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Universidade Federal da Bahia

Instituto de Cincias da Sade Programa de Ps-Graduao em Processos Interativos dos rgos e Sistemas

TATIANE DE OLIVEIRA TEIXEIRA

EFEITOS IMUNOMODULATRIOS DO EXTRATO DE ALLIUM CEPA L. E DA QUERCETINA

SOBRE A PRODUO DE MEDIADORES INFLAMATRIOS E A OSTEOCLASTOGNESE IN VITRO

Salvador 2015

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TATIANE DE OLIVEIRA TEIXEIRA

EFEITOS IMUNOMODULATRIOS DO EXTRATO DE ALLIUM CEPA L. E DA QUERCETINA

SOBRE A PRODUO DE MEDIADORES INFLAMATRIOS E A OSTEOCLASTOGNESE IN VITRO

Salvador 2015

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Processos Interativos dos rgos e Sistemas, Instituto de Cincias da Sade, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obteno do ttulo de Doutor em Processos Interativos dos rgos e Sistemas. rea de Concentrao: Distrbio dos rgos e Sistemas.

Orientadora: Prof. Dr. Camila A. Viana de Figueiredo

T266p

Teixeira, Tatiane de Oliveira. Efeitos imunomodulatrios do extrato de Allium cepa L. e da quercetina sobre a produo de mediadores inflamatrios e a osteoclastognese in vitro / Tatiane de Oliveira Teixeira. Salvador: 2015. 96f.: Il.; 30cm.

Orientadora: Profa. Dra. Camila Alexandrina Viana de Figueiredo Tese (Doutorado) - Programa de Ps-Graduao em Processos Interativos dos rgos e Sistemas do Instituto de Cincias da Sade da Universidade Federal da Bahia. 1. Allium cepa L. Quercetina. Perda ssea. Citocinas. Inflamao. Osteoclastos. . I. Figueiredo, Camila Alexandrina Viana de. II. UFBA. IV. Ttulo. CDU 615-053.2

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TATIANE DE OLIVEIRA TEIXEIRA

EFEITOS IMUNOMODULATRIOS DO EXTRATO DE ALLIUM CEPA L. E DA QUERCETINA

SOBRE A PRODUO DE MEDIADORES INFLAMATRIOS E A OSTEOCLASTOGNESE IN VITRO

Aprovada em ________________________

Comisso Examinadora Camila Alexandrina Viana de Figueiredo (Orientadora)___________________________ Doutora em Farmacologia pela Universidade Estadual de Campinas, Brasil (2005) Professor Adjunto IV da Universidade Federal da Bahia (UFBA) Gabriela Botelho Martins_____________________________________________________ Doutora em Odontologia pela Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, Brasil (2004) Professor Adjunto da Universidade Federal da Bahia (UFBA) Tercio Carneiro Ramos_______________________________________________________ Doutor em Farmacologia pela Universidade Federal do Cear, Brasil (2000) Professor Adjunto da Universidade do Estado da Bahia (UNEB) Karina Carla de Paula Medeiros_______________________________________________ Doutora em Produtos Naturais e Sintticos Bioativos pela Universidade Federal da Paraba, Brasil (2009) Professor Adjunto II da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) Luciana Lyra Casais e Silva___________________________________________________ Doutorado em Cincias (Fisiologia Geral), pela Universidade de So Paulo, Brasil (2001) Professor Adjunto da Universidade Federal da Bahia (UFBA)

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Processos Interativos dos rgos e Sistemas, Instituto de Cincias da Sade, Universidade Federal da Bahia, como requisito para obteno do ttulo de Doutor em Processos Interativos dos rgos e Sistemas. rea de Concentrao: Distrbio dos rgos e Sistemas.

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Dedico este trabalho minha famlia, sempre muito presente e essencial em minha vida.

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AGRADECIMENTOS

A toda a minha famlia, por ter acreditado em mim, permitindo que eu tenha mais um sonho realizado.

minha me, Tnia Lcia, e ao meu pai, Gilberto, pelo apoio e amor incondicional.

s minhas irms Tnzia e Thasa, pela compreenso, e aos meus sobrinhos Pedro, Jlia e minha afilhada Clara, pela alegria e coragem transmitidas, que me deram fora para superar o cansao e as limitaes.

minha av Dilza, pelos ensinamentos da vida e pelo carinho.

Ao meu noivo Gabriel, pelo apoio incondicional, companheirismo e amor.

Aos meus amigos, por compreenderem as minhas ausncias e me apoiarem.

Profa. Camila Figueiredo, minha orientadora, exemplo de coragem, perseverana e sucesso, pela confiana, pelo incentivo e pela insistncia na busca da excelncia que um trabalho cientfico exige.

Profa. Anuradha Prakki, por ter me apoiado e acolhido, cujos ensinamentos e estmulo cientfico foram fundamentais.

A Getlio Nogueira-Filho, pela confiana e oportunidade.

Profa. Neuza Alcntara Neves, pelo aprendizado que me propiciou e pela colaborao.

Aos meus colegas do Laboratrio do Imunofarmacologia e Biologia Molecular (IMUNOBIO), pelo apoio e incentivo.

A todos aqueles da University of Toronto (UofT) que me dispensaram carinho e colaborao durante meu estgio no Canad, especialmente os meus colegas de laboratrio e amigos Carlos Brito, Carolina Ferreira e Terry Stavroullakis, que atravessaram comigo essa fase importante, com companheirismo e pacincia principalmente nos momentos difceis.

Aos meus colegas de turma do doutorado, pelo inestimvel companheirismo.

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AGRADECIMENTO INSTITUCIONAL

Fapesb, pelo financiamento durante o doutorado no Brasil (Bolsa de Doutorado) e no exterior (Bolsa Doutorado Sanduche).

Universidade Federal da Bahia e ao programa de Ps-Graduao em Processos Interativos dos rgos e Sistemas, por me proporcionarem aprendizado e crescimento cientfico.

University of Toronto, na qual o presente trabalho foi desenvolvido.

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Have the courage to follow your heart and intuition. They somehow already know what you truly want to become.

Everything else is secondary. Steve Jobs

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TEIXEIRA, Tatiane de Oliveira. Efeitos imunomodulatrios do extrato de Allium cepa L. e da quercetina sobre a produo de mediadores inflamatrios e a osteoclastognese in vitro. 96f. : Il. 2015. Tese (Doutorado) - Instituto de Cincias da Sade, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2015.

RESUMO

Introduo: A periodontite uma doena inflamatria que afeta a insero do tecido conjuntivo e do osso de suporte que rodeia os dentes. Os osteoclastos esto implicados na homeostasia do tecido sseo em situaes patolgicas, como na doena periodontal. O desequilbrio na remodelao ssea pela induo de inflamao e perda ssea mediada pelos osteoclastos pode ser desencadeado pelo LPS de P. gingivalis (PgLPS). Alguns fatores e frmacos podem restaurar a homeostase do osso, com a regulao de mediadores inflamatrios como o extrato metanlico de Allium cepa L. (AcE) e a quercetina (Qt), que tm demonstrado possuir propriedades anti-inflamatrias. Objetivos: Nossos objetivos foram analisar os efeitos imunomoduladores in vitro do AcE e da Qt na osteoclastognese em condies inflamatrias (PgLPS-induzida). Mtodos: Clulas precursoras de osteoclastos (RAW 264.7) foram diferenciadas com 30 ng/mL de RANKL, coestimuladas com PgLPS (1 g/mL) e tratadas com AcE (50-1000 g/mL) ou Qt (1,25, 2,5 ou 5 M). Ensaios de reduo da resazurina e ensaio para mensurao de protena total foram utilizados para avaliar a viabilidade celular. Ensaio de fosfatase cida resistente ao tartarato (TRAP) foi utilizado para determinar a quantidade de p-nitrofenol libertado; e colorao de TRAP foi utilizada para avaliar o nmero e o tamanho dos osteoclastos multinucleados. Os nveis de citocinas foram quantificados por ELISA em sobrenadantes de cultura celular. Utilizando-se ensaios de Western blot, foi avaliada a fosforilao e a degradao do IB. Resultados: Foram determinadas concentraes no citotxicas de AcE e de Qt em culturas celulares. A osteoclastognese foi modulada negativamente nas concentraes testadas de AcE e de Qt em comparao com o controle. Todas as concentraes de AcE e de Qt diminuram significativamente o nmero de osteoclastos grandes, presumivelmente mais ativos, e as concentraes de AcE a 1000 g/mL M reduziram o nmero de osteoclastos pequenos. Observou-se um decrscimo da produo de IL-6 e IL-1 e um aumento da produo de IL-3 e IL-4. Alm disso, tanto o AcE quanto a Qt regularam negativamente a via do NF-B. Concluso: Esses resultados sugerem que o AcE e a Qt podem ser inibidores de osteoclastognese em condies inflamatrias, por meio da diminuio da ativao da via do NF-B induzida por PgLPS e RANKL. Mais estudos so necessrios para apoiar o uso do AcE e da Qt para tratar doenas que envolvam perda ssea patolgica, incluindo-se a periodontite. Palavras-chave: Allium cepa L. Quercetina. Perda ssea. Citocinas. Inflamao. Osteoclastos.

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TEIXEIRA, Tatiane de Oliveira. Immunomodulatory effects of Allium cepa L. extract and quercetin on the production of inflammatory mediators and osteoclastogenesis in vitro. 96f. : Il. 2015. Thesis (PhD) - Instituto de Cincias da Sade, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2015.

ABSTRACT

Introduction: Periodontitis is an inflammatory disease that affects connective tissue attachment and the supporting bone that surrounds the teeth. Osteoclasts are implicated in normal bone remodeling and bone loss. P. gingivalis LPS (PgLPS) can cause an imbalance in the remodeling by inducing inflammation and osteoclast-mediated bone loss. Allium cepa L. (AcE) and quercetin (Qt) have been shown to possess anti-inflammatory properties. Objectives: Our aims were to examine the in vitro modulatory effects of AcE and Qt on osteoclastogenesis under inflammatory conditions (LPS-induced). Methods: RAW 264.7 cells were differentiated with 30ng/mL of RANKL, co-stimulated with PgLPS (1g/mL) and treated with AcE (50-1000 g/mL) or Qt (1.25, 2.5 or 5 M). Resazurin reduction and total protein content assays were used to detect cell viability. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) assays were used to determine the amount of released p-nitrophenol that indicates the degree of differentiation in RANKL-stimulated cells; and TRAP staining was used to evaluate the number and size of TRAP-positive multinucleated osteoclast cells. Cytokine levels were measured using ELISA on osteoclast precursor cell culture supernatants. Using western blot analysis IB phosphorylation and IB degradation were evaluated. Results: Both AcE and Qt did not affect cell viability. Osteoclastogenesis was significantly affected by AcE and Qt when compared to control. Small (less active) osteoclast counts were decreased by AcE (1000 g/mL) and Qt (2.5 and 5 M), while all concentrations of AcE and Qt significantly decreased the number of large and presumably active osteoclasts. We observed lower production of IL-6 and IL-1 and an increased production of IL-3 and IL-4. Also both AcE and Qt downregulated NF-B pathway. Conclusion: These findings suggest that AcE and Qt may be inhibitors of osteoclastogenesis under inflammatory conditions (LPS-induced) via attenuation of RANKL/ PgLPS-induced NF-B activation. Further studies are needed in other to support the use of AcE and Qt to treat diseases involving pathological bone loss including periodontitis. Keywords: Allium cepa L. Quercetin. Bone loss. Cytokines. Inflammation. Osteoclasts.

