UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE … estadual paulista “julio de mesquita filho”...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS ARARAQUARA BIANCA BELON JANUARIO APLICAÇÃO DE CÓDIGOS DE BARRAS DE DNA (DNA BARCODING) NA IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Senna Mill. (Fabaceae) e Casearia Jacq. (Salicaceae) PARA ESTUDOS DE VARIABILIDADE GENÉTICA Araraquara- SP 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS ARARAQUARA
BIANCA BELON JANUARIO
APLICAÇÃO DE CÓDIGOS DE BARRAS DE DNA (DNA BARCODING) NA
IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Senna Mill. (Fabaceae) e Casearia Jacq.
(Salicaceae) PARA ESTUDOS DE VARIABILIDADE GENÉTICA
Araraquara- SP
2014
BIANCA BELON JANUARIO
APLICAÇÃO DE CÓDIGOS DE BARRAS DE DNA (DNA BARCODING) NA
IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Senna Mill. (Fabaceae) e Casearia Jacq.
(Salicaceae) PARA ESTUDOS DE VARIABILIDADE GENÉTICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à
Farmácia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências Farmacêuticas
como pré-requisito para obtenção do título de Mestre
em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia.
Orientadora: Profª. Drª. Regina Maria Barretto Cicarelli
Co-orientador: Dr. Marco Túlio Alves da Silva
Araraquara
2014
BIANCA BELON JANUARIO
APLICAÇÃO DE CÓDIGOS DE BARRAS DE DNA (DNA BARCODING) NA
IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Senna Mill. (Fabaceae) e Casearia Jacq.
(Salicaceae) PARA ESTUDOS DE VARIABILIDADE GENÉTICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia
Aplicadas à Farmácia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade
de Ciências Farmacêuticas, como pré-requisito para obtenção do grau de Mestre em
Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Regina Maria Barretto Cicarelli (orientadora)
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara
Prof. Dr. André Olmos Simões
Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP – Campinas
Prof. Dr. Ian Castro-Gamboa
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- UNESP - Araraquara
Araraquara, 16 de janeiro de 2014.
DEDICATÓRIA
Ao meu avô, Antonio Belon pela dedicação, e
por sempre ter me apoiado na busca e
realização dos meus sonhos.
AGRADECIMENTOS
À Deus por ter me acompanhado nessa jornada, que mesmo curta foi de grande
importância na minha vida.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP pela oportunidade de realizar este
trabalho, e ao programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de estudo, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp) pelo
auxílio financeiro.
À professora Regina Maria Barretto Cicarelli pela orientação e confiança em mim
depositadas, obrigado por ter me recebido em seu laboratório, compartilhado seus
conhecimentos, e por ter contribuído efetivamente no meu crescimento acadêmico profissional.
Ao Dr. Marco Túlio Alves da Silva pela co-orientação.
À professora Rejane Maria Tommasini Grotto pelo uso do analisador genético ABI 3500
utilizado para eletroforese capilar.
Aos professores Alberto José Cavalheiro, Maria Goretti de Vasconcellos Silva, Mariana
Helena Chaves, e Roseli Buzanelli Torres pela ajuda na coleta e identificação das plantas.
Aos meus pais, Sonia Maria Belon por sempre me apoiar nas minhas escolhas e na busca
por meus objetivos, e Dorlan Januario pelo incentivo e compreensão, sem vocês nada disso teria
acontecido.
Aos meu irmãos Diego Belon Januario e Martina Belon Januario por estarem sempre ao
meu lado e acompanhar meu crescimento.
A toda minha família que sempre torceu pelo meu sucesso tanto pessoal quanto
profissional e fazem partem desta minha conquista.
Aos meus amigos, que sempre me apoiam e torceram por mim.
À Fernanda Polverari e Cilene Mori, pela amizade e principalmente pelo apoio.
Ao grupo do laboratório, Danilo Braganholi, Isabela Brunelli, Flávia Alves, Andrea
Kohatsu, Naiara Sanches, Lis Arnosti, Ana Valéira Freitas pela amizade e ajuda que
prestaram nesses anos.
A todos, enfim, meu muito obrigada!
RESUMO
O Brasil é o país com maior diversidade biológica no mundo, sendo que os biomas
brasileiros possuem uma importância biológica inestimável para a flora e fauna. Projetos de
pesquisa, visam estabelecer uma estratégia consistente, moderna e integrada para a documentação
de acessos a espécies vegetais da flora brasileira, com foco em biomas como o Cerrado e
Caatinga. A falta de informações sobre o sistemas naturais causam impactos para a
biodiversidade mundial, estimulam diversas iniciativas para identificar, caracterizar e catalogar
espécies. O código de barras do DNA (DNA barcoding) vem como uma importante ferramenta no
auxílio dos pesquisadores. Embora bem padronizado para caracterização de amostras animais, o
estudo do código de barras de DNA em plantas mostrou-se mais complexo, sendo necessário a
análise de genes plastidiais e nucleares. Neste trabalho foram identificadas as espécies de plantas,
por DNA barcoding utilizando primers específicos, psbA-trnH (região intergênica de
cloroplastos), rbcl (gene que codifica uma proteína altamente conservada, a ribulose bifosfato
carboxilase) e ITS2 (espaçador interno transcrito da subunidade grande de DNA ribossomal). O
sucesso da amplificação ocorreu para os três pares de primers, mas ITS2 apresentou baixo
rendimento na PCR, nas espécies testadas, S. spectabilis, S. multijuga, S. splendida, S. alata, S.
trachypus, S. gardneri, S. macranthera, S. acuruensis, C. sylvestris, C. rupestres e C.
gossypiosperma. Os resultados do sequenciamento confirmaram o sucesso da amplificação; e o
alinhamento das sequências e a construção de árvores filogenéticas permitiu demonstrar a
aplicabilidade das regiões escolhidas neste estudo. Após as análises, a metodologia de DNA
Barcoding demonstrou ser eficiente para melhorar a identificação das espécies estudadas, com as
regiões psbA-trnH, rbcL e ITS2.
Palavras-chave: DNA Barcoding, Senna sp, Casearia sp, Cassia sp, variabilidade genética,
filogenia.
ABSTRACT
Brazil is the country wich has the richest biological diversity in the world, and the
brazilian biomes have an invaluable biological importance for flora and fauna. Research projects
aimed establish a consistent, modern and integrated strategy for documenting flora plant species,
focusing on biomes such as Cerrado and Caatinga. Lack of information about the natural systems
causes impacts on global biodiversity, stimulating initiatives to identify, characterize and catalog
species. DNA barcoding is an important tool to help the researchers. Although already standard
for characterize animals, the study of DNA barcode in plants is more complex, analysis of
nuclear and plastid genes is needed. In this work, the plant species were identified by DNA
barcoding using specific primers psbA-trnH (intergenic region of chloroplasts), rbcL (gene that
encodes a highly conserved protein, the ribulose bisphosphate carboxylase) and ITS2 (internal
transcribed spacer of the large subunit ribosomal DNA). The success of amplification was in
three pair of primers, but ITS2 showed low PCR sucess, the species tested are listed below, S.
spectabilis , S. multijuga, S. splendida, S. alata, S. trachypus, S. gardneri, S. macranthera, S.
acuruensis, C. sylvestris, C. rupestris and C. gossypiosperma . The results of sequencing
confirmed the successful amplification, and alignment of sequences and construction of
phylogenetic trees allowed to demonstrate the applicability of the selected regions in this study.
After analysis, the methodology of DNA Barcoding proved efficient for better species
identification, with psbA-trnH, rbcL and ITS2 region.
Keywords: DNA Barcoding, Senna sp, Casearia sp, Cassia sp, genetics, phylogeny variability.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Regiões mais utilizados como DNA Barcoding...................................................18
Figura 2. Representação esquemática do marcador rbcL. . ................................................ 19
Figura 3. Representação esquemática da região ITS ........................................................... 19
Figura 4. Região esquemática da região psbA-trnH. ........................................................... 20
Figura 5. Exemplares do gênero Senna ............................................................................... 23
Figura 6. Senna spectabilis .................................................................................................. 24
Figura 7. Casearia sylvestris................................................................................................25
Figura 8. Eletroforese em gel de agarose (1,0%) corado com brometo de etídio, dos produtos de
PCR amplificados do gênero Senna, com os primers específicos, psbA-trnH....................35
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose (1,0%) corado com brometo de etídio, dos produtos de
PCR amplificados do gênero Senna, com os primers específicos, rbcL..............................35
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose (1,0%) corado com brometo de etídio, dos produtos de
PCR amplificados do gênero Senna e Casearia, com os primers específicos, psbA-trnH e
rbcL......................................................................................................................................36
Figura 11. Eletroforese em gel de agarose (1,0%) corado com brometo de etídio, dos produtos de
PCR amplificados do gênero Senna e Casearia, com os primers específicos, ITS2...........37
Figura 12. . Árvores consenso bootstrap, construídas a partir do marcador psbA-trnH, rbcL e ITS2
com os gêneros Senna e Cassia..........................................................................................40
Figura 13. . Árvores consenso bootstrap, construídas a partir do marcador psbA-trnH, rbcL e ITS2
com o gênero Casearia........................................................................................................41
Figura 14. Média dos valores máximo e mínimo da distância intraespecífica e interespecífica com
o marcador psbA-trnH..........................................................................................................43
Figura 15 Média dos valores máximo e mínimo da distância intraespecífica e interespecífica com
o marcador rbcL...................................................................................................................44
Figura 16. Média dos valores máximo e mínimo da distância intraespecífica e interespecífica com
o marcador ITS2...................................................................................................................44
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Iniciadores utilizados na reação de PCR e sequenciamento.................................28
Tabela 2. Concentração das amostras utilizadas na reação de sequenciamento...................30
Tabela 3. Número de acesso das espécies obtidas no GenBank............................................33
Tabela 4. Indicadores de cada marcador e sucesso do sequenciamento...............................38
Tabela 5 Valores máximos e mínimos da distância intraespecífica e interespecífica, e Barcoding
gap.........................................................................................................................................43
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Base nitrogenada adenina
ATP Trifosfato de Adenosina
C Base nitrogenada citosina
CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio
dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfatado
DNA
DNA cp
Ácido desoxirribonucleico
DNA cloroplastidial
DNA mt DNA mitocondrial
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
G Base nitrogenada guanina
N Número
NCBI National Center for Biotechnology Information
PCR Polymerase Chain Reaction
qsp. Quantidade suficiente para
RPM Rotações por minuto
T Base nitrogenada timina
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem
°C Grau Celsius
cm Centímetro
G Grama
mL Mililitro
µL Microlitro
mM Milimolar
M Molar
µg Micrograma
ng Nanograma
mm Milímetro
pb Pares de base
pH Potencial hidrogeniônico
U Unidade
pmol Picomol
X Vezes
∞ Infinito
~ Aproximadamente
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
LISTA DE SÍMBOLOS
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................15
1.1 Brasil e a biodiversidade........................................................................................15
1.2 DNA Barcoding......................................................................................................16
1.3 Genoma das plantas e genes candidatos à DNA Barcoding..................................17
1.4 Genes utilizados neste trabalho ............................................................................. 18
1.5 Reconstrução filogenética ..................................................................................... 20
1.6 Famílias e gêneros estudados ................................................................................ 21
1.6.1 Gêneros Senna e Cassia ........................................................................................ 22
1.6.2 Gênero Casearia ....................................................................................................24
2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 25
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 26
3.1 Local e coleta das amostras................................................................................... 26
3.2 Preparo do material e extração de DNA ............................................................... 27
3.3 Confecção de primes (iniciadores)........................................................................ 27
3.4 Amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e purificação dos produtos
obtidos .............................................................................................................................. 28
3.5 Sequenciamento, purificação das sequências ....................................................... 29
3.6 Análise das sequências ......................................................................................... 31
3.7 Reconstrução Filogenética .................................................................................... 31
3.8 Análise interespecífica e intraespecífica ............................................................... 33
4 RESULTADOS ........................................................................................................... 34
4.1 Extração de DNA .................................................................................................. 34
4.2 PCR e purificação ................................................................................................. 34
4.3 Sequenciamento e alinhamento das sequências .................................................... 37
4.4 Reconstrução filogenética ..................................................................................... 39
4.5 Análise interespecífica e intraespecífica................................................................42
5 DISCUSSÃO................................................................................................................45
6 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 48
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 49
Apêndice A ......................................................................................................................... 55
Apêndice B...........................................................................................................................58
Apêndice C...........................................................................................................................60
Apêndice D...........................................................................................................................61
Apêncice E............................................................................................................................67
Apêndice F............................................................................................................................69
Apêndice G...........................................................................................................................70
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Brasil e a biodiversidade
O Brasil é um dos países com maior diversidade biológica no planeta, sendo muitas das
espécies endêmicas. Devido a sua dimensão continental e à grande variação geomorfológica e
climática, o Brasil abriga sete biomas, Amazônia, Mata Atlântica, Cerrado, Caatinga, Pampas,
Pantanal e Ambientes Costeiros (Manguezais), e muitos ecossistemas. A biodiversidade pode ser
qualificada pela diversidade em ecossistemas, em espécies biológicas, em endemismos e em
patrimônio genético. Nos ecossistemas brasileiros encontram-se espécies de essencial
importância medicinal, utilizadas através dos tempos por povos indígenas do (BRASIL, 2007).
Os biomas Cerrado e Caatinga possuem características interessantes para justificar suas
escolhas no contexto deste trabalho principalmente porque são biomas com características
próprias e genuinamente brasileiros. São reconhecidas 5.344 espécies vegetais na Caatinga
(GIULIETTI, CONCEIÇÃO, QUEIROZ, 2006), que é o único bioma exclusivo do Brasil,
ocupando, principalmente, a região Nordeste, além da porção norte do Estado de Minas Gerais.
Pode ser caracterizada pela vegetação do tipo savana estépica, pela longa estação seca, apesar
disso, tem sido descrita na literatura como uma região pobre de espécies (EITEN, 1982).
De acordo com o Ministério do Meio Ambiente (BRASIL, 2007), o Cerrado apresenta
elevada riqueza de espécies, sendo o segundo maior bioma brasileiro e compreende um conjunto
de ecossistemas, com vegetação arbustiva e arbórea, sendo a maior savana tropical do planeta,
onde estima-se a existência de mais de 6 mil espécies de árvores, 800 espécies de aves, além de
grande variedade de peixes e outras formas de vida. A maioria dessas espécies são endêmicas,
ou, quando não, certamente a sobrevivência em ambiente com características tão próprias
ocasionou a seleção de características particulares, tornando cerrado um hotspot de importância
mundial (CASTRO et al., 1999 e MYERS et al., 2002).
Desde os primórdios das civilizações, as plantas de um modo geral são de grande
importância tanto para alimentação, vestuário quanto para cultos religiosos, remédios, chás. As
angiospermas (plantas com flores e frutos) são o grupo mais diversificado de plantas, com cerca
de aproximadamente 300.000 espécies. A classificação das angiospermas passou por grandes
modificações nas últimas duas décadas e muitos grupos e famílias tradicionalmente reconhecidos
estão sendo revistos. As angiospermas podem ser erva, subarbusto, arbusto, árvore,
16
liana/volúvel/trepadeira, podem ser encontradas em todos domínios fitogeográficos como
Amazônia, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica, Pampa, Pantanal (FORZZA et al.,2012)
A falta de informação sobre os sistemas naturais, nos quais ocorrem plantas neotropicais,
e particularmente devido à mudança nesses sistemas sem o conhecimento prévio de fauna e flora
faz com que o impacto antropogênico aumente (BALMFORD et al., 2002; GONZALES et al.,
2009).
Atualmente, devido a preocupação mundial com a biodiversidade, cresce a necessidade
de programas de conservação capazes de associar mapeamento e planejamento com exploração
econômica. Por outro lado, é escasso, mesmo fragmentário, o número de profissionais que se
dedicam à identificação da biodiversidade (GARCIA, 1995).
