UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE ODONTOLOGIA

CENTRO DE ORTODONTIA E ORTOPEDIA FACIAL

PROF. JOSÉ ÉDIMO SOARES MARTINS

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CLODRONATO NA MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA E

REABSORÇÃO RADICULAR EM RATTUS NORVEGICUS

Ana Maria Telles Pinheiro

C.D.

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Especialista em Ortodontia e Ortopedia Facial.

Salvador, 2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE ODONTOLOGIA

CENTRO DE ORTODONTIA E ORTOPEDIA FACIAL

PROF. JOSÉ ÉDIMO SOARES MARTINS

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CLODRONATO NA MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA E

REABSORÇÃO RADICULAR EM RATTUS NORVEGICUS

Ana Maria Telles Pinheiro

C.D.

ORIENTADOR: PROF. DR. MICKELSON RIO LIMA DE OLIVEIRA COSTA

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. MARCOS ANDRÉ VANNIER DOS SANTOS

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Especialista em Ortodontia e Ortopedia Facial.

Salvador, 2006

P654 Pinheiro, Ana Maria Telles

Avaliação dos efeitos do clodronato na movimentação dentária e reabsorção radicular em Rattus norvegicus / Ana Maria Telles Pinheiro – Salvador, 2006. 93 f. Orientador: Prof. Dr. Mickelson Rio Lima de Oliveira Costa Co-Orientador: Prof..Dr. Marco André Vannier dos Santos Dissertação (especialização em ortodontia) – Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Odontologia. 2006 1. Clodronato. 2. Reabsorção radicular. 3. Movimentação dentária. I. Costa, Mickelson Rio Lima de Oliveira (Orientador). II. Santos, Marco André Vannier dos. III. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Odontologia. IV. Título

CDU:616.314-089.23

A meu marido,

André Pinheiro,

ponto de equilíbrio e co-responsável pelas grandes conquistas da minha

vida...

Dedico.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

A meus pais,

Mariângela e Justino Telles,

“os fazedores de sonhos” da minha vida;

e a meu filho, Victor, que, antes mesmo de nascer, já participou desta

conquista...

AGRADECIMENTOS

A Deus, que sempre abençoa todos os meus projetos,

Aos meus irmãos, Fernando e Luciana e cunhados-irmãos, Cláudia e Bruno,

por participarem de todos os meus grandes momentos,

Aos meus sobrinhos, Fernando e Bernardo, por serem sinônimo de ternura,

alegria e pureza para quem quer que os conheça,

À tia Vanda e tio Miguel por terem servido de meio para que Deus colocasse

André na minha vida,

Ao meu orientador, Prof. Dr. Mickelson Costa, pela paciência, dedicação e,

acima de tudo, por ter, verdadeiramente, me guiado dentro de um mundo até então

para mim desconhecido, o do trabalho experimental, de forma tão tranqüila,

À Prof. Myrela Galvão por ter colaborado de forma tão desapegada para a

execução deste projeto, tornando os momentos experimentais mais prazerosos,

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Marcos André Vannier dos Santos, pelo

exemplo de simplicidade e pela total disponibilidade que sempre demonstrou ter

para com o nosso trabalho, abrindo as portas da FIOCRUZ-Ba e viabilizando toda a

nossa pesquisa,

A Diego, grande amigo que conheci nesta fase da minha vida, cuja ajuda foi

inestimável durante todas as etapas deste trabalho e que vai ficar para mim como

um dos grandes “saldos positivos”,

À toda a equipe da FIOCRUZ-Ba, em especial à Srª. Cristina dos Santos

Vasconcelos, técnica do Departamento de Anatomia Patológica da FIOCRUZ-Ba,

por ter simplificado, por muitas vezes, o nosso trabalho,

À Srª. Maria de Lourdes, técnica em histopatologia da UFBA, por ter dado

mais celeridade na fase final de processamento histológico do material coletado,

À Profª. Drª. Luciana Ramalho, pela paciência e pelo carinho que sempre teve

comigo e pelo exemplo de seriedade que dá em tudo o que faz,

À Profª. Drª. Cristina Cangussu que nos faz entrar no turbilhão de idéias

matemáticas da estatística de maneira segura e consciente,

Aos meus professores do curso de especialização em Ortodontia da

Universidade Federal da Bahia: Profª. Drª. Telma Martins de Araújo; Prof. Rogério

Ferreira; Prof. Fernando Habib; Prof. Dr. Marcos Alan Vieira Bittencourt; Profª.

Fernanda Catharino; Prof. Márcio Sobral; Profª. Mayra Seixas; Profª. Myrela Galvão;

Prof. Marcelo Castelucci; Prof. Rivail Brandão; Profª. Luciana Gomes; Prof. Roberto

Costa Pinto e Prof. Dr. Mickelson Costa, por terem me introduzido no fascinante

caminho desta especialidade,

Aos meus colegas de turma: Daniel Bill; Indira Maia; Inêssa Barbosa; Mônica

Corbacho e Valmir Dall´orto e aos contemporâneos da segunda turma (Aline Cruz;

Aline Freitas; Gustavo Maciel; Lívia Marianetti; Paloma Nunes e Ricardo Lavenere) e

da quarta (Adriana Libório; Débora Rosseti; Érica Guanaes; Cristiane Becker; Mauro

Henrique; Thiago Vinhas), pelos dois anos de convivência intensa, pontilhados de

momentos especialmente inesquecíveis,

À D. Lúcia, André, Damião e D. Ginalva por dividirem os momentos

“estressantes” com nós, alunos,

Ao Dr. Joélio Ribeiro que, com o simples exemplo, me fez ver as grandes

realizações profissionais que a Ortodontia poderia me trazer,

Aos amigos: Adriana Sicupira, Alexandre Moreira, Cláudia Embiruçu, Eduardo

Batalha, Emerson da Silva, Eugênio Arcadinos Leite, Fernanda Muitinho, Flávia

Cabral, Ianderlei Souza, Luiz Gustavo Cavalcanti Bastos, Priscila Pinheiro Lima da

Silva, Vagner Mendes, por terem sempre acreditado em mim e no meu potencial.

À Semp Toshiba, pela inestimável ajuda ao Centro de Ortodontia e Ortopedia

Facial Professor José Édimo Soares Martins.

A todos que, de alguma maneira, contribuíram para a realização deste

trabalho.

RESUMO

O presente trabalho buscou avaliar a efetividade e o mecanismo de ação do

clodronato na diminuição da reabsorção radicular e sua influência na taxa de

movimentação dentária induzida ortodonticamente. Portanto, seu objetivo foi testar a

hipótese desse medicamento inibir de maneira seletiva tal processo, com pouca ou

nenhuma influência nesse movimento.

Dezoito ratos foram distribuídos em três grupos: CONTROLE, com 6 animais;

GRUPO I, com 5 animais (clodronato administrado nos dias 0, 2, 4 e 6); GRUPO II,

com 7 animais (clodronato administrado no 5º dia). Todos foram submetidos à

movimentação dentária ortodôntica e sacrificados no sétimo dia do experimento,

quando as peças foram removidas, fixadas, descalcificadas, incluídas em parafina e

coradas em hematoxilina e eosina para análise em microscopia de luz.

Comparando-se as taxas de movimentação foi encontrada diferença

estatisticamente significante entre os grupos CONTROLE e I, o que não ocorreu

entre o CONTROLE e o GRUPO II. Durante a análise histológica semi-quantitativa o

GRUPO CONTROLE apresentou concentração de osteoclastos bem mais

expressiva que o GRUPO II (83% e 43%, respectivamente, para o grau moderado-

intenso). A reabsorção óssea nesses dois grupos, por sua vez, não apresentou

diferenças marcantes (50% e 57%, respectivamente, para o grau moderado-intenso),

enquanto que a reabsorção radicular foi maior no GRUPO CONTROLE do que nos

grupos I e II (respectivamente 67%, 20% e 57% para o grau moderado-intenso).

A associação dos achados histológicos à taxa de movimentação dentária

sugere que o uso do clodronato no quinto dia do experimento pode diminuir a

reabsorção radicular com pouca influência na movimentação dentária induzida

ortodonticamente.

ABSTRACT

This experimental study was motivated and performed in order to better

elucidate the mechanisms underlying on the action of clodronate on root resorption.

We tested the hypothesis that this compound may selectively inhibits root resorption

without significant influence on tooth movement. Sample consisted of three

experimental groups of 18 rats, CONTROL (n=6), GROUP I (n=5, clodronate

administered subcutaneously in days 0, 2, 4 and 6) and GROUP II (n=7, clodronate

administered subcutaneously in days 5). First upper molars were moved using ni-ti

closed coil spring for 7 days. The animals were sacrificed and the tissue fragments of

the moved teeth and adjacent alveolar region were fixed, decalcified, included in

paraffin and HE stained for light microscopy. Taken together the results suggest that

subcutaneous injection of clodronate in the fifth day of tooth movement in rats may

decrease root resorption without significant influence on tooth movement rate.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

% Percentagem

P-C-P Ponte de dois átomos de fosfato ligados a um de Carbono

ATP Adenosina trifosfato

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

TM Trade mark (marca registrada)

g Grama

mo Movimento ortodôntico

S Sacrifício

C Aplicação de clodronato

N Número de animais por grupo

mL Mililitro

Kg Kilograma

NiTi Níquel-titânio

® Marca registrada

1º M Primeiro molar

n º Número

” Polegadas

mg Miligrama

M Molaridade

EDTA EthyleneDiamineTetrAcetic acid (Ácido etilenodiaminotetra-acético)

µm Micrômetro

HE Hematoxilina e Eosina

ANOVA Análise de Variância

p p valor

< Menor

mm Milímetro

= Igual

pH Pondus hidrogenii (nível de acidez)

F Furca

LP Ligamento periodontal

RO Reabsorção óssea

NO Neoformação óssea

D Superfície mesial da raiz distal

LRRA Lacuna de reabsorção radicular ativa

UFBA Universidade Federal da Bahia

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 Pesagem do animal

Figura 2 Adaptação cervical do conjunto amarrilho-mola de NiTi ao

primeiro molar superior esquerdo: a. fio de amarrilho metálico 0.08”

(Dental Morelli) sendo introduzido na região entre 1º e 2ºmolares

superiores esquerdos com o auxílio de uma pinça Mathiew; b. fio

de amarrilho após passar pelo ponto de contato; c. fio de amarrilho

envolvendo o 1ºM com a respectiva mola de Níquel-Titânio; c.

amarração do conjunto mola-fio de amarrilho com o auxílio da

Mathiew à cervical do 1ºM.

Figura 3. a e b. confecção do orifício entre os incisivos superiores com

broca esférica nº2 (KG Sorensen).

Figura 4. a. Animal posicionado em dispositivo de acrílico ligeiramente

inclinado, em decúbito dorsal, com a cabeça perpendicular ao solo;

b. peso de chumbo de 45g preso ao amarrilho fixado à extremidade

anterior da mola de NiTi, distendendo-a, produzindo força

equivalente.

29

31

31

32

Figura 5. a. Fotopolimerização da resina na região anterior; b. desgaste

dos incisivos inferiores com fresa do tipo roda (KG Sorensen) e c.

aparelho montado.

Figura 6. OSTAC – Solução injetável.

Figura 7. a. Avaliação da distância entre a face mesial do primeiro molar

superior esquerdo e um orifício criado na vestibular dos incisivos

superiores, utilizando paquímetro de precisão (Beerendonk Caliper

78532 - AESCULAP); b. espaço criado na distal do primeiro molar

pelo deslocamento mesial deste durante uma semana de aplicação

de força (seta).

