UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

LUCAS PEREIRA DE ALENCAR

LEVEDURAS E Geotrichum capitatum DO TRATO DIGESTIVO E FEZES DE EMAS (Rhea americana) MANTIDAS EM CATIVEIRO: IDENTIFICAÇÃO E

SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO

FORTALEZA

2012

LUCAS PEREIRA DE ALENCAR

LEVEDURAS E Geotrichum capitatum DO TRATO DIGESTIVO E FEZES DE EMAS (Rhea americana) MANTIDAS EM CATIVEIRO: IDENTIFICAÇÃO E

SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, herbívoros, onívoros e aves. Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha Co-Orientadora: Profa. Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante

FORTALEZA

2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Estadual do Ceará

Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho

Bibliotecário Responsável – Francisco Welton Silva Rios - CRB-3/919

A368l Alencar, Lucas Pereira de

Leveduras e Geotrichum capitatum do trato digestivo e fezes de emas (Rhea americana) mantidas em cativeiro: identificação e sensibilidade antifúngica in vitro / Lucas Pereira de Alencar. — 2012.

CD-ROM. 77 f. : il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol. “CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho

acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm)”. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade

de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2012.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha. Co-orientação: Profa. Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante. 1. Rhea americana. 2. Leveduras. 3. Candida spp.. 4. Antifúngicos -

resistência. I. Título. CDD: 636.089

Ao amigo Antonio Emanuel Pedroza de Souza (in memorian) que muito acreditava na transformação pela educação. Eternamente mestre Pedroza...

AGRADECIMENTOS

A quem, direta e indiretamente, contribuiu para a realização desta jornada meus sinceros

agradecimentos;

A Deus, pela força e sucessivas oportunidades oferecidas e pela presença nos momentos mais

árduos;

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Veterinária, da

Universidade Estadual do Ceará;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio

financeiro;

Ao Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará,

pela oportunidade;

Ao professor Marcos Fábio Gadelha Rocha pelos ensinamentos, por ter acreditado em mim,

pela sabedoria repassada em poucas palavras e pelo exemplo de pessoa;

À professora Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante pela orientação, compreensão e doutrina

mostrada em seus atos em prol do CEMM;

Ao professor José Júlio Costa Sidrim pelo senso de trabalho com mérito, por proporcionar

grandes ensinamentos como examinador ou examinado;

À professora Rossana de Aguiar Cordeiro por sua forma de ensinar, por sua disponibilidade e

por sua dedicação com os alunos;

À professora Nilza Dutra Alves pela amizade, pelo estímulo, pela ajuda e indicação. Querida,

por tudo, obrigado;

Ao Professor André Jalles Monteiro pela ajuda na análise estatística.

Ao professor Moacir Franco de Oliveira pelos animais para a pesquisa, pela ajuda na coleta e

por seus ensinamentos na graduação;

Aos professores e funcionários da UECE, em especial aos professores do PPGCV, pelo tempo

disponível e atenção prestada;

Às professoras Adriana de Queiroz Pinheiro e Maria Fátima da Silva Teixeira pela

participação como avaliadores na qualificação e na disciplina de seminário;

À Terezinha de Jesus e ao Daniel Teixeira Lima, pelo suporte na realização de nossas

pesquisas;

À Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia pela ajuda, orientação, por sua disposição e

dom em disseminar o que aprende, dádiva de poucos;

Ao Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira por sua força e positivismo, por sua presença na

execução do projeto e nos plantões, pelos aconselhamentos e amizade;

Ao Manoel Paiva de Araújo Neto pelo compartilhamento de ensinos, ideias e materiais;

Aos colegas do CEMM pelo convívio, pela divisão de alegrias e angústias. Em especial ao

Charles Ielpo Mourão, George Cândido Nogueira, João Paulo Otaviano Zeferino, Paula

Bittencourt Vago, Ramila de Brito Macedo e Sabrina Tainah da Cruz Silva;

Às amigas Janalia Azevedo de Faria e Lucelina da Silva Araújo pelas conversas e momentos

de trabalho; e aos amigos da graduação, pelas lembranças;

Aos meus pais, Antonio Pereira da Silva e Maria Domingos de Alencar, pelo carinho, amor,

pela minha educação, por tudo;

Aos meus irmãos pelo apoio e amizade verdadeira;

À minha esposa Allene Magda de Souza Alves por me compreender nos momentos

estressantes e lúdicos, e sempre estar ao meu lado, pelo amor recíproco;

Ao meu filho Rafael Souza Pereira de Alencar, por mudar meu humor ao me sorrir, por me

mostrar outro sentido da palavra amar;

Aos meus tios e tias, avós e primos, pelo incentivo a perserverar;

Aos meus queridos amigos Aldfran, Vanessa, Rosângela, Luiz, Silvana, Rozildo, Simone,

Mário Sérgio, Gilmar e Pedroza (in memorian), pelos momentos felizes que passamos juntos

e que passaremos novamente;

Aos amigos animais por mostrarem que a vida é bem mais simples do que possamos presumir

e por mostrarem que as qualidades tão buscadas em humanas são facilmente observadas

nestes seres, como amizade, sinceridade, lealdade e companheirismo;

Aos demais que contribuíram e que por algum motivo não foram citados, agradeço

sinceramente.

i

RESUMO Há um interesse crescente na criação emas (Rhea americana) no Brasil. No entanto, não existem dados sobre a microbiota gastrointestinal por leveduras e outros fungos nestas aves. Portanto, os objetivos deste trabalho foram avaliar a presença de leveduras e Geotrichum spp. na microbiota do trato digestivo e fezes de emas e avaliar a sensibilidade antifúngica destes microrganismos in vitro. Ademais, foi avaliada a secreção de fosfolipases em isolados de Candida spp. Para este fim, foram investigadas 58 emas de criatórios, nas cidades de Fortaleza e Mossoró, nordeste do Brasil. As amostras foram recolhidas a partir de orofaringe e cloaca dos animais, com swabs estéreis. Amostras de fezes foram coletadas a partir do ambiente, raspando com um bisturi. Para o isolamento primário, o material foi semeado em ágar Sabouraud dextrose 2% acrescido de cloranfenicol (0,5 g / L). Cepas com características sugestivas do gênero Cryptococcus eram repicados em ágar semente de níger. Os fungos foram identificados pelas características macro e micromorfológicas, bem como através da cultura em meio CHROMagar-Candida e caracterização bioquímica, e, excepcionalmente, pelo método automatizado VITEK 2. Após a identificação, todas as amostras foram submetidas ao teste de sensibilidade antifúngica pelo método de microdiluição em caldo definido pelo Clinical Laboratory Standards Institute (documento M27-A3), diante anfotericina B, itraconazol e fluconazol para Candida spp. e estes três antifúngicos mais voriconazol e caspofungina para as demais leveduras e Geotrichum capitatum. A capacidade de cepas de Candida spp. secretar fosfolipases também foi testado, através da cultura em ágar gema de ovo. Foram isolados leveduras e G. capitatum em pelo menos um local anatômico em 50/58 das aves (14/17 jovens e 36/41 adultos) e em 8/10 amostras fecais. Na maioria dos casos, apenas uma única espécie foi isolada a partir de cada sítio (50/79 sítios positivos), com um máximo de quatro espécies observadas em apenas 2 casos (4/79). Em 36/58 dos animais foram isoladas leveduras a partir de orofaringe e em 35/58 a partir da cloaca. Um total de 117 isolados foi obtido, pertencentes aos gêneros Candida (77/117), Trichosporon (25/117) Geotrichum (11/117) e Rhodotorula (4/117). A C. parapsilosis foi a espécie mais presente (19/117), seguida por C. albicans (18/117), C. tropicalis (13/117), C. guilliermondii (12/117), G. capitatum (11/117), T. mucoides (11/117), C. krusei (10/117), C. famata (5/117), T. asteroides (5/117), R. mucilaginosa (4/117), T. asahii (3/117), T. cutaneum (3/117) e T. ovoides (3/117). Houve maior presença de C. albicans na orofaringe das emas jovens do que nos adultos (p <0,001). Enquanto o G. capitatum foi mais frequente nas amostras de cloaca de animais adultos (p<0,05); assim como foi mais presente em cloaca que em orofaringe tanto em jovens como adultos (p<0,01). Quanto às espécies de Candida não foi observada resistência à anfotericina B, mas 16 cepas foram simultaneamente resistentes aos dois derivados azólicos (11/18 C. albicans, 1/10 C. krusei, 2/19 C. parapsilosis e 2/13 C. tropicalis). Houve elevada resistência principalmente em cepas de C. albicans ao fluconazol (15/18) e ao itraconazol (13/18). Outras espécies apresentaram resistência, como: C. parapsilosis (7/19 ao fluconazol e 3/19 ao itraconazol), C. tropicalis (6/13 ao fluconazol e 5/13 ao itraconazol), C. guilliermondii (1/12 ao itraconazol) e C. krusei (2/10 ao fluconazol e 1/10 ao itraconazol). Quanto às outras leveduras e G. capitatum a maioria dos isolados foi sensível aos antifúngicos in vitro, no entanto, a resistência frente fluconazol (1) e itraconazol (2) foi detectada em T. mucoides. Por fim, 23/77 cepas Candida spp. secretaram fosfolipases. Em síntese, o trato digestivo dos animais estudados apresentou heterogeneidade de espécies de Candida potencialmente patogênicas, uma vez que parte delas apresentou resistência aos derivados azólicos e secretaram fosfolipases. Palavras-chave: Rhea americana. Leveduras. Candida spp. Antifúngicos. Resistência.

ii

ABSTRACT There is growing interest in breeding rheas (Rhea americana) in Brazil. However, there are no data on the gastrointestinal microbiota of yeasts and others fungi in these birds. Therefore, the aims of this work were to evaluate the presence of yeasts and Geotrichum spp. in the microbiota from the digestive tract of captive rheas and to evaluate the in vitro antifungal sensitivity of these microorganisms. Additionally, the secretion of phospholipases in Candida spp. was performed. For this purpose, 58 rheas from breeding operations in the cities of Fortaleza and Mossoró, northeastern Brazil, were used. Samples were gathered from the oropharynx and cloaca of the animals, using sterile swabs. Stool samples were collected from their pens, by scraping with a scalpel. For the primary isolation, the material was seeded onto 2% Sabouraud dextrose agar plus chloramphenicol (0.5 g/L). Strains with suggestive characteristics of the genus Cryptococcus were subcultured in níger seed agar. The fungi were identified by macro and micromorphological characteristics as well as by culturing on CHROMagar-Candida medium and biochemical profiling, and, exceptionally by the automated VITEK 2 method. After identification, all the strains were submitted to antifungal sensitivity testing by the standard method defined by the Clinical Laboratory Standards Institute (document M27-A3), using broth microdilution, against amphotericin B, itraconazole and fluconazole in Candida spp. strains and for these three antifungal agents plus voriconazole and caspofungin for others yeasts and Geotrichum capitatum. The ability of Candida spp. to secrete phospholipases was also tested, by culturing on egg yolk agar. Yeasts and G. capitatum were isolated from at least one anatomical site in 50/58 of the birds (14/17 juveniles and 36/41 adults) and in 8/10 fecal samples. In the large majority of cases, only a single species was isolated from each site (50/79 positive sites), with up to four species being observed only in two cases (4/79). In 36/58 animals was isolated fungi from the oropharynx and in 35/58 from the cloaca. A total of 77 isolates were obtained, belonging to genera Candida (77/117), Trichosporon (25/117) Geotrichum (11/117) and Rhodotorula (4/117). The C. parapsilosis was the more frequent species isolated (19/117), followed by C. albicans (18/117), C tropicalis (13/117), C guilliermondii (12/117), G. capitatum (11/117), T. mucoides (11/117) C. krusei (10/117), C famata (5/117), T. asteroides (5/117), R. mucilaginosa (4/117), T. asahii (3/117), T. cutaneum (3/117) and T. ovoides (3/117). There was greater presence of C. albicans in the oropharynx of the juvenile rheas than in the adults (p<0.001), while G. capitatum was more frequent in cloacal samples from adult animals (p<0.05), as well as it was more present in cloaca than in oropharynx, both in youth as in adults (p<0.01). As Candida species, no resistance was observed to amphotericin B, but 16 strains were simultaneously resistant to the two azole derivatives (11/18 C. albicans, 1/10 C. krusei, 2/19 C. parapsilosis and 2/13 C. tropicalis). There was particularly high resistance of C. albicans strains to fluconazole (15/18) and to itraconazole (13/18). Other species showed resistance, as: C. parapsilosis (7/19 to fluconazole and 3/19 to itraconazole), C. tropicalis (6/13 to fluconazole and 5/13 to itraconazole), C. guilliermondii (1/12 to itraconazole), C. krusei (2/10 to fluconazole and 1/10 to itraconazole). As others yeasts and G. capitatum most of the isolates were susceptible to antifungals in vitro; however, resistance against fluconazole (1) and itraconazole (2) was detected in T. mucoides. Finally, 23/77 Candida spp. strains secreted phospholipases. In summary, this study indicates that digestive tract of the studied animals showed heterogeneity of potentially pathogenic Candida species, since some of them were resistant to azole derivatives and secreted phospholipases. Keywords: Rhea americana. Yeasts. Candida spp. Antifungals. Resistance.