1.2 DNA Barcoding
Atualmente, biólogos confrontam um planeta com milhões de espécies das quais,
proporcionalmente a esse número, poucas já foram identificadas; por isso têm sido desenvolvidas
técnicas moleculares denominadas DNA Barcoding ou "códigos de barra de DNA" (HEBERT et
al., 2003), que consiste em um sistema único e universal com o objetivo de identificar todos os
organismos em nível específico, utilizando-se sequências de regiões específicas do DNA.
O código de barras de DNA vem sendo utilizado para diversas aplicações biológicas, tais
como identificação de espécies crípticas, detecção de espécies invasivas no ecossistema, espécies
recentemente descritas, revisões taxonômicas, detecção de teias alimentares e relação entre
predador-presa, luta contra o comércio ilegal de espécies ameaçadas de extinção e madeira
extraída ilegalmente (COSTION et al., 2011)
O DNA Barcoding deve ter uma região ideal e que atenda à alguns critérios; para facilitar
a amplificação e o sequenciamento, o fragmento deve ter sequência com comprimento curto;
suficientemente variável para separar espécies irmãs; e apresentar sítios conservados para o
desenvolvimento de primers universais (FORD et al., 2009).
A possibilidade de existir um código de barras de DNA começou a ser proposta, estudada
e estabelecida, verificando-se a possibilidade de criar um sistema de identificação que consiste na
análise de pequenos fragmentos de DNA, na qual o código de barras para o reino animal poderia
se basear na diversidade de parte de uma sequência de um gene mitocondrial, a subunidade I da
17
citocromo oxidase (COI), gene com alto potencial discriminatório entre espécies próximas e
facilmente amplificável, fragmento com comprimento aproximado de 650 pares de bases (pb)
(HEBERT; GREGORY, 2005).
O grande objetivo do DNA Barcoding, é, fornecer um rápido, preciso e um método
automático para identificação das espécies utilizando regiões do DNA padronizadas ( HEBERT,
2003).
Nas plantas, especialmente as angiospermas, por apresentarem baixas taxas de
substituição de bases no DNA mitocondrial, divergências das regiões codificantes do gene COI
entre famílias de plantas com flores e por rapidamente terem a estrutura do seu genoma
mitocondrial modificada, levaram a busca de regiões barcoding alternativas, como as regiões de
plastídios que já estão sendo investigadas (KRESS et al, 2005; FAZEKAS et al., 2008; CBOL,
2009).
1.3 Genoma das plantas e genes para DNA Barcoding
O entendimento evolutivo e natureza genética das plantas até os dias de hoje continua
sendo complexa e limitada. A célula vegetal possui genomas de origem nuclear, mitocondrial
(DNAmt) e cloroplastídico (DNAcp), cada um com características que definem sua utilidade para
resolver questões evolutivas.
O núcleo é onde encontra-se grande parte das informações genéticas, porém no estudo do
genoma nuclear das angiospermas, são encontradas dificuldades devido ao seu grande tamanho e
complexidade (BENNETT, et al.,2000).
Atualmente, vários genes e espaços intergênicos tem sido identificados como significantes
marcadores evolucionários que vem sendo largamente utilizado em análises filogenéticas, além
da utilização para DNA Barcoding (RAVI et al., 2007).
Assim os genes utilizados para DNA Barcoding de plantas são de genomas de plastídios,
nuclear, mitocondrial, (Figura 1).
18
Figura 1. Regiões mais utilizados como DNA Barcoding de plantas.
Fonte: modificada de (http://www.mundoeducacao.com/biologia/plastidios.htm, http://www.emforma.net/11966-mitocondria,
http://www.picstopin.com/480/envoltura-nuclear-y-
nucleoloflv/http:%7C%7Ci*ytimg*com%7Cvi%7CWDwdgOkRSiM%7C0*jpg/, acesso em 01 e fevereiro de 2014)
1.4 Genes candidatos a DNA Barcoding utilizados neste trabalho
Os genes utilizados e testados neste trabalho são: rbcL (rbclaf – rbclajf634r), gene
codificante de uma proteína altamente conservada, a ribulose-1,5-bisfosfato ou Rubisco (Figura
2), possui comprimento aproximado de 1400 pb (FORD et al., 2009), porém na técnica de DNA
Barcoding, utiliza-se uma porção menor com aproximadamente 550 pb (STOECKLE et al.,
2011). Sua escolha como barcode foi adotada por ser um gene comum entre as plantas e pela sua
utilização histórica em estudos filogenéticos.
19
Figura 2: Representação esquemática do marcador rbcL. Primer forward - rbcLa (F) e reverse -
rbcLa (R) e rbcLajf634 (R)
Fonte: autor
O ITS (ITS1 e ITS2 – internal transcribed spacer), a aplicação deste marcador (Figura 3),
como DNA Barcoding, para a identificação molecular de plantas medicinais teve resultados
satisfatórios na diferenciação de várias espécies (CHEN et al., 2010). A região ribossomal nuclear
(DNAnr), 18S-26S, do espaço transcrito interno (ITS) tem provado ser uma região com boas
características para estudos filogenéticos em muitas famílias de angiospermas. Os dois
espaçadores podem ser utilizados, ITS1 e ITS2 (cada um com <300 pb), e podem ser
amplificados utilizando-se primers universais, (BALDWIN et al, 1995).
Figura 3. Representação esquemática da região ITS.
Fonte: autor
O psbA-trnH (espaçador intergênico não transcrito), (Figura 4), é facilmente amplificado e
sequenciado com apenas um par de primers na maioria dos taxa, apresenta alta variação de
nucleotídeos, com comprimento entre 200-500 pb na maioria das espécies de Angiospermas e
Gimnospermas. (KRESS et al., 2005).
20
Figura 4. Representação esquemática da região psbA-trnH.
Fonte: autor
O uso do DNA barcode como alternativa molecular para a identificação de espécies,
geralmente é feito através da comparação entre sequências do material de interesse, podendo este
ser colhido em qualquer estágio da vida do indivíduo, com aquelas depositadas em bancos de
sequências obtidas de amostras bem identificadas e que possuem material acessível.
Essas técnicas podem ser utilizadas como um recurso forense podendo, assim, confirmar e
auxiliar no reconhecimento de espécies de plantas sujeitas a biopirataria. Além disso, podem
auxiliar também em inventários florísticos e delimitações na taxonomia de espécies, onde nem
sempre é possível a coleta de indivíduos completos para a identificação taxonômica a partir de
padrões morfológicos (HEBERT et al., 2003).
1.5 Reconstrução filogenética
De acordo com os princípios da evolução, os seres vivos partilham de um único ancestral
comum, e os organismos são fontes de informação de sua própria história evolutiva, onde surge
interesse no estudo das relações de parentescos entre organismos, assim, a existência de conexões
entre espécies, ou filogenia nos remete a verificar como essas relações surgiram. Atualmente,
muitas abordagens e dados tanto moleculares como morfológicos foram sendo desenvolvidos
para inferir relações filogenéticas (AMORIM, 2002).
As árvores filogenéticas são utilizadas para representações evolutivas entre as espécies., e
do ponto de vista computacional estas árvores são representadas por grafos, onde cada grafo
21
representa uma unidade taxonômica e uma unidade do sistema de classificação de espécie,
podendo ser agrupamentos de gêneros ou até mesmo de reinos, ou a própria espécie.
As arestas representam as relações de herança genética ou parentesco entre as unidades
taxonômicas, estas arestas se forem orientadas ou se o grafo ou subgrafo possuir uma raiz, é
possível determinar quem é o ancestral e quem é o descendente numa relação. O padrão de
ramificação das arestas é chamado de topologia (OLIVEIRA, 2010).
Matrizes de distância são matrizes preenchidas com o valor das distâncias resultantes da
comparação entre cada dois objetos. Estes objetos podem ser, por exemplo, unidades
taxonômicas ou espécies. Estas distâncias são calculadas através de diversos modelos de
evolução tais como, por exemplo, os modelos Jukes-Cantor, Kimura, Dayho e Jones-Taylor-
Thornton (JTT) (OLIVEIRA, 2010). Após o cálculo das distâncias e preenchimento da matriz,
algoritmos tais como UPGMA e Neighbor-Joining (NJ) são utilizados para inferir agrupamentos
(clusters) filogenéticos. Neighbor-Joining (NJ); é um método para construção de clusters
introduzido por Saitou e Nei (1987) . Neste método, a matriz de distâncias utilizada não necessita
possuir apenas distâncias ultramétricas e as linhagens da árvore não precisam evoluir na mesma
taxa. Produz uma árvore binária e sem raiz.
1.6 Famílias e Gêneros estudados
Este trabalho trata-se de um estudo em relação à caracterização e uso dos códigos de
barras de DNA para a classificação de espécies, do gênero Senna, Cassia e Casearia. O NuBBE
– Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais estabelecido no
Instituto de Química da UNESP tem obtido resultados expressivos em seus estudos de
prospecção, na área de Química de Produtos Naturais. Este grupo de pesquisadores participa
desde o início do programa BIOTA-FAPESP, realizando estudos químicos na flora do Cerrado e
Mata Atlântica. A união de esforços e experiências entre os laboratórios da UNESP (IQ -
NuBBE, FCF, FC), Instituto de Botânica – SMA/SP, UFMG (DATAPLAMT), UFC (LOE, LPN
e CENAUREMN) e UFPI (Laboratórios de Produtos Naturais e de Farmacologia, BIOTEN) tem
como meta principal estabelecer uma estratégia consistente, moderna e integrada para a
documentação de acessos a espécies vegetais da flora brasileira, enfocando os biomas Cerrado e
22
Caatinga, incluindo a localização dos indivíduos identificação a partir de dados morfo-
anatômicos e genéticos (DNA Barcoding).
1.6.1 Gêneros Senna e Cassia
Estes dois gêneros encontram-se dentro da família Fabaceae. A família Fabaceae ou
Leguminosae compreende aproximadamente 727 gêneros e 19.325 espécies, sendo considerada a
terceira maior família de Angiosperma (LEWIS et al., 2005).
O gênero Senna pertence à família Leguminosae-Caesalpinioideae; é um gênero
pantropical constituído por aproximadamente 260 espécies, sendo que dessas, 200 ocorrem no
continente americano (RODRIGUES et al., 2005).
Atualmente, algumas das espécies que hoje pertencem ao gênero Senna estavam
anteriormente incluídas no gênero Cassia, a subtribo Cassinae que compreende três gêneros:
Cassia L., Senna Mill. e Chamaecrista Moench. As espécies de Chamaecrista e Senna estiveram
incluídas em Cassia até o tratamento taxonômico de Irwin e Barneby (1981), quando estes
gêneros foram separados, (VIEGAS JR. et al, 2006; RODRIGUES et al., 2010).
No Brasil o gênero Senna é constituído por 80 espécies, apesar do gênero não ser
endêmico no país, possui 26 endêmicas, 4 subespécies e 55 variedades (FORZZA et al., 2010;
SOUZA, BORTOLUZZI, 2013).
Algumas das espécies estudadas nete trabalho (apêndice A): Senna spectabilis, Senna
multijuga, Senna splendida, Senna alata, Senna trachypus, Senna gardneri, Senna macranthera,
Senna acuruensis, Senna cearensis, Senna rugosa e Senna occidentalis; (Figura 5 e 6). As
espécies de Senna são utilizadas na medicina tradicional e popular como purgativa, corante, anti-
inflamatória, analgésica, antiparasitária, inseticida, antitumoral, hepatoprotetora, (RODRIGUES
et al., 2010).
23
Figura 5. Exemplares do gênero Senna.
Senna alata Senna multijuga
Senna macranthera Senna spectabilis
Fonte: RODRIGUES, 2010.
24
Figura 6. Senna spectabilis
Fonte: (http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com.br/2011/11/senna-spectabilis-dc-hs-irwin-barneby.html, acesso
em 27 de junho de 2012.)
1.6.2 Gênero Casearia
O gênero Casearia é um membro pertencente à família Salicaceae, sendo Casearia
sylvestris Swartz (Flacourtiaceae) uma árvore altamente distribuída dentro de vários ecossistemas
da América do Sul, como o Cerrado, Mata Atlântica e Amazônia (MARQUETE et al., 2013). Na
medicina popular brasileira, o uso dessa planta está relacionada com propriedades
farmacológicas, incluindo atividades anti-inflamatória, antiofídica, antiulcerativa. No Brasil, C.
sylvestris é popularmente conhecida como “guaçatonga”, palavra de origem “Tupi-Guarani”, o
que indica uma antiga exploração de comunidades nativas do Brasil (SANTOS, 2007).
Recentemente, estudos moleculares, ecológicos, químicos e filogenéticos, fez a
aproximação de várias famílias, incluindo Flacorticaceae e Salicaceae, fazendo com que a família
Flacourtiaceae fosse extinta e a maioria dos gêneros permutasse para a família Salicaceae,
incluindo Casearia (SOUZA, LORENZI; 2005).
As espécimes relacionadas para este trabalho foram: Casearia sylvestris var. lingua,
Casearia sylvestris var. sylvestris (Figura 7), Casearia sylvestris intermediaria, Casearia
gosspypiosperma e Casearia rupestres.
25
Figura 7. Casearia sylvestris
Fonte: Eduardo L. H. Giehl (http://www.ppmac.org/content/gua%C3%A7atonga acesso em 26 de novembro de
2013)
Todas as espécies utilizadas neste trabalho possuem alguma dificuldade na classificação
pelos modelos clássicos, baseados na morfologia; assim o presente projeto apresenta relevância e
importância na avaliação da biodiversidade de espécies de plantas medicinais brasileiras, visando
um melhor entendimento dessas espécies.
Além disso, a análise filogenética pelo código de barras do DNA (DNA Barcoding) pode
trazer perspectivas interessantes na ampliação desses estudos para outras áreas da biodiversidade
brasileira.
2 OBJETIVOS
Este trabalho possui como objetivo, a aplicação da metodologia do código de barras do
DNA (DNA Barcoding) na classificação genética de espécies da flora brasileira, com os
marcadores psbA-trnH, rbcL e ITS2, em especial dos gênero Senna, Cassia e Casearia, para
comparação interespecífica e intraespecífica.
26
3 MATERIAIS E MÉTODOS
A metodologia utilizada empregou a extração de DNA genômico das diversas espécimes
estudadas (apêndice A), que foram utilizadas em reações de amplificação por PCR de regiões
marcadoras específicas do DNA genômico, na dependência da espécie, seguido do
sequenciamento, e comparação dos gêneros nos bancos de dados internacionais como o BLAST
(ZHANG,2000; MORGULIS,2008) do NCBI (National Center for Biotechnology Information), e
assim utilizar ferramentas de bioinformática para a identificação e elaboração de árvores
filogenéticas.
3.1 Local e coleta das amostras
O material foi coletado em regiões diferentes do país (nordeste e sudeste). As espécies do
gênero Senna; Senna multijuga, Senna splendida, Senna alata, Senna trachypus, Senna gardneri,
Senna macranthera, Senna acuruensis, Senna rugosa, Senna cearenses e Senna occidentalis,
foram cedidas pela Profa. Dra. Maria Goretti de Vasconcelos Silva, da Universidade Federal do
Ceará, e coletadas em bioma de Caatinga, nos estados do Ceará e Piauí, com a certificação
botânica realizada pelo Herbário Prisco Bezerra (Universidade Federal do Ceará).
Outras espécies de Senna e Casearia: Senna spectabilis, Senna multijuga e Casearia
sylvestris var. lingua, Casearia sylvestris var. sylvestris, Casearia sylvestris intermediaria,
Casearia rupestres, Casearia gossypiosperma; foram coletadas pela autora e pela equipe do Prof.
Dr. Alberto José Cavalheiro e pela Dr. Aline Coqueiro, do Instituto de Química da Unesp de
Araraquara (IQ). As espécies de Senna foram coletadas no IQ, e as espécies de Casearia no IAC
(Instituto Agronômico de Campinas), estas provenientes de bioma de Cerrado, as informações
referentes aos dados botânicos, tal como exsicata e certificação foram disponibilizadas pela
Profa. Roseli Buzanelli Torres, pesquisadora do IAC (Instituto Agronômico de Campinas).
