UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS … 1. INTRODUÇÃO Desde as mais remotas eras o homem...
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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CLONAGEM, CARACTERIZAÇÃO DO GENE vip3A DE Bacillus thuringiensis E TRANSFORMAÇÃO DE Agrobacterium tumefaciens Matheus de Oliveira Bazoni Orientadora: Janete Apparecida Desidério Sena Jaboticabal – SP Agosto – 2006 Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias do Câmpus de Jaboticabal – UNESP, para obtenção do Título de Mestre em Agronomia – (Área de Concentração em Genética e Melhoramento de Plantas).
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CLONAGEM, CARACTERIZAÇÃO DO GENE vip3A DE Bacillus thuringiensis E TRANSFORMAÇÃO DE Agrobacterium
tumefaciens
Matheus de Oliveira Bazoni
Orientadora: Janete Apparecida Desidério Sena
Jaboticabal – SP
Agosto – 2006
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias do
Câmpus de Jaboticabal – UNESP, para
obtenção do Título de Mestre em
Agronomia – (Área de Concentração em
Genética e Melhoramento de Plantas).
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Clonagem, Caracterização do gene vip3A de Bacillus thuringiensis e
Transformação de Agrobacterium tumefaciens
RESUMO - Bacillus thuringiensis é a bactéria mais utilizada no controle biológico de
insetos praga. Algumas linhagens de B. thuringiensis produzem uma classe de proteínas
chamadas Vips (proteína inseticida vegetativa). As Vips são produzidas e secretadas
como proteínas solúveis na fase de crescimento vegetativo da bactéria. Em particular a
proteína Vip3A possui atividade entomopatogênica contra insetos pragas, da ordem
Lepidoptera, revelando alta bioatividade para: Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, entre
outras espécies. Vip3A é codificada pelo gene vip3A(a) e pelo homologo vip3A(b) cuja
seqüência prevê uma proteína com 791 aminoácidos, com 88.5 kDa. Neste trabalho foi
isolado o gene vip3A de B. thuringiensis linhagem HD-125, por PCR utilizando iniciadores
específicos, e clonado no vetor de expressão em plantas pGA748. A digestão com as
enzimas XhoI e PstI permitiu a orientação correta de clonagem e o seqüenciamento dos
clones positivos demonstraram que o gene vip3A foi clonado com sucesso. O
seqüenciamento foi feito através da amplificações de regiões distintas do gene, região
Vip5-Vip2 e Vip3-Vip6. A seqüência de nucleotídeos analisada pela ferramenta BLASTN
indicou 93% de homologia para região Vip5-Vip2 e 85% para região Vip3-Vip6 quando
alinhadas com a seqüência do gene vip3A(a) depositada no GenBank (acesso L48811). O
filograma gerado pelo programa CLUSTALW demonstrou maior similaridade entre o gene
vip3A(a) e o gene vip3A da linhagem B. thuringiensis HD-125 estudada neste trabalho. O
vetor pGA748 contendo o gene vip3A na orientação correta de clonagem foi utilizado para
transformar por eletroporação a linhagem GV3101 de Agrobacterium tumefaciens com
grande eficiência.
PALAVRAS – CHAVE: Eletroporação, Proteína vegetativa inseticida, PCR, gene vip3A.
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1. INTRODUÇÃO
Desde as mais remotas eras o homem iniciou a luta contra as pragas. Os danos que
elas causam à agricultura são de grande importância econômica acarretando enormes
prejuízos, não somente às plantas, mas também aos animais domésticos e ao próprio
homem.
Os danos causados pelos insetos às plantas são variáveis e podem ser observados em
todas as partes do tecido vegetal, algumas pragas podem ser citadas como as grandes
responsáveis pelo prejuízo econômico de certos países.
O uso abusivo de pesticidas químicos em diferentes culturas, vem ocasionado sérios
danos ecológicos, deixando resíduos no solo, água e alimentos, tornando-os tóxicos para
animais e humanos, além de atingir insetos não alvo, podendo assim acabar com
populações benéficas para o ambiente.
Além disso, a dependência de defensivos agrícolas oriundos do petróleo, o aumento da
demanda de produtos livres de resíduos de agrotóxicos e os avanços científicos e
tecnológicos obtidos pela recente introdução de ferramentas da biologia molecular, são
fatores que impulsionaram a adoção e o uso do controle biológico como alternativa à
utilização dos defensivos químicos.
Em busca de métodos menos agressivos ao ambiente, de maior especificidade e
eficiência no combate a insetos pragas, têm se iniciado sistemas de controle biológico
utilizando microorganismos. Dentre os organismos empregados no controle biológico,
Bacillus thuringiensis, se destaca por apresentar atividade entomopatogênica contra um
largo espectro de hospedeiros pertencentes as ordens: Lepidoptera, Coleoptera, Diptera
(LERECLUS et al., 1993), além de atingir também alguns invertebrados como
nematóides, sarcomastigofora e platelmintos (FEITELSON et al., 1993). Este
microorganismo pode ser isolado de vários ecossistemas como: solo, ambiente aquático,
superfície de plantas, insetos mortos ou vivos e grãos estocados.
B. thuringiensis é uma espécie bacteriana capaz de produzir, durante sua fase de
esporulação, inclusões cristalinas de proteínas bioinseticidas que foram denominadas
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genericamente de proteína cristal (proteína Cry) ou delta-endotoxina codificada pelo
gene cry.
Segundo ESTRUCH et al., (1996), B. thuringinesis também produz uma classe de
proteínas chamada Vip (Proteína Inseticida Vegetativa) sendo esta produzida e
secretada como proteína solúvel na fase de crescimento vegetativo da bactéria. As Vips
incluem as proteínas binárias Vip1 e Vip2 com especificidade para coleópteros e Vip3A
com ação especifica para Lepidópteros, estas estão em amplo estudo devido a sua
especificidade, alto potencial ativo e como alternativa para o controle da resistência de
insetos às proteínas Cry.
A proteína Vip3A é codificada pelo gene vip3A(a) e pelo homólogo vip3A(b), com
88,5 kDa e 791 aminoácidos. As propriedades biológica e molecular dessas proteínas
estabelece uma distinta classe de toxina inseticida, as quais diferem da família das
delta-endotoxinas. Elas representam a segunda geração de toxinas inseticidas podendo
ser usadas no controle de insetos pragas importantes, com grande eficiência.
As aplicações da engenharia genética para a proteção de plantas têm permitido a
introdução e expressão dos genes de proteínas Cry e Vip, em culturas de interesse
econômico como milho, algodão, batata, tomate, entre outras; visando o controle das
principais pragas que são a maior causa de perdas e danos nas mais importantes culturas
do mundo. Algumas plantas transgênicas já foram produzidas como o “Milho Bt11”
contendo a proteína cristal Cry1Ab, isolada da bactéria B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 e
recentemente, a Syngenta produziu o “Milho ICP4 Pacha”, contendo a proteína inseticida
Vip3A, isolada da bactéria B. thuringiensis AB88, e introduziu o gene vip3A(a) de B.
thuringiensis em plantas de algodão variedade Coker 312.
Neste sentido, o presente trabalho teve por objetivo a amplificação e seqüenciamento
do gene vip3A da linhagem B thuringiensis HD-125 bem como a clonagem deste no vetor
de expressão em plantas pGA748 que foi utilizado para transformação de Agrobacterium
tumefaciens linhagem GV3101, a qual poderá ser utilizada em programas de
melhoramento genético de plantas dicotiledôneas e monocodiledôneas expressando a
característica de resistência à pragas, como Spodoptera frugiperda, Agrotis ipisilon,
Diatraea saccharalis, Anticarsia gemmatalis, entre outras espécies.
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2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Bactéria Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis, é uma bactéria Gram-positiva, quimioheterotrófica, aeróbia
facultativa, podendo também crescer em anaerobiose (ARANTES, 1989), cuja
temperatura ideal de crescimento é 300C. Esta possui células vegetativas com formato
de bastonetes e quando em condições inóspitas (geralmente desfavoráveis),
desenvolvem um ciclo de esporulação típico dos bacilos, com esporos de formato
elipsoidal, localizando-se na região central ou paracentral da célula.
As linhagens de B. thuringiensis possuem um genoma variando de 2,4 a 5,7
megabases (Mb) e alguns isolados possuem muitos elementos extracromossômicos,
alguns circulares e outros lineares (CARLSON et al., 1994 e 1996).
