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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MÍRIAM LUZIA NOGUEIRA MARTINS DE SOUSA EFEITOS DE INDUTORES NA MATURAÇÃO OVARIANA DE FÊMEAS DO CAMARÃO Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) FORTALEZA - CEARÁ 2017
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MÍRIAM LUZIA NOGUEIRA MARTINS DE SOUSA
EFEITOS DE INDUTORES NA MATURAÇÃO OVARIANA DE FÊMEAS DO
CAMARÃO Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862)
FORTALEZA - CEARÁ
2017
MÍRIAM LUZIA NOGUEIRA MARTINS DE SOUSA
EFEITOS DE INDUTORES NA MATURAÇÃO OVARIANA DE FÊMEAS DO
CAMARÃO Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862)
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientadora: Profª Drª. Célia Maria de Souza Sampaio.
FORTALEZA 2017
Ao meu esposo Manoel Paiva de Araújo que de uma forma particular, sempre me deu força, me apoiou, principalmente nos momentos de maior dificuldade. Aos meus pais Francisco Martins de Sousa e Irene Nogueira Costa, a quem eu agradeço minha existência e agradeço por nunca desistirem!!! In memórian de Antônia Nogueira de Albuquerque Costa e Francisco Martins de Sousa Júnior!!!
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Veterinária, da
Universidade Estadual do Ceará.
A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Funcap), pelo
apoio financeiro.
Ao Laboratório de Carcinicultura (LACAR), da Universidade Estadual do Ceará.
À Professora Célia Maria de Souza Sampaio pela atenção, Paciência, Confiança, apoio,
orientação e dedicação em todos esses anos de pós-graduação, minha amiga, madrinha e mãe
científica.
Ao Prof. Aldeney Andrade Soares Filho pela amizade, incentivo, sugestões e brilhante
coorientação durante a realização de diversas pesquisas.
Aos amigos de Laboratório MSc. Arthur Vinicius Lourenço Ferreira, Moisés Fernandes
Martins, MSc. Caroline Costa Lucas, MSc. Luana Rolim Melo pelas tantas vezes que
colocamos as mãos na cabeça e juntos catamos os cacos e começamos de novo, de novo e de
novo.
Ao amigo, colega de laboratório, namorado e marido Manoel Paiva de Araújo Neto por ter
sido meu braço direito durante a execução do projeto de Doutorado. Pela ajuda dada ao longo
de todo esse processo, pelas puxadas de orelha, por escutar os desabafos, por fazer comigo as
rações e por fazer minha estatística.
A todos os colegas que passaram ao longo desses quase cinco anos pelo LACAR, por todo o
suporte proporcionado para a realização da pesquisa, pela convivência divertida, nas coletas e
cultivo dos espécimes utilizados na pesquisa.
Ao Laboratório de Histologia de Efeitos Causados por Venenos de Serpentes e Plantas
(HISTOVESP), da Universidade Estadual do Ceará.
À Professora Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista pela confiança dada a minha pesquisa,
pela abertura total de seu laboratório, pelo empréstimo de seus melhores alunos.
Á MSc. Glayciane Bezerra de Morais (Nina), Karen Denise da Silva Macambira Barbosa,
Francisco Antônio Felix Xavier Júnior pela ajuda ao longo da execução das análises das
amostras, pelas conversas, risadas, conselhos, puxadas de orelha e pelos ensinamentos que me
foram passados durante o meu Doutorado.
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Ao Prof. Dr. Bartolomeu W. S. de Sousa coordenador do Laboratório de Tecnologia do
Pescado, da Universidade Estadual do Ceará, pela ajuda nas análises das rações utilizadas
nesse projero.
À Drª Janaina Andrade dos Santos. Drª Nathalie Ommundsen Pessoa e a Drª Fernanda
Menezes de Oliveira e Silva pelo aceite do convite a banca e por todas as sugestões.
A Deus, por ter me iluminado, ter dado força, paciência, perseverança e motivação para que
eu terminasse o Doutorado.
No fim tudo dá certo, e se não deu certo é
porque ainda não chegou ao fim.
(Fernando Sabino)
RESUMO
Macrobrachium amazonicum é um camarão nativo vastamente distribuído em bacias da
América do Sul, largamente explorada pela pesca artesanal no Norte e Nordeste do Brasil e
que nos últimos anos vem apresentando grande potencial para aquicultura. Devido a isso,
estudos que forneçam informações que venham subsidiar a produção deste animal em
cativeiro, evitando os riscos do seu esgotamento em ambiente natural são necessários. Assim,
visando avaliar o efeito de indutores sobre parâmetros reprodutivos e zootécnicos, fêmeas de
M. amazonicum foram cultivadas por 90 dias em aquários, com volume útil de 20 L e
divididas em cinco tratamentos, cada um com cinco repetições: animais alimentados com
ração comercial suplementada com óleo de peixe (n=100); animais alimentados com ração
comercial suplementada com óleo de linhaça (n=100); animais alimentados com ração
comercial suplementada com óleo de coco (n=100); animais alimentados apenas com ração
comercial, que constituiu o grupo controle (n=100) e animais que sofreram a técnica de
uniablação do pedúnculo ocular (n=50). Diariamente, foram obtidos a temperatura e o pH da
água. Foram realizadas análises de composição centesimal da ração, ganho de peso dos
animais e analises histológica das gônadas e dos hepatopâncreas. A análise de variância foi
aplicada aos tratamentos e, quando significativa, aplicou-se o teste de Dunnett ou teste T-
Student, com alfa de 5%, no software GraphPad Prism 7.0. Em relação à composição
centesimal das rações, todas eram isoprotéicas, apresentando a ração de coco menor teor de
umidade (6,06 ± 0,50); em relação aos lipídios totais as rações suplementadas com óleo de
coco (9,65 ± 0,26) e peixe (9,64 ± 0,87) apresentaram os maiores teores. Em relação ao ganho
de peso a ração mais eficiente foi a ração suplementada com óleo de coco (1,75 ± 0,50),
seguida daquelas com óleo de peixe (1,42 ± 0,47) e com linhaça (1,53 ± 0,34). Quanto à
caracteristicas morfológicas, a glândula digestiva apresentou uma maior vacuolização das
células B nas amostras oriundas de animais que sofreram uniablação do pedúnculo e nas
amostras que receberam suplementação dos óleos na ração em comparação ao grupo controle.
Quanto as caracteristicas morfológicas do ovário foi encontrada diferença significativa para a
quantidade de oócitos 4 (maduros), entre as rações de linhaça e coco. Também foram
encontrados folículos pós ovulatórios nas amostras oriundas de animais uniablados e animais
que sofreram suplementação com óleo de peixe. Vale destacar que foi observada proliferação
de tecido conjuntivo ao longo da gônada de animais que foram submetidos à técnica de
uniablação ocular. Neste trabalho foi possível perceber que dois indutores utilizados foram
eficientes, tanto na diminuição do tempo entre as maturações ovarianas, quanto na presença
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de estruturas que indicaram ovulação: a técnica de uniablação do pedúnculo ocular e a ração
suplementada com óleo de peixe.
Palavras-chave: Maturação gonadal. Camarão de água doce. Hepatopâncreas.
Morfofisiologia da reprodução. Indutores ovarianos.
ABSTRACT
Macrobrachium amazonicum is a native prawn vastly distributed in basins of South America,
widely exploited by artisanal fishery in the North and Northeast of Brazil and that in recent
years has presented great potential for aquaculture. Due to this, studies that provide
information that will subsidize the production of this animal in captivity, avoiding the risks of
its depletion in the natural environment are necessary. Thus, this study aim to evaluate the
effect of inducers on reproductive and zootechnical parameters of females of M. amazonicum.
In order to achieve this goal, females were cultivated for 90 days in aquariums, with a useful
volume of 20 L. Thereby, were applied five treatments, each one with five repetitions: (I)
animals fed only with commercial feed, which constituted the control group (n = 100), (II)
animals fed with commercial feed supplemented with fish oil (n = 100), (III) animals fed with
commercial feed supplemented with linseed oil (n = 100), (IV) animals fed with commercial
feed supplemented with coconut oil (n = 100) and animals that underwent ocular peduncle
uniablation (n = 50). The temperature and pH of the water were daily measured. Were
performed analysis of centesimal composition, weight gain of the animals and histological
analyzes of gonads and hepatopancreas. The analysis of variance was used to verify the
differences of averages between the treatments and, when significant, the Dunnett or test
Student’s t-test, with alpha of 5%, was applied in the software GraphPad Prism 7.0. Thus,
were observed that the feed were isoproteic, with coconut feed presenting lower moisture
content (6.06 ± 0.50); (9.65 ± 0.26) and fish (9.64 ± 0.87) presented the highest levels of total
lipids. In relation to weight gain, the feed most efficient was the one supplemented with
coconut oil (1.75 ± 0.50), followed by those with fish oil (1.42 ± 0.47) and linseed (1.53 ±
0.34). As to the morphological characteristics, the digestive gland presented a greater
vacuolization of the B cells in the samples from animals that suffered uniablation of the
peduncle and in the samples that received supplementation of the oils in the feed in
comparison to the control group. Regarding the morphological characteristics of the ovary, a
significant difference was found for the quantity of oocytes 4 (mature), between the linseed
and coconut feed. Post ovulatory follicles were also found in samples from uniablated animals
and animals that had been supplemented with fish oil. Another characteristic noted only in the
samples that suffered uniablation was a marked proliferation of connective tissue along the
gonad. In this work, it was possible to notice that two inducers were efficient in reducing the
time between ovarian maturation and the presence of structures that indicated ovulation,
which was the ocular peduncle uniablation technique and the fish oil supplementation
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Key words: Gonadal maturation. Freshwater prawn. Hepatopancreas. Morphophysiology of
reproduction. Ovarian inductors.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Photomicrograph of the digestive gland of M. amazonicum. A: overview of the digestive gland of the control group. 20x / HE. C: Overview of the digestive gland of the unilaterally ablated group. Increased 20x. HE. Microscope Nikon Eclipse Nis, Nis Softaware 4.0. Arrows indicate B cells. Circles indicate E cells...........................................................................................................................................71 Figura 2 - Photomicrographs of ovaries originating from females who suffered unilateral eyestalk ablation. It shows an accentuated proliferation of connective tissue (arrows), similar to areas of fibrosis on the slides. HE. Microscope Nikon Eclipse Nis, Nis Softaware 4.0..............................................................................................................................................72 Figura 3 - Weight gain of female prawns M. amazonicum, submitted to three rations supplemented with different sources of lipids………………………………………………..89 Figura 4 - Photomicrography of digestive glands of M. amazonicum females, fed with rations without and with supplementation of vegetable and animal oils. [1] control group gland: presence of E, R and B cells; Increase of 20X. [2] gland of the group supplemented with fish oil: presence of E, R and B cells; Increase of 20X. [3] group gland supplemented with coconut oil: presence of E and B cells; Increase of 20X. [4] gland of the group supplemented with flaxseed oil: presence of E and B cells; Increase of 20X. HE technique. Microscope Nikon® Eclipse Nis, Software Nis 4.0.....................................................................................90
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Variation of temperature and pH of the water during the 90 days of the experiment (mean ± standard error)………………………………………………………….70 Tabela 2 - Variation of pH and water temperature during the 90 days of experiment. Columns with different letters indicate significant difference (p ≤ 0.05)……………………………...86 Tabela 3 - Centesimal composition of the rations used in the experiment. Lines with different letters indicate significant difference (p ≤ 0.05)……………………………………………..87
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
FUNCAP - Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
UECE - Universidade Estadual do Ceará
LACAR – Laboratório de Carcinicultura
HISTOVESP - Laboratório de Histologia de Efeitos Causados por Venenos de Serpentes e
Plantas
VIH - Hormônio inibidor da vitelogênese
MIH - Hormônio inibidor da muda
COX/GS - Complexo órgão-X/glândula do seio
CHH - Hormônio hiperglicêmiante de crustáceos
EPA - Ácido ecosapentaenóico
DHA - Ácido docosahexaenóico
EFA – Ácidos graxos essenciais
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16
2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 18
2.1 Sistemática e Biologia de Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) .......................... 18
2.2 Aparelho reprodutor da fêmea de M. amazonicum .......................................................... 19
2.3 Vitelogênese .................................................................................................................. 20
2.3.1 Vitelogênese em fêmeas de M. amazonicum ................................................................ 21
2.4 Regulação endócrina da vitelogênese ............................................................................. 21
2.5 Principais técnicas usadas para acelerar a maturação ovariana ........................................ 22
2.5.1 Papel dos lipídios na vitelogênese em Decápodes ........................................................ 23
3 JUSTIFICATIVA............................................................................................................ 26
4 HIPÓTESE ...................................................................................................................... 27
5 OBJETIVOS ................................................................................................................... 28
5.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 28
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 28
6 CAPÍTULOS ................................................................................................................... 29
6 CAPÍTULO 1.................................................................................................................... 29
6 CAPÍTULO 2.................................................................................................................... 54
6 CAPÍTULO 3.................................................................................................................... 73
7 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 91
8 PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 92
9 REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 93
1 INTRODUÇÃO
A produção mundial de animais aquáticos no ano de 2014 alcançou 73,8 milhões de
toneladas e movimentou US$160,2 bilhões, sendo que a produção de crustáceos representou
6,9 milhões de toneladas (US$36,2 bilhões). Deste montante, a produção de camarões de água
doce foi de aproximadamente 450 mil toneladas, registrando um aumento de cerca de 12
vezes nas duas últimas décadas com um valor de produção de aproximadamente 2,2 milhões
de dólares (FAO, 2012; FAO 2016).
No Brasil, a produção de camarões de água doce apresentou oscilações entre 200 até
450 toneladas entre os anos de 2000 e 2006 (MARQUES E MORAES-VALENTI, 2012),
entretanto, foi registrado um declínio para uma produção de 230 toneladas em 2007 e apenas
100 toneladas em 2008 e 2009 (FAO, 2012). Atualmente, a única espécie produzida
comercialmente é o Macrobrachium rosenbergii, porém existe uma espécie nativa, M.
amazonicum, que ao longo dos anos vem apresentando ótimo potencial para produção em
cativeiro (MORAES-VALENTI et al., 2010).