Ainda da região Nordeste do país, no estado do Piauí, em bioma de Caatinga, foram
coletadas pela Profa. Dra. Mariana Helena Chaves, a espécie Senna acuruensis a certificação
botânica dessa espécie foi realizada no Herbário Graziela Barroso na Universidade Federal do
Piauí, Todas essas plantas etão descritas no apêndice A.
27
As espécies do gênero Cassia foram anexadas para comparação com as espécies do
gênero Senna, sendo as sequências retiradas do GenBank, NCBI.
Todas as equipes que coletaram as espécies presentes neste trabalho possuem autorização pelo
órgão gestor e cadastro no Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (Sisbio).
3.2 Preparo do material e extração de DNA
O material coletado foi armazenado em sílica gel, até o momento da extração de DNA. A
extração de DNA total, de folhas, foi realizada de acordo com o protocolo de Murray e
Thompon, (1980) com modificações; conforme descrito a seguir: 0,5 g de material vegetal de
folhas secas foram trituradas, e colocadas em tubos de 2 mL, contendo as esferas de cerâmica;
adicionou-se 3 mL de tampão de extração CTAB ( CTAB 0,053 M, NaCL 1,4 M, PVP 10000
2%, Tris 0,1 M pH 8,0 e EDTA 0,25 M pH 8,0) contendo beta – mercaptoetanol (0,2%); a lise, e
homogeneização das folhas trituradas, foram realizadas com o uso do aparelho Precellys (Bertin
Technologies) à 6.500 g e temperatura ambiente, o macerado foi transferido (tanto a parte líquida
quanto a sólida) para tubo eppendorf (2 mL), sem as esferas de cerâmica, e deixado 30 minutos
em banho-maria a 65ºC; centrifugou-se a 20.817g por 5 minutos e recuperando-se 900 μL do
sobrenadante. Adicionou-se (volume/volume) de clorofórmio álcool isoamílico e
homogeneizando-se por inversão do tubo, centrifugou-se a 20.817g por 5 minutos, recuperando-
se 800 μL do sobrenadante, ao qual adicionou-se 0,6 do volume de isopropanol, e incubou-se 30
minutos a – 4ºC. Após centrifugação a 20.817g por 20 minutos, o precipitado foi lavado duas
vezes com álcool 70%, e seco a vácuo por 6 minutos. A amostra foi ressuspensa em 50 μl de
água ultrapura, incubando-se por 65ºC por 30 minutos para dissolução completa do DNA; a
análise do material foi realizada através de eletroforese em gel de agarose 1% corado com
brometo de etídio. Ao fim da extração, cada uma das amostras foi quantificada em
espectrofotômetro Epoch (Biotek), e armazenadas a -20 °C, até o momento de uso.
3.3 Confecção de primers (iniciadores)
Os primers foram sintetizados conforme as instruções baseadas nos bancos de dados
internacionais como o BOLD (RATNASINGHAM, 2007; FAZEKAS, 2008; LESKINEN, E.;
28
ALSTRÖM-RAPAPORT, C.,1999; WHITE, et al., 1990), para amplificar os fragmentos a serem
analisados. A tabela 1 apresenta informações mais detalhadas sobre os iniciadores.
Tabela 1: Iniciadores utilizados na reação de PCR e sequenciamento
Iniciador Orientação Sequência
trnH-
psbA
psbA
Forward
5'- GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'
trnH Reverse 5'- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'
rbcLa-
rbclajf634
rbcla Forward 5’-TGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’
rbcLajf634 Reverse 5’-GAAACGGTCTCTCCAACGCAT -3’
ITS1 ITS1f Forward 5'- TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG -3'
ITS1r Reverse 5'- GCTGCGTTCTTCATGTTG-3'
ITS2 ITS2f Forward 5’- CATCGATGAAGAACGCAGC -3’
ITS2r Reverse 5’- TTCCTTCCGCTTATTGATATGC-3’
3.4 Amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e purificação dos
produtos obtidos
Todas as amostras foram testadas para amplificação das regiões do DNA plastidial e
nuclear da planta, conforme os primers previamente escolhidos, e condições da PCR realizada de
acordo com o respectivo primer, (FAZEKAS, 2008; LESKINEN, E.; ALSTRÖM-RAPAPORT,
C.,1999; CBOL, 2009); segundo protocolo abaixo:
29
10X PCR Buffer (Invitrogen), 200mM Tris-HCl (pH 8,4), 500mM KCl;
50 mM MgCl2 (Invitrogen) ;
10 mM dNTP mixture (dNTP mix Fermentas),
1U de Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen);
iniciador forward (10 mM ) (Tabela 1);
iniciador reverse (10 mM ) (Tabela 1);
5 ng de DNA;
Água ultrapura (Milli-Q) autoclavada qsp. 20 µl
Os fragmentos foram amplificados em termociclador Veriti (Applied Biosystems)
conforme a ciclagem para cada par de primer:
trnH-psbA e rbcLa-rbcLajf634 ITS1 e ITS2
95 °C por 4 minutos 94 °C por 6 minutos
94 °C por 30 segundos 96 °C por 1 minuto e 10 seg.
55 °C por 1 minuto 35 ciclos 54 °C por 50 seg 35 ciclos
72 °C por 1 minuto 72 °C por 1 minuto e 30 seg.
72 °C por 10 minutos 72 °C por 10 minutos
10 ºC 4 ºC
Os produtos de PCR (~ de 200 a 700 pb) foram purificados previamente à realização da
reação de sequenciamento para retirada dos nucleotídeos não incorporados e excesso de
iniciadores, utilizando GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare), de
acordo com instruções do fabricante.
Após a purificação do produto de PCR, as amostras foram quantificadas utilizando Epoch
(Biotek) e armazenados sob refrigeração até o momento do uso.
3.5 Reação de sequenciamento e purificação sequências
30
As reações de sequenciamento foram realizadas em ambas as fitas do DNA, utilizando os
mesmos iniciadores (Tabela 1) em tubos de 0,2 mL conforme o protocolo do fabricante do Big
Dye Terminator v. 3.1, descrito abaixo:
1 µL de Big Dye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems);
1,75 µL de tampão do kit Big Dye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems);
1 µL do iniciador direto ou reverso (1,6 picomolar) (Tabela 1);
Produto de PCR purificado (2 µL) (Tabela 2);
Água ultrapura (Mili-Q) autoclavada qsq. 10 µL.
As reações de sequenciamento foram realizadas em termociclador Veriti (Applied
Biosystems) conforme a ciclagem abaixo:
96 °C por 1 minuto
96 °C por 10 segundos
50 °C por 10 segundos 25 ciclos
60 °C por 4 minutos
4 °C
Tabela 2. Concentração das amostras utilizadas na reação de sequenciamento.
Fragmento (pb) Concentração
(ng/µL)
200 – 500
500 – 1000
3 a 10
5 a 20
31
Os produtos das reações de sequenciamento foram purificados e precipitados, com
etanol/EDTA conforme protocolo do fabricante, Big Dye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems)
e descrito a seguir.
Após a ciclagem, os tubos foram removidos do termociclador e centrifugados por 1
minuto, as amostras foram transferidas para uma placa de 96 poços, na qual adicionou-se 2,5 μL
de EDTA 125mM e 25μL de etanol 100% em cada poço, selou-se a placa e envolvendo-a em
papel alumínio e misturou-se por inversão; a placa foi incubada à temperatura ambiente e abrigo
da luz por 15 minutos; centrifugou-se a 2.500 g por 30 minutos a 4ºC, imediatamente, a placa
foi destampada e invertida para descarte do sobrenadante e centrifugada a 185 g por 15
segundos, a seguir adicionou-se 100 μL de etanol 70% em cada poço, a placa foi selada
novamente, e centrifugada a 2.500 g por 15 minutos a 4ºC; inverteu-se a placa para descartar o
sobrenadante e centrifugando-se por 1 minuto a 185 g; a placa foi deixada secando no
termociclador com a tampa aberta por 2 minutos a 90 ºC.
As amostras foram ressuspensas na placa utilizando Formamida HI-DI (Applied
Biosystems) conforme o protocolo descrito a seguir: na placa foi adicionada 10 µL de Formamida
HI-DI , em cada poço. A placa foi colocada em agitador, durante 1 minuto. A seguir, foi
centrifugada brevemente (“spin”). As amostras foram desnaturadas a 95 °C em termociclador
Veriti (Applied Biosystems) com a tampa aberta por 3 minutos, e colocada em gelo por 3 minutos.
A eletroforese capilar foi realizada no analisador genético ABI 3500 (Applied Biosystems), com o
polímero POP-7 (Applied Biosystems) e capilar de 50 cm (Applied Biosystems), conforme
programa pré determinado.
3.6 Análise das sequências
As sequências forward e reverse de cada par de primer foram feitas em duplicata e
editadas, no programa BioEdit (HALL, 1999), para obtenção da sequencia consenso. O
alinhamento múltiplo e a matriz das sequências foram editados a partir do programa Clustal W
(THOMPSON et al., 1994) implementado no programa BioEdit e MEGA5 (TAMURA et al.,
2011), sendo as matrizes conferidas manualmente, e com o auxílio da ferramenta de
bioinformática BLAST (ZHANG, 2000; MORGULIS, 2008), foi possível a confirmação dos
gêneros das plantas usadas neste trabalho.
32
Para avaliar o sucesso da técnica e das regiões do código de barras de DNA, foi gerado o
alinhamento de todas as sequências no programa BioEdit, e posteriormente utilizados outros
programas (MEGA 5, para avaliação e classificação das espécies.
3.7 Reconstrução Filogenética
Para avaliar se as amostras de diferentes indivíduos formam um agrupamento específico
monofilético foram utilizados algoritmos como o Neighbor-Joining (NJ) (SAITOU, NEI, 1987).
Neste trabalho, utilizamos NJ pois é o método mais empregado para trabalhos com marcadores
moleculares em espécies vegetais, e tem mostrado ser um método robusto e confiável, com
diferentes conjuntos de dados (AUSTERLITZ, et al. 2009). O suporte dos ramos resultantes foi
obtido por bootstrap como método de reamostragem, utilizando 1000 réplicas. As distância
evolucionárias foram computadas utilizando o método K2P (Kimura 2-parameter method),
análises foram realizadas por meio do programa MEGA5 (TAMURA et al., 2011).
Para as análises filogenéticas, e comparação dos gêneros, nas árvores de rbcL, psbA-
trnH, e ITS2 foram inseridas sequencias (Tabela 3) obtidas no GenBank das espécies do gênero
Cassia.
O parâmetro para a escolha destas espécies foi que, no banco de dados tivessem nos três
marcadores escolhidos as mesmas espécies.
E para suporte, e enraizamento da árvore um grupo externo foi anexado para indicar que o
mesmo está ramificado fora do grupo analisado (gêneros Senna e Casearia. E para outras
análises, como a de variação intraespecífica foi inserida a espécie Senna obtusifolia.
33
Tabela 3. Número do acesso das espécies obtidas no GenBank (NCBI).
Espécie Número de acesso ao
Genbank (NCBI)
psbA-trnH rbcL ITS2
Cassia javanica gi|32030096 gi|452090358 gi|222354703
Cassia fistula gi|312603467 gi| 2342919 gi|452090053
Cassia grandis gi|259187031 gi|148590307 gi|222354702
Cassia roxburghii gi|320140106 gi|408354185 gi|452090056
Salix alba* gi|289541021 gi|289541055 gi|5912343
Ornithopus compressus** gi|336245247 gi|340511729 gi|380468143
Senna obtusifolia gi|512492577
gi|312603484
gi|384591566
gi|384591568
gi|300089233
gi|300089232
*grupo externo Casearia
**grupo externo Senna
3.8 Análise interespecífica e intraespecífica
Vários testes são utilizados para analisar os dados de DNA Barcoding e para resolução de
espécies. Dentro dessas metodologias uma das mais indicadas e utilizadas é o “barcoding gap”
(CBOL, 2009). Nesta abordagem, as espécies são consideradas resolvidas se a distância mínima
interespecífica é maior que a máxima intraespecífica.
A análise foi direcionada utilizando o programa MEGA5, esta análise determina a
diferença entre todos os possíveis pares de sequências mais próximas, são conhecidas como
distâncias de pares (pairwise distance), e estabelece um limite de similaridade. Além disso, este
processo tem sido indicado como rápido e preciso para examinar as relações entre as espécies
(HEBERT, et al. 2003).
Dentro desta abordagem, foi realizada a média das distâncias mínimas e máximas, para
quando o barcoding gap, não resolvia completamente, para que as distâncias intraespecíficas e
interespecíficas ficassem evidentes.
34
4 RESULTADOS
4.1 Extração de DNA
Os DNAs foram extraídos de 28 espécimes, sendo 13 amostras inicialmente do gênero
Senna (13 espécies) e 15 amostras do gênero Casearia ( 3 espécies); a metodologia utilizada para
extração do DNA genômico com tampão CTAB mostrou-se eficiente.
Todas as amostras extraídas, foram confirmadas através de eletroforese em gel de agarose
a 1%, e as amostras quantificadas em espectrofotômetro.
4.2 PCR e purificação
Foi realizada a PCR de todos as amostras, cujos produtos estão apresentados nas figuras 8,
a 11, as bandas obtidas apresentaram os tamanhos esperados, utilizando os conjuntos de
iniciadores psbA-trnH (figuras 8 e 10), com alguma variação de tamanhão entre as espécies, rcbL
(figuras 9 e 10), e ITS2 (figura 11), similares ao descritos na literatura, (KRESS, 2009), com
tamanho médio entre 200 e 700 pares de bases.
Com marcador ITS1, também foi realizada PCR com as amostras, porém não ocorreu a
amplificação, e portanto este marcador não foi mais utilizado.
O marcador ITS2 foi o único que mostrou alguma dificuldade na amplificação e
posteriormente no sequenciamento, sendo que as amostras S. alata, S. gardneri, S. macranthera,
S. trachypus, C. sylvestris intermediaria 1, C. sylvestris intermediaria 12, C. sylvestris sylvestris
8, C. sylvestris sylvestris 5 e C. sylvestris lingua 7 foram identificadas como fungos (figura 11).
Das 28 amostras iniciais, 5 amostras do gênero Casearia não amplificaram na PCR,
mesmo após inúmeras tentativas, apesar destas mesmas amostras não apresentaram problemas na
extração.
Uma amostra que primeiramente havia sido identificada como do gênero Senna, foi
identificada posteriormente como Poincianella pyramidalis, sendo indicada nas figuras como
Senna sp.
35
Figura 8. Eletroforese em gel de agarose (1,0%) corado com brometo de etídio, dos produtos de
PCR amplificados do gênero Senna, com os primers específicos, psbA-trnH. Senna acuruensis
(2),Senna alata (3), Senna cearensis (4), Senna gardneri (5), Senna macrathera (6), Senna
multijuga (7), Senna spectabilis (8), Senna splendida (9), Senna plendida (10), Senna splendida
(11), Senna rugosa (12), Senna trachypus (13), Senna sp. (14). Marcador molecular:
GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder, 75-20,000 pb, (1).
Fonte: autor
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose (1,0%) corado com brometo de etídio, dos produtos de
PCR amplificados, do gênero Senna, com os primers específicos, rcbLa-rcbLajf634: Senna
acuruensis (2), Senna alata (3), Senna cearensis (4), Senna gardneri (5), Senna macranthera (6),
Senna multijuga (7), Senna spectabilis (8), Senna splendida (9), Senna splendida (10), Senna
splendida (11), Senna rugosa (12), Senna trachypus (13), Senna sp. (14), Senna sp.(15).
Marcador molecular: GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder, 75-20,000 pb, (1).