iii

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Table 1: Distribution of Candida spp. in samples from digestive tract and feces of healthy rheas ..................................................................................................................................... 53

Table 2: Candida species isolated according to collection site and animal age range ............. 54

Table 3: In vitro susceptibilities of Candida species to antifungal drugs ............................... 55

Table 4: Phospholipase activity of Candida spp. strains ....................................................... 56

CAPÍTULO 2

Table 1: In vitro susceptibilities of opportunistic yeasts and yeast-like isolates recovered from captive rheas ......................................................................................................................... 67

iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Grupo de emas (Rhea americana) conduzido à baia de contenção para manejo sanitário. ............................................................................................................................... 14

Figura 2: Etapas da contenção em emas. A-aproximação; B- captura pelas asas; C- posicionamento atrás do animal e; D- imobilização das asas e corpo do animal. ................... 15

Figura 3: Isolamento primário em meio Sabouraud dextrose 2%, a partir de cloaca (A) e orofaringe (B) de emas. Observam-se colônias características de Candida spp. (seta verde), Geotrichum spp. (seta azul), Rhodotorula spp. (seta vermelha) e Trichosporon spp. (seta preta). ................................................................................................................................... 19

Figura 4: Microcultivo de C. albicans em ágar fubá acrescido de Tween 80. A- Macroscopia do crescimento da cepa nas estrias e em volta da lamínula; B- Na microscopia observa-se a presença de clamidoconídios (setas azuis). ............................................................................ 20

Figura 5: Avaliação da secreção de fosfolipase por cep as de Candida spp. em meio ágar gema de ovo. Observa-se a formação de uma zona esbranquiçada e opaca, indicativa da produção da enzima. A linha vermelha representa o diâmetro da colônia e a azul o diâmetro total. ..................................................................................................................................... 24

vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIDS Acquired immunodeficiency syndrome CE Ceará CEMAS Centro de Multiplicação de Animais Silvestres CEMM Centro Especializado em Micologia Médica CGB Canavanina-glicina-azul de bromotimol CIM Concentração inibitória mínima CLSI Clinical Laboratory Standards Institute IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis IUCN International Union for Conservation of Nature and Natural Resources HIV Human immunodeficiency virus LPTA Lisofosfolipase-transacylase Lyso-PL Lisofosfolipase MIC Minimal inhibitory concentration n Número da amostra NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards pH Potencial hidrogeniônico PLB Fosfolipase B Pz Atividade de fosfolipase RN Rio Grande do Norte sp. Espécie spp. Espécies UECE Universidade Estadual do Ceará var. Variedade

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 12

2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 13

2.1 Aspectos biológicos da Rhea americana .................................................................. 13

2.2 Microbiota por leveduras do trato gastrintestinal de aves .......................................... 15

2.3 Identificação das espécies de leveduras .................................................................... 18

2.4 Secreção de fosfolipases como fator de virulência .................................................... 22

2.5 Teste de sensibilidade a antifúngicos em leveduras do gênero Candida .................... 25

2.6 Aves como reservatórios de leveduras: algumas considerações importantes ............. 28

3. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 30

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS ...................................................................................... 31

5. OBJETIVOS ................................................................................................................ 32

5.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 32

5.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 32

6. CAPÍTULO 1 ................................................................................................................. 33

7. CAPÍTULO 2 .................................................................................................................. 57

8. CONCLUSÕES.............................................................................................................. 68

9. PERPECTIVAS ............................................................................................................. 69

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................... 70

12

1. INTRODUÇÃO

A espécie Rhea americana Linnaeus, 1857 (Rheiformes, Rheidae) é uma ave

silvestre conhecida no Brasil como ema. Esta ave pertence ao grupo das ratitas, que

compreende aves corredoras não voadoras, de grande porte, que quando adultas atingem

até 1,7 m de altura e 35 kg. A ema é onívora, com dieta composta de gramíneas,

leguminosas e pequenos animais, como cobras, ratos, lagartos e insetos. É classificada

como uma ave silvestre pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos

Naturais Renováveis - IBAMA, cabendo a este órgão a regularização de criadouros

desta espécie, sendo proibida a sua caça. No Brasil as emas povoam áreas do Nordeste,

Centro-Oeste, Sudeste e Sul do país.

Nacionalmente observa-se um crescente interesse na comercialização de

produtos oriundos de animais silvestres, tais como aqueles provenientes de emas em

cativeiro, estando a criação de emas em cativeiro ainda dando seus passos iniciais. Por

conseguinte, há uma carência de estudos sobre os aspectos zoonóticos e sanitários

destas aves mantidas em criatórios.

Está bem demonstrado na literatura científica que leveduras, em especial

Candida spp., são microrganismos comumente encontradas na microbiota

gastrintestinal de aves. Entretanto, vários estudos tem evidenciado uma variação na

microbiota de acordo com a espécie hospedeira. Vale destacar que estes dados são

inexistentes em emas. Logo, desconhece-se a atuação destas aves como agentes

reservatórios e carreadores de agentes fúngicos no ambiente, assim como o risco

relacionado à manipulação destes animais.

Diante do exposto, é importante a identificação de leveduras e outros fungos do

trato gastrintestinal de emas, com vistas a contribuir com o conhecimento acerca da

microbiota, virulência e perfil de sensibilidade antifúngico in vitro.

13

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Aspectos biológicos da Rhea americana O gênero Rhea possui uma única espécie, Rhea americana, que agrupa aves

silvestres conhecidas no Brasil como emas (ordem Struthioniformes, subordem Rheae e

família Rheidae) (ALMEIDA, 2003). As emas são aves genuinamente sul-americanas,

com ampla distribuição geográfica e boa adaptação em clima seco.

A Rhea americana engloba cinco subespécies: R. a. albescens (LYNCH;

HOLMBERG, 1878), ocorrendo no nordeste e leste da Argentina; R. a. intermedia

(ROTHSCHILD; CHUBB, 1914), presente no sudeste do Brasil e Uruguai; R. a.

americana (LINNAEUS, 1758), habitando do nordeste ao sudeste do Brasil; R. a.

nobilis (BRODKORB, 1939), encontrada no leste do Paraguai e R. a. araneipes

(BRODKORB, 1938), presente no oeste do Paraguai, leste da Bolívia e sudoeste do

Brasil (GIANNONI; SANCHEZ, 1995).

As emas são aves de grande porte, pernaltas, corredoras e não voadoras,

pertencentes ao grupo das ratitas, podendo atingir quando adultas até 1,7m de altura e

35 kg. As ratitas estão representadas na África pelo avestruz (Struthio camelus), na

Austrália pelo casuar e emu (Casuarius spp. e Dromaius novaehollandiae,

respectivamente) e na Nova Zelândia pelo kiwi (Apteryx australis) (SICK, 1997). As

emas, muitas vezes, são confundidas com avestruzes, devido suas semelhanças físicas,

sendo diferenciadas principalmente pelo número de dedos e porte físico. A ema possui

três dedos em cada membro pélvico e seu tamanho é menor que o avestruz, que possui

apenas dois dedos em cada membro pélvico.

As emas vivem em grupos sociais, algumas vezes numerosos, contudo, os

machos podem ser solitários ou reunir fêmeas e formar grupos reprodutivos (Fig. 1). Os

machos fazem os ninhos, chocam os ovos e cuidam dos filhotes (HASENCLEVER et

al., 2004). A ema macho é maior do que a fêmea e apresenta um colar de penas escuras

na base do pescoço (MENDES, 1985). As emas são onívoras com dieta composta de

gramíneas, leguminosas, plantas herbáceas (inclusive folhas ardidas e espinhosas),

frutas, sementes e pequenos animais, como cobras, ratos, lagartos, lagartixas e insetos

(MENDES, 1985; DURIGAN; GARRIDO, 1986; PARIZZI et al., 2007; SOARES et

al., 2010; IUCN, 2012).

Fonte: CEMAS, 2012

Figura 1: Grupo de emas (Rhea americana) conduzido à baia de contenção para manejo sanitário.

O Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis –

IBAMA classifica as emas como aves silvestres, sendo sua criação e comércio de carne

e subprodutos controlados por este órgão, ficando o abate destes animais restrito a

abatedouros com serviço de inspeção. Ademais, é importante destacar que a caça destas

aves é proibida. Em 2012, a Rhea americana foi classificada pela International Union

for Conservation of Nature and Natural Resources-IUCN, como espécie quase

ameaçada de extinção, com tendência de diminuição da população em localidades onde

há avanço em áreas naturais (IUCN, 2012).

Há uma carência de estudos sobre os aspectos sanitários de emas mantidas em

criatórios. Desconhecendo-se, assim, quais microrganismos estão presentes nestas aves

e se o contato com estes animais facilita a disseminação de agentes infecciosos para

novos hospedeiros e ambientes. Portanto, as emas, a exemplo de outros animais

silvestres, podem aumentar a dispersão geográfica de nichos ecológicos na cadeia de

transmissão de doenças, tanto para o homem quanto para outros animais (NUNES,

2007; SILVA, 2010). Com isso, faz-se necessário que animais silvestres com produção

em cativeiro, sejam investigados quanto a sua importância como reservatórios ou

portadores de microrganismos patogênicos, mesmo na ausência de sinais clínicos de

infecção estabelecida (Fig. 2) (ACHA; SZYFRES, 2003).

Fonte: CEMAS, 2012

Figura 2: Etapas da contenção em emas. A-aproximação; B- captura pelas asas; C- posicionamento atrás do animal e; D- imobilização das asas e corpo do animal.

No tocante as emas, por exemplo, é importante o conhecimento acerca da

microbiota de seu trato digestivo, uma vez que é comum o isolamento de leveduras

potencialmente patogênicas a animais e humanos, como parte da microbiota do trato

gastrintestinal de diversas espécies de aves (BRILHANTE et al., 2010; CAFARCHIA et

al., 2006a).

2.2 Microbiota por leveduras do trato gastrintestinal de aves

Dentre os diversos agentes fúngicos que colonizam as aves destacam-se as

leveduras, rotineiramente encontradas no trato gastrintestinal e fezes de aves. Sendo

descrito que os diversos arranjos destes microrganismos na microbiota são

influenciados pelas características do hospedeiro entre os diferentes segmentos do trato

digestivo, como pH, temperatura, alimentação, etc., existindo um refinado equilíbrio. A

manutenção da população microbiana residente é influenciada por mudanças físicas,

químicas, imunológicas, e fatores microbiológicos ainda pouco compreendidos

(MELVILLE et al., 2004; CAFARCHIA et al., 2006ab).

A B

C D

16

Conhecer os componentes da microbiota fúngica dos diferentes sítios do

hospedeiro é indispensável na compreensão de doenças infecciosas que podem acometer

os animais, uma vez que alterações no equilíbrio favorece a multiplicação de um

microrganismo presente na microbiota, levando ao desencadeamento de uma doença

(MELVILLE et al., 2004).

As leveduras que compõem a microbiota residente são bastante variáveis entre

as diversas espécies de aves e entre os diferentes sítios num mesmo animal, o que por

vezes dificulta a classificação da microbiota transitória, já que não há uniformidade na

microbiota (CAFARCHIA et al., 2006a; CAFARCHIA et al., 2006b; KOCIJAN et al.,

2009; MANCIANTI; NARDONI; CECCHERELLI, 2002; BRILHANTE et al., 2010;

COSTA et al., 2010; SIDRIM et al., 2010; BRILHANTE et al., 2012).

Entre as leveduras de interesse médico, Candida spp. e Cryptococcus

neoformans são as espécies que representam maior risco, principalmente a hospedeiros

em situações estressantes, doenças virais, subnutrição, uso de medicamentos

imunossupressores, dentre outras (BRILHANTE et al., 2010). Porém, espécies dos

gêneros Rhodotorula, Trichosporon e Geotrichum também têm sido implicadas como

causadoras de infecções em hospedeiros animais e humanos, frequentemente com

prognóstico pobre (LORD et al., 2010; CHITASOMBAT et al., 2012; WIRTH;

GOLDANI, 2012). Apesar dos fungos do gênero Geotrichum não serem considerados

como leveduras por alguns autores, são expressivos os relatos de isolamento a partir de

aves, além disso, ultimamente são muitos os relatos de envolvimento em infecções em

hospedeiros humanos e animais, inclusive com aparecimento de fenômeno de

resistência antifúngica, contribuindo para a inclusão deste gênero fúngico na presente

pesquisa (THOMPSON et al., 2009; FIGUEREDO; CAFARCHIA; OTRANTO, 2011;

BIRRENBACH et al.; 2012; CHITASOMBAT et al., 2012).

