UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA … · Tabela 3.1 – Etanol produzido (g/ L)...

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CAMPUS DE BOTUCATU

DETERMINAÇÂO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM DIFERENTES SUBSTRATOS

JULIANO TONIATO

Dissertação apresentada à Faculdade deCiências Agronômicas da UNESP – Campus deBotucatu, para obtenção do título de Mestre emAgronomia (Energia na Agricultura)

BOTUCATU – SP

Agosto – 2013

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CAMPUS DE BOTUCATU

DETERMINAÇÂO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM DIFERENTES SUBSTRATOS

JULIANO TONIATO

Orientador: Prof. Dr. Waldemar Gastoni Venturini Filho

Dissertação apresentada à Faculdade deCiências Agronômicas da UNESP – Campus deBotucatu, para obtenção do título de Doutor emAgronomia (Energia na Agricultura)

BOTUCATU – SP

Agosto - 2013

V

A meus pais, José Mario & Leopoldina,

pelo amor incondicional, carinho e

suporte;

À Inha (Marcela), pela infância maravilhosa

repleta de amor e brigas; pelo cunhadão

Fábio, de quem me orgulho e amo muito

e, à vocês pelo Caio;

À minha vó Alzira (in memorian),

pelo amor incondicional oferecido;

A meus amigos, pelas memórias que me

geraram e que sempre levarei comigo;

A meus desapegos, por me

lembrarem a importância de amar;

E à Deus, pelos milagres, mas acima de tudo

pela possibilidade de ter as

dedicatórias acima.

VI

Todo homem seria covardese tivesse coragem para isso.

(John Wilmot)

VII

AGRADECIMENTOS

À Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu (FCA) da Universidade Estadual

Paulista (UNESP).

À FAPESP pela bolsa concedida, apoio financeiro e técnico.

Ao coordenador da Pós-graduação em Agronomia (Energia na Agricultura) da

Faculdade de Ciências Agronômicas.

Ao professor orientador Waldemar Gastoni Venturini Filho, pela orientação e

ensinamentos transmitidos

Ao prof. Cesar Martins e prof. Pedro Novelli, pela ajuda força, amizade e

ensinamentos.

A todos amigos que me ajudaram nesse trabalho: Jamile Bassetto, Andressa Nogueira,

Fernanda Bronzatto, Bruno da Silva Jubileu, Francine Boesso e Maíra Uliana, um muito

obrigado.

Ao Quadripé, pelos dias homéricos que passamos juntos e, que ainda estão claros

como Cristal em minha memória.

Ao meu grande amigo Bruno Innocenti pela amizade e em segundo, pela ajuda na

obtenção das leveduras junto À LNF-Brasil, e à empresa por ter ajudado.

À Miriam Roberta Henrique e à Usina Açucareira São Manoel pela ajuda e suporte

com material e tempo.

À Márcia Garcia (Técnica Horticultura) por toda ajuda, paciência e conversas.

Aos amigos verdadeiros; por mesmo não tendo seus nomes aqui, ainda saberem o

quanto são importantes.

E à LASPAU, pela ajuda com os próximos passos.

VIII

SUMÁRIO

Página

LISTA DE TABELAS............................................................................................... X

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... XII

LISTA DE EQUAÇÕES........................................................................................... XIII

RESUMO................................................................................................................... 1

SUMMARY............................................................................................................... 4

CAPÍTULO I............................................................................................................. 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS................................................................................. 6

1.1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 6

1.2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................... 7

1.2.1. Leveduras alcoólicas - Saccharomyces cerevisiae............................ 7

1.2.2. Taxonomia........................................................................................... 7

1.2.3. Metabolismo: Fermentação alcoólica e respiração.............................. 8

1.2.4. Fermentação alcoólica........................................................................ 9

1.2.5. Cinética .............................................................................................. 9

1.3. REFERÊNCIAS.............................................................................................. 14

CAPÍTULO II............................................................................................................ 16

VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA

COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE

LEVEDURAS…………………………………..…………………………………... 16

RESUMO................................................................................................................... 16

SUMMARY............................................................................................................... 16

2.1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 17

2.2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 19

2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 22

2.4. CONCLUSÕES.............................................................................................. 29

2.5. AGRADECIMENTOS................................................................................... 29

2.6. REFERÊNCIAS.............................................................................................. 30

IX

CAPÍTULO III.......................................................................................................... 35

ANEXOS................................................................................................................... 36

CAPÍTULO IV.......................................................................................................... 58

CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................... 59

X

LISTA DE TABELAS

Página

CAPÍTULO II............................................................................................................. 16



LEVEDURAS............................................................................................................. 16

Tabela 2.1: Velocidade especifica () a partir da fermentação dos três mostos..... 22

Tabela 2.2. Consumo de açúcar, produção de etanol e quociente respiratório .…… 25

Tabela 2.3. Fatores de conversão paras os mostos testados …………………..……. 27

Tabela 2.4. Caracterização da matéria prima utilizada no preparo dos mostos ......... 28

CAPÍTULO III............................................................................................................ 35

FERMENTAÇÃO DO MELAÇO.............................................................................. 36

Tabela 3.1 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto de melaço…. 36

Tabela 3.2 – Açúcar (g/L) consumido durante a fermentação do mosto de melaço 37

Tabela 3.3 – Biomassa (g/L) produzida durante a fermentação do mosto de

melaço......................................................................................................................... 38

Tabela 3.4 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) produzida

durante a fermentação do mosto de melaço…………………................................. 38

Tabela 3.5 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h) durante a

fermentação do mosto de melaço................................................................................ 39

Tabela 3.6 – Velocidades Instantâneas de produção de Biomassa (g/L.h) durante a

fermentação do mosto de melaço................................................................................ 39

Tabela 3.7 - Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de

etanol (цP), e biomassa (цX) ..................................................................................... 40

Tabela 3.8 – Comparação estatística entre os fatores de conversão calculados a

partir dos dados experimentais.................................................................................... 41

FERMENTAÇÃO DO CALDO DE CANA ……….......………………………… 43

Tabela 3.9 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto caldo de cana 43

Tabela 3.10 – Açúcar consumido (g/L) durante a fermentação do caldo de cana...... 44

XI

Tabela 3.11 – Biomassa produzida (g/L) durante a fermentação caldo de cana......... 45

Tabela 3.12 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h)……………. 46

Tabela 3.13 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h) ...……… 47

Tabela 3.14 – Velocidades Instantâneas de produção de biomassa substrato (g/L.h) 48

Tabela 3.15: Valores de цMax para a consumo de substrato (µS), produção de

etanol (µP), e biomassa (µX) ……….……….………..........................……….…..... 49

Tabela 3.16 – Comparação estatística entre os fatores de conversão referentes à

fermentação do caldo-de-cana. ……….……….……….……….……….……….… 49

FERMENTAÇÃO DO MOSTO MISTO................................................................... 51

Tabela 3.17 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto misto……... 51

Tabela 3.18 – Substrato consumido (g/L) durante a fermentação do mosto misto..... 52

Tabela 3.19 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) durante a

fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……….…... 53

Tabela 3.20 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h) durante a

fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……….…… 54

Tabela 3.21 – Velocidades Instantâneas de produção de biomassa (g/L.h) durante a

fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……………. 55

Tabela 3.22 – Valores de цMax……….……….……….……….……….……….... 56

Tabela 3.23 - Comparação estatística entre os fatores de conversão referentes à

fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……….…..... 56

XII

LISTA DE FIGURAS

Página

CAPÍTULO I...................................................................................................................... 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS.......................................................................................... 6

Figura 1.1. (A) representação linear das fases do crescimento e (B) representação

semilogarítmica................................................................................................................... 11

