UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA - Ufba · A minha bela e amada mãe sempre com astral alegre e...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
Tese de Doutorado
ANGELA GIUDICE DINIZ
MONÓCITOS E MACRÓFAGOS PARTICIPAM DA
PROTEÇÃO E DA PATOLOGIA ASSOCIADA À
INFECÇÃO POR Leishmania braziliensis
SALVADOR-BAHIA
2012
PPGIm
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
ANGELA GIUDICE DINIZ
MONÓCITOS E MACRÓFAGOS PARTICIPAM DA
PROTEÇÃO E DA PATOLOGIA ASSOCIADA À
INFECÇÃO POR Leishmania braziliensis
Orientadora: Profª Drª Olívia A. Bacellar
Co-orientador: Dr. Edgar M. Carvalho
Salvador-Bahia
2012
PPGIm
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Imunologia, do Instituto de
Ciências da Saúde da Universidade
Federal da Bahia, como pré-requisito para
obtenção do grau de Doutor em
Imunologia.
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Dedicatória
DEDICO ESTA TESE
Aos meus filhos, Renata e Marcelo por todos os sonhos alcançados juntos nesta
caminhada e por todos aqueles que ainda lutamos para alcançar. Muitíssimo obrigada.
Ao meu pai, (in memorian) por me ensinar a viver com humildade e ser meu exemplo
profissional.
A minha bela e amada mãe sempre com astral alegre e positivo.
Aos meus irmãos pela compreensão das minhas ausências e pelo incentivo nos
momentos difíceis.
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Agradecimentos
A minha orientadora Dra. Olívia Bacellar não só pela orientação, mas também pela sua
confiança, paciência e amizade.
A Dr. Edgar M. de Carvalho grande exemplo de pesquisador, pelos seus ricos
ensinamentos e pela oportunidade de me deixar fazer parte do grupo do Serviço de
Imunologia.
A minha amiga Thaís Delavechia não só pela sua amizade e incentivo além da sua
indispensável ajuda no FACS durante o decorrer desta tese.
À Célia Vendrame, amiga, companheira que com sua serenidade ajudou nos
experimentos da tese.
Aos meus queridos amigos Rosana, Anselmo, Silvane, Marcita, Tânia, Andrea e Joyce
pelo apoio incondicional e pela nossa grande amizade.
Aos pesquisadores que viajam quinzenalmente na obtenção das amostras que
contribuíram para a realização deste estudo.
Aos colegas Juliana, Viviane, Silvana, Lílian, Kátia, Adriano e Neto pela companhia de
todos os dias.
A Ricardo Riccio e Anselmo pela ajuda nas estatísticas.
As secretárias e amigas Elbe e Lucinha pela amizade, dedicação e presteza.
Aos queridos amigos da secretária, Cristiano, Paulo Lessa, Orlando e Seu Dilson pela
ajuda constante e incansável.
Aos participantes da banca examinadora por doarem seu tempo para o enriquecimento
deste trabalho.
A todos os médicos, pesquisadores, funcionários e estudantes por fazerem do Serviço de
Imunologia um local prazeroso de se trabalhar.Aos professores e funcionários do
programa de Pós-graduação em Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde.
Ao responsável por tudo isso existir “Deus”.
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APOIO FINANCEIRO
●NIH Grant AI30639
●Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
●Universal 472198/2009-2.
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“Seja qual for o seu sonho, comece.
Ousadia tem genialidade, poder e magia”.
J.W. von Goethe
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I. RESUMO
MONÓCITOS E MACRÓFAGOS PARTICIPAM DA PROTEÇÃO E DA
PATOLOGIA ASSOCIADA À INFECÇÃO POR Leishmania braziliensis ANGELA GIUDICE DINIZ. Introdução: Na leishmaniose cutânea (LC) e mucosa
(LM) causadas por Leishmania braziliensis, a patologia está associada com a produção
exacerbada de citocinas pró-inflamatórias. Cerca de 10% dos indivíduos residentes em
Corte de Pedra- BA, uma área de transmissão de L. Braziliensis apresentam reação de
hipersensibilidade tardia ao antígeno de Leishmania, não apresentam evidências de
doença clínica e são considerados como tendo uma forma subclínica (SC) da doença.
linfócitos desses indivíduos não produzem ou apresentam uma produção menor de IFN-
e TNF- quando comparados a pacientes com LC. Até o momento não está claro
porque esses indivíduos têm a capacidade de controlar a doença. Como a erradicação do
parasito ou a ocorrência de formas assintomáticas da infecção não podem ser explicadas
pela ação efetiva da resposta imune adaptativa, é necessário um maior aprofundamento
do conhecimento do papel da resposta imune inata no controle da infecção. Os
macrófagos são as principais células que abrigam a Leishmania e consequentemente a
sobrevivência ou morte desse parasito depende da ativação dessas células, da produção
de oxidantes e de moléculas inflamatórias. Todavia na LC e na LM os parasitos não são
totalmente destruídos e uma constante ativação macrofágica pode vir a contribuir para a
reação inflamatória e patogênese da doença. Objetivo: Avaliar o papel dos monócitos
/macrófagos na imunopatogênese da leishmaniose tegumentar. Metodologia:
Macrófagos de pacientes com LC, LM e indivíduos SC foram infectados in vitro com L.
braziliensis e avaliados quanto à suscetibilidade a infecção por Leishmania e a
capacidade de matar o parasito. No sobrenadante dos macrófagos infectados foram
avaliadas as produções de óxido nítrico (NO), superóxido (O2-) pelo reagente de Griess,
quimiocinas e TNF-α por teste imunoenzimático. Foram também avaliadas a frequência
de monócitos inflamatórios (CD14+CD16
+), assim como a caracterização fenotípica
dessas células por citometria de fluxo nos diferentes grupos estudados. Resultados:
Após a exposição a L. braziliensis, macrófagos de indivíduos SC apresentaram uma
diminuição significante na percentagem de células infectadas e no número de
amastigotas por 100 macrófagos em comparação com as células de pacientes com LC e
LM. A produção de NO e O2- foi detectada, mas não houve variação significante entre
os diferentes grupos. A produção de quimiocinas e de TNF-α foi maior em pacientes
8
com LC e LM quando comparado com a do grupo SC. A frequência de monócitos
CD14+CD16
+ foi maior em doentes com LC em comparação com indivíduos SC.
Conclusão: Nossos dados sugerem que monócitos/macrófagos desempenham um papel
importante no controle da infecção por L. braziliensis e na patologia da leishmaniose
tegumentar.
Palavras-chave: Leishmaniose tegumentar americana; Leishmania braziliensis; infecção
subclínica; macrófagos; monócitos inflamatórios.
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II. ABSTRACT
MONOCYTES AND MACROPHAGES PARTICIPATE IN PROTECTION AND
THE PATOLOGY ASSOCIATED WITH Leishmania braziliensis INFECTION.
ANGELA GIUDICE DINIZ Introduction: The pathology of cutaneous (CL) and
mucosal leishmaniasis (ML) caused by Leishmania braziliensis is associated with the
overproduction of proinflammatory cytokines. In contrast with these clinical forms of
infection, about 10% of individuals living in Corte de Pedra- BA, an area of L.
braziliensis transmission, presenting with delayed hypersensitivity reaction to
leishmania antigen, have no evidence of clinical disease and are considered to have
subclinical disease (SC). Lymphocytes of these individuals either do not produce or
have a lower production of IFN- and TNF- compared to patients with CL. It is not
clear why these individuals have the ability to control the disease. Since the eradication
parasites or asymptomatic form of infection cannot be explained by the effective action
of the adaptive immune response, a greater depth of knowledge of the role of the innate
immune response in infection control is required. Macrophages are the main cells that
harbor the Leishmania parasite. Consequently, the survival or death of these parasites
depends on the activation of these cells, with the subsequent production of oxidants and
inflammatory molecules. However, in LC and LM parasites are not fully destroyed, and
constant macrophage activation may contribute to the inflammatory response and
pathogenesis of the disease. Objectives: Evaluate the role of monocytes/macrophages in
the immunopathogenesis of tegumentary leishmaniasis. Methodology: Macrophages
from CL, ML patients and SC individuals were cultured in vitro with L. braziliensis and
evaluated for susceptibility to Leishmania infection and the ability to kill the parasite. In
the supernatant of infected macrophage cultures were evaluated the production of nitric
oxide (NO), superoxide (O2-) by Griess reagent, chemokines and TNF-α by enzyme
immunoassay. The frequency of inflammatory monocytes (CD14+CD16
+) and the
phenotypic characterization of those cells by flow cytometry in different groups were
also evaluated. Results: After exposure to L. braziliensis, macrophages derived from
SC individuals showed a significantly lower number of infected cells and a smaller
number of intracellular amastigotes compared to cells from CL and ML patients.
Production of NO and O2- were detected, but did not change significantly among the
different groups. Production of chemokines and TNF-α in supernatants of macrophages
from CL and ML patients was higher when compared with the SC group. The frequency
10
of CD14+CD16
+ monocytes in patients with CL was higher compared with SC
individuals. Conclusion: Our data suggest that monocytes/macrophages play a pivotal
role in controlling L. braziliensis infection and in tegumentary leishmaniasis pathology.
Key words: American tegumentary leishmaniasis; Leishmania braziliensis; subclinical
infection; macrophages; inflammatory monocytes.