Esta bactéria produz uma inclusão protéica de formato cristalino, que confere a
característica entomopatogênica. Este cristal, sintetizado durante a fase de esporulação,
é formado por polipeptídeos denominados proteínas Cry ou δ-endotoxinas, que vão
sendo acumuladas dentro da célula bacteriana, liberados juntamente com esporos no
momento da lise celular
B. thuringiensis também produz uma classe de proteínas chamadas Vips
(proteínas inseticidas vegetativas) que são produzidas e secretadas durante a fase de
crescimento vegetativo da bactéria (ESTRUCH et al., 1996) e também possui atividade
entomopatogênica.
Muitas linhagens naturais de B. thuringiensis foram isoladas em várias áreas
geográficas e de diferentes origens, incluindo grãos, solos, superfícies de plantas
(MARTIN & TRAVERS, 1989; SMITH & COUCHE, 1991), insetos vivos ou mortos
(BERNHARD et al., 1997, CHAUFAUX et al., 1997) e a partir de amostras de águas de
rios e lagos (MEADOWS, 1993).
Dentre os organismos empregados no controle biológico, B. thuringiensis se
destaca por produzir um número de toxinas inseticidas, incluindo, exotoxinas,
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enterotoxinas, Vips e endotoxinas. Apresentado atividade tóxica contra cerca de 130
espécies de insetos das ordens Lepidóptera, Díptera e Coleóptera, estando também
incluídas importantes pragas agrícolas brasileiras como Spodoptera frugiperda, Diatraea
saccharalis e Anticarsia gemmatalis e vetores de doenças de importância mundial,
pertencentes aos gêneros Aedes, Culex e Anopheles (LERECLUS et al., 1993), além de
atingir também alguns invertebrados como nematóides, sarcomastigofora e platelmintos
(FEITELSON et al., 1993). Os produtos à base de B. thuringiensis são inócuos a
mamíferos e vertebrados, não apresentam toxicidade às plantas, não são poluentes e
devido a sua grande especificidade, não atingem os inimigos naturais do inseto alvo
(SMITS, 1997).
Este bacilo é responsável por 90%-95% do mercado de bioinseticidas
(VALADARES-INGLIS et al., 1998) e produtos à base deste são comercializados em
todo mundo há mais de 50 anos (DIAS et al., 2002).
Algumas populações de pragas de culturas como Heliothis virescens, Plutella
xylostella, Tricoplusia ni (ESTADA & FERRE, 1994), Spodoptera exigua (MOAR et al.,
1995), e S. littoralis (MÜLLER-COHN et al., 1996) têm apresentado elevados níveis de
resistência a proteínas Cry de B. thuringiensis em laboratório.
Grandes centros de pesquisas em todo o mundo estão buscando novas linhagens
de B. thuringiensis com potenciais tóxicos diferentes das já conhecidas,
Grupos como da FIOCRUZ do Rio de Janeiro – RJ (CAVADOS et al., 1998), EMBRAPA
– milho e sorgo de Sete Lagoas – MG (VALICENTE et al., 2000) e da UNISINOS de São
Leopoldo – RS (AZAMBUJA et al., 2001).
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2.2. Proteína Vip3A
A nova classe de proteínas chamada Vip, produzida por B. thuringiensis,
diferentemente das δ-endotoxinas cuja expressão é restrita para esporulação, Vip3A são
expressadas no estágio vegetativo de crescimento bem como durante à fase de
esporulação. As proteínas Vips não possuem homologia com proteínas conhecidas.
O gene vip3A tem dois homólogos, o gene vip3A(a) (proteína Vip3Aa) acesso
L48811, isolado da linhagem B. thuringiensis. AB88 e o gene vip3A(b) (proteína Vip3Ab)
acesso L48812, isolado da linhagem B. thuringiensis. AB424 cuja seqüência prevê uma
proteína com 791 aminoácidos e massa molecular de 88,5 kDa sendo este secretado
sem a porção N-terminal no fluído sobrenadante por culturas de B. thuringiensis
(ESTRUCH et al., 1996).
A proteína Vip3A possui atividade inseticida contra um grande espectro de insetos
praga de importância agronômica da ordem Lepidóptera e revela alta bioatividade para:
lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), lagarta-da-
beterraba (Spodptera exigua) (ESTRUCH et al., 1996), contra lagarta-da-maçã (Heliothis
virescens), lagarta-da-espiga (Helicoverpa zea) (DOSS et al., 2002) e também contra
lagarta-do-repolho (Trichoplusia ni), perfurador-da-folha-do-algodão (Bucculatrix
thurberiella) e lagarta-da-vagem-da-soja (Pseudoplusia includens) (SYNGENTA, 2005).
No caso de Agrotis ipsilon, Vip3A proporciona 260 vezes mais atividade inseticida que
algumas proteínas Cry1A relatadas como sendo ativas contra esta praga (ESTRUCH et
al., 1996; MACINTOSH et al., 1990).
Segundo AZOL (2006) a proteína Vip3A teve uma eficiência de 62% na
mortalidade das larvas de Spodoptera frugiperda quando alimentadas com dieta artificial
contendo a proteína Vip3A.
Estas proteínas são aparentemente secretadas pela célula e por elas não
formarem inclusões cristalinas são excluídas pela nomenclatura da proteína Cry
(CRICKMORE et al., 1998).
Diferentemente das proteínas Cry as quais unem-se em cristais insolúveis dentro
da célula mãe, Vip3A é secretada como proteína solúvel por algumas linhagens de B.
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thuringiensis durante a fase vegetativa de crescimento, limitando sua aplicação no
campo (ARORA et al., 2003).
O gene vip3A codificador da proteína Vip3A inicia a expressão desta proteína
durante a fase de crescimento vegetativo e continua ativamente expresso em culturas
esporulantes. Altos níveis de expressão em combinação com alta estabilidade da
proteína favorecem a produção de grandes somas de proteína nos sobrenadantes de
culturas esporulantes (ESTRUCH et al., 1996).
A ação da proteína Vip3A tem sido examinada e demonstra iniciar sua atividade
no epitélio intestinal do inseto assim como as proteínas Cry, porém devido a sua forma
solúvel as proteínas Vips se ligam mais rapidamente aos receptores de membrana das
células epiteliais do intestino do inseto susceptível e começa uma progressiva
degeneração da camada epitelial (YU et al., 1997).
A união das toxinas Cry à membrana epitelial das células do intestino médio se
realiza através de receptores ou sítios de união específicos para cada uma delas
(HOFMANN et al., 1988). As proteínas Cry após a ingestão, são solubilizadas,
principalmente em função do pH intestinal do inseto (pH ~ 10), das características e
composição do cristal liberando peptídeos sem atividade inseticida que recebem o nome
de protoxinas. Existem evidências de que a velocidade de solubilização depende do pH.
Ao mesmo tempo em que se solubilizam as protoxinas, estas são ativadas pela ação das
proteases intestinais, principalmente as serinas. O produto ativo dessas toxinas,
resultante de todos estes processos, ligam-se de maneira irreversível a receptores de
membrana das células epiteliais do intestino do inseto, levando à formação de poros
inespecíficos ou canais iônicos que alteram a permeabilidade destas células. Esta
alteração promove a lise celular e a ruptura da integridade intestinal (LI et al., 1991; GILL
et al., 1992). Todos esses processos tem como conseqüência uma parada alimentar,
septicemia e morte da larva.
As proteínas Vip possuem toxicidade da mesma magnitude como as das
proteínas Cry contra insetos susceptíveis. O espectro inseticida das proteínas Vip inclui
certas pragas importantes, as quais tem mostrado insensibilidade para as proteínas Cry
(BHALLA et al., 2005).
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LEE et al. (2003), compararam o modo de ação da proteína Vip3A com Cry1Ab
em experimentos de ativação proteolítica, ligação a BBMV ("Brush Border Membrane
Vesicles") e habilidade para formar poros em dois diferentes ensaios in vitro. Os autores
verificaram que Vip3A difere em várias etapas, quanto ao modo de ação, utilizando um
alvo molecular diferente e formando distintos canais iônicos, comparada à Cry1Ab. A
interação das proteínas Vip com os receptores do intestino das larvas de diferentes
lepidópteros tem colocado essas proteínas como uma segunda geração de toxinas de B.
thuringiensis, com excelente potencial para o manejo da resistência dos insetos.
