tradicionais fontes de resistência.

Embora o cacau seja uma espécie tolerante a sombra, os efeitos do

sombreamento, além do decréscimo da irradiância, envolve, dentre outros fatores, o

decréscimo da temperatura e do movimento do ar no interior da plantação, afetando

também a umidade relativa do ar e o conteúdo de água no solo (WESSEL, 1989).

Plantas lenhosas são aeróbias e dependem, sobretudo, de um suprimento de

oxigênio molecular do ambiente para sustentar a respiração e várias outras reações

de oxidação e oxigenação. O alagamento afeta (i) o crescimento da parte aérea; (ii)

a expansão de folhas e entrenós, causando a senescência e abscisão prematura

das folhas; (iii) promove clorose, epinastia e necrose foliar; (iv) inibe a fotossíntese e

o transporte de carboidratos; (v) suprime o metabolismo da raiz; (vi) induz o

3

fechamento estomático e a redução da condutância estomática e (vii) promove a

redução do volume das raízes (KOZLOWSKI, 1997) (viii) altera a anatomia e (ix)

induz mortalidade da planta. Apesar disso, muito pouco se conhece a respeito do

comportamento fisiológico desses clones em condições de alagamento associadas

a diferentes níveis de sombra.

As proteínas denominadas aquaporinas (AQPs) controlam o transporte

específico de água através das membranas celulares em todos os organismos vivos

e estão envolvidas na absorção de água pela raiz (HENZLER et al., 1999;

TYERMAN et al., 2002). Algumas AQPs desenvolvem outras funções como

transporte de amônia e outras substâncias, incluindo CO2 no mesofilo da folha

durante a fotossíntese (UEHLEIN et al., 2003; HANBA et al., 2004; FLEXAS et al.,

2006). Apesar disso, pouco se conhece sobre o papel fisiológico das aquaporinas

sob condições desfavoráveis.

Geralmente, o conceito de estresse ambiental em plantas é associado

diretamente com a produção de injúrias e, portanto com perdas econômicas.

Quando se analisam os efeitos de um determinado fator de estresse numa

determinada espécie, seria razoável observar o aparecimento de injúrias que

implicam em perdas mais ou menos importantes tanto na quantidade como na

qualidade do produto final. Porém, nos últimos anos houve um aumento crescente

na quantidade de trabalhos de pesquisa envolvendo possíveis aspectos benéficos

de quantidades moderadas de estresse sobre diferentes tecidos vegetais

(GIAVENO; OLIVEIRA, 2003).

De acordo com Giaveno e Oliveira (2003), um organismo pode ser

considerado como suscetível a um determinado estresse quando sofrer alterações

graves no seu metabolismo sob a forma de injúrias mais ou menos importantes. Já

Morgan (1990) sugeriu que plantas suscetíveis não possuem a capacidade de

detectar a presença do fator estressor ou de reagir ao mesmo por meio de

alterações no sistema hormonal. Por outro lado, se o organismo não apresenta

sintomas de injúrias, por estresse, deve ser considerado como resistente

(GIAVENO; OLIVEIRA, 2003).

A disponibilidade de radiação associada à saturação hídrica frequentemente

observada em solos hidromórficos podem ser fatores limitantes para o

estabelecimento e adaptação às condições que o ambiente oferece. Neste sentido,

4

o presente trabalho teve como objetivo avaliar as características fisiológicas e a

expressão de gene de aquaporina em dois clones de T. cacao, contrastantes para a

resistência ao alagamento do solo (TSA-792 - resistente e TSH-774 - suscetível),

submetidos a diferentes níveis de sombreamento e a dois regimes hídricos (alagado

e não-alagado), visando elucidar os possíveis mecanismos de sobrevivência ao

sombreamento e a sua interação com a anoxia.

5

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Respostas fisiológicas das plantas à variação da irradiância

No interior de florestas úmidas, a luz é o recurso limitante para o crescimento

e desenvolvimento das plantas (WHITMORE, 1996). Em geral, apenas 1-2% da

irradiância que atinge o dossel alcança o interior da floresta e pode chegar a 25%

quando uma clareira é formada por abertura no dossel. Neste caso, a luz aumenta

normalmente por um período de meses ou anos, mas decai gradualmente com o

restabelecimento da vegetação. Espécies arbóreas podem diferir extensivamente na

maneira com que respondem a essas variações de irradiância (THOMPSON et al.,

1992). Assim, o conhecimento sobre os requerimentos de luz de espécies arbóreas

tropicais é importante tanto para a recomposição de florestas como para o

desenvolvimento de culturas de espécies economicamente importantes, além de

esclarecer o padrão ótimo de desenvolvimento inicial de cada espécie.

Quando plântulas são expostas às alterações na irradiância, a maioria delas é

capaz de aclimatar-se à mudança ocorrida. A aclimatação envolve mudanças em

uma série de processos metabólicos em resposta à presença do estresse, que

ocorrem num período curto de tempo. Uma planta aclimatada tem sua tolerância ao

estresse aumentada. Em nível foliar, a aclimatação é expressa através de ajustes

fisiológicos das folhas existentes ou por meio de lançamentos foliares apresentando

fisiologia e estrutura anatômica alterada. (WYKA et al., 2007). A aclimatação pode

ser distinguida da adaptação, que se refere a um nível de resistência determinado

geneticamente e adquirido por processos de seleção ao longo de muitas gerações.

A capacidade de algumas espécies em manter populações de plântulas no

sub-bosque de florestas está associada à capacidade das mesmas de aumentar a

6

sobrevivência sob baixas irradiâncias, ou seja, tolerar o sombreamento

(WALTERS;REICH, 2000). A tolerância à sombra é um conceito ecológico que se

refere à capacidade de uma dada espécie de planta de tolerar baixos níveis de

irradiância. Do ponto de vista fisiológico, é definida como o mínimo de irradiância na

qual a planta pode sobreviver. Contudo, a tolerância à sombra é associada com

características como fisiologia, bioquímica, anatomia e morfologia foliar além

daquelas em nível de planta inteira e, embora muitas espécies possam tolerar

condições de baixa luminosidade, somente uma fração delas é capaz de se

reproduzir sob tal condição. Assim, uma definição biológica de tolerância à sombra

deve considerar todo o ciclo de vida da planta. Além disso, a duração da estação de

crescimento e a ocorrência de múltiplos estresses podem alterar a capacidade da

planta de tolerar baixas irradiâncias. De acordo com Niinemets e Valladares (2006),

a tolerância à sombra é inversamente correlacionada com outros fatores limitantes

como déficit hídrico e alagamento.

O crescimento de plântulas arbóreas e a capacidade de adaptar-se às

alterações em determinados ambientes depende de interações entre as

características morfofisiológicas. As características morfológicas incluem área foliar,

espessura e arranjo das folhas, produção de biomassa da raiz, do caule e da folha e

os parâmetros derivados dessas variáveis como área foliar específica, razão

raiz/parte aérea e razão de área e de massa foliar. Para as características

fisiológicas freqüentemente avalia-se a taxa de assimilação de CO2, condutância

estomática, transpiração e a eficiência do uso da água.

Diversas variáveis de crescimento como altura e diâmetro do caule, utilizadas

com maior freqüência, têm sido usadas na avaliação da resposta das plantas à

diferentes níveis de irradiância. Moraes Neto et al. (2000) estudando o

comportamento de espécies arbóreas que ocorrem na mata Atlântica verificaram

diferenças significativas na altura e no diâmetro do caule entre as espécies

estudadas em função dos níveis de irradiância. A produção de biomassa seca, a

área foliar total e específica e as relações entre a biomassa seca da parte aérea e

radicular são também muito utilizadas na avaliação do crescimento de espécies

arbóreas submetidas à variações na irradiância (FARIAS et al., 1997). Verifica-se

uma tendência ao direcionamento da biomassa seca para as raízes em plantas

submetidas a pleno sol. No geral, plântulas crescidas em baixa irradiância alocam

7

biomassa preferencialmente para o caule e folhas do que para as raízes (KITAJIMA,

1994). Scalon et al., (2001) constataram maior distribuição de biomassa na parte

aérea de plantas de pitangueira (Eugenia uniflora L.) submetidas a pleno sol.

Também verificaram que as plantas submetidas a pleno sol apresentaram maior

altura, diâmetro do caule e maior área foliar.

Ao se estudar a capacidade adaptativa de uma determinada espécie a certos

níveis de luminosidade, as variáveis de trocas gasosas foliares são muito úteis. A

taxa fotossintética exerce um importante papel, pois as diferenças de tolerância à

sombra entre espécies estão relacionadas, principalmente, com a capacidade de

adaptação de seu aparelho fotossintético à intensidade de radiação do ambiente

(KRAMER; KOZLOWSKI, 1979). Folhas de plantas aclimatadas ou adaptadas à

altos níveis de irradiância geralmente apresentam taxas fotossintéticas maiores do

que folhas aclimatadas ou adaptadas à baixos níveis de irradiância (BJORKMAN et

al., 1972; BOARDMAN, 1977; BJORKMAN, 1981) Análises feitas por Farquhar e

Sharkey (1982) indicaram que as taxas fotossintéticas superiores apresentadas por

folhas à pleno sol são resultado da alta condutância estomática e da capacidade

fotossintética do mesofilo que apresenta grande quantidade de enzimas

fotossintéticas, inclusive Rubisco.

A adaptação/aclimatação do aparelho fotossintético envolve reduções nos

níveis de enzimas que participam do ciclo de redução do carbono, nos componentes

da cadeia de transporte de elétrons e nas proteínas e pigmentos associados com a

captação da energia luminosa. Geralmente, diferentes graus de luminosidade

causam alterações fisiológicas e morfológicas na planta e o grau de adaptação é

ditado por características genéticas da planta em interação com o seu meio

ambiente (MORAES NETO et al., 2000).

A intensidade de luz também afeta a estrutura e a atividade dos cloroplastos.

Os cloroplastos de plantas de sombra contêm mais tilacóides do que plantas de sol.

Nos tilacóides de plantas sombreadas observa-se um decréscimo na razão clorofila

a/b e na razão proteínas solúveis/clorofila (ANDERSON; OSMOND, 1987). O baixo

conteúdo de proteínas solúveis em plantas sombreadas é refletido também na baixa

atividade da Rubisco (BJORKMAN, 1968). Observações paralelas da atividade de

carboxilase da Rubisco e da taxa de assimilação de CO2 sugerem que a baixa

quantidade da enzima é parcialmente responsável pelo baixo ponto de saturação

8

luminosa observado em plantas sombreadas (BOARDMAN, 1977). Inversamente, as

altas taxas fotossintéticas em plantas de sol devem-se a altas quantidades de

Rubisco e outras enzimas fotossintéticas.

2.2. Respostas fisiológicas das plantas ao alagamen to do solo

O alagamento, um tipo de estresse abiótico, é comum em solos

hidromórficos, em solos de pouca drenagem, em regiões com elevado índice

pluviométrico e em fazendas com larga escala de irrigação (PEZESHKI, 1994;

KOZLOWSKI, 1997). Em condições normais de drenagem, o solo contém poros

preenchidos com ar que apresenta conteúdo de oxigênio similar ao da atmosfera

(cerca de 20%) (PEZESHKI, 1994). A água em excesso substitui o ar presente

nesses poros, restringindo o fluxo de oxigênio no interior do solo, gerando uma

condição de hipoxia (deficiência de oxigênio) ou a anoxia (total ausência de

oxigênio) (PENG et al., 2005). O solo tornando-se hipóxico ou anóxico leva as

raízes a uma situação de estresse fazendo com que as plantas respondam com

maior ou menor eficiência, permitindo a distinção entre espécies tolerantes e

intolerantes à baixa disponibilidade de O2 (ARMSTRONG et al., 1994). A hipoxia é a

forma mais comum de estresse em solos e ocorre durante alagamento a curto prazo

quando as raízes são submersas, porém, a parte aérea permanece em contato com

a atmosfera. A anoxia ocorre em solos que sofrem alagamento por longos períodos

e em plantas completamente submersas em água (PONNAMPERUMA, 1972).

A maioria das respostas de crescimento em raízes hipóxicas e parte aérea

ocorrem em resposta ao etileno. O etileno é sintetizado via rota dependente de O2 e

sua concentração endógena é determinada predominantemente pela taxa de

produção e difusão, ambos afetados pelo alagamento. Os genes que codificam a

ácido1-carboxílico-1-aminociclopropano (ACC) sintase (ACS) e a ACC oxidase

(ACO) são induzidos pelo alagamento (COHEN; KENDE, 1987) enquanto a difusão

do etileno para o ambiente externo é dificultada. O precussor do etileno é o ACC o

qual é sintetizado normalmente nas raízes (BRADFORD; YANG, 1980). Como a

conversão do ACC em etileno necessita de O2, a reação é bloqueada nas células

radiculares em anaerobiose e o ACC é translocado para a região aeróbica da raiz

9

ou para a parte aérea. Como conseqüência, a quantidade de ACC na parte aérea

aumenta.

O etileno inicia e regula muitas respostas morfológicas, químicas e

moleculares, que permitem a planta evitar a anaerobiose nas raízes sob

alagamento, como o desenvolvimento de aerênquima. Aerênquimas são tecidos

com grandes espaços intercelulares que fornecem uma rota de baixa resistência às

trocas gasosas entre a raiz anaeróbica e a parte aérea aeróbica (JACKSON;

ARMSTRONG, 1999). A síntese de etileno é reforçada em raízes sob hipoxia

coincidindo com o desenvolvimento de aerênquima (VISSER, 2003).

O O2 participa da respiração aeróbica como aceptor final de elétrons na

fosforilação oxidativa, na geração de ATP e regenaração de NAD+, e em várias

rotas biossintéticas cruciais como a síntese de clorofila, ácidos graxos e esteróis

(DENNIS et al., 2000). As conseqüências da deficiência de O2 variam desde

aumento da biomassa do caule em relação à raiz até perda das plântulas devido ao

alagamento sazonal (KENNEDDY et al., 1992).

A redução da atividade fotossintética (iniciando a partir de um ou dois dias de

exposição das raízes a esse estresse) pode ocorrer devido à baixa concentração

interna de CO2 nas folhas (ASHRAFF, 2003). Para períodos relativamente longos

de inundação, as limitações da fotossíntese que não ocorrem por razões

estomáticas podem ser atribuídas a diversos fatores como: alteração nas enzimas

do ciclo de Calvin; degradação dos pigmentos fotossintéticos (PEZHESKI, 1994);

potencial hídrico reduzido; deterioração no transporte de fotoassimilados devido à

baixa atividade de absorção (HUANG et al.,1994; LIAO; LIN, 1994). Alguns autores

sugerem que o fechamento estomático pode estar associado com um decréscimo

da condutividade hidráulica das raízes (DAVIES; FLORE, 1986; KOZLOWSKI,

1997), como também na transmissão de sinais hormonais das raízes para a parte

aérea. Dentre esses hormônios estão o ABA e a citocinina (ELSE et al., 1996).

A troca da respiração aeróbica pela anaeróbica afeta severamente a

disponibilidade de energia, requerendo grande quantidade da reserva de

carboidratos existentes na planta, gerando produtos finais potencialmente tóxicos e

causando acidez citoplasmática. Os carboidratos são fornecidos pela respiração

anaeróbica a partir de fontes de reserva ou por meio da translocação dos

fotoassimilados provenientes das folhas ativas fotossinteticamente. A translocação é

10

sensível às condições de anaerobiose e dependendo da planta, não consegue

sustentar a alta demanda de carboidratos exigidos pelas raízes durante o

alagamento, com exceção das espécies tolerantes que possuem aerênquimas.

Como conseqüência, a capacidade em armazenar grande quantidade de

carboidratos em raízes ou rizomas pode conferir à espécie tolerância prolongada à

condição de anoxia (SILVA, 2006).

O fechamento estomático aumenta a possibilidade de sobrevivência da

plântula, pois reduz a demanda por água e nutrientes para a raiz e a absorção de

nutrientes tóxicos (JACKSON, 1994). Porém, em algumas espécies adaptadas a

solos alagados o fechamento estomático não ocorre (JACKSON; DREW, 1984),

como é o caso do Pinus silvestris (ZAERR, 1983) onde não se observaram

diferenças significativas na taxa de fotossíntese entre as plantas alagadas e

controle.

A fase fotoquímica nas folhas também é afetada pelo alagamento do solo.

Nesse caso, ocorre uma redução das reações a nível cloroplastídico e

conseqüentemente uma redução no fornecimento de energia gerada pelo

fotossistema II (ISHIDA, 2004).

O metabolismo anaeróbico leva a geração de energia sem o oxigênio como

aceptor final de elétrons. A nível molecular, a deficiência de O2 induz a produção de

um conjunto de aproximadamente 20 polipeptídios, as proteínas do estresse

anaeróbico (ASP’s – anaerobic stress proteins) sendo, a maioria, enzimas

envolvidas na rota de fermentação (BLOM; VOESENEK, 1996). Os principais

processos envolvidos no metabolismo anaeróbico - fermentação lática e etanólica -

podem exceder o mesmo levando a um acúmulo de diversos produtos de

fermentação tais como etanol, lactato, alanina (derivados do piruvato, produto final

da glicólise), Gaba (ácido alfa-aminobutírico), succinato e malato (RICARD et al.,

1994; DREW, 1991; ). Nesse caso, a respiração mitocondrial é interrompida devido

à ausência de um aceptor final de elétrons. Como resultado a produção de ATP

diminui de 36 para 2 moles por mole de glicose metabolizada (MORARD;

SILVESTRE, 1996), afetando diversos aspectos do metabolismo celular (FUKAO;

BALEY-SERRES, 2004)

Quando organismos aeróbicos são privados de O2, a fosforilação oxidativa na

mitocôndria é inibida, enquanto glicólise e fermentação são promovidas. O acúmulo

11

de piruvato resulta de um declínio na taxa de oxidação e aumento na taxa de

síntese, através da descarboxilação do ácido oxaloacético (AOA) e aumento da

atividade da ácido-oxaloacetato descarboxilase (AOA-DC) sob hipoxia (STREETER;

THOMPSON, 1972).

Abordagens recentes utilizando a técnica de macro e microarranjo e análises

proteômicas ajudam no entendimento da função de genes e proteínas envolvidas na

adaptação ao alagamento e a anaerobiose (DOLFERUS et al., 2003). Com o auxílio

das técnicas de genética molecular, Toojinda et al. (2003), caracterizaram a região

no cromossomo 9 de Oriza sativa como a responsável pela tolerância ao

alagamento, retardamento da senescência e insensibilidade ao etileno.

