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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Campus Araraquara PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS E NUTRIÇÃO ÁREA CIÊNCIA DOS ALIMENTOS PALOMA ANDRADE MARTINS NASCIMENTO DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS E FIRMEZA EM FRUTOS ÍNTEGROS DE PESSEGUEIRO POR MEIO DA ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR) Araraquara – São Paulo 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Campus Araraquara
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS E NUTRIÇÃO
ÁREA CIÊNCIA DOS ALIMENTOS
PALOMA ANDRADE MARTINS NASCIMENTO
DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS E FIRMEZA EM FRUTOS
ÍNTEGROS DE PESSEGUEIRO POR MEIO DA ESPECTROSCOPIA DO
INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR)
Araraquara – São Paulo
2015
II
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Campus Araraquara
PALOMA ANDRADE MARTINS NASCIMENTO
DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS E FIRMEZA EM FRUTOS
ÍNTEGROS DE PESSEGUEIRO POR MEIO DA ESPECTROSCOPIA DO
INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR)
Orientador: Prof. Dr. Gustavo Henrique A. Teixeira
Coorientadora: Prof.ª Drª Fabíola Manhas Verbi Pereira
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Alimentos e Nutrição, da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para
a obtenção do título de Mestre em Ciência dos
Alimentos.
Araraquara – São Paulo
2015
III
IV
Dedico à Deus, meu Jesus Cristo, que dia a dia me cumula de bênçãos e me
capacita, pois de mim mesma nada sou capaz, mas toda a capacidade vem
d’Ele. À Ele toda honra, glória e louvor.
V
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Jesus, o meu Deus, aquele que era, que é e o que há de vir, por ser a
fortaleza do meu coração, e estar comigo todos os dias. Eu sou o teu povo e Tu és o
meu Deus. Te amo Senhor!
Agradeço ao meu esposo Matias por me apoiar e me incentivar nos momentos de
dificuldade e fraqueza. Por enxugar minhas lágrimas, lutando comigo em cada dificuldade.
Obrigada por suas orações. “Melhor é serem dois do que um”. Eclesiastes 4,9.
Agradeço aos meus filhos Daniel e Lídia, por compreender os momentos em que estive
ausente fisicamente e mentalmente também. Vocês são o presente de Deus na minha
vida, herança do Senhor. Amo muito!!
Agradeço a minha avó Dionília (in memória), por ter sido minha amiga, pelos muitos
conselhos e por ter cuidado de mim. Você me conhecia em um olhar. Sinto sua falta.
Agradeço a minha mãe Raquel, por seu esforço, sendo a cuidadora do lar, e mesmo
assim, sempre me proporcionou o melhor. Obrigada pelas orações, pelo apoio e incentivo.
Agradeço ao Sebastião, amigo inesperado, por Deus enviado. Muito Obrigada!
Agradeço ao meu Pastor Rosivaldo Russo, por ter orado por mim e por minha família,
pela palavra de vitória ministrada ao ingressar neste desafio.
Agradeço a minha amiga Adriane, que nunca me negou auxílio, sendo hospitaleira em
todos os momentos. Meu muito obrigada!
Agradeço aos amigos que conheci durante essa etapa, tanto na FCFAR quanto no IQ,
pelo apoio, pelas palavras de ânimo e incentivo. Obrigada!
Lívia, companheira de mestrado. Disciplinas, cursos, congressos, coletas, análises, dúvidas,
preocupações... passou rápido né! Obrigada!
Agradeço a professora Magali Monteiro, que mesmo com seu jeito inusitado, me ensinou
muito. Obrigada!
VI
Agradeço a professora Patrícia Mastroianni, que mesmo em outra área, permitiu que
eu fizesse meu estágio de docência, acrescentando em minha formação. Obrigada pela
oportunidade!
Agradeço ao professor Luís, que se dispôs a me ajudar e ensinar. Não havia distância e
nem mesmo hora para o seu auxílio. Meu muito Obrigada!
Agradeço a minha coorientadora professora Fabíola que me acolheu como aluna, me
ajudando, me ensinando, me aconselhando, estando sempre disponível. A senhora foi
além, Muito Obrigada!
Agradeço ao meu orientador professor Gustavo, que aceitou me orientar, acreditou em
mim, foi paciente, calmo e compreensivo como todo Mestre deveria ser. Saiba que eu
o respeito e o admiro. Muito Obrigada!
Agradeço à todos os docentes, funcionários da Pós Graduação e Biblioteca da FCFAR,
pela atenção e pelos serviços prestados.
Agradeço a todos que direta ou indiretamente me auxiliaram, meu Muito Obrigada!
À CAPES, pela bolsa concedida.
VII
“Determinando tu algum negócio, ser-te-á firme, e a luz brilhará em teus
caminhos.”
Jó 22.28
VIII
RESUMO
O pessegueiro é uma espécie frutífera nativa da China que é cultivada em regiões de clima
temperado, pois necessita de baixas temperaturas para o seu desenvolvimento. No entanto, em
condições subtropicais e tropicais brasileiras, a cultivar Aurora 1 se destaca, pois necessita de
poucas horas de frio para a quebra da dormência de suas gemas, além de ter frutos atrativos em
função da sua coloração externa, ser uma cultivar bastante precoce estando disponível primeiro
no mercado. Os consumidores, de maneira geral, ao adquirirem uma fruta, esperam que esta
esteja doce, suculenta e com a firmeza desejada. O teor de sólidos solúveis (SS) e a firmeza dos
frutos são os atributos de qualidade mais importantes para a aquisição do pêssego e apesar das
técnicas de determinação tanto dos teores de SS quanto da firmeza serem simples, estas são
destrutivas e relativamente demoradas. Uma alternativa seria o uso da espectroscopia do
infravermelho próximo (NIR), pois esta técnica permite reconhecer a estrutura de moléculas,
obtendo informações qualitativas e quantitativas. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi
desenvolver um método analítico utilizando a espectroscopia do infravermelho próximo
associado a ferramentas quimiométricas para a determinação do teor de SS e firmeza em frutos
íntegros do pessegueiro ‘Aurora 1’. Verificar a influência do estádio de maturação e da época
de colheita dos frutos nos modelos desenvolvidos. O modelo de calibração foi desenvolvido
com pêssegos colhidos no ano de 2013 em três estádios de maturação e em três colheitas
distintas. O modelo de predição foi desenvolvido com frutos colhidos em 2014. Os espectros
NIR foram obtidos nas regiões da “cor de fundo” e da “cor de recobrimento” da epiderme de
cada fruta, sendo os mesmos obtidos na forma de log 1/R e foram empregadas várias técnicas
de pré-processamento. A Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizada para verificar
a formação de grupos e os modelos de calibração foram desenvolvidos utilizando a regressão
por mínimos quadrados parciais (PLS). O desempenho do modelo foi avaliado com base nos
valores dos erros quadráticos médios de predição (RMSEP) e o coeficiente de determinação
(RP2). Não foi observado o agrupamento das frutas em função da coloração da epiderme (cor
de fundo e cor de recobrimento), estádios de maturação e época de colheita pela PCA. O modelo
construído utilizando o método de validação externa apresentou um RMSEVE de 1,08 % com
11 variáveis latentes (LVS) e um RVE2 de 0,59. O conjunto de predição, dados independentes,
resultou em um modelo menos preciso (RMSEP 1,04 %, Rp2 0,45 e 11 LVs). O mesmo ocorreu
para a determinação de firmeza com a validação externa resultando em um modelo melhor com
RMSEVE de 9,51 N e RVE2 de 0,40, e o conjunto de predição com RMSEP de 13,2 N, RP
2 0,40
com 7 LVs. A espectroscopia NIR mostrou ser um potente método analítico para determinar
SS e firmeza de frutos intactos de baixo requerimento em frio como a cultivar ‘Aurora 1’. No
entanto, é necessário otimizar os modelos para reduzir os erros de predição.
Palavras chave: Prunus persica, Aurora 1, estádios de maturação, quimiometria, PLS.
IX
ABSTRACT
The peach tree is a fruit species native from China, which has been cultivated in temperate
regions because it requires low temperatures for its development. However, in Brazilian sub-
tropical and tropical conditions the ‘Aurora 1’ cultivar stands out as it needs few hours of
chilling to break the bud dormancy, in addition the fruit is attractive in terms of external colour,
and is a precocious cultivar with fruit been available first in the market. In general, when
purchasing a fruit consumers expect that they are sweet, juicy, and with a desired firmness. The
soluble solids content (SSC) and fruit firmness are important quality attributes for peach fruit
acquisition and although the determination techniques for SSC and firmness are simple, they
are destructive and relatively time consuming. An alternative method would be the use of near
infrared spectroscopy (NIR), as this technique allows the recognition of molecular structure,
obtaining qualitative and quantitative information. Therefore, the aim of this study was to
develop an analytical method using infrared spectroscopy combined with chemometric tools to
the determination of SSC and firmness in intact ‘Aurora 1’ peach fruit, and also verify the
influence of maturity stages and fruit harvest season in the developed models. The calibration
models were developed with peach fruits harvested in 2013 in three maturity stages, and at three
different crops. The prediction model was developed with fruits harvested in 2014. The NIR
spectra were collected in the regions of "background colour" and "blush colour" of the skin of
each fruit. The spectra were obtained as log 1/R and various pre-processing techniques were
employed. The Principal Component Analysis (PCA) was used to verify the cluster formation
and the calibration model were developed using partial least squares regression (PLS). The
model performance was evaluated based on the values of the mean square error of prediction
(RMSEP) and the coefficient of determination (RP2). It was not possible to observe any cluster
based on fruit skin colour (background colour and blush colour), maturity stages, and harvest
season by PCA. The model constructed using the external validation set had RMSEVE of 1.08
% with 11 latent variables (LVS) and a RVE2 of 0.59. The prediction set, independent data,
resulting in a less accurate model (RMSEP 1.04 %, Rp2 0.45 and 11 LVs). The same trend
happened for determining firmness with the external validation resulting in better model with
RMSEVE of 9.51 N and RVE2 of 0.40 and the prediction set with RMSEP of 13.2 N, RP
2 of 0.40
and 7 LVs. The NIR spectroscopy showed to be a potential analytical method to determine SSC
and firmness of intact low chilling ‘Aurora 1’ cultivar. However, it is necessary to optimize the
models in other to reduce the prediction errors.
Keywords: Prunus persica, Aurora 1, maturity stages, chemometrics, PLS.