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III. LISTA DE FIGURAS
Figuras 1A e 1B. Avaliação in vitro da infecção de macrófagos humanos com
promastigotas de L. braziliensis......................................................................................42
Figuras 2A e 2B. Produção de Óxido nítrico e do Superóxido em macrófagos humanos
infectados ou não com L. braziliensis.............................................................................44
Figuras 3A, 3B e 3C Avaliação da produção de CCL2, CXCL8 e CCL3 após infecção
de macrófagos humanos com L. braziliensis.................................................................. 46
Figuras 4A e 4B Avaliação da produção de CXCL9 após infecção de macrófagos
humanos com L. braziliensis...........................................................................................47
Figuras 5A e 5B Avaliação da produção de TNF-α após infecção de macrófagos
humanos com L. braziliensis...........................................................................................49
Figuras 6A, 6B e 6C Frequência de monócitos CD14+ CD16
+ em pacientes com LC e
em indivíduos com infecção SC......................................................................................51
Figuras 7A, 7B e 7C Histogramas que representam a Intensidade média de fluorescência
da expressão ex vivo das moléculas HLA-DR, CD80 e CD86 nos monócitos CD14+
CD16+/-
de um paciente com LC.....................................................................................53
Figuras 8A, 8B e 8C Expressão ex vivo das moléculas HLA-DR, CD80 e CD86 nos
monócitos CD14+ CD16
+/- de indivíduos SC e pacientes com LC..................................54
Figuras 9A, 9B e 9C Análise da aquisição e do percentual de monócitos CD14+ CD16
+
sem estímulo e estimulados com SLA de um paciente com LC.....................................56
Figura 10 Expressão de TNF-α em monócitos CD14+ CD16
+/- estimulados com SLA em
indivíduos SC e pacientes com LC.................................................................................57
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IV. LISTA DE ABREVIATURAS
CCL2/MCP-1: Proteína quimiotática de monócitos
CCL3/MIP1-α: Proteina inflamatória de macrófagos
CCR2: Receptor 2 de quimiocina
CCR5: Receptor 5 de quimiocina
CD3: Marcador de superfície de células T
CD14: Marcador de superficie celular da população de monocitos
CD16: Marcador de superficie celular da população de monócitos, macrófagos e células
NK
CD19: Marcador de superfície de células B
CD 56: Marcador de superfície de células NK
CD80: Molécula de superfície co-estimulatória CD80
CD86: Molécula de superfície co-estimulatória CD86
CMSP: Células mononucleares do sangue periférico
CXCL8/IL-8: Interleucina 8
CXCL9/MIG: Monocina induzida por interferon gama
CXCL10/ IP-10: Proteína induzida por interferon gama
CX3CR1: CX3C Receptor de quimiocina-1
CXCR1: CXC Receptor de quimiocina-1
DTH: Teste de hipersensibilidade tardia
ELISA: Enzyme linked ummunosorbent assay (ensaio enzimático)
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FACS: Sistema de citometria de fluxo
FITC: Fluorescein isothiocyanate (isotiocianato de fluoresceína)
HIV: Vírus da imunodeficiência humana
HLA-DR: Antigeno Leucocitario Humano
H2O2: Peróxido de hidrogênio
IFN- y: Interferon gamma
IL-1: Interleucina 1
IL-4: Interleucina 4
IL-5: Interleucina 5
IL-6: Interleucina 6
IL-10: Interleucina 10
IL-12: Interleucina 12
iNOS: Óxido nitrico sintase induzível
LC: Leishmaniose cutânea
LCD: Leishmaniose cutânea difusa
LD: Leishmaniose Disseminada
LM: Leishmaniose mucosa
LPS: Lipopolissacarídeo
LTA: Leishmaniose Tegumentar Americana
LV: Leishmaniose visceral
mAbs: Anticorpos monoclonais
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mRNA: Ácido ribonucléico mensageiro
IDRM: Intradermo reação de Montenegro
NADH: Nicotinamida adenina dinucleotídeo hidrogênio
NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato hidrogênio
NK: Célula natural killer
NO: Óxido nítrico
NO2-: Nitrito
O2-: Ânion superóxido
ONOO-: Peroxinitrito
Pe: Phycoerythrin (ficoeritrina)
Pe-CY5: Phycoerythrin cyanine (ficoeritrina-cianina 5)
PMNs: Polimorfonucleares
RNI: Reativos intermediários do nitrogênio
ROI: Reativos intermediários do oxigênio
SC: Subclínico
SFB: Soro fetal bovino
SLA: Antígeno solúvel de Leishmania
TH1: Linfócitos T “helper” auxiliares tipo1
Th2: Linfócitos T “helper” auxiliares tipo2
TLR: Receptor “toll-like”
TLR2: Receptor “toll-like” 2
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TLR 4: Receptor “toll-like” 4
TLR9: Receptor “toll-like” 9
TNF-: Fator de necrose tumoral – alfa
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V. SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................19
1.1 Aspectos epidemiológicos.........................................................................................19
1.2 Agentes etiológicos e transmissão.............................................................................19
1.3 Aspectos clínicos da leishmaniose tegumentar americana (LTA).............................20
1.4 Aspectos imunológicos da leishmaniose tegumentar................................................21
1.5 Resposta inflamatória e lesão tecidual na leishmaniose tegumentar.........................23
1.6 Eventos iniciais da resposta imune na infecção por Leishmania...............................23
1.7 Radicais derivados do oxigênio e nitrogênio e sua impotância para regular o
parasitísmo.......................................................................................................................25
1.8 Citocinas e quimiocinas na leishmaniose..................................................................26
1.9 Subpopulações de monócitos e seu papel na infecção e inflamação.........................28
2. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA..........................................................................31
3. HIPÓTESES................................................................................................................32
4. OBJETIVOS................................................................................................................33
4.1 Objetivo Geral...........................................................................................................33
4.2 Objetivos Específicos................................................................................................33
5. DESENHO DO ESTUDO...........................................................................................34
5.1 Área endêmica...........................................................................................................34
5.2 Definição de casos.....................................................................................................34
5.3 Critérios de inclusão..................................................................................................35
17
5.4 Critérios de exclusão.................................................................................................35
6. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................36
6.1 População do estudo…………………………………………………………..........36
6.2 Parasito......................................................................................................................36
6.3 Antígeno solúvel de leishmania................................................................................37
6.4 Separação das células e culturas de macrófagos.......................................................37
6.5 Infecção de macrófagos humanos com uma cepa de L. braziliensis.........................37
6.6 Determinação da produção de óxido nítrico e superóxido........................................38
6.7 Determinação da produção de quimiocinas e TNF-...............................................38
6.8 Análise da expressão de CD14, CD16, HLA-DR, CD80 e CD86 em monócitos por
citometria de fluxo...........................................................................................................38
6.9 Expressão de TNF- nos monócitos CD14+ CD16
+ por análise de citometria de
fluxo.................................................................................................................................39
6.10 Análises Estatísiticas...............................................................................................39
7. RESULTADOS...........................................................................................................41
7.1 Avaliação in vitro da infecção de macrófagos humanos por L. braziliensis...........41
7.2 Produção do óxido nítrico e do superóxido em macrófagos humanos infectados ou
não com L. braziliensis....................................................................................................43
7.3 Avaliação da produção de quimiocinas após a infecção de macrófagos humanos com
L. braziliensis...................................................................................................................45
7.4 Avaliação da produção de TNF- após a infecção de macrófagos humanos com L.
braziliensis.......................................................................................................................48
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7.5 Frequência de monócitos inflamatórios em pacientes com LC e em indivíduos com
infecção SC......................................................................................................................50
7.6 Expressão das moléculas HLA-DR, CD80, CD86 nos monócitos inflamatórios.........
CD14+CD16
+ de indivíduos SC e pacientes com LC......................................................52
7.7 Expressão de TNF- em monócitos CD14+CD16
+ estimulados com SLA em............
indivíduos SC e pacientes com LC..................................................................................55
8. DISCUSSÃO GERAL.................................................................................................58
9. CONCLUSÕES...........................................................................................................65
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................66
11. ANEXOS.................................................................................................................. 77
Artigo 1– Macrophages participate in host protection and the disease pathology
associated with Leishmania braziliensis infection
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos epidemiológicos
As leishmanioses são um grupo de doenças que se estabelecem em células do
sistema fagocítico mononuclear, determinando formas clínicas tegumentar e visceral da
doença. Afetam cerca de 12 milhões de pessoas no mundo, sendo 2 milhões de novos
casos por ano (1.5 milhão leishmaniose tegumentar e 500 mil leishmaniose visceral).
Além disso, cerca de 350 milhões de pessoas estão expostas ao risco de infecção com
70.000 mortes a cada ano (Reithinger et al. 2007). Nos últimos anos, a globalização
econômica e o aumento do fluxo migratório estenderam a distribuição da doença para
países desenvolvidos. A doença é considerada um grave problema de saúde pública,
causando significativa morbidade e mortalidade.
No Brasil tanto a leishmaniose visceral como a leishmaniose tegumentar são
endêmicas e apresentam-se em franca expansão geográfica. A leishmaniose visceral
(LV), atinge 22 estados e tem uma prevalência de 3000 casos por ano enquanto que a
leishmaniose tegumentar é descrita em vários municípios de todas as unidades
federadas, sendo registrados em média cerca de 30.000 novos casos por ano. A maior
incidência da doença ocorre nas regiões norte e nordeste (Ministério da Saúde, 2009).
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) tem alta incidência no estado da
Bahia, 22/100.000 habitantes, sendo distribuída em áreas agrícolas, associadas ao
desmatamento. A doença afeta indivíduos jovens, produtivos e mesmo crianças que se
expõem à infecção durante atividades agrícolas.
1.2 Agentes Etiológicos e Transmissão:
Os protozoários causadores da leishmaniose pertencem a ordem Kinetoplastida,
família Trypanosomatidae e gênero Leishmania (Grimaldi et al. 1993). Nas Américas
são conhecidas atualmente 11 espécies de Leishmania dermotrópicas causadoras de
doença em humanos. No Brasil, as principais espécies de Leishmania causadoras de
LTA são: Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis e Leishmania amazonensis
(Ministério da saúde, 2009). A L. braziliensis é o principal agente causal da leismaniose
cutânea e da leishmaniose mucosa na América Central e América do Sul. Na Bahia,
20
principalmente em Corte de Pedra (região endêmica), a leishmaniose tegumentar é
causada por L. braziliensis.
Todas as espécies de Leishmania são transmitidas ao homem por fêmeas
infectadas do inseto da família Pyshcodidae e subfamília Phlebotominae que inocula as
formas prosmatigotas metacíclicas na pele durante o repasto sanguíneo. Parasitos do
gênero Leishmania apresentam duas formas evolutivas em seu ciclo de vida, a forma
promastigota e a amastigota. Promastigotas são encontrados no inseto e podem ser
classificadas como promastigotas procíclicas, que se multiplicam no intestino do inseto,
ou como as promastigotas metacíclicas infectantes, que são encontrados em partes da
boca e do intestino anterior do inseto. Ao picar outro animal e eventualmente o homem,
o inseto regurgita o material aspirado misturado com os parasitos e ocorre a inoculação
das formas promastigotas metacíclicas infectantes, que são englobadas por células
fagocíticas do hospedeiro (como os macrófagos, neutrófilos e células dendríticas)
recrutadas ao sítio da infecção. Os parasitos internalizados nos macrófagos se
diferenciam em amastigotas no interior do fagolisossoma e se multiplicam por divisão
binária. Quando a célula hospedeira está altamente parasitada há o rompimento da sua
membrana e as amastigotas disseminam-se pelos tecidos infectando novos macrófagos
exacerbando assim a infecção (Lainson et al. 1987; Hepburn 2003).
1.3 Aspectos Clínicos da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)
A leishmaniose tegumentar pode apresentar uma diversidade de formas clínicas
no homem incluindo, leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose mucosa (LM),
leishmaniose disseminada (LD), leishmaniose cutânea difusa (LCD) e aínda infecção
subclínica (SC) ou assintomática dependendo da espécie de Leishmania infectante, da
região geográfica, do grau de imunidade do indivíduo e do inseto vetor.
Leishmaniose cutânea: É a forma mais comum de apresentação da doença. Apresenta
uma lesão de pele benigna, pode ser auto-curável, sendo causada por diferentes espécies
de Leishmania. A lesão inicia-se habitualmente com uma área de vermelhidão e edema
no sítio de inoculaçao pelo inseto e depois de 3 a 4 semanas desenvolve-se na maioria
dos casos, uma única úlcera com bordas elevadas, endurada e eritematosa, onde os
parasitos são encontrados principalmente nas bordas da lesão (Marsden et al. 1984;
Marsden 1985).