As espécies não-tolerantes desenvolvem sintomas característicos, os quais

resultam de distúrbios causados pela hipoxia ou anoxia nas raízes. Os mais comuns

são abscisão de folhas, flores e frutos, clorose, redução no comprimento das raízes,

redução no crescimento em altura, inibição da formação dos primórdios foliares,

redução na expansão, podendo tais efeitos levar a morte do vegetal (MEDRI et al.,

1998; PEREIRA et al, 2000; ARMSTRONG et al., 1994; KOZLOWSKI, 1997).

Espécies tolerantes ao alagamento normalmente formam aerênquimas, lenticelas e

raízes adventícias (KOZLOWSKI, 1997). As lenticelas participam da captação e

difusão de O2 para o sistema radicular e na liberação de produtos voláteis

potencialmente tóxicos como etanol, acetaldeído e etileno (MEDRI, 1998).

Alemanno et al (2003), verificaram em condições “in vitro” que o T. cacao em

resposta a uma condição de estresse, pode sintetizar novos compostos fenólicos,

como forma de proteção dos seus tecidos contra a detoxicação.

2.3. Efeitos isolados da irradiância e do alagament o do solo no cacaueiro

O cacau, como espécie nativa da Amazônia, é tolerante ao sombreamento.

Nos sistemas de produção de cacau, o sombreamento destaca-se como uma das

mais importantes técnicas culturais capazes de manter condições ecológicas

indispensáveis ao crescimento, desenvolvimento e produção das plantas

(CUNNINGHAM; BURRIDGE, 1960). Diante dessa característica, a cultura é

normalmente associada a outras espécies, cuja finalidade é a de sombreá-la desde

a fase de implantação até a fase produtiva.

12

Nos trópicos úmidos (precipitação anual excede 2000 mm), a exemplo do sul

da Bahia, Brasil, o cacau é cultivado em sistema de ‘Cabruca’, onde o cultivo é

realizado sob sombra de Mata Atlântica raleada (LOBÃO et al., 2007), sob sombra

de árvores como Erythrina fusca ou em intercultivo com palmáceas para diversificar

a produção e para explorar os benefícios da interação árvore-cultivo. As árvores têm

várias funções incluindo sombreamento da cultura para evitar a evapotranspiração,

controle da erosão e ciclagem de nutrientes (BEER, 1997; YOUNG, 1997;

HARTEMINK, 2005). Dependendo da espécie, as árvores utilizadas podem ser

regularmente podadas para melhoria do solo (ex: Erytrina spp.) ou deixá-las crescer

para produção de lenha e madeira, como Cordia spp sendo que vários sistemas

agroflorestais utilizam mais do que três espécies (MÜLLER; GAMA RODRIGUES,

2007). O sombreamento deve permitir a passagem de 50 a 60% de luz, para

cacaueiros adultos (GRAMACHO et al. 1992; ALVIM, 1977). De acordo com

Enríquez (1986), deve-se sombrear o cacaueiro durante os três primeiros anos e,

após, mantê-lo em torno de 50% de sombra, garantindo, assim, um bom

desenvolvimento das plantas.

Apesar de o cacaueiro ser planta típica de sombra, as vantagens do uso do

sombreamento não estão propriamente relacionadas com os níveis de intensidade

luminosa mais favoráveis ao crescimento e produção do cacaueiro (ALVIM, 1977).

Seus principais benefícios consistem na (i) conservação do solo e dos recursos

hídricos, (ii) na maior longevidade das plantações, (iii) na maior estabilidade da

produção, (iv) na menor incidência de pragas e doenças, na redução da velocidade

do vento, importante para plantas jovens de cacau que são sensíveis à dessecação

(LEITE, 1981); (v) na redução de plantas invasoras, (vi) na diversificação da

exploração agrícola com o uso de plantas de interesse econômico e (vii) na redução

do desequilíbrio nutricional (BEER, 1987).

O cacau, em condições de sombreamento, é influenciado por diversos fatores

ambientais, pois, além da redução da intensidade de radiação luminosa, o

sombreamento promove variações na temperatura, velocidade do vento e umidade

relativa do ar e do solo (DIAS, 2001; ANIM-KWAPONG, 2003). No entanto, diversos

estudos têm demonstrado que a produção aumenta com o aumento da irradiância

na área de cultivo (ZUIDEMA et al., 2005). Vários autores (AKENORAH et al., 1974;

CABALA-ROSAND et al., 1972; BYRNE, 1972), estudando o rendimento de

13

cacaueiros fertilizados e não sombreados, relataram que o rendimento mais alto foi

obtido com cacaueiros fertilizados e sem sombreamento. Entretanto, os tratamentos

sem sombra apresentaram maior variabilidade na produção e a mesma não era

mantida por mais de dez anos (Figura 1 ).

Figura 1. Efeitos do sombreamento e de fertilizantes sobre o rendimento do

cacaueiro “Amelonado” em Gana (AKENORAH et al, 1974).

Doenças como a podridão-parda (Phytphora palmivora) do cacaueiro são

favorecidas pelo aumento da umidade devido ao aumento no sombreamento

(DAKWA, 1980; SMITH, 1979). Meléndez (1993) comparando as condições

microclimáticas, a liberação de esporos e a incidência da doença (Moniliophthora

roreri) em cacaueiros crescendo sob o sombreamento de Erythrina poeppigiana,

Gliricidia sepium e Inga edulis não encontrou diferenças significativas, exceto para

liberação de esporos que foi maior sob o sombreamento de E. poeppigiana.

Somadas à incidência de pragas e doenças, a produção e a competição por água

são questões fundamentais na controvérsia sobre o uso de árvores para fins de

sombreamento na cultura do cacau.

O sol, assim como a sombra, traz vantagens e desvantagens para o cultivo do

cacau. Os problemas causados a uma plantação a pleno sol são superexposição e

desequilíbrio nutricional. Tal plantação é também afetada pelo estresse hídrico,

14

insetos e doenças (CUBA, 1972). Em solos férteis, livre de insetos, pragas e

doenças, com disponibilidade hídrica e nutrientes, o cacau apresenta maior

produção à pleno sol do que sob sombra (ALVIM, 1958). Um exemplo é na região

de Mucugê (semi-árido baiano), onde o cacau recentemente está sendo cultivado a

pleno sol com sistema de quimirrigação por gotejamento e com produção elevada

(ALMEIDA; VALLE, 2007).

A capacidade de produção das plantas é função direta da área foliar. Altas

produções não podem ser esperadas de plantas pequenas com reduzida área foliar.

O uso da irradiância deve ser o mais eficiente possível e para isso, boa parte das

folhas deve receber luz solar. A fotossíntese das folhas localizadas no interior do

dossel é reduzida, o que faz com que algumas folhas funcionem mais como dreno

do que como fonte de fotoassimilados (KHAN et al., 1987; DIAS, 2001) reduzindo

também a produção de sementes (ZUIDEMA et al., 2005) .No entanto, sob cultivo a

pleno sol, sua longevidade não ultrapassa os seis meses. Muller e Biehl (1993)

encontraram que a longevidade média das folhas de cacaueiro, medida em dias

após o lançamento, de plântulas desenvolvidas em baixa e alta luminosidade foi de

450 e 250 dias, respectivamente.

Augusto (1997), estudando trocas gasosas em cacaueiros submetidos à

irrigação complementar no Espírito Santo, verificou que cacaueiros irrigados

apresentaram valores crescentes de taxa fotossintética líquida, em intensidade

luminosa de até 600 µmol fótons m-2 s-1, com tendência da fotossíntese se

estabilizar em valores próximos de 5,6 µmol CO2 m-2 s-1. Por outro lado, cacaueiros

não irrigados apresentam valores crescentes de fotossíntese, até intensidade

luminosa de 250 µmol fótons m-2 s-1, estabilizando em torno de 3,4 µmol CO2 m-2 s-1.

Ao considerar um dia típico de sol de verão das regiões tropicais onde se cultiva

cacau, pode-se atingir uma luminosidade em torno de 2000 µmol fótons m-2 s-1 e o

cacaueiro, por ser uma planta C3, parece apresentar seu ponto de saturação de luz

em torno de 400 µmol fótons m-2 s-1 (MIELKE et al., 2005b).

O cacau é uma espécie sensível à escassez de água e também ao

alagamento do solo. Por isso, necessita de solos com uma boa drenagem de água.

O alagamento é uma importante barreira para o crescimento inicial e o

estabelecimento do cacaueiro em locais sujeitos a alagamentos periódicos como no

Brasil, Gana, Nigéria e Costa do Marfim onde a precipitação total excede a

15

evapotranspiração e o solo torna-se hipóxico (SENA GOMES; KOZLOWSKY, 1986).

Rehem (2009) avaliando as respostas fisiológicas de mudas clonais de cacau ao

alagamento do substrato observou a ocorrência de decréscimo no crescimento, na

área foliar, na condutância estomática e nas taxas de assimilação de CO2; epinastia

e queda das folhas; hipertrofia de lenticelas e formação de raízes adventícias na

parte submersa do caule. Tais alterações, morfológicas e fisiológicas, são

dependentes do genótipo avaliado. Sena Gomes e Kozlowsky (1986) relataram

resultados similares para plântulas de cacau do genótipo Catongo destacando o

fechamento dos estômatos, que teve início 2h após o alagamento do solo. Apesar

disso, muito pouco se conhece à respeito do comportamento fisiológico do

cacaueiro em condições de alagamento.

2.4. As aquaporinas

A absorção de água e seu movimento através da planta são necessários para

um grande número de processos celulares e fisiológicos tais como: aumento celular,

movimento estomatal, fotossíntese, transporte no floema e transpiração. A água é

absorvida pela raiz dentro do apoplasto, mas, para atravessar a barreira hidrofóbica

das estrias de Caspary (espessamento de suberina presente nas células da

endoderme), as moléculas de águas são transferidas para o simplasto via caminho

transcelular, o qual é proposto ser regulado pelas aquaporinas (AMODEO et al.,

1999; JOHANSSON et al., 2000). As aquaporinas (AQP) são proteínas de 26-30

kDa, pertencentes a superfamília das proteínas integrais da membrana (MIP). Essas

proteínas especificamente facilitam o fluxo passivo de moléculas de água através

das membranas celulares, parecem regular a rota transcelular de água (AGRE et

al., 1993; MAUREL, 1997) e realizam um papel vital no transporte de grandes

volumes de água com gasto mínimo de energia. Algumas aquaporinas realizam

outras funções tais como transporte de amônia e outras substâncias (LUU;

MAUREL, 2005; FLEXAS et al., 2006). Desde a descoberta da primeira aquaporina

em eritrócitos humanos e túbulos renais (AGRE, MIPs têm sido identificadas em

outros organismos incluindo plantas (MAUREL et al., 1997), insetos (BEURON et

al., 1995), leveduras (CARBREY et al., 2001), bactérias (CALAMITA et al., 1995),

protozoários (MITRA et al., 2000) e Archae (KOZONO et al., 2003).

16

Proteínas integrais de membrana individuais variam no tamanho desde 195

(animais) a > 500 aminoácidos (fungos) (ZARDOYA, 2005). Elas são conhecidas

por funcionar como um tetrâmero, composto por unidades monoméricas individuais.

Cada monômero de MIP tem uma estrutura altamente conservada e tipicamente

exibe (1) seis alfa-hélices hidrofóbicas transmembrana (H1 – H6); (2) cinco loops

inter- hélices (LA – LE) sendo que os loops A, C e D são hidrofílicos com localização

citoplasmática ou extracelular, enquanto os loops B e E são hidrofóbicos e estão

parcialmente embebidos na membrana; (3) uma sequência AEF (Ala-Glu-Phe) ou

AEFXXT no domínio N-terminal freqüentemente observado (ZARDOYA; VILLALBA,

2001); (4) duas sequências NPA (asparigina-prolina-alanina) ou “box NPA”

altamente conservadas nos loops B e E (REIZER et al., 1993). A proteína é

estruturada em duas metades, cada uma com três hélices transmembranas (H1 –

H3 ou H4 – H6) e um pequeno loop (LB ou LE) contendo o box NPA. Com base na

similaridade das seqüências as aquaporinas identificadas em plantas nos últimos 10

anos podem ser classificadas dentro de quatro principais subfamílias: as proteínas

integrais da membrana plasmática (PIPs), as proteínas integrais do tonoplasto

(TIPs), as proteínas integrais da membrana similares à nodulina-26 (NIPs) e as

pequenas proteínas integrais básicas da membrana (SIPs) (JOHANSON et al.,

2001; ZARDOYA, 2005).

17

Figura 2. Estrutura das aquaporinas, mostrando as seis α-hélices e as regiões de

duplicação gênica (primeira e segunda metade). NH2 = região

aminoterminal; COOH = região carboxiterminal; A, C, D = loops

hidrofílicos; B e E = loops hidrofóbicos; NPA = Box asparigina–prolina-

alanina; SH = local de inibição por mercúrio (Hg2+); Ser256 = serina 256,

local de fosforilação por proteínas quinases A (PKA) (VERA-ESTRELLA

et al., 2005).

Desde o primeiro relato de aquaporina em plantas por Maurel et al., (1993),

um aumento no número de genes de aquaporinas em plantas têm sido relatados e

alteraram o conhecimento de como as plantas podem regular o fluxo de água em

diferentes condições fisiológicas (TYERMAN et al.,1999,2002; JOHANSSON et al.,

2000; JAVOT; MAUREL, 2002; MAUREL et al., 2002). Diferente dos animais, as

plantas expressam um grande número de aquaporinas. No genoma de Arabdopsis

thaliana 35 genes de aquaporinas foram identificados (JOHANSON et al.,2001;

QUIGLEY et al.,2002), em milho (Zea mays), 36 genes foram identificados

18

(CHAUMONT et al.,2001) enquanto que em vertebrados somente 11 -13 tipos

diferentes de aquaporinas existem (AQP1-AQP11 ou 13).

As proteínas integrais da membrana plasmática (PIP) constituem a maior

subfamília com 13 isoformas em Arabdopsis e 14 em Zea mays (JOHANSON et al.,

2001; CHAUMONT et al., 2001). A maioria das PIPs está localizada na membrana

plasmática e subdividem-se em dois grupos filogenéticos denominados PIP1 e PIP2

(ZARDOYA, 2005). As isoformas de PIP1 possuem 90% de identidade entre as

sequências, entretanto sua permeabilidade e função divergem. Expressões

heterólogas em ovócitos de Xenopus de isorfomas de PIP demonstraram uma baixa

ou nenhuma atividade de transporte de água nessas proteínas (CHAUMONT et al.,

2000; FETTER et al., 2004), porém, a permeabilidade a pequenos solutos e gases,

como glicerol e CO2 mostrou-se aumentada (UEHLEIN et al., 2003; BIELA et al.,

1999). Fetter et al. (2004), investigando a influência da heteromerização em

aquaporinas na permeabilidade a água mostrou que a co-expressão de duas

isoformas de PIPs em milho aumentou a permeabilidade à água em relação a

avaliações das proteínas individualmente. Nesse caso, a heteromerização é

necessária para as PIPS atuarem como canal funcional.

As aquaporinas pertencentes à subfamília PIP2 são mais eficientes como

canais de água do que os membros da subfamília PIP1. Geralmente, PIP2s

apresentam uma região N-terminal mais curta e uma região C-terminal mais longa

além de uma sequência adicional de 4-10 aminoácidos no loop A. Essas proteínas

podem estar envolvidas no transporte celular de água nas raízes, folhas (LOPEZ et

al., 2003; MARTRE et al., 2003), órgãos reprodutivos (BOTS et al., 2005) e na

germinação da semente (SCHUURMANS et al., 2003). Além disso, Hanba et al.,

(2004) superexpressando a HvPIP2;1 (Hordeum vulgare) confirmou a hipótese de

que essa proteína facilita o transporte de CO2.

Uma das primeiras proteínas com função de aquaporina em plantas foi

identificada na membrana do vacúolo de Arabidopsis thaliana. Essa proteína,

chamada TIP1;1 e inicialmente denominada γ-TIP (MAUREL et al., 1993), foi

altamente seletiva a água, quando expressa em ovócitos de Xenopus. No genoma

de Arabdopsis, foram identificadas 10 TIPs divididas em cinco grupos filogenéticos

(TIP1, TIP2, TIP3, TIP4 e TIP5). Medidas isoladas da permeabilidade a água de

vacúolos isolados e membranas plasmáticas mostrou uma permeabilidade 100

19

vezes mais alta do tonoplasto (MAUREL et al., 1997) evidenciando o papel do

tonoplasto na regulação do fluxo de água na célula vegetal. Boursiac et al. (2005)

avaliando a expressão de TIPs em Arabdopsis após estresse por salinidade

observou uma redução de 75% na abundância de transcritos após exposição ao

tratamento. Também, como demonstrado por Gerbeau et al. (2009), algumas TIPs

podem equilibrar as concentrações de uréia entre o vacúolo e o citoplasma.

Segundo Holm et al. (2005) e Loque et al. (2005), o transporte de amônio (NH4+) e

sua base conjugada gasosa, amônia (NH3), são mediadas pelas proteínas integrais

do tonoplasto.

A nodulina 26 foi descrita como as maiores proteínas integrais da membrana

do simbiossomo correspondendo a 10% das proteínas totais da membrana. No

genoma de Arabidopsis, nove proteínas integrais similares à nodulina 26,

distribuídas em dois grupos (NIP1 e NIP2) foram identificadas. Expressão

heteróloga em ovócitos de Xenopus demonstrou que nodulinas 26 são permeáveis

à glicerol (RIVERS et al., 1997) e amônia (NIEMIETZ et al., 2000). Em não

leguminosas, as proteínas integrais similares a nodulina 26 desempenham um

importante papel nas relações hídricas, sendo expressas em tecidos vegetativos e

reprodutivos além de transportar ácido bórico (TAKANO et al., 2006) e ácido lático

(CHOI; ROBERTS, 2007). Quando comparadas a outras aquaporinas, NIPs

possuem uma baixa atividade de permeabilidade a água.

As pequenas proteínas integrais da membrana (SIPs) foram identificadas por

Johansson et al. (2002), porém, informações acerca dessas aquaporinas ainda são

escassas. Sabe-se que são pequenas em tamanho e diferem das outras MIPs por

serem altamente básicas. O seu pequeno tamanho deve-se à região N-terminal que

é mais curta quando comparada as outras MIPs, mas similar a AqpZ (aquaporina Z)

de E.coli. Ishikawa et al., (2005) estudando a localização celular de SIPs em

Arabidopsis, verificou que SIPs eram mais abundantes no retículo endosplamático.