A descoberta da proteína vip3A foi muito importante para o controle biológico de
insetos pragas, pois, segundo MONERAT & BRAVO (2000), atualmente não só se
aproveitam as misturas de esporos e cristais, obtidos após o cultivo de B. thuringiensis,
como também é possível utilizar o seu sobrenadante.
2.3. Bactéria Agrobacterium tumefaciens
As agrobactérias são microorganismos tipicamente do solo, aeróbias e Gram-
negativas. Não formam esporos e possuem forma de bacilo (Figura 1), medindo 0,6-1,0
x 1,5-3,0 µm, movendo-se no solo por meio de flagelos.
O gênero Agrobacterium está subdividido em cinco espécies que diferem entre si
pela patogenicidade e pelo modo de infecção em diferentes plantas. Dessa forma, A.
tumefaciens é o agente etiológico da galha-da-coroa (crown gall), (BRASILEIRO &
CARNEIRO, 1998).
As agrobactérias ocorrem em todos os tipos de solos, cultivados ou não, onde são
geralmente encontradas nas galhas ou em estreita associação com raízes ou no solo
adjacente às plantas. As diferentes espécies do gênero Agrobacterium ocorrem em todo
o mundo, mas são mais facilmente encontradas em regiões de clima temperado.
Temperaturas acima de 34°C ou solos ácidos reduzem drasticamente suas chances de
sobrevivência, enquanto solos arenosos podem em certas condições, favorecer a
sobrevivência (LIPPINCOTT et al., 1981).
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Mais de 600 espécies vegetais são conhecidamente susceptíveis à infecção por
A. tumefaciens, pertencendo a maioria delas à classe das Angiospermas dicotiledôneas
e Gyminospermas e, mais raramente, às Angiospermas monocotiledôneas (CLEENE &
LEY, 1976).
2.3.1. Interação Agrobacterium – hospedeiro
A infecção de uma planta por Agrobacterium inicia-se pela penetração da bactéria
no tecido vegetal através de uma lesão sofrida pela planta por tratos culturais, geadas,
insetos, etc. As bactérias são atraídas pelas moléculas-sinal que são exsudadas pela
célula lesada, em resposta ao ferimento, como, por exemplo, compostos fenólicos,
açúcares e aminoácidos. Em contato com as células vegetais (Figura 1), as bactérias
sintetizam microfibrilas de celulose, propiciando uma melhor fixação (LACORTE e
MANSUR, 1993).
As moléculas-sinal vão ativar genes que estão localizados na região de virulência
(região vir) do plasmídio Ti (de Tumor-inducing), que é um plasmídio de alto peso
molécular (150 a 250Kb), presente em todas linhagens patogênicas de Agrobacterium. A
região vir é um regulon composto de seis a oito operons, contendo, aproximadamente,
25 genes. As diversas proteínas codificadas pelos genes vir vão promover a
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de varredura mostrando aligação de A. tumefaciens às células vegetais. Imagem de Martha Hawes www. genomanewsnetwork.org/
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transferência de uma outra região do plasmídio Ti da bactéria para a célula vegetal.
Essa região, denominada T-DNA (de transferred DNA), é delimitada por duas
seqüências repetidas de 25pb, conhecidas como extremidades direita e esquerda. Uma
vez no núcleo da célula, o T-DNA é integrado, de forma estável, no genoma vegetal
(BRASILEIRO, 1993).
A expressão de genes presentes no T-DNA, os oncogenes, interfere na
biossíntese de hormônios, levando á formação da galha ou tumor. As únicas regiões do
T-DNA essenciais para sua transferência são as seqüências de cerca de 25pb
localizadas e suas extremidades. Assim, os genes presentes no T-DNA podem ser
deletados ou manipulados por engenharia genética de maneira a portar genes de
interesse, sem alterar o processo de transferência. A região vir do plasmídio Ti, também
é essencial para transferência pois esta região contém genes cujos produtos vão
promover a transferência do T-DNA (WALDEN et al., 1990; HOOYKAAS &
BEIJERSBERGEN, 1994; ZUPAN & ZAMBRYSKI, 1995).
A preparação de uma linhagem de A. tumefaciens para ser utilizada como vetor
para a transformação de plantas inclui duas etapas distintas.
Na primeira é preciso obter as linhagens “desarmadas”, linhagens nas quais o T-
DNA original, com os oncogenes, foi deletado por meio de um processo de dupla
recombinação (ZAMBRYSKI et al., 1983).
A segunda etapa envolve a preparação de um vetor contendo o T-DNA com os
genes de interesse. Por causa do seu tamanho (~200 Kb), o plasmídio Ti não pode ser
manipulado diretamente. Dessa forma, plasmídios menores (vetores) são utilizados, pois
são mais fáceis de manipular. Esses vetores para transformação contêm as
extremidades do T-DNA, entre as quais os genes de interesse são clonados. Graças a
ele, foram obtidas plantas de batata resistentes a viroses (LAWSON et al., 1990),
algodoeiros resistentes a insetos (PERLAK et al., 1990), tomates de amadurecimento
tardio (HAMILTON et al., 1990) plantas de canola macho estéreis (MARIANI et al.,
1992), entre outros exemplos.
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2.4. Produção de proteínas inseticidas de B. thuringiensis em plantas
Em plantas geneticamente modificadas com genes de B. thuringiensis, as
lagartas, ao se alimentarem do tecido foliar, ingerem a proteína B. thuringiensis que atua
nas células epiteliais do tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al., 1997). A proteína
B. thuringiensis promove a ruptura osmótica irreversível das células e causa a morte dos
insetos, antes que os mesmos consigam causar danos econômicos à cultura
(PIETRANTONIO et al., 1993; GILL, 1995).
As primeiras publicações relatando a obtenção de plantas transgênicas contendo o
gene da δ-endotoxina de B. thuringiensis. incluem os trabalhos de VAECK et al. (1987),
BARTON, WHITELEY e YANG (1987), ADANG et al. (1987), e FISCHOFF et al. (1987). Os
três primeiros grupos publicaram experimentos usando fumo transgênico, enquanto
FISCHOFF et al. (1987) publicaram resultados com tomates transgênicos transformados
via Agrobacterium usando um vetor T-DNA.
Plantas transgênicas de fumo foram obtidas por transformação de discos foliares de
Nicotiana tabacum var. Petit Havana SR1. As plantas transformadas com as fusões δ-
endotoxina-neo e com as construções contendo o gene δ-endotoxina truncado produziram
75-100% de mortalidade em larvas de Manduca sexta (Lepidoptera). Os transformantes
contendo as construções com fusão traducional produziram uma alta freqüência de plantas
exibindo 70-100% de mortalidade contra Manduca, enquanto o gene da endotoxina
truncado não fusionado apresentou níveis semelhantes de toxicidade mas em uma menor
porcentagem de transformantes.
BARTON, WHITELEY e YANG (1987) estudaram a expressão de um fragmento
aminoterminal do gene cryIA(a) de B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 em fumo transgênico.
Transformantes foram obtidos em Nicotiana tabacum cv. Havana 425 usando um vetor
binário de A. tumefaciens. Eles obtiveram plantas transgênicas usando construções com o
gene da δ-endotoxina completo ou com o gene truncado codificando para uma proteína de
644 aminoácidos. Ambos os genes foram dirigidos por uma seqüência promotora 35 S
(CaMV), incluindo uma região não traduzida do AMV RNA 4 e a região 3’ de poliadenilação
da nopalina sintetase. Nenhuma das plantas regeneradas a partir de calos transformados
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com o gene completo produziram níveis detectáveis de CryIA(a), mRNA ou atividade
inseticida.
FISCHOFF et al. (1987) publicaram a primeira transformação de tomate via
Agrobacterium tumefaciens com o gene cryIA(b) de B. thuringiensis var. kurstaki HD-1.
Duas versões truncadas do gene B. thuringiensis. foram usadas; uma codificando para
uma proteína de 646 aminoácidos e a outra codificando para uma proteína de 725
aminoácidos. Cada versão foi dirigida pelo promotor CaMV 35S e a região 3’ de
poliadenilação do gene da nopalina sintetase. A expressão dos fragmentos aminoterminal
da δ-endotoxina produziu plantas com alto nível de atividade contra Helicoverpa zea e
Heliothis virescens, as quais requerem altos níveis de proteínas de B.t. para mortalidade. A
progênie das plantas demonstraram um padrão de herança típico de gene dominante
Mendeliano.