Fonte: autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
36
Figua 10. Eletroforese em gel de agarose (1,0%) corado com brometo de etídio, dos produtos de
PCR amplificados do gênero Casearia, com os primers específicos; primers psbA-trnH: C.
sylvestris var. sylvestris (2), C. sylvestris var. sylvestris (3), C. sylvestris var. lingua (4), C.
sylvestris var. lingua (5), C. sylvestris intermediaria (6), C. sylvestris intermediaria (7), C.
sylvestris intermediaria (8), Casearia gossypiosperma (9), Casearia rupestris (10); primers
rcbLa-rcbLajf634: C. sylvestris var. sylvestris (12), C. sylvestris var. sylvestris (13), C. sylvestris
var. lingua (14), C. sylvestris var. lingua (15), C. sylvestris intermediaria (16), C. sylvestris
intermediaria (17), C. sylvestris intermediaria (18), C. gossypiosperma (19), C. rupestris (20).
Marcador molecular: GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder, 75-20,000 pb, (1 e 11).
Fonte: autor
37
Figura 11. Eletroforese em gel de agarose (1,0 %) dos produtos de PCR amplificados dos gêneros
Senna e Casearia, com primer específicos; ITS2 forward – ITS2 reverse: Senna acuruensis (2),
Senna alata (3), Senna cearensis (4), Senna gardneri (5), Senna macranthera (6), Senna
multijuga (7), Senna spectabilis (8), Senna splendida (9), Senna splendida (10), Senna splendida
(11), Senna rugosa (12), Senna trachypus (13), Senna sp. (14), Senna sp.(15), C. sylvestris var.
sylvestris 8(17), C. sylvestris var. sylvestris 5(18), C. sylvestris var. lingua 7 (19), C. sylvestris
var. lingua 10 (20), C. sylvestris intermediaria 1 (21), C. sylvestris intermediaria 12 (22), C.
sylvestris intermediaria 13(23), C. gossypiosperma (24), C. rupestris (25). Marcador molecular:
GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder, 75-20,000 pb, (1 e 16).
Fonte: autor
4.3 Sequenciamento e alinhamento das sequências
Uma sequencia de DNA Barcoding deve ser facilmente amplificável por PCR, com
primers e reações padronizadas universalmente, e posteriormente sequenciada com sucesso.
Os resultados mostraram que a porcentagem de amplificação e sequenciamento dos
marcadores candidatos à DNA Barcoding, psbA-trnH, rbcL e ITS2, foi respectivamente de
77,77%, 77,77% e 40,74%, como é possível verificar na tabela 4, onde também é possível
verificar os dados dos gêneros separadamente.
38
Tabela 4. Indicadores de cada marcador e sucesso do sequenciamento.
Marcador psbA-trnH rbcL ITS2
Número de amostras total /n. 27 27 27
Número de amostras do gênero Senna / n. 12 12 12
Número de amostras do gênero Casearia /n. 15 15 15
Sucesso do sequenciamento do gênero Senna /n. 12 12 9
Sucesso do sequenciamento do gênero Senna /% 100 100 75
Sucesso do sequenciamento do gênero Casearia/n. 9 9 3
Sucesso do sequenciamento do gênero Casearia/% 60 60 20
Sucesso do sequenciamento total / n. 21 21 11
Sucesso do sequenciamento total /% 77,77 77,77 40,74
Tamanho do fragmentos de Senna /pb 132-357 462-597 217-355
Média do tamanho dos fragmentos de Senna 282,84 530,46 302,33
Tamanho dos fragmentos de Casearia /pb 165-249 526-575 256-292
Média do tamanho dos fragmentos de Casearia 222,55 548,22 277,33
Média total do tamanho dos fragmentos 252,695 539,34 289,83
O uso da técnica de DNA barcoding nas espécies estudadas neste trabalho apresentou
resultados do sequenciamento similares com os marcadores psbA-trnH e rbcL, como observado
na tabela acima.
Assim como neste trabalho, outros estudos envolvendo floras tropicais também obtiveram
resultados satisfatórios no sequenciamento de psbA-trnH e rbcL (KRESS et al., 2009,
GONZALEZ et al., 2009 e KRESS et al., 2010).
O marcador ITS2, apesar da PCR aparentemente ter apresentado produtos (figura 11), com
bandas de acordo com o esperado para este marcador, houve algumas dificuldades no
sequenciamento em 4 amostras do gênero Senna e 6 amostras do gênero Casearia, após
alinhamento como “query”, no BLAST, estas amostras foram identificadas como fungos
endofíticos, indicando contaminação das amostras, um problema que pode ocorrer com este
39
marcador, anteriormente reportado por outros autores Chase et al (2007), Kress, et al (2007),
Gonzalez, et al (2009), Chen, et al (2010).
O alinhamento das sequências, com os marcadores psbA-trnH, rbcL e ITS2, foi realizado
com o programa BioEdit, apêndices de B, a G, para edição para posteriormente a realização das
árvores filogenéticas.
As sequências com o marcador psbA-trnH do gênero Senna, foi possível notar já pelas
bandas do gel (figura 8) e pelo alinhamento a diferença de tamanhos entre as espécies (LAHAYE
et al., 2008, STARR et al., 2009, ROY et al., 2010).
4.4 Reconstrução Filogenética
A história evolucionária foi inferida para as espécies dos gêneros Senna, Cassia e
Casearia, utilizando o algoritmo Neighbor-Joining (NJ), (SAITOU; NEI, 1987), utilizando o
programa MEGA5 (TAMURA et al., 2011), as árvores foram geradas com os marcadores psbA-
trnH, rbcL e ITS2 (Figura 12 e 13).
Nos gêneros Senna e Cassia foi possível observar a similaridade entre os gêneros. Em
todos os marcadores Senna georgica se agrupou com as espécies de Cassia, apoiando resultados
de trabalhos anteriores (BRUNEAU et al., 2001; MARAZZI et al., 2006; TORRES, et al., 2011).
Ainda dentro destes gêneros, é possível observar que os marcadores ITS2 e psbA-trnH,
foram os melhores para separar espécies, com bootstrap e distância maiores que de rbcL.
No gênero Casearia, o locus que melhor separou as espécies foi psbA-trnH, visto que o
ITS2 não obteve resultado significativo no sequenciamento, assim foi possível observar que
dentro da espécie C. sylvestris pode haver diferenças significativas como descrito em Claudino
(2013), diferenças entre C. sylvestris var. sylvestris e C. sylvestris var. lingua.
40
Figura 12. Árvores consenso bootstrap, construídas a partir do marcador psbA-trnH (a), rbcL (b)
e ITS2 (c), respectivamente, com os gênero Senna e Cassia.
a
b
c Fonte: autor
41
Figura 13. . Árvores consenso bootstrap, construídas a partir do marcador psbA-trnH(a), rbcL(b)
e ITS2(c), respectivamente, com o gênero Casearia.
a
b
c
Fonte: autor
42
4.5 Análise interespecífica e intraespecífica
O barcoding gap entre as distâncias intraespecíficas e interespecíficas foi determinado pela
distribuição da variação da distância-p das três regiões individuais, realizado no programa
MEGA5; dentro da análise os valores para o gênero Senna foram de 0 para todos os marcadores,
(tabela 5), provavelmente devido a similaridade entre espécies congêneres.
No marcador psbA-trnH a espécies que não mostraram valores significantes foram S. gardneri
com S. rugosa, S. trachypus com S. multijuga, S. acuruensis com S. multijuga e S. trachypus. Já
no marcador rbcL foram S. gardneri com S. multijuga, S. macranthera com S. cearensis, S.
acuruensis com S. trachypus, e S. splendida com S. rugosa. E no ITS2 foi apenas S. acuruensis
com S. multijuga, corroborando com os resultados apresentados pela reconstrução filogenética..
Foi realizada as médias das variações de distância interespecífica do gênero Senna, na qual os
marcadores ITS2 e psbA-trnH foram os mais significativos, os valores do marcador rbcL mostram
a pouca variação deste marcador (figuras 14, 15 e 16).
Na análise do gênero Casearia, no barcoding gap houve uma significativa variação de
distância, tabela 5, onde é possível observar também a variação intraespecífica no marcador
psbA-trnH, tabela 5 e figura 14, comprovando os resultados da reconstrução filogenética que
sugerem variação dentro da espécie C. sylvestris.
O barcoding gap de Casearia não foi possível ser realizado com o marcador ITS2, devido as
dificuldades deste marcador no sequenciamento e na busca sem sucesso, no Genbank, para que
fosse realizado esta abordagem.
No gênero Cassia, é possível observar as variações interespecíficas, (tabela 5 e figuras 14, 15)
e 16. Não foi realizado o barcoding gap do gênero Cassia, pois também não foi possível
encontrar a mesma espécie para comparação intraespecífica.
43
Tabela 5. Valores máximos e mínimos da distância intraespecífica e interespecífica, e Barcoding
gap.
psba -
trnH
rbcL ITS2
máxima mínima máxima mínima máxima mínima
intraespecifica S. obtusifolia 0 0 0 0 0 0
intraespecífica C. sylvestris 0,019608 0 0 0
interespecifica Senna 0,176471 0 0,018567639 0 0,25203 0
interespecifica Casearia 0,686275 0,196078 0,00795756 0 0,08943 0,07317
interespecífica Cassia 0,039216 0 0,00795756 0 0,12195 0,09756
Barcode gap Senna 0
0
0
Barcode gap Casearia 0,18
0
*
*não determinado
Fonte:autor
Figura 14. Média dos valores máximo e mínimo da distância intraespecífica e interespecífica com
o marcador psbA-trnH.
Fonte:autor
44
Figura 15. Média dos valores máximo e mínimo da distância intraespecífica e interespecífica com
o marcador rbcL.
0,0000000,0020000,0040000,0060000,0080000,0100000,0120000,0140000,0160000,0180000,020000
Fonte:autor
Figura 16. Média dos valores máximo e mínimo da variação intraespecífica e interespecífica com
o marcador ITS2.
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
intraespecificaS.obtusifolia
interespecificaSenna
interespecificaCasearia
interespecíficaCassia
Fonte:autor
45
5 DISCUSSÃO
Neste trabalho foi examinada a eficácia de quatro loci (psbA-trnH, rbcL, ITS1 e ITS2)
descritos como DNA Barcoding para identificação das espécies do gênero Senna e Casearia, as
quais estão inseridas dentro de importantes biomas brasileiros, o Cerrado e a Caatinga.
De acordo com CBOL (2009), um DNA Barcoding ideal deve ter regiões adequadamente
conservadas para o desenho de um primer universal, alta eficiência na PCR, e variabilidade
suficiente para ser utilizado na identificação de espécies.
Dentro dos quatro loci escolhidos para este trabalho dois mostraram-se eficientes na PCR,
sendo o ITS1 logo descartado, devido ao baixo sucesso na PCR, apesar de inúmeras tentativas.
Após o sequenciamento do marcador ITS2, verificou-se algumas dificuldades no
processamento das amostras, principalmente dentro do gênero Casearia, problemas com
sequências de baixa qualidade e amostras contaminadas com fungos endofíticos, nos trabalhos de
Chase et al. (2007), Kress, et al. (2007), Gonzalez, et al. (2009), Chen, et al. (2010), onde foi
testada a região ITS (ITS1 e ITS2), foram relatadas as mesmas dificuldades.
O artigo de Hollingsworth (2011) discute e pontua os problemas relatados anteriormente:
contaminação de fungos, problemas na amplificação e sequenciamento na região ITS2, marcador
que apresentou a menor eficiência no sequenciamento em relação aos usados neste estudo, com
taxas de apenas 20% de plantas do gênero Casearia, e de 75% de plantas sequenciadas do gênero
Senna, com uma taxa de 44,44% do total de amostras.
O alinhamento das sequências das regiões utilizadas, foi realizado com facilidade, no
entanto, o espaçador intergênico psbA-trnH mostrou uma alta variação de tamanho entre as
espécies amostradas, (LAHAYE et al., 2008, STARR et al., 2009, ROY et al., 2010). Contudo,
foi observado uma alta taxa de identificação das árvores amazônicas neste DNA Barcoding locus
em Gonzalez et al. (2009).
Na identificação das espécies pela região COI, de acordo com Srivathsan e Meier (2011),
o método original proposto por Hebert et al. (2003), envolveu a construção de árvores de
Neighbor-Joining com base no modelo de distância Kimura 2-parâmetro (K2P). Este modelo,
46
apesar de ser utilizado em DNA Barcoding em animais também foi utilizado para trabalhos com
marcadores moleculares em espécies vegetais.
Dentro da topologia gerada a partir de NJ, no geral, a maioria das espécies se agrupou em
seus respectivos gêneros. O marcador ITS2 e psbA-trnH apresentaram cladogramas com melhor
resolução para o gênero Senna e psbA-trnH para Casearia, entretanto, o marcador rbcL não foi
tão eficiente, apesar de ser uma região codificadora amplamente utilizada em estudos
filogenéticos e uma das mais bem caracterizadas no Genbank, ( NEWMASTER et al., 2006), um
dos fatores pode ser a baixa ou nenhuma variação nas sequência das regiões testadas,
principalmente nas codificantes do DNA plastidial, alguns genes podem ser insuficientes na
distinção das espécies devido a sua lenta evolução em relação à taxa de especiação, a solução
seria aumentar o número de regiões analisadas (FAZEKAS et al., 2009).
De acordo com Amorim (2002) um grupo de espécies descende de um ancestral comum,
quando compartilha alguma característica entre si. Tais ancestrais podem ser classificados em
recentes ou distantes, espécies que compartilham um ancestral recente são bastante similares,
possuindo várias características herdadas de um ancestral comum. Na análise das árvores foi
possível verificar a forte similaridade entre as espécies do gênero Cassia com o gênero Senna,
que anteriormente estava inseridos em Cassia e posteriormente foram separados pelo tratamento
taxonômico de Irwin & Barneby (1981), (VIEGAS JR. et al, 2006; RODRIGUES et al., 2010).
No trabalho de Marazzi (2006), que estudou relações filogenéticas dentro de Senna, com
outros marcadores plastidiais, também foi possível verificar as relações muito próximas da
subtribo Cassiinae, principalmente entre Cassia e Senna, corroborando com estudos anteriores
(BRUNEAU et al., 2001; MARAZZI et al., 2006; TORRES, et al., 2011).
Na análise do barcoding gap não houve variação significativa em todos os marcadores
para os genêros Senna, e Casearia, apenas no marcador psbA-trnH. Dois fatores são
componentes críticos para que qualquer estudo com DNA Barcoding obtenha sucesso,
(FAZEKAS, et al. 2008), uma das possíveis explicações para a falta de variação de distância
entre as espécies é que a amostragem final deste estudo não incluiu várias amostras para a mesma
espécie, e várias espécies por gênero (BOLSON, 2012), entretanto a necessidade de uma
abordagem multilocus é sugerida por alguns autores (CBOL, 2009; KRESS, et al.2005;
NEWMASTER, et al.,2006), porém não foi realizada neste estudo.
47
Além disso, é importante ressaltar, que nas análises de variação de distância
intraespecífica e interespecífica, os resultados com o marcador psbA-trnH, na espécie C.
sylvestris revelam indícios da diferenças entre as variedades C. sylvestris lingua e C. sylvestris
sylvestris, como relatado por Claudino (2013), que demonstrou diferenças entre essas variedades
por estudos morfoanatômicos e químicos.
Outra observação importante, é que, apesar de nem todas as abordagens obterem um
resultado satisfatório, não se pode descartar a aplicabilidade da metodologia, pois é possível
avaliar as médias dos valores de variação distâncias, nas figuras 14, 15 e 16, principalmente
interespecífica, que corrobora com o sucesso de estudos de floras tropicais, e plantas medicinais
chinesas, onde o marcadores psbA-trnH e ITS2 são os mais eficazes (GONZALEZ, et al, 2009;
CHEN et al., 2010; LIU, et al., 2012; TRIPATHI, et al., 2013).