Figura 1.2: Curvas típicas da variação das concentrações dos componentes de uma

fermentação……................................................................................................................. 12

CAPÍTULO II..................................................................................................................... 15

VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A

PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS……….................... 16

Figure 2.1: Ethanol production (g L-1) during the 10 hours of experiment……………… 23

Figure 2.2: Sugar consumption (g L-1 ) during the 10 hours of experiment……………... 24

Figure 2.3: Biomass production (g L-1 ) during the 10 hours of experiment…………….. 26

CAPÍTULO III.................................................................................................................... 35

FERMENTAÇÃO DO MELAÇO...................................................................................... 36

Figura 3.1 –Planilha do Excel utilizada para o cálculo das velocidades específicas.......... 40

Figura 3.2 – Representações gráficas dos dados obtidos durante a fermentação do

melaço................................................................................................................................ 42

FERMENTAÇÃO DO CALDO DE CANA...................................................................... 39

Figura 3.3 – Representações gráficas dos dados obtidos durante a fermentação do caldo

de cana................................................................................................................................ 50

FERMENTAÇÃO DO CALDO DE MOSTO MISTO...................................................... 51

Figura 3.4 – Representações gráficas dos dados obtidos durante a fermentação do caldo

de cana............................................................................... ................................................ 57

XIII

LISTA DE EQUAÇÕES

Página

CAPÍTULO I.............................................................................................................. 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS.................................................................................. 6

Equação 1.1: Cálculo das velocidades instantâneas de consumo de substrato,

produção de etanol e biomassa ................................................................................... 12

Equação 1.2. Cálculo das velocidades especificas de consumo de substrato,


Equação 1.3. Fator de conversão de substrato em produto……...................................... 13

Equação 1.4. Fator de conversão de substrato em Biomassa….................................. 13

Equação 1.5: Tempo de geração característico de cada cepa .................................... 13

CAPÍTULO II............................................................................................................. 16



LEVEDURA............................................................................................................... 16

Equação 2.1. Cálculo das velocidades instantâneas de consumo de substrato,


Equação 2.2. Cálculo das velocidades especificas de consumo de substrato,


Equação 2.3. Cálculo dos fatores de conversão .......................................................... 21

Equação 2.4. Cálculo dos fatores de conversão .......................................................... 21

Equação 2.5. Quociente respiratório........................................................................... 21

Equação 2.6. Equação de Boltzmann.......................................................................... 21

1

RESUMO

O etanol é um combustível verde que além da influência na econômica possui grande

impacto social, político e ambiental. O objetivo deste trabalho foi descrever a cinética

fermentativa e o rendimento de quatro linhagens de leveduras na fermentação em três mostos

compostos de melaço, Caldo de cana e misto de melaço e caldo de cana. As linhagens

escolhidas foram BG-1, CAT-2 e PE-2 (de destilarias) e UNIFERM (levedura seca de

panificação. A fermentação ocorreu em triplicada e a cada hora foram medidos o teor de

açúcares redutores, etanol e massa celular. A linhagem BK foi a que apresentou maior

velocidade de produção de etanol e consumo de substrato. CAT-1 foi a que mais produziu

etanol. As duas linhagens formam o grupo das rápidas enquanto as linhagens PE-2 e BG-1

foram as que apresentaram as menores velocidades ficando no grupo das lentas. PE-2

apresentou dois dos maiores fatores de conversão YP/S enquanto a BG-2 tendeu a consumir

substrato por vias aeróbicas. Os parâmetros cinéticos não puderam descrever o rendimento,

2

uma vez que estão ligados à velocidade, eles estão fortemente associadas à formação e

densidade da espuma.

Palavras-chave: fermentacao, cinetica, etanol, sacarose.

3

SPECIFIC VELOCITY AS A TOOL TO COMPARE PERFOMANCE OF FOUR STRAINS

OF ALCOHOLIC YEAST Botucatu, 2013. 50p. Dissertacao (Mestrado em

Agronomia/Energia na Agricultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade

Estadual Paulista.

Author: JULIANO TONIATO

Adviser: WALDEMAR GASTONI VENTURINI FILHO

SUMMARY

Ethanol is a greenhouse-friendly fuel with immense social, political and environmental

impact. Our objective was to describe fermentative performance and yield for four yeast

strains from Brazilian ethanol plants during the fermentation of three types of must - molasses,

Sugar cane and mixed must (sugarcane and molasses). We used BG-1, CAT-2 e PE-2 (ethanol

plant strains) e UNIFERM (dry baker’s yeast). Fermentations were carried in triplicates. Each

hour we collected and analyzed samples for reducing sugars, ethanol and biomass. Yeasts

were split into two groups fast and slow fermenters. For the fast fermenter BK has shown the

4

highest speed values for both substrate consumption and ethanol production while CAT-1 had

the highest ethanol yield. For the slow fermenter PE-2 had two of the greatest YP/S factors

while BG-1 tended to use sugar through aerobic pathways. Kinetic parameters could not be

related to ethanol yielding although, they are directly connected to foam formation and its

characteristics.

Keywords: fermentation, Kinect, ethanol, sucrose

5

CAPÍTULO I

6

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

1.1 INTRODUÇÃO

Atualmente o petróleo fornece aproximadamente 1/3 da energia primária consumida no

mundo, sendo considerada a principal fonte energética, desde o bem estar pessoal até o

desenvolvimento industrial, e a prestação de serviços. Assim alterações no suprimento ou no

uso do petróleo teriam desdobramentos econômicos, políticos e sociais importantes para a

maior parte das nações do mundo. Devido à combustão crescente de combustíveis fosseis

iniciada à 60 anos, nota-se uma escassez e o aumento do preço desta fonte não renovável de

energia. Portanto essas alterações que estão sendo gradualmente intensificadas exigem

mudanças nos padrões industriais e de consumo da sociedade humana, de forma a reduzir a

emissão de gases do efeito estufa. (PEREIRA et al., 2008)

Uma das opções é o bioetanol, um excelente substituto para a gasolina que é o

principal combustível renovável usado em automóveis no mundo (HISS, 2001). No Brasil, o

etanol, produzido da cana-de-açúcar, já substitui hoje metade da gasolina que seria consumida

7

e seu custo é competitivo sem os subsídios que viabilizaram o programa no seu início, o

Proálcool. Além disso, desde os tempos do Brasil colônia, a cultura da cana-de-açúcar tem

sido uma grande fonte de riqueza para a economia brasileira (SCHNEIDER. et al., 2012).

Hoje, o Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e etanol com crescente

aumento na produção. No primeiro semestre de 2012 foram exportados mais de 595 mil litros

e em 2011 foram exportados mais de 2 milhões de litros (UNICA, 2012).

1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.2.1 Leveduras alcoólicas - Saccharomyces cerevisiae

A levedura S. cerevisiae é a responsável pela produção do etanol através da fermentação

no Brasil. O processo utiliza a sacarose proveniente da cana-de-açúcar, na forma de caldo de

cana e melaço, como substrato para fermentação. Durante os processos de fermentação

industrial, as leveduras passam por diversas formas de stress (BATISTOTE et al., 2011 e

BROSNAN et al., 2000 assim as cepas de S. cerevisiae utilizadas como inóculos nas usinas

devem apresentar elevada velocidade de fermentação, bom rendimento de conversão de substrato

para etanol e células, resistência aos elevados teores alcoólicos e resistência à elevada temperatura

de fermentação.