21
Leishmaniose mucosa: Aproximadamente 3% dos pacientes com leishmaniose cutânea
por L. braziliensis evoluem para a forma mais grave da doença, a LM. O principal
agente causador desta doença é a L. braziliensis. As lesões são múltiplas, acima da
cintura pélvica, são infiltradas, com ulcerações destrutivas nas mucosas do nariz, boca e
faringe. Existem também casos raros de lesão mucosa em indivíduos sem histórico de
lesão cutânea (Marsden 1986; Jones et al. 1987; Marsden 1994).
Infecção subclínica: É observada em indivíduos residentes em área endêmica de
leishmaniose. Esses indivíduos apresentam reação de hipersensibilidade tardia ao
antígeno de leishmania positivo (DTH) e são considerados como tendo uma forma
subclínica da doença. Individuos considerados subclícnicos não desenvolvem doença e
o controle da infeção ocorre sem o uso de medicamentos (Bosque et al. 2000; Follador
et al. 2002; de Oliveira Camera et al. 2006).
1.4 Aspectos imunológicos da leishmaniose tegumentar
É sabido que as leishmanioses representam um excelente modelo sistêmico para
estudo da resposta imune mediada por células. Em 1986, MOSMANN iniciou uma
revolução conceitual na imunologia por dividir as células T “helper” (Th) em duas
populações (Th1 e Th2) com perfis de citocinas antagonicas e contrareguladoras. Em
camundongos, na infecção por Leishmania major a resistência é dependente do
desenvolvimento de um tipo de resposta imune Th1 que está associada com a produção
de IFN-, enquanto que susceptibilidade está associada com o desenvolvimento de
resposta Th2 com produção de IL-4 e IL-5 (Liew 2002; Sacks e Noben-Trauth 2002).
Em humanos, na ausência da ativação de células Th1, a produção de IFN- é baixa
ou ausente e os macrófagos perdem a capacidade de destruir leishmânias e formas
disseminadas da leishmaniose são observadas como a leishmaniose visceral e
leishmaniose cutânea difusa (Carvalho et al. 1988; Bomfim et al. 1996). Todavia, nas
formas cutânea e mucosa da leishmaniose tegumentar apesar de existir uma resposta
imune protetora, os pacientes evoluem para a doença. Do ponto de vista histopatológico,
as lesões de LC e LM são caracterizadas por um processo inflamatório com linfócitos e
plasmócitos e com raros ou até mesmo ausência de parasitos (Bittencourt e Barral
1991). Na realidade, evidências têm sido acumuladas de que a resposta imune participa
da lesão tecidual da leishmaniose tegumentar: 1) Os pacientes com LC e LM
apresentam uma produção aumentada de IFN- e TNF- (Ribeiro-de-Jesus et al. 1998)
22
mas, em vez de controlarem a infecção, desenvolvem úlceras cutâneas e mucosas; 2)
Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de pacientes com LC e LM
quando estimuladas com antígeno de L. braziliensis in vitro produzem pouco ou não
produzem IL-10 e a adição exógena dessa citocina não regula a produção de IFN- e
TNF- nestes pacientes (Bacellar et al. 2002); 3) Embora IL-10 seja expressa em
células da lesão de pacientes com LC e LM, em células da lesão mucosa há uma menor
expressão do receptor de IL-10 do que nas células da lesão cutânea (Faria et al. 2005);
4) A produção de TNF- e IFN- no soro e em sobrenadantes de culturas de células
estimuladas com o antígeno de leishmania diminuem significativamente após o
tratamento (Da-Cruz et al. 1996; Ribeiro-de-Jesus et al. 1998). Em contraste com estas
formas clínicas de infecção causada por L. braziliensis, cerca de 10% dos indivíduos
residentes em área de transmissão por L. braziliensis, apesar da exposição a esse
parasito, não apresentam evidências de doença clínica. Esses indivíduos apresentam
DTH positivo (teste de Montenegro) e são considerados como tendo uma forma SC da
doença (Follador et al. 2002). Linfócitos de indivíduos com a forma SC da infecção por
L. braziliensis não produzem ou apresentam uma produção menor de IFN- e TNF-
quando comparados com pacientes com LC após estimulação in vitro com antígeno de
L. braziliensis. Por outro lado, células de indivíduos com a forma SC produzem mais
IL-5 que pacientes com leishmaniose cutânea (Follador et al. 2002). Foi visto também
que um equilíbrio na produção das citocinas IFN-/ IL-10 produzidas por indivíduos SC
podem representar uma melhor modulação da resposta imune associada com um
prognóstico favorável (Gomes-Silva et al. 2007). Até o momento não está claro porque
os indivíduos com a forma SC da infecção por L. braziliensis têm a capacidade de
controlar a doença.
Resultados recentes revelam a existência de complexidades na regulação de
citocinas e nos mecanismos de aquisição de resistência ou suscetibilidade. A produção
de IFN-γ por células Th1 favorece ativação dos macrófagos e morte do parasito, no
entanto, a produção excessiva dessa citocina poderia levar à inflamação descontrolada e
destruição dos tecidos.
23
1.5 Resposta inflamatória e lesão tecidual na leishmaniose tegumentar
A destruição celular e tecidual que leva ao aparecimento da lesão é a responsável
pela mais importante manifestação clínica na leishmaniose tegumentar que é a úlcera
leishmaniótica. Nossos estudos prévios têm mostrado a importância da resposta
inflamatória na destruição tecidual na leishmaniose tegumentar e a incapacidade de IL-
10 modular esta resposta na leishmaniose mucosa. Por exemplo, existe uma associação
entre produção de IFN- e TNF- e tamanho da lesão assim como o aparecimento de
formas mais graves da doença (Bacellar et al. 2002; Antonelli et al. 2005). O uso da
pentoxifilina, um inibidor de TNF- associado ao antimônio, cura pacientes com LC e
LM que são refratários ao tratamento com antimonial (Lessa et al. 2001; Bafica et al.
2003) e acelera a cura de pacientes virgens de tratamento (Machado et al. 2007).
Também tem sido identificada uma grande atividade de células citotóxicas em lesões de
pacientes com LC (Machado et al. 2002; Faria et al. 2005; Faria et al. 2009).
1.6 Eventos iniciais da resposta imune na infecção por Leishmania
Nesta fase inicial da interação parasito-hospedeiro diversas células presentes no
meio atuam, despertando grande interesse nos últimos anos por suas ações
diversificadas. Após a infecção por Leishmania, os neutrófilos são as primeiras células a
chegar ao sítio da infecção. Estas células possuem vida curta, morrem por apoptose e
são fagocitadas por macrófagos e células dentríticas que assim se infectam com os
parasitas (van Zandbergen et al. 2004). Outras células do sistema imune inato, são as
células natural killer (NK), que possuem atividade citotóxica, desempenham papel
importante no controle da infecção por Leishmania e aparecem no sítio da infecção 24
horas depois da inoculação pelos parasitas (Muller et al. 2001). Os monócitos tem
origem de células precursoras na medula óssea, possuem meia-vida na circulação que
varia de 1 a 3 dias. Os macrófagos teciduais são oriundos da migração dos monócitos a
partir da circulação e pela proliferação de precursores de macrófagos nos tecidos. Os
monócitos desempenham funções importantes na resposta inflamatória, o que é
essencial para a resposta inata a patógenos. Estes representam cerca de 10% dos
leucócitos no sangue humano e 4% dos leucócitos no sangue de camundongo. Essas
células são classificadas pela expressão da molécula de superfície CD14 responsável
pela ligação ao complexo lipopolissacarídeo (LPS) e pela ativação de macrófagos.
24
Os monócitos não são uma população homogênea, apresentam subtipos que são
principalmente baseados nas diferenças de expressão de moléculas de superfície (Grage-
Griebenow et al. 2001). No homem duas populações são distinguidas, os monócitos
clássicos que são CD14+CD16
- e os inflamatórios CD14
+CD16
+. Estas subpopulações
de monócitos do sangue periférico, apresentam características morfológicas e funções
diferentes. Os monócitos inflamatórios são potentes produtores de TNF- e apresentam
baixa ou nenhuma produção de IL-10. Estas células parecem ser mais maduras,
presentam uma alta expressão dos níveis de HLA-DR quando comparadas com os
monócitos clássicos. O aumento do número destas células têm sido reportados em
doenças inflamatórias e infecções em humanos (Ziegler-Heitbrock 2007; Belge, et al.
2002). Durante o processo de inflamação, ocorre um aumento do número de monócitos
circulantes e da sua produção na medula óssea, assim como a redução do tempo de
permanência dos mesmos na circulação, uma vez que eles migram para o foco da lesão.
Os macrófagos apresentam um elevado grau de heterogeneidade fenotípica e
funcional e podem responder a estímulos endógenos que são rapidamente gerados após
lesão ou infecção (Mosser e Edwards 2008). Esses estímulos iniciais são tipicamente
produzidos por células do sistema imune inato e podem exercer um efeito transitório
sobre a fisiologia dos macrófagos. Os macrófagos também podem responder a sinais
que são produzidos por moléculas das células da imunidade adaptativa. Esses sinais são
mais focados e prolongados do que os estímulos da imunidade inata (Mosser e Edwards
2008). Foram identificadas 3 populações de macrófagos ativados, cada uma das quais
tem uma fisiologia distinta e estas populações podem ser geradas em resposta a sinais
da resposta imune inata ou adaptativa: 1. Macrófagos ativados classicamente: São os
macrófagos produzidos durante respostas mediadas por células da resposta imune.
Através da combinação de dois sinais, o IFN- e TNF-α, resultando em uma população
de macrófagos com uma melhor capacidade microbicida/tumoricida e que secretam
níveis elevados de citocinas e mediatores pró-inflamatórios (O’Shea e Murray 2008).
Estes macrófagos classicamente ativados são componentes vitais de defesa do
hospedeiro, mas a sua ativação deve ser controlada, porque as citocinas e seus
mediadores podem levar a série de danos teciduais 2. Macrófagos ativados
alternativamente ou “wound healing”: São macrófagos que podem ser desenvolvidos
em resposta a sinais da resposta inata ou adaptativa. Um dos primeiros sinais inatos a
ser liberados durante a lesão tecidual se pensa ser a IL-4 (Loke et al 2007). A produção
25
precoce desta citocina converte rapidamente macrófagos residentes em uma população
de células que estão programados para promover a cicatrização de feridas através da
produção da matriz extracelular. O papel destes macrófagos em defesa do hospedeiro na
imunidade adaptativa continua a ser um pouco enigmatico. 3. Macrófagos regulatórios:
Estes macrófagos podem surgir após as respostas imunes inatas ou adaptativas.
Glicocorticóides são liberados por células supra-renais, em resposta ao stress, e pode
inibir a defesa mediada por macrófagos e suas funções inflamatórias dando origem a
uma população de macrófagos reguladores. Estes macrófagos não contribuem para a
produção da matriz extracelular, e muitas destas células reguladoras expressam níveis
elevados de moléculas co-estimulatórias (CD80 e CD86) e, por conseguinte, podem
apresentar antígenos a células T (Edwards et al 2006). Macrófagos reguladores podem
também ser explorados por parasitas, patógenos bacterianos e virais.
