UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS RAFAELA DAMASCENO MAGALHÃES ANÁLISE MOLECULAR POR PCR EM TEMPO REAL PARA A IDENTIFICAÇÃO DA PREFERÊNCIA ALIMENTAR DE FLEBOTOMÍNEOS TRANSMISSORES DAS LEISHMANÍASES FORTALEZA – CEARÁ 20 16
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
RAFAELA DAMASCENO MAGALHÃES
ANÁLISE MOLECULAR POR PCR EM TEMPO REAL PARA
A IDENTIFICAÇÃO DA PREFERÊNCIA ALIMENTAR DE FLEBOTOMÍNEOS
TRANSMISSORES DAS LEISHMANÍASES
FORTALEZA – CEARÁ
20 16
RAFAELA DAMASCENO MAGALHÃES
ANÁLISE MOLECULAR POR PCR EM TEMPO REAL PARA
A IDENTIFICAÇÃO DA PREFERÊNCIA ALIMENTAR DE FLEBOTOMÍNEOS
TRANSMISSORES DAS LEISHMANÍASES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade
de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de
Carnívoros, Onívoros e Aves.
Orientadora: Dra. Luciana Magalhães Melo.
Coorientadora: Dra. Ana Corolina Fonseca Lindoso
Melo.
FORTALEZA – CEARÁ
2016
Dedico a minha Mãe, Maria Darci Vieira
Damasceno (In memorian), que sempre me
acompanhou durante essa caminhada e sonhou
com esse momento, e de que hoje, junto de
Deus, está muito feliz com essa realização.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela dádiva da vida.
À Universidade Estadual do Ceará e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinária,
por disponibiliza a infraestrutura necessária para o desenvolvimento do projeto de pesquisa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo fornecimeto
da bolsa de Pós-Graduação.
À Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua pelos ensinamentos, paciência e confiança depositada ao
longo do mestrado.
À Dra. Luciana Magalhães Melo, pelos ensinamentos, paciência e por disponibilizar a estrutura
do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR).
À Dra. Ana Carolina Fonseca Lindoso Melo por todos os momentos de disponibilização de seus
conhecimentos como coorientadora;
Aos funcionários do PPGCV, em especial a Maria da Silva Moura (ELI), pelo apoio e amizade
durante o mestrado.
A minha mãe, Maria Darci Vieira Damasceno e minha avó, Maria Isles Vieira Damasceno, pelo
amor, carinho, e acima de tudo, o apoio para que eu pudesse caminhar em busca dos meus
objetivos.
Ao meu namorado, Sthanney Lopes Soares, por todo amor, dedicação, carinho e
companheirismo.
A todos os integrantes do LABODOPAR, pela amizade e cooperação ao longo desses dois anos
de trabalho. Em especial às Dras. Ana Caroline Moura e Fernanda Rondon, obrigado pela
contribuição na parte experimental e pelos ensinamentos.
Aos alunos de iniciação científica, Kaliu e Jeferson pelo apoio durante toda a execução do
trabalho.
Enfim, a todos vocês, meu muito obrigado!
RESUMO
A investigação do hábito alimentar de flebotomíneos tem grande significado ecológico e
epidemiológico. Diferentes metodologias, incluindo uso de técnicas sorológicas, foram
utilizadas para identificação das fontes de repasto. Contudo, abordagens moleculares com
elevada sensibilidade e especificidade têm se sobressaído como importantes ferramentas nessa
área. Estratégias de amplificação de genes mitocondriais, como o citocromo b, através de PCR
convencional ou PCR em tempo real vêm sendo empregadas com elevados índices de detecção.
No entanto, a inadequada especificidade das abordagens de amplificação gênica empregadas
demanda a utilização conjunta de técnicas auxiliares que contribuem para aumentar o tempo de
execução e os custos do processo. Assim, uma estratégia metodológica ideal deve ser capaz de
aliar alta sensibilidade de detecção, especificidade compatível para repasto sanguíneo em
múltiplas espécies animais, além de baixo custo. Nesse sentido, o presente trabalho objetivou
desenvolver uma nova abordagem de PCR em tempo real com SYBR Green baseada na
amplificação das regiões do genoma mitocondrial (WMG-qPCR) que são menos conservadas
entre humanos (Homo sapiens), caninos (Canis lupus familiaris), felinos (Felis catus), murinos
(Rattus novergicus) e galináceos (Gallus gallus). Para tanto, na primeira etapa experimental,
três protocolos de extração de DNA foram ajustados e adequados para que se obtivessse
amostras de DNA mitocondrial (mtDNA) com rendimento e qualidade adequada para uso na
WMG-qPCR. Na segunda etapa experimental, a especificidade das amplificações foi testada
através de ensaio de reação-cruzada com o DNA das espécies animais. A sensibilidade das
reações foi determinada por construção de curvas-padrão com concentrações de DNA
equivalentes a 0,1 x 106 a 1 µl de sangue extraído a partir de cada espécie animal. O DNA de
flebotomíneos machos da espécie Lutzomyia longipalpis também foi utilizado nas reações para
a exclusão de falsos positivos. Dentre os principais resultados destacaram-se o kit baseado em
ligação de DNA total em resina de sílica que foi capaz de obter maior quantidade de mtDNA;
a metodologia WMG-qPCR que apresentou alta sensibilidade e espécie-especificidade sendo
capaz de promover a detecção de 26, 84, 130, e 320 fg DNA em 10 pL de sangue de felino,
humano, canino e murino, respectivamente; além disso, foi capaz de amplificar 5pg de DNA
em 5 pL de sangue de galináceo. Assim, a metodologia WMG-qPCR se apresentou como
importante ferramenta para investigação de repasto sanguíneo, devido a sua capacidade de
diferenciar possíveis fontes preferenciais de Lutzomyia spp.
Palavras chave: Repasto sanguíneo, Lutzomyia, Leishmania, qPCR, Leishmaníases.
ABSTRACT
Study meal sandfly habit has great ecological and epidemiological significance. Different
methods, including use of serological techniques were used to identify the sources of repast.
However, moleculares approaches with high sensitivity and specificity have excelled as
important tools in this area. Mitochondrial gene amplification strategies, such as cytochrome b,
using conventional PCR or real time PCR have been used with high levels of detection.
However, inadequate specificity of gene amplification approaches employed demand the joint
use of ancillary techniques that contribute to increase the runtime and process costs. Thus, an
ideal strategy methodology should be able to combine high detection sensitivity, specificity
compatible for blood feeding in multiple species, and low cost. Thus, this research project aims
to develop a new PCR approach in real time with SYBR Green based on amplification of
regions of the mitochondrial genome (WMG-qPCR) that are less conserved between human
(Homo sapiens), dogs (Canis lupus familiaris), cats (Felis catus), mice (Rattus norvegicus) and
chickens (Gallus gallus). Therefore, the first experimental stage, three DNA extraction
protocols will be adjusted and appropriate in order to obtain mitochondrial DNA samples
(mtDNA) yield and quality suitable for use in WMG-qPCR. In the second experimental stage,
the specificity of the amplifications will be tested through cross-reaction assay with the DNA
of the animal species. The sensitivity of the reactions will be determined by construction of
standard curves with DNA concentrations equivalent to from 0.0000001 to 1 ml of blood drawn
from each animal species. The DNA of male sandflies of the Lutzomyia longipalpis species
will also be used in the reactions to the exclusion of false positives. Among the most important
results is emphasized that the kit based on the total DNA binding silica resin was able to achieve
greater amount of mtDNA; WMG-qPCR methodology showed high sensitivity and species-
specificity being capable of promoting the detection of 10 uL of blood, equivalent to 26, 84,
130, and 320 fg DNA feline, human, canine and murine respectively; Furthermore, he was able
to amplify 5 gallinaceous blood pL (5 pg DNA). The WMG-qPCR methodology presented as
an important tool for blood feeding research due to their ability to differentiate possible
preferred sources of Lutzomyia spp.
Keywords: Blood meal, Lutzomyia, Leishmania, qPCR, Leishmaniasis.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1 – Pleomorfismo de Leishmania sp. A) forma amastigota, intracelular,
dentro de uma célula fagocítica mononuclear de hospedeiro
vertebrado. B) forma promastigota, extracelular, com corpo
fusiforme e flagelo longo, presente no trato intestinal de insetos
vetores. Fonte: BRASIL (2006).................................................................
13
Figura 2 – Ciclo de transmissão de Leishmania sp. Setas azuis representam o ciclo
de vida do parasito no homem; no inseto é representado pelas setas
vermelhas. Fonte: Center for diseases Control and Prevetion
(Adaptado)..................................................................................................
17
CAPITULO 1
Figure 1 – Schematic representation of WMG-qPCR primer distributions on
mitochondrial genomes. Graphical circular notations of cats (Felis
catus), humans (Homo sapiens), rats (Rattus novergicus), dogs (Canis
lupus) and chickens (Gallus gallus) genomes, as the Genbank accession
numbers, were presented. The relative position of the primer pairs
(Camt1, Hmt1, Hmt2, Hmt3, Rmt1, Rmt2, Rmt3, Dmt1, Chmt1,
Chmt2, Chmt3, Chmt4, Chmt5 and Chmt6) and the main
mitochondrial genes were also shown. D-loop: displacement loop; 12S
rRNA and 18S rRNA: ribosomal RNA genes; ND1 (to 6): NADH
dehydrogenase subunit 1 (to 6) gene; COX1 (to 3): cytochrome c
oxidase subunit 1 (to 3) gene; ATP6: subunit-6 ATP-synthase gene;
ATP8: subunit-8 ATP-synthase gene; CYTB: cytochrome
b….……………………...............................................................................