1.2.2 Taxonomia

A levedura alcoólica Saccharomyces cerevisiae pertence ao Filo Ascomycota, Classe

Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales, Família Saccharomycetaceae, gênero

Saccharomyces (SUH e BLACKWELL, 2006). Elas têm passado por inúmeras mudanças

desde a sua descoberta, há 150 anos. Quando a primeira publicação sobre taxonomia de

leveduras foi compilada por Guilliermond, em 1912, o gênero Saccharomyces compreendia 46

espécies divididas em seis grupos separados de acordo com a atividade fermentativa sobre os

açúcares. Atualmente, de acordo com a última revisão taxonômica, 14 espécies são aceitas

dentro do gênero Saccharomyces, as quais estão classificadas em três grupos previamente

estabelecidos por van der Walt. (GUIMARÃES et al., 2006)

8

1.2.3 Metabolismo: fermentação alcoólica e respiração

Os fungos, reino aos quais as leveduras pertencem, são seres que não possuem

maquinária autotrófica; produzem energia através de fontes externas (TRABULSI, 2008). As

leveduras alcoólicas metabolizam anaerobicamente o açúcar, para gerar energia (ATP) que

será empregada na realização de diversos trabalhos fisiológicos (absorção, excreção e outros) e

biossíntese necessários à manutenção da vida, crescimento e multiplicação, para perpetuar a

espécie. O etanol e o CO2 resultantes se constituem tão somente de produtos de excreção

(TORIJA, 2003).

A degradação do açúcar até etanol e gás carbônico envolve 12 reações em seqüência

ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica. Inicialmente, a sacarose, que é um

dissacarídeo, se hidrolisa na presença da enzima invertase, produzindo os monossacarídeos

glicose e frutose. A seguir, sob ação de outras enzimas, os monossacarídeos são fermentados,

produzindo o etanol com a liberação de gás carbônico, o que pode ser expresso

matematicamente pela equação química simplificada de Gay Lussac:

C12H22O11 + H2O 2 C6H12O6

C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 23,5 kcal

Furletti (1987) descreve um comportamento típico das leveduras alcoólicas. A

fermentação tende a acontecer em anaerobiose devido ao efeito Pasteur. Nessa situação ocorre

a inibição da fermentação alcoólica devido à presença de oxigênio, sob condições específicas

de meio. A aeração do mosto faz com que a levedura tenda a oxidar os carboidratos por

respiração. Com isso, a produção de álcool diminui e a multiplicação da levedura é favorecida.

Outro caso especial acontece em presença de altas concentrações de glicose e oxigênio.

Nessa situação a célula pode fermentar em vez de respirar. Esse comportamento metabólico é

provocado por um efeito conhecido como Crabtree ou repressão catabólica. Esse efeito se faz

presente em condições onde a concentração de glicose ultrapassa um valor limite

9

(CARVALHO et al., 2007). Thomson et al. (2005) confirma essas informações dizendo que a

alta concentração de glicose acelera a glicólise, com produção de quantidades de ATP pela

fosforização do substrato. Esse mecanismo reduz a necessidade da fosforilação oxidativa,

diminuindo no final da via a necessidade de oxigênio. O autor afirma que esse fenômeno

surgiu de mecanismos de competição derivados da natureza antisséptica do etanol.

1.2.4 Fermentação alcoólica

A fermentação alcoólica é fortemente afetada vários fatores como, por exemplo, os

químicos (açúcar, oxigênio, pH, minerais, vitaminas), físicos (temperatura, agitação) e

biológicos (bactérias contaminantes e leveduras selvagens).

Um dos fatores de maior importância é a temperatura de fermentação. Embora as

leveduras alcoólicas sejam organismos que crescem em diferentes temperaturas, a fermentação

pode ocorrer dentro de uma faixa de 10°C até 35°C. Em temperaturas maiores que 40ºC as

células começam a se tornar inviáveis (ANGELIS, 1987). Dentro deste intervalo, quanto

maior a temperatura, maior será a velocidade do processo fermentativo, sendo também maior a

formação de produtos secundários a fermentação (KLEIN, 2006).

TORIJA et al. (2003) diz que com o aumento da temperatura há maior formação de

metabólitos secundários como o glicerol, ácido acético e ácido succínico. Gutierrez (1993)

também mostrou que com o aumento de temperatura e da concentração de sacarose ocorreu

maior formação de álcool isoamílico pelas leveduras estudadas.

1.2.5 Cinética

Na fermentação alcoólica, os substratos (açúcares) são transformados em produtos

(etanol), e parte da energia (ATP) gerada é usada para a produção de biomassa (células).

Assim, as concentrações de substrato (açúcar), produto (etanol) e células (levedura) variam

com o tempo da fermentação. Hiss (2001) define a variação dessas concentrações como

cinética química do sistema.

10

Após a inoculação da levedura em um meio de cultura favorável ao seu crescimento,

observa-se um comportamento característico dos valores de concentração celular, que

didaticamente é dividida em fases (GRETSCHMANN 2009 e HISS, 2001):

- Fase 1: latência, que segue imediatamente à inoculação do meio com o microorganismo

(Saccharomyces cerevisiae). Trata-se de um período de adaptação durante o qual a

célula sintetiza as enzimas necessárias ao metabolismo dos componentes do meio.

Durante esta fase não há reprodução celular;

- Fase 2: transição, onde se observa o início da reprodução microbiana propriamente dita,

havendo um aumento gradual da velocidade de crescimento;

-Fase 3: logarítmica ou exponencial, em que a velocidade de crescimento é máxima;

-Fase 4: linear de crescimento, com velocidade de reprodução constante;

-Fase 5: desaceleração, devido ao esgotamento do meio de cultura e ao acúmulo de inibidoes,

em que a velocidade de crescimento diminui até se anular;

-Fase 6: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se

mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o

número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem.

-Fase 7: declínio ou lise, a taxa de morte é maior que a taxa de produção de novas células.

A Figura 1.1 representa de maneira linear e semilogarítmica as fases do crescimentodas leveduras de acordo com Hiss (2001).

11

Figura 1.1 - Parte superior (A), a representação linear das fases do crescimento e na parte inferior (B), a

representação semilogarítmica (Fonte: HISS (2001).

Para estudos cinéticos, Nascimento et al. (2009) e Hiss (2001) recomendam o

acompanhamento dos itens de acordo com os seguintes critérios. Como substrato, chamado de

“S” elege-se o composto que limita a reação; como produto, o de interesse econômico

(chamado de “P”), e finalmente X, como a concentração do microorganismo, chegando-se

assim à S=glicose, P=Etanol e X=Levedura.

A Figura 1.2 é a representação clássica da variação das concentrações de substrato,

produto e células em função do tempo de fermentação.

12

Figura 1.2: Curvas típicas da variação das concentrações dos componentes de uma fermentação, onde S, X, P,

representam substrato, levedura e produto respectivamente e S0, X0 seus valores iniciais (HISS (2001).

É possível comparar quantitativamente as diferentes condições de cultivo através da

diferença entre as concentrações finais e iniciais (denominadas dX, dP e dS).

Dividindo-se esses valores pelo tempo gasto (dt tendendo à zero) temos as velocidades

instantâneas de transformação (“r”) descritas pelas equação 1.1, abaixo. Os autores chamam de

rX, rS e rP de produtividade de produção de biomassa, de consumo de substrato e produção de

produto respectivamente (HISS, 2001).

(1.1)

Devido ao fato de X (concentração celular) variar como tempo e como conseqüência a

concentração do complexo enzimático responsável pela conversão S-P, Gaden (1955) sugeriu

a normalização pelas velocidades especificas “µ” de crescimento, consumo de substrato e de

formação de produto, descrito pelas equação (1.2) a seguir.

(1.2)

O rendimento também pode ser chamado de fator de conversão de substrato em

produto (YP/S). Os calculo foi sugerido por Ribeiro e Horii (1999) descrito na fórmula 3.