Os testes de campo descritos por WARREN et al. (1992) e CAROZZI et al. (1991)
consistiram de seis linhagens de fumo transgênicos expressando uma proteína CryIA(b)
truncada de 645 aminoácidos de B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 inserido em um único
locus do genoma do fumo. Das seis linhagens testadas, cinco forneceram controle contra
Manduca sexta e Heliothis virescens.
Os autores também observaram que os níveis de δ-endotoxina aumentaram durante
o desenvolvimento da planta, com um substancial aumento no tempo de florescimento,
com cerca de 0,01% da proteína solúvel total.
A Syngenta produzio o “Milho ICP4 Pacha”-Syngenta”, contendo a proteína
inseticida Vip3A, isolada da bactéria Bacillus thuringiensis AB88, e recentemente
introduziu o gene vip3A(a) que codifica essa proteína inseticida em plantas de algodão,
Gossypium hirstum variedade Coker 312 utilizando a linhagem GV3101 de A. tumefaciens,
a metodologia e resultados não foram publicados, SYNGENTA (2005).
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3.OBJETIVOS
Amplificação via PCR do gene vip3A da linhagem B. thuringiensis HD-125 com o uso de
iniciadores específicos;
Seqüenciamento do gene vip3A;
Subclonagem do gene vip3A no vetor de expressão em plantas pGA748, sob o
controle do promotor CaMV 35S;
Transformação de A. tumefaciens linhagem GV3101/pMP90.
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4. MATERIAL E MÉTODOS
Neste trabalho foi utilizada a linhagem B. thuringiensis, HD-125 (Lepidóptero
específico), gentilmente cedida pela Embrapa, Sete Lagoas, MG. A linhagem B.
thuringiensis tenebrionis como referência de controle negativo (coleóptero específico),
obtida do “Bacillus Genetic Stock Center” da Universidade Estadual de Ohio, Columbus,
USA e a linhagem “desarmada” GV3101/pMP90 de A. tumefaciens, as amostras
encontram-se em manutenção no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia
Aplicada do Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, FCAV – UNESP,
Jaboticabal, São Paulo, Brasil.
4.1. Extração do DNA genômico para reações de PCR
O DNA total de cada amostra foi obtido através da utilização do Kit InstaGene
Matrix (Bio-Rad), seguindo instruções do fabricante. As colônias isoladas foram obtidas
pela inoculação por estriamento de uma alíquota da solução estoque de esporos, em
placas de Petri, contendo meio de cultura NA (“Nutriente Ágar”-Difco), incubadas em
BOD a 30°C por aproximadamente 20 hs. Uma colônia foi suspensa em tubos de
microcentrífuga contendo 1,0 ml de água Milli-Q estéril e centrifugadas em centrífuga
Eppendorf por 1 min a 15294 xg. O sobrenadante foi descartado e o precipitado
ressuspenso em 200 µl da resina InstaGene Matrix (esta em constante agitação em
agitador). As suspensões obtidas foram incubadas a 56°C por 25 min, depois os tubos
agitados em vórtex por 10 s. e incubados a 100º C por 8 min. A seguir os tubos foram
novamente agitados em vórtex por 10 s. e centrifugados em microcentrífuga por 2 min a
15294 xg. O sobrenadante (contendo o DNA) foi transferido para outro tubo de plástico
previamente esterilizado.
As amostras de DNA foram armazenadas a -20º C até sua utilização.
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4.2. Determinação da presença do gene vip3A
Para o isolamento e confirmação da presença do gene vip3A na linhagem HD
125, foi utilizado o par de iniciadores (primers) descritos por LOGUERCIO et al. (2002),
cujas seqüências estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1. Iniciadores específicos para o gene vip3A.
Iniciadores Seqüências
Vip5 5”ATGACCAAGAATAATACTAAATTAAGC3’(d)
Vip 2 5’TCTGGGCACAATAATTTATCC3’(r)
Vip 3
Vip 6
5’CAGGACATGCATTGATTGG3’(d)
5’GATCTTACTTAATAGAGACATGC3’(r)
(d): direto; (r): reverso
As reações para amplificação do gene completo partindo do “start codon” até o
“stop codon” foram feitas utilizando-se o par de iniciadores Vip5 e Vip6, conduzidas em
um volume de 20 µL, contendo aproximadamente 30 ng de DNA; 250 µM de uma
solução de dNTPs; 2,0 mM de MgCl2; solução tampão para reação de PCR [1X]; 0,2 µM
de cada um dos iniciadores; 1,0 U da enzima Taq DNA polimerase (Gibco-BRL) e água
Milli-Q estéril para completar o volume da reação. Em todas as reações de amplificação
foi feito um controle negativo, substituindo o volume de DNA por água Milli-Q estéril.
As reações foram conduzidas em aparelho termociclador (PTC-100
Programmable Thermal Controller – MJ Research, inc.) com circuito Hot Bonnet
utilizando o seguinte programa: um passo de desnaturação de 2 min a 94oC e 30 ciclos
consistindo de um passo de desnaturação por 30 s. a 94oC; pareamento por 45 s. a
17
53oC, uma extensão de 1 min e 30 s. a 72oC e no fim dos 30 ciclos foi programada uma
extensão a 72oC por 5 min.
Após o término das reações de amplificação, 4 µL de azul de bromofenol (0,5%
de azul de bromofenol em glicerol 50%) foi adicionado à 4 µL de cada amostra e logo
após aplicadas em gel de agarose 1,5%, contendo (0,5 µg/ml) de brometo de etídio e
submetido a corrida eletroforética por aproximadamente 2 hs a 70 V em tampão TEB
[1X] (89 mM de Tris; 89 mM de ácido bórico e 2,5 mM de EDTA, pH 8,2). Os fragmentos
de DNA amplificados foram visualizados pela incidência de luz UV e documentados em
um fotodocumentador modelo GEL DOC 2000 (BIO-RAD).
4.3. Clonagem dos produtos amplificados
Os produtos resultantes da amplificação com os iniciadores citados na tabela 1,
foram ligados ao vetor de clonagem pGEM-T Easy (PROMEGA) (figura 2). A ligação do
inserto ao vetor seguiu a proporção de 4:1, respectivamente, sendo a adição de 1 µL da
enzima T4 DNA ligase (3 U/µL), 50ng do vetor pGEM-T Easy, tampão apropriado, 200
ng de produto da PCR e água Milli-Q estéril num volume total de 10 µL. As ligações
foram incubadas a 4°C por uma noite. Após a incubação, a solução foi utilizada para a
transformação de células de Escherichia coli DH10B competentes.
18
4.4. Produção de células competentes para transformação
Para os experimentos de transformação da linhagem de E. coli DH10B, foi
necessária a obtenção de células competentes conforme descrito por HANAHAN et al.
(1983), com modificações como se segue :
A partir de um pré-inóculo de 10 mL em meio SOB (LB contendo KCl 25 mM; MgCl2
10mM; MgSO4 10mM), incubado durante 16 hs a 37°C sob agitação (250 rpm), foi
inoculado um frasco contendo 100 mL de meio SOB, o qual foi incubado a 37°C sob
agitação com freqüentes medidas de densidade óptica, até obtenção de D.O600nm entre
0,35 e 0,6.
Atingindo este ponto, a cultura foi transferida para 2 tubos Falcon de 50 mL,
resfriada em gelo por 10 min e centrifugada a 5.000 xg por 10 min a 4°C. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e os tubos mantidos invertidos por alguns
minutos para eliminação do restante do sobrenadante.
Figura 2. Vetor de clonagem pGEM-T Easy utilizado para a clonagem do gene vip
3A de B. thuringiensis linhagem HD-125.
19
Decorrido este tempo, a massa de células foi ressuspendida em 1/3 do volume
inicial do cultivo (33 ml) em solução RF1 (acetato de potássio 30 mM; cloreto de rubídio
100 mM; cloreto de manganês 50 mM; cloreto de cálcio 10 mM e glicerol 15%; pH 5,8
ajustado com ácido acético 0,2 M). Os volumes dos dois tubos foram concentrados em
um único tubo o qual foi incubado em gelo por 15 min e novamente centrifugado a 5000
xg a 4°C, o sobrenadante foi desprezado.
Em seguida, as células foram ressuspendidas em tampão RF2 (MOPS-3-ácido[n-
morfolino] propano-sulfônico 10 mM; cloreto de rubídio 10 mM; cloreto de cálcio 75 mM;
glicerol 15%; pH 6,8 foi ajustado com NaOH 2N), em 1/12,5 do volume original (8,0 ml),
sendo então, incubadas em gelo por 15 min.