As informações geradas pelos códigos de barras de DNA para identificação das diferentes
espécies em estudo, suas respectivas árvores filogenéticas e outros dados adicionais servirão para
inventariar as espécies em estudo, para que estas espécies sejam de conhecimento público, na
pesquisa básica sobre bioprospecção e correlação com a produção dos metabólitos secundários,
com potencial inovador para posterior investimento na produção de alimentos, descoberta de
protótipos para a indústria farmacêutica, cosmética, agroquímica, química, recuperação de
ambientes degradados, combate à biopirataria, na biotecnologia, para a obtenção de
biomoléculas com grande interesse nas pesquisas de aspectos químicos, biológicos,
farmacológicos e toxicológicos, colaborando no gerenciamento e conservação desses recursos
naturais brasileiros.
A disponibilização dos dados em banco de dados de acesso público possibilitará
avanços científicos por outras equipes que estudam esse tema no Brasil, auxiliando em futuro
próximo, a elaboração de políticas públicas que colaborem na preservação dos diferentes
ecossistemas.
48
6 CONCLUSÕES
A metodologia de DNA Barcoding mostrou ser uma ferramenta aplicável para a
identificação das espécies estudadas no presente trabalho.
As abordagens baseadas nas análises filogenéticas de NJ, de variação interespecífica e
intraespecífica, mostraram que os marcadores psbA-trnH e ITS2, são os mais indicados para a
identificação dessas espécies.
49
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMORIM, D.S. Fundamentos de Sistemática Filogenética. Ribeirão Preto: Holos, 2002,156 p.
AUSTERLITZ, F.; DAVID, O.; SCHAEFFER, B.; BLEAKLEY, K.; OLTEANU, M.;
LEBLOIS, R.; VEUILLE, M.; LAREDO, C. DNA barcode analysis: a comparison of
phylogenetic and statistical classification methods. BMC Bioinformatics. v. 10, p. 10, 2009.
BALDWIN, B.G.; SANDERSON, M. J.; PORTER, R. K; WOJCIECHOWSKI, M. F.;
CAMPBELL, C. S.; DONOGHUE, M. J. The ITS Region of Nuclear Ribosomal DNA: A
Valuable Source of Evidence on Angiosperm. Phylogeny Source: Annals of the Missouri
Botanical Garden, v. 82, n. 2 , p. 247-277, 1995.
BALMFORD, A.; BRUNER, A,; COOPER, P.; COSTANZA, R.; FARBER, S.; GREEN, R. E.;
JENKINS, M.; JEFFERISS, P.; JESSAMY, V.; MADDEN, J.; MUNRO, K.; MYERS, N.;
NAEEM, S.; PAAVOLA, J.; RAYMENT, M.; ROSENDO, S.; ROUGHGARDEN, J.;
TRUMPER, K.; TURNER, R.K. Economic Reasons for Conserving Wild Nature. Science. v. 297
p. 950-953, 2002 .
BENNETT, M.D., BHANDOL, P., LEITCH, I.J. Nuclear DNA amounts in angiosperms and
their modem uses – new estimates. Annals of Botany. v.86, p. 859-909, 2000.
BRASIL. Ministério do Meio Ambiente. Áreas Prioritárias para a Conservação, Uso Sustentável
e Repartição de Benefícios da Biodiversidade Brasileira: Atualização – Portaria MMA nº 9, de
23 de janeiro de 2007, http://www.mma.gov.br/estruturas/chm/_arquivos/biodiversidade31.pdf.
Acesso em 10 de agosto de 2011.
BIODIVERSIDADE. Revista Pesquisa da FAPESP. n. 167, 2010, 36p.
BOLSON, M. Aplicação de DNA Barcoding em espécies vegetais arbóreas da floresta
ombrófila mista. 2012. 144 f. Dissertação. (Mestrado em Botânica) – Universidade Federal do
Paraná, Curitiba, 2012.
BRUNEAU, A.; FOREST, F.; HERENDEEN, P. S.; KLITGAARD, B. B.; LEWIS, G. P.
Phylogenetic relationships in the Caesalpinioideae (Leguminosae) as inferred from chloroplast
trnL intron sequences. Systematic Botany. v. 26, p.487-514, 2001.
CAVALLARI, M. M.; GIMENES, M. A.; BILLOT, C.; TORRES, R. B.; ZUCCHI, M. I.;
CAVALHEIRO, A.J.; BOUVET J. M. Population genetic relationships between Casearia
sylvestris (Salicaceae) varieties occurring sympatrically and allopatrically in different ecosystems
in south-east Brazil. Annals of Botany. v.106, p. 627–636, 2010.
CBOL Plant Working Group. A DNA barcode for land plants. Proceedings of the National
Academy of Sciences. v.106, n.31, p. 12794–12797, 2009.
50
CHASE, M. W.; SALAMIN, N.; WILKINSON, M., DUNWELL, J. M.; KESANAKURTHI, R.
P.; HAIDAR, N.; SAVOLAINEN, V. Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term
goals. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological
Sciences. v. 360, p.1889–1895, 2005.
CHASE, M. W.; COWAN, R. S.; HOLLINGSWORTH, P. M.; VAN DEN BERG, C.;
MADRINAN, S.; PETERSEN, G; SEBERG, O.; JORGSENSEN, T.; CAMERON, K. M.;
CARINE, M.; PEDERSEN, N.; HEDDERSON, T. A. J.; CONRAD, F.; SALAZAR, G. A.;
RICHARDSON, J. E.; HOLLINGSWORTH, M. L.; BARRACLOUGH, T. G.; KELLY, L.;
WILKINSON, M. A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants. Taxon. v.56,
p. 295–299, 2007.
CHEN, S.; YAO, H.; HAN, J.; LIU, C.; SONG, J.; SHI, J. L.; ZHU, Y.; MA, X.; GAO, T.;
PANG, X.; LUO, K.; LI, Y.; LI, X.; JIA, X.; LIN, Y.; LEON, C. Validation of the ITS2 Region
as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species. Plos One. v.5, n.1, p. 8313,
2010.
CLAUDINO, J. C.; SACRAMENTO, L. V.; KOCH, I; SANTOS, H. A.; CAVALHEIRO, A .J.;
TININIS, A. G.; SANTOS, A. G. Evaluation of morpho-anatomical and chemical differences
between varieties of the medicinal plant Casearia sylvestris Swartz. Anais da Academia
Brasileira de Ciencias. v.85. p.1253-1265, 2013.
COSTION, C.; FORD, A.; CROSS, H.; CRAYN, D.; HARRINGTON, M.; LOWE, A. Plant
DNA Barcodes Can Accurately Estimate Species Richness in Poorly Known Floras. Plos One. v.
6, n.11, p. e26841, 2011.
EITEN, G. Delimitação do conceito de Cerrado. Arquivos do Jardim Botânico. Rio de Janeiro.
21: 125-134. Brazilian Savannas. In: Huntley, B.J. e Walker, B.H. (eds.). Ecology of tropical
savannas. Ecological Studies, New York, Spring-Verlag. v.42, p. 25-47, 1977 .
FAZEKAS, A.J.; BURGESS, K.S.; KESANAKURTI, P.R.; GRAHAM, S.W.; NEWMASTER,
S.G.; HUSBAND, B.C.; PERCY, D.M.; HAJIBABAEI, M.; BARRETT, S. C. H. Multiple
Multilocus DNA Barcodes from the Plastid Genome Discriminate Plant Species Equally Well.
PLoS ONE. v. 3, n. 7, p. e2802, 2008.
FORD, C. S.; AYRES, K. L.; TOOMEY, N.; HAIDER, N.; STAHL, J. V. A.; KELLY, L. J.;
WIKSTROM, N.; HOLLINGSWORTH, P. M.; DUFF, R. J.; HOOT, S. B.; COWAN, R. S.;
CHASE, M. W.; WILKINSON, M. J. Selection of candidate coding DNA Barcoding regions for
use on land plants. Botanical Journal of the Linnean Society, v.159, p.1-11, 2009.
FORZZA, R.C., COSTA, A., WALTER, B.M.T., PIRANI, J.R., MORIM, M.P., QUEIROZ,
L.P., MARTINELLI, G., PEIXOTO, A.L., COELHO, M.A.N., BAUMGRATZ, J.F.A.,
STEHMANN, J.R., LOHMANN, L.G., HOPKINS, M. Angiospermas in Lista de Espécies da
Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro, 2012.
51
GARCIA, S E. Biodiversidade, Biotecnologia e saúde: Caderno de Saúde Pública, Rio de
Janeiro, v.11, n. 3, p. 495-500, 1995.
GIULIETTI, A. M.; CONCEIÇÃO, A.; QUEIROZ, L. P. (ORG.). Instituto do Milênio do
Semi-Árido: Diversidade e Caracterização das Fanerógamas do Semi-árido Brasileiro. Recife:
Ministério da Ciência e Tecnologia, 2006, v. 1, p. 202-2002. Castro et al., Ann. Missouri Bot.
Gard. v.86, p. 192-224, 1999.
GONZALEZ, M. A.; BARALOTO, C.; ENGEL, J.; MORI, S. A.; PÉTRONELLI, P.; RIÉRA,
B.; ROGER, A.; CHRISTOPHE THÉBAUD, C.; CHAVE, J. Identification of Amazon trees with
DNA barcodes. Plos One. v. 4, n.1, p. e7483, 2009.
HALL, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program
for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series: Oxford Journals, v. 41, p. 95-98,
1999.
HEBERT, P.D.N.; CYWINSKA, A.; BALL S.L.; DEWAARD, J.R. Biological identifications
through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. v. 270,
p.313-321, 2003.
HEBERT, P. D. N.; GREGORY, T. R. The promise of DNA Barcoding for taxonomy.
Systematic Botany, v.54, p.852-859, 2005.
HOLLINGSWORTH, P.M. Refining the DNA barcode for land plants. Proceedings of the
National Academy of Sciences. v.108, p. 19451–19452, 2011.
KRESS, W. J.; ERICKSON, D. L. A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding
rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region. Plos One. v.2, n.6, p. e508,
2007.
KRESS, W.J.; ERICKSON, D.L. DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics.
Proceedings of the National Academy of Sciences. v.105, n.8, p.2761–2762, 2008.
KRESS, W. J.; ERICKSON, D. L.; JONES, F. A.; SWENSON, N. G.; PEREZ, R.; SANJUR,
O.; BERMINGHAM, E. Plant DNA barcodes and a community phylogeny of a tropical forest
dynamics plot in Panama. Proceedings of the National Academy of Sciences. v. 106, n. 44, p.
18621-18626, 2009.
KRESS, W. J.; ERICKSON, D. L.; SWENSON, N. G.; THOMPSON, J.; URIARTE, M.;
ZIMMERMAN; J. K. Advances in the Use of DNA Barcodes to Build a Community Phylogeny
for Tropical Trees in a Puerto Rican Forest Dynamics Plot. Plos One. v.5, p. e15409, 2010.
KRESS, W. J.; WURDACK, K. J.; ZIMMER, E. A.; WEIGT, L. A.; JANZEN, D. H. Use of
DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences.
v. 102, n.23, p.8369–74, 2005.
52
LAHAYE, R.; van der BANK, M.; BOGARIN, D.; WARNER, J.; PUPULIN, F.; GIGOT, G.;
MAURIN, O.; DUTHOIT, S.; BARRACLOUGH, T. G.; SAVOLAINEN, V. DNA Barcoding
the floras of biodiversity hotspots. Proceedings of the National Academy of Sciences. v. 105, n.
8, p. 2923-2928, 2008.
LESKINEN, E.; CECILIA ALSTRÖM-RAPAPORT, C. Molecular phylogeny of Salicaceae and
closely related Flacourtiaceae: evidence from 5.8 S, ITS 1and ITS 2 of the rDNAPl. Systematics
and Evolution. v.215, p.209-227, 1999.
LEWIS, G. P.; SCHIRIRE, B.; MACKINDER, B.; LOCK, M. Legumes of the World. London:
Royal Botanic Gardens, Kew, 2005, 577p.
LIU, Y.; ZHANG, L.; LIU, Z.; LUO, K.; CHEN, S. ; CHEN, K. Species identification of
Rhododendron (Ericaceae) using the chloroplast deoxyribonucleic acid PsbA-trnH genetic
marker. Pharmacognosy Magazine.v. 8, n. 29, p. 29–36, 2012.
MARQUETE, R.; TORRES, R. B.; MEDEIROS, E. S. Salicaceae in Lista de Espécies da Flora
do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro.
(http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB14361), 2013.
MEIER, R.; SHIYANG, K.; VAIDYA, G.; NG, P. K. L. DNA Barcoding and taxonomy in
Diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success. Systematic.
Biology. v.55, p. 715-728, 2006.
MARAZZI, B.; ENDRESS, P. K.; QUEIROZ, L. P.; CONTI, E. Phylogenetic relationships
within senna (Leguminosae,Cassiinae) based on three chloroplast dna regions: patterns in the
evolution of floral symmetry and extrafloral nectaries. American Journal of Botany. v.93(2), p.
288–303, 2006.
MORGULIS, A.; COULOURIS, G.; RAYTSELIS, Y.;. MADDEN, T. L.; AGARWALA, R.;
SCHÄFFER, A. A. Database Indexing for Production MegaBLAST Searches. Bioinformatics.
v. 24, p.1757-1764, 2008.
MURRAY, M. G.; THOMPSON, W. F. Rapid isolation of high molecular weigth plant DNA.
Nucleic Acids Research, Standford, v.8,n.19, p.4321-4325, 1980.
MYERS, N.; MITTERMEIER , R. A.; MITTERMEIER , C. G.; DA FONSECA, G. A. B.;
KENT, J. Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature. v.403, p. 853-858, 2000.
NEWMASTER, S. G.; FAZEKAS, A. J.; RAGHUPATHY, S. DNA barcoding in land plants:
evaluation of rbcL in a multigene tired approach. Canadian Journal of Botany. v. 84, p. 335–
341, 2006.
BOLSON, M. Aplicação de DNA Barcoding em espécies vegetais arbóreas da floresta ombrófila
mista. 2012. 144 f. Dissertação. (Mestrado em Botânica) – Universidade Federal do Paraná,
Curitiba, 2012.
53
OLIVEIRA, K. Z. Construção de árvores filogenéticas baseadas em genomas completos.
2010. 87f. Dissertação. (Mestrado em Ciência da Computação) – Universidade Estadual de
Campinas, 2010.
RATNASINGHAM, S. ; HEBERT, P. D. BOLD : The Barcode of Life Data
System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. v. 7, p. 355–364, 2007.
ROMANO, E. Extração de DNA de tecidos vegetais. In: BRASILEIRO, A. C. M.; CARNEIRO,
V. T. C. ed. Manual de transformação genética de plantas. Brasília. Embrapa-SPI/Embrapa-
CENARGEN.p.163-177, 1998.
ROY, S.; TYAGI, A.; SHUKLA, V.; KUMAR, A.; SINGH, U. M.; CHAUDHARY, L. B.;
DATT, B.; BAG, S. K.; SINGH, P. K.; NAIR, N. K.; HUSAIN, T.; TULI, R. Universal plant
DNA barcode loci may not work in complex groups: A case study with Indian Berberis species.
Plos One, v.5, n.10, 2010.
SANTOS, A. G.; PEREZ, C. C.; TININIS, A. G.; BOLZANI, V. S.; CAVALHEIRO, A. J.
Clerodane Diterpenes from leaves of Casearia sylvestris SWARTZ. Quimica Nova. v. 30, n. 5, p.
1100-1103, 2007.
SAITOU, N; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution. v.4, n. 4, p. 406-425, 1987.
SOUZA, V. C.; BORTOLUZZI, R.L.C. Senna in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim
Botânico do Rio de Janeiro, 2013.
SOUZA,V.C.; LORENZI, H. 2005. Botânica Sistemática – Guia ilustrado para identificação das
famílias de Angiosperma da flora brasileira, baseado em APG II. São Paulo: Nova Odessa –
Instituto Plantarum, 2005, 640 p.