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LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10

Efeito do Allium cepa L. na proliferao de clulas RAW 264.7...........................

Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na morfologia e na contagem celular em clulas RAW 264.7 coradas com DAPI................................................ Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na apoptose em clulas RAW 264.7.............................................................................................................. Efeito do Allium cepa L. na viabilidade celular de clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS.............................................................................................. Efeito do Allium cepa L. nos nveis de protena total de clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS.............................................................................................. Efeito do Allium cepa L. na morfologia e na contagem celular em clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS coradas com DAPI.......................................... Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na viabilidade celular na osteoclastognese induzida por RANKL e estimulada com PgLP......................... Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na osteoclastognese induzida por RANKL e estimulada com PgLPS................................................................... Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na atividade de reabsoro osteoclstica............................................................................................................ Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na ativao da via de sinalizao do NF-B em clulas RAW 264.7 estimuladas com RANKL e PgLPS.................

45 46 47 48 49 50 51 53 55 59

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na produo de citocinas durante a osteoclastognese e a atividade dos osteoclastos....................................................

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LISTA DE ABREVIATURAS, NOTAES E SIGLAS

AcE AP-1 ATCC CD4+ CD8+

Cel Cel/Ctrl Ctrl DAPI DMEM DMSO DP Ecoli ELISA ERK HPLC IFN IgE IKK IB IL iNOS JNK LPS MAPK M-CSF MCP-1 MMP MTT NFATc1 NF-B NK OD

Extrato metanlico de Allium cepa L. Ativador de protena 1 American Type Culture Collection Linfcitos T auxiliares com grupamento de diferenciao 4 Linfcitos T auxiliares com grupamento de diferenciao 4 Grupo controle apenas com clulas Grupo controle negativo Grupo controle 4,6-diamidino-2-fenil-indol Meio Eagle modificado por Dulbecco Dimetilsulfxido Doena periodontal Escherichia coli Enzyme-Linked Immunosorbent Assay- Ensaio imunoenzimtico Quinase regulada pelo sinal extracelular Cromatografia lquida de alta eficincia Interferon Imunoglobulina tipo E Quinase de c-Jun N-terminal Inibidor da quinase kappa B Interleucina xido ntrico-sintase induzida Quinase de c-Jun N-terminal Lipopolissacardeo Protena cinase mitgeno ativada Fator de estimulao de colnias de macrfagos Protena quimiottica de moncitos-1 Metaloproteinases de matriz brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazlio Fator nuclear de clulas T ativas c1 Fator de transcrio nuclear kappa B clulas natural killer Densidade ptica

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OPG PBS Pg PG pH PI3K Qt RANK RANKL RAW 264.RIPA RPM SFB Th1 Th2 TIB-71 TLR TNF TRAP

Osteoprotegerina Soluo fosfato tamponada bissdica Porfiromonas gingivalis Prostaglandina Potencial de hidrognio inico fosfatidilinositol-3-cinase Quercetina Receptor ativador do fator de transcrio NF-B Ligante do receptor ativador do NF-B Linhagem celular de macrfagos/moncitos murinos Radio-Immunoprecipitation Assay (soluo tampo) Rotaes por minuto Soro Fetal Bovino Linfcito T auxiliar do tipo 1 Linfcito T auxiliar do tipo 2 Nmero de catlogo da linhagem celular RAW 264.7 Toll-like receptors Fator de necrose tumoral Fosfatase cida resistente ao tartarato

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SUMRIO

1 INTRODUO 16

2 REVISO DE LITERATURA 20 2.1 RESPOSTA IMUNOLGICA ........................................................................................................ 21 2.2 FISIOPATOLOGIA DA DOENA PERIODONTAL .................................................................... 23 2.3 TECIDO SSEO E OSTEOCLASTOGNESE ............................................................................. 25 2.4 PRODUTOS NATURAIS................................................................................................................ 30

2.4.1 Allium cepa L. 30 2.4.2 Quercetina 32

3 OBJETIVOS 33 3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................ 34 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................................................... 34

4 MATERIAIS E MTODOS 35 4.1 REAGENTES .................................................................................................................................. 36

4.1.2 Extrato metanlico de Allium cepa L. (AcE) 36 4.2 CULTURA CELULAR.................................................................................................................... 37 4.3 ENSAIO PARA DIFERENCIAO DOS OSTEOCLASTOS ...................................................... 37 4.4 ENSAIOS DE VIABILIDADE CELULAR .................................................................................... 38

4.4.1 Ensaios de reduo da resazurina e de concentrao de protena total 38 4.4.2 Anlise de imagem e contagem de clulas coradas por DAPI 39 4.4.3 Ensaio de Caspase 3/7 39

4.5 ENSAIO DE FOSFATASE CIDA RESISTENTE AO TARTARATO (TRAP) .......................... 40 4.6. ENSAIO DE REABSORO DE HIDROXIAPATITA (colorao de Von Kossa) .................... 40 4.7 ENSAIO PARA MENSURAR A SECRECO DE CITOCINAS .................................................. 41 4.8 ENSAIO DE WESTERN BLOT PARA ANLISE DA INIBIO DA VIA DO NF-B ............. 41 4.9 ANLISE ESTATSTICA .............................................................................................................. 42

5 RESULTADOS 43 5.1 Allium cepa L. E QUERCETINA NO INDUZEM EFEITOS TXICOS EM CLULAS RAW 264.7 NA PRESENA OU NA AUSNCIA DE RANKL e pgLPS .................................................... 44 5.2 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A OSTEOCLASTOGNESE INDUZIDA POR RANKL ESTIMULADA POR PgLPS EM CLULAS RAW 264.7 .................................................... 52 5.3 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A REABSORO DOS OSTEOCLASTOS ...... 54 5.4 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A PRODUO DE CITOCINAS DURANTE A OSTEOCLASTOGNESE E A ATIVIDADE DOS OSTEOCLASTOS ............................................. 56 5.5 Allium cepa L. E QUERCETINA INIBEM A ATIVAO DA VIA DE SINALIZAO DO NF-B EM CLULAS ESTIMULADAS POR RANKL E PgLPS ............................................................. 58

6 DISCUSSO 60

7 CONCLUSO 66

REFERNCIAS 68

APNDICES 77

16

1 INTRODUO

17

No processo inflamatrio, o organismo reage a uma agresso e capaz de deflagrar

uma resposta no especfica contra padres de agresso previamente definidos, sendo o

sistema imune capaz ainda de identificar e reagir a agentes agressores especficos, segundo

seu potencial antignico. Respostas inflamatrias normais so rigorosamente controladas e

autolimitantes. A inflamao crnica, no entanto, pode causar um aumento anormal da

atividade osteoclstica promovendo a reabsoro ssea excessiva, como observado na

osteoporose, na artrite reumatoide e na doena periodontal (DP) (SOUZA; LERNER, 2013;

YANG et al., 2013). Na remodelao ssea fisiolgica, precursores de osteoclastos se tornam

ativados e se diferenciam em osteoclastos (osteoclastognese), que iniciam o processo de

reabsoro ssea. Os osteoblastos esto envolvidos na formao da matriz ssea, garantindo a

manuteno da massa ssea (RAM et al., 2015).

Na DP, a ativao excessiva do sistema imunolgico por bactrias e seus produtos

estimulam a produo e a secreo de diversas molculas regulatrias, como as citocinas,

quimiocinas, fatores de transcrio e molculas coestimuladoras, resultando na sequncia de

eventos que provocar a destruio do tecido conjuntivo e do osso alveolar (LIU; LERNER;

TENG, 2010; ZHAO; IVASHKIV, 2011). Assim sendo, pode-se observar que produtos

bacterianos e citocinas inflamatrias constituem as principais causas subjacentes da perda

ssea caracterizada pela quebra de equilbrio entre a diferenciao e a atividade de

osteoclastos e osteoblastos (LIU; LERNER; TENG, 2010). No processo que caracteriza a

osteoclastognese, est bem estabelecida a importncia da estimulao de progenitores de

osteoclastos mononucleares pelo fator de estimulao de colnias de macrfagos (M-CSF) e a

ativao do fator de transcrio nuclear kappa B (NF-B) por RANKL (KAJIYA et al., 2010).

O RANKL liga-se ao seu receptor RANK e induz a diferenciao de precursores de

osteoclastos ao longo da linhagem osteoclstica e a sua fuso em osteoclastos maduros,

clulas que reabsorvem a matriz ssea, ao passo que a osteoprotegerina (OPG) previne a

ligao RANK-RANKL por inibio competitiva. Na periodontite, o aumento da

concentrao de citocinas pr-inflamatrias pode afetar diretamente a perda ssea

aumentando os nveis de RANKL e ativar osteoclastos, alm de inibir a atividade de OPG

(KAJIYA et al., 2010).

Alguns fatores e frmacos podem promover homeostase do osso. A regulao da

secreo de citocinas pr-inflamatrias e anti-inflamatrias pode modular a

osteoclastognese, diminuindo a reabsoro ssea e reduzindo a perda ssea clnica (SINGH

et al., 2012). Frmacos como os bifosfonatos, que so moduladores da diferenciao e da

atividade dos osteoclastos, tm sido estudados como substncias adjuvantes da terapia

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periodontal de raspagem e alisamento radicular (RAR) na tentativa de diminuir a inflamao e

a perda ssea associada a essa patologia (LANE et al., 2005). Contudo, efeitos adversos

(osteonecrose de maxilares) tm sido relacionados com o uso do bisfosfonato alendronato

(NICOLATOU-GALITIS et al., 2011).

Recentemente, a importncia do uso de produtos naturais tem aumentado, bem como o

interesse pela descoberta de novas drogas seguras e eficazes para o tratamento de condies

inflamatrias (JOO, 2014). Estudos tm investigado o uso de produtos naturais no tratamento

de vrias doenas inflamatrias, tais como asma (DOURADO et al., 2014), colite ulcerativa

(GONG et al., 2012), doena de Crohn (KREBS; OMER; OMER, 2010) e perda ssea em

estados inflamatrios, como na periodontite (KAJIYA et al., 2010).

Flavonoides contidos em frutas e vegetais tm sido estudados como agentes anti-

inflamatrios (SATU et al., 2013). O principal flavonoide encontrado no Allium cepa L.