Figura 8. Osso maxilar osteotomizado.

33

34

35

35

LISTA DE QUADROS

Página

Quadro 1 Identificação dos grupos: mo (movimento ortodôntico), S

(sacrifício); C (aplicação de clodronato) e N (número de animais por

grupo).

Quadro 2 Representação esquemática dos referenciais numéricos

utilizados.

Quadro 3 Representação da tabela utilizada para registro dos dados

30

36

37

SUMÁRIO

Página

1 INTRODUÇÃO 16

2 PROPOSIÇÃO 27

3 ABORDAGEM EXPERIMENTAL 28

4 DESENVOLVIMENTO SEQUENCIAL DA PESQUISA 38

4.1 ARTIGO 1 38

4.1 ARTIGO 2 66

5 CONCLUSÃO 83

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 84

7 ANEXO 93

16

1 INTRODUÇÃO

O cemento radicular é um tecido conjuntivo mineralizado e avascular que

recobre as raízes anatômicas dos dentes, composto por 45-50% de substância

inorgânica e 50-55% de matéria orgânica e água. A porção inorgânica é composta

basicamente por hidroxiapatita e a orgânica é constituída por colágeno tipo I e

proteoglicanas. Suas células, cementoblastos e cementócitos, são similares aos

osteoblastos e osteócitos, respectivamente, e sua nutrição se dá por meio de

difusão, através do ligamento periodontal. Sua principal função é inserir as fibras

deste ligamento à superfície radicular e vedar os túbulos dentinários (LINDHE &

KARRING, 1997; CATE, 1998; KATCHBURIAN & ARANA, 1999)

Este tecido pode ser dividido em: primário ou acelular, formado durante o

processo de desenvolvimento radicular e irrupção dentária; e secundário ou

celular, formado após o dente ter irrompido e em resposta às demandas

funcionais. Este último apresenta uma composição muito semelhante a do tecido

ósseo, todavia não possui vasos sanguíneos, linfáticos e inervação (LINDHE &

KARRING, 1997; CATE, 1998). É passível de reabsorção e neoformação numa

intensidade muito menor que a do osso (KATCHBURIAN & ARANA, 1999), além

17

de se depositar continuamente ao longo da vida, o que constituem aspectos

clínicos importantes (LINDHE & KARRING, 1997).

A resistência aumentada do cemento à reabsorção em relação ao osso

torna viável o movimento dentário ortodôntico. Entretanto, mesmo quando as

radiografias não revelam alterações visíveis na superfície radicular, acredita-se

que a maioria dos dentes movidos ortodonticamente sofra uma reabsorção

radicular, seguida de reparo. Na área reabsorvida, observam-se lacunas criadas

por odontoclastos, rapidamente reparadas, ainda que de maneira incompleta, pela

formação de novo cemento capaz de reinserir as fibras do ligamento periodontal e

promover o restabelecimento dos demais tecidos (CATE, 1998; GU et al., 1999).

Durante o tratamento ortodôntico, a compressão dos vasos sanguíneos, à

medida que a pressão no ligamento periodontal aumenta, provoca obliteração dos

mesmos e necrose estéril de áreas deste tecido, conhecidas como zonas de

hialinização. Esta alteração tecidual impede a movimentação dentária até que

tanto o tecido necrótico quanto o osso adjacente sejam removidos pelos

osteoclastos (RODY Jr. et al., 2001; PROFFIT & FIELDS Jr., 2002). Logo, a

compressão do ligamento periodontal constitui um fator de risco diferenciado para

o movimento dentário (KING et al., 1998) e está intimamente associada com a

indução osteoclástica (YOKOYA et al., 1997). Esta última, por sua vez, ocorre

inicialmente nos canais vasculares do osso alveolar e no ligamento periodontal,

no lado de pressão (YOKOYA et al., 1997).

Os odontoclastos aparentam compartilhar características semelhantes com

os osteoclastos no que diz respeito à estrutura celular (formação das bordas em

escova e complexo de Golgi bem desenvolvido vizinho ao núcleo), assim como à

função celular (reabsorção das matrizes mineralizadas). Todavia, diferente dos

18

osteoclastos que podem ser comumente observados no osso, os odontoclastos

apresentam-se de forma temporária e restrita aos locais onde está ocorrendo

reabsorção radicular. Portanto, os primeiros seriam regulados por hormônios

sistêmicos e fatores locais, enquanto que os segundos seriam controlados

basicamente por fatores locais e estresse mecânico (WATANABE et al., 2000).

A transferência de forças ortodônticas para os tecidos periodontais envolve

mecanismos biológicos que resultarão em reabsorção óssea e radicular. Apesar

da relação entre esta degradação e a força não estar clara, tem sido demonstrado

que fatores sistêmicos podem regular tal atividade (SAITO et al., 1991;

ALHASHIMI et al., 2001).

Há estudos que relacionam o início da reabsorção radicular às áreas

adjacentes à zona de tecido hialinizado, ocorrendo em casos de compressões

maiores e mais duradouras (REITAN, 1974; BRUDVIK & RYGH, 1993; ADACHI et

al., 1994; CATE, 1998; GU et al., 1999; BREZNIAK & WASSERSTEIN, 2002),

podendo ser evidenciada ainda nos casos em que uma reativação seja realizada

durante o pico da expansão do número de osteoclastos, ou seja, no quarto dia após

a ativação inicial (GU et al., 1999). Desta forma, pequenas lacunas de reabsorção,

algumas das quais envolvendo dentina, podem ser observadas após quatro dias de

movimentação dentária experimental em ratos (BRUDVIK & RYGH, 1993).

Num estudo desenvolvido por Rody Jr. e colaboradores, em 2001, a cinética

osteoclástica foi observada, tendo sido constatado que o número de osteoclastos no

dia 3 encontra-se significativamente maior no osso alveolar e no ligamento

periodontal. Por outro lado, na superfície radicular esse pico ocorre no dia 7,

evidenciando que tais células chegam nessas diferentes regiões em momentos

distintos (RODY Jr. et al., 2001).

19

Os dados conseguidos a partir de uma ativação simples de aparelhos

ortodônticos montados em ratos sugerem que o período entre o estímulo e o

aumento detectável na população de osteoclastos é de aproximadamente três

dias, sendo este o intervalo mínimo para que a remodelação óssea alveolar

apareça nesses animais (um e quatro dias após a ativação inicial) (BARON et al.,

1986; KING et al., 1998; GU et al., 1999). Foi constatado ainda que o número e o

tamanho destas células, além do perímetro da erosão atingem o seu pico no

quinto dia de movimentação dentária ortodôntica experimental, sendo a superfície

mesial radicular (lado de pressão) a mais atingida (KING et al., 1991).

Num estudo desenvolvido por Noxon e colaboradores, em 2001, com 96

ratos submetidos à movimentação ortodôntica durante sete dias, os autores

observaram que as maiores porcentagens de apoptose encontravam-se entre os

dias 5 e 7, o que coincide com o período em que o número de osteoclastos está

voltando para o seu normal. Este processo, por sua vez, foi detectado de forma

percentualmente mais significativa na superfície óssea e no ligamento periodontal.

(NOXON et al., 2001).

Os osteoclastos são células multinucleadas que produzem um ambiente

extracelular ácido, promovendo, por conseguinte, a solubilização dos minerais

ósseos. Portanto, o requisito básico para que o movimento dentário ortodôntico

ocorra é a chegada destas células aos sítios de compressão, promovendo a

remodelação óssea (NOXON et al., 2001). Esse turnover ósseo na região alveolar

interdental é caracterizado por períodos de reabsorção ativa e formação, ocorrendo

tanto nos sítios de pressão como nos de tensão, sendo controlado pela quantidade

de osso perdido ou formado de cada lado (KING et al., 1991).

20

A condição do tecido cementóide e a sua interação com as células da

membrana periodontal adjacente são de extrema importância para a reabsorção

radicular ortodonticamente induzida (BRUDVIK & RYGH, 1993).

A remoção do tecido hialinizado juntamente com cementóide, fibras

colágenas e osteóide ocorre antes e durante o restabelecimento do ligamento

periodontal. Com isto, algumas áreas da superfície radicular tornam-se menos

protegidas e, portanto, mais susceptíveis à reabsorção radicular. Tais áreas são

prontamente atacadas por odontoclastos ou osteoclastos, posto que podem ser

consideradas células da mesma linhagem, apresentando morfologia e

propriedades similares. Uma vez criadas as lacunas de reabsorção, o cemento é

removido da sua superfície de maneira gradativa (RYGH, 1977; BREZNIAK &

WASSERSTEIN, 2002).

A reabsorção óssea é um processo complexo que envolve outros fatores, tais

como: capacidade de reabsorção óssea individual dos osteoclastos; sua adesão à

superfície óssea; o transporte de íons de hidrogênio; e a secreção enzimática.

Aspectos não relacionados aos osteoclastos também podem desempenhar papéis,

incluindo mobilidade dentária aumentada e redução da resistência secundária ao

movimento dentário ortodôntico; o aumento da vascularização do ligamento

periodontal; e a redução na densidade óssea (GU et al., 1999).

Por muitos anos, ortodontistas e biólogos vêm tentando entender melhor este

processo para otimizar o tratamento ortodôntico. A solução seria prevenir tanto a

formação de tecido hialinizado, como acelerar a sua remoção pelos osteoclastos. Tal

solução é difícil de ser alcançada na clínica por requerer pressões muito baixas

(abaixo do nível em que ocorre colapso das arteríolas), além de um controle preciso

dos sítios de compressão (RODY Jr. et al., 2001; KAMENYAMA et al., 2003).

21

Considerando que a reabsorção e o encurtamento radiculares são

conseqüências indesejáveis do tratamento ortodôntico, estudos têm sido

desenvolvidos ao longo dos anos com o objetivo de diminuir a reabsorção radicular

sem comprometer a movimentação dentária. Os bisfosfonados apresentam-se como

uma alternativa provável para o controle dessa reabsorção, uma vez que funcionam

como bloqueadores ou inibidores da ação dos osteoclastos (IGARASHI et al., 1994;

LIU et al., 2004).

Após a descoberta de que podem controlar de maneira eficiente a formação e

dissolução de fosfato de cálcio in vitro, assim como a mineralização e a reabsorção

óssea in vivo, os bisfosfonados foram desenvolvidos e usados no tratamento de

desordens ósseas como a doença de Paget, a hipercalcemia maligna e a

osteoporose (RODAN & FLEISCH, 1996; BUKOWSKI et al., 2005). Cada

bisfosfonado deve ser considerado um complexo isolado, cujas estruturas os tornam

específicos para o tecido ósseo ou outros tecidos mineralizados (SHINODA et al.,

1983).

Estes compostos são análogos dos pirofosfatos, nos quais a ponte de

oxigênio foi deslocada por um carbono com várias cadeias laterais (P-C-P) (SATO et

al., 1991; KIM et al., 1999; RODAN & FLEISCH, 1996; ITO et al., 2001; BUKOWSKI

et al., 2005). Ambos ligam-se fortemente à hidroxiapatita, o que explica sua ação

farmacológica específica nos tecidos mineralizados, em especial nos ossos

(ADACHI et al., 1994; RODAN & FLEISCH, 1996; IGARASHI et al., 1996; FLEISCH,

1998; KIM et al., 1999; RUSSEL & ROGERS, 1999). De fato, eles se depositam

preferencialmente em locais de reabsorção osteolcástica ativa, sendo liberados

quando o osso sobre o qual ele se encontra depositado é novamente reabsorvido,

inibindo tal processo (RODAN & FLEISCH, 1996; MURAD et al., 1997; BREZNIAK &

22

WASSERSTEIN, 2002; BUKOWSKI et al., 2005; LEU et al., 2005). Essa inibição

levaria a um aumento na maturação óssea, o que traria como conseguinte uma

maior resistência à reabsorção daquele osso mais mineralizado (GRIER & WISE,

1998).