49
Figure 2 – Comparisons of DNA extraction kits for WMG-qPCR. A) Validation
of Hmt3 and L1F primer pairs for quantitative purposes. Efficiency,
linearity (R2) and curve equation were presented. B) Total-DNA and
mtDNA quantifications. K1: protein/DNA-precipitation kit; K2:
resin-based total DNA purification kit; K3: resin-based plasmid
DNA purification kit. DNA extraction kits were compared within the
mtDNA (A,B: P < 0.05) or total DNA (a,b: P < 0.05)
quantifications................................................…………………….……
50
Figure 3 Specificity of WMG-qPCR primers. The pairs Dmt1, Camt1, Hmt2,
Rmt2 and Chmt6 were tested for cross-reaction with blood DNA
samples of Dog, Cat, Human, Chicken and Rat. Negative controls
were prepared with water in substitution to DNA template. The Ct
values were achieved in the presence of DNA amount equivalent to
1 μL blood of each animal species (0.1 μL for chicken). Melting
temperature (Tm) of amplicons were
shown....................….……………...……………………………………
51
Figure 4 Standard curves of WMG-qPCR amplifications. Sensitivities were
accessed by serial dilution of DNA obtained from 50 µL blood of
each animal species. Curves were plotted from 0.01 pL to 1 μL blood
for human, dog, cat and rat and from 0.005 pL to 0.5 μL blood for
chicken. The primer sensitivity (dotted arrows) was established by
the lower blood volume that could be successfully amplified in the
triplicate reactions, and were also expressed as equivalent DNA
amount
(fg)..........……………………...…………………………………………
52
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ct Ciclo do limiar de detecção da fluorescência;
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior;
Cyt b Citocromo b;
DNA Ácido desoxiribonucléico;
ELISA Reação de Imunofluorescência Indireta;
IRM Intradermorreação de Montenegro;
kDNA DNA de cinetoplasto;
L. chagasi Leishmania chagasi;
L. cruzi Lutzomyia cruzi;
L. infantum Leishmania infantum;
L. longipalpis Lutzomyia longipalpis;
LCM Leishmaníase tegumentar cutâneo-mucosa;
LV Leishmaníase visceral;
LTD Leishmaníase tegumentar difusa;
LTL Leishmaníase tegumentar localizada;
LT Leishmaníase tegumentar;
MS Ministério da saúde;
MTHD Metilenotetrahidrofolato desidrogenase;
NNN Novy, MacNeal e Nicolle;
pg Picograma
PCR Reação em Cadeia da Polimerase;
pnoc Prepronociceptina;
qPCR Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real;
RFLP Restriction Fragment Length Polymorfism;
RLB Reverse Line Blotting;
WHO World Health Organization;
WMG Whole Mitochondrial Genome;
µm Micrômetro.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 13
2.1 LEISHIMANÍASES .................................................................................................. 13
2.1.1 Agentes etiológicos ....................................................................................................13
2.1.2 Sintomatologia ........................................................................................................... 14
2.1.3 Diagnóstico ................................................................................................................ 15
2.1.4 Ciclo de transmissão ................................................................................................. 17
2.2 VETORES FLEBOTOMÍNEOS ................................................................................ 18
2.2.1 Morfologia e biologia ................................................................................................ 18
2.3 TRIAGENS DE REPASTO SANGUÍNEO ............................................................... 19
2.3.1 Estratégias imunológicas .......................................................................................... 19
2.3.2 Estratégias moleculares ............................................................................................ 20
3 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 25
4 HIPOTESE CIENTIFICA ....................................................................................... 26
5 OBJETIVOS ............................................................................................................. 27
5.1 GERAL ....................................................................................................................... 27
5.2 ESPECÍFICOS ............................................................................................................. 27
6 CAPITULO I .............................................................................................................. 28
7 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 54
8 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 55
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 56
12
1 INTRODUÇÃO
As Leishmaníases são antropozoonoses causadas por protozoários intracelulares do
gênero Leishmania, que podem apresentar-se de duas formas clinicas: Leishmaníase
Tegumentar (LT) e Leishmaníase Visceral (LV). A transmissão aos seus hospedeiros se dá pela
picada de flebotomíneos fêmeas infectadas (LAINSON E SHAW, 1987; REY, 2011). Apenas
as fêmeas são hematófagas, pois necessitam de alimentação sanguínea para a ovogênese
(FONTELES et al., 2009).
A investigação na biologia destes insetos, principalmente em relação a fonte
alimentar, tem grande significado ecológico e epidemiológico, pois propicia o conhecimento
sobre a preferência por hospedeiros em condições naturais e indica o papel protetor que certos
animais podem desempenhar em relação ao homem nas áreas de transmissão da doença
(FONTELES et al., 2009; QUARESMA et al., 2012).
Diferentes metodologias têm sido utilizadas para identificação dessas fontes
alimentares. Dentre os métodos sorológicos, destacam-se os ensaios de antígeno-anticorpo com
a precipitina (OLIVEIRA-PEREIRA et al., 2008) e a técnica de ELISA (MARASSÁ, et al.,
2013). No entanto, algumas limitações como a exigências de sangue relativamente fresco, baixa
sensibilidade e a possibilidade de reação cruzada entre as espécies tornaram essas técnicas
ultrapassadas (HAOUAS et al., 2007).
Atualmente abordagens moleculares com elevada sensibilidade e especificidade, como
a reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional e em tempo real (qPCR), vêm sendo
ferramentas importantes nessa área (PAIVA-CAVALCANTI et al., 2010). Estratégias de
amplificação de genes mitocondriais, como os do citocromo b, através de PCR convencional
(JIMÉNEZ et al., 2013; GARLAPATI et al., 2012) ou PCR em tempo real (SALES et al, 2015)
vêm sendo empregadas com elevados índices de detecção. Contudo, a inadequada
especificidade das abordagens de amplificação gênica empregadas, demandam a utilização
conjunta de técnicas auxiliares, como sequenciamento de DNA (SALES et al, 2015), o que
contribui para aumentar o tempo de execução e os custos do processo. Assim a descrição de
uma abordagem metodológica de identificação de preferência alimentar com base na
amplificação por PCR em tempo real com oligonucleotídeos específicos desenhados a partir do
genoma mitocondrial completo de possíveis hospedeiros das leishmaníases é uma alternativa
que contribuirá com o aprimoramento no tempo e no custo desta técnica.
13
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LEISHIMANÍASES
2.1.1 Agentes etiológicos
As Leishmaníases têm como agentes causadores, protozoários intracelulares
obrigatórios pertencentes à Ordem Kinetoplastida, Família Trypanosomatidae e Gênero
Leishmania (LEVINE et al., 1980). As espécies de Leishmania assumem características
morfológicas diferentes (pleomorfismo) de acordo com seu ciclo de vida e hospedeiro que
habitam, possuindo duas formas de vida. A forma amastigota (Figura 1A): arredondada e com
presença de flagelo rudimentar, a qual está presente no sistema fagocitário de hospedeiros
mamíferos, e a forma promastigota: fusiforme e com flagelo exteriorizado (Figura 1B) que vive
no meio extracelular, na luz do trato digestivo dos insetos vetores, os hospedeiros invertebrados
(DOSTÁLOVÁ E VOLF, 2012).
Figura 1: Pleomorfismo de Leishmania sp. A) forma amastigota, intracelular, dentro de uma
célula fagocítica mononuclear de hospedeiro vertebrado. B) forma promastigota, extracelular,
com corpo fusiforme e flagelo longo, presente no trato intestinal de insetos vetores. Fonte:
BRASIL (2006).
A classificação taxonômica mais atual divide o gênero Leishmania em dois sub-
gêneros: Viannia (LAINSON E SHAW, 1987) que inclui os complexos: braziliensis, guyanensis,
naiffi e lainsoni; e sub-gênero Leishmania (ROSS, 1903) que possui os complexos: donovani,
infantum, tropica, aethiopica, major e mexicana (NCBI, 2016). Estes diferentes complexos
B A
14
albergam as espécies de agentes etiológicos envolvidos no acometimento das leishmaníases
tegumentar (LT) e visceral (LV) (SAHA et al., 2005; SERIN et al., 2005; OMS, 2016).
Em relação à etiologia da forma tegumentar, já foram descritas onze espécies nas
Américas, no entanto, no Brasil, foram encontradas somente sete espécies: L. (Leishmania)
amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (Viannia) guyanensis, L. (Viannia) lainsoni, L.
(Viannia) lindenberg, L. (Viannia) naiffi e L. (Viannia) shawi (LAINSON E SHAW, 1987; MS,
2000; QUARESMA, 2011).
Na forma visceral, a espécie envolvida na América do Sul é Leishmania infantum
(DANTAS-TORRES, 2006), descrita anteriormente como Leishmania chagasi na década de 30
por Cunha e Chagas (1937). Entretanto, nos últimos anos estudos moleculares confirmaram a
suspeita de que L. chagasi seria idêntica a L. infantum (MAURICIO et al., 2000),
convencionando-se então esta última nomenclatura.
2.1.2 Sintomatologia
A LV é caracterizada por lesões que afetam os órgãos internos, levando
frequentemente a óbito na ausência de tratamento. Acomete principalmente pacientes
imunodeprimidos, crianças e idosos. A forma visceral é demonstrada pelo intenso dano em
órgãos vitais e anemia grave, sendo uma síndrome clínica, caracterizada por febre irregular de
longa duração, desnutrição, hepatoesplenomegalia, leucopenia e trombocitopenia (BRASIL,
2006).
A LT, por sua vez, ocasiona diferentes lesões na pele, podendo subdividir-se em
três formas: a LT localizada (LTL), que causa lesões ulcerosas em nível de pele, geralmente no
local da picada do flebotomíneo; a LT disseminada ou difusa (LTD) que provoca erupções
disseminadas pelo corpo; e a LT mucocutânea (LCM), que afeta a pele e mucosas,
principalmente, do nariz e da boca causando mutilações faciais e, consequentemente,
desconfortos físicos e psicológicos. (WHO, 2010; REY, 2011; NEVES, 2012).
A leishmaníase mucocutânea é a variação clínica mais prevalente na América do
Sul, caracterizada por nódulos sintomáticos que se iniciam mais frequentes em membros
inferiores, com posterior ulceração e consequências estéticas graves para o paciente. Estima-se
que 40% dos pacientes desenvolvem lesões secundárias no complexo naso-faríngeo, com
evidente obstrução nasal, perfuração de septo e destruição da cartilagem nasal (MS, 2000).
