UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA … · se o que quero dizer-te é que te...

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

EFEITO DA ADIÇÃO DE ANTIOXIDANTE (Trolox®) AO MEIO DE MANUTENÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS

PRODUZIDOS IN VIVO E AO MEIO DE TRANSPORTE DE OÓCITOS BOVINOS ASPIRADOS DE OVÁRIOS

PROVENIENTES DE ABATEDOURO

Roberta Machado Ferreira

Médica Veterinária

JABOTICABAL – SP - BRASIL

2008

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

EFEITO DA ADIÇÃO DE ANTIOXIDANTE (Trolox®) AO MEIO DE MANUTENÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS

PRODUZIDOS IN VIVO E AO MEIO DE TRANSPORTE DE OÓCITOS BOVINOS ASPIRADOS DE OVÁRIOS

PROVENIENTES DE ABATEDOURO

Roberta Machado Ferreira

Orientador: Prof. Dr. Paulo Henrique Franceschini

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciência Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária (Reprodução Animal)

JABOTICABAL – SP - BRASIL Junho de 2008

Ferreira, Roberta Machado

F383e Efeito da adição de antioxidante (Trolox®) ao meio de manutenção de embriões bovinos produzidos in vivo e ao meio de transporte de oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de abatedouro / Roberta Machado Ferreira. – – Jaboticabal, 2008

xxii, 138 f. ; 28 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008 Orientador: Paulo Henrique Franceschini Banca examinadora: Francisco Guilherme Leite, Antônio Cláudio

Tedesco Bibliografia 1. Bovinos-embriões-antioxidante (Trolox®). 2. Bovinos-

transferência de embriões. 3. Bovinos-produção in vitro de embriões. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.

CDU 619:636.2

Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.

DADOS CURRICULARES DA AUTORA

ROBERTA MACHADO FERREIRA – filha de Roberto Gouvêa Ferreira e Claudina

Silva Machado, nascida em 02 de maio de 1982, na cidade de Campinas, São

Paulo, é Médica Veterinária formada pela Faculdade de Ciências Agrárias e

Veterinárias da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus

de Jaboticabal - UNESP, em 13 de janeiro de 2006, na cidade de Jaboticabal –

SP. Em março do mesmo ano ingressou no mestrado pelo Programa de Pós-

graduação em Medicina Veterinária, área de concentração: Reprodução Animal,

em mesma Instituição de ensino, sob orientação do Prof. Dr. Paulo Henrique

Franceschini. Durante o período de mestrado, realizou projetos de pesquisa junto

ao laboratório do Prof. Dr. Pietro Sampaio Baruselli, Departamento de Reprodução

Animal da Universidade de São Paulo – USP – São Paulo e junto ao laboratório do

Ph.D. Milo Wiltbank, Department of Dairy Science na Universidade de Wisconsin –

Madison – EUA, onde permaneceu por 6 meses.

“As mais lindas palavras de amor são ditasno silêncio de um olhar.” (Leonardo da Vinci)

Aos meus pais, amores da minha vida,

as pessoas mais maravilhosas que conheci!

Em vocês me espelho e me inspiro para tentar sempre ser o melhor!

Busco forças para alcançar meus objetivos e conquistar meus sonhos!

Por vocês tento ser uma pessoa que traga orgulho e faça a diferença!

Por vocês existo e sou feliz!!!!!!

Ao meu namorado,

que me deu sempre as palavras certas nas horas certas,

não me deixou desanimar e, além de trazer apoio de amigo,

ainda me deu o privilégio de receber seu amor.

Dedico

“Amo como ama o amor. Não conheço nenhuma outra razão para amar senão amar.

Que queres que te diga, além de que te amo, se o que quero dizer-te é que te amo?”

(Fernando Pessoa)

http://www.pensador.info/autor/Leonardo_da_Vinci/

http://www.pensador.info/autor/Fernando_Pessoa/

“Quero, um dia, dizer às pessoas que nada foi em vão...

Que o amor existe, que vale a pena se doar às amizades e às pessoas,

que a vida é bela sim e que eu sempre dei o melhor de mim...

e que valeu a pena.”

(Mário Quintana)

AGRADECIMENTOS

http://www.pensador.info/autor/Mario_Quintana/

“Há duas formas para viver a sua vida: Uma é acreditar que não existe milagre.

A outra é acreditar que todas as coisas são um milagre.” (Albert Einstein)

À Deus, por ter permitido que eu nascesse em uma família tão maravilhosa e cheia de

amor. Por ter criado um mundo tão lindo, com a natureza exuberante e animais fantásticos e

ter guiado meus passos para uma profissão que me mantém em pleno contato com tudo isso!

Minha profissão exige trabalho árduo, mas me leva a lugares abençoados e cheios de paz......

Depois de um dia de trabalho, não há nada tão gratificante quanto ver um filhote nascendo,

ouvir o barulhinho calmante das águas e do mato e assistir um lindo pôr-do-sol à beira de

um lago!!!!!! Obrigada mesmo!!!

Aos meus amados pais biológicos, Claudina Silva Machado e Roberto Gouvêa

Ferreira, que são as grandes jóias da minha vida, por terem me concedido a vida e me

ensinarem a vivê-la com plenitude, honestidade, entusiasmo e paixão. Por terem me mostrado

como ser uma pessoa de princípios, a respeitar todos os indivíduos e ter gratidão. Por

patrocinarem meus estudos, projetos e diversões. Principalmente por terem comigo um amor

incondicional e cumplicidade eterna. Saibam que amo vocês com todo meu coração e que tudo

que faço na vida é pensando em trazer-lhes orgulho e alegria!!!!!!! AMO MUITO

VOCÊS!!!!

Aos meus queridos pais do coração, tio Chico (Francisco Eduardo Lima Corrêa

Silva) e Eliete Raquel Gomide, por trazerem alegria às pessoas que mais amo no mundo

(meus pais) e cuidarem delas com carinho e dedicação!!!! Por terem sempre me tratado e

amado como filha!!! Vocês são pessoas maravilhosas por quem terei carinho e gratidão

eterna!!!

Ao meu grande amigo, companheiro, cúmplice, parceiro e namorado Henderson

Ayres, por todos os ensinamentos, paciência, dedicação e ajuda durante os inúmeros

experimentos e na confecção desse trabalho. Por permitir que eu tivesse contato com uma

http://www.pensador.info/autor/Albert_Einstein/

família tão especial quanto a sua. Por todo amor e momentos maravilhosos de alegria e

companheirismo que passamos. Pelo apoio do dia-a-dia e pelo conforto de saber que posso

contar sempre com uma pessoa que confio e amo tanto. Você é uma pessoa muito especial na

minha vida! TE AMO!!

Aos meus primeiros irmãos “tortos” e muito queridos, Mariana da Rocha Corrêa

Silva e Daniel da Rocha Corrêa Silva, por terem feito a minha infância mais feliz, cheia de

bagunças, brigas e diversões que só existem entre verdadeiros irmãos. Hoje somos mais do

que grandes amigos e sabemos que temos uns aos outros pro que der e vier!!!!!

Aos meus segundos irmãos tortos, Maíla Gomide e Matheus Gomide, por terem

tornado minha família ainda maior e cheia de alegria!

À minha primeira e linda sobrinha, Isadora Rocha Corrêa Novaes. Mari e Henrique

Tahan Novaes, obrigada por terem me dado a grande alegria de ser titia!!!! Não há

palavras para descrever isso!!!!

Aos meus avós Ana Silva Machado, Wagner Gillet Machado, Roberto Ferreira e

Inah Gouvêa Ferreira (in memorian) por terem sido grandes pais na educação e no amor!!!!

Com certeza o que sou hoje se deve em grande parte aos esforços e afetos de vocês!!!!!

Aos meus avós do coração Haydée da Costa Lima Silva e Cyro Corrêa Silva (in

memorian), por todo afeto sincero, simplicidade e alegria. Vocês são um exemplo de casal e

modelo de pessoas!

Aos meus padrinhos queridos Sandra Roberta Ferreira Vívolo e José Maurício Silva

Machado, por serem pessoas tão especiais! Meus pais com certeza tiveram muito critério e

sabedoria nessa escolha!!!!

Aos meus tios que tanto amo, Cíntia Ferreira Fagundes, Renato Júnior Arruda

Fagundes, Marco Antônio Vívolo, Gilda Marlise Sizanoski Machado, Luiz Wagner Silva

Machado e Antônio Alfredo Silva Machado (in memorian), por todos os incontáveis mimos e

pelos momentos deliciosos que tivemos juntos!!!!

Aos primos Thiago e Daniela Ferreira Fagundes, Érika e Carina Kocssis Machado,

Ana Luiza e Gabriela Sizanoski Machado. Pela alegria incrível da chegada de cada um de

vocês a família e por todos os momentos super divertidos que passamos juntos.

Ao meu querido orientador, pai e amigo Cocão (Prof. Dr. Paulo Henrique

Franceschini), pela confiança e apoio em meu trabalho, pelas conversas e lições de vida, pela

presença nos momentos difíceis e conselhos de pai. Por abrir meus olhos e me encorajar a

vencer os obstáculos da vida, sem nunca faltar com o amparo e olhar amigo. Por ser um

porto seguro e educador nato. Por me dar o privilégio de tê-lo como orientador e amigo pra

toda vida e proporcionar-me um convívio enriquecedor!!!!!! Espero ter lhe trazido orgulho e

momentos de alegria! Você é extremamente especial pra mim!

Ao amigo e veterinário Carlão (Carlos Alberto Rodrigues), que me recebeu de braços

abertos e sempre se mostrou solícito para ensinar e ajudar! Obrigada pelas oportunidades e

pelo ambiente alegre e descontraído de trabalho, pelas brincadeiras e risadas, pelas palavras

de amigo, pelo apoio constante e pela seriedade nos trabalhos! Obrigada por confiar na

minha capacidade e acreditar em mim! Sobretudo, obrigada pela amizade! Você é muito

querido!

À Fazenda Santa Rita (Agrindus/SA), proprietários e funcionários por terem aberto

“as porteiras” para meu aprendizado e realização do meu projeto. Cada um de vocês se

mostrou particularmente especial! Obrigada pela ajuda, apoio e pelos sorrisos diários que

fizeram do ambiente de trabalho um lugar muito gostoso.

Às veterinárias e amigas Alessandra Ambrósio Teixeira, Juliana Pinto Pieroni e

Maria Emilia Franco Oliveira pela grande ajuda e empenho na realização da parte de

campo desse projeto. Obrigada por proporcionarem momentos tão divertidos. Vocês são

grandes amigas!

À empresa Vitrogen (unidade Cravinhos), em especial à Dra. Yeda Fumie Watanabe

por me receberem tão bem e possibilitarem o desenvolvimento desse trabalho! Obrigada pelo

profissionalismo, seriedade e amizade!

Aos funcionários e amigos da empresa Vitrogen (unidade Cravinhos) pela ajuda na

realização desse trabalho e pelos momentos de alegria e descontração! Aline Patrícia do Val

Loffler, Ricardo Favati, Ane Rose Lopes da Silva, Laila de Castro Oliveira, Daniel e Aline,

foi realmente muito bom conhecê-los e trabalhar com vocês!

À Lagoa da Serra, especialmente à Dra. Lúcia Helena Rodrigues pelo fornecimento

de todas as palhetas de sêmen utilizadas nesse projeto. Obrigada pelo incentivo e apoio à

tantas pesquisas.

Ao Prof. Dr. Antônio Cláudio Tedesco e ao Departamento de Química da USP-

Ribeirão Preto, pela presteza, atenção e apoio durante todas as etapas desse projeto. Pelo

sorriso amigo, pelo carinho das palavras e pela colaboração como membro da banca

examinadora! O senhor foi fundamental nesse trabalho!

Ao Prof. Dr. Francisco Guilherme Leite pela amizade, ensinamentos e valiosas

sugestões como membro da banca examinadora desse projeto.

À “mãe” UNESP-FCAV (Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita

Filho” - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias) e à todo o corpo docente, discente e

funcionários dessa renomada Instituição! Obrigada pela oportunidade de completar minha

graduação e mestrado em uma unidade de nível tão reconhecido em todo o país. Por muito

tempo minha casa e família foi vocês!

Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado.

Aos Professores do Departamento de Reprodução Animal da UNESP: Paulo

Henrique Franceschini, César Roberto Esper, Joaquim Mansano Garcia, Francisco

Guilherme Leite, Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, Gilson Hélio Toniollo e Wilter

Ricardo Russiano Vicente, que sempre estiveram prontos para ajudar. Obrigada por todos

os ensinamentos das disciplinas e do dia-a-dia e pelas incontáveis conversas. Todos vocês

foram muito importantes no meu crescimento.

À todos os demais professores da UNESP - FCAV com quem convivi e trabalhei

durante meu mestrado, especialmente Alvimar José da Costa, Rosângela Zacarias Machado,

Márcia Rita Pacheco, Izabelle Auxiliadora Molina de Almeida Teixeira, Kleber Tomás de

Resende e Gener Pereira, que sempre se mostraram dispostos a ajudar e compartilhar seus

conhecimentos. Vocês possibilitaram a realização de diversos trabalhos e me proporcionaram

grandes aprendizados. Obrigada pelo apoio

Aos professores da Universidade de São Paulo - USP, especialmente Mayra Elena

Ortiz DÀvila Assumpção, José Antonio Visintin, Pietro Sampaio Baruselli e Ed Hoffmann

Madureira, agradeço por todo carinho, atenção e pelas experiências e conhecimentos

transmitidos durante as disciplinas e conversas.

Aos professores da UNESP-FMVZ, Câmpus Botucatu, com que tive o prazer de

conviver e aprender durante disciplinas e encontros.

À todos os meus professores desde o jardim de infância à pós-graduação. Sem vocês,

minha educação não seria tão bem moldada e eu jamais chegaria onde estou!!!! Obrigada!

Às empresas de produtos veterinários: Intervet, OuroFino, Pfizer, Schering-Ploug,

Tortuga e tantas outras que apoiam a pesquisa e fazem grandes parcerias com instituições

de ensino e fazendas com o intuito de melhorar o desenvolvimento da pecuária brasileira.

Aos amigos queridos do Departamento de Reprodução Animal da UNESP-FCAV:

Isabel Aparecida Penharol Natarelli, Roberta Vantini, Ivo Luiz de Almeida, Paulo Sérgio

da Silva, Maria Emilia Franco Oliveira, Mabel Freitas Cordeiro, Naiara Zoccal Saraiva,

Danilas Salinet de Melo, Marcelo Barbosa Bezerra, Michelly Fernandes de Macedo, Max

Vitório Resende, Aline Costa de Lúcio, Ana Paula Perini, Juliana Corrêa Borges, Márcio

Ribeiro Silva, Rúbia Bueno da Silva, Lourival Paz Landim, Felipe Perecin, Christina

Ramires Ferreira, Erlon Gomes de Oliveira Júnior, Clara Slade Oliveira, Letícia Zocolaro de

Oliveira, Tatiane Almeida Drummond Tetzner, Kellen de Sousa Oliveira, Eliana Cristina

Gazoto, Aracélle Elisane Alves, Maricy Apparicio Ferreira, Eveline Zanetti, Juliana Pinto

Pieroni, o meus sinceros agradecimentos pelo ótimo convívio diário, apoio nos trabalhos,

alegria constante, momentos de diversão e confraternização, simpatia e coleguismo que

tornaram nosso ambiente de trabalho (e fora de trabalho) tão especial e agradável.

À minha amiga-irmã mineirinha Mila (Maria Emilia Franco Oliveira), pela

amizade incomparável e sinceridade fraterna, pelos momentos de ternura e apoio, risadas

intermináveis, cantorias no carro, trapalhadas constantes, companheirismo nas festas e

danças, parceria nos trabalhos (e como trabalhamos...), enfim, por seu jeitinho único e

especial. Tenho certeza absoluta que sempre fomos amigas em outras vidas e que estamos

predestinadas a estarmos sempre juntas......sem você eu não saberia o real significado da

palavra “amizade”!!!!!!!

À amiga Meibol (Mabel Freitas Cordeiro), por sua receptividade e atenção

indescritíveis! Se existe uma pessoa sempre disposta a ajudar os outros e preocupada com as

pessoas, esse alguém é você!!!! Você é singular e especial! Obrigada por ser assim!

Ao amigo Samuel Figueiredo de Souza, com sua alegria e correrias constantes!!! Por

me apresentar ao mundo das cabras e à tradição do “risca-faca”!!!! Pelo trabalho

descontraído, apesar de intenso, pelos churrascos e danças!!!! Foi muito divertido!

À todos os meus amigos queridos da graduação e da UNESP-FCAV. Vocês

tornaram meus dias mais brilhantes, com alegria e companheirismo em todos os momentos.

Fizeram a passagem por essa faculdade ser especial e inesquecível! Obrigada meus amigos!

Às minhas grandes amigas de infância e adolescência: Roberta Piola, Marina

Medina Cunha, Mariana de Paula Ribeiro Jorge e Alexandra Frealdo Dummond!

Amizades como as de vocês são raras, pois são verdadeiras e duram a vida toda! Não

importa a distância, ou que passe muito tempo sem nos vermos, sabemos que a amizade está

lá e os reencontros são maravilhosos!

Ao pessoal do CPPAR e à toda turma do PET, pelos momentos divertidíssimos,

pelas viagens engraçadas (Pantanal, inesquecível!!) e por todas as atividades em grupo que

nos fizeram crescer juntos e nos ensinaram a ter responsabilidades...... vai ficar na memória!

Ao Prof. Dr. Alvimar José da Costa, por todas as oportunidades e ensinamentos. Com

o senhor aprendi que “quem não tem gratidão, não tem caráter”, que se tornou um dos

grandes princípios da minha vida.

À Profa. Dra. Adolorata Aparecida Bianco, uma mãezona, por quem tenho um afeto

especial!!!! Obrigada pelas preocupações e pelas lições de vida!

Ao Prof. Dr. Pietro, meu orientador de doutorado, que me recebeu de braços abertos.

Sempre foi um grande sonho trabalhar com o senhor, agora será uma grande honra!

Obrigada pela confiança e oportunidade!

Ao Ph.D Milo Wiltbank, obrigada por ter me recebido em seu laboratório e

depositado tanta confiança em meu trabalho. O tempo que passei aí foi muito importante

para meu crescimento profissional e pessoal!

À todo o pessoal do “Animal Science” da Universidade de Wisconsin – Madison

(Katie, Alexandre Pato, Reno, Carla, Tonia, Josie, Dr. Luo, Denise, Lisa, Lynn,

Hemantha, Jerry e Paul Fricke) e aos colegas de Madison-WI (Jair, Natan, Bernardo,

Tito, Juliana, Leane, Diego). Foi muito bom conhecê-los!

Às grandes amigas da República Bão Tamém, Maria Emilia Franco Oliveira,

Juliana Silva Lopes e Ludmilla Bertonha de Martini. Vocês foram minha família e minhas

grandes companheiras durante os últimos anos que passei em Jaboticabal!!! Obrigada pelos

momentos de amizade, descontração, pelas conversas animadas e convivência harmoniosa!

Vocês sempre estarão em lugar especial do meu coração! Adoro vocês!

À todos os memoráveis churrascos, festas, “risca-faca”, bailões no curral, cervejadas,

aniversários, congressos e encontros.....esses momentos sempre foram motivo de descontração,

alegria, divertimento e, principalmente, confraternização entre amigos!!!!!!!!!!! Sem falar das

idéias e oportunidades interessantes que sempre surgiram nesses eventos!

À todos os animais, que são o grande motivo da existência da minha profissão!!!

Obrigada por tantas vezes serem objeto de experimentações e pelas muitas vezes que são

criados com destino à alimentação humana!!!! Devemos à vocês um grande respeito e

gratidão!!!! Obrigada também, por serem tão puros promotores de sorrisos e muitas vezes

fonte de carinho incondicional e fidelidade inigualável!!! A vida seria muito sem graça sem

vocês!!!!

“A amizade é uma predisposição recíproca que torna

dois seres igualmente ciosos da felicidade um do outro.” (Platão)

http://www.pensador.info/autor/Platao/

i

SUMÁRIO SUMÁRIO.......................................................................................................................i

LISTA DE ABREVIATURAS..........................................................................................v

LISTA DE TABELAS....................................................................................................ix

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................xviii

RESUMO....................................................................................................................xxi

SUMMARY.................................................................................................................xxii

1 INTRODUÇÃO......................................................................................................1

2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................3

2.1 Metabólitos Reativos do Oxigênio (ROS) ..................................................3

2.1.1 Radical superóxido (O2-)........................................................................4

2.1.2 Radical Hidroxila (OH˚) ..........................................................................4

2.1.3 Peróxido de hidrogênio (H2O2) ...............................................................4

2.2 Estresse Oxidativo em oócitos e embriões ................................................5

2.3 Antioxidantes .............................................................................................5

2.3.1 α – Tocoferol (vitamina E) ......................................................................6

2.3.2 Trolox® (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico)..........7

2.4 Fêmeas Repetidoras de serviço e Transferência de Embriões................10

3 HIPÓTESE .........................................................................................................12

3.1 Experimento 1..........................................................................................12

3.2 Experimento 2..........................................................................................12

4 OBJETIVOS .......................................................................................................13

4.1 Experimento 1..........................................................................................13

4.2 Experimento 2..........................................................................................13

5 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................14

5.1 Antioxidante .............................................................................................14

5.1.1 Escolha do Antioxidante.......................................................................14

5.1.2 Definição da dose do Antioxidante .......................................................14

5.1.3 Pesagem e Armazenagem das Alíquotas de Antioxidante...................14

5.1.4 Teste de Solubilidade do Antioxidante .................................................15

5.1.5 Preparo do Antioxidante.......................................................................15

ii

5.2 Experimento 1..........................................................................................16

5.2.1 Local e Período de Execução...............................................................16

5.2.2 Condições Climáticas...........................................................................16

5.2.3 Animais.................................................................................................16

5.2.3.1 Doadoras de Embriões..................................................................17

5.2.3.2 Receptoras de Embriões...............................................................23

5.2.4 Colheita, manipulação e inovulação dos embriões ..............................24

5.2.4.1 Colheita dos embriões...................................................................24

5.2.4.2 Seleção e classificação dos embriões...........................................25

5.2.4.3 Separação dos grupos ..................................................................25

5.2.4.4 Envase e inovulação dos embriões...............................................25

5.2.4.5 Diagnóstico de gestação ...............................................................26

5.2.5 Dados colhidos.....................................................................................26

5.2.5.1 Doadoras.......................................................................................26

5.2.5.2 Receptoras....................................................................................26

5.2.5.3 Intervalo Colheita-Divisão dos Grupos, Divisão dos grupos-

Inovulação e Colheita-Inovulação ...................................................................27

5.2.6 Análises estatísticas.............................................................................27

5.3 Experimento 2..........................................................................................28

5.3.1 Local e período de execução ...............................................................28

5.3.2 Procedimentos laboratoriais da PIV .....................................................29

5.3.2.1 Aspiração intra-folicular, seleção e classificação dos oócitos .......29

5.3.2.2 Separação dos grupos ..................................................................29

5.3.2.3 Maturação in vitro de Embriões.....................................................30

5.3.2.4 Fecundação in vitro de Embriões..................................................31

5.3.2.5 Cultivo in vitro de Embriões...........................................................32

5.3.3 Procedimentos Laboratoriais para dosagem de Capacidade

Antioxidante Total ...............................................................................................33

5.3.4 Análise estatística ................................................................................34

6 RESULTADOS ...................................................................................................36

6.1 Experimento 1..........................................................................................36

iii

6.1.1. Resultados Gerais ...................................................................................36

6.1.2. Resultados Específicos............................................................................38

6.1.2.1. Estação do ano.................................................................................38

6.1.2.2. Categoria da doadora .......................................................................42

6.1.2.3. DEL das doadoras ............................................................................42

6.1.2.4. Acasalamentos .................................................................................46

6.1.2.5. Embriões totais, degenerados e viáveis e oócitos NF ......................46

6.1.2.6. Estádio e Qualidade Embrionária .....................................................49

6.1.2.7. Qualidade e localização (lado) do CL das receptoras ......................59

6.1.2.8. Sincronia doadora-receptora ............................................................63

6.1.2.9. Número de eventos (IA e/ou TE) e DEL das receptoras...................63

6.1.2.10. Protocolos reprodutivos das receptoras............................................69

6.1.2.11. Intervalo Divisão dos Grupos-Inovulação (Div-Inov) e Colheita de

embriões-Inovulação (Col-Inov)..........................................................................69

6.1.2.12. Outras Avaliações.............................................................................76

6.2. Experimento 2..........................................................................................78

6.2.1. Resultados Gerais – Fase 1 (PIV) ...........................................................78

6.2.2. Resultados Específicos – Fase 1 (PIV)....................................................78

6.2.3. Resultados Gerais – fase 2 (Capacidade Antioxidante Total)..................89

6.2.4. Resultados Específicos – fase 2 (Capacidade Antioxidante Total) ..........90

7. DISCUSSÃO ......................................................................................................91

7.1. Experimento 1..........................................................................................91

7.1.1. Períodos do Ano...................................................................................93

7.1.2. Categoria da doadora e estruturas recuperadas ..................................95

7.1.3. Estádio e Qualidade Embrionária e Sincronia do cio entre doadora e

receptora ..........................................................................................................104

7.1.4. Qualidade e localização (lado) do CL das receptoras ........................106

7.1.5. Protocolos reprodutivos das receptoras .............................................108

7.1.6. Número de eventos e DEL das receptoras.........................................110

7.1.7. Intervalo Divisão dos Grupos-Inovulação e Colheita-Inovulação .......111

7.1.8. Outras avaliações...............................................................................112

iv

7.2. Experimento 2........................................................................................112

7.2.1. Fase 1 - (PIV) .....................................................................................112

7.2.1.1. Taxas de clivagem, blastocisto e eclosão ...................................114

7.2.2. Fase 2 – (Capacidade Antioxidante Total) .........................................116

8. CONCLUSÕES.................................................................................................119

8.1. Experimento 1........................................................................................119

8.2. Experimento 2........................................................................................119

9. IMPLICAÇÕES .................................................................................................121

10. PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................................122

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................123

v

LISTA DE ABREVIATURAS

AAPH - 2,2′-azobis (2-amidinopropano) dihidrocloreto

Amb. - ambiental

BE - Benzoato de estradiol

Bi - blastocisto inicial

Bt - blastocisto total

Bl – blastocisto

Blt – total de blastocistos

BST – somatotrofina bovina

Bx - blastocisto expandido

Bxt - total de blastocistos expandidos

C25 – taxa de concepção aos 25 dias

C46 – taxa de concepção aos 46 dias

C - carbono

CAT - catalase

Cat. - categoria

CCO – complexo cumulus-oócito

CE - Cipionato de estradiol

CIV – cultivo in vitro

CL(s) – corpo(s) lúteo(s)