Apesar disso, o relacionamento entre o papel das aquaporinas na regulação

do estado hídrico na planta e a regulação da expressão dos seus genes é confuso.

Algumas aquaporinas são constitutivamente expressas (JOHANSSON et al., 1996),

enquanto a expressão de outras é regulada por diferentes estímulos tais como

estágio de desenvolvimento, hormônios ou por condições ambientais adversas

(VERA-ESTRELLA et al., 2004). A expressão dos genes das AQPs aumenta,

20

diminui ou permanece inalterada sob condições de estresse hídrico a curto prazo

(ALEXANDERSSON et al., 2005; AHARON et al., 2003). Além disso, embora

respostas da expressão gênica a mudanças ambientais possam ocorrer dentro de

horas, o padrão de expressão das AQPs após estresse hídrico a longo prazo,

envolvendo mecanismos de aclimatação, continuam a serem elucidados.

21

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Material vegetal e condições de cultivo

O experimento foi conduzido em condições de casa de vegetação da

Universidade Estadual de Santa cruz (UESC), Ilhéus, BA, Brasil. Foram utilizados

dois clones de T. cacao contrastantes para resistência ao alagamento do solo (TSA-

792- resistente e TSH-774 – suscetível). Esses clones foram fornecidos pelo Instituto

Biofábrica do Cacau (IBC) com aproximadamente 4 a 6 meses de idade após o

enraizamento das estacas obtidas das extremidades de ramos plagiotrópicos de

plantas matriz com 5 a 10 anos de idade.

Posteriormente, as plantas clonais foram transplantadas e cultivadas em

vasos plásticos com capacidade de 25 L contendo solo como substrato. Quarenta

plantas de cada clone foram submetidas aos tratamentos de sombra por um período

de quatro meses. Tais tratamentos foram denominados como T0 (no interior da casa

de vegetação), T25 (sombrite de 25%, no interior da casa de vegetação), T50

(sombrite de 50%, no interior da casa de vegetação) e T75 (sombrite de 75%, no

interior da casa de vegetação), sendo 10 plantas de cada clone por tratamento

perfazendo um total de 80 plantas clonais.

Após o quarto mês de sombreamento, submeteram-se as plantas ao

alagamento do solo por um período de 85 dias (sombreamento + alagamento). O

tratamento alagado foi obtido vedando os furos de drenagem localizados no fundo

dos vasos e adicionando água, até 20 mm acima do nível do solo, à metade do

número de vasos. No tratamento não-alagado, vinte plantas de cada clone foram

mantidas em vasos de mesma capacidade, mas com fundos perfurados para

escoamento do excesso de água da irrigação.

22

3.2. Parâmetros micrometeorológicos

Os parâmetros micrometereológicos avaliados, durante o período de 85 dias,

da interação sombreamento x alagamento do solo na casa de vegetação, foram

umidade relativa e temperatura do ar. Os dados foram coletados por meio de uma

estação climatológica Hobo Micro Station Data Logger (OnSet, USA), com sensores

internos que registram em ambiente Windows. A coleta dos dados

micrometeorológicos foi automatizada com o armazenamento das leituras e posterior

transferência, através da porta serial, para um microcomputador. A radiação

fotossinteticamente ativa (RAF) foi determinada utilizando-se sensores quânticos S-

LIA-M003 (faixa espectral: 400 – 700 nm), acoplados à referida estação

climatológica. Posteriormente, foi realizada a análise calculando as médias diárias.

3.3. Medições de trocas gasosas foliares

As medições de trocas gasosas foliares foram realizadas ao longo do período

de interação sombreamento x alagamento do solo utilizando o medidor portátil LI-

6400 (Li-Cor Inc., Nebrasca, USA). As medições pontuais foram realizadas entre 8

e12 h. A irradiância foi mantida em 800 µmol m-2 s-1, acima da irradiância de

saturação de luz das plantas não alagadas. As taxas de fotossíntese líquida por

unidade de área foliar (A), a condutância estomática ao vapor de água (gs), a taxa

transpiratória foliar (E) foram estimadas a partir dos valores da variação de CO2 e

da umidade do ar no interior da câmara, determinados pelo analisador de gases a

infravermelho do referido aparelho. O tempo mínimo, pré-estabelecido para a

estabilização das leituras foi de 60 s e o máximo, para salvar cada leitura, de 120 s.

O coeficiente de variação (CV) máximo admitido para salvar cada leitura será de

0,8%. Além da radiação fotossinteticamente ativa (RFA), foram mantidos constantes

a temperatura do bloco a 26°C e o CO2 atmosférico no interior da câmara foliar. A

concentração de CO2 intercelular (Ci) foi calculada pelo equipamento a partir dos

valores de A, gs e E (VON CAEMMERER; FARQUHAR, 1981). Foram estimados

também a eficiência intrínseca (A/gs) e a instantânea do uso da água (WUE).

3.4. Medições de fluorescência da clorofila a

23

As medições de fluorescência da clorofila a foram efetuadas nas mesmas

épocas e folhas das plantas usadas para as medições de trocas gasosas usando

também um medidor portátil de fotossíntese (LI-COR, Inc. Lincoln, Nebraska, USA),

modelo Li-6400, com câmara Li-6400-40 para medições simultâneas de emissão de

fluorescência e de trocas gasosas foliares. Em cada medição, um clip foliar foi

colocado na folha por 30 minutos para a reflexão da radiação solar, o decréscimo da

temperatura foliar e a oxidação de todo o sistema de transporte fotossintético de

elétrons. Os sinais de fluorescência foram registrados no sistema de aquisição de

dados do LI-6400 que calculou automaticamente as fluorescências mínima (Fo),

máxima (Fm), e o rendimento quântico potencial máximo (Fv/Fm).

3.5. Determinação do teor de clorofila a, b, total e carotenóides

O teor de clorofila por área foi determinado em extratos dimetilsulfóxido

(DMSO) de discos foliares segundo Hiscox e Israelstam (1979), com algumas

modificações. Após incubação de três discos foliares (0,5 cm2) com 1 mL de DMSO

saturado com CaCO3 por 24 h a 65 ºC, a absorbância dos extratos foi lida no

espectrofotômetro de microplacas (VERSAmax) nos comprimentos de onda 645 nm,

663 nm e 480 nm, para a determinação das concentrações das clorofilas a, b e total

e de carotenóides, respectivamente (Tabela 1). A concentração de clorofila total foi

estimada pela soma dos teores de clorofila a e b.

24

Tabela 1. Equações utilizadas na determinação das concentrações de clorofilas a, b

e total e de carotenóides.

Comprimento de onda (nm) Pigmento

480 Carotenóides

645 Clorofila b

663 Clorofila a

Quantidade de pigmento ( µg/cm 2)

12,7 x A663 - 2,69 x A645

22,9 x A645 - 4,68 x A663

(A480 + 0,114 x A663 - 0,668 x A645) x V x 103/112,5 x 0,63702

3.6. Extravasamento de eletrólitos

Para acessar a estabilidade das membranas foi utilizada a técnica do

extravasamento de eletrólitos (BAJJI et al., 2001). Os discos foliares (3) com ½ cm

de diâmetro foram lavados em água destilada para a retirada do conteúdo das

células rompidas durante a remoção e de outros eletrólitos aderidos. Após a

lavagem, os discos foram secos em papel absorvente e colocados em frascos

contendo 10 mL de água destilada a 25ºC por 6 h sob agitação constante. Em

seguida, a condutividade elétrica foi medida (C1) e os frascos com os discos foram

colocados a 90 ºC por 2 h. Depois do equilíbrio da temperatura, a condutividade

elétrica máxima foi medida (C2) e o extravasamento de eletrólitos calculado por meio

da seguinte fórmula: (C1/C2) x 100.

3.7. Parâmetros de crescimento

No final do período experimental, mediram-se (i) a altura e o diâmetro do

coleto das plantas, usando régua e paquímetro respectivamente; e (ii) a área foliar

total por planta, usando um medidor de área LI-3100 (LI-COR, Inc. Lincoln,

Nebraska, USA) e contou o número de folhas por planta. Em seguida, para

obtenção da biomassa seca, as plantas dos genótipos clonais foram divididas em

partes (raiz, caule e folha), armazenadas em sacos de papel e secas em estufa de

ventilação forçada de ar a 75 °C até massa constante. A partir das variáveis de

crescimento e da biomassa seca determinaram-se: (i) razão de área foliar (RAF=

25

área foliar total / biomassa seca total); (ii) área foliar específica (AFE = área foliar /

biomassa seca foliar); (iv) razão de massa foliar (RMF = biomassa seca foliar /

biomassa seca total); e (v) razão raiz / parte aérea (R/PA = biomassa seca da raiz /

biomassa seca da parte aérea).

3.8. Teor de carboidratos

3.8.1. Obtenção do extrato

A) Açúcares solúveis totais - Inicialmente, 0,1g de cada amostra seca foi

submetida a uma extração com 5 mL de etanol 80% a quente, homogeneizado e

deixado em repouso durante 5 minutos. Em seguida acrescentou-se mais 5 mL de

etanol e as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 5.000 rpm sendo o

sobrenadante transferido para balão volumétrico (50 mL). Esta etapa foi repetida

mais três vezes, os sobrenadantes foram combinados e o volume completado para

50 mL com água destilada (extrato etanólico I).

As amostras foram clarificadas pela adição de 100 mg de carvão vegetal

ativado e filtração em papel de filtro Whatiman nº 1 ou similar (extrato etanólico II).

Do extrato etanólico II, tomaram-se alíquotas de 5 mL que foram

acondicionadas em béquer de 25 mL e evaporadas em chapa de aquecimento a

60°C até a secura. O resíduo resultante foi dissolvido em 5 mL de água destilada

(extrato etanólico III) e acondicionado em frascos de vidro tipo penicilina a -20°C.

B) Amido - Ao resíduo das extrações alcoólicas adicionaram-se 2,5 mL de

água destilada e 3,25 mL de ácido perclórico a 52%. As amostras foram

homogeneizadas, deixadas em repouso por 20 min., e novamente homogeneizadas.

Após, acrescentou-se 2,5 mL de água destilada e as amostras foram centrifugadas

por 10 minutos a 5.000 rpm sendo o sobrenadante transferido para balão

volumétrico de 50 mL. Esta etapa foi repetida, porém o tempo de repouso das

amostras foi de 30 minutos. Os sobrenadantes foram combinados e o volume

completado para 50 mL com água destilada. Alíquotas de 5 mL foram

acondicionadas em frascos de vidro tipo penicilina a -20 °C.

26

3.8.2. Quantificação

Para a quantificação dos açúcares solúveis totais e amidos foi utilizado o

método calorimétrico descrito por Laurentin e Edwards (2003). A concentração de

açúcares solúveis totais foi calculada tomando-se por base os dados da curva

padrão obtida com D-glicose. Para isso uma solução de glicose (1000 µg/mL) foi

preparada diluindo-se 0,1g de glicose em 100 mL de água destilada. Alíquotas de 10

mL (100 µg /mL), 7,5 mL (70 µg /mL), 5,0 mL (50 µg /mL) e 2,5 mL (25 µg /mL)

foram transferidas para balões volumétricos e o volume completado para 100 mL.

3.9. Expressão gênica de aquaporina

Para as análises de expressão gênica de aquaporina via Real Time

qRT-PCR foram realizadas coletas de folhas maduras de plantas não alagadas e

alagadas pertencentes aos genótipos TSA-792 e TSH-774 no tempo de 24 h após a

aplicação do tratamento alagado. As plantas não alagadas já se encontravam

aclimatadas aos níveis de irradiância T0, T25, T50 e T75. As amostras foram

armazenadas a –80°C após fixação em nitrogênio líquido e em seguida foram

liofilizadas. Foram realizadas extrações de RNA das folhas do tratamento não-

alagado e do tratamento alagado utilizando o RNAqueous Kit (Ambion – Applied

Biosystems). Em seguida, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de

agarose a 1% para avaliar se o RNA estava livre de DNA e íntegro para ser

submetido à reação de síntese de primeira fita do cDNA.

A síntese de cDNA foi realizada utilizando 1 µl de RNA total como molde, 20

unidades do RiboLock™ RNase Inhibitor (Fermentas), 10 mmol L-1 de dNTPs Mix

(Fermentas), 0,5 µg de primer Oligo d(T)18 e 200 unidades de RevertAidTM H-Minus

M-MuLV (Fermentas). A reação foi incubada a 42ºC por 60 min finalizando com 70ºC

durante 10 min. para inativação da enzima.

O RT-PCR quantitativo foi realizado em um termociclador Real Time PCR

(Applied Biosystems, modelo 7500), usando o kit The Maxima™ SYBR Green/ROX

qPCR Master Mix (Fermentas). A abundância de transcritos da proteína integral da

membrana plasmática PIP1;3 foi analisada por meio do seguinte primer: Forward-5’-

GACTTCCATCTCCTCTCTCTT-3’ / Reverse-5’-ATGGGCAGGGAAGGATAAAAG-3’

27

(Tm = 55ºC) (BAIGES et al., 2001). O mix para a reação foi composto por 500 ηg de

cDNA como molde, 5 pM de cada primer e uma quantidade suficiente do fluoróforo

SYBR Green I (Fermentas) para um volume final da reação de 20 µL. As condições

da reação foram 50ºC por 2 min., 95ºC por 10 min., 50 repetições de 95ºC por 15 s e

55ºC por 1 min..

Posteriormente, as leituras de fluorescência foram analisadas pelo Sequence

Detection Software (SDS, Applied Biosystems). Todas as reações foram submetidas

as mesmas condições de análise e normalizadas pelo sinal do corante de referência

passiva ROX para correção de flutuações na leitura decorrentes de variação no

volume e evaporação ao longo da reação. Os valores para o Ciclo Threshold (CT)

foram determinados e os números da expressão relativa dos genes foram calculados

como uma porcentagem da amostra não alagada do tratamento T0 utilizando o

método 2–∆∆Ct (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001) com o gene da subunidade ribossomal

18S como controle endógeno.

3.10. Análise estatística

O experimento foi conduzido em condições de casa de vegetação em

delineamento experimental inteiramente casualizado em fatorial 2x4x2, referentes

aos 2 genótipos clonais (TSH-774 e TSA–792), 4 níveis de sombreamento (T0, T25,

T50 e T75) e 2 regimes hídricos (alagado e não-alagado), com cinco repetições,

perfazendo um total de 80 mudas clonais. Os dados foram submetidos à ANOVA,

teste de Tukey (p < 0,05) e análises de regressão.

28

4. RESULTADOS

4.1. Variáveis microclimáticas

Durante o período de 16/04/09 a 09/07/09 foram monitoradas a temperatura

(°C) e a umidade relativa do ar (UR, %), no interior da casa de vegetação, e de

16/04/09 a 22/05/09 a radiação fotossinteticamente ativa (RFA, µmol fótons m-2 s-1)

nos ambientes de cultivo T0, T25, T50 e T75 (Figura 1). A temperatura máxima

observada durante o período da interação sombreamento x alagamento do solo foi

28°C e a mínima 21°C. A umidade relativa mínima observada durante o período

experimental foi de 73% e a máxima de 95%. A partir dos dados de RFA coletados

no interior dos ambientes de cultivo foi determinado que 1) no tratamento T0, sem

tela sombrite, o valor médio de RFA foi de 194,6 µmol fótons m-2 s-1; 2) no

tratamento T25, com tela sombrite de 25% de atenuação da radiação solar total

incidente, o valor médio de RFA foi de 93,3 µmol fótons m-2 s-1, que corresponde a

47% de RFA do tratamento T0; 3) no tratamento T50, com sombrite de 50%, o valor

médio de RFA foi de 61 µmol fótons m-2 s-1, correspondendo a 31,5% de RFA do

tratamento T0; 4) no tratamento T75, com sombrite de atenuação de 75%, o valor

médio de RFA foi de 44,1 µmol fótons m-2 s-1; equivalente a 22% de RFA do

tratamento T0 a pleno sol.

29

Figura 3. Variáveis microclimáticas medidas no interior da casa de vegetação. (A)

Temperatura (°C) do ar; (B) Umidade relativa (%) do ar; (C) Valores

médios diários (7h – 17h) de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) em

cada nível de sombreamento (NS, %); (▲) T0; (○) T25; (��)T50 e (��)T75.

(A)

(B)

(C)

30

4.2. Observações visuais

Todas as plântulas sobreviveram ao período de alagamento, porém

com sintomas de estresse como clorose nas folhas (Figura 4). Esta condição foi

mais evidente em plantas alagadas a pleno sol do que em plantas alagadas sob

sombreamento. Além disso, lenticelas hipertrofiadas na região submersa do caule,

sinais de decomposição nas raízes inundadas, ausência de raízes adventícias e

ausência de sintomas de injúria característicos de plantas intolerantes como necrose

e senescência foliar foram observadas em ambos os genótipos. Esses sintomas

ocorreram em todos os níveis de luminosidade.

Figura 4. Morfologia externa de plantas dos genótipos clonais de cacau TSA-792 e

TSH-774 submetidos ao sombreamento por quatro meses e ao

sombreamento + alagamento do solo por um período de 85 dias. (A)

Clorose foliar aos oito dias (TSH-774) e (B) aos 85 dias após o

alagamento do solo (TSA-792); (C) Lenticelas hipertrofiadas na base do

caule oito dias após o alagamento do solo.

31

4.3. Trocas gasosas foliares

As superfícies de resposta ilustram as diferenças entre os tratamentos

(alagado e não-alagado) para ambos os clones TSA-792 e TSH-774, e as diferenças

apresentadas na interação genótipo x nível de sombra x alagamento x época.

A análise de variância indicou que as váriáveis apresentaram diferenças

intergenotípicas significativas para tratamentos, nível de sombreamento, época e

para a interação entre ambos (Tabela 2).

Tabela 2. Valores de probabilidade da ANOVA para os efeitos de genótipo (G), nível

de sombreamento (NS), regime hídrico (RH), tempo (T) e da interação

entre GxNSxRHxT nas trocas gasosas foliares. (*) p<0,05; (**) p<0,01;

(***) p<0,001; (NS) não significativo.