(cebola) a quercetina (Qt), potente inibidor in vitro da diferenciao dos osteoclastos

(WATTEL et al., 2004), que exibe diversas propriedades farmacolgicas, tais como efeitos

anti-inflamatrios e antioxidantes (CHENG et al., 2010; YAMAGUCHI; WEITZMANN,

2011; GUO et al., 2012). O Allium cepa L. tambm tem sido testado tanto para o tratamento

de condies inflamatrias, como a asma (KAISER et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2015),

quanto para desordens no metabolismo sseo, como na reabsoro ssea induzida por

ovariectomia em ratos (HUANG et al., 2008), e na modulao da osteoclastognese induzida

por RANKL em clulas de ratos precursoras de osteoclastos, por meio da inibio das vias de

sinalizao de ERK, p38 e NF-B (TANG et al., 2009). A modulao da diferenciao e da

funo dos osteoclastos uma estratgia promissora para o tratamento de doenas

inflamatrias e sseo-destrutivas (KIM, H. et al., 2014).

Diante do exposto e considerando-se a relevncia do estudo de substncias com

propriedades imunomodulatrias, as abordagens propostas neste trabalho podem ajudar a

desvendar os possveis benefcios do Allium cepa L. e do seu flavonoide quercetina sobre os

osteoclastos e seus precursores, em condies normais e de perfil inflamatrio induzido por

LPS. Na tentativa de explorar o potencial teraputico dessas substncias, a osteoclastognese

e a atividade dos osteoclastos foram observadas por meio da modulao de mediadores

inflamatrios e da interferncia na via de sinalizao do NF-B em clulas precursoras de

osteoclastos, estimuladas ou no por PgLPS e RANKL. Almeja-se que as substncias testadas

possam se tornar drogas para compor o arsenal teraputico para tratar doenas inflamatrias

que envolvam perda ssea patolgica, incluindo-se a periodontite.

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O trabalho de pesquisa e a elaborao da tese durante o doutorado geraram a produo

de dois artigos. O primeiro j foi publicado: OLIVEIRA, Tatiane et al. Effect of Allium cepa

L. on lipopolysaccharide-stimulated osteoclast precursor cell viability, count, and morphology

using 4, 6-diamidino-2-phenylindole-staining. International Journal of Cell Biology, New

York, v.2014, Aug. 2014 (APNDICE A). O segundo artigo, OLIVEIRA, Tatiane et al.

Allium cepa L. and quercetin inhibit RANKL/Porphyromonas gingivalis LPS-induced

osteoclastogenesis by downregulating NF-B signaling pathway, foi submetido revista

Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine e aceito para publicao

(APNDICE B).

20

2 REVISO DE LITERATURA

21

2.1 RESPOSTA IMUNOLGICA

A inflamao uma resposta protetora para que seja restabelecida a homeostase em

situaes de desafios extremos ao organismo, tais como infeco, estresse e leso tecidual.

um processo dinmico, com uma sequncia de reaes ordenadas que se iniciam com uma

atividade aguda, podendo evoluir para um processo crnico. A fase aguda da inflamao

relativamente curta e desencadeia, na rede vascular, em resposta s agresses, a vasodilatao

e o aumento da permeabilidade, que possibilitam a transmigrao celular, predominantemente

de neutrfilos (DAMBROSIO; PANINA-BORDIGNON; SINIGAGLIA, 2003;

SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

Citocinas, quimiocinas, aminas biognicas e eicosanoides produzidos e liberados

caracterizam e modulam o processo inflamatrio, podendo desencadear simples respostas

locais ou aquelas capazes de gerar alteraes em todo o organismo. A inflamao aguda pode

evoluir para a fase crnica, na tentativa de eliminar a infeco e de estabelecer o reparo

tecidual. Nessa fase, mais longa, ocorre o recrutamento de macrfagos, linfcitos e

plasmcitos, a proliferao de vasos sanguneos, a fibrose e a necrose tecidual. Apesar da

complexidade e da diversidade de funes, as atividades dos sinais inflamatrios objetivam o

reparo tecidual e o restabelecimento do equilbrio dos vrios sistemas do organismo

(FINKELMAN, 2010; KOTAS; MEDZHITOV, 2015).

A primeira linha de defesa de nosso organismo coordenada pelo sistema imune inato

que monta a resposta inicial ao tecido invadido. A vasodilatao, o aumento da

permeabilidade vascular e a infiltrao celular so, inicialmente, geradas nessa fase inata. Os

componentes celulares primrios do sistema imune inato so os macrfagos, clulas

dendrticas, clulas natural killer (NK) e neutrfilos. A esses componentes celulares, os

macrfagos acrescentam, por exemplo, citocinas pr-inflamatrias, quimiocinas e xido

ntrico, que amplificam a resposta inflamatria e ativam a cascata de coagulao. Outros

fatores frequentemente ativados durante a resposta inata incluem o sistema complemento, os

eicosanoides e o fator de ativao plaquetria (PAF) (DAMBROSIO; PANINA-

BORDIGNON; SINIGAGLIA, 2003; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

Os macrfagos e as clulas dendrticas tm a capacidade de responder a uma variedade

de produtos microbianos por meio de receptores de reconhecimento padro presentes nas suas

superfcies. Os receptores do tipo toll (TLRs) demonstraram ser crticos para o

reconhecimento de padres moleculares e para a sinalizao biolgica associada a agentes

22

patognicos, como os lipopolissacardeos (LPS) de bactrias gram-negativas, lipoprotenas de

organismos gram-positivos e de DNA bacteriano (UNDERHILL, 2003). Ligaes ao

complexo do TLR desencadeiam o recrutamento de protenas de sinalizao intracelular que

so capazes de ativar o inibidor da cascata de NF-B (IkB), resultando na degradao da

protena inibidora IkB e na libertao subsequente de NF-B citoplasmtico. Em seguida, o

fator de transcrio NF-B transloca-se para o ncleo para ligar-se a regies promotoras de

genes que regularo a codificao de mediadores pr-inflamatrios, tais como o fator de

necrose tumoral (TNF), a interleucina 1-beta (IL-1), a interleucina 6 (IL-6) (WARD;

LENTSCH, 2002).

A produo de citocinas geralmente autolimitada, embora algumas dessas protenas

possam persistir na circulao durante longos perodos de tempo, determinando a magnitude

da resposta inata e influenciando profundamente na imunidade adaptativa (LIEW, 2003;

SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). No entanto, a resposta imune adaptativa

principalmente induzida pela apresentao de antgenos estranhos s clulas T CD4+ e CD8+.

Os subconjuntos melhor definidos de linfcitos T CD4+ so as clulas do tipo T helper 1

(Th1) e T helper 2 (Th2), subconjuntos essencialmente definidos pelo perfil de citocinas que

produzem. A induo da resposta Th1 promovida por macrfagos e clulas dendrticas.

Vrus, bactrias intracelulares e seus produtos bacterianos estimulam a produo de citocinas

com perfil Th1, promovendo a imunidade antimicrobiana mediada por fagcitos

(SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Infeces helmnticas e doenas alrgicas como

a asma desencadeiam o aumento do nmero de linfcitos CD4+ do tipo Th2, que produzem

interleucinas como IL-4, IL-5 e IL-13, correlacionando-se, por exemplo, no caso da asma,

com o grau de eosinofilia das vias areas. Alm disso, na asma atpica, a polarizao Th2

estimula as respostas mediadas pela imunoglobulina E (IgE). Com o aumento da IgE,

observa-se uma maior ligao desta com o receptor de alta afinidade (FcRI) nos mastcitos

que, ativados, liberam mediadores inflamatrios e citocinas, promovendo a eosinofilia

tecidual e a hiper-reatividade brnquica (FINKELMAN, 2010; LAMBRECHT; HAMMAD,

2015).

A resposta inflamatria a uma infeco, a exposio ao antgeno ou a leso no tecido

objetivam a eliminao dos agentes etiolgicos e potencializam o reparo tecidual. A

inflamao excessiva pode, no entanto, causar leso do tecido, descompensao fisiolgica,

disfuno de rgos e at mesmo levar morte (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

A artrite reumatoide (SOUZA; LERNER, 2013), a doena inflamatria do intestino (GONG

et al., 2012; JOO, 2014), a asma (HOLGATE et al., 2009) e a periodontite (BOYLE;

23

SIMONET; LACEY, 2003) so doenas inflamatrias crnicas, caracterizadas por durao

prolongada, nas quais a inflamao, a destruio tecidual e as tentativas de reparao do

tecido ocorrem simultaneamente (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

2.2 FISIOPATOLOGIA DA DOENA PERIODONTAL

A doena periodontal (DP) causada por infeco por agentes patognicos presentes

na placa dentria, biofilme constitudo por bactrias, protenas salivares e clulas epiteliais

descamadas (ALVES et al., 2007); uma resposta imune bem orquestrada que inclui

respostas inata e adaptativa (GEMMELL; SEYMOUR, 1998).

O processo inflamatrio que caracteriza a DP acomete o periodonto gengiva,

ligamento periodontal, cemento radicular, e osso alveolar, estruturas de suporte que envolvem

os dentes (BASCONES-MARTINEZ et al., 2011). A inflamao periodontal ocorre em

resposta a antgenos bacterianos da placa dentria e inclui processos inflamatrios que levam

ao surgimento da gengivite e da peridontite.

A gengivite caracterizada por hiperemia, edema e sangramento gengival, quando

ainda no h alterao no nvel de insero do tecido conjuntivo ao dente (ALVES et al.,

2007; CEKICI et al., 2014; HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015). Quando a gengivite no

tratada precocemente, a inflamao pode tornar-se crnica, evoluindo para a periodontite.

Durante a periodontite, a placa bacteriana se acumula entre o epitlio de juno e o prprio

dente, resultando em inflamao que desencadeia a formao de bolsa periodontal, perda da

insero do tecido conjuntivo ao dente, presena de sangramento ao estmulo da sondagem,

abscessos, mobilidade dentria e at perda de unidades dentrias, em decorrncia da

reabsoro excessiva do osso alveolar (ALVES et al., 2007; BASCONES-MARTINEZ et al.,

2011; HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015).