Col-Div - intervalo Colheita-Divisão dos Grupos

Col-Inov – intervalo Colheita-Inov

CR4 – nome do meio de cultivo in vitro de embriões utilizado

Cu+ - cátion monovalente de cobre Cu2+ - cátion bivalente de cobre

D - dia

DEL – dias em lactação

Div-Inov – intervalo Divisão dos grupos-Inovulação

DMPBS – Dubelcco Modified Phosphate Buffer Saline

DMSO - dimetilsulfóxido

vi

ECC – escore de condição corporal

eCG - gonadotrofina corionica eqüina

EL – escore de locomoção

Est. - estação

Estag. - estádio

Fe (III) – ferro três

Fe2+ - cátion bivalente de ferro

FeSO4 - sulfato de ferro

FIV – fecundação in vitro

FR - freqüência respiratória

FSH – hormônio folículo estimulante

GA – grupo antioxidante

GC – grupo controle

GnRH – hormônio liberador de gonadotrofina

GPx - glutationa peroxidase

GR - glutationa redutase

GSH – glutationa

H - hidrogênio

H2O2 - peróxido de hidrogênio

HO2˚ - radical hidroperoxila

IATF – inseminação artificial em tempo fixo

Interv. - intervalo

L - litro

LH – hormônio luteinizante

LOO˙ - radicais peroxil

LOOH - hidroperóxido de lipídio

M - mórula mg - miligramas

MHz – mega Hertz

min – minuto

MIV – maturação in vitro

vii

mL - mililitros

Mt – total de mórula

n – número

NF – não fertilizados

nm - nanômetro

nmol - nanomol

NRC – Nutritional Requirements of Catlle o - grau

O2 - oxigênio

O2- - radical superóxido

ºC – graus Celsius

OH - hidroxila

OH˚ - radical hidroxila

P4 – progesterona

PG – perda gestacional

PGF - prostaglandina

PGF2α - prostaglandina 2α

PGK – Penicilina G potássica

PIV – Produção in vitro

proc GLIMMIX – tipo de programa estatístico

prot. - protocolo

Prx - peroxiredoxinas

ROS - Metabólitos Reativos do Oxigênio

S - sul

S/A – sociedade anônima

SAS – sistema de análise estatística

Sincr. - sincronização

SOD - superóxido dismutase

SOV - superovulação

Tab. - tabela

TBARS – Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

viii

TE – transferência de embriões

TR. – temperatura respiratória

TETF - transferência de embrião em tempo fixo

TQC – meio para manutenção de embriões (Bioniche/USA – Nutricell) TR - temperatura retal

Trat. - tratamento

Trolox® - 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico

UI – unidades internacionais

UNESP – Universidade Estadual Paulista

vs - versus

W – oeste

X - versus

α - alfa

α-Toc˙ - radical tocoferol

β - beta

γ - gama

δ - sigma

μmol – micromol

μmol.L-1 – micromol por litro

% - porcentagem

’ - minuto

” - segundo

+ - mais

= - igual

> - maior que

< - menor que

± - mais ou menos

≤ - menor ou igual

≥ - maior ou igual

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Protocolo de superovulação (SOV) de vacas não lactantes da raça

Holandesa, doadoras de embriões...........................................................19

Tabela 2. Protocolo de superovulação (SOV) de novilhas da raça Holandesa,

doadoras de embriões.............................................................................20

Tabela 3. Protocolo de superovulação (SOV) de vacas em lactação da raça

Holandesa, doadoras de embriões.........................................................22

Tabela 4. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de

receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa, após a

transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de

manutenção (TQC Holding Plus) com ou sem adição de antioxidante

(Trolox®)...................................................................................................36

Tabela 5. Média da umidade relativa do ar semanal e das temperaturas ambientais

mínima, máxima e média semanais, nos dois diferentes períodos do ano

em que foram realizadas as etapas experimentais..................................38

Tabela 6. Estruturas recuperadas (total, embriões degenerados e embriões viáveis)

após lavagens uterinas realizadas em doadoras de embriões da raça

Holandesa, em dois diferentes períodos do ano.......................................38


receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a

transferência de embriões produzidos in vivo, em dois diferentes períodos

do ano. .....................................................................................................39

x


receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a


manutenção (TQC Holding Plus) com ou sem adição de antioxidante

(Trolox®), em dois diferentes períodos do ano.........................................41

Tabela 9. Estruturas recuperadas (total, oócitos não fertilizados, embriões

degenerados e embriões viáveis) após lavagens uterinas realizadas em

doadoras de embriões da raça Holandesa, nas três diferentes

categorias de doadora...........................................................................42

Tabela 10. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional

de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa

após a transferência de embriões produzidos in vivo, segundo a

categoria da doadora..............................................................................44

Tabela 11. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras

de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a


manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), segundo

categoria da doadora..............................................................................45

Tabela 12. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias repetidoras de serviço de gestação

e perda gestacional de receptoras de embriões da raça Holandesa após

a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada touro utilizado

nos acasalamentos.................................................................................46



após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio

xi

de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), para cada

touro utilizado nos acasalamentos. ........................................................46

Tabela 14. Estruturas recuperadas (total, oócitos não fertilizados, embriões

degenerados e embriões viáveis) após lavagens uterinas realizadas

em doadoras de embriões da raça Holandesa, em cada categoria de

doadora, em dois diferentes períodos do ano.....................................47

Tabela 15. Média do número de embriões (estágio e qualidade) recuperados por

colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em meio

de manutenção sem adição de antioxidante (Trolox®), por categoria de

doadora...................................................................................................48

Tabela 16. Média do número de embriões (por estágio e qualidade) recuperados por

colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em meio

de manutenção com adição de antioxidante (Trolox®), por categoria de

doadora...................................................................................................49

Tabela 17. Média do número de embriões em estágio de Mórula (M), recuperados

por colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em

meio de manutenção com e sem adição de antioxidante (Trolox®), em

cada categoria de doadora, em dois diferentes períodos do ano...........50

Tabela 18. Média do número de embriões em estágio de Blastocisto inicial (Bi),

recuperados por colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa,

mantidos em meio de manutenção com e sem adição de antioxidante

(Trolox®), em cada categoria de doadora, em dois diferentes períodos

estação do ano........................................................................................51

Tabela 19. Média do número de embriões em estágio de Blastocisto (Bl),


xii



do ano....................................................................................................52

Tabela 20. Média do número de embriões em estágio de Blastocisto expandido (Bx)




do ano.....................................................................................................53



após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada estágio

embrionário.............................................................................................54




manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), por estágio

embrionário.............................................................................................55



após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada

qualidade embrionária.............................................................................56




manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), por

qualidade embrionária.............................................................................57

xiii



após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada ovário

que apresentava o corpo lúteo (CL)........................................................58




manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), para cada

ovário que apresentava o corpo lúteo (CL).............................................59



após a transferência de embriões produzidos in vivo, de acordo com a

qualidade do corpo lúteo (CL).................................................................60




manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), de acordo

com a qualidade do corpo lúteo (CL)......................................................61



após a transferência de embriões produzidos in vivo, de acordo com a

sincronia entre doadora e receptora.......................................................62




xiv

manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), de acordo

com a sincronia entre doadora e receptora.............................................63



após a transferência de embriões produzidos in vivo, de acordo com o

número de dias em lactação (DEL) das receptoras................................64




de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), de acordo

com o número de dias em lactação (DEL) das receptoras.....................65



após a transferência de embriões produzidos in vivo, de acordo com o

número eventos das receptoras..............................................................66




de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), de acordo

com o número de eventos das receptoras..............................................67



após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada

protocolo reprodutivo...............................................................................69

xv




manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), para cada

protocolo reprodutivo...............................................................................70



após a transferência de embriões produzidos in vivo, segundo o Intervalo

Divisão dos Grupos-Inovulação..............................................................71



transferência de embriões produzidos in vivo, segundo o Intervalo

Colheita-Inovulação dos embriões..........................................................72

Tabela 39. Temperatura retal, freqüência respiratória, escore de condição corporal,

escore de locomoção e produção leiteira média (últimos 7 dias antes da

inovulação) de receptoras de embriões da raça Holandesa, por grupo de

tratamento................................................................................................75

Tabela 40. Temperatura retal (TR), freqüência respiratória (FR), escore de condição

corporal (ECC) e escore de locomoção (EL) de doadoras de embriões da

raça Holandesa, de acordo com a categoria, no primeiro período

experimental (abril a junho)......................................................................76

Tabela 41. Valores de P das variáveis inerentes à receptora (produção leiteira (prod.

leite), temperatura retal (TR), freqüência respiratória (FR), escore de

condição corporal (ECC) e escore de locomoção (EL) e interação entre

tratamento (trat.) e essas variáveis) para taxas de concepção aos 25 e 46

xvi

dias e a perda gestacional de receptoras de embriões da raça

Holandesa, no primeiro período experimental (abril a junho)..................76

Tabela 42. Efeito da adição de antioxidante (Trolox®) ao meio de transporte de

oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de matadouro e do

tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de

clivagem de embriões após a maturação e fecundação in vitro............78




blastocisto no D6 pós-fecundação in vitro (interação tratamento x tempo

P = 0,03)................................................................................................80

Tabela 44. Valores de P do tratamento com antioxidante, do tempo de manutenção

dos oócitos no meio de transporte e da interação entre antioxidante e

tempo de manutenção, relacionados à taxa de blastocisto no D6

(interação tratamento x tempo; P = 0,03)..................................................80




blastocisto no D7 pós-fecundação in vitro.............................................82




blastocisto no D9 pós-fecundação in vitro.............................................84



xvii


eclosão no D11 pós-fecundação in vitro...............................................86

Tabela 48. Concentração de Trolox® (mM) no meio de transporte de oócitos bovinos

(tratado ou não com esse antioxidante) aferida a partir de amostras

colhidas em diferentes tempos (0, 8 e 20 horas)....................................89

xviii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura molecular da vitamina E (α-tocoferol) e do Trolox® (6-hidroxi-

2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico)............................................8

Figura 2. Esquema geral de protocolo de superovulação (SOV) de vacas não

lactantes e novilhas da raça Holandesa, doadoras de embriões. ............17

Figura 3. Esquema geral de protocolo de superovulação (SOV) de vacas em

lactação da raça Holandesa, doadoras de embriões. ..............................20

Figura 4. Protocolo de transferência de embrião em tempo fixo (TETF) para

sincronização da ovulação em receptoras de embrião repetidoras de

serviço da raça Holandesa......................................................................22

Figura 5. Esquema de montagem de placas de maturação in vitro de complexos

cumulus-oócitos........................................................................................30

Figura 6. Esquema de montagem do tubo de gradiente de Percoll para centrifugação

do sêmen a ser utilizado na fecundação in vitro de oócitos......................31

Figura 7. Esquema de montagem de placas de cultivo in vitro de embriões.............32

Figura 8. Esquema de colheita de alíquotas de meio de transporte de oócitos para a

dosagem da capacidade antioxidante total...............................................32

Figura 9. Média da umidade relativa do ar e da temperatura ambiental média

semanal, nos dois períodos do ano em que foram realizadas as etapas

experimentais na fazenda Santa Rita, Descalvado – SP…........................37

xix

Figura 10. Gráfico de dispersão de 1/concepção aos 25 dias (Concep25d) em

relação ao Intervalo Coleta-Inovulação dos embriões (P = 0,08)...........73

Figura 11. Gráfico de dispersão da concepção aos 25 dias (Concep25d) em relação

ao Intervalo Coleta-Inovulação (min) dos embriões (P = 0,01).................74

Figura 12. Efeito da adição de antioxidante (Trolox®) ao meio de transporte de



clivagem de embriões após a maturação e fecundação in vitro.............79




blastocisto no D6 pós-fecundação in vitro (interação tratamento x tempo

P = 0.003)................................................................................................81




blastocisto no D7 pós-fecundação in vitro...............................................83




blastocisto no D9 pós-fecundação in vitro...............................................85



tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de eclosão

no D11 pós-fecundação in vitro...............................................................87

xx

Figura 17. Curva padrão e equação da reta de absorbância versus concentração de

Trolox®......................................................................................................88

Figura 18. Esquema resumido dos possíveis efeitos de diferentes níveis de ingestão

de alimentos na fisiologia reprodutiva das fêmeas bovinas. P4 =

progesterona, E2 = estradiol, IGF-I = fator de crescimento semelhante à

insulina (SARTORI et al., 2007)................................................................99

xxi

EFEITO DA ADIÇÃO DE ANTIOXIDANTE (TROLOX®) AO MEIO DE MANUTENÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VIVO E AO MEIO DE TRANSPORTE DE OÓCITOS BOVINOS ASPIRADOS DE OVÁRIOS PROVENIENTES DE ABATEDOURO RESUMO - Os objetivos do estudo foram: avaliar o efeito antioxidante do Trolox® 1)

no meio de manutenção de embriões sobre as taxas de concepção (25 e 46 dias) e a

perda gestacional de receptoras bovinas Holandesas repetidoras de serviço, em dois

períodos (abril-junho/setembro-novembro) e 2) no meio de transporte de oócitos

bovinos aspirados de ovários de abatedouro sobre as taxas de clivagem, blastocisto

e eclosão in vitro. No Experimento 1, doadoras de embriões foram superovuladas e

submetidas à lavagem uterina. Os embriões colhidos foram divididos em dois grupos,

deixados em meio com ou sem antioxidante, por 2 a 6h. No Experimento 2, folículos

foram aspirados e os complexos cumulus-oócito grau I e II foram divididos em quatro

grupos: Controle 8h, Antioxidante 8h, Controle 20h e Antioxidante 20h. Então, foram

mantidos em uma transportadora de oócitos (37ºC) por 8 ou 20 horas. Após a

maturação, fecundação e cultivo in vitro, as taxas de clivagem (D3), blastocisto (D6,

7 e 9) e eclosão (D11) foram avaliadas. Alíquotas de 200 µL do meio de transporte

foram retiradas em cada momento experimental (0, 8 e 20h) para realização dos

testes de capacidade antioxidante total (CAT). No Experimento 1, não houve efeito

de tratamento sobre as variáveis avaliadas. Foi verificado efeito de período

experimental (P=0,001), categoria da doadora (P<0,05), qualidade embrionária

(P=0,049) e intervalo Divisão dos Grupos-Inovulação (P<0,0001). No Experimento 2,

não houve efeito de tratamento sobre as taxas analisadas. No entanto, houve

redução das taxas de clivagem e blastocisto (D7 e 9) nos grupos 20 horas. Ainda, no

D6 foram obtidas taxas de blastocisto semelhantes nos grupos Antioxidante 8 e 20h.

A análise da CAT evidenciou que o Trolox® auxiliou o combate às ROS.

Palavras-chave: antioxidante (Trolox®), aspiração intrafolicular, bovinos da raça

Holandesa, capacidade antioxidante total, produção in vitro de embriões,

transferência de embriões.

xxii

EFFECT OF THE ADDITION OF AN ANTIOXIDANT (TROLOX®) TO A HOLDING MEDIA FOR BOVINE IN VIVO PRODUCED EMBRYOS AND TO A TRANSPORT MEDIA FOR BOVINE OOCYTES ASPIRATED FROM SLAUGHTER HOUSE OVARIES SUMMARY – The objectives of the present study were to evaluate the effect of the

addition of an antioxidant (Trolox®) 1) to a holding media for bovine in vivo produced

embryos, on conception rates 25 and 46 days of pregnancy and pregnancy loss, in

Holstein bovine recipients at 4th or more service, during two periods of the year (April-

June/September-November) and 2) to a transport media for bovine oocytes aspirated

from slaughter house ovaries, on in vitro cleavage, blastocyst and hatching rates. In

Experiment 1, donor cows were superovulated and submitted to uterine flushings.

The recovered embryos were divided into two groups, kept in holding media with or

without antioxidant, for 2-6h. In Experiment 2, follicles were aspirated and cumulus-

oocyte complexes grade I and II were divided into four groups: Control 8h, Antioxidant

8h, Control 20h and Antioxidant 20h. Oocytes were kept in a transportable machine

(37ºC) for 8 or 20 hours. After in vitro maturation, fertilization and culture, cleavage

(D3), blastocyst (D6, 7 and 9) and hatching rates (D11) were evaluated. Samples

(200 µL) of the transport media were collected in each experimental moment (0, 8 e

20h) for total antioxidant capacity assay (TACA). In Experiment 1, no effect of

treatment was observed. Effects of experimental period (P=0.001), donor category

(P<0.05), embryo quality (P=0.049) and interval Group division-embryo transfer

(P<0.0001) were detected. In Experiment 2, no effect of treatment was found on the

analyzed rates. However, reduction on cleavage and blastocyst (D7 e 9) rates was

detected on Groups 20h. Also, on D6 similar blastocyst rates were observed in

Groups Antioxidant 8 and 20h. The analysis of TACA evidenced that Trolox®

collaborated with the combat against the ROS.

Key-words: antioxidant (Trolox®), intrafolicular aspiration, Holstein bovines, total

antioxidant capacity, in vitro embryo production, embryo transfer.

1

1 INTRODUÇÃO

O Brasil tem demonstrado crescimento econômico da ordem de 3,5% ao

ano. Boa parte desse desenvolvimento se deve ao potencial de expansão da

agropecuária do país, sendo observado aumento significativo nos índices de

produtividade do rebanho bovino nacional, de forma a suprir a demanda do mercado

interno e ainda possibilitando a exportação de produtos de origem animal,

principalmente carne e leite (CARDOSO, 2006). Na cadeia produtiva do leite, a raça

Holandesa (Bos taurus taurus) assume papel de destaque, sendo responsável por

70% da produção total nacional deste produto (CONFEDERAÇÃO DA

AGRICULTURA E PECUÁRIA DO BRASIL, 2005).

Fêmeas repetidoras de serviço (considerar serviço como inseminação ou

transferência de embrião) têm considerável impacto na economia de fazendas

comerciais de leite (LAFI & KANEENE, 1992) e são normalmente definidas como

animais que requerem três ou mais serviços antes de tornarem-se prenhes. Esses

animais são caracterizados pelas baixas taxas de fertilização (GRADEN et al., 1968;

O’FARRELL et al., 1983) e/ou mortalidade embrionária precoce (LINARES, 1981a;

GUSTAFSSON & LARSSON, 1985). Nesse contexto, a transferência de embriões

(TE) tem se mostrado uma importante ferramenta, especialmente durante períodos

de estresse térmico, para incrementar as taxas de concepção desses animais

(RODRIGUES et al., 2004; 2007a; SARTORI, 2007 e NEGRÃO et al., 2002).

A TE em bovinos é a técnica mais utilizada em todo o mundo para multiplicar

animais de alto valor genético (BÓ et al., 2004). A Sociedade Internacional de

Transferência de embriões relatou as estatísticas da TE no mundo em 2002

(THIBIER, 2003), atentando para o aumento de 20% no número de embriões bovinos

produzidos por múltipla ovulação. Alguns autores relatam que a múltipla ovulação e

transferência de embriões (MOET) pode incrementar em 1,4 a 2,6% o ganho

genético de um rebanho, enquanto a OPU (ovum pick-up) associada a produção in

vitro de embriões (PIV) em novilhas pré-púberes pode elevar esse índice para até

2

22% (LAND & HILL, 1975; BROGLIATTI & ADAMS, 1996). No ano de 2004 foram

transferidos no mundo todo, aproximadamente 480.000 embriões bovinos produzidos

por MOET e 106.000 embriões produzidos por fecundação in vitro (THIBIER, 2004).

O Brasil se insere neste cenário como vice-líder mundial em número de transferência

de embriões produzidos in vivo com 87.732, e líder mundial com embriões

produzidos in vitro com 60.000 transferências (THIBIER, 2004).

Segundo o último relatório da Sociedade Brasileira de Tecnologia de

Embriões (SBTE, 2007), apesar da crescente produção brasileira de embriões in vitro

(196.000), foram produzidos 70.000 embriões in vivo (Viana e Camargo, 2007), o que

projeta aproximadamente 15.000 superovulações por ano e destaca o Brasil no

cenário mundial de produção de embriões.

Sabe-se ainda, que os efeitos deletérios dos radicais livres causam a

lipoperoxidação da membrana plasmática de gametas masculinos e femininos e,

também, de embriões de mamíferos cultivados in vitro, sendo responsável por

perdas na produção in vitro de embriões e diminuição de fertilidade in vivo

(BORGES, 2008). Assim, aliar a transferência de embriões ao uso de antioxidantes,

poderia ser uma interessante estratégia para melhorar as taxas de concepção após a

TE em receptoras bovinas repetidoras de serviço da raça Holandesa (Bos taurus

taurus). Da mesma forma, a produção in vitro de embriões poderia ser também

beneficiada pelo uso desses produtos.

3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Metabólitos Reativos do Oxigênio (ROS)

Metabólitos Reativos do Oxigênio (ROS, do termo em inglês Reactive Oxigen

Species), radicais livres e oxidantes são termos utilizados na identificação dos

intermediários químicos reativos do metabolismo do oxigênio (HALLIWELL &

GUTTERIDGE, 1999; NORDBERG & ARNÉR, 2001). O termo radical livre não é

considerado o mais adequado, pois nem todos os metabólitos reativos do oxigênio

são radicais livres. O mesmo se aplica ao termo oxidante, uma vez que alguns ROS

(ex. O2- e H2O2) podem atuar tanto como agentes oxidantes como redutores, em

sistemas diferentes. Já o termo metabólitos reativos do oxigênio (ROS) inclui todos

os radicais e não radicais derivados do oxigênio (HALLIWELL & GUTTERIDGE,

1999).

Quimicamente, são substâncias que apresentam número ímpar de elétrons,

sendo, portanto, altamente energéticos e instáveis. Podem ser formados pela ação

direta de alguma fonte de energia externa (luz, calor e radiação) ou interna, pelo

próprio organismo (subprodutos da respiração celular), por reações catalisadas pelos

metais (ferro e cobre) ou por enzimas. Essa energia, ao atingir o átomo, faz com que

um elétron seja removido do seu orbital, formando um novo átomo contendo um

elétron extra, denominado radical livre, que para se tornar novamente estável,

precisa liberar essa energia acumulada (BORGES, 2008).

Os ROS são encontrados em todos os sistemas biológicos. Em condições

fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, o O2 sofre redução tetravalente, com

aceitação de quatro elétrons, resultando na formação de H2O. Durante esse

processo, são formados intermediários reativos como os radicais superóxido (O2-),

hidroperoxila (HO2˚) e hidroxila (OH˚) e o não radical peróxido de hidrogênio (H2O2).

Normalmente, a redução completa do O2 ocorre na mitocôndria e a reatividade dos

ROS é neutralizada pela entrada de quatro elétrons (FERREIRA & MATSUBARA,

1997; NORDBERG & ARNÉR, 2001).

4

2.1.1 Radical superóxido (O2-) O radical superóxido é um radical livre formado a partir do oxigênio molecular,

pela adição de um elétron. Sua formação ocorre espontaneamente, especialmente

na membrana mitocondrial, através da cadeia respiratória. É também produzido por

flavoenzimas, lipoxigenases e cicloxigenases (NORDBERG & ARNÉR, 2001). Sua

formação ocorre em quase todas as células aeróbicas e é produzido durante a

ativação máxima de neutrófilos, monócitos e eosinófilos (FERREIRA &

MATSUBARA, 1997). È um radical pouco reativo e não tem a habilidade de penetrar

membranas lipídicas, agindo, portanto, apenas no compartimento onde é produzido

(NORDBERG & ARNÉR, 2001).

2.1.2 Radical Hidroxila (OH˚) É considerado o radical livre mais reativo em sistemas biológicos, sendo

capaz de causar mais danos do que qualquer outro ROS. É formado a partir do

peróxido de hidrogênio em uma reação catalisada por íons metais (Fe ++ ou Cu+),

denominada reação de Fenton (FERREIRA & MATSUBARA, 1997; NORDBERG &

ARNÉR, 2001). O radical hidroxila também pode iniciar a oxidação dos ácidos graxos

poliinsaturados das membranas celulares (lipoperoxidação).

2.1.3 Peróxido de hidrogênio (H2O2) O H2O2 não é um radical livre, mas um metabólito do oxigênio extremamente

deletério porque participa como intermediário na reação que produz o OH˚; tem vida

longa e é capaz de atravessar membranas biológicas (FERREIRA & MATSUBARA,

1997; NORDBERG & ARNÉR, 2001). Uma vez produzido o H2O2 é removido por um

dos três sistemas de enzimas antioxidantes: catalase, glutationa peroxidase ou

peroxiredutases (NORDBERG & ARNÉR, 2001).

5

2.2 Estresse Oxidativo em oócitos e embriões

O estresse oxidativo é resultado de um desbalanço entre a produção de ROS e

os mecanismos de defesa celular antioxidante. A geração de ROS ocorre

fisiologicamente durante o metabolismo celular. Em condições fisiológicas, a

fosforilação oxidativa que ocorre nas mitocôndrias é a principal fonte intracelular de

ROS, sendo 2% do oxigênio (O2) consumido completamente reduzido, gerando O2−.

O estresse oxidativo tem sido considerado responsável por diferentes tipos de

injúrias, incluindo a peroxidação lipídica de membranas, a oxidação de aminoácidos

e ácidos nucléicos, apoptose e necrose (HALLIWELL et al., 1992). As concentrações

intracelulares de ROS são aumentadas em sistemas de produção in vitro:

quantidades mais elevadas de O2− e H2O2 têm sido detectadas em embriões de

camundongos em estádio inicial de clivagem, produzidos in vitro, quando

comparadas à produção in vivo desses mesmos animais (NASR-ESFAHANI et al.,

1990; NASR-ESFAHANI & JOHNSON, 1991 e GOTO et al., 1993) e têm sido

relacionadas ao atraso no desenvolvimento inicial de embriões (NODA, 1992). Ainda,

diversos estudos demonstraram que embriões são particularmente sensíveis à

exposição à ROS gerados em diferentes formas: exposição à tensão atmosférica de

O2, peróxido de hidrogênio, sulfato de ferro (FeSO4), 2,2′-azobis (2-amidinopropano)

dihidrocloreto (AAPH), síntese de inibidor de glutationa (GSH) ou indutor de oxidação

do tiol (diamido; UMAOKA et al., 1992; TARIN & TROUNSON, 1993; GARDINER &

REED, 1994; HIRANRUENGCHOCK & HARRIS, 1995; FUJITANI et al., 1997;

TAKAHASHI et al., 1997; MORALE`S et al., 1999; LIU et al., 1999).

2.3 Antioxidantes

Segundo HALLIWELL & GUTTERIDGE (1999), antioxidante pode ser definido

como qualquer substância que, quando presente em baixa concentração comparada

àquela do substrato oxidável, retarda ou previne significativamente a oxidação

daquele substrato.

Para proteger-se do efeito letal da formação excessiva de ROS, a célula

possui um sistema de defesa antioxidante enzimático e um não enzimático. O

6

sistema enzimático é composto pelas enzimas superóxido dismutase (SOD - remove

o radical superóxido, convertendo-o em peróxido de hidrogênio); catalase (CAT –

destrói o peróxido de hidrogênio, convertendo-o em água e oxigênio),

peroxiredoxinas (Prx), glutationa (GSH), glutationa redutase (GR) e glutationa

peroxidase (GPx – mais importante na remoção de peróxidos na célula). Fazem

parte do sistema não enzimático um grande número de compostos de baixo peso

molecular, incluindo as vitaminas C e E, diferentes compostos de selênio,

ubiquinonas (coenzima Q), ácido úrico e ácido lipóico (NORDBERG & ARNÉR,

2001). Esse sistema pode atuar em duas linhas: como removedor, varredor do

agente antes que ele cause lesão (glutationa reduzida, superóxido dismutase,

catalase, glutationa peroxidase e vitamina E) ou como reparador da lesão ocorrida

(ácido ascórbico, GR e GPx; FERREIRA & MATSUBARA, 1997). Com exceção da

vitamina E (α-tocoferol), que é um antioxidante estrutural de membrana, a maior

parte dos agentes antioxidantes encontra-se no meio intracelular (FERREIRA &

MATSUBARA, 1997).

2.3.1 α – Tocoferol (vitamina E) Vitamina E é um termo nutricional que se refere a um grupo de tocoferóis e

tocotrienóis com atividade antioxidante. Apenas oito moléculas naturais revelam

atividade antioxidante: quatro tocoferóis (α, β, γ, δ) e quatro tocotrienóis (α, β, γ, δ),

conforme BRIGELIUS-FLOHÉ & TRABER (1999) e HALLIWELL & GUTTERIDGE

(1999). O α-tocoferol é a forma mais abundante na natureza e a que possuí maior

atividade biológica (BRIGELIUS-FLOHÉ & TRABER, 1999).

A molécula da vitamina E é dividida em duas partes: um anel cromanol,

também chamado de cabeça croman (hidrofílica) e uma cadeia ou cauda de

hidrocarbonetos (hidrofóbica), que serve para ancorá-la na membrana lipídica. O

grupo OH pertence ao anel cromanol é o responsável por sua atividade antioxidante.

Essa vitamina é conhecida como o principal antioxidante lipofílico que protege os

ácidos graxos poliinsaturados dos tecidos contra a peroxidação, sendo um potente

removedor de radicais peroxil (LOO˙) e, provavelmente, o mais importante inibidor da

7

reação em cadeia da lipoperoxidação em animais (HALLIWELL & GUTTERIDGE,

1999).