Para que o cultivo desta espécie tenha sucesso é importante entender que estratégia
alimentar deve ser seguida para manter os reprodutores sempre aptos a produzirem
descendentes, minimizando o efeito do cativeiro. Isto envolve alguns aspectos como a
nutrição, processamento e manejo alimentar. A estratégia alimentar precisa ter como base o
comportamento fisiológico e as exigências nutricionais da espécie na fase de reprodução.
Uma técnica bastante usada comercialmente para estimular a indução da maturação
gonadal levando-se a uma antecipação do estado ovígero e um aumento na frequência de
desovas para crustáceos decápodes é a uniablação do pedúnculo ocular. Esta técnica extirpa
um complexo de órgãos causando um desequilíbrio hormonal e metabólico ao animal.
Devido à técnica de uniablação causar tais problemas e por saber a importância da
alimentação principalmente quando se trata de fazê-lo em pequenos tanques uma melhor
compreensão do papel das dietas na maturação gonadal ajudará a superar alguns desafios de
produção. Um conhecimento considerável sobre a nutrição do camarão tem sido gerado
durante os últimos 20 anos (New et al., 2009), mas as dietas de formulação podem ainda ser
melhoradas usando localmente material disponível e suplementação com alguns nutrientes
ainda não testados. Entre os principais compostos da dieta estão os lipídios. Os lipídios
ingeridos pelos animais, principalmente em forma de triglicerídios, são convertidos no
hepatopâncreas em lipídios polares e glicolipoproteínas, como no caso da vitelina e
lipovitelina. Durante o ciclo reprodutivo, essas proteínas são transportadas aos ovários através
da hemolinfa (CAHU; CUZON; QUAZUGUEL, 1995). Não se sabe o quanto deve ser
17
suplementado e se essa suplementação teria resultados positivos sobre parâmetros
reprodutivos de fêmeas da espécie M. amazonicum.
Embora o estudo do controle endócrino do ciclo reprodutivo, uma etapa crucial para
entender a maturação ovariana, já tenho sido estudada em algumas espécies de crustáceos, são
escassos os estudos relacionados às fêmeas da espécie M. amazonicum.
Diante do exposto e do potencial produtivo do camarão M. amazonicum, é importante
a geração de estudos que forneçam informações para subsidiar técnicas de produção, seja por
meio dos sistemas de cultivo comercial ou da exploração racional dos estoques naturais,
evitando os riscos do seu esgotamento.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Sistemática e Biologia de Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862)
Macrobrachium amazonicum pertence à família Palaemonidae Rafinesque, 1815, que
possui ampla distribuição geográfica, ocupando uma imensa diversidade de ambientes, e
inclui espécies com grande interesse econômico (MELO, 2003; FERREIRA et al., 2010). No
território brasileiro são registradas 64 espécies, sendo 38 palemoníneos e 27 pontoníneos
(MELO, 2003; FERREIRA et al., 2012; CARVALHO et al., 2014).
Macrobrachium Spence Bate, 1868 é o gênero com maior número de espécies, com
246 espécies conhecidas mundialmente, 19 das quais encontradas no Brasil, incluindo duas
espécies introduzidas (MACIEL et al., 2011; VERA-SILVA et al., 2016).
Membros desta família apresentam ampla distribuição geográfica, ocorrendo em águas
tropicais e subtropicais de ambientes dulcícolas, estuarinos e marinhos em todo o planeta.
Representantes do Macrobrachium spp. são distribuídos por toda a América, Caribe, África e
Ásia (VERA-SILVA et al., 2016).
Ainda de acordo com Melo (2003), a família Palaemonidae é a mais representativa no
Brasil. No Ceará, das oito espécies de camarões de água doce identificadas, sete pertencem a
esta família, sendo todas representantes do gênero Macrobrachium, tais estas, M. acanthurus,
M. amazonicum, M. birai, M. carcinus, M. jelskii, M. nattereri e M. olfersi. A espécie Atya
scabra também é encontrada no Estado.
Das espécies nativas do Brasil, M. amazonicum é a preferida atualmente para estudos
sobre viabilidade de cultivos, devido ao seu rápido crescimento e fácil manutenção em
cativeiro. Apesar de atingir um crescimento menor que outras espécies do gênero, com cerca
de 10 g e 10 cm de comprimento e peso médios, a mesma não apresenta a agressividade
característica de M. acanthurus e M. carcinus, além de ser mais resistente a doenças e
predadores (LOBÃO; ROJAS, 1991).
M. amazonicum caracteriza-se por apresentar rostro longo e delgado, alcançando além
do escafocerito e dirigido, anteriormente, para cima; margem dorsal com 9 a 12 dentes, sendo
o primeiro situado atrás da órbita; os primeiros sete dentes são aproximados formando uma
crista basal na metade proximal do rosto; os últimos dentes estão mais largamente espeçados,
estando o último próximo da extremidade. Margem ventral do rosto com 8 a 10 dentes,
estando o distal mais largamente espaçado. Pleura do quinto somito abdominal com espinho
pequeno, mas distinto. Telso terminando em ponto mediano agudo, com 2 pares de espinhos
19
na margem posterior, par interno não alcançando a extremidade do telso. Segunda pata, no
adulto, é a mais forte, alcançando, por todo o comprimento do carpo, além do escafocerito;
dedos ¾ do comprimento da palma, cobertos por forte camada de cerdas; faces cortantes de
ambos os dedos com forte dente proximal; palma alongada e com numerosas espínulos; carpo,
também, com espínulos, mero 2/3 do comprimento do carpo. Os últimos três pereiópodos
alongados, o terceiro alcançando o fim do escafocerito; própodo da terceira pata três vezes o
comprimento do dátilo; machos adultos com mero, carpo e própodo cobertos por espínulos
curtos, nas fêmeas os espínulos estão ausentes (MELO, 2003).
2.2 Aparelho reprodutor da fêmea de M. amazonicum
Nas fêmeas decápodes, o aparelho reprodutor é constituído por um par de ovários
associados aos ovidutos que se abrem nos gonóporos localizados na base do terceiro par de
pereiópodos (KROLL et al., 1992). Ainda segundo o autor, algumas fêmeas apresentam
estruturas especializadas para receber o esperma, como a espermateca em decápodes.
Com especial ênfase aos ovários dos decápodes, estes estão localizados na região
dorsal do intestino. Eles são parcialmente fusionados na região cefalotorácica, consistindo de
um par e vários lobos laterais (KROLL et al., 1992). Em espécies do gênero Macrobrachium,
como por exemplo, em M. rosenbergii, ovários totalmente desenvolvidos se encontram
apoiados dorsalmente no estômago e hepatopâncreas, logo atrás dos olhos, podendo adentrar
até o primeiro segmento abdominal (LING, 1969). Assim, os ovários desta espécie se
desenvolvem em direção à parte posterior do cefalotórax, e quando maduros tornam-se
facilmente identificáveis por transparência da carapaça, como uma grande massa alaranjada
devido ao acumulo de vitelogenina, que contém pigmentos do tipo carotenoides. (CAVALLI
et al., 2001).
Os ovários dos decápodes estão envoltos por uma cápsula de tecido conjuntivo que se
invagina formando septos, os quais suportam o epitélio germinativo. O epitélio germinativo
origina as ovogônias e as células foliculares (ADIYODI; SUBRAMONIAM, 1983; BELL;
LIGHTNER, 1988).
O epitélio germinativo, também denominado de zona de proliferação pode ser
observado tanto na periferia como no centro dos ovários da maioria das espécies de
decápodes. As zonas de proliferação constituem a camada germinal das oogônias (KROLL et
al., 1992). Estas zonas de proliferação podem variar em relação às espécies, devido à pressão
exercida pela produção e crescimento dos ovócitos.
20
2.3 Vitelogênese
Uma etapa crucial no processo de desenvolvimento ovariano é a vitelogênese, que é
um período importante no desenvolvimento ovariano de fêmeas de crustáceos, caracterizada
por massivo aumento da concentração da síntese de vitelogenina na hemolinfa e, sua posterior
deposição em oócitos em crescimento.
É um processo importante na reprodução de animais ovíparos (JASMANI et al.,
2004), sendo dividido em duas fases: vitelogênese primária, ou endógena, na qual o ovócito
passa a acumular vitelo endógeno, e termina quando o ovócito atinge o diâmetro característico
de cada espécie; e a vitelogênese secundária, ou exógena, que passa a acontecer quando a
vitelogenina, que é a precursora do vitelo, está presente na hemolinfa, no ovário e no
hepatopâncreas, é captada pelo ovário por endocitose (KROLL et al., 1992; FERREIRA et al.,
2012).
A composição da substância de reserva dos oócitos pode variar de espécie para
espécie e às vezes até mesmo entre os indivíduos, dependendo da dieta. Sabe-se que a água é
o constituinte principal deste, e a parte sólida contém quase todos os compostos orgânicos e
inorgânicos que são necessários para sustentar a vida e garantir um crescimento normal do
embrião. Dentre estes, as proteínas e os lipídios constituem a maior parte das reservas
orgânicas do vitelo, representando 50-80% da matéria seca em um ovário maduro (SYAMA,
2009).
Nos crustáceos um órgão que está intimamente ligado a modificação e armazenamento
dos lipídios para serem utilizados na vitelogênese é o hepatopâncreas (YING et al., 2006). Os
recursos deste são utilizados para atender às necessidades de reprodução e metabólicas da
fêmea (ADIYODI; ADIYODI, 1970; HASEK; FELDER, 2005). O papel deste no
fornecimento de nutrientes para o desenvolvimento ováriano tem sido relatado em algumas
espécies de camarão (TSENG et al., 2001; BUCKUP et al., 2008). Ocorrem também relatos
na literatura do papel do hepatopâncreas de crustáceos como o local de síntese da vitelogenina
(SOROKA et al, 2000; YANG et al., 2000). No camarão, Penaeus vannamei, além do ovário,
o hepatopâncreas foi encontrado como sendo o sítio comum para a síntese de vitelogenina
(YANO; CHINZEI, 1987).
O processo de formação e acumulação de vitelo nos ovócitos de crustáceos tem sido
ao longo dos anos discutida por alguns autores que dizem que a origem do vitelo pode ser
como produção intraovocítica, extra-ovocítica ou a combinação das duas (LEPORE et
al,1993).
21
Um dos principais argumentos a favor da origem extra-ovocítica é a existência na
hemolinfa de uma proteína idêntica à contida nas vesículas de vitelo (lipovitelina), que
entraria no ovócito pelo processo de pinocitose, o qual ocorreria apenas quando os ovócitos
acumulam reservas de vitelo (WOLIN et al,1973).
A hipótese da produção extra-ovocítica de vitelo é ainda suportada pela observação
ultrastrutural de numerosas microvilosidades e vesículas de micropinocitose na membrana
plasmática de ovócitos em vitelogênese que sugerem uma produção exógena de componentes
do vitelo que desta forma entram no ovócito (LEPORE et al,1993). Vários estudos utilizando
marcadores demonstraram a captura de material exógeno pelo ovócito (WOLIN et al,1973).
Estudos imunológicos em vários décapodas identificaram locais extra-ováricos de síntese da
vitelina e da vitelogenina (molécula precursora da vitelina): hemócitos, hemolinfa (KROL et
al, 1992), tecido adiposo subepidermal (JUNÉRA e CROISILLE, 1980), e o hepatopâncreas
(FERREIRA, 2012). A vitelogenina poderia ainda ser sintetizada pelas células foliculares,
secretada para a hemolinfa e dali captada pelos ovócitos em desenvolvimento (YANO;
CHINZEI, 1987).
2.3.1 Vitelogênese em fêmeas de M. amazonicum
Poucos são os estudos desenvolvidos até o presente momento que investigam a
vitelogênese nesta espécie. No ano de 2012, Ferreria et al (2012) descobriram que a expressão
de vitelogênese ocorre tanto no ovário quanto no hepatopâncreas. Que a vitelogenina começa
a ser encontrada nos ovários a partir de primeiro estádio de maturação, porém seu pico
acontece no estádio 3 de maturação.
Outro resultado encontrado no estudo foi que este processo promove o acúmulo de
lípídios e o crescimento de oócitos, assim como favorece também a maturação sexual das
fêmeas.
2.4 Regulação endócrina da vitelogênese
Essa ligação intrinseca e indissolúvel entre muda e vitelogênese é realizada por uma
delicada interação multihormonal, que envolve principalmente neuropeptídeos – hormônio
inibidor da vitelogênese (VIH) e hormônio inibidor da muda (MIH), ambos originários do
complexo órgão-X/glândula do seio (COX/GS). Assim, a coordenação hormonal, tanto da
muda quanto da vitelogênese torna-se vital para a realização de um crescimento contínuo do
corpo e aumento da fecundidade. Os fatores endócrinos que controlam este processo podem
22
ser divididos em duas classes: hormônios inibidores e os hormônios estimuladores do
desenvolvimento ovariano (ADIYODI; ADIYODI, 1970).
Hormônios inibidores do desenvolvimento ovariano são encontrados, principalmente
no pedúnculo ocular, no chamado complexo órgão-X/glândula do seio (COX/GS).
O complexo órgão-X/glândula do seio (COX/GS) é o principal centro de controle
endócrino, e localizado bilateralmente no pedúnculo ocular da maioria dos crustáceos
(REDDY; RAMAMURTHI, 1999). O órgão-X é formado por um conjunto de células
neurossecretora. Os axônios das células formam um nervo principal que converge
lateralmente para a hemolinfa onde seus terminais axônios dilatados formam uma discreta
armazenagem de onde serão liberados hormônios, ou seja, seio da glândula (SPAZIANI et al.,
1994). Em crustáceos, os hormônios produzidos pelo órgão X são armazenados na cavidade
da glândula, de onde são lançados na hemolinfa sob os estímulos apropriados. Os principais
hormônios peptídicos secretados pelo complexo são: MIH (hormônio inibidor da muda), VIH
(hormônio inibidor da vitelogênese) e CHH (hormônio hiperglicêmiante de crustáceos);
coletivamente chamados de peptídeos família-CHH, MIH, e VIH têm como alvo outras
glândulas endócrinas, enquanto CHH tem como alvo tecidos somáticos. Todos esses
hormônios peptídicos possuem sobreposições atividades biológicas (KELLER, 1992;
NAGARAJU, 2011).