X
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Nome em inglês Tradução/ Descrição
AT ---- Acidez Titulável
C ---- Carbono
cv. ---- Cultivar
H ---- Hidrogênio
HCA Hierarchical Cluster Analysis Análise de Agrupamentos
Hierárquicos
hv ---- Fótons
IAC Independent Component Analysis Análise de Componentes
Independentes
IAC ---- Instituto Agronômico de
Campinas
J ---- Jaules
kg ---- Quilogramas
kj ---- Quilojaules
KNN K-Nearest Neighbor K-ésimo Vizinho mais Próximo
L* Lightness Luminosidade
LDA Linear Discriminant Analysis Análise Linear Discriminante
MLR Multiple Linear Regression Regressão Multi- Linear
MPLS Modified Partial Least Squares
Regressão Linear Modificada por
Mínimos Quadrados Parciais
MSC Multiplicative Scatter Correction Correção do Sinal Multiplicativo
MT ---- Magness- Taylor test
N ---- Newtons
N ---- Nitrogênio
XI
NIR Near Infrared Spectroscopy Espectroscopia do Infravermelho
Próximo
nm ---- Nanômetros
O ---- Oxigênio
º h ---- Ângulo hue
PC Principal Component Componente Principal
PCA Principal Component Analysis Análise de Componentes
Principais
PCR Principal Component Regression Regressão por Componentes
Principais
PLS Partial Least Squares
Regressão por Mínimos
Quadrados Parciais
PLS-DA Partial Least Square Discriminant
Analysis
Análise Discriminante por
Mínimos Quadrados Parciais
PME ---- Pectinametilesterase
R² Correlation Coefficient of
Determination Coeficiente de Determinação
R2C
Correlation Coefficient of
Determination of Calibration
Coeficiente de Determinação para
Calibração
R2P
Correlation Coefficient of
Determination of Prediction
Coeficiente de Determinação para
Predição
R2VE
Correlation Coefficient of
Determination of External Validation
Coeficiente de Determinação para
Validação Externa
RMSEC Root Mean Square Error for
Calibration
Erros Quadráticos Médios de
Calibração
RMSECV Root Mean Square Error for
Cross Validation
Erros Quadráticos Médios de
Validação Cruzada
RMSEP Root Mean Square Error for
Prediction
Erros Quadráticos Médios de
Predição
RMSEVE Root Mean Square Error for
External Validation
Erros Quadráticos Médios de
Validação Externa
XII
RPD Ratio Standard Deviation Desvio do Resíduo de Predição
S ---- Enxofre
SEC Error Standart for Calibration Erro Padrão de Calibração
SEP Error Standart for Prediction Erro Padrão de Predição
SIMCA Soft-Independent Modeling of Class
Analogy
----
SNV Standard Normal Variate Variação Normal Padrão
SS Soluble Solids Sólidos Solúveis
SSC Soluble Solids Content Teor de Sólidos Solúveis
VL Latent Variable Variáveis Latentes
μm ---- Micrometros
XIII
LISTA DE FIGURAS
Capítulo I
Figura 1. Os espectros NIR obtidos por (a) reflectância, (b) transmitância ou (c)
interactância..............................................................................................................................15
Capítulo II
Figure 1. NIR spectra, raw spectra (A); multiplicative scatter correction (MSC) (B); first
derivative of Savitsky-Golay (d1A) (C) …………………………………………….…. ……..39
Figure 2. Scores of PC1 and PC2 from the principal component analysis based on NIR spectra
(A, C, and E) and CIE colour parameters (B, D, and F). Bush and background colour (A-B),
harvest seasons (C-D), and maturity stages (E-F)………………..…..……………………….41
Figure 3. Reference (measured) and predicted values of soluble solids content (SSC - %) in
intact peach fruit ‘Aurora 1’. PLS regression MSC correction……………….………………..42
Figure 4. Reference (measured) and predicted values of firmness (N) in intact peach fruit
‘Aurora 1’. PLS regression with first derivative of Savitsky-Golay (d1A)…………....……….45
XIV
LISTA DE TABELAS
Capítulo II
Table 1. Descriptive statistics of the calibration and validation set (2013), and the prediction
set (2014) classified with the classic Kernnard-Stone selection
algorithm……………………………………………………………………….……………. 36
Table 2. Performance of PLS models developed using NIR spectra of intact ‘Aurora 1’ peach
fruit for soluble solids determination (%) ………….………………………..……………….. 42
Table 3. Performance of PLS models developed using NIR spectra of intact ‘Aurora 1’ peach
fruit for firmness (N) ………………………………………………………….........................44
XV
SUMÁRIO
CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 2
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 5
2.1 Objetivo geral .................................................................................................................. 5
2.2 Objetivo específico .......................................................................................................... 5
3. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................... 6
3.1 O Pessegueiro .................................................................................................................. 6
3.1.1 A cultivar Aurora 1 ................................................................................................. 7
3.2 Aspectos pós colheita ..................................................................................................... 7
3.2.1 Coloração ................................................................................................................ 8
3.2.2 Firmeza ................................................................................................................... 9
3.2.3 Sólidos solúveis e ácidos orgânicos ..................................................................... 10
3.2.4 Padrões de qualidade ............................................................................................ 12
3.3 Espectroscopia do infravermelho próximo (NIR) ..................................................... 14
3.3.1 Princípios .............................................................................................................. 14
3.3.2 Absorção ............................................................................................................... 15
3.4 Quimiometria ................................................................................................................ 16
3.4.1 Análise de componentes principais (PCA) ........................................................... 18
3.4.2 Regressão por mínimos quadrados parciais (PLS) ............................................... 19
3.4.3 Aplicações ............................................................................................................ 20
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 23
XVI
CAPÍTULO II
ABSTRACT ........................................................................................................................ 33
1. Introduction ........................................................................................................................ 34
2. Materials And Methods ..................................................................................................... 35
2.1 Fruit material ................................................................................................................... 35
2.2 FT-NIR spectra acquisition ............................................................................................. 36
2.3 Reference analysis ........................................................................................................... 36
2.3.1 Colour .................................................................................................................... 36
2.3.2 Firmness ................................................................................................................ 37
2.3.3 Soluble solids content (SSC) ................................................................................. 37
2.4 Chemometrics .................................................................................................................. 37
3. Results And Discussion ...................................................................................................... 38
3.1 NIR spectra ...................................................................................................................... 38
3.2 Principal component analysis (PCA) ............................................................................... 40
3.3 PLS prediction models: soluble solids content (SSC) ..................................................... 41
3.4 PLS prediction models: firmness ..................................................................................... 43
4. Conclusions ......................................................................................................................... 46
Acknowledgments ................................................................................................................ 46
References............................................................................................................................. 46
CAPÍTULO 1
2
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, a área cultivada com pessegueiros ultrapassa 23.000 hectares, sendo
que o estado do Rio Grande do Sul é o maior produtor (MEZZOMO et al., 2010) e o
estado de São Paulo ocupa a segunda colocação, com aproximadamente 2.800 hectares
(LEONEL et al., 2011). A produção nacional de pêssego em 2013 foi de 217.706 mil
toneladas, com uma rentabilidade de R$ 312.059,00 (IBGE, 2015).
O pessegueiro é uma frutífera tradicionalmente cultivada em regiões de clima
temperado (MEDEIROS; RASEIRA, 1998). Porém, é possível o seu cultivo em regiões
subtropicais e tropicais, devido ao desenvolvimento de diversas técnicas agronômicas,
tais como: poda, controle de irrigação, melhoramento genético, dentre outras.
Os climas subtropicais e tropicais predominam em todo o território brasileiro
(IBGE, 2015), desta forma, os produtores paulistas e dos demais estados utilizando as
técnicas descritas anteriormente podem ampliar a produção de cultivares com baixo
requerimento em frio, como é o caso da cultivar Aurora 1, que requer baixa exposição ao
período de temperaturas baixas para a quebra da dormência de suas gemas.
Considerando a importância econômica da cultura do pessegueiro, a melhora das
práticas pós-colheita se faz necessário, como por exemplo, a classificação dos frutos em
função do teor de açúcares ou sólidos solúveis da fruta e não somente o uso das Normas
de Classificação de Pêssego e Nectarina estabelecidas pelo Programa Brasileiro para a
Modernização da Horticultura & Produção Integrada de Frutas (CEAGESP, 2008), que
não exigem a classificação quanto aos parâmetros de qualidade tais como: a firmeza e o
teor de sólidos solúveis (SS) e/ou acidez titulável (AT).
O teor de SS é um importante atributo de qualidade para o consumidor final.
Crisosto et al. (2003) avaliaram a aceitação de pêssegos pelos consumidores em função
do teor de sólidos solúveis. Estes autores observaram que teores de SS de 13% para
cultivares de polpa amarela tem aceitação de 70% e, para cultivares de polpa branca a
aprovação foi de 100% quando os teores de SS eram de 16%. Contudo, frutos com valores
abaixo de 10% de SS eram rejeitados por aproximadamente 70%. Portanto, a classificação
dos frutos de pessegueiro com base neste atributo de qualidade poderia alavancar a
comercialização desta fruta.
Outro importante atributo de qualidade avaliado pelo consumidor é a firmeza dos
frutos, pois está associada à resistência ao transporte e à vida de prateleira (MATIAS et
3
al., 2013). Esta é uma propriedade também relacionada ao valor econômico do produto e
deveria ser avaliada no processo de classificação dos frutos de pessegueiro.
Os métodos tradicionais para quantificação de variáveis classificatórias na etapa
de pós-colheita, como por exemplo, o teor de sólidos solúveis, acidez titulável, pH, teor
de açúcares e pigmentos (carotenóides), são geralmente destrutivos, laboriosos, que
demandam muito tempo, geram resíduos tóxicos e algumas vezes envolvem
procedimentos especializados ou demorados para a escala de tempo atualmente requerida
em tempo real (MORGANO et al., 2005; ZIOSI et al., 2008). Assim, para que os métodos
classificatórios atendam às necessidades do mercado produtor, os frutos devem passar
rapidamente pela esteira de classificação e suas propriedades de qualidade rapidamente
atribuídas, o que é inviável com as técnicas analíticas tradicionais. Deste modo, uma das
alternativas é a utilização de técnicas não destrutivas.
Dentre estas técnicas, a espectroscopia do infravermelho próximo (NIR) tem sido
utilizada desde o final da década de 60 para a avaliação da qualidade em alimentos. Em
1965, a espectroscopia NIR foi aplicada pela primeira vez para avaliar o teor de umidade
em grãos (NORRIS; HART, 1965). O sistema tornou-se uma técnica ideal para a análise
de alimentos por ser rápida, de baixo custo, não necessitar de reagentes químicos e não
gerar resíduos.
A espectroscopia NIR já foi utilizada em frutos de pessegueiro para avaliar vários
atributos, para determinação de SS por Kawano et al., 1992; Walsh et al., 2004 (apud
NICOLAÏ et al., 2007). Slaughter, 1995 (apud NICOLAÏ et al., 2007) analisou o teor de
sorbitol e clorofila, Carlomagno et al. (2004) analisaram a maturação, além da técnica
que vem sendo utilizada com imagem multi-hiperespectral, onde Zwiggelaar et al. (1996)
avaliaram os danos mecânicos e Lu; Peng (2006) determinaram a firmeza, utilizando a
validação cruzada e o modelo de regressão multi-linear (MLR).
No Brasil, a utilização da espectroscopia NIR para o controle de qualidade de
frutas ainda é incipiente, mesmo com frutos de importância econômica, como é o pêssego.
No Rio Grande do Sul a espectroscopia NIR foi utilizada para avaliar o ponto de
maturação de pêssegos Chimarrita em função do índice de diferença de absorbância por
meio da análise de regressão polinomial (BOTH et al., 2010). Recentemente Betemps et
al. (2014) utilizaram a espectroscopia NIR para a determinação de sólidos solúveis e
firmeza em quatro cultivares de pêssegos: Chimarrita, Maciel, Eldorado e Jubileu, todas
produzidas também na região Sul do Brasil.