O grupo P-C-P, uma estrutura comum dos bisfosfonados, é resistente à

hidrólise enzimática, o que explica porque os bisfosfonados não são metabolizados

no corpo, sendo excretados de forma inalterada pelos rins, em parte por um

processo de secreção tubular ativa. Apresentam baixa absorção no intestino, o que

pode ser atribuído ao tamanho e carga do grupo atuando como agentes limitantes

da sua penetração na membrana celular. A concentração destes compostos será

maior para o osso medular e menor para o osso cortical (ADACHI et al., 1994;

RODAN & FLEISCH, 1996; FLEISCH, 1998; RUSSEL & ROGERS, 1999). Deve-se

considerar ainda que sua meia-vida óssea situa-se entre três meses e um ano

(KOIVUKANGAS et al., 2001).

Cada grupo de bisfosfonado apresenta suas próprias características

químicas, físico-químicas e biológicas (IGARASHI et al., 1994; RODAN & FLEISCH,

1996; FLEISCH, 1998; ITO et al., 2001; HORIE et al., 2003), sendo elas dose-

dependentes (HUGHES, et al., 1995; BREZNIAK & WASSERSTEIN, 2002; LIU et

al., 2004).

Os mecanismos de ação destes fármacos podem ser considerados em três

níveis: tecidual, celular, e molecular. Em nível tecidual, a ação de todos os

bisfosfonados aparenta ser semelhante: redução da renovação óssea (RODAN &

FLEISCH, 1996; FLEISCH, 1998).

Em nível celular, os osteoclastos constituem o alvo dos bisfosfonados.

Estas células podem ter sua ação reduzida através: da inibição do seu

23

recrutamento para a superfície óssea; da inibição da sua atividade na superfície

óssea; ou da diminuição do seu ciclo celular, uma vez que, após desligarem-se da

superfície óssea, tais osteoclastos sofreriam um processo de apoptose (ADACHI

et al.,1994; RODAN & FLEISCH, 1996; MURAD et al., 1997; RUSSEL &

ROGERS, 1999; ITO et al., 1999; ITO et al., 2001).

Uma vez que os odontoclastos apresentam características semelhantes

aos osteoclastos, estudos revelam que também estes últimos sofrem apoptose

após a administração de bisfosfonado, apresentando alterações citológicas,

incluindo atividade reabsortiva reduzida (IGARASHI et al., 1994; WATANABE et

al., 2000).

Em nível molecular, a cadeia de eventos que leva à inativação

osteoclástica ou à sua formação diminuída, decorrente da exposição direta ou

indireta a determinado bisfosfonado ainda não foi completamente elucidada. As

possibilidades incluem tanto a sua ação direta num receptor da superfície celular

e/ou a sua fagocitose pelo osteoclasto no interior do qual ele interage com uma

enzima ou outra molécula afetando o metabolismo celular (RODAN & FLEISCH,

1996).

O mecanismo através do qual o bisfosfonado penetra no osteoclasto pode

ser tanto a difusão passiva como durante a reabsorção, graças às características

endocíticas destas células (SAHNI et al., 1993, IGARASHI et al., 1996). Estes

processos são creditados às suas bordas em escova, apesar de alguns autores

sugerirem a existência de uma outra via de captação destes compostos (ITO et

al., 2001).

Os efeitos positivos de tais compostos podem ser aplicados à clínica

ortodôntica, o que justifica um número cada vez maior de pesquisas nessa área.

24

A exemplo disso, um estudo feito com administração tópica e sistêmica de

bisfosfonados em ratos mostrou que tanto a movimentação ortodôntica dentária

como a recidiva podem ser evitadas. Isto sugere que tais substâncias podem ser

úteis no reforço de ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico

(IGARASHI et al., 1994; KIM et al., 1999; LIU et al., 2004). Além disso, a

administração local de bisfosfonado causa a redução tanto no número de lacunas

de reabsorção quanto no de odontoclastos durante a movimentação ortodôntica

(IGARASHI et al., 1994).

Acredita-se que o período de maior concentração de osteoclastos na

superfície radicular não coincide com o de máxima atividade destas células na

superfície óssea e, conseqüentemente, com o de movimentação ortodôntica mais

intensa. De fato, este pico de concentração de osteoclastos na raiz ocorre

posteriormente (IGARASHI et al., 1996; RODY Jr et al., 2001; NOXON et al.,

2001). Tal consideração pode viabilizar a utilização de bisfosfonados para diminuir

o risco de reabsorção radicular sem comprometer a taxa de movimentação

dentária.

Estudos sobre a relação existente entre a estrutura e a atividade dos

bisfosfonados indicam que a sua potência e o seu mecanismo de ação variam de

acordo com a cadeia lateral ligada ao átomo de carbono na molécula de P-C-P.

Baseado na diferença da estrutura desta cadeia lateral, eles podem ser divididos em

duas classes: os que contêm uma molécula de Nitrogênio e os que não a contêm.

Essas duas classes de medicamento também diferem no seu mecanismo de ação

molecular. Investigações recentes revelaram que aqueles bisfosfonados que

apresentam um átomo de Nitrogênio na cadeia lateral, tais como o alendronato, são

mais potentes do que os que não o apresentam, inibindo a reabsorção por bloquear

25

a penetração de proteínas nos osteoclastos (DUNFORD et al., 2001; FRITH &

ROGERS, 2003; LIU et al., 2004; BUKOWSKI et al., 2005). Os bisfosfonados que

não contêm o átomo de Nitrogênio podem ser incorporados a análogos do ATP e

atuar inibindo a síntese de proteínas e induzindo a apoptose nos osteoclastos

(FRITH & ROGERS, 2003; BUKOWSKI et al., 2005).

O clodronato, por sua vez, encontra-se no grupo dos bisfosfonados que não

apresentam o átomo de Nitrogênio (LIU et al., 2004). Ao invés disso, contém dois

átomos de Cloro na cadeia lateral, apresentando propriedades físico-químicas

semelhantes às dos demais, inibindo, portanto, a função osteoclástica (PLOSKER &

GOA, 1994; FRITH & ROGERS, 2003; LIU et al., 2004).

Somada a atividade anti-reabsortiva, tem sido relatada a associação deste

tipo de bisfosfonado com uma função antiinflamatória (LIU et al., 2004). Uma vez

que as citocinas e os mediadores do processo inflamatório desempenham

importante papel na resposta biológica à simulação mecânica ortodôntica, incluindo

reações adversas como dor (NGAN et al., 1994) e reabsorção radicular (BRUDVIK &

RYGH, 1994), o clodronato pode ser considerado em estudos que envolvam o

controle da movimentação ortodôntica (LIU et al., 2004).

O clodronato é um bisfosfonado de segunda geração de potência baixa

quando comparado com as drogas mais recentes, mas tem sido bem estudado e já

se encontra comercialmente disponível (KAASTAD et al., 1997; LIU et al., 2004).

Uma característica importante associada ao clodronato é que sua atividade

anti-reabsortiva não prejudica a mineralização óssea e, além disso, ele tem sido

associado à prevenção de perda óssea decorrente de imobilização em pacientes

paraplégicos (KAASTAD et al., 1997).

26

Estudos mostram que a administração de clodronato por períodos longos em

dosagem terapêutica apresenta alguns efeitos benéficos e nenhum efeito colateral

sobre o desenvolvimento ósseo normal (KOIVUKANGAS et al., 2001).

Num estudo desenvolvido por LIU e colaboradores, em 2004, constatou-se

que a administração local do clodronato não causa qualquer tipo de reação

inflamatória significativa no local da aplicação ou efeito colateral sistêmico, tais como

perda de apetite ou alteração no peso dos animais. Além disso, os autores

concluíram que essa droga inibe a movimentação dentária induzida pelo estresse

ortodôntico (HAYASHI et al., 2002; LIU et al., 2004).

A necessidade de maiores esclarecimentos acerca da efetividade e do

mecanismo através do qual o clodronato diminui a reabsorção radicular motivou a

realização desse estudo experimental, cujo objetivo é testar a hipótese do clodronato

inibir de maneira seletiva tal processo, com pouca ou nenhuma influência na taxa de

movimentação dentária induzida ortodonticamente.

27

2 PROPOSIÇÃO

Após o exposto, o autor se propõe a:

1. Avaliar a ação de dois regimes de aplicação do clodronato no periodonto

de inserção de ratos (Rattus norvegicus) durante uma semana de

movimentação dentária ortodôntica;

2. Comparar as taxas de movimentação dentária nesta mesma condição

experimental;

3. Testar a viabilidade do uso deste medicamento para diminuição da

reabsorção radicular induzida ortodonticamente.

28

3 ABORDAGEM EXPERIMENTAL

Esta pesquisa consistiu na utilização de Rattus norvegicus, tendo seguido as

normas de conduta de experimentação animal do Centro de Pesquisa Gonçalo

Moniz da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-Ba) e foi realizada de acordo com as

Normas para a Prática Didático-Científica da Vivissecção de Animais, recomendadas

pela Lei 6638 de 08 de maio de 1979 (Anexo).

3.1 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS

Os animais foram fornecidos e mantidos no biotério do Centro de Pesquisa

Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-Ba), em temperatura

ambiente e com iluminação dia e noite, alimentados com ração Purina LabinaTM e

água ad libitum e pesados quando da montagem do aparelho e no dia da sua morte,

com o objetivo de se observar quaisquer alterações de peso relacionadas à

alimentação e/ou às condições experimentais (Figura 1).

29

Figura 1. Pesagem do animal

3.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

Foram utilizados dezoito ratos (Rattus norvegicus), machos, com

aproximadamente 300g e dois meses de vida.

De acordo com a proposição deste trabalho, os animais foram aleatoriamente

distribuídos em três grupos: CONTROLE, com seis animais submetidos à

movimentação dentária ortodôntica; GRUPO I, com cinco animais tratados com

administração do clodronato por via subctânea nos dias 0, 2, 4 e 6 do experimento e

submetidos à movimentação dentária ortodôntica; e GRUPO II, com sete animais

tratados com administração de clodronato por via subcutânea no dia 5 e submetidos

à movimentação dentária ortodôntica. Todos foram mortos no dia 7 do experimento

(Quadro 1).

Os animais foram alimentados diariamente, acompanhados in loco e a

serragem das gaiolas trocada a cada 48 horas. Estas foram identificadas com o

nome do pesquisador, data da montagem do aparelho e da morte e grupo

experimental.

30

Grupo / Dia 0 1 2 3 4 5 6 7 N

CONTROLE mo mo mo mo mo mo mo S 06

GRUPO I C mo mo C mo mo C mo mo C mo S 05

GRUPO II mo mo mo mo mo C mo mo S 07

3.3 MANIPULAÇÃO DA AMOSTRA

3.3.1 Anestesia

Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia geral, obtida pela

associação de 1,33 mL/kg de cloridrato de quetamina e 0,67 mL/kg de xilazina por

via subcutânea.