Estudos pioneiros, como o de Cragg e Clayton (1971), evidenciaram leveduras a

partir da cultura de fezes frescas de gaivotas (Larus occidentalis), pertencentes aos

gêneros Candida, Rhodotorula e Trichosporon. Do gênero Candida, as espécies obtidas

foram C. albicans (36/166 amostras examinadas), C. guilliermondii (7/166 amostras),

C. krusei (2/166 amostras) e C. glabrata (1/166 amostras). Os autores isolaram ainda

cepas de Geotrichum sp. dentre outros fungos. Com a cultura de fezes secas eles

isolaram seis espécies de Candida., sendo C. albicans (1,6%) e C. parapsilosis (2,4%)

as mais prevalentes.

17

Kocan e Hasenclever (1972), obtiveram leveduras a partir de swabs de cavidade

oral de 247 espécimes de columbiformes de sete espécies distintas, isolando os gêneros

Candida, Saccharomyces e Geotrichum em mais de 55% das aves. As espécies mais

frequentemente isoladas foram C. albicans e C. guilliermondii. Em 1976, Ramirez et al.

isolaram espécies fúngicas a partir do trato digestivo de 51/80 pombos, entre as

leveduras isoladas estavam os gêneros Candida, Rhodotorula e Trichosporon, além de

Geotrichum candidum. Outros estudos com columbiformes relatam a ocorrência do

gênero Cryptococcus, além dos demais gêneros fúngicos citados, compondo a

microbiota e ocasionalmente em infecções nos hospedeiros (LEHMANN, 1985; FILIÚ

et al., 2002)

Melville et al. (2004) em seu estudo acerca das espécies de microrganismos

(bactérias aeróbias e fungos) que compõem a microbiota normal de avestruzes (Struthio

camelus), relataram que em amostras de cloaca, as bactérias mais frequentes foram

Escherichia coli, Bacillus spp., Streptococcus spp., Staphylococcus coagulase-negativo

e Pseudomonas aeruginosa. No tocante aos fungos presentes neste sítio, foram isolados

apenas Rhodotorula spp. e Candida albicans. Nas amostras de orofaringe foram

encontradas as bactérias, em ordem decrescente de isolamento, E. coli, Bacillus spp.,

Staphylococcus coagulase-negativo e Klebsiella pneumoniae; assim como as leveduras

C. albicans, Rhodotorula spp. e Cryptococcus spp. Vale destacar que neste estudo não

foram isolados fungos filamentosos em nenhum dos sítios avaliados.

Em um estudo realizado na Europa, em 2006, com sete diferentes espécies de

aves silvestres migratórias, Cafarchia et al. (2006b) isolaram leveduras dos gêneros

Candida, Saccharomyces, Cryptococcus, Trichosporon e Rhodotorula, em 66/421

(15,7%) dos espécimes. Os autores isolaram as seguintes espécies com maior

frequência, Rhodotorula mucilaginosa (28,2%), Cryptococcus albidus (18,4%) e

Candida albicans (9,2%).

Diversos outros trabalhos relataram o isolamento de leveduras integrantes da

microbiota de aves, como: de filhotes de grifo (Gyps fulvus) (KOCIJAN et al., 2009),

rapinantes (CAFARCHIA et al., 2006a; BRILHANTE et al., 2012), pombos (Columba

livia) (COSTA et al., 2010), psitacídeos (MANCIANTI; NARDONI; CECCHERELLI,

2002; BRILHANTE et al., 2010; SIDRIM et al., 2010), dentre outros. Nestes estudos

foi observada uma variação na distribuição dos componentes da microbiota do trato

gastrintestinal, que pode ser influenciada por fatores espécie-específicos, como pH,

temperatura, ecologia, dieta, comportamento e habitat (CAFARCHIA et al., 2006ab).

18

Apesar desta variação, há uma coincidência nas leveduras encontradas, independente da

espécie animal, particularmente Candida spp., que são importantes microrganismos da

microbiota do trato gastrintestinal das aves, com ampla distribuição. Isso nos permite

inferir que as aves podem apresentar-se como reservatórios desses microrganismos para

o ambiente e outros animais, pois já foi observado que os microrganismos podem ser

transmitidos por meio de fômites entre hospedeiros diferentes (MORETTI et al., 2000;

SAMOUR; NALDO, 2002).

As diversas espécies Candida, mas principalmente a C. albicans, são

comumente descritas como agentes fúngicos envolvidos em infecções em filhotes de

aves ou em indivíduos com algum grau de comprometimento imunológico. Esta

condição predispõe os hospedeiros a uma multiplicação excessiva dos componentes de

sua microbiota, primordialmente do trato gastrintestinal, transformando-os em possíveis

disseminadores destas leveduras para outros animais ou humanos (MORETTI et al.,

2000; MARTINO et al., 2002; SAMOUR; NALDO, 2002; MELVILLE et al., 2004).

As aves ao albergarem leveduras no trato gastrintestinal as eliminam no

ambiente através das fezes (BRILHANTE et al., 2010). Nestes casos, as espécies mais

comumente citadas são C. albicans, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. krusei e C.

glabrata. Assim, durante o manejo destes animais, faz-se necessário o entendimento de

que muitos dos agentes fúngicos aviários podem apresentar implicações zoonóticas

importantes, com destaque para a candidíase (MELVILLE et al., 2004; CAFARCHIA et

al., 2006a; BRILHANTE et al., 2010).

2.3 Identificação das espécies de leveduras

Leveduras são fungos unicelulares em forma ovalada ou esférica, e cuja unidade

funcional é o blastoconídio. A maioria das leveduras com relevância clínica se reproduz

por processos assexuados, cujos principais mecanismos são o brotamento e a fissão

celular (DE HOOG et al., 2000; ROMANI, 2011). A presença de pseudomicélio é

comum para diversas espécies do gênero Candida, formando cadeias celulares unidas.

Há ainda fungos que apresentam hifas verdadeiras, como é o caso dos gêneros

Trichosporon e Geotrichum (DE HOOG et al., 2000).

As leveduras comumente isoladas de aves pertencem aos gêneros Candida,

Cryptococcus, Trichosporon e Rhodotorula (Fig. 3), as quais algumas vezes apresentam

colônias macroscopicamente distintas, permitindo excepcionalmente nestes casos,

determinarmos o gênero baseado na macroscopia das colônias (CAFARCHIA et al.,

2006a; BRILHANTE et al., 2010; BRILHANTE et al., 2012; WIRTH; GOLDANI,

2012). Como descrito no tópico anterior, é importante salientar o comum isolamento a

partir do trato gastrintestinal de aves de colônias de fungos do gênero Geotrichum, este

gênero agrupa fungos filamentosos com características leveduriformes como, por

exemplo, nas primeiras fases do seu crescimento a temperaturas mais elevadas (37-

42ºC), sendo tratado em alguns trabalhos simplesmente como leveduras, portanto deve-

se a isso a inclusão deste gênero fúngico no tópico de identificação de leveduras

(KOCAN; HASENCLEVER, 1972; DE HOOG et al., 2000; MARTINO et al., 2004;

FIGUEREDO; CAFARCHIA; OTRANTO, 2011; BIRRENBACH et al.; 2012).

Fonte: CEMM, 2012

Figura 3: Isolamento primário em meio Sabouraud dextrose 2%, a partir de cloaca (A) e orofaringe (B) de emas. Observam-se colônias características de Candida spp. (seta verde), Geotrichum spp. (seta azul), Rhodotorula spp. (seta vermelha) e Trichosporon spp. (seta preta).

Em geral, Candida spp. apresentam colônias lisas, úmidas ou secas, de coloração

branca ou creme. Cryptococcus spp. formam colônias úmidas, mucóides de coloração

creme, marrom ou avermelhada, dependendo do meio onde crescem e da espécie

isolada. Trichosporon spp. apresentam colônias secas, rugosas de coloração branca a

creme e Rhodotorula spp. formam colônias úmidas ou secas, de coloração rosa a

avermelhada. Geotrichum spp. apresentam colônias geralmente secas, com aspecto

furfuráceo e coloração branca ou hialina (DE HOOG et al., 2000). Além destas

características macroscópicas, para identificar as espécies é necessário a realização de

testes fenotípicos mais abrangentes, avaliando características bioquímicas e

micromorfológicas.

Para avaliar a micromorfologia das colônias realizam-se testes, como o

microcultivo em placa, utilizando ágar fubá acrescido de Tween 80, para avaliar

colônias de Candida spp., Cryptococcus spp. e Geotrichum spp., enquanto para avaliar

A B

Rhodotorula spp. faz-se microcultivo em placa usando ágar malte a 2% e para avaliar

Trichosporon spp. faz-se microcultivo em lâmina usando ágar malte a 2% (DE HOOG

et al., 2000).

Para diversas espécies de Candida e Trichosporon (Fig. 4), a avaliação

micromorfológica é o teste padrão-ouro na identificação, uma vez que formam

estruturas específicas, como hifas e pseudo-hifas, dispostas em padrões característicos

para cada espécie (GUÉHO et al., 1994; DE HOOG et al., 2000; MILAN; ZAROR,

2004). Colônias de Geotrichum apresentam ampla filamentação no teste de microcultivo

produzindo um arranjo de hifas fragmentadas formado exclusivamente por artroconídios

de forma subglobosa a cilíndricos (DE HOOG et al., 2000; MARTINO et al., 2004;

FIGUEREDO; CAFARCHIA; OTRANTO, 2011; BIRRENBACH et al.; 2012). Já para

Cryptococcus spp. e Rhodotorula spp. as provas bioquímicas são essenciais para a

identificação, uma vez que não formam hifas nem pseudo-hifas, quando submetidos a

testes micromorfológicos (DE HOOG et al., 2000; GARCÍA-MARTOS et al., 2004).

Fonte: CEMM, 2012

Figura 4: Microcultivo de C. albicans em ágar fubá acrescido de Tween 80. A- Macroscopia do crescimento da cepa nas estrias e em volta da lamínula; B- Na microscopia observa-se a presença de clamidoconídios (setas azuis).

Quanto às provas bioquímicas, a realização da prova da urease em meio ureia de

Christensen, por exemplo, permite detectar a ação da enzima por meio colorimétrico e

assim distinguir a qual divisão pertence o microrganismo, sendo Ascomycota (Candida

spp. e Geotrichum spp.) urease negativa e sendo Basidyomycota (Cryptococcus spp.,

Trichosporon spp. e Rhodotorula spp.) urease positiva (DE HOOG et al., 2000). As

cepas de Candida spp. são submetidas às provas de assimilação e de fermentação de

carboidratos e de assimilação de nitrogênio (BRITO et al., 2009). Colônias de

Cryptococcus spp., Trichosporon spp. e Rhodotorula spp. são submetidas somente aos

testes de assimilação de carboidratos e de nitrogênio, uma vez que não apresentam

A B

21

características fermentadoras (GUÉHO et al., 1994; DE HOOG et al., 2000; GARCÍA-

MARTOS et al., 2004). As características de crescimento sob temperaturas distintas

também podem ser utilizadas como uma ferramenta adicional para a identificação de

algumas espécies de leveduras (GUÉHO et al., 1994; DE HOOG et al., 2000; GARCÍA-

MARTOS et al., 2004).

Ademais, alguns testes específicos podem ser realizados, como o crescimento

em meios cromogênicos para Candida spp., com o objetivo de identificar colônias

mistas e realizar um diagnóstico presuntivo rápido, ou o crescimento em meios

contendo concentrações distintas de cicloheximida para Candida spp. e Trichosporon

spp. (GUÉHO et al., 1994; DE HOOG et al., 2000; QUINDÓS et al., 2001). Usa-se

também meios com precursores para síntese de melanina, como o ágar semente de

níger, para a identificação principalmente de C. neoformans e de C. gattii (DE HOOG et

al., 2000; MILAN; ZAROR, 2004). Adicionalmente, para diferenciar Cryptococcus

neoformans de C. gattii, realiza-se a quimiotipagem das cepas, a qual envolve cultivos

em meio canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB), C. neoformans é sensível à

glicina presente no meio, assim não há crescimento da colônia e não há alteração da cor

do meio, permanecendo esverdeado (DE HOOG et al., 2000; MILAN; ZAROR, 2004).

Apesar destes esforços, a identificação de algumas colônias ainda pode

permanecer indeterminada, assim a identificação pode ser auxiliada através de testes

não automatizados como API 20C AUX (bioMérieux, Mercy l’Etoile, France)

avaliando a capacidade de assimilação de diferentes fontes de carbono, ID 32C

(bioMérieux, Mercy l’Etoile, France) avalia a assimilação de carboidratos, ácidos

orgânicos e sensibilidade a cicloheximida e esculina, e RapID Yeast Plus system

(Innovative Diagnostic System, Norcross, GA) avaliando a hidrólise enzimática dos

substratos e assimilação de carboidratos de leveduras com importância clínica; ou

podem ser usados testes automatizados como VITEK 2 (bioMérieux, Vitek, Hazelwood,

MO) esta bateria de testes analisa a assimilação de diferentes fontes de carbono e

nitrogênio, testes enzimáticos e sensibilidade a cicloheximida, e Baxter Microscan

(Baxter Microscan, West Sacramento, CA) avaliando o perfil enzimático das cepas em

quatro horas de teste.