STOECKLE, M. Y; GAMBLE, C. C.; KIRPEKAR, R.; YOUNG, G.; AHMED, S.; LITTLE, D.
P. Commercial Teas Highlight Plant DNA Barcode Identification. Scientific Reports. v.1, n.42,
2011.
STARR, J. R.; NACZI, R. F.; CHOUINARD, B. N. Plant DNA barcodes and species resolution
in sedges (Carex, Cyperaceae). Molecular Ecology Resources, v.9, p.151-63, 2009.
SRIVATHSAN, A.; MEIER, R. On the inappropriate use of Kimura-2-parameter (K2P)
divergences in the DNA-barcoding literature. Cladistics, v.27, p.1–5, 2011.
TAMURA, K.; PETERSON, D.; PETERSON, N.; STECHER, N.; NEI, M; KUMAR, S.
MEGA5: Molecular Evolutionary Genetic Analysis Using Maximum Likelihood , Evolutionary
Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution, v. 28, n. 10, p.
2731-2739, 2011.
54
THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D. G.; GIBSON, T. J. CLUSTAL W: improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap
penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research. v. 22, p. 4673-4680, 1994.
TRIPATHI, A.M.; TYAGI, A.; KUMAR, A.; SINGH, A.; SINGH, S.; CHAUDHARY, L. B.;
ROY, S. The Internal Transcribed Spacer (ITS) Region And Trnh-Psba Are Suitable Candidate
Loci For DNA Barcoding Of Tropical Tree Species Of India. Plos One. v.8, p.e57934, 2013.
TORRES, D. C.; LIMA, J. P. M. S.; FERNANDES, A. G.; NUNESAND, E. P.; GRANGEIRO,
T. B. Phylogenetic relationships within Chamaecrista sect. Xerocalyx (Leguminosae,
Caesalpinioideae) inferred from the cpDNA trnE-trnT intergenic spacer and nrDNA ITS
sequences. Genetics and Molecular Biology. v. 34, 2, p. 244-251, 2011.
VIEGAS JR., C.; DE REZENDE, A.; SILVA, D. H. S.; CASTRO-GAMBÔA, I.; BOLZANI, V.
S.; BARREIRO, E. J.; DE MIRANDA, A. L. P.; ALEXANDRE-MOREIRA, M. S.; YOUNG,
M. C. M. Aspectos químicos, biológicos e etnofarmacológicos do gênero Cassia. Quimica Nova.
v. 29, n. 6, p. 1279-1286, 2006.
WHITE, T. J.; BRUNS, T.; LEE, S.; TAYLOR, J. Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: (INNIS, M.; GELFAND, D.; SNINSKY, J.;
WHITE, T.) PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic
Press, (1990), p. 315-322.
ZHANG, Z.; SCHWARTZ, S.; WAGNER, L.; MILLER, W. A greedy algorithm for aligning
DNA sequences. Journal of Computational Biology. v.7, n.1-2, p.203-14, 2000.
55
Apêndice A. Lista de espécies estudadas neste trabalho.
Família/Gênero/Espécie coletor bioma/município/estado coordenadas
geográficas
depósito/exsicata
Fabaceae Lindl.
Senna alata (L.) Roxb Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga/
Piripiri-PI
04⁰21'997"S;
041⁰49'800"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do Ceará
/ 11525
Senna gardneri H.S.
Irwin & Barneby
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga/
estrada Tianguá-Viçosa-
CE
03⁰39'684"S;
041⁰06'734"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do Ceará
/ 47385
Senna macranthera
(DC. ex Collad.) H.S.
Irwin & Barneby
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga/
estrada Tianguá-Viçosa-
CE
03⁰39'684"S;
041⁰06'734"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do Ceará
/ 47384
Senna splendida
(Vogel) H.S. Irwin &
Barneby
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga /
Tianguá-CE
03⁰49'511"S;
041⁰06'430"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do Ceará
/ 47388
Senna trachypus (Mart.
ex Benth.) H.S. Irwin &
Barneby
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga /
Tianguá-CE
03⁰49'511"S;
041⁰06'430"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do Ceará
/ 47377
Senna rugosa (G.Don.)
H.S Irwin & Barneby
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga /
Tianguá-CE
03⁰49'511"S;
041⁰06'430"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do
Ceará/38112
56
Senna cearensis Afr.
Fern.
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga /
Tianguá-CE
03⁰49'660"S;
041⁰06'452"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do
Ceará/39514
Senna georgica (Vogel)
H.S Irwin & Barneby
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga/
Piripiri-PI
04⁰21'997"S;
041⁰49'800"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do Ceará
/ 47378
Senna sp* (Tul.) L.P.
Queiroz, Comb.Nov.
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga/ Pedro
II-PI
04⁰25'745"S;
041⁰29'307"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do Ceará
/ NI
Senna occidentalis (L)
Link
Profa. Maria
Goretti de
Vasconcelos
Silva
Cerrado-Caatinga/
Piripiri-PI
04⁰21'997"S;
041⁰49'800"W
Herbário Prisco
Bezerra -
Universidade
Federal do Ceará
/ 39194
Senna spectabilis(DC.)
H.S.Irwin & Barneby *
Dra. Aline
Coqueiro
Cerrado/ IQ-Unesp-
Araraquara-SP
/SP 384109
Senna multijuga (Rich.)
H.S.Irwin & Barneby *
Dra. Aline
Coqueiro
Cerrado/ IQ-Unesp-
Araraquara-SP
/SP 384103
Senna acuruensis Benth
(H.S.Irwin & Barneby)
Profa.
Mariana
Helena
Chaves
Caatinga/Jatobá-PI 04°51’48,6”S,
42°04’19.6”W
Herbário Graziela
Barroso - UFPI/
TEPB 17193
Salicaceae Mirb.
Casearia sylvestris Sw.
intermediária
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51270, IAC
48646
57
Casearia sylvestris Sw.
intermediária
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
51270, IAC
48646
Casearia sylvestris Sw.
var. sylvestris
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51268
Casearia sylvestris Sw.
var. sylvestris
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51268
Casearia sylvestris Sw.
var. sylvestris
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51268
Casearia sylvestris Sw.
var. sylvestris
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51268
Casearia sylvestris var.
lingua (Camp) Eichler
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 46485
Casearia sylvestris Sw.
var. sylvestris
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51268
Casearia sylvestris Sw.
var. sylvestris
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51268
Casearia sylvestris var.
lingua (Camp) Eichler
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51268
Casearia sylvestris Sw.
intermediária
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51270, IAC
48646
Casearia sylvestris Sw.
intermediária
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51270, IAC
48646
Casearia sylvestris Sw.
intermediária
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 51270, IAC
48646
Casearia rupestris
Eichler
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ Coleção
Monjolinho/IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 41542
Casearia
gossypiosperma Briq.
Prof. Alberto
J. Cavalheiro
Cerrado/ Coleção
Monjolinho/IAC-
Campinas-SP
22⁰52'14"S;
47⁰4'37"W
IAC 34440
* falta algum dado na
identificação da espécie
58
Apendice B. Alinhamento das sequências dos gêneros Senna e Cassia com o marcador psbA-trnH.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis --------------------------------------------CTGCGGTCGAGGCTCCATCTATA-AATGGATAAAATTGTGGTCTTAATATATATGA
Senna rugosa --------------------------------------------------------CTCCATCTATA-AATGGATAAAATTGTGGTCCTAATATATATGA
Senna cearensis ----------------------------------------------------GAGGCTCCATCTATA-AATGGATAATATTGTGGTCCTAATATATATGA
Senna alata ---------------------------------------------------------------------------------GTGGTCTTAATATATATGA
Senna gardneri -----------------------------------------------------------CATCTATA-AATGGATAAAATTGTGGTCCTAATATATATGA
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus -------------------------------------------------------------------------ATAAAATTGTGGTCCTAATATATATGA
Senna acuruensis ------------------------------------------------------------------------GATAAAATTGTGGTCCTAATATATATGA
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------TTAGCTGCGGTTGAGGCTCCATCTATA-AATGGATAAAATTGTGGTCCAAATATATATGA
Senna splendida ----------------------------------------CTAGCTGCGGTTGAGGCTCCATCTATA-AATGGATAAAATTGTGGTCCTAATATATATGA
Cassia javanica ------------------------ATAACTTCCTCTAGACCTAGCTGTGGTTGAGGCTCCATCTATTTAATGGATAAAATTGTGGTCTTAATATATACGA
Cassia fistula -----------------------ATAACTTCCCTCTAGACCTAGCTGCGGTTGAGGCTCCATCTATA-AATGGATAAAATTGTGGTCTTAATATATACGA
Cassia grandis GTTATGGCTTGAACGTAATGCTCATAACTTCCCTCTAGACCTAGCTGCGGTTGAGGCTTCATCTATA-AATGGATAAAATTGTGGTCTTAATATATACGA
Cassia roxburghii -------------------------ATACTTCCTCTAGACCTAGCTGCGGTTGAGGCTCCATCTATA-AATGGATAAAATTGTGGTCTTAATATATACGA
Ornithopus compressus --------------------------------------------------TCGAGGCTCCATCTATA-AATGGATAATTTTGGGGTTTTAAAGGATACGA
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga ----------------------------CCTTCTTGATATTGTTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTCTTCATATTCATACAA-TTTT--TTT-
Senna spectabilis GCTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAACCCTCTTGATATTGCTCCTTTACGTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTCTTCATATTCATACAAAT-CT--TTTT
Senna rugosa GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAACCCTCTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGCCTTTTTCTTCATATTCAAAAAA--TTT--TTT-
Senna cearensis GTTTTTGAATGTAAAGGAGCAATATCAACCCTCTTGATATTGTTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTCTTCATATTCATACAA----T--TTTT
Senna alata GTTTTTGAAAGTAAAGGAGCAATATCAAGAGGGTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTTTTAATAGTATTTTTCTTCATATTCATACAAATTCT--TTTT
Senna gardneri GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAACCCTCTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGCCTTTTTCTTCATATTCAAAAAA--TTT--TTT-
Senna macranthera ----------GTAAAGGAGCAATATCAACCCTCTTGATATTGTTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTCTTCATATTCATACAA----T--TTTT
Senna trachypus GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAACCTTCTTGATATTGTTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTCTTCATATTCATGCAA-TTTT--TTTT
Senna acuruensis GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAACCTTCTTGATATTGTTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTCTTCATATTCATGCAA-TTTT--TTTT
Senna georgica --------------AGGAGCAATATCAAGAGGTTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTT-----AGTCTTTTTCTTCATA--CAT-CAA---TT--TTCT
Senna occidentalis GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAACTCTCTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTGTTTTTCTTCATATTCATACAA-TTTT--TTTT
Senna splendida GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAAGAGGGTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGCCTTTTTCTTCATATTCAAAAAA--TTT--TTTT
Cassia javanica GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAAGAGGTTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTGTTCATA--CAT-CAA---TT--TTAT
Cassia fistula GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAAGAGGTTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTT-----AGTCTTTTTCTTCATA--CAT-CAA---TT--TTCT
Cassia grandis GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAAGAGGTTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTCTTCATA--CAT-CAA---TT--TTCT
Cassia roxburghii GTTTTTGAACGTAAAGGAGCAATATCAAGAGGTTTGATATTGCTCCTTTACTTTCTTTTTTAGTAGTCTTTTTCTTCATA--CAT-CAA---TT--TGAT
Ornithopus compressus GTTTTTGAAAGTAAAAGAGCAATATCAACAAAGTTGATATTGCCCTTTTACTTTTTTTTATTCTAATTATTTATTTACTACTTCAATATTCTTTAGCATT
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga A--------------CTTTA-----------CCATTA----------------AAATAATGATAAAGACAGAATACAAATGAAAAATATCTGAAATCTTT
Senna spectabilis ATTTACTTCAACATTCTTTA-----------ACAT-----------TATTTTAACATAAGAAAAAG-ATATTGGAGTTTCGTATTTT-TTTT-----CTT
Senna rugosa ATTTACTTCAATATTCTTTC----------AATATTCTTTAA----CATTTTAACATAAGAAAAAG-ATATTGGAGTTTCTTACTTTTTTTT-----CTT
Senna cearensis TTTTACTTCAATATTCTTTA-----------ACAT-----------TATTTTAACATAAGAAAAAG-ATATTGGAGTTTCGTACTTT-TTTTTGTTTCTT
59
Senna alata ATTTACTTCAACATTCTTTA-----------ACAT-----------TATTTTAACATAAGAAAAAAAATATTGGAGTTTCATACTTTTTTTTTTTTT---
Senna gardneri ATTTACTTCAATATTCTTTC----------AATATTCTTTAA----CATTTTAACATAAGAAAAAG-ATATTGGAGTTTCTTACTTTTTTT------CTT
Senna macranthera TTTTACTTCAATATTCTTTA-----------ACAT-----------TATTTTAACATAAGAAAAAG-ATATTGGAGTTTCGTACTTT-TTTTTGTTTCTT
Senna trachypus A--------------CTTTA-----------CCATTA----------------AAATAATGATAAAGGCAGAATACAAATGAAAAATATCTGACATTCTT
Senna acuruensis A--------------CTTTA-----------CCATTA----------------AAATAATGATAAAGGCAGAATACAAATGAAAAATATCTGAAATTCTT
Senna georgica AGTTACTTCAACATTCTTTA----TTCTTTAACAT-----------TATTTTAACATAAGAAAAAGGATATTGGAGTTTCATACTTTCTTTTTGTTGCTT
Senna occidentalis ATTTACTTCAACATTCTTTA-----------ACATTAGAAAAAGATAAATGATAAAAAATGATAAAGAAAGAATACAAATGAAAAATATCTGTAATT-TT
Senna splendida ATTTACTTCAATATTCTTTA----------ACATTATTTTAA----CATTTTAACATAAGAAAAAG-ATATTGGAGTTTCTTACTTTTTTT------CTT
Cassia javanica ATTTACTTCAACATTCTTTA-----------ACAT-----------TATTTTAACATAAGAAAAAGGATATTGGAGTTTCATACTTTCTTTTTGTTTCTT
Cassia fistula AGTTACTTCAACATTCTTTA----TTCTTTAACAT-----------TATTTTAACATAAGAAAAAGGATATTGGAGTTTCATACTTTCTTTTTGTTGCTT
Cassia grandis ATTTACTGCAACATTCTTTA-----------ACAT-----------TATTTTAACATAAGAAAAAGGATATTGGAGTTTCATACTTTCTTTTTGTTGCTT
Cassia roxburghii ATTTATTTCAACATTCTTTAACATTATTTTAACATAAGAAAAAGGATATTGTAACATAAGAAAAAGGATATTGGAGTTTCATACTTTCTTTTTGTTGCTT
Ornithopus compressus GTTTATTTTCACATAATCATTTTTTTTTATCTAATTTGAGAGGA--TGAGTAAGAACTTAGAAAAAAAAAGGGGGGGGTTAAAATAGAAGAATGGGTTAT
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga TTTT------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTATGATAAATCCTT-----TCT--------------------------------------------------------
Senna rugosa TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTAAGATCAATCCTT-----TCT--------------------------------------------------------
Senna cearensis TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTATGATCAATCCTT-----TCT--------------------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTAAGATCAATCCTT-----TCT--------------------------------------------------------
Senna macranthera TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTATGATCAATCCTT-----TCT--------------------------------------------------------
Senna trachypus TTTTAGATAGTATAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGGATTGTGAATCCACCATGCGCGA------------------------------
Senna acuruensis TTTTAGATAGTATAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGAT---------------------------------------------------------------
Senna georgica TTTTTACTAATTTCTACGTTTTTCTGATCAATCTTTCTTTCTCTTTTGAAATGTAAA-----------AAGACAAATGAATGTTTAAATTGGAGTCTATC
Senna occidentalis TTTTATATAGTATAGGGGCGGA------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTAAGATCAATCCTT-----TCT--------------------------------------------------------
Cassia javanica TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTCTGATCAATCTTTCTTTCTCTTTTGAAATGTAAA-----------AAGACAAATGAATGTTTAAATTGGAGTCTATC
Cassia fistula TTTTTACTAATTTCTACGTTTTTCTGATCAATCTTTCTTTCTCTTTTGAAATGTAAA-----------AAGACAAATGAATGTTTAAATTGGAGTCTATC
Cassia grandis TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTCTGATCAATCTTTCTTTCTCTTTTGAAATGTAAA-----------AAGACAAATGAATGTTTAAATTGGAGTCTATC
Cassia roxburghii TTTT-ACTAATTTCTACGTTTTTCTGATCAATCTTTCTTTCTCTTTTGAAATGTAAATGAAATGTAAAAAGACAAATGAATGTTTAAATTGGAGTCTATC
Ornithopus compressus TTTTACTAAGTATCGG------------------------------------------------------------------------------------
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ------TATAAGACGAGGAAAAACTTAAAAATAATGATAAAGAAA--GAATACAAATGAAAAAATATCTGTAATTT---TTTTTAGATAGTTTAGATAGT
Senna rugosa ------TAGAAGACGAGGAAAAACTTTAAAATAATGAAAAAT-----TAATCTTTTTTAGATAGTATAG-------------------------------
Senna cearensis ------TAGAAGACGAGGAAAAACTCAAAAATAATGATAAAGAAA--GAATACAAATGAAAAA-TATCTGTAATTT---TTTTT-------TTAGATAG-
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ------TAGAAGACGAGGAAAAACTTTAAAATAATGAAAAAT-----TAATCTTTTTTAGATAGTATAGGGGCGGATGTA--------------------
Senna macranthera ------TAGAAGACGAGGAAAAACTCAAAAATAATGATAAAGAAA--GAATACAAATGAAAAA-TATCTGTAATTT---TTTTT-------TTAAATAGT
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica GTATCTTAGAAGACGAGGAAAAACTTTTAAATAATGATAAAGAAA--GAATACAAATGCAAA--TCTCTGTAATTT---TTAGATAGTATAGGGGCGGAT
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ------TAGAAGACGAGGAAAAACTTTAAAATAATGAAAAATATCTTTAATCTTTTTTAGATAGTATAGGGGCGGA------------------------
60
Cassia javanica GTATCTTAGAAGACGAGGAAAAACTTTTAAATAATGATAAAGAAA--GAATACAAATGCAAA--TCTCTGTAATTT---TTAGATAGTATAGGGGCGGAT
Cassia fistula GTATCTTAGAAGACGAGGAAAAACTTTTAAATAATGATAAAGAAA--GAATACAAATGCAAA--TCTCTGTAATTT---TTAGATAGTATAGGGGCGGAT
Cassia grandis GTATCTTAGAAGACGAGGAAAAACTTTTTAATAATGATAAAGAAA--GAATACAAATGCAAA--TCTCTGTAATTT---TTAGATAGTATAGGGGCGGAT
Cassia roxburghii GTATCTTAGAAGACGAGGAAAAACTTTTTAATAATGATAAAGAAG--GAATACAAATGCAAA--TCTCTGTAATTT---TTAGATAGTATAGGGGCGGAT
Ornithopus compressus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
510 520 530 540
....|....|....|....|....|....|....|....|....|.