O grupo hidroxila presente no grupo fenólico do anel cromanol rapidamente

reage com o radical peroxil (LOO˙), transferindo para ele o seu átomo de H,

convertendo-o em hidroperóxido de lipídio –LOOH (BRIGELIUS-FLOHÉ & TRABER,

1999; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999; NORDBERG & ARNÉR, 2001) e um

radical tocoferoxyl; um segundo radical peroxil se liga ao radical antioxidante para

formar outro hidroperóxido (LOOH) que é um produto não radical (LIEBLER, 1993).

Para cada molécula de vitamina E oxidada, dois radicais peroxil são consumidos

(LIEBLER, 1993).

No entanto, dependendo dos compostos presentes na reação, a vitamina E

pode exercer efeito anti ou pró-oxidativo (BRIGELIUS-FLOHÉ & TRABER, 1999).

Segundo HALLIWELL & GUTTERIDGE (1999), os tocoferóis podem reduzir Fe(III) a

Fe2+ e Cu2+ a Cu+, que por sua vez exercem efeito pró-oxidativo. Além disso, o radical

tocoferol (α-Toc˙) oriundo da redução do radical peroxil, pode abstrair hidrogênio dos

ácidos graxos poliinsaturados, atuando então como um fraco promotor de

lipoperoxidação. Esses fenômenos já foram observados em alguns sistemas in vitro.

Para BOLLE et al. (2002) o uso da vitamina E como terapia antioxidante pode ser

considerada uma faca de corte duplo, dependendo rigorosamente da dose ou da

concentração in vitro da vitamina.

2.3.2 Trolox® (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico)

O 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico, posteriormente

designado com o nome de Trolox C (CORT et al., 1975), é um análogo hidrossolúvel

do tocoferol, que foi sintetizado por Scott e sua equipe em 1974 e indicado como

antioxidante para a preservação de óleos e gorduras. Esta substância apresenta

propriedades antioxidantes e é eficaz tanto em gordura animal quanto vegetal,

característica que o torna singular, já que o tocoferol tem pouca atividade na

preservação da peroxidação de óleos vegetais (SCOTT et al., 1974). Sua atividade

8

antioxidante em óleos vegetais e em gordura animal é maior que a do α e do γ-

tocoferol (CORT et al., 1975).

O mecanismo de ação do efeito antioxidante do Trolox é semelhante ao da

vitamina E, ou seja, envolve o OH fenólico e a remoção de radicais peroxil

(ALBERTINI & ABUJA, 1999). Sua estrutura é composta por um núcleo croman,

semelhante ao do α-tocoferol, e um grupo ácido carboxílico no carbono 2 (Fig. 1)

Vitamina E (α-tocoferol)

Trolox® (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico)

Figura 1: Estrutura molecular da vitamina E (α-tocoferol) e do Trolox® (6-hidroxi-

2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico).

9

O interesse por antioxidantes hidrossolúveis origina-se da observação de que

a maioria dos ROS (ex. ânion superóxido) é gerada dentro da fase aquosa. Apenas

os radicais peroxil que não são eliminados pelos antioxidantes hidrossolúveis e que

passam para dentro da fase lipídica é que podem desencadear a peroxidação dos

lipídios (FREI et al. 1989 apud SAGACH et al., 2002)

Segundo BARCLAY et al. (1995), o Trolox tem vantagem sobre os outros

antioxidantes que são apenas lipossolúveis, como a vitamina E. Devido a sua

estrutura cromanol, que lhe dá atividade antioxidante, e ao grupo carboxila, que tem

moderado efeito hidrossolúvel, o Trolox é distribuído em ambas as fases da

bicamada de lipídios das biomembranas, tornando-se um excelente protetor contra a

lipoperoxidação. Além disso, o Trolox pode ser adicionado diretamente à membrana

lipídica (sistema intacto) sem a necessidade de solventes ou outros métodos de

extração, o que o torna conveniente para estudos em sistema biológicos naturais.

WU et al. (1990) observaram que o Trolox protegeu miócitos, hepatócitos e

eritrócitos contra radicais de oxigênio gerados artificialmente. Usando hepatócitos

humanos como modelo, os autores exploraram o mecanismo de ação do Trolox na

célula e sugeriram que o seu comportamento foi consistente com o esperado para

um antioxidante: reduziu o nível de dienos conjugados (produto da lipoperoxidação,

marcador de dano oxidativo em hepatócitos humanos) enquanto prolongava a

sobrevivência da célula apesar da presença de radicais de oxigênio altamente

reativos. Ou seja, atuou como removedor de ROS.

SAGACH et al. (2002) investigaram a atividade antioxidante do Trolox na

isquemia/perfusão cardíaca e observaram que o tratamento com esse antioxidante

aumentou significativamente a recuperação cardíaca após isquemia/reperfusão,

quando comparado com o α-tocoferol, que foi menos eficaz. Além disso, a produção

de TBARS foi significativamente inibida pelo Trolox, sugerindo que o efeito benéfico

do mesmo era devido à sua atividade antioxidante.

WANG et al. (2002) avaliaram o efeito dose-dependente do Trolox (100 a 800

μmol) no desenvolvimento de embriões de ratos e observaram que em altas

concentrações (600 e 800 μmol) esse antioxidante era tóxico aos embriões. Ainda,

10

FEUGANG et al. (2004) avaliaram o efeito do Trolox® em embriões bovinos

cultivados sob estresse oxidativo a partir do estádio de mórula (Dia 5 pós-IA).

Embriões cultivados com doses crescentes de Trolox ® (0; 0,4; 1,0 and 2,5 mM)

mostraram embriotoxicidade dose-dependente no Dia 8 pós-IA. Adicionalmente, o

uso de 400 μM de Trolox® previniu, ao menos parcialmente (P < 0:05), a

degeneração próoxidante-induzida de blastocistos no Dia 8, além de aumentar

significativamente as taxas de eclosão nesse mesmo dia e reduzir a apoptose

próoxidante-induzida no Dia 7.

2.4 Fêmeas Repetidoras de serviço e Transferência de Embriões

As fêmeas repetidoras de serviço têm considerável impacto na economia de

fazendas comerciais de leite (LAFI & KANEENE, 1992) e são normalmente definidas

como animais que requerem três ou mais serviços antes de tornarem-se prenhes.

Esses animais são caracterizados pelas baixas taxas de fertilização (GRADEN et al.,

1968; O’FARRELL et al., 1983) e/ou mortalidade embrionária precoce (LINARES,

1981; GUSTAFSSON & LARSSON, 1985). BÅGE et al. (2001) verificaram que

novilhas repetidoras de serviço apresentaram duração prolongada do estro, folículo

pré-ovultatório duradouro, atraso no pico de LH, forte tendência de níveis

suprabasais de progesterona no período que antecede a ovulação e aumento tardio

da progesterona no diestro. Uma assincronia hormonal ao redor do estro tem sido

registrada em novilhas repetidoras de serviço que apresentam níveis de

progesterona de aproximadamente 0,5-1,0 nmol/L (excedendo concentrações basais

normais de ≤ 0,5 nmol/L) e emergência de pico pré-ovulatório de LH tardio

(GUSTAFSSON et al., 1986; ALBIHN et al., 1991). A desregulação endócrina entre o

concepto e o ambiente tanto no oviduto quanto no útero resultando em morte

embrionária precoce, pode ser explicada pela fertilidade prejudicada em novilhas

repetidoras de serviço (ALBIHN et al., 1989; ALBIHN et al., 1991). A transferência de

embrião é uma ferramenta potencialmente utilizada para minimizar os efeitos do

ambiente uterino sobre o desenvolvimento embrionário inicial (durante os sete

11

primeiros dias), promovendo maiores taxas de concepção evitando dessa forma a

mortalidade embrionária precoce.

12

3 HIPÓTESE

3.1 Experimento 1

O antioxidante (Trolox®) adicionado ao meio de manutenção (solução TQC

holding) de embriões bovinos produzidos in vivo atuaria neutralizando as ROS

produzidas, reduzindo seus efeitos deletérios sobre os embriões e,

consequentemente, aumentando as taxas de concepção após a TE para receptoras

bovinas repetidoras de serviço da raça Holandesa (Bos taurus taurus).

3.2 Experimento 2

O antioxidante (Trolox®) adicionado ao meio de transporte (H199+) de oócitos

bovinos obtidos por aspiração intra-folicular de ovários provenientes de abatedouros

atuaria neutralizando as ROS produzidas, reduzindo seus efeitos deletérios sobre os

oócitos e, consequentemente, aumentando as taxas de clivagem, blastocisto (D6, D7

e D9) e de eclosão (D11) durante a produção in vitro de embriões. Esse efeito seria

ainda mais evidente quanto utilizado em um período de transporte mais extenso

(20h).

13

4 OBJETIVOS

4.1 Experimento 1 Avaliar o efeito da adição de antioxidante (Trolox®) ao meio de manutenção

(TQC Holding Plus) de embriões bovinos produzidos in vivo sobre a taxa de

concepção após a transferência de embriões para receptoras bovinas repetidoras de

serviço da raça Holandesa (Bos taurus taurus).

4.2 Experimento 2 Avaliar o efeito da adição de antioxidante (Trolox®) ao meio de transporte

(H199+) de oócitos bovinos obtidos por aspiração intra-folicular de ovários

provenientes de abatedouros sobre as taxas de clivagem, blastocisto (D6, D7 e D9) e

de eclosão (D11) durante a produção in vitro de embriões.

Avaliar o consumo (eficiência de neutralização de ROS) do antioxidante

(Trolox®) adicionado ao meio de transporte (H199+) de oócitos bovinos obtidos por

aspiração intra-folicular de ovários provenientes de abatedouros (capacidade

antioxidante total).

14

5 MATERIAL E MÉTODOS O presente projeto foi composto por dois experimentos: um envolvendo a

tecnologia de transferência de embriões – TE (Experimento 1) e outro envolvendo a

produção in vitro de embriões - PIV (Experimento 2).

5.1 Antioxidante

5.1.1 Escolha do Antioxidante O antioxidante escolhido para o presente projeto foi o 6-hidroxi-2,5,7,8

tetrametil croman-2-ácido carboxílico (Trolox®1), um análogo hidrossolúvel da

vitamina E. A escolha se baseou no fato de o Trolox poder ter vantagem sobre

antioxidantes apenas lipossolúveis, como a vitamina E. Dessa forma, o Trolox®

poderia ser distribuído em ambas as fases da bicamada de lipídios das

biomembranas, tornando-se um excelente protetor contra a lipoperoxidação, além de

poder atingir o meio celular interno e, supostamente, ser incorporado pela célula.

5.1.2 Definição da dose do Antioxidante A dose de Trolox® definida para uso em meio de manutenção de embriões,

TQC Holding Plus2 e posterior inovulação a fresco desses embriões foi de 400

µmol.L-1. Para sua determinação, foram realizadas pesquisas em artigos científicos

divulgados (WANG et al., 2002 e Feugang et al., 2004) e consultas ao Prof. Dr.

Antônio Cláudio Tedesco, do Departamente de Química da Universidade de São

Paulo, Câmpus de Ribeirão Preto.

5.1.3 Pesagem e Armazenagem das Alíquotas de Antioxidante Para se atingir a concentração desejada do antioxidante (0,1mg/mL), foi

realizada a pesagem do produto (1,0 mg ou 0,5mg) em pó adquirido no mercado 1 Acros Organics, New Jersey, USA 2 TQC Holding Plus - Bioniche/USA – Nutricell, Brasil

15

diretamente em tubos cônicos de 1,5 mL, com auxílio de uma balança digital de alta

precisão. Essas alíquotas foram armazenadas em uma caixa protegidas da luz, calor

e umidade até o momento do uso, quanto seriam diluídas em 10 ou 5 mL de meio,

respectivamente. As pesagens foram realizadas no Laboratório de Reprodução

Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Câmpus de

Jaboticabal.

5.1.4 Teste de Solubilidade do Antioxidante O teste de solubilidade do antioxidante (Trolox®) foi realizado no

Departamento de Química da Universidade de São Paulo, Câmpus de Ribeirão

Preto. Para a realização do teste foram utilizados tubos cônicos de 1,5 mL contendo

1,0 mg de antioxidante previamente aliquotado, seringa, agulha, meio de

manutenção de embriões – TQC Holding Plus, vórtex e banho-maria. Uma diluição

inicial foi realizada adicionando-se 1,0 mL de meio ao conteúdo do tubo cônico,

sendo, posteriormente, realizada a diluição final com mais 9 mL de meio, a fim de se

completar 10 mL.

Devido à grande dificuldade de diluição do antioxidante pó tanto no meio de

manutenção dos embriões produzidos in vivo quanto no meio de transporte dos

oócitos que passariam pela produção in vitro de embriões, foi realizada, na empresa

VITROGEN Pesquisa e Desenvolvimento em Biotecnologia da Reproducao S/C Ltda,

a diluição prévia do antioxidante em etanol 95%. Nesse caso, no momento do uso, a

diluição inicial foi realizada adicionando-se 4,0 µL de etanol 95% ao conteúdo do

tubo cônico (0,5 mg de Trolox®), sendo, posteriormente, realizada a diluição final

com meio de transporte (H199+3), a fim de se completar 5 mL de uma solução final

de 400 µmol.L-1.

5.1.5 Preparo do Antioxidante Na fase de campo (Experimento1), imediatamente anterior a cada uso, a

diluição do antioxidante foi realizada, adicionando-se 1,0 mL de meio de manutenção 3 TCM 199 - Tissue Culture Medium 199 - Sigma - M 4530, St. Louis,. MO

16

- TQC Holding Plus ao conteúdo do tubo cônico e procedendo-se passagens

consecutivas e alternadas por vórtex e banho-maria a 39ºC até a completa diluição.

Posteriormente, a solução obtida foi transferida para um tubo cônico de polietileno de

15 mL, onde foi realizada a diluição final com mais 9,0 mL de meio, a fim de se

completar os 10 mL finais. Então, a solução foi homogeneizada e aspirada em uma

seringa de 20 mL, onde foi mantida protegida da luz e calor até o momento do uso.

Na fase laboratorial (Experimento 2), no dia do uso, a diluição inicial foi

realizada adicionando-se 4,0 µL de etanol 95% ao tubo cônico contendo 0,5 mg de

Trolox®, sendo, posteriormente, realizada a diluição final com meio de transporte

(H199+4), a fim de se completar 5 mL de uma solução final de 400 µmol.L-1. A

solução era, então, homogeinizada e mantida em estufa até o momento da sua

utilização.

5.2 Experimento 1 5.2.1 Local e Período de Execução

O presente experimento foi realizado durante os meses de abril a junho e

setembro a novembro de 2007, na Fazenda Santa Rita (Agrindus S/A), localizada no

sudoeste do Brasil, na Estrada Velha Descalvado/São Carlos, município de

Descalvado (21º54'14" S / 47º37'10" O). A Agrindus é, referencialmente, a principal

granja leiteira da região e a segunda maior produtora de leite do país.

5.2.2 Condições Climáticas Foi realizado um levantamento das médias de temperatura e umidade da

região durante todo o período experimental. Esses parâmetros foram diariamente

registrados.

5.2.3 Animais Todas as fêmeas em lactação utilizadas no presente experimento foram

mantidas em freestalls (baias de estabulação livre) com acesso a um piquete

4 TCM 199 - Tissue Culture Medium 199 - Sigma - M 4530, St. Louis,. MO

17

adjacente com pastagem. Vacas não lactantes e novilhas foram alojadas em

piquetes com pastagem e água ad libitum. As vacas em lactação foram ordenhadas

três vezes ao dia, atingindo uma média produção leiteira de 40.500 litros de leite/dia.

O rebanho total da fazenda consistia em 3.000 animais (1650 adultos e 1350 jovens)

e a produção individual registrada teve média de 35L/vaca/dia no inverno e

30L/vaca/dia no verão, sendo 82 a 90% do rebanho adulto em lactação. A

alimentação fornecida continha silagem de milho e concentrado a base de soja e

milho, suficientes para suprir ou sobrepor os requerimentos nutricionais de vacas

leiteiras em lactação, não lactantes ou novilhas (NRC 2001).

5.2.3.1 Doadoras de Embriões

Sessenta e cinco doadoras de embriões da raça holandesa, sendo 20 vacas

não lactantes, 15 vacas em lactação e 30 novilhas, foram utilizadas no presente

trabalho. Esses animais foram submetidos a protocolos hormonais de superovulação

(SOV) e inseminação artificial em tempo fixo (IATF), sendo, posteriormente

submetidos à colheita de embriões (Figuras 2 e 3 e Tabelas 1, 2 e 3).

Inserção do Implante + BE + P4 (+ bST*)

PGF (m e t)

Retirada do Implante

NORGESTOMET

FSH

D15 (m)

D9 (m)

D8 (m)

D6 D5 D4 D0 D8 (t)

D7

Colheita de Embriões GnRH IA IA

Figura 2. Esquema geral de protocolo de superovulação (SOV) de vacas não lactantes e novilhas da raça

Holandesa, doadoras de embriões.

* bST foi administrado somente nas vacas não lactantes. Novilhas não receberam esse hormônio

m = manhã; t = tarde

BE (Benzoato de estradiol, 2mg) + P4 (Progesterona, 50mg) – Index, Brasil

Norgestomet (implante auricular de progestágeno, 3mg) - Crestar®, Intervet, Brasil

bST (somatotrofina bovina recombinante) - Boostin ® – Schering-Plough Coopers, Brasil

FSH (hormônio folículo estimulante, 400UI) – Pluset, Laboratorios Calier, Espanha

17PGF (prostaglandina 2α) - Ciosin® – Schering-Plough Coopers, Brasil

GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) – Fertagyl® – Intervet, Brasil

Tabela 1. Protocolo de superovulação (SOV) de vacas não lactantes da raça Holandesa, doadoras de embriões.

D0 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D15

1Norgestomet1 4mL 3mL 2mL 1mL 2,5mL

P4+BE2 (2mL) Manhã FSH6 FSH FSH + FSH GnRH8 IA9 Colheita

2mL PGF2α7 + bST3

4mL 3mL 2mL 1mL

Aminopool4 Tarde FSH FSH FSH + FSH + IA

+ PGK5

(manhã) 2mL PGF2α

Retirar

Implante

1 Norgestomet (implante auricular de progestágeno, 3mg) - Crestar®, Intervet, Brasi 2 BE (Benzoato de estradiol, 2mg) + P4 (Progesterona, 50mg) – Index, Brasil 3bST (somatotrofina bovina recombinante) - Boostin ® – Schering-Plough Coopers, Brasil 4 Complexo vitamínico e aminoácidos - Protran 5 Penicilina G Potássica – infusão uterina – SAMVET, Brasil 6 FSH (hormônio folículo estimulante, 400UI) – Pluset, Laboratorios Calier, Espanha 7 PGF (prostaglandina 2α) - Ciosin® – Schering-Plough Coopers, Brasil 8 GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) – Fertagyl® – Intervet, Brasil 9 Inseminação artificial

18

Tabela 2. Protocolo de superovulação (SOV) de novilhas da raça Holandesa, doadoras de embriões.

D0 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D15

1Norgestomet1 4mL 3mL 2mL 1mL 2,5mL

P4+BE2 Manhã FSH4 FSH FSH + FSH GnRH6 IA7 Colheita

(2mL) 2mL PGF2α5

Aminopool3 4mL 3mL 2mL 1mL

Tarde FSH FSH FSH + FSH + IA

(manhã) 2mL PGF2α Retirar

Implante

1 Norgestomet (implante auricular de progestágeno, 3mg) - Crestar®, Intervet, Brasi 2 BE (Benzoato de estradiol, 2mg) + P4 (Progesterona, 50mg) – Index, Brasil 3 Complexo vitamínico e aminoácidos - Protran 4 FSH (hormônio folículo estimulante, 400UI) – Pluset, Laboratorios Calier, Espanha 5 PGF (prostaglandina 2α) - Ciosin® – Schering-Plough Coopers, Brasil 6 GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) – Fertagyl® – Intervet, Brasil 7 Inseminação artificial

19

20

Figura 3. Esquema geral de protocolo de superovulação (SOV) de vacas em lactação da raça Holandesa, doadoras

de embriões.

FSH

D15 (m)

D9 (t)

D8 (m)

D6 D5 D4 (t)

D0 D9 (m)

D7

Colheita de Embriões GnRH

IA + bST IA

NORGESTOMET (2 implantes)

PGF (t)

Retirada do Implante Inserção do

Implante + BE + P4 + bST

PGF (m)

D10

** Rotineiramente a bST é administrada às vacas em lactação a cada 12 dias (exemplo D0 e D12), portanto, estão constantemente sobre efeito desse hormônio

bST (somatotrofina bovina recombinante) - Boostin ® – Schering-Plough Coopers, Brasil

Norgestomet (implante auricular de progestágeno, 3mg) - Crestar®, Intervet, Brasil

FSH (hormônio folículo estimulante, 400UI) – Pluset, Laboratorios Calier, Espanha

BE (Benzoato de estradiol, 2mg) + P4 (Progesterona, 50mg) – Index, Brasil

GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) – Fertagyl® – Intervet, Brasil

PGF (prostaglandina 2α) - Ciosin® – Schering-Plough Coopers, Brasil

21

D0 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D15

2 Norgestomet1 4mL 3mL 2mL 1mL 2,5mL

P4+BE2 Manhã FSH FSH FSH + FSH + GnRH8 IA9 Colheita

(3mL) + bST3 2mL

PGF2α

Retirar

Implante

Aminopool4 4mL 3mL 2mL 1mL

+ Metricure5 Tarde FSH6 FSH FSH + FSH IA +

(tarde) 2mL

PGF2α7 bST**

Tabela 3. Protocolo de superovulação (SOV) de vacas em lactação da raça Holandesa, doadoras de embriões.

** Rotineiramente a bST é administrada às vacas em lactação a cada 12 dias (exemplo D0 e D12), portanto, estão constantemente sobre efeito desse hormônio.

3bST (somatotrofina bovina recombinante) - Boostin ® – Schering-Plough Coopers, Brasil

6 FSH (hormônio folículo estimulante, 400UI) – Pluset, Laboratorios Calier, Espanha

1 Norgestomet (implante auricular de progestágeno, 3mg) - Crestar®, Intervet, Brasi 2 BE (Benzoato de estradiol, 2mg) + P4 (Progesterona, 50mg) – Index, Brasil

8 GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) – Fertagyl® – Intervet, Brasil

7 PGF (prostaglandina 2α) - Ciosin® – Schering-Plough Coopers, Brasil

5 Metricure® (Cefapirina benzatínica) - Intervet, Brasil

4 Complexo vitamínico e aminoácidos - Protran

9 Inseminação artificial

23

5.2.3.2 Receptoras de Embriões

No programa de TE foram utilizadas como receptoras de embriões apenas

fêmeas holandesas adultas repetidoras de serviço, ou seja, que já haviam recebido 3

ou mais inseminações artificiais (IA) sem resultar concepção. Foram utilizadas 482

fêmeas receptoras de embrião, sendo 178 de cio natural, 147 com cio induzido por

aplicação de PGF2α5 e 157 submetidas a protocolo de transferência de embriões em

tempo fixo (TETF; Figura 1). No dia da TE, equivalente a 6-8 dias após a data do cio,

10 dias após a aplicação de PGF2α

(2%) e higienização da região perivulvar. Um único

embrião foi inovulado no corno ipsilateral ao CL de cada receptora.

e 17 dias após o início do protocolo de TETF, as

candidatas a receptoras foram previamente examinadas (palpação transretal) para a

verificação da presença de CL e identificação do ovário em que esta estrutura se

encontrava. As fêmeas selecionadas foram então preparadas para a inovulação do

embrião, recebendo anestesia epidural (tricotomia, antissepsia e epidural) com

160mg de cloridrato de lidocaína6

Norgestomet

72 TETF

Remoção do implante + eCG (400 UI) + PGF

+ CE (0,5 mg)

Dia 0 Dia 8 Dia 17

Figura 4. Protocolo de transferência de embrião em tempo fixo (TETF) para

sincronização da ovulação em receptoras de embrião repetidoras de

serviço da raça Holandesa.

BE (Benzoato de estradiol) – Index, Brasil

eCG (gonadotrofina corionica eqüina) - Folltropin® - Intervet, Brasil

** bST administrado a cada 12 dias (exemplo D0 e D12), portanto, as vacas estão constantemente sobre efeito desse hormônio

5 Prostaglandina F2α - Ciosin® – Schering-Plough Coopers, Brasil 6 Cipionato de estradiol - E.C.P.® – Pfizer Saúde Animal, Brasil

24

5.2.4 Colheita, manipulação e inovulação dos embriões

5.2.4.1 Colheita dos embriões

No programa de SOV e TE, inicialmente, as doadoras foram avaliadas

(palpação transretal) para contagem do número de CLs presentes em cada um dos

ovários, a fim de se determinar os cornos a serem lavados e se estimar o número de

embriões a serem colhidos. Os animais aptos a entrarem em colheita foram

conduzidos para um brete de contenção adjacente, onde foram adequadamente

posicionados com os membros anteriores elevados. Lavagem, tricotomia e

antissepsia do espaço intervertebral sacro-coccígeo foram realizadas para a

aplicação da anestesia epidural com cloridrato de lidocaína 2%7. Posteriormente,

realizou-se a remoção das fezes presentes na ampola retal com auxílio de uma luva

de palpação transretal. A região perineal, perivulvar e adjacências foram então

cautelosamente higienizadas e a cauda do animal contida. Após a antissepsia (álcool

70%) da região vulvar, um expansor metálico estéril foi introduzido na vagina e

conduzido pela cérvix, com o objetivo de promover sua dilatação e remoção do muco

presente, facilitando a posterior passagem da sonda de Folley. Acoplada a um

mandril metálico, a sonda de Folley (no 18 ou 20) foi então introduzida na vagina do

animal e conduzida pelos anéis cervicais até atingir o corpo uterino, sendo, a partir

daí, direcionada a um dos cornos uterinos. Uma vez posicionada, com sua

extremidade no terço proximal (ápice) do corno uterino, o balão da sonda foi inflado,

com o auxílio de uma seringa de 20 mL e o mandril (da sonda) cuidadosamente

removido. Um tubo de silicone de dupla via (tubo em “Y”) foi, então, acoplado à

sonda, possibilitando, pela abertura e fechamento de suas travas, a realização das

lavagens individuais dos cornos uterinos com DMPBS8 (0,5 L para cada corno).

Durante o procedimento de lavagem, o corno foi preenchido diversas vezes com o

fluido, massageado cuidadosamente e esvaziado. O fluido escoado dos cornos

uterinos passou por um filtro, protegido da incidência de luz, que foi constantemente

drenado (nunca esvaziado totalmente). Após a lavagem de ambos os cornos, o filtro 7 Lidovet – Bravet, Brasil 8 DMPBS – Nutricell, Brasil

25

foi devidamente desacoplado do sistema de lavagem e encaminhado para um

laboratório.

5.2.4.2 Seleção e classificação dos embriões

No laboratório, o conteúdo do filtro foi despejado em placas de cultivo celular

de 100 mm e o filtro cuidadosamente lavado, com auxílio de uma seringa de 60 mL

com DMPBS. Em seguida, utilizando-se um estereomicroscópio com luz indireta, foi

realizada a procura e seleção (separação das estruturas não fecundadas e

degeneradas) dos embriões de cada doadora, individualmente, sendo passados para

uma placa de cultivo celular contendo TQC Holding Plus. A classificação dos

embriões foi realizada de acordo com o seu estádio de desenvolvimento (mórula-M,

blastocisto inicial-Bi, blastocisto-Bl ou blastocisto expandido-Bx) e qualidade (graus I,

II ou III), seguindo as normas estabelecidas no Manual da IETS (1998).