Na infecção por Leishmania os macrófagos desempenham papel importante na
resposta imune, seja por atuarem como células apresentadoras de antígenos ou por
produzirem e liberarem mediadores inflamatórios e quimiotáticos. Os macrófagos
infectados migram para o linfonodo regional (Moll et al. 1993), mas ainda na pele, estas
células podem sofrer influencia de quimiocinas e citocinas liberadas por queratinócitos,
neutrófilos, mastócitos e macrófagos presentes no sítio da inoculação. Durante esta fase,
membros da família das quimiocinas têm uma importância fundamental na atração dos
subtipos de leucócitos no sítio da infecção e também de estimulá-los (Rot e von Andrian
2004).
1.7 Radicais derivados do oxigênio e nitrogênio e sua importância para regular o
parasitísmo
Os macrófagos atuam como primeira linha de defesa do hospedeiro onde a
produção e liberação dos compostos reativos intermediários do oxigênio (ROI) e do
nitrogênio (RNI) por estas células têm sido identificadas como crítico no controle da
infecção por Leishmania. Durante o primeiro estágio da infecção o superóxido (O2-) é
produzido como parte do “burst” respiratório de macrófagos humanos e murinos em
resposta a fagocitose. O O2- é catalizado pela enzima oxidase NADPH como resultado
do aumento do consumo de oxigênio que é típico do processo de fagocitose (Babior
2000; Van Assche et al. 2011). Depois da ativação dos macrófagos, há um aumento de
várias citocinas como IFN-, TNF- e da enzima NADPH oxidase com produção de O2-
,formação também do peróxido do hidrogênio (H2O2), radical hidroxil (HO.), hipoclorito
26
(OCL-) e peroxinitrito (ONOO
-) (Babior 2000). Outro importante oxidante anti-
leishmanicida é o óxido nítrico (NO). Esta molécula é catalizada por uma das três
isoformas da óxido nítrico sintase (NOS): NOS-1 (neuronal ou nNOS), NOS-III
(endotelia ou eNOS) e NOS-II (induzível ou iNOS). As duas primeiras são constitutivas
e a terceira isoforma, a iNOS, é conhecida por ser expressa durante a resposta imune
contra patógenos. A produção do NO é induzida principalmente por citocinas pro-
inflamatórias como IFN- e TNF- após ativação do macrófago (Liew et al. 1990a).
Aumento da expressão de iNOS pode ser demonstrado no sítio da infecção por
Leishmania (Stenger et al. 1996). A produção de NO em muitos modelos experimentais
pode estar diretamente relacionada com a capacidade do hospedeiro em controlar a
proliferação microbial, uma vez que a supressão da atividade de iNOS está relacionada
com um aumento dramático na carga parasitária (Stenger et al. 1996; MacMicking et al.
1997). Estudos anteriores mostraram que na infecção de camundongos por Leishmania,
os macrófagos são ativados e o controle do crescimento intracelular do parasita depende
fundamentalmente da produção de NO (Liew et al. 1990b; Augusto et al. 1996;
Mossalayi et al. 1999). Entretanto, em humanos a produção de NO por macrófagos
ativados é relativamente reduzida em comparação aos níveis encontrados em
camundongos, embora haja expressão de mRNA para iNOS após estimulação com IFN-
(Balestieri et al. 2002).
As moléculas O2- e NO são importantes no controle da infecção intracelular por
Leishmania onde são responsáveis pela formação espontânea de vários metabólitos
H2O2 e peroxinitrito ONOO-, entretanto estes mecanismos microbicidas às vezes não
são eficazes na destruição dos parasitos, havendo progressão da infecção para a doença.
1.8 Citocinas e quimiocinas na leishmaniose
As citocinas e quimiocinas são importantes mediadores envolvidos na
manutenção do processo inflamatório, podendo estimular ou inibir a resposta imune
(Sher et al. 1992). Além disso, esses mediadores estão envolvidos na indução das
respostas Th1 e Th2. As citocinas são produzidas por diferentes tipos celulares e atuam
também sobre várias células. Atuam na ativação de macrófagos, inflamação,
quimiotaxia, desempenhando um papel importante na polarização da resposta imune,
assim como, na manutenção e diferençiação celular. O TNF- é sintetizado por
macrófagos e outras células em resposta a toxinas bacterianas, processos inflamatórios e
27
outros estímulos invasivos. Foi originalmente identificado em ratos como caquectinas
indutoras de anemia, emagrecimento e febre. O TNF- representa o principal mediador
da resposta do hospedeiro às bactérias gram-negativas, podendo também desempenhar
importante papel na resposta a outros organismos infecciosos (Warzocha et al. 1995). A
citocina TNF- é importante, uma vez que é secretada na fase inicial da infecção por
Leishmania, podendo determinar a progressão ou o controle da infecção. Participa da
ativação dos macrófagos, e com, isso pode levar a destruição de Leishmania via indução
da produção de radicais do oxigênio e do nitrogênio que são tóxicos para o parasito. Foi
visto que, pacientes com lesões crônicas apresentaram uma forte expressão de citocinas
pró-inflamatórias como TNF- (Melby et al. 1994). Isto mostra que embora a produção
de TNF- possa estar envolvida no controle da multiplicação do parasita nas fases
iniciais da infecção por Leishmania, esta citocina também pode estar envolvida no dano
tecidual na leishmaniose tegumentar.
As quimiocinas são polipeptídeos de baixo peso molecular (8-10kDa) que
desempenham papéis importantes durante a resposta imune, desencadeando a ativação
das integrinas e induzindo o recrutamento de linfócitos antígeno-específicos para os
tecidos periféricos em resposta à inflamação (Springer 1994). Atualmente, cerca de 50
quimiocinas humanas e 20 receptores de quimiocinas têm sido caracterizados (Zlotnik e
Yoshie 2000). Alguns receptores recebem a ligação de apenas uma quimiocina, outros
receptores são compartilhados por várias quimiocinas. O contrário também ocorre onde
uma quimiocina pode se ligar a vários receptores. As quimiocinas foram classificadas
em quatro grandes famílias, dependendo do número e disposição de moléculas da
cisteína na terminação amino da proteína: C, CC, CXC e CX3C. As quimiocinas da
família CC estão envolvidas especialmente com a quimiotaxia de eosinófilos, monócitos
e linfócitos T. As quimiocinas da família CXC, como CXCL-8 (IL-8), são moléculas
quimiotáticas de neutrófilos. Outras quimiocinas desta família como as que se ligam ao
receptor CXCR3, recentemente, têm sido descritas como possíveis recrutadoras de
linfócitos T ativados e monócitos sanguíneos. A CCL2 - Proteína quimiotáxica de
monócito (MCP-1) apresenta expressiva importância no recrutamento e ativação de
monócitos, linfócitos T e basófilos durante a inflamação aguda. Foi o primeiro membro
descrito da subclasse CC. São potentes ativadores e quimioatrativos de linfócitos T. São
capazes de estimular a lise de células-alvo pelas células NK provenientes da corrente
sanguínea. A CCL3 - Proteína inflamatória de macrófago (MIP1-) é uma das
28
quimiocinas da subclasse CC, sendo descrita inicialmente como regulador da
hematopoiese e inibidor da proliferação das células-tronco. A CXCL-8 foi a primeira
quimiocina a ser descoberta, há cerca de 20 anos. Faz parte da subfamília CXC e
apresenta como uma das suas principais funções a promoção da quimiotaxia de
neutrófilos, servindo também como fator ativador de neutrófilos (Bazzoni et al. 1991).
O papel das quimiocinas na infecção por Leishmania, além do recrutamento dos
leucócitos, inclui participação na imunidade mediada por células, ativação celular e
atividade leishmanicida (Teixeira et al. 2006). A produção de diferentes padrões de
quimiocinas associadas às várias formas clínicas da leishmaniose tegumentar sugere
uma importante participação destas moléculas na resposta imune protetora a
Leishmania. Durante a leishmaniose ativa, as células da lesão de pacientes infectados
com Leishmania mexicana que desenvolveram leishmaniose cutânea localizada auto
curável apresentam alta expressão de quimiocinas como CCL2 , CXCL9 e CXCL10
(Ritter e Korner 2002). Já foi demonstrado que a infecção de macrófagos humanos com
promastigotas de L. major induz a expressão de CXCL8 (Badolato et al. 1996). A
produção excessiva dessas moléculas podem potencializar uma inflamação
descontrolada que culmina com destruíção tecidual (Ritter e Korner 2002; Amato et al.
2003). A CXCL9 também conhecida como monocina induzida por IFN-γ (MIG) está
associada com a resposta Th1 (Mikhak et al. 2006). A produção de moléculas
microbicidas induzidas por essas e outras quimiocinas tem sido observada. Fagócitos
mononucleares humanos infectados in vitro com Leishmania infantum e estimulados
com CCL2 e CCL3 produzem mais NO, de modo semelhante ao induzido pelo IFN-,
destruindo o parasito (Brandonisio et al. 2002). Citocinas, quimiocinas, metabólitos do
tecido e mediadores inflamatórios podem influenciar na diferenciação dos macrófagos
nos tecidos. Além disso, estas células podem mudar seu fenótipo funcional de acordo
com mudanças no microambiente (Stout et al. 2005). Desta forma, a mesma
subpopulação de monócitos pode se diferenciar em diferentes tipos de macrófagos
dependendo do microambiente e do patógeno encontrado neste ambiente (Strauss-Ayali
et al. 2007).
1.9 Subpopulações de monócitos e seu papel na infecção e inflamação
A existência de diferentes populações de monócitos humanos no sangue já está
bem estabelecida. Monócitos humanos que eram identificados somente pela expressão
29
de CD14, agora são classificados pela expressão de CD14 e CD16 (FcRIII). Além dos
monócitos clássicos que são fortemente positivos para a molécula de superfície CD14
(CD14+CD16
-), foi caracterizada outra população de monócitos que co-expressam
CD16 e baixos níveis de CD14 (CD14+CD16
+). Os monócitos CD14
+CD16
-
representam cerca de 90-95% do total de monócitos de uma pessoa sadia enquanto as
células CD14+CD16
+consistem de 5-10% do total de monócitos (Passlick et al. 1989;
Ziegler-Heitbrock 1996). Estas subclasses diferem em muitos aspectos, incluindo
expressão de moléculas de adesão e receptores de quimiocinas. Monócitos CD14+
CD16- expressam CCR2 (receptor para MCP-1), CD62L (L-selectina), enquanto
monócitos CD14+CD16
+ não expressam CCR2, mas expressam CCR5 (receptor para
MIP-1/RANTES) e CX3CR1 (Weber et al. 2000). A expressão de receptores
específicos de quimiocinas e de moléculas de adesão pode ter consequências funcionais
importantes, representando não somente diferenças no padrão de migração (Weber et al.
2000; Ancuta et al. 2003), mas também conferindo diferença na susceptibilidade a
infecções, como por exemplo, na infecção pelo HIV (Doranz et al. 1996; Faure et al.