15
2.1.3 Diagnóstico
O diagnóstico das leishmaníases é realizado a partir do exame clínico, dados
epidemiológicos e técnicas laboratoriais, que se constitui por métodos: parasitológico,
imunológico e molecular. O diagnóstico parasitológico consiste na demonstração do parasito,
e pode ser realizado por pesquisa direta e indireta. O diagnóstico direto consiste na pesquisa de
formas amastigotas em microscopia óptica de material obtido, geralmente de lesões ou
aspirados de baço, fígado ou medula óssea (SUNDAR E RAI, 2002; ALVES E
BEVILACQUA, 2004).
Na pesquisa indireta pode ser realizado o cultivo in vitro da amostra clínica suspeita
e inoculação em animais de laboratório, usualmente hamsters (Mesocricetus auratus). O cultivo
in vitro pode ser realizado em meio sólido monofásico (meio de Schneider) ou,
preferencialmente, em meio bifásico (meio NNN – Novy, MacNeal e Nicolle) coberto com um
meio líquido (meio de Schneider) contendo entre 10 – 30% de soro fetal bovino (SFB). O
período de cultivo é de 4 a 5 semanas à temperatura de 22-28°C, até que as promastigotas de
Leishmania spp. possam ser visualizadas por microscopia invertida ou ótica (SCHUSTER E
SULLIVAN, 2002; SUNDAR e RAI, 2002; BRASIL, 2006).
As técnicas sorológicas demonstram a presença de anticorpos reativos contra o
parasito (ZIJLSTRA et al., 2001). Dentre os testes sorológicos mais citados e recomendados
para inquéritos em saúde pública são, o ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA) e a
reação de imunofluorescência indireta (RIFI) os quais permitem avaliar, de forma indireta, a
infecção pela expressão dos níveis de anticorpos circulantes (BRASIL, 2006).
A técnica ELISA, é fundamentada na imunodetecção de antígenos solúveis
(METTLER et al., 2005), por meio da implementação de antígenos ou anticorpos acoplados a
uma enzima e a presença de um anticorpo de detecção, desencadeando uma reação
colorimétrica (SRIVIDYA et al., 2012). Já a metodologia da imunofluorescência indireta é uma
técnica usada para a detecção e localização de antígenos em células e tecidos, no entanto
apresenta limitações principalmente pela baixa reprodutibilidade e resultados falso-positivos.
Já foram relatadas reações cruzadas com Trypanosoma cruzi, Trypanosoma caninum, L.
braziliensis e Ehrlichia canis (SILVA et al., 2011). Além disso, o RIFI pode ser impraticável
em áreas rurais por causa da falta de equipamentos de laboratório e técnicos qualificados para
interpretar os resultados (COURA-VITAL et al., 2014).
16
Dentre os testes sorodiagnósticos para a leishmaníase tegumentar humana o
primeiro a ser utilizado ainda na década de 30 foi a Intradermorreação de Montenegro (IRM),
que mede a hipersensibilidade celular tardia. A IRM detecta a resposta imune celular adquirida
que se desenvolve pela ativação dos linfócitos T sensibilizados que mediam a atração para o
sítio de inoculação e, posteriormente, ativam macrófagos, monócitos e linfócitos. As células
ativadas, entre elas os macrófagos, se acumulam causando inchaço e eritema local. O processo
inflamatório instaurado induz os macrófagos e os linfócitos a liberarem enzimas, causando
destruição tissular. O grau de resposta é medido 48 ou 78 horas após a injeção intradérmica e
uma enduração de 5 mm ou mais em seu maior diâmetro é considerada positiva (MS, 2000).
Atualmente, outras técnicas diagnósticas que vêm sendo utilizadas como
ferramenta para detecção de Leishmania em amostras clínicas de humanos e animais são as
técnicas moleculares (BRANDÃO-FILHO et. al. 2003; VAN WYSNSBERGHE et al., 2009).
Dentre as técnicas mais modernas utilizadas para o diagnóstico das leishmanioses, destacam-se
as técnicas, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que permite a amplificação in vitro de
sequências de nucleotídeos e apresenta-se como método bastante sensível e especifico para
detectar DNA de Leishmania spp. em ampla variedade de amostras biológicas (ALVAR et al.,
2004). Como também a PCR em tempo real (qPCR), método quantitativo baseado no
monitoramento dos ciclos de amplificação do DNA-alvo. Assim, pode ser utilizada para
determinação da carga parasitária de forma acurada e sensível, permitindo a detecção de
pequenas quantidades de DNA do parasito (GALLETTI et al., 2011).
A escolha dos primers utilizados nas reações de PCR e qPCR é de fundamental
importância para a técnica e permite diferenciar espécies dos subgêneros Leishmania e Viannia
(NEITZKE-ABREU et al., 2013). Nesse sentido, vários genes-alvos têm sido estudados, tais
como os que codificam a enzima glicose-6-fosatodesidrogenase, as proteínas do choque térmico
(GOTO & LAULETTA LINDOSO, 2010), a polimerase-alfa, a subunidade ribossomal 18S
(BEZERRA-VASCONCELOS et al., 2011), a MTHD (proteína similar à
metilenotetrahidrofolato desidrogenase), a RNase III (RODRIGUES et al., 2014), além do
próprio DNA não-cromossomal de cinetoplasto, kDNA (BEZERRA-VASCONCELOS et al.,
2011; RODRIGUES et al., 2014).
Assim, tanto a PCR convencional, quanto a qPCR, têm permitido a identificação da
espécie de Leishmania em questão, e, consequentemente, o direcionamento das devidas ações
epidemiológicas de controle e adequação ao tratamento utilizado.
17
2.1.4 Ciclo de transmissão
O ciclo de transmissão (Figura 2) dos parasitas causadores das leishimaníases se
inicia quando o inseto vetor durante seu repasto sanguíneo no hospedeiro vertebrado ingere junto
com o sangue as formas amastigotas. No intestino do inseto estas formas sofrem diversas
diferenciações, processo denominado de metaciclogênese, até se tornarem formas infectantes,
chamadas de promastigotas metacíclicas. Estas formas migram para a parte anterior do sistema
digestório do inseto, que no próximo repasto sanguíneo serão regurgitados no local da picada
juntamente com a saliva que contém um peptídeo vasodilatador e imunomodulador que
contribuirá para a infecção no hospedeiro (OLIVEIRA et al, 2003; BRODIE et al, 2007).
No hospedeiro vertebrado os parasitas são fagocitados pelas células do sistema
fagocítico mononuclear e se diferenciam em amastigotas, as formas imóveis. Logo se inicia o
processo de divisão binária no interior dos macrófagos até causar rompimento destas, e assim,
amastigotas serão liberadas no meio extracelular podendo ser fagocitadas por outros macrófagos,
expandindo a infecção que se dissemina por via linfática e/ou sanguínea, permitindo então a
infecção de outros flebótomos durante a hematofagia neste hospedeiro (BRASIL, 2006).
Figura 2: Ciclo de transmissão de Leishmania sp. Setas azuis representam o ciclo de vida do
parasito no homem; no inseto é representado pelas setas vermelhas. Fonte: Center for diseases
Control and Prevetion (Adaptado).
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2.2 VETORES FLEBOTOMÍNEOS
O modo de transmissão das leishmaníases aos seus hospedeiros se dá através da
picada de fêmeas de flebotomíneos infectadas, as quais são classificados na Ordem Diptera;
Subordem Nematocera; Família Psycodidae; Subfamília Phlebotominae e Gênero Lutzomyia
no Novo mundo (ALVAR, 1997). Estes insetos possuem pequenas dimensões, medindo de dois
a três milímetros, corpo densamente piloso e coloração amarelo-palha (ADLER, 1964;
SCHLEIN E WARBURG, 1986; YOUNG E LAWYER, 1987).
Existe, atualmente, cerca de 900 espécies de flebotomíneos descritas, destas,
aproximadamente 100 espécies são suspeitas de agirem como vetores de Leishmania spp., mas
pouco menos de 50 são realmente vetores comprovados (LAINSON E RANGEL, 2005). A
maioria das espécies estão presentes nas regiões tropicais e subtropicais ocupando uma
variedade de nichos ambientais. No entanto, o crescente desmatamento e o avanço da
urbanização estimularam esses insetos a se adaptarem aos ambientes peridomésticos,
modificando o perfil essencialmente rural da doença (ANDRADE FILHO, et al., 2001;
BRASIL, 2006).
A principal espécie envolvida na transmissão da LV no Brasil é Lutzomyia longipalpis
(LUTZ E NEIVA, 1912). No entanto, outras espécies de flebotomíneos têm sido incriminadas
na transmissão de L. infantum. Lutzomyia cruzi foi recentemente apontado no estado do Mato
Grosso e Mato Grosso do Sul, assim como, Lutzomyia evansi na Colômbia e Venezuela
(SANTOS et al., 1998; MONTOYA-LERMA et al., 2003; MISSAWA E LIMA, 2006; SILVA
et al., 2008).
2.2.1 Morfologia e biologia
Os flebotomíneos são insetos cujo ciclo de vido é caracterizado pela holometabolia,
com desenvolvimento em quatro estágios: ovo, larva (com quatro estádios), pupa e adulto
(YOUNG E DUNCAN, 1994; MAROLI et al., 2013). Seus ovos são elípticos, medem
aproximadamente 300 a 500 μm de comprimento por 70 a 150 μm de largura e são depositados
sob a forma de pequenos amontoados, são esbranquiçados no momento da postura, mas após
algumas horas tornam-se castanho-escuros (YOUNG E DUNCAN, 1994; COSTA et al., 2013).
As larvas são brancas, pequenas e de aspecto vermiforme e após a eclosão começam a se
alimentar da matéria orgânica do solo (YOUNG E DUNCAN, 1994; RANGEL E LAINSON,
19
2003). A pupa possui coloração esbranquiçada ou amarelada, tornando-se escurecida quando
próximo a emergência do inseto adulto e é constituída por 13 segmentos, sendo que os quatro
primeiros constituem o cefalotórax e os demais constituem o abdômen (RANGEL E
LAINSON, 2003; MAROLI et al., 2013).