A cavidade oral humana abriga uma enorme carga de espcies microbianas (CEKICI

et al., 2014). As bolsas periodontais, aprofundamentos patolgicos do sulco gengival

formadas a partir da migrao e da proliferao de clulas do epitlio juncional, se tornam um

nicho favorvel para a continuao da colonizao dos diversos tipos de patgenos

bacterianos (BASCONES-MARTINEZ et al., 2011; HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015).

relevante o conhecimento sobre a microbiota subgengival para que se compreendam

as suas implicaes na patognese da DP e se conhea o eventual impacto dos resultados do

24

tratamento sobre esses microrganismos. Socransky e outros (1998) estudaram as relaes

entre as bactrias subgengivais em amostras de microfilme bacteriano de 185 indivduos, e as

espcies encontradas foram classificadas de acordo com o envolvimento na iniciao e na

progresso da DP e distribudas em cinco grandes complexos marcados por cores. O primeiro

deles, denominado complexo vermelho, constitudo por Porphyromonas gingivalis,

Treponema denticola e Tannerella forsythia, e as espcies individuais desse grupo foram

fortemente associadas com formas graves da DP, relacionadas com a profundidade da bolsa e

com o sangramento sondagem. O segundo grupo, complexo laranja, composto por

Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Peptostreptococcos

micros, Streptococcus constellatus, Eubacterium nodatum, Campylobacter showae,

Campylobacter gracilis e Campylobacter rectus, mostrou-se intimamente relacionado com o

complexo vermelho e envolvido na iniciao e na progresso da periodontite crnica. No

terceiro grupo, complexo amarelo, esto includos Streptococcus sanguis, Streptococcus

oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus gordonii e Streptococcus intermedius. Fazem parte

do complexo verde, o quarto grupo, composto por Campylobacter concisus, Eikenella

corrodens e Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo a. Ao quinto grupo, complexo

violeta, foram adicionados Veillonella parvula e Actinomyces odontolyticus. Outras espcies

encontradas nos biofilmes analisados foram a A. actinomycetemcomitans serotype b,

Selenomonas noxia e Actinomyces naeslundii genospecies 2 (A. viscosus), que apresentaram,

porm, pouca relao com os cinco grupos supracitados (SOCRANSKY et al., 1998; GATTO

et al., 2014).

Alguns mecanismos estariam implicados na produo de danos sseos mediados pela

presena de bactrias e seus produtos que, sozinhos ou em conjunto, desencadeariam o

desequilbrio entre osteoclastos e osteoblastos. A ativao direta e indireta da reabsoro

ssea osteoclstica pode ocorrer por uma variedade de produtos txicos biologicamente ativos

a exemplo das endotoxinas de bactrias gram-negativas P. gingivalis conhecidas como

lipopolissacardeos (LPS), que esto fortemente associadas com a perda ssea patolgica que

caracteriza a DP (NAIR, 1996; HENDERSON; NAIR, 2003; LIU; LERNER; TENG, 2010;

HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015).

Na DP, sabe-se que produtos bacterianos como o LPS e citocinas inflamatrias

constituem as principais causas subjacentes da perda ssea. As citocinas pr-inflamatrias

foram identificadas como molculas fundamentais na induo e na regulao positiva para a

destruio dos tecidos periodontais, incluindo a IL-1, o TNF, a interferon-gama (IFN-), a IL-

6 e, principalmente, o RANKL, que, em contraste com as outras citocinas pr-inflamatrias,

25

induzem diretamente a diferenciao de osteoclastos (osteoclastognese) (KAJIYA et al.,

2010).

2.3 TECIDO SSEO E OSTEOCLASTOGNESE

O osso composto de matriz extracelular e clulas. A matriz extracelular subdivide-se

em parte orgnica principalmente constituda pelo colgeno tipo I (aproximadamente 95%)

e inorgnica. A matriz inorgnica participa como reservatrio dos ons clcio e fosfato,

aparecendo como cristais de hidroxiapatita depositados na matriz de colgeno. Os ostecitos

so clulas do tecido sseo que atuam como mecanossensores, regulando a estrutura ssea por

meio da comunicao de seus processos dendrticos no tecido sseo, regulando a massa e a

estrutura ssea. Juntamente com os osteoblastos responsveis pela deposio de tecido

sseo essas clulas garantem a formao, a manuteno e a remodelao da matriz ssea.

Os osteoclastos so clulas responsveis pela reabsoro da matriz ssea (COWIN, 2002;

SINGH et al., 2012).

O osso um tecido metabolicamente ativo e sofre remodelao contnua. Em

indivduos normais, existe o equilbrio entre o processo mediado pela atividade dos

osteoclastos e dos osteoblastos (CEKICI et al., 2014). A remodelao ssea fisiolgica

normal imprescindvel para a manuteno da resistncia ssea e para a integridade do

sistema esqueltico, uma vez que qualquer desequilbrio pode levar ao aumento ou

diminuio da massa ssea. A remodelao assegura o restabelecimento de microdanos e a

integridade mecnica do sistema esqueltico, e regula a liberao de clcio e fsforo a partir

dos ossos para o sangue (SINGH et al., 2012).

Os osteoblastos sintetizam a matriz orgnica rica em colgeno e permitem condies

ideais para a mineralizao, uma vez que secretam protenas da matriz ssea e

metaloproteinases de matriz (MMPs) (COWIN, 2002; SINGH et al., 2012). Os osteoclastos

so clulas gigantes multinucleadas, de origem hematopoitica, que derivam das clulas de

linhagem moncito-macrfago, sendo as nicas clulas capazes de degradar o tecido sseo

mineralizado (UDAGAWA et al., 1990). Os osteoclastos formam lacunas, conhecidas como

lacunas de Howship, ambiente cido decorrente da liberao do contedo dos vacolos

acidoflicos citoplasmticos, o que desencadeia a rpida dissoluo de cristais de

hidroxiapatita (SINGH et al., 2012).

26

A reabsoro ssea est sujeita influncia de vrios fatores locais e sistmicos.

Muitos deles interagem e alteram o metabolismo das clulas sseas, como, por exemplo,

prostaglandinas (PG) E2 e leucotrienos, mediadores inflamatrios metablitos do cido

araquidnico; alteraes hormonais causadas, por exemplo, na falta de estrognio em

osteoporose ps-menopausa; glicocorticoides em excesso como na doena de Cushing;

excesso de hormnio da paratireoide ou hormnios da tireoide em hiperparatireoidismo e

tirotoxicose, respectivamente; ou como consequncia de tratamento farmacolgico (LIU;

LERNER; TENG, 2010). Pesquisas mostram que a vitamina D ativada, isto , o calcitriol ou a

1,25 hidroxivitamina D (1,25(OH)2 D) tambm pode exercer influncia sobre a dinmica da

remodelao ssea (KITAZAWA et al., 2003; HA et al., 2006; SINGH et al., 2012). A

1,25(OH)2 D induz a absoro intestinal de clcio e fsforo, inibe a proliferao de clulas da

paratireoide e modula negativamente a sntese do hormnio paratireideo (inibindo o

hiperparatireoidismo e a perda ssea), modula a sensibilidade ao clcio e aumenta a

transcrio do receptor sensvel ao clcio (CANAFF; HENDY, 2002).

Um dos mecanismos responsveis pela patognese de doenas inflamatrias que

afetam o sistema sseo parece ter influncia sobre a diferenciao e a ativao descontrolada

de osteoclastos (CEKICI et al., 2014).

A osteoclastognese, processo de diferenciao dos osteoclastos, essencial para a

manuteno da homeostasia do tecido sseo, est tambm presente na patognese de diversas

patologias caracterizadas pela atividade osteoltica. Ela coordenada pela interao de trs

membros da superfamlia do fator de necrose tumoral (TNF): o RANKL, ligante do receptor

ativador do fator de transcrio nuclear kappa B (NF-B), o RANK, receptor ativador do

NF-B, e a osteoprotegerina (OPG). A diferenciao de clulas osteoclsticas depende de um

sistema central de controle relacionado com a ligao de molculas RANKL/RANK

(BAUDHUIN et al., 2007). A identificao e a caracterizao de RANKL, seu receptor

RANK, e o receptor osteoprotegerina chamariz solvel (OPG) contriburam, de forma

significativa, para a compreenso do mecanismo de remodelao esqueltica, na qual a

diferenciao de osteoclastos fundamental. A OPG regula negativamente a

osteoclastognese, inibindo a interao entre RANK e RANKL por ser um antagonista natural

de RANKL (KAJIYA et al., 2010). A ligao do RANKL ao RANK no s induz a

osteoclastognese, mas tambm promove a sobrevivncia e a ativao de osteoclastos. Porm,

quando a concentrao de OPG mais elevada em relao ao nvel de RANKL expresso, a

ligao de OPG a RANKL impede a sua ligao a RANK. Essa inibio da ligao de

RANKL e RANK mediada pela OPG diminui a velocidade e a intensidade da

27

osteoclastognese e promove a apoptose de osteoclastos anteriormente diferenciados e

ativados, reduzindo-se, assim, o processo de reabsoro ssea (IKEDA et al., 2004; KAJIYA

et al., 2010).

Os osteoblastos e os fibroblastos gengivais e periodontais tambm so considerados

fontes de RANKL e OPG no tecido periodontal. Alm disso, os fibroblastos do ligamento

periodontal desempenham papis cruciais na regulao da homeostase do ligamento

periodontal, que liga o osso do processo alveolar ao cemento radicular (KAJIYA et al., 2010).

A induo da diferenciao osteoclstica, alm da presena e da ligao do RANKL

com o RANK, requer o fator estimulador de colnias de macrfagos (M-CSF). Essa citocina,

produzida por clulas vizinhas do estroma e dos osteoblastos, induz a fuso de pr-

osteoclastos em osteoclastos, que sero secundariamente ativados em osteoclastos maduros

pelo prprio RANKL (IKEDA et al., 2004; BAUD'HUIN et al., 2007). A ativao do RANK

pelo RANKL seguida da sua interao com membros associados famlia do receptor TNF

(TRAF). O TRAF6 leva expresso de genes especficos responsveis pela diferenciao e

ativao osteoclstica, e seus alvos incluem as protenas cinases (MAPKs) como as vias das

cinases p38, a quinase de c-Jun N-terminal (JNK), cinase regulada por sinal extracelular

(ERK) e a fosfatidilinositol-3-cinase (PI3KA) / protena cinase B alm de fatores de

transcrio como o NF-B, a protena ativadora transcripcional (AP-1) e o fator nuclear de

clulas T ativas c1 (NFATc1), considerado como regulador mestre da osteoclastognese.

Essas ativaes permitem que os osteoclastos expressem marcadores especficos tais como a

fosfatase cida resistente ao tartarato (TRAP), a catepsina K, receptores de calcitonina e

receptores de integrina (BAUDHUIN et al., 2007; LIU; LERNER; TENG, 2010; PEREIRA

et al., 2011; SINGH et al., 2012; SOUZA; LERNER, 2013).

Alm da importncia na osteoclastognese, o RANKL tem um papel no

desenvolvimento imunitrio. Exerce ativao da JNK nas clulas T, atua em clulas

dendrticas inibindo a apoptose e induz a produo de citocinas pr-inflamatrias, tais como

TNF, IL-1, IL-1b e IL-6 (PEREIRA et al., 2011; SINGH et al., 2012).

Diversos hormnios e citocinas exercem, direta ou indiretamente, seus efeitos sobre a

osteoclastognese pela regulao da produo de clulas do estroma/osteoblsticas de OPG e

RANKL, como, por exemplo: o estrognio aumenta a produo de OPG; o PTH e os

glicocorticoides aumentam a produo de RANKL e diminuem a produo de OPG; e a 1,25

dihidroxivitamina D3 aumenta a produo de RANKL (BAUDHUIN et al., 2007; PEREIRA

et al., 2011).