Para a condutância estomática (gs) foi verificado que houve interação entre

genótipo, nível de sombreamento, regime hídrico e duração do tratamento (Tabela

2). Nota-se, nas plantas não alagadas do genótipo TSA-792, que não houve efeito

do sombreamento (Figura 5A). No tratamento alagado, os valores de gs foram

similares aos das plantas não alagadas. Entretanto, com o tempo de alagamento,

verificou-se uma redução em gs a partir da primeira medição. As plantas não

alagadas do genótipo TSH-774 sofreram influência do sombreamento com tendência

à redução de gs com o aumento do sombreamento e com o tempo de exposição ao

G NS RH T

A 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0000 ***

gs 0,0001 *** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0096 **

E 0,0009 *** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,2356 NS

A/gs 0,5585 NS 0,0352 * 0,0336 * 0,0000 *** 0,2064 NS

A/E 0,2551 NS 0,3494 NS 0,0004 *** 0,0000 *** 0,0000 ***(µmol CO2 mmol H2O-1)

Variável

(µmol CO2 mol H2O)

GxNSxRHxT

(mmol H2O m-2 s-1)

(µmol CO2 m-2 s-1)

(mol m-2 s-1)

32

alagamento (Figura 5B). O valor de gs nas plantas alagadas foi consideravelmente

menor quando comparada com as do genótipo TSA-792 no tratamento a pleno sol,

porém observou-se um aumento significativo com o aumento do nível de sombra,

alcançando valores próximos aos das plantas não alagadas.

Comparando os coeficientes de determinação das equações de regressão do

tratamento não-alagado em ambos os genótipos, verificou-se que apenas 16% da

variação em gs para o genótipo TSA-792 e 36 % para o genótipo TSH-774 deveu-se

ao nível de sombreamento e o tempo, o que pode ser considerado pouco

significativo.

Figura 5. Condutância estomática ao vapor de água (

sombreamento por quatro meses e ao

não-alagado (y=1,097 – 0,307T - 0,

1,314***T – 0,3531NS + 0,385*T2 + 0,

0,695NS – 0,239T2 – 0,173NS2 –

0,156NS2 –

(A)

33

Condutância estomática ao vapor de água (gs) em nível foliar em genótipos clonais de cacau

e ao sombreamento + alagamento do solo por um período de

0,106NS – 0,0875T2 – 0,0047NS2 – 0,0685TNS / R2 = 0,

+ 0,2806*NS2 + 0,2123TNS/ R2= 0,86); (B) TSH-774 não-alagado

0,182TNS / R2 = 0,36); alagado (y= 0,586 – 0,931***T

0,171TNS / R2

(B)

) em nível foliar em genótipos clonais de cacau submetidos ao

alagamento do solo por um período de 48 dias. (A) TSA-792

= 0,16); alagado (y=1,173 –

alagado (y= 1,151 – 0,64*T +

+ 0,552*NS + 0,421**T2 –

= 0,77

34

A taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar (A) nas plantas não

alagadas, em ambos os genótipos, manteve-se constante em relação ao nível de

sombreamento (Figura 6), porém decrescendo ao longo do período dos tratamentos

(tempo). Entretanto, observaram-se diferenças intergenotípicas significativas para as

plantas alagadas. Para o clone TSA-792, a taxa fotossintética em relação ao nível de

sombreamento apresentou valores médios similares aos das plantas não alagadas

(Figura 6A). Em contrapartida, o clone TSH-774 apresentou valores inferiores de A

no tratamento a pleno sol (6 µmol m2 s-1 ) quando comparado ao clone TSA-792 (11

µmol m2 s-1), alcançando valores próximos aos das plantas não alagadas com o

aumento do nível de sombreamento (Figura 6B). Para ambos os genótipos, os

valores de A foram reduzidos significativamente com o tempo de alagamento, com

uma média de 3,0 µmol m2 s-1 para o clone TSA-792 e de 2,0 µmol m2 s-1 para o

clone TSH-774 aos 48 dias após a aplicação do tratamento alagado.

Seguindo o mesmo padrão de respostas de gs e A, a transpiração foliar (E) foi

significativamente reduzida nas plantas submetidas ao alagamento do solo desde o

início do tratamento e manteve-se durante todo o experimento (Figura 7). Entretanto,

para a variável E, não houve interação significativa entre genótipos, nível de

sombreamento, regime hídrico e tempo (p<0,05) (Tabela 2). Verificou-se que a

queda nos valores de E com o tempo de alagamento foi mais acentuada para o

genótipo TSH-774 (Figura 7A), sendo que o genótipo TSA-792 (Figura 7B)

apresentou valor de E superior ao do genótipo TSH-774 ao final do experimento.

Figura 6. Taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar

por quatro meses e ao sombreamento +

(y=9,95 – 0,172 T + 0,012NS – 0,04T

+ 0,135*T2 + 0,0006*NS2 + 0,0053 TNS/ R

0,175NS2 – 0,195TNS/ R2 = 0,70); alagado (

(A)

35

Taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar (A) em genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento

sombreamento + alagamento do solo por um período de 48 dias.

0,04T2 – 0,0001NS2 – 0,0015TNS / R2 = 0,80); alagado (y=12,11

+ 0,0053 TNS/ R2= 0,97); (B) TSH-774 não-alagado (y= 1,22 – 0,35*

; alagado (y= 0,70 – 0,842*T + 0,63*NS – 0,22T2 – 0,24NS2

(B)

submetidos ao sombreamento

(A) TSA-792 não-alagado

); alagado (y=12,11 – 2,394***T – 0,05*NS

35*T + 0,087NS – 0,037T2 –

– 0,092TNS / R2 = 0,82).

Figura 7. Taxa transpiratória foliar (E) em genótipos clonais de cacau

sombreamento + alagamento do solo por um período de

0,082NS – 0,3108T2 – 0,1765NS2

0,394*NS2 + 0,1365TNS/ R2= 0,86);

0,139TNS/ R2 = 0,29); alagado (y=

(A)

36

) em genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento

alagamento do solo por um período de 48 dias. (A) TSA-792 não-alagado

– 0,166TNS / R2 = 0,14); alagado (y=1,192 – 1,446***T

= 0,86); (B) TSH-774 não-alagado (y= 1,058 – 0,567*T + 0,4177NS

0,832 – 1,278***T + 0,4621*NS – 0,552*T2 – 0,223NS2

(B)


alagado (y= 1,104 – 0,606*T +

***T – 0,374NS + 0,505**T2 +

NS – 0,276T2 – 0,397*NS2 – 2 – 0,020TNS / R2 = 0, 80).

37

Para a eficiência intrínseca do uso da água (A/gs) (Figura 8), a ANOVA não

foi significativa para o fator genótipo e para a interação entre genótipos, nível de

sombreamento, regime hídrico e tempo (p<0,05). Entretanto, observaram-se

diferenças significativas entre plantas não alagadas e alagadas em condições de

sombreamento e com o tempo de exposição ao tratamento. Por outro lado, a

eficiência instantânea do uso de água (A/E) aumentou com o nível de

sombreamento, com reduções significativas em relação ao tempo de exposição aos

diferentes níveis de sombreamento nas plantas não alagadas do genótipo TSA-792

(Figura 8A). Nas plantas alagadas, houve uma redução pouco significativa da A/E

em relação ao nível de sombreamento e um incremento com a duração do mesmo

(Figura 8A). Comportamento inverso pôde ser verificado nas plantas não alagadas

pertencentes ao genótipo TSH-774 (Figura 8B), que reduziu a A/E com o aumento

do nível de sombreamento e aumentou com o tempo de exposição. Entretanto, nas

plantas alagadas, houve um leve aumento nos valores de A/E, seguido por uma

redução significativa com o nível de sombreamento, sendo que o mesmo

comportamento foi observado com o tempo de alagamento.

Nas plantas alagadas pertencentes ao genótipo TSA-792, o valor de A/E

apresentou comportamento similar ao das plantas não alagadas, entretanto, em um

patamar inferior (Figura 9A). Os valores de A/E foram superiores nos tratamentos de

sombreamento T25 e T50, tanto para o tratamento não-alagado quanto para o

alagado. Pequenos decréscimos foram observados com o tempo de alagamento.

Para o genótipo TSH-774 (Figura 9B), o tratamento não-alagado apresentou

comportamento similar ao não-alagado do genótipo TSA-792, porém com valores

inferiores de A/E. Nas plantas alagadas, A/E foi reduzido a partir do tratamento T25

de sombreamento e também com o tempo de alagamento. Mesmo sob alagamento,

as plantas do genótipo TSA-792 apresentaram A/gs similar ao das plantas não

alagadas do genótipo TSH-774.

Figura 8. Eficiência intrínseca do uso da água (

meses e ao sombreamento + alagamento do solo por um período de

0,252T + 0,949**NS – 0,283T2 – 0,

0,1648T2 + 0,19NS2 + 0,147TNS/ R

0,5532**NS2 – 0,163TNS/ R2 = 0,53

R2 = 0,51).

(A)

38

Eficiência intrínseca do uso da água (A/gs) em genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento


0,6273**NS2 – 0,16TNS / R2 = 0,60); alagado (y=0,8542

0,147TNS/ R2= 0,16); (B) TSH-774 não-alagado (y= 0,906 – 0,1374T

= 0,53); alagado (y= 0,6112 – 0,382T + 0,635NS – 0,523*T2 –

(B)

submetidos ao sombreamento por quatro

792 não-alagado (y= 0,4465 –

0,8542 – 0,053T – 0,4074NS -

T - 0,842**NS – 0,289*T2 +

0,6904*NS2 – 0,1255TNS /

Figura 9. Eficiência instantânea do uso da água (


0,0617T + 1,024**NS – 0,1764T2 –

0,1145T2 - 0,83**NS2 - 0,1806TNS/ R

- 0,609**NS2 – 0,1455TNS/ R2 = 0,56

0,46.

(A)

39

Eficiência instantânea do uso da água (A/E) em genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento


– 0,808**NS2 – 0,0075TNS / R2 = 0,60); alagado (y=0,355

0,1806TNS/ R2= 0,50); (B) TSH-774 não-alagado (y= 0,3822 + 0,0466*

= 0,56); alagado (y= 0,6217 + 0,219T + 0,536NS – 0,455T2 – 0,

(B)


792 não-alagado (y= 0,707 –

0,355 – 0,0862T – 1,121**NS -

0466*T + 0,751**NS – 0,396*T2

0,56NS2 – 0,1717TNS / R2 =

40

4.4. Emissão de fluorescência da clorofila a

A análise de variância (ANOVA) para a emissão de fluorescência da clorofila

a foi significativa para regime hídrico e nível de sombreamento. Para os genótipos

avaliados somente não foi significativa a variável fluorescência máxima (Fm). A

ANOVA também não foi significativa para a interação genótipo x nível de

sombreamento x regime hídrico (Tabela 3).


de sombreamento (NS), regime hídrico (RH), tempo (T) e das interações

NSxRH e GxNSxRHxT na emissão de fluorescência da clorofila a. (*)

p<0,05; (**) p<0,01; (***) p<0,001; (NS) não significativo.

Observa-se que nas plantas não alagadas do genótipo TSA-792, a

fluorescência mínima (Fo) não sofreu variações com a duração do tratamento

(Figura 10). Entretanto, Fo foi bastante reduzido com o aumento do nível de

sombreamento (Figura 10A). Essa redução foi observada também nas plantas

alagadas. Houve um leve aumento de Fo com o período de alagamento para o

genótipo TSA-792 (Figura 10A). Em contrapartida, para o genótipo TSH-774, não se

observou alterações nos valores de Fo nas plantas não alagadas, para o nível de

sombreamento (Figura 10B). Já para as plantas alagadas, verificou-se uma

diminuição nos valores de Fo nos tratamentos T25 e T50, com um aumento pouco

significativo para o tratamento T75. Embora os dois genótipos tenham apresentado

aumento de Fo com o tempo de exposição ao alagamento, evidenciou-se para o

genótipo TSA-792, resistente ao alagamento, esse aumento foi gradual, enquanto

G NS RH T NS x RH GxNSxRHxTFo 0,0095 ** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0356 * 0,020596 * 0,2681 NS

Fm 0,2943 NS 0,0000 *** 0,0254 * 0,0000 *** 0,000022 *** 0,4188 NS

Fv/Fm 0,0059 ** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0347 * 0,000068 *** 0,1230 NS

Variável

41

para o genótipo TSH-774, suscetível ao alagamento, o aumento pôde ser observado

a partir dos primeiros dias de alagamento do solo. As plantas não alagadas do

genótipo TSA-792 apresentaram valores maiores de Fo no tratamento a pleno sol do

que as plantas não alagadas do genótipo TSH-774 (300 e 250, respectivamente) e

valores menores no tratamento T75 (200 e 250, respectivamente.

Para a variável fluorescência máxima (Fm), não houve diferença significativa

em relação ao nível de sombreamento para as plantas não alagadas do genótipo

TSA-792 (Figura 11A). Nas plantas alagadas, os valores de Fm aumentaram nos

tratamentos T25 e T50 e diminuíram no T75 em comparação com o tratamento T0.

Por outro lado, houve um aumento significativo (p<0,05) de Fm em relação à

duração do período de alagamento. Nas plantas não alagadas do genótipo TSH-774

(Figura 11B), verificou-se um comportamento similar àquelas do genótipo TSA-792,

cujos níveis de sombreamento influenciaram pouco nos valores de Fm. No

tratamento alagado, os valores de Fm foram similares para os tratamentos T0 e T75

e os maiores valores foram encontrados nos tratamentos T25 e T50. Entretanto,

para o genótipo TSH-774, o valor de Fm se manteve constante durante todo o

período de alagamento (Figura 11B).

Figura 10. Fluorescência mínima (Fo) foliar em genótipos clonais de cacau

sombreamento + alagamento do solo por um período de

1,63**NS + 1,017T2 + 0,013*NS2

0,015*NS2 - 0,006TNS/ R2= 0,50);

0,036TNS/ R2 = 0,50); alagado (y=

(A)

42

) foliar em genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento

alagamento do solo por um período de 48 dias. (A) TSA-792 não-alagado

– 0,039TNS / R2 = 0,42); alagado (y= 241,37 + 15,40

= 0,50); (B) TSH-774 não-alagado (y= 235,81 + 7,55T - 0,624NS

251,16 + 28,04T – 2,56**NS – 2,10T2 + 0,027**NS2 – 0,141TNS

(B)


alagado (y= 264,04 – 10,19T +

15,40T – 1,80*NS – 1,123 T2 +

NS – 1,114T2 + 0,003NS2 –

141TNS / R2 = 0,63).

Figura 11. Fluorescência máxima (Fm) em nível foliar de genótipos clonais de cacau


45,04**T + 1,47NS - 2,94T2 - 0,012

0,041*NS2 + 0,335TNS/ R2= 0,46);

– 0,308**TNS/ R2 = 0,54); alagado (

(A)

43

) em nível foliar de genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento


0,012NS2 – 0,170TNS / R2 = 0,67); alagado (y= 1106,48 + 38,1

= 0,46); (B) TSH-774 não-alagado (y= 1097,71 + 33,84*T + 2,081*

; alagado (y= 1120,7 – 10,16T + 3,99*NS + 1,014T2 – 0,05**NS

(B)


792 não-alagado (y= 1070,18 +

38,1T + 2,54NS – 6,41*T2 -

2,081*NS – 1,77T2 - 0,0155NS2

NS2 + 0,192TNS / R2 = 0,42).

44

Verificou-se um incremento significativo no rendimento quântico do

fotossistema II com o aumento do nível de sombreamento nas plantas não alagadas

do genótipo TSA-792 (Figura 12A). Nesse caso, as plantas submetidas ao

tratamento a pleno sol apresentaram valores para Fv/Fm de 0,600 e as plantas

submetidas ao tratamento T75 de sombreamento apresentaram valores de 0,800.

Não houve variação no tempo de exposição ao sombreamento. Já nas plantas

alagadas esse aumento foi bastante expressivo, sendo que as plantas submetidas a

pleno sol apresentaram valores equivalentes às plantas não alagadas. Contudo, nos

tratamento T25 e T75 os valores de Fv/Fm alcançaram 0,9 e não sofreram

alterações com a duração do período de alagamento.

Nas plantas não alagadas do genótipo TSH-774, observou-se um aumento

pouco significativo nos valores de Fv/Fm entre os níveis de sombreamento (Figura

12B), que variaram em torno de 0,800 e 0,900 para os tratamento T0 e T75,

respectivamente. Não foram observadas alterações significativas (p<0,05) com o

tempo de exposição aos tratamentos de sombra. Verificou-se um comportamento

similar das plantas alagadas deste genótipo com àquelas do genótipo TSA-792 em

relação ao nível de sombreamento. Entretanto, com o tempo de alagamento, as

plantas do genótipo TSH-774 exibiram um decréscimo acentuado de Fv/Fm, quando

comparadas as do genótipo TSA-792, a partir dos primeiros dias após a aplicação

do tratamento alagado.

Figura 12. Rendimento quântico máximo de PS2 (

por quatro meses e ao sombreamento +

0,7548 + 0,017T + 0,0016**NS –

0,002**NS + 0,00005T2 - 0,00002**

0,00085NS + 0,0006T2 - 0,00001NS

– 0,00004**NS2

(A)

45

Rendimento quântico máximo de PS2 (Fv/Fm) em folhas de genótipos clonais de cacau submetidos ao sombreamento

sombreamento + alagamento do solo por um período de 48 dias. (A)

0,0015T2 - 0,00001*NS2 – 0,0007TNS / R2 = 0,48); alagado (y=

00002**NS2 + 0,00006TNS/ R2= 0,65); (B) TSH-774 não-alagado

NS2 – 0,00002TNS/ R2 = 0,44); alagado (y= 0,7753 – 0,032T

+ 0,0001TNS / R2

(B)

submetidos ao sombreamento

(A) TSA-792 não-alagado (y=

); alagado (y= 0,782 – 0,008T +

alagado (y= 0,7860 – 0,0006T +

0,032T + 0,0033**NS + 0,003T2

= 0,63).

46

4.5. Teores de pigmentos cloroplastídicos

Não houve interação intergenotípíca significativa (p<0,05) para nível de

sombreamento e regime hídrico (Tabela 4). Verificou-se que os teores de pigmentos

cloroplastídicos foram significativamente maiores nas plantas não alagadas em

relação às plantas alagadas.



entre NSxRH e GxNSxRS no teor de pigmentos cloroplastídicos. (*)

p<0,05, (**) p<0,01; (***) p<0,001; (NS) não significativo.