A suspensão de células foi distribuída em alíquotas de 200 µl em tubos de
microcentrífuga previamente resfriados. Estas alíquotas foram congeladas em gelo seco
e álcool e em seguida armazenadas à -80ºC.
4.4.1. Transformação de células competentes de E. coli
No experimento de transformação foi utilizado o protocolo de HANAHAN et al.
(1983) como se segue: Tubos contendo células competentes foram removidos do freezer
e mantidos em gelo para descongelamento lento. O volume de 200 µl de células
competentes foi adicionado em um tubo de microcentrífuga (1,5 ml) juntamente com 20µl
da reação de ligação, seguindo-se agitação suave e incubação em banho de gelo por 30
min.
Após este tempo, a suspensão de células foi submetida a tratamento de choque
térmico pela transferência do tubo para um banho-maria a 42ºC por 90 s., transferindo-se
novamente para o gelo mantendo-se assim por 2 min.
Em seguida, foram adicionados a cada tubo 800 µl de meio SOC (meio LB, 25mM
KCl; 10mM MgCl2; 10mM MgSO4; 20mM de glicose), seguindo-se incubação sob
agitação a 110 rpm por 1 h a 37ºC. Decorrido esse tempo, uma alíquota de 80 µl da
20
cultura foi transferida para placas contendo meio LB Àgar com 50 µg/ml de ampicilina e
60 µl de X-Gal a 2%. As placas foram incubadas em estufa a 37ºC por 16 hs. Os clones
transformantes que desenvolveram a coloração branca foram selecionados e estas
colônias foram transferidas de forma organizada para placas de 96 poços, contendo LB
suplementado com ampicilina, para crescimento a 37ºC, posterior estocagem em glicerol
(40%) e manutenção a -80ºC.
4.5. Extração de DNA plasmidial dos transformantes
A extração de DNA plasmidial dos clones foi realizada em placas de 96 poços,
inoculando-se 10 µl de cada colônia estocada em 1,0 ml de meio LB com ampicilina (50
µg/mL) em cada poço. As placas foram incubadas a 37°C por 22 hs, sob agitação a 220
rpm. As placas foram centrifugadas a 3.220 xg em microcentrífuga durante 5 min e o
sobrenadante foi descartado.
As massas de células obtidas foram ressuspendidas em 240 µl de GTE (Glicose 50
mM, Tris-HCl pH 8,0 25 mM; EDTA 10 mM), sendo as amostras de DNA coletadas por
centrifugação e os “pellets” após secos foram ressuspendidos em solução de RNAse (10
mg/ml), aos quais foram adicionados 60 µl de solução de lise (NaOH 4M; SDS 10%). As
placas foram agitadas por inversões suaves e incubadas por 10 min.
Decorrido o tempo, foram adicionados 60 µl de solução de neutralização (Acetato
de potássio 3M pH 5,8), seguindo-se suaves agitações por inversão, (foi observado,
nesta fase, a formação de um precipitado branco).
Após a neutralização, as placas foram centrifugadas rapidamente e incubadas por
30 min em estufa a 90°C após esse período as placas foram esfriadas em gelo por 10
min. Os sobrenadantes foram coletados e transferidos para novas placas onde foram
adicionados 110 µl de isopropanol gelado, após centrifugar 45 min a 3.220 xg, o
sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 200 µl de Etanol 70% gelado seguindo
de nova centrifugação por 5 min a 3.220 xg descartando o sobrenadante. As placas
21
secaram em fluxo laminar por 20 min. As amostras de DNA plasmidial foram
ressuspendidas em 20 µl de água Milli-Q estéril e mantidas congeladas a -20°C.
Após a extração do DNA dos clones, a verificação da presença de plasmídeos e a
determinação da quantidade de DNA, foram feitas pela aplicação do material obtido em
gel de agarose 0,8%. Para tanto, 2 µL da solução de DNA, juntamente com 2 µL de
tampão de corrida (azul de bromofenol/glicerol) foram aplicados em canaletas do gel de
agarose 0,8% contendo tampão TEB e submetidos a uma corrida eletroforética por cerca
de 1 hora a 70 V. A quantificação do DNA obtido foi feita utilizando-se do plasmídeo
pGEM3Z em diferentes concentrações: 50, 100 e 200 ng, como padrão da análise e
documentados em fotodocumentador.
4.6.Digestão do DNA
Para liberação dos fragmentos inseridos no vetor pGEM-T Easy foi utilizado 0,4 µl
da enzima EcoRI; 20 µl de DNA; 5 µl de tampão para a enzima [10x] e água Milli-Q
estéril para completar o volume final de 50 µl.
As reações foram mantidas a 37°C por 1 h e 30 min. Para verificação dos
tamanhos dos fragmentos obtidos nas reações de digestão foi utilizado uma amostra de
DNA com fragmentos de tamanhos conhecidos, múltiplos de 1kb (1kb Plus DNA
Ladder), produzida pela Gibco-BRL, o qual serviu como referência de migração
eletroforética. Os géis de agarose foram visualizados sob luz UV e fotodocumentados
em equipamento fotodocumentador (Gel Doc 2000 - BIO-RAD).
4.7. Seqüenciamento dos clones positivos
Para o seqüenciamento foram selecionados ao acaso alguns clones positivos
para presença do gene vip3A resultantes da transformação de E.coli DH10B com vetor
de clonagem pGEM –T. Estes foram submetidos a reações de amplificação de duas
regiões distintas do gene (Figura 3) a região Vip5-Vip2 e a região Vip3-Vip6 utilizando os
22
pares de iniciadores específicos Vip5 e Vip2 para a primeira região e Vip3 e Vip6 para a
segunda região (Tabela 1). A reação consistiu de 2 µl de “Big Dye Terminator” (Perkin
Elmer), 2 µl de tampão para Big Dye, 2 µl de cada um dos iniciadores, 100 ng de DNA (2
µl) e água Milli-Q estéril para completar o volume de 10 µl. As amplificações foram
realizadas conforme o seguinte programa: 2 min a 94°C seguindo de 30 ciclos de: 30 s.
a 94°C, 45 s. a 53°C, 1 min a 72°C e no final dos 30 ciclos foi programado uma extensão
a 72°C por 5 min.
Após a amplificação foi feita a purificação da PCR através da adição de 80 µl de
isopropanol 75% em cada tubo, incubação a temperatura ambiente por 15 min e
centrifugação a 3.220 xg por 45 min a 20°C. O sobrenadante foi descartado e o DNA
lavado com 150 µl de etanol 70%, centrifugado a 3.220 xg por 5 min a 20°C este
procedimento foi repetido por mais duas vezes. Após a última lavagem, os tubos foram
mantidos a temperatura ambiente, por 20 min, para secagem das amostras e posterior
ressuspensão em 2 µl de tampão de carregamento (0,2 ml EDTA 25mM, pH 8,0; 50
mg/ml Blue Dextran; 1,0 ml formamida deionizada). As amostras foram submetidas à
desnaturação por 2 min a 96°C.
A eletroforese foi realizada em seqüenciador automático “ABI PRISM 377 DNA
sequencing Analysis”, após a obtenção das seqüências, as mesmas foram submetidas à
vip2
1.21 Kb
Gene vip3A
2.37 Kb
ATG
1.31 Kb
Vip5
Vip3 vip6
0.15Kb
Figura 3. Esquema da posição das regiões Vip5-Vip2 e Vip3-Vip6 no gene vip3A.
23
análise de qualidade de bases pelo “software” Bioedit e, posteriormente, foi feito o
alinhamento múltiplo com outras seqüências através do programa CLUSTALW,
(THOMPSON et al., 1994) www.ebi.ac.uk/clustalw/.