2000). Adicionalmente, os monócitos CD14+CD16
+ produzem concentrações elevadas
da citocina pro-inflamatória TNF- mas não expressam concentrações detectáveis da
citocina antiinflamatória IL-10, após estimulação com LPS (Frankenberger et al. 1996;
Belge et al. 2002). Um padrão similar de produção de citocinas foi observado após
estimulação destas subclasses de monócitos com células tumorais in vitro, com alta
produção de IL-12 e TNF- e baixa produção de IL-10 por monócitos
CD14+CD16
+quando comparado com monócitos CD14
+CD16
- (Szaflarska et al. 2004).
No mesmo estudo, foi encontrada expressão mais elevada de NO sintase e produção de
NO nos monócitos CD14+CD16
+ (Szaflarska et al. 2004). Desta forma, baseado no
padrão de produção de citocinas os monócitos CD14+CD16
+ podem ser considerados
monócitos pró-inflamatórios. Monócitos estimulados podem produzir grande
quantidade de moléculas efetoras envolvidas na defesa contra patógeno (Serbina et al.
2008) e na patogênese de várias doenças inflamatórias como a aterosclerose (Libby et
al. 2008). O padrão de expressão de moléculas co-estimulatórias tem sido implicados na
direção de uma resposta Th1 ou Th2. Monócitos CD14+CD16
+ apresentaram maior
expressão da molécula HLA-DR (Passlick et al. 1989) e isto poderia sugerir uma maior
atividade de apresentação de antígeno destas células. Na infecção por L. chagasi foi
observado uma alteração na expressão de moléculas de adesão e moléculas co-
30
estimulatórias tanto em monócitos como em macrófagos humanos (De Almeida et al.
2003). Um aumento considerável do número de monócitos CD14+CD16
+ tem sido
descrito para uma variedade de agentes infecciosos sistêmicos em humanos, incluindo
síndrome urêmica hemolítica, sepsis bacteriana e HIV. Todas estas infecções são
acompanhadas por um aumento pronunciado desta subpopulação. Recentemente, foi
observado que pacientes com LC têm frequência mais elevada dos monócitos que
expressam a molécula CD16 (Soares et al. 2006). Embora monócitos CD16+ apresentem
alta produção de TNF- e concentrações mais baixas de IL-10 (Belge et al. 2002),
pouco se sabe sobre o papel dessas células na leishmaniose.
31
2. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
A leishmaniose tegumentar americana constitui um importante problema de saúde
pública, devido às altas taxas de prevalência mundial e de difícil controle
epidemiológico. No Brasil tem-se observado um elevado crescimento do número de
casos de LTA, tanto em magnitude como em expansão geográfica, com surtos
epidêmicos em todas as regiões. Em Corte de Pedra-BA, são diagnosticados anualmente
cerca de 900 casos de leishmaniose no Posto de Saúde desta área endêmica. A maioria
dos casos é de leishmaniose cutânea, sendo 3-5% de LM e 2-3% leishmaniose
disseminada (LD), trazendo a possibilidade de realizar estudos para esclarecer os
mecanismos envolvidos na patogênese dessas formas clínicas.
Muito se avançou na compreensão da imunopatogênese da leishmaniose
tegumentar humana, tendo como base aspectos relacionados à documentação que a forte
resposta do tipo Th1 não modulada estaria associada à destruição tecidual observada
nesta doença. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel dos monócitos/macrófagos e de
moléculas secretadas por estas células na da resposta imune exacerbada que é observada
na leishmaniose tegumentar. O conhecimento de que os monócitos CD14+CD16
+ estão
associados a várias doenças inflamatórias e infecciosas e que citocinas, quimiocinas e
outras moléculas produzidas por células da resposta imune inata possam interferir na
diferenciação dos macrófagos nos tecidos e na resposta imune adaptativa, nos dão
suporte para o estudo do comportamento destas células na leishmaniose tegumentar.
Embora a imunidade adaptativa venha sendo extensivamente estudada no modelo
de infecção por Leishmania, trabalhos recentes abordando a defesa do hospedeiro contra
diversos patógenos tem demonstrado que as células da resposta imune inata apresentam
um importante papel não apenas nos mecanismos iniciais de destruição do patógeno,
mas também no direcionamento do tipo de resposta imune especifica gerada. Dessa
forma, o recrutamento da população celular no início da infecção parece ter papel
importante no desenvolvimento da doença.
32
3. HIPÓTESES
Hipótese. 1 Macrófago de pacientes com leishmaniose cutânea, mucosa e de indivíduos
com infecção subclínica comportam-se de maneira distintas frente à infecção in vitro
com Leishmania.
Hipótese. 2 Na leishmaniose cutânea, o predomínio de monócitos inflamatórios
CD14+CD16
+ poderia estar associado com a expressão clínica da doença.
33
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Avaliar o papel dos monócitos e macrófagos na infecção por L. braziliensis.
4.2 Objetivos Específicos:
Objetivo 1 Avaliar in vitro a capacidade de infecção e multiplicação de L. braziliensis
em macrófagos de pacientes com leishmaniose cutânea, leishmaniose mucosa e de
indivíduos com infecção subclínica, após infecção in vitro com L. braziliensis.
Objetivo 2 Avaliar a produção de NO e O2- por macrófagos de pacientes com
leishmaniose cutânea, leishmaniose mucosa e subclínicos, após infecção in vitro por L.
braziliensis.
Objetivo 3 Avaliar a produção de quimiocinas e TNF-α por macrófagos de pacientes
com leishmaniose cutânea, leishmaniose mucosa e subclínicos, após infecção in vitro
por L. braziliensis e após estímulo com LPS.
Objetivo 4 Avaliar a freqüência de células CD14+CD16
+ no sangue periférico de
pacientes com leishmaniose cutânea e de indivíduos com infecção subclínica por L.
braziliensis e a expressão de HLA-DR, CD80 e CD86, como também avaliar a
produção de TNF-α, por essas células após estímulo com antígeno solúvel de leishmania
(SLA).
34
5. DESENHO DO ESTUDO
5.1 Área Endêmica
Nossa área de estudo, Corte de Pedra, município de Tancredo Neves, está
localizada a 280 km a sudoeste de Salvador, Bahia. Esta região é conhecida há mais de
30 anos como área de infecção por L. braziliensis, e é a região onde se registra a mais
alta taxa de incidência da doença no estado onde o número de casos de leishmaniose
tegumentar em 2011 foi de 900 casos. O Serviço de Imunologia do Hospital
Universitário Prof. Edgard Santos se encontra localizado em Salvador onde se realizam
os estudos imunológicos. Desde 1980 um Posto de Saúde foi estabelecido na vila de
Corte de Pedra e desde então médicos do Serviço de Imunologia visitam a área a cada
duas semanas. A partir de 2001 um médico radicado em Corte de Pedra dá assistência a
esta população, juntamente com médicos da Universidade Federal da Bahia. O Posto
também conta com o apoio de 4 agentes de saúde treinados, todos residentes na região.
Eles prestam assistência aos pacientes, visitam as famílias, e participam das atividades
de pesquisa. Médicos da Universidade incluindo clínicos, imunologistas,
infectologistas, dermatologistas e otorrinolaringologistas trabalham quinzenalmente no
posto de saúde. O posto de saúde tem se tornado um centro de referência para o
diagnóstico e tratamento da leishmaniose tegumentar e recebe pacientes oriundos de 20
municípios que estão dentro de uma área de 9.935 km2 e uma população de 454.000
habitantes.
5.2. Definição de casos
5.2.1 Leishmaniose Cutânea (LC): é definida como a presença de uma lesão ulcerada
na pele, sem evidência de envolvimento da mucosa. O diagnóstico é realizado pela
detecção do parasito através da cultura do aspirado da lesão, da histopatologia ou pelo
achado da lesão típica e por dois dos seguintes testes: teste positivo de
hipersensibilidade tardia ao antígeno de Leishmania (Reação de Montenegro-DTH),
teste sorológico positivo e histopatologia compatível com leishmaniose tegumentar.
5.2.2 Leishmaniose Mucosa (LM): é caracterizada pela presença de uma lesão mucosa
metastática, localizada, mais frequentemente, no septo nasal ou estendida para o palato,
faringe e orofaringe. Aproximadamente 3% dos pacientes com infecção por L.
braziliensis evoluem para a forma mucosa. Por definição, as lesões mucosas não são
35
contíguas com a lesão cutânea primária. O diagnóstico é realizado pelos mesmos
métodos utilizados para LC.
5.2.3 Infecção Subclínica por L. braziliensis (SC): indivíduos residentes na área
endêmica sem história atual ou passada de leishmaniose, com teste positivo de
hipersensibilidade tardia ao antígeno de Leishmania.
5.2.4 Controles sadios (CS): indivíduos adultos não residentes em área endêmica, sem
história pregressa de leishmaniose, que aceitaram participar do estudo.
5.3 Critérios de Inclusão
Pacientes com LC, LM e infecção SC de L. braziliensis foram selecionados
baseados nos critérios de definição de caso estabelecidos nos itens citados
anteriormente. Pacientes com LC e LM com duração da doença não superior a 60 dias e
virgens de tratamento para leishmaniose. Pacientes com LC no máximo com 3 lesões
cutâneas. Todos os pacientes diagnosticados com leishmaniose tegumentar,
independente de participarem do estudo foram tratados com antimonial pentavalente, o
tratamento padrão recomendado pela Organização Mundial de Saúde e pelo Ministério
da Saúde. Os indivíduos com infecção subclínica foram identificados durante as visitas
aos domicílios pelo médico residente na área e por um dos assistentes de saúde que
fazem busca ativa da doença entre os familiares dos pacientes com LC e LM. Nesses
casos além da informação clínica foi realizada a Reação de Montenegro para saber se
houve contato com a Leishmania. Os indivíduos com Reação de Montenegro positiva e
que não apresentaram a doença (infecção SC) foram então convidados a participar do
estudo. Todos os participantes foram voluntários que consentiram em participar do
estudo. O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) explicando nossa
proposta e procedimento foi lido pelo participante ou por um dos médicos da equipe na
presença de uma testemunha, e assinou o TCLE.
5.4 Critérios de Exclusão
Pacientes com sorologia positiva para HIV, portadores de doenças debilitantes
como insuficiência renal, insuficiência hepática e diabetes mellitus, indivíduos que
tenham feito uso de drogas imunossupressoras ou apresentem condições que possam
alterar a resposta imune ou contra indiquem a doação de sangue para a avaliação no
soro, a exemplo de gravidez, crianças com idade inferior a 15 anos e gestantes.
36
6. MATERIAIS E MÉTODOS
6.1 População do Estudo
Foram avaliados 42 pacientes com LC, 11 pacientes com LM, 24 indivíduos com
infecção SC e 22 CS. A confirmação diagnóstica foi realizada pelo isolamento do
parasita, uma resposta positiva (Reação de Montenegro-DTH) e características
histológicas de LC e LM. Indivíduos que apresentaram contato domiciliar com
pacientes com LTA sem história passada ou atual de leishmaniose e com o teste de
DTH positivo e produção de IFN- em culturas estimuladas com SLA foram
considerados como portadores de infecção subclínica. O exame físico desses indivíduos
não mostrou uma cicatriz típica da LC. Os indivíduos utilizados como controles sadios
foram pessoas na sua maioria, compostas de estudantes da área urbana de Salvador e
que não tiveram história de contato com área endêmica de leishmaniose.