13

(1.3)

O autor também sugeriu o fator de conversão de substrato em biomassa (fórmula 4).

(1.4)

Hiss (2001) ainda descreve que a fase exponencial de crescimento também tem como

característica o tempo de geração tg, ou seja, o tempo necessário para que o valor da

concentração celular dobre (logo X = 2Xi)

Assim,

ou (1.5)

1.3 Referências bibliográficas

ANGELIS, D.F. Leveduras. In: _________ (Org): Microbiologia da fermentação alcoólica.

Rio Claro: UNESP, 1987. p.41-62.

BATISTOTE, M. et al. Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. Ciência e

Natura, Ufsm, v. 2, n. 32, p.83-95, 2010.

BROSNAM, M. P. et al. The estress response is repressed during fermentation in brewery

strains of yeast. Revista Analytica, United Kingdom, v. 88, n. 5, p.746-755, 2000. doi:

10.1046/j.1365-2672.2000.01006.x.

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14

FURLETTI, M.E.M. Fatores físicos químicos que interferem na fermentação alcoólica. In:

DEANGELIS, D.F. (Org). Microbiologia da Fermentação Alcoólica. Rio Claro: UNESP,

1987, p.72-79.

GADEN, E.J. Fermentation kinectics and productivity. Chem. Ind., v.12, p.154-159, 1955.

GRETSCHMANN, A.S. Ajuste de curvas na produção de etanol num processo em

batelada. In: X ENCONTRO GAÚCHO DE EDUCAÇÃO MATEMÁTICA, 10., 2009, Ijui:

Anais... Ijui: Trabalhos X EGEM. 2009. Disponível em:

<http://www.projetos.unijui.edu.br/matematica/cd_egem/fscommand/CC/CC_61.pdf > .

Acesso em : 22 abril. 2013.

GUIMARÃES, T.M. et al. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae strains

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p.119-126, 2006.

GUTIERREZ, L.E. Produção de álcoois superiores por linhagens de saccharomyces durante

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HISS, H. Cinética de processos fermentativos In: SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.;

AQUARONE, E.; BORZANI, W.R (Coord.) Biotecnologia Industrial. São Paulo: Edgard

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KLEIN, T. Avaliação de aromas característicos produzidos por diferentes

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– CentroFederal de Educação tecnológica de Bento Gonçalves, Bento Gonçalves, 2006.

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15

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composition for fuel ethanol production and the context of biorefinery. v.2 Rio de Janeiro:

Ed. Amiga Digital Ufrj, 2008. 45 p. (Biotechnology).

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16

CAPÍTULO II

16

VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A

PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS DURANTE A

FERMENTAÇÃO DE MOSTOS FEITO DE MELAÇO, CALDO DE CANA E MISTO.

RESUMO

Nosso objetivo foi comparar e descrever o comportamento cinético de quatro linhagens

utilizadas nas usinas durante a fermentação do mosto misto de melaço e caldo de cana. Nós

utilizamos as linhagens CAT-1, PE-2 e BG-1 (usinas) e fermento seco de panificação (marca

UNIFERM). As leveduras foram testadas em triplicatas. Amostras foram coletadas a cada

hora e analisadas quanto ao teor de açúcares redutores, etanol e biomassa. CAT-1 teve a maior

produção de etanol e fator (YP/S), entretanto a linhagem BK apresentou as maiores velocidades

(rs, rp, s and p). BG-1 apresentou os altos valores de QR, logo bom crescimento celular, PE-2

não acabou a fermentação. Apesar dos valores s and P não estarem relacionados com a

17

produção de etanol e com os fatores de conversão, os parâmetros estão diretamente

correlacionados com a formação e características da espuma formada.

ABSTRACT

Since Pasteur yeast selection is used as technique for detecting strains with certain properties.

Nowadays, some strains have been already isolated from Brazilian ethanol plants. Our

objective was to describe and compare kinetic behavior of four strains used in Brazilian

ethanol plants during the fermentation of musts made of sugar cane, molasses and mixed must

of sugarcane juice and molasses and check whether specific velocity () is a good tool to

compare yeasts’ performance. We used BG-1, CAT-2 e PE-2 (ethanol plant strains) and BK

(dry baker’s yeast). Fermentations were carried in triplicates. We collected samples each hour

and then, analyzed them for reducing sugars, ethanol and biomass. CAT-1 and BK are fast

fermenters, BK was the fastest fermenter with the greatest velocities (rs, rp, s and p) while

CAT-1 had the greatest ethanol yield and substrate conversion in two musts (YP/S) and the

second highest s and s. Yet, BG-1 tends to show high QR, thus good growth and PE-2 didn`t

finish the process. s and P values were not related to ethanol yielding and substrate

conversion, although these parameters seem to have a direct correlation to foam formation and

density.

2.1 INTRODUÇÃO

O etanol exerce grande influência na economia, sociedade e meio ambiente. O brasil

produziu mais de 23 bilhões de litros durante a safra 2011/2012, o que representa U$48

bilhões do BIP, injetando em média U$23 milhões na economia (UNICA, 2013 e REYNOL,

2009). O setor representa 6% de todos os empregos da agroindústria (VILAÇA; PINTO,

2011). Além disso, o etanol de cana é altamente competitivo com o milho (LEITE, 2005).

O etanol é produzido durante a fermentação, nesse processo a levedura Saccharomyces

cerevisiae assimila açúcar para produzir energia (ATP) e eliminando etanol e CO2 como

produto (BRANDÃO et al., 2007). Entretanto, sob condições especificas a levedura pode

18

oxidar o substrato na presença de oxigênio produzindo menos etanol; é o efeito Pasteur, um

importante fator nas fermentações industriais.

O processo de produção de etanol, no Brasil, se utiliza principalmente da sacarose do

caldo de cana e/ou melaço (BATISTOTE et al. 2010). Várias técnicas pode ser empregadas na

obtenção do caldo, por exemplo, esmagamento mecânico ou difusão (ALCARDE et al., 2012

e MENEGUETTI et al., 2011), enquanto melaço é o resíduo da centrifugação durante a

processo de produção do açúcar, e por essa razão mais impuro (MACHADO, 2012 e PAYNE,

1989).

A linhagem da levedura, juntamente com a composição do mosto, exercem importante

papel na produção enzimática responsável pela fermentação. Diferentes perfis podem, por

exemplo, aumentar a produção de componentes de crescimento celular (ácido nucleico e

proteínas), enquanto outros podem ser de caráter adaptativo, o que de certa maneira, interfere

na no etanol produzido. (BRANDÃO et. al., 2007; GUIMARÃES et al., 2006 e LIMA et al.,

2001). Temperatura, pH e vitaminas do mosto também desempenham papel importante na

fermentação (BRANDÃO et al., 2007 e THOMSON 2005).

Quando Pasteur (1866) notou que o tipo de levedura utilizado na produção de vinhos

eram responsáveis por determinadas características, ele iniciou a busca por linhagens que

culminariam em técnicas, em sua maioria dispendiosas, que permitem marcar linhagens e as

escolher por suas características (SUÁREZ-LEPE, MORATA, 2012 e SUÁREZ-LEPE,

IÑIGO, 2004). Recentemente, Basso et al. (2008) mostrou que as técnicas resultam em

linhagens como as CAT-1, PE-2, BG-1, SA-1 e Y904. Não coincidentemente, Batistote et al.

(2010) relatou que dentre essas linhagens, Catanduva 1 (CAT-1), Pedra 2 (PE-2), Barra

Grande 1 (BG-1) e o fermento de panificação são as mais utilizadas pelas usinas

sucoenergéticas do Brasil.