28

A ativao das clulas T, direta e indiretamente, por lipopolissacardeos (LPS), entre

outros, aumenta a expresso do RANKL, induzindo diretamente a osteoclastognese (LIU;

LERNER; TENG, 2010; SINGH et al., 2012). Alm disso, diversas citocinas com perfil Th1 e

Th2 foram identificadas como estimuladores diretos ou indiretos da diferenciao,

sobrevivncia e atividade dos osteoclastos. As citocinas modulam as respostas inflamatrias e

ativam diferentes vias intracelulares que iniciam a diferenciao de osteoclastos (GEMMELL;

SEYMOUR 1998; GARLET, 2010; BRAUN; ZWERINA, 2011). A IL-1 e o TNF induzem

a expresso de outros mediadores que amplificam a resposta inflamatria, tais como as

prostaglandinas, e levam produo de enzimas lticas e produo de quimiocinas, ativando

a diferenciao de osteoclastos (KUDO et al., 2002; DEO; BHONGADE, 2010). A IL-1, a

IL-6 e a IL-7 tambm promovem, direta e indiretamente, a osteoclastognese. Por outro lado,

outras citocinas, tais como o interferon gama (IFN-), a IL-3 e a IL-4 podem atuar como

inibidores osteoclastognicos (SINGH et al., 2012).

indiscutvel que a perda ssea periodontal seja mediada por citocinas, inclusive o

RANKL, e que os antgenos orais, incluindo bactrias Gram-negativas e seus produtos,

interferem na produo e secreo desses mediadores inflamatrios (KAJIYA et al., 2010). A

endotoxina LPS a principal componente da membrana exterior de bactrias gram-negativas.

Moncitos humanos so extremamente sensveis ao LPS e respondem expressando muitas

citocinas inflamatrias, exacerbando, assim, a reposta inflamatria.

Propem-se, pelo menos, cinco mecanismos pelos quais as bactrias ou seus produtos,

como o LPS, podem induzir danos em estruturas mineralizadas. A capacidade de usar esses

diferentes mecanismos destrutivos depende da natureza da infeco e da proximidade da

bactria com o local afetado. A destruio direta da matriz inorgnica por bactrias ocorre

apenas em cries dentrias nas quais o cido produzido por bactrias aderidas aos dentes, tais

como o Streptococcus mutans, solubiliza os componentes da matriz calcificada da dentina e

do esmalte. Outros mecanismos potenciais esto relacionados com a ativao direta e indireta

de osteoclastos por bactrias ou seus componentes. Diretamente, o LPS bacteriano pode ativar

osteoclastos. Alm disso, esses componentes podem ativar a produo de citocinas

osteolticas e ativar linfcitos T CD4+ sensibilizados para expressar e secretar o RANKL

(HENDERSON; NAIR, 2003). A estimulao dos moncitos humanos por LPS, por exemplo,

ativa vrias vias de sinalizao intracelular que incluem a quinase IkappaB (IKK) da via

NF-B e trs ativadas por protena quinase ativada por mitgenos (MAPK): quinases

reguladas por sinais extracelulares (ERK) 1 e 2, quinase de c-Jun N-terminal (JNK) e p38. Por

meio do estmulo das diversas vias de sinalizao intracelular, desencadeia-se a ativao de

29

uma variedade de fatores de transcrio que incluem o NF-B e o AP-1, que coordenam a

induo de muitos genes codificadores de mediadores inflamatrios (GUHA; MACKMAN,

2011).

Outro mecanismo j analisado a inibio direta ou indireta de formao ssea

osteoblstica. A invaso dos osteoblastos por bactrias tambm vem sendo pesquisada como

outro possvel mecanismo associado periodontite. A invaso bacteriana a essas clulas pode

estar relacionada com a desregulao da remodelao ssea normal, resultando na alterao

da funo das clulas e na apoptose das clulas sseas (ALEXANDER et al., 2003;

HENDERSON; NAIR, 2003).

Moduladores da diferenciao e da atividade dos osteoclastos, como os bifosfonatos,

tm sido apontados como substncias adjuvantes na terapia periodontal de raspagem e

alisamento radicular (RAR) (LANE et al., 2005). Os bifosfonatos so anlogos quimicamente

estveis do pirofosfato que regulam a mineralizao ssea por ligao aos cristais de

hidroxiapatita e promovem ao quelante sobre o clcio. Alm disso, seus efeitos

farmacolgicos clssicos parecem estar relacionados com efeitos inibitrios sobre

osteoclastos. Os bifosfonatos so os principais frmacos para o tratamento da osteoporose, e

as diferenas individuais entre eles, em termos de ligao mineral e aes bioqumicas, se

refletem em seu comportamento clnico e em sua eficcia (RUSSELL et al., 2008). Na doena

periodontal experimental, bifosfonatos como o alendronato sdico preservam a reabsoro

ssea alveolar, tm atividade anti-inflamatria e antibacteriana (MENEZES et al., 2005) e

potencial antirreabsortivo (KIMMEL, 2007). Contudo, o uso dessas substncias tem sido

relacionado com diversos efeitos adversos, como a osteonecrose de maxilares, constatada

aps a administrao oral do bifosfonato alendronato (NICOLATOU-GALITIS et al., 2011).

Os frmacos empregados no tratamento da perda ssea possuem vantagens

teraputicas inerentes, mas tambm desvantagens. As constantes pesquisas buscam novos

frmacos que apresentem uma maior especificidade aliada a uma diminuio dos efeitos

colaterais. Desse modo, os potenciais teraputicos de produtos naturais tm sido avaliados

como estratgia farmacolgica segura e eficaz para a modulao do metabolismo sseo.

30

2.4 PRODUTOS NATURAIS

Produtos naturais tm sido usados ao longo dos sculos para tratar inmeras doenas.

Entre mais de 20 mil plantas medicinais disponveis aos seres humanos, um nmero limitado

foi, at hoje, suficientemente analisado (AMIRGHOFRAN, 2012). Alguns desses compostos

naturais tm sido utilizados em funo dos seus efeitos imunomoduladores e promissores de

proteo para doenas que alteram o metabolismo sseo e desencadeiam a perda ssea

patolgica, como a periodontite (BU et al., 2008; TANG et al., 2009).

Muitos dos medicamentos hoje disponveis no mundo originaram-se de trabalhos

elaborados a partir de produtos naturais usados tradicionalmente na cultura popular

(AMIRGHOFRAN, 2012; YANG et al., 2013). A Organizao Mundial da Sade, em 1978,

reconheceu oficialmente o uso de fitoterpicos. Em 1981, por meio da poltica de plantas

medicinais e de fitoterpicos, foi definido, no Brasil, o estudo das plantas medicinais como

uma das prioridades de investigao clnica (BRASIL, 2011).

Muitas reas como a etnobotnica e a etnofarmacologia vm desenvolvendo pesquisa

e seleo de novas plantas medicinais e substncias oriundas de plantas, que propiciam a

obteno de novos medicamentos com garantia de eficcia, segurana e qualidade.

Dentre as espcies registradas em um inqurito popular realizado por Costa e outros

(2010), no municpio de Salvador, o Allium cepa L. foi o segundo produto de origem vegetal

mais citado (19,74%), sendo utilizado etnofarmacologicamente para o tratamento de doenas

inflamatrias, tais como a asma (COSTA et al., 2010). Nesse contexto, investigou-se o

potencial teraputico dessa substncia e de um dos seus flavonoides, a quercetina, em modelo

murino de alergia respiratria (OLIVEIRA et al., 2015a). O potencial imunomodulador

observado despertou o interesse para o conhecimento dos mecanismos celulares e moleculares

responsveis pela ao dessas drogas e sua utilizao em outros modelos experimentais.

2.4.1 Allium cepa L.

O Allium cepa L., nome cientfico para a cebola, uma planta bulbosa que pertence

famlia Alliaceae. A cebola um ingrediente alimentar amplamente utilizado e

comercialmente cultivado em todo o mundo (BHANOT; SHRI, 2010). Diferentes tipos de

extratos de Allium cepa L. (aquoso, etanlico e hidroalcolico) e seus compostos isolados

(polissacardeos e flavonoides) tm apresentado resultados promissores, in vitro e in vivo,

31

tendo-se comprovado atividades antibacteriana, antioxidante, anti-histamnica, anti-

inflamatria, podendo ainda inibir a reabsoro ssea (MHLBAUER; LOZANO; REINLI,

2002; KAISER et al., 2009; TANG et al., 2009; MNAYER et al., 2014).

Pesquisas in vitro e in vivo avaliaram o potencial imunomodulador de alguns

compostos naturais e seus constituintes qumicos, inclusive do Allium cepa L., e do

flavonoide quercetina em modelo de asma ao extrato do caro Blomia tropicalis (BtE)

(CERQUEIRA-LIMA et al., 2010; DOURADO et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2015a). Nesse

modelo, induzida a polarizao Th2, como constatado na asma atpica, desencadeando-se

respostas mediadas por anticorpos IgE, ativao de mastcitos, liberao de mediadores e

citocinas, promovendo-se a eosinofilia tecidual e a hiper-reatividade brnquica (BAQUEIRO

et al., 2010). O Allium cepa L. e um de seus metablitos, a quercetina, reduziram efetivamente

parmetros imunolgicos no modelo experimental de asma induzida pelo BtE. Houve uma

diminuio significativa no nmero total de clulas no lavado broncoalveolar, na peroxidase

eosinoflica do pulmo, na densidade de clulas no pulmo e na produo de muco ao serem

comparados os animais alrgicos tratados com Allium cepa L. e os animais alrgicos no

tratados; alm disso, observou-se seu potencial broncodilatador em ensaios com traqueia

isolada de camundongo. A reduo desses parmetros demonstrou a capacidade e as

propriedades anti-inflamatria e imunomoduladoras desses compostos naturais (OLIVEIRA

et al., 2015).

Tambm foi referido o potencial do Allium cepa L. em diminuir a reabsoro ssea

induzida por ovariectomia em animais (TANG et al., 2009). Os dados desse estudo sugerem

que a soluo do p bruto de Allium cepa L. em gua inibe a osteoclastognese de coculturas

de clulas do estroma da medula ssea e de clulas de macrfagos por meio da atenuao de

RANKL induzida por ERK, p38 e ativao de NF-B. No entanto, os efeitos funcionais do

Allium cepa L. sobre os osteoclastos e osteoblastos cultivados ainda so desconhecidos.

Tem-se constatado que vrios metablitos secundrios derivados de plantas interferem

diretamente sobre molculas e em mecanismos como a mediao de respostas e de atividade

de segundos mensageiros inflamatrios, assim como na expresso de fatores de transcrio e

molculas pr-inflamatrias (ROGERIO et al., 2007). Os principais compostos presentes no

extrato de Allium cepa L. (AcE) so os compostos sulfurosos e os flavonoides (LANZOTTI,

2006; ROGERIO et al., 2007; LKKE et al., 2012; COLINA-COCA et al., 2013).