3.3.2 Montagem do Aparelho

Maxila – O aparelho consistiu na utilização de fio de aço inoxidável de 0.08”

(fio de amarrilho) da marca Dental Morelli para adaptação cervical do primeiro molar

superior esquerdo. A este amarrilho foi adaptada uma mola fechada de níquel-titânio

(NiTi) da TP Orthodontics®, presa na sua extremidade anterior a fio de amarrilho de

mesmo calibre e marca (Figura 2). Este, por sua vez, foi introduzido em orifício

criado entre os incisivos superiores, no terço cervical, com broca esférica nº2 (KG

Sorensen), montada em peça reta (Kavo) adaptada a um motor elétrico BLM 600

(Driller) (Figura 3).

Quadro 1.Identificação dos grupos a serem estudados. mo (movimento ortodôntico), S (sacrifício); C (aplicação de clodronato) e N (número de animais por grupo).

31

A força desenvolvida pela mola foi de 45g. Para proceder à ativação do

aparelho, os animais foram posicionados num dispositivo de acrílico ligeiramente

Figura 3. a e b. Confecção do orifício entre os incisivos superiores com broca esférica nº2 (KG Sorensen).

a b

Figura 2. Adaptação cervical do conjunto amarrilho-mola de NiTi ao primeiro molar superioresquerdo: a. fio de amarrilho metálico 0.08” (Dental Morelli) sendo introduzido na região entre 1º e 2ºmolares superiores esquerdos com o auxílio de uma pinça Mathiew; b. fio de amarrilho após passar pelo ponto de contato; c. fio de amarrilho envolvendo o 1ºM com a respectiva mola de NiTi; d. amarração do conjunto mola-fio de amarrilho com o auxílio da Mathiew à cervical do 1ºM.

d

ba

c

32

inclinado, em decúbito dorsal, com a cabeça perpendicular ao solo. Foi preso ao

amarrilho fixado à extremidade anterior da mola de NiTi um peso de chumbo de 45g

que ficou suspenso, criando uma distensão na mola produzindo força equivalente

(Figura 4a e b). O amarrilho envolveu os incisivos e foi fixado à sua superfície

vestibular, previamente atacada com ácido fosfórico a 37% (Vigodent), sendo

coberto por resina composta fotopolimerizável (Vigodent), removendo-se o excesso

de fio de amarrilho com alicate de corte específico (Unitek- 3M) (Figura 5a e c).

O movimento dentário ortodôntico ocorreu durante sete dias, ao término dos

quais os ratos foram mortos.

Mandíbula – Os procedimentos na mandíbula limitaram-se à extração do

primeiro molar esquerdo, realizada com o auxílio de pinça mosquito (Quinelato); e ao

desgaste dos incisivos para evitar danos o aparelho, realizado com fresa do tipo

b

Figura 4. a. Animal posicionado em dispositivo de acrílico ligeiramente inclinado, em decúbito dorsal, com a cabeça perpendicular ao solo; b. peso de chumbo de 45g preso ao amarrilho fixado à extremidade anterior da mola de NiTi, distendendo-a, produzindo força equivalente.

a b

33

roda (KG Sorensen), montada em peça reta (Kavo) adaptada a um motor elétrico

BLM 600 (Driller) (Figura 5b).

3.3.3 Administração do Clodronato

O clodronato utilizado foi o Ostac® (sal sódico do ácido clodrônico) em

solução injetável (Figura 6). Sua administração ocorreu por via subcutânea numa

concentração de 10 mg/Kg. A solução de clodronato foi preparada diluindo-o em

água destilada, até alcançar uma concentração de 2x10-3M, sendo o seu pH

ajustado a 7,4.

Figura 5. a. Fotopolimerização da resina na região anterior; b. desgaste dos incisivos inferiores com fresa do tipo roda (KG Sorensen)e c. aparelho montado.

a

b c

34

Os animais do Grupo I receberam a medicação nos dias 0, 2, 4 e 6 em dose

única e horário pré-estabelecido; e os animais do Grupo II receberam o bisfosfonado

em dose única no quinto dia, também em horário pré-estabelecido.

3.3.4 Avaliação da quantidade de movimento dentário

A avaliação clínica da movimentação dentária consistiu na realização de

medidas iniciais e finais do período experimental, feitas duas vezes por um mesmo

examinador, previamente calibrado, com o auxílio de paquímetro de precisão

(Beerendonk Caliper 78532 - AESCULAP). Foram utilizadas como referências a face

mesial do primeiro molar superior esquerdo e um orifício criado na resina localizada

na face vestibular dos incisivos superiores. Considerou-se como taxa de

movimentação dentária a diferença entre as medidas iniciais e finais (Figura 7).

Figura 6. OSTAC – Solução injetável.

35

3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

Após a morte dos animais, os ossos maxilares foram dissecados e

osteotomizados para a obtenção de secções teciduais das regiões mesial e distal

aos primeiros molares superiores, englobando estruturas periodontais e dentárias

(Figura 8).

A fixação das peças foi feita com solução contendo paraformaldeído a 4%,

Glutaraldeído a 2,5%, tamponada com Cacodilato 0,1M. Subseqüentemente, foram

Figura 7. a. Avaliação da distância entre a face mesial do primeiro molar superior esquerdo e um orifício criado na vestibular dos incisivos superiores, utilizando paquímetro de precisão (Beerendonk Caliper 78532 - AESCULAP); b. espaço criado na distal do primeiro molar pelo deslocamento mesial deste durante uma semana de aplicação de força (seta).

a b

Figura 8. Osso maxilar osteotomizado.

36

descalcificadas por quatro semanas em solução contendo 10g de EDTA para 50mL

de Cacodilato de 0,2M.

As peças descalcificadas foram reduzidas em suas porções mesial e distal, de

modo a preservar a região de implantação dos molares, e incluídas em parafina.

Secções sagitais seriadas de 3µm, processadas para coloração de rotina

(hematoxilina e eosina – HE), foram usadas para observações em microscópio de

luz (Olympus BX51).

3.5 COLETA DE DADOS E ANÁLISE DAS LÂMINAS

Utilizando-se microscopia de luz em aumentos variados, um único

examinador, previamente calibrado, realizou uma análise descritiva e semi-

quantitativa, considerando a presença ou ausência dos seguintes aspectos

representativos do processo de movimentação ortodôntica: reabsorção radicular,

reabsorção óssea e concentração de osteoclastos. Para tanto, foram avaliadas as

áreas de compressão e tração do ligamento periodontal na região de furca no terço

cervical (superfície mesial da raiz distal e distal da raiz mesial, respectivamente).

A padronização da análise semi-quantitativa foi obtida pela determinação de

referenciais numéricos de correlação abaixo especificados (Quadro 2).

0 – Ausente

1- Leve

2 - Moderado

3 – Intenso

No instante da coleta, os dados foram registrados em tabelas com as

informações esquematizadas como apresentado (Quadro 3).

Quadro 2. Representação esquemática dos referenciais numéricos utilizados.

37

Reabsorção Radicular

Reabsorção Óssea

Concentração de Osteoclastos

Quando da análise, os dados coletados foram organizados e as lâminas

fotografadas por meio de sistema fotográfico digital Sansung acoplado ao

microscópio (Olympus BX51).

Os resultados obtidos foram analisados no software GraphPad Prism® versão

4.0, sendo que as diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de análise

de variância (ANOVA), tendo-se adotado como estatisticamente significantes valores

de p menores que 0,05 (p<0,05).

Quadro 3. Representação da tabela utilizada para registro dos dados

38

4 DESENVOLVIMENTO SEQUENCIAL DA PESQUISA

4.1 ARTIGO 1 (a ser submetido para publicação no periódico The Angle

Orthodontist)

Avaliação dos Efeitos do Clodronato na Movimentação Dentária e Reabsorção

Radicular em Rattus norvegicus

Telles-Pinheiro, A. M.; Vannier-Santos, M. A.; Oliveira-Costa, M. R. L.

Resumo

Objetivo: Avaliar os efeitos induzidos pela aplicação de clodronato na fase

intermediária (5º dia) do ciclo de remodelação alveolar em ratos submetidos à

movimentação dentária induzida ortodonticamente.

Materiais e Métodos: Dezoito ratos foram distribuídos em três grupos: CONTROLE,

com 6 animais; GRUPO I, com 5 animais (clodronato administrado nos dias 0, 2, 4 e

6); GRUPO II, com 7 animais (clodronato administrado no 5º dia). Todos foram

submetidos à movimentação dentária ortodôntica e mortos no sétimo dia do

experimento. A taxa de movimentação foi calculada e foram avaliados

39

histologicamente os seguintes aspectos: reabsorção radicular, reabsorção óssea e

concentração de osteoclastos.

Resultados: Comparando-se as taxas de movimentação foi encontrada diferença

estatisticamente significante entre os grupos CONTROLE e I, o que não ocorreu

entre o CONTROLE e o GRUPO II. Durante a análise histológica semi-quantitativa o

GRUPO CONTROLE apresentou concentração de osteoclastos superior em relação

ao GRUPO II (83% e 43%, respectivamente, para o grau moderado-intenso). A

reabsorção óssea nesses dois grupos, por sua vez, não apresentou diferenças

marcantes (50% e 57%, respectivamente, para o grau moderado-intenso), enquanto

que a reabsorção radicular foi maior no GRUPO CONTROLE do que nos grupos I e

II (respectivamente 67%, 20% e 57% para o grau moderado-intenso).

Conclusões: A associação dos achados histológicos à taxa de movimentação

dentária sugere que o uso do clodronato no quinto dia do experimento pode diminuir

a reabsorção radicular com pouca influência na movimentação dentária induzida

ortodonticamente.

PALAVRAS-CHAVE: Clodronato; Reabsorção radicular; Movimentação dentária

ortodôntica.

40

INTRODUÇÃO

Inúmeros estudos vêm sendo desenvolvidos ao longo dos anos com o

objetivo de se descobrir recursos através dos quais se consiga diminuir o risco de

reabsorção radicular durante o tratamento ortodôntico. Após a descoberta da

eficácia dos bisfosfonados na formação e dissolução de fosfato de cálcio in vitro,

bem como na mineralização e reabsorção óssea in vivo, estes passaram a ser

utilizados no tratamento de desordens ósseas tais como a Doença de Paget, a

hipercalcemia maligna, a displasia fibrosa, e a osteoporose 1 - 5 e, por ligarem-se de

maneira eficiente à hidroxiapatita, têm sido associados a uma provável interferência

na reabsorção óssea e radicular.

O mecanismo de ação desses agentes ainda não foi completamente

esclarecido e cada grupo de bisfosfonado apresenta suas próprias características

químicas, físico-químicas e biológicas 1, 3, 5, 6, 7, sendo elas dose-dependentes 8 - 11.

O clodronato encontra-se no grupo dos bisfosfonados que contém dois

átomos de Cloro na cadeia lateral, apresentando propriedades físico-químicas

semelhantes às dos demais, inibindo, portanto, a função osteoclástica 11 - 14.

Os efeitos positivos de tais compostos podem ser aplicados à clínica

ortodôntica, o que justifica um número cada vez maior de pesquisas nessa área. A

exemplo disso, um estudo feito com administração tópica e sistêmica de

bisfosfonados em ratos mostrou que tanto a movimentação ortodôntica como a

recidiva podem ser evitadas. Isto torna tais substâncias úteis no reforço de

ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico 4, 6, 11. Além disso, a

administração local de bisfosfonado causa a redução tanto no número de lacunas de

reabsorção quanto no de odontoclastos durante a movimentação ortodôntica 6.