Todos os pacientes foram atendidos no Posto de Saúde de Corte de Pedra,
localizada na região sudoeste do estado da Bahia, Brasil, que é bem conhecida por sua
alta taxa de transmissão de L. braziliensis. Alguns experimentos não incluíram
amostras de todos os pacientes. As análises imunológicas foram realizadas antes do
tratamento para todos que participaram do estudo. Este trabalho foi aprovado pelo
Comitê de Ética da Universidade Federal da Bahia (Parecer/Resolução N° 019/2008) e
todos os voluntários que doaram sangue para isolamento das células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) e execução das análises ex-vivo e ou in vitro foram
esclarecidos sobre a finalidade do estudo e todos assinaram o termo de consentimento.
6.2 Parasito
Foi utilizada a L. braziliensis (MHOM/BR/2003/LTCP15344) caracterizada por
eletroforese de enzima multilocus (Cupolillo et al. 1994). Este isolado foi obtido a
partir de uma lesão da pele de um paciente com LC, onde foi inicialmente cultivado em
meio bifásico (NNN). Após isolamento, o parasita foi criopreservado em nitrogênio
líquido. Para estimulação in vitro das CMSP, foram utilizadas promastigotas em fase
estacionária de crescimento, cultivadas em meio Schneider (sigma Aldrch, St. Louis,
MO), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Gibco BRL), com 2 % de
urina estéril.
37
6.3 Antígeno solúvel de Leishmania
O antígeno de Leishmania (antígeno bruto) foi preparado a partir da L.
braziliensis (MHOM/BR/2001) como descrito anteriormente (Reed et al. 1986).
6.4 Separação das células e cultura de macrófagos
As CMSP foram isoladas a partir de sangue heparinizado dos pacientes e doadores
sadios, diluídos 1:2 em salina 0,9%, por um gradiente de densidade, o Ficoll Hypaque
(LSM; Organon, Durham, NC). As células foram distribuídas em poços de lâmina Lab-
Tec. Os monócitos foram separados por aderência. Após 6 dias de cultura em meio de
RPMI completo 1640 (soro AB humano a 10% inativado, 100 U de penicilina/ml,
estreptomicina 100 ug/ml) (GIBCO BRL, Grand Island, NY, EUA), as células aderentes
se diferenciaram em macrófagos. Foi visto que 99% das células em cultura foram
identificadas como macrófagos por observação microscópica. Para avaliar a pureza dos
macrófagos, células aderentes foram removidas e analisadas por citometria de fluxo. Os
macrófagos foram analisados de acordo com as suas características de tamanho (FSC)
versus granulosidade (SSC) numa região denominada “gate”. A pureza foi avaliada por
análise utilizando os seguintes anticorpos monoclonais (mAbs): CD14-PE-Cy5
(macrófagos), CD3-PE (células T), CD19-FITC (células B) e foram confirmadas como
CD14+, CD3
-, CD19
-. A influência das células T no sistema foi considerada ausente,
porque a população das células aderentes consistia em menos de 1% de células TCD3+.
Também foi avaliada a produção de IFN- em sobrenadantes de macrófagos infectados
por ELISA e observou-se que os níveis de IFN- foram muito baixos ou indetectáveis.
6.5 Infecção de macrófagos humanos com uma cepa de L. braziliensis
Os macrófagos obtidos das CMSP (1 x 106cels/poço) dos CS, SC e de pacientes
com LC e LM, foram infectados no sexto dia com promastigotas de L. braziliensis na
fase estacionária em uma proporção de 2:1. Os macrófagos foram também estimulados
com LPS (100 ng/ml) e os não infectados foram utilizados como controles. Os
macrófagos foram incubados a 37ºC com 5% CO2 durante 2 h. Após a incubação, os
parasitas extracelulares restantes foram removidos por lavagem suave. As infecções
foram feitas nos tempos de 2h, 48h e 96 h e as células foram coradas pelo Giemsa. A
infecção foi avaliada pela contagem da percentagem dos macrófagos infectados e pelo
número de amastigotas por 100 macrófagos. Esta análise foi realizada por dois
observadores independentes que desconheciam as condições experimentais. Depois de
38
cada tempo, os sobrenadantes das culturas foram coletados e armazenados a -20°C para
análise da produção de NO, O2-, quimiocinas e TNF-α.
6.6. Determinação da produção de óxido nítrico e superóxido
A dosagem de óxido nítrico foi realizada de forma indireta, pela detecção de um
dos produtos estáveis da síntese do NO, o nitrito (NO2-) presentes nos sobrenadantes das
culturas de células, utilizando para isto o reagente de Griess (Ding et al. 1988). A
produção de O2- foi determinada pela adição de hidroxilamina (0,5 mM) nas culturas
dos macrófagos infectados (Elstner e Heupel 1976). Hidroxilamina converte superóxido
em nitrito, que pode ser quantificada utilizando-se do reagente de Griess. A produção de
NO2- gerado pela liberação de NO foi determinada em paralelo, sem a adição da
hidroxilamina.
6.7 Determinação da produção de quimiocinas e TNF-
Os sobrenadantes das culturas de células dos CS, SC, e dos pacientes com LC e
LM foram avaliados para CCL2, CCL3, CXCL8, CXCL9 e TNF- após 2, 48 e 96 h de
infecção, por ELISA sanduíche de acordo com as instruções do fabricante (BD
Pharmingen e R & D Systems, Minneapolis, MN). Os resultados foram expressos em
pg/ml baseados em uma curva padrão gerada a partir de citocinas recombinantes. A
sensibilidade dos ensaios das citocinas foi de 15,6 pg/ml para CXCL8, CXCL9 e TNF-
α e de 7,8 pg ml para CCL2 e CCL3.
6.8 Análise da expressão de CD14, CD16, HLA-DR, CD80 e CD86 em monócitos
por citometria de fluxo
A expressão de CD14, CD16, HLA-DR, CD80 e CD86 ex vivo foi analisada em
monócitos derivados do sangue periférico de pacientes com LC e indivíduos SC através
da citometria de fluxo. Não foi analisado para este estudo células de pacientes com LM
já que durante o período de avaliação, não houve casos de pacientes com LM na região
de Corte de Pedra, além do que o nosso principal objetivo nos monócitos foi comparar
os indivíduos subclínicos com a forma clássica de leishmaniose tegumentar. Foram
utilizados anticorpos conjugados com isotiocianato de fluoresceína-(FITC), ficoeritrina-
(PE) e ficoeritrina cianina 5 (PE-Cy5) (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA). A
expressão das moléculas de superfície CD14 e CD16 em CMSP foi analisado no dia da
coleta através da marcação destas subpopulações com os seguintes mAbs anti-CD14
39
conjugado com FITC, anti-CD16 conjugado com PE-Cy5 e anti-CD56 conjugado com
PE, tal como descrito previamente (Bottrel et al. 2001). A expressão de superfície de
HLA-DR, CD80 e CD86 em CMSP foi determinada utilizando mAbs anti- HLA-DR,
CD80 e CD86 conjugado com PE (eBioscience, San Diego, CA, EUA). Pelo menos
100.000 eventos foram adquiridos no citômetro de fluxo FACS calibur. Foi analisado a
amostra controle não marcada (células sem adição de anticorpo) e os controles
isotípicos FITC, PE e PE-Cy5 foram adicionados aos experimentos. Procedeu-se a
aquisição das amostras: tamanho x granulosidade, para visualisar o padrão de dispersão
dos monócitos.
6.9 Expressão de TNF- nos monócitos CD14+ CD16
+ através de citometria de
fluxo
Monócitos derivados do sangue periférico foram incubados com SLA (50 µg/ml),
ou na ausência de qualquer estímulo durante 6 horas. Após este tempo, as células foram
incubadas com os anticorpos monoclonais CD14 e CD16 durante 20 min a 4C, lavadas
com PBS contendo 1% de de soro bovino com albumina e fixadas com uma solução de
formaldeído a 2%. Em seguida, foi efetuado a permeabilização da membrana celular e
adicionado o anticorpo anti-TNF--PE e então, os monócitos foram incubadas por 30
minutos, à temperatura ambiente, protegidos da luz. As células foram lavadas 2 vezes e
ressuspensas com PBS contendo 1% de soro bovino com albumina para análise por
citometria de fluxo. Os parâmetros foram analisados na população de monócitos por
“gate”, onde foi definida a região classicamente ocupada por estas células de acordo
com o tamanho-versus-granulosidade. A expressão intracelular de TNF- nas
subpopulações de monócitos CD14+CD16
- e CD14
+CD16
+ foi avaliada. Um total de
100.000 eventos foram contados e adquiridos utilizando o citômetro de fluxo FACS
calibur. Células não marcadas e isotipos controles com FITC, PE e PE-Cy5 foram
adicionados aos experimentos.
6.10. Análises Estatísticas
O teste não pareado de Kruskal-Wallis foi utilizado para analisar os resultados dos
experimentos de infecção de macrófagos, para comparar os níveis de NO e O2-,
quimiocinas e TNF-, produzidos pelos macrófagos, assim como para análises da
expressão de CD14 e CD16 pelos monócitos. Para comparações estatísticas entre os
monócitos CD14+CD16
- e CD14
+CD16
+ que expressam CD80, CD86, e HLA-DR e
40
produz TNF- foi utilizado o teste t de Student. O ponto de corte para significância
estatística foi estabelecido em p <0,05. A análise dos dados deste estudo foi realizada
usando o programa Graphpad-prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
41
7. RESULTADOS
7.1 Avaliação in vitro da infecção de macrófagos humanos com promastigotas de L.
braziliensis
A percentagem de células infectadas e o número de amastigotas/100 macrófagos
foram semelhantes nos quatro grupos após 2 horas de infecção (Figuras 1A e 1B). Após
48 horas, os macrófagos dos SC apresentaram uma menor proporção de células
infectadas e um menor número de amastigotas por 100 macrófagos em comparação com
CS, LC e LM (SC × CS, ***p <0,001; SC × LC, *p<0,05 e **p <0,01; SC × LM , ***p
<0,001). Após 96 horas de infecção, a percentagem de macrófagos infectados e o
número de amastigotas por 100 macrófagos diminuiu em todos os quatro grupos. No
entanto, ambos os valores foram significativamente mais baixos nos pacientes SC em
relação ao CS e pacientes com LM, *** p <0.001) (Figuras 1A e 1B).