2.5 Principais técnicas usadas para acelerar a maturação ovariana
Uma etapa crucial no processo de maturação gonadal em cada ciclo reprodutivo de
decápodes é a vitelogênese, que se caracteriza por um aumento massivo da concentração de
vitelogenina na hemolinfa, sendo um pré-requisito necessário para a maturação completa de
ovócitos ovarianos.
Dentre as principais técnicas utilizadas para estimular a vitelogênese merece destaque
a técnica de ablação do pedúnculo ocular, que consiste no corte ou esmagamento de um dos
pedúnculos oculares (BARBIÉRI Jr; OSTRENSKY, 2001). Ainda de acordo com os autores,
esta técnica vem sendo utilizada com sucesso na indução da maturação gonadal de crustáceos
decápodes obtendo-se uma antecipação do estado ovígero e um aumento na frequência de
desovas.
Adicionalmente à ablação do pedúnculo ocular, a alimentação é de fundamental
importância no processo de maturação, principalmente quando se trata de fazê-lo em
pequenos tanques. Entre os principais compostos da dieta estão às gorduras, principalmente os
ácidos graxos da série linolênica (ômega 3, de origem marinha), colesterol e seus derivados
23
(FENUCCI, 1988). De acordo com Wouters et al. (2001), é necessário o armazenamento
suficiente de nutrientes para o início da reprodução de camarões, além disto, dietas ricas em
lipídios são importantes para a maturação gonadal. Cavalli et al. (2001) em estudo realizado
em M. rosenbergii observaram que o nível total de lipídios no ovário aumenta com a
maturação, sendo o requerimento de lipídeos para o desenvolvimento do ovário dependente da
imediata ingestão de dietas com esse nutriente, visto que de uma forma geral, os crustáceos
têm habilidade limitada para biossíntese de fosfolipídios, devido à ausência da enzima3-
hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase (MITRA; MUKHOPADHYAY;
CHATTOPADHYAY, 2005). Uma dieta adequada é identificada como fator crucial para a
maturidade sexual e a reprodução do camarão em cativeiro. Quando a dieta é desbalanceada
ou incompleta pode causar baixo desempenho reprodutivo ou até mesmo impedir a
reprodução (KAWAHIGASHI, 1998).
2.5.1 Papel dos lipídios na vitelogênese em Decápodes
O lipídio, a principal fonte de energia é referida como o componente orgânico
principal de hepatopâncreas; seu metabolismo está sujeito a maior modificação durante a
vitelogênese, embriogênese e desenvolvimento larval. Os lipídios desempenham um papel
essencial como uma reserva de energia (triacilgliceróis), e como o componente básico de
membranas (fosfolipídeos), na síntese hormonal e constitui a parte mais importante da vitelina
(KANAZAWA; TESHIMA, 1971; GALOIS, 1983).
Na espécie exótica M. rosenbergii, o hepatopâncreas é o principal órgão de
armazenamento e processamento de lipídios (D 'ABRAMO; SHEEN, 1993). No entanto, as
suas reservas contribuem apenas parcialmente para a vitelogênese (CAVALLI et al., 1999). A
diminuição significativa em alguns tipos de lipídios neutros, principalmente o triacilglicerol,
de ácidos graxos livres e dos diacilgliceróis, ocorre na fase final de maturação (CAVALLI et
al., 2001). O mesmo ocorre para fêmeas da espécie Penaueus monodon.
Os níveis de lipídios neutros são normalizados após a desova, o que sugere um
possível armazenamento de energia no final da maturação dos ovários, necessária para cobrir
as necessidades metabólicas para desova (CAVALLI et al, 2001). Os níveis elevados de
lipídio neutros, principalmente triglicerídeos tanto nos ovários quanto no hepatopâncreas, vêm
sendo relatado em várias espécies de camarão, tais como P. japonicus (TESHIMA et al.,
1989), P. monodon (MILLAMENA; PASCUAL, 1990) e M. rosenbergii (CAVALLI et al.
2001) ao longo do período de maturação dos ovários.
24
A importância dos lipídios no metabolismo embrionário pode ser aferida pelo fato de
representar 60% do total da energia utilizada no desenvolvimento do embrião dos crustáceos
(WEHRTMANN; GRAEVE, 1998). Durante a embriogênese, a maioria dos lipídios
reorganiza-se, ao invés de ser utilizado como fonte de energia, verificando-se um consumo
seletivo dos mesmos (BABU, 1987). Os fosfolipídios e colesterol são usados como
componentes estruturais na biogênese de membranas (ROSA; NUNES 2002; ROSA; NUNES
2003). A utilização preferencial de lipídios polares ou neutros depende da espécie e pode ser
reflexo de adaptações ambientais (NARCISO, 1999).
Tal como nos peixes marinhos, os camarões apresentam uma biossíntese de ácido
ecosapentaenóico (EPA) 20:5n-3 e ácido docosahexaenóico (DHA) 22:6n-3 a partir dos seus
precursores, muito pouco ativa, o que indicia uma baixa atividade da enzima dessaturase Δ4 e
Δ5 (NARCISO, 1999; POUSÃO-FERREIRA, 2006). Assim, EPA e DHA são considerados
ácidos graxos essenciais (EFA) para os camarões, com funções importantes na reprodução,
fertilização, eclosão e crescimento. O aporte de DHA e EPA tem de ser pela dieta, porque a
capacidade para sintetizá-los é limitada e a quantidade disponibilizada pelo hepatopâncreas
não suprime as necessidades (YING et al., 2006), sendo o perfil em ácidos graxos dos
crustáceos normalmente reflexo da sua dieta, especialmente no que diz respeito aos EPA. A
necessidade dos crustáceos em obter PUFA n-3 traduz a importância destes ácidos gordos em
funções fisiológicas estruturais (NARCISO, 1999).
Ao contrário dos peixes, os crustáceos são incapazes de biossintetizar esteróis, devido
à ausência da enzima3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase (MITRA; MUKHOPADHYAY;
CHATTOPADHYAY, 2005), razão pela qual, o colesterol é considerado um nutriente
essencial nas dietas de crustáceos. De acordo com Wouters et al. (2001), é necessário o
armazenamento suficiente de nutrientes para o início da reprodução de camarões, além disto,
dietas ricas em lipídios são importantes para a maturação gonadal.
Nas espécies ovíparas ou ovovivíparas, em que o desenvolvimento embrionário é
independente do corpo materno, os ovos funcionam quase como um sistema fechado, já que
não existe aporte de nutrientes maternos, e é essencial que as reservas vitelinas contenham os
nutrientes e a energia indispensáveis à manutenção da homeostasia e ao desenvolvimento do
embrião, até ao início da alimentação exógena (ROSA et al., 2007).
Em qualquer espécie a descendência é afetada direta e indiretamente pela qualidade da
dieta dos progenitores, com especial ênfase para a dieta materna. A oviparidade foi para
muitos organismos multicelulares, uma estratégia de vida que permitiu um grande salto
25
evolutivo, uma vez que a embriogênese se desenvolve fora do corpo materno (ROSA et al.,
2007).
Nos crustáceos, as fêmeas podem transferir até 60% das suas reservas lipídicas para os
ovos (ROSA et al., 2007), o que sugere que o metabolismo dos lipídios é extremamente
dependente das reservas parentais (ROSA; NUNES 2002; ROSA; NUNES 2003), existindo
cada vez mais evidências de que a acumulação de lipídios nos ovários prove diretamente da
dieta (WOUTERS et al., 2001).
Em um estudo conduzido por Cavalli et al. (2001) com M. rosenbergii foi observado
que o nível total de lipídios no ovário da fêmea aumentava à medida que a maturação
avançava, sendo o requerimento de lipídios para o desenvolvimento do ovário dependente da
imediata ingestão de dietas com esse nutriente, visto que de uma forma geral, os crustáceos
têm habilidade limitada para biossíntese de fosfolipídios.
3 JUSTIFICATIVA
O controle endócrino da reprodução tem sido investigado em vários crustáceos.
Entretanto, na prática, a manipulação hormonal para indução do desenvolvimento ovariano e
da ovoposição está limitada à técnica de uniablação do pedúnculo ocular, técnica essa que
inviabiliza a utilização dessa fêmea por mais de três ciclos reprodutivo. Diferentes estudos
têm sido realizados na busca de uma alternativa a esta técnica, contudo, em termos gerais,
para crustáceos cultivados em cativeiro não há um consenso entre autores sobre o melhor
método e o mais econômico para a maturação gonadal de fêmeas, e em relação aos camarões
do gênero Macrobrachium, este estudo está limitado à espécie exótica.
Assim, devido à falta de estudos que avaliem a indução da maturação ovariana em
fêmeas de M. amazonicum, este trabalho se propõe a estudar os efeitos da uniablação ocular e
da suplementação lipídica na maturação e ciclo reprodutivo de fêmeas desta espécie.
4 HIPÓTESE
A utilização de dieta com fontes extras de lipídios possui o mesmo efeito na maturação
ovariana, no ciclo reprodutivo e no ganho de peso que o método convencional.
5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o uso de indutores na maturação das gônadas de fêmeas de Macrobrachium
amazonicum, em cativeiro.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar o efeito das rações formuladas no Laboratório de Carcinicultura da
Universidade Estadual do Ceará, sobre as gônadas e hepatopâncreas de fêmeas de M.
amazonicum;
- Estudar o efeito da uniablação do pedúnculo ocular sobre as gônadas e
hepatopâncreas de fêmeas de M. amazonicum;
6 CAPÍTULOS
6 CAPÍTULO 1
MATURAÇÃO OVARIANA DE CRUSTÁCEOS DECÁPODAS: UMA REVISÃO
OVARIAN MATURATION OF CRUSTACEA DECÁPODAS: A REVIEW
Periódico: Ciência Rural
RESUMO
O estudo do desenvolvimento ovariano passa por entender tanto a questão alimentar,
fisiológica quanto comportamental das fêmeas estudadas. Em crustáceos, por estes serem
animais invertebrados, a maturação ovariana acontece concomitantemente com o crescimento
e formação de uma nova carapaça, a muda ou ecdise. Uma das principais fases desse período
é a vitelogênese, que consiste no processo pelo qual reservas são progressivamente
armazenadas nos ovócitos de animais ovíparos, originando o vitelo dos ovos maduros. Os
estudos avaliando os processos envolvidos no desenvolvimento ovariano do camarão M.
amazonicum, e a importância desses processos para o sucesso na produção e manutenção de
estoques naturais, ainda são escassos. Esta revisão tem como objetivo reunir informações
acerca do desenvolvimento ovariano das principais espécies comerciais de camarões para
direcionamento de pesquisas que visem um maior conhecimento acerca da biologia do
camarão da Amazônia, M. amazonicum.
Palavras-chave: Vitelogênese, Macrobrachium amazonicum, desenvolvimento gonadal,
ablação, dieta parental.
31
MATURAÇÃO OVARIANA DE CRUSTÁCEOS DECÁPODAS: UMA REVISÃO
OVARIAN MATURATION OF CRUSTACEA DECÁPODAS: A REVIEW
Míriam Luzia Nogueira Martins de Sousa1; Manoel Paiva de Araújo Neto2;
Arthur Vinicius Lourenço Ferreira1; Célia Maria de Souza Sampaio3
1. Laboratório de Carcinicultura, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Ceará. E-mail: [email protected]. Autor para correspondência.
2. Laboratório de Biologia Ambiental, Instituto Federal do Ceará (IFCE), Departamento de Ciências Biológicas, Acaraú, Ceará.
3. Laboratório de Carcinicultura, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Ciências Biológicas, Fortaleza, Ceará.
ABSTRACT
The study of ovarian development involves understanding of feeding, physiological and
behavioral issues on the studied female shrimps. In crustaceans, being invertebrate animals,
ovarian maturation occurs concurrently with the growth and formation of a new shell,
moulting or ecdysis. One of the main stages of this period is the vitellogenesis, which is the
process by which reserves are progressively stored in oocytes of oviparous animals, resulting
on the yolk from the mature eggs. The studies on evaluating M. amazonicum ovarian
development processes, and the importance of these processes for the success in the
production and maintenance of natural stocks, are too few. This review aims to gather
information on the ovarian development of the main commercial species of shrimp to direct
researches that aim to go further in search of knowledge about the biology of the Amazon
River prawn, M. amazonicum.
Key words: vitellogenesis, Macrobrachium amazonicum, gonadal development,
ablation, parental diet.
32
INTRODUÇÃO
A reprodução nos crustáceos, especialmente nos decápodas, ocorre geralmente entre a
interação da muda e do desenvolvimento gonadal. Estes eventos envolvem mobilização
cíclica de reservas orgânicas estocadas que serão direcionadas para a epiderme e gônadas
através de ação hormonal (ADIYODI & ADIYODI, 1970). Assim, o desenvolvimento
ovariano em crustáceos é regulado principalmente por dois neurohormônios, o hormônio
inibidor da gônada (GIH) secretado pelo complexo órgão X (glândula do sinus), localizados
nos pedúnculos oculares e pelo hormônio estimulante da gônada (GSH), secretado pelo
cérebro e gânglio torácico (ADIYODI & ADIYODI, 1970; EASTMAN-REKS &
FINGERMAN, 1984; WAINWRIGHT & REES, 2001).
O ciclo reprodutivo dos crustáceos é constituído por quatro etapas, segundo Pinheiro
(1998): maturação gonadal, liberação dos gametas, incubação dos ovos e eclosão das larvas.