Em trabalhos anteriores, usando-se espectrometria de massa para anlise direta de

compostos sulfurosos volteis, comprovou-se a presena de propanotiol, dissulfeto dipropil e

tiossulfonatos. Os sulfxidos, a que se atribuem o sabor e o odor da cebola, podem ser

32

tambm responsveis pela atividade biolgica do Allium cepa L. Alm disso, os flavonoides,

compostos naturais fenlicos presentes em frutas e vegetais, exibem diversas propriedades

farmacolgicas, tais como efeito anti-inflamatrio, antioxidante e modulador da reabsoro

ssea patolgica. Dentre os flavonoides presentes no Allium cepa L., destaca-se a quercetina

(PARK et al., 2009; GUO et al., 2012).

2.4.2 Quercetina

Os flavonoides so compostos polifenlicos que possuem um esqueleto benzopirnico,

e suas caractersticas estruturais os distribuem em: flavonas, isoflavonas, flavonis, flavanas,

flavanonas, antocianidinas e chalconas (BOOTS; HAENEN; BAST, 2008). A quercetina, que

pertence a uma subclasse dos flavonoides, classificada como um flavonol e constituda por

um esqueleto de difenil propano (C6C3C6) com dois anis benznicos ligados a um anel

pirano. Presente em diversas fontes vegetais, a quercetina apresenta atividade inibitria de

ativao da cascata inflamatria e bloqueia a produo de TNF, a ativao de NF-B e a

sntese de citocinas. Possui, ainda, a capacidade de inibir a degranulao de neutrfilos e a

liberao de nions superxido, sendo tambm capaz de modular a ativao de mastcitos

(DAS; RAM; GHOSH, 2003; MIN et al., 2007). Alguns autores sugerem que a quercetina

modula o desenvolvimento e a atividade de osteoclastos in vitro, porm se fazem necessrios

novos estudos que esclaream o preciso mecanismo de ao desse composto em clulas de

reabsoro ssea (RASSI et al., 2005).

Nesse contexto, h considerveis evidncias do potencial do Allium cepa L. e da

quercetina na inibio de mecanismos que desencadeiam a perda ssea patolgica. Alm

disso, sabe-se que vrios frmacos usados atualmente na teraputica foram obtidos a partir de

plantas ou de seus componentes bioativos. Assim sendo, mediante a induo da

osteoclastognese e da avaliao da atividade osteoclstica, busca-se investigar o potencial

teraputico do AcE e da quercetina em modelos in vitro e conhecer o papel que desempenham

na terapia da perda ssea patolgica.

33

3 OBJETIVOS

34

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o potencial imunomodulador do extrato metanlico de Allium cepa L. e do

flavonoide quercetina na osteoclastognese e na atividade dos osteoclastos, em modelos in

vitro.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Avaliar a citotoxicidade in vitro do extrato de Allium cepa L. e do flavonoide

quercetina.

Determinar as concentraes in vitro do extrato de Allium cepa L. e do flavonoide

quercetina, que inibem a osteoclastognese e a atividade dos osteoclastos em culturas

celulares.

Avaliar o efeito do extrato de Allium cepa L. e do flavonoide quercetina na

diferenciao de osteoclastos maduros e nos nveis de citocinas em culturas de clulas RAW

264.7, ativadas por RANKL e PgLPS.

Avaliar o efeito do extrato de Allium cepa L. e do flavonoide quercetina na

atividade de osteoclastos e nos nveis de citocinas em culturas de clulas RAW 264.7 ativadas

por RANKL e PgLPS.

Avaliar o efeito do extrato de Allium cepa L. e do flavonoide quercetina na via de

sinalizao (NF-B) relacionada com a diferenciao e a funo dos osteoclastos ativados por

RANKL e PgLPS.

35

4 MATERIAIS E MTODOS

36

4.1 REAGENTES

Macrfagos murinos (RAW 264.7) foram obtidos da American Type Culture

Collection (ATCC), catlogo no.TIB-71. O Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), o

Meio Essencial Mnimo de Eagle-modificao alfa (MEM-) e o Soro Fetal Bovino (SFB),

foram adquiridos na Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Os kits de ensaio

imunoenzimtico (ELISA) para dosagem das citocinas IL-3, IL-4, IL-6, IL-1 e TNF foram

adquiridos na NeoBioscience Technology Co., Ltd. (BD) (China), e o LPS derivado de P.

gingivalis (Pg), na Cedarlane (33277, Ontrio, Canad). Para o ensaio de viabilidade celular o

Alamar Blue (resazurina) foi adquirido na Invitrogen (DAL 1025, Grand Island, NY) e a

quantificao total de protenas foi determinada pelo mtodo do cido bicinconnico (kit

BCA Protein Assay), Thermo Scientific Pierce (23225, Rockford, EUA). RANKL derivada

de rato; dimetilsulfxido (DMSO) 99,5%; penicilina G-estreptomicina; kits de fosfatase

cida resistente ao tartarato (TRAP); 4,6-diamidino-2-fenil-indol (DAPI) para colorao

DAPI; quercetina 98% (2 - (3,4-Di-hidroxifenil) -3,5,7-tri-hidroxi-4H-1-benzopiran-4-ona,

3,3, 4, 5,6 - entahydroxyflavone), com massa molecular de 302.24 g/mol; e os outros

produtos qumicos utilizados neste trabalho foram obtidos a partir de Sigma Aldrich (St.

Louis, MO, EUA).

4.1.2 Extrato metanlico de Allium cepa L. (AcE)

O extrato metanlico de Allium cepa L. foi obtido de acordo com o padro descrito por

Oliveira e outros (2015). Resumidamente, as amostras foram descascadas, cortadas, e a

extrao foi realizada por macerao, permanecendo em lcool metlico (CH3OH) a 99,8%

durante 7 dias. Aps filtrao, o extrato foi concentrado por evaporao sob presso reduzida,

utilizando-se um evaporador rotativo. A seguir, o solvente foi removido e, aps secagem na

estufa, o AcE foi mantido em -20oC at seu uso durante a fase experimental. A normalizao

do extrato de Allium cepa L. foi realizada por cromatografia lquida de alta eficincia

(HPLC). A porcentagem mdia calculada de Qt no extrato de AcE foi de 2,5% (OLIVEIRA et

al., 2015). Foram testadas as diferentes concentraes de AcE (100, 500 ou 1000 g/mL) e de

Qt (1,25, 2,5 ou 5 M). As concentraes de AcE foram selecionadas com base em um estudo

anterior (OLIVEIRA et al., 2014) no qual no foi observado efeito txico das concentraes

de AcE testadas em culturas celulares de precursores de osteoclastos, estimuladas ou no com

37

LPS. Como estmulos inflamatrios foram usados LPS de Porphyromonas gingivalis (Pg),

bactria comumente associada DP (HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015), e de

Escherichia coli (Ecoli), utilizada como padro para desencadear a resposta inflamatria em

diversos modelos de inflamao (SHADDOX et al., 2013).

4.2 CULTURA CELULAR

A linhagem celular de moncito/macrfago de camundongo RAW 264.7 foi utilizada

como precursora de osteoclastos. As culturas celulares foram mantidas em frascos de cultura

contendo DMEM, 10% SFB, 100 g/mL de penicilina e 100 g/mL de estreptomicina a 37C

com 5% de CO2. O meio DMEM foi trocado a cada 3 dias.

4.3 ENSAIO PARA DIFERENCIAO DOS OSTEOCLASTOS

Para avaliar os efeitos dos compostos testados na atividade dos osteoclastos e na

osteoclastognese em condies inflamatrias, as clulas da linhagem RAW 264.7 foram

plaqueadas em microplacas de 96 poos (5x103 clulas/poo), contendo meio -MEM, 10%

SFB, 2 mM de L-glutamina e 100 g/mL de penicilina/estreptomicina. Aps 24h de

incubao, a fim de simular a diferenciao de clulas e, simultaneamente, uma infeco, as

clulas foram tratadas na ausncia e na presena de 30 ng/mL de RANKL e 1 g/mL Pg LPS.

As concentraes testadas de Qt 1.25g/mL (Qt 1.25), 2,5 g/mL (Qt 2.5), 5 g/mL

(Qt5), de AcE 100g/mL (AcE 100), AcE 500g/mL (AcE 500), AcE 1000g/mL (AcE

1000) foram tambm adicionadas aos poos, durante 5 dias, com troca do meio no terceiro

dia. As amostras foram dissolvidas em DMSO, e a concentrao final de DMSO no excedeu

0,05%, no causando efeitos txicos em clulas RAW 264.7. Essa concentrao de DMSO foi

a mesma usada no grupo controle negativo (Cel/Ctrl).

38

4.4 ENSAIOS DE VIABILIDADE CELULAR

Foram realizados ensaios para definir as concentraes no txicas de AcE e de

quercetina sobre clulas da linhagem RAW 264.7, usadas sob diferentes condies nos

protocolos experimentais. Inicialmente, foi avaliado o efeito do AcE (10-8000g/mL) sobre a

proliferao celular e o efeito do AcE e da Qt na contagem de clulas viveis coradas por

DAPI e na induo de apoptose. Alm disso, foi avaliado o efeito do AcE nas clulas RAW

264.7, sob a induo de condies inflamatrias (usando-se LPS de Pg e Ecoli) in vitro

utilizadas neste trabalho. Sob essas condies, a viabilidade celular foi avaliada por meio dos

mtodos de reduo da resazurina e de concentrao de protena total. A contagem de clulas

viveis precursoras de osteoclastos (RAW 264.7) foi realizada com as clulas coradas por

DAPI. Adicionalmente, foram feitos ensaios de viabilidade para definir as concentraes no

txicas de AcE e de quercetina sob condies inflamatrias (LPS de Pg) e de induo da

osteoclastognese (RANKL).

4.4.1 Ensaios de reduo da resazurina e de concentrao de protena total

Ensaio de reduo de resazurina (Alamar Blue) foi realizado para analisar as clulas

precursoras de osteoclastos viveis com o metabolismo ativo na proliferao celular e na

osteoclastognese em condies normais e inflamatrias, como previamente descrito

(KARTNER et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2014). Para tanto, clulas da linhagem RAW

264.7 foram cultivadas na ausncia e na presena de RANKL e LPS, e na presena e na

ausncia de AcE (10-8000g/mL), incluindo-se as concentraes de AcE (100, 500 ou 1000

g/mL) ou de Qt (1,25, 2,5 ou 5 M), durante 5 dias. Em todos os testes de viabilidade, o

DMSO (50%) foi usado como o controle positivo. As culturas foram colocadas em meio

contendo 10% de Alamar Blue. Aps 4h de incubao, 100 l do meio foi transferido para as

cavidades de uma placa de 96 poos, e a densidade ptica (OD) foi medida a um comprimento

de onda de 570 nm e 600 nm, utilizando-se um leitor de espectrofotometria (BioRad 3550). A

porcentagem de citotoxicidade foi calculada em relao ao grupo controle.