Além disso, tem-se empregado ultimamente a identificação molecular das cepas,

empregando as diversas ferramentas moleculares baseadas em reação de cadeia de

polimerase (PCR) para identificação e estudos filogenéticos, utilizando como alvos

regiões conservadas (região D1/D2 do 28 S rDNA) ou variáveis (região ITS e IGS1),

22

respectivamente, ou até mesmo realizar sequenciamento do DNA fúngico (COLOMBO;

PADOVAN; CHAVES, 2011). Pode-se lançar mão da análise de polimorfismos de

restrição (RFLP), envolvendo a quebra do DNA por enzimas de restrição em regiões

com determinadas sequências de bases e a separação dos fragmentos resultantes por

eletroforese, gerando diferentes perfis de bandas, ou polimorfismos, de acordo a espécie

fúngica envolvida (BORIOLLO et al., 2005; COLOMBO; PADOVAN; CHAVES,

2011).

2.4 Secreção de fosfolipases como fator de virulência

Em condições favoráveis no hospedeiro, leveduras podem passar de

microrganismos comensais para agentes patogênicos, sob influência de diversos fatores

de virulência que contribuem para a patogenicidade destes microrganismos (ZENG et

al., 2008; COSTA et al., 2009). Entre estes fatores destacam-se a capacidade de adesão

a células epiteliais e endoteliais, a formação de tubo germinativo com consequente

desenvolvimento da forma filamentosa, a ocorrência de variabilidade fenotípica e de

modulação antigênica, a produção de toxinas e de enzimas extracelulares hidrolíticas,

como aspartil proteinase e fosfolipases, que favorecem a instalação do microrganismo e

a invasão tecidual no hospedeiro (IBRAHIM et al., 1995; GHANNOUM, 2000; ZENG

et al., 2008; ALBY; BENETT, 2009; VIEIRA; COUTINHO, 2009; YENIŞEHIRLI;

BULUT; TUNÇOGLU, 2010).

Dentre estes fatores ressaltam-se as enzimas hidrolíticas que atuam no meio

extracelular. As fosfolipases fazem parte de um grupo heterogêneo de enzimas que

hidrolisam uma ou mais ligações éster nos glicerofosfolipídios. Estas enzimas clivam

uma ligação éster específica dos fosfolipídios que são um dos principais componentes

químicos das membranas celulares hospedeiras. Variando o sítio-alvo de ligação na

molécula do fosfolipídio estas enzimas recebem denominações com letras (A, B, C, e

D) para diferenciá-las entre si, além disso, algumas recebem números após as letras para

identificar sub-tipos de fosfolipase, por exemplo fosfolipase A1 (PLA1) hidrolisa a

ligação éster do ácido graxo na posição sn-1, enquanto fosfolipase A2 (PLA2) hidrolisa

a ligação éster do ácido graxo na posição sn-2 (GHANNOUM, 2000).

Segundo Ghannoum (2000) C. albicans secreta variedades de fosfolipase B

(PLB) que apresenta atividade também de lisofosfolipase (Lyso-PL) e lisofosfolipase-

transacilase (LPTA). As enzimas PLB e Lyso-PL hidrolisam a ligação na posição sn-1 e

sn-2 do ácido graxo, respectivamente, e LPTA cliva a ligação no ácido graxo livre.

23

Ghannoum (2000) relata também trabalhos evidenciando a ação de fosfolipase D (PLD)

nesta espécie.

A atividade das fosfolipases provavelmente esta envolvida no processo de

ruptura de membrana na invasão da célula hospedeira, favorecendo a patogenicidade ao

facilitarem a penetração destes microrganismos no tecido hospedeiro (GHANNOUM,

2000; SILVA; PORTO; TEIXEIRA, 2006; VIEIRA; COUTINHO, 2009).

As fosfolipases lisam as células hospedeiras ou alteram as características de

superfície das mesmas, facilitando os processos de aderência e de penetração, sendo

possível estabelecer um valor preditivo de mortalidade através da taxa de produção

dessa enzima (IBRAHIM et al., 1995; SAMARANAYAKE et al., 2005). As

fosfolipases já foram implicadas como fatores de virulência de Candida spp.,

Cryptococcus neoformans, Clostridium perfringens, Rickettsia spp., Staphylococcus

aureus, Toxoplasma gondii, dentre outros, sendo que o tipo de fosfolipase implicada na

virulência varia de acordo com o organismo (IBRAHIM et al., 1995; GHANNOUM,

2000). Além disso, tem-se observado que a produção de fosfolipase por C. albicans

isoladas de seres humanos, por exemplo, pode variar de acordo com o sítio de

isolamento do microrganismo no hospedeiro e com o estado de saúde do hospedeiro

(IBRAHIM et al., 1995; SAMARANAYAKE et al., 2005).

Atualmente, sabe-se que a elevada atividade de fosfolipase está correlacionada

com outros atributos de virulência, como ao aumento da capacidade de aderência às

células epiteliais e da taxa de mortalidade, em modelos animais (SAMARANAYAKE

et al., 2005; COSTA et al., 2009) e à maior capacidade de invasão dos tecidos

hospedeiros e de formação de tubo germinativo (SAMARANAYAKE et al., 2005).

Os relatos pioneiros de secreção de fosfolipases por C. albicans foram feitos por

Costa et al. (1968) ao observarem o crescimento dessa espécie em meio sólido contendo

gema de ovo ou lecitina. Em 1975, Pugh e Cawson verficaram elevada atividade de

fosfolipase na extremidade da hifa em crescimento, garantindo maior capacidade de

invadir células e tecidos (GHANNOUM, 2000). Barrett-Bee et al. (1985), foram os

primeiros a avaliar o papel da fosfolipase extracelular na virulência de C. albicans. Eles

observaram correlação entre atividade de fosfolipase e parâmetros potenciais de

patogenicidade. Assim, as cepas que se aderiam mais fortemente às células epiteliais

bucais e eram as mais patogênicas para camundongos apresentavam uma maior

produção de fosfolipase.

Price, Wilkinson e Gentry (1982) descreveram um método para detecção da

atividade de fosfolipase em C. albicans, que consiste em semear as cepas em placas

contendo meio ágar Sabouraud dextrose, acrescido de gema de ovo que é uma rica fonte

de fosfolipídios. Este método é de fácil execução e reprodutibilidade, tornando-se o

método clássico na triagem de cepas de Candida spp. para produção de fosfolipases por

diversos pesquisadores. Nos isolados positivos é possível observar a formação de uma

zona de precipitação densa, ao redor da colônia, possivelmente, devido à formação de

complexos de cálcio com os ácidos graxos, liberados em decorrência da ação enzimática

sobre os fosfolipídios do meio (GHANNOUM, 2000; CAFARCHIA et al., 2008; ZENG

et al., 2008; COSTA et al., 2009; VIEIRA; COUTINHO, 2009).

O grau de atividade de fosfolipase (Pz) é definida obtendo-se a razão entre o

diâmetro da colônia e o diâmetro total, formado por colônia e zona de precipitação.

Assim, quando Pz é igual a um (Pz = 1), não há produção de fosfolipase extracelular

(Fig. 5). Por outro lado, quando Pz é menor que um (Pz <1), há atividade da enzima,

sendo que Pz ≥ 0,64 demonstra uma baixa atividade e Pz < 0,64 demonstra uma alta

atividade enzimática (GHANNOUM, 2000; VIEIRA; COUTINHO, 2009). Contudo, o

método desenvolvido por Price, Wilkinson e Gentry (1982) não é capaz de diferenciar a

produção de lipases e fosfolipases pela cepa, já que na gema de ovo há substrato para a

ação das duas enzimas, assim seu uso aplica-se somente como método de triagem

inicial. Esta metodologia também não é adequada para testar cepas com baixa produção

enzimática, sendo necessária a confirmação por métodos mais sensíveis, como ensaios

colorimétricos e radiométricos específicos (GHANNOUM, 2000; COSTA et al., 2009).

Fonte: CEMM, 2009

Figura 5: Avaliação da secreção de fosfolipase por cep as de Candida spp. em meio ágar gema de ovo. Observa-se a formação de uma zona esbranquiçada e opaca, indicativa da produção da enzima. A linha vermelha representa o diâmetro da colônia e a azul o diâmetro total.

25

São poucos os trabalhos que abordam a produção de fosfolipase por leveduras de

origem aviária. Cafarchia et al. (2008) avaliaram a produção de fosfolipase em 13

espécies de leveduras previamente isoladas da cloaca de rapinantes, aves migratórias e

passeriformes, e de fezes de rapinantes colhidas dos recintos. Com positividade em

48,1% e 73,3% para leveduras isoladas da cloaca e fezes, respectivamente, em diversas

espécies de Candida spp. Vieira e Coutinho (2009) avaliaram a atividade de fosfolipase

de 25 isolados de Candida spp., oriundos do inglúvio de filhotes de papagaios (A.

aestiva e A. amazonica) com e sem sinais clínicos de ingluvite, verificando positividade

em 68% das cepas de diferentes espécies. Sidrim et al. (2010) avaliaram a produção de

fosfolipase em 59 cepas de Candida spp. isoladas de cavidade oral, inglúvio, cloaca e

fezes de calopsitas, e obtiveram positividade em todas as cepas de C. albicans e 40% de

positividade em C. não-albicans, com maior proporção de fortemente positiva

observada em cavidade oral, seguida por cloaca e inglúvio. Esse conjunto de dados

sugere que isolados de origem aviária possuem capacidade de secreção de fosfolipase,

assim como acontece em isolados humanos.

2.5 Teste de sensibilidade a antifúngicos em leveduras do gênero Candida

A partir da década de 1980, houve uma multiplicação dos pacientes

imunocomprometidos com síndrome de imunodeficiência adquirida-AIDS, e junto

houve forte aumento nos casos de micoses humanas, especialmente as candidíases

orofaríngeas que não raramente apresentavam-se irresponsivas ao tratamento

antifúngico empregado, comprometendo a saúde de tais pacientes e em muitos casos

levando ao óbito mesmo se instituindo a terapia antifúngica (HOSPENTHAL et al.,

2004; MATTA et al., 2007; TAMURA et al., 2007; JOHNSON, 2008). Os

pesquisadores observaram o surgimento de resistência aos derivados azólicos,

observada principalmente em cepas de C. albicans frente ao fluconazol, entre pacientes

infectados com o vírus da imunodeficiência humana-HIV, que apresentavam candidíase

oral e esofágica, previamente à introdução de terapia antirretroviral (JOHNSON, 2008;

KANAFANI; PERFECT, 2008).

Estes acontecimentos levaram pesquisadores a buscarem rapidamente uma

abordagem terapêutica efetiva para o paciente, aumentando com isso sua sobrevida.

Assim, a busca de informações sobre o perfil de sensibilidade in vitro aos antifúngicos

da rotina clínica, especialmente dos fungos mais comumente envolvidos em infecções,

26

tem sido de grande importância na elaboração de um plano terapêutico adequado à

região, assim como as medidas profiláticas necessárias.

Desse modo, em 1985, o Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), então

conhecido como National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS),

identificou que não havia um procedimento padrão para o teste de sensibilidade, e que

20% dos laboratórios membros empregavam o método de diluição em caldo e,

entretanto, obtinham resultados de concentração inibitória mínima (CIM) discrepantes.

Então, em 1992, o NCCLS reúne na Norma M27-P a metodologia padronizando o teste

de macrodiluição em caldo, especificando o meio a ser utilizado, tamanho e preparação

do inóculo, o tempo e a temperatura de incubação e as diluições utilizadas, tornando-o

reprodutível e praticável aos laboratórios de rotina (CLSI, 2008).

Em 1995, a Norma M27-T, trouxe faixas de referência de CIM para as drogas

antifúngicas disponíveis, frente a duas cepas controle de qualidade e padronizou a

técnica de microdiluição em caldo. Em 1997, a Norma M27-A foi publicada,

especificando os pontos de corte para os antifúngicos disponíveis. Em 2002, a Norma

M27-A2 padronizou as faixas de referência de CIM 24 e 48 horas, para drogas

previamente estabelecidas e recém-lançadas (CLSI, 2008).

Em 2009, foi publicado o documento M27-A3 que apresenta como principal

novidade em relação ao documento M27-A2, a percentagem na leitura em relação aos

derivados azólicos que era de 80% de inibição e agora é de 50% em relação ao

crescimento fúngico sem contato com a droga testada (CLSI, 2008).

O teste de sensibilidade a antifúngicos pelo método de microdiluição em caldo é

realizado em placas acrílicas estéreis de 96 poços em formato de U. Nestas placas o

inóculo é diluído a uma concentração definida e igual para os diversos poços, e então

estes inóculos, são expostos a drogas antifúngicas com concentrações sucessivamente

decrescentes, sendo possível observar o efeito destes fármacos sobre o crescimento

fúngico, identificando assim a menor concentração da droga capaz de inibir o

crescimento do microrganismo, denominada de concentração inibitória mínima (CIM)

padronizado pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008).