Ainda segundo esse autor, em sistemas de cultivo, as taxas de fecundidade e de fertilidade das
espécies cultiváveis tornam-se importantes, devido ao fato desses serem fatores determinantes
para o cultivo.
Na maturação gonadal existem fatores exógenos e endógenos que interferem na
fisiologia dos crustáceos. Dentre os exógenos destaca-se a ablação do pedúnculo ocular
(CUNHA & OSHITO, 2010) e a alimentação (SAMUEL et al., 1999) e entre os fatores
endógenos estão o estádio de desenvolvimento (CHAVEZ & MAGALHÃES, 1993), o
estádio de muda (LOBÃO et al., 1996), a energia e as reservas de nutrientes necessárias para a
reprodução (SHANJU & GERALDINE, 2011). Tais fatores levam a mudanças fisiológicas
nos decápodes, induzindo modificações metabólicas e hormonais.
Uma etapa crucial no processo de maturação gonadal em cada ciclo reprodutivo de
decápodes é a vitelogênese, que se caracteriza por um aumento massivo da concentração de
vitelogenina na hemolinfa, sendo um pré-requisito necessário para a maturação completa de
33
ovócitos ovarianos. Dentre as principais técnicas utilizadas para estimular a vitelogênese
merece destaque a técnica de ablação do pedúnculo ocular, que consiste no corte ou
esmagamento de um dos pedúnculos oculares. Esta técnica vem sendo utilizada com sucesso
na indução da maturação gonadal de crustáceos decápodes obtendo-se uma antecipação do
estado ovígero e um aumento na frequência de desovas (BARBIÉRI Jr & OSTRENSKY,
2001).
Adicionalmente à ablação do pedúnculo ocular, a alimentação é de fundamental
importância no processo de maturação, principalmente quando se trata de fazê-lo em
pequenos tanques. Entre os principais compostos da dieta estão às gorduras, principalmente os
ácidos graxos da série linolênica (ômega3, de origem marinha), colesterol e seus derivados
(FENUCCI, 1988). Uma dieta adequada é identificada como fator crucial para a maturidade
sexual e a reprodução de camarões em cativeiro. Quando a dieta é desbalanceada ou
incompleta pode causar baixo desempenho reprodutivo ou até mesmo impedir a reprodução
(KAWAHIGASHI, 1998).
Dentre as espécies nativas brasileiras, Macrobrachium amazonicum é a preferida
atualmente para cultivos, devido ao seu rápido crescimento e fácil manutenção em cativeiro.
Apesar de atingir um crescimento menor que outras espécies do mesmo gênero, a mesma não
apresenta a agressividade característica de M. acanthurus e M. carcinus, além de ser mais
resistente a doenças e predadores (LOBÃO; ROJAS, 1991).
Devido a escassez de estudos avaliando os processos envolvidos com desenvolvimento
ovariano no camarão M. amazonicum, e a importância desse processo para o sucesso na
produção e manutenção de estoques naturais, esta revisão tem como objetivo reunir
informações a cerca do desenvolvimento ovariano das principais espécies comerciais de
camarões, para o direcionamento de pesquisas que visem um maior conhecimento acerca da
biologia do camarão da Amazônia, M. amazonicum.
34
Aparelho reprodutor das fêmeas decápodas
Nas fêmeas decápodes, o aparelho reprodutor é constituído por um par de ovários
associados aos ovidutos que se abrem nos gonóporos localizados na base do terceiro par de
pereiópodos (KROLL et al., 1992). Ainda segundo o autor, algumas fêmeas apresentam
estruturas especializadas para receber o esperma, como a espermateca em decápodes.
Com especial ênfase aos ovários dos decápodes de água doce, estes estão localizados
na região dorsal do intestino. Eles são parcialmente fusionados na região cefalotorácica,
consistindo de um par e vários lobos laterais (KROLL et al., 1992). Em espécies do gênero
Macrobrachium, como por exemplo, em M. rosenbergii, ovários totalmente desenvolvidos se
encontram apoiados dorsalmente no estômago e hepatopâncreas, logo atrás dos olhos,
podendo adentrar até o primeiro segmento abdominal (LING, 1969). Assim, os ovários desta
espécie se desenvolvem em direção à parte posterior do cefalotórax, e quando maduros
tornam-se facilmente identificáveis por transparência da carapaça, como uma grande massa
alaranjada devido ao acumulo de vitelogenina, que contém pigmentos do tipo carotenoides.
(CAVALLI et al., 2001).
Nesses crustáceos, os ovários estão envoltos por uma cápsula de tecido conjuntivo que
se invagina formando septos, os quais suportam o epitélio germinativo. O epitélio
germinativo origina as ovogônias e as células foliculares (ADIYODI & SUBRAMONIAM,
1983; BELL & LIGHTNER, 1988).
O epitélio germinativo, também denominado de zona de proliferação pode ser
observado tanto na periferia como no centro dos ovários da maioria das espécies de
decápodes. As zonas de proliferação constituem a camada germinal das ovogônias (KROLL
et al., 1992). Estas zonas de proliferação podem variar em relação às espécies, devido à
pressão exercida pela produção e crescimento dos ovócitos.
Desenvolvimento ovariano
35
A maturação do ovário, em crustáceos, pode ser e observada à medida que o órgão
sofre uma série de mudanças na coloração e no tamanho durante o seu desenvolvimento. Em
muitos estudos morfológicos mudanças (cor) e índice gonadal (relação entre o peso da gônada
e o peso do animal) foram utilizados como um marcador para o desenvolvimento das gónadas
de maturação.
Segundo Carvalho e Pereira (1981) fêmeas do camarão M. acanthurus semelhante às
de M. rosenbergii apresentam quatro estádios de desenvolvimento gonadal. No entanto, esses
autores dividiram o estádio II em três níveis de maturação, os quais apresentam diferenças
apenas na coloração, sendo estes:
1) Estádio I – Imaturo: ovários pequenos, incolores e transparentes; não são visíveis
por transparência da carapaça;
2) Estádio II – em Maturação: caracterizado pelas fases de pré-vitelogênese e
vitelogênese. Esses autores subdividiram estes dois estádios em três níveis de maturação: a)
Maturação 1: ovários opacos, esbranquiçados ou às vezes esverdeados. Nesta fase surgem os
primeiros pigmentos e os ovários são visualizados através da carapaça; b) Maturação 2:
ovários túrgidos, distendidos em comprimento, largura e espessura. Apresentam coloração
verde-clara, com a superfície dorsal rica em cromatóforos, visível através da carapaça; e c)
Maturação 3: ovários volumosos, túrgidos. Os ovários, de coloração verde-oliva, ricos em
cromatóforos, podem ser observados sem dificuldade por transparência da carapaça;
3) Estádio III – Maduro: ovários volumosos, túrgidos, de coloração verde-escura.
Quando totalmente cheios, os ovários preenchem toda a cavidade cefalotoráxica dorsal,
distendendo-se da base do rostro até a metade do primeiro segmento abdominal e;
4) Estádio IV – Pós-eliminação total: ovários pequenos, flácidos, de coloração pardo-
amarelada ou esbranquiçada, ricamente permeados de cromatóforos. Tamanho e localização
semelhantes aos observados nos estádios I e II, anteriormente descritos.
36
Vitelogênese
Uma etapa crucial no processo de desenvolvimento ovariano é a vitelogênese, que é
um período importante no desenvolvimento ovariano de fêmeas de crustáceos, caracterizada
por massivo aumento da concentração da síntese de vitelogenina na hemolinfa e, sua posterior
deposição em oócitos em crescimento.
É um processo importante na reprodução de animais ovíparos (JASMANI et al.,
2004), sendo dividido em duas fases: vitelogênese primária, ou endógena, na qual o ovócito
passa a acumular vitelo endógeno, e termina quando o ovócito atinge o diâmetro característico
de cada espécie; e a vitelogênese secundária, ou exógena, que passa a acontecer quando a
vitelogenina, que é a precursora do vitelo, está presente na hemolinfa, no ovário e no
hepatopâncreas, é captada pelo ovário por endocitose (KROLL et al., 1992; FERREIRA et al.,
2012).
A composição da substância de reserva dos oócitos pode variar de espécie para
espécie e às vezes até mesmo entre os indivíduos, dependendo da dieta. Sabe-se que a água é
o constituinte principal deste, e a parte sólida contém quase todos os compostos orgânicos e
inorgânicos que são necessários para sustentar a vida e garantir um crescimento normal do
embrião. Dentre estes as proteínas e os lipídios constituem a maior parte das reservas
orgânicas do vitelo, representando 50-80% da matéria seca em um ovário maduro
(MILLAMENA & PASCUAL, 1990; PENAFLORIDA & MILLAMENA, 1990;
MOHAMED & DIWAN, 1992; SYAMA, 2009).
Nos crustáceos um órgão que esta intimamente ligado a modificação e armazenamento
dos lipídios para serem utilizados na vitelogênese é o hepatopâncreas (YING et al., 2006). Os
recursos deste são utilizados para atender às necessidades de reprodução e metabólicas da
fêmea (ADIYODI & ADIYODI, 1970; ANILKUMAR, 1980; HASEK & FELDER, 2005). O
papel deste no fornecimento de nutrientes para o desenvolvimento ováriano tem sido relatado
37
em algumas espécies de camarão (TSENG et al., 2001; BUCKUP et al., 2008). Ocorrem
também relatos na literatura do papel do hepatopâncreas de crustáceos como o local de síntese
da vitelogenina (LEE & CHANG, 1999; SOROKA et al, 2000; YANG et al., 2000). No
camarão, Penaeus vannamei, além do ovário, o hepatopâncreas foi encontrado como sendo o
sítio comum para a síntese de vitelogenina (YANO & CHINZEI, 1987).
O processo de formação e acumulação de vitelo nos ovócitos de crustáceos tem sido
ao longo dos anos discutida por alguns autores que dizem que a origem do vitelo pode ser
como produção intraovocítica, extra-ovocítica ou a combinação das duas (LEPORE et al,
1993).
Um dos principais argumentos a favor da origem extra-ovocítica é a existência na
hemolinfa de uma proteína idêntica à contida nas vesículas de vitelo (lipovitelina), que
entraria no ovócito pelo processo de pinocitose, o qual ocorreria apenas quando os ovócitos
acumulam reservas de vitelo (WOLIN et al, 1973).
A hipótese da produção extra-ovocítica de vitelo é ainda suportada pela observação
ultrastrutural de numerosas microvilosidades e vesículas de micropinocitose na membrana
plasmática de ovócitos em vitelogênese que sugerem uma produção exógena de componentes
do vitelo que desta forma entram no ovócito (LEPORE et al, 1993). Vários estudos utilizando
marcadores demonstraram a captura de material exógeno pelo ovócito (WOLIN et al, 1973).
Estudos imunológicos em vários décapodas identificaram locais extra-ováricos de síntese da
vitelina e da vitelogenina (molécula precursora da vitelina): hemócitos, hemolinfa (KROL et
al, 1992), tecido adiposo subepidermal (Junéra e Croisille, 1980), e o hepatopâncreas
(FERREIRA, 2012). A vitelogenina poderia ainda ser sintetizada pelas células foliculares,
secretada para a hemolinfa e dali captada pelos ovócitos em desenvolvimento (YANO &
CHINZEI, 1987).
Interação muda e maturação gonadal
38
Para que a vitelogênese ocorra, na maioria dos crustáceos, as atividades vitelogênicas
devem acontecer entre as fases do ciclo de muda. Normalmente esta ocorre durante os
estádios B, C e D1 da muda.
O crescimento dos crustáceos é um processo descontinuo associado com sucessivas
mudas (HARTNOLL, 2001). Este processo de muda é identificado por estádios e sub-estádios
característicos. Para decápodes são indicados os estádios A, B, C, D e E divididos em pós-
muda precoce A1 e A2, pós-muda tardia B1 e B2; estádios de intermuda C1 precoce e C2
tardia; e estádios de pré-muda D0, D1’, D1’’ e D1’’’; D2’ e D2’’; D3; D4 e E (ecdise)
(HAYD et al., 2008). Segundo Chen e Chen (2003) as mudas de decápodes são afetada por
fatores com temperatura, salinidade, intensidade luminosa, poluentes e também pela nutrição.
Entre os décapodes, podem ser distinguidos dois tipos de ciclo de muda: um
denominado "diecdísico", caracterizado pela existência de várias mudas ao longo do ano ou
de uma época e no qual a fase de intermuda, C4, é muito curta, e o outro "anecdísico", no qual
a muda é anual e logo com um período de intermuda bastante mais longo. Alguns décapodes
cessam, de forma permanente, o ciclo de muda a partir de um determinado estado adulto -
anecdísico terminal ou permanente (estádio C4 T). A continuação do processo reprodutivo
nestas espécies em C4 T, ou de várias desovas durante a mesma intermuda que é nesse caso
prolongada, constituem um forte argumento para a distinção dos dois hormônios, os quais
podem, conforme a fase do ciclo da muda, agir antagônica ou sinergeticamente. O sinergismo
aparente do hormônio inibidor da muda (MIH) e do hormônio inibidor da gônada (GIH),
característico durante a pós-muda, é transformado num antagonismo durante a intermuda,
dada a necessária mobilização das reservas metabólicas para o ovário, que se sobrepõe
temporariamente ao crescimento tecidular. De fato, um elevado nível de MIH é essencial para
a reprodução, inibindo o funcionamento do órgão Y. Nos décapodas, as células do órgão X,
sob a influência de diferentes sinais (fotoperíodo, temperatura, alimentação), poderão dar
39
origem à MIH ou à GIH. Considerando o crescimento dos ovócitos em duas fases, em que na
primeira o ovócito cresce até ser capaz de acumular o vitelo e na segunda o vitelo é
depositado, o controle por inibição da GIH parece exercer-se apenas na segunda fase, sendo a
primeira controlada positivamente pelo hormônio da muda (MH) (ADIYODI & ADIYODI,
1970).