Hiss (2001) afirmou que uma ferramenta para comparar as leveduras é através da

cinética. Por tudo isso, nosso objetivo foi descrever e comparar os parâmetros cinéticos de três

linhagens comerciais de leveduras e a de panificação durante a fermentação de três diferentes

tipos de mosto.

19

2.2 MATERIAIS E MÉTODOS.

Foram comparadas quarto linhagens de leveduras – uma linhagem de panificação (BK)

e três marcas comerciais utilizadas em usinas no Brasil.

As marcas comerciais foram CATANDUVA (CAT-1), BARRA GRANDE (BG-1) e

USINA DA PEDRA (PE-2), uma vez que elas são as mais utilizadas nas destilarias

(BATISTOTE et al. 2010); UNIFERM (BK) foi escolhida como a de panificação por ser

facilmente encontrada em panificadoras e estabelecimentos comerciais.

O mosto, com 15ºBrix, foi obtido após a diluição em água da matéria prima. No caso

do mosto misto, o caldo de cana e o melaço foram diluídos separadamente, seguidos da

homogeneização e checagem do ºBrix. O teor de solido solúveis (ºBrix) foi checado em

refratômetro digital. Pol, pH e pureza foram analisados e calculados de acordo com

Copersucar (2001) e Brasil (2005).

Cada linhagem foi fermentada em triplicata perfazendo um total de 36 parcelas

experimentais. Cada parcela consistia em 5 litros do respectivo mosto inoculados na proporção

de 10% (m/m) – os volumes foram calculados em pré-teste de maneira que após as 11 coletas,

permanecesse um volume de no mínimo 90% do original e o processo se encerrasse dentro de

10 horas. As fermentações ocorreram em béqueres de 11 litros em temperatura ambiente.

Foram coletadas amostras horárias seguidas de congelamento com nitrogênio líquido.

A técnica permitiu o processamento de amostras simultâneas, entretanto a formação de cristais

influencia a viabilidade e possivelmente a quantificação da biomassa, Shi et al. (2013) provou

que o congelamento à -18ºC pode diminuir em 50% a viabilidade, além disso, a viabilidade

após a liofilização pode ser menor que 0,1% (BERNY; HENNEBERT, 1991).

Análises químicas

Após serem descongeladas, as amostras foram analisadas para açúcares redutores (AR), etanol

e biomassa, de acordo com os seguintes protocolos.

Açúcares redutores – Método colorimétrico através da oxidação com o ácido

dinitrosalicílico (DNS), descrito por Miller (1959) e adaptado por Lopes et al. (2010)

20

Etanol – Oxidação do etanol pelo dicromato de potássio descrito por Joslyn (1970)

Biomassa – Método gravimétrico descrito por Cooney (1981).

Parâmetros cinéticos

Velocidade instantânea.

Velocidade Instantânea “r” é a velocidade medida em um determinado instante. A

equação 1 (mostra os cálculos aonde “rS” é a velocidade instante na de consumo de

substrato; “rP” é a velocidade instantânea de produção de etanol e r é a velocidade

instantânea do crescimento celular.

(1)

Velocidade especifica “”

As velocidades instantâneas são importantes ferramentas na descrição da performance

em condições especificas entretanto, ela não é suficiente para comparar e descrever diferente

mostos e diferentes concentrações de inóculo – a quantidade de complexo enzimático

responsável pela fermentação varia, o que afeta diretamente a transformação S-P. É possível

normalizar as taxas, dividindo-se os valores de “r” pela sua biomassa correspondente. O

resultado é conhecido como velocidade especifica () descrita na fórmula 2 (GADEN, 1955).

(2)

Ribeiro e Horii (1999) relataram que os valores de são maiores na fase exponencial

do crescimento microbiano, e que em muitos estudos o parâmetro pode ser chamado de MAX

ou m.

21

Fator de conversão

Gretschmann (2009) descreve como o substrato consumido é convertido em produto e

biomassa nos chamados fatores de conversão, sendo YP/S o fator de conversão de substrato em

produto (equação 3) e YX/S o fator de conversão de substrato em biomassa (equação 4).

(3)

(4)

Coeficiente respiratório

Kocková-Kratochvílová (1990) reporta que a relação entre fermentação e respiração

pode ser expressa pelo quociente respiratório (QR) cujo valor varia com o tipo de levedura. A

equação 5 permite afirmar que quanto maiores as condições de anaerobiose maior será o valor

de QR (FERNANDES, 2008 e KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1990).

No presente trabalho, o quociente respiratório foi calculado a partir dos valores

experimentais de açúcar e dos valores de CO2 e O2 obtidos a partir de cálculos

estequiométricos.

(5)

Análise estatística

Os dados foram plotados e analisados através do programa estatístico OriginPro

(versão 8, OriginLab). As curvas foram ajustadas utilizando a equação de Boltzmann para

ajustes sigmoides como descrito na equação 6.

(6)

22

2.3.RESULTADOS E DISCUSSÃO

De acordo com os parâmetros cinéticos (tabela 1) as leveduras puderam ser divididas

em dois grupos – rápidas e lentas.

Tabela 2.1: Velocidade especifica máxima para os três mostos

testados.

BG-1 PE-2 CAT-1 BK

µS – melaço 0.38 0.27 0.48 0.56

µP – melaço 0.12 0.07 0.17 0.25

µX – melaço 0.06 0.02 0.03 0.01

µS – caldo de cana 0.08 0.09 0.15 0.21

µP – caldo de cana 0.22 0.24 0.36 0.84

µX – caldo de cana 0.01 0.01 0.02 ---

S – misto 0.19 0.24 0.37 0.51

P – misto 0.07 0.07 0.16 0.22

X – misto 0.02 0.01 0.05 0.03

Velocidades especificas máximas para consume de substrato

(µS), produção de etanol (µP) e crescimento celular (µX) para os

mostos feitos de “melaço”, “caldo de cana” e “misto”, não foi

possível detectar crescimento na linhagem BK durante a

fermentação do mosto de caldo de cana.

No grupo das rápidas estão as leveduras que apresentam altos valores de S e P e

logo, os menores tempos de fermentação. BK foi a mais rápida das quatro quanto as

velocidades de consumo de substrato e produção de etanol – a fermentação havia se completou

entre as 3 primeiras horas de experimento (figura 1 e 2).

igure 1

23

Figura 1: Produção de etanol em (g L-1) durante as 10 horas de experimento.

Na figura a seguir as concentrações estão em g L-1 e o tempo em horas, as curvas como

esperados foram inversamente proporcionais ao consumo de substrato encontrado na figura 1,

sendo as maiores velocidades de produção de etanol no intervalo de hora posterior ao das

24

maiores velocidades de consumo de substrato.

1

1

Figura 2: Consumo de açúcar (g L-1) durante as 10 horas de experimento.

25

CAT-1 é a outra linhagem do grupo das rápidas sendo que a fermentação acabou por

volta da quinta hora. Mesmo estando em Segundo nos valores cinéticos de S e P, a levedura

apresentou a maior produção absoluta de etanol nos três motos testados (tabela 2).

Silva (2011) chama o grupo de Tumultuosa e mostra outra característica desse tipo de

fermentação – para o autor toda a produção e liberação de CO2 e calor estão concentradas na

fase exponencial e consequentemente na espuma. Usinas cujo tempo é um fator importante e

que estão preparadas para o calor e espuma formados podem se beneficiar das leveduras desse

grupo.

No grupo das lentas estão as linhagens BG-1 e PE-2. PE-2 apresentou a maior

quantidade de açúcar residual após as dez horas de experimento, por outro lado apresentou os

maiores valores de conversão (yP/S) em dois dos três mostos testados (tabela 3). Conclui-se que

Tabela 2.2 Consumo de açúcar (g), produção de etanol (g) e quociente respiratório dos

três mostos testados.