42
Figuras 1A e 1B: Avaliação in vitro da infecção de macrófagos humanos com
promastigotas de L. braziliensis em uma proporção de 2 leishmânias /macrófago de
pacientes SC (n=12), LC (n=10), LM (n=11) e CS (n=12) para determinar a
susceptibilidade dos macrófagos, bem como a sua capacidade de matar este parasito. A
percentagem de macrófagos infectados (Figura 1A) e o número de parasitos (Figura 1B)
foram avaliadas em 2, 48 e 96 horas após a infecção. Os resultados representam a média
± desvio padrão (DP). A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Kruskal-
Wallis. (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001)
A
B
0
10
20
30
40
50
60CS
SC
LC
LM
****
***
***
***
2 48 96
Tempo (horas)
% d
eM infe
cta
dos
0
50
100
150
200
250
300
350CS
SC
LC
LM
***
***
*****
***
2 48 96Tempo (horas)
Am
ast
igota
s/1
00M
43
7.2 Produção de óxido nítrico e do superóxido em macrófagos humanos infectados
ou não com L. braziliensis
A produção de NO e O2- aumentou nos macrófagos infectados com L. braziliensis
quando comparados com a produção observada nos macrófagos não infectados e esta
produção tende a ser mais elevada em 96 horas de infecção (Figuras 2A e 2B). Esta
tendência coincidiu com uma diminuição significativa no número do parasito
intracelular nos grupos estudados. Não houve diferença estatística na produção de NO
entre os grupos em nenhum dos tempos analisados (Figura 2A). A produção de O2- por
macrófagos humanos infectados aumentou após 96 horas de infecção, mas não houve
diferença estatística na produção de superóxido entre os grupos analisados após 48 e 96
horas (Figura 2B).
44
Figuras 2A e 2B: Avaliação in vitro da produção de NO e O2- na infecção de
macrófagos humanos com L. braziliensis em uma proporção de 2 leishmanias
/macrófago de CS (n=6), SC (n=6) e de pacientes com LC (n=6) e LM (n=5).
Macrófagos não infectados foram utilizados como controles. Sobrenadantes foram
coletados em 48 e 96 horas de infecção para a detecção de NO (Figura 2A) e O2- (Figura
2B) utilizando-se o reagente de Griess. Os dados são expressos como a média ± desvio
padrão. A análise estatística foi realizada através do teste de Kruskal-Wallis. (p> 0,05).
0
2
4
6
Meio
L. braziliensis
CS LC LMSC CS LC LMSC
48h 96h
A
NO
2(
M)
0
10
20
30
48h 96h
LCSC LC SCCS CS
B
L. braziliensis
Meio
O2
- ( M
)
45
7.3 Avaliação da produção de quimiocinas após a infecção de macrófagos humanos
com L. braziliensis
A produção de CCL2, CCL3, CXCL8 e CXCL9 foi semelhante em todos os
grupos após 2 horas de infecção. As Figuras 3 e 4 mostram a produção de CCL2, CCL3,
CXCL8 e CXCL9 nos sobrenadantes de macrófagos infectados por L. braziliensis em
48 horas de infecção. A concentração de CCL2 foi bastante variável. Macrófagos de
pacientes com LC (mediana 4660 pg/ml, variando de 0-31.618 pg/ml) e os macrófagos
de pacientes com LM (mediana 6080 pg /ml, variando de 3.600-25.270 pg/ml)
produziram uma maior concentração desta quimiocina do que as culturas dos indivíduos
SC (mediana 447 pg/ml, 0-4700 pg/ml, *p <0,05 e ***p <0,001 ) (Figura 3A). As
concentrações de CXCL8 produzidas pelos macrófagos de pacientes com LC (mediana
4790 pg/ml, 960-16.250 pg/ml) e LM (5360 pg/ml, 336-32100 pg/ml) foram mais
elevadas do que as produzidas pelos indivíduos SC (570 pg/ml, 136-4980 pg/ml; *p
<0,05) (Figura 3B). CCL3 foi detectada em todos os grupos e não mostrou diferenças
significantes entre eles ( p> 0,05), (Figura 3C). Foi visto que não houve diferença na
produção de CXCL9 entre os grupos quando os macrófagos foram estimulados com
LPS (100 ng/ml) por 48 horas, (Figura 4A). Os níveis de CXCL9 foram
significativamente mais elevados nos sobrenadantes dos macrófagos de pacientes com
LC (1510 pg/ml, 0-17.205 pg/ml) e pacientes com LM (16.396 pg/ml, 4.324-25.080
pg/ml) quando comparados com os CS (66 pg/ml, 0-390 pg/ml, ***p <0,001), (Figura
4B). Os macrófagos de pacientes SC produziram menos CXCL9 (265 pg/ml, 47-2905
pg/ml) do que os dos pacientes com LM e LC (***p <0,001, *p <0,05), (Figura 4B). No
tempo de 96 horas de cultura, os níveis de quimiocinas ainda foram elevados e bastante
semelhantes aos de 48 horas (dados não mostrados).
46
Figuras 3A, 3B, 3C: Avaliação in vitro da produção de CCL2 (Figura 3A),
CXCL8(Figura 3B) e CCL3(Figura 3C) em macrófagos de CS (n=14), SC (n=12), LC
(n=16) e LM (n=11), que foram infectados com L. braziliensis em uma proporção de 2
leishmanias/macrófago. Sobrenadantes foram coletados após 48 horas de infecção e a
produção das quimiocinas estudadas foram determinadas por ELISA. Na infecção, cada
símbolo representa um paciente diferente e cada linha representa a mediana de um
grupo (Figuras 3A, 3B, 3C. Para análise estatística, o teste não paramétrico de Kruskal-
Wallis foi utilizado. (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001).
A
B
CS SC LC LM0
2000
4000
6000
8000
1000010000
20000
30000
40000
**
*
***
CC
L2(
pg
/ml)
CS SC LC LM0
1000
2000
3000
4000
50005000
15000
25000
35000
45000 *
* *
CX
CL
8(p
g/m
l)
CS SC LC LM0
100
200
300
400
1000
2000
3000
4000
CC
L3(p
g/m
l)
C
47
Figuras 4A e 4B: Avaliação in vitro da produção de CXCL9 em macrófagos de
CS (n = 14), SC (n=12), LC (n=16), e LM (n=11), estimulados com LPS (100ng/ml) e
quando infectados com L. braziliensis em uma proporção de 2 leishmânias/macrófago.
Após 48 horas, os sobrenadantes foram colhidos e a produção de CXCL9 foi
determinada por ELISA. Nos macrófagos estímulados com LPS (Figura 4A) as barras
representam as médias ± desvio padrão. Cada símbolo representa um paciente diferente,
e cada linha representa a mediana de um grupo (Figura 4B). Para análise estatística, o
teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi utilizado. (*p <0,05, **p <0,01, ***p
<0,001).
CS SC LC LM0
200
400
600
800
1000
50001000015000200002500030000 ***
***
***
*
CX
CL
9(p
g/m
l)
A
B
CS SC LC LM0
1000
2000
3000
4000
5000
LPS(100ng)
(CX
CL
9)p
g/m
l
48
7.4 Avaliação da produção de TNF- após a infecção de macrófagos humanos com
L. braziliensis
Na avaliação in vitro da produção de TNF- em macrófagos de CS (n =14), SC
(n=12), LC (n=16), e LM (n=11), foi visto que quando os macrófagos foram
estimulados com LPS (100ng/ml) por 48 horas, não foi observado diferenças na
produção de TNF- entre os grupos analisados (p>0,05), (Figura 5A). Na infecção com
L. braziliensis, a produção desta citocina foi semelhante em todos os grupos após 2
horas de infecção. Em 48 horas, macrófagos infectados de pacientes com LM e LC
secretaram mais TNF-α (mediana 64 pg/ml, variando 1-341 pg/ml e 52 pg/ml, variando
0-170 pg/ml, respectivamente), quando comparados com macrófagos infectados dos CS
(0 pg/ml, variando 0-74 pg/ml, **p <0,01 e *p <0,05), (Figura 5B). Nos SC, a produção
de TNF- (1.05 pg/ml e 0-6.2 pg/ml respectivamente), foi menor que os observados nas
células dos pacientes com LC e LM, (*p <0,05 e **p<0.01), (Figura 5B). Em 96 h de
cultura, os níveis de TNF-α ainda estavam elevados e semelhantes aos produzidos em
48 horas.
49
Figuras 5A e 5B: Avaliação in vitro da produção de TNF- em macrófagos de CS (n =
14), SC (n = 12), LC (n = 16), e LM (n = 11), estimulados com LPS (100ng) e quando
infectados com L. braziliensis em uma proporção de 2 leishmânias/macrófagos. Após
48 horas, os sobrenadantes foram colhidos e os níveis de TNF- foram determinados
por ELISA. Nos macrófagos estímulados com LPS as barras representam as médias ±
devio padrão (Figura 5A). Cada símbolo representa um paciente diferente e cada linha
representa a mediana de um grupo (Figura 5B). Para análise estatística, o teste não
paramétrico de Kruskal-Wallis foi utilizado (*p<0.05; **p<0.01).
CS SC LC LM0
5
10
15
2020406080
100100
200
300
400 *
**
*
**
TN
F-
(pg
/ml)
A
B
CS
SC LC LM
0
500
1000
1500
2000
2500
LPS (100ng)
TN
F-
(pg
/ml)
50
7.5 Frequência de monócitos inflamatórios em pacientes com LC e em indivíduos
com infecção SC
Os monócitos inflamatórios (CD14+CD16
+) estão aumentados em diferentes
patologias. Neste trabalho nós caracterizamos a frequencia destas células em pacientes
com LC, indivíduos SC e CS. Os nossos resultados mostraram que a percentagem dos
monócitos inflamatórios CD14+CD16
+ (Figura 6C) foi aumentada significativamente
em pacientes com LC (26,53 ± 7,9) quando comparadas com indivíduos SC (17,45 ±
7,6) e com o grupo CS (14,03 ± 8,0) (**p<0.01 e ***p <0,001).
51
Figuras 6.A, 6B e 6C: A frequência da subpopulação de monócitos inflamatórios
(CD14+CD16
+) foi avaliada por citometria de fluxo. Os monócitos foram isolados de
acordo com as suas características fenotípicas de tamanho x granulosidade (Figura 6A).
A expressão dos monócitos CD16 foi definida e analisada no quadrante superior direito
(Figura 6B). A percentagem de células CD14+CD16
+ dos diferentes grupos CS (n=16),
SC (n=15) e LC (=30), está apresentada na (Figura 6C). Cada símbolo representa um
paciente diferente e cada linha representa a mediana de um grupo. Para a análise
estatística, o teste de o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi utilizado (**p <0,01;
***p <0,001).
A
0
10
20
30
40
50CS
SC
LC
CD14+CD16+
**
***
% C
D16
+ mo
no
cito
s
C
B
52
7.6 Expressão das moléculas CD80, CD86 e HLA-DR nos monócitos inflamatórios
CD14+CD16
+ de indivíduos SC e pacientes com LC
Para melhor caracterizar estas subpopulações de monócitos foi avaliada também a
expressão de HLA-DR, CD80 e CD86 nos grupos SC e LC. Os resultados mostraram
que houve uma maior expressão de HLA-DR (Figura 8A), CD80 (Figura 8B) e CD86
(Figura 8C) nos monócitos CD14+CD16
+ quando comparados com os monócitos
CD14+CD16
-, sendo esta diferença estatísticamente significante (*p<0.05, **p <0,01;
***p <0,001).
53
Figuras 7A, 7B e 7C: Os histogramas representam a intensidade média de
fluorescência (IMF) da expressão ex vivo das moléculas HLA-DR (Figura 7A), CD80
(Figura 7B) e CD86 (Figura 7C) em duas diferentes subpopulações de monócitos
CD14+CD16
- e CD14
+CD16
+. Os histogramas acima representam a IMF destas
moléculas nas células de um paciente com LC.