O crescimento somático e a reprodução, como processos inseparáveis e integrados,
necessitam de um mecanismo de controle estreitamente interligado: o desenvolvimento da
gônada é possível através de uma transformação de sinergismo entre a MIH e a GIH, como
acontece na pós-muda, para um antagonismo durante a intermuda o que possibilita o
desenrolar do processo reprodutivo. A muda é desencadeada quando os níveis dos hormônios
MIH e GSH são baixos e os níveis das hormonas GIH e MH são elevados; por outro lado, o
processo reprodutivo é iniciado quando os níveis das hormonas MIH e GSH (hormônio
estimulador da gônada) são elevados e os níveis das hormonas GIH e MH são baixos. Nos
animais ablacionados, a muda acontece se a atividade da hormona GSH estiver suprimida
pelo sistema nervoso central (SNC) ou/e pela MH, e a reprodução pode ocorrer se a GSH, por
estimulação do SNC, suprimir a ação da MH (ADIYODI & ADIYODI, 1970).
Regulação endócrina da vitelogênese
Essa ligação intrinseca e indissolúvel entre muda e vitelogênese é realizada por uma
delicada interação multihormonal, que envolve principalmente neuropeptídeos – hormônio
inibidor da vitelogênese (VIH) e hormônio inibidor da muda (MIH), ambos originários do
complexo órgão-X/glândula do seio (COX/GS). Assim, a coordenação hormonal, tanto da
muda quanto da vitelogênese torna-se vital para a realização de um crescimento contínuo do
corpo e aumento da fecundidade. Os fatores endócrinos que controlam este processo podem
ser divididos em duas classes: hormônios inibidores e os hormônios estimuladores do
desenvolvimento ovariano.
40
Hormônios inibidores do desenvolvimento ovariano: são encontrados, principalmente
no pedúnculo ocular, no chamado complexo órgão-X/glândula do seio (COX/GS). O
complexo órgão-X/glândula do seio (COX/GS) é o principal centro de controle endócrino, e
localizado bilateralmente no pedúnculo ocular da maioria dos crustáceos (REDDY &
RAMAMURTHI, 1999). O órgão-X é formado por um conjunto de células neurossecretora.
Os axônios das células formam um nervo principal que converge lateralemente para a
hemolinfa onde seus terminais axônios dilatados formam uma discreta armazenagem de onde
serão libertação os hormônios, ou seja, seio glândula (SPAZIANI et al., 1994). Em
crustáceos, os hormônios produzidos pelo órgão X são armazenados na cavidade da glândula,
de onde são lançados na hemolinfa sob os estímulos apropriados. Os principais hormônios
peptídicos secretados pelo complexo são: MIH (hormônio inibidor da muda), VIH (hormônio
inibidor da vitelogênese) e CHH (hormônio hiperglicêmiante de crustáceos); coletivamente
chamados de peptídeos família-CHH. MIH, e VIH têm como alvo outras glândulas
endócrinas, enquanto CHH tem como alvo tecidos somáticos. Tudos esses hormônios
peptídicos possuem sobreposições atividades biológicas (KELLER, 1992; NAGARAJU,
2011).
Papel dos lipídios na nutrição de Decápodes
O lipídio, a principal fonte de energia é referida como o componente orgânico
principal de hepatopâncreas; seu metabolismo está sujeito a maior modificação durante a
vitelogênese, embriogênese e desenvolvimento larval. Os lipídios desempenham um papel
essencial como uma reserva de energia (triacilgliceróis), e como o componente básico de
membranas (fosfolipídeos), na síntese hormonal e constitui a parte mais importante da vitelina
(KANAZAWA & TESHIMA, 1971; GALOIS, 1983).
Na espécie exótica M. rosenbergii, o hepatopâncreas é o principal órgão de
armazenamento e processamento de lipídios (D 'ABRAMO & SHEEN, 1993). No entanto, as
41
suas reservas contribuem apenas parcialmente para a vitelogênese (CAVALLI et al., 1999). A
diminuição significativa em alguns tipos de lipídios neutros, principalmente o triacilglicerol,
de ácidos graxos livres e dos diacilgliceróis, ocorre na fase final de maturação (CAVALLI et
al., 2001). O mesmo ocorre para fêmeas da espécie Penaueus monodon. Os níveis de lipídios
neutros são normalizados após a desova, o que sugere um possível armazenamento de energia
no final da maturação dos ovários, necessária para cobrir as necessidades metabólicas para
desova (MILLAMENA & PASCUAL, 1990; CAVALLI et al, 2001). Os níveis elevados de
lipídio neutro, principalmente triglicéridos tanto nos ovários quanto no hepatopâncreas, vem
sendo relatado em várias espécies de camarão, tais como P. japonicus (TESHIMA et al.,
1989), P. monodon (MILLAMENA & PASCUAL, 1990) e M. rosenbergii (CAVALLI et al.
2001) ao longo do período de maturação dos ovários.
A importância dos lipídios no metabolismo embrionário pode ser aferida pelo fato de
representar 60% do total da energia utilizada no desenvolvimento do embrião dos crustáceos
(WEHRTMANN & GRAEVE, 1998). Durante a embriogênese, a maioria dos lipídios
reorganiza-se, ao invés de ser utilizado como fonte de energia, verificando-se um consumo
seletivo (BABU, 1987). Os fosfolipídios e colesterol são usados como componentes
estruturais na biogénese de membranas (ROSA & NUNES 2002; ROSA & NUNES 2003). A
utilização preferencial de lipídios polares ou neutros depende da espécie e pode ser reflexo de
adaptações ambientais (NARCISO, 1999).
Tal como nos peixes marinhos, os camarões apresentam uma biossíntese de ácido
ecosapentaenóico (EPA) 20:5n-3 e ácido docosahexaenóico (DHA) 22:6n-3 a partir dos seus
precursores, muito pouco ativa, o que indicia uma baixa atividade do enzima dessaturase 4 e
Δ5 (NARCISO, 1999; POUSÃO-FERREIRA, 2006). Assim, EPA e DHA são considerados
ácidos graxos essenciais (EFA) para os camarões, com funções importantes na reprodução,
fertilização, eclosão e crescimento. O aporte de DHA e EPA tem de ser pela dieta, porque a
42
capacidade para os sintetizar é limitada e a quantidade disponibilizada pelo hepatopâncreas
não suprime as necessidades (YING et al., 2006), sendo o perfil em ácidos gordos dos
crustáceos normalmente reflexo da sua dieta, especialmente no que diz respeito aos EFA. A
necessidade dos crustáceos em obter PUFA n-3 traduz a importância destes ácidos gordos em
funções fisiológicas estruturais (NARCISO, 1999).
Ao contrário dos peixes, os crustáceos são incapazes de biossintetizar esteróis, devido
à ausência da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase (MITRA;
MUKHOPADHYAY; CHATTOPADHYAY, 2005), razão pela qual, o colesterol é
considerado um nutriente essencial nas dietas de crustáceos.
De acordo com Wouters et al. (2001), é necessário o armazenamento suficiente de
nutrientes para o início da reprodução de camarões, além disto, dietas ricas em lipídios são
importantes para a maturação gonadal.
Nas espécies ovíparas ou ovovivíparas, em que o desenvolvimento embrionário é
independente do corpo materno, os ovos funcionam quase como um sistema fechado, já que
não existe aporte de nutrientes maternos, e é essencial que as reservas vitelinas contenham os
nutrientes e a energia indispensáveis à manutenção da homeostasia e ao desenvolvimento do
embrião, até ao início da alimentação exógena (ROSA et al., 2007).
Em qualquer espécie a descendência é afetada direta e indiretamente pela qualidade da
dieta dos progenitores, com especial ênfase pela dieta materna. A oviparidade foi para muitos
organismos multicelulares, uma estratégia de vida que permitiu um grande salto evolutivo,
uma vez que a embriogênese se desenvolve fora do corpo materno (ROSA et al., 2007).
Nos crustáceos, as fêmeas podem transferir até 60% das suas reservas lipídicas para os
ovos (ROSA et al., 2007), o que sugere que o metabolismo dos lipídios é extremamente
dependente das reservas parentais (ROSA & NUNES 2002; ROSA & NUNES 2003),
43
existindo cada vez mais evidências de que a acumulação de lipídios nos ovários provem
diretamente da dieta (WOUTERS et al., 2001).
Em um estudo conduzido por Cavalli et al. (2001) com M. rosenbergii foi observado
que o nível total de lipídios no ovário da fêmea aumentava a medida que a maturação
avançava, sendo o requerimento de lipídeos para o desenvolvimento do ovário dependente da
imediata ingestão de dietas com esse nutriente, visto que de uma forma geral, os crustáceos
têm habilidade limitada para biossíntese de fosfolipídios.
O decápode de água doce, camarão da Amazônia, Macrobrachium amazonicum
Os camarões de água doce são crustáceos decápodes pertencentes à subordem
Pleocyemata e família Palaemonidae (HOLTHUIS & NG, 2010). O gênero mais
representativo desta família é o Macrobrachium, que segundo Holthuis e Ng (2010), é
circuntropical e nativo em todos os continentes, exceto na Europa e Antartida. Atualmente,
existem em todo o mundo cerca de 243 espécies de camarões pertencentes a esse gênero (DE
GRAVE & FRANSEN, 2011), dentre as quais 46 são registradas nas Américas e 19 no Brasil
(MELO, 2003; SANTOS; HAYD & ANGER, 2013). Vale destacar que, a maioria das
espécies de camarão de água doce de interesse comercial pertence ao gênero Macrobrachium
(MELO, 2003).
No Brasil, os camarões de água doce estão distribuidos em três famílias e nove
gêneros. A família Palaemonidae é subdividida nas subfamílias Palaemoninae e
Euryrhynchinae, nestas, seis gêneros foram catalogados até o momento, Palemonetes,
Paleomon, Pseudopaleomon, Cryopisis e Macrobrachium, pertencentes à primeira
subfamília e o gênero Euryrhynchus pertencente à segunda. Já a família Atyidae é composta
pelos gêneros Potimirim e Atya. Por fim, a família Segestidae é composta pelo gênero Acetes
(MELO, 2003).
44
Ainda de acordo com Melo (2003), a família Palaemonidae é a mais representativa no
Brasil. No Ceará, das oito espécies de camarões de água doce identificadas, sete pertencem a
esta família, sendo todas representantes do gênero Macrobrachium, tais estas, M. acanthurus,
M. amazonicum, M. birai, M. carcinus, M. jelskii, M. nattereri e M. olfersi. A espécie Atya
scabra também é encontrada no estado.
Das espécies nativas do Brasil, M. amazonicum é a preferida atualmente para estudos
sobre viabilidade de cultivos, devido ao seu rápido crescimento e fácil manutenção em
cativeiro. Apesar de atingir um crescimento menor que outras espécies do gênero, com cerca
de 10 g e 10 cm de comprimento e peso médios, a mesma não apresenta a agressividade
característica de M. acanthurus e M. carcinus, além de ser mais resistente a doenças e
predadores (LOBÃO & ROJAS, 1991).
Em relação às populações observadas para o M. amazonicum foram descritas as que
vivem próximas à costa e, portanto, suas larvas necessitam de água salobra, e uma população
que vive a quilômetros de distância do litoral e por isso completam seu ciclo em água doce
(KUTTY et al., 2000).
Sua origem no Estado do Ceará deve-se ao fato de ter sido transplantado da bacia
amazônica para servir de espécie forrageiro para peixes carnívoros dos açudes nordestinos, o
qual, a partir de 1959 passou a ser capturado para consumo humano (GURGEL & MATOS,
1983).
Caracteriza-se por apresentar rostro longo e delgado, alcançando além do escafocerito
e dirigido, anteriormente, para cima; margem dorsal com 9 a 12 dentes, sendo o primeiro
situado atrás da órbita; os primeiros sete dentes são aproximados formando uma crista basal
na metade proximal do rosto; os últimos dentes estão mais largamente espeçados, estando o
último próximo da extremidade. Margem ventral do rosto com 8 a 10 dentes, estando o distal
mais largamente espaçado. Pleura do quinto somito abdominal com espinho pequeno, mas
45
distinto. Telso terminando em ponto mediano agudo, com 2 pares de espinhos na margem
posterior, par interno não alcançando a extremidade do telso. Segunda pata, no adulto, é amais
forte, alcançando, por todo o comprimento do carpo, além do escafocerito; dedos ¾ do
comprimento da palma, cobertos por forte camada de cerdas; faces cortantes de ambos os
dedos com forte dente proximal; palma alongada e com numerosas espínulos; carpo, também,
com espínulos, mero 2/3 do comprimento do carpo. Os últimos três pereiópodos alongados, o
terceiro alcançando o fim do escafocerito; própodo da terceira pata três vezes o comprimento
do dátilo; machos adultos com mero, carpo e própodo cobertos por espínulos curtos, nas
fêmeas os espínulos estão ausentes (MELO, 2003).
Reprodução e desenvolvimento ovariano de fêmeas de M. amazonicum
Sobre a reprodução da espécie, as fêmeas apresentam atividade reprodutiva contínua,
com maior intensidade durante a primavera, final do verão e início do outono, períodos estes
que coincidem com o início e o final da estação chuvosa e com o aumento das temperaturas
do ar e da água (PORTO, 1998). Já sobre o desenvolvimento ovariano da espécie, o autor
descreve quatro, e não cinco estádios gonadais, pois o mesmo não considera a condição de
desovado como um outro estádio: 1) Estádio I – Imaturo: ovários incolores e transparentes, de
difícil visualização através da carapaça. Localizam-se sobre o hepatopâncreas, no espaço entre
o coração e o estômago. Oócitos não visíveis a olho nu. Ausência de cromatóforos; 2) Estádio
RD – Rudimentar: ovários no início do desenvolvimento, opacos e levemente esverdeados.
Localizam-se no espaço entre a base do rostro e o coração, ocupam inicialmente ¼, podendo
atingir até 2/4, distendendo-se e começando a recobrir a borda superior do estômago.