A mensurao da concentrao de protena total foi utilizada para confirmar o efeito

no citotxico do AcE e da Qt sobre a viabilidade celular. A concentrao de protenas totais,

em todas as amostras testadas, foi comparada com uma curva padro preparada por diluio

da soluo padro de protena fornecida no kit. Nesse ensaio, como descrito por Kartner e

39

outros (2010), as clulas foram lavadas com PBS e lisadas com tampo de lise (citrato

trissdico 90 mM, NaCl 10 mM, 0,1% de Triton X-100, pH 4,8). A OD foi medida a um

comprimento de onda de 562 nm, utilizando-se um leitor de espectrofotometria (BioRad

3550), e os nveis de protena total foram mensurados.

4.4.2 Anlise de imagem e contagem de clulas coradas por DAPI

O ensaio foi realizado para confirmar que as clulas precursoras de osteoclastos (RAW

264.7) apresentavam caractersticas morfolgicas normais sob as concentraes testadas de

AcE ou de Qt sob condies normais ou inflamatrias induzidas por LPS. Para tanto, as

clulas foram cultivadas em placas de 96 poos na presena e na ausncia de LPS e das

concentraes teste de AcE (100, 500 ou 1000 g/mL) ou de Qt (1,25, 2,5 ou 5 M) durante 5

dias. O dimetilsulfxido (DMSO) a 50% foi utilizado como controle positivo. Para a

aplicao da tcnica de microscopia de fluorescncia, utilizou-se o corante DAPI (46-

diamidino-2-fenilindol). A anlise de imagem e a contagem de clulas por colorao com

DAPI foram realizadas como anteriormente descrito (OLIVEIRA et al., 2014). As clulas

foram coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), e aquelas com ncleos fragmentados

ou condensados foram definidas como clulas apoptticas (XIONG et al., 2011). Foram feitas

cinco imagens para cada grupo, usando-se o microscpio de fluorescncia (Cytation 3, Biotek,

EUA), e as barras representaram 100 m. Cada amostra foi analisada utilizando-se o software

Gen5 (Biotek, EUA).

4.4.3 Ensaio de Caspase 3/7

Objetivando-se avaliar quantitativamente sinais intracelulares de ativao da apoptose,

foram verificados os nveis de caspases efetoras de apoptose (Caspase 3/7), utilizando-se o

mtodo quimiluminescente de placas, com o kit de ensaio de caspase-3/7 Glo (Pierce, EUA).

As clulas foram cultivadas na presena e na ausncia do AcE (100, 500 ou 1000 g/mL) ou

da Qt (1,25, 2,5 ou 5 M). Foi adicionado o reagente caspase-3/7 Glo e, aps misturarem-se

suavemente as clulas, foram incubadas temperatura ambiente durante 1 h. A luminescncia

de cada amostra foi medida na placa de leitura de luminmetro Cytation 3, Biotek (EUA).

40

4.5 ENSAIO DE FOSFATASE CIDA RESISTENTE AO TARTARATO (TRAP)

Para examinar-se o efeito inibidor do AcE e da Qt na osteoclastognese induzida por

RANKL/PgLPS em RAW 264.7, medidas quantitativas e qualitativas de TRAP foram

obtidas por meio de dois mtodos anteriormente descritos (CRASTO et al., 2013). A

diferenciao dos osteoclastos foi medida por meio da quantificao de clulas marcadas

positivamente pela TRAP. O nmero de osteoclastos multinucleados TRAP+ por poo foi

determinado e foram distribudos em osteoclastos pequenos (2-5 ncleos) e grandes (>10

ncleos). As imagens digitais de clulas TRAP+ foram obtidas com objetiva de 40X sob

microscopia de campo claro, usando-se um microscpio Leica DM IRE2 e o software

OpenLab (Leica Microsystems). A anlise das imagens foi realizada com o software NIH

ImageJ 1.46r. Alm disso, foi determinada a atividade da TRAP total solvel. Utilizou-se um

tampo detergente acdico para que as clulas fossem permeabilizadas e fosse possvel medir-

se a liberao de p-nitrofenol pelos osteoclastos. A quantidade de p-nitrofenol liberado indica

o grau de diferenciao celular. Procedeu-se leitura da microplaca a um comprimento de

onda de 405 nm utilizando-se um leitor de espectrofotometria (BioRad 3550).

4.6. ENSAIO DE REABSORO DE HIDROXIAPATITA (colorao de Von Kossa)

A acumulao mineral foi visualizada com a colorao histoqumica de fosfato de

clcio Von Kossa. Ensaios de reabsoro em superfcie de placas de 24 poos, Corning Osteo

Assay (Corning Life Sciences, EUA) foram realizados como descrito por Kartner e outros

(2010). Resumidamente, clulas RAW 264.7 foram diferenciadas em osteoclastos e deixadas

a aderir s placas a 37 C com 100 L de meio contendo 30 ng/mL de RANKL. No quinto

dia, as clulas RAW 264.7 foram transferidas para placas de ensaio, e foram testadas as

concentraes de AcE (100, 500, 1000 g/mL) ou de Qt (1,25, 2,5 ou 5 M). Aps 24 h, as

clulas foram removidas das placas com a adio de 500 L de soluo de hipoclorito de

sdio a 1,2% por 5 min. Em seguida, as placas foram aspiradas, lavadas cuidadosamente com

gua e secadas antes da colorao. A colorao modificada de Von Kossa foi usada para

aumentar o contraste do ensaio. A microscopia de campo escuro mostrou a reabsoro nos

poos em 40X. A densidade ptica de uma rea preta completa (100% de absorbncia) com a

41

matriz corada de Von Kossa sem nenhum osteoclasto foi utilizada como controle. Para avaliar

com mais preciso as reas de reabsoro afetadas, elas foram quantificadas e calculadas

usando-se o Image J 1.46r.

4.7 ENSAIO PARA MENSURAR A SECRECO DE CITOCINAS

Os nveis de citocinas foram medidos em sobrenadantes obtidos a partir de clulas

RAW 264.7 na presena e na ausncia de RANKL (30 ng/mL)/PgLPS (1 g/mL), e de AcE

(100, 500 ou 1000 g/mL) ou de Qt (1,25, 5 ou 2,5 M) com kits de ELISA disponveis

comercialmente. A secreo de IL-6, IL-3, IL-4, TNF e IL-1 foi medida nos sobrenadantes

recolhidos durante a diferenciao de osteoclastos (aps 24 h, 3 dias e 5 dias), e, aps 24 h,

em placas de superfcie Osteo Assay para medir-se a atividade dos osteoclastos. Os

sobrenadantes de cultura de clulas foram recolhidos e centrifugados para remover os restos

celulares, e o ensaio foi realizado de acordo com as especificaes do fabricante. A

absorbncia de cada amostra foi medida a 450 nm com um leitor de espectrofotometria. Os

resultados foram comparados com a curva padro preparada por diluio da soluo padro

fornecida no kit.

4.8 ENSAIO DE WESTERN BLOT PARA ANLISE DA INIBIO DA VIA DO NF-B

Clulas RAW 264.7 foram cultivadas durante 2 horas e, durante 1 hora, foram pr-

tratadas na presena e na ausncia da concentrao tima do AcE (1000 g/mL) ou da Qt

(5 uM) juntamente com um controle no tratado. Em seguida, as clulas foram estimuladas

com RANKL e PgLPS durante 30 minutos, conforme descrito por Xie e outros (2012). As

clulas tratadas com os reagentes indicados foram lisadas em soluo tampo para extrao de

protenas (RIPA) com protease e inibidores de fosfatase (Cell Signaling, Danvers, MA). O

lisado celular foi centrifugado a 13.000 rpm durante 20 min para remover os detritos

celulares. A transferncia de iguais concentraes de protenas foi confirmada com o ensaio

que mensura a concentrao de protena total (Bio-Rad). O lisado celular (10 g de protena)

foi separado por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio e

42

transferido para uma membrana de nitrocelulose. Aps a transferncia, a membrana foi

bloqueada com 5% de albumina srica bovina/soluo salina tamponada com fosfato

contendo 0,05% de Tween-20, durante 2 h. A membrana foi ento incubada com anti-IB,

anti-p-IB e anti--actina (utilizada como controle) durante 2 h. Foram detectadas bandas

utilizando-se reagentes ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA), de acordo com as

instrues do fabricante, que foram analisadas utilizando-se MyECL Imager (Thermo

Scientific, Rockford, IL, EUA).

4.9 ANLISE ESTATSTICA

Para cada ensaio, a significncia estatstica foi determinada pela anlise de varincia

(ANOVA), seguida do ps-teste de Tukey (p

43

5 RESULTADOS

44

5.1 Allium cepa L. E QUERCETINA NO INDUZEM EFEITOS TXICOS EM CLULAS RAW 264.7 NA PRESENA OU NA AUSNCIA DE RANKL e pgLPS

Nos ensaios de viabilidade, clulas RAW 264.7 foram cultivadas, durante 5 dias, na

presena e na ausncia de AcE nas concentraes de 10-8000g/mL, no induzindo

proliferao celular (Fig. 1). Adicionalmente, o AcE e a Qt no induziram toxicidade na

viabilidade celular avaliada por DAPI (Fig. 2) nem no ensaio de induo de apoptose

(Caspase 3/7) (Fig. 3) em clulas RAW 264.7. Alm disso, no foram observados efeitos

txicos nas culturas de clulas precursoras de osteoclastos, na presena ou ausncia do AcE

ou da Qt sob induo inflamatria in vitro com LPS (Pg e Ecoli). Sob essas condies, essas

clulas foram avaliadas nos ensaios de reduo da resazurina (Fig. 4), na mensurao da

concentrao de protena total (Fig. 5) e na contagem de clulas viveis coradas por DAPI

(Fig. 6). Nesses experimentos, observou-se que o AcE e a Qt, tanto no ensaio de reduo da

resazurina quanto na dosagem de protenas totais, no demonstraram efeitos txicos na

osteoclastognese induzida por RANKL/PgLPS (Fig. 7).