O teor de clorofila a foi significativo para o nível de sombreamento, regime

hídrico e para a interação entre ambos (p< 0,05) (Tabela 4). Não foram observadas

diferenças significativas em relação ao teor de clorofila a para as plantas não

alagadas do genótipo TSA-792 entre os níveis de sombreamento, enquanto que

para genótipo TSH-774 houve diferença entre os tratamentos T0 e T75 (Figura 13A).

Nas plantas submetidas ao tratamento alagado, o teor de clorofila a aumentou com a

elevação do nível de sombreamento, sendo a diferença mais significativa observada

nas plantas crescidas sob o tratamento T75 (Figura 13B). Neste tratamento, o teor

de clorofila a não diferiu entre os dois genótipos estudados.

G NS RH NS x RH G x NS x RH

Clorofila a (µg cm-2) 0,6791 NS 0,0000***

0,0000***

0,0425*

0,9376 NS

Clorofila b (µg cm-2) 0,1413 NS 0,1995 NS 0,0059 ** 0,2503 NS 0,2805 NS

Clorofila total (µg cm-2) 0,1913 NS 0,0001 *** 0,0000 *** 0,0441 * 0,3713 NS

Carotenóides (µg cm-2) 0,4216 NS 0,0008 *** 0,0001 *** 0,5390 NS 0,9710 NS

Clorila a/b 0,0033 ** 0,0017 ** 0,0001 *** 0,0394 * 0,4226 NS

Variável

47

Figura 13. Teor de clorofila a em genótipos clonais de cacau submetidos ao

sombreamento por quatro meses e ao sombreamento + alagamento do

solo por um período de 48 dias. (A) Tratamento não-alagado; (B)

Tratamento alagado; (�) genótipo TSA-792; (�) genótipo TSH-774.

Médias intra e intergenotípica com as mesmas letras minúsculas e

maiúsculas, respectivamente, não diferem entre si pelo teste de Tukey

(p<0,05).

O teor de clorofila b apresentou um padrão de resposta similar ao de clorofila

a, porém em concentrações significativamente menores (Figura 14). Nas plantas não

alagadas, não houve diferenças significativas entre os níveis de sombreamento para

ambos os genótipos (Figura 14A). Nas plantas alagadas, o teor de clorofila b foi

bastante reduzido, ao passo que nas plantas submetidas à baixa irradiância os

valores se aproximaram aos das plantas não alagadas. Entretanto, em T75 os

valores duplicaram em relação aos das plantas cultivadas a pleno sol (Figura 14B).

Diferenças intergenotípicas não foram observadas para as plantas não alagadas,

entretanto o genótipo TSH-774 tendendo a apresentar um teor de clorofila b maior

do que o TSA-792.

(A) (B)

48

Figura 14. Teor de clorofila b foliar em genótipos clonais de cacau submetidos ao






(p<0,05).

O teor de clorofila total (a + b) não apresentou diferenças intragenotípicas

significativas (p<0,05) entre as médias dos quatro tratamentos de sombreamento

(Figura 15). Verificou-se uma tendência de as plantas não alagadas do genótipo

TSH-774 apresentarem uma maior concentração de clorofila total nos tratamento

T25, T50, T75. Nas plantas alagadas, o teor de clorofila total foi bastante reduzido,

ao passo que as plantas submetidas ao tratamento T75 apresentaram uma

concentração de clorofila duas vezes maior em relação às plantas cultivadas a pleno

sol. Pôde-se observar também que tanto para o teor de clorofila a e b (Figura 13B e

13B), quanto para o teor de clorofila total (Figura 15B), o genótipo TSA-792 foi

superior ao TSH-774 nos tratamento alagado dos níveis T0 e T25 de sombreamento.

(A) (B)

49

Figura 15. Teor de clorofila total (a + b) foliar em genótipos clonais de cacau

submetidos ao sombreamento por quatro meses e ao sombreamento +

alagamento do solo por um período de 48 dias. (A) Tratamento não-

alagado; (B) Tratamento alagado; (�) genótipo TSA-792; (�) genótipo

TSH-774. Médias intra e intergenotípica com as mesmas letras

minúsculas e maiúsculas, respectivamente, não diferem entre si pelo teste

de Tukey (p<0,05).

O teor de carotenóides não apresentou diferenças intragenotípicas

significativas (p<0,05) entre as plantas não alagadas nos tratamentos de

sombreamento T0 e T25, porém nos níveis de sombreamento T50 e T75, o genótipo

TSH-774 foi superior ao genótipo TSA-792 em relação à concentração de

carotenóides (Figura 16A). Para as plantas alagadas, o genótipo TSA-792

apresentou teor de carotenóides, nos tratamentos T0 e T25, superiores ao genótipo

TSH-774 (Figura 16B).

(A) (B)

50

Figura 16. Teor de carotenóides foliar em plantas de genótipos clonais de cacau


alagamento do solo por um período de 48 dias. (A) Tratamento não-

alagado; (B) Tratamento alagado; (�) genótipo TSA-792; (�) genótipo

TSH-774. Médias intra e intergenotípica com as mesmas letras

minúsculas e maiúsculas, respectivamente, não diferem entre si pelo teste

de Tukey (p<0,05).

Para a razão clorofila a/b, não houve diferenças intragenotípicas nos quatro

níveis de sombreamento (Figura 17). Entre os genótipos, houve uma tendência do

clone TSA-792 não-alagado apresentar uma razão clorofila a/b um pouco maior do

que o clone TSH-774 nos tratamentos T25, T50 e T75 (Figura 17A). Nas plantas

alagadas, verificou-se, para o genótipo TSA-792, que a razão clorofila a/b foi maior

nos tratamentos T0, T25 e T50, quando comparado ao genótipo TSH-774 (Figura

17B).

(A) (B)

51

Figura 17. Razão clorofila a/b em folhas de genótipos clonais de cacau submetidos

ao sombreamento por quatro meses e ao sombreamento + alagamento do





(p<0,05).

4.6. Extravasamento de eletrólitos

De acordo com a análise de variância, o extravasamento de eletrólitos não foi

significativo (p<0,05) para genótipo, nível de sombreamento, regime hídrico e a

interação entre ambos (Tabela 5). Entretanto, observou-se, nas plantas alagadas,

uma tendência de acréscimo na porcentagem de eletrólitos nos tratamentos T50 e

T75 para o genótipo TSA-792 (Figura 16A) e nos tratamentos T0 e T25 para o

genótipo TSH-774 (Figura 16B).

(A) (B)

52



NSxRH e GxNSxRH no extravasamento de eletrólitos. (*) p<0,05; (**)

p<0,01; (***) p<0,001; (NS) não significativo.

4.7. Biomassa seca

Não houve efeitos significativos da interação tripla genótipo x nível de

sombreamento x regime hídrico para as variáveis de biomassa seca analisadas

(p<0,05, Tabela 6). A interação dupla entre nível de sombreamento x regime hídrico

foi significativa para área foliar total, biomassa seca de raiz, caule, folha e total e a

área foliar específica (p<0,05).

G NS RH NSxRH GxNSxRH

0,0694 NS 0,1999 NS 0,3296 NS 0,9802 NS 0,6067 NS

Variável

Extravasamento de eletrólitos (%)

53


de sombreamento (NS), regime hídrico (RH) e das interações GxRH e

GxNSxRH no extravasamento de eletrólitos. (*) p<0,05; (**) p<0,01; (***)

p<0,001; (NS) não significativo.

Variável G NS RH NSxRH

Altura 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0064 ** 0,1989 NS 0,5121 NS

Diâmetro do coleto 0,0000 *** 0,0024 ** 0,0000 *** 0,4754 NS 0,1964 NS

Nº de folhas 0,0600 NS 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0590 NS 0,7495 NS

Área foliar total 0,0222 * 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0018 *** 0,3671 NS

Biomassa seca

Raiz 0,0013 ** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,7762 NS

Caule (g) 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0710 NS 0,0070 ** 0,6720 NS

Folha (g) 0,9039NS

0,0000 *** 0,0000 *** 0,0082 ** 0,2890 NS

Total 0,0052 ** 0,0000 *** 0,0000 *** 0,0001 *** 0,3305 NS

RAF (x 10-2 m2 g-1) 0,0000 *** 0,0719 * 0,0000 *** 0,2598 NS 0,6134 NS

AFE 0,9559NS

0,0000 *** 0,0000 *** 0,0210 * 0,3222 NS

RMF (x 10-2 m2 g-1) 0,0016 ** 0,1944 NS 0,0000 *** 0,0836 NS 0,7218 NS

R/PA 0,0248 * 0,8451 NS 0,0002 *** 0,3973 NS 0,7299 NS

GxNSxRH

(cm)

(mm)

(g)

(x 10-2 m2)

(g)

A altura das plantas não foi influenciada pelas interações entre tratamentos

(Tabela 6), porém observaram-se efeitos significativos (p<0,001) isolados do nível de

sombreamento e do regime hídrico, com tendência à diminuição da altura com o

aumento do nível de sombreamento. No tratamento a pleno sol e T25, as plantas

apresentaram altura média similar, exceto para o tratamento alagado do genótipo

TSA-792 que apresentou uma redução de 25% na altura em relação ao tratamento

não-alagado do mesmo genótipo e aos tratamentos não-alagado e alagado do

genótipo TSH-774 (Figura 18).

No tratamento T50 e T75 de sombreamento, as médias de altura das plantas

não alagadas de ambos os genótipos foram similares às das plantas alagadas. No

geral, as plantas alagadas e alagadas do genótipo TSH-774 tenderam a apresentar

altura superior ao das plantas do genótipo TSA-792.

54

Figura 18. Altura da planta em genótipos clonais de cacau submetidos ao


solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 79,85 –

0,29*NS / R²= 0.94); (○) TSA-792 – alagado (y = 60,95 + 0,443NS +

0,0078NS2/ R²= 0.93); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 80,43 +

0,252NS - 0,006NS² / R²= 0.76); (∆) TSH-774 alagado (y = 75,90 +

0,111NS – 0,0026NS² / R²= 0.55).

O diâmetro do coleto foi pouco afetado pelo sombreamento nas plantas não

alagadas (Figura 19). Nesse caso, observou-se tendência à diminuição com o

aumento do nível de sombreamento, nas plantas não alagadas de ambos os

genótipos avaliados e no tratamento não-alagado do genótipo TSA-792, sendo que

as plantas não alagadas do genótipo TSH-774 apresentaram valores médios

superiores aos do genótipo TSA-792. No tratamento alagado, o diâmetro do coleto

no genótipo TSH-774 foi maior nas plantas submetidas aos tratamentos T0 e T75 de

sombreamento e menor nas plantas submetidas aos tratamentos T25 e T50. Esse

resultado é válido também na comparação com as plantas alagadas do genótipo

TSA-792.

55

Figura 19. Diâmetro do coleto em plantas em genótipos clonais de cacau


alagamento do solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792 – não-

alagado (y = 18,18 + 0,0825NS – 0,0007NS² / R²= 0,98); (○) TSA-792

alagado (y = 15,16 + 0,0393NS - 0,0011NS² / R²= 0,42); (▼) TSH-774 –

não-alagado (y = 22,28 + 0,1112NS – 0,0008NS² / R²= 0,90); (∆) TSH-

774- alagado (y = 18,34 + 0,2187*NS - 0,0025*NS² / R²= 0,99).

Observou-se efeito siginificativo (p < 0,001) da irradiância e do regime hídrico

no número de folhas (Tabela 6), que foi reduzido em 40% nas plantas não alagadas

com o aumento do nível de sombreamento (Figura 20). As plantas submetidas ao

tratamento alagado apresentaram uma redução de 60% em relação as plantas não

alagadas. Não se observou diferenças intergenotípicas significativas (p<0,05). para o

número de folhas.

56

Figura 20. Número de folhas em plantas de genótipos clonais de cacau submetidos

ao sombreamento por quatro meses e ao sombreamento + alagamento

do solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y =

100,5**e-0,009(NS) / R²= 0,99); (○) TSA-792 – alagado (y = 50,3**e-

0,009*(NS) / R²= 0,96); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 90,9e-0,008(NS)/

R²= 0,90); (∆) TSH-774 alagado (y = 24,3 + 26,93*e-0,102*(NS) / R²= 0,99).

A biomassa seca da raiz (BSR) foi significativamente (p<0,001) influenciada

pelo nível de sombreamento e pelo regime hídrico e pela interação entre ambos os

fatores (Tabela 6). Nas plantas não alagadas, observou-se uma redução

exponencial de BSR com o aumento do nível de sombreamento, sendo que as

plantas submetidas ao tratamento T75 de sombreamento apresentaram BSR

equivalente a 33% ao das plantas do tratamento T0 (Figura 21). Já nas plantas

alagadas, a redução de BSR foi linear, porém pouco significativa em relação a BSR

das plantas cultivadas a pleno sol e no sombreamento denso (T75).

57

Figura 21. Biomassa seca da raiz em genótipos clonais de cacau submetidos ao


solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y =

21,73e-0,018*(NS) / R²= 0,95); (○) TSA-792 – alagado (y = 8,85 -

0,065*NS / R²= 0,95); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 26,80*** e-

0,015***(NS)/ R²= 0,99); (∆) TSH-774- alagado (y = 10,76 – 0,07NS / R²=

0,85).

Houve interação dupla (nível de sombreamento x regime hídrico) e um

decréscimo significativo (p<0,01) na biomassa seca do caule (BSC) em ambos os

genótipos clonais avaliados com o aumento do nível de sombreamento e com o

alagamento do solo (Figura 22). No nível maior de sombreamento, houve uma

redução de 50% de BSC em relação ao tratamento a pleno sol, para ambos

genótipos clonais avaliados. No tratamento alagado, observaram-se diferenças

intergenotípicas significativas (p<0,05) apenas para o tratamento T0. No tratamento

T75, os genótipos clonais apresentaram valores de BSC semelhantes entre os

tratamentos não-alagado e alagado.

58

Figura 22. Biomassa seca do caule em genótipos clonais de cacau submetidos ao


solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 32,94

+ 0,5954*NS – 0,0044NS²/ R²= 0,99); (○) TSA-792 – alagado (y = 24,31

+ 0,0441NS – 0,0025*NS²/ R²= 0,99); (▼) TSH-774 – não-alagado (y =

42,37 + 0,6568*NS – 0,0044*NS² / R²= 0,99); (∆) TSH-774- alagado (y

= 31,09 + 0,3727NS - 0,0024NS² / R²= 0,97).

A biomassa seca de folha (BSF) foi afetada significativamente (p<0,01) pela

interação nível de sombreamento x regime hídrico (Tabela 6). Tanto no tratamento

não-alagado quanto no alagado, os valores de BSF foram reduzidos em 50% com o

aumento do nível de sombreamento (Figura 23). Verificou-se que, no tratamento

não-alagado, não houve diferenças significativas (p<0,05) entre os genótipos clonais

avaliados. No tratamento alagado, o decréscimo de BSF, para o genótipo TSA-792,

apresentou comportamento linear, ao passo que para o genótipo TSH-774, a

resposta foi quadrática, com a redução máxima no tratamento T50 de

sombreamento.

59

Figura 23. Biomassa seca da folha em genótipos clonais de cacau submetidos ao



38,70e-0,014*(NS)/ R²= 0,97); (○) TSA-792 – alagado (y = 18,5 – 0,14*NS

/ R²= 0,97); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 37,30 – 0,32*NS / R²=

0,88); (∆) TSH-774 alagado (y = 22,63 + 0,5741*NS - 0,0053*NS² / R²=

0,99).

Houve interação dupla significativa (p<0,001), entre nível de sombreamento e

regime hídrico, para biomassa seca total (BST) (Tabela 6). Os valores de BST

sofreram um decréscimo de 60% nas plantas não alagadas dos genótipos clonais

avaliados (Figura 24). Observou-se uma tendência de as plantas não alagadas do

genótipo TSH-774 apresentarem valores de BST superiores ao genótipo TSA-792.

Nas plantas alagadas, respostas em relação a BST foram similares as de BSF.

60

Figura 24. Biomassa seca total em genótipos clonais de cacau submetidos ao



92,4***e-0,015*(NS) / R²= 0,97); (○) TSA-792 – alagado (y = 50,71+

0,0564NS – 0,0039*NS² / R²= 0,99); (▼) TSH-774 – não-alagado (y =

106,46 e-0,013*(NS)/ R²= 0,99); (∆) TSH-774 alagado (y = 65,11 +

1,0914*NS + 0,0087NS² / R²= 0,99).

Houve alocação diferenciada de BSR, BSC, BSF entre os tratamentos não-

alagado e alagado e os níveis de sombreamento (Figura 25). No tratamento não-

alagado do genótipo TSA-792, observou-se que as plantas investem mais em folhas

e caule e menos em raízes. As médias da proporção de biomassa seca

corresponderam a 43%, 36% e 21% para folha, caule e raiz, respectivamente. No

tratamento alagado, o acúmulo de biomassa seca foi direcionado para o caule, que

correspondeu a 52% de BST. Tal incremento foi seguido pela redução em BSF (33%

de BST), ao passo que na raiz manteve-se constante (16% de BST).

No tratamento não-alagado do genótipo TSH-774, a maior proporção de

biomassa seca foi observada no caule, com uma média de 40%, seguida pelas

folhas (36%) e raiz (24%). No tratamento alagado, BSC correspondeu a 53% de

61

BST. Houve um incremento de BSC com o aumento do sombreamento até o

tratamento T50, ao passo no T75, as plantas apresentaram proporção de BSC

equivalente ao de T25.

Figura 25. Proporção de biomassa seca de raiz, caule e folha em relação à

biomassa seca total em genótipos clonais de cacau submetidos ao


solo por um período de 85 dias. Tratamento não-alagado: 0C, 25C,

50C e 75C; Tratamento alagado: 0A, 25A, 50A e 75A.

TSA-792

TSH-774

62

A área foliar total (AFT) por planta foi afetada significativamente (p<0,01) pela

interação nível de sombreamento e pelo regime hídrico (Tabela 6). Nos tratamentos

não-alagado, AFT foi inversamente proporcional ao sombreamento disponível para

ambos os genótipos clonais e apresentou um modelo exponencial (Figura 26).

Diferenças intergenotípicas para AFT foram observadas somente no tratamento T0,

sendo o TSA-792 o genótipo clonal com maior AFT. O tratamento alagado reduziu

AFT em 60% tanto para o genótipo TSA-792 quanto para o genótipo TSH-774, com

tendência de TSA-792 apresentar maior AFT do que o TSH-774.