4
Diante do exposto, a importância de determinar os atributos sólidos solúveis e
firmeza utilizando uma técnica não destrutiva e não invasiva como a espectroscopia do
infravermelho próximo, associada a ferramentas quimiométricas, irá contribuir para uma
melhor classificação na casa de embalagens, destinando assim, frutos com maior
qualidade para o mercado consumidor.
5
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método analítico não destrutivo
utilizando a espectroscopia do infravermelho próximo associada à técnicas
quimiométricas de predição para o controle de qualidade de frutos íntegros de pessegueiro
‘Aurora 1’ quanto ao teor de sólidos solúveis e firmeza.
2.2 Objetivo Específico
Desenvolver um modelo de regressão por mínimos quadrados parciais (PLS) tanto
para sólidos solúveis quanto para firmeza em frutos íntegros do pessegueiro ‘Aurora 1’.
Verificar se o estádio de maturação dos frutos e época de colheita influenciam nos
modelos desenvolvidos.
6
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 O pessegueiro
O pessegueiro pertence à família Rosaceae, subfamília Prunoídea, gênero Prunus
que abrange as cultivares exploradas comercialmente, sendo estas destinadas tanto para
o consumo in natura quanto para a industrialização (DAREZZO, 1998; ZANETE;
BIASE, 2004).
A China é o principal produtor mundial de pêssego, com uma produção de
aproximadamente 12 milhões de toneladas, em seguida se destaca a Itália e os Estados
Unidos da América (EUA). Na América Latina, o Chile é o principal produtor, sendo o
oitavo produtor mundial com 325.000 mil toneladas, depois se destaca a Argentina. O
Brasil ocupa a décima terceira posição entre os países produtores de pêssego (FAOSTAT,
2015).
Proveniente da China, o pessegueiro é cientificamente denominado de Prunus
persica L. (Batsch). Há relatos de que esta espécie começou a ser cultivada vários séculos
antes de Cristo. Porém, no Brasil, foi introduzida por volta do ano 1532, no município de
São Vicente – São Paulo (SP), com mudas provenientes da Ilha da Madeira (MEDEIROS;
RASEIRA, 1998) e, a partir daí foi disseminada pelo país.
Atualmente, a área cultivada com pessegueiros ultrapassa 23.000 mil hectares,
sendo o estado do Rio Grande do Sul o maior produtor nacional (MEZZOMO et al.,
2010), e o estado de São Paulo o segundo, com aproximadamente 2.800 mil hectares
(LEONEL et al., 2011). A produção nacional de pêssego em 2013 foi de 217.706 mil
toneladas, com uma rentabilidade de R$ 312.059,00 milhões (IBGE, 2015).
Tradicionalmente cultivado em regiões de clima temperado, o pessegueiro
necessita de baixas temperaturas para o seu desenvolvimento e produção (MEDEIROS;
RASEIRA, 1998). Entretanto, é possível o seu cultivo em regiões subtropicais e tropicais,
devido ao desenvolvimento de diversas técnicas agronômicas, tais como: poda, aplicação
de reguladores de crescimento, controle de irrigação, manejo do solo, melhoramento
genético, dentre outras.
O zoneamento agrícola para a cultura do pessegueiro no estado de São Paulo foi
regulamentado pela Portaria nº 60, de 17 de fevereiro de 2011, e abrange
aproximadamente 253 munícipios aptos para o cultivo desta espécie (MAPA, 2015).
7
3.1.1 A cultivar Aurora 1
A cultivar Aurora-1 (IAC 680-179) foi desenvolvida pelo programa de
melhoramento genético do Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Planta vigorosa, de
maturação precoce, excepcional produtividade e pouco exigente em frio. Medeiros;
Raseira (1998) relataram que a cv. Aurora-1 necessita de menos de 200 horas de frio,
enquanto que as cultivares Eldorado e Riograndense requerem aproximadamente 300
horas e a cultivar Granito exige no mínimo 400 horas de frio para completar o ciclo
produtivo. A colheita dos frutos da cv. Aurora -1 inicia-se em meados de outubro e
estende-se até o final de novembro, porém, em condições de temperaturas elevadas a
maturação torna-se ainda mais precoce.
O fruto do pessegueiro é classificado como um fruto simples, pois é formado por
apenas um ovário. Além disso, é carnoso indeiscente, ou seja, é uma drupa carnosa onde
a polpa (mesocarpo) envolve o caroço (endocarpo) e este não se abre visando a liberação
da semente (OLIVEIRA et al., 1998; CUNHA JÚNIOR, 2007).
As características dos frutos da cv. Aurora 1: tem massa média de 90 a 110g,
formato redondo oblongo, epiderme com fundo amarelado (cor de fundo) e matiz
vermelha intensa (cor de recobrimento), caroço pequeno e preso, polpa firme e amarelada
com auréola tênue ao redor do caroço, sabor acentuadamente doce, baixa acidez (pH 4,6)
e teor de sólidos solúveis em torno de 14°Brix (MEDEIROS; RASEIRA, 1998;
DONADIO, 2010). Os frutos destinam-se ao mercado in natura e devido à firmeza da
polpa são mais resistentes ao manuseio e à conservação pós-colheita (OJIMA et al.,
1989). O fruto da cv. Aurora-1, quando maduro, apresenta a epiderme de fundo amarelo
e coloração vermelha cobrindo 80% da superfície (PEREIRA et al., 2002).
3.2 Aspectos pós-colheita
O pêssego é um fruto climatérico (CAMPBELL; PADILLA-ZAKOUR, 2013), o
que implica na continuidade do processo de amadurecimento mesmo após a colheita,
resultante do aumento da produção de etileno e, consequentemente, na elevação da taxa
respiratória (BONORA et al., 2013). Logo, esta questão restringe o armazenamento dos
frutos.
O amadurecimento do fruto do pessegueiro envolve muitos processos bioquímicos
e fisiológicos, como a degradação de clorofila e amido, a biossíntese de pigmentos e
compostos voláteis, o acúmulo de açúcares e ácidos orgânicos bem como as modificações
da estrutura e composição de polissacarídeos da parede celular (JIANG et al., 2013).
8
Estudos também revelam que mesmo para pêssegos utilizados para a produção de
conserva, a maturação tem influência sobre o sabor do fruto (SLAUGHTER et al., 2013),
visto que o teor de açúcares aumenta aproximadamente 10% em frutos climatéricos
(MARTINS et al., 2013).
3.2.1 Coloração
Os pêssegos apresentam coloração externa e interna muito atrativa. Esta coloração
é dada por pigmentos formados por compostos carotenóides que possuem propriedades
funcionais (TEIXEIRA et al., 1983a). Além dos carotenóides, os pêssegos possuem
compostos fenólicos (CAMPBELL; PADILLA-ZAKOUR, 2013), recomendados à
alimentação, devido seus efeitos benéficos à saúde. Os carotenóides e os compostos
fenólicos estão presentes em maior quantidade na epiderme do fruto (CAMPBELL;
PADILLA-ZAKOUR, 2013).
Os frutos de polpa clara são geralmente mais doces e macios, propícios para o
consumo in natura, além disso, possuem boa relação polpa/caroço, são poucos fibrosos,
e algumas cultivares são ricas em vitamina A e cálcio (CHITARRA; CARVALHO,
1985). Além do consumo in natura, o pêssego é considerado uma das frutas com melhores
características para serem utilizadas em conservas, com grande potencial de
aproveitamento industrial (MAURAYAMA, 1973).
A coloração do fruto também exerce influência em sua aceitação por parte dos
consumidores, sendo o fator mais evidente e talvez o principal relacionado à
caracterização da qualidade em frutos in natura e em produtos enlatados. Um estudo
realizado em 1965, com 2.277 consumidores, avaliou a aceitação dos frutos de
pessegueiro em conserva quanto a coloração da polpa, sendo essa dividida em três
categorias, (amarelo pálido: valores de cor L* = 57,8, a* = 8,1 e b* = 33,5; meio laranja:
L* = 62,6, a* = 9,3, e b* = 37,3; e laranja profundo: L* = 54,5, a* = 11,9, b* = 33,9). Os
frutos amarelos pálidos foram reprovados por 56% dos consumidores, enquanto que os
meios laranja e os de cor laranja profundo foram aceitos por 97% e 84% dos
consumidores, respectivamente (CZERKASKYJ, 1971 apud SLAUGHTER et al., 2013).
Quanto a coloração da epiderme, os frutos de coloração mais intensa têm maior
preferência por parte dos consumidores (CHITARRA, M.; CHITARRA, A., 1990).
Trevisan et al. (2006) avaliaram a preferência dos consumidores de frutos de pessegueiro
in natura pela coloração da epiderme, sendo os frutos verdes avaliados de forma negativa,
os frutos de coloração amarelada tinham 34% de aceitação, contudo os frutos de coloração
9
avermelhada, associada ao maior teor de sólidos solúveis, representaram a maior
porcentagem com 38% de aceitabilidade.
Segundo Slaughter et al. (2013) a coloração da epiderme não tem uma relação
linear com a coloração da polpa, ou seja, as alterações na coloração da epiderme não
refletem quaisquer mudanças consistente na coloração da polpa. Nota-se que a coloração
é um dos parâmetros de qualidade que influenciam na aceitação por parte do consumidor,
pois ela se refere a aparência do produto.
A colheita dos frutos do pessegueiro está relacionada as mudanças no tamanho e
alterações na coloração da epiderme, atributos que não representam fielmente o estádio
de maturação ideal para sua comercialização, pois não considera os parâmetros físico-
químicos. Além disso, a coloração dos frutos também está associada a disponibilidade de
radiação solar no interior da copa das árvores (LAYNE et al., 2001).
Os frutos podem ser classificados quanto a coloração da epiderme utilizando a
região equatorial da cor de fundo, pelo ângulo hue (°h). Os frutos maduros apresentam °h
variando de 80 - 106º e frutos de maturidade fisiológica, conhecido como ‘de vez’,
compreendem °h de 100 - 115º (CUNHA JUNIOR et al., 2007).
Desta forma, o produtor deve avaliar a colheita dos frutos em função do seu
destino, ou seja, o ponto de maturação ideal de acordo com a oferta para o mercado. Para
o mercado próximo ou venda direta ao consumidor, os frutos devem ser colhidos
maduros, com as características organolépticas desejáveis pelo consumidor e com certa
firmeza para resistir ao manuseio e ao transporte. No entanto, os frutos que serão
armazenados antes da comercialização, devem estar firmes, porém o seu processo de
amadurecimento já iniciado, com o objetivo de evitar distúrbios fisiológicos que possam
interferir na qualidade final do produto (MEDEIROS; RASEIRA, 1998).
3.2.2 Firmeza
A firmeza se refere à resistência mecânica, ou seja, o quanto as frutas e hortaliças
suportam o estresse de impacto e compressão, enquanto que a textura está relacionada
com a uniformidade, aspereza, regularidade, densidade e solidez (FERREIRA, 2011). A
perda da firmeza do fruto também está associada aos processos fisiológicos que ocorrem
durante a maturação, o amadurecimento na árvore e/ou durante o manuseio pós-colheita
(VALERO et al., 2007).