4.8. Seleção e eluição dos fragmentos de DNA do gel
Após a digestão do DNA, a seleção e recuperação dos fragmentos de tamanho
desejado para a subclonagem foram feitos pela visualização em gel de agarose de baixo
ponto de fusão (LMP) com concentração de 1,0 % em tampão TAE (Tris-Base 2M,
Acetato 1M, EDTA 0,1M) tendo como marcador (1kb Plus DNA Ladder). Depois de
determinada a região provável do gel (~2.370 pb) onde o gene vip3A estaria localizado,
esta foi cortada e aos pedaços de agarose foram adicionados 30 µl/10mg de NaCl (1M)
e colocados em banho a 65°C por 20 min. Após a fusão, foi adicionado 1 volume de
fenol. a seguir vórtex por 1 min e centrifugação a 15.295 xg por 10 min à temperatura
ambiente. A fase aquosa foi coletada e 1 volume de fenol/clorofórmio (1:1) foi
adicionado, a seguir 1 min de vórtex e nova centrifugação à 15.295 xg. Em seguida, a
fase aquosa foi tratada com 1 volume de clorofórmio,1 min de vórtex, nova centrifugação
e coleta da fase aquosa. Para precipitar o DNA foi adicionado 10% do volume total de
acetato de sódio 3M pH 5,2 e 2 volumes de etanol absoluto. A amostra foi incubada a -
80°C por por 1 h. O precipitado foi centrifugado a 15.295 xg por 30 min a 4°C, lavado
duas vezes com 1 ml de etanol 70% e centrifugado por 15 min, 15.295 xg a 4°C. O
precipitado obtido foi seco em fluxo laminar e ressuspendidos em 10µl de água Milli-Q
estéril.
24
4.9. Preparo do vetor de expressão pGA 748
O vetor de expressão pGA748 é do tipo vetor binário, apresenta origem de
replicação e marcadores de resistência a drogas para seleção e manutenção em
Agrobacterium e em E. coli, em adição ao segmento de T-DNA contendo um marcador
de seleção efetivo em plantas, e sítios de restrição para a conveniente introdução do
DNA exógeno (Figura 4).
O vetor plasmidial pGA748 é extraído da linhagem de E. coli MC1061 através de
maxi - preparação de DNA. Cerca de 10 µg deste vetor (20 µl ), foram digeridos com
adição de 2,0 µl da enzima EcoRI (10U/µl), 5,0 µl de tampão apropriado e 23 µl de água
Mill-Q estéril completando o volume para 50 µl, a reação foi incubada a 37°C por 2 hs.
Para limpeza do DNA, o volume foi aumentado para 400 µl com TE (10:1) pH 8,0 e
adicionado 1 volume de fenol. Seguiu-se vórtex por 1 min e centrifugação a 15.295 xg
em centrífuga Eppendorf por 10 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi
transferido para um novo tubo e adicionou-se 1 volume de fenol/clorofórmio (1:1),
seguindo-se 1 min de vórtex e nova centrífugação. Em seguida, tratou-se a fase aquosa
com 1 volume de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), seguindo 1 min de vórtex e
novamente centrifugado por 10 min. O DNA foi precipitado com a adição de 2 volumes
de etanol absoluto e 50 µl de NaCl (1M), incubado a -80°C, por 1 h. Posteriormente foi
centrifugado a 15.295 xg por 25 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e ao
precipitado foi adicionado 1ml de etanol 70%, seguindo centrifugação a 15.295 xg por 15
min a 4°C. O precipitado obtido foi seco em fluxo laminar e ressuspendidos em 40µl de
água Milli-Q estéril.
Em seguida, o vetor linearizado foi defosforilado com a enzima (CIP), fosfatase
alcalina intestinal de bezerro na seguinte reação: 40 µl do vetor pGA748/EcoRI, 18 µl da
enzima CIP (1 unidade/µl – GIBCO-BRL), 7 µl de tampão CIP [10x]. e 5 µl de água Milli-
Q estéril para completar 70 µl (volume total da reação). A reação foi mantida a 37°C
durante 50 min.
25
Novamente procedeu-se a limpeza do DNA como descrito anteriormente, porém o
precipitado obtido foi ressuspendido em 30 µl de água Milli-Q estéril.
4.9.1. Preparo das ligações
O fragmento referente ao gene vip3A eluído foi ligado ao vetor pGA 748
linearizado e defosforilado na proporção 4:1, utilizando 3 µl de T4 DNA ligase, 2 µl de
Tampão da ligase [10x], 4 µl de inserto,1 µl do vetor pGA e água Milli-Q estéril para
completar 20µl, volume final da reação. As ligações foram incubadas a 23°C por 16 hs.
Decorrido este tempo, procedeu-se à transformação de células de Escherichia-coli
DH10B competentes.
12 Kb
Figura 4. Mapa de restrição do vetor de expressão pGA748. BD e BE - bordas direita e esquerda do T-DNA do plasmídio Ti. P35S - promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor. nptII - gene que confere resistência à canamicina. Tc -marca de resistência à tetraciclina.
26
4.9.2. Transformação de E. coli DH-10B competentes
Para o experimento de transformação foi utilizado o protocolo de HANAHAN et
al., (1983), descrito no item 4.4.1. com algumas modificações:
O tratamento de choque térmico foi feito pela transferência do tubo, contendo a
suspensão de células para um banho-maria a 42°C por 1 min e 50 s.
Posteriormente uma alíquota de 100 µl da cultura foi transferida para placas
contendo meio LB ágar suplementado com os antibióticos tetraciclina (5 µg/ml) e
canamicina (12,5µg/ml), para seleção dos transformantes. Os clones foram coletados,
estocados, e submetidos a minipreparações de DNA.
4.9.3. Orientação correta de subclonagem
Para verificação do sentido correto em que o gene foi ligado ao vetor (sentido 5` -
3`) foi necessário selecionar uma enzima de restrição que estivesse presente no inserto,
para isso foi feita uma análise virtual do gene vip3A usando o programa pDRAW32
(http//www.acaclone.com). Com base no resultado obtido foi selecionada a enzima PstI
devido a existência de somente um sítio de restrição para esta enzima na seqüência do
gene vip3A (Figura 5). Feita esta análise foi realizada uma dupla digestão utilizando a
enzima XhoI presente no ”polilinker” do vetor pGA748 (Figura 4) e PstI presente no
inserto. O produto da digestão foi observado por eletroforese em gel de agarose 0,8%
corado com brometo de etídeo sob ação de luz UV.
O DNA plasmidial foi extraído de um dos clones com a orientação correta de
subclonagem, o qual foi, em seguida utilizado para transformar a linhagem de A.
tumefaciens GV3101/pMP90, por meio de eletroporação.
27
4.10. Preparo das células competentes de A. tumefaciens
Para o preparo das células competentes, uma única colônia de A. tumefaciens foi
retirada de uma placa com meio 2xLB ágar, deixada a 28°C por 3 dias, e inoculada em
100ml de meio 2xLB líquido. O crescimento se deu a 28°C, com agitação de 120 rpm,
por 12 a 16 hs.
Em seguida cerca de 50ml da cultura foram transferidos para 500ml de 2x LB em
um frasco de 2,5 L. As células foram crescidas a 28°C, com agitação de 120 rpm por
cerca de 4 hs e transferido para 2 frascos de centrífuga de 250ml gelados. Estes frascos
foram deixados no gelo por 20 min.
Após centrifugação a 4°C, por 15 min a 4000 xg, o meio foi descartado e as
células foram gentilmente ressuspensas em cada frasco com 250ml de água Milli-Q
estéril gelada. Centrifugou-se novamente a 4°C, por 15 min a 4000 xg e repetiu-se esta
lavagem por 5-6 vezes. O sobrenadante foi então descartado e as células em cada tubo
foram ressuspendidas em glicerol 10% gelado. A suspensão de células de cada tubo foi
transferida para um único tubo Falcon de 50ml e após centrifugação a 4°C por 10 min a
Vip3A
Figura 5. Análise virtual fornecida pelo programa pDRAW32 evidenciando o sítio derestrição para a enzima PstI selecionada e os locais de pareamento dos “primers”.
28
3000 xg, o sobrenadante foi descartado e as células foram gentilmente ressuspensas
em 2 ml de glicerol 10% gelado. Foram feitas alíquotas de 80 µl em tubos de
microcentrífuga que foram imediatamente estocados a –80°C.
4.10.1. Transformação de A. tumefaciens por eletroporação
Uma liquota de 80µl de células de A. tumefaciens eletrocompetente foi retirada do
freezer a – 80°C e colocada no gelo para descongelamento lento. Cerca de 1µl (~1µg/µl)
da ligação foi adicionado e o tubo incubado no gelo por 4 min.
A mistura de células competentes e DNA foi transferida para uma cubeta de
eletroporação (0,1 cm) gelada.