5.2.4.3 Separação dos grupos

A divisão dos embriões para os dois grupos experimentais (GC – grupo

controle e GA – grupo antioxidante) foi realizada após a classificação, atentando-se

para manter semelhante proporção de estádio e qualidade embrionária em cada

grupo. Durante esse processo, os embriões foram transferidos para novas placas de

cultivo celular contendo gotas de TQC Holding Plus, com ou sem antioxidante, onde

permaneceram por um período de 2 a 8 horas. O momento de divisão dos grupos foi

registrado.

5.2.4.4 Envase e inovulação dos embriões

Após o período de espera em meio de manutenção, os embriões passaram

por banhos seqüenciais desse mesmo meio (Manual da IETS, 1998), sendo

posteriormente envasados em palhetas de 0,25 mL para transferência a fresco. Os

26

embriões foram inovulados no corno uterino ipsilateral ao ovário onde se encontrava

o CL, em fêmeas previamente selecionadas (ver item 5.2.3.2.)

5.2.4.5 Diagnóstico de gestação

O diagnóstico de gestação foi realizado aos 25 dias pós-TE, com auxílio de

aparelho de ultrassom (Aloka SSD 500, transdutor linear de 5 MHz, Tokyo, Japão). A

confirmação de concepção foi realizada aos 46 dias, por palpação transretal.

5.2.5 Dados colhidos

5.2.5.1 Doadoras

As doadoras de embriões foram avaliadas quanto à categoria (lactante, não

lactante ou novilha), número de dias em lactação (DEL), número de CL em cada

ovário e total, touro utilizado na IA, número de embriões colhidos (estádios e

qualidades), número de embriões degenerados, número de embriões viáveis e

número de oócitos não-fertilizados (NF). Ainda, durante o primeiro período

experimental (abril-junho), uma parcela das doadoras contribuiu com dados

adicionais como: escore de condição corporal (ECC), escore de locomoção (EL),

temperatura retal (TR) e freqüência respiratória (FR).

5.2.5.2 Receptoras

As receptoras de embriões foram avaliadas quanto ao número de eventos (IA

ou TE recebidas), número de dias em lactação (DEL), lado e qualidade do CL,

estádio e qualidade do embrião inovulado (IETS, 1998), protocolo reprodutivo (cio

natural, cio induzido por aplicação de PGF ou sincronização da ovulação para TETF).

Ainda, durante o primeiro período experimental (abril-junho), uma parcela das

receptoras contribuiu com dados adicionais como: produção semanal de leite (média

dos sete dias que antecederam a colheita), ECC, EL, TR e FR.

27

5.2.5.3 Intervalo Colheita-Divisão dos Grupos, Divisão dos grupos-Inovulação e Colheita-Inovulação

Os horários da colheita dos embriões, divisão dos grupos (controle e

antioxidante) e inovulação foram devidamente registrados, a fim de se obter os

intervalos de Colheita-Divisão dos Grupos (Col-Div, entre a colheita de embriões até

a divisão dos grupos experimentais), Divisão dos grupos-Inovulação (Div-Inov,

período de permanência em TQC Holding Plus com ou sem antioxidante antes da

inovulação dos embriões) e Colheita-Inovulação (Col-Inov, entre colheita e

inovulação dos embriões).

5.2.6 Análises estatísticas

A unidade experimental “vaca” (doadora ou receptora) foi o objeto das

medidas repetidas ao longo do tempo. A análise de variáveis contínuas e dados

binomiais foi realizada por regressão logística utilizando o proc GLIMMIX do SAS9,

sendo a unidade experimental “vaca” incluída no modelo estatístico como variável de

efeito aleatório. Para a análise dos dados referentes às doadoras foram incluídas as

informações de época do ano, data da colheita, categoria da doadora (novilha, vaca

seca ou lactante), touro, ordem de parição, umidade relativa do ar (de 120 dias

antes, da semana ou do dia da colheita) e temperatura máxima, mínima e média (de

120 dias antes, da semana ou do dia da colheita). Para a análise dos dados

referentes às receptoras foram incluídas as informações de tratamento (controle ou

antioxidante), época do ano, data da inovulação, categoria de doadora (novilha, vaca

seca ou lactante), touro, ordem de parição da doadora e da receptora, número de

eventos reprodutivos (inseminações e/ou inovulações) prévios da receptora, número

de dias em lactação da receptora, protocolo reprodutivo (observação de estro,

prostaglandina ou TETF) da receptora, tempo de permanência (ou não) dos

embriões no antioxidante, tempo decorrido entre a colheita e a inovulação, ovário

que continha o CL (direito ou esquerdo), qualidade do CL, sincronia doadora-

receptora, estádio de desenvolvimento embrionário, qualidade do embrião, umidade 9 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 2001

28

relativa do ar (de 120 dias antes, da semana ou do dia da colheita) e temperatura

máxima, mínima e média (de 120 dias antes, da semana ou do dia da colheita).

Ainda, as interações, tanto em doadoras quanto em receptoras, foram utilizadas nos

modelos estatísticos.

Para construir o modelo final de regressão logística foram removidas, de

acordo com os critérios estatísticos de Wald, todas as variáveis com P > 0,20. No

modelo final de doadoras foram incluídas as variáveis época do ano, categoria da

doadora (novilha, vaca não lactante ou lactante) e a interação entre época do ano e

categoria da doadora. Já, no modelo final de receptoras foram incluídas as variáveis

tratamento (controle ou antioxidante) época do ano, categoria da doadora (novilha,

vaca seca ou lactante), qualidade do embrião e temperatura máxima, mínima e

média da semana da colheita. O intervalo Col-Inov foi também analisado por

regressão linear, utilizando o Guide Data Analysis. Probabilidades de P < 0,05 foram

consideradas como significantes, e probabilidades entre 0,05 e 0,10 foram discutidas

como tendências. Todos os dados estão expressos como médias ± erro padrão da

média.

5.3 Experimento 2

5.3.1 Local e período de execução O Experimento 2 foi dividido em duas fases experimentais: produção in vitro

de embriões (PIV) e dosagem de capacidade antioxidante total. A primeira fase (PIV)

foi realizada durante os meses de junho a outubro 2007 e janeiro a março de 2008,

na empresa VITROGEN Pesquisa e Desenvolvimento em Biotecnologia da

Reproducao S/C Ltda. Localizada no sudoeste do Brasil, no município de Cravinhos

(21º20'25" S / 47º43'46" O), a Vitrogen é uma das maiores empresas de produção in

vitro de embriões do país. A segunda fase foi realizada durante o mês de abril 2008

no Departamento de Química da Universidade de São Paulo, Câmpus de Ribeirão

Preto, município de Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. Todas as análises foram feitas

sob supervisão do Prof. Dr. Antônio Cláudio Tedesco.

29

5.3.2 Procedimentos laboratoriais da PIV

5.3.2.1 Aspiração intra-folicular, seleção e classificação dos oócitos

Os ovários utilizados para a realização do presente Experimento foram obtidos

de abatedouros e transportados em solução salina 0,9% estéril, suplementada com

antibiótico, em recipiente térmico a 35ºC. No laboratório, 2 a 3 horas passadas do

abate, os ovários foram borrifados com álcool 70% e lavados duas vezes em solução

fisiológica aquecida (35ºC), suplementada com soro fetal bovino (SFB) e antibiótico.

Em seguida, foi realizada a aspiração dos folículos de 2 a 7 mm com auxílio de

agulha de calibre 18G acoplada a uma seringa de 10 mL. O conteúdo folicular

recuperado foi despejado em um tubo cônico de 50 mL mantido em banho-maria.

Após todos os ovários terem sido submetidos ao processo de aspiração intra-

folicular, o conteúdo folicular obtido foi filtrado, lavado com a mesma solução

fisiológica suplementada acima mencionada e depositado em uma placa de cultivo

celular de 60 x 15 mm (Corning®). As placas foram então levadas para o fluxo

laminar para que a procura dos oócitos fosse realizada sob estereomicroscópio.

Somente oócitos grau I e II foram utilizados no presente experimento. Oócitos

atrésicos, apresentando cumulus expandido, ausência de células do cumulus

(desnudos) ou citoplasma muito escuro, muito claro ou com grânulos foram

descartados.

Em seguida, os oócitos selecionados foram lavados duas vezes no meio

TCM199 com sais de Earles, glutamina, NaHCO3 e Hepes (GibcoTM, Cat. Nº.12350-

039) suplementado com piruvato (22 µg/mL), antibiótico (8,3 mg/mL), e 10% de SFB

(GibcoTM Cat. Nº. 10270-106), denominado meio de lavagem (H199+).

5.3.2.2 Separação dos grupos

Logo após a seleção, os complexos cumulus-oócito (CCO) foram

homogeneamente separados em quatro grupos (Controle 8h, Antioxidante 8h,

30

Controle 20h e Antioxidante 20h), contendo aproximadamente 50 CCO cada, sendo

mantida a mesma proporção de oócitos grau I e II em cada grupo. Os CCO foram

transferidos para tubos de poliestireno de 1,5 mL, contendo 1,0 mL de meio H199+

com ou sem antioxidante (Trolox®), da seguinte forma:

- Grupo Controle 8h (GC8h): 50 CCO + 1,0 mL de H199+;

- Grupo Antioxidante 8h (GA8h): 50 CCO + 1,0 mL de H199+ + antioxidante;

- Grupo Controle 20h (GC20h): 50 CCO + 1,0 mL de H199+;

- Grupo Antioxidante 20h (GA20h): 50 CCO + 1,0 mL de H199+ + antioxidante.

Os tubos referentes aos quatro grupos foram devidamente identificados e

mantidos em uma transportadora de oócitos (Mini Tub), com temperatura constante

de 37ºC, por 8 (GC8h e GA8h) ou 20 horas (GC20h e GA20h). Esse sistema estaria

simulando o transporte de oócitos do campo para o laboratório após aspiração intra-

folicular in vivo, com diferentes períodos de transporte (8 e 20h).

5.3.2.3 Maturação in vitro de Embriões

Passado o período de transporte, os CCO foram removidos dos tubos e

lavados duas vezes em gotas de TCM199 com sais de Earles, glutamina e NaHCO3

(GibcoTM, Cat. Nº. 11150-059) suplementado com 10% de SFB (Cat. Nº. 16140),

piruvato (22 µg/mL), antibiótico (8,3 mg/mL), 0,5 µg de FSH/mL, 50 µg de LH/mL e 1

µg de estradiol/mL (Sigma Cat. Nº. E-8875), denominado meio de maturação

(B199+). Os CCO foram, então, transferidos para migrogotas de 70 µL de B199+,

cobertas com óleo mineral (Sigma, Cat. Nº. M-8410) em placas de cultivo celular

(Fig. 5). Aproximadamente 25 CCO foram colocados em cada microgota e levados à

incubadora a 38,5 – 38,8ºC e 5% de CO2 em atmosfera com umidade saturada até

completar 24 horas de maturação (16 horas e 4 horas para os grupos 8h e 20h,

respectivamente).

31

35 µL meio + 3,5 mL óleo + 35 µL meio + 10

µL oócitos

Figura 5. Esquema de montagem de placas de maturação in vitro de complexos

cumulus-oócitos.

5.3.2.4 Fecundação in vitro de Embriões

a-) Preparação dos oócitos

Após o período de maturação, os oócitos foram lavados em meio TALP

suplementado com heparina (10 µg/mL), piruvato (22 µg/mL), antibiótico (0,5

mg/mL), BSA livre de ácidos graxos (6 mg/mL) e solução PHE (2 µM de penicilamina,

1 µM de hipotaurina e 0,25 µM de epinefrina), denominado meio FIV.

b-) Preparo dos espermatozóides e inseminação in vitro

As palhetas de sêmen de 0,25 mL de um único touro e única partida (Lagoa

da Serra Ltda) foram descongeladas em banho-maria a 35ºC, durante 30 segundos e

seu conteúdo submetido à técnica de gradiente de Percoll (PercollTM, GE Heathcare

Bio- Sciences AB, Cat. No. 17-0891-01) para a obtenção dos espermatozóides

móveis e remoção do diluidor e do plasma seminal (Fig. 6). Para tanto, o gradiente

de Percoll (45 e 90%) previamente preparado com TALP-SPERM e equilibrado em

estufa, teve o sêmen de uma palheta depositado sobre ele e foi submetido à

centrifugação (320G) por 30 minutos. Terminada a centrifugação, o sobrenadante foi

descartado e o pellet avaliado quanto ao volume (µL), concentração e motilidade

espermática, retirando-se, para isto, duas alíquotas 5 µL, as quais foram diluídas em

250 µl de água e 250 µl de meio FIV, respectivamente. O volume de meio FIV que

deveria ser adicionado ao pellet (diluição) foi calculado e o sêmen devidamente

32

diluído, a fim de que cada 10 µL de sêmen contivesse o equivalente a 2 x 106 de

espermatozóides. Após a adição de 10 µL de sêmen em cada microgota de meio FIV

contendo aproximadamente 25 oócitos, foi realizada a incubação de espermatozóide

e oócito a 38,5-38,8ºC e 5% de CO2 em atmosfera com umidade saturada por 18 a

22 horas.

Percoll 90%

Centrífuga Diluente do sêmen

SPTZ mortos

SPTZ viáveis

Sêmen

Percoll 45%

Figura 6. Esquema de montagem do tubo de gradiente de Percoll para centrifugação

do sêmen a ser utilizado na fecundação in vitro de oócitos.

5.3.2.5 Cultivo in vitro de Embriões

Passado o período de incubação pós FIV, os supostos zigotos foram lavados

em 5 microgotas de meio CR4 (meio de cultivo) e o excesso de células do cumulus

foi removido. Posteriormente, foram depositados em microgotas de 50 µL de CR4

cobertas por óleo mineral (Sigma, Cat. Nº. M-8410; Fig. 7).

No terceiro dia de cultivo (D3) foi realizada a avaliação e contagem dos

embriões clivados (taxa de clivagem) e o feeding, ou seja, remoção de

aproximadamente 30 µL de meio e adição de 40 µL de meio CR4 novo.

Nos sexto, sétimo e nono dias de cultivo (D6, D7 e D9) foram realizadas

avaliações e contagens do número de embriões em cada estágio de

desenvolvimento embrionário (mórula compacta - Mo, blastocisto inicial - Bi,

blastocisto - Bl, blastocisto expandido - Bx, blastocisto eclodindo - Bn, blastocisto

33

eclodido - Be e blastocisto regredido - Br). No décimo primeiro dia de cultivo (D11) foi

realizada a avaliação e contagem apenas dos blastocistos eclodidos - Be.

25 µL meio + 3,5 mL óleo + 25 µL meio + 10

µL embriões

Figura 7. Esquema de montagem de placas de cultivo in vitro de embriões.

5.3.3 Procedimentos Laboratoriais para dosagem de Capacidade Antioxidante Total

Para a realização dos testes de capacidade antioxidante total, foram retiradas,

em duplicata, alíquotas de 200 µL do meio de transporte de ambos os grupos em

cada tempo experimental (0, 8 e 20h). Dessa forma, para cada réplica, foram

colhidas 12 alíquotas de meio, como no diagrama abaixo (Fig. 8). As amostras foram

imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -33ºC até o

momento da realização das análises. Esses procedimentos foram todos realizados

ainda no laboratório de PIV.

0 hora 0 hora

Grupo Cont. 8 horas Grupo Antiox. 8 horas

20 horas 20 horas

Figura 8. Esquema de colheita de alíquotas de meio de transporte de oócitos para a

dosagem da capacidade antioxidante total.

34

No laboratório de Química, amostras referentes a 14 réplicas (com 12

alíquotas cada) foram utilizadas para a dosagem da capacidade antioxidante total. O

princípio do ensaio antioxidante utilizado é a formação do radical ferril mioglobina a

partir de metamioglobina e peróxido de hidrogênio. Esse radical oxida o ABTS (2,2’-

azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) para produzir o radical cátion

ABTS•+, um cromógeno solúvel de cor verde que pode ser determinado por

espectrofotômetro em comprimento de onda de 405 nm. Os antioxidantes suprimem

a produção de radicais livres de forma concentração dependente, sendo que a

intensidade da coloração decresce proporcionalmente à concentração de

antioxidante. Nesse kit, o Trolox® é utilizado como antioxidante padrão ou controle.

Todos os ensaios foram realizados segundo o protocolo que acompanha o

próprio kit, sendo a curva padrão modificada para que as amostras se enquadrassem

nos valores desta. Para a construção da curva padrão (absorbância vs concentração

de Trolox®) foram utilizadas as concentrações de Trolox® 0, 15, 105, 210, 420, 500 e

600 µM, sendo a equação da reta utilizada para a obtenção das concentrações das

amostras analisadas.

5.3.4 Análise estatística Na primeira fase, a unidade experimental “oócito” foi o objeto das medidas

repetidas ao longo do tempo. A análise de variáveis dos dados binomiais foi

realizada por regressão logística utilizando o proc GLIMMIX do SAS. Para a análise

dos dados foram inclusas as informações de réplica, tratamento (controle vs

antioxidante), momento de colheita da amostra (0, 8 e 20 horas) e interações entre

estas variáveis.

Para construir o modelo final de regressão logística foram removidas todas as

variáveis que não apresentaram efeito estatístico (P > 0,10). No modelo final foram

incluídas as variáveis réplica, tratamento e momento. Probabilidades de P < 0,05

foram consideradas como significantes. Todos os dados foram expressos como

média ± erro padrão da média.

35

Na segunda fase, a análise das concentrações de antioxidante foi realizada

por regressão logística utilizando o proc GLIMMIX do SAS. Para a análise dos dados

foram incluídas as informações de tratamento (controle ou antioxidante), momento de

colheita da amostra (0, 8 e 20 horas), réplica e interações entre essas variáveis.

Para construir o modelo final de regressão logística foram removidas, de

acordo com os critérios estatísticos de Wald, todas as variáveis com P > 0,10. No

modelo final foram inclusas apenas as variáveis tratamento e réplica. Probabilidades

de P < 0,05 foram consideradas como significantes. Todos os dados foram

expressos como média ± erro padrão da média.

36

6 RESULTADOS

6.1 Experimento 1

6.1.1. Resultados Gerais

Para a análise final dos dados obtidos no presente experimento foram

removidos todos os dados imprecisos ou com baixo número de observações, tais

como, doadoras das quais foi colhido apenas um embrião (n = 10), receptoras que

receberam mais de um embrião (n = 1), receptoras que receberam IA e embrião (n =

2), receptoras assincrônicas em dois ou mais dias em relação à doadora (n = 3),

animais descartados do plantel antes das verificações de concepção (n = 5),

embriões congelados (n = 27) e touros utilizados para IA de poucas doadoras (um

touro com 2 IA e 6 embriões e outro com apenas 1 IA e 1 embrião). Dessa forma, de

um total de 75 doadoras (25 vacas não lactantes, 19 vacas em lactação e 31

novilhas), 537 receptoras e 5 touros, foram efetivamente utilizados 65 doadoras (20

vacas não lactantes, 15 vacas em lactação e 30 novilhas), 482 receptoras e 3 touros.

Ainda, foi realizado um total de 87 colheitas de embriões (alguns animais passaram

por mais de uma colheita), sendo 20 em vacas lactantes, 31 em vacas não lactantes

e 36 em novilhas. Dos 482 embriões, 240 compuseram o GA e 242 o GC.

Alguns dados como produção de leite, ECC, EL, TR e FR foram colhidos

apenas no primeiro período experimental e de apenas uma parcela dos animais

(doadoras e receptoras). Dados como intervalo Div-Inov, produção de leite, DEL,

ECC, EL, TR, FR, qualidade do CL, número de CL e número de eventos foram

agrupados em classes, a fim de se possibilitar uma melhor análise estatística.

Foi possível comprovar a homogeinicidade entre os dois grupos experimentais

quanto a todos os aspectos avaliados, tanto para doadoras quanto para receptoras.

Nesse contexto, as doadoras (n = 65) utilizadas em ambos os grupos experimentais

foram as mesmas, uma vez que todas tiveram seus embriões divididos igualmente

entre os tratamentos. Esses animais apresentaram DEL médio de 502,30 ± 37,22,

37

média do total de estruturas recuperadas na lavagem uterina de 10,51 ± 0,89 (n = 87,

número de colheitas), número médio de estruturas NF recuperadas de 3,97 ± 0,56 (n

= 87), número médio de embriões degenerados recuperados de 0,49 ± 0,11 (n = 87)

e número médio de embriões viáveis recuperados de 6,11 ± 0,53 (n = 87).

As receptoras (n = 482), por sua vez, apresentaram número médio de eventos

(IA/TE) de 6,58 ± 0,15; sendo 6,68 ± 0,20 para o GA (n = 240) e 6,48 ± 0,22 para o

GC (n = 242) e DEL médio de 360,26 ± 8,38; com 366,06 ± 11,19 para o GA (n =

240) e 354,40 ± 11,69 para o GC (n = 242).

Os intervalos Col-Div foram similares para ambos os grupos, uma vez que

embriões de uma mesma doadora foram sempre divididos entre os dois grupos, no

mesmo momento. Ainda, os intervalos Div-Inov e Col-Inov foram semelhantes entre

ambos os grupos, apresentando médias de 266,89 ± 5,58 min (GA = 276,61 ± 7,91 e

GC = 257,40 ± 7,81 min) e 368,99 ± 5,82 min (GA = 377,34 ± 8,48 e GC = 360,83 ±

7,94 min), respectivamente.

As taxas de concepção aos 25 e 46 dias (média de 38,2% e 28,8%,

respectivamente) e a perda gestacional (média de 24,5%) foram também similares

entre os dois grupos, sendo que os animais do GA apresentaram 38,3; 27,9 e 27,2%

e do GC 38; 29,8 e 21,7%, respectivamente (P > 0,05; Tab.4).


(entre 25 e 46 dias) de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa, após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção (TQC Holding Plus) com ou sem adição de antioxidante (Trolox®; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Tratamento

Antioxidante Controle P

Concepção aos 25 dias 38,3 % (92/240) 38,0 % (92/242) 0,81


Perda Gestacional 27,2 % (25/92) 21,7 % (20/92) 0,51 TQC Holding Plus – Bioniche/USA - Nutricell, Brasil

38

Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA

6.1.2. Resultados Específicos

6.1.2.1. Estação do ano

Maior umidade relativa do ar semanal foi detectada durante o outono, em

relação à primavera. No entanto, a primavera apresentou maiores temperaturas

ambientais mínima, máxima e média do que o outono (Fig.9, Tab.5).

20 40 60 80

Tem

pera

tura

am

bien

tal m

édia

(ºC

)

0

20

40

60

80

Temperatura Set - Nov Temperatura Abril - Junho

Dias dos trimestres experimentais

20 40 60 80

Um

idad

e re

lativ

a do

ar m

édia

(%)

0

20

40

60

80

Umidade Abril - Junho Umidade Set - Nov

Figura 9. Média da umidade relativa do ar e da temperatura ambiental média semanal, nos dois períodos do ano em que foram realizadas as etapas experimentais na fazenda Santa Rita, Descalvado - SP (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

39

Tabela 5. Média da umidade relativa do ar semanal e das temperaturas ambientais mínima, máxima e média semanais, nos dois períodos do ano em que foram realizadas as etapas experimentais na fazenda Santa Rita, Descalvado - SP (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Abril-Junho Setembro-Novembro P

Umidade semanal (%) 62,3 57,9 < 0,0001

Temp. Amb. Mínima (ºC) 14,0 18,1 < 0,0001

Temp. Amb. Máxima (ºC) 26,3 32,7 < 0,0001

Temp. Amb. Média (ºC) 20,2 25,4 < 0,0001 Temp. Amb. = Temperatura Ambiental

6.1.2.1.1. Doadora Não foi determinada diferença estatística quanto ao número total de estruturas

recuperadas, número de embriões degenerados e número de embriões viáveis,

obtidos através da lavagem uterina das doadoras de embriões, nos dois diferentes

períodos do ano (Tab.6).

Tabela 6. Estruturas recuperadas (total, embriões degenerados e embriões viáveis) após lavagem uterina realizada em doadoras de embriões da raça Holandesa, em dois diferentes períodos do ano (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Período do Ano

Abril-Junho (n=60) Setembro-Novembro (n=27) P

Total de Estruturas 10,87 ± 1,18 9,70 ± 1,16 0,49

Embriões Degenerados 0,49 ± 0,14 0,48 ± 0,20 0,84

Embriões Viáveis 5,83 ± 0,65 6,74 ± 0,93 0,36

40

6.1.2.1.2. Receptora Foram realizadas 313 transferências de embrião durante o período de abril-

junho e 169 durante setembro-novembro, que resultaram em maior taxa de

concepção aos 25 dias durante o primeiro período, quando comparado ao outro

momento avaliado (41,9 vs 31,4%, respectivamente, P < 0,01; Tab.7). No entanto,

não houve efeito de período do ano sobre a taxa de concepção aos 46 dias ou sobre

a perda gestacional. Ainda, como não houve interação (P > 0,10) entre períodos do

ano e tratamentos, os resultados para os dois períodos foram analisados

conjuntamente para as demais variáveis (Tab.8).

Tabela 7. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, em dois diferentes períodos do ano (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Período do Ano




Perda Gestacional 25,2 % (33/131) 22,6 % (12/53) 0,56

Tabela 8. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção (TQC Holding Plus) com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), em dois diferentes períodos do ano (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Período do Ano


Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. Per. Trat. x Per.

Concepção aos 25 dias 41,9 % (65/155)a 41,8 % (66/158)a 31,8 % (27/85)b 31,0 % (26/84)b 0,78 0,001 0,90

Concepção aos 46 dias 31,0 % (48/155) 31,6 % (50/158) 22, 4 % (19/85) 26,2 % (22/84) 0,58 0,30 0,72

Perda Gestacional 26,2 % (17/65) 24,2 % (16/66) 29,6 % (8/27) 15,4 % (4/26) 0,28 0,56 0,29 Letras minúsculas distintas em um mesmo tratamento diferem significativamente entre si para diferentes estações, na mesma linha, com P < 0,05.

Trat. = tratamento

Per. = Período do ano

Per. X Est. = interação tratamento-período do ano

Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA TQC Holding Plus – Bioniche/USA – Nutricell, Brasil

40

42

6.1.2.2. Categoria da doadora

Para todas as categorias de doadora (vaca em lactação, vaca não lactante e

novilha) foram observados valores (totais e média/colheita) semelhantes quanto ao

número total de estruturas recuperadas, número de embriões degenerados e número

de embriões viáveis, obtidos através da lavagem uterina. No entanto, constatou-se

interação de período do ano e categoria, sendo observado um menor número de

oócitos NF na categoria das novilhas (0,94 ± 0,23 por colheita), em relação a vacas

não lactantes (5,39 ± 0,87; P = 0,001) e lactantes (7,37 ± 1,63; P = 0,002; Tab.9).

Além disso, foi detectada maior taxa de concepção aos 25 dias, das receptoras

cujos embriões foram provenientes de doadoras em lactação (44,2%) quando

comparados aos provenientes de novilhas (29,8; P = 0,02). Embriões de doadoras

em lactação também resultaram maior taxa de concepção aos 46 dias (37,6%), com

relação tanto a novilhas (23,4%; P = 0,009), quanto a doadoras não lactantes

(25,3%; P = 0,02). Ainda, menor perda gestacional (15,1%) foi relacionada às

doadoras em lactação, quando comparadas às doadoras não lactantes (38,3%; P =

0,01; Tab.10)

No entanto, dentro de cada categoria, não foi encontrado efeito de tratamento

sobre as taxas de prenhez aos 25 e 46 dias e sobre a perda gestacional (Tab.11).

6.1.2.3. DEL das doadoras

A média de DEL das doadoras que participaram do presente projeto foi de

502,30 ± 37,22. Não foi observada diferença nos DEL dos animais utilizados durante

a fase experimental realizada no período de abril a junho e setembro a novembro; P

> 0,05.