A firmeza é um dos atributos de qualidade avaliada pelo consumidor, pois está
associada à resistência ao transporte e à vida de prateleira (MATIAS et al., 2013). A perda
10
excessiva da firmeza é avaliada pelo consumidor como um fruto sobremaduro, conhecido
popularmente como “passado”, ou seja, no seu estádio de senescência. Portanto, esta
propriedade relaciona-se diretamente ao valor econômico do produto e deveria ser
avaliada no processo de classificação dos frutos de pessegueiro.
De maneira geral, as técnicas analíticas utilizadas para a determinação da firmeza
são destrutivas, pois avaliam a pressão de turgescência celular, ou seja, depende da
turgidez, da pressão celular (FERREIRA, 2011), geralmente são analisadas por um
instrumento aplanador ou um penetrômetro, levando a perda do material analisado.
As alterações da firmeza do fruto são determinadas, em grande parte, pela parede
celular e pelos polissacarídeos da lamela média. Os polissacarídeos da parede celular
consistem principalmente de pectina, hemicelulose e celulose, enquanto que a lamela
média é constituída por compostos pécticos ligados ao cálcio (ZHANG et al., 2010). A
pectina está relacionada ao processo de amadurecimento dos frutos (FISHMAN et al.,
1993) e é caracterizada como um homopolissacarídeo formado por monômeros de ácido
galacturônico organizados em cadeias lineares de α1,4 D-ácido galacturônico, constituída
por grupos carboxílicos que podem estar esterificados com metanol (COULTATE, 1998).
Segundo Fishman et al. (1993) o amaciamento em frutos de pessegueiro é
acompanhado pela conversão das pectinas insolúveis em pectinas solúveis. Nos frutos
imaturos os ácidos carboxílicos ligados ao cálcio formam o pectato de cálcio que é
insolúvel. Com o processo de amadurecimento ocorre a liberação do cálcio, por ação da
enzima pectinametilesterase (PME) e a solubilização das protopectinas da parede celular
pela ação das enzimas protopectinases, tornando assim a estrutura do fruto macia,
produzindo os ácidos pectínicos (quando esterificados aos grupos metílicos) ou ácidos
pécticos (quando não esterficados), também conhecidos como pectinas solúveis. O
metabolismo das protopectinas tornam a parede celular mais macia, aumentando o teor
das pectinas solúveis (CHITARRA, M.; CHITARRA, A., 1990).
De acordo com Kader (2002), frutos de pessegueiro quando apresentam firmeza
entre 27 – 36N são considerados “prontos para compra” e entre 9 – 13N estão “prontos
para o consumo”.
3.2.3 Sólidos solúveis e ácidos orgânicos
Os açúcares representam de 65 a 85% do teor de sólidos solúveis, desta forma a
determinação do SS é um método indireto para se quantificar o teor de açúcares presentes
nos frutos. A determinação do teor de SS é uma técnica simples, que pode ser executada
11
no próprio campo com o auxílio de refratômetro manual e não requer pessoal técnico
especializado. Este teor pode ser expresso em porcentagem e/ou em graus Brix (Brix)
(CHITARRA, M.; CHITARRA, A., 1990).
O grau Brix é um índice influenciado por todos os componentes solúveis presentes
no citoplasma das células vegetais (MONTEVECCHI et al., 2012). No entanto, os graus
Brix pertencem a uma escala que indica a porcentagem de sacarose em uma solução pura
desse açúcar em água. Em uma solução de sacarose pura, um grau Brix é igual a 1%
(g/100g) de sacarose, em suco de frutas, um grau Brix se relaciona a 1% (g/100g) de
sólidos solúveis em solução (LIMA et al., 2008).
Os açúcares e os ácidos orgânicos são os componentes primários que conferem o
“flavor”, que é influenciado pela quantidade e composição do tipo de açúcares, ácidos
orgânicos e metabolitos secundários acumulados nas frutas. O conteúdo de açúcares e
ácidos das frutas fazem parte de um processo dinâmico durante o crescimento e
desenvolvimento do fruto, necessários para a alteração do sabor da fruta, e implementação
de funções fisiológicas correspondentes (JIANG et al., 2013).
Há quatro tipos de açúcares primários no pêssego: sacarose, glicose, frutose e
sorbitol (WU et al., 2005), sendo que a sacarose corresponde a 80,6%. O fruto no estádio
maduro apresenta um aumento significativo do teor de sacarose, sugerindo ainda que a
sacarose é a forma primária de acúmulo após a fase de crescimento do pêssego (JIANG
et al., 2013).
Durante o desenvolvimento, a biossíntese de polissacarídeos foi relacionada ao
aumento dos SS, que progrediu de 10 °Brix, no nonagésimo dia após a antese (abertura
das folhas), para 11 ºBrix, no centésimo décimo primeiro dia a antese (CUNHA JÚNIOR
et al., 2007).
Golding et al. (2006) relataram que o teor de sólidos solúveis pode variar em até
4% no interior dos pessegueiros maduros, sendo esta variação do núcleo do tecido e o
fruto inteiro. De acordo com Jiang et al. (2013), os açúcares estão distribuídos em três
compartimentos no pêssego: vacúolos, citoplasma e espaço livre e, essa distribuição varia
de acordo com o estádio de maturação. Em frutos imaturos os açúcares estariam em maior
concentração no espaço livre e nos frutos maduros em maior concentração nos vacúolos.
Os ácidos orgânicos malato, citrato, quinato e chiquimato também estão presentes
em diferentes compartimentos nos frutos de pessegueiro. Nos frutos maduros, 77,3% dos
ácidos orgânicos se relacionam ao ácido málico (JIANG et al., 2013). Wu et al. (2005)
relataram que quanto maior a quantidade de sacarose menor a quantidade de ácidos
12
orgânicos, especificamente o ácido quinínico. Porém, Jiang et al. (2013) relataram
discreto aumento na quantidade total de ácidos em frutos no estádio maturo em relação
aos imaturos, e um aumento significativo na quantidade de sacarose nos frutos maduros.
Para Montevecchi et al. (2012), a doçura da fruta não está relacionada somente com o
conteúdo de açúcar, mas é amplamente controlada pela acidez, que atua com efeito
antagônico.
Bonora et al. (2013) compararam os frutos no mesmo estádio de maturação com
relação a sua distribuição no dossel (copa) da árvore e os valores mais altos de SS foram
observados nos localizados na parte superior da árvore (topo), quando comparados
àqueles posicionados na região mediana e camadas inferiores do dossel. Sobretudo, os
valores de acidez titulável foram menores nos frutos na parte média da árvore. Os frutos
menores estariam na parte inferior no dossel, devido à menor exposição à luz, que afetam
a oferta de carboidratos e o crescimento dos frutos. Consequentemente isto influenciaria
a maturidade, pois os frutos na parte superior externa recebem maior quantidade de
radiação solar, atingindo a maturidade fisiológica primeiro do que os que estão na parte
inferior e interior da copa.
Medeiros; Raseira (1998) relataram que a temperatura também tem grande
influência no teor de sólidos solúveis. No verão, temperaturas altas durante o dia e
temperaturas amenas durante à noite, proporcionam frutos com maior teor de sólidos
solúveis, porém temperaturas amenas no verão produziriam frutos com sabor
adstringente.
3.2.4 Padrões de qualidade
Considerando a importância econômica da cultura do pessegueiro, se faz
necessário a melhora das práticas pós-colheita. De maneira geral, os produtores se
limitam a colher manualmente os frutos maturos, no estádio de maturação comercial
(qualquer estádio de maturidade do fruto, podendo ser desde o início do desenvolvimento
até a senescência), sendo os frutos depositados e transportados em recipientes plásticos
com capacidade de 18 kg. Bonora et al. (2013) relataram que a colheita dos frutos maturos
é avaliada pela experiência do agricultor, que é determinado pelos parâmetros de
coloração e tamanho. A cada colheita, os frutos devem atingir uma cor de fundo amarelo
aceitável, sendo escolhidos e divididos em classes de diâmetro homogêneo.
Na casa de embalagem (packing house), os pêssegos são selecionados com a
retirada dos frutos mal formados, dos que têm lesões mecânicas e com sintomas de
13
doenças e, em alguns casos, classificados de acordo com as Normas de Classificação de
Pêssego e Nectarina estabelecidos pelo Programa Brasileiro para a Modernização da
Horticultura & Produção Integrada de Frutas (CEAGESP, 2008). Nesta classificação o
lote de pêssego é caracterizado por seu grupo, coloração de polpa (subgrupo), tamanho
(classe) e categoria (qualidade). Contudo, não há nestas normas de classificação nenhuma
menção aos parâmetros físicos e químicos de qualidade, tais como firmeza e teor de
sólidos solúveis e acidez titulável.
O teor de SS é um importante atributo de qualidade para o consumidor final.
Crisosto et al. (2003) avaliaram a aceitação de pêssegos pelos consumidores em função
do teor de sólidos solúveis. Estes autores observaram que a cv. Elegant Lady, de polpa
amarela, obteve 70% de aceitação para os frutos com teor de SS de 13% e quando os
valores de SS eram inferiores a 11%, estes frutos tinham pouca receptividade pelos
consumidores. Para a cv. Ivory Princess, de polpa branca, quando o teor de SS foi de 16%,
os frutos tiveram aprovação de 100% pelos consumidores, enquanto que os frutos com
valores abaixo de 10% de SS foram rejeitados por aproximadamente 70% dos mesmos.
Desta forma, a concentração mínima de sólidos solúveis totais para satisfazer a
maioria dos consumidores, é de 11%. No entanto, em condições comerciais, grande parte
da safra não alcança estes valores por diversas razões, devido condições climáticas
adversas, poda inadequada no verão, uso indiscriminado de fertilizantes, e crescimento
inadequado (GOLDING et al., 2006).
A classificação dos frutos de pessegueiro com base no teor de SS poderia
alavancar a comercialização desta fruta, pois os frutos ofertados no mercado interno
apresentam teores de sólidos solúveis com valores entre 7,9 e 17 °Brix, (CERETTA et
al., 2000; OLIVEIRA; CEREDA, 2003; OLIVEIRA, 2009; MEDEIROS; RASEIRA,
1998; MATIAS et al., 2013).
O Departamento de Alimentação e Agricultura da Califórnia (CDFA) ainda utiliza
para os frutos de pessegueiros em conserva, métodos destrutivos de análise. Para a
coloração, o fruto é cortado e a cor da polpa é comparada com a cor de um padrão de
referência da indústria, utilizando um disco de cor. Para a firmeza, há inspetores
inicialmente treinados, que avaliam os frutos pelo toque, e quando a fruta é considerada
como possivelmente mole demais, os frutos são submetidos a um teste de firmeza da
polpa com o penetrômetro (SLAUGHTER et al., 2013).