A postura ocorre geralmente em locais úmidos com presença de matéria orgânica e
após 10 dias ocorre a eclosão dos ovos. O ciclo desde o ovo à forma adulta pode ocorrer em 30
dias e seu período de vida como adulto pode chegar a 29 dias (KILLICK-KENDRICK, 1999).
Os flebotomíneos adultos são insetos pequenos, medem cerca de 2 a 3 milímetros, tem
coloração acastanhada, pousam com asas abertas e seus voos são curtos. Tanto machos como
fêmeas, necessitam realizar ingestão de carboidratos, que fornecem a energia necessária à
sobrevivência e às atividades de deslocamento, acasalamento e postura. Assim, os açúcares
ingeridos pelos flebotomíneos correspondem à fonte de energia necessária para estes insetos,
sem a qual viveriam apenas poucos dias após emergir. As principais fontes são glicose, frutose
sacarose, maltose, dentre outros. Na natureza, as principais fontes destes carboidratos são
provenientes de seiva vegetal, néctar de flores e de frutos e secreções de afídeos (RANGEL E
LAINSON, 2003).
As fêmeas apresentam um aparelho bucal do tipo sugador-picador adaptado para
picar a pele de vertebrados e sugar o sangue, isso se deve ao hábito hematófago que estas
possuem. A realização do repasto sanguíneo por parte das fêmeas é imprescindível à maturação
ovariana e, consequentemente, ao completo ciclo reprodutivo desses insetos (YOUNG E
DUNCAN, 1994; MAROLI et al., 2013), embora a autogenia (desenvolvimento de ovos sem
haver repasto sanguíneo) ocorra na primeira postura em algumas espécies (RANGEL E
LAINSON, 2003; WHO, 2010). Sua preferência alimentar é bastante eclética, o que justifica
sua presença em locais onde vivem galináceos, suínos, caprinos e equinos (BARATA et al.,
2005; MONTEIRO et al., 2005; OLIVEIRA-PEREIRA et al., 2008; FONTELES et al., 2009).
2.3 TRIAGENS DE REPASTO SANGUÍNEO
2.3.1 Estratégias imunológicas
Diferentes metodologias vêm sendo utilizadas para identificação de fontes
alimentares de vetores flebotomíneos com intuito de avaliar adequadamente a sua preferência
alimentar. Dentre os métodos sorológicos, os mais utilizados baseavam-se em ensaios de
20
antígeno-anticorpo como a técnica de precipitina, empregada como uma importante ferramenta
para identificação de fontes de repasto sanguíneo de vetores (OLIVEIRA-PEREIRA et al.,
2008). Esta técnica tradicional se caracteriza pela interação de proteínas presentes no soro
proveniente do sangue digerido pelos artrópodes, confrontado com os anticorpos adequados
dos possíveis hospedeiros (LOROSA, 1998). Embora esta tenha sido muito utilizada, sua
sensibilidade e especificidade são baixas, o que dificulta a sua utilização com insetos de
pequeno porte (MARASSÁ, et al., 2004).
Outra metodologia sorológica utilizada é a técnica ELISA (MARASSÁ, et al.,
2013) que apresenta vantagens ao obter um aumento na sensibilidade, permitir o processamento
de um grande número de amostras e poder reconhecer fontes sanguíneas em amostras contendo
quantidades reduzidas de sangue recém-ingerido (MARASSÁ et al., 2013). No entanto, a
presença de alguns limites, como a possibilidade de reação cruzada entre as espécies, a
necessidade de produção de anticorpos específicos para uma ampla variedade de hospedeiros
potenciais e a incapacidade de revelar reservatórios não esperados tornaram essas técnicas
ultrapassadas (HAOUAS et al., 2007).
2.3.2 Estratégias moleculares
Nas últimas décadas, as biotécnicas moleculares, especialmente, baseadas na
amplificação por PCR do DNA do sangue presente nos flebotomíneos, trouxeram a
possibilidade de aplicações metodológicas com sensibilidade compatível com o tamanho
reduzido do vetor (SANT’ANNA et al., 2008; QUARESMA et al., 2012; HAOUAS et al.,
2007). Nesse contexto, algumas estratégias metodológicas direcionadas à amplificação de
genes nucleares (como o que codifica a prepronociceptina, pnoc) e de genes mitocondriais
(como o do citocromo b, cyt b) vem sendo testadas através de PCR convencional ou qPCR.
Além disso, várias técnicas auxiliares também já foram empregadas com o objetivo de
incrementar a especificidade das identificações, como uso de múltiplos iniciadores
(SANT’ANNA et al., 2008), digestão com enzima de restrição (SOARES et al., 2014),
hibridização com sondas de DNA (GARLAPATI et al., 2012) ou sequenciamento de DNA
(SALES et al., 2015).
O primeiro método molecular desenvolvido utilizou a PCR convencional, para
amplificação do gene pnoc, associada ao sequenciamento de DNA (HAOUAS et al., 2007).
Nesse estudo, a eficiência de detecção do gene pnoc em flebotomíneos capturados em campo
21
foi de 79% (77/97), sendo superior àquelas obtidas pelo uso de testes imunológicos baseados
em ELISA (NGUMBI, et al., 1992; COLMENARES; 1995; BONGIORNO, et al., 2003). Por
outro lado, Baum et al. (2015) conseguiram determinar a fonte de repasto sanguíneo em apenas
29% (27/93) dos flebotomíneos utilizando a amplificação desse mesmo gene. Esse achado pode
ter sido atribuído à ausência do gene pnoc em aves, tornando factível sua amplificação apenas
em mamíferos. Além disso, a possibilidade de degradação enzimática no DNA presente no
intestino dos flebotomíneos pode ter maior impacto sobre o gene pnoc uma vez que este só
apresenta uma única cópia por genoma mamífero (ZAVERI et al., 2000).
Apesar de terem aumentado a eficiência de detecção de repasto, quando
comparadas às técnicas imunológicas, as abordagens de amplificação do gene pnoc não foram
conclusivas quanto à especificidade. Os estudos realizados não incluíram testes direcionados
de reação cruzada, utilizando apenas amostras de campo de fêmeas ingurgitadas de
flebotomíneos. Assim, Haouas et al. (2007) sequenciaram os 77 produtos de PCR obtidos e
identificaram apenas três espécies hospedeiras: bovina (71/77), humana (4/77) e equina (2/77).
Similarmente, Baum et al. (2015) identificaram a ocorrência de repasto somente em suínos
(13/27), cães (9/27) e equídeos (1/27).
Outra vertente de estudos vem consolidando a utilização do DNA mitocondrial
(mtDNA) na identificação das fontes de repasto sanguíneo em flebotomíneos. A escolha desse
DNA-alvo, a exemplo das investigações forenses, se deve à maior estabilidade do DNA dupla-
fita circular, quando comparado ao DNA nuclear (ANDRÉASSON et al., 2006), bem como à
multiplicidade de cópias que naturalmente existem nas células eucarióticas (BROWN, 1985).
Diante disso, Paternina et al. (2016) realizou um estudo comparativo entre o gene
mitocondrial cyt b e o gene nuclear pnoc, através de PCR convencional e sequenciamento de
DNA. Como esperado, a eficiência de detecção do repasto com gene cyt b (74%) foi muito
superior àquela obtida com pnoc (7%). Adicionalmente, o valor supreendentemente baixo
obtido com o gene nuclear foi atribuído a falhas nas etapas de amplificação (21% das 141
amostras totais) e de sequenciamento (33% das 30 amostras amplificadas). A despeito disso, a
amplificação do gene cyt b permitiu a identificação de 10 espécies de vertebrados nas quais 8
espécies de flebetomíneos realizaram repasto sanguíneo. Além disso, as fontes de repasto de 37
amostras (26%) não puderam ser identificadas, porque o gene cyt b de flebotomíneo foi
amplificado em detrimento ao do hospedeiro.
Ozbel et al. (2016) também realizaram a identificação da preferência alimentar de
flebotomíneos através de PCR convencional com amplificação do gene cyt b associada a
22
sequenciamento de DNA. Nesse estudo, as fontes de repasto de 80% (12/15) das fêmeas de
Phlebotomus tobbi foram identificadas: humano (8/12), cão (3/12) e rato (1/12). Similarmente,
Maia et al. (2015) utilizando a mesma estratégia de identificação, conseguiram amplificar o
DNA hospedeiro presente em 43 espécimes de um total de 78 fêmeas capturadas (3
Phlebotomus ariasi, 49 Phlebotomus perniciosus, 1 Phlebotomus sergenti e 25 Sergentomyia
minuta). As fontes de alimentação de 69,77% (30/43) foram identificadas após sequenciamento:
equino (12/30), galináceo (5/30), humano (4/30), (3/30), suíno (2/30), bovino (2/30), ovino
(1/30) e lagarto (1/30).
Além do sequenciamento, outras estratégias auxiliares foram empregadas com o
objetivo de incrementar a especificidade na identificação dos repastos sanguíneos em
flebotomíneos, como uso de múltiplos iniciadores (SANT’ANNA et al., 2008), digestão com
enzima de restrição (SOARES et al., 2014) e hibridização com sondas de DNA (GARLAPATI
et al., 2012). Adicionalmente, essas investigações foram predominantemente baseadas na
amplificação do gene mitocondrial cyt b, presente em todos os vertebrados, aumentando assim
a eficiência de detecção das amplificações, quando comparado ao gene pnoc.