Figura 26. Área folia total em genótipos clonais de cacau submetidos ao



7272,25**e-0,012*(NS) / R²= 0,98); (○) TSA-792 – alagado (y = 3073,40 +

0,5971NS – 0,3067NS² / R²= 0,98); (▼) TSH-774 – não-alagado (y =

6033,8e-0,01*(NS)/ R²= 0,80); (∆) TSH-774 alagado (y = 2509,70 +

36,179NS + 0,3207NS² / R²= 0,94).

63

Houve interação significativa (p<0,05) entre nível de sombreamento e regime

hídrico para o parâmetro área foliar específica (AFE) (Tabela 6), que variou de 2 a 4

cm2 g-1 no tratamento não-alagado e de 3 a 8 cm2 g-1 no tratamento alagado. As

plantas submetidas aos tratamentos de sombreamento e aos dois regimes hídricos

apresentaram aumento de AFE com o aumento do sombreamento (Figura 27). Esse

acréscimo foi mais pronunciado nas plantas submetidas ao alagamento. Para o

genótipo TSA-792 as respostas de AFE ao nível de sombreamento e ao alagamento

do solo foram exponenciais, enquanto que para o genótipo TSH-774 as respostas

foram quadráticas.

Figura 27. Área foliar específica em genótipos clonais de cacau submetidos ao



2,08*e0,01*(NS) / R²= 0,95); (○) TSA-792 – alagado (y = 3,6 e0,011***(NS)/

R²= 0,99); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 1,53 + 0,0654NS –

0,0005NS²/ R²= 0,81); (∆) TSH-774 alagado (y = 2,72 + 0,2054NS -

0,0019*NS² / R²= 0,99).

64

A razão de área foliar (RAF) foi significativa (p<0,001) apenas para regime

hídrico e genótipos clonais avaliados (Tabela 6). Entretanto, observou-se uma

tendência de as plantas não alagadas apresentarem aumento de RAF com o

aumento do nível de sombreamento (Figura 28). Os valores de RAF variaram de 50

a 80 cm2 g-1, para as plantas não alagadas, e de 40 a 60 cm2 g-1 para as alagadas.

As plantas do genótipo TSA-792 apresentaram RAF bastante superior ao do

genótipo TSH-774 nos tratamentos não-alagado e alagado até o nível T50 de

sombreamento. No nível T75 de sombreamento, as plantas alagadas dos genótipos

avaliados mostraram valores de RAF similares.

a

Figura 28. Razão de área foliar em genótipos clonais de cacau submetidos ao



+ 0,8279NS - 0,009 NS²/ R²= 0,85); (○) TSA-792 – alagado (y = 75.42 +

0,1823NS – 0,0032NS²/ R²= 0,50); (▼) TSH-774 – não-alagado (y =

54,58 + 0,7597NS – 0,0088NS²/ R²= 0,80); (∆) TSH-774 alagado (y =

40,867 + 0,0095NS + 0,0016NS² / R²= 0,75).

65

Para a razão de massa foliar (RMF), verificaram-se diferenças

intergenotípicas significativas (p<0,01) entre os tratamentos não-alagado e alagado

(Tabela 6). Não houve diferenças significativas entre os níveis de sombreamento. As

plantas do genótipo TSA-792 do tratamento não-alagado apresentaram RMF maior

do que as plantas do genótipo TSH-774 submetidas ao mesmo tratamento (Figura

29). Nas plantas alagadas, observou-se uma tendência de decréscimo de RMF com

o aumento do nível de sombreamento. Essa tendência foi mais acentuada no

genótipo TSH-774 até o nível T50 de sombreamento. No nível T75 os dois genótipos

apresentaram valores de RMF equivalentes.

Figura 29. Razão de massa foliar em genótipos clonais de cacau submetidos ao


solo por um período de 85 dias. (●) TSA-792 – não-alagado (y = 0,41 +

0,002NS - 0,0003 NS²/ R²= 0,99); (○) TSA-792 – alagado (y = 0,34 –

0,006NS - 0,0006NS²/ R²= 0,99); (▼) TSH-774 – não-alagado (y = 0,36

+ 0,0011NS + 0,00002NS²/ R²= 0,15); (∆) TSH-774- alagado (y = 0,34 -

0,0048NS + 0,00005NS² / R²= 0,97).

66

A análise de variância indicou que a razão raiz/parte aérea (R/PA) foi

significativa apenas para o fatores genótipo (p<0,05) e regime hídrico) (p<0,001)

(Tabela 6). No tratamento não-alagado e alagado, R/PA foi maior no genótipo TSH-

774 (Figura 30). Não houve resposta significativa (p<0,05) de R/PA com o aumento

do nível de sombreamento nas plantas alagadas e não alagadas. Entretanto, o

genótipo TSH-774 apresentou tendência de maior acréscimo de R/PA com o

aumento dos níveis de sombreamento.

Figura 30. Razão raiz/parte aérea (R/PA) em genótipos clonais de cacau


alagamento do solo por um período de 85 dias. (●) TSA -792 – não-

alagado (y = 0,32 - 0,003NS – 2,965NS²/ R²= 0,92); (○) TSA-792 –

alagado (y = 0,20 - 0,0002NS + 3,19NS²/ R²= 0,50); (▼) TSH-774 –

não-alagado (y = 0,33 - 0,0011NS + 7,74NS²/ R²= 0,35); (∆) TSH-774-

alagado (y = 0,21 + 0,0021NS - 2,30NS² / R²= 0,43).

67

4.8. Teor de carboidratos

De acordo com a análise de variância (Tabela 7), os fatores nível de

sombreamento, regime hídrico, órgão (raiz, caule e folha) e a interação entre nível

de sombreamento x regime hídrico foram significativos (p<0,05) para o teor de

açúcares solúveis totais (AST) em plantas submetidas ao sombreamento e ao

alagamento do solo. Entretanto, para o teor de amido, houve diferenças

intergenotípicas significativas (p<0,05) em relação ao regime hídrico e órgão e à

interação entre nível de sombreamento e regime hídrico (p<0,05).


de sombreamento (NS), regime hídrico (RH), órgão e das interações

NSxRH, RHxÓrgão, NSxRHxÓrgão e GxNSxRHxÓrgão no teor de

carboidratos. AST= açúcares solúveis totais (*) p<0,05; (**) p<0,01; (***)

p<0,001; (NS) não significativo.

Fator AST Amido

G 0,4886 NS 0,0403 *

NS 0,0018 ** 0,2128 NS

RH 0,0000 *** 0,0000 ***

Órgão 0,0000 *** 0,0000 ***

NS x RH 0,0019 ** 0,2603 NS

RH x Órgão 0,0835 NS 0,0000 ***

NS x RH x Órgão 0,8178 NS 0,0753 NS

G x NS x RH x Órgão 0,6418 NS 0,8104 NS

Carboidrato (mg g-1)

68

4.8.1. Açúcares solúveis totais

Nas raízes dos genótipos clonais de cacau avaliados, houve decréscimo no

teor de AST com os tratamentos de sombreamento e alagado (Figura 31). Por

apresentar teor AST de 50% maior no tratamento T0, a redução nas plantas não

alagadas do genótipo TSA-792 foi mais expressiva do que no genótipo TSH-774. O

tratamento alagado promoveu o aumento linear de AST nas raízes de clones TSA-

792 com o aumento do sombreamento. Esse aumento correspondeu a 75% quando

comparado aos tratamentos T0 e T75. Já para o genótipo TSH-774, não houve

variação do teor de AST em raízes de plantas sombreadas, com uma média de 60

mg g-1 de matéria seca.

Figura 31. Teor de açúcares solúveis totais na raiz de genótipos clonais de cacau



alagado (y = 56,50 – 1,20NS + 0,012NS2/ R2= 0,99); (○) TSA-792 –

alagado (y = 43,5 + 0,39***NS / R2= 0,99); (▼) TSH-774 – não-alagado

(y = 44,77 – 0,47NS + 0,003 NS2/ R2= 0,60); (∆) TSH-774- alagado (y =

54,5 + 0,33 NS – 0,004 NS2/ R2= 0,83).

69

O teor de AST no caule foi reduzido drasticamente nas plantas não alagadas

submetidas aos tratamentos de sombreamento. Para o genótipo TSA-792, o teor de

AST correspondeu a 25% do observado no tratamento T0, ao passo que para o

genótipo TSH-774 foi de 50% (Figura 32). No tratamento alagado, houve tendência

de manutenção do teor de AST entre os níveis de sombreamento para o genótipo

TSH-774. Entretanto, para o genótipo TSA-792, verificou-se uma tendência de

redução no teor de AST no tratamento T75 de sombreamento.

Figura 32. Teor de açúcares solúveis totais no caule de plantas de genótipos

clonais de cacau submetidos ao sombreamento por quatro meses e ao

sombreamento + alagamento do solo por um período de 85 dias. (●)

TSA-792 – não-alagado (y = 74,93 e-0,02*(NS)/ R2= 0,96); (○) TSA-792 –

alagado (y = 78,25 + 0,81NS – 0,014NS2/ R2= 0,97); (▼) TSH-774 –

não-alagado (y = 48,85e- 0,013(NS)/ R2= 0,76); (∆) TSH-774- alagado (y =

75,03 + 0,243NS – 0,006NS2/ R2= 0,99).

70

Não houve diferenças significativas (p<0,05) entre o teor AST nas folhas dos

genótipos clonais avaliados no tratamento não-alagado (Figura 33). Observou-se,

para ambos os genótipos, no tratamento não-alagado, a tendência de AST diminuir

com o aumento do sombreamento. Observou-se uma redução no teor de AST entre

os níveis de sombreamento para o genótipo TSA-792 e de aumento para o genótipo

TSH-774.

Figura 33. Teor de açúcares solúveis totais em folhas de plantas de genótipos

clonais de cacau submetidos ao sombreamento por quatro meses e ao

sombreamento + alagamento do solo por um período de 85 dias. (●)

TSA-792 – não-alagado (y = 74,93 e-0,02*(NS)/ R2= 0,96); (○) TSA-792 –

alagado (y = 78,25 + 0,81NS – 0,014NS2/ R2= 0,97); (▼) TSH-774 –

não-alagado (y = 48,85e- 0,013(NS)/ R2= 0,76); (∆) TSH-774- alagado (y =

75,03 + 0,243NS – 0,006NS2/ R2= 0,83).

71

4.8.2. Amido

Não houve ajuste de modelos para os pontos referentes ao tratamento

alagado do genótipo clonal TSA-792 e para o tratamento não-alagado do TSH-774

(Figura 34). Foi observada tendência de redução no teor de amido no sistema

radicular com o aumento do nível de sombreamento para o genótipo TSA-792 não-

alagado e aumento para o TSH-774 alagado.

Figura 34. Teor de amido na raiz de genótipos clonais de cacau submetidos ao



– 0,0914NS + 0,0008 NS2/ R2= 0,95). (∆) TSH-774- alagado (y = 10,55

+ 0,125NS – 0,002 NS2/ R2= 0,95)

Os tratamentos de sombreamento não influenciaram significativamente

(p<0,05) o teor de amido no caule, tanto para o tratamento não-alagado quanto para

o alagado. Nas plantas não alagadas, houve diferenças intragenotípicas em relação

ao teor de amido no caule. Observou-se, para estas plantas, tendência de maior

72

acúmulo de amido no tratamento T75 de sombreamento (Figura 35). Os maiores

teores de amido foram verificados nas plantas alagadas submetidas aos tratamentos

T0, T25 e T50 de sombreamento, ao passo que no tratamento T75 os valores se

aproximaram ao das plantas não alagadas. Além disso, neste regime hídrico, o

comportamento foi inversamente proporcional aos tratamentos de sombreamento.

Para o genótipo TSA-792, o acúmulo de amido no caule das plantas alagadas do

tratamento T0 foi 140% maior em relação as plantas não alagadas, enquanto que

para o genótipo TSH-774 esse acúmulo foi de 85%.

Figura 35. Teor de amido no caule de plantas de genótipos clonais de cacau



alagado (y = 55,30 – 1,40 NS + 0,0165 NS2/ R2= 0,80); (○) TSA-792 –

alagado (y = 128,70e-0,0055*(NS)/ R2= 0,93); (▼) TSH-774 – não-alagado

(y = 46,00 – 0,796 NS + 0,0094 NS2/ R2= 0,96); (∆) TSH-774- alagado

(y = 91,08 + 1,06 NS – 0,018 NS2/ R2= 0,65).

73

Não houve variação do teor de amido nas folhas das plantas de ambos os

genótipos clonais submetidos aos tratamentos de sombra e alagamento do solo, a

exceção do tratamento T75, onde se observou um aumento do teor de amido nas

folhas das plantas alagadas e uma redução na folhas das plantas não alagadas

(Figura 36).

Figura 36. Teor de amido nas folhas de plantas de genótipos clonais de cacau



alagado (y = 15,25 + 0,0561 NS – 0,016 NS2/ R2= 0,70); (○) TSA-792 –

alagado (12,36 – 0,21 NS + 0,0033 NS2/ R2= 0,90); (▼) TSH-774 –

não-alagado (y = 15,09 – 0,094 NS + 0,0007 NS2/ R2= 0,85); (∆) TSH-

774- alagado (y = 16,77 – 0,053 NS + 0,0013 NS2/ R2= 0,40).

74

4.9. Expressão gênica da aquaporina PIP1;3

No presente estudo, a técnica de PCR em tempo real quantitativa foi utilizada

para determinar o perfil da expressão gênica da proteína integral da membrana

plasmática PIP1;3 em plantas de ambos os genótipos clonais de cacau submetidos

a dois regimes hídricos, não-alagado e alagado, e a quatro níveis de irradiância (T0,

T25, T50 e T75). As amostras coletadas no tratamento T0 foram utilizadas como

calibradoras, para resultados comparativos, já que não receberam tratamentos de

sombreamento no interior da casa de vegetação. Houve variações intergenotípicas

em relação ao perfil da expressão do gene PIP1;3 em nível foliar (Figura 37).

Observou-se, nas plantas não-alagadas dos genótipos clonais TSA 792 e TSH-774,

uma repressão da expressão gênica de PIP1;3 nos níveis T25, T50 e T75 em

comparação ao tratamento T0. Nesse caso, o gene PIP1;3 sofreu maior repressão

nas plantas pertencentes ao genótipo TSA-792. Diferenças intergenotípicas na

abundância de transcritos foram evidenciadas também nas plantas alagadas e

submetidas aos diferentes níveis de sombreamento. O tratamento alagado induziu a

expressão gênica da aquaporina PIP1;3 somente nas plantas do genótipo TSA-792,

ao contrário do genótipo TSH-774, cuja expressão deste gene foi reprimida em

maior intensidade, quando comparada a expressão no tratamento não-alagado.

75

Figura 37 . Perfil da expressão do gene PIP1;3 em folhas de plantas de dois

genótipos clonais de T. cacao crescidas em quatro níveis de

sombreamento (T0, T25, T50 e T75) por um período de quatro meses e

submetidas ao alagamento por 24 h. ( ) TSA-792 não-alagado; ( )

TSA-792 alagado; ( ) TSH-774 não-alagado; ( ) TSH-774 alagado.

Os valores expressos são relativos ao tratamento não-alagado no interior

da casa de vegetação (T0). Colunas representam os valores médios ±

erro padrão de três réplicas biológicas.

76

5. DISCUSSÃO

5.1. Parâmetros fisiológicos

A resposta específica de plantas ao alagamento varia com muitos fatores

incluindo espécie, genótipo, idade e condição da planta, qualidade da água e

duração do período de alagamento (KOZLOWSKI, 1984; KRAMER; KOZLOWSKI,

1979). Como o alagamento elimina o O2 presente no solo, a absorção do mesmo é

favorecida pela produção de lenticelas hipertrofiadas na base do caule. Assim, as

lenticelas observadas nas mudas dos genótipos de cacaueiro avaliados neste

experimento (Figura 4) poderiam ser interpretadas como uma adaptação para

aumentar o transporte de O2 dos tecidos da parte aérea para as raízes. Ferreira et al

(2001), avaliando o crescimento inicial de Piptadenia gonoacantha sob inundação

em diferentes níveis de luz, observaram a protusão de lenticelas desde o primeiro

dia de avaliação. Ainda, compostos potencialmente tóxicos associados com a

anaerobiose (acetaldeído, etanol e etileno) são liberados das plantas pelas lenticelas

(CHIRKOVA; GUTMAN 1972). De acordo com Lobo e Joly (1998), a produção de

lenticelas em plantas inundadas nem sempre tem valor adaptativo, podendo ser

resultantes de alterações hormonais. Mielke et al (2005a, 2003), avaliando as

respostas de Annona glabra e Genipa Americana ao alagamento do solo, relataram

para as duas espécies a presença de lenticelas, leve clorose foliar e ausência de

necrose e senescência foliar.

A condutância estomática (gs) é diretamente proporcional à abertura do poro

estomático. A maior abertura que pode ocorrer no poro estomático, a qual depende

do formato e das propriedades da parede celular, determina o limite máximo da taxa

de entrada de gás (LARCHER, 2000). O decréscimo de gs em folhas de plantas

77

arbóreas tolerantes ou não-tolerantes é uma resposta comum ao alagamento do

solo e está, na maioria dos casos, ligado ao fechamento estomático ocasionado pela

diminuição da difusão de CO2 (KOZLOWSKI, 1997, KOZLOWSKI et al., 2002,

CARVALHO; ISHIDA et al., 2002; OLIVEIRA, 2007). Tanto o genótipo TSA-792

quanto o TSH-774 apresentaram valores de gs variando de 0,020 a 0,120 µmol m-2

s-1 (Figura 5). Estes valores estão de acordo com Nobel (1991), que afirmou que

plantas lenhosas comumente apresentam valores de gs nesta mesma faixa, quando

os estômatos encontram-se abertos.

Bertolde et al. (2010), avaliando os mesmos genótipos, encontraram valores

de 0,08 µmol m-2 s-1 para plantas não alagadas do genótipo TSA-792 e de 0,05 µmol

m-2 s-1 após 45 dias de alagamento. Já para o genótipo TSH-774 os valores de gs

foram 0,06 e 0,02 µmol m-2 s-1, nas plantas não alagadas e alagadas,

respectivamente. Segundo estes autores, os genótipos apresentaram respostas que

permitiram a caracterização de ambos como tolerante (TSA-792) e suscetível (TSH-

774) ao alagamento do solo. Sena Gomes e Kozlowski (1986), avaliando os efeitos

do alagamento do substrato nas relações hídricas e no crescimento de plântulas de

cacau da variedade Catongo relataram que o fechamento dos estômatos foi iniciado

duas horas após a aplicação do tratamento de alagamento. Parolin (2001) e Lopez e

Kursar (2003) demonstraram redução em gs, quando as plantas de floresta

sazonalmente inundada foram submetidas ao alagamento. Entretanto, os valores de

gs em plântulas de Annona glabra, submetidas ao alagamento do solo, foram

reduzidos no quarto dia, mas retornou aos valores controle no 11º, 18º e 56º dia

após a aplicação do tratamento (MIELKE et al., 2003).