Os métodos tradicionais para a quantificação dos atributos físicos e químicos na
etapa de pós-colheita, como por exemplo, os teores de sólidos solúveis, açúcares, acidez
14
titulável e pH geralmente são simples, porém destrutivos e relativamente demorados,
sendo inviáveis para a completa análises dos frutos, além de não representar
fidedignamente todo o lote, pois exigem instrumentos distintos de análise, além de gerar
resíduos químicos. Sendo assim, para que esses atributos de qualidade sejam avaliados
de imediato, analisados simultaneamente e quando necessário, produzir a reprodutividade
destas análises, é essencial um método que também seja preciso, mas sobretudo não
destrutivo e rápido. Deste modo, uma possível alternativa é a utilização de técnicas não
instrumentais não destrutivas.
3.3 Espectroscopia do infravermelho próximo (NIR)
3.3.1 Princípios
A região do infravermelho é dividida em três regiões denominadas de:
infravermelho próximo, que vai de 0,8 μm à 2,5 μm ou 12.500 – 4.000 cm-1;
infravermelho médio: 2,5 μm à 50 μm ou 4.000 – 200 cm-1; e infravermelho distante: 50
μm a 1.000 μm ou 200 – 10 cm-1 (MENDHAM et al., 2002). Nestas regiões são medidas
as vibrações dos átomos de hidrogênio (H) ligados ao oxigênio (O), nitrogênio (N) e
carbono (C).
Segundo Pasquini (2003), a espectroscopia do infravermelho próximo é um tipo
de espectroscopia vibracional que emprega a energia dos fótons (hv) na faixa de 2,65 x
10-19 a 7,96 x 10-20 Jaules (J), que corresponde a faixa de comprimento de onda de 750 a
2.500 nm (13.000 a 4.000 cm-1).
A espectroscopia NIR é uma técnica relacionada ao processo de pesquisa das
propriedades da matéria, fornecendo informações sobre a estrutura físico-química através
de sua interação com a radiação eletromagnética, em uma frequência específica
(HARRIS; BERTOLUCCI, 1978). Tal efeito ocorre quando os conteúdos energéticos da
radiação infravermelha incidente são similares aos campos elétricos gerados pelas
ligações químicas, sendo associados a comprimentos de ondas específicos. A radiação
infravermelha corresponde a faixa de energia de frequências vibracionais de estiramento
e dobramento das ligações covalentes. As moléculas são excitadas atingindo um estado
de maior energia, sendo este processo quantificado.
Dentre as características da espectroscopia NIR, as mais significantes são:
velocidade (um minuto ou menos por amostra), aplicação universal (qualquer molécula
15
contento C-H; N-H; S-H ou bandas de O-H), necessita de mínimo preparo das amostras
e não é destrutivo (PASQUINI, 2003).
3.3.2 Absorção
A absorção da espectroscopia do infravermelho próximo situa-se entre 8 a 40
kj/mol. Neste processo são absorvidas as frequências vibracionais naturais da molécula
analisada e a energia absorvida serve para aumentar a amplitude dos movimentos
vibracionais das ligações nas moléculas (PAVIA et al., 2012). Para amostras líquidas, a
absorção da energia da luz segue a Lei de Beer-Lambert, a qual descreve a propriedade
de absorção da luz das substâncias em relação à concentração de um constituinte, ou seja,
uma relação linear entre a absorbância e a concentração (PASQUINI, 2003).
Segundo Nicolaï et al. (2007) a radiação emitida pela espectroscopia NIR incide
sobre a amostra, logo esta pode ser obtida de diferentes maneiras dependendo da posição
da fonte de luz e o detector, sendo por reflectância, transmitância ou interactância (Figura
1), contudo também depende da composição química e parâmetros físicos da amostra
(PASQUINI, 2003). Na aquisição espectral por reflectância a fonte de luz e o detector são
posicionados em um ângulo de 45º, na transmitância a fonte de luz é posicionada de frente
para o detector, entretanto no modo de interactância a fonte de luz e o detector são
colocados paralelamente um para o outro.
Figura 1. Os espectros NIR podem ser obtidos por (a) reflectância, (b) transmitância ou (c)
interactância. Adaptado de Nicolaï et al. (2007).
16
A propagação de radiação NIR em frutas e vegetais atinge sua microestrutura, e
pode ser útil para verificar as propriedades relacionadas à microestrutura, como a rigidez,
danos internos, e até mesmo atributos sensoriais. Portanto, esta técnica permite analisar a
amostra, obtendo informações qualitativas e quantitativas proveniente da interação das
ondas eletromagnéticas do infravermelho próximo, com seus constituintes.
3.4 Quimiometria
A área de conhecimento denominada quimiometria, tem suas origens da química,
sendo descrita por Swede, Svante Wold e Bruce R. Kowalski (OTTO, 2007). Relata-se
que seu início ocorreu por volta de 1970, onde o acesso aos sistemas computacionais
permitiu a outros grupos, que não engenheiros e matemáticos, fizessem uso desta
ferramenta (OTTO, 2007; BRERETON, 2014).
A quimiometria é uma área de conhecimento interdisciplinar, que abrange
modelos matemáticos, estatísticos e ciências da computação, permitindo extrair o máximo
das informações dos dados químicos analisados (GEMPERLINE, 2006). Em 1974, foi
fundada a Sociedade de Quimiometria Internacional. Após alguns anos, foram
organizadas uma série de conferências. Atualmente, já é possível encontrar periódicos
específicos voltadas para a área da quimiometria (OTTO, 2007).
Algumas das aplicações das análises quimiométricas envolvem a calibração,
validação, predição, testes de significância e otimização das mensurações químicas em
procedimentos experimentais (GEMPERLINE, 2006).
As análises quimiométricas são de fundamental importância para a utilização da
espectroscopia NIR, pois embora a técnica seja um método de análise rápida e que permite
analisar vários atributos ao mesmo tempo, a técnica gera uma grande quantidade de dados,
além de ruído espectral. Walsh (2005) relata que a espectroscopia NIR se baseia em uma
abordagem estatística multivariada para descobrir a relação entre a absorção espectral na
região do infravermelho e o atributo de interesse. Pasquini (2003) relata que a
quimiometria e a técnica da espectroscopia NIR evoluíram em simbiose. Desta forma, é
indispensável a utilização da quimiometria, pois através da análise exploratória é possível
a compreensão dos dados, além de verificar a tendência das amostras, detectar amostras
anômalas, simplificar as bases de dados, e por fim, extrair o máximo de informações.
Há dois métodos de análise exploratória: os supervisionados e dentre eles: Análise
Linear Discriminante (Linear Discriminant Analysis- LDA); K-ésimo Vizinho mais
17
Próximo (K-Nearest Neighbor- KNN); Análise Discriminante- por mínimos quadrados
parciais (Partial Least Square Discriminant Analysis PLS-DA); e Soft-Independent
Modeling of Class Analogy (SIMCA). E no método não supervisionado tem-se: a Análise
de Componentes Principais (Principal Component Analysis- PCA) e a Análise de
Agrupamentos Hierárquicos (Hierarchical Cluster Analysis- HCA). No método
supervisionado é importante conhecer a amostra, ou seja, é preciso informações sobre a
amostra, para que a classe seja determinada com base nestas informações. Por outro lado,
quando não se conhece a amostra é possível realizar a análise exploratória pelo método
não supervisionado (POPPI; SOUZA, 2012).
Além da análise exploratória, que é amplamente utilizada nas análises
quimiométricas, também é possível realizar o pré-processamento dos dados espectrais,
construção dos modelos de calibração para análises quantitativas e qualitativas e modelos
de transferência (MOGHIMI et al., 2010).
As técnicas de pré-processamento dos dados espectrais visam remover
informações irrelevantes relacionados aos fenômenos físicos contidos nos espectros
(NICOLAÏ et al., 2007; RINNAN et al., 2009). Dentre as técnicas de pré-processamento,
encontram-se os métodos de correção de dispersão, são eles: a correção de sinal
multiplicativo (Multiplicative Scatter Correction - MSC) (MARTENS; NAES, 1994), a
variação normal padrão (Standard normal variate- SNV) (BARNES et al., 1989), e o De-
trend (RINNAN et al., 2009). Os derivados espectrais que se referem ao alisamento dos
espectros, sendo às derivadas de Savitsky-Golay (SAVITSKY; GOLAY 1964) e Norris-
Willians (RINNAN et al., 2009).
Para a construção do conjunto de calibração, deve-se incluir amostras que
proporcionem todas as possíveis fontes de variação, a fim de aumentar a robustez do
modelo de calibração, mesmo que isso influencie na predição de futuras amostras, pois
geralmente diminui a precisão dos modelos de predição (SÁNCHEZ et al., 2011).
Os modelos de calibração mais utilizados para os espectros NIR são: regressão
por mínimos quadrados parciais (Partial Least Squares – PLS) e a regressão por
componentes principais (Principal Component Regression - PCR). O modelo PLS é um
pouco melhor do que o PCR, pois não inclui as variáveis latentes de menor importância
para descrever a variação dos parâmetros de qualidade (MOGHIMI et al., 2010).
18
3.4.1 Análise de componentes principais (PCA)
A análise de componentes principais é utilizada com o objetivo de visualizar a
estrutura dos dados, encontrar similaridades entre amostras, detectar amostras anômalas
(outliers) e reduzir a dimensionalidade do conjunto de dados, baseados nas medidas
multivariadas das amostras (WU et al., 1997; LYRA et al., 2010). A PCA é o fundamento
para diversos métodos de reconhecimento de padrões, classificação e calibração
multivariada (POPPI; SOUZA, 2012).
A PCA é uma análise exploratória classificada como método não supervisionado,
pois não requer quaisquer informações sobre a natureza da amostra, sendo que o objetivo
é identificar possíveis agrupamentos. Os métodos não supervisionados permitem a
interpretação multivariada de conjuntos de dados complexos por meio de gráficos bi ou
tridimensionais (POPPI; SOUZA, 2012).
Poppi; Souza (2012) explicam que a PCA é um método que permite diminuir a
dimensionalidade por meio da representação do conjunto de dados em um novo sistema
de eixos, denominados de componentes principais (PC), sendo possível a visualização da
natureza multivariada dos dados em poucas dimensões.
Para a construção da matriz, dispõe-se nas linhas as amostras e nas colunas os
dados de referência, e as medidas instrumentais, que são as variáveis. Considerando um
gráfico, seja bi ou tridimensional, cada amostra corresponde a um ponto no espaço, e a
variável a dimensão no espaço, logo, cada componente principal descreve a variação ou
espalhamento entre os pontos usando o menor número possível de eixos (FERREIRA et
al., 1999).
Na PCA, a matriz X é decomposta em duas matrizes, sendo escores (T) e pesos
(P), e mais uma matriz de erros (E). Os escores se referem à similaridade das amostras,
estes representam as coordenadas das amostras no sistema de eixos formados pelas
componentes principais. Os pesos (loadings) representam o quanto cada variável
contribui para cada componente principal, sendo assim, é possível verificar qual variável
contribui para o agrupamento observado no gráfico de escores. Desta forma, a
porcentagem de variância explicada é determinada pelo número de componentes
principais que represente a maior porcentagem da variação presente no conjunto de dados
(POPPI; SOUZA, 2012).