Tabela 9. Estruturas recuperadas (total, oócitos não fertilizados, embriões degenerados e embriões viáveis) após lavagem uterina realizada em doadoras de embriões da raça Holandesa, nas três diferentes categorias de doadora (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Categoria

Lactante (n=20) Novilha (n=36) Não lactante (n=31) P

Total de Estrutura 16,45 ± 2,39 6,55 ± 0,79 11,26 ± 1,35 0,49

Não Fertilizados 7,37 ± 1,63a 0,94 ± 0,23b 5,39 ± 0,87a 0,02

Embriões Degenerados 0,84 ± 0,19 0,28 ± 0,14 0,52 ± 0,24 0,84

Embriões Viáveis 8,65 ± 1,39 5,33 ± 0,59 5,39 ± 0,91 0,36 Letras minúsculas distintas diferem significativamente entre si, na mesma linha, com P < 0,05.

42

43

Tabela 10. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, segundo a categoria da doadora (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Categoria da Doadora

Lactante Novilha Não lactante P

Concepção aos 25 dias 44,2 % (73/165)a 29,8 % (51/171)b 41,1 % (60/146)ab 0,03

Concepção aos 46 dias 37,6 % (62/165)a 23,4 % (40/171)b 25,3 % (37/146)b 0,004

Perda Gestacional 15,1 % (11/73)a 21,6 % (11/51)ab 38,3 % (23/60)b 0,01 Letras minúsculas distintas diferem significativamente entre si, na mesma linha, com P < 0,05.

Tabela 11. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), segundo categoria da doadora (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Categoria da Doadora

Lactante Novilha Não lactante P

Antioxidante Controle Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. Cat. Trat. X Cat.

Concepção aos 25 dias

42,7 % (35/82)a

45,8 % (38/83)a

27,9 % (24/86)b

31,8 % (27/85)b

45,8 % (33/72)ab

36,5 % (27/74)ab 0,76 0,03 0,40


34,1 % (28/82)a

41,0 % (34/83)a

24,4 % (21/86)b

22, 4 % (19/85)b

25,0 % (18/72)b

25,7 % (19/74)b 0,73 0,004 0,65

Perda Gestacional

20,0 % (7/35)a

10,5 % (4/38)a

12,5 % (3/24)ab

29,6 % (8/27)ab

45, 5 % (15/33)b

29,6 % (8/27)b 0,76 0,01 0,12

Letras minúsculas distintas em um mesmo tratamento diferem significativamente entre si para diferentes categorias, na mesma linha, com P < 0,05. Trat. = Tratamento Cat. = Categoria da doadora Trat. X Cat. = interação tratamento-categoria da doadora Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA

44

46

6.1.2.4. Acasalamentos

Não foi observado efeito de nenhum dos 3 touros utilizados nas taxas de

concepção aos 25 e 46 dias e nas perdas gestacionais de vacas e novilhas (Tab.12).

Também não houve efeito de tratamento sobre esses parâmetros para nenhum dos

touros utilizados (Tab.13).

6.1.2.5. Embriões totais, degenerados e viáveis e oócitos NF

Como já foi mencionado, ao serem considerados os dados gerais para ambas

as estações do ano estudadas, observou-se uma interação entre categoria da

doadora e período do ano. A análise dessa interação mostrou que apenas ocorre

uma diferença do número de oócitos NF durante abril-junho entre as categorias

novilha (0,73 ± 0,29) e vaca lactante (9,29 ± 1,96; P < 0,0001) e, ainda, que há um

aumento significativo de NF de vacas lactantes nessa mesma época do ano, quando

comparada à setembro-novembro (9.29 ± 1.96 vs 2.00 ± 0.84; P = 0,0199; Tab.14).

Tabela 12. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada touro utilizado nos acasalamentos (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Touro

A B C P

Concepção aos 25 dias 39,9 % (156/391) 37,0 % (10/27) 28,1 % (18/64) 0,78


Perda Gestacional 25,6 % (40/156) 20,0 % (2/10) 16,7 % (3/18) 0,57

46

Touro

A B C P

Antioxidante Controle Antioxidante Controle Antioxidante Controle Touro Trat. Trat. x Touro


40,7 % (79/194)

39,1 % (77/197)

35,7 % (5/14)

38,5 % (5/13)

25,0 % (8/32)

31,3 % (10/32) 0,78 0,73 0,81


29, 4 % (57/194)

29,9 % (59/197)

21,4 % (3/14)

38,5 % (5/13)

21,9 % (7/32)

25,0 % (8/32) 0,28 0,92 0,57

Perda Gestacional

27,8 % (22/79)

23,4 % (18/77)

40,0 % (2/5)

0,0 % (0/5)

12,5 % (1/8)

20,0 % (2/10) 0,57 0,97 0,94

Tabela 13. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), para cada touro utilizado nos acasalamentos (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Trat. = Tratamento Trat. X Touro. = interação tratamento-Touro Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA

Tabela 14. Estruturas recuperadas (total, oócitos não fertilizados, embriões degenerados e embriões viáveis) após lavagem uterina realizada em doadoras de embriões da raça Holandesa, nas diferentes categorias de doadora, em dois diferentes períodos do ano (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Letras minúsculas distintas em uma mesma estação do ano diferem significativamente entre si para diferentes categorias, na mesma linha, com P < 0,05 Letras maiúsculas distintas em uma mesma categoria diferem significativamente entre si para diferentes estações do ano, na mesma linha, com P < 0,05. Cat. = Categoria da doadora Estação X Cat. = interação estação do ano-categoria da doadora

47

Período do Ano


Lactante (n=15)

Novilha (n=22)

Não lactante (n=23)

Lactante (n=5)

Novilha (n=14)

Não lactante

(n=8) Período Cat. Período

x Cat.

Total Estruturas

18,27 ± 3,01

5,86 ± 0,75

10,83 ± 1,67

11,00 ± 1,82

7,64 ± 1,65

12,50 ± 2,10 0,49 0,12 0,11

Não Fertilizados

9,29 ± 1,96aA

0,73 ± 0,29b

5,57 ± 1,13ab

2,00 ± 0,84B

1,29 ± 0,37

4,88 ± 0,97 0,02 0,0002 0,02

Embriões Degenerados

1,00 ± 0,23

0,23 ± 0,15

0,43 ± 0,29

0,40 ± 0,24

0,36± 0,29

0,75 ± 0,41 0,84 0,44 0,40

Embriões Viáveis

8,67 ± 1,76

4,91 ± 0,57

4,87 ± 1,03

8,60 ± 2,04

6,09 ± 1,25

6,88 ± 1,95 0,36 0,43 0,67

49

6.1.2.6. Estádio e Qualidade Embrionária

Houve diferença da média do número de embriões (estádio e qualidade)

recuperados por colheita, apenas para algumas classificações embrionárias e

categorias de doadora (Tab.15 e 16).

Tabela 15. Média do número de embriões (estágio e qualidade) recuperados por colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em meio de manutenção sem adição de antioxidante (Trolox®), por categoria de doadora (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).


Categoria

Lactante (n=20) Novilha (n=36) Não lactante (n=31)P

Controle M1 0,00 ± 0,00 0,06 ± 0,04 0,06 ± 0,04 0,54

Controle M2 1,00 ± 0,32 0,61 ± 0,19 0,74 ± 0,14 0,46

Controle M3 1,90 ± 0,35a 1,00 ± 0,15b 0,65 ± 0,15b 0,0004

Controle Mt 2,90 ± 0,52a 1,67 ± 0,25b 1,45 ± 0,22b 0,007

Controle Bi1 0,10 ± 0,10 0,03 ± 0,03 0,06 ± 0,04 0,91

Controle Bi2 0,30 ± 0,13 0,33 ± 0,10 0,55 ± 0,15 0,09

Controle Bi3 0,20 ± 0,09 0,14 ± 0,06 0,06 ± 0,04 0,36

Controle Bit 0,60 ± 0,20 0,50 ± 0,11 0,68 ± 0,16 0,16

Controle Bl1 0,15 ± 0,08 0,03 ± 0,03 0,35 ± 0,16 0,06

Controle Bl2 0,55 ± 0,29 0,11 ± 0,05 0,19 ± 0,10 0,20

Controle Bl3 0,05 ± 0,05 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,19

Controle Blt 0,75 ± 0,32 0,14 ± 0,06 0,55 ± 0,23 0,92

Controle Bx1 0,15 ± 0,11a 0,00 ± 0,00b 0,00 ± 0,00b 0,05

Controle Bx2 0,00 ± 0,00 0,03 ± 0,03 0,00 ± 0,00 0,50

Controle Bx3 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 -

Controle Bxt 0,15 ± 0,11 0,03 ± 0,03 0,00 ± 0,00 0,11

50

Tabela 16. Média do número de embriões (por estágio e qualidade) recuperados por colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em meio de manutenção com adição de antioxidante (Trolox®), por categoria de doadora (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).


Categoria

Lactante (n=20) Novilha (n=36) Não lactante (n=31)P

Antioxidante M1 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,06 ± 0,04 0,16

Antioxidante M2 0,60 ± 0,20 0,64 ± 0,17 0,65 ± 0,11 0,99

Antioxidante M3 1,75 ± 0,24a 1,25 ± 0,17a 0,71 ± 0,20b 0,003

Antioxidante Mt 2,35 ± 0,33 1,89 ± 0,21 1,42 ± 0,23 0,05

Antioxidante Bi1 0,05 ± 0,05 0,00 ± 0,00 0,13 ± 0,13 0,49

Antioxidante Bi2 0,45 ± 0,17 0,31 ± 0,10 0,55 ± 0,15 0,28

Antioxidante Bi3 0,30 ± 0,13 0,08 ± 0,06 0,13 ± 0,06 0,69

Antioxidante Bit 0,80 ± 0,17 0,39 ± 0,12 0,81 ± 0,22 0,29

Antioxidante Bl1 0,20 ± 0,16 0,08 ± 0,05 0,35 ± 0,15 0,35

Antioxidante Bl2 0,70 ± 0,26a 0,03 ± 0,03b 0,13 ± 0,06b 0,0004

Antioxidante Bl3 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 -

Antioxidante Blt 0,90 ± 0,37 0,11 ± 0,05 0,48 ± 0,16 0,57

Antioxidante Bx1 0,20 ± 0,12ª 0,03 ± 0,03ab 0,00 ± 0,00b 0,03

Antioxidante Bx2 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 -

Antioxidante Bx3 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 -

Antioxidante Bxt 0,20 ± 0,12a 0,03 ± 0,03ab 0,00 ± 0,00b 0,03

Ainda, considerando-se os totais de embriões de cada estádio embrionário, não

foi observada interação entre período do ano e categoria da doadora (Tab.17, 18, 19

e 20).

Tabela 17. Média do número de embriões em estágio de Mórula (M), recuperados por colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em meio de manutenção com e sem adição de antioxidante (Trolox®), em cada categoria de doadora, em dois diferentes períodos do ano (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Período do Ano


Lactante (n=15)

Novilha (n=22)


Lactante (n=5)

Novilha (n=14)

Não lactante

(n=8) Per. Cat. Per. x

Cat.

Mórula Controle 3,07 ± 0,62 1,64 ± 0,28 1,52 ± 0,27 2,40 ± 1,03 1,71 ± 0,49 1,250 ± 0,31 0,49 0,05 0,76

Mórula Antioxidante 2,53 ± 0,35 1,82 ± 0,26 1,26 ± 0,28 1,80 ± 0,80 2,00 ± 0,35 1,88 ± 0,40 0,93 0,27 0,26


Per. = Período do ano

Cat. = Categoria da doadora

Per. X Cat. = interação período do ano-categoria da doadora

50

Tabela 18. Média do número de embriões em estágio de Blastocisto inicial (Bi), recuperados por colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em meio de manutenção com e sem adição de antioxidante (Trolox®), em cada categoria de doadora, em dois diferentes períodos do ano (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Período do Ano


Lactante (n=15)

Novilha (n=22)


Lactante (n=5)

Novilha (n=14)

Não lactante


Cat.

Blast. inicial Controle 0,47 ± 0,19 0,46 ± 0,14 0,52 ± 0,16 1,00 ± 0,55 0,57 ± 0,17 1,13 ± 0,35 0,02 0,19 0,28

Blast. inicial Antioxidante 0,67 ± 0,19 0,32 ± 0,14 0,83 ± 0,28 1,20 ± 0,37 0,50 ± 0,23 0,75 ± 0,31 0,31 0,55 0,72

Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA Per. = Período do ano



51

Tabela 19. Média do número de embriões em estágio de Blastocisto (Bl), recuperados por colheita de doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em meio de manutenção com e sem adição de antioxidante (Trolox®), em cada categoria de doadora, em dois diferentes períodos do ano (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).




52

Período

Abril-Junho Setembro-Novembro

P

Lactante (n=15)

Novilha (n=22)


Lactante (n=5)

Novilha (n=14)

Não lactante


Cat.

Blastocisto Controle 0,80 ± 0,40 0,14 ± 0,07 0,39 ± 0,19 0,60 ± 0,40 0,14 ± 0,10 1,00 ± 0,73 0,55 0,57 0,29

Blastocisto Antioxidante 0,80 ± 0,46 0,09 ± 0,06 0,35 ± 0,13 1,20 ± 0,58 0,14 ± 0,10 0,88 ± 0,48 0,17 0,57 0,56

Tabela 20. Média do número de embriões em estágio de Blastocisto expandido (Bx) recuperados por colheita de

doadoras de embriões da raça Holandesa, mantidos em meio de manutenção com e sem adição de antioxidante (Trolox®), em cada categoria de doadora, em dois diferentes períodos do ano (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Período

Abril-Junho Setembro-Novembro

P

Lactante (n=15)

Novilha (n=22)


Lactante (n=5)

Novilha (n=14)

Não lactante


Cat.

Blast. Expand. Controle 0,13 ± 0,13 0,05 ± 0,05 0,00 ± 0,00 0,20 ± 0,20 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,91 0,13 0,78

Blast. Expand. Antioxidante 0,20 ± 0,14 0,05 ± 0,05 0,00 ± 0,00 0,20 ± 0,20 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,82 0,07 0,94




53

Tabela 21. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada estágio embrionário (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Estágio Embrionário

Mórula Blastocisto Inicial Blastocisto Blastocisto

Expandido

P


35,8 % (111/310)

43,6 % (41/94)

41,4 % (29/70)

37,5 % (3/8) 0,54


27,7 % (86/310)

34,0 % (32/94)

25,7 % (18/70)

37,5 % (3/8) 0,32

Perda Gestacional

22,5 % (25/111)

22,0 % (9/41)

37,9 % (11/29)

0,0 % (0/3) 0,25

Com relação às taxas de concepção aos 25 e 46 dias e à perda gestacional,

não houve diferença significativa entre os 4 estádios embrionários (M, Bi, Bl e Bx;

Tab.21) e tampouco entre os tratamentos, para cada um dos estádios (Tab.22). No

entanto, a qualidade embrionária mostrou ter efeito sobre a taxa de concepção aos

25 dias, sendo clara a queda dessa taxa quando se passou de grau 2 para grau 3

(Tab.23). Não houve efeito de qualidade embrionária dentro dos diferentes

tratamentos (Tab.24).

55

Tabela 22. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), por estágio embrionário (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Estágio Embrionário

Mórula Blastocisto Inicial Blastocisto Blastocisto

Expandido

P

Antiox. Contr. Antiox. Contr. Antiox. Contr. Antiox. Contr. Trat. Estad.Trat.

X Estad.


35,5 % (55/155)

36,1 % (56/155)

46,7 % (21/45)

40,8 % (20/49)

38,9 % (14/36)

44,1 % (15/34)

50,0 % (2/4)

25,0 % (1/4) 0,49 0,54 0,74


26,5 % (41/155)

29,0 % (45/155)

35,6 % (16/45)

32,7 % (16/49)

22,2 % (8/36)

29,4 % (10/34)

50,0 % (2/4)

25,0 % (1/4) 0,67 0,32 0,67

Perda Gestacional

25,5 % (14/55)

19,6 % (11/56)

23,8 % (5/21)

20,0 % (4/20)

42,9 % (6/14)

33,3 % (5/15)

0,0 % (0/2)

0,0 % (0/1) 1,00 0,25 1,00

Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA Trat.. = Tratamento

Estad. = Estádio embrionário

Trat. X Estad. = interação tratamento-estádio embrionário

55

56

Tabela 23. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada qualidade embrionária (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Qualidade Embrionária

Grau 1 Grau 2 Grau 3 P

Concepção aos 25 dias 44,2 % (19/43)ab 42,5 % (96/226)a 32,4 % (69/213)b 0,049


Perda Gestacional 31,6 % (6/19) 25,0 % (24/96) 21,7 % (15/69) 0,70 Letras minúsculas distintas diferem significativamente entre si para diferentes qualidades embrionárias, na mesma linha, com P < 0,05

Tabela 24. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), por qualidade embrionária (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Qualidade Embrionária


Antioxidante Controle Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. Grau Trat. x Grau


43,5 % (10/23)ab

45,0 % (9/20)ab

42,9 % (45/105)a

42,1 % (51/121)a

33,0 % (37/112)b

31,7 % (32/101)b 0,88 0,049 0,94


30,4 % (7/23)

30,0 % (6/20)

30,5 % (32/105)

33,1 % (40/121)

25,0 % (28/112)

25,7 % (26/101) 0,88 0,27 0,90

Perda Gestacional

30,0 % (3/10)

33,3 % (3/9)

28,9 % (13/45)

21,6 % (11/51)

24,3 % (9/37)

18,8 % (6/32) 0,86 0,70 0,80

Letras minúsculas distintas em mesmo tratamento diferem significativamente entre si para diferentes qualidades embrionárias, na mesma linha, com P < 0,05 Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA Trat. = Tratamento

Trat. X Grau. = interação tratamento-grau de qualidade embrionária

57

59

6.1.2.7. Qualidade e localização (lado) do CL das receptoras

Considerando-se que a inovulação de embriões foi realizada sempre no corno

uterino ipsilateral ao ovário cuja presença de CL foi detectada, a porcentagem de

concepção se manteve semelhante para embriões inovulados em qualquer antímero

dos cornos uterinos (Tab.25). Também não houve diferença desse parâmetro dentro

dos grupos experimentais (Tab.26).

Quanto à qualidade do CL das receptoras que receberam embrião, foram

realizadas 269 transferências para vacas com CL grau 1, 188 para vacas com CL

grau 2 e apenas 25 para animais com CL grau 3. A classificação do CL em graus 1, 2

ou 3 é altamente subjetiva e baseia-se no tamanho e número de CL à palpação

transretal, sendo grau 1 referente a CL grande ou mais de 1 CL, grau 2 referente à

CL único de tamanho intermediário e grau 3 indicativo de CL único e pequeno.

Apesar de uma grande diferença numérica nas taxas de concepção a TE

relacionadas a CL grau 3 quando comparado ao grau 1 (maior diferença) e ao grau 2

(menor diferença), não foi observada diferença significativa em concepção e perda

gestacional para as diferentes qualidades de CL (Tab.27). Ainda, não houve efeito de

tratamento dentro de nenhuma dessas categorias de classificação (Tab.28).

Tabela 25. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada ovário que apresentava o corpo lúteo (CL; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Lado do Corpo Lúteo

Direito Esquerdo P




Tabela 26. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), para cada ovário que apresentava o corpo lúteo (CL; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Lado do Corpo Lúteo

Direito Esquerdo P

Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. CL Trat. x CL

Concepção aos 25 dias 36,5 % (54/148) 34,8 % (49/141) 41,3 % (38/92) 42, 6 % (43/101) 0,81 0,24 0,82

Concepção aos 46 dias 26,4 % (39/148) 28,4 % (40/141) 30,4 % (28/92) 31, 7 % (32/101) 0,72 0,50 0,61

Perda Gestacional 27,8 % (15/54) 18,4 % (9/49) 26,3 % (10/38) 25,6 % (11/43) 0,58 0,99 0,25

Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA Trat. = tratamento

CL – lado do corpo lúteo

Trat. X CL = interação tratamento-lado do corpo lúteo

59

60

Tabela 27. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, de acordo com a qualidade do corpo lúteo (CL; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Qualidade do Corpo Lúteo





Tabela 28. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), de acordo com a qualidade do corpo lúteo (CL; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Qualidade do Corpo Lúteo


Antioxidante Controle Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. Grau Trat.

x Grau


41,8 % (56/134)

39,3 % (53/135)

33,7 % (32/95)

38,7 % (36/93)

36,4 % (4/11)

21,4 % (3/14) 0,69 0,55 0,32


32,8 % (44/134)

30,4 % (41/135)

20,0 % (19/95)

30,1 % (28/93)

36,4 % (4/11)

21,4 % (3/14) 0,79 0,33 0,14

Perda Gestacional

21,4 % (12/56)

22,6 % (12/53)

40,6 % (13/32)

22,2 % (8/36)

0,0 % (0/4)

0,0 % (0/3) 1,00 0,52 0,44

Trolox® - Acros Organics, New Jersey, USA Trat. = Tratamento

Trat. X Grau = interação tratamento-grau de qualidade do corpo lúteo

61

63

6.1.2.8. Sincronia doadora-receptora

Foram utilizadas nesse experimento, receptoras com sincronia do cio exata

com a doadora (D0) ou com um dia de diferença (D+1 ou D–1). Com relação às

taxas de concepção aos 25 e 46 dias e à perda gestacional, não houve diferença

significativa entre a sincronia doadora-receptora (Tab.29) e tampouco entre os

tratamentos, para D0, D+1 ou D-1 (Tab.30).

6.1.2.9. Número de eventos (IA e/ou TE) e DEL das receptoras

Para a realização da análise estatística, o número de DEL foi transformado em

duas classes (até 321 dias e acima de 321 dias), de acordo com a mediana dos

valores registrados. No entanto, não foi observada diferença significativa sobre a

concepção aos 25 e 46 dias e a perda gestacional das receptoras enquadradas

nessas duas classes (Tab.31). Também não foi encontrado efeito de tratamento para

nenhuma dessas categorias (Tab.32).

O número de eventos (média de 6,58 ± 0,14) também foi dividido em classes (3

a 5 eventos – média de 4,06 ± 0,07 - e a partir de 6 eventos – média de 8,63 ± 0,18).

Não foi detectado efeito desse parâmetro sobre as taxas de prenhes e a perda

gestacional (Tab.33) e, tampouco, de tratamento, dentro das duas classes

analisadas (Tab.34).

Tabela 29. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, segundo a sincronia do cio entre doadora e receptora (FCAV–UNESP, Câmpus de Jaboticabal/2008).

Sincronia Doadora-Receptora

D-1 D0 D+1 P



Perda Gestacional 11,5 % (3/26) 24,7 % (24/97) 30,0 % (18/60) 0,22 D = dia da sincronização do cio doadora-receptora

Tabela 30. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), de acordo com a sincronia do cio entre doadora e receptora (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Sincronia do cio entre doadora e receptora

D-1 D0 D+1 P

Antioxidante Controle Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. Sincr. Trat. x Sincr.


27,6 % (8/29)

46,2 % (18/39)

47,3 % (52/110)

41,7 % (45/108)

31,0 % (31/100)

30,5 % (29/95) 0,43 0,16 0,19


24,1 % (7/29)

41,0 % (16/39)

32,7 % (36/110)

34,3 % (37/108)

23,0 % (23/100)

20,0 % (19/95) 0,36 0,25 0,30

Perda Gestacional

12,5 % (1/8)

11,1 % (2/18)

30,8 % (16/52)

17, 8 % (8/45)

25,8 % (8/31)

34,5 % (10/29) 0,89 0,22 0,32


Sincr. = Sincronização

Trat. X Sincr. = interação tratamento-sincronização

63

Tabela 31. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, de acordo com o número de dias em lactação (DEL) das receptoras (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Classe de Dias em Lactação (DEL)

Até 321 dias Acima de 321 dias P




64

Tabela 32. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), de acordo com o número de dias em lactação (DEL) das receptoras (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Classe de Dias em Lactação (DEL)

Até 321 dias Acima de 321 dias P

Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. DEL Trat. x DEL

Concepção aos 25 dias 39,0 % (46/118) 39,7 % (48/121) 37,7 % (46/122) 35,9 % (42/117) 0,76 0,61 0,54




DEL = dias em lactação

Trat. X DEL = interação tratamento-dias em lactação

65

66

Tabela 33. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, de acordo com o número eventos (IA e/ou TE) das receptoras (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Classe de Eventos (IA e/ou TE)

3 a 5 eventos Acima de 5 eventos P




TE = transferência de embrião

IA = inseminação artificial

Tabela 34. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), de acordo com o número de eventos (IA e/ou TE) das receptoras (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Classe de Eventos (IA e/ou TE)

3 a 5 eventos Acima de 5 eventos P

Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. Eventos Trat. x Eventos





Trat. X Eventos = interação tratamento-número de eventos IA = inseminação artificial

TE = transferência de embrião

67

69

6.1.2.10. Protocolos reprodutivos das receptoras

Não foi determinada diferença estatística do tipo de protocolo reprodutivo de

receptoras (cio natural, cio induzido por PGF ou TETF) sobre as taxas de concepção

aos 25 e 46 dias e a perda gestacional (Tab.35). Ainda, não foi observado efeito de

tratamento para nenhum desses protocolos sobre nenhum desses parâmetros

(Tab.36).

6.1.2.11. Intervalo Divisão dos Grupos-Inovulação (Div-Inov) e Colheita de embriões-Inovulação (Col-Inov)

Ambos os intervalos, Div-Inov e Col-Inov, foram transformados em classes de

intervalos de tempo definidas. Não foi verificado efeito de tratamento dentro dessas

classes de intervalo, o que possibilitou o agrupamento dos dados. Foi constatada

uma diferença estatística altamente significativa entre o intervalo Div-Inov ≤ 3 e os

demais, com relação à concepção aos 25 dias, notando-se uma queda acentuada de

25,3% do primeiro para o segundo intervalo (Tab.37). Tendência de queda de

concepção aos 46 dias também foi observada, considerando-se os mesmos

intervalos.

A análise do intervalo Col-Inov mostrou haver diferença numérica importante

entre as classes, evidenciando a ocorrência de queda na taxa de concepção aos 25

dias à medida que se aumentava o tempo de espera para a inovulação (Tab. 38).

Com o intuito de melhor avaliar esse fenômeno, foi realizada a construção de

gráficos de probabilidade tanto para as classes estudadas quanto para os tempos

reais (em minutos) registrados. Os gráficos e suas respectivas equações de reta

encontram-se nas Figuras 10 e 11.

Tabela 35. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões

repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, para cada protocolo reprodutivo (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Protocolo reprodutivo

Cio TETF PGF P

Concepção aos 25 dias 39.3 % (70/178) 33.8 % (53/157) 41.5 % (61/147) 0.54

Concepção aos 46 dias 29.2 % (52/178) 26.8 % (42/157) 30.6 % (45/147) 0.61

Perda Gestacional 25.7 % (18/70) 20.8 % (11/53) 26.2 % (16/61) 0.93 TETF – transferência de embrião em tempo fixo

69

Tabela 36. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, mantidos em meio de manutenção com ou sem adição de antioxidante (Trolox®), para cada protocolo reprodutivo (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Protocolo reprodutivo

Cio TETF PGF P

Antioxidante Controle Antioxidante Controle Antioxidante Controle Trat. Prot. Trat. X Prot.