A redução acentuada de gs para as plantas alagadas do genótipo TSH-774

(Figura 5B) afetou a assimilação de CO2 nos tratamentos a pleno sol, mas sob

sombreamento os valores de A mantiveram-se elevados. Nesse caso, sugere-se que

sob condições de alagamento, o genótipo TSH-774 parece aclimatar-se sob baixa

incidência de luz, porém, sob alta intensidade de radiação luminosa, a luz torna-se

uma fator de redução da atividade fotossintética. De acordo com DaMatta (2004), a

menor eficiência de assimilação de carbono a pleno sol deve-se principalmente ao

fechamento estomático.

De acordo com Lenssen et al. (1999), há uma hierarquia de efeitos

ambientais, ou seja, qual fator deve ser considerado primeiro como o de maior

78

influência nas respostas das plantas aos efeitos ambientais. Assim, espécies

tolerantes podem ser afetadas independentemente por ambos os fatores, mas, para

espécies intolerantes ao alagamento, os efeitos do sombreamento podem ser

reduzidos porque o alagamento é o fator dominante (LENSSEN et al., 1999).

O melhor desempenho das plantas alagadas do genótipo TSA-792 sob altas

irradiâncias (Figura 5A) deveu-se possivelmente ao aumento da produção de

Rubisco e, ou da capacidade de regeneração de RuBP (ribulose-1,5 bisfosfato –

substrato para a carboxilação) (Long e Hällgren, 1993), a alta atividade de enzimas

fotossintéticas e ao transporte de fotoassimilados mais eficiente do que o genótipo

TSH-774. Entretanto, análises da atividade enzimática e quantificação do teor de

Rubisco nas folhas seriam necessárias para sustentar essa afirmação.

A taxa de assimilação de CO2 nas plantas não alagadas (Figura 6) não foi

influenciada pelo regime de irradiância e só foram observadas variações com o

tempo de exposição aos tratamentos de sombra. Este fato deveu-se à idade

fisiológica das folhas já que pouco ou nenhum lançamento foliar foi observado nas

plantas submetidas aos tratamentos de sombreamento. Quando as folhas crescem,

sua capacidade para fotossintetizar aumenta até elas atingirem a maturidade, a

partir de então, a taxa de assimilação de CO2 começa a decrescer. Yamaguchi e

Friend (1979), trabalhando com plantas de Coffea arabica, demonstraram que as

taxas fotossintéticas são baixas nas folhas em início de expansão (par +1),

alcançam valores máximos nas folhas recém expandidas (par +2) e decrescem

tornando-se constantes com a idade nas folhas fisiologicamente maduras (par+3,

par +4).

Vários estudos demonstram que o alagamento do solo é capaz de diminuir,

de forma significativa, a capacidade fotossintética das plantas sensíveis ao estresse.

Espécies que são sensíveis ao alagamento frequentemente exibem reduções

severas em A e gs (PEZESHKI, 1993; GRAVATT; KIRBY, 1998), sendo estas

variáveis úteis na determinação do grau de tolerância das plantas ao alagamento do

solo (GRAVATT; KIRBY, 1998). De acordo com Pezeshki (1993), um indicador da

tolerância ao alagamento é a inibição inicial das trocas gasosas seguida por uma

recuperação. Bertolde et al. (2010) encontraram valores similares de taxa de

assimilação de CO2 em genótipos de TSA-792 e TSH-774 submetidos ao

alagamento do substrato.

79

A transpiração foliar (E) tem sido pouco estudada em experimentos de

alagamento do solo. Quando E excede a capacidade de reposição da água perdida,

devido a absorção radicular deficiente em condições de alagamento, os estômatos

se fecham parcial ou totalmente com consequente redução em gs. Com essa

restrição às trocas gasosas foliares, a atividade do sistema fotossintético torna-se

reduzida e a taxa de assimilação de CO2 diminui (JACKSON, 2002). Os resultados

do presente trabalho mostram que os efeitos do alagamento causaram redução da

taxa de transpiração tanto para o genótipo TSA-792 (Figura 7A) quanto para o

genótipo TSH-774 (Figura 7B), acompanhada pela diminuição de gs e A, indicando a

existência de mecanismos de adaptação no sentido de diminuir as perdas de água.

Resultados semelhantes foram observados por Rehem et al. (2009) e Bertolde et al.

(2010).

As plantas alagadas do genótipo TSA-792 sobressaíram-se em relação à

eficiência intrínseca do uso da água (A/gs, Figura 8A), quando comparado com as

plantas alagadas do genótipo TSH-774 (Figura8B). A diminuição de gs foi

proporcional ao decréscimo de A, mantendo constante a razão A/gs. Nessas

circunstâncias, o genótipo TSA-792 mostra-se mais tolerante ao estresse, por meio

da economia de água durante as trocas gasosas. As plantas alagadas do genótipo

TSH-774 reduziram a A/gs em relação ao nível de sombreamento e período de

alagamento, devido ao decréscimo mais acentuado de A em relação a gs. A forma

como A relaciona-se com gs tem importância ecológica, pois, se A e gs variam

proporcionalmente, é possível que a concentração interna de CO2 (Ci) no mesofilo

foliar e as eficiências intrínsecas (A/E) e instantâneas (A/gs) do uso de água se

mantenham constantes, no sentido de otimização das trocas gasosas (SCHULZE;

HALL, 1982). A razão A/E, um parâmetro fisiológico capaz de auxiliar a

compreensão das relações hídricas, expressa quantitativamente o comportamento

momentâneo das trocas gasosas em nível floliar (LARCHER, 2000). Segundo Ito

(1978), o aumento de A/E, produzido pela queda de gs e E, é devido à manutenção

da taxa fotossintética das plantas, mesmo com o fechamento parcial dos estômatos.

Os dados de trocas gasosas foliares do presente estudo confirmam os

encontrados por Bertolde et al. (2010) que concluíram que, mesmo apresentando

alterações no comportamento fisiológico, o genótipo TSA-792 apresentou maior

tolerância ao alagamento do que o genótipo TSH-774.

80

A determinação dos teores de clorofila em folhas é extremamente importante,

pois a atividade fotossintética da planta depende da capacidade da folha para

absorver luz (MARENCO; LOPES, 2005). Embora o alagamento cause redução no

teor de clorofila, devido à degradação e, ou decréscimo da sua síntese, as plantas

alagadas dos dois genótipos clonais de cacau avaliados, submetidas ao nível mais

alto de sombreamento, apresentaram teor de clorofila a equivalente ao das plantas

não alagadas a pleno sol (Figura 13). O fato de as plantas, mantidas em tratamentos

mais sombreados, apresentarem maiores teores de clorofilas está relacionado ao

efeito compensatório da espécie, quando submetidas à baixa intensidade de luz

(ALMEIDA et al., 2004) Outros autores sugerem, além disso, redução na sua síntese

em conseqüência do acúmulo de etileno (SENA GOMES; KOZLOWSKI, 1988).

A clorofila b é um dos pigmentos acessórios sintetizado por meio da oxidação

do grupo metil da clorofila a para um grupo aldeído (STREIT et al., 2005). Segundo

Vieira (1996), o estresse provocado na planta pela luz é freqüente sob condições

tropicais, e a concentração de clorofilas e carotenóides são indicadores da

suscetibilidade da planta à variação da intensidade da luz. Nas plantas não-alagadas

Figura 14A), o genótipo TSH-774 tendeu apresentar concentrações de clorofila a e

b maiores do que o genótipo TSA-792 nos tratamentos T25, T50 e T75. Sugere-se

que o genótipo TSH-774 seja mais tolerante à sombra do que o genótipo TSA-792.

Kramer e Kozlowiski (1979) afirmaram que folhas de sombra apresentam uma maior

concentração de clorofilas do que as folhas de sol. Esses resultados estão de

acordo com Rêgo e Possamai (2006), que observaram que níveis de sombreamento

elevado proporcionaram maiores teores de clorofila a e b em jequitibá-rosa; e com

Carvalho (1996), que encontrou maior teor de clorofila b nos níveis mais altos de

sombreamento para as espécies Cabralea canjarana e Centrolobium robustum. O

aumento da clorofila pode ser associado também a uma maior quantidade de grana

em cloroplastos de folhas de sombra em relação às folhas de sol (MEBRAHTU;

HAVOVER, 1991).

A combinação das clorofilas (a + b) e dos pigmentos acessórios, como os

carotenóides, capacita as plantas a captarem a maior parte de energia disponível da

luz solar (MARTINAZZO et al., 2007). Embora o genótipo TSH-774 apresente maior

acúmulo de clorofila total e de carotenóides, sob condições normais de irrigação

(Figura 15A), o genótipo TSA-792 apresentou maior acúmulo de clorofila total e

81

carotenóides nas plantas alagadas do tratamento T0 e T25 (Figura 15B e 16B).

Esses resultados esclarecem, em parte, a maior eficiência fotossintética deste

genótipo (Figura 6A). De acordo com Engel e Poggiani (1991) e Atroch et al.,(2001),

as clorofilas são um dos fatores ligados à eficiência fotossintética de plantas, ao

crescimento e a adaptabilidade a diversos ambientes.

Em geral, o alagamento do solo reduziu o teor de clorofila a,e b e total nos

dois genótipos estudados. Pezeshki et al. (1996) também observaram resultados

semelhantes ao estudarem espécies arbóreas em condição de solo alagado. Em

plântulas de Eryithrina variegata, a diminuição no conteúdo de clorofilas também foi

detectada por Muthuchelian et al (1995), após 10 dias de inundação.

Freqüentemente é observado que a razão clorofila a/b tende a diminuir com o

aumento do nível de sombreamento, devido uma maior proporção de clorofila b em

ambientes sombreados. Este fato ocorre devido à lenta degradação da clorofila b em

plantas de sombra, em relação à clorofila a (ENGEL; POGGIANI, 1991). Nos

resultados obtidos no presente trabalho, essa maior razão clorofila a/b não foi

observada (Figura 17), já que a contribuição da clorofila b foi menor. Estes

resultados estão de acordo com Martinazzo et al. (2007), que demonstraram que os

níveis de sombreamento não afetaram, significamente, a relação clorofila a/b em

mudas de Eugenia uniflora. As plantas não alagadas, em todos os níveis de

sombreamento, apresentaram razões clorofila a/b em torno de 5 ug cm2 e plantas

alagadas de 3,5 a 4,5 ug cm2 com o aumento do nível de sombreamento. Conforme

Seybold e Egle (1970), plantas expostas a elevadas intensidades de luz apresentam

razões clorofila a/b em torno de 3,2 a 4,0 ug cm-2 e plantas crescendo em ambientes

com baixa irradiância possuem razões a/b em torno de 2,5 a 2,9 ug cm-2.

Uma característica comum em plantas submetidas a estresses abióticos é o

aumento da permeabilidade da membrana, expresso pelo aumento na liberação de

íons ou extravasamento de eletrólitos. Alguns trabalhos evidenciaram a utilidade

desta variável, junto com parâmetros fisiológicos, na avaliação das respostas de

espécies vegetais ao estresse e na distinção entre genótipos tolerantes e sensíveis

a um determinado estresse abiótico (BRITO et al., 2009; KARLIDAG, 2009; MARTIN

et al., 1987). Os resultados apresentados neste estudo mostram a suscetibilidade do

genótipo TSH-774 à alta irradiância quando em condições de alagamento (Figura

18). Esse fato pode ser atribuído à indução de respostas ao estresse oxidativo,

82

levando à peroxidação lipídica, permeabilização da membrana e morte celular

(SCANDALIOS, 1993).

O registro da fluorescência em folhas intactas (fluorescência da clorofila in

vivo), especialmente durante a fase de indução pela exposição à radiação após uma

fase de escuro (efeito Kautsky), permite avaliar o estado do fotossistema para a

síntese de ATP, ou seja, avaliar a adaptação à radiação e detecção das mudanças

do aparato fotossintético durante o desenvolvimento da planta ou durante o estresse

(LARCHER, 2005; STRANT; ÖQUIST, 1988; BAKER, 2008).

O valor Fo representa a emissão de luz pelas moléculas de clorofilas a do

complexo antena, antes dos elétrons terem migrado para o centro de reação do

fotossistema 2 (PS2) (MATHIS; PAILLOTIN, 1981) e é um valor referência na

determinação das outras variáveis de fluorescência (HIPKINS; BAKER, 1986).

Segundo Bolhàr-Nordenkampf et al. (1989), o valor de Fo nem sempre é uma

constante e, geralmente, aumenta por dois motivos: os centros de reação de PS2

está comprometido ou a transferência da energia de excitação do complexo antena

para os centros de reação está prejudicada. De acordo com os resultados obtidos

neste experimento, o aumento nos valores de Fo para as plantas alagadas de

ambos os genótipos (Figura 10) pode ter sido causado por alterações estruturais nos

pigmentos fotossintéticos, já que diferenças foram observadas entre plantas não

alagadas e alagadas, quanto ao teor de pigmentos (Figuras 13, 14, 15, 16 e 17).

Estes resultados estão de acordo com Bertolde et al. (2010).

A partir de Fo, a emissão de fluorescência continua a crescer até alcançar a

fluorescência máxima, significando que as moléculas de plastoquinona a receberam

os elétrons do PS 2 e reduziram-se (MATHIS; PAILLOTIN, 1981). Assim, a

fluorescência máxima representa o nível de fluorescência quando toda a quinona

(Qa) é reduzida (BAKER, 2008).

O rendimento quântico potencial máximo (Fv/Fm) (Fm-Fo/Fm) indica a

eficiência máxima na qual a luz absorvida pelo PS 2 é utilizada para a redução da

quinona (BAKER, 2008) e permite, avaliar o rendimento do fotossistema de PS2

após a adaptação ao escuro. A invariabilidade de Fv/Fm nas plantas do genótipo

TSA-792 (Figura 12A), com o período de alagamento, demonstra que a eficiência

fotossintética de PS2 não foi prejudicada e pode ser considerado um indicativo da

resistência deste genótipo à condição de alagamento. Maurenza et al. (2009),

83

avaliando plântulas de Pouteria glomerata (Sapotaceae) parcialmente inundadas,

encontraram valores de Fv/Fm variando entre 0,78 e 0,80 para os tratamentos

alagado e não-alagado, respectivamente, considerando-as com ausência de danos

em PS2. Tais valores foram similares aos encontrados neste trabalho e aqueles

encontrados por Bertolde et al (2010). Valores inferiores a 0,75 indicam situação de

estresse e, portanto, redução do potencial fotossintético da planta (MAXWELL;

JOHNSON, 2000). De acordo com Schreiber et al. (1998), na prática, a razão entre a

fluorescência máxima (Fm) [toda quinona (Qa) reduzida] e a fluorescência mínima

(Fo) (toda Qa oxidada) é aproximadamente 5 a 6 em tecidos fotossintetizantes

saudáveis e adaptados ao escuro.

Os diferentes tratamentos induziram a alocação diferenciada de biomassa nos

diferentes órgãos das plantas de ambos os genótipos clonais. Essas diferenças nos

padrões de biomassa podem ser um fator considerado importante na interpretação

da capacidade adaptativa de cada genótipo ao sombreamento e ao alagamento do

solo. Um maior investimento no crescimento em altura em ambientes sombreados é

uma resposta comum, relatada em vários trabalhos (CANCIAN; CORDEIRO 1998,

POORTER 1999, FERRER; DILLENBURG 2000, JURADO et al., 2006). De acordo

com Ryser e Eek (2000), o aumento no crescimento em altura pode ser vantajoso

como resposta ao sombreamento em curto prazo. No presente estudo, o

crescimento em altura dos genótipos clonais avaliados foi reduzido em condições de

baixa irradiância (Figura 19). Essa resposta poderia ser interpretada como uma

conservação dos recursos por parte da planta, já que um rápido crescimento em

altura estaria associado principalmente a plantas não tolerantes ao sombreamento

(MORGAN; SMITH 1979, BROKAW 1987). Carelli e Fahl (2000) observaram menor

crescimento em altura em mudas de Coffea arabica com excesso de sombreamento

(70% de sombreamento) e não detectaram diferenças significativas entre as plantas

a pleno sol e a 50 % de sombreamento. Pedroso e Varela (1995) e Barbosa (1990)

não encontraram diferenças significativas em crescimento em altura ao testarem

diferentes níveis de sombreamento em mudas de Ceiba pentandra e Jacaranda

copaia, respectivamente.

A redução no crescimento em altura nas plantas alagadas e sombreadas

(Figura 19) poderia ser explicada pelo menor transporte e distribuição de nutrientes

minerais nas plantas (REHEM et al., 2009) e pelo decréscimo na produção de

84

fotoassimilados, evidenciado pela baixa taxa fotossintética liquida apresentadas pelo

genótipo clonal TSH-774 crescido nessa condição. Em solos alagados o crescimento

caulinar pode ser auxiliado pela ação das raízes adventícias que, durante sua

atividade, facilitam a captação de nutrientes. Contudo, não foi relatada presença de

raízes adventícias nos genótipos avaliados. Bertolde et al. (2010) relataram

presença de quantidade média e baixa de raízes adventícias para os genótipos TSA-

792 e TSH-774, respectivamente, submetidos ao alagamento do substrato.

Decréscimo no diâmetro do coleto em plantas não alagadas sob diferentes

níveis de sombreamento foi relatado por Almeida et al. (2005) em mudas de Acacia

mangium submetidas a três condições de sombreamento (pleno sol, 30% e 50%).

Fonseca et al. (2002) observaram que ocorreu decréscimo linear do diâmetro do

coleto em função do aumento do período de permanência sob sombreamento. De

acordo com Fonseca et al. (2002), a redução no diâmetro do coleto é um fator

desfavorável, pois implica na redução da biomassa seca do sistema radicular. Engel

et al. (1991) também relataram que mudas produzidas à pleno sol são mais

adequadas, pois apresentam maior diâmetro do coleto e, provavelmente, um

sistema radicular melhor desenvolvido. No caso de ambos os genótipos clonais

avaliados, a comparação deste parâmetro entre os diferentes níveis de irradiância

testados permite inferir que o sombreamento acentuado (T75) inibiu o crescimento

da planta como um todo (Figura 19), ao passo que o crescimento em altura e em

diâmetro foram favorecidos nos tratamentos T0 e T25 de sombreamento. Em

condições de anoxia, as alterações no diâmetro do coleto estão associadas à

hipertrofia da base do caule e à formação de aerênquima (MIELKE et al., 2005 b).