Espera-se com o teste de sensibilidade antifúngica, prever a resposta dos

pacientes à terapia a ser instituída. Pois, embora existam diferentes fatores que

influenciem a resposta clínica (sítio de infecção, status imunológico do hospedeiro,

farmacocinética da droga, adesão do paciente à terapia etc.), o perfil de sensibilidade in

vitro, parece seguir o mesmo padrão mostrado nos testes de sensibilidade a

27

antibacterianos, onde 90% das infecções causadas por microrganismos que apresentam

sensibilidade in vitro e 60% das infecções causadas por microrganismos que apresentam

resistência in vitro respondem bem à quimioterapia antimicrobiana in vivo, levando a

utilização da regra 90-60 e orientando a aplicação da terapia antifúngica mais adequada,

direcionando o paciente aos 90% de sucesso terapêutico (REX; PFALLER, 2002;

KANAFANI; PERFECT, 2008; MAIA, 2009). Desse modo ao se realizar um teste de

sensibilidade antifúngica in vitro, talvez o que se extrai de mais importante dos

resultados obtidos é o direcionamento de qual fármaco não deve ser utilizado naquele

caso específico (PFALLER, 2012).

Apesar da correlação entre o sucesso terapêutico e os resultados de sensibilidade

in vitro ainda não ter sido completamente elucidada, a realização desses testes permite

avanços importantes sobre epidemiologia das enfermidades, o que contribui para a

criação de um protocolo terapêutico eficiente. Assim, o conhecimento das espécies mais

prevalentes em determinada região e a caracterização desses microrganismos, inclusive

com o perfil de sensibilidade a drogas, auxilia na seleção de agentes antifúngicos

adequados, antecipando o início da terapia. Ademais, relatos recentes sugerem que

espécies como C. krusei e C. glabrata sejam menos sensíveis a drogas como fluconazol

e anfotericina B, quando comparadas a outras espécies de leveduras, logo o uso destes

antifúngicos deve ser desestimulado no combate a estas leveduras. Há também relatos

pontuais de resistência intrínseca a poliênicos em C. guilliermondii (HOSPENTHAL et

al., 2004; PFALLER; DIEKEMA, 2007; JOHNSON, 2008; KANAFANI; PERFECT,

2008; PFALLER, 2012).

De forma geral, a taxa de resistência aos derivados azólicos permanece baixa,

entre a maioria das espécies de Candida spp., variando de 1-2,1% em C. albicans, de

0,4-4,6% em C. parapsilosis e de 1,4-6,6% em C. tropicalis. No entanto, C. glabrata, a

segunda espécie mais prevalente em infecções fúngicas sistêmicas nos Estados Unidos,

apresenta crescente resistência ao fluconazol, cuja taxa de resistência aumentou de 7

para 12%, entre os anos 2001 e 2004 (KANAFANI; PERFECT, 2008). Outros trabalhos

relatam a resistência de espécies de Candida spp. a outros antifúngicos derivados

azólicos usados e assim o tratamento de candidíase com a terapia clássica tem ficado

cada vez mais dificultado (JOHNSON, 2008; MAIA, 2009).

São muitos os trabalhos que monitoram o perfil de sensibilidade a antifúngicos

de leveduras isoladas de amostras clínicas humanas, no entanto, ainda são poucos os

trabalhos com leveduras isoladas de animais. Brito et al. (2009) isolaram Candida spp.

28

da região perineal, da vagina, do prepúcio e da cavidade oral de cães hígidos e

observaram resistência a derivados azólicos em dois isolados de C. albicans e três

isolados de C. tropicalis. Sidrim et al. (2010) ao pesquisarem cavidade oral, inglúvio,

cloaca e fezes de calopsitas isolaram cepas de C. albicans resistentes ao itraconazol (14

isolados) e ao fluconazol (4 isolados), e isolaram duas cepas de C. tropicalis resistentes

ao fluconazol quando se leva em conta o ponto de corte para fluconazol maior ou igual a

8µg, proposto por Pfaller (2012).

2.6 Aves como reservatórios de leveduras: algumas considerações importantes

As aves de vida livre ou de cativeiro apresentam um importante papel, como

reservatórios e/ou carreadores de várias espécies de microrganismos, contribuindo para

a contaminação ambiental e, algumas vezes, para a disseminação de doenças

(MANCIANTI; NARDONI; CECCHERELLI, 2002; CAFARCHIA et al., 2006a;

CAFARCHIA et al., 2006b; KOCIJAN et al., 2009).

Particularmente no tocante às leveduras, muitos trabalhos tem referido que as

aves albergam espécies de Candida, Cryptococcus, Trichosporon e Rhodotorula, em

seu trato digestivo, eliminando-as no ambiente através de suas excretas. Tem sido

relatado que em aves, o estresse e, consequentemente, a imunossupressão são

importantes fatores desencadeantes de doenças fúngicas. Vale destacar que nesta

situação clínica, as leveduras são eliminadas em grande quantidade, aumentando não só

os riscos de contaminação ambiental, mas também dos contactantes, incluindo o homem

(CAFARCHIA et al., 2008; BRILHANTE et al., 2010).

Estudos recentes realizados em nosso laboratório evidenciaram em pombos

(COSTA et al., 2010), calopsitas (SIDRIM et al., 2010), rapinantes (BRILHANTE et

al., 2012) e/ou em suas excretas, cepas de Cryptococcus spp. e Candida spp. resistentes

a derivados azólicos. Despertando, assim, a preocupação com uma possível

contaminação do ambiente com leveduras patogênicas, que apresentam um histórico de

fenômeno de resistência, in vitro, diante antifúngicos rotineiramente utilizados na

prática clínica, como o fluconazol e o itraconazol.

Por fim, considerando os relatos de criptococose e candidíase em humanos

expostos à excreta de aves, a população de um modo em geral, mas especialmente os

indivíduos imunossuprimidos devem ser alertados quanto aos riscos potenciais de

conviver em ambientes habitados por estes animais (CAFARCHIA et al., 2008). Esta

29

preocupação deve ser redobrada quando se trata de aves silvestres devido à carência de

estudos sobre os aspectos zoonóticos e sanitários destas aves mantidas em cativeiro,

desconhecendo-se, portanto, o risco relacionado à manipulação destes animais.

30

3. JUSTIFICATIVA

Nos últimos anos tem ocorrido um aumento no interesse pela criação comercial de

emas (Rhea americana). No entanto, não há estudos específicos acerca da microbiota destes

animais tampouco sobre o perfil de sensibilidade e virulência dos microrganismos

encontrados. Vale destacar que em outras pesquisas abordando a microbiota por leveduras em

animais, encontramos microrganismos potencialmente patogênicos; bem como cepas

resistentes aos antifúngicos utilizados na prática clínica. Diante desta situação, é importante a

identificação de leveduras do trato gastrintestinal de emas, com vistas a contribuir com o

conhecimento acerca da microbiota, virulência e perfil de sensibilidade antifúngico in vitro.

31

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

Espécies de leveduras potencialmente patogênicas integram a microbiota do trato

digestivo de emas (Rhea americana);

Há fenômeno de resistência antifúngica in vitro em Candida spp. e Geotrichum spp.

isolados do trato digestivo de emas;

Candida spp. isoladas do trato digestivo de emas são capazes de secretar in vitro

fosfolipases.

32

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo geral

Com este estudo buscou-se caracterizar a microbiota, por leveduras, do trato digestivo

de emas (Rhea americana) mantidas em cativeiro.

5.2 Objetivos específicos

Identificar leveduras e Geotrichum spp. presentes na orofaringe, cloaca e fezes de

emas;

Estabelecer o perfil de sensibilidade antifúngica in vitro para as leveduras isoladas;

Determinar o perfil de sensibilidade antifúngica in vitro para as cepas de Geotrichum

spp.;

Avaliar a secreção de fosfolipase in vitro, pelas leveduras do gênero Candida isoladas.

33

6. CAPÍTULO 1

Detecção de Candida spp. resistentes a azólicos na microbiota de emas (Rhea americana): possíveis implicações para a saúde humana e animal

Detection of Candida spp. resistant to azoles in the microbiota of rheas (Rhea

americana): Possible implications for human and animal health

Periódico: Veterinary Microbiology (submetido em novembro de 2012)

Fator de Impacto: 3,256

34

RESUMO Há um interesse crescente na criação emas (Rhea americana) no Brasil. No entanto, não

existem dados sobre a microbiota gastrointestinal por leveduras nesta espécie. Portanto, o

objetivo deste trabalho foi isolar Candida spp. a partir do trato digestivo de emas e avaliar in

vitro a sensibilidade antifúngica e secreção de fosfolipases dos fungos encontrados. Para este

fim, foram investigadas 58 emas de criatórios, nas cidades de Fortaleza e Mossoró, nordeste

do Brasil. As amostras foram recolhidas a partir de orofaringe e cloaca dos animais, com

swabs estéreis e amostras de fezes foram coletadas a partir do ambiente. O material foi

semeado em ágar Sabouraud dextrose 2% acrescido de cloranfenicol (0,5 g/L) e os fungos

foram identificados pelas características macro e micromorfológicas, bem como através da

cultura em meio CHROMagar-Candida e caracterização bioquímica. Após a identificação,

todas as cepas isoladas foram submetidas ao teste de sensibilidade antifúngica pelo método de

microdiluição em caldo definido pelo Clinical Laboratory Standards Institute (documento

M27-A3), ante a anfotericina B, itraconazol e fluconazol. A capacidade de cepas de Candida

spp. secretarem fosfolipases foi avaliado através da cultura em ágar gema de ovo. Candida

spp. foram isolados em pelo menos um local anatómico em 36/58 das aves (14/17 jovens e

22/41 adultos) e em 6/10 amostras fecais. Na grande maioria dos casos, apenas uma única

espécie foi isolada a partir de cada sítio (36/56 sítios positivos), com um máximo de três

espécies observadas em apenas quatro casos (4/56). Um total de 77 isolados foi obtido,

pertencentes às espécies C. parapsilosis (19/77), C. albicans (18/77), C. tropicalis (13/77), C.

guilliermondii (12/77), C. krusei (10/77) e C. famata (5/77). Houve maior presença de C.

albicans na orofaringe das emas jovens do que nos adultos (p <0,001). Não foi observada

resistência a anfotericina B, mas 16 cepas foram simultaneamente resistentes aos dois

derivados azólicos (11/18 C. albicans, 1/10 C. krusei, 2/19 C. parapsilosis e 2/13 C.

tropicalis). Houve elevada resistência principalmente em cepas de C. albicans ao fluconazol

(15/18) e ao itraconazol (13/18). E finalizando, 23/77 cepas secretaram fosfolipases. Em

síntese, o trato digestivo dos animais estudados apresentou heterogeneidade de espécies de

Candida potencialmente patogênicas, uma vez que parte delas apresentou resistência aos

derivados azólicos e secretaram fosfolipases.

Palavras-chave: Rhea americana. Candida spp.. Resistência. Antifúngicos. Fosfolipase.

35

Veterinary Microbiology – Research Paper

Detection of Candida spp. resistant to azoles in the microbiota of rheas (Rhea

americana): Possible implications for human and animal health

Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante1, Lucas Pereira de Alencar1,2, Rossana de Aguiar

Cordeiro1, Débora de Souza Collares Maia Castelo-Branco1, Carlos Eduardo Cordeiro

Teixeira1, Ramila de Brito Macedo1, Daniel Teixeira Lima1, Manoel de Araújo Neto Paiva1,2,

André Jalles Monteiro3, Nilza Dutra Alves4, Moacir Franco de Oliveira4, José Júlio Costa

Sidrim1, Marcos Fábio Gadelha Rocha1,2

1Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical

Mycology Center, Postgraduate Program in Medical Microbiology, Federal University of

Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. 2School of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of

Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. 3Department of Statistics and Applied Mathematics, Federal University of Ceará, Fortaleza-

CE, Brazil 4Department of Animal Science, Federal Rural University of the Semiarid, Mossoró-RN,

Brazil,

Corresponding Author. R. S. N. Brilhante. Rua Barão de Canindé, 210; Montese. CEP:

60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 85 3295-1736 E-mail: brilhante@ufc.br

36

Abstract

There is growing interest in breeding rheas (Rhea americana) in Brazil. However, there are no

data on the gastrointestinal microbiota of yeasts in this species. Therefore, the aim of this

work was to isolate Candida spp. from the digestive tract of rheas and to evaluate in vitro the

antifungal sensitivity and secretion of phospholipases of the fungi encountered. For this

purpose, 58 rheas from breeding operations in the cities of Fortaleza and Mossoró,

northeastern Brazil, were used. Samples were gathered from the oropharynx and cloaca of the

animals, using sterile swabs. Stool samples were collected from their pens, by scraping with a

scalpel. For the primary isolation, the material was seeded onto 2% Sabouraud dextrose agar

plus chloramphenicol (0.5 g/L). The fungi were identified by macro and micromorphological

characteristics as well as by culturing on CHROMagar-Candida medium and biochemical

profiling. After identification, all the strains were submitted to antifungal sensitivity testing by

the standard method defined by the Clinical Laboratory Standards Institute (document M27-

A3), using broth microdilution, against amphotericin B, itraconazole and fluconazole. The

capacity of the Candida spp. strains to secrete phospholipases was also tested, by culturing on

egg yolk agar. Candida spp. were isolated from at least one anatomical site in 36/58 of the

birds (14/17 juveniles and 22/41 adults) and in 6/10 fecal samples. In the large majority of

cases, only a single species was isolated from each site (36/56 positive sites), with up to three

species being observed only in four cases (4/56). A total of 77 isolates were obtained,

belonging to the species C. parapsilosis (19/77), C. albicans (18/77), C. tropicalis (13/77), C.

guilliermondii (12/77), C. krusei (10/77) and C. famata (5/77). There was greater presence of

C. albicans in the oropharynx of the juvenile rheas than in the adults (p<0.001). No resistance

was observed to amphotericin B, but 16 strains were simultaneously resistant to the two azole

derivatives (11/18 C. albicans, 1/10 C. krusei, 2/19 C. parapsilosis and 2/13 C. tropicalis).