40.9 % (36/88)

37. 8 % (34/90)

32.1 % (27/84)

35.6 % (26/73)

42.6 % (29/68)

40.5 % (32/79) 0.84 0.54 0.83


29.5 % (26/88)

28. 9 % (26/90)

25.0 % (21/84)

28.8 % (21/73)

29.4 % (20/68)

31.6 % (25/79) 0.59 0.61 0.91

Perda Gestacional

27. 8 % (10/36)

23.5 % (8/34)

22.2 % (6/27)

19.2 % (5/26)

31.0 % (9/29)

21.9 % (7/32) 0.51 0.93 0.95


Prot. = Protocolo de sincrozização do estro

Trat. X Prot. = interação tratamento-protocolo de sincronização do estro

TETF – transferência de embrião em tempo fixo

70

Tabela 37. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, segundo o Intervalo Divisão dos Grupos-Inovulação (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Intervalo Divisão dos Grupos-Inovulação (horas)

Div-Inov ≤ 3 3 > Div-Inov ≤ 4 4 > Div-Inov ≤ 5 Div-Inov > 5 P

Concepção aos 25 dias 65,2 % (30/46)a 39,3 % (24/61)b 31,3 % (15/48)b 36,5 % (38/104)b <0,0001

Concepção aos 46 dias 43,5 % (20/46)x 26,2 % (16/61)y 25,0 % (12/48)y 28,8 % (30/104)y 0,06

Perda Gestacional 33,3 % (10/30) 33,3 % (8/24) 20,0 % (3/15) 21,1 % (8/38) 0,46

Letras minúsculas distintas diferem significativamente entre si, na mesma linha, com P < 0,05 Div-Inov = intervalo divisão dos grupos experimentais e inovulação dos embriões

71

72

Tabela 38. Taxas de concepção aos 25 e 46 dias de gestação e perda gestacional de receptoras de embriões repetidoras de serviço da raça Holandesa após a transferência de embriões produzidos in vivo, segundo o Intervalo Colheita -Inovulação dos embriões (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Intervalo Colheita-Inovulação (horas)

Col-Inov ≤ 5 5 > Col-Inov ≤ 6 6 > Col-Inov ≤ 7 P




Col-Inov = intervalo colheita e inovulação dos embriões

74

Intervalo Colheita-Inovulação

1/C

once

pção

aos

25

dias

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0 1/Concep25d = - 0,0072 + 0,4201*IntervaloColheita-InovulaçãoR2 = 0,97

Concep25d = 47,8 % Concep25d = 39,8 %

Concep25d = 34,1 %

Até 5 horas Entre 5 e 6 horas Entre 6 e 7 horas

Figura 10. Gráfico de dispersão de 1/concepção aos 25 dias (Concep25d) em

relação ao Intervalo Colheita-Inovulação dos embriões (P = 0,08; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

75

Intervalo Colheita-Inovulação (min)

150 200 250 300 350 400 450

Con

cepç

ão a

os 2

5 di

as

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

71

Figura 11. Gráfico de dispersão da concepção aos 25 dias (Concep25d) em relação ao Intervalo Colheita-Inovulação (min) dos embriões (P = 0,01; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

76

6.1.2.12. Outras Avaliações

Durante a primeira fase experimental (abril-junho), uma parcela dos animais

(doadoras e receptoras) teve também outras características avaliadas, tais como

produção leiteira (somente receptoras), escore de condição corporal (ECC), escore

de locomoção (EL), temperatura retal (TR), freqüência respiratória (FR). Quanto a

essas variáveis, foi observada também uma boa homogeinicidade de distribuição

entre os dois grupos experimentais (Tab.39). As receptoras apresentaram médias de

produção leiteira (7 dias antes da TE) de 24,10 ± 0,49 L de leite/dia, temperatura

retal de 39,20 ± 0,04 ºC, freqüência respiratória de 69,89 ± 1,24 movimentos/min,

ECC de 3,08 ± 0,03 e EL de 1,30 ± 0,04. Na categoria de doadora, foi observada

uma maior média de ECC das vacas não lactantes (4,10 ± 0,12) com relação a vacas

lactantes (3,41 ± 0,14; P = 0,0051) e novilhas (3,403 ± 0,10; P = 0,0005; Tab.40)

Como não houve efeito de nenhuma dessas variáveis sobre as taxas de

concepção aos 25 e 46 dias e tampouco interação dessas variáveis com o

tratamento, suas aferições não foram incluídas no segundo período experimental

(setembro-novembro, Tab.41).

Tabela 39. Temperatura retal (TR), freqüência respiratória (FR), escore de condição corporal (ECC), escore de locomoção (EL) e produção leiteira média (últimos 7 dias antes da inovulação) de receptoras de embriões da raça Holandesa, por grupo de tratamento (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Grupos Experimentais

Antioxidante Controle P

TR (ºC) 39,22 ± 0,06 39,18 ± 0,05 >0,05

FR (mov/min) 72,65 ± 1,88 67,28 ±1,62 >0,05

ECC (1 a 5) 3,07 ± 0,04 3,10 ± 0,04 >0,05

EL (1 a 5) 1,33 ± 0,08 1,28 ± 0,07 >0,05

Produção Leite (Kg) 23,30 ± 0,70 24,85 ± 0,68 >0,05

77

Tabela 40. Temperatura retal (TR), freqüência respiratória (FR), escore de condição corporal (ECC) e escore de locomoção (EL) de doadoras de embriões da raça Holandesa, de acordo com a categoria, no primeiro período experimental (abril-junho; FCAV–UNESP, Câmpus de Jaboticabal/2008).

Letras minúsculas distintas diferem significativamente entre si, na mesma linha, com P < 0,05.

Lactante (n=15) Novilha (n=22) Não lactante (n=23) P

TR (ºC) 38,69 ± 0,18 38,35 ± 0,08 38,46 ± 0,06 0,18

FR (mov/min) 50,33 ± 3,76 53,85 ± 2,43 48,67 ± 2,87 0,59

ECC (1 a 5) 3,41 ± 0,14a 3,403 ± 0,10a 4,10 ± 0,12b <0,0001

EL (1 a 5) 1,42 ± 0,23 1,00 ± 0,00 1,28 ± 0,16 0,22

Tabela 41. Valores de P das variáveis inerentes à receptora (produção leiteira (prod. leite), temperatura retal (TR), freqüência respiratória (FR), escore de condição corporal (ECC) e escore de locomoção (EL) e interação entre tratamento (trat.) e essas variáveis) para taxas de concepção aos 25 e 46 dias e perda gestacional de receptoras de embriões da raça Holandesa, no primeiro período experimental (abril-junho; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

P

Concepção 25 dias Concepção 46 dias Perda Gestacional

Prod. leite 0.08 0.11 0.53

Prod. leite*Trat. 0.76 0.80 0.36

TR 0.95 0.81 0.55

TR * Trat. 0.89 0.71 0.38

FR 0.74 0.63 0.67

FR*Trat. 0.79 0.79 0.86

ECC 0.30 0.32 0.73

ECC*Trat. 0.12 0.10 0.41

EL 0.88 0.43 0.32

Locomoção*Trat. 0.61 0.96 0.46

78

6.2. Experimento 2

6.2.1. Resultados Gerais – Fase 1 (PIV)

Para a análise final dos dados obtidos nesse segundo experimento foram

removidos todos os dados relativos aos testes pré-experimentais (de meios e modos

de diluição do antioxidante), erros na produção, imprecisão de resultados ou grupos

que sofreram contaminação, totalizando 6.571 oócitos descartados. Dessa forma, de

um total de 11.137 oócitos selecionados e submetidos aos procedimentos in vitro

para a produção de embriões (55 réplicas), foram efetivamente analisados 4.566

oócitos integrantes a 26 réplicas. Do total de estruturas efetivamente avaliadas, 1231

oócitos compuseram o GC8h, 1082 o GA8h, 1108 o GC20h e 1145 o GA20h.

Portanto, considerando-se apenas a variável tratamento, 2339 oócitos fizeram parte

do grupo controle, enquanto 2227 constituíram o grupo tratado com antioxidante e,

considerando-se apenas a variável tempo, 2313 oócitos foram mantidos por 8 horas

em meio de transporte, enquanto 2253 permaneceram nesse meio por 20h. Ainda,

como o número de oócitos classificados como qualidade grau I e II foi dividido

igualmente entre os 4 grupos, foi possível comprovar a homogeinicidade entre os

grupos experimentais tanto quanto ao número como quanto a qualidade das

estruturas utilizadas.

Considerando-se todos os oócitos analisados os resultados gerais obtidos

nesse experimento foram: 63,9% de taxa de clivagem, 11,9% de taxa de blastocisto

no D6, 25,8% de taxa de blastocisto no D7, 31,6% de taxa de blastocisto no D9 e

75,2% de taxa de blastocisto eclodido (D11).

6.2.2. Resultados Específicos – Fase 1 (PIV)

As taxas de clivagem, de blastocisto nos dias 6, 7 e 9 de cultivo e de

blastocistos eclodidos (D11) foram similares entre os dois grupos (controle e

antioxidante). No entanto, efeito de tempo (8 para 20 horas) foi observado em todos

os momentos analisados.

79

Particularmente, quanto às taxas de clivagem, não foi observado efeito de

tratamento ou interação tratamento-tempo de transporte. No entanto, houve uma

redução de quase 15% na porcentagem de embriões clivados com o aumento do

tempo de transporte de 8 para 20 horas (P < 0,0001; Tab. 42 e Fig. 12).


oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de matadouro e do tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de clivagem de embriões após a maturação e fecundação in vitro (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Efeito Principal (Tempo x Tratamento P = 0,31)

8 horas 20 horas P

Tempo 71,2 % (1647/2313) 56,4 % (1271/2253) <0,0001

Trolox Controle

Tratamento 64,8 % (1443/2227) 63,0 % (1474/2339) 0,50

80

0

20

40

60

80

AntioxidanteControle 8 horas 20 horas

71,2 % (1647/2313)

56,4 % (1271/2253)

64,8 % (1443/2227)63,0 %

(1474/2339)

Taxa

de

cliv

agem

(%)


oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de matadouro e do tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de clivagem de embriões após a maturação e fecundação in vitro (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

81

No sexto dia de cultivo foi detectada interação entre tratamento e tempo de

permanência no meio de transporte, portanto todos os dados tiveram que ser

analisados separadamente. Nesse dia, houve redução das taxas de blastocisto

com o aumento do tempo de transporte no grupo controle e constância de

resultados no grupo antioxidante (Tab. 43 e 44; Fig. 13).


oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de matadouro e do tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de blastocisto no D6 pós-fecundação in vitro (interação tratamento x tempo P = 0,03; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Antioxidante Controle P *

8 horas 11,7 % (127/1082) 14,5 % (178/1231) 0,19

20 horas 11,4 % (131/1145) 9,8 % (109/1108) 0,61

P ** 1,00 0,003 -

* P para comparação entre Controle e Antioxidante ** P para comparação entre 8 e 20 horas

Tabela 44. Valores de P do tratamento com antioxidante, do tempo de manutenção

dos oócitos no meio de transporte e da interação entre antioxidante e tempo de manutenção, relacionados à taxa de blastocisto no D6 (interação tratamento x tempo; P = 0,03; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Tratamento Tempo Tratamento x Tempo

0,68 0,01 0,03

82

Controle 8h

Taxa

de

blas

toci

sto

no D

6 (%

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Antioxidante 8h Controle 20 h Antioxidante 20h

9,8 % b (109/1108)

11,4 % (131/1145)

11,7 % (127/1082)

14,5 % a (178/1231)


oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de matadouro e do tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de blastocisto no D6 pós-fecundação in vitro (interação tratamento x tempo P = 0,003; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

83

No sétimo dia de cultivo, como não foi detectada interação tratamento-tempo,

os dados foram agrupados para a análise dos efeitos principais, observando-se

redução das taxas de blastocisto nesse dia, com o avançar do período de

transporte (P = 0,01; Tab. 45 e Fig. 14).


oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de matadouro e do tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de blastocisto no D7 pós-fecundação in vitro (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Efeito Principal (Tempo x Tratamento P = 0.23)

8 horas 20 horas P

Tempo 28,7 % (664/2313) 22,8 % (514/2253) 0,01

Antioxidante Controle

Tratamento 25,5 % (568/2227) 26,1 % (610/2339) 0,66

84

Controle

Taxa

de

blas

toci

sto

no D

7 (%

)

0

5

10

15

20

25

30

35

Antioxidante 8 horas 20 horas

28,7 % a (664/2313)

22,8 % b (514/2253)

25,5 % (568/2227)

26,1 % (610/2339)



85

No nono dia de cultivo, também não foi detectada interação tratamento-

tempo. Dessa forma, os dados foram também agrupados para a análise dos efeitos

principais, observando-se novamente redução das taxas de blastocisto com o

avançar do período de transporte (P = 0,005; Tab. 46 e Fig. 15).



Efeito Principal (Tempo x Tratamento P=0.27)

8 horas 20 horas Tempo

Tempo 35,2 % (814/2313) 27,9 % (629/2253) 0,005


Tratamento 32,1 % (715/2227) 31,1 % (727/2339) 0,23

86

0

10

20

30

40

Controle Antioxidante 8 horas 20 horas

35,2 % a (814/2313)

27,9 % b (629/2253)

32,1 % (715/2227)31,1 %

(727/2339)

Taxa

de

blas

toci

sto

no D

9 (%

)



87

No décimo primeiro dia de cultivo, foram analisadas as taxas de eclosão.

Nesse dia, também não houve interação tratamento-tempo e a análise dos dados

agrupados mostrou mais uma vez efeito principal de tempo, com redução da

porcentagem de blastocistos eclodidos com o aumento do período de transporte (P

= 0,005; Tab. 47 e Fig. 16).


oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de matadouro e do tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de eclosão no D11 pós-fecundação in vitro (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Efeito Principal (Tempo x Tratamento P=0.22)

8 horas 20 horas P

Tempo 72,2 % (588/814) 79,3 % (499/629) 0,005


Tratamento 74,1 % (530/715) 76,3 % (555/727) 0,76

88

Controle

Taxa

de

blas

toci

sto

no D

11 (%

)

0

20

40

60

80

100

Antioxidante 8 horas 20 horas

72,2 % a (588/814)

79,3 % b (499/629)74,1 %

(530/715)

76,3 % (555/727)


oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de matadouro e do tempo de permanência dos oócitos nesse meio, sobre a taxa de eclosão no D11 pós-fecundação in vitro (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

89

6.2.3. Resultados Gerais – fase 2 (Capacidade Antioxidante Total)

Para a análise final dos dados obtidos no terceiro experimento foram

removidos todos os dados que apresentaram desvio padrão igual ou superior a 60%

do valor da média, ou seja, aqueles que apresentavam grande diferença entre duas

alíquotas de mesma amostra (erros de pipetagem ou leitura). Dessa forma, de um

total de 168 alíquotas analisadas (84 amostras em duplicata), foram efetivamente

consideradas 120, ou seja, 60 amostras.

A curva padrão e a equação de reta utilizadas para a determinação da

concentração total de antioxidante das amostras analisadas estão representadas na

Figura 17.

y = - 0.5499x + 0.6396

R2 = 0.989

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400

Absorbância (405 nm)

Conc

entra

ção

(mM

)

Figura 17. Curva padrão e equação da reta de absorbância versus concentração de

Trolox® (FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

90

6.2.4. Resultados Específicos – fase 2 (Capacidade Antioxidante Total)

Não foram observadas interações entre tratamento (controle vs antioxidante) e

momento de colheita das amostras (0, 8 e 20 horas), réplica e momento e tratamento

e réplica (P > 0,15). No entanto, foi detectado efeito de réplica (P = 0,0001) e

tratamento (P < 0,0001) sobre as concentrações de antioxidante avaliadas.

Valores negativos de concentração de antioxidante foram observados para

todas as amostras referentes ao grupo controle e valores positivos ou “menos”

negativos (comparados ao controle) para todas as amostras do grupo tratado,

independentemente dos tempos de colheita. Como não foi detectado interação ou

efeito do momento da colheita das amostras (0, 8 ou 20h; P = 0,31) os resultados

puderam ser agrupados em apenas 2 grupos (controle e antioxidante). As médias ±

erro padrão encontradas para os grupos estão apresentadas na Tabela 48.

Tabela 48. Concentração de Trolox® (mM) no meio de transporte de oócitos bovinos (tratado ou não com esse antioxidante) aferida a partir de amostras colhidas em diferentes tempos (0, 8 e 20 horas; FCAV – UNESP, Câmpus de Jaboticabal / 2008).

Concentração de Antioxidante (mM) Tempo


P

0 hora 0,057 ± 0,048 -0,184 ± 0,020 < 0,0001

8 horas 0,018 ± 0,040 -0,191 ± 0,027 < 0,0001

20 horas 0,064 ± 0,038 -0,168 ± 0,019 < 0,0001

Efeito Principal (Tratamento x Tempo P = 0,65)

0 hora 8 horas 20 horas P Tempo

-0,064 ± 0,024 -0,086 ± 0,022 -0,053 ± 0,022 0,31

Antioxidante (n=58) Controle (n=68) P Tratamento

0,046 ± 0,024 -0,181 ± 0,013 < 0,0001

91

7. DISCUSSÃO

7.1. Experimento 1

A Hipótese inicial do presente experimento não foi completamente confirmada,

uma vez que o antioxidante (Trolox®) adicionado ao meio de manutenção (solução

TQC holding) de embriões bovinos produzidos in vivo não resultou em aumento das

taxas de concepção após a TE (25 e 46 dias de gestação) em receptoras bovinas

repetidoras de serviço da raça Holandesa (Bos taurus taurus). No entanto, um

aspecto que deve ser levado em consideração está associado à diluição do

antioxidante. Nesse experimento, o Trolox® foi diluído diretamente em meio de

manutenção de embriões. A diluição foi bastante complicada, sendo necessária a

passagem por banho-maria e vórtex inúmeras vezes até que não fosse mais

observado o pó a olho nú. Apesar da completa diluição aparente no meio, pode ser

que esta não tenha se dado efetivamente (microscopicamente), fato que pode ter

sido um dos fatores responsáveis pela ausência de observação do resultado

(aumento da taxa de concepção) esperado.

Como sugerem os resultados referentes à análise da capacidade antioxidante

total encontrados no Experimento 2 (segunda fase) desse mesmo trabalho, o

antioxidante provavelmente exerceria a função esperada, promovendo a

neutralização de algumas ROS produzidas, o que poderia ter auxiliado a frente de

defesa biológica própria dos embriões (sistema de defesa enzimática celular;

NORDBERG & ARNÉR, 2001), reduzindo os efeitos deletérios das ROS sobre as

estruturas embrionárias. Para que isso ocorresse, contudo, a diluição deveria ter sido

eficiente, o que não pode ser plenamente garantido devido às ponderações feitas

acima. Portanto, duas hipóteses podem ser levantadas: ausência de diluição

eficiente e não atuação do antioxidante ou diluição eficiente e ação antioxidante

esperada, sem, no entanto, refletir em aumento de concepção.

Um estudo retrospectivo realizado na mesma fazenda em que foi realizado o

presente experimento, avaliou as taxas de concepção, mês a mês, referentes a

3.858 TEs em vacas Holandesas de alta produção (28,4 ± 2,3 kg/dia), repetidoras de

92

serviço, nos anos de 2001 a 2006 (ROGRIGUES et al., 2007a). Nesse estudo prévio,

as taxas obtidas nos meses de abril, maio e junho foram de 46,34 % (171/369); 47,73

% (158/331) e 40,18 % (131/326) e nos meses de setembro, outubro e novembro de

39,84 % (151/379); 36,70 % (149/406) e 38,63 % (141/365), respectivamente.

Quando as médias referentes aos meses agrupados de abril a junho e setembro a

novembro são calculadas (dados não publicados), as taxas de concepção obtidas

são de 44,8% (460/1026) e 38,3% (441/1150), respectivamente, mostrando uma

redução numérica dessas taxas do primeiro para o segundo período analisado. De

forma semelhante, foi encontrada no presente estudo uma redução da taxa de

concepção aos 25 dias de gestação entre os mesmos meses agrupados e mesma

categoria animal (41,9% e 31,4%; P = 0,001; respectivamente; Tab.7), o que realça a

constância desses resultados nessa propriedade. Ainda, quanto às perdas

gestacionais, pode-se dizer que os resultados obtidos no presente experimento

(média de 24,5%) assemelham-se aos obtidos por VASCONCELOS et al. (2006) e

SARTORI et al. (2006).

Diversos fatores são responsáveis pela baixa fertilidade em fêmeas bovinas,

porém, o período mais crítico parece estar relacionado à fase peri-ovulatória (entre

alguns dias antes e alguns dias após a inseminação e ovulação; SARTORI et al.,

2007; 2002). Além do efeito negativo do estresse térmico, há outros fatores que

comprometem a qualidade dos ovócitos e embriões durante esse período em vacas

leiteiras. Atualmente a TE tem sido utilizada não somente durante o verão, mas

também durante outras épocas do ano, principalmente em vacas repetidoras de

serviço (NEGRÃO et al., 2002). Entretanto, deve-se considerar os custos de

produção de embriões, especialmente quando se utiliza superovulação e colheita de

embriões produzidos in vivo. Eventualmente, no futuro a TE competirá com a IA

como o principal método para o estabelecimento de gestações em bovinos leiteiros,

como sugerido por HANSEN & BLOCK (2004). Isso poderá tornar-se uma realidade,

principalmente quando outras biotecnologias, tais como a sexagem de

espermatozóides e criopreservação de embriões produzidos in vitro, forem

aperfeiçoadas (SARTORI et al., 2007).

93

7.1.1. Períodos do Ano Observou-se maior taxa de concepção aos 25 dias de gestação durante o

período de abril a junho em relação a setembro-outubro. Esse resultado difere do

que era esperado, uma vez que se acreditava que esse primeiro período ainda

sofreria influência do clima mais quente e úmido do período anterior (verão) e,

portanto, apresentaria menor taxa de concepção. Essa suposição baseou-se em uma

série de estudos que foram eficientes em mostrar a influência negativa de ambientes

quentes e úmidos (estresse térmico) sobre o desempenho reprodutivo de bovinos

(FERRELL & JENKINS, 1998; HANSEN, 2004), sendo essa problemática ainda mais

intensa quando se trata de animais pouco adaptados a essas condições climáticas,

como é o caso do gado Holandês (TITO, 1998). Ainda, esse efeito parece se

prolongar por mais de 120 dias após o estresse térmico (TORRES-JÚNIOR et al,

2008).

Quanto às condições climáticas registradas durante o experimento, foi

detectada maior umidade relativa do ar semanal durante os meses de abril a junho,

em relação aos meses de setembro a novembro. No entanto, o período de setembro-

novembro apresentou maiores temperaturas ambientais mínima, máxima e média do

que a outra estação experimental (Fig.9, Tab.5).

Importantes informações para a análise do binômio temperatura-umidade

durante os dois períodos experimentais puderam ser extraídas utilizando-se o Índice

de Temperatura e Umidade (ITU) para bovinos proposto por ARMSTRONG (1994;

Anexo A). Considerando-se as médias semanais de umidade e temperatura máxima,

média e mínima em cada período (Tab.5), pôde ser constatada, com base no ITU,

ausência de estresse térmico durante os momentos em que foram registradas as

temperaturas mínima e média para ambos os períodos experimentais. No entanto,

quando as temperaturas máximas atingidas foram analisadas, foi possível observar a

ocorrência de estresse térmico moderado nos animais durante os meses de abril a

junho e de estresse térmico propriamente dito durante os meses de setembro a

novembro. Esse resultado evidencia que, durante o período experimental que

compreende o intervalo de setembro a novembro, os animais estiveram sobre efeitos

mais intensos do estresse térmico, em relação aos demais meses avaliados, o que

94

deve ter sido responsável por uma redução da eficiência reprodutiva e pela queda

das taxas de concepção observadas nesse período.

Na tentativa de avaliar o ponto crítico que tenha causado essa queda de

concepção, doadoras e receptoras foram avaliadas separadamente quanto a uma

série de características reprodutivas que poderiam ter sido afetadas pelo estresse

térmico. A avaliação das doadoras de embriões mostra que não foi observada

diferença no número de estruturas totais, embriões degenerados e embriões viáveis

recuperados pela lavagem uterina, em ambos os períodos experimentais (abril-junho

e setembro-novembro; Tab.6), evidenciando que provavelmente, o estresse térmico

deve ter atuado prejudicando a qualidade das estruturas (oócitos e embriões) e não a

quantidade. Nesse contexto, diversos autores mostram que a exposição ao calor

pode estar ligada a degeneração das células da teca e granulosa, reduzindo a

qualidade dos oócitos, sua fertilização e as taxas de concepção (CHEBEL et al.,

2004; SARTORI et at., 2002; WOLFENSON et al., 2000; ROTH et al., 2001).

É importante ressaltar que a alta temperatura e umidade devem ter também

sido responsáveis por causar alterações reprodutivas nas receptoras de embrião.

Sabe-se que vacas submetidas a um agudo estresse calórico no início de uma onda

folicular sofrem comprometimento no desenvolvimento e na esteroidogênese

folicular, por várias semanas após a ocorrência do estresse (BADINGA et al., 1993;

ROTH et al., 2001b), o que pode ter levado a problemas na preparação do ambiente

uterino, tornando-o menos adequado para a recepção do embrião. Ainda, tanto em

novilhas quanto em vacas lactantes, o estresse calórico favorece a inibição do

folículo dominante, com um conseqüente atraso na luteólise e ovulação (WILSON et

al., 1998a; b). Caso esse atraso tenha ocorrido, teria acarretado um retardo na

formação do CL e, consequentemente, no início da secreção de progesterona,

hormônio fundamental para o estabelecimento (reconhecimento materno-fetal;

MANN et al.,1999) e manutenção da gestação.

Uma meta-análise de 17 estudos de suplementação de progesterona indicou

que o tratamento com esse hormônio durante a primeira semana pós-IA aumentou a

taxa de concepção, mas não teve efeito quando administrado durante a segunda ou

terceira semanas (ROBINSON et al., 1989; MACMILLAN & PETERSON, 1993;

95

MANN & LAMMING, 1999; STEVENSON et al., 2007), demonstrando a importância

desse hormônio na manutenção da prenhez. Além disso, a hipertermia ocasiona

também efeito deletério sobre a competência oocitária e a síntese de substâncias

requeridas para o desenvolvimento embrionário inicial (HANSEN, 1997; AL-

KATANANI et al., 2002, 1999; ROCHA et al., 1998; RUTLEDGE et al., 1999),

prejudicando o desempenho tanto das doadoras quanto das receptoras.

Todas essas informações apontam severos efeitos negativos causados pelo

estresse térmico sobre a fisiologia reprodutiva e que podem ser aplicados tanto à

doadora quanto à receptora de embriões, justificando os mecanismos pelos quais a

redução da taxa de concepção pode ter ocorrido nos meses em que os animais

estavam de fato sujeitos a esse tipo de estresse.

7.1.2. Categoria da doadora e estruturas recuperadas Valores (totais e média/colheita) semelhantes quanto ao número total de

estruturas recuperadas, de embriões degenerados e de embriões viáveis, obtidos

através da lavagem uterina, foram observados nas três categorias de doadora

avaliadas. De forma semelhante, outros estudos também não identificaram diferença

entre vacas lactantes e não lactantes (HASLER et al., 2006) ou novilhas (LEROY et

al., 2005).

No entanto, diferentemente do que foi observado no presente estudo, um

trabalho realizado nos EUA (Vale São Joaquim, Califórnia; CHEBEL et al., 2008), no

qual foram colhidos dados de duas propriedades leiteiras, durante julho de 2006 a

junho de 2007, mostrou diferença na produção total de estruturas e embriões viáveis

entre vacas em lactação (6,77; 3,62 e n = 309) e vacas não lactantes (14,14; 5,44 e n

= 359; P < 0,01). Nesse mesmo estudo, foi encontrado também efeito de época do

ano, sendo as estações mais quentes associadas a menor produção de embriões

viáveis, o que também vai contra os resultados ora apresentados. Apesar da

contradição de dados entre o presente estudo e o realizado por CHEBEL et al.

(2008), é importante destacar que no experimento mencionado, tanto doadoras

lactantes quanto não lactantes foram submetidas ao mesmo protocolo

superovulatório (bastante semelhante ao descrito para as vacas não lactantes no

96

presente experimento, mas utilizando cio “base”), no qual o GnRH foi administrado

48 horas após a aplicação de PGF2α, o que pode ter prejudicado o desempenho das

doadoras em lactação. Sabe-se que vacas lactantes possuem metabolismo elevado,

o que causa ovulação atrasada e justificaria, portanto, a utilização do protocolo

modificado descrito no atual estudo, com atraso de 12 horas no início das aplicações

de FSH e GnRH 60 horas após a PGF2α. Essa afirmativa é apoiada por estudos

brasileiros que confirmam a hipótese que, em doadoras Holandesas em lactação

superestimuladas, o atraso da indução da ovulação aumenta as taxas de ovulação

por permitir um aumento do diâmetro folicular e da capacidade ovulatória no

momento da administração de LH (BARUSELLI et al., 2005; MARTINS et al., 2005;

RODRIGUES et al., 2005). Em um desses estudos, realizado por MARTINS et al.