O “Gene Pulser” foi ajustado para 25 µF, com 1.8 Kv de carga e o “Pulse
Controller”, para 400 Ω. O pulso foi aplicado por 5,5 s. A cubeta foi removida e
imediatamente adicionado 1ml de meio SOC à cubeta, ressuspendendo-se as células. A
suspensão de células foi transferida para um tubo de 1,5 ml e incubada com agitação de
140 rpm a 28°C por 5 hs para permitir a recuperação das mesmas.
Decorrido este tempo as células foram plaqueadas (80µl/placa) em meio YEB
ágar (Extrato de carne 5g/L, Extrato de levedura 1g/L, Peptona 5g/L Sacarose 5g/L,
MgSO4 240mg/L, pH 6,8) VERVLIET et al., (1975), contendo 12,5µg/ml de canamicina e
5µg/ml de tetraciclina. As placas foram incubadas a 28°C até o surgimento dos
transformantes (aproximadamente 48 hs).
4.10.2. Extração de DNA dos transformantes
Alguns clones ao acaso foram coletados e transferidos para 3 ml de meio YEB
contendo 5µg/ml de tetraciclina e 12,5µg/ml de canamicina, incubados a 28°C, com
agitação de 120 rpm, por 16 hs.
29
Após este tempo foi transferido 1,5 ml da cultura para tubos de microcentrífuga e
centrifugados a 12.000 xg por 2 min. Os sobrenadantes foram descartados e o sedimento
foi ressuspenso em 1 ml de Tampão I (NaCl 0,2 M em TE – 10 ml pH 8,0), centrifugados a
12.000 xg por 2 min. Esta etapa foi repetida por mais duas vezes para eliminar todo o resto
de meio de cultura.
Após as lavagens o sedimento foi ressuspendido em 200 µl de tampão I e
adicionado 200 µl de solução I (NaOH 0,2 N, SDS 1% - 1ml), misturado por inversão 4 a 6
vezes e incubado no gelo por 15 min. Em seguida foram adicionados 150 µl de acetato de
potássio 3 M (pH 5,2) previamente resfriado, misturado por inversão quatro vezes e
incubado no gelo por 30 min. Decorrido este tempo, centrifugou-se a 12.000 xg, por 5 min.
Os sobrenadantes foram retirados cuidadosamente e transferidos para outro tubo, a eles
foi acrescentado 1 volume de fenol (~500 µl), os tubos foram agitados em agitador do tipo
vortex por 2 min e centrifugados a 12.000 xg, por 5 min, para separar as fases. A fase
aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo.
Em seguida foi adicionado 1 volume (~500 µl) de clorofórmio/álcool isoamílico 24:1,
os tubos foram agitados por 2 min em vórtex, e centrifugados a 12.000 xg por 5 min, a
fase aquosa foi transferida para um novo tubo. Para precipitar o DNA foi adicionado 1
volume de isopropanol (mantido a –20°C), misturado por inversão e incubado a –80°C
por uma hora. Decorrido este tempo os tubos foram centrifugados a 12.000 xg, por 30
min a 4°C, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado pela adição de 500
µl de etanol 70%. O precipitado obtido foi seco em fluxo laminar e ressuspendidos em
20µL de água Milli-Q estéril.
4.10.3. Confirmação da presença do gene vip3A Para confirmar a presença do gene vip3A, nos transformantes de A. tumefaciens,
os DNAs resultantes das minipreparações foram submetidos a reações de PCR
utilizando-se os iniciadores Vip5 e Vip6 apresentados na tabela 1 seguindo a mesma
reação, os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose 1% e
30
fotodocumentados em fotodocumentador Gel Doc 2000 (Bio-Rad). Os clones positivos
foram estocados em glicerol 40% e mantidos no freezer á – 80°C.
31
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para estudar o gene vip3A na linhagem HD-125 de B. thuringiensis foi utilizado o
kit Insta Gene Matrix para obtenção do material genético, o qual demonstrou ser um
método eficiente e mais rápido quando comparado com o método descrito por MARMUR
et al., (1961).
Neste trabalho foram utilizados os pares de iniciadores específicos descritos por
LOGUERCIO et al., (2002) que amplificam o gene vip3A completo como também regiões
distintas do gene como as regiões Vip5-Vip2 e Vip3-Vip6, (Figura 3). A utilização do par
de iniciadores Vip5-Vip6 para amplificação do gene completo resultou num produto
esperado de (~2.370 pb) com banda única, canaleta 2 (Figura 6).
A análise virtual da seqüência de nucleotídeos do gene vip3A(a), depositada no
GenBank com o número de acesso L48811, através do programa pDRAW 32, permitiu
verificar que a amplificação com o iniciador Vip5 inicia-se a partir do “start codon” (ATG)
e o iniciador Vip6 faz o pareamento a partir do “stop codon” (TTA), portanto, estes
amplificam o gene vip3A(a) completo, o que permitiu a sua subclonagem em um vetor de
expressão em plantas.
Nos estudos realizados por LOGUERCIO et al., (2002) foram apresentadas
bandas inespecíficas quando da amplificação das amostras com o mesmo par de
iniciadores. Na canaleta 3 (Figura 6) comprova-se a ausência de amplificação da
linhagem padrão usada como controle negativo, a B. thuringiensis tenebrionis
(coleoptéro-específico).
O produto desta amplificação foi ligado no vetor de clonagem pGEM-T Easy e os
DNAs plasmidiais obtidos dos clones de Escherichia coli transformadas, portadores do
gene vip3A, foram submetidos a digestão com a enzima de restrição EcoRI para
liberação do inserto.
32
As digestões (Figura 7 – canaletas: 4 e 5, 9 – 12) e o seqüenciamento dos clones
positivos utilizando os dois pares de iniciadores (Tabela 1) demonstraram que o gene
vip3A de B. thuringiensis foi clonado com sucesso. A seqüência de nucleotídeos obtida
para região Vip5-Vip2 teve um tamanho de 824 pb (Figura 8A) e a região Vip3-Vip6 com
tamanho de 846 pb (Figura 8B) O alinhamento das seqüências geradas utilizando-se da
ferramenta BLASTN indicou 93% de homologia para a região Vip5-Vip2 e 85% para
região Vip3-Vip6, quando comparada à seqüência do gene vip3A(a) presente no
GenBank, com número de acesso L48811.
Segundo RICE (1999) e AZOL (2006) ambas as regiões Vip5-Vip2 e Vip3-Vip6
são altamente conservadas nesta espécie.
WU et al., (2004) utilizaram iniciadores específicos para amplificação do gene
vip3A de B. thuringiensis linhagem WB50. Após o seqüenciamento, a seqüência de
nucleotídeos de 2.460pb analisada indicou 99% de homologia quando alinhada com
aquela do gene vip3A(a) depositada no Banco de dados.
Figura 6. Eletroferograma confirmando a presença do genevip3A na linhagem B. thuringiensis HD-125. Canaleta 1: Peso molecular:1Kb Plus DNA Ladder; 2: fragmentoamplificado com ~2.370pb; 3: CN- B.t. tenebrionis; 4: controle negativo da reação.
1 2 3 4
3.000pb 2.000pb
2.370pb
33
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
3.000pb2.000pb
PGEM-T2.370pb
Figura 7. Eletroferograma da digestão dos clones positivosutilizando a enzima EcoRI. Canaleta 1: PM: !Kb; canaletas 4,5,6,7,9,10,11,12, demonstram a presença e liberação dofragmento inserido no vetor pGEM-T Easy, as demais canaletas mostram a ausência do fragmento.