There was particularly high resistance of C. albicans strains to fluconazole (15/18) and to

37

itraconazole (13/18). Finally, 23/77 strains secreted phospholipases. In summary, the

digestive tract of healthy rheas (Rhea americana) contains potentially pathogenic Candida

spp. because of resistance to the azole derivatives and the secretion of phospholipases.

Keywords: Rhea americana. Candida spp. Resistance. Antifungals. Phospholipases.

38

Introduction

The rhea (Rhea americana) is a large flightless bird with a close phylogenetic

relationship with the ostrich (Struthio camelus), cassowary (Casuarius sp.), emu (Dromaius

novaehollandiae) and kiwi (Apteryx australis). The species is native to South America and is

found in the wild in many regions of Brazil, despite threats from hunting and habitat

destruction (Parizzi et al., 2007; Soares et al., 2010; Iucn, 2012). Rheas are omnivorous,

feeding on many plant species, small rodents, reptiles and insects. In recent years, there has

been an increase in the number of rhea farms in Brazil, to produce meat and feathers.

There are very few studies on the sanitary aspects of commercial breeding of rheas.

There is no information on what microorganisms are present in these birds and whether

contact with the animals facilitates the dissemination of infectious agents to new hosts and

environments. The rhea, as is the case of other wild animals, possibly increases the dispersion

of ecological niches in the transmission chain of diseases, both to humans and other animals

(Azevedo et al., 2010; Soares et al., 2010). Therefore, it is necessary to investigate animals

that are widely dispersed in the wild and also bred in captivity for their possible role as

reservoirs of pathogenic microorganisms, even in the absence of clinical signs of infection.

Yeasts are microorganisms commonly found in the gastrointestinal microbiota of

birds (Mancianti et al., 2002; Melville et al., 2004; Cafarchia et al., 2006a; Brilhante et al.,

2010; Costa et al. 2010). There are reports of antifungal resistance of Candida spp. strains

isolated from healthy cockatiels (Sidrim et al., 2010). The microbiota can vary according to

the host species (Melville et al., 2004; Cafarchia et al. 2006b; Brito et al., 2009; Brilhante et

al., 2010), but generally there is high frequency of the isolation of Candida spp., particularly

C. albicans. To the best of our knowledge, however, there have been no specific studies about

of the microbiota of Candida spp. in rheas or antifungal resistance and virulence of the

microorganisms found. Therefore, the objective of this work was to isolate yeasts of the

39

Candida genus in the microbiota in these birds and to characterize these isolates for resistance

to antifungal agents of clinical use and analyze their production of phospholipases (an

important virulence factor commonly detected in yeasts isolated from birds).

Materials and Methods

Animals

Fifty-eight apparently healthy birds (Greater Rhea, Rhea americana) of both sexes,

bred in captivity in the cities of Fortaleza - Ceará (3° 43′ 6″ S 38° 32′ 36″ W) and Mossoró -

Rio Grande do Norte (5° 11′ 17″ S 37° 20′ 39″ W), northeastern Brazil, were studied, of them

17 juveniles (≤ 12 months) and 41 adults (> 12 months). The birds were physically restrained

and before specimen collection, they were individually evaluated. This study was approved by

the animal research ethics committee of Ceará State University (protocol number 11044670-

4/43).

Sample collection

Samples were collected from two anatomical sites (oropharynx and cloaca) and from

droppings. Sterile cotton swabs were used to obtain samples from the oropharynx and cloaca.

The swabs were inserted into the anatomical site and rotated. Then they were placed into

sterile glass slants, containing 1 mL of sterile saline (0.9% NaCl), keeping the cotton

extremity in contact with the solution at 10 ºC until processing, within 12 hours. Stool

samples (pool of feces) were collected from the pens where the birds were maintained and

were kept at 10 ºC in the same sterile saline solution until processing, within 12 hours. The

samples were kept refrigerated at 10 °C until laboratory processing (Brilhante et al., 2010).

Isolation and fungal identification procedures

40

The swabs with samples from the oropharynx and cloaca were inoculated in Petri

dishes containing 2% Sabouraud dextrose agar (SDA, Difco Laboratories) with

chloramphenicol and incubated at 25 ºC, for 10 days, during which the dishes were observed

daily for evaluation of the presence of fungal colonies. Previous to streaking agar plates, the

stool samples were processed as described by Brilhante et al. (2010). The cultured media were

incubated at 25 ºC for 10 days. For each positive sample, colonies were observed

microscopically after Gram staining. For Candida spp., the colonies were initially grown on

chromogenic media (HiChrome Candida Differential Agar, HiMedia, Mumbai, India) for

identification of mixed colonies. Afterwards, individual colonies were subcultured into slants

containing potato dextrose agar and Christensen’s urea agar and after 24 to 48h the

microorganisms were grown on cornmeal Tween-80 agar for morphological analysis. A sugar

assimilation test was also performed for each isolate and the results were interpreted

according to De Hoog et al. (2000).

Antifungal susceptibility testing

The Candida spp. strains were tested against amphotericin B (AMB, Sigma Chemical

Corporation, USA), fluconazole (FLC, Pfizer, Brazil) and itraconazole (ITC, Janssen

Pharmaceutica, Belgium). The antifungal drugs were diluted according to the document

M27A3 (CLSI, 2008). The concentration range tested was 0.03125-16 µg/mL for AMB and

ITC and 0.125-64 µg/mL for FLC (Brito et al., 2009; Sidrim et al., 2010). Inocula were

prepared from two-day-old cultures grown on potato dextrose agar at 35 oC to reach a final

concentration of 0.5 - 2.5 x 103 cells/mL in RPMI medium buffered to pH 7 with 0.165M

morpholinepropanesulfonic acid (MOPS), as recommended by CLSI (2008). Susceptibility

was investigated by broth microdilution in 96-well microdilution plates at 35 ºC for 48 hours.

All the isolates were tested in duplicate. For AMB, MIC was defined as the lowest

41

concentration at which no growth was observed; for ITC and FLC, MICs were defined as the

lowest drug concentration inhibiting fungal growth by 50% when compared to the control

well (CLSI, 2008). Isolates with MICs >1, ≥64 and ≥1 µg/mL were considered resistant to

AMB, FLC and ITC, respectively (CLSI, 2008), except for C. albicans, C. parapsilosis and

C. tropicalis against FLC, which were considered resistant for MIC ≥ 8 (Pfaller, 2012). C.

parapsilosis ATCC 22019 was included as quality control for each test (CLSI, 2008).

Phospholipase experiments

All strains were tested for phospholipase activity. The test was performed according to

Sidrim et al. (2010). Briefly, the medium used was 2% Sabouraud dextrose agar,

supplemented with 1 mol/L of sodium chloride, 0.05 mol/L of calcium chloride and 8% sterile

egg yolk emulsion, at a concentration of 30%. The emulsion was heated to 40 ºC and

incorporated into the sterile Sabouraud medium after it reached the same temperature. Then

the medium was poured into 90-mm Petri dishes and the yeast inoculum was prepared in

sterile saline at a concentration of 4 on the McFarland scale. The inoculum (5 µL) was

dripped onto a 5-mm sterilized filter paper disk, which was then placed on the agar. Next,

plates were incubated at 35 ºC for seven days. Phospholipase activity (Pz) was determined by

calculating the ratio between the diameter of the yeast colony and the total diameter, including

the colony and the precipitation zone. According to this criterion, when Pz = 1, the isolate is

phospholipase negative; when 1 > Pz ≥ 0.64 the isolate is positive for phospholipase activity;

and when Pz < 0.64, the isolate is strongly positive for this enzyme.

Statistical Analysis

Fisher’s exact test was used to check for differences in the number of isolates between

the anatomical sites and bird age ranges (adult versus juvenile). Student’s t-test was used to

42

compare the MICs in relation to the antifungal drugs as well as for comparison between the

sites in relation to the species isolated for paired samples. To compare the species irrespective

of collection site, ANOVA was used with post hoc application of the Fisher test. ANOVA

was also employed to assess differences in production of phospholipases, both among species

and between their isolation sites. Results with p< 0.05 were considered significant.

Results

A total of 36/58 rheas were positive for growth of Candida spp. in at least one of the

sites sampled (14/17 for juveniles and 22/41 for adult birds). The positivity per site was 29/58

in the oropharynx of 21/58 in the cloaca, as well as 6/10 in feces, with Candida spp. being

found in both anatomical sites in 14/58 animals.

Only one Candida species was isolated in 39/56 positive samples, while in 13/56 cases

two species were isolated and in 4/56 three were isolated (Table 1). Therefore, a total of 77

Candida spp. were obtained, comprising six species, as described in Table 2. The most

frequently isolated species were C. parapsilosis (19/77) and C. albicans (18/77). C. albicans

was more frequent in the oropharynx of juvenile birds than in adults (p <0.0001) (Table 2).

The results obtained from antifungal susceptibility testing are grouped in Table 3.

There was no resistance to amphotericin B among the isolates. However, 16 strains were

resistant to both azole derivatives, namely C. albicans (11/18), C. krusei (1/10), C.

parapsilosis (2/19), C. tropicalis (2/13) and C krusei (1/10). There was a significant

occurrence of resistance among the strains of C. albicans to fluconazole (15/18) and

itraconazole (13/18). Other isolates showed resistance as follows: C. parapsilosis (7 and 3/19

to fluconazole and itraconazole, respectively); C. tropicalis (6 and 5/13 to fluconazole and

itraconazole, respectively); C. guilliermondii (1/12 to itraconazole); and C. krusei (2 and 1/10

to fluconazole and itraconazole, respectively).

43

The phospholipase activity (Pz) of the 77 strains of Candida spp. tested is shown in

Table 4. Fifty-four strains were negative (Pz = 1) for the excretion of phospholipases, while

18 were positive (1> Pz ≥ 0.64) and five were strongly positive (Pz <0.64). The phospholipase

activity average of the strains that were positive was 0.75, with 9/18 C. albicans, 1/5 C.

famata, 2/12 C. guilliermondii, 4/19 C. parapsilosis and 2/13 C. tropicalis. The average of Pz

in strongly positive strains was 0.60 for 1/12 C. guilliermondii, 3/19 C. parapsilosis and 1/13

C. tropicalis). No significant difference was found concerning the secretion of phospholipases

by Candida species.

Discussion

This is the first study to focus on Candida spp. isolated from the oropharynx, cloaca

and droppings of rheas, for the purpose of analyzing the occurrence of resistance to

antifungals in healthy birds. There have been reports of invasive fungal infection of rhea

lungs caused by Aspergillus fumigatus (Reissig et al., 2002; Copetti et al., 2004), but there are

no data on colonization by Candida spp. in healthy rheas.

There was high rate of positive animals to Candida spp. (62.07%), much higher than

the isolation of yeasts in birds of prey (25%) (Cafarchia et al., 2006a) and near the rate in

cockatiels (65%) (Brilhante et al., 2010). The isolation rate of Candida spp. in the oropharynx

of the rheas was higher than observed in ostriches and cockatiels (Melville et al., 2004;

Brilhante et al., 2010), and the isolation in the cloaca was higher than in ostriches and

migratory birds (Melville et al., 2004; Cafarchia et al., 2006b).

Rhea droppings provide a good substrate for colonization by Candida spp., with 60%,

positivity, greater than observed in studies of other bird species (Mancianti et al., 2002;

Cafarchia et al., 2006a; Brilhante et al., 2010), suggesting care should be exercised when

handling the droppings of this bird.

