Universidade Estadual do Ceará Faculdade de Veterinária Biotecnologia da Reprodução Animal

Criopreservação de Embriões

Vicente José de F. Freitas

Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução

www.uece.br/lfcr

Plano de Aula

�  Apresentar os princípios da criopreservação de

embriões.

�  Discutir as técnicas de criopreservação.

�  Apresentar os fatores que afetam o sucesso da técnica.

�  Apresentar as considerações finais sobre o tema.

Conceito

Redução, ou mesmo parada, de todos os fenômenos biológicos:

ü  movimentos moleculares,

ü  reações químicas e

ü  atividades enzimáticas

em temperaturas inferiores a -150°C.

Histórico

Espécie Referência

Murina Whittingham et al., 1972

Bovina Wilmut & Rowson, 1973

Ovina Willadsen et al., 1976

Caprina Bilton & Moore, 1977

Vantagens �  Otimização das biotecnologias reprodutivas.

�  Conservação de material genético:

�  Raças de produção.

�  Espécies em extinção.

�  Prevenção de perdas de animais vivos durante o transporte.

Vantagens

Programa de Conservação da Raça Morada Nova Branca

(UECE-UFC)

Ovelha doadora

Sincronização/ Superovulação IA por laparoscopia

com sêmen de carneiro MNb

+ 6 dias

Colheita/congelação dos embriões

TE para ovelhas receptoras

Nascimento das crias

Princípio da criopreservação

•  protocolo empregado na criopreservação de uma célula deve

ser suficientemente ...

•  lento (evitar a cristalização da água intracelular) e

•  suficientemente rápido (evitar a exposição das células a

elevadas concentrações de eletrólitos antes da congelação).

Crioprotetores

Papel de proteção da célula, pois...: •  Reduz a formação de cristais de gelo;

•  Diminui o ponto crioscópico da água;

•  Aumenta a estabilidade da membrana celular.

Tipos de crioprotetores:

a)  Permeáveis: �  propilenoglicol, glicerol, etilenoglicol, dimetilssulfóxido

(DMSO).

b)  Não permeáveis: •  polivinilpirrolidona, polietilenoglicol, ficoll, dextran e álcool

polivinílico

Tipos de criopreservação

1. Congelação clássica (lenta):

•  Também conhecida como método de congelação clássica, tradicional

ou de equilíbrio.

•  Esta técnica foi padronizada e largamente utilizada no âmbito

comercial e industrial.

•  Criação de um delicado balanço entre vários fatores que determinam

a formação de cristais de gelo, fraturas, danos tóxicos e osmóticos,

permitindo trocas entre os meios extra e intracelular sem que

ocorram sérios efeitos osmóticos e deformidades celulares.

Tipos de criopreservação 2. Vitrificação:

•  Esta técnica pode ser considerada um método de criopreservação em que a formação de

cristais de gelo é totalmente eliminada.

•  A solidificação é atingida pelo aumento extremo da viscosidade e não pela cristalização,

chegando diretamente à fase vítrea.

•  Permite a passagem pela zona crítica de temperatura de maneira rápida, o que impede o

desenvolvimento de injúrias ocasionadas pela formação dos cristais de gelo.

•  A concentração do crioprotetor traz efeitos tóxicos e hipertônicos, aumentando o risco

de injúrias causadas pelo choque osmótico e pela toxicidade celular.

Congelação lenta

1.  Princípio: •  Equilíbrio progressivo entre os crioprotetores utilizados e o

compartimento aquoso do embrião.

2.  Crioprotetores: •  Glicerol, etilenoglicol, DMSO, propanodiol.

3.  Cristalização (seeding): •  Deve ser induzida pelo operador antes que ocorra de maneira

espontânea.

•  Evita a congelação de células em temperaturas excessivamente baixas.

Congelação lenta

Exemplo de curva de congelação de embriões (caprinos e ovinos)

Congelação lenta

Equipamentos programáveis para congelação de embriões

Vitrificação

1.  Características:

•  Estado líquido estado vítreo (amorfo)

•  Crioprotetores com alto grau de viscosidade: •  Etilenoglicol e DMSO

•  Alta velocidade na criopreservação: •  Imersão direta no NL.

Vitrificação

�  Open Pulled Straw (OPS):

Palheta de 0,25 ml esticada (diâmetro interno pequeno )

Vitrificação

Kit para vitrificação pelo método de OPS

Fatores que influenciam no sucesso da técnica

1)  Estádio de desenvolvimento embrionário:

•  Embriões mais tardios (blastocistos) apresentam maior taxa de sobrevivência

Melhor taxa de sobrevivência

Fatores que influenciam no sucesso da técnica

2) Qualidade do embrião: •  Embriões de melhor qualidade apresentam maior taxa de sobrevivência.

Fatores que influenciam no sucesso da técnica

3) Espécie/subespécie animal:

•  Zebuínos apresentam menor taxa de sobrevivência embrionária

Considerações •  Ambas as técnicas (congelação lenta e vitrificação)

podem ser utilizadas para criopreservação de embriões.

•  A eficiência das duas técnicas pode variar de acordo com diversos fatores que devem ser levados em consideração.

•  A vitrificação parece apontar, em um futuro próximo, como técnica de escolha.