>Vip5-Vip2 AAACCTAATACTCCCGATAAGAACCTTATCTTATCCATATATGGATTTAGCTTAGCTTACATACATTAAAGACTGGAATTGAATCATTACTAATTGCGAACCCAATCAATGCCTGTCCTGGTTTAACTTCCACAATCATCTTTGCATCTTCATCACTTCCTTTAACTGTTGCATAATTAAGATTAGAAAAAGTATTAGAAAGTGTAAGGAGGATGTTTACTCTAAATTCCTCTTTTTCCTTATTTAAATGTTCATTCATAATAGAAGTATAATCGATATCTGCTAAGCCTAATAATTTTCGGCATGTTGTTAAAGAAAGAAAAGCTTTTGCTTGCAGAGCTGGTAATACAATTAAGAAGTTATAAACATTTCCGACCTCACTGCCACTTGTTTTCACATTTTCTTTAGTAATTAATTCCGATGCAGGTTTTAAAGCTGAACGCCGAATAAATTATTTCCTACCATTACATCGTGGAATGTATTAAGGCAAGATTCAAAACCATCCACATCATTTTTTGTGACACTTTTCGCTAGATCAGATAACTCANTTAACTCATCAAGAATATCTGCCCGAGAGCCATCCTTTTTTACTTTTGAACTATTTTCCGTACCAAAAAGTAGTTCCCCAAATTTTCTGTTCACNTATTTAATCCTTTGATACCCAGGTGTACTNCTCCGNAAGGGGGGAGGTAACTCGGTACGTTGGGCGGAATCGGATACCAATTTATCGGGAAAANNNCCACCCANAGCATCACGCAAGGANGCGTTNGGCCAGACTNAGGGGCCG
>Vip3-Vip6 GGAACTTGAAGATGCGACCCAGTATTATTAGCCCTTTCCAGTAGACCGGTACAAAAGTTATCNTTCGACAATGATGCCTTGACGGTTAGCAAAAACTGGTGATACGCGCAGCTCTTATAGCCCCCATATCATACCGCTTCCCTATAATATCCAATCCTCACATTATCATCTCCGGACACTGAAAAACCACTCTAGATGTTGCATAAACTATCGAATTGAAGGGATAGGATGAAACTCCCTCGTCCTCCCAGACATCGAGCGAGAGAATTGCCGCTAATATTAAATGATCCCAAACTCGTGCAATTATTTGTATAACGTAATTCGGGACTGATGAAGTAGTCAGAATGACTAATTGCCAAAATAATAAAGCTATCTCCCCAAGCTTCATCGCCATTTTGACTTTTTAAAATTAAATACACTCCCTTTAAATCAGTTCCTGTAGTAAAACGTTTAGAAATAGTTTGATAATCTCCTACATTATTATTTGTATCTTCATAATGAACATACCCAGAAGTGGCATCTTTTAAATGAATAGAAGGGGCGCCTTAGGCAGGCAGTGGGATGAGGAGCCGGGGAAGCGGGGGCGACGCAGCGCGAGCGCGGGCCAGCGGTGTGGCGGCCGCAGGACAGGGGCGGGGNNNGNNGNNGNGGNNGCGCGCGGGAGGAGGGGCGTGGNGGTCCCTCACCGCTGCCGGTGGAGGGGGCGGCAGGTGAGCCGCGATGCGTGGCAGGGGCGCGGGAGGGGGGACGCCGAGGGGGGCGCGC
Figura 8. Seqüência FASTA da região Vip5-Vip2 (A) e seqüência FASTA da região Vip3-Vip6 (B).
A
B
34
O alinhamento múltiplo feito através da utilização do programa CLUSTALW gerou
um filograma de similaridade genética entre as seqüências obtidas pelo “software”
Bioedit e os outros genes vips depositados no GenBank. Os resultados podem ser
observados na Figura 9.
Na Figura 9, observou-se a formação de dois grupos principais; dentre estes um
grupo apresentou os genes vip83 e vip3A(b) e um grupo maior com outros 4 genes
incluindo as seqüências geradas pelo “Bioedit” demonstrando que a linhagem HD-125
apresenta maior similaridade genética para o gene vip3A(a). Esses dados corroboram o
trabalho de LOGUERCIO et al., (2002) onde este cita que a linhagem HD-125 tem um
segmento quase inteiramente idêntico ao relatado vip3A(a).
Segundo ESTRUCH et al., (1996), a proteína Vip3A(b) é 98% idêntica à Vip3A(a),
com a identificação de apenas 5 aminoácidos diferentes quando se compara as duas
seqüências.
Em análises por reações de PCR com iniciadores específicos, DONOVAN et. al.,
(2001), comprovaram que a linhagem B. thuringiensis HD-1 contem o gene vip3A. Ainda
DONOVAN et al., (2001) relataram que a proteína Vip3A pode ser um componente para
a toxicidade de uma variedade de B. thuringiensis contra insetos da ordem Lepidoptera.
9
35
SELVAPANDIYAN et al., (2001) analisaram a toxicidade da proteína Vip
construindo deleções de N e C terminal, expressadas em E.coli. As deleções de 39 a.a.
do N terminal reduziu sua toxicidade contra larvas de S. litura. Similarmente, a deleção
de 154 a.a. do C terminal aboliu completamente sua atividade contra estas larvas.
Os DNAs dos clones de E. coli, transformadas com o vetor de expressão pGA748
mais o gene vip3A foram digeridos com as enzimas XhoI e PstI para análise do sentido
de clonagem, ou seja, o codon ATG do fragmento correspondente ao gene vip3A
deveria estar “upstream” ao promotor 35S do vetor pGA748, para que fosse possível a
expressão deste gene em plantas. Essa análise gerou três bandas. O perfil das bandas
pode ser observado na Figura 10. Quando o fragmento foi clonado no sentido contrário
(sentido 3` - 5`), canaletas 3 e 5, observou-se um fragmento de 9.982 pb, um de 2.600
pb e um terceiro fragmento de 1.788 pb, (Figura 11A) Quando o fragmento estava
clonado no sentido correto (sentido 5`- 3`), canaletas 2 e 4, distinguia-se um fragmento
de 11.188 pb, 2.600 pb e um terceiro de 582 pb, (Figura 11B).
1 2 3 4 5
2.600pb1.788pb
582pb
9.982pb11.188pb
3.000pb
1.000pb
12.000pb
600pb
Figura 10. Eletroferograma demostrando o sentido daclonagem do gene no vetor pGA748, utilizando asenzimas XhoI e PstI. Canaleta 1 PM, canaletas 2 e 4 sentido correto (5` - 3`), canaletas 3 e 5 sentido inverso (3`- 5`).
36
Obtido o clone com a orientação correta de clonagem, partiu-se para a extração
do DNA plasmidial e a eletroporação de A. tumefaciens linhagem GV3101. Os clones
transformantes foram analisados por PCR, utilizando-se os iniciadores Vip5 e Vip6
(Tabela 1.), e os produtos desta amplificação podem ser visualizados na Figura 12, a
Figura 11. Esquema ilustrativo da construção do vetor de expressão emplantas pGA748 com o gene vip3A inserido no sentido inverso (3’- 5’) (A) e a ligação do gene vip3A no sentido correto (5’- 3’), upstream” ao promotor 35S (B)
P35S
9 400pb
B
PstI1.788p
9 400pb
P35S
A
37
qual demostra a presença do gene vip3A completo na linhagem de A. tumefaciens
transformada.
A transformação por eletroporação de células de A. tumefaciens com o vetor
pGA748 foi altamente eficiente, resultando em 100% de clones analisados contendo o
gene vip3A.
GOULD et al., (1990) concluíram que espécies monocotiledôneas de milho podem
ser transformadas com grande eficiência utilizando linhagens de A. tumefaciens
desarmadas.
Em estudos futuros poderá ser feito a transformação de uma cultivar de interesse
econômico para expressão do gene vip3A mediadas por A. tumefaciens e posterior
avaliação do nível de expressão desta proteína através da extração de RNA e utilização
da técnica de RT-PCR. As plantas transformadas poderiam ser utilizadas em bioensaios
contra larvas de Lepidópteros em condições de campo.
Estudos que verificam a abundância, a distribuição e a diversidade de isolados de
B. thuringiensis são importantes não somente para a busca de novas alternativas de
controle de insetos pragas, através do isolamento de linhagens com especificidade
3.000pb2.370pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 12. Eletroferograma evidenciando a presença do genevip3A nos clones transformantes de A. tumefaciens. Canaleta 1:PM, 2: HD-125, canaletas 3,4,5,6,7,8 amplificação do gene, 9 CN:Bt tenebrionis, 10: controle negativo da reação.
38
toxica diferente das atualmente conhecidas, mas também para responder questões
ligadas a evolução (conseqüente classificação) e as relações ecológicas desta espécie
(VILAS BOAS, 2002).
39
6. CONCLUSÕES
O vetor de expressão em células de planta, pGA748, apesar de ser um
plasmídio grande, permitiu a manipulação e análise em células de E. coli DH10B, quanto
à determinação correta de subclonagem do gene vip3A.
A transformação por eletroporação de A. tumefaciens com o vetor pGA748 foi
altamente eficiente, resultando em 100% de clones analisados contendo o gene vip3A.
A construção do vetor pGA748 com o gene vip3A inserido no sentido correto,
pode ser usado em transformação indireta via A. tumefaciens, ou transformação direta
pelo uso de Biobalística e/ou eletroporação de protoplasto.
40
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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