BG-1 PE-2 CAT-1 BK

ΔS – melaço 108.13 105.16 107.61 106.58

Etanol – melaço 39.23 46.14 46.21 44.76

QR – melaço 2.92 4.27 4.00 3.78

ΔS – caldo de cana 106.17 81.01 109.47 108.11

Etanol – caldo de

cana 36.22 31.38 40.75 38.45

QR – caldo de cana 2.22 2.77 2.37 2.66

ΔS – misto 98.17 97.11 99.44 103.92

Etanol – misto 38.03 31.38 40.75 37.70

QR – misto 2.80 2.16 3.22 2.49

TA – Etanol total em g: ΔS açúcar residual após as 10 horas de fermentação e QR

quociente respiratório.

26

a fermentação não havia acabado e que respeitado sua velocidade, ela poderia produziria

quantidades satisfatórias de etanol. No gráfico isso é verificado pela baixa inclinação da curva.

Figura 3: Produção de células (biomassa em g L-1) durante as 10 horas de experimento.

27

Tabela 2.3: Fatores de conversão após as 10 horas de fermentação.

BG-1 foi a quarta levedura testada e a que apresentou os menores valores de S e P,

até três vezes menor que os de BK. Os valores de QR e de etanol produzidos indicam que a

levedura foi quem mais utilizou substrato por vias aeróbicas, o que explica os fatores de

crescimento YX/S e o crescimento celular (figura 3). Leveduras secas são utilizadas na

alimentação animal há mais de seis décadas. Thrune et al. (2009) observaram que o uso da

levedura triplicou nos últimos 10 anos nos Estados Unidos, passando de 16,9 para 50,8% o

número de produtores que utilizam a levedura como fonte de aditivo alimentar no rebanho

leiteiro. Além disso, os processos tradicionais de propagação de leveduras requerem entre 8 e

15 dias, chegando a 30 dias em alguns casos. Esses fatores reforçam a importância da

linhagem para as empresas que comercializem a levedura seca.

Batistote et al. (2010) encontraram o mesmo desempenho em três linhagens de

destilarias durante a fermentação do caldo de cana. Entretanto, em seu experimento BK foi a

de menor desempenho cinético e em produção de etanol – a marca comercial de levedura de

panificação pode ser uma possível explicação.

Pavlak et al. (2011) por outro lado achou maiores valores de YP/S, entretanto o autor

usou hidrolisado de batata doce como mosto – Muitos fatores podem influenciar a cinética dos

hidrolisados fazendo a diferir da do mosto de cana de açúcar. Dentre as diferenças que

podemos citar estão pH, a presença de inibidores como ácidos fracos (ácido acético), furfural,

BG-1 PE-2 CAT-1 BK

Y P/S – Melaço 0.36 0.44 0.43 0.42

Y X/S – Melaço 0.12 0.05 0.05 0.04

Y P/S – Caldo de

cana 0.34 0.39 0.37 0.36

Y X/S – Caldo de

cana 0.04 0.06 0.04 -

Y P/S - Misto 0.39 0.32 0.41 0.36

Y X/S - Misto 0.08 0.04 0.08 0.05

28

hidroximetil furfural e componentes fenólicos (ANDRADE et al., 2013; LI et al., 2011 e

ALMEIDA et al., 2009).

Alcarde et al. (2012) mostrou outro fator que pode explicar essas diferenças, o autor

afirma que a microbiologia é um importante fator e que juntamente com as características

físico-químicas do mosto podem afetar fortemente a formação de metabolitos secundários. A

tabela 3 está de acordo com essas informações - o melaço apresenta baixa pureza, o que

representa menos açúcares e mais componentes solubilizados, além disso, a maturação da cana

no experimento 2 (15,6 ºBrix) pode ter influenciado a capacidade fermentativa do

mosto(ALCARDE et al. 2012 e Rodrigues 1995).

Tabela 2.4: Caracterização da matéria prima usada no prepare

dos mostos.

ºBrix pol pureza pH

Melaço 79.13 11.40 69.00 6.06

Caldo de cana 15.60 11.50 74.00 5.43

Misto – Caldo de cana 20.1 17.8 88.50 5.54

Misto - Melaço 86.00 4.60 53.20 6.26

ºBrix (ºBrix), pol (g L-1), pureza (%) e pH da material prima

empregada no prepare do mosto.

As curvas ajustadas de nosso experimento (figuras 1 e 2) seguem o padrão sigmoide de

crescimento microbiano (HISS, 2001). Nesta curva, a fase exponencial representa a taxa mais

rápida de metabolismo que a levedura pode apresentar, o que pode ser numericamente

representado pelos valores de “”. Além disso, o metabolismo consiste em fermentar a fonte

de carbono em etanol, calor e crescendo com a energia necessária. Durante nosso experimento

BK e CAT-1 apresentaram os maiores valores S e P e consequentemente, a maior produção

de CO2; em consonância, BK e CAT-1 apresentou as maiores quantidade desde espuma

formada, sendo esta espessa e resistente à quebra mecânica. Adicionalmente, BG-1 e PE-2

produziram muito menos espuma sendo essa menos espessa e menos resistente à quebra. Por

29

tudo isso é possível concluir que as velocidades especificas máximas estão diretamente

associadas à espuma e suas características.

2.4.CONCLUSÃO

As leveduras puderam ser divididas em dois grupos de acordo com a velocidade e

tempo de fermentação.

CAT-1 e BK estão no grupo das rápidas – usinas que o tempo é um importante fator e

que estão preparadas para a espuma e o calor formado, associados à altos valores de ,

podem se beneficiar das linhagens

Além disso, BK foi a linhagem que apresentou a maior velocidade especifica de

consume de substrato e produção de etanol em todos os mostos testados enquanto CAT-1 foi a

que apresentou a maior produção de etanol

BG-1 e PE-2 são fermentadoras lentas por apresentarem valores de até três vezes

menores que os de BK. A espuma e o calor formados seguiram a tendência.

Ainda, PE-2 apresentou dois dos três maiores fatores de conversão de substrato em

etanol, mesmo a fermentação não tendo se completado após as dez horas.

BG-1 apresentou as menores velocidades de consume de substrato e produção de

etanol, entretanto ela apresentou altos valores de coeficiente respiratório o que pode ser um

indicativo para usinas que vendam levedura seca para a alimentação animal.

Pela análise dos dados, as velocidades instantâneas e especificas não puderam ser

relacionadas com a produção de etanol, entretanto elas foram diretamente proporcionais à

espuma e suas características.

2.5. AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP – processo nº 2010/14318-7) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES).

30

2.6. REFERÊNCIAS

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34

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abr. 2013.

35

CAPÍTULO III

36

3.1 - Tabelas da fermentação do Melaço

Tabela 3.1 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do

mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das

curvas pelo programa Origin

Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 4,46 4,81 8,78 16,25

2 9,12 8,84 20,12 30,73

3 16,71 13,02 30,48 39,03

4 25,72 17,37 37,71 42,64

5 33,13 21,87 41,84 44,02

6 37,59 26,55 43,94 44,52

7 39,79 31,40 44,95 44,69

8 40,77 36,44 45,42 44,76

9 41,19 41,65 45,63 44,78

10 41,36 47,06 45,73 44,79

37

Tabela 3.2 – Açúcar (g/L) consumido durante a fermentação do

mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das

curvas pelo programa Origin.