19
3.4.2 Regressão por mínimos quadrados parciais (PLS)
Os modelos por mínimos quadrados parciais (PLS) derivam um conjunto de
variáveis latentes (VL) por decomposição simultânea das variáveis de resposta e de
previsão. As informações espectrais NIR são decompostas na matriz (X) e as informações
das concentrações de referência (matriz Y) utilizadas ao mesmo tempo, associando as
mesmas a fim de se obter uma relação linear na fase de calibração (MARTENS; NAES,
1994). Para a construção do modelo, retiram-se informações do conjunto de dados da
matriz espectral (matriz X), que são correlacionadas com as informações retiradas do
conjunto de dados de referência (matriz Y). Por meio de combinações lineares dos dados
espectroscópicos (matriz X) e dos dados de referência (matriz Y), se obtém o número de
variáveis latentes necessárias para correlacionar os espectros e as concentrações.
Para a construção do modelo de calibração é usado um número de variáveis
latentes que proporcione o menor erro padrão de previsão (SEP), ou seja, que as
diferenças entre os valores de referência e os valores previstos sejam os menores. No
entanto, há outros parâmetros estatísticos que devem ser considerados na construção dos
modelos: erros quadráticos médios para a calibração (RMSEC), erros quadráticos médios
de validação externa (RMSEVE) e erros quadráticos médios de predição (RMSEP), além
do coeficiente de determinação para calibração (R2C), coeficiente de determinação para
validação externa (R2VE) e predição (R2
P), e pelo desvio do resíduo de predição (RPD)
(NICOLAÏ et al., 2007).
Segundo Nicolaï et al. (2007) os valores de RPD se referem a acurácia dos
modelos, um RPD entre 1,5 e 2 significa que o modelo pode discriminar valores baixos
de valores altos da variável resposta; valores entre 2 e 2,5 indicam que previsões
quantitativas grosseiras são possíveis; valores entre 2,5 e 3 correspondem a uma boa
predição; e valores acima são modelos de excelente precisão.
Ainda não há trabalhos publicados com cultivares brasileiras de clima subtropical
e tropical utilizando a espectroscopia do infravermelho próximo. Desta forma, valores
conhecidos de sólidos solúveis e firmeza poderiam proporcionar maior rentabilidade à
cadeia produtiva, ao se agregar valor ao produto em função de uma garantia da qualidade
dos frutos à serem comercializados.
20
3.4.3 Aplicações
Em 1965, Norris e colaboradores aplicaram esta técnica pela primeira vez para
avaliar o teor de umidade em grãos (NORRIS; HART, 1965). A partir de então ela tem
sido utilizada para análises rápidas de determinação do teor de umidade, proteína e
lipídios, de uma variedade de produtos agrícolas e alimentícios (DAVIES; GRANT, 1987
apud NICOLAÏ et al., 2007).
As aplicações mais antigas em produtos hortícolas visavam a determinação do
teor de matéria-seca em cebola (BIRTH et al., 1985 apud NICOLAÏ et al., 2007), sólidos
solúveis em maçã (BELLON-MARUEL, 1992 apud NICOLAÏ et al., 2007) e umidade
em champignon (ROY et al., 1993 apud NICOLAÏ et al., 2007). No entanto, há diversas
outras aplicações que incluem a determinação da composição química de forragens
(ALOMAR et al., 1999; FONTANELI et al., 2004), de café (MORGANO et al., 2005),
de cana-de-açúcar (VALDERRAMA et al., 2007), e o controle de qualidade de
medicamentos (SIMON DE SOUZA; FERRÃO, 2006; ALCALÀ et al., 2013).
Há alguns estudos que avaliaram a qualidade interna de frutas e vegetais, como
em maçã (XIAOBO et al., 2007; GIOVANELLI et al., 2014), pêra (CAVACO et al.,
2009; XU et al., 2012), kiwi (SCHAARE; FRASER, 2000; MOGHIMI et al., 2010),
tomate (SHAO et al., 2007; TIWARI et al., 2013), e ameixas (VALERO et al., 2007;
LOUW; THERON, 2010).
Considerando frutos de nectarina, Peano et al. (2006) avaliaram três cultivares
isoladamente e relataram um erro padrão de calibração (SEC) variando entre 0,47 a 0,71
ºBrix e o coeficiente de determinação (R²) de 0,75 a 0,86 para a predição de SS. Para
firmeza, o SEC variou entre 4,12 a 8,14 N e o R² de 0,45 a 0,66. Sánchez et al. (2011)
analisaram nectarinas comparando o método de regressão linear modified partial least
squares (MPLS) ao método de regressão não linear com algoritmo Local. Estes autores
relataram discreta melhora ao se utilizar o algoritmo Local, relatando um SEP de 0,75
ºBrix e R² de 0,87 para o teor de sólidos solúveis, e um SEP de 20,61N e R² de 0,68 para
a firmeza. Golic; Walsh (2006) desenvolveram um modelo combinado para diversas
variedades de pêssegos e nectarinas, e estes relataram valores de R² superiores a 0,88 e
valores de erros quadráticos médios de validação cruzada (RMSECV) variando de 0,53 a
0,88 ºBrix.
A espectroscopia NIR já foi utilizada em frutos de pessegueiro para avaliar vários
atributos, para determinação de SS por Kawano et al., 1992; Walsh et al., 2004 (apud
NICOLAÏ et al., 2007). Slaughter, 1995 (apud NICOLAÏ et al., 2007) analisou o teor de
21
sorbitol e clorofila; Carlomagno et al. (2004) analisaram a maturação, além da técnica
que vem sendo utilizada com imagem multi-hiperespectral, onde Zwiggelaar et al. (1996)
avaliaram os danos mecânicos e Lu; Peng (2006) determinaram a firmeza, utilizando a
validação cruzada e o modelo de regressão multi- linear (MLR).
Shao et al. (2011) analisaram o teor de SS de duas cultivares de pêssegos e
compararam o método não linear Independent Component Analysis (IAC) ao método
linear Partial Least Squares (PLS) e obtiveram melhores resultados pelo método não
linear IAC, com valores de R² de 0,95 e RMSEP de 0,42 ºBrix. Golding et al. (2006)
utilizaram o NIR portátil para avaliar o SS em diferentes estádios de maturidade de
pêssegos, os valores foram RMSECV de 0,36 e R² de 0,91. Ying et al. (2005) também
investigaram o teor de SS em duas cultivares de pêssego, no entanto analisaram os
espectros originais e após a aplicação da primeira e segunda derivada de Savitsky-Golay,
sendo que o melhor modelo foi utilizando os espectros originais onde obtiveram SEP de
0,12 e o R² de 0,90.
Da mesma forma que os sólidos solúveis, a espectroscopia NIR também já foi
utilizada para a determinação da firmeza em frutos de pessegueiro. No entanto, o uso da
espectroscopia NIR para a predição da firmeza se baseia nas informações relacionadas,
principalmente, às propriedades físicas (espalhamento de luz), ao contrário dos sólidos
solúveis que utilizam as propriedades químicas (absorção da luz) dos tecidos biológicos
(PASQUINI, 2003; NICOLAÏ et al., 2007).
Utilizando modelo PLS e somente frutos da variedade Calrico, Lafuente et al.
(2014), desenvolveram modelos para a predição de firmeza com 5 variáveis latentes, RCV²
de 0,77, RMSECV de 0,9 MT (Magness- Taylor test), e RPD de 1,97. Fu et al. (2008),
avaliaram a firmeza de diferentes variedades de pêssegos obtidos em comércio local, com
espectros de reflectância difusa e obtiveram valores de R2 de 0,87, RMSECV de 6,23N e
SEP de 5,42N.
No Brasil, a utilização da espectroscopia NIR para o controle de qualidade de
frutas ainda é incipiente, mesmo com frutos de importância econômica, como é o pêssego.
No Rio Grande do Sul a espectroscopia NIR foi utilizada para avaliar o ponto de
maturação de pêssegos Chimarrita em função do índice de diferença de absorbância por
meio da análise de regressão polinomial (BOTH et al., 2010). Embora estes autores
tenham usado a regressão polinomial, esta não é a mais indicada para estudos com a
espectroscopia NIR, pois estes apenas corrigem as diferenças entre os valores de
referência e os obtidos pelos espectrômetros.
22
Recentemente Betemps et al. (2014) utilizaram a espectroscopia NIR para a
determinação de sólidos solúveis e firmeza em pêssegos das cultivares Chimarrita,
Maciel, Eldorado e Jubileu, todas produzidas na região Sul do Brasil. Os valores relatados
do SEC variaram de 0,35 a 0,55 °Brix para SS e 3,73 a 7,75 N para firmeza. Os modelos
de calibração ficam melhores quando são utilizadas diferentes variedades e épocas de
colheitas distintas, apresentando resultados superiores quando as variedades são
analisadas individualmente (TIWARI et al., 2013). Contudo, há outras variáveis que
podem influenciar nos modelos de predição como: região geográfica, temperatura, tempo
de colheita, e a própria cultivar (GOLIC; WALSH, 2006).
23
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CAPÍTULO 2
33
Robust PLS models for soluble solids content and firmness in low chilling peach
using near-infrared spectroscopy (NIR)
Paloma Andrade Martins Nascimentoa, Lívia Cirino de Carvalhoa, Luís Carlos Cunha
Júniorb, Fabíola Manhas Verbi Pereirac, Gustavo Henrique de Almeida Teixeirad,*
aUniversidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas
(FCFAR), Campus de Araraquara. Rod. Araraquara- Jaú, km.1 s/n, Araraquara – SP,
Brazil.
bUniversidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão
Preto (FCFRP), Av. do Café s/n, Ribeirão Preto – SP, Brazil.
cUniversidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química (IQ), Campus de
Araraquara. Rua Prof. Francisco Degni, 55, Araraquara – SP, Brazil.
dUniversidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
(FCAV), Via de acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n, Jaboticabal – SP, Brazil. CEP:
14.870-900.
*Corresponding author: Tel.: +55 16 3209-7532
E-mail address: [email protected]
ABSTRACT
The objectives of this study was to develop partial least square (PLS) models using NIR
spectroscopy for the determination of SSC and firmness in intact low chilling ‘Aurora-1’
peach fruit, and verify the influence of maturity stage and harvest season on the models
to be developed (robustness). FT-NIR spectra were obtained as log 1/R with fruit
harvested in 2013 at 3 maturity stages and in 2014. The spectra were collected on the
background and blush colour skin areas of the each fruit. Model performance was
evaluated based on the values of root mean square error for prediction (RMSEP) and
coefficient of determination (RP2) obtained from validation fruit set (Kennard-Stone), and
prediction fruit set (2014). PCA could not group the fruit based on blush and background
skin colour, maturity stages, and harvest season. The model constructed using the external
validation method obtained a RMSEVE of 1.08 % with 11 latent variables (LVS) and a
34
RVE2 of 0.59. The prediction set, independent data, resulting in a less accurate model
(RMSEP 1.04 %, Rp2 0.45 and 11 LVS). The same trend happened for determining
firmness with the external validation resulting in better model with RMSEVE 9.51 N and
RVE2 of 0.40 and the prediction set with RMSEP of 13.2 N, RP
2 0.40 with 7 LVS. The NIR
spectroscopy showed to be a potential analytical method to determine SSC and firmness
of intact low chilling ‘Aurora 1’ cultivar. However, it is necessary to optimize the models
in other to reduce the prediction errors.