Aparência entre levemente granulosa, com oócitos pouco diferenciados, e um pouco mais
granulosa, com oócitos pequenos. Alguns cromatóforos são visíveis por transparência da
carapaça; 3) Estádio IN – intermediário: ovários de coloração geralmente verde-claro, opacos.
Projetam-se sobre o estômago, ocupando cerca de ¾ do espaço entre a base do rostro e o
46
coração. Aparência um pouco mais granulosa com oócitos bem distintos. Observação de
muitos cromatóforos podem ser observados por transparência da carapaça; 4) Estádio M –
Maduro: desenvolvimento máximo dos ovários, de coloração verde-escura, volumosos e
túrgidos. Recobrem todo o estômago, preenchendo inteiramente o espaço entre a base do
rostro e o coração. Aparência intensamente granulosa devido aos oócitos nitidamente visíveis.
Superfície dos ovários repleta de grandes cromatóforos, observados facilmente por
transparência da carapaça e 5) Condição D – Desovado: ovários esbranquiçados, flácidos e
pequenos. Localizam-se sobre o hepatopâncreas, ocupando a região mediana do espaço entre
o estômago e o coração. Alguns indícios ajudam a reconhecer as fêmeas com ovários na
condição de desovado, como a presença de câmara incubadora no abdome e vestígios de
recente incubação de ovos (cascas de ovos aderidos nas cerdas ovígeras dos pleópodes).
Já Ribeiro (2006), descreveu as seguintes características para a maturação ovariana:
Estádio I: ovários são pequenos, incolores e apresentam consistência gelatinosa. Estádio II:
apresentam coloração esbranquiçada. Nesse estádio observam-se aumentos no tamanho e no
volume do ovário, e sua visualização ainda é difícil por transparência através da carapaça.
Estágio III: ovários apresentam coloração esverdeada e cromatóforos em sua região dorsal.
Esses órgãos são túrgidos e encontram-se apoiados na parte posterior do estômago. Neste
estágio de maturação é possível a visualização do ovário por transparência através da
carapaça. Estádio IV: ovários apresentam-se túrgidos, volumosos e de coloração esverdeada
mais intensa quando comparada ao estágio III. Os ovários ocupam grande parte da cavidade
do celoma no cefalotórax e são facilmente observados por transparência através da carapaça.
Estádio V: os ovários são mais volumosos e túrgidos, e de coloração verde intenso. Estes
órgãos preenchem toda a cavidade cefalotorácica e se estendem da região entre os olhos
pedunculados até o primeiro segmento abdominal, sendo facilmente observado por
transparência através da carapaça.
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Vitelogênese em fêmeas de M. amazonicum
Poucos são os estudos desenvolvidos até o presente momento que investigam a
vitelogênese nesta espécie. No ano de 2012, Ferreria et al, (2012) descobriram que a
expressão de vitelogênese ocorre tanto no ovário quanto no hepatopâncreas. Que a
vitelogenina começa a ser encontrada nos ovários a partir de primeiro estádio de maturação,
porém seu pico acontece no estádio 3 de maturação.
Outro resultado encontrado no estudo foi que este processo promove o acúmulo de
lípídios e o crescimento de oócitos, assim como favorece também a maturação sexual das
fêmeas.
CONCLUSÃO
Todos os eventos metabólicos que ocorrem durante o cultivo de crustáceos decápodas
são de suma importância, visto que Carcinicultura movimenta anualmente, milhões de dólares
no mundo inteiro. Tentar diminuir o tempo de maturação das espécies, tentando maximizar a
produção com o intuito de obter animais aptos a reprodução, e fazendo com que estes
produzam descentes em maior quantidade e com melhor qualidade, norteiam a atividade
aquícola. Entender o metabolismo animal, dando ênfase a diminuição do tempo de obtenção
de novos animais passa por entender a maturação gonadal dos progenitores. Uma etapa
crucial desse processo é a vitelogênese, que é de suma importância, visto que é intimamente
ligada a maturação gonadal e oocitária. A espécie nativa com maior potencial para o cultivo,
M. amazonicum apresenta, até o momento, informações escassas sobre este processo, sendo
de suma importância a compreensão da vitelogênese desta, para contribuir com informações
essenciais para a implementação de técnicas de manejo adequadas para preservação e cultivo
desta espécie.
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6 CAPÍTULO 2
EFEITO DA UNIABLAÇÃO DO PEDÚNCULO OCULAR NA MORFOLOGIA DA GLÂNDULA DIGESTIVA E DOS OVÁRIOS DE FÊMEAS DE MACROBRACHIUM AMAZONICUM
(HELLER, 1862)
EFFECT OF UNILATERAL EYESTALK ABLATION ON THE MORPHOLOGY OF THE DIGESTIVE GLAND AND OVARIES OF MACROBRACHIUM AMAZONICUM (HELLER, 1862)
FEMALES Periódico: Ciência Rural
55
RESUMO
Este estudo teve como objetivos avaliar os efeitos da uniablação do pedúnculo ocular na
morfologia da glândula digestiva e dos ovários de fêmeas de Macrobrachium amazonicum.
Fêmeas de M. amazonicum foram distribuídas aleatoriamente, em dois grupos, animais
intactos e uniablados, com 50 indivíduos cada, que foram distribuídas em dez subgrupos com
10 camarões em aquários com volume útil de 20 L, com temperatura e pH medidos
diariamente. Os animais foram observados durantes 90 dias, no qual foi acompanhada a
maturação ovariana, o processo de muda e o comportamento animal. Na análise histológica,
as glândulas digestivas e os ovários foram fixados e preparados histologicamente, sendo as
amostras analisadas à microscopia de luz. Observou-se mais muda por animal/mês, nos
aquarios com fêmeas uniabladas. Quanto ao desenvolvimento ovariano, as fêmeas que foram
submetidas a uniablação levaram menos tempo para atingirem ao estádio maduro. Em relação
a análise histologica, a glândula digestiva apresentou uma maior vacuolização das células B
nas amostras oriundas de fêmeas intactas. Na analise dos ovários foram encontradas
diferenças histologicas, nas fêmeas uniabladas não foi observado a presença de oócitos pré-
ovulatórios, sendo encontrado apenas oogônias, oócitos primários, secundários e terciários, e
ocorreu uma acentuada proliferação de tecido conjuntivo ao longo da gônada. Pode-se
concluir que a uniablação do pedúnculo ocular aplicada em fêmeas de M. amazonicum na
temperatura média de 30,0 ºC e pH 8,0 diminui o tempo necessário para a maturação
ovariana.
56
Effect of unilateral eyestalk ablation on the morphology of the digestive gland and
ovaries ofMacrobrachiumamazonicum(Heller, 1862)females
Efeito da uniablação do pedúnculo ocular na morfologia da glândula digestiva e dos ovários
de fêmeas de Macrobrachiumamazonicum(Heller, 1862)
Míriam L. N.de S. Martins1*, Aldeney Andrade Soares Filho2, Manoel de Araújo NetoPaiva3,
Moises FernandesMartins1, Arthur Vinicius Lourenço Ferreira1,,Janaina Serra Azul Monteiro
Evangelista1, Glayciane Bezerra de Morais1, Francisco Antônio Felix Xavier Júnior5, Karen
Denise da Silva Macambira Barbosa5, Célia Maria de Souza Sampaio1
1-School of Veterinary Medicine, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil. 3- Department of Fisheries Engineering, Federal University of Ceará, Bioecology Laboratory - LABEC 4-Federal Institute of Education, Science and Technology of Ceará, CampusAcaraú, Environmental Biology Laboratory and Microbiology – LABIAM 5- Histology Laboratory of the State University of Ceará *CorrespondingAuthor. Míriam L. N.de S. Martins. Rua José Camelo, 169; Parangaba. CEP: 60.740-750. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 85 3101-9604. E-mail: [email protected] ABSTRACT
This study aimed to evaluate the effects of unilateral eyestalk ablation on digestive gland and
the ovaries morphology of Macrobrachium amazonicum females. These females prawn were
randomly assigned into two groups, intact and unilateral eyestalk ablated animals, with 50
individuals each, which were distributed in ten groups with 10 prawns in aquariums with
useful volume of 20 L, with temperature and pH measured daily. The animals were observed
for 90 days, in which ovarian maturation, moulting and animal behavior were monitored. In
the histological analysis, the digestive glands and the ovaries were fixed and histologically
prepared, and the samples were analyzed by light microscopy. There was more molt per
animal/month in aquariums with unilateral eyestalk ablated female. In relation to the ovarian
development, females who underwent unilateral eyestalk ablation reached a mature stage
faster. Concerning the histological analysis, the digestive gland showed a higher vacuolation
of the B cells in the samples from intact females. Histological differences were found in the
57
analysis of ovarian, in the unilateral eyestalk females was not observed the presence of
preovulatory oocytes, It was found only oogonia, primary, secondary and tertiary oocytes, and
there was a marked proliferation of connective tissue along the gonad. It was concluded that
the unilateral eyestalk ablation applied to M. amazonicum female, at a temperature of 30.0 ° C
and pH 8.0 decreases the time required for ovarian maturation.
Key words: gonadal maturation, freshwater prawn, hepatopancreas, morphophysiology
reproduction.
RESUMO
Este estudo teve como objetivos avaliar os efeitos da uniablação do pedúnculo ocular na
morfologia da glândula digestiva e dos ovários de fêmeas de Macrobrachium amazonicum.
Fêmeas de M. amazonicumf oram distribuídas aleatoriamente, em dois grupos, animais
intactos e uniablados, com 50 indivíduos cada, que foram distribuídas em dez subgrupos com
10 camarões em aquários com volume útil de 20 L, com temperatura e pH medidos
diariamente. Os animais foram observados durantes 90 dias, no qual foi acompanhada a
maturação ovariana, o processo de muda e o comportamento animal. Na análise histológica,
as glândulas digestivas e os ovários foram fixados e preparados histologicamente, sendo as
amostras analisadas à microscopia de luz. Observou-se mais muda por animal/mês, nos
aquarios com fêmeas uniabladas. Quanto ao desenvolvimento ovariano, as fêmeas que foram
submetidas a uniablação levaram menos tempo para atingirem ao estádio maduro. Em relação
a análise histologica, a glândula digestiva apresentou uma maior vacuolização das células B
nas amostras oriundas de fêmeas intactas. Na analise dos ovários foram encontradas
diferenças histologicas, nas fêmeas uniabladas não foi observado a presença de oócitos pré-
ovulatórios, sendo encontrado apenas oogônias, oócitos primários, secundários e terciários, e
ocorreu uma acentuada proliferação de tecido conjuntivo ao longo da gônada. Pode-se
concluir que a uniablação do pedúnculo ocular aplicada em fêmeas de M. amazonicum na
58
temperatura média de 30,0 ºC e pH 8,0 diminui o tempo necessário para a maturação
ovariana.
Palavras-chave: maturação gonadal, camarão de água doce, hepatopâncreas, morfofisiologia
da reprodução.
INTRODUCTION
In the southeast of the South American continent, the Macrobrachium amazonicum
prawn stands out because of its economic importance - it is widely exploited in artisanal
fisheries in the north and northeast of Brazil. However, there has been a decline in natural
stocks due to overfishing, combined with the degradation of the environment as a result of
anthropic action (MARCIEL &VALENTI, 2009).
Regarding reproduction, there are factors that lead to physiological changes which
induce metabolic and hormonal changes, whether endogenous, such as the stages of gonadal
development (CHAVEZ &MAGALHÃES, 1993), molt stages (LOBÃO et al., 1996),and the
necessary nutrient reserves for reproduction (SHANJU &GERALDINE, 2011), or exogenous
factors, such as food availability and eyestalk ablation (CUNHA &OSHITO, 2010).
According to Cunha and Oshito (2010), vitellogenesis is a crucial step in the gonadal
maturation process, characterized by a massive increase in vitellogenin concentration in the
hemolymph, being a prerequisite for the full maturation of ovarian oocytes.
Eyestalk ablationis commonly used to stimulate vitellogenesis, which consists in
cutting or crushing the eyestalks. With this, it becomes possible to anticipate the ovigerous
condition and increase the spawning frequency, once the eyestalk contains neurosecretory
cells responsible for the production, storage and distribution of molt and gametogenesis
regulatory hormones, such as the gonad-inhibiting hormone (GIH) and the molt-inhibiting
hormone (MIH) (ADIYODI & ADIYODI, 1970; BARBIÉRI JR & OSTRENSKY, 2001).It is
worth pointing out that this technique has been widely applied in species of penaeid shrimp,
59
successfully producing various species (PRIMAVERA, 1988). However, the application in
species of freshwater prawn has not yet been fully studied, having been tested in some species
of M. acanthurus (CARVALHO &PEREIRA, 1981) and M. rosenbergii (SANTOS &
PINHEIRO, 2000).
Therefore, this study aimed to evaluate the effect of unilateral eyestalk ablation on the
morphology of the digestive gland and ovaries of M. amazonicum females.
MATERIAL AND METHODS
M. amazonicum females originating from the breeding stock of the Laboratory of
Prawn Farming(LACAR) of the State University of Ceará - UECE, were randomly assigned
to two groups: intact animals (50 specimens) and unilaterally ablated animals (50 specimens).
Each group was divided into five subgroups with 10 shrimps in 20-liter tanks. The
temperature and the pH of the water were measured daily, and partial exchange of 30% by
volume of water was carried out in the morning.
Ablation was conducted using heated scissors, the cut flush with the base of the stalk,
on animals previously anesthetized with ice, and during the intermolt stage, according to
Primavera (1979), in order to favor ovarian maturation and not the molt. The animals were fed
a pelleted feed containing 35% of crude protein twice a day. The quantity offered was 5% of
the live weight of the animals stocked. The mortality rate was also observed after the use of
the technique.
The animals were observed over a period of 90 days for ovarian maturation, the
process of molting and animal behavior, according to Carvalho (1998).