0 113,03 113,78 113,14 114,10

1 34,41 28,60 33,06 22,55

2 13,76 14,19 11,98 4,12

3 8,34 11,76 6,43 2,00

4 6,91 11,34 4,97 1,78

5 6,54 11,28 4,59 1,75

6 6,44 11,26 4,49 1,75

7 6,41 11,26 4,46 1,75

8 6,41 11,26 4,45 1,75

9 6,40 11,26 4,45 1,75

10 6,40 11,26 4,45 1,75

38

Tabela 3.3 – Biomassa (g/L) produzida durante a fermentação do mosto de melaço. Osvalores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.


0 65,05 65,03 65,00 65,97

1 65,25 65,08 65,01 66,70

2 66,23 65,21 65,17 67,66

3 69,65 65,57 67,01 68,66

4 74,78 66,36 70,21 69,47

5 77,35 67,58 70,73 69,99

6 77,99 68,74 70,76 70,30

7 78,12 69,42 70,76 70,45

8 78,15 69,72 70,76 70,53

9 78,15 69,83 70,76 70,57

10 78,15 69,87 70,76 70,59

Tabela 3.4 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) produzida

durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os valores

foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 2,33 3,88 9,25 16,22

2 4,66 4,03 11,34 14,48

3 7,59 4,18 10,37 8,30

4 9,01 4,34 7,22 3,61

5 7,40 4,51 4,13 1,38

6 4,46 4,68 2,10 0,50

7 2,20 4,85 1,01 0,18

8 0,98 5,03 0,47 0,06

9 0,42 5,22 0,21 0,02

10 0,17 5,41 0,10 0,01

39

Tabela 3.5 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h)

durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os

valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.


1 78,61 85,18 80,08 91,55

2 20,65 14,41 21,08 18,43

3 5,42 2,44 5,55 2,12

4 1,42 0,41 1,46 0,22

5 0,37 0,07 0,38 0,02

6 0,10 0,01 0,10 0,00

7 0,03 0,00 0,03 0,00

8 0,01 0,00 0,01 0,00

9 0,00 0,00 0,00 0,00

10 0,00 0,00 0,00 0,00

Tabela 3.6 – Velocidades Instantâneas de produção de Biomassa (g/L.h)

durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os

valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.


1 0,20 0,05 0,01 0,73

2 0,98 0,14 0,16 0,96

3 3,42 0,36 1,84 1,00

4 5,13 0,79 3,20 0,81

5 2,57 1,22 0,52 0,53

6 0,65 1,16 0,03 0,30

7 0,13 0,68 0,00 0,16

8 0,02 0,30 0,00 0,08

9 0,00 0,11 0,00 0,04

10 0,00 0,04 0,00 0,02

40

Figura 3.1 – Exemplo de planilha do Excel utilizada para o cálculo das velocidades

específicas. Ela foi construída de acordo com o proposto por Hiss (2001). X(g/L) é a

concentração horária da Biomassa, M(g/L) é a concentração do componente que se prentende

calcular o ц, dM/dt é o a velocidade instanea “r” e цm é a velocidade específica.

Tabela 3.7 - Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol

(цP), e biomassa (цX)

цS rS цP rP цX

BG-1 1.17a 86,70a 0.11b 13.86a 0,050b

PE-2 1.38a 88,90a 0.13ab 13.00a 0,013a

CAT-1 1.39a 90,97a 0.14ab 20.29a 0,08ab

BK 1.41a 91,54a 0.23 a 20.63a 0,11a

Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol (цP), e

biomassa (цX), bem como as velocidades instantâneas máximas para o consumo de

substrato (rS), produção de etanol (rP) durante a fermentação do melaço. Letras

diferentes indicam valores diferentes (p>5). Os dados são referentes à fermentação do

melaço. Os valores foram calculados a partir dos dados experimentais.

41

Tabela 3.8 – Comparação estatística entre os

fatores de conversão calculados a partir dos dados

experimentais, os dados são referentes à

fermentação do melaço. Letras diferentes indicam

valores diferentes (p>5).

Fator de conversão

BG-1 0.35 a

PE-2 0.37 a

CAT-1 0.41 a

Controle 0.56 a

42

Figura 3.2 – a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação do

melaço. b) Representação gráfica do etanol produzido durante a fermentação do melaço c)

Representação gráfica da biomassa produzida durante a fermentação do melaço

43

3.2 - Tabelas da fermentação do caldo de cana

Siglas

BG-1 - Usina Barra Grande,

CAT-1 - Usina Catanduva

PE-2 - Usina da Pedra

BK – Levedura de Panificação, marca UNIFERFM

Tabela 3.9 – Etanol produzido (g/L) durante a

fermentação do mosto de melaço. Os valores foram

calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin

Tempo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

0 0,96 1,47 -0,53 0,00

1 3,02 3,00 5,52 12,02

2 6,22 5,17 15,36 38,02

3 10,78 8,07 26,07 38,45

4 16,44 11,71 33,64 38,45

5 22,41 15,90 37,52 38,45

6 27,72 20,28 39,18 38,45

7 31,76 24,41 39,84 38,45

8 34,49 27,96 40,09 38,45

9 36,18 30,77 40,19 38,45

10 37,19 32,85 40,22 38,45

44

Tabela 3.10 – Açúcar consumido (g/L) durante a


calculados após o ajuste das curvas pelo programa

Origin

Tempo


0 111,1 111,1 111,1 111,1

1 104,09 101,12 108,49 111,16

2 97,87 99,99 87,40 52,82

3 88,54 97,55 62,19 20,78

4 75,69 92,58 38,73 8,66

5 59,96 83,41 21,48 4,75

6 43,25 69,24 10,87 3,55

7 27,98 52,45 5,04 3,19

8 15,82 37,81 2,03 3,09

9 7,15 28,09 0,54 3,05

10 1,46 22,75 -0,20 3,05

45

Tabela 3.11 – Biomassa produzida (g/L) durante a


calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Pelo tratamento estatístico e pela a variabilidade próprio

da metodologia a levedura BK aparentemente não

cresceu.

Tempo


0 72,68 66,18 65,50 69,16

1 72,75 66,18 65,56 69,16

2 72,94 66,18 66,53 69,16

3 73,41 66,18 68,89 69,16

4 74,32 66,18 69,28 69,16

5 75,49 66,18 69,30 69,16

6 76,42 66,69 69,30 69,16

7 76,91 71,77 69,30 69,16

8 77,11 72,61 69,30 69,16

9 77,18 72,62 69,30 69,16

10 77,21 72,62 69,30 69,16

46

Tabela 3.12 – Velocidades Instantâneas de produção de

etanol (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço a

cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o

ajuste das curvas pelo programa Origin.


1 2,05 1,53 6,05 12,02

2 3,21 2,16 9,84 26,00

3 4,56 2,90 10,71 0,43

4 5,66 3,64 7,57 0,00

5 5,97 4,19 3,88 0,00

6 5,30 4,38 1,66 0,00

7 4,04 4,14 0,66 0,00

8 2,73 3,55 0,25 0,00

9 1,70 2,81 0,10 0,00

10 1,00 2,08 0,04 0,00

47

Tabela 3.13 – Velocidades Instantâneas de consumo de

substrato (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço a

cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o

ajuste das curvas pelo programa Origin.

Intervalo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 CONTROLE

1 6,22 1,13 21,09 58,33

2 9,33 2,43 25,21 32,05

3 12,85 4,97 23,46 12,12

4 15,73 9,18 17,25 3,91

5 16,71 14,17 10,61 1,20

6 15,27 16,79 5,83 0,36

7 12,16 14,64 3,01 0,11

8 8,66 9,72 1,50 0,03

9 5,69 5,34 0,73 0,01

10 3,54 2,64 0,36 0,00

48


biomassa substrato (g/L.h) durante a fermentação do mosto de

melaço a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados

após o ajuste das curvas pelo programa Origin. As

velocidades da linhagem BK é zero pois devido ao tratamento

estatístico e à metodologia, a levedura aparentemente não

cresceu.