41

Os dados conseguidos a partir de uma ativação simples de aparelhos

ortodônticos montados em ratos sugerem que o período entre o estímulo e o

aumento detectável na população de osteoclastos é de aproximadamente três dias,

sendo este o intervalo mínimo para que a remodelação óssea alveolar apareça

nesses animais (um e quatro dias após a ativação inicial) 15 - 17. Por sua vez, o

número e o tamanho dessas células, além do perímetro da erosão atingem o seu

pico no quinto dia de movimentação dentária ortodôntica experimental, sendo a

superfície mesial radicular (lado de pressão) a mais atingida 18.

Acredita-se que o período de maior concentração de osteoclastos na

superfície radicular não coincida com o de máxima atividade dessas células na

superfície óssea e, conseqüentemente, com o de movimentação ortodôntica mais

intensa. De fato, num estudo desenvolvido por Rody Jr. e colaboradores, em 2001, a

cinética osteoclástica foi observada, tendo sido constatado que o número de

osteoclastos no dia 3 encontra-se significativamente maior no osso alveolar e no

ligamento periodontal. Por outro lado, na superfície radicular esse pico ocorre no dia

7, evidenciando que tais células chegam nessas diferentes regiões em momentos

distintos19 - 21.

O objetivo desta pesquisa é avaliar os efeitos induzidos pela aplicação de

clodronato na fase intermediária (5º dia) do ciclo de remodelação alveolar em ratos

submetidos à movimentação dentária induzida ortodonticamente.

42

MATERIAIS E MÉTODOS

Esta pesquisa consistiu num estudo experimental com Rattus Norvegicus,

tendo seguido as normas de conduta de experimentação animal do Centro de

Pesquisa Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-Ba) e as Normas

para a Prática Didático-Científica da Vivissecção de Animais, recomendadas pela Lei

6638 de 08 de maio de 1979.

Os animais foram fornecidos e mantidos no biotério da FIOCRUZ-Ba, em

temperatura ambiente, com iluminação dia e noite, alimentados com ração Purina

LabinaTM e água ad libitum e pesados quando da montagem do aparelho e no dia da

morte, com o objetivo de se observar quaisquer alterações de peso relacionadas à

alimentação e/ou às condições experimentais

Dezoito ratos (Rattus norvegicus), machos, com aproximadamente 300g e

dois meses de vida foram distribuídos, aleatoriamente, em três grupos: CONTROLE,

com seis animais; GRUPO I, com cinco animais tratados com administração do

clodronato por via subctânea nos dias 0, 2, 4 e 6 do experimento; e GRUPO II, com

sete animais tratados com administração em dose única de clodronato por via

subcutânea no dia 5. Todos os animais foram submetidos à movimentação dentária

ortodôntica e mortos no dia 7 do experimento.

Os procedimentos foram realizados sob anestesia geral, obtida pela

associação de 1,33 mL/kg de cloridrato de quetamina e 0,67 mL/kg de xilazina por

via subcutânea.

O aparelho consistiu na utilização de fio de aço inoxidável de 0.08” (fio de

amarrilho) da marca Dental Morelli para laçar o primeiro molar superior esquerdo . A

esse amarrilho foi adaptada uma mola fechada de níquel-titânio (NiTi) da TP

43

Orthodontics®, presa na sua extremidade anterior a fio de amarrilho de mesmo

calibre e marca. Esse, por sua vez, foi introduzido em orifício criado entre os

incisivos superiores, no terço cervical, com broca esférica nº2 (KG Sorensen),

montada em peça reta (Kavo) adaptada a um motor elétrico BLM 600 (Driller).

A força liberada pela mola foi de 45g. Para proceder à ativação do aparelho,

os animais foram posicionados num dispositivo de acrílico ligeiramente inclinado, em

decúbito dorsal, com a cabeça perpendicular ao solo. Foi preso ao amarrilho fixado à

extremidade anterior da mola de NiTi um peso de chumbo de 45g que ficou

suspenso, criando uma distensão na mola produzindo força equivalente. O amarrilho

envolveu os incisivos e foi fixado à sua superfície vestibular, previamente atacada

com ácido fosfórico a 37% (Vigodent), sendo coberto por resina composta

fotopolimerizável (Vigodent), removendo-se o excesso de fio de amarrilho com

alicate de corte específico (Unitek- 3M) (Figura 1a).

Os procedimentos na mandíbula limitaram-se à extração do primeiro molar

esquerdo e ao desgaste dos incisivos para evitar danos ao aparelho.

O clodronato utilizado foi o Ostac® (sal sódico do ácido clodrônico) em

solução injetável. Sua administração ocorreu por via subcutânea numa concentração

de 10 mg/Kg. A solução de clodronato foi preparada diluindo-o em água destilada,

até alcançar uma concentração de 2x10-3M, sendo o seu pH ajustado a 7,4. Os

animais do GRUPO I receberam a medicação nos dias 0, 2, 4 e 6 em dose única e

horário pré-estabelecido; e os animais do GRUPO II receberam o bisfosfonado em

dose única no dia 5, também em horário pré-estabelecido.

O movimento dentário ortodôntico ocorreu durante sete dias, ao término dos

quais os ratos foram mortos.

44

A avaliação clínica da movimentação dentária consistiu na realização de

medidas iniciais e finais do período experimental, com o auxílio de paquímetro de

precisão (Beerendonk Caliper 78532 - AESCULAP). Foram utilizadas como

referências a face mesial do primeiro molar superior esquerdo e um orifício criado na

resina localizada na face vestibular dos incisivos superiores. Considerou-se como

taxa de movimentação dentária a diferença entre as medidas iniciais e finais (Figura

1b e c). Esses dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA).

Após a morte dos animais, os ossos maxilares foram dissecados e

osteotomizados para a obtenção de secções teciduais das regiões mesial e distal

aos primeiros molares superiores, contendo estruturas periodontais e dentárias.

A fixação das peças foi feita com solução contendo paraformaldeído a 4%,

glutaraldeído a 2,5%, tamponada com cacodilato 0,1M. Subseqüentemente, foram

descalcificadas por quatro semanas em solução contendo 10g de EDTA para 50ml

de cacodilato de 0,2M.

As peças descalcificadas foram reduzidas em suas porções mesial e distal, de

modo a preservar a região de implantação dos molares, e incluídas em parafina.

Secções sagitais seriadas de 3µm, processadas, coradas com hematoxilina e eosina

(HE), foram usadas para observações em microscópio de luz (Olympus BX51).

Foram realizadas análises descritiva e semi-quantitativa, considerando-se os

seguintes aspectos: reabsorção radicular, reabsorção óssea e concentração de

osteoclastos. Para tanto, foram avaliadas as áreas de compressão do ligamento

periodontal na região de furca, no terço cervical (superfície mesial da raiz distal).

Os resultados obtidos foram analisados no software GraphPad Prism® versão

4.0, sendo que as diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de análise

45

de variância (ANOVA). Foram considerados estatisticamente significantes valores de

p menores que 0,05 (p<0,05).

46

RESULTADOS

- Movimentação Dentária

Pelo teste de Kolomorov-Smirnov, constatou-se distribuição normal da taxa de

movimentação entre os três grupos, com p valor igual a 0,05.

A média de movimentação dentária para o GRUPO CONTROLE foi de

1,1mm; para o GRUPO I, 0,5mm e para o GRUPO II, 0,9mm. A análise de variância

(ANOVA) indicou diferença estatisticamente significante entre o GRUPO

CONTROLE e o GRUPO I, o que não foi detectado entre o GRUPO II e o GRUPO

CONTROLE (Gráfico 1), com p < 0,001.

- Reabsorção Óssea

A reabsorção óssea encontrou-se em grau moderado-intenso em 50% dos

espécimes para o GRUPO CONTROLE e 57% para o GRUPO II (Figura 2). Essa

diferença, todavia, não foi considerada estatisticamente significante.

Cem por cento das peças avaliadas do GRUPO I apresentaram reabsorção

óssea em grau ausente-leve. Quando esses dados são comparados com os dos

outros dois grupos, percebe-se significância estatística (p=0,046) (Figura 3; Gráfico

2).

- Reabsorção Radicular

No grupo CONTROLE observou-se 33% da amostra apresentando

reabsorção radicular em grau ausente-leve, enquanto que 67% apresentaram esse

mesmo aspecto variando de moderado a intenso (Gráfico 3). A maioria dessas

lacunas eram ativas, contendo osteoclastos no seu interior (Figura 4).

47

No GRUPO II o padrão de reabsorção radicular foi mais suave, com 43%

apresentando-o em grau ausente-leve (Figura 6b) e 57%, moderado-intenso (Gráfico

3). Uma diferença marcante foi que a maior parte dessas lacunas apresentaram-se

inativas, com ausência de células multinucleadas no seu interior e, muitas dessas

lesões, em franca regeneração (Figura 5).

No GRUPO I 80% dos animais exibiram esse aspecto de forma ausente-leve,

enquanto os outros 20%, moderado-intenso (Figura 6a).

- Concentração de Osteoclastos

A concentração de osteoclastos, dentro de um padrão moderado-intenso, no

GRUPO CONTROLE foi de 83% (Figura 2a). O GRUPO II, por sua vez, apresentou

esse mesmo padrão em 43% (Figura 2b) e no GRUPO I 100% dos espécimes exibiu

essa taxa em grau ausente-leve (Figura 7; Gráfico 4).

Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos I e CONTROLE.

48

DISCUSSÃO

A montagem do aparelho utilizada trouxe como vantagem a liberação de força

durante um intervalo de tempo suficientemente longo para induzir a reabsorção

radicular de forma constante, além de ser bem tolerada pelos animais, o que está de

acordo com os achados de Brudvik & Rygh, em 1993. Essa foi padronizada em 45g,

sendo capaz de estimular a movimentação ortodôntica, além de induzir a

diferenciação de um grande número de osteoclastos 16, 21 - 23.

Foram utilizadas, como recurso para ativação do aparelho, molas de níquel-

titânio. Dessa forma, buscou-se eliminar os efeitos do tempo, temperatura, pH

salivar, absorção de água e da deformação permanente sofridos pelos recursos

elastoméricos 24.

Apesar de alguns autores defenderem a idéia de que os estudos que

descrevem as características e a resposta biológica durante a fase linear do

movimento dentário ortodôntico devam apresentar um período experimental de pelo

menos duas semanas 25, o presente trabalho levou em consideração que a fase de

recrutamento dos osteoclastos normalmente coincide com o primeiro dia após a

ativação inicial do aparelho no rato, enquanto que o pico do aumento no seu número

ocorre quatro dias após a ativação inicial 16, 17. Acredita-se ainda que o aumento na

concentração dessas células se dá de maneira diferenciada para o osso alveolar e

para a superfície radicular. Rody Jr. e colaboradores, em 2001, constataram que o

número de osteoclastos no dia 3 encontra-se significativamente maior no osso

alveolar e no ligamento periodontal. Por outro lado, na superfície radicular esse pico

ocorre no dia 7, evidenciando que tais células chegam nessas diferentes regiões em

momentos distintos 20. Dessa forma, os animais foram sacrificados no sétimo dia do

49

experimento, o que está de acordo com metodologias desenvolvidas também em

outros trabalhos 18, 20, 21, 23.