44

There was predominance of colonization by a single species in the collection sites

(69.64% of the positive samples). In turn, two Candida species were in found in 23.21% of

the samples and three were found in 7.14% of them. The same pattern has been observed in

other birds (Melville et al., 2004; Cafarchia et al., 2006a; Vieira & Coutinho, 2009; Brilhante

et al., 2010). The predominance of a single yeast species in a large part of collection sites

suggests some yeast species are able to inhibit the colonization of others (Brilhante et al.,

2010). This can propitiate the appearance of infection in light of the opportunistic character of

the Candida species. Besides this, C. albicans was the most common single species, and in

immunocompromised hosts this yeast species can be particularly pathogenic (Rodríguez-

Galán et al., 2010). Because of the high rate of positive rheas to Candida spp., breeders

should pay attention to changes in the parasite-host balance, since factors such as stress, poor

sanitation, overcrowding and poor nutrition among confined animals can favor infection by

these microorganisms and facilitate their dissemination from multiplication in the colonized

sites (Rodríguez-Galán et al., 2010; Vieira & Coutinho, 2009).

C. parapsilosis was the species most often found in this study, occurring in both sites

irrespective of the birds’ age range. This yeast is an emerging pathogen that has been growing

more prevalent in humans and animals in recent years. It is the non-albicans Candida species

that has been most often reported in cases of invasive candidiasis, mainly in

immunocompromised individuals (Trofa et al., 2008; Lord et al., 2010).

C. albicans was the second most frequent species. It is also commonly found in other

bird species (Melville et al., 2004; Brilhante et al., 2010). C. albicans is often isolated in both

healthy and sick hosts and is the most common species in infections, accounting for over half

of invasive candidiasis cases (Lass-Flörl, 2008; Lord et al., 2010). A greater frequency of C.

albicans in the oropharynx of birds, as observed here, also has been reported by other authors

45

(Melville et al., 2004; Brilhante et al., 2010), suggesting this yeast is one of the main

components of the microbiota of this anatomical site in birds.

Other non-albicans Candida species have been increasingly reported in human and

animal infections, sometimes being classified as emerging pathogens (Deem, 2003; Desnos-

Ollivier et al., 2008; Lord et al., 2010). Several of these species were isolated in this study,

such as C. famata, C. guilliermondii, C. tropicalis and C. krusei. C. famata is considered to be

a non-pathogenic commensal yeast, but its involvement has been reported in infections of the

ocular system, central nervous system and in cases of candidemia (Nawange et al., 2009). C.

guilliermondii has been reported in superficial infections and (rarely) in invasive infections.

Its involvement is more common in onicomycoses, but it has also been cited in bone

infections and candidemia. Resistance of clinical strains of C. guilliermondii against

amphotericin B has been previously reported (Pfaller et al., 2006). C. tropicalis is among the

most mentioned non-albicans Candida species involved in infections (Ortega et al., 2011). It

can be present in cancer patients, in intensive care units or in post-operative patients. It caused

the highest mortality among Candida species responsible for candidemia in a study carried

out in Italy (Tortorano et al., 2002; Ortega et al., 2011). C. krusei is involved in around 4% of

infections by the Candida genus, being more often isolated in patients with blood disorders,

transplant patients and patients with previous use of azole-based antifungals (Ortega et al.,

2011).

Regarding in vitro antifungal sensitivity, we did not observe any resistance to

amphotericin B, showing that the strains isolated in rheas react to this drug similarly to those

isolated in other healthy animals (Brito et al., 2009; Sidrim et al., 2010). The strains isolated

in this study were more sensitive to amphotericin B than the Candida spp. isolated in

cockatiels (Sidrim et al., 2010).

46

The resistance of Candida spp. to the azole derivatives investigated here was

substantial. Among the species that presented resistance to both azole derivatives tested are C.

albicans, C. krusei, C. parapsilosis and C. tropicalis, all of which have often been implicated

as human or animal pathogens (Deem, 2003; Lord et al., 2010; Sidrim et al., 2010). We also

observed resistance to itraconazole in strains of C. guilliermondii. The high number of strains

resistant to azole derivatives in this study corroborates other findings of resistance in Candida

spp. isolated from healthy animals and environmental sources (Brito et al., 2009; Sidrim et al.,

2010; Lord et al., 2010; Brilhante et al., 2011, Brilhante et al., 2012). Resistance to azole

derivatives is fundamentally linked to changes in the gene sequence or expression, and as a

rule it appears due to selective pressures induced by the improper use of azole products in

clinical practice or stock raising (Kanafani & Perfect, 2008; Pfaller, 2012; Brilhante et al.,

2012). Since the animals evaluated in this study had no history of prior treatment with

antifungal drugs, the resistance may be associated with the presence of these compounds in

the feed or fruits given to these animals.

The average activity of phospholipases (Pz) in the Candida spp. of this study was

lower than observed in studies of other birds (Cafarchia et al., 2008; Vieira & Coutinho, 2009;

Sidrim et al., 2010) and healthy humans (Oksuz et al., 2007). Some authors have observed a

correlation between resistance to fluconazole and secretion of phospholipases (Ying &

Chunyang, 2012). This might have occurred in our study, where more than 80% of the C.

albicans strains were resistant to fluconazole and 50% were positive for production of this

enzyme. Non-albicans Candida species in smaller proportion also secreted phospholipases,

including strains of C. guilliermondii, C. parapsilosis and C. tropicalis, all of which are

strong producers of phospholipases.

Conclusion

47

The digestive tract of health rheas (Rhea americana) contains potentially pathogenic

Candida spp. because of resistance to azole derivatives and the secretion of phospholipases.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq; Brazil; Process 562296/2010-7).

Transparency Declaration

None to declare.

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53

Table 1: Dis tribu tion of C andida s pp. in s amples fro m diges tive tract and feces of healthy rheas

Table 1: Distribution of Candida spp. in samples from digestive tract and feces of healthy rheas

Species Oropharynx Cloaca Feces Total C. parapsilosis 2 3 2 7 C. albicans 11 3 --- 14 C. tropicalis 1 5 --- 6 C. guilliermondii 3 1 --- 4 C. krusei 2 2 --- 4 C. famata 2 --- 2 4 C. parapsilosis + C. albicans --- 1 --- 1 C. parapsilosis + C. tropicalis 1 4 --- 5 C. parapsilosis + C. guilliermondii 2 --- 1 3 C. albicans + C. guilliermondii --- 1 --- 1 C. albicans + C. krusei 1 --- --- 1 C. albicans + C. famata 1 --- --- 1 C. guilliermondii + C. krusei 1 --- --- 1 C. parapsilosis + C. guilliermondii + C. krusei --- 1 1 2 C. parapsilosis + C. tropicalis + C. krusei 1 --- --- 1 C. tropicalis + C. guilliermondii + C. krusei 1 --- --- 1 Total 29 21 6 56

54

Table 2: C andida species is olated according to collection s ite and animal age range

Table 2: Candida species isolated according to collection site and animal age range

Species Oropharynx Cloaca

Feces Total Juvenile Adult Juvenile Adult

C. parapsilosis 2 4 2 7 4 19 C. albicans 11 2 3 2 --- 18 C. tropicalis 2 2 4 5 --- 13 C. guilliermondii 2 5 --- 3 2 12 C. krusei 2 4 --- 3 1 10 C. famata 1 2 --- --- 2 5 Total 20 19 9 20 9 77

55

Table 3: In vitr o s us ceptibilities of C and ida s pecies to antifungal d rugs

Table 3: In vitro susceptibilities of Candida species to antifungal drugs

Species (n) Drugs

MIC (µg/ml)

GM Range

MIC50 MIC90 S (n) R (n)

C. parapsilosis

(19)

AMB 0.12 0.031-0.5 (19) - 0.125 0.25

FLC 2.489 0.125-4.0 (12) ≥8.0 (7) 4.0 32.0

ITC 0.268 0.031-0.5 (16) ≥1.0 (3) 0.125 32.0

C. albicans

(18)

AMB 0.25 0.0625-1.0 (18) - 0.25 0.55

FLC 33.26 1.0-2.0 (3) ≥8.0 (15) 64.00 128.0

ITC 5.879 0.0625-0.25 (5) ≥1.0 (13) 16.00 32.00

C. tropicalis

(13)

AMB 0.146 0.031-1.0 (13) - 0.125 0.8

FLC 3.232 0.125-4.0 (7) ≥8.0 (6) 4.0 32.0

ITC 1.0 0.062-0.25 (8) ≥1.0 (5) 0.25 32.00

C. guilliermondii

(12) AMB 0.118

0.03125-0.5

(12)

- 0.187 0.425

FLC 3.175 0.5-32.0 (12) - 4.0 27.20

ITC 0.166 0.031-0.5 (11) ≥1.0 (1) 0.125 22.55

C. krusei

(10)

AMB 0.25 0.062-1.0 (10) - 0.25 0.95

FLC 4.287 0.125-16.0 (8) ≥64.0 (2) 2.00 121.6

ITC 0.267 0.0625-0.5 (9) ≥1.0 (1) 0.187 28.85

C. famata

(5)

AMB 0.125 0.031-0.5 (5) - * *

FLC 3.48 0.25-16.0 (5) - * *

ITC 0.143 0.062-0.5 (5) - * *

AMB: Amphotericin B, FLC: Fluconazole, ITC: Itraconazole, GM: Geometric mean, S: sensible, R:

resistant, (-): not detected.* Not calculated. The small number of strains does not allow reliable results.

56

Table 4: Phospholipas e activity of C andida s pp. s trains

Table 4: Phospholipase activity of Candida spp. strains

Species Phospholipase activity

[mean±SD (n)] Negative strains (Pz=1) 1>Pz≥0,64 Pz < 0,64

C. albicans 18 0.74±0.09 (9) --- 9 C. famata 5 0.65 (1) --- 4 C. guilliermondii 12 0.77±0.14 (2) 0.55 (1) 9 C. krusei 10 --- --- 10 C. parapsilosis 19 0.74±0.06 (4) 0.62±0.01 (3) 12 C. tropicalis 13 0.85±0.07 (2) 0.61 (1) 10 Total 77 0.75±0.09 (18) 0.60±0.03 (5) 54

57

7. CAPÍTULO 2

Leveduras e fungos leveduriformes patógenos oportunistas (não-Candida, não-

Cryptococcus) na microbiota de emas cativas (Rhea americana)

Opportunistic yeasts and yeast-like pathogens (non-Candida, non-Cryptococcus) in

the microbiota of captive rheas (Rhea americana)

Periódico: The Veterinary Journal (submetido em novembro de 2012)

Fator de Impacto: 2.37

58

RESUMO Leveduras e fungos leveduriformes oportunistas têm sido reconhecidos como

importantes patógenos em pacientes de alto risco. O objetivo principal deste estudo foi

avaliar a presença destes microrganismos na microbiota de emas em cativeiro. Além

disso, a sensibilidade antifúngica in vitro foi realizada. Geotrichum capitatum (11),

Trichosporon mucoides (11), T. asteroides (5), Rhodotorula mucilaginosa (4), T. asahii

(3), T. cutaneum (3) e T. ovoides (3), foram obtidos a partir da orofaringe, cloaca e fezes

de 58 animais. A maioria dos isolados foi sensível aos antifúngicos in vitro, no entanto,

a resistência frente fluconazol (1) e itraconazol (2), foi detectada em T. mucoides. Este

estudo indica que emas saudáveis podem ser reservatórios de patógenos oportunistas.

Resistência primária a derivados azólicos em cepas de T. mucoides obtidas a partir

destes animais demonstra o risco potencial destes microrganismos para os seres

humanos.

Palavras-chave: Rhea americana. Leveduras. Geotrichum capitatum. Antifúngicos.

59

The Veterinary Journal (Short Communication)

Opportunistic yeasts and yeast-like pathogens (non-Candida, non-Cryptococcus) in

the microbiota of captive rheas (Rhea americana)

Rossana de Aguiar Cordeiro1,*, Lucas Pereira de Alencar1,2, Raimunda Sâmia Nogueira

Brilhante1, Débora de Souza Collares Maia Castelo-Branco1, Carlos Eduardo Cordeiro

Teixeira1, Ramila de Brito Macedo1, Daniel Teixeira Lima1, Manoel de Araújo Neto

Paiva1,2, André Jalles Monteiro3, Nilza Dutra Alves4, Moacir Franco de Oliveira4, José

Júlio Costa Sidrim1, Marcos Fábio Gadelha Rocha1,2

1Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized

Medical Mycology Center, Postgraduate Program in Medical Microbiology, Federal

University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil. 2School of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of

Ceará, Fortaleza, CE, Brazil. 3Department of Statistics and Applied Mathematics, Federal University of Ceará,

Fortaleza, CE, Brazil. 4Department of Animal Science, Federal Rural University of the Semiarid, Mossoró,

RN, Brazil.