45

Cel 10 50 100 200 250 500 1000 2000 4000 8000 DMSO0

50

100

150

***

AcE ( g/mL)

Pro

lifer

ao

cel

ular

(%)

Figura 1. Efeito do Allium cepa L. na proliferao de clulas RAW 264.7. Clulas foram cultivadas na presena e ausncia de AcE (10-8000g/mL); clulas no tratadas (Cel) no foram expostas ao AcE; e DMSO foi usado como controle positivo. Aps de 5 dias de exposio a droga, a proliferao celular foi avaliada usando o ensaio de resazurina (Alamar Blue). Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No houve signficncia estatstica entre o controle (Cel) e as concentraes de AcE testadas. Houve significncia estatstica entre o controle positivo (DMSO) e todas as concentraes testadas. p

46

Ctrl DMSO0

50

100

150

AcE (g/mL) - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - 1.25 2.5 5

***

Con

tage

m c

elul

ar p

or D

API

(%)

Figura 2. Efeito do Allium cepa L. e quercetina na morfologia e contagem celular em clulas RAW 264.7 coradas com DAPI. Clulas foram cultivadas durante 5 dias na presena das concentraes testadas de AcE e Qt. (A) Morfologia de ncleos das clulas foi observada (a) Ctrl, (b) AcE 100 g / mL, (c) AcE 500 g / mL, (d) AcE 1000 g / mL, (e) Qt 1.25M, (f) Qt 2,5 M, (g) Qt 5M, (h) DMSO; (B) Contagem de clulas atravs de colorao DAPI utilizando um microscpio de fluorescncia. Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No houve diferena significante entre controle (Ctrl) e todas as concentraes testadas. Houve significncia estatstica entre o controle positivo (DMSO), o Ctrl e todas as concentraes testadas de AcE e Qt. p

47

Cel 1.25 2.5 50

2000

4000

6000

8000

Qt ( M)

B

Ativ

idad

e C

aspa

se 3

/7

Figura 3. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na apoptose em clulas RAW 264.7. Em A e B, a atividade de caspase-3 e capase-7 foram avaliadas atravs do ensaio de caspase 3/7. Em A e B, os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No houve significncia estatstica entre o controle (Cel) e as concentraes testadas de AcE e Qt. ANOVA-Tukey.

Cel 10 50 100 10000

2000

4000

6000

8000

AcE (g/mL)

A

Ativ

idad

e C

aspa

se 3

/7

48

Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0

50

100

150

Pg LPS (1g/mL) + + + + + +

AcE (g/mL)

F

***Via

bilid

ade

Cel

ular

(%

)

Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0

50

100

150

Ecoli LPS (1g/mL) + + + + + +

G

AcE ( g/mL)

***Via

bilid

ade

Cel

ular

(%

)

Figura 4. Efeito da Allium cepa L. na viabilidade celular de clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS. Clulas foram cultivadas na presena de Pg LPS (A, B e F) ou Ecoli LPS (C, D e G), e AcE; clulas no tratadas com AcE e expostas ao DMSO, foram utilizadas como controle positivo (DMSO). Aps 5 dias de exposio, a proliferao celular foi avaliada pelo ensaio de resazurina (Alamar Blue). As imagens mostradas representam resultados observados em mltiplas imagens feitas dos seguintes grupos: Ctrl PgLps (A) e AcE 1000g/mL (B); Ctrl EcoliLPS (C) e AcE 1000g/mL (D). Em F e G, os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No houve significncia estatstica entre o controle (Ctrl) e as concentraes testadas de AcE. Houve significncia estatstica entre o controle positivo (DMSO) e todas as concentraes testadas de AcE. p

49

Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Pg LPS(1g/mL) + + + + +

AcE (g/mL)

A

***

Prot

ena

(mg/

mL)

Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ecoli LPS (1g/mL) + + + + +

AcE (g/mL)

B

***

Prot

ena

(mg/

mL)

Figura 5. Efeito da Allium cepa L. nos nveis de protena total de clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS. Em A e B, as clulas foram cultivadas na presena de PgLPS (A) ou Ecoli LPS (B), e AcE; o grupo controle (Ctrl) no foi exposto ao AcE e o DMSO foi usado como controle positivo (DMSO). Aps 5 dias, foi realizado o ensaio para quantificar os nveis de protena total. Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No houve significncia estatstica entre o controle (Ctrl) e as concentraes testadas de AcE. Houve significncia estatstica entre o controle positivo (DMSO) e todas as concentraes testadas de AcE. p

50

Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0

50

100

150

AcE (g/mL)

Pg LPS (1g/mL) + + + + + +

F

***

Con

tage

m c

elul

ar p

or D

API

(%)

Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0

50

100

150

Ecoli LPS (1g/mL) + + + + + +

AcE (g/mL)

G

***

Con

tage

m c

elul

ar p

or D

API

(%)

Figura 6. Efeito da Allium cepa L. na morfologia e contagem celular em clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS coradas com DAPI. Clulas RAW 264.7 foram cultivadas na presena de Pg LPS (A, B e F) ou Ecoli LPS (C, D e G), e AcE; o grupo controle (Ctrl) no foi exposto ao AcE e o DMSO foi usado como controle positivo (DMSO). A morfologia celular foi observada em A (Ctrl PgLPS) e B (AcE 1000g/mL); C (Ctrl EcoliLPS) e D (AcE 1000g/mL). Em F e G, as clulas foram contadas depois de coradas com DAPI e foi usado um microscpio de fluorescncia. Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No houve significncia estatstica entre o controle (Ctrl) e as concentraes testadas de AcE. Houve significncia estatstica entre o controle positivo (DMSO) e todas as concentraes testadas de AcE. p

51

Ctrl 0

50

100

150

PgLPS (1g/mL) + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) + + + + + + +AcE (g/ml) - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - 1.25 2.5 5

A

Viab

ilidad

e C

elul

ar (

%)

Ctrl 0.0

0.5

1.0

1.5

PgLPS (1g/mL) + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) + + + + + + +AcE (g/ml) - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - 1.25 2.5 5

B

Prot

ena

(mg/

mL)

Figura 7. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na viabilidade celular na osteoclastognese induzida por RANKL e estimulada com PgLPS. As clulas foram cultivadas na presena de PgLPS, RANKL e AcE ou Qt; clulas no tratadas (Ctrl) no foram expostas a AcE ou Qt. Aps 5 dias de exposio contnua, a viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de resazurina (Alamar Blue)) (A) e os nveis de protena total foram avaliados usando ensaio de protena (B). Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No houve diferena estatisticamente significante entre o controle (Ctrl) e as concentraes testadas de AcE e Qt. ANOVA-Tukey.

52

5.2 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A OSTEOCLASTOGNESE INDUZIDA POR RANKL ESTIMULADA POR PgLPS EM CLULAS RAW 264.7

Para determinar-se o efeito do AcE e da Qt na diferenciao de clulas precursoras de

osteoclastos em osteoclastos maduros sob o estmulo de RANKL/PgLPS, a colorao de

TRAP foi utilizada para avaliar o nmero e o tamanho dos osteoclastos multinucleados por

poo. Na ausncia de LPS, RANKL, AcE e Qt, no se evidenciou a presena de osteoclastos

(Fig. 8 Aa). Na presena de LPS e RANKL, houve aumento estatisticamente significativo da

diferenciao de clulas RAW 264.7 em osteoclastos (Fig. 8 Ab). Todas as trs concentraes

testadas de AcE (100, 500 ou 1000 g/mL) e de Qt (1,25, 2,5 ou 5 M) inibiram a

diferenciao de osteoclastos induzidos por RANKL/PgLPS (p

53

Cel Ctrl0

10

20

30

40

50

*** ***

***

B

PgLPS (1g/mL) - + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) - + + + + + + +AcE (g/ml) - - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - - 1.25 2.5 5

*************** ***

***

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PgLPS (1g/mL) - + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) - + + + + + + +AcE (g/ml) - - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - - 1.25 2.5 5

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PgLPS (1g/mL) - + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) - + + + + + + +AcE (g/ml) - - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - - 1.25 2.5 5

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de

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nol (

nM)

Figura 8. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na osteoclastognese induzida por RANKL e estimulada com PgLPS. Em (A), a colorao TRAP por microscpio de campo claro mostrou osteoclastos diferenciados na presena de AcE ou Qt, aps 5 dias. As setas mostram a diminuio do tamanho de osteclastos. Os osteoclastos foram divididos em dois grupos diferentes de acordo com o nmero de ncleos contados: osteoclastos pequenos (B) de 2-5 ncleos e osteoclastos grandes (C) com 10 ou mais ncleos por clula. Em (D), a secreo de PNP (nM) foi diminuda em todos as concentraes testadas de AcE e Qt . Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. Houve significncia estatstica entre o controle (Ctrl) e as concentraes testadas de AcE e Qt. * p

54

5.3 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A REABSORO DOS OSTEOCLASTOS

A figura 9A mostra imagens do ensaio de colorao de Von Kossa. Observa-se a

quantificao da superfcie parcialmente reabsorvida por osteocastos induzidos por

RANKL/PgLPS (Ctrl), em comparao com o controle no tratado (Cel). O tratamento com

as trs concentraes de AcE e de Qt reduziu significativamente os efeitos da RANKL/PgLPS

sobre a atividade dos osteoclastos quando comparados com o controle positivo (Ctrl)

(p

55

Cel Ctrl 0.0

0.5

1.0

1.5

******

***

B

PgLPS (1g/mL) - + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) - + + + + + + +AcE (g/ml) - - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - - 1.25 2.5 5

***

*** ***rea

de

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Figura 9. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na atividade de reabsorso osteoclstica. Em (A) clulas RAW 264.7 induzida por RANKL foram diferenciadas em osteoclastos durante 5 dias e transferidas para placas de ensaio Corning Osteo. As clulas maduras foram testadas na presena de PgLPS, RANKL e AcE ou Qt durante 24 h e o grupo no tratado (Ctrl) no foi exposto a AcE ou Qt. O ensaio de Von Kossa foi realizado, onde as placas com as amostras foram secas temperatura ambiente e fotografadas usando fotomicrografia de campo digital. As imagens foram quantificadas e as reas sem reabsorso apareceram pretas e as brancas foram as reabsorvidas. Em (B), a quantificao de A. Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. Houve significncia estatstica entre o controle (Ctrl) e as concentraes testadas de AcE e Qt. *** p

56

5.4 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A PRODUO DE CITOCINAS DURANTE A OSTEOCLASTOGNESE E A ATIVIDADE DOS OSTEOCLASTOS

O efeito do AcE e da Qt na produo de mediadores inflamatrios produzidos por

osteoclastos induzidos por RANKL/PgLPS foi investigado por meio da quantificao dos

nveis de citocinas durante a osteoclastognese e na atividade dos osteoclastos. Durante a

diferenciao de osteoclastos no quinto dia, a secreo de IL-1 foi modulada pelo AcE com

100 g/mL, 500 g/mL e 1000 g/mL (p

57

Tabela 1. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na produo de citocinas durante a osteoclastognese e a atividade dos osteoclastos. O sobrenadante foi recolhido e as citocinas IL-1, IL-6, TNF, IL-3 e IL-4 foram mensuradas durante a osteoclastognese (24 horas, 3 dias e 5 dias) e a atividade dos osteoclastos (24 horas). Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experincias independentes. Houve significncia estatstica entre o controle (Cel) e Ctrl # p

58

5.5 Allium cepa L. E QUERCETINA INIBEM A ATIVAO DA VIA DE SINAL