A mecânica ortodôntica utilizada produz um deslocamento dentário inicial de

inclinação mesial, cujo centro de resistência localiza-se próximo ao ápice radicular,

criando áreas de tensão e compressão bem características. Por essa razão, foi

escolhido para ser avaliado o terço cervical da superfície mesial da raiz distal na

região de furca (área de compressão), concordando com relatos encontrados na

literatura 18, 22, 23. Tais regiões são claramente de maior risco para a reabsorção

radicular do que as de tensão, por apresentarem indução osteoclástica associada à

existência de força compressiva no ligamento periodontal 17, 18, 23, 26.

Tem sido observado que o osso alveolar adjacente a áreas de hialinização

tecidual não é reabsorvido na fase inicial da movimentação dentária 26. Tais regiões

são comumente observadas no terceiro ou quarto dia de experimento, normalmente

nas superfícies mesiais das raízes, podendo estar relacionadas com reabsorções

radiculares 22. Nesse estudo, poucas áreas de tecido hialinizado puderam ser

detectadas. Esse baixo índice pode estar associado ao fato dos animais terem sido

sacrificados no sétimo dia do experimento, o que pode sugerir que uma eliminação

prévia do tecido necrótico já tenha ocorrido, deixando como seqüelas áreas de

reabsorção radicular, caracterizadas como pequenas lacunas ou cavidades no

cemento, algumas atingindo a junção cemento-dentinária 9, 10, 27.

A remoção do tecido hialinizado ocorre antes e durante o restabelecimento do

ligamento periodontal. Dessa forma, algumas áreas da superfície radicular tornam-

se menos protegidas e, portanto, mais susceptíveis à reabsorção, sendo

prontamente atacadas por osteoclastos. Uma vez criadas as lacunas de reabsorção,

o cemento é removido da sua superfície de maneira gradativa 9, 10, 27. Com isso, após

50

movimentação induzida, além de ter sido detectada redução significativa na altura da

crista alveolar na região de furca e alargamento da membrana periodontal na

periferia dos sítios de compressão, também foram observadas lacunas de

reabsorção radicular ativas nos três grupos 22.

Analisando os dados obtidos a partir do GRUPO CONTROLE, observa-se um

quadro histológico previsível, com uma concentração de osteoclastos variando,

principalmente, de moderada a intensa, compatível com a estimulação ortodôntica

desenvolvida 15 - 18, 21, 23, 26.

No GRUPO I foi detectada uma concentração de 100% da reabsorção óssea

dentro de um padrão ausente-leve, o que condiz com a concentração reduzida do

número de osteoclastos presentes (100% - ausente-leve). Pela mesma razão, as

lacunas de reabsorção radicular ativas não foram observadas ou encontraram-se de

forma leve na maioria dos animais avaliados desse grupo (80%), o que está de

acordo com a literatura quando afirma que a administração de bisfosfonado causa a

redução tanto no número de lacunas de reabsorção quanto no de osteoclastos

durante a movimentação ortodôntica 6.

Sendo assim, a taxa de movimentação dentária para esse grupo mostra que a

administração do clodronato influenciou tal aspecto, vez que diminuiu de forma

estatisticamente significativa quando comparada com o GRUPO CONTROLE, o que

concorda com a literatura quando sugere que tais substâncias podem ser úteis no

reforço de ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico4, 6, 11.

Para o GRUPO II, a administração do clodronato ocorreu no quinto dia de

movimentação ortodôntica, uma vez que existem estudos que afirmam que do

primeiro ao sétimo dia após a aplicação de uma força ortodôntica, a concentração de

pré-osteoclastos e osteoclastos aumenta no lado de pressão do ligamento

51

periodontal, havendo um pico no quarto ou quinto dia na superfície alveolar e um

decréscimo a partir do sétimo15 - 18, 20, 21, 23, 26. Por outro lado, no sétimo dia estaria

ocorrendo um aumento no número de osteoclastos na superfície radicular20. Com a

metodologia aplicada a esse grupo, buscou-se atingir uma concentração máxima do

bisfosfonado coincidente ao momento de maior atividade osteoclástica na superfície

radicular. Há autores, entretanto, que indicam que, na circunferência do ligamento

periodontal necrótico, a reabsorção radicular ocorre após 2 a 3 dias em ratos 22.

O GRUPO II apresentou uma concentração de osteoclastos

predominantemente dentro de um padrão ausente-leve (57%), especialmente na

superfície radicular. Dessa forma, as lacunas de reabsorção radicular apresentaram-

se com menor freqüência, dimensão e atividade osteoclástica quando comparadas

ao GRUPO CONTROLE sem, entretanto, influenciar significativamente a taxa de

movimentação dentária. Tal fato deve-se, provavelmente, à atuação do clodronato

nas fases iniciais do ciclo de remodelação no rato, coincidindo com o pico de

osteoclastos na superfície radicular. Esses resultados são importantes quando

confrontados com relatos prévios da utilização clínica dos bisfosfonados em

Ortodontia para inibir a reabsorção óssea 1, 9, 10, 28, 29, podendo ser úteis no reforço de

ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico 6, 11. Tais propriedades

precisam ser entendidas sempre como dependentes da dose e do período do ciclo

de remodelação em que a droga é administrada8 - 11.

A dose diária subcutânea relativamente alta de 10 mg/Kg do clodronato vem

sendo usada em diversos estudos desenvolvidos em ratos e tem mostrado aumentar

a densidade óssea desses animais 30. Tal fato fundamentou a dosagem utilizada no

presente trabalho, assim como o tempo de aplicação da droga baseou-se na cinética

osteoclástica que vem sendo estudada ao longo dos anos, demonstrando que,

52

dependendo do período em que a droga é administrada, a população de

osteocalstos vai estar mais concentrada na superfície alveolar ou radicular20.

O fato de que no GRUPO II houve uma diminuição no número de

osteoclastos e estes estariam tendendo a concentrar a sua ação na reabsorção

óssea pode sustentar a hipótese de que o pico da concentração dessas células na

raiz ocorre posteriormente, ou sugerir que cementoclastos e osteoclastos podem

apresentar meias-vidas diferentes 19- 21.

Quando os três grupos são comparados em relação à taxa de movimentação

dentária, observa-se que não houve diferenças estatisticamente significante entre os

grupos CONTROLE e II, podendo-se inferir que, apesar do clodronato ter sido

administrado, a movimentação ortodôntica não foi alterada. Entre os grupos

CONTROLE e I, por sua vez, foi detectada uma diminuição desse mesmo aspecto

com significância estatística. Duas considerações podem ser feitas acerca desses

achados: a primeira é a de que o clodronato estaria interferindo na cinética

osteoclástica, vez que, sendo administrado no quinto dia, conseguiria inibir o

aumento da concentração dessas células na superfície radicular, já tendo esse

mesmo pico ocorrido na superfície óssea e, portanto, possibilitando a movimentação

dentária ortodonticamente induzida, ao contrário do que foi observado no GRUPO I.

Nesse, a administração do medicamento nos dias indicados pode ter atuado numa

fase inicial da movimentação dentária, quando a concentração de osteoclastos é alta

na superfície alveolar, impedindo a reabsorção nessa região e, por conseguinte, o

deslocamento do dente. Outra consideração a ser feita é se essa interferência

ocorreu em virtude da dosagem do medicamento ter sido diferenciada. Para

esclarecer eventuais dúvidas outros estudos devem ser realizados, com variações

nas dosagens, em períodos diferentes.

53

Qualquer correlação a ser feita com o movimento ortodôntico em humanos,

deve considerar que neles a fase em que o osso é reabsorvido no ciclo de

remodelação dura aproximadamente um mês, enquanto que o mesmo período

aparenta finalizar em aproximadamente uma semana em estudos realizados em

ratos17.

Um dos maiores interesses relacionados a esse tipo de experimento consiste

em quanto tais achados podem ser extrapolados para o ser humano. Uma vez que a

maioria dos estudos com experimentação animal vem sendo realizada em ratos, as

diferenças morfológicas e fisiológicas entre esses animais e o osso alveolar e o

ligamento periodontal humanos devem ser consideradas. De modo particular, o

desenvolvimento tecidual durante a formação radicular e as mudanças decorrentes

da ativação ortodôntica aparentam ser mais rápidas nos ratos do que nos seres

humanos, apesar dos seus principais mecanismos serem muito semelhantes17.

É sabido que um número cada vez maior de pacientes que procura o

consultório odontológico para realizar tratamento ortodôntico pode fazer uso dos

bisfosfonados para controle de desordens ósseas, o que torna imprescindível o

entendimento dos mecanismos de ação desses medicamentos e sua possível

interferência na mecânica ortodôntica.

Esse estudo introduz importantes considerações quanto às possibilidades do

uso dessa classe de medicamentos para o controle clínico da reabsorção radicular.

Entretanto, experimentos mais específicos devem ser realizados para confirmação

desses achados e determinação de dosagens e métodos de administração efetivos.

54

CONCLUSÃO

A administração do clodronato no quinto dia não trouxe alterações

significantes para a taxa de movimentação dentária;

A aplicação do clodronato diminuiu sensivelmente as reações histológicas do

periodonto de inserção de ratos (Rattus norvegicus), entretanto, quando

aplicado no quinto dia do ciclo de remodelação óssea o aspecto mais

influenciado dentre os estudados foi a reabsorção radicular;

A associação dos achados histológicos à taxa de movimentação dentária

sugere que o uso do clodronato no quinto dia do experimento pode diminuir a

reabsorção radicular com pouca influência na movimentação dentária

induzida ortodonticamente.

55

AGRADECIMENTOS

A André Luiz Andrade Pinheiro, Myrela Galvão Cardoso Costa, Diego

Menezes, pela colaboração durante toda a fase de execução do trabalho; a Luciana

Ramalho, pelo auxílio na avaliação histológica de todo o material coletado; a Cristina

Cangussu, pela ajuda inestimável na estatística do estudo e a Cristina dos Santos

Vasconcelos, pelo empenho que dedicou no processamento das lâminas.

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LEGENDAS DAS FIGURAS E DOS GRÁFICOS

Figura 1. a. Aparelho montado; b. Avaliação da distância entre as cavidades de

referência utilizando paquímetro; c. Espaço criado na distal do primeiro molar pelo

deslocamento mesial deste durante uma semana de aplicação de força (seta).

Figura 2. a. Reabsorção óssea em grau moderado-intenso observada em amostras

do GRUPO CONTROLE; b. Lacunas de reabsorção contendo osteoclastos no seu

interior (setas). Ligamento periodontal (LP); cemento radicular (CR); osso alveolar

(OA); dentina (D). Aumento de 400x. H. E.

Figura 3. Área de pressão na região de furca. Comparação entre o padrão de

reabsorção óssea nos grupos I (a) e II (b). Lacunas de reabsorção óssea (setas).

Aumento de 200x. H.E.

Figura 4. Lacunas de reabsorção radicular ativas (setas) em amostras do GRUPO

CONTROLE. Aumento de 1000x. H. E.

Figura 5. Lacunas de reabsorção radicular inativas em amostras do GRUPO II.

Áreas de reparo (setas). Aumento de 1000x. H. E.

Figura 6. Integridade radicular em amostras dos grupos I (a) e II (b). pode-se

observar ausência de reabsorção radicular mesmo na periferia de área de

hialinização (setas). Aumento de 400x. H. E.

Figura 7. a. Concentração de osteoclastos em grau ausente-leve em amostras do

GRUPO I. Aumento de 200x. H. E. b. Baixa concentração de osteoclastos próximo a

60

área de hialinização no GRUPO I. Lacunas de reabsorção óssea (setas); área de

hialinização (H). Aumento de 1000x. H. E.