For the morphological analysis, digestive glands and the ovaries were removed and
fixed in Davidson® solution for 48 and 72 hours, respectively. Inclusion in paraffin was then
performed, after which the ovaries and glands were cut to a 3-mm size and stained with
hematoxylin /eosin.
60
The analysis of the characteristics of organs such as the ovarian cells and the
hepatopancreas were performed under a Nikon® Eclipse Nis and Nis Software 4.0
microscope. Temperature data and pH were statistically analyzed using the Student’s t-test,
paired for the average alpha of 5% in Graphpad Prism 7.0 software.
RESULTS
The average water temperature was 30.0 °C ± 1.1 and 30.0 ± 1.3 °C for tanks with
intact females and unilaterally ablated females, respectively, with no significant statistical
difference observed (p > 0.05). As for the pH, the average was 8.08 ± 0.4 and 8.3 ± 0.1,
respectively, with significant difference (p< 0.05) between the averages.
There were two molts per animal/month in tanks with intact females, while in tanks
with unilaterally ablated females there were four molts per animal/month.
With regard to ovarian development, intact females spentan average of 27 days to pass
from the spawning stage to the maturity stage. This time was reduced to 22 days in females
who had undergone unilateral ablation.
Histology of the digestive gland (hepatopancreas)
There was no significant statistical difference in the quantification of the cells of the
digestive gland of intact and ablated females. A common feature to both treatments was the
tubular interstitium, wherein the connective tissue between the tubules, in both groups, was
thin and unobtrusive.
There were differences between the two treatments regarding the morphology and
cellular organization of the lobes of the digestive gland. The ablated females showed a large
number of E cells (embryonic), especially in the distal and middle region, and a small amount
of B cells (vesicular) along this region (Figure 1).
61
An intense vacuolization was observed in the lobes of the digestive gland of the
animals in the control group, which indicates a large amount of B cells (vesicular) along the
tubule, with a large vacuole and even fusion of these cells (Figure 1).
Figure 1: Photomicrograph of the digestive gland of M. amazonicum. A: overview
of the digestive gland of the control group. 20x / HE. C: Overview of the digestive gland of
the unilaterally ablated group. Increased 20x. HE. Microscope Nikon Eclipse Nis, Nis
Softaware 4.0.Arrows indicate B cells. Circles indicate E cells.
Ovary Histology
There were no macroscopic differences between the two groups regarding theovaries
tested. Macroscopic analysis allowed the observation of five maturation stages for both the
unilaterally ablated animals as well as the animals in the control group.
The histological analysis showed significant statistical differences in the quantification
of cells between the ovaries of the animals analyzed, in addition to morphological and
organizational differences. The presence of pre ovulatory oocytes was not observed in
unilaterally ablated females. Only oogonia, primary, secondary and tertiary oocytes were
found. A strong amount of proliferation of connective tissue along the ovary was also
observed, which was not restricted to any specific area (Figure 2).
Regarding the intact females, no difference was found when compared to literature,
allowing for the correlation of macroscopic findings with histological findings.
Figure 2: Photomicrographs of ovaries originating from females who suffered
unilateral eyestalk ablation. It shows an accentuated proliferation of connective tissue
(arrows),similar to areas of fibrosis, and the presence of amebocyte (circles) on the
slides.HE. Microscope Nikon Eclipse Nis, Nis Softaware 4.0.
DISCUSSION
62
Throughout the experiment, temperature and water pH measures remained within the
normal patterns expected for the cultivation of the Macrobrachium species, ranging from 28
to 31 ° C and 7.0 to 8.5 respectively, which is considered an optimal range (NEW et al.,
2010).
A change in the overall behavior of the animal was observed after unilateral eyestalk
ablation, since the technique causes a synchronism break in the endocrine metabolism,
resulting in a general physiological imbalance (ADIYODI &ADIYODI 1970).
One of the hormones modified with the removal of the peduncle is the crustacean
hyperglycemic hormone (CHH) which has a key role in the metabolic process and is involved
in the production of ecdysteroids (YASUDA &COLS, 1994) in ovarian physiology
(KHAYAT, 1998) and osmoregulation (SERRANO, 2003).
Increased feed intake and lack of daily feed leftover observed in tanks containing
animals undergoing ablation is related to the lack of substances synthesized by the eyestalk
and which serve to regulate the amount of food ingested by the animal. This substanceis
produced by the X-organ-sinus-gland complex in the breast and is known as the Feeding
Inhibition Factor (FIF) (SEARS el al., 1991). Changes in feeding activity, an increase in the
amount of food ingested and no feed leftover in the tanks has been observed in studies with
other crustacean species subjected to unilateral eyestalk ablation, such as the Panulirus
ornatos lobster(JUINIO-MEÑEZ &RUINATA, 1996), the Penaeus monodon marine shrimp
(PRIMAVERA, 1988) and the M. rosenbergiif reshwater shrimp (SANTOS &PINHEIRO,
2000).Those results corroborate the findings in this study.
Eyestalk ablation also eliminates the source of the gonad-inhibiting hormone (GIH)
and the molt-inhibiting hormone (MIH), allowing for greater concentration of the gonad-
stimulating hormone (GSH) produced by the Y-organ located in the carapace, stimulating
gonadal maturation (ADIYODI &ADIYODI, 1970). This change in hormone levels justifies
63
the differences between the groups, both in the number of molts and in ovarian development
time.
Studies on eyestalk ablation in freshwater prawn were conducted in M. rosenbergii
(SANTOS &PINHEIRO, 2000). According to these authors, unilateral eyestalk ablation was
efficient for the breeding of the species, even in animals that had not reached sexual maturity,
with advantages such as anticipation of the first spawning; increase in the number of
consecutive spawns; reduction of the spawning period; and high rate of spawning/survival at
the end of the experiment.
A maturation cycle was also observed right after ablation, and that the interval
between an ovarian maturation, oocytes presence in the womb, and another maturation was
shorter in the group that underwent the unilateral ablation. The same situation was found by
Cunha and Oshiro (2010) while working with M. acanthurus. The authors found that
unilateral eyestalk ablation is effective to promote ovarian maturation thorough endocrine
imbalance.
The unilateral ablated females had fewer B cells than the intact females. This indicates
a stress which may have been caused by an endocrine imbalance, causing the animals larger
amount of feed. The opposite occurred in the group of intact females that had higher numbers
of B cells throughout the hepatopancreas tubule, and these were so large that they often
merged. Experiments with M. amazonicum farmed in nurseries subjected to two types of
diets, the first consisting of natural food (with no supply of ration) and the second with feed
supply (10%), found the same cellular pattern observed in this study (FRANCESCHINI-
VICENTINI et al., 2009). According to the authors, the pattern with fewer and smaller B cells
results from starvation.
The use of the ablation technique showed a strong proliferation of connective tissue in
the ovaries of all the animals analyzed. According to Carvalho and Pereira (1991), these
64
findings are related to ovaries at the spawning stage. The strong proliferation of connective
tissue cells is associated with an ovarian restoration process, since this has the reabsorption
function, which was also reported in Palaemon paucidens (KAMIGUCHI, 1971) and
Artemisia longinaris (CHRISTIANSEN &SCELZO, 1971).
However, in this study, the morphology of follicular cells, different from that found in
the studies of Chaves and Magalhães (1993) and Carvalho and Pereira (1981), was not
homogeneous. This fact may suggest that the unilateral ablation technique can lead to a
pathological condition of the gonads in the M. amazonicum, showing a possible state of
degeneration or neoplasms. Therefore, studies should be performed to elucidate these
findings.
It is worth highlighting that, in this study, the external morphology of the ovary does
not correspond to the histological findings, since the organs used in this study had anintense
green color, occupying almost the entire carapace region, which characterized the ovary as
mature and not as being at the spawning stage.
CONCLUSION
It can be concluded that the unilateral eyestalk ablation in M. amazonicum females in
average temperature of 30.0 °C and pH 8.0 decreases the time required for ovarian
maturation. However, an adjustment in the amount of feed supplied to these animals is
necessary to make sure if the changes seen in the digestive gland were due to a nutritional
deficit or the technique. It is also important to use cytological techniques to determine
whether the proliferation found in the connective tissue of the ovaries of ablated females is a
normal or pathological condition.
ACKNOWLEDGEMENT
Cearense Foundation for the Support of Scientific and Technological Development
(FUNCAP) for financial support.
65
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Doi:10.1006/gcen.1994.1138.
70
Table 1. Variation of temperature and pH of the water during the 90 days of the experiment
(mean ± standard error).
Unilateral eyestalkablated Intact females
Temperature 30.01±1.33 29.91±1.07
pH 8.27±0.17ᵃ 8.08±0.42ᵇ
a, b indicates significant difference (p < 0.05).
71
Figure 1: Photomicrograph of the digestive gland of M. amazonicum. A: overview of the digestive gland of the control group. 20x / HE. C: Overview of the digestive gland of the unilaterally ablated group. Increased 20x. HE. Microscope Nikon Eclipse Nis, Nis Softaware 4.0. Arrows indicate B cells. Circles indicate E cells.
72
Figure 2: Photomicrographs of ovaries originating from females who suffered unilateral eyestalk ablation. It shows an accentuated proliferation of connective tissue (arrows), similar to areas of fibrosis on the slides. HE. Microscope Nikon Eclipse Nis, Nis Softaware 4.0.
73
CONCLUSÕES (letra times new-roman; tamanho 12; espaço 1,5; justificado)
(A numeração deste ítem deve seguir a numeração dos capítulos).
6 CAPÍTULO 3
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO LIPÍDICA SOBRE PARÂMETROS REPRODUTIVOS E ZOOTÉCNICOSEM FÊMEAS DE MACROBRACHIUM AMAZONICUM
EFFECT OF LIPID SUPPLEMENTATION ON REPRODUCTIVE AND ZOOTECHNICAL
PARAMETERS IN MACROBRACHIUM AMAZONICUM FEMALES
Periódico: Aquaculture
74
Effect of lipid supplementation on reproductive and zootechnical parameters in
Macrobrachium amazonicum females
Míriam Luzia Nogueira Martins de Sousaa, Aldeney Andrade Soares Filhob, Bartolomeu W.
S. de Sousac, Manoel Paiva de Araújo Netod, Arthur Vinicius Lourenço Ferreiraa, Moisés
Martins Fernandesa, Christianna Veloso Ribeiroa, Janaina Serra Azul Monteiro Evangelistae,
Célia Maria de Souza Sampaioa
aSchool of Veterinary Medicine, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State University of Ceará,
Fortaleza, Ceará, Brazil.
bDepartment of Fisheries Engineering, Federal University of Ceará, Bioecology Laboratory – LABEC
cDepartment of Fisheries Engineering, Federal University of Ceará, Fish technology Laboratory – LATEPE
d-Federal Institute of Education, Science and Technology of Ceará, Campus Acaraú, Environmental Biology
Laboratory and Microbiology – LABIAM
eHistology Laboratory of the State University of Ceará
Corresponding Author: Míriam L. N.de S. Martins. Street José Camelo, 169; Parangaba. CEP: 60.740-750.
Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 85 3101-9604. E-mail: [email protected]
75
1. Introduction
Macrobrachium amazonicum is a native freshwater prawn vastly distributed in basins in
South America, and widely exploited by artisan fishermen in the North and Northeast of
Brazil. In recent years, the species has shown great potential for aquaculture. However, there
has been a decline in its natural stocks due to non-selective fishing, along with degradation of
habitats, as a result of anthropic action (Maciel and Valenti, 2009).
As this species has high productivity, it is necessary to carry out studies that provide
information for subsidies to the production of this animal in captivity, avoiding the risks of its
depletion in the natural environment. To this end, studies on the reproduction of this species,
with emphasis on the reproductive cycle in crustaceans, consist of four stages: gonadal
maturation, gamete release, egg incubation and larvae hatching (Pinheiro, 1998).
There are factors that interfere in the process of gonadal maturation. One of them is the diet,
which stands out as an exogenous factor (Samuel et al., 1999). An adequate diet is identified
as a crucial factor for sexual maturity and prawn reproduction in captivity. When the diet is
unbalanced or incomplete, it can cause poor reproductive performance or even prevent
reproduction (Kawahigashi, 1998).
One of the main compounds of this diet is lipids, which are a heterogeneous group of
substances insoluble in water and soluble in organic solvents, found in the tissues of plants
and animals, and which actas important sources of metabolic energy (ATP). They are the
richest group of nutrients known as crude energy (lipids, 9.5 kcal/g, protein, 5.6 kcal/g,
carbohydrate, 4.1 kcal/g). They can be used as a source of energy to save proteins for the
growth of animals, especially fatty acids of the linolenic series (omega-3, marine origin),
cholesterol and its derivatives (Fenucci, 1988). According to Wouters et al. (2001), sufficient
storage of nutrients is required for the beginning of the reproduction in prawns. In addition to
that, diets rich in lipids are important for gonadal maturation.
76
In a study carried out in Macrobrachium rosenbergii, Cavalli et al. (2001) observed that the
total lipid level in the ovary increases with maturation. He also observed that lipid
requirement for the development of the ovary depends on the immediate intake of diets
containing this nutrient, since crustaceans generally have limited phospholipid biosynthesis
ability due to the absence of enzyme 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (Mitra et al.
2005), one of the determining factors in the gonadal maturation of female prawns. An
adequate diet is identified as a crucial factor for sexual maturity and reproduction of prawns in
captivity. When the diet is unbalanced or incomplete, it may cause poor reproductive
performance or even prevent reproduction (Kawahigashi, 1998).
There are no studies on lipid supplementation and its action on the reproductive cycle of M.
amazonicum females. Therefore, the present study aims to evaluate the effect of the addition
of alternative sources of lipids on the reproductive and zootechnical parameters of females of
the species M. amazonicum.
2. Material and methods
M. amazonicum females from the breeding stock of the Laboratory of Prawn Farming
(LACAR) of the State University of Ceará (UECE) were randomly assigned to four groups.