Nesse contexto, Sant’anna et al. (2008) realizaram amplificação simultânea das
sequências do cyt b de mamíferos e de aves em uma única reação de PCR (PCR multiplex),
utilizando iniciadores específicos para humanos, cães e galiformes. Tal estudo obteve
sensibilidade de 74%, sendo capaz de identificar a fonte de repasto sanguíneo de 43 dos 58
flebotomíneos capturados: 41 (70,7%) foram positivos para galinhas e 2 (3,4%) para cães. A
ausência de amplificação do DNA nas 15 amostras remanescentes pode ter sido causada pela
presença de sangue de outras espécies animais, não avaliadas na PCR multiplex, ou pela
digestão do sangue no intestino do flebotomíneo. Similarmente aos estudos com o gene pnoc,
não houve avaliação de reação cruzada entre as espécies animais, uma vez que apenas amostras
obtidas em campo foram utilizadas.
Uma outra abordagem, denominada PCR-RFLP, baseou-se na identificação da
espécie animal através do padrão de digestão produzido por enzimas de restrição (RFLP,
Restriction Fragment Length Polymorfism) sobre o produto de PCR do cyt b (QUARESMA et
al., 2012; SOARES et al., 2014). Assim, Quaresma et al. 2012, utilizando as enzimas TaqI,
HaeIII e MwoI, identificaram a fonte alimentar de 23 (60,5%) das 38 fêmeas ingurgitadas de
Psychodopygus lloydi. Os perfis de bandas das amostras foram comparados com os padrões de
digestão de diferentes hospedeiros vertebrados (controles). Um total de 8 flebotomíneos
(34,8%) produziram perfis de bandas específicas para primatas, 6 (26,1%) para aves e 9 (39,1%)
23
apresentaram padrões mistos, sugerindo que as fêmeas podem ter se alimentado de mais de um
hospedeiro. Esses padrões mistos foram roedor/marsupial (4/9), humano/galinha (2/9) e
roedor/marsupial/humano (1/9), além de outras combinações com vários hospedeiros não-
definidos (2/9). Além disso, as fontes alimentares de um total de 15 amostras não foram
identificadas.
Em 2014, SOARES et al. também aplicaram PCR-RFLP para estudo de repasto de
L. longipalpis, digerindo os produtos amplificados de 358pb do cyt b com as enzimas AciI, AluI,
HaeIII e RsaI. Após análise inicial in silico, os perfis de fragmentos de restrição de 10 espécies
de vertebrados (Homo sapiens, Rattus norvegicus, Didelphis marsupialis, Canis familiaris,
Felis catus, Sus domesticus, Bos taurus, Gallus gallus, Equus caballus e Cerdocyon thous)
foram validados com o DNA obtido de amostras de sangue ou tecidos animais. Posteriormente,
de um total de 80 fêmeas ingurgitadas de Lu. longipalpis obtidas em campo, foi possível
amplificar 76 amostras (95%), dentre as quais, 10 foram escolhidas aleatoriamente para
digestão dos seus produtos de PCR com enzimas de restrição. Assim, foi possível identificar a
fonte de repasto em 4 amostras (40%): Homo sapiens (1/4), Bos taurus (1/4) e Equus caballus
(2/4). Os perfis não identificados apresentaram quantidades insuficientes de DNA, resultando
em bandas eletroforéticas fracas ou mesmo ausentes, inviabilizando a análise.
Outra abordagem utilizada na investigação das fontes de repasto sanguíneo de
flebotomíneos associou a PCR convencional com a hibridização com sondas de DNA (ABBASI
et al., 2009; GARLAPATI et al., 2012). Nessa estratégia, denominada PCR-RLB, sondas
espécie-específicas de DNA são ligadas a uma membrana de nylon (RLB, Reverse Line
Blotting) e, em seguida, os produtos biotinilados oriundos da amplificação do gene cyt b são
submetidos a uma reação de hibridização com as sondas imobilizadas. A revelação pode ser
colorimétrica ou quimioluminescente. A vantagem mais evidente dessa abordagem
metodológica é a sensibilidade, sendo capaz de detectar uma quantidade tão pequena quanto 1
pg de DNA na reação, por até 96h pós-repasto realizado em homem, galinha ou pombo
(ABASSI et al., 2009). Esse achado é especialmente relevante devido ao tamanho diminuto dos
insetos flebotomíneos. Assim, quando aplicada a amostras de campo, PCR-RLB permitiu
identificar a fonte de repasto sanguíneo em 65% (288/442) das amostras de Phlebotomus
argentipes (GARLAPATI et al., 2012) e 76% (68/89) de Phlebotomus papatasi (ABASSI et
al., 2009). Por outro lado, os autores deixam claro que a construção de sondas específicas para
um grande número de espécies hospedeiras é laboriosa e difícil de otimizar. Adicionalmente,
24
vários problemas com a hibridização cruzada das sondas entre as espécies animais foram
observados.
Finalmente, devido à alta sensibilidade intrínseca à qPCR, essa técnica vem sendo
aplicada em investigações de repasto sanguíneos, não só em flebotomíneos (SALES et al.,
2015), como também em pulgas (GRAHAM et al., 2012; 2013; WOODS et al., 2009),
triatomíneos (MOTA et al., 2007) e culicídeos (VAN DEN HURK et al., 2007).
Assim, Sales et al. (2015), desenharam iniciadores para qPCR do gene cyt b, com
base nas sequências gênicas de cão, gato, cavalo, galinha, rato e humano. Os autores obtiveram
sensibilidade adequada demonstrada pela capacidade de detecção nos ensaios de até 1 pg de
DNA. No entanto, amplificações inespecíficas foram observadas nos ensaios de reação cruzada
entre algumas espécies animais. Assim, iniciadores para cyt b de galinha também amplificaram
DNA de homem e de rato. Iniciadores construídos para gato amplificaram inespecificamente o
DNA de cavalo, cão, rato, galinha e homem. Já os iniciadores desenhados para humanos
geraram produtos inespecíficos com o DNA de cão, gato e rato. Dessa forma, a técnica de
sequenciamento de DNA foi necessária para viabilizar a identificação do repasto nas amostras
coletadas em campo, produzindo 91% (91/100) de eficiência na detecção das espécies
hospedeiras que incluíram: homem (73%), galinha (23%), cão (22%), cavalo (15%), rato (11%)
e gato (2%).
Os diversos estudos para identificação das fontes alimentares de flebotomíneos
através da amplificação de mtDNA vêm utilizando exclusivamente iniciadores desenhados para
regiões conservadas entre as espécies animais, como o gene cyt b. Consequentemente, a baixa
especificidade nessa detecção ainda é evidente nas diversas investigações e tem sido apenas
parcialmente contornada pela utilização de técnicas auxiliares à PCR, como RFLP, RLB,
sequenciamento etc. O desenho de iniciadores para novos alvos moleculares de cada espécie
animal pode ser o passo-chave para o desenvolvimento de uma estratégia metodológica mais
bem-sucedida.
Nesse sentido, o desenho de iniciadores com base no genoma mitocondrial
completo (WMG, Whole Mitochondrial Genome) pode ser uma abordagem promissora. Esse
processo pode ser especialmente amparado pela elevada estabilidade dos genes mitocondriais
(pouco susceptíveis à recombinação gênica) e pela ampla disponibilidade das sequencias
completas das diferentes espécies animais no banco de dados na internet, permitindo uma
extensa comparação entre as mesmas (PERKINS e SCHALL, 2002).
25
3 JUSTIFICATIVA
A identificação da fonte alimentar de flebotomíneos tem sido muito importante para a
adoção de medidas de prevenção e controle das leishmaníases. O conhecimento da preferência
alimentar destes insetos por décadas foi pouco alcançado com técnicas tradicionais. Isso se deve
especialmente à dificuldade de detecção do sangue no intestino do flebotomíneo, em face do
seu diminuto tamanho. As abordagens moleculares têm revolucionado essa vertente de
investigação, devido sua alta sensibilidade e possibilidade de ajuste para alta especificidade.
Nesse contexto, uma estratégia metodológica molecular ideal para investigações de
preferência alimentar de flebotomíneos deve ser capaz de aliar alta sensibilidade de detecção,
especificidade compatível com repasto sanguíneo realizado em múltiplas espécies animais,
além de baixo custo de aplicação. A identificação do sangue ingerido por fêmeas de
flebotomíneos baseada na detecção de DNA do hospedeiro por PCR em tempo real utilizando
SYBR Green é uma alternativa.
As informações obtidas através desses estudos poderão contribuir para o entendimento
da biologia de flebotomíneos vetores e serão de grande importância e aplicabilidade na
epidemiologia das leishmaníases visceral e tegumentar.
26
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
A PCR em tempo real com SYBR Green® utilizando iniciadores desenhados a partir do
genoma mitocondrial completo de humanos (Homo sapiens), caninos (Canis lupus familiaris),
felinos (Felis catus), murinos (Rattus novergicus) e galináceos (Gallus gallus) é capaz de
identificar a fonte de repasto sanguíneo de flebotomíneos Lutzomyia spp.
27
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver uma metodologia de PCR em tempo real com SYBR Green®, baseada em
genoma mitocondrial completo (WMG-qPCR), para identificação das espécies animais fontes
de repasto sanguíneo para fêmeas de flebotomíneos.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estabelecer um protocolo de extração de DNA mais adequado para utilização em
WMG-qPCR, utilizando a espécie humana (Homo sapiens) como referência;
Comparar o rendimento de três métodos com diferentes princípios de extração de DNA,
utilizando a espécie humana (Homo sapiens) como referência;
Desenhar iniciadores específicos para humanos (Homo sapiens), caninos (Canis lupus
familiaris), felinos (Felis catus), murinos (Rattus novergicus) e galináceos (Gallus
gallus), utilizando o genoma mitocondrial completo dessas espécies;
Avaliar a especificidade das amplificações de WMG-qPCR para as 5 espécies animais,
na presença de DNA do flebotomíneo Lutzomyia sp.;
Determinar a sensibilidade das reações de WMG-qPCR para as 5 espécies animais.