Keywords: Prunus persica L., Aurora 1, maturity stages, chemometrics, PLS.
1. Introduction
In temperate regions peach trees (Prunus persica L.) require exposure to chilling
temperatures during the winter to overcome the rest period, after which normal bud break
and development can occur (Viti et al., 2010; Campoy et al., 2011). The duration of
chilling length required to bud break of a given cultivar is known as the chilling
requirement of that particular cultivar (Wagner Junior et al., 2013), and it varies greatly
from 1,050 hours in ‘Contender’ to 600 hours in ‘La Feliciana’ (Parker and Werner,
2015). On the other hand, in subtropical and tropical regions the cultivation of peach trees
is possible due to agronomic innovations and the development of low chilling cultivars,
which require low exposure to chilling temperatures (100 to 200 hours).
In Florida, USA, Ferguson et al. (2008) reported various low chilling cultivars,
such as, ‘Flor da Prince’ and ‘Tropical beauty’ with 150 hours estimated chilling units,
and ‘UFSun’ with 100 hours. In subtropical regions of Brazil the cultivation of peach
trees is carried out also with low chilling cultivars originated from local breading
programs, for example the cultivar Aurora 1 (Ojima, 1989). The cultivar Aurora-1
requires less than the 100 hours of chilling period to bud break. Its fruit has oblong shape,
weights around 100 g, and presents a red blush colour (80% colour over yellow
background), and the fruit has also excellent sensory quality, with firm flesh, yellow pulp,
and high soluble solids content (SSC), approximately 14% (Cunha Junior et al., 2007;
Donadio, 2010).
Peach quality is greatly affected by the soluble solids content and it influences the
acceptance of peach fruit by the consumers. Crisosto et al. (2003) reported 70% consumer
acceptance when ‘Elegant Lady’ peach had 13% of SSC, on the other hand, when SSC
were less than 11% there was little receptivity by consumers. Consumers also evaluate
35
the firmness as an important quality parameter. Kader (2002) reported that fruit with a
firmness of 27 to 36 Newton (N) can be considered “ready-to-buy” and with 9 to 13 N
considered ripe “ready-to-eat”.
The determination of SSC and firmness are based on simple analytical methods
(A.O.A.C. 1997), but both determinations are destructive, time for consuming, and are
not adequate to monitor peach quality in modern grading lines. One alternative method is
the use of near infrared (NIR) spectroscopy as method to determine internal quality
attributes of various fruit (Nicolaï et al., 2007; Mariani et al., 2014; Viegas et al., 2016).
Regarding peach fruit, Golic and Walsh (2006) developed a combined model for several
peach and nectarine cultivars to determine SSC. Golding et al. (2006) used a portable NIR
to predict SSC in peach fruit at different maturity stages. The development of models to
predict SSC in peach fruit is the most common use of NIR spectroscopy (Ying et al.,
2005; Shao et al., 2011), but firmness (Fu et al., 2008; Lafuente et al., 2015) and flesh
colour (Slaughter et al., 2013) were also studied. Although various studies can be found
regarding the use of NIR spectroscopy evaluating peach fruit quality, the developed
models were built based on cultivars with high chilling requirements and with fruit
produced in temperate regions. These models cannot be used in subtropical and/or tropical
regions to monitor peach quality, as the cultivars and environment are very different, thus,
it is necessary the development of models for peach fruit produced in these conditions.
Therefore, the objectives of this study was to develop partial least square (PLS)
models using NIR spectroscopy for the determination of SSC and firmness in intact low
chilling ‘Aurora-1’ peach fruit, and verify the influence of maturity stage and harvest
season on the models to be developed (robustness).
2. Materials and Methods
2.1. Fruit material
Peach fruit were harvest in commercial orchards of Val Frutas, located at Vista
Alegre do Alto, São Paulo, Brazil, (21º10’14” S latitude, 48º37’45” W longitude, and 700
m altitude). A total of 539 intact peach fruit of the low chilling cultivar Aurora 1 were
collected in 2013 and 2014. The fruit were harvest in three maturity stages, as such:
physiological mature (100 to 115 hue angle), ripe (106 to 80 hue angle), and over-ripe
(hue angle lower than 80) based on the recommendations of Cunha Junior et al. (2007).
The fruit were also harvested at the beginning, in the middle and at the end of the crop
36
season in 2013 to build the calibration and validation models, and at the beginning of the
harvest season in 2014, to build the prediction model (Table 1).
Table 1. Descriptive statistics of the calibration and validation set (2013), and the
prediction set (2014) classified with the classic Kernnard-Stone selection algorithm. Soluble Solids Content (SSC - %) Firmness (Newton - N)
Group N1 Mean SD2 Maximum Minimum Mean SD Maximum Minimum
Calibration 340 11.2 1.66 17.6 6.6 44.1 14.7 111.7 4.9
Validation 90 11.4 1.68 16.0 6.3 42.1 12.2 78.4 10.8
Prediction 109 12.7 1.38 17.0 9.2 53.9 13.9 84.3 15.7
1N = number, 2SD = standard deviation.
2.2. FT-NIR spectra acquisition
The spectra were collected using a FT-IR Spectrum 100N (PerkinElmer, Shelton,
CT, USA). The spectrometer was equipped with Near Infrared Reflectance Accessory
(NIRA), an integrating sphere and InGaAs detector. The light source was a halogen lamp.
Diffuse reflectance spectra were obtained over the range of 4,000 to 10,000 cm-1 (1,000
to 2,500 nm) at a spectral resolution of 8 cm-1 with 64 scans per spectra. The log 1/R
spectra were referred as absorbance spectra for convenience.
Fruit were set onto the NIRA and two spectra were collected on the equator of
both sides of each fruit (blush and background colour), equidistant from proximal and
distal ends (Subedi et al., 2007). Each spectrum was used as individual sample in the
models. After spectra acquisition, fruit were subjected to analytical determinations,
considering the same areas of spectral analysis.
2.3 Reference analysis
2.3.1. Colour
L*, a* and b* colour coordinates were determined using a Minolta colorimeter
CR 400 (Minolta, Osaka, Japan). L measures luminosity, while a* and b* values index
the red–green and yellow–blue space, respectively. Determinations were taken on the two
sides of each fruit (blush and background colour) at the same areas where the NIR spectra
were acquired. It was also calculated the hue angle, arc tangent of (b * / a *), and
chromaticity, (C *) ([(a *) x 2 + (b *) x 2] x 0.5) according to the method described by
McGuire (1992). Fruit were reclassified according to the maturation stages by the hue
37
angle according to Cunha Junior et al. (2007), physiological mature (100 to 115 °), ripe
(106 to 80 °) and over-ripe (hue angle of < 80 °).
2.3.2. Firmness
Firmness was determined using a penetrometer Bishop FT 327, Italy, using an 8
mm tip. The results were expressed in Newton (N), on the same two positions where the
NIR spectra were acquired. The laboratory error for this determination was 4.02 N.
2.3.3. Soluble solids content (SSC)
The fruit parts where the NIR spectra were collected were also used to analysed
the soluble solids content according to the reference method 920.151 reported by
A.O.A.C. (1997). It was used a refractometer (Alpha, Atago Co., Ltd, Japan). The
measurements were carried out in duplicate and the results were expressed in percentage
(%). The laboratory error for this determination was 0.4%.
2.4. Chemometrics
The Unscrambler version 10.3 (Camo, Oslo, Norway) was used for data analysis.
Spectra were pre-processed using Standard Normal Variate (SNV), Multiplicative Scatter
Correction (MSC), SNV+ De-Trend, second polynomial order of the first (d1A) of
Savitzky–Golay with smoothing window five points (2+2).
Calibration and validation models were developed using the data set from 2013
(430 fruit). The samples were divided into two groups, the calibration set (n=340) and
validation set (n=90) using the classic selection algorithm of Kernnard-Stone (Kennard
and Stone, 1969). The prediction was carried out using the samples from 2014 (n=109)
which were not included in the calibration set (Table 1). Principal Component Analysis
was considered to study the influence of the external variables (maturity stages, harvest
seasons, and year) to build Partial Least Squares Regression (PLSR) models. Model
performance was described by the statistical terms of coefficient of determination of
calibration (Rc2), the root mean square error of calibration (RMSEC), coefficient of
determination of external validation (RVE2), the root mean square error of external
validation (RMSEVE) and prediction, coefficient of determination of prediction (RP2), root
mean square error of prediction (RMSEP), bias corrected RMSEP, and ratio of the
standard deviation of SSC and firmness to bias corrected RMSEP (SDRp) (Golic and
Walsh, 2006; Nicolaï et al., 2007).
38
3. Results and discussion
3.1. NIR spectra
The mean raw NIR spectra of each harvest can be seen in Figure 1A. The spectra
showed two important regions and spectra were dominated by the presence of water. As
intact peach fruit have 85 – 95% moisture the predominant peaks were related to OH
stretch observed between 1,400 – 1,500 nm and at 1,900 – 2,000 nm, related to the OH
asymmetric stretch and bending combinations (Osborne et al., 1993). Two other small
peaks were observed between 1,100 – 1,200 nm and at 1,800 nm being related to the
presence of sugar, which are the second and third CH overtone, respectively (Osborne et
al., 1993; Louw and Theron, 2010). Light scattering was observed and it was mainly due
to the presence of velvet skin in ‘Aurora 1’ peach fruit. In other to reduce the influence
of light scattering and the base line drift various pre-processing were applied to the
spectra, and MSC and first derivative of Savitsky-Golay with five smoothing point (d1A)
were considered the best results (Figure 1B and 1C).
39
Figure 1. NIR spectra, raw spectra (A); multiplicative scatter correction (MSC) (B); first derivative of
Savitsky-Golay (d1A) (C).
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500
Ab
so
rban
ce (l
og
= 1
/R)
Wavelenght (nm)
Harvest 1 Harvest 2 Harvest 3 Harvest 4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500
Ab
so
rba
nc
e (
log
= 1
/R)
aft
er
MS
C
Wavelenght (nm)
Harvest 1 Harvest 2 Harvest 3 Harvest 4
-0,006
-0,001
0,004
0,009
0,014
0,019
0,024
0,029
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500
Ab
so
rba
nc
e (
log
= 1
/R)
aft
er
d¹A
Wavelenght (nm)
Harvest 1 Harvest 2 Harvest 3 Harvest 4
A
B
C
40
3.2.Principal component analysis (PCA)
PCA was used to observe the variations due to spectra acquisition (blush and
background colour), harvest season and maturity stage (Figure 2). For PCA it was used a
total of 539 fruit, which corresponded to 1,078 spectra with no pre-processing.
As ‘Aurora 1’ peach fruit has the skin with two colours (blush and background
colour) and this differences could influence the development of PLS models, the NIR
spectra were collected in both colour regions. However, it was not observed any cluster
formation between the samples (Figure 2A) with PC1 and PC2 representing 98% of the
data explained variance. This result can be an advantage, because regardless of the
property to be analysed, there is no need to place the fruit in a specific position for NIR
spectra acquisition. On the other hand, when PCA was carried out using the CIE colour
parameters it was possible to separate the fruit based on blush and background colour
(Figure 2B).