Each group had five replicates: animals fed commercial feed + fish oil (n = 100); animals fed
commercial feed+ linseed oil (n = 100); animals fed commercial feed + coconut oil (n = 100);
and animals fed only commercial ration, which constituted the control group (n = 100). The
females of these groups were distributed in five subgroups having20 shrimps in aquariums
with a working volume of 20 L. The temperature and the pH of the water were measured
daily, and partial exchange of 30% by volume of water was carried out in the morning.
Each aquarium was equipped with an aeration system by means of compressors and water
heating controlled by thermostats. A photoperiod of 12:12 was used.
77
The animals were observed over a period of 90 days for ovarian maturation, the process of
molting and animal behavior, according to Carvalho (1998).
2.1 Experimental diets
Four diets were used containing 30% of digestible protein, and 3 of them being supplemented
(5%) with different sources of lipids: two of plant origin (linseed oil and coconut oil), and one
of animal origin (fish oil).
The feed ingredients were previously crushed and sieved through a 600μm mesh. Initially, the
commercial feed was macerated, and then the oils were mixed in the dry feed. Subsequently,
all diets were homogenized in a commercial beater, the final pellet size being 2.00 mm (0.5
mm of expansion). The diets were oven dried at 50°C for 6 hours and stored in plastic pots at
-3°C until use. The animals were fed these rations twice daily. The total amount offered was
5% of the live weight of the animals stocked.
All the samples were analyzed in triplicate for proximate composition following standard
methods (AOAC, 1995). Crude protein (N × 6.25) was determined by the Kjeldahl method
using Kjeldahl apparatus (TE – 036/1, Tecnal, Brazil). Crude lipid was determined by the
ether-extraction method using Soxtec System (TE -044 Tecnal, Brasil). Moisture was
determined by drying a sample to a constant weight at 105°C. Ash content was determined by
combustion of a sample in a muffle furnace at 550°C for 8 hours.
For the morphological analysis, the ovaries and digestive glands were removed and fixed in
Boiun® solution for 12 and 24 hours, respectively. Inclusion in paraffin was then performed,
after which the ovaries and glands were cut to a 3-mm size and stained with
Hematoxylin/Eosin. The determination and classification of ovarian cells were performed
according to the parameters suggested by Meeratana and Sobhon, (2007) and Soonklang et al.
(2012).
78
Analyses of the characteristics of the ovarian cells and the hepatopancreas were performed
under a Nikon® Eclipse Nis and Nis Software 4.0 microscope.
For the analysis of the weight gain, the animals were weighed at the beginning and at the end
of the experiment.
2.2. Statistical analysis
The analysis of variance was used to verify differences in means between the treatments.
When significant, the Dunnett test with 5% alpha was applied in GraphPad Prism 7.0
software.
3. Results
The mean values of water temperature and pH measured for the culture of animals during the
experiment ranged from 29.5 °C to 29.9 °C for the temperature and from 7.5 to.8.43 for the
pH (Table 1).
(Table 1)
The centesimal composition of the feed used in the present study (Table 2) shows that the
total amount of protein in the feeds was not statistically different, confirming that the rations
are isoprotein.
(Table 2)
Regarding moisture, the feed supplemented with coconut oil showed the lowest moisture
(6.06 ± 0.15). The control feed (commercial feed) showed the highest humidity (9.78 ± 0.38).
In relation to the amount of total lipids present in the feed, it was observed that the highest
levels were present in the feed supplemented with coconut oil (9.65 ± 0.26) and fish oil (9.64
± 0.87).
3.1 Weight gain
For the analysis of the weight gain of the prawns (Fig. 1), the feed was supplemented with
coconut oil (1.75 ± 0.50), followed by fish oil (1.42 ± 0.47) and linseed oil (1, 53 ± 0.34). The
79
feeds supplemented with an additional source of lipid did not present a statistically significant
difference when compared to the commercial feed. (p ≤ 0.05).However, when compared to
each other, only the feed supplemented with coconut oil showed a statistically significant
difference in relation to the diet supplemented with fish oil and linseed oil.
(Figure 1)
3.2 Histology of the digestive gland
No difference was observed between the organs of the groups analyzed for color, texture and
gland size. The gland occupies a large part of the cephalothoracic cavity, just below the ovary.
It has an orange color and is divided into two lobes formed by various secretory tubules, the
hepatopancreatic lobes, which start on a blind bottom with channels that flow into the
stomach. These lobes are covered by a pseudo-stratified epithelium, which rests on the basal
lamina, where the five characteristic cell types of the digestive gland were found: E cells
(undifferentiated), F cells (fibrillar), R cells (reabsorptive), B cells (vesicular), and M cells
(basal).
Another characteristic that was common among the treatments was the tubular interstice,
which had a thin and discreet connective tissue.
As for the cells, no differences were found in the characteristics of the cell types. It was
possible to notice an intense vacuolization in the lobes of the digestive gland, which indicates
a large number of B cells (vesicular) presenting a large vacuole and even a fusion between
these cells and R cells (reabsorptive) along the tubule (Fig. 2).
(Figure 2)
3.3 Ovary Histology
No difference was observed in the external morphology of ovaries in the four groups analyzed
for color, texture and size. The macroscopic analysis of the ovaries allowed the determination
of five stages of gonadal maturation already described for the species in the literature: stage I
80
- spawned; stage II - immature; stage III - rudimentary or initial maturation; stage IV -
intermediate or ovarian maturation stage; and stage V - mature or ovarian maturation stage.
No significant difference was observed in the slides regarding the number of oocytes 1 (Oc1 -
primary), oocytes 2 (Oc2 - secondary) and oocytes 3 (Oc3 - tertiary). A significant difference
(p ≤ 0.05) was found only for oocytes 4 (Oc4 - mature) in linseed and coconut oil rations,
indicating that a larger number of cells reached final maturation (Table 3). Primary oocytes
(Oc1) were observed on ovarian slides of females fed commercial feed, feed supplemented
with fish oil and feed supplemented with coconut oil. However, no primary oocytes were
found in the slides containing the treatment that received supplementation of linseed oil
(Table 3).
(Table 3)
4. Discussion
The average values of temperature and pH found in the present work are in agreement with
those reported in the literature for the culture of M. amazonicum (Moraes-Riodades et al.,
2006; Preto et al., 2011).The temperature indicated for the breeding of decapod crustaceans is
between 28 °C and 31 °C, and the pH ranges from 7 to 8.
Among the feeds, the one that presented less moisture in its composition was the feed
supplemented with coconut oil. This fact is important, since excess moisture results in
dilution of all nutrients in the feeds, proportionally reducing their nutritive value and
compromising the quality of the product. The higher the moisture content, the faster the
rations will lose their nutritional qualities, being more susceptible to fungus development.
Therefore, the quality control in the production of these feeds is important for the correct
nutrition of the animals in each phase of the reproduction. Thus, genetic potential can be
exploited, increasing productive, reproductive and feeding efficiency (Custódio et al., 2005).
81
For Pereira et al. (2010), the intrinsic quality of fats is measured by their structural
composition of fatty acids and their saturation, which directly interferes with the digestibility
of the energy contained in it. Free fatty acids, derived from triglycerides (fats and alcohol), in
particular, are the main source of aerobic fuel for energy metabolism of the shrimp
musculature. In addition, they are essential components of cell membranes, serving as
biological carriers in the absorption of liposoluble vitamins (A, D, E and K) as well as sources
of essential fatty acids, steroid precursors and prostaglandins.
There is no conclusive information on the fatty acid requirements for freshwater prawns.
Linolenic acid (n-3) is trapped in the shrimp tissue, while linoleic (n-6) is metabolized to
obtain energy (New et al., 2010). Both linoleic and linolenic acid are essential for freshwater
prawns, but the nutritional value of the second fatty acid is higher (Tacon, 1987; New et al.,
2010).
Other factors observed during the experiment were the amount of feed left at the bottom of
the feed tank by the animals and the time the animals took to reach the feed and consume it. It
was possible to observe that the feed supplemented with fish oil was the one that presented
less leftovers at the bottom of the aquariums throughout the experiment, followed by the feed
supplemented with linseed oil, and then the feed supplemented with coconut oil, with the
commercial ration presenting the largest amount of leftovers at the bottom of the aquariums.
In relation to the time elapsed between feed supply and its consumption, the feed
supplemented with linseed oil presented an average time lapse of 10 minutes, followed by
feeds supplemented with fish and coconut oil , which presented a time lapse of 15 and20
minutes, respectively, while the commercial feed presented the longest time lapse, more than
25 minutes. According to Glencross et al. (2007), the consumption of feed is associated with
its palatability and this, in turn, is based on the levels of inclusion of the ingredients that
compose it.
82
None of the treatments showed any alteration in the morphological pattern of the
hepatopancreatic lobe, its tubular interstice presenting the same pattern, with thin and discrete
connective tissue between the tubules. This fact was also observed by Franceschini-Vicentini
(2009). The digestive and absorptive functions of the digestive gland are well established: R
cells store lipids, but these cells do not make up more than 50% of the body mass of the living
organ, which in turn represents 4 to 10% of the animal body weight. F and R cells are pointed
out by Dall and Moriarty (1983) as the main site of lipid absorption, final digestion and lipid
metabolism, while B cells release lipases in the lumen tubule for digestion.
However, it is worth mentioning that it was possible to observe a higher number of B cells in
the samples fed the commercial diet, which characterizes higher lipase release in the lumen
tubule, indicating a greater digestion of the diet.
According to Tacon (1987), when added to the feed, lipids lubricate the gastrointestinal tract,
which facilitates the passage of food, increasing the palatability and the reduction of dust in
the feeds. This explains the results found in this study in relation to the fact that the
palatability of supplemented feeds was higher than that of commercial feed, and less time
elapsed between the supply and the consumption of supplemented feeds by the animals.
Regarding the diet supplemented with fish oil, it was possible to observe the presence of post-
ovulatory follicles. According to Chaves and Magalhães (1993), these are cellular cords
twisted to a greater or lesser degree, which derive from the oocyte follicular envelopes and are
indicators of their elimination.
5. Conclusions
In this work, it was possible to observe that two rations were outstanding. One was the diet
supplemented with fish oil, which had better performance regardingthe reproductive
parameters, with the presence of postovulatory follicles. The other was the feed supplemented
with coconut oil because of its zootechnical parameters due to agreater weight gain.
83
Acknowledgments
The authors would like to express their gratitude for grants and financial support from the
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (CNPq) (460119/2014-1),
Souza, B.W.S is senior investigator of CNPq (Brazil).
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TABLE
Table 1 Variation of pH and water temperature during the 90 days of experiment. Columns
with different letters indicate significant difference (p ≤ 0.05).
Ration Temperature pH
Ration commercial (RCt) 29.9 ºCa 8.07b
Ration + Fish oil (RP) 29.5 ºCb 8.43a
Ration + Linseed oil (RL) 29.5 ºCb 7.5d
Ration + Coconut oil (RC) 29.6 ºCb 7.77c
87
Table 2 Centesimal composition of the rations used in the experiment. Lines with different
letters indicate significant difference (p ≤ 0.05).
Composition
(%)
Ration
commercial
(RCt)
Ration commercial
+ Fish oil (RP)
Ration
commercial +
Linseed oil
(RL)
Ration
commercial +
Coconut oil
(RC)
Total Protein 33.19 32.85 31.25 31.32
Total lipid 6.59b 9.64a 7.54ab 9.65a
Humidity 9.78c 7.44b 7.68b 6.06a
Ashes 8.29 7.87 8.28 8.77
88
Table 3 Difference between staging of reproductive cells of females of M. amazonicum.
Columns with different asterisks (*) indicate a significant difference between the parameters
(p ≤ 0.05).
Oocytes Cells Control Fish oil Linseed oil Coconut oil
OC1 3 ± 0.6 4.3 ± 0.75 0 1 ± 0.32
OC2 5.2 ± 0.58 4.8 ± 0.48 1.8 ± 0.23 2 ± 0.27
OC3 3.2 ± 0.23 5.09 ± 0.27 7.2 ± 0.63 2.6 ± 0.36
OC4 0 0.4 ± 0.13 1.5 ± 0.26 * 3 ± 0.27**
89
FIGURE
Figure 1 Weight gain of female prawns M. amazonicum, submitted to three rations
supplemented with different sources of lipids.
90
Figure 2 Photomicrography of digestive glands of M. amazonicum females, fed with rations
without and with supplementation of vegetable and animal oils. [1] control group gland:
presence of E, R and B cells; Increase of 20X. [2] gland of the group supplemented with fish
oil: presence of E, R and B cells; Increase of 20X. [3] group gland supplemented with coconut
oil: presence of E and B cells; Increase of 20X. [4] gland of the group supplemented with
flaxseed oil: presence of E and B cells; Increase of 20X. HE technique. Microscope Nikon®
Eclipse Nis, Software Nis 4.0.
7 CONCLUSÕES
1 A uniablação do pedúnculo ocular aplicada em fêmeas de M. amazonicum na temperatura
média de 30,0 ºC e pH 8,0 diminui o tempo entre uma maturação ovariana e outra.
2 Dentre as rações testadas, a ração suplementada com óleo de peixe apresentou um melhor
desempenho em relação a parâmetros reprodutivos.
3 Dentre as rações testadas, a ração suplementada com óleo de coco apresentou um melhor
desempenho em relação ao ganho de peso dos animais avaliados.
4 A ração que mais se aproximou da uniablação do pedúnculo ocular, em relação a
diminuição de tempo entre uma maturação e outra foi a ração de peixe.
8 PERSPECTIVAS
- Mais estudos devem ser feitos utilizando ferramentas como a imuno-histoquímica,
microscopia eletrônica e da cromatografia para visualização e quantificação da real ação dos
lipídios na maturação ovariana de fêmeas do camarão Macrobrachium amazonicum.
- Estudar mais óleos vegetais de plantas oriundas da nossa Região para estimular o mercado
local e tentar baratear o preparo de rações para cultivo.
- A criação de um centro de cultivo da espécie aqui no Ceará, para abastecimento do mercado,
evitando assim o problema de esgotamento de animais no meio ambiente devido à sobrepesca.
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