Gráfico 1. Comparação entre as taxas de movimentação dos três grupos, tendo

como teste estatístico o ANOVA (**p = 0,000) **p= p valor.

Gráfico 2. Proporção de lacunas de reabsorção óssea ausentes-leves e moderadas-

intensas nos grupos estudados. Houve diferença estatisticamente significante do

GRUPO I em relação aos grupos CONTROLE e II (p=0,046).

Gráfico 3. Proporção de lacunas de reabsorção radicular nas intensidades ausente-

leve e moderada-intensa nos grupos estudados. Não houve diferença

estatisticamente significante entre os grupos (p=0,253).

Gráfico 4. Proporção da concentração de osteoclastos nas intensidades ausente-

leve e moderada-intensa nos grupos estudados. Houve diferença estatisticamente

significante do GRUPO I em relação aos grupos CONTROLE e II (p=0,008).

61

FIGURAS

Figura 1

a

b

c

62

Figura 3

a b

LPLP

D D

OA OA

CR CR

Figura 4

a b

LP

LP

DD

CR

CR

Figura 2

a b

LP

LP

D

D

OA

OAOA

CR

63

Figura 6

a b

LPLP

D D

OA OA

CR

CR

Figura 7

a b LP

LP

D

D

CRCR

OA

OA

H

Figura 5

a b

LP LP

D

D

CR

CR

64

GRÁFICOS

Gráfico 1

Reabsorção Óssea

012345678

Controle Grupo I GrupoII

Ausente-Leve Moderado-Intenso

Gráfico 2

* *p < 0,001

p=0,046

100%

50%

50%

57%

43%

1,12

0,47

0,9

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Controle Grupo I Grupo II

Taxa

de

Mov

imen

taçã

o D

entá

ria (m

m)

65

Reabsorção Radicular

012345678

Controle Grupo I Grupo II

Ausente-Leve Moderado-Intenso

Gráfico 3

Concentração de Osteoclastos

012345678

Controle Grupo I Grupo II

Ausente-Leve Moderado-Intenso

Gráfico 4

p=0,008

p=0,253

80%

67%

33%

57%

43%

20%

100%83%

17%

57%

43%

66

4.2 ARTIGO 2 (a ser submetido para publicação no periódico Dental Press)

Mecanismos da Ação dos Bisfosfonados (Clodronato) e sua Influência na

Clínica Ortodôntica

Telles-Pinheiro, A. M.; Vannier-Santos, M.; A. Oliveira-Costa, M. R. L.

Resumo

O objetivo deste trabalho é fazer uma breve revisão de literatura acerca das

alterações metabólicas decorrentes da administração dos bisfosfonados,

particularmente do clodronato, uma vez que, sendo a hidroxiapatita o seu principal

alvo, tanto o tecido ósseo quanto o dentário podem sofrer modificações. Desta

forma, é interessante que o ortodontista conheça o tema, afim de que possa antever

possíveis implicações durante o tratamento ortodôntico de pacientes que fazem uso

crônico deste medicamento, assim como conhecer os benefícios que, futuramente,

poderão ser aplicados à clínica ortodôntica.

PALAVRAS-CHAVE: Bisfosfonados; Clodronato; Mineralização óssea;

Osteoporose; Doença de Paget.

INTRODUÇÃO

A reabsorção óssea é uma importante função celular para o desenvolvimento

e a fisiologia do esqueleto. A fisiopatologia de muitas desordens ósseas inclui tanto

o aumento (como a exemplo da osteoporose, metástases ósseas e a doença de

Paget) quanto a diminuição (variadas síndromes da osteoporose) do grau de

reabsorção óssea. Portanto, existe uma necessidade genuína de regular,

67

especialmente inibir, este processo em muitas dessas doenças, o que pode ocorrer

de várias formas: diminuição no número de osteoclastos formados; inibição do seu

mecanismo de ação; ou indução da morte celular prematura. Esses aspectos, além

de serem regulados por mediadores fisiológicos, vêm sendo utilizados na terapêutica

clínica medicamentosa e em abordagens experimentais para inibir a reabsorção

óssea 1.

68

BISFOSFONADOS

Os bisfosfonados foram primeiramente sintetizados na Alemanha, em 1865,

tendo sido o Etidronato o primeiro a ser utilizado para tratamento em humanos, há

aproximadamente cem anos 2.

Após a descoberta de que podem controlar de maneira eficiente a formação e

dissolução de fosfato de cálcio in vitro, assim como a mineralização e a reabsorção

óssea in vivo, os bisfosfonados foram desenvolvidos e usados no tratamento de

desordens ósseas como a doença de Paget, a hipercalcemia maligna e a

osteoporose 3, 4. Cada bisfosfonado deve ser considerado um complexo isolado,

cujas estruturas os tornam específicos para o tecido ósseo ou outros tecidos

mineralizados 5.

Estes compostos são análogos dos pirofosfatos nos quais a ponte de oxigênio

foi deslocada por um carbono com várias cadeias laterais (P-C-P) 3, 4, 6-8. Ambos

ligam-se fortemente à hidroxiapatita, o que explica sua ação farmacológica

específica nos tecidos mineralizados, em especial nos ossos 2, 3, 7, 9-11. De fato, eles

se depositam preferencialmente em locais de reabsorção osteolcástica ativa, sendo

liberados quando o osso sobre o qual ele se encontra depositado é novamente

reabsorvido, inibindo tal processo 3, 4, 12. Todavia, o tratamento de osteoclastos,

monócitos e células tumorais com bisfosfonados, levou à morte celular, indicando

que a reabsorção óssea não é essencial para que a droga penetre nas células 4. Da

mesma forma, há estudos que demonstram que a hidroxiapatita não é essencial

para que tais compostos sejam ativados, apesar de não excluírem a possibilidade de

a sua incorporação nessa matriz contribuir para a sua eficácia in vivo 13.

69

O grupo P-C-P é resistente à hidrólise enzimática, o que explica porque os

bisfosfonados não são metabolizados no corpo, sendo excretados de forma

inalterada pelos rins, em parte por um processo de secreção tubular ativa.

Apresentam baixa absorção no intestino, o que pode ser atribuído ao tamanho e

carga do grupo atuando como agentes limitantes da sua penetração na membrana

celular. A concentração destes compostos será maior para o osso medular e menor

para o osso cortical 2, 3, 9, 11. Deve-se considerar ainda que sua meia-vida óssea é

longa, situando-se entre três meses e um ano 14.

A ação farmacológica dos bisfosfonados para uso clínico é inibir a reabsorção

óssea 3, 4, 15-17. Essa inibição levaria a um aumento na maturação óssea, o que traria

como conseguinte maior resistência à reabsorção daquele osso mais mineralizado

18. Entretanto, há estudos que sugerem a possibilidade de formação óssea quando a

droga é administrada em doses mais baixas do que aquelas necessárias para

prevenir a reabsorção. Isto pode ser atribuído ao efeito positivo no processo de

diferenciação dos osteoblastos 19. Neste sentido, há autores que defendem a idéia

de que, apesar de serem os bisfosfonados considerados ávidos por osteoclastos,

apresentam efeitos evidentes sobre os osteoblastos e osteócitos. Existe ainda ação

sobre a angiogênese; apoptose; secreção de citocinas e adesão celular; e sistema

imunológico 4.

O mecanismo de ação desses agentes ainda não foi completamente

esclarecido e cada grupo de bisfosfonado apresenta suas próprias características

químicas, físico-químicas e biológicas 2, 3, 8, 19, 20, sendo elas dose-dependentes 13, 16,

17, 21.

Os mecanismos de ação dos bisfosfonados podem ser considerados em três

níveis: tecidual, celular, e molecular 2, 3.

70

Em nível tecidual, a ação de todos os bisfosfonados aparenta ser semelhante:

redução do turnover ósseo. Isso é evidenciado pela diminuição tanto da reabsorção

quanto da formação óssea. A reabsorção é difícil de ser medida quantitativamente

através de métodos morfológicos, todavia, os bisfosfonados diminuem os seus

parâmetros, tais como a extensão da área de reabsorção ativa e a profundidade da

erosão medida a partir da superfície óssea. A esta reabsorção diminuída, soma-se

uma formação também reduzida. Já que não existe evidência de redução da

atividade osteoblástica nos sítios individuais de mineralização, conclui-se que a

redução na formação óssea total é conseqüência de reabsorção diminuída, o que

implica em menor remodelação 2, 3.

Em nível celular, os osteoclastos constituem o alvo dos bisfosfonados. Estas

células podem ter sua ação reduzida através: da inibição do seu recrutamento para

a superfície óssea; da inibição da sua atividade na superfície óssea; da diminuição

do seu ciclo celular, vez que, após desligarem-se da superfície óssea, tais

osteoclastos sofreriam um processo de apoptose; e existe ainda a teoria de que

haveria alteração óssea ou do mineral ósseo, reduzindo o grau de sua dissolução, o

que não pôde ser sustentado 3, 8, 9, 11, 15,. Há autores que afirmam que os

bisfosfonados podem atuar ainda sobre outras células envolvidas na renovação

óssea, como os osteoblastos e macrófagos. Estes apresentam a sua atividade e

proliferação inibidas in vitro. Segundo tais autores, parte da atividade anti-

reabsortiva dos bisfosfonados sobre os osteoclastos seria osteoblasto-dependente 4,

10, 22. Outros autores sugerem que os osteoclastos seriam mais sensíveis a esses

compostos do que os macrófagos 13.

Num estudo realizado por Hughes e colaboradores, ficou constatado que,

quando os osteoclastos foram expostos a três tipos de bisfosfonados (risedronato,

71

pamidronato e clodronato), sofreram apoptose in vitro, o que foi confirmado in vivo.

Estes resultados sugerem que estes compostos podem causar redução no número

de osteoclastos pela indução de apoptose osteoclástica, sendo este o seu principal

mecanismo de ação in vivo 13.

Uma vez que os odontoclastos apresentam características semelhantes aos

osteoclastos, estudos revelam que também estes últimos sofrem apoptose após a

administração de bisfosfonado, apresentando alterações citológicas, incluindo

atividade reabsortiva reduzida 20, 23.

Em nível molecular, a cadeia de eventos que leva à inativação osteoclástica

ou à sua formação diminuída, decorrente da exposição direta ou indireta a

determinado bisfosfonado ainda não foi completamente elucidada. As possibilidades

incluem tanto a sua ação direta num receptor da superfície celular e/ou a sua

fagocitose pelo osteoclasto no interior do qual ele interage com uma enzima ou outra

molécula afetando o metabolismo celular 3. O mecanismo através do qual o

bisfosfonado penetra no osteoclasto pode ser tanto a difusão passiva como durante

a reabsorção, graças às características endocíticas destas células 10, 22. Estes

processos são creditados às suas bordas em escova, apesar de alguns autores

sugerirem a existência de outra via de captação destes compostos 8.

Após a administração dos bisfosfonatos, o número de osteoclastos diminuiu

significativamente num estudo desenvolvido por Ito e colaboradores. Inicialmente,

estas células tornaram-se desprovidas das bordas em escova e destacaram-se da

superfície óssea. Nelas o aparelho de Golgi encontrava-se degradado ou disperso

no citoplasma. Logo em seguida, os osteoclastos passaram a apresentar

características típicas de apoptose, com núcleos picnóticos, mostrando

condensação e marginação de heterocromatina e fragmentação de DNA. Numa fase

72

tardia da apoptose, pôde ser observado o aumento e fusão nucleares e sua

subseqüente destruição, levando ao extravasamento dos componentes nucleares no

citoplasma. Em determinadas áreas também foi detectada a presença de

osteoclastos apoptóticos migrando para ou presentes nos capilares. Logo, a maioria

destas células é eliminada pelos macrófagos, mas algumas ainda escapam para a

corrente sanguínea 24.