28
6 CAPÍTULO 1
Um novo qPCR de Genoma Mitocondrial Completo com SYBR Green®
para identificar repasto sanguíneo de flebotomíneos
A new Whole Mitochondrial Genome qPCR (WMG-qPCR) with SYBR Green®
to identify phlebotomine sand fly blood meals
Periódico: Acta tropica
(Submetido em 26 de Agosto de 2016)
Qualis: A2
29
A new Whole Mitochondrial Genome qPCR (WMG-qPCR) with SYBR Green® to
identify phlebotomine sand fly blood meals
Ana Caroline M. Rodriguesa, Rafaela. D. Magalhãesa, Kalil A. M. Romcya, Jeferson L. S.
Freitasa, Ana Carolina F. L. Melob, Fernanda C. M. Rodona, Claudia M. L. Bevilaquaa, Luciana
M. Meloa*.
aLaboratory of Parasitology Diseases. Veterinary School. State University of Ceará, Av. Doutor
Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE, Brazil, 60714-903.
bLaboratory of Parasitology. Medicine School. Federal University of Ceará, Rua Alexandre
Baraúna, 949, Campus Porangabuçu, Fortaleza-CE, Brazil, 60430-160.
*Corresponding author: Luciana M. Melo. Tel.: +55 85 31019861; fax: +55 85 31019840 E-
mail address: [email protected]
30
Abstract
Phlebotomine sand flies are blood-feeding insects of marked medical and veterinary
significance. Investigations on the biology of these insects hold great importance for both
ecological and epidemiological purposes. The present work describes a new approach for real-
time PCR (qPCR) with SYBR Green®, named WMG-qPCR, to identify phlebotomine blood
meals. The novelty of the assay was to design primers based on the Whole Mitochondrial
Genome (WMG) of the potential hosts (human, dog, cat, brown rat and chicken) aiming to
amplify through qPCR the regions of mitochondrial DNA (mtDNA) which are less conserved
among all species. Initially, the best method for mtDNA extraction to be applied in WMG-
qPCR was determined. Afterwards, amplification specificities were accessed by cross-reaction
assays with mtDNA samples from all animal species, besides phlebotomine DNA. Finally, the
selected primers were also tested for their limit of DNA detection through standard curves
constructed by serial dilution of blood DNA obtained for each target animal species. The
WMG-qPCR was able to detect as low as 10 pL of blood, equivalent to 26, 84, 130, and 320 fg
DNA of cat, human, dog and rat, respectively. The assay was also capable to amplify as low as
5 pL of chicken blood (5 pg DNA). In conclusion, WMG-qPCR seems to be a promising tool
to identify phlebotomine blood meals, with high species-specificity and sensitivity.
Furthermore, as no supplementary techniques are required, this new approach presents
minimized costs and simplified technical-training requirements for execution.
Keywords: real-time PCR, blood feeding, Lutzomyia, mtDNA, sandfly
31
1. Introduction
Sand flies are vectors capable of transmitting various diseases, such as arboviruses,
trypanosomiases and leishmaniasis (Adler and Theodor, 1957; Alexander, 2003; Rassi et al,
2012.). Visceral leishmaniasis (VL) is caused by the protozoan Leishmania infantum (Dantas-
Torres, 2006). In Brazil, the most important sand fly species in VL transmission are Lutzomyia
longipalpis and Lutzomyia cruzi (Queiroz et al., 2012). VL is a serious parasitic disease with a
high mortality rate among untreated patients, it is one of the five parasitic diseases of major
concern for the World Health Organization (WHO, 2016).
Investigations on the biology of these insects hold great importance for both ecological
and epidemiological purposes. Studying the blood-feeding pattern of these insects may help in
the understanding of their interactions with potential reservoir hosts of Leishmania parasites.
Different serological methods have been traditionally applied to study the blood-feeding
behavior of sand flies, including the precipitin test (Baum et al., 2013; Nery et al., 2004) and
ELISA (Afonso et al., 2012; Marassá et al., 2004). However, these methods present some
technical limitations (e.g., the possibility of cross-reactivity between species, the need for
producing specific antibodies to several species, and the inability to discover unpredicted hosts)
(Haouas et al., 2007).
In the last decades, molecular methods have been developed for sand flies blood meal
identification, including PCR. The DNA amplification from blood present in sand flies, have
brought the possibility of methodological applications with sensitivity compatible to the
reduced size of these vectors (Sant'Anna et al, 2008; Haouas et al, 2007). Strategies for
mitochondrial DNA amplification (mtDNA), like that using the cytochrome b gene (CYTB),
based on either conventional PCR (Abbasi et al., 2009; Jiménez et al., 2013; Garlapati et al.,
2012) as real time PCR (Sales et al., 2015) have been used with high levels of sensibility.
However, the genetic marks employed have demonstrated low specificity, requiring the use of
32
auxiliary techniques, like DNA sequencing for sand fly blood meal identification (Sales et al.,
2015).
In these circumstances, an ideal methodological strategy to investigate sand flies feeding
preferences should be able to combine high sensitivity, specificity and low cost of application.
Given this background, the current investigation describes a new approach for qPCR with
SYBR Green® based on amplifications of mtDNA regions which were less conserved between
human (Homo sapiens), dog (Canis lupus familiaris), cat (Felis catus), rat (Rattus norvegicus)
and chicken (Gallus gallus). Furthermore, aspects such as sensitivity and specificity of these
reactions and the best method to obtain the DNA samples are also described.
2. Materials and Methods
2.1. Declaration of ethics
This study was carried out in strict accordance with the guidelines for the ethical use of
animals in research. The Animal Ethics Committee from the State University of Ceará
(CEUA/UECE n.12236895-9) also approved the experimental protocol. Additionally, this
study was carried out in strict accordance with the guidelines for the ethical use of animals in
research (ASAB, 2006).
2.2. Experimental design
The present investigation was divided into two experimental steps. The first experiment
aimed to select the best method for DNA extraction for WMG-qPCR. To achieve this end, DNA
from human-blood samples was obtained using three different extraction methods (K1, K2 and
K3). The methods were compared by both fluorimetric DNA measurements and mtDNA
quantifications.
33
In the second experiment, several primers were designed based on the whole
mitochondrial genome (WMG) of humans (Homo sapiens), dogs (Canis lupus familiaris), cats
(Felis catus), rats (Rattus norvegicus) and chickens (Gallus gallus) and used for qPCR reactions
(named WMG-qPCR). Thereafter, the best primers were selected according to specificity in
cross-reaction assays with DNA of all animal species and L. longipalpis. Additionally, the
sensitivity of the amplifications were determined by construction of standard curves with serial-
dilution of blood DNAs.
2.3. Biological samples
Blood samples from five different animal species were used: Homo sapiens, Rattus
norvegicus, Felis catus, Canis familiaris and Gallus gallus. A total volume of 1 mL of
peripheral blood was collected from three to five specimens from each animal species. Aliquots
of blood samples were stored in a freezer at -80°C until the DNA extraction.
In addition, ten males of Lutzomyia longipalpis sand fly were collected using CDC light
traps (John W. Hock Company, Gainsville, Florida) in the city of Fortaleza, in Ceará state,
Brazil. The insects’ identification was based on the external morphological features (Young
and Duncan, 1994) and performed by technicians of Zoonosis Control Center of Health's
Secretary of Fortaleza. The specimens were preserved in individual tubes at -80°C until DNA
extraction.
2.4. DNA extraction
In the first experiment, human DNA was extracted from 50µL of blood using
commercial kits (K1, K2 and K3) which are based on distinct principles: K1) Wizard Genomic
DNA Purification (Promega, Madison, USA) based on both protein and DNA precipitation;
K2) Wizard SV Genomic DNA Purification System Kit (Promega, Madison, USA) in which
34
DNA binds to silica resin; K3) PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen, Carisbad,
California, USA) designated for resin-based plasmid DNA purification. The protocols were
carried out complying with the manufacturer’s instructions, with slight modifications for blood.
The DNA samples were eluted (or solubilized) in 50µL DNase-free water, aliquoted and stored
at -80°C until qPCR for mtDNA quantifications.
In the second experiment, the K2 method was used to obtain the DNA samples from
blood of the five animal species. Additionally, DNA from ten male phlebotomies was obtained
following the manufacturer's instructions adapted for insects. Thus, a disruption step was
performed in 2mL grinding tubes with 1.4mm ceramic beads (Bertin Technologies, France) and
Precellys 24 equipment (Bertin Technologies, Orléans, France) set for three cycles of 20
seconds at 6,500rpm interspaced by 15 seconds. All DNA samples were eluted in 50µL DNase-
free water, aliquoted and stored at -80°C until accomplishing WMG-qPCR reactions.
All DNA samples were quantified using the reagent Quant-iT dsDNA high-sensitivity
assay or Quant-iT dsDNA Broad-Range assay and Qubit 2.0 Fluorometer equipment
(Invitrogen, Carisbad, California, USA) following the manufacturer's recommendations.
2.5. qPCR reactions
The reactions for mtDNA quantifications and WMG-qPCR were similar in general
conditions, with exception of both primer and template DNA concentrations (described in the
correspondent sections). Thus, amplification reactions consisted of 20µL total volume
containing 10µL of 2x FastStart Universal SYBR-Green Master Mix (Roche, Mannheim,
Germany), 2µL of primers, 1µL of DNA sample and 7µL of ultrapure water. Amplifications
were performed in triplicate per sample for each gene.
The thermal cycling consisted of initial incubation 95ºC for 10min, followed by 40
cycles of amplification at 95ºC for 15 s and 60ºC for 45s and was performed in the thermocycler
35
Mastercycler EP Realplex 4S (Eppendorf, Hamburg, Germany). Specificity was ascertained
after completion of the amplification in the presence of SYBR Green by a melting procedure
(55–95ºC, starting fluorescence acquisition at 55ºC and taking measurements at 10 s intervals
until the temperature reached 95ºC). Threshold and threshold cycle (Ct) values were
automatically determined by Realplex 2.2 software (Eppendorf, Hamburg, Germany) using
default parameters.