PCA was also carried out to verify the differences between harvest seasons with
fruit harvested at the beginning (harvest 1), in the middle (harvest 2) and at the end of the
harvest season (harvest 3) in 2013, and at the beginning of the harvest season in 2014
(harvest 4), Figure 2C. Again there was no cluster formation among harvest seasons with
the samples presenting the same distribution with PC1 and PC2 also representing 98% of
the variance. Using the colour parameters it was also not possible to separate fruit base
on the different harvests (Figure 2D).
Similarly, to the other variations, the differences in maturity stages
(physiologically mature, ripe, and over-ripe) did not form any cluster with samples
overlapping regardless the maturity stage (Figure 2E). On the other hand, with the CIE
colour parameters is was possible to separate the fruit based on the different maturity
stages (Figure 2F), showing that the fruit were physiologically different, but the NIR
could not detect such differences. Although the PCA did not showed any difference
between the sample variations the incorporation of these variability are of paramount
importance. Tiwari et al. (2013) reported superior performance when models were
developed with the incorporation of different cultivars and harvest seasons. Nicolaï et al.
(2007) also highlighted the necessity to incorporate into the models as much information
as possible to obtain a robust prediction model.
Likewise, there was no cluster formation among the variations of the samples
when the NIR spectra were pre-processed (data not shown).
41
Figure 2. Scores of PC1 and PC2 from the principal component analysis based on NIR spectra (A, C, and
E) and CIE colour parameters (B, D, and F). Bush and background colour (A-B), harvest seasons (C-D),
and maturity stages (E-F).
3.3. PLS prediction models: soluble solids content (SSC)
The descriptive statistics of the sample set for SSC can be seen in Table 1. The
calibration statistics of the PLS models obtained with the raw and pre-processed NIR
spectra (MSC, SNV, SNV+ De-trend and d1A) are shown in Table 2. The best
performance of the SSC calibration model was developed with NIR spectra pre-processed
with MSC and SNV (Table 2), both were used to reduce the influence of light scattering.
These models had the lowest values of RMSEC (1.01 – 1.02 %) and higher Rc2 (0.63). For
the validation set using Kennard-Stone algorithm, the best results were also obtained with
MSC and SNV with a RMSEVE of 1.08 and 1.09 %, respectively, and a RVE2 of 0.59 and
0.58. The robustness of the developed model was tested using an external prediction set
composed by fruit from a difference year (2014). Again, the MSC and SNV pre-
42
processing resulted in better prediction models with both showing a SEP of 1.02 %, RP2
of 0.45 and RPD of 1.36. The comparison between the predicted SSC values and the
values obtained with the reference method are shown in Figure 3.
Table 2. Performance of PLS models developed using NIR spectra of intact ‘Aurora 1’
peach fruit for soluble solids determination (%). Calibration External validation Prediction
RMSEC RC2 RMSEVE RVE
2 RMSEP SEP RP2 RPD
PLS (11), original 1.07 0.59 1.15 0.53 1.05 1.02 0.45 1.35
PLS (11), MSC 1.01 0.63 1.08 0.59 1.04 1.02 0.45 1.36
PLS (11), SNV 1.02 0.63 1.09 0.58 1.04 1.03 0.45 1.36
PLS (11) SNV + De trend 1.01 0.63 1.08 0.59 1.04 1.03 0.45 1.36
PLS (11), d1A 0.89 0.72 1.35 0.36 1.29 1.11 0.40 1.10
a - RPD = standard deviation ratio (SD/RMSEP).
Although the determination coefficients (R2) of the validation and prediction sets
were below 0.70 (RVE2 = 0.59 and RP
2 = 0.45, respectively), the RMSEC and RMSEVE
were very low, ranging from 0.89 to 1.35 %, respectively. These results are in agreement
to Nicolaï et al. (2007), who reported values of 1.0 to 1.5 % as being consistent with
studies that used external validation groups, with fruit coming from different orchards
and periods of the year.
Figure 3. Reference (measured) and predicted values of soluble solids content (SSC - %) in intact peach
fruit ‘Aurora 1’. PLS regression MSC correction.
9
10
11
12
13
14
15
16
17
9 10 11 12 13 14 15 16 17
Measured soluble solids content (SSC- %)
NIR
pre
dic
ted
so
lub
les
oli
ds
co
nte
nt
(SS
C-
%)
SEP = 1.02
RP2 = 0.45
43
NIR spectroscopy has been used for the development of SSC prediction models
in other peach fruit cultivars. Shao et al. (2011) reported values RMSEP of 0.42 % and R²
of 0.95 in ‘Milu’ and ‘Hongxianju’ peach cultivars. Ying et al. (2005) also investigated
the SSC determination in ‘Honey’ and ‘Sweet’ peach cultivars, and reported SEP values
of 0.53 % and the R² of 0.92. Portable NIR spectrometer was also use to evaluate SSC in
peach fruit in different maturity stages by Golding et al. (2006), with a reported RMSECV
of 0.36 % and a R² of 0.91. All these studies showed better determination coefficients,
but the models were developed with cultivars grown in temperate regions, with higher
chilling requirements, and in different countries, therefore these models cannot be used
and/or transferred to subtropical and tropical peach growing regions. According to Golic
and Walsh (2006) many variables, e.g. temperature, geographic region, picking time,
cultivar, data pre-treatment and model algorithm, can affect the performance of a
predictive model. It is therefore expected that the model prediction statistics for a truly
independent population will be poorer than the calibration statistics (RMSEP > RMSECV).
The RPD values were considered very low (Table 2), in the prediction group it
was possible to get a RPD of 1.36, which can allows discrimination of fruit with low from
high SSC. According to Nicolaï et al. (2007), a model can discriminate variables with
low from high levels when the RPD values are between 1.5 and 2, a coarse quantitative
prediction is possible when the RPD values are between 2 and 2.5, and a good to excellent
prediction accuracy is possible when the values are between 2.5 and 3. Therefore, the
bigger the RPD value the better the model probability to predict the chemical composition
of external samples out of the calibration set (Smyth et al., 2008).
3.4. PLS prediction models: firmness
The descriptive statistics of the sample set for firmness can be seen in Table 1.
The calibration statistics of the PLS models obtained with the raw and pre-processed NIR
spectra (MSC, SNV, SNV+ De-trend, and d1A) are shown in Table 3.
44
Table 3. Performance of PLS models developed using NIR spectra of intact ‘Aurora 1’
peach fruit for fruit firmness (N). Models Calibration External validation Prediction
RMSEC RC2 RMSEVE RVE
2 RMSEP SEP RP2 aRPD
PLS (7), original 11.0 0.54 9.8 0.35 13.7 11.2 0.35 1.01
PLS (7), MSC 11.1 0.53 9.9 0.34 13.3 11.4 0.34 1.04
PLS (7), SNV 11.0 0.54 10.0 0.33 13.8 11.5 0.32 1.01
PLS (7) SNV + De trend 11.2 0.52 9.8 0.35 13.0 11.5 0.32 1.07
PLS (7), d1A 9.3 0.67 9.5 0.40 13.2 10.8 0.40 1.05
a - RPD = standard deviation ratio (SD/RMSEP).
Similar to Bobelyn et al., (2010), it was observed a lower performance for the PLS
firmness models with lower R2 values and higher errors than for SSC. The best
calibration, validation and prediction PLS firmness models performances were developed
with NIR spectra pre-processed with the first derivative of Savitsky-Golay (d1A), Table
3. The calibration model had the lowest RMSEC value (9.3 N) and highest Rc2 (0.67). The
external validation set also generated the lowest RMSEVE (9.5 N) and RVE2 (0.40).
Similarly, to SSC, the SEP values increased when the prediction was carried out using
the fruit from the 2014 harvest. The observed SEP was of 10.8 N and the RP2 of 0.40,
with a RDP of 1.05 (Table 3). One possible explanation of the performance obtained with
the prediction set was a severe drought in 2014 at the peach production area (CPTEC,
2015), which might have affected the fruit quality. However, the inclusion of all possible
sources of variation is imperative to increase the robustness of the models (Nicolaï et al.,
2007; Sánchez et al., 2011). The comparison between the predicted firmness values and
the reference values are shown in Figure 4.
45
Figure 4. Reference (measured) and predicted values of firmness (N) in intact peach fruit ‘Aurora 1’. PLS
regression with first derivative of Savitsky-Golay (d1A).
The NIR spectroscopy has been also used to determine firmness in peach fruit.
Using the cultivar ‘Calrico’, Lafuente et al. (2015) developed PLS models for predicting
firmness with a RMSECV of 0.9 MT (Magness-Taylor test), RCV² of 0.77, and a RPD of
1.97. Fu et al. (2008) determined firmness of different peach cultivars reported a RMSECV
of 6.3 N, SEP of 5.4 N and a R2 of 0.87. Betemps et al. (2014) using a NIR-Case of
Sacmi® reported SEP values ranging from 12.1 to 32.7 N and R2 from 0.16 to 0.63 for
the cultivars ‘Chimarrita’, ‘Maciel’, ‘Eldorado’ and ‘Jubileu’, all with high chilling
requirements peach cultivars. This variation shows that single cultivar models are
possibly more accurate and reliable than a multi cultivar model (Golic and Walsh, 2006).
However, Louw and Theron et al., (2010) reported that multi cultivar models have an
equal or better precision than single ones. The inclusion of different cultivars generates
more robust models. The RPD values for the firmness models (Table 3) were lower than
for SSC (Table 2). The prediction set model showed a RPD of just 1.05, which according
to Nicolaï et al. (2007) does not even allow quantitative predictions from low to high
levels.
Although robust calibration models are obtained using different cultivars and
different production years than analysing individual cultivar (Tiwari et al., 2013), our
results are the first attempt to use NIR spectroscopy to predict SSC and firmness in low
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ted
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ne
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(Ne
wto
n –
N)
Measured firmness (Newton - N)
SEP = 10.8
RP2 = 0.40
46
chilling peach fruit cultivar which incorporated variability regarding harvest season,
maturity stages to increase robustness.
4. Conclusions
PCA could not group the fruit based on blush and background skin colour,
maturity stages, and harvest season when NIR spectra was used, but when CIE colour
parameters were used it was possible to separate the fruit based on the blush and
background skin colour, and in function to the maturity stages.
The best SSC prediction model for an independent group was obtained with NIR
spectra pre-processed with MSC (SEP = 1.02 %, RP2 = 0.45, and RPD = 1.36), and for
firmness the best model was developed applying the first derivative of Savitsky-Golay
(SEP = 10.8 N, RP2 = 0.40, and RDP = 1.05).
The NIR spectroscopy showed to be a potential analytical method to determine
SSC and firmness of intact low chilling ‘Aurora 1’ cultivar. However, it is necessary to
optimize the models in other to reduce the prediction errors.
Acknowledgments
The authors would like to thank CAPES for the providing the Master scholarship
of the first author, and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) for funding this research: process number 2008/51408-1.
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