Senna multijuga ----------------------------------------------
Senna spectabilis ATAGGGG---------------------------------------
Senna rugosa ----------------------------------------------
Senna cearensis ----------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------
Senna macranthera A---------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------
Senna georgica GT--------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------
Cassia javanica GTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGGATTG-----------------
Cassia fistula GTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGT-----------------------
Cassia grandis GTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGGATTGTGAATCCCCCCTGCCGC
Cassia roxburghii GTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGT-----------------------
Ornithopus compressus ----------------------------------------------
Apendice C. Alinhamento das sequências do gênero Casearia com o marcador psbA-trnH.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Casearia sylvestris var. sylve -----------------------AAGTTTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTTTGTACGGGTTCTTGAAAA-------------ACTA
Casearia sylvestris var. sylve --------------CTGTTGTCGAAGTTTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTTTGTACGGGTTCTTGAAAA-------------ACTA
Casearia sylvestris var. lingu -----TAGACCTAGCTGTTGTCGAAGTTTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTTTGTACGGGTTCTTGAAAA-------------ACTA
Casearia sylvestris var. lingu --------------------------TTTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTTTGTACGGGTTCTTGAAAA-------------ACTA
Casearia sylvestris intermedia -----------------------GAGTTTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTTTGTACGGGTTCTTGAAAA-------------ACTA
Casearia sylvestris intermedia -------GACCTAGCTGTTGTCGAAGTTTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTTTGTACGGGTTCTTGAAAA-------------ACTA
Casearia sylvestris intermedia ---------------TGTTGTCGAAGTTTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTTTGTACGGGTTCTTGAAAA-------------ACTA
Casearia gossypiosperma ---------------------------TTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTGCGTACGGGTTCTTGAAAA-------------ACTA
Casearia rupestris CCCTCTAGACCTAGCTGTTGTCGAAGTTTCATCTACAAATGGATAAGACTTCGGT---CTTAGTGTGTACGGGTTCTTGAAAACTAAAAGACTAAAACTA
Salix alba -----CTCTATTTACAATTACCAAGATTCGAATTTCTAACATTTACCATTTAATTTAACCGTTTTTTTATAAGTCTTAAAAGAAAGAAATACAAAAGGAA
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Casearia sylvestris var. sylve AAAAAA---------GGAGCAAT-ACCAAC---CCTGATAGAACAAGAAATTGGCGATTGCTCCTTTTTTTAGTTTTAGTCTTTTTTTCTTTTGTTTTTT
Casearia sylvestris var. sylve AAAAAA---------GGAGCAAT-ACCAAC---CCTGATAGAACAAGAAATTGGCGATTGCTCCTTTTTTTAGTTTTAGTCTTTTTTTCTTTTGTTTTTT
Casearia sylvestris var. lingu AAAAAA---------GGAGCAAT-ACCAAC---CCTGATAGAACAAGAAATTGACGATTGCTCCTTTTTTTAGTTTTAGTCTTTTTTTCTTTTGTTTTTT
Casearia sylvestris var. lingu AAAAAA---------GGAGCAAT-ACCAAC---CATAATAGAACAAGAAATTGGCGATTGCTCCTTTTTTTAGTTTTAGTCTTTTTTTCTTTTGTTTTTT
Casearia sylvestris intermedia AAAAAA---------GGAGCAAT-ACCAAC---CCTGATAGAACAAGAAATTGGCGATTGCTCCTTTTTTTAGTTTTAGTCTTTTTTTCTTTTGTTTTTT
61
Casearia sylvestris intermedia AAAAAA---------GGAGCAAT-ACCAAC---CATAATAGAACAAGAAATTGGCGATTGCTCCTTTTTTTAGTTTTAGTCTTTTTTTCTTTTGTTTTTT
Casearia sylvestris intermedia AAAAAA---------GGAGCAAT-ACCAAC---CATAATAGAACAAGAAATTGGCGATTGCTCCTTTTTTTAGTTTTAGTCTTTTTTTCTTTTGTTTTTT
Casearia gossypiosperma AAAAAA---------GGAGCAATCGCCAATT-TCTTGTTCTATCAGGGGGTTGGT-ATTGCTCCTTTTTTTAGTTTTAGTCTTTTTTTCTTTTGTTTTTT
Casearia rupestris ACAAAA---------CGAGCAATCGCCAACC-CCCTGATAGAACAAGAAATTGGCGATTGCTCGTTTTGTTATTTTTA----------------------
Salix alba AAAAAAAGTATTTAAGGAGCAAT-GCCAACCCTCTTGATAGAACAAGAAATTGGCGATTGCTCCTTTTTTTTTTCAAAAGCTCGTACACACTAAGACAAA
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Casearia sylvestris var. sylve ACTATTTTGTATTTTACTATAGAGTAGTTTTACTATAGAGTATTAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGGA--------------------
Casearia sylvestris var. sylve ACTATTTTGTATTTTACTATAGAGTAGTTTTACTATAGAGTATTAGGGGCGGAT----------------------------------------------
Casearia sylvestris var. lingu ACTATTTTGTATTTTACTATAGAGTAGTT-----------------------------------------------------------------------
Casearia sylvestris var. lingu ACTATTTTGTATTTTACTATAGA-----------------------------------------------------------------------------
Casearia sylvestris intermedia ACTATTTTGTATTTTACTATAGAGTAGTTTTACTATAGAGTATTAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGGATTGTGAATCCACCATGCGCG
Casearia sylvestris intermedia ACTATTTTGTATTTTACTATAGAGTAGTTTTACTATAGAGTATTAGGG-CGGAT----------------------------------------------
Casearia sylvestris intermedia ACTATTTTGTATTTTACTATAGAGTAGTTTTACTATAGAGTATTAGGGGCGGA-----------------------------------------------
Casearia gossypiosperma ACTATTTTGTGTTTTACTATAGAGTATTAGGGGCG-----------------------------------------------------------------
Casearia rupestris ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Salix alba AGTCTTAT-CCCTTTACAAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGAGCTTCG---------------------------------------------------
.
Casearia sylvestris var. sylve -
Casearia sylvestris var. sylve -
Casearia sylvestris var. lingu -
Casearia sylvestris var. lingu -
Casearia sylvestris intermedia A
Casearia sylvestris intermedia -
Casearia sylvestris intermedia -
Casearia gossypiosperma -
Casearia rupestris -
Salix alba -
Apêndice D. Alinhamento das sequências dos gêneros Senna e Cassia com o marcador rbcL.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ---------------------------------------GTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATAT
Senna rugosa --CAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGGTTCAAAGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTGAATTATTATACTCCTGATTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Senna cearensis ---------------------------------------------------------------------------------------------------T
Senna georgica --------------------------------------------------------TTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Senna occidentalis ------------------------------------------------------------CTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATAT
Senna acuruensis -----------------------------------------------------------ACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Senna alata ---------------------------------------------------------------------------ACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Senna gardneri ---------------------------------------------AAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Senna macranthera -------------------------------------------------------------TTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
62
Senna trachypus -----------------------------------------------------------------------CCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia javanica ------------------------------------------------------AATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Cassia grandis CACAAACAGAAACTAAAGCAAGTGTTGGGTTCAAAGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Cassia roxburghii -------------------AAGTGTTGGGTTCAAAGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
Ornithopus compressus ------------------------------------CTGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATAT
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
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Senna multijuga -----------TCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna spectabilis CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna rugosa CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna cearensis CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna georgica CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna occidentalis CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna acuruensis CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna alata CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAGGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna gardneri CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna macranthera CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna trachypus CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Senna splendida -TTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Cassia javanica CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Cassia grandis CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Cassia roxburghii CTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
Ornithopus compressus CTTAGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCCGAAGAAGCAGGTGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACACCGGTG
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
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Senna multijuga TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna spectabilis TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGATAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna rugosa TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAGTCAATTTATTGCTTATGTAGCTT
Senna cearensis TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna georgica TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna occidentalis TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCGT
Senna acuruensis TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna alata TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna gardneri TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna macranthera TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna trachypus TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Senna splendida TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAGTCAATTTATTGCTTATGTAGCTT
Cassia javanica TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Cassia grandis TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Cassia roxburghii TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
Ornithopus compressus TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATACATTGCTTATGTAGCTT
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
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Senna multijuga ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
63
Senna spectabilis ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna rugosa ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna cearensis ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCGATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna georgica ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna occidentalis ATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna acuruensis ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna alata ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGATTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna gardneri ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna macranthera ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCGATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna trachypus ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Senna splendida ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Cassia javanica ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Cassia grandis ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Cassia roxburghii ATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGA
Ornithopus compressus ATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTAGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCTCTTCGCGCTCTACGTCTGGA
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
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Senna multijuga GGATTTGCGAATCCCTAATTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna spectabilis GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna rugosa GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATGTTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna cearensis GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna georgica GGATTTGCGAATCCCTATTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna occidentalis GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna acuruensis GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATATTAAAACCTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna alata GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna gardneri GGATTTGCGAATCCCTAATTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna macranthera GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna trachypus GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATATTAAAACCTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Senna splendida GGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATGTTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Cassia javanica GGATTTGCGAATCCCTATTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Cassia grandis GGATTTGCGAATCCCTATTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCCCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGTCCCCTA
Cassia roxburghii GGATTTGCGAATCCCTATTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTA
Ornithopus compressus GGATTTGCGAATTCCTAATGCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGAATCCAAGTGGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGCCCTCTA
510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
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Senna multijuga TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCC---------------------------
Senna spectabilis TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGG--------------------------------------------------
Senna rugosa TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTACCAAAGATG-
Senna cearensis TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAAGATG
Senna georgica TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCTGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAA----
Senna occidentalis TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTT-----------
Senna acuruensis TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCTGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAAGATG
Senna alata TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAAGATG
Senna gardneri TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTG---------------------
Senna macranthera TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTG---------------
Senna trachypus TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCTGTTTATGAATGTCTCCGCGG-----------------------
64
Senna splendida TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTT----------
Cassia javanica TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAAGATG
Cassia grandis TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAAGATG
Cassia roxburghii TTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAAGATG
Ornithopus compressus TTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTTCGCGGGGGGCTTGATTTTACTAAAGATG
610 620 630 640 650 660 670 680 690 700
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna cearensis ATGAGAATGTGAATTCCCAACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCA----------------------------------------------------
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ATGAGAA---------------------------------------------------------------------------------------------
Senna alata A---------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia javanica ATGAGAATGTGAATTCCCAACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCTGCTTTTGTGCCGAAGCACTTTATAAAGCACAGGCCGAAA-------------
Cassia grandis ATGAGAATGTGAATTCCCAACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCTGCTTTTGTGCCGAAGCACTTTATAAAGCACAGGCCGAAACAGGTGAAATCAA
Cassia roxburghii ATGAGAATGTGAATTCCCAACCATTT--------------------------------------------------------------------------
Ornithopus compressus ATGAAAATGTGAACTCCCAACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCTTATTTTGTGCTGAAGCCCTTTTTAAAGCACAGGACGAAACAGGTGAAATCAA
710 720 730 740 750 760 770 780 790 800
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Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna cearensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia javanica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia grandis AGGGCATTACTTGAATGCTACGGCAGGTACATGCGAAGAAATGATCAAAAGAGCTGTATTTGCCCGAGAATTGGGCGTTCCTATCGTAATGCATGACTAC
Cassia roxburghii ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Ornithopus compressus AGGGCATTACTTGAATGCTACTGCCGGTACATGCGAAGAAATGATAAAAAGA------------------------------------------------
810 820 830 840 850 860 870 880 890 900
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Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
65
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna cearensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia javanica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia grandis TTAACAGGAGGATTCACTGCAAATACTAGCTTGGCTCATTATTGCCGGGATAATGGTCTACTTCTTCATATCCATCGTGCAATGCATGCAGTTATCGATA
Cassia roxburghii ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Ornithopus compressus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000
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Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna cearensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia javanica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia grandis GACAGAAGAATCATGGTATGCACTTTCGTGTACTAGCTAAAGCGTTACGCTTGTCTGGTGGAGATCATATTCACGCTGGTACCGTAGTAGGTAAACTTGA
Cassia roxburghii ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Ornithopus compressus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100
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Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna cearensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
66
Cassia javanica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia grandis AAGGGAAAGAGAGATCACTTTAGGCTTTGTTGATTTACTACGTGATGATTTTATTGAAAAAGATCGAAGCCGCGGTATTTATTTCACTCAGGATTGGGTC
Cassia roxburghii ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Ornithopus compressus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna cearensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia javanica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia grandis TCTCTGCCGGGTGTTCTGCCCGTTGCTTCGGGGGGTATTCACGTTTGGCATATGCCGGCTCTTACCGAGATCTTTGGAGATGATTCCGTACTACAATTCG
Cassia roxburghii ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Ornithopus compressus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300
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Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna cearensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia javanica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia grandis GTGGAGGAACTTTAGGGCACCCTTGGGGAAATGCACCCGGTGCCGTAGCTAATCGAGTAGCTCTAGAAGCATGTGTACAGGCTCGTAATGAGGGACGTGA
Cassia roxburghii ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Ornithopus compressus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
67
Senna cearensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna occidentalis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna acuruensis ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna alata ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna gardneri ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna macranthera ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna trachypus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna splendida ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia javanica ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Cassia grandis TCTTGCTCGTGAGGGTAATGAAATTATTCGTGAGGCTAGCAAATGGAGTCCTGAATTAGCTGCTGCTTGTGAAGTATGGAAGGAGATCAAATTTGAATTC
Cassia roxburghii ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Ornithopus compressus ----------------------------------------------------------------------------------------------------
1410 1420
....|....|....|....|.