2.6. mtDNA quantifications
In the first experiment, DNA extraction methods (K1, K2 and K3) were compared by
relative quantitation of mtDNA using the DDCt method (Livak and Schimittgen, 2001). Thus,
among the primers designed for mtDNA amplifications in human (Figure 1), the pair Hmt3-
F/Hmt3-R was selected for use in this assay because the amplification efficiency was
compatible with quantitative aims. Additionally, data normalization was performed through
amplification of a Long Interspersed Nuclear Element, (LINE) sequence, using the primers L1-
F: GCTGGATATGAAATTCTGGGTTGA and L1-R: AGGAAATACAGAGAACGCCACA
A, previously reported by Pal et al. (2010). All reactions were set with 0.6μM primers and 0.5ng
total DNA. Negative controls consisted in reactions without template DNA.
2.7. Primer design for WMG-qPCR
In the second experiment, primers for WMG-qPCR were designed using the
PrimerBlast software (Ye et al, 2012, available at: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) and
the complete sequences of mitochondrial genomes of humans, dogs, cats, rats and chickens
(Figure 1). Additionally, the PrimerBlast parameters were adjusted to exclude amplifications in
L. longipalpis, Lutzomyia migonei, L. infantum and Leishmania braziliensis (GenBank taxids
7200, 85761, 5671 and 5660, respectively). The primers were also analyzed in silico for
36
unintended secondary structures using OligoAnalyzer 3.1 software (available at:
www.idtdna.com/calc/analyzer). Finally, multiple alignments of target regions for the designed
primers were also inspected to access the level of sequence conservation between the animal
species using the Clustal Omega software (Sievers et al., 2011, available at:
www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo).
2.8. WMG-qPCR specificity
The amplification specificities were determined by cross-reaction assays with DNA
samples from all five animal species, besides phlebotomine DNA. Thus, each primer pair
(Figure 1) was subjected to WMG-qPCR reactions in the presence of DNA mass equivalent to
1 μL blood of each animal species (32.0 ng for rat, 8.4 ng for human, 2.6 ng for cat and 13.2 ng
for dog), except for chicken, in which the DNA amount was 100 ng (equivalent to 0.1 μL blood).
Cross-reaction was also tested in the presence of DNA equivalent to 0.2 phlebotomine (DNA
from 10 L. longipalpis males eluted in 50 μL water). Finally, all WMG-qPCR reactions were
set with 0.3 μM primers, except Hmt3-F/Hmt3-R, for which the best concentration was 0.6 μM.
Furthermore, negative controls were also prepared with water instead of template DNA.
2.8. WMG-qPCR sensitivity
The primers selected in cross-reaction assays were also tested for their limit of DNA
detection. Then, the sensitivities of WMG-qPCR amplifications were analyzed through
standard curves constructed by serial dilution of DNA obtained from 50 µL blood of each
animal species. Thus, curves were plotted from 0.01 pL to 1 μL blood for human, dog, cat and
rat and from 0.005 pL to 0.5 μL blood for chicken. The WMG-qPCR sensitivity was established
by the lower blood volume that could be successfully amplified in the triplicate reactions.
37
2.8. Data and Statistical Analysis
The total DNA concentrations (in ng/µL) and the mtDNA amplification levels (in
relative units) were both expressed as mean (± SD) of three or four replicates. The groups (K1,
K2 and K3) were compared using the one-way ANOVA, followed by Sidak’s multiple
comparisons test. The melting curves of the WMG-qPCR amplicons were constructed by
plotting the inverse negative derivative of the fluorescence signal versus temperature (expressed
in ° C) and qualitatively analyzed. The Ct and melting temperature (Tm) data were expressed
as the mean (± SD) of three or more measurements. The software GraphPad Prism 7 (GraphPad
Software, Inc., La Jolla, USA) was used for all statistical analyzes, and the value of P<0.05 was
set as the limit for statistical significance.
3. Results
3.1. mtDNA quantifications
The preliminary aim of the present investigation was to choose the best mtDNA
extraction method to be applied to WMG-qPCR. Thus, we first compared the total DNA amount
yielded by the methods. The K2 kit produced 274.0±6.2 ng total DNA which was higher than
(P<0.0001) K1 (203.0±17.0 ng) and K3 (174.5 ± 2.8 ng). Additionally, K3 generated less total
DNA than K1 (P<0.05).
Second, the mtDNA quantifications were achieved by amplification of DNA samples
with both Hmt3-F/Hmt3-R and L1-F/L1-R primers (Figure 2). Primarily, amplification
efficiencies (98% for Hmt3 and 96% for L1F) were determined to be compatible with qPCR
(Figure 2A). Despite of all DNA extraction methods being able to produce amplicons
throughqPCR (Figure 2B), the resin-based commercial kit (K2) was suitable for greater mtDNA
amplification when compared to K1 (P<0.0001) and K3 (P<0.01). Additionally, K1 yielded less
mtDNA than K3 method (P<0.0001).
38
3.2. WMG-qPCR specificity and primer selection
A total of 16 primer pairs were drawn for WMG-qPCR and subjected to cross-reaction
selection with blood DNA from all animal species and from phlebotomine. Thus, the primer
pairs Dmt1, Camt1, Hmt2, Rmt2 and Chmt6 produced specific amplicons with the target DNA
and Tm (° C) of the products were shown in Figure 3. The Ct values in the presence of DNA
amount equivalent to 1 μL blood of each animal species varied from 13.01 ± 0.04 (for Rmt2
with rat DNA) to 14.95 ± 0.15 (for Camt1 with cat DNA). Additionally, the Ct was
13.66 ± 1.18 for Chmt6 with DNA from 0.1 μL chicken blood. Despite of some unspecific
amplicons being generated with Rmt2 and DNA from the species other than rats, the produced
Ct values ranged from 29.36 ± 0.24 to 35.96 ± 0.99 with chicken and cat DNA samples,
respectively. Finally, some light noises were observed in the melting curves drawn for Hmt2,
Camt1 and Dmt1 primers with non-target samples, but the observed Ct values were always
higher than 30 (data not shown).
3.3. WMG-qPCR sensitivity
The selected primers pairs Dmt1, Camt1, Hmt2 and Rmt2 were able to detect as low as
10 pL blood of dog, cat, human and rat, respectively, in triplicate WMG-qPCR reactions (Figure
4). Furthermore, the pair Chmt6-F/Chmt6-R was capable to amplify only 5 pL of chicken blood.
Although we did not aim to select primers for quantitative purposes, the amplification
parameters of standard curves were also presented for each primer pair.
4. Discussion
In the present study we developed a new approach of SYBR Green®-based qPCR assays
aiming to identify female sand fly blood meals. The novelty of the present work was to design
primers based on the complete mitochondrial genome of the five animal species. Thus, different
39
from the other reports that elected only one gene to amplify, particularly the cyt b (Sales et al.,
2015), we used the PrimerBlast software to design primer pairs in mitochondrial genome
regions less conserved between all species. Our approach named WMG-qPCR (Whole
Mitochondrial Genome qPCR) was able to specifically amplify the mtDNA target regions with
high sensitivity, detecting the DNA amount equivalent to the thousandth part of one microliter
blood volume.
Initially, we investigated the best method for DNA extraction to be applied in WMG-
qPCR. Thus, we compared commercial kits with different DNA extraction principles: protein
and DNA precipitations (K1), total-DNA-binding silica resin (K2) and plasmid-binding silica
resin (K3). To accomplish this aim, both total DNA and mtDNA were quantified, by fluorimetry
and qPCR (with Hmt3 and L1F primers), respectively. Since total DNA is composed by both
nuclear and mitochondrial DNA, the fluorimetric quantification is not sufficient to elect the best
DNA-extraction method to be applied on mtDNA amplifications. Thus, for WMG-qPCR, we
selected the method K2 because it yielded greater amount of mtDNA than K1 and K3. The K2
method also produced the highest total-DNA mass, but we did not used this criteria to select it.
Most commercially available silica-column methods rely on high concentrations of
chaotropic salts and low pH to promote the binding of negatively charged DNA phosphate
backbones to positively charged silica column. The total amount of DNA that adsorbs to silica
depends on solution pH, ionic strength, electrolyte type, valency, and conformation of DNA
(i.e., linear or circular shape and level of coil) (Svozil et al., 2008). Since mtDNA properties
are somewhat similar to those of bacterial plasmid (i.e. both are double-strand circular DNA),
commercial kits for plasmid extraction hasbeen successfully used for both extraction and
enrichment of mtDNA from eukaryotic cells (Defontaine et al., 1991; Peloquin et al., 1993). In
the present work, we also could indicate plasmid-extraction method (K3) for WMG-qPCR
because it provided the second best level of mtDNA, when compared with the two commercial
40
kits tested. Despite of the K1 method producing great quantities of total DNA, it yielded the
lowest mtDNA amount. Since this method relies on a series of precipitation steps to purify high-
molecular-weight DNA, mtDNA could not be effectively recovered by this approach, as
mitochondrial genome has a low molecular weight, i.e. ~16Kbp (Jessie et al., 2001).
After we have settled that the K2 method was be able to produce great amounts of
mtDNA for qPCR applications, it was used to obtain the samples for the subsequent WMG-
qPCR assays. Thus, mtDNA from animal blood samples (dog, human, cat, rat and chicken) and
sand flies were used to access specificity and sensitivity of WMG-qPCR. First, we selected
primer pairs presenting proper target amplification without cross-reaction. Thus, the primer
pairs Dmt1, Camt1, Hmt2, Rmt2 and Chmt6 produced specific amplicons in the presence of the
target DNA, as indicated by only one sharp single-peak in melting curves of PCR products.