Intervalo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 CONTROLE

1 0,07 0,00 0,06 0,00

2 0,19 0,00 0,97 0,00

3 0,47 0,00 2,36 0,00

4 0,91 0,00 0,39 0,00

5 1,17 0,01 0,02 0,00

6 0,93 0,51 0,00 0,00

7 0,49 5,07 0,00 0,00

8 0,20 0,84 0,00 0,00

9 0,08 0,01 0,00 0,00

10 0,03 0,00 0,00 0,00

49

Tabela 3.15 - Valores de цMax para a consumo de substrato (µS), produção de

etanol (µP), e biomassa (µX), bem como as velocidades instantâneas máximas

para o consumo de substrato (rS), produção de etanol (rP) e o intervalo de tempo.

Letras diferentes indicam valores diferentes (p>5). Os dados são referentes à

fermentação do mosto de cana-de-açúcar.

µS rS µP rP цX

BG-1 0,27b 36.16b 0,08bc 16,49a 0,47a

PE-2 0,29b 30.09b 0,07c 13,51a 0,37a

CAT-1 0,56ab 42.75ab 0,16ab 19,35a 0,33a

Controle 0,82a 57.01a 0,21a 19,34a 0,50a

Tabela 3.16 – Comparação estatística entre os

fatores de conversão referentes à fermentação do

caldo-de-cana. Letras diferentes indicam valores

estatisticamente diferentes (p>5).

Fator de conversão

BG-1 0.35 a

PE-2 0.34 a

CAT-1 0.36 a

Controle 0.35 a

50

Figura 3.3 – a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação do

mosto de caldo de cana. b) Representação gráfica do etanol produzido durante a

fermentação do mosto de caldo de cana. c) Representação gráfica da biomassa

produzida durante a fermentação do mosto de caldo de cana

51

3.3 - Tabelas da fermentação do mosto misto

Siglas

BG-1 - Usina Barra Grande,

CAT-1 - Usina Catanduva

PE-2 - Usina da Pedra

BK – Levedura de Panificação, marca UNIFERFM

Tabela 3.17 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto

misto de melaço e caldo de cana. Os valores foram calculados após o

ajuste das curvas pelo programa Origin


0 0,24 1,47 -0,53 0,00

1 2,13 3,00 5,52 12,02

2 4,51 5,17 15,36 37,70

3 7,45 8,07 26,07 37,70

4 10,98 11,71 33,64 37,70

5 15,05 15,90 37,52 37,70

6 19,58 20,28 39,18 37,70

7 24,38 24,41 39,84 37,70

8 29,25 27,96 40,09 37,70

9 33,94 30,77 40,19 37,70

10 38,26 32,85 40,22 37,70

52

Tabela 3.18 – Substrato consumido (g/L) durante a fermentação do mosto

misto de melaço e caldo de cana. Os valores foram calculados após o

ajuste das curvas pelo programa Origin


0 103,82 107,94 102,00 107,74

1 99,91 106,05 97,76 88,62

2 94,61 103,07 86,26 47,40

3 87,60 98,49 62,83 16,27

4 78,70 91,67 34,25 6,48

5 67,89 82,06 15,08 4,35

6 55,51 69,48 6,79 3,92

7 42,22 54,50 3,88 3,84

8 28,92 38,56 2,95 3,82

9 16,50 23,52 2,65 3,82

10 5,65 10,83 2,56 3,82

53

Tabela 3.19 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h)

durante a fermentação do mosto misto de melaço e cada-de- açúcar a cada

intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo

programa Origin


1 1,89 1,53 6,05 12,02

2 2,39 2,16 9,84 25,68

3 2,94 2,90 10,71 0,00

4 3,52 3,64 7,57 0,00

5 4,07 4,19 3,88 0,00

6 4,53 4,38 1,66 0,00

7 4,80 4,14 0,66 0,00

8 4,86 3,55 0,25 0,00

9 4,69 2,81 0,10 0,00

10 4,32 2,08 0,04 0,00

54

Tabela 3.20 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h)

durante a fermentação do mosto misto de melaço e cana-de-açúcar a cada

intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo

programa Origin


1 3,91 1,89 4,24 19,11

2 5,31 2,98 11,50 41,22

3 7,00 4,59 23,43 31,13

4 8,91 6,82 28,58 9,79

5 10,81 9,61 19,16 2,14

6 12,38 12,58 8,30 0,43

7 13,29 14,98 2,90 0,08

8 13,30 15,93 0,94 0,02

9 12,42 15,04 0,29 0,00

10 10,86 12,69 0,09 0,00

55


biomassa (g/L.h) durante a fermentação do mosto misto de

melaço e cana-de-açúcar a cada intervalo de hora. Os valores

foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin

Intervalo


1 1,11 0,64 0,91 0,30

2 1,54 0,66 2,86 0,30

3 1,67 0,63 3,05 2,98

4 1,38 0,55 1,06 1,41

5 0,91 0,44 0,21 0,06

6 0,51 0,33 0,04 0,00

7 0,27 0,24 0,01 0,00

8 0,13 0,16 0,00 0,00

9 0,06 0,11 0,00 0,00

10 0,03 0,07 0,00 0,00

56

Tabela 3.22 – Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol (цP), e

biomassa (цX), bem como as velocidades instantâneas máximas para o consumo de substrato

(rS), produção de etanol (rP) e o intervalo de tempo. Letras diferentes indicam valores

diferentes (p>5). Os dados são referentes aos dados experimentais do mosto misto de melaço

e cana-de-açúcar.

Tabela 3.23 - Comparação estatística entre os

fatores de conversão referentes à fermentação do

mosto misto de melaço e caldo de cana. Letras

diferentes indicam valores estatisticamente

diferentes (p>5).

Fator de conversão

BG-1 0.35 b

PE-2 0.27 c

CAT-1 0.39 ab

Controle 0.40 a

57

Figura 3.4 – a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação

do mosto de caldo de cana. b) Representação gráfica do etanol produzido durante a

fermentação do mosto de caldo de cana. c) Representação gráfica da biomassa

produzida durante a fermentação do mosto de caldo de cana

58

CAPÍTULO IV

59

CONSIDERAÇÕES FINAIS

As quatro linhagens de leveduras testadas apresentaram comportamento cinético e

características produtivas diferentes - tais características permitem a indicação das diferentes

linhagens para diferentes finalidades.

Durante o experimento foi constatado que os parâmetros cinéticos estão associados

com a produção de espuma e calor; uma vez que esses fatores em grande impacto na indústria,

conhecer o perfil da levedura empregada no sistema pode reduzir gastos e diminuir perdas.

Foi verificado que para estudos cinéticos com amostragem horaria é necessário o

congelamento das amostras em nitrogênio líquido - o que compromete a viabilidade celular e

dificulta a mensuração da biomassa celular, uma possível saída seria emprego de técnicas

como a espectrofotometria.

Os protocolos químicos que medem a variação da concentração de substrato e etanol

possuem baixa sensibilidade para medir pequenas variações, o que dificultou quantificar os

compostos nos momentos em que as concentrações eram baixas ou com pequena variação.

Sugere-se o emprego de técnicas mais sofisticadas e com maior sensibilidade como a

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cromatografia gasosa.

Estudos futuros sobre cinética da fermentação podem envolver o perfil de consumo dos

diferentes açúcares e a formação de compostos secundários. Ainda pode ser sugerido um

estudo genético e quantitativo da dinâmica populacional das linhagens durante a fermentação

alcoólica.

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA … · Tabela 3.1 – Etanol produzido (g/ L)...

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