*Corresponding Author. Rossana de Aguiar Cordeiro. Address: Federal University of Ceará. Rua Coronel Nunes de Melo, 1315 CEP: 60430-270, Fortaleza, CE, Brazil. E. mail: rossanacordeiro@ufc.br

60

Abstract

Opportunistic yeasts and yeast-like fungi have been recognized as important

pathogens in high-risk patients. The main aim of this study was to evaluate the presence

of these microorganisms in the microbiota of captive rheas. Additionally, the in vitro

antifungal susceptibility was performed. Geotrichum capitatum (11), Trichosporon

mucoides (11), T. asteroides (5), Rhodotorula mucilaginosa (4), T. asahii (3), T.

cutaneum (3) and T. ovoides (3) were obtained from the oropharynx, cloaca and feces of

58 animals. Most of the isolates were susceptible to antifungals in vitro; however,

resistance against fluconazole (1) and itraconazole (2) was detected in T. mucoides. This

study indicates that healthy rheas can be reservoirs of opportunistic pathogens. Primary

resistance to azoles in T. mucoides strains obtained from these animals demonstrates the

potential risk of these microorganisms to humans.

Keywords: Rhea americana. Yeasts. Geotrichum capitatum. Antifungals.

61

In recent years, a growing incidence of rare pathogens as the primary cause of

opportunistic infections has been detected in high-risk patients, such as those with

cancer, prolonged neutropenia and HIV infection. These infections are frequently

related with high mortality and morbidity rates and usually require optimal patient

management (Miceli et al., 2011; Chitasombat et al., 2012). Although the list of such

species is continually rising, many studies have shown the particular hazard from non-

Candida fungi, such as Trichosporon, Rhodotorula, Geotrichum and Malassezia

species, in patients with poor immune status (Lord et al., 2010; Chitasombat et al.,

2012).

Opportunistic non-Candida fungi are easily recovered from environmental

sources such as soil and fresh water and can even become part of the permanent or

transitory microbiota of skin, gastrointestinal or genitourinary tracts of humans (Miceli

et al., 2011). They are also occasionally reported as pathogens in domestic animals

(Copetti et al., 2004; Spanamberg et al., 2008). Besides that, some studies have warned

that small animals, especially birds, are potential sources of these pathogenic yeasts

(Brilhante et al., 2010; Lord et al., 2010).

The Greater Rhea (Rhea americana) is large flightless birds found exclusively in

the South America. In the past few years there has been an increase in the breeding of

this bird in Brazil for meat and feathers. Diseases previously restricted to other bird

species, such as aspergillosis, are emerging in Greater Rheas as a consequence of poor

management (Copetti et al., 2004). Since the microbiota of these birds is poorly known,

this study aimed to evaluate the occurrence of opportunistic yeast and yeast-like fungi in

oropharynx, cloaca and feces of captive rheas. Additionally, the in vitro antifungal

susceptibility was performed.

62

Samples from the oropharynx (n=58) and cloaca (n=58) were obtained with

sterile cotton swabs, while stool samples (n=10) were collected from bird pens with

sterile scalpel blades and processed as previously described (Brilhante et al., 2010). All

samples were inoculated onto Petri dishes containing 2% Sabouraud dextrose agar

(Difco, USA) with chloramphenicol and incubated at 25 ºC for 10 days. Fungal

identification was performed as described elsewhere for Trichosporon (Rodriguez-

Tudela et al., 2005), Rhodotorula and Geotrichum (De Hoog et al., 2000). Some isolates

were also tested with the VITEK 2 kit (BioMérieux, France), according to the

manufacturers’ instructions. This study was approved by the animal research ethics

committee of Ceará State University (protocol number 11044670-4/43).

Fungal strains were tested for resistance to amphotericin B (AMB, Sigma,

USA), fluconazole (FLC, Pfizer, Brazil) itraconazole (ITC, Janssen, Belgium),

voriconazole (VRC, Pfizer, USA) and caspofungin (CAS, Merck Sharp & Dohme,

Brazil). Susceptibility testing was performed by broth microdilution, according to

document M27-A3 (CLSI, 2008). For AMB, the MIC was defined as the lowest

concentration at which no growth was observed, while ITC, FLC, VRC and CAS, the

MICs were defined as the lowest drug concentration inhibiting fungal growth by 50%,

comparing to the control well. Isolates with MICs >1, ≥64, ≥1, ≥1 and ≥2 µg/mL were

considered resistant to AMB, FLC, ITC, VRC and CAS, respectively. C. parapsilosis

ATCC 22019 was included as quality control (CLSI, 2008). Differences of MIC values

between species were tested by ANOVA and Fisher's LSD test. In both cases the

significance level was p <0.05.

A total of 40 isolates of yeasts and yeast-like fungi were obtained from different sites,

comprising seven distinct species: G. capitatum (11/40), T. mucoides (11/40), T. asteroides

63

(5/40), R. mucilaginosa (4/40), T. asahii (3/40), T. cutaneum (3/40) and T. ovoides

(3/40) (Table 1).

Most of the isolates were susceptible to the antifungal drugs, but resistance

against FLC (n=1) and ITC (n=2) was detected in T. mucoides strains (Table 1). Statistical

analysis showed that T. ovoides and T. asteroides presented greater MICs for AMB and G.

capitatum and R. mucilaginosa had the lowest MIC values among the isolated fungi

(p<0.05).

Opportunistic fungal infections have become a serious health problem

worldwide. They are usually associated with poor prognosis and high

mortality/morbidity rates. These infections are usually caused by saprophytes and there

are a large number of putative virulence factors, such as ability to adhere to silicone and

latex catheters in order to form biofilms, filamentous growth and exoenzyme and

capsule production (Miceli et al., 2011). In addition, resistance to antifungals has also

been detected in some of these species (Miceli et al., 2011). In the present study, some

potentially pathogenic species were recovered from rheas’ microbiota. The positivity

index of yeast and yeast-like species (43%) was higher than observed in other bird

species (Cafarchia et al., 2006; Brilhante et al., 2010).

Most of the isolates showed susceptibility to azoles, AMB and CAS. However,

resistance against ITC and FLC was observed among T. mucoides strains. This result

reinforces the idea that other fungal species besides Candida and Cryptococcus from

animal sources exhibit antifungal resistance. Although resistance against AMB and

susceptibility to azoles had been widely reported among Trichosporon species

(Rodriguez-Tudela et al., 2005; Lord et al., 2010), in the present study none of the

Trichosporon strains showed resistance to AMB. Azole resistance in strains isolated

64

from healthy animals is likely to be related to selection pressure by use of azole

derivatives (Lord et al., 2010) possibly in agriculture.

Although rare yeasts are emerging as opportunistic human pathogens, diagnosis

remains challenging and treatment suboptimal (Miceli et al., 2011). Miceli et al. (2011)

reported in their paper that Trichosporon was the third most commonly isolated

noncandidal yeast from clinical specimens in the ARTEMIS Global Antifungal

Surveillance Program. Previously considered nonpathogenic, Rhodotorula species have

emerged as opportunistic pathogens with the ability to colonize and infect susceptible

humans as well as animals (Wirth & Goldani, 2012). Additionally, in the ARTEMIS

surveillance project, Rhodotorula species were the fourth most common noncandidal

yeasts isolated from clinical specimens (Miceli et al., 2011). Concerning the yeast-like

fungus Geotrichum, few data for antifungal susceptibilities exist, but strains resistant to

fluconazole have been reported (Miceli et al., 2011). Finally, our study indicates that

healthy rheas can act as reservoirs of opportunistic yeasts and yeast-like pathogens and

that the primary resistance to azoles in T. mucoides strains could demonstrate a potential

risk of these microorganisms to humans.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; Brazil; Process 562296/2010-7).

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Table 1: In vitr o s us ceptibilit ies of opport unis tic yeasts and yeas t-like is olates recovered from captive rheas

Table 1: In vitro susceptibilities of opportunistic yeasts and yeast-like isolates

recovered from captive rheas

GM: Geometric mean * Not calculated. The small number of strains does not allow reliable MIC50 or MIC90 results. R: resistance. In vitro resistance against fluconazole (n=1) and itraconazole (n=2) was detected in T. mucoides strains.

Species Source (n) MIC (µg/ml) Drugs GM Range MIC50 MIC90

G. capitatum Oropharynx (1)

Cloaca (10) Feces (0)

AMB 0.117 0.031 - 0.25 0.125 0.25 FLC 0.827 0.125 - 32.0 0.50 26.40 ITC 0.097 0.031 - 1.0 0.125 0.425 VRZ 0.037 0.031 - 0.062 0.031 0.062 CAS 0.070 0.031 - 0.25 0.062 0.225

T. mucoides Oropharynx (2)

Cloaca (7) Feces (2)

AMB 0.182 0.125 - 0.5 0.125 0.45 FLC 4.537 1.0 - ≥64R 4.00 105.60 ITC 0.302 0.031- >16R 0.125 27.20 VRZ 0.051 0.031 - 0.125 0.031 0.125 CAS 0.085 0.031 - 0.25 0.062 0.25

T. asteroides Oropharynx (1)

Cloaca (2) Feces (2)

AMB 0.574 0.25 - 1.0 * * FLC 4.00 0.5 - 32.0 * * ITC 0.189 0.125 - 0.5 * * VRZ 0.062 0.031 - 0.125 * * CAS 0.062 0.031 - 0.25 * *

T. asahii Oropharynx (1)

Cloaca (1) Feces (1)

AMB 0.157 0.031 - 0.5 * * FLC 3.175 1.0 - 8.0 * * ITC 0.078 0.062 - 0.125 * * VRZ 0.099 0.031 - 0.25 * * CAS 0.099 0.031 - 0.25 * *

T. cutaneum Oropharynx (1)

Cloaca (2) Feces (0)

AMB 0.396 0.25 - 1.0 * * FLC 16.00 16.0 * * ITC 0.25 0.125 - 0.5 * * VRZ 0.078 0.031 - 0.125 * * CAS 0.078 0.031 - 0.5 * *

T. ovoides Oropharynx (1)

Cloaca (2) Feces (0)

AMB 0.63 0.5 - 1.0 * * FLC 2.00 0.5 - 8.0 * * ITC 0.062 0.031 - 0.25 * * VRZ 0.099 0.062 - 0.25 * * CAS 0.125 0.062 - 0.25 * *

R. mucilaginosa Oropharynx (4)

Cloaca (0) Feces (0)

AMB 0.037 0.031 - 0.062 * * FLC 0.353 0.25 - 0.5 * * ITC 0.176 0.125 - 0.25 * * VRZ 0.074 0.031 - 0.25 * * CAS 0.088 0.031 - 0.25 * *

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8. CONCLUSÕES

1. As leveduras dos gêneros Candida, Rhodotorula e Trichosporon e o fungo filamentoso Geotrichum capitatum compõem a microbiota da orofaringe, cloaca e fezes de emas saudáveis, com destaque para Candida spp.;

2. Há fenômeno de resistência a antifúngicos derivados azólicos (itraconazol e fluconazol) em leveduras isoladas em emas, principalmente para a espécie C. albicans;

3. Não observou-se fenômeno de resistência entre as cepas de G. capitatum isoladas em emas saudáveis;

4. Todas as espécies de Candida spp. isoladas de orofaringe, cloaca e fezes de emas, com exceção de C. krusei, foram capazes de secretar fosfolipases, com destaque para C. albicans pelo maior percentual de cepas com atividade enzimática.

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9. PERPECTIVAS

O pioneirismo deste trabalho forneceu dados importantes sobre a microbiota do trato digestivo de emas (Rhea americana). Vale destacar que conhecer a microbiota por leveduras em emas auxilia a compreensão da dinâmica microbiana deste hospedeiro, contribuindo com entendimento de sua biologia e possíveis distúrbios na interação parasito-hospedeiro. É importante destacar que a identificação de leveduras como componentes comuns à microbiota de emas tem relevância zootécnica e sanitária. Ademais, o monitoramento do perfil de sensibilidade de cepas de leveduras de origem animal é escasso, e os trabalhos nessa área restringem-se a grupos de pesquisa pontuais. Foi observado neste trabalho um fenômeno de resistência a derivados azólicos em cepas de T. mucoides e em diversas cepas Candida spp., principalmente C. albicans. O achado de cepas de diferentes gêneros resistentes a derivados azólicos em um primeiro levantamento põe-nos a refletir sobre a origem dessa resistência e até que ponto os animais estudados contribuem para a disseminação destas cepas, ou se estes animais estão sofrendo algo devido a ações humanas. Este fenômeno pode ser consequência de um desequilíbrio ambiental, onde uma pressão seletiva importante pode estar agindo para o aparecimento da resistência. Faz-se necessário, portanto, uma investigação das causas do aparecimento dessa resistência, assim como a compreensão dos mecanismos pelos quais esses microrganismos expressam tal resistência. Por fim, conhecer a virulência de um microrganismo contribui na elaboração de um prognóstico, e consequentemente permite-nos adequarmos a abordagem terapêutica empregada. A observação de cepas de Candida spp. produtoras de fosfolipases em emas saudáveis nos permite perceber que estes isolados tem potencial patogênico, para possivelmente em um desequilíbrio, expressar tais enzimas e estabelecer uma infecção, tanto no hospedeiro quanto em contactantes. Porém, pesquisas avaliando outros fatores de virulência, in vitro e in vivo, são necessárias para desvendar o real risco destes microrganismos em estabelecerem infecções nos diversos hospedeiros.

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