(2005), vacas que receberam LH 48 horas após a PGF2α tiveram desempenho

bastante inferior em número de embriões transferíveis (2,3 ± 0,5 vs 4,9 ± 0,9) e

congeláveis (2,1 ± 0,5 vs 4,7 ± 0,9) além de apresentarem maior dispersão das

ovulações (17,5 ± 2,3 vs 10,9 ± 2,0h entre a primeira e última ovulação) quando

comparadas aos animais tratados com LH 60 horas após o agente luteolítico,

respectivamente. Novamente, esses dados corroboram com a redução numérica de

estruturas e embriões viáveis observados por CHEBEL et al. (2008) e justificam a

diferença encontrada nos resultados desses autores e os obtidos no presente

experimento. Além disso, não se deve esquecer que o uso de implante de

progestágeno para a sincronização da onda de crescimento folicular pode ter sido

responsável por uma melhora no desempenho das doadoras do presente trabalho,

aproximando os resultados em termos de estruturas colhidas entre vacas não

lactantes e lactantes.

Alguns trabalhos também apresentam uma comparação do desempenho à

SOV e lavagem uterina entre gado de leite e corte. Em um deles, vacas leiteiras em

lactação produziram menor quantidade de oócitos/embriões (estruturas totais) do que

vacas de corte (PUTNEY et al., 1988). Esse resultado evidencia o comprometimento

reprodutivo de vacas em lactação, o qual deve estar relacionado ao seu metabolismo

bastante acelerado, resultando, consequentemente, em índices reprodutivos

inferiores aos encontrados para animais de corte.

97

Outro resultado encontrado no presente estudo foi a ocorrência de menor

número de oócitos NF por colheita na categoria das novilhas (0,94 ± 0,23) em

relação às vacas não lactantes (5,39 ± 0,87; P = 0,001) e lactantes (7,37 ± 1,63; P =

0,002; Tab.9). Estudos avaliando a taxa de concepção em grandes rebanhos leiteiros

comerciais mostram que a fertilidade de novilhas (> 60%) parece ser bastante

superior à encontrada em vacas (25 a 40%), reforçando os resultados encontrados

no presente experimento (BUTLER, 2008a).

Inesperadamente, maior taxa de concepção aos 25 dias foi obtida em

receptoras cujos embriões foram provenientes de doadoras em lactação (44,2%)

quando comparados aos provenientes de novilhas (29,8; P = 0,02). Embriões de

doadoras em lactação também resultaram maior taxa de concepção aos 46 dias

(37,6%), com relação tanto a novilhas (23,4%; P = 0,009), quanto a doadoras não

lactantes (25,3%; P = 0,02). Ainda, menor perda gestacional (15,1%) foi relacionada

às doadoras em lactação, quando comparadas às doadoras não lactantes (38,3%; P

= 0,01; Tab.10). Contradizendo os resultados ora encontrados no seguinte projeto,

diversos trabalhos já acima mencionados mostram eficiência reprodutiva inferior

quando do uso de embriões de vacas lactantes. As possíveis explicações para essa

inesperada superioridade dos embriões provenientes de vacas em lactação

encontrada no presente estudo residem em 4 aspectos principais: nutrição, DEL,

bem-estar animal e utilização de bST.

a) Nutrição

Quanto à nutrição, é importante ressaltar que na propriedade em que foi

realizado esse estudo, as vacas não lactantes receberam rotineiramente a mesma

ração que é formulada para vacas em lactação, ou seja, receberam quantidade de

nutrientes bastante superior à exigida para sua mantença. Sabe-se que o alto

consumo de matéria seca provoca aumento do metabolismo de estradiol

(SANGSRITAVONG et al., 2002), hormônio essencial para a fertilização (MANN &

LAMMING, 2000). A redução das concentrações de estradiol também está associada

à formação de folículos persistentes, o que leva a diminuição da qualidade oocitária

(WILTBANK et al., 2006) e comprometimento do desenvolvimento embrionário

(MANN & LAMMING, 1999). Além disso, estudos mostram que a ingestão de dietas

98

com alto nível protéico pode ser prejudicial ao desempenho reprodutivo dos animais,

podendo levar a alterações no fluido folicular, ambiente uterino e/ou desenvolvimento

embrionário e, consequentemente, redução na taxa de concepção (BUTLER, 2008b),

como descrito a seguir:

A concepção e o estabelecimento da concepção dependem de uma progressão

ordenada de eventos e processos inter-relacionados que ocorrem dentro do trato

reprodutivo: desenvolvimento folicular resultando em ovulação, fertilização do oócito,

transporte e desenvolvimento do embrião, reconhecimento materno e implantação do

embrião. A amônia, uréia ou outro subproduto tóxico do metabolismo das proteínas

podem interferir em um ou mais desses passos, comprometendo a eficiência

reprodutiva (BUTLER, 2008b). Dessa forma, as medidas de nitrogênio uréico

plasmático (PUN) e no leite (MUN) têm fornecido um índice bastante útil para o

estudo da associação entre o metabolismo da proteína da dieta e a eficiência

reprodutiva. Em muitos trabalhos, aumentos nas concentrações de PUN e MUN

foram correlacionados à menor fertilidade de vacas leiteiras tanto em confinamento

quando mantidas a pasto (BUTLER, 1998; WESTWOOD et al., 1998; TAMMINGA,

2006; WITTWER et al., 1999). Nesse contexto, as taxas de concepção diminuiram

cerca de 20% quando o PUN ou o MUN eram > 19 mg/dL (BUTLER et al., 1996).

Ainda, mais recentemente, um amplo estudo de campo sugeriu que a taxa de

concepção pode ser reduzida mesmo com níveis de MUN mais baixos (>15,4 mg/dL;

RAJALA-SCHULTZ et al., 2001). Esses resultados sugerem a ocorrência de

alterações metabólicas ligadas ao alto consumo protéico que podem estar causando

menor fertilidade das doadoras não lactantes do presente estudo.

Quando estudos mais específicos envolvendo alterações em fluido folicular e

ambiente uterino são considerados, os efeitos negativos do excesso de proteína na

dieta ficam ainda mais evidentes. HAMMON et al. (2005) demonstraram que os

níveis de uréia e amônia encontrados no fluido folicular estavam direta e

positivamente relacionados aos níveis de PUN, confirmando os resultados que foram

encontrados em um estudo em que novilhas alimentadas de forma a gerar altos

níveis de amônia no rúmen apresentaram altos níveis de amônia no fluido folicular

(SINCLAIR et al., 2000). Ainda, os oócitos colhidos dessas mesmas novilhas tiveram

99

taxas de clivagem menores que dos animais do grupo controle (dieta gerando baixos

níveis de amônia), o que mostra uma influência negativa da proteína em excesso no

desenvolvimento embrionário e mais uma vez pode explicar as taxas obtidas por

doadoras não lactantes superalimentadas no presente trabalho.

O alto consumo de proteína também alterou as concentrações de minerais nas

secreções uterinas durante a fase lútea (JORDAN et al., 1983), o nível de amônia no

fluido uterino (HAMMON et al., 2005) e o pH uterino ao longo do ciclo estral (ELROD

& BUTLER, 1993; ELROD et al., 1993). Normalmente, o pH uterino aumenta de

cerca de 6,8 ao estro para 7,1 no dia 7 do ciclo estral (fase lútea), mas esse

aumento não foi observado em vacas lactantes e novilhas alimentadas com dietas

ricas em proteína. Os resultados desses estudos sugerem que o aumento dos níveis

de uréia devido a utilização de uma dieta rica em proteína pode reduzir a fertilidade

por interferir com os efeitos da progesterona sobre o microambiente uterino,

proporcionando dessa forma condições sub-ótimas para manter o desenvolvimento

do embrião (BUTLER, 2001). Apesar de, no presente estudo, os embriões

permanecerem pouco tempo em contato com o ambiente uterino das doadoras, este

se mostra muito importante e pode estar exercendo alguma influência sobre o

desenvolvimento embrionário inicial, o que pode ter levado às reduzidas taxas de

concepção aos 46 dias e altas taxas de perda gestacional verificadas.

Mais recentemente, um estudo de RHOADS et al. (2006) em vacas leiteiras

mostrou a grande influência do alto PUN do desenvolvimento embrionário precoce

(enquanto ainda nas doadoras). Nesse trabalho, as taxas de concepção observadas

foram mais baixas nas receptoras que receberam embriões recuperados de vacas de

PUN alto em relação às doadoras de PUN moderado (11 e 35%, respectivamente).

Esses resultados indicam que os efeitos prejudiciais do PUN elevado ocorrem antes

do dia 7 após a IA e podem ser direcionados ao desenvolvimento dos oócitos nos

folículos ovarianos ou a aspectos do desenvolvimento embrionário no oviduto e

útero. Esse dado fortalece, e muito, a hipótese ora criada de que a alimentação

excessivamente rica em proteínas pode ter sido uma grande responsável pelas

baixas taxas de concepção das receptoras que foram inovuladas com embriões

provenientes de vacas não lactantes superalimentadas no presente experimento.

100

Ainda, os efeitos negativos da superalimentação podem ser mediados por

alterações endócrinas como a hiperinsulinemia e o aumento da glucose e IGF-1, o

que pode interferir com o transporte de glicose no embrião e intensificar a apoptose

(SANTOS et al., 2008; SARTORI et al., 2007; Figura 18).

INGESTÃO DE ALIMENTO

Muito baixaBaixa

Muito altaAlta

Anestro SubfertilidadeP4E2

IGF-I

Qualidade- Ovócitos - Embriões

Tamanho e quantidade de

folículos

P4E2

IGF-I



folículos

Ondas foliculares

no ciclo

Ondas foliculares

no ciclo

INGESTÃO DE ALIMENTO

Muito baixaBaixa

Muito altaAlta

Anestro SubfertilidadeP4E2

IGF-I



folículos

P4E2

IGF-I



folículos

Ondas foliculares

no ciclo

Ondas foliculares

no ciclo

Figura 18. Esquema resumido dos possíveis efeitos de diferentes níveis de ingestão

de alimentos na fisiologia reprodutiva das fêmeas bovinas. P4 = progesterona, E2 = estradiol, IGF-I = fator de crescimento semelhante à insulina (SARTORI et al., 2007)

b) DEL

Em um de seus estudos, SARTORI et al. (2002) observaram alta incidência de

baixa qualidade embrionária em vacas de alta produção e no início da lactação em

comparação a vacas não lactantes (2,2 +/- 0,3 vs. 3,1 +/- 0,3) e novilhas (2,2 +/- 0,3

vs. 3,8 +/- 0,4), respectivamente. Ainda, vacas em início de lactação apresentaram

alta porcentagem de embriões não viáveis comparadas às vacas não lactantes. No

101

entanto, a média de DEL das doadoras em lactação que fizeram parte do presente

projeto foi de 502,30 ± 37,22, o que mostra claramente que esses animais estavam

fora do início e pico de lactação e do período de balanço energético negativo, que

são grandes fatores responsáveis pela queda do desempenho reprodutivo de vacas

em lactação de alta produção. Esse fato pode justificar o bom desempenho dessa

categoria animal encontrado no atual experimento.

c) Bem-estar animal

Na propriedade em que o presente projeto foi desenvolvido, vacas não

lactantes e novilhas (inclusive as doadoras) foram mantidas em piquetes, enquanto

as vacas em lactação foram acondicionadas em galpões tipo freestall equipados com

ventiladores, aspersores e camas limpas para descanso. Dessa forma, pode-se

supor que as doadoras em lactação estavam em equilíbrio metabólico (item b) e

ambiental bom o suficiente para que pudessem desempenhar boa função

reprodutiva, como foi efetivamente observado no presente estudo ao se analisar as

taxas de concepção das receptoras que receberam embriões de doadoras dessa

categoria.

d) Utilização de bST

Quanto ao uso de bST, podemos especular que a utilização desse hormônio

nas doadoras em lactação pode ter sido um dos fatores responsáveis por uma

provável melhora na qualidade dos embriões recuperados dos animais dessa

categoria e pela maior taxa de concepção encontrada nas receptoras inovuladas com

esses embriões. Essa hipótese foi levantada com base em uma série de estudos a

respeito dos efeitos da bST na reprodução de vacas em lactação, como relatado a

seguir:

Em linhas gerais, foi mostrado que o uso de bST em associação a protocolos

de sincronização da ovulação (como o Ovsynch) em animais já cíclicos, foi capaz de

aumentar as taxas de concepção (MOREIRA et al., 2000), melhorar as

características embrionárias e aumentar as taxas de transferência de embriões

(THATCHER et al., 2001; STEVENSON, 2008). Quanto ao momento da aplicação da

bST, MOREIRA et al. (2001) observaram melhora nas taxas de concepção de

animais recebendo bST tanto no dia da IA quanto no início do protocolo Ovsynch (10

102

dias antes da IA), sendo constatado um aumento de 9% na concepção dos grupos

tratados (34%) em relação ao grupo controle (sem bST, 25%). Os mesmos autores

encontraram resposta ainda melhor dos animais tratados com bST, quando foi

aplicada a pré-sincronização (Presynch) anterior ao protocolo Ovsynch, para os

mesmos três grupos (com bST = 56 a 58% vs sem bST = 43%). Esses resultados

mostram que o uso de bST, mesmo 10 dias antes da IA, já produz efeitos benéficos

que resultam em melhores índices reprodutivos e que, portanto, podem explicar, de

certa forma, as melhores respostas obtidas por doadoras que receberam esse

hormônio no presente estudo.

Outro estudo (SANTOS et al., 2004) testou o uso de bST em vacas em

lactação, cíclicas, de primeiro serviço e mostrou que os animais tratados com esse

hormônio apresentaram maior taxa de concepção aos 45 dias pós-IA (53%) do que

os não tratados (40%). Os autores também observaram que o tratamento com bST

reduziu as perdas de concepção após a primeira IA, resultado que reforça os obtidos

no presente trabalho, já que as perdas observadas em receptoras que receberam

embriões provenientes de doadoras submetidas a aplicação de bST (vacas em

lactação) foram inferiores às relativas a doadoras que não foram tratadas (vacas não

lactantes).

Mais além, um experimento conduzido para determinar o efeito da bST sobre o

desenvolvimento de embriões de doadoras superovuladas (THATCHER et al., 2001)

mostrou que o tratamento das vacas com bST aumentou as taxas de fertilização

(menor número de oócitos NF), a porcentagem de embriões transferíveis ou

congeláveis e acelerou a maturação embrionária (maior número de embriões na fase

de blastocisto). No presente experimento não foi observada diferença no número de

oócitos NF e embriões viáveis entre as doadoras que receberam ou não bST. No

entanto, é muito importante ressaltar que os animais tratados ou não eram de

categorias diferentes (vacas em lactação e vacas não lactantes/novilhas,

respectivamente), o que inviabilizaria essa comparação. Provavelmente, se

tivéssemos um grupo de doadoras em lactação que não recebesse a bST, os

resultados seriam semelhantes aos encontrados pelo grupo de THATCHER, ou seja,

seria observada uma melhora de fertilidade nos animais recebendo esse hormônio.

103

Dessa forma, podemos supor que a bST melhorou sim os índices relativos aos

oócitos e embriões das vacas em lactação do presente estudo, deixando-as

inclusive, semelhantes as vacas não lactantes e novilhas em termos de número de

embriões viáveis.

Essa especulação ganha ainda mais força quando os resultados da segunda

fase experimental do trabalho acima mencionado (THATCHER et al., 2001) são

levados em consideração. Nessa fase, observou-se que entre receptoras

Holandesas em lactação que não receberam bST, a transferência de embriões

provenientes de doadoras tratadas com bST aumentou a taxa de concepção em

comparação à TE de doadoras não tratadas (56 vs 26%), demonstrando a influência

positiva desse hormônio sobre a qualidade dos embriões produzidos por doadoras

tratadas. Além disso, esses autores mostraram que, independentemente da fonte de

embriões, a taxa de concepção das receptoras tratadas com bST um dia após o

estro e, posteriormente, a cada 14 dias (43%) foram mais elevadas que a de

receptoras controle que receberam embriões provenientes de doadoras controle

(sem bST; 26%). Esse manejo de receptoras (bST a cada 12 dias) foi também

adotado no presente estudo, uma vez que demonstra ser benéfico para a fertilidade,

além de aumentar a produção de leite.

Quanto ao uso de bST em vacas não lactantes, um trabalho realizado por

BILBY et al. (2004) mostrou redução das taxas de prenhez quando esse hormônio foi

utilizado em animais dessa categoria (bST = 27.2% vs sem bST = 63.6%), resultado

que dá suporte para os obtidos no presente projeto. Neste mesmo trabalho prévio foi

observado maior tamanho do concepto e maior quantidade total de interferon-tau no

lavado uterino dos animais tratados com bST, bem como tendência de maior peso do

CL desse grupo, o que em um primeiro momento contrasta com os resultados de

prenhez. No entanto, os autores sugerem que, nas vacas não lactantes, a bST deve

ter hiperestimulado o IGF-1 e a insulina plasmática, causando assincronia entre

concepto e útero, o que foi prejudicial à prenhez.

Outro aspecto relacionado à bST que não deve ser ignorado é que o veículo

utilizado para carrear esse hormônio (forma comercial utilizada – Boostin® 10) é a

10 Somatotropina bovina recombinante, 500 mg, Schering-Plough, Brasil.

104

vitamina E (1.655 UI, nesse caso), a qual possuí ação antioxidante que pode ter

auxiliado ainda mais o desempenho das doadoras em lactação. Além disso, é

importante ressaltar que, como já foi mencionado, todas as receptoras receberam

aplicações regulares (a cada 14 dias) de bST, o que pode ter mascarado a ação

antioxidante esperada com o uso do Trolox®.

De maneira geral, os resultados acima indicam que a bST pode elevar as taxas

de concepção de vacas leiteiras em lactação ao aumentar as taxas de fertilização,

acelerar o desenvolvimento embrionário precoce e afetar fatores nas vacas prenhes

que estimulam o desenvolvimento do embrião (STEVENSON, 2008), o que pode de

certa maneira explicar os melhores índices alcançados pelas receptoras que

receberam embriões das doadoras em lactação, nas quais foi usado a bST.

7.1.3. Estádio e Qualidade Embrionária e Sincronia do cio entre doadora e receptora

Sobre os parâmetros estádio e qualidade embrionária, pode-se dizer que o

primeiro apresenta menor subjetividade em relação ao segundo. No entanto, ambos

se mostram extremamente importantes na tomada de decisão entre descarte,

transferência e congelamento de embriões, sendo, dessa maneira, muito importante

que a classificação das estruturas embrionárias seja realizada por um profissional

treinado e qualificado para tal trabalho.

Similarmente a diversos trabalhos realizados tanto em gado de corte (SPELL et

al., 2001; HASLER, 2001) quanto em gado de leite (CHEBEL et al., 2008; HASLER,

2001), não foi observado no presente estudo efeito de estádio embrionário sobre as

taxas de concepção aos 25 e 46 dias e à perda gestacional. No entanto, no atual

experimento a qualidade embrionária mostrou ter efeito sobre a taxa de concepção

aos 25 dias, sendo clara a queda dessa taxa de grau 2 para grau 3 (Tab.23).

Diversos outros autores também detectaram diferenças em concepção de acordo

com o grau de qualidade do embrião inovulado (CHEBEL et al., 2008; PEIXOTO et

al., 2007; HASLER, 2001; DONALDSON, 1985). Em um desses trabalhos, CHEBEL

et al. (2008) observaram queda na taxa de concepção à medida que a qualidade

embrionária se mostrava inferior [grau 1 = 59,4% (443/746), grau 2 = 53,8%

105

(157/292) e grau 3 = 35,2% (51/145)], evidenciando uma redução mais brusca de

grau 2 para 3, dados que corroboram com os resultados do presente experimento.

Quanto à sincronia do cio entre doadora e receptora, os resultados

encontrados no presente estudo sugerem que receptoras com sincronia perfeita de

cio (0 dias de diferença) e com defasagem de sincronia do cio igual a -1 ou +1 dia

com relação às doadoras, apresentam semelhantes taxas de concepção aos 25 e 46

dias de gestação e perda gestacional. Esse resultado se assemelha ao observado

em um estudo retrospectivo realizado na mesma propriedade referente aos anos de

2001 a 2006, no qual não foi verificado efeito do dia de sincronia (0, -1 ou +1) na taxa

de concepção utilizando embriões frescos [39,96 % (189/473), 45,28 % (652/1440) e

43,55 % (314/721), respectivamente; RODRIGUES et al., 2007b]. HASLER (2001) e

RODRIGUES et al. (2003) também afirmaram que a assincronia do cio entre doadora

e receptora de mais ou menos 24 horas não afetou as taxas de prenhez. Dados de

um trabalho realizado por SPELL et al. (2001) no qual houve também

acompanhamento ultrassonográfico do crescimento do CL e análise da concentração

plasmática de progesterona, reforçam essa afirmativa, uma vez que não foi

observado efeito de dia de sincronia entre doadora e receptora sobre a taxa de

concepção, apesar do aumento detectado em diâmetro e volume do CL e da

concentração plasmática de progesterona a medida que os dias pós-estro

aumentavam nas receptoras (de 6,5 para 8,5 dias). Os resultados dos quatro

trabalhos apresentados sugerem que é possível realizar a inovulação de embriões

frescos em receptoras nesses três momentos de sincronia com a doadora, sem, no

entanto, provocar perdas na eficiência reprodutiva desses animais.

Outros trabalhos, no entanto, mostraram maior taxa de prenhez apenas

quando as receptoras apresentavam cio ao mesmo tempo (dia 0) ou 12 a 24 horas

antes (dia +1) da doadora (PEIXOTO et al., 2007; HEYMAN, 1988; COLEMAN et al.,

1987). Uma saída para tentar manter taxas de prenhez semelhantes para os três

momentos de sincronia em questão (-1, 0 e +1) seria trabalhar com a combinação de

estádio embrionário e dia de sincronia, dessa forma, embriões em fase de

desenvolvimento mais inicial seriam inovulados em receptoras -1, enquanto embriões

mais avançados em desenvolvimento seriam transferidos em fêmea +1, os demais

106

poderiam ser direcionados para os animais de dia 0. Um estudo realizado por

DONALDSON (1995) com dados referentes a 13.663 embriões colhidos e

transferidos em uma central de TE, mostrou que em alguns casos essa combinação

pode ser interessante, como o uso de Bi no dia 0 e mórulas iniciais no dia -1. Apesar

disso, esse mesmo autor relata que a diferença nas taxas de prenhez entre

receptoras -1, 0 e 24 horas foi bastante pequena, sendo de fato bastante reduzidas

quando se utilizou animais -3 e +3.

Na propriedade em que foi realizado o presente trabalho, sempre que possível

e especialmente nos casos de embriões em estádio precoce ou tardio do

desenvolvimento, foi realizada a combinação entre estádio embrionário e sincronia

do estro entre doadora e receptora. Provavelmente, esse fator pode ter colaborado

para a obtenção de taxas de concepção semelhantes para os três dias de sincronia

ora utilizados.

7.1.4. Qualidade e localização (lado) do CL das receptoras

Como esperado, a porcentagem de concepção se manteve semelhante para

embriões inovulados em qualquer antímero dos cornos uterinos (sempre ipsilateral

ao CL). No entanto, diferentemente do que se esperava, não houve diferença

significativa em concepção e perda gestacional para as diferentes qualidades de CL

das receptoras, apesar de uma grande diferença numérica relacionada ao CL grau 3

comparado ao grau 1 (maior diferença) e ao grau 2 (menor diferença). Pode-se supor

que essa ausência de significância estatística possa estar relacionada ao pequeno

número de animais apresentando CL grau 3, sendo possível, portanto, que ocorra de

fato uma queda da taxa de concepção ao se utilizar receptoras apresentando CLs de

pior qualidade, conforme o critério adotado. Essa hipótese ganha força quando se

analisa um trabalho publicado por RODRIGUES et al. (2003), no qual se determinou

a taxa de concepção de 396 novilhas Bos taurus x Bos indicus inovuladas após a

detecção do estro conforme do tamanho do CL único à palpação transretal. Nesse

estudo foram obtidas taxas semelhantes para CL grau 1 e 2 (50,6 e 47,3%,

respectivamente) e uma queda significante de concepção nas receptoras com CL

classificado como grau 3 (31,4%).

107

Em um outro trabalho, realizado por AMBROSE et al. (1999), a classificação do

CL foi também realizada por palpação transretal, baseando-se no seu tamanho e

suas características palpáveis. Dessa forma, o CL foi categorizado como 3

(excelente: CL grande de tamanho aproximado ≥2,0 cm e bem definido, com coroa

proeminente), 2 (bom: CL pequeno ≥1,0 e <2,0 cm, mas facilmente palpável, com

superfície arredondada e sem coroa proeminente), 1 (ruim: CL deficiente ou corpo

hemorrágico ≤1,0 cm), ou 0 (não palpável: Cl não detectado à palpação). A acurácia

da classificação do CL à palpação retal foi determinada através da dosagem da

concentração plasmática de progesterona. Nesse contexto, considerou-se como

diagnóstico positivo correto todas as vacas com CL classificado como 1, 2 ou 3 que

apresentaram concentração de progesterona ≥1,5 ng e como diagnóstico positivo

incorreto aquelas agrupadas em CL 1, 2 ou 3 que apresentaram progesterona <1,5

ng/mL; animais agrupados em CL 0 deveriam ter progesterona <1,5 ng/mL para

serem considerados como classificados corretamente. Os resultados obtidos por tais

pesquisadores mostraram um aumento da concentração de progesterona plasmática

média à medida que a qualidade do CL subia de categoria (melhorava), ou seja, de

grau 0 (2,99 ± 0,49) para grau 1 (4,62 ± 0,54), grau 2 (5,44 ± 0,38) e grau 3 (7,13 ±

0,25). A relação linear entre essas variáveis apresentou correlação positiva (r = 0,46;

P < 0,01) e o contraste ortogonal revelou que as concentrações de progesterona de

fêmeas com CL classificado como grau 0 e 1 diferiu (P < 0,01) de vacas com CL 2 e

3, sendo a categoria 0 diferente da 1 (P < 0,03) e a categoria 2 diferente da 3 (P <

0,01).

Os dados apresentados acima (AMBROSE et al., 1999) embasam o uso da

classificação do CL por palpação transretal, através da mensuração da concentração

de progesterona e fornecem uma possível explicação para as quedas numéricas nas

taxas de concepção encontradas no presente experimento quando da utilização de

receptoras com CL classificado como grau 3. É importante relembrar que

classificação apresentada no atual trabalho se mostra inversa (1 = excelente, 2 =

bom e 3 = “ruim”) à proposta pelo grupo de AMBROSE, sendo, portanto, o CL grau 3

ora apresentado equivalente ao grau 1 apresentado por esses pesquisadores.

108

Complementarmente, em outro trabalho, a ultrassonografia foi utilizada para

determinar a área do CL e realizar sua classificação em graus 1 (>2,0 cm2) , 2 (1,5 a

2,0 cm2) e 3 (<1,5 cm2) em receptoras Bos taurus x Bos indicus (BARUSELLI et al.,

2000a; 2003). Ainda, foi observada correlação entre as classes de CL (por

ultrassonografia) e a dosagem de progesterona plasmática no momento da

inovulação em receptoras de embrião bovino (BARUSELLI et al., 2003;

MANTOVANI, 2003) e entre a taxa de concepção e o diâmetro do CL único em

novilhas Bos taurus x Bos indicus tratadas para inovulação em tempo fixo (dados não

publicados).

Vale reenfatizar que a classificação do CL via palpação transretal apresenta

alta subjetividade, sendo importante haver elevada competência profissional por

parte do veterinário responsável pela realização do exame para que esse parâmetro

possa ser de fato utilizado como fator de avaliação das receptoras.