Apesar da ausência de interação entre níveis de sombreamento e regimes

hídricos, os efeitos do sombreamento e do alagamento foram evidentes, em relação

ao no número de folhas, para os genótipos clonais TSA-792 e TSH-774 (Figura 20).

Nesse caso, o sombreamento acentuado (T75) reduziu o número de folhas em 40%

e o alagamento do solo em 60% em ambos os genótipos clonais avaliados. Nos

tratamentos mais sombreados, os genótipos avaliados não produziram novas folhas,

mas as manteve desde o início do experimento em bom estado fisiológico. Em

contrapartida, o maior número de folhas observadas no tratamento não-alagado

proporcionou uma maior produção de fotoassimilados e partição de biomassa entre

os órgãos vegetativos, favorecendo o seu crescimento e desenvolvimento, exemplo

85

do maior crescimento em altura (Figura 19), diâmetro do coleto (Figura 19) e

produção de biomassa seca total (Figura 24). Ferreira et al. (2001), avaliando o

crescimento de mudas de Piptadenia gonoacantha, submetidas ao alagamento, em

três níveis de irradiância (40%, 70% e 100%) relataram que houve uma redução de

45% no número de folhas nas plantas alagadas, e que não houve interação

significativa entre nível de sombreamento e regime hídrico. Campos e Uchida

(2002), trabalhando com uma espécie nativa da Amazônia (Jacarandá copaia),

encontraram maior número de folhas em ambiente sob 30% de sombreamento.

O decréscimo da biomassa seca de raiz, em função dos tratamentos de

sombreamento nas plantas não alagadas (Figura 21), revela a existência de uma

estreita relação entre a disponibilidade de radiação luminosa e a aquisição de

biomassa pela planta. Os menores valores de BSR observados em plantas mais

sombreadas está relacionado aos menores comprimentos e densidades das raízes

(Lei e Lechowicz, 1998). Segundo Claussen (1996) plantas que recebem altos níveis

de irradiância investem mais em raízes. Assim, por terem uma maior demanda

evapotranspiratória, um maior investimento no crescimento do sistema radicular

assume maior importância nas plantas sob altas irradiâncias do que nas

sombreadas. Nas plantas submetidas ao tratamento alagado, a redução observada

na biomassa seca da raiz (65%) deveu-se à decomposição causada por atividade

fúngica e à susceptibilidade do sistema radicular aos microorganismos presentes em

solos alagados (KOZLOWSKI, 1997). Esses resultados estão de acordo com Mielke

et al. (2003), que observaram uma redução de 49,7% na biomassa da raiz em

plantas de Genipa americana sob estresse por alagamento.

O acúmulo de biomassa seca no caule foi favorecido pelos tratamentos sem

sombreamento (Figura 22). Campos e Uchida (2002) relataram que o nível de 30%

de sombreamento promoveu maiores índices de biomassa seca no caule em mudas

de Ochroma lagopus, enquanto que a do sistema radicular foi reduzida em 50% e

70% de sombreamento. Silva et al. (2007) avaliando plantas de Theobroma

grandiflorum em três níveis de sombreamento (0%, 50% e sombra natural) observou

maior investimento em biomassa seca do caule nas plantas que estavam na

condição de 50% de sombreamento.

O maior acúmulo de biomassa seca em folhas observada no tratamento T0,

com maior nível de irradiância (Figura 23), para ambos os genótipos clonais

86

avaliados, se deveu, em grande parte, ao maior número e espessura das folhas

associado a altas taxas fotossintéticas. Segundo Scalon et al. (2001), o aumento da

espessura do limbo foliar, em condições de alta irradiância, é um dos recursos

utilizados pelas plantas como proteção dos pigmentos fotossintéticos. Almeida et al.

(2005) ao avaliarem o crescimento de Acacia mangium a pleno sol, 30 e 70% de

sombreamento, também verificaram que o acúmulo de biomassa foliar foi

proporcional ao aumento da irradiância. Por outro lado, redução da biomassa seca

foliar no tratamento alagado, principalmente para o genótipo clonal TSH 774, se

deveu principalmente à redução nos lançamentos foliares, além de clorose seguida

de abscisão das folhas.

O decréscimo na área foliar total com o aumento do nível de sombreamento

observado no presente estudo (Figura 26) não está de acordo com o que é

normalmente observado. Segundo Scalon et al. (2001) e Campos e Uchida (2002),

ao avaliarem as respostas das plantas ao sombreamento, há uma necessidade de

ampliação da superfície fotossintetizante para maximizar a captação da baixa

radiação disponível. Kluge (1998) verificou redução da área foliar em Passiflora sp.

sob reduzida intensidade de luz. Entretanto, Santos (2005) observou que a área

foliar foi dez vezes maior em plantas de Cedrela fissilis submetidas à pleno sol. No

tratamento alagado, a diferença na área foliar total, em relação ao tratamento não-

alagado, indica que a produção de folhas novas bem como a expansão de folhas já

existentes são afetadas negativamente pelo alagamento (KOZLOWSKI et al., 1991;

KOZLOWSKI; PALLARDY 1997).

A área foliar específica é um parâmetro que relaciona a área foliar individual e

a biomassa seca da folha (DIAS-FILHO, 1997), ou seja, é a área foliar por unidade

de massa da foliar (KITAJIMA, 1996). Embora não tenha havido diferenças

intergenotípicas entre as plantas não alagadas (Figura 27), houve aumento da área

foliar específica à medida que se reduziu a irradiância disponível. Tal incremento da

área foliar específica é uma resposta comum observadas em plantas sob baixas

irradiâncias (FAHL et al., 1994; STONEMAN; DELL, 1993), pois, é reflexo de

modificações nas dimensões e formas das folhas que tornam-se maiores e mais

delgadas do que folhas produzidas sob altas intensidades de luz. Por outro lado, sob

anoxia, o aumento na área foliar específica, em ambos os genótipos clonais

87

avaliados, demonstra que o cacau tende a reter mais fotoassimilados nas folhas em

situação de estresse.

A razão de área foliar (RAF) (área foliar total/biomassa seca total) é a área

foliar, em cm2, utilizada pela planta para produzir 1 g de biomassa seca

(BENINCASA, 1988). Desse modo, plantas com sombreamento mais intenso tendem

a possuir maior RAF, pois necessitam de maior área foliar para interceptação da

radiação total incidente. A tendência ao aumento de RAF em plantas não alagadas e

mais sombreadas (Figura 28) está de acordo com Kitajima (1996), que verificou que

plantas arbóreas tropicais apresentavam baixo investimento em raízes e elevada

RAF. Os genótipos TSA-792 e TSH-774 apresentaram, no tratamento alagado,

valores de RAF mais baixos em comparação com o tratamento não-alagado. Rehem

et al. (2009), avaliando o efeito do alagamento do substrato no crescimento de

genótipos clonais de cacau, verificaram que os clones CCN-10 e CP-49, tolerantes

ao alagamento, caracterizaram-se por apresentar baixos valores de RAF,

favorecendo a obtenção de altas taxas fotossintéticas.

A razão de massa foliar (RMF) é a razão entre a biomassa seca acumulada

nas folhas e a biomassa seca acumulada na planta toda. Como as folhas (fonte)

produzem biomassa seca a partir da fotossíntese e que os demais órgãos (drenos)

dependem da exportação de fotoassimilados, quanto maior o valor de RMF maior é

a quantidade de material não exportado. No presente trabalho, verificaram-se

diferenças em RMF apenas entre os genótipos e o regime hídrico (Figura 29). No

tratamento não-alagado, o genótipo TSA-792 acumulou mais biomassa seca foliar

do que o genótipo TSH-774, e no alagado essa diferença foi observada somente nos

tratamentos de sombreamento T25 e T50. No tratamento alagado, as plantas dos

genótipos clonais avaliados apresentaram menor RMF em relação as não alagadas,

indicando que mais biomassa seca foi distribuída para raízes e caules do que para

os órgãos fotossintéticos. Esse fato pode ser confirmado na Figura 25 que

demonstra a proporção de biomassa seca total que foi alocada para a raiz, o caule e

folha.

Segundo o mecanismo de alocação de biomassa raiz/parte aérea, sugerido

por Brouwer (1983), as plantas direcionam a biomassa para a parte aérea, se a

assimilação de carbono é limitada por luz e CO2, ou para as raízes se os recursos

limitantes são nutrientes minerais e água. Por isso, espera-se que sob altas

88

irradiâncias a alocação de biomassa para as folhas decresça e aumente para as

raízes, devido à maior demanda evapotranspiratória, sendo o inverso para baixas

irradiâncias. Esse modelo de alocação não se aplica ao observado no presente

estudo, já que, de acordo com a ANOVA (Tabela 7), não houve influência dos

tratamentos de sombreamento na razão raiz/parte aérea.

Plantas alagadas do genótipo clonal TSH-774 apresentaram uma tendência

de acréscimo na razão raiz/parte aérea, enquanto que para o genótipo TSA-792

essa razão se manteve constante (Figura 30). Esse resultado indica que o

crescimento da parte aérea, para o genótipo TSH-774, foi reduzido em relação a

raiz, ao passo que para o genótipo TSA-792 o balanço entre o crescimento de raiz e

parte aérea foi mantido constante. Segundo Kozlowski (1997) a raiz é o órgão mais

diretamente afetado pelo alagamento do solo, sendo, tipicamente, mais reduzido do

que a parte aérea. A supressão na formação e expansão das folhas deve ter

provocado a redução no crescimento da parte aérea em plantas do genótipo TSH-

774. Ferreira et al. (2001), avaliando plântulas de Piptadenia gonoacantha com cinco

meses de idade, submetidas a dois regimes hídricos (não-alagado e alagado) e três

níveis de irradiância, verificaram que plântulas alagadas apresentaram, aos 60 dias

de aplicação dos tratamentos, menor razão raiz/parte aérea.

A classificação das espécies em tolerantes ao alagamento deve ser baseada

na capacidade em manter ou aumentar a biomassa seca da parte aérea durante

períodos de alagamento, segundo critério sugerido por Lobo e Joly (1998). Nesse

caso, plantas alagadas do genótipo clonal TSH-774 mostraram-se pouco tolerantes

ao alagamento do solo, devido à redução da biomassa da parte aérea em relação ao

sistema radicular (Figura 30).

O acúmulo de carboidratos durante o crescimento é essencial para a

sobrevivência das plantas. O armazenamento de carboidratos é importante tanto

para o metabolismo, germinação da semente, sobrevivência e crescimento da

plântula quanto para defesa (KOZLOWSKI, 1992). A redução observada no teor de

AST nas plantas não alagadas, em função do sombreamento, para ambos os

genótipos coincidiu com a redução no crescimento em altura, indicando que os AST

não foram direcionados dos órgãos fonte para o crescimento em altura das plantas

como forma de evitar o sombreamento.

89

Uma proporção maior de AST ficou alocada nas folhas das plantas dos

genótipos clonais submetidos ao alagamento do solo (Figura 33). Segundo

Kozlowski (1997) e Pezeshki (1994), a translocação de açúcares solúveis das folhas

para as raízes é bastante afetada pelo alagamento do solo. Deste modo, os

açúcares solúveis produzidos na fotossíntese tendem a se acumular nas folhas, e

não são translocados para as raízes, onde são necessários para manter a via

glicolítica em funcionamento. Portanto, a maior disponibilidade de substrato

respiratório, como a glicose, pode ser determinante na sobrevivência dos tecidos

radiculares em ambientes alagados (CRAWFORD; BRAENDLE, 1996; DREW, 1997;

VARTAPETIAN; JACKSON, 1997). Os resultados correspondem aos encontrados

por Carvalho e Ishida (2002), que observaram maior acúmulo de AST na folha e

aumento em raízes de Bactris gasipaes submetidas ao alagamento do solo.

Nas raízes de plantas alagadas do genótipo clonal TSA-792, observaram-se

aumento do teor de AST (Figura 31) em função do nível de sombreamento e

manutenção do teor de amido (Figura 34). Porém, para o genótipo TSH-774 não

houve resposta em relação ao teor de AST, enquanto o teor de amido manteve-se

abaixo daquele observado para o genótipo TSA-792. Possivelmente, plantas do

genótipo TSA-792 sintetizam mais açúcares solúveis como forma de tolerância ao

estresse por alagamento, indicando uma eficiente atividade fotossintética mesmo

sob deficiência de O2 no sistema radicular. Segundo Menezes et al. (2006), o

aumento na concentração de açúcares é conseqüência da hidrólise do amido,

mecanismo pelo qual as plantas adquirem tolerância ao estresse hídrico.

Nas plantas não alagadas de ambos os genótipos clonais de T. cacao, com

ou sem sombreamento, o alto teor de amido no caule (Figura 35), em relação às

raízes e folhas (Figuras 35 e 37), sugerem que o caule parece ser o órgão de

estocagem de amido na planta. Em folhas de plantas alagadas destes genótipos, o

teor de amido foi muito baixo em relação ao caule e similar ao teor de amido nas

raízes. Segundo Liao e Lin (2001), um grande acúmulo de amido nas folhas de

plantas sob estresse abiótico poderia causar inibição da fotossíntese (feedback

inhibition). Entretanto, outros fatores como redução na condutância estomática e no

teor de clorofila total nas plantas alagadas pode ter contribuído para o decréscimo

na atividade fotossintética, observado nos dois genótipos clonais de cacau

avaliados.

90

5.2. Expressão gênica da aquaporina PIP1;3 em plant as submetidas ao

sombreamento e ao alagamento do solo

A descoberta das aquaporinas alterou a visão de como a água é transportada

rapidamente através da membrana e como a planta é capaz de regular o fluxo de

água em diferentes condições fisiológicas. As aquaporinas desempenham também

um importante papel em resposta ao estresse abiótico. Caracterização molecular e

funcional de aquaporinas tem demonstrado sua importância na regulação da rota

transcelular de água, em resposta a fatores abióticos adversos como alagamento,

seca, salinidade e temperatura (ZHAO et al, 2007).

Jang et al. (2004) avaliaram a expressão de 13 genes de aquaporinas em

plântulas de Arabidopsis thaliana submetidas à estresses abióticos e classificaram o

gene PIP1;3 como de expressão intermediária, apresentando 2000 – 5000 cópias

por nanograma de RNA total. Fraysse et al. (2005), utilizando a técnica de

imunolocalização em células de raiz, caule e folha de Spinacia oleracea,

demonstraram que a aquaporina SoPIP1;1, homóloga de AtPIP1;3 em A. thaliana, é

altamente expressa em células-guarda da epiderme foliar. Resultados similares

foram encontrados por Sun et al. (2001) que, por meio da técnica de hibridização in

situ de RNA, afirmaram que células-guarda de Vicia faba apresentam altos níveis de

expressão de aquaporinas da subfamília PIP1 e, provavelmente, estão envolvidas

no controle do movimento estomático. De acordo com Sarda et al. (1997),

aquaporinas pertencentes às subfamílias PIP e TIP são induzidas em células-guarda

de plantas de Helianthus annuus sob estresse hídrico.

A indução da expressão gênica de PIP1;3, observada em plantas clonais do

genótipo TSA-792, submetidas ao alagamento do solo, possivelmente contribuiu

para a regulação do volume e turgor das células-guarda em nível foliar; uma vez que

as relações hídricas nessas células são similares às demais, ou seja, à medida que

o potencial osmótico decresce, como resultado da absorção iônica, a água move-se

para dentro das células-guarda (TAIZ; ZEIGER, 2004) via aquaporinas e a pressão

de turgor aumenta mantendo os ostíolos abertos. Verificou-se que o genótipo TSA-

792, considerado resistente ao alagamento do solo, apresentou taxas fotossintética

(A) e transpiratória (E) e condutância estomática (gs) eficientes aos 48 dias de

interação sombreamento x alagamento do solo, quando comparado ao genótipo

91

TSH-774, cujos valores de A, E e gs se aproximaram de zero e os níveis de

expressão de PIP1;3 foram equivalentes ao tratamento não-alagado.

Sob condições normais de temperatura e umidade relativa do ar, com água e

radiação solar disponível, a fotossíntese é favorecida e os estômatos encontram-se

amplamente abertos. Como os estudos têm demonstrado que as aquaporinas

participam dos mecanismos de abertura e fechamento do poro estomático

(FRAYSSE et al., 2005; SUN et al., 2001; SARDA et al., 1997), sugere-se que a

repressão do gene PIP1;3, observada em plantas não-alagadas de ambos os

genótipos clonais de cacau, é uma resposta esperada; já que, em condições

ambientais ótimas, os genes que apresentam altos níveis de expressão, em

resposta a estresses ambientais diversos, são reprimidos e a síntese protéica é

verificada somente em níveis necessários à manutenção celular.

Apesar de o mecanismo que regula o movimento estomático ser bem

documentado, os sinais que regulam as aquaporinas, nesse processo, ainda são

desconhecidos. Entretanto, os resultados do perfil de expressão do gene de

aquaporina PIP1;3 forneceram novas informações acerca das respostas de

genótipos clonais de cacau aos estresses abióticos estudados, tornando-se ponto de

partida para avaliações futuras do papel de cada aquaporina nas relações hídricas

do cacaueiro.

92

6. CONCLUSÕES

O alagamento do solo foi o principal fator estressor, para a maioria das

respostas fisiológicas observadas, em ambos os genótipos de cacau avaliados,

durante a interação entre sombreamento e alagamento do solo.

O tempo de exposição ao alagamento do solo e a intensidade de radiação

luminosa interferiram nas trocas gasosas e na emissão de fluorescência da clorofila

em nível foliar, cujos ajustes fisiológicos foram distintos entre os genótipos clonais

de cacau avaliados.

As respostas fisiológicas, resultantes da interação entre níveis de

sombreamento e alagamento do solo, foram atenuadas para o genótipo clonal TSA-

792, que apresentou crescimento e desenvolvimento superiores em relação ao

genótipo clonal TSH-774.

A relação observada entre os níveis de expressão gênica e os parâmetros de

trocas gasosas foliares permitiu afirmar que a expressão do gene PIP1;3 é

modulada por anoxia, principalmente para o genótipo clonal de cacau TSA-792,

considerado resistente ao alagamento do solo.

93

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