Senna multijuga ---------------------
Senna spectabilis ---------------------
Senna rugosa ---------------------
Senna cearensis ---------------------
Senna georgica ---------------------
Senna occidentalis ---------------------
Senna acuruensis ---------------------
Senna alata ---------------------
Senna gardneri ---------------------
Senna macranthera ---------------------
Senna trachypus ---------------------
Senna splendida ---------------------
Cassia javanica ---------------------
Cassia grandis CCAGCAATGGATACTTTGTAA
Cassia roxburghii ---------------------
Ornithopus compressus ---------------------
Apêndice E. Alinhamento das sequências dos gêneros Casearia com o marcador rbcL.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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Casearia sylvestris intermedia AGGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
Casearia sylvestris intermedia ------------AAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
Casearia sylvestris intermedia ---------------------AATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
Casearia sylvestris var. lingu ---------------------AATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
Casearia sylvestris var. lingu ----TGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
Casearia sylvestris var. sylve ---------------------AATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
Casearia sylvestris var. sylve ------------AAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
68
Casearia gossypiosperma -----GGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
Casearia rupestris ------------AAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGG
Salix albA -----------------TATAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGG
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Casearia sylvestris intermedia GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Casearia sylvestris intermedia GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Casearia sylvestris intermedia GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Casearia sylvestris var. lingu GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Casearia sylvestris var. lingu GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Casearia sylvestris var. sylve GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Casearia sylvestris var. sylve GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Casearia gossypiosperma GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACCGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Casearia rupestris GGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
Salix albA AGTTCCGCCCGAGGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCGGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAT
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Casearia sylvestris intermedia AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Casearia sylvestris intermedia AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Casearia sylvestris intermedia AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Casearia sylvestris var. lingu AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Casearia sylvestris var. lingu AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Casearia sylvestris var. sylve AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Casearia sylvestris var. sylve AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Casearia gossypiosperma AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Casearia rupestris AAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTA
Salix albA AAGGGACGATGCTACGACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAGGAAGGTTCTGTTA
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
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Casearia sylvestris intermedia CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Casearia sylvestris intermedia CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Casearia sylvestris intermedia CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Casearia sylvestris var. lingu CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Casearia sylvestris var. lingu CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Casearia sylvestris var. sylve CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Casearia sylvestris var. sylve CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Casearia gossypiosperma CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGCCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Casearia rupestris CTAACATGTTTACTTCTATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAAC
Salix albA CTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATTCCTACTGCTTATGTTAAAAC
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
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Casearia sylvestris intermedia TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
Casearia sylvestris intermedia TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
Casearia sylvestris intermedia TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
69
Casearia sylvestris var. lingu TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
Casearia sylvestris var. lingu TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
Casearia sylvestris var. sylve TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
Casearia sylvestris var. sylve TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
Casearia gossypiosperma TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
Casearia rupestris TTTCCAAGGCCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTATGGCCGTCCACTATTGGGCTGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA
Salix albA TTTTCAAGGCCCACCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAATAAGTAT---------------------------------------------
510 520 530 540 550 560 570
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Casearia sylvestris intermedia TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTA-CGCGGTGGACTTGATTTTACTAAAGATGACGAGAAC
Casearia sylvestris intermedia TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTA-CGCGGTGGACTTGATTTTACTAAAGATGACGAGAA-
Casearia sylvestris intermedia TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTA-CGCGGTGGACTTGATTT-------------------
Casearia sylvestris var. lingu TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTA-CGCGGTGGACTTGATT--------------------
Casearia sylvestris var. lingu TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTA-CGCGGTGGACTTGATTT-------------------
Casearia sylvestris var. sylve TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTA-CGCGGTGGACTTGATTTTACTAAAGATGAC------
Casearia sylvestris var. sylve TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTAGCGCGGTGGACTTGATTTTACTAAAGATGACGAG---
Casearia gossypiosperma TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTA-CGCGG-------------------------------
Casearia rupestris TCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTA-C-----------------------------------
Salix albA ----------------------------------------------------------------------------
Apêndice F. Alinhamento das sequências dos gêneros Senna e Cassia com o marcador ITS2.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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Senna multijuga ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna spectabilis ----------------TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCA-TTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACGCATCGTTGCCCCAAGC
Senna rugosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------
Senna georgica ------CCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCA-CTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACACAACGTTGTTCCCAAC
Senna occidentalis AGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCA-CTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACGCATCGTTGCCCCAAAC
Senna acuruensis -----------------CGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCA-CTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACGCATCGTTGCCCCGAAC
Senna splendida ----------GAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCACTTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACGCATCGTATCCCCAAAC
Senna cearensis AGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCA-CTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACGCATCGTTGCCCCAAAC
Ornithopus compressus AGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGATGCCA-TTAGGTTGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACACATCGTTGCCCCAACT
Cassia fistula AGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCA-CTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACACAACGTTGTTCCCAAC
Cassia grandis AGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCA-ATAGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACACAACGTTGCCCC---C
Cassia javanica AGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCA-ATAGGCCGAGGGCATGTCTGCCTGGGCGTCACACAACGTTGCCCATAAT
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
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Senna multijuga ---GTCGTCCCTCCGGTTAATCGGAGCGGCCGA--GGTGCTTGGGC-GGAA-GTTGGCCTCCCGTGAGCCCCTGCCTCGCGGATGGTTGAAAATGGAGCC
Senna spectabilis CCTGCCGTGCCTCCTGTTGATCGGGGCAGGCGG--GTTGCTTGGGC-GGAA-TCTGGCCTCCCGTGAGAAC-TGGCTCGTGGATGGCCGAAAGTAGAGCC
Senna rugosa --CACCGTCCCTCCGATCGGTCGGGGCAGGCGA--GGTGCTTGGGG-GGAA-TTTGCCCTCCCGTGAGCCG-TGTCTTGCGGATGGTCGAAAAAGGTGCC
Senna georgica CCCATTCTCGCTCCCTCCCACCGGAGCGGCGGGATGGTGGTTGGGGAGGAA-GTTGGCCTCCCGTGAGCGT-GGCCTCGCGGATGGCTGAAAGACGAGCC
70
Senna occidentalis CACGTCGTCCCTCCGGTATGTCGGAGCGGGCGA--GGTGCTTGGGC-GGAA-GTTGGCCTCCCGTGAGCAA-TGCCTCGTGGATGGTTGAAAAAGGAGCC
Senna acuruensis CACGTCGTCCCTCCGGTTGGTCGGAGCGGGCGA--GGTGCTTGGGC-GGAA-GTTGGCCTCCCGTGAGCCCCTGCCTCGCGGATGGTTGAAAATGGAGCC
Senna splendida CACATCGTCCCACCGATCGGTCGGGGCAGGCGA--GGTGCTTGGGG-GAAA-GTTGGCCTCCCGTGAGCCG-TGTCTTGCGGATGGTCGAAAAAGGTGCC
Senna cearensis CGCGTCGTCCCTCCGGTCGGTCGGAGCGGGCGA--GGTGGTTGGGC-GGAA-GTTGGCCTCCCGTGAGCCCCTGCCTTGCGGATGGTTGAAAATGTAGCC
Ornithopus compressus CCTAACGCCTC-----------GAGCTAGGATG---ATACTTGGGG-CGAATGTTGGCGTCCCGTGAGATT-ACTCTCGCGGTTTGCTGAAATCTGAGTC
Cassia fistula CCCATTCTCGCTCCCTCCCACCGGAGCGGCGGGATGGTGGTTGGGGAGGAA-GTTGGCCTCCCGTGAGCGT-GGCCTCGCGGATGGCTGAAAGACGAGCC
Cassia grandis CAAGCAACCCCAC---------GAGGGAGGCGG----------GGC-AGAA-GCTGGCCTCCCGTGAGCAC-GGCCTCGCGGATGGCTGAAAGACGAGCC
Cassia javanica CCCATTCGCTCTCCCTCCCCATCAGAGGGGCGAGCGGTGGGCGGGGCGGAATGCTGGCCTCCCGTGAGCGC-GGCCTCGCGGATGGCTGAAAGATGAGCC
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Senna multijuga TGTGGGGGG-CGACCGCCACGTTCCACGGTGGATGAGCAGA---TGCCTCGAGACCGACCGTGCGCGAGCCGTCCCTACGTTTTGGCTGCGAGACCCTTA
Senna spectabilis TGCGGGTGG-GCATTGCCACGCTCCACGGTGGATGAGCTGA---TGCCTCGAGATCGATCGTGCGCGAGCTGTCCCCCTGTCCAGGCTGCAAGGCCCCCG
Senna rugosa TGTGGG-GG-CAGTCSCCACGTTCCACGGTGG-TGAGCAGA---TGTCTCGAGACCGACCGTGCGCTGGTTGTCCCGACTTATAGGCTGTCGTGCCCTTG
Senna georgica TGTGGGGGAGCGATCACCACGTTCCACGGTGGATGAGCAGAAAATGGCTTGATACCGATCGTGCGTGAGTCGTGCCCCC-------CTGTTGGGCTCTTG
Senna occidentalis TGTGGGGGGGCGACCGCCACGTTCCACGGTGGATGAGCGCT---AGCCTCGAGACCGAACGTGCGCGAGCTGTCCCTCCGACTAGGCTGCGAGACCCTTG
Senna acuruensis TGTGGGGGGGCGACCGCCACGTTCCACGGTGGATGAGCAGA---CGCCTCGAGACCGACCGTGCGCGAGCTGTCCCTACGTTTAGGCTGCGAGACCCTTT
Senna splendida TGCGGG-GG-CAGTGGCCACGTTCCACGGTGGATGAGCAGA---TGTCTCGAGACCGATCGTGCGCTGGTTGTCCCGACGTATAGGCTGCCACGCCCTTG
Senna cearensis TGTGGGGGG-CGACCGCCATGTTCCACGGTGGATGAGCAGG---TGCCTCGAGACCGACCATGCGCGAGCTGTCCCTACGGCTAGGCTGCGAGACCCTTG
Ornithopus compressus CATGGTATG-TGTTTTCCATGATGGATGGTGGTTGAGTACA----ATCTCGAAGGCCAATCAACGAAAACTCTACTCTTCTCGGGCTCCTGTGACCCATA
Cassia fistula TGTGGGGGAGCGATCACCACGTTCCACGGTGGATGAGCAGAAAATGGCTTGATACCGATCGTGCGTGAGTCGTGCCCCC-------CTGTTGGGCTCTTG
Cassia grandis TGTGGGGAG-CGAACACCACGTTCCACGGTGGATGAGCAGAAACTGCCTCGATGCCGATCGTGCGTGAGTCGCATCCCCC------CCACCCGGGCTCCG
Cassia javanica TGTGGGGGAGCGATCACCACGGTCCACGGTGGATGAGCAGGGAATGCCTTGATACCGACCGTGCGTGCGT------------------------------
310 320 330 340 350 360 370 380
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Senna multijuga CGAGCGAGGATGCGCTCCCAACGCGACC-----------------------------------------------------
Senna spectabilis GTGGTGTGAATGCGCTCCCGACGCGACCCCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAAGGA
Senna rugosa GGAGCCATGAAGCTCTCTCAATGCGACCCCAGGTCAGGCGG----------------------------------------
Senna georgica GACCCTCGTTCGTTCTCCTAACGCGACCCCAGGTC----------------------------------------------
Senna occidentalis CGAGCGAGGAATCGCTCCCAACGCGACCCCAGG------------------------------------------------
Senna acuruensis CGAGCGAGGATGCGCTCCCAACGCGACCCCAG-------------------------------------------------
Senna splendida GGAGCCATGAAGCTCTCCCAATGCGACCCC---------------------------------------------------
Senna cearensis CGAGCGAGGATGCGCTCCCAACGCGACCCCAGG------------------------------------------------
Ornithopus compressus TGCGTTAAAGTGCGCTTACAA------------------------------------------------------------
Cassia fistula GACCCTCGTTCGTTCTCCTAACGCGACCCC---------------------------------------------------
Cassia grandis CGACCCTAA---TTCTCCCAACGCGACCCCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTG----------------------------
Cassia javanica ---------------------------------------------------------------------------------
Apêndice G. Alinhamento das sequências dos gêneros Casearia com o marcador ITS2.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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71
Salix alba CAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCCTGGTCGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACGCATCGTCGCCCCCGCT
Casearia rupestris ----ATCCCGTGGACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTACTGGCCGAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCACGCATCGTCGCCCCCACC
Casearia sylvestris var. lingu ----------------ATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGCGGCCTACTGGCCTAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCACGCGTCGTCACCCCAGAG
Casearia gossypiosperma ---------GTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTACTGGCCGAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCACGCGTCGTCGCCCCCGGG
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
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Salix alba CCCCTCGGC---TCACGAGGGCGGGGGCGGATACTGGTCTCCCGCGCGCTCCCGCCCGTGGTTGGCCTAAAA-TCGAGTCCCCGGCGACGGTCGCCACGA
Casearia rupestris CCAAGCCT----------GGGGCGGGGCGGAATTTGGCCTCCCGCGCGCTCCCGCTCGCGGTTGGCCCAAAA-TCGA-GTCCCGGCGGCGGTCGCCACGA
Casearia sylvestris var. lingu CCTCCCCT-----GGCGGGGGCCGGGGCGGATATTGGCCTCCCGCACGCTCCGGCTTGCGGTTGGCCCAAAA-TCGA-GTCCCGGCGACGGTCGCCACGA
Casearia gossypiosperma CCCTCCCCCAAGCGGGGGGGCGGGGGGCGGATGTTGGCCTCCCGCGCGCTCCCGCTCGCGGTTGGCCCAAAAATCGAAGTCCCGGCGACGGTCGCCACGA
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Salix alba CAAGCGGTGGTTGAGAGACCCTCGGACACGGTCGTGCGCGTGC-TCGTCGCCC--CCGGACCTCCCGGACCCCCGAGCATTGGCTTTCAAGGATGCTCTC
Casearia rupestris CGAGCGGTGGTTGAGAGACCCTCGGACACGGTCGTGCGCGCGCCCAGTCGCCAGTTCGGGCCTCA-GGACCCT---------------------------
Casearia sylvestris var. lingu CGAGCGGTGGTTGAGAGACCCTCGGACACGGTCGTGAGCGTGCCTCGTCGCCCGTTCGGGCCTCACGGACCCTCGAGCGCCGGTTTGC--GGACGCTCTC
Casearia gossypiosperma CGAGCGGTGGTTGAGAGACCCTCGGACACGGTCGTGCGCGTGCCTCGTCG--------GACCTCACGGACCCTCGAGCGCCGGTTTGC--GGACGCTCTC
310 320 330 340
....|....|....|....|....|....|....|....|.
Salix alba GTT-GCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGTGAGTTTAA
Casearia rupestris -----------------------------------------
Casearia sylvestris var. lingu GTTTGTGAC--------------------------------
Casearia gossypiosperma GTTTGCGACCC------------------------------
8