7.1.5. Protocolos reprodutivos das receptoras

Postula-se que vacas que apresentam cio natural ou induzido por PGF (sem

indutor de ovulação) ovulam um pouco mais tardiamente do que fêmeas submetidas

a protocolos de sincronização do ciclo estral, nos quais a ovulação é induzida

hormonalmente. Essa diferença ocorre uma vez que, nas fêmeas de ovulação

espontânea, há necessidade de um maior crescimento do folículo dominante, para

que este atinja a maturidade e produza quantidade de estradiol suficiente para

induzir o pico endógeno de LH e, consequentemente, a ovulação. Nas vacas de

ovulação induzida, no entanto, a administração do indutor de ovulação causa um

pico de LH anterior ao que se daria naturalmente, promovendo a ovulação mais

precocemente, e, portanto, de um folículo menor ao que ovularia espontaneamente.

Dessa forma, espera-se que ocorra a formação de um CL maior e, portanto, que

resulte em maior produção de progesterona e maiores taxas de concepção em

fêmeas que ovulam espontaneamente, em comparação às de ovulação induzida

(BARUSELLI, 2008).

Nesse contexto, BARUSELLI et al. (2000b; 2003) mostraram que vacas que

apresentam cio natural ou induzido por PGF (sem indutor de ovulação) possuem

numericamente maiores taxas de concepção, em relação a vacas de ovulação

109

sincronizada e induzida (PGF = 56,3% vs Ovsynch = 49,2%; P = 0,20). De forma

semelhante foi observado no presente estudo, um aumento numérico nas taxas de

concepção aos 25 e 46 dias de receptoras de cio natural (39,3 e 29,2%) e que

receberam uma injeção de PGF (41,5 e 30,6%) em relação às submetidas ao

protocolo de TETF (33,8 e 26,8%).

No entanto, é importante ressaltar que em programas de TE nos quais são

utilizadas receptoras de cio natural ou induzido por PGF, faz-se necessário haver

observação de cio bastante eficiente. Sabe-se também, que vacas de alta produção

leiteira apresentam demonstração de cio de duração mais curta (LOPEZ et al., 2005),

o que pode dificultar bastante a detecção do estro desses animais. Portanto, uma

boa alternativa para aumentar as taxas de aproveitamento das receptoras (e,

consequentemente, as taxas de prenhez), seria a utilização de protocolos de TETF,

uma vez que se aboli a necessidade de detecção de cio. Esse efeito pode ser

evidenciado nos trabalhos de BARUSELLI et al. (2000b; 2003), nos quais foram

obtidas respectivamente para os grupos PGF e Ovsynch taxas de aproveitamento de

45,2 (80/177) e 72,6% (122/168), com P < 0,0001 e taxas de prenhez de 25,4

(45/177) e 35,7% (60/168), com P = 0,03. Ainda, protocolos utilizando dispositivos de

P4 e eCG poderiam ser mais eficientemente aplicados a todos os animais, inclusive

àqueles em anestro ou sem CL ao início do protocolo.

Um trabalho realizado por RODRIGUES et al. (dados em via de publicação) no

qual é realizada a comparação entre taxas de aproveitamento, concepção e prenhez

de receptoras utilizadas após a aplicação de PGF associada á observação de cio

versus receptoras submetidas a protocolos de TETF apresentando ou não CL no

início do protocolo, mostra que apesar da superioridade numérica do grupo PGF

quanto à taxa de concepção aos 30 e 60 dias (PGF = 53,6 e 47,6% vs TETF com CL

= 42,6 e 38,5% vs TETF sem CL = 38,4 e 37,7%; P > 0,05) o protocolo foi capaz de

aumentar as taxas de aproveitamento (35,9a vs 76,5b vs 62,4%c; P = 0,001) e,

portanto, as taxas de prenhez aos 30 (19,2 a vs 32,6b vs 24%ab, respectivamente; P

=0,0006) e 60 dias (17,1a vs 29,4b vs 23,5%ab, respectivamente; P = 0,001), inclusive

no grupo de fêmeas que não apresentavam CL ao início do tratamento.

110

É importante ainda ressaltar que, no presente trabalho, o eCG foi utilizado no

momento da retirada do implante de norgestomet. Esse hormônio possui efeito

luteotrófico comprovado (BARUSELI et al., 2000a), fato que deve ter desempenhado

papel importante na elevação das taxas de concepção desse grupo, deixando-o

semelhante aos demais (cio natural e PGF).

7.1.6. Número de eventos e DEL das receptoras Como as receptoras utilizadas no presente experimento eram todas

classificadas como repetidoras de serviço, já era de se esperar que apresentassem

DEL relativamente alto. O DEL médio encontrado foi de 360,26 ± 8,38 dias, o que

sugere fortemente que esses animais estavam fora do pico de lactação (ao redor do

segundo mês de lactação; MOLENTO et al., 2004) e do período de balanço

energético negativo, fatores grandemente relacionados a quedas no desempenho

reprodutivo de vacas em lactação de alta produção. Provavelmente, o fato de

estarem todas em uma mesma fase (pós pico de lactação) e já com balanço

energético restabelecido, deve ter sido responsável pela semelhança nas taxas

concepção aos 25 e 46 dias e a perda gestacional das receptoras com até 321 dias e

aquelas acima de 321 dias de lactação.

De forma semelhante, esperava-se alto número de eventos dentre as

receptoras, uma vez que eram repetidoras de serviço (mais de 3 eventos). Sabe-se

que fêmeas dessa categoria apresentam taxas de concepção inferiores a fêmeas de

menos de três serviços. A TE é uma tecnologia utilizada para melhorar as taxas

dessa categoria de animais (SARTORI, 2007; NEGRÃO et al., 2002), sendo esse

emprego da TE até mesmo denominado “embrioterapia” por alguns veterinários e

pesquisadores. Os resultados de um estudo envolvendo 5693 IA e 3858 TE em

vacas Holandesas de alta produção repetidoras de serviço indicaram que a TE

apresenta maior taxa de concepção que a IA ao longo do ano, mostrando ser uma

alternativa eficaz para manter altas taxas de concepção durante o ano todo em

animais que apresentam menor eficiência reprodutiva (RODRIGUES et al., 2007a).

Outros trabalhos reforçam a superioridade da TE em relação à IA, especialmente nas

estações mais quentes do ano (NEGRÃO et al., 2002; VASCONCELOS et al., 2006).

111

Complementarmente, os resultados do presente experimento mostram que a TE

pode nivelar as taxas de concepção e de perda gestacional das repetidoras de

serviço em geral, uma vez animais com mais de 5 eventos apresentaram taxas

semelhantes aos de 3 a 5.

7.1.7. Intervalo Divisão dos Grupos-Inovulação e Colheita-Inovulação

No presente experimento, foi constatada uma diferença estatística altamente

significativa entre o intervalo Div-Inov ≤ 3 horas e os demais, com relação à

concepção aos 25 dias, sendo observada uma queda acentuada de 25,3% quando o

intervalo passou de ≤ 3 para entre 3 e 4 horas (Tab.37). Também, foi detectada uma

forte tendência (P = 0,06) de queda de concepção aos 46 dias, considerando-se os

mesmos intervalos.

A análise do intervalo Col-Inov, por sua vez, não evidenciou diferença

estatística entre as classes de intervalo, apesar de uma visível queda numérica das

taxas de concepção com o aumento do tempo. No entanto, o gráfico de dispersão e

a equação de regressão linear (1/concepção aos 25 dias) construídos com estas

mesmas classes mostraram tendência (P = 0,08) de queda de concepção à medida

que o intervalo Col-Inov aumentou. Complementarmente, quando se analisa o gráfico

de dispersão construído com os valores reais dos intervalos (em minutos), observa-

se que há, de fato, uma queda significativa dessas taxas com o passar do tempo.

Esse último gráfico, no entanto, apresenta R2 baixo, mostrando que há efeito de

muitos outros fatores na queda de concepção e não apenas desse intervalo.

Esse conjunto de dados evidencia de forma bastante interessante a

importância em se transferir os embriões em um intervalo de tempo não muito longo

após a colheita. No caso desse experimento em particular, pôde ser observado que

vacas que receberam os embriões com até três horas da divisão dos grupos, ou até

cinco horas da colheita, apresentaram taxas de concepção bastante superiores em

relação aos demais intervalos. Além disso, é importante atentar para a possibilidade

de haver, de fato, uma queda gradativa dessas taxas à medida que se prolonga o

tempo de espera para a inovulação dos embriões.

112

Esses resultados se mostram bastante interessantes quando se considera a

importância do planejamento do tempo em programas MOET realizados em

fazendas comerciais, visando sempre a otimização dos procedimentos e

maximização dos resultados. Os gráficos apresentados fornecem, ainda, subsídios

para a avaliação custo-benefício (intervalo de tempo-queda de concepção) por parte

do profissional, embasando sua tomada de decisões quanto à alterações de manejo

para incremento das taxas reprodutivas.

7.1.8. Outras avaliações

Devido à ausência de efeito de produção leiteira (receptoras), escore de

condição corporal (ECC), escore de locomoção (EL), temperatura retal e freqüência

respiratória sobre as taxas de concepção aos 25 e 46 dias e de interação dessas

variáveis com o tratamento, suas aferições não foram incluídas na segunda etapa

experimental.

No entanto, a análise dessas variáveis, evidenciou, nas doadoras, a

ocorrência de maior média de ECC nas vacas não lactantes (4,10 ± 0,12) com

relação a vacas lactantes (3,41 ± 0,14; P = 0,005) e novilhas (3,403 ± 0,10; P =

0,0005; Tab.40). Esse fato pode estar diretamente relacionado à própria fisiologia

desses animais, uma vez que, naturalmente, apresentam metabolismo mais lento

(não estão produzindo leite), o que, associado à superalimentação fornecida a essa

categoria animal, favorece a deposição de tecido adiposo e a ocorrência de

alterações metabólicas que pode ter afetado o desenvolvimento oocitário e

embrionário e reduzido a taxa de concepção de receptoras inovuladas com esses

embriões (como explicado no item 7.1.2a).

7.2. Experimento 2

7.2.1. Fase 1 - (PIV) A hipótese inicial desse experimento não foi completamente confirmada, uma

vez que o antioxidante (Trolox®) adicionado ao meio de transporte (solução

TMC199) de oócitos bovinos aspirados de ovários provenientes de abatedouro e

submetidos à PIV, não foi capaz de promover aumento das taxas de clivagem, de

113

blastocisto (D6, 7 e 9 de cultivo) e de eclosão. No entanto, esse trabalho trouxe

importantes contribuições para o desenvolvimento dessa linha de pesquisa.

Diferentemente do Experimento 1, o Trolox® foi agora inicialmente diluído em

etanol (5 µL) para depois ser adicionado ao meio de teste, nesse caso, o meio de

transporte de oócitos. Dessa forma, admite-se que a diluição tenha sido de fato muito

mais eficiente e confiável e, portanto, não deve ter sido um fator responsável pela

ausência de observação do resultado esperado (aumento das taxas referentes à

PIV). Outra interessante opção seria o uso do dimetilsulfóxido (DMSO) como diluidor

prévio do antioxidante (ao invés de etanol), uma vez que se comporta como solvente

biologicamente mais compatível, além de possuir boa ação de permeação cutânea, o

que poderia melhorar a incorporação do Trolox® ao meio (Tedesco, 2008).

Como sugerem os resultados referentes à análise da capacidade antioxidante

total encontrados na segunda fase desse Experimento, o antioxidante provavelmente

exerceu a função esperada, promovendo a neutralização de algumas ROS

produzidas, o que deve ter auxiliado a frente de defesa biológica própria dos oócitos

e embriões (sistema de defesa enzimática celular; NORDBERG & ARNÉR, 2001),

reduzindo os efeitos deletérios das ROS sobre essas estruturas. Portanto, a

ausência de observação do efeito esperado pode supostamente estar ligada a quatro

situações: antioxidante insuficiente (dose), adição única do antioxidante (talvez seja

necessário haver doses de reforço), momento de uso (pode ser necessário utilizar o

antioxidante também no cultivo) ou ação antioxidante parcial, sobre apenas algumas

ROS (necessidade de associação com outro antioxidante).

Um estudo retrospectivo realizado no laboratório onde foi realizado o presente

experimento, avaliou as taxas de blastocisto obtidas em todas as unidades dessa

empresa (dentro e fora do Brasil), incluindo dados relativos à 1.474.981 oócitos de

diversas raças, fecundados por diferentes touros (em vias de publicação). A média

alcançada foi de 32%, sendo 30% o índice obtido pela unidade em que o atual

experimento foi conduzido. Esses valores mostram a constância de resultados da

empresa e dão suporte aos dados ora obtidos. Outros estudos recentes envolvendo

a PIV mostram taxas de blastocisto no D7 semelhantes às obtidas no presente

experimento (MOORE et al., 2007; ALOMAR et al., 2007). Ainda, em um desses

114

trabalhos (ALOMAR et al., 2007), foi observada diferença nessas taxas para

diferentes touros, sendo que o uso do sêmen de determinados touros resultou em

grupos de oócitos fertilizados apresentando primeira clivagem mais precoce e

melhores taxas de blastocisto em relação aos mais tardios (31,3 vs 21,9%,

respectivamente). Esses dados são interessantes, pois ajudam a mostrar que o touro

utilizado no presente experimento se enquadra dentro das taxas da PIV esperadas.

7.2.1.1. Taxas de clivagem, blastocisto e eclosão

A análise dos resultados obtidos durante as fases da PIV mostra que houve,

em todos os momentos estudados, um forte efeito do tempo de permanência dos

oócitos no meio de transporte (8 vs 20 horas) sobre as taxas de clivagem, blastocisto

e eclosão, sem no entanto ter havido efeito de tratamento. Esse dado demonstra

claramente a ocorrência de queda da eficiência dessa técnica quando os oócitos

passam longos períodos em meio de transporte antes de serem transferidos para o

meio de maturação, mesmo que estejam sendo mantidos em meios quimicamente

equilibrados. Dessa forma, pode-se inferir que seja provável que diversos outros

fatores, além da produção de ROS, estejam atuando negativamente sobre esses

gametas de forma tempo-dependente.

Uma possível explicação para redução do desempenho dos grupos que

tiveram seus oócitos por 20 horas no meio de transporte é que a maturação oocitária

iniciou e ocorreu em sua maior parte nesse meio, que não é adequado para esse fim.

Nesse caso, esses gametas permaneceram apenas 4 horas no meio B199+, o qual

possuí todos os hormônios necessários para que a maturação dos CCO se dê de

forma adequada. Diferentemente, os CCO do grupo 8 horas, permaneceram por 16

horas no meio próprio para a maturação, o que certamente foi um grande fator

responsável pelo maior desempenho à PIV obtido por esse grupo.

As taxas de clivagem encontradas nesse projeto foram semelhantes nos

grupos tratado e controle para ambos os tempos de transporte. No entanto, não

houve uma classificação rigorosa de acordo com o número de células clivadas no

momento da avaliação desse parâmetro, ou seja, tanto os embriões apresentando 2

células quanto os de várias células foram igualmente classificados como clivados,

115

sem distinção de qualidade ou grau de clivagem. Esse fato pode ter ocultado um

possível efeito melhorador por parte do antioxidante nessa fase.

Apesar da falha ocorrida, pode-se supor que os oócitos submetidos ao meio

com antioxidante tenham sido beneficiados, de alguma forma, seja pela incorporação

do Trolox® à mebrana celular, ou mais ainda, ao meio interno dos oócitos, sendo

dessa forma “carregado” com o gameta por um período mais prolongado

(fecundação e cultivo). A avaliação da taxa de blastocisto no D6 realça essa

inferência, uma vez que, ao contrário do que ocorreu no grupo controle, não foi

observada redução dessa taxa no grupo tratado quando o tempo de transporte foi

aumentado de 8 para 20 horas. Dessa maneira, o antioxidante parece ter sido capaz

de manter semelhantes taxas de blastocisto no D6 mesmo com um longo período de

exposição dos oócitos ao meio de transporte (20 horas).

Contrariamente ao observado no D6, as taxas de blastocisto no D7 e D9 não

foram mantidas no grupo antioxidante, havendo, novamente uma redução

significativa nessas taxas em ambos os grupos (antioxidante e controle) quando se

passou de 8 para 20 horas de transporte. Esse efeito pode não ter sido observado

devido à quantidade insuficiente do antioxidante, seja por erro na dose única total,

por necessidade de doses de suplementação, por exigência de uso em diferentes

momentos (FIV/CIV) ou por carência de associação a outros agentes antioxidantes

que atuem sobre outros tipos de ROS (complementação e/ou potencialização).

Assim, pode-se supor que a utilização de Trolox® em dose única de 400 µM foi

insuficiente para manter similares taxas de blastocisto no D7 e D9 com o aumento do

tempo de transporte, tendo apresentado-se eficiente apenas no sexto dia de cultivo.

A taxa de eclosão, por sua vez, mostrou-se superior no grupo de embriões

referentes ao tempo de transporte de 20 horas em relação ao grupo 8 horas.

Inicialmente essa taxa parece bastante contraditória, no entanto, é importante

ressaltar que a taxa de eclosão reflete o número de blastocistos presentes no D9 que

havia eclodido no D11, independentemente do valor total de oócitos, diferente do

cálculo das taxas anteriores. Como foi mostrado acima, o grupo 20 horas apresentou

menor taxa de maturação oocitária em relação ao grupo controle. Assim, pode-se

supor que nesse grupo (20h) apenas os CCO de qualidade superior conseguiram

116

resistir e, como esse número foi reduzido, menores taxas de clivagem e blastocisto

foram alcançadas (embriões que resistiram dividido pelo total de oócitos). Em

contrapartida, como nesse grupo somente os superiores progrediram na PIV, a

maioria conseguiu eclodir, justificando as melhores taxas de eclosão alcançada por

esse grupo. Esse fato acaba por aproximar esses dois grupos em termos de

produção numérica efetiva de embriões com capacidade de eclosão, mostrando ser

viável o uso de meios de transporte por períodos mais longos (longas distâncias, por

exemplo); O prolongamento do tempo em meio de transporte, no entanto, deve ser

evitado, especialmente se considerarmos que grande parte dos oócitos aspirados in

vivo não possuí qualidade excepcional, tendo maiores chances de sucesso quando

submetidos a curtos períodos nesse meio;

7.2.2. Fase 2 – (Capacidade Antioxidante Total) Em ensaios laboratoriais como o realizado no presente estudo, a construção

da curva padrão e da equação de reta são pontos cruciais para a extração dos

resultados obtidos no ensaio. Nesse aspecto, a curva ora obtida se mostrou bastante

apta para seu devido fim (R2 bem próximo de 1 e pontos que retrataram, de fato, as

concentrações padrão determinadas).

O efeito de réplica (P = 0,0001) detectado na análise estatística dos dados

pode ser explicado, uma vez que, por mais que se trabalhe para manter as mesmas

condições laboratoriais em todas as réplicas, pequenas alterações são praticamente

impossíveis de serem evitadas. A produção dos meios utilizados nas diversas etapas

da PIV não é perfeitamente idêntica todas as vezes, o tempo de armazenagem

desses meios também pode variar (produção a cada 2 ou 3 dias), a manipulação dos

meios e oócitos é humana, e portanto, também sujeita a oscilações. Assim, o fator

mais importante a ser considerado nesses casos não é a igualdade numérica das

réplicas, mas sim a constância de resultados e comportamentos dentro dos grupos

experimentais avaliados.

Com base nessas informações, pôde ser observada a ocorrência de “valores

negativos” de concentração de antioxidante em todas as amostras referentes ao

grupo controle, evidenciando a presença de ROS nesses meios. Em contrapartida,

117

valores positivos de concentração de Trolox® ou mais próximos de zero, foram

encontrados para todas as amostras do grupo tratado, independentemente dos

tempos de colheita, mostrando que houve um auxílio ao combate de ROS por parte

do antioxidante adicionado.

Quando se analisa apenas o grupo controle, pôde ser notada constância de

valores em relação aos três momentos analisados, além de valores de erro padrão

pequenos em relação às médias obtidas. O fato de terem sido encontrados valores

negativos (ou seja, presença de ROS) já no momento 0 hora indica que o próprio

meio já estava produzindo radicais livres, ou seja, os oócitos que fossem ali

colocados já deveriam de imediato iniciar o combate a esses elementos, utilizando-

se de suas próprias armas biológicas (sistema de defesa enzimática celular;

NORDBERG & ARNÉR, 2001). A constância desses valores nos demais momentos

estudados (8 e 20 horas) mostra a eficiência desses oócitos em combater sozinhos

os radicais continuamente produzidos pelo meio e por seu próprio metabolismo

(Tedesco, 2008). Para tal, provavelmente, a ativação desse mecanismo de defesa ao

estresse oxidativo deve ter sido ininterrupta e, mesmo assim, incapaz de bloquear

mais intensamente esses agentes, o que sugere a alta produção de ROs nesse

sistema.

No grupo tratado com antioxidante, por sua vez, houve um resultado bastante

interessante com relação ao comportamento dos valores de concentração de Trolox®

encontrados. Inicialmente, foi observado erro padrão elevado em relação às médias

encontradas, em todos os momentos (0, 8 e 20 horas) analisados, o que evidencia

uma baixa sensibilidade desse ensaio quando os valores de concentração se

aproximavam de zero. Apesar disso, quando as médias de concentração de

antioxidante foram examinadas, detectou-se valores mais altos nos momentos 0 e 20

horas em relação ao 8 horas. Como no momento zero pôde ser observado que já

havia produção de ROS pelo meio (controle 0h), o antioxidante, que já havia sido

diluído no meio antes mesmo da seleção dos oócitos (meio deixado em estufa para

equilibrar a temperatura), foi sendo incorporado e consumido para combater esses

ROS. No momento 8h o antioxidante deve ter continuado sua ação, no entanto, os

CCO, que já estavam presentes no meio, podem ter incorporado e/ou internalizado

118

parte do Trolox®, resultando nas menores concentrações encontradas no meio

analisado. No momento 20 horas, estranhamente, a concentração de Trolox® no

meio de transporte mostrou-se maior que a observada no momento 8h, o que pode

ser explicado pelo equilíbrio próprio do sistema biológico com relação a esse

antioxidante (parte do que foi internalizado deve ter sido devolvido ao meio para o

sistema chegar ao equilíbrio). Além disso, o Trolox® remanescente ao final das 20

horas pode já ter perdido seu efeito, por não ser sustentável por muito tempo nesse

meio, mostrando que apesar da sua presença, o mecanismo de defesa celular deve

ter permanecido funcional, o que auxiliou na manutenção da sua concentração

(Tedesco, 2008).

Resumidamente, a neutralização dos radicais já produzidos pelo meio,

proporcionou a colocação dos CCOs em meio com menor potencial para causar

estresse oxidativo, aliviando a sobrecarga da defesa natural dessas células. No

entanto, o antioxidante utilizado pode estar em quantidade insuficiente ou estar,

provavelmente, aniquilando apenas alguns tipos de ROS, o que demonstra que sua

ação isolada pode ser insuficiente para melhorar as taxas observadas na PIV. Há

necessidade, portanto, de se estudar associações do Trolox® a outros agentes

antioxidantes (como o ácido ascórbico, a glutationa ou o ß-caroteno, por exemplo),

que atuem sobre as demais ROS, complementando seu leque de ação ou

potencializando seu efeito. Ainda, existe a hipótese que suplementações adicionais

de Trolox® (inclusive em outros momentos da PIV) venham a ser necessárias para

que esse agente atue eficientemente e de forma contínua na prevenção do estresse

oxidativo.

Esse trabalho traz importantes contribuições no direcionamento do estudo

com antioxidantes (Trolox®), uma vez que mostra que pode ser uma importante

ferramenta contra o estresse oxidativo. Ainda, quando combinado ao resultado de

outros trabalhos (FEUGANG et al., 2004), conduz a um estreitamento do intervalo de

dose desse produto a ser pesquisado (entre 400 e 800 µmol.L-1).

119

8. CONCLUSÕES

Dentro das condições em que o presente trabalho foi conduzido e face aos

resultados ora obtidos, pode-se concluir que:

8.1. Experimento 1

- A adição de Trolox® ao meio de manutenção de embriões colhidos in vivo

não foi eficiente em promover incremento das taxas de concepção de receptoras

holandesas repetidoras de serviço que receberam esses embriões;

- há evidências de queda da concepção à medida que se aumenta o intervalo

colheita-inovulação;

- o planejamento das atividades relacionadas à MOET e o gerenciamento do

tempo na busca pela maximização da eficiência reprodutiva de um rebanho devem

levar em consideração o intervalo colheita-inovulação dos embriões;

- o estresse térmico influenciou negativamente a eficiência reprodutiva;

- a categoria da doadora e a qualidade embrionária influenciaram a taxa de

concepção.

8.2. Experimento 2

- O uso de antioxidante (Trolox®) no meio de transporte de oócitos bovinos

aspirados de ovários provenientes de abatedouro não foi eficiente em promover

incremento das taxas de clivagem e blastocisto;

- o antioxidante parece ter “segurado” a taxa de blastocisto no D6 quando os

CCO foram mantidos por 20 horas em meio de transporte;

120

- a seleção inicial dos oócitos de melhor qualidade provavelmente é

responsável pela superioridade das taxas de clivagem e blastocisto no grupo 8h e

de eclosão no grupo 20h;

- os resultados obtidos no ensaio antioxidante (kit) sugerem que o Trolox®

exerceu, de fato, o efeito protetor desejado sobre o material biológico estudado;

121

9. IMPLICAÇÕES

A não observação de efeito do antioxidante sobre as taxas avaliadas nos

Experimentos 1 e 2, não significa que este não estava atuando eficientemente, mas

sim que, provavelmente, o fenômeno de proteção oxidativa estivesse ultrapassando

as metodologias utilizadas, ou seja, as taxas avaliadas não foram métodos sensíveis

o suficiente para captar esse efeito benéfico. A análise da capacidade antioxidante

total, por sua vez, mostrou de forma bastante clara a funcionalidade e eficiência do

antioxidante no combate dos ROS nos dois meios estudados.

É de grande importância que o estudo envolvendo antioxidantes na

reprodução animal continue avançando, para que se consiga, em um futuro próximo,

determinar as formas mais eficientes de uso desses produtos (como doses, vias,

repetições, associações) objetivando a maximização da eficiência reprodutiva dos

rebanhos bovinos.

122

10. PERSPECTIVAS FUTURAS

Como base nos resultados mencionados e discutidos no presente trabalho,

pode-se inferir uma série de estudos que poderiam ser feitos, a fim de melhor

entender o uso de antioxidantes na reprodução animal (especificamente, em fêmeas

bovinas e na PIV) e que buscassem aprimorar as técnicas já utilizadas na TE e PIV:

a- Avaliação de Intervalos Div-Inov e Col-Inov inferiores aos que foram utilizados

(verificar se a maior redução pode melhorar ainda mais as taxas de concepção);

b- Repetição do Experimento 1 e 2 utilizando a diluição prévia do Trolox® em DMSO;

c- Utilização do Trolox® (diluição prévia em etanol) no meio de colheita de embriões;

d- Estudo de doses do Trolox® (eficiência vs toxicidade);

e- Estudo sobre exposição única vs repetida ao antioxidante (equilíbrio, inativação);

f- Associação do Trolox® à outro(s) antioxidante(s), como ácido ascórbico, glutationa,

o ß-caroteno ou outros, no meio de trabalho (à campo/PIV) ou por via parenteral/oral;

g- Desenvolvimento de implantes de liberação lenta de antioxidante;

h- Estudos para verificar se ocorre a internalização do Trolox® nas células

(oócitos/embriões – zona pelúcida) e seu mecanismo de ação;

i- Desenvolvimento de protocolos de sincronização de receptoras com associação de

antioxidantes de forma suplementar ou via implante de liberação lenta;

j- Desenvolvimento de técnicas mais sensíveis que sejam capazes de melhor avaliar

o efeito do uso de antioxidantes.

k- Estudo de formas mais eficientes de veiculação da vitamina E e comparação ao

Trolox® (a vitamina E pode ser mais interessante, pois é um antioxidante natural)

Muitas outras linhas de pesquisa em antioxidante podem ser sugeridas, afinal

há ainda uma infinidade de aspectos a serem desvendados a respeito desse tópico,

com destaque para a reprodução animal.

123

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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