Os efeitos positivos de tais compostos podem ser aplicados à clínica

ortodôntica, o que justifica um número cada vez maior de pesquisas nessa área. A

exemplo disso, um estudo feito com administração tópica e sistêmica de

bisfosfonados em ratos mostrou que tanto a movimentação ortodôntica dentária

como a recidiva podem ser evitadas. Isto torna tais substâncias úteis no reforço de

ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico20, 21. Além disso, a

administração local de bisfosfonado causa a redução tanto no número de lacunas de

reabsorção quanto no de odontoclastos durante a movimentação ortodôntica20.

Kim e colaboradores desenvolveram um estudo onde constataram que uma

única administração sistêmica de bisfosfonado diminui a quantidade de recidiva

inicial em molares de ratos movimentados experimentalmente, o que estaria

associado a diminuição no número de osteoclastos no ligamento periodontal, assim

como às mudanças estruturais detectadas nessas células, tais como o

desaparecimento das bordas em escova e da polaridade citoplasmática7. Alguns

bisfosfonados podem, ainda, inibir a reabsorção radicular decorrente da

movimentação dentária20.

73

CLODRONATO

Estudos sobre a relação existente entre a estrutura e a atividade dos

bisfosfonados indicam que a sua potência e o seu mecanismo de ação variam de

acordo com a cadeia lateral ligada ao átomo de carbono na molécula de P-C-P,

estrutura comum dos bisfosfonados. Baseado na diferença da estrutura desta cadeia

lateral, eles podem ser divididos em duas classes: os que contêm uma molécula de

Nitrogênio e os que não a contêm. Essas duas classes de medicamento também

diferem no seu mecanismo de ação molecular. Investigações recentes revelaram

que aqueles bisfosfonados que apresentam um átomo de Nitrogênio na cadeia

lateral, tais como o Alendronato, são mais potentes do que os que não o

apresentam, inibindo a reabsorção por bloquear a penetração de proteínas nos

osteoclastos 4, 21, 25, 26. Aqueles bisfosfonados que não contêm o átomo de Nitrogênio

podem ser incorporados a análogos do ATP e atuar inibindo a síntese de proteínas e

induzindo a apoptose nos osteoclastos 4, 26.

A maioria dos bisfosfonados clinicamente testados apresenta afinidades

semelhantes em relação ao tecido ósseo do ser humano. Uma afinidade reduzida, é

traduzida em baixa potência o que implicaria em dosagens maiores para aumentar a

sua eficácia, à exemplo do que é observado com o clodronato 12.

O clodronato, por sua vez, encontra-se no grupo dos bisfosfonados que não

apresentam aquele átomo de Nitrogênio 21. Ao invés disso, contém dois átomos de

Cloro na cadeia lateral. Além da sua grande semelhança estrutural com o

Pirofosfato, este bisfosfonado é conhecido por apresentar propriedades físico-

químicas semelhantes às dos demais, inibindo, portanto, a função osteoclástica

sendo incorporado metabolicamente a um análogo do ATP não-hidrolisável,

74

resultando na apoptose osteoclástica (principal mecanismo de ação para inibir a

reabsorção óssea por este composto) 21, 26, 27.

O tratamento combinado do clodronato com o alendronato pode aumentar o

efeito antireabsortivo de baixa concentração de um bisfosfonado que apresente o

átomo de Nitrogênio. Ao mesmo tempo, o clodronato pode também antagonizar

alguns dos efeitos e das funções moleculares atribuídas a concentrações mais altas

destes mesmos compostos 26.

Somada a atividade anti-reabsortiva, tem sido relatada a associação deste

tipo de bisfosfonado com função antiinflamatória 21. Já que as citocinas e os

mediadores do processo inflamatório desempenham importante papel na resposta

biológica à simulação mecânica ortodôntica, incluindo reações adversas como dor 28

e reabsorção radicular 29, o clodronato deveria ser o bisfosfonado mais indicado para

o controle da movimentação ortodôntica 21.

O clodronato é um bisfosfonado de segunda geração de potência baixa

quando comparado com as drogas mais recentes, mas tem sido bem estudado e já

se encontra comercialmente disponível. As doses recomendadas para seres

humanos são baixas quando comparadas com as utilizadas nas experimentações

animais, onde se costuma observar o efeito dose-dependente do medicamento,

assim como ocorre para outros bisfosfonados 21, 30. A dose diária subcutânea

relativamente alta de 10 mg/Kg do clodronato tem sido usada em diversos estudos

desenvolvidos em ratos e tem mostrado aumentar a densidade óssea desses

animais 30.

A via de administração mais utilizada para o clodronato é a intravenosa, vez

que essa droga apresenta pobre absorção no trato gastrointestinal, com proporção

de 1 a 2 % da dose oral 31.

75

Uma característica importante associada ao clodronato é que sua atividade

anti-reabsortiva não prejudica a mineralização óssea e, além disso, ele tem sido

associado à prevenção de perda óssea decorrente de imobilização em pacientes

paraplégicos 30; e decorrente de extração de molares superiores em ratos 32.

Estudos mostram que a administração de clodronato por períodos longos em

dosagem terapêutica apresenta alguns efeitos benéficos sobre o desenvolvimento

ósseo, o que o torna um medicamento seguro para a osteoporose 14.

76

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

Desde a descoberta dos seus efeitos sobre os tecidos biológicos em 1968,

muito progresso tem sido conseguido para se compreender melhor os mecanismos

de ação dos bisfosfonados. Enquanto os efeitos sobre a mineralização aparentam

ser físico-químicos através da inibição do crescimento dos cristais, os referentes à

sua reabsorção são celulares. Todavia, os mecanismos moleculares que levam à

inibição desta reabsorção ainda precisam ser esclarecidos. Existe um consenso de

que o efeito final é sobre os osteoclastos, mas não se sabe o quanto desse efeito se

dá por inibição da sua atividade e o quanto ocorre devido à diminuição no seu

número 2, 11, 24.

As aplicações clínicas atuais dos bisfosfonados são a doença de Paget, a

osteoporose, e osteólises associadas às neoplasias. Pode-se citar ainda a utilização

deste fármaco para a diminuição da reabsorção óssea para casos de: atrofia de

Sudeck; displasia fibrosa; para evitar perda de implantes ósseos; reabsorção

alveolar e perda óssea associada à doença periodontal 2, 4, 11, 21, 25,26.

Estudos experimentais, por sua vez, particularizam a utilização de

bisfosfonados para otimizar o tratamento ortodôntico. Neste, a reabsorção óssea

mecanicamente induzida é uma etapa importante para que a movimentação dentária

ocorra e, por essa razão, deve ser o principal alvo para que a intervenção

farmacológica assegure os resultados conseguidos. Caso uma movimentação

dentária indesejável possa ser prevenida com bloqueadores da reabsorção óssea, o

tratamento ficaria menos complexo e mais seguro. Dentro desse contexto, o

clodronato se apresenta, em determinadas concentrações, como um potente inibidor

77

do movimento dentário ortodôntico quando administrado localmente. Esta resposta é

comparável à de outros tipos de bisfosfonados 9, 20, 21.

A atividade anti-reabsortiva e antiinflamatória do clodronato e, por

conseguinte, sua ação indireta na resposta biológica à simulação da mecânica

ortodôntica, incluindo reações adversas como dor 21, 28 e reabsorção radicular 29,

sugerem que este deveria ser o bisfosfonado mais indicado para o controle da

movimentação ortodôntica 21.

O conhecimento aprofundado deste tema por parte do Ortodontista é de

extrema importância, vez que, com o aumento do número de adultos que buscam

esta especialidade, a tendência de tratar pacientes que fazem uso crônico deste

fármaco e, por conseguinte, apresentam o metabolismo ósseo alterado, é aumentar.

Além disso, a Ortodontia, como especialidade que acompanha os avanços

conseguidos também no campo da Farmacologia, tem intensificado os estudos

nessa área, para, num futuro próximo, trazer os benefícios dos bisfosfonados para a

realidade clínica.

78

AGRADECIMENTOS

Dr. André Luiz Andrade Pinheiro, Drª. Myrela Galvão Cardoso Costa, Dr.

Diego Menezes, pela colaboração durante toda a fase de execução do trabalho; Drª.

Luciana Ramalho, Drª. Cristina Cangussu e Srª. Cristina, por estarem sempre

disponíveis para nos ajudar no que fosse preciso.

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83

5 CONCLUSÃO

Após o exposto, conclui-se:

1. A aplicação do clodronato diminuiu sensivelmente as reações histológicas

do periodonto de inserção de ratos (Rattus norvegicus), entretanto, quando

aplicado no quinto dia do ciclo de remodelação óssea a influência foi maior

sobre a reabsorção radicular;

2. A administração do clodronato no quinto dia não trouxe alterações

significantes para a taxa de movimentação dentária;

3. A associação dos achados histológicos à taxa de movimentação dentária

sugere que o uso do clodronato no quinto dia do experimento pode

diminuir a reabsorção radicular com pouca influência na movimentação

dentária induzida ortodonticamente.

84

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93

7 ANEXO

Normas para a prática Didático-Científica da Vivissecção em animais

Art. 01. Fica permitida, em todo território nacional, a vivissecção em animais, nos

termos desta lei.

Art. 02. Os biotérios e os centros de experiências e demonstrações com animais

vivos deverão ser registrados em órgão competente e por ele autorizado a funcionar.

Art. 03. A vivissecção não será permitida:

I – sem o emprego de anestesia;

II – em centros de pesquisas e estudos não registrados em órgão competente;

III – sem supervisão de técnico especializado;

IV – com animais que não tenham permanecido mais de 15 dias em biotério

legalmente autorizado;

V – em estabelecimento de ensino de 1o e 2o graus e em quaisquer locais

freqüentados por menores de idade;

Art. 04. O animal só poderá ser submetido às intervenções recomendadas nos

protocolos das experiências que constituem a pesquisa ou os programas de

aprendizagem cirúrgica, quando durante ou após a vivissecção, receber cuidados

especiais.

Parágrafo 1 – Quando houver indicação, o animal poderá ser sacrificado sob estrita

obediência às prescrições científicas.

Parágrafo 2 – Caso não sejam sacrificados, os animais utilizados em experiência ou

demonstrações somente poderão sair do biotério 30 (trinta) dias após a intervenção,

desde que destinados à pessoas ou entidades idôneas que por eles queiram

responsabilizar-se.

Art. 05. Os infratores desta lei estarão sujeitos:

I – às penalidades cominadas no artigo 64, caput, do Decreto-lei 3.688 de

03/10/1941, no caso de ser a primeira infração;

II – à interdição e cancelamento do registro do biotério ou do centro de pesquisa, no

caso de reincidência;

Art. 06. O Poder Executivo, no prazo de 90 (noventa) dias, regulamentará a

presente Lei, especificando:

94

I – o órgão competente para o registro e a expedição de autorização dos biotérios e

centros de experiências e demonstrações com animais vivos;

II – as condições gerais exigíveis para o registro e o funcionamento dos biotérios;

III – o órgão e autoridades competentes para fiscalização dos biotérios e centros

mencionados no inciso I.

Art. 07. Esta lei entra em vigor na data de sua publicação.

Art. 08. Revogam-se as disposições em contrário.