In order to select the primers above, we designed a variable number of pairs for each
animal species. Thus, for dog and cat, we tested only one primer pair (Dmt1 and Cmt1) which
works properly in cross-reaction assays. On the other hand, for humans and rats, it was
necessary to investigate three pairs of primers for each one. Unwanted products occurred for
Hmt1 reactions (targeting human COX1 gene) with both rat (Tm 82.4±0.1) and sand fly (Tm
82.0±0.1) samples. Additionally, these primers also produced unspecific sign with cats,
chickens and dogs DNA. The Rmt1 primers (for rat 16S rRNA gene amplification) produced
unexpected amplicons with humans (Tm 76.8±0.1), cats (Tm 77.8±0.1) and dogs (Tm 78.3±0.1)
samples and they were unspecific in reactions with chickens DNA. The Rmt3 pair, designed to
amplify rat ND1 gene, generated unwanted products with cats (Tm 77.5±0.2) and chickens (Tm
82.4±0.2) templates and it was nonspecific with humans and dogs. The highest number of
primer pairs investigated in cross-reaction assays was six, for chicken. The pairs Chmt1 and
Chmt2 (for ND2 and ND5 genes, respectively) generate primer-dimers, indicated by double-
peak in melting-curves of the PCR products. Unwanted products were observed for Chmt4
41
(targeting chicken ND5 gene) with dogs (Tm 79.9±0.10) and for Chmt5 with both cats
(80.7±0.0) and rats (Tm 79.5±0.00).
Several methodologies have been used to detect the blood meal in phlebotomine vectors,
incidentally, genetic markers have been employed including mitochondrial (e.g., cytochrome
b; Baum et al., 2015; Anaguano et al., 2015) and nuclear (e.g., prepronociceptin; Paternina et
al., 2016) genes. The former approach takes advantage of the high stability of mtDNA (Savu et
al., 2011). However, all these approaches have shown limitations regarding specificity,
requiring the use of auxiliary techniques, such as DNA sequencing, to identify blood meal in
sand flies. In the present work, we improved specificity of real-time PCR method with SYBR
Green® using no supplementary technology, as DNA sequencing or probes. Besides the
mtDNA stability, our strategy based on WMG is strongly supported by the wide availability of
complete genome sequences in online database, as GenBank. Additionally, primer-design
software can choose less-conserved regions across animal species, since the sequence lengths
of mitochondrial genomes (~16,000 bp) are higher than a single gene (e.g., ~1,500 bp for cyt
b).
The cross-reaction assays also provided the early indicatives of primer sensitivities
through Ct values (ranging from 13.0 to 14.9 for selected primers) in the presence of DNA
equivalent to 1 µL blood (0.1 µL for chicken). Then, the Chmt3 primers (targeting chicken
ATP6 gene) was wasted because their low sensitivity (Ct = 19.3±0.0) despite of no unspecific
products. Finally, both Hmt2 and Hmt3 pairs (designed for human ND6 gene) presented no
unspecific amplicons, but the former was select based on Ct values (14.2±0.0 and 15.1±0.1,
respectively) in the presence of DNA from 1 µL blood.
Subsequently, the primers Dmt1, Camt1, Hmt2, Rmt2 and Chmt6, selected in cross-
reaction assays, were also tested for their detection limit (i.e., sensitivity) through WMG-qPCR
standard curves. Several methodologies have been used to detect the blood meal in mosquitoes
42
(Kent, 2009), but some biological differences make it difficult to extrapolate the results for sand
flies. The most important issue is the amount of blood imbibed in the midgut, i.e. up to 1 L
for sand flies (Daba et al., 2004) and 2-6 L for mosquitoes (Clements, 1992). Thus, it is
essential to have a technique sensitive enough to detect DNA minimal amounts In this context,
the researchers are beginning to investigate sand fly blood meals by real-time PCR (Sales et al.,
2015). Here, the WMG-qPCR assay allowed to detect as low as 26 fg of DNA (equivalent to
10 pL of cat blood). Indeed, this sensitivity was almost four times greater than the best result
reported by Sales et al. (2015), i.e., 100 fg human DNA, using qPCR amplification of CYT B
gene. Concerning qPCR sensitivity, our results were also better than that reported for other
species: eight times for dogs (130 fg vs 1 pg), three times for rats (320 fg vs 1 pg) and 40 times
for cats (26 fg vs 1 pg). However, for both human and chicken, the detection limits were almost
similar (84 vs 100 fg and 5 vs 10 pg, respectively). Since the authors also targeted mtDNA, it
is possible that the use of auxiliary techniques, as DNA sequencing, could have decreased qPCR
sensitivity when compared to WMG-qPCR.
5. Conclusion and perspectives
The SYBR Green®-based WMG-qPCR standardized herein represents promising tool
to identify phlebotomine sand fly blood meals. Our new methodological approach is highly
sensible and species-specific. Furthermore, as no supplementary techniques are required, the
WMG-qPCR presents minimized costs and simplified technical-training requirements for
execution. Finally, the most imminent perspective of our research group is to apply this
methodology in field-collected sand flies, particularly Lutzomyia spp. This plan will contribute
to understand the biology of Leishmania vectors in endemic areas of Brazil and ultimately
validate the WMG-qPCR for blood meal investigations.
43
Conflict of interest
There is no conflict of interest involved in this manuscript.
Acknowledgements
R. D. Magalhães and A. C. M. Rodrigues are recipients of CAPES (Brasilia, Brazil) grants. K.
A. M. Romcy and J. L. S. Freitas thank CNPq (Brasilia, Brazil) and FUNCAP (Fortaleza,
Brazil), respectively, for their scholarships. C. M. L. Bevilaqua is a Senior Researcher of CNPq
(303018/2013-5). The authors gratefully acknowledge the staff for management and other
technical assistance with the animals needed for this project.
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48
FIGURES
Fig. 1. Schematic representation of WMG-qPCR primer distributions on mitochondrial
genomes. Graphical circular notations of cats (Felis catus), humans (Homo sapiens), rats
(Rattus novergicus), dogs (Canis lupus) and chickens (Gallus gallus) genomes, as the Genbank
accession numbers, were presented. The relative position of the primer pairs (Camt1, Hmt1,
Hmt2, Hmt3, Rmt1, Rmt2, Rmt3, Dmt1, Chmt1, Chmt2, Chmt3, Chmt4, Chmt5 and Chmt6)
and the main mitochondrial genes were also shown. D-loop: displacement loop; 12S rRNA and
18S rRNA: ribosomal RNA genes; ND1 (to 6): NADH dehydrogenase subunit 1 (to 6) gene;
COX1 (to 3): cytochrome c oxidase subunit 1 (to 3) gene; ATP6: subunit-6 ATP-synthase gene;
ATP8: subunit-8 ATP-synthase gene; CYTB: cytochrome b.
49
Fig. 2. Comparisons of DNA extraction kits for WMG-qPCR. A) Validation of Hmt3 and L1F
primer pairs for quantitative purposes. Efficiency, linearity (R2) and curve equation were
presented. B) Total-DNA and mtDNA quantifications. K1: protein/DNA-precipitation kit; K2:
resin-based total DNA purification kit; K3: resin-based plasmid DNA purification kit. DNA
extraction kits were compared within the mtDNA (A,B: P < 0.05) or total DNA (a,b: P < 0.05)
quantifications.
50
Fig. 3. Specificity of WMG-qPCR primers. The pairs Dmt1, Camt1, Hmt2, Rmt2 and Chmt6
were tested for cross-reaction with blood DNA samples of Dog, Cat, Human, Chicken and Rat.
Negative controls were prepared with water in substitution to DNA template. The Ct values
were achieved in the presence of DNA amount equivalent to 1 μL blood of each animal species
(0.1 μL for chicken). Melting temperature (Tm) of amplicons were shown.
51
Fig. 4. Standard curves of WMG-qPCR amplifications. Sensitivities were accessed by serial dilution of DNA obtained from 50 µL blood of each
animal species. Curves were plotted from 0.01 pL to 1 μL blood for human, dog, cat and rat and from 0.005 pL to 0.5 μL blood for chicken. The
primer sensitivity (dotted arrows) was established by the lower blood volume that could be successfully amplified in the triplicate reactions, and
were also expressed as equivalent DNA amount (fg).
52
A new Whole Mitochondrial Genome qPCR (WMG-qPCR) with SYBR Green® to
identify phlebotomine sand fly blood meals
Research highlights:
WMG-qPCR is a real-time PCR method without probes to identify sandfly blood
meals.
Primers were based on the Whole Mitochondrial Genome (WMG) of the potential
hosts.
A resin-based commercial kit extracts DNA suitable for WMG-qPCR.
WMG-qPCR detected 10pL blood of cat, human, dog or rat, and 5pL blood of
chicken.
53
A new Whole Mitochondrial Genome qPCR (WMG-qPCR) with SYBR Green® to
identify phlebotomine sand fly blood meals
Ana Caroline M. Rodriguesa, Rafaela. D. Magalhãesa, Kalil A. M. Romcya, Jeferson L. S.
Freitasa, Ana Carolina F. L. Melob, Fernanda C. M. Rodona, Claudia M. L. Bevilaquaa,
Luciana M. Meloa*.
Graphical Abstract:
Whole mitochondrial genome of chickens and humans used to design primers for WMG-
qPCR, a real-time PCR method to identify phlebotomine blood meals.
54
7 CONCLUSÕES
A estratégia metodológica de WMG-qPCR padronizada no presente para investigação
de repasto sanguíneo em fêmeas de flobotomíneos apresentou alta sensibilidade e espécie-
especificidade.
Na abordagem, foram selecionados primers capazes de promover a detecção de
concentrações de DNA de 26, 84, 130, and 320 fg DNA para gato, homem, cão e rato,
respectivamente, senda estas equivalentes a 10 pL de sangue. Além disso, foi capaz de
amplificar DNA equivalente a 5 pL de sangue de galinha (5 pg de DNA).
Finalmente, a metodologia de WMG-qPCR não requer técnicas complementares, o que
minimiza seus custos de execução e requerimentos técnicos de aplicação.
55
8 PERSPECTIVAS
A perspectiva mais iminente é a aplicação da metodologia de WMG-qPCR em
flebotomíneos coletados em campo, particularmente Lutzomyia spp. Essa aplicação irá
contribuir para a compreensão da biologia dos vetores das leishmaníases em áreas endêmicas
do Brasil. Finalmente, também irá validar o WMG-qPCR como ferrramenta para investigações
de fontes de repasto sanguíneo. De maneira mais ampla, essas descobertas irão contribuir para
o conhecimento do comportamento alimentar dos flebotomíneos e direcionamneto das medidas
de controle desses vetores.
56
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