A
B
C
54
Figuras 8A, 8B e 8C: A Expressão ex vivo de HLA-DR, CD80 e CD86 nas
subpopulações de monócitos CD14+CD16
+ de pacientes com LC (n=08) e de indivíduos
SC (n=07) estão expressos em intensidade média de fluorescência (MFI) de cada
molécula dentro dos monócitos CD16+
e CD16- e indicados como média ± desvio
padrão. A análise estatística utlilizada para comparações entre os 2 grupos, foi o teste t
de Student. (*p<0.05; **p<0.01 e ***p <0,001).
HLA-DR
0
500
1000
1500
CD14+CD16
-
CD14+CD16
+
SC LC
*
*
A
inte
nsid
ad
e m
éd
ia d
e f
luo
rescê
ncia
CD86
0
200
400
600
800
CD14+CD16
-
CD14+CD16
+
* ** **
SC LC
inte
nsid
ad
e m
éd
ia d
e f
luo
rescê
ncia
CD80
0
500
1000
1500
CD14+CD16
-
CD14+CD16
+
SC LC
*
*
inte
nsid
ad
e m
éd
ia d
e f
luo
rescê
ncia B
C
55
7.7 Expressão de TNF- em monócitos CD14+CD16
+ estimulados com SLA em
indivíduos SC e pacientes com LC
Células CD14+CD16
+ têm sido mostradas ser a principal fonte de expressão da
citocina inflamatória TNF-. Neste trabalho, monócitos CD14+CD16
+ de indivíduos SC
e pacientes com LC estimulados com SLA (50 µg/ml), apresentaram uma maior
expressão de TNF- quando comparados com os monócitos CD14+CD16
- (Figura 9).
56
Figuras 9A, 9B e 9C: Para aquisição dos monócitos, seguiu-se a definição dos
parâmetros de tamanho (FSC) X granulosidade (SSC). (Figura 9A). A percentagem de
células CD14+CD16
+ expressando TNF- foram definidas e analisadas no quadrante
superior direito. Sem estímulo (Figura 9B), e com estímulo de SLA (Figura 9C). Os
dados representados acima são de um paciente com LC.
R2
A
B C
10.3%9.3 %
57
Figura 10. Expressão de TNF- em monócitos CD14+CD16
+/- estimulados com
SLA em indivíduos SC e pacientes com LC: As células foram estimuladas ou não
com SLA (50 µg/ml) durante 6 horas. Os resultados são apresentados como a média ±
desvio padrão de indivíduos SC (n = 14) e LC pacientes (n = 09) e expressa em
percentagem. Para comparações entre os grupos o teste estatístico utilizado foi o teste t
de Student.
D
0
20
40
60
CD14+CD16
-
CD14+CD16
+
SC LC
*
*E
xp
res
sã
o d
eT
NF
- (
%)
58
8. DISCUSSÃO GERAL
A despeito de CMSP de pacientes com LC e LM produzirem grandes
quantidades de IFN-, a principal citocina responsável pela ativação dos macrófagos
para matar a Leishmania, esses pacientes desenvolvem a lesão. Várias evidências já
mostraram que a resposta imune adaptativa, através da produção de citocinas pro-
inflamatórias (IFN- e TNF-) pelas células T estão envolvidas na forte resposta
inflamatória que é responsável pelo desenvolvimento da lesão nesses pacientes. Por
outro lado, alguns indivíduos residentes em área de transmissão de L. braziliensis
apresentam uma reação de hipersensibilidade tardia ao antígeno de leishmania mas não
desenvolvem a doença. As CMSP desses indivíduos produzem pouco IFN- e TNF-
quando comparados com os pacientes com LC (Follador et al. 2002). Até o momento
não está claro porque esses indivíduos SC tem a capacidade de controlar a infecção.
Nesse contexto a erradicação do parasito ou a ocorrência de formas assintomáticas da
infecção não podem ser explicadas pela ação efetiva da resposta imune adaptativa, então
a resposta imune inata pode ter uma papel importante no controle da infecção. No nosso
estudo avaliamos a capacidade de L. braziliensis para infectar e sobreviver em
macrófagos de indivíduos com diferentes formas clínicas da infecção por L. braziliensis.
Além disso, medimos moléculas secretadas por estas células. Sabemos que os
macrófagos são células importantes na infecção por Leishmania já que elas abrigam o
parasito, atuam como células apresentadoras de antígenos e secretam moléculas que
vão ativar as células T para produzir o IFN-, que é a principal molécula ativadora de
macrófagos para matar a Leishmania. Os macrófagos também produzem quimiocinas
que são moléculas que participam do processo inflamatório.
Os nossos dados mostraram que houve diferenças intrísecas na resposta dos
macrófagos à infecção por promastigotas de L. braziliensis in vitro. Claramente os
indivíduos com infecção SC por L. braziliensis puderam controlar o crescimento do
parasito na ausência de células T ou produtos de células T através da capacidade dos
macrófagos matar Leishmania. Alternativamente, macrófagos de pacientes com LC e
LM permitiram a sobrevivência da Leishmania e produziram quantidades elevadas de
quimiocinas pró-inflamatórias que são moléculas conhecidas por atraírem os
neutrófilos, monócitos e células T ativadas e por induzirem uma reação inflamatória,
contribuindo para a patologia associada com a infecção por L. braziliensis. Já foi
59
demonstrado que os macrófagos de indivíduos com infecção subclinica por L.
panamensis são menos permissivos a entrada da Leishmania do que os macrófagos de
pacientes com leishmaniose recorrente (Bosque et al. 2000). A resposta imune do tipo
Th1 controla a multiplicação e disseminação do parasita na LC e LM, mas não erradica
a infecção por Leishmania (Ribeiro-de-Jesus et al. 1998). Além disso, esta exacerbada e
não modulada resposta imune do tipo-1 observada em LC e LM está associada com o
desenvolvimento da lesão (Bacellar et al. 2002). Em contraste, os indivíduos com
infecção SC por L. braziliensis controlam o crescimento do parasita e não desenvolvem
a doença, apesar de apresentarem uma baixa produção de IFN- quando comparados
com pacientes com LC e LM. Portanto, é provável que em indivíduos SC a resposta
imune inata desempenha um papel importante no controle do crescimento do parasito.
No presente estudo, após 2 horas de infecção, não foi observada diferenças no número
de parasitos nos macrófagos dos grupos, sugerindo que no início da infecção essas
células comportam-se de maneira semelhante. No entanto, após 48 horas a percentagem
de células infectadas e o número de amastigotas diminuíram nos macrófagos de
indivíduos com infecção SC quando comparados com LC e LM, indicando que as
células de pacientes SC tem uma maior capacidade de matar os parasitos do que as
células de pacientes com LC e LM.
Os mecanismos usados por macrófagos humanos para matar Leishmania ainda
não estão bem estabelecidos. Mas, sabe-se que depois do reconhecimento da
Leishmania spp., macrófagos são ativados e são então chamados de “células efetoras”
que podem fagocitar e destruír o parasito. Vários processos celulares começam depois
da ativação dos macrófagos, como degradação das enzimas do fagolisossoma, geração
do “burst” oxidativo e produção de NO. Estudos de monócitos e macrófagos em
culturas humanas e de murinos demonstram que o “burst” respiratório ocorre depois da
fagocitose das formas promastigotas das leishmanias, resultando em um aumento da
produção dos ROIs como O2- e H2O2 que são necessários para a morte dos parasitos
(Gantt et al. 2001; Kumar et al. 2002; Singh et al. 2004). De qualquer maneira esses
relatos não indicam a proporção de macrófagos infectados que produz oxidantes além
do que alguns parasitos residem em células não ativadas. O O2- é gerado pelas
nicotinamida-adenina-dinucleótidofosfato (NADPH) / oxidase NADH. Pode ser que
durante a fagocitose leishmanias geram o “burst” oxidativo nos macrófagos mas
protegem elas própias da ação desta molécula. Em estágios mais tardios da infecção,
60
RNIs são também produzidos, entre eles o NO que é produzido pela atividade da
enzima iNOS, contribuíndo também para eliminação do parasito. No entanto nas
infecções por Leishmania, as atividades microbicidas dos macrófagos estão seriamente
comprometidas levando a sobrevivência e proliferação dos parasitas dentro dos
macrófagos (Olivier et al. 2005). A fagocitose é completada dentro de duas horas.
Depois da fagocitose, as promastigotas se transformam em amastigotas e neste estágio o
NO começa a ser importante como um mecanísmo de defesa contra o parasito. O NO é
um dos mais potentes radicais com atividade leishmanicida e desempenha um papel
importante no controle da infecção na leishmaniose murina (Liew e Cox 1991). Já em
humanos, um estudo recente mostrou que a produção manteve-se inalterada em co-
cultura de neutrófilos humanos com macrófagos infectados com L. braziliensis (Novais
et al. 2009). Nossos resultados mostraram que macrófagos infectados por L. braziliensis
produziram NO e O2-, embora não foram observadas diferenças entre os diferentes
grupos, sugerindo que os derivados oxidantes não são críticos no controle da infecção
pelos macrófagos infectados por L. braziliensis. Sabe-se que depois da ativação dos
macrófagos há um aumento da produção de várias citocinas como TNF-α e IFN-γ e com
isso produção de ROI e de RNI liderando normalmente a destruição dos
microorganismos fagocitados, já a Leishmania é um dos poucos protozoários que
podem sobreviver até mesmo se replicar neste ambiente hostil (Stafford et al. 2002).
Casos de resistência parcial da Leishmania aos reativos intermediários do oxigênio e do
nitrogênio tem sido descritos em certas espécies de Leishmania tanto na forma de
promatigotas extracelulares como na forma de amastigotas intracelulares (Miller et al.
2000; Mukbel et al. 2007). O parasito pode adotar vários mecanismos de defesa para
lidar com o estresse oxidativo: Foi visto que a membrana lipofosfoglicano diminui a
produção de radicais superóxido inibindo NADPH oxidase e o parasita também se
protege expressando enzimas antioxidantes e proteínas (Van Assche et al. 2011). Várias
espécies de Leishmania possuem resistência parcial ao ROI ou ao RNI. Esta resistência
tem sido descrita nos dois estágios do parasito, tanto na formas promastigota
extracelular como na forma amastigota intracelular (Miller et al. 2000; Mukbel et al.
2007). Analisando diferentes isolados de Leishmania que se originaram de pacientes
com leishmaniose tegumentar de uma área endêmica de transmissão por L. braziliensis,
identificou-se alguns isolados que foram resistentes à morte pelo NO, que positivamente
se correlacionava com o tamanho da lesão (Giudice et al. 2007). Estes dados sugerem
que a produção de O2- e NO não são os principais mecanismos utilizados pelos
61
macrófagos para matar Leishmania. Promastigotas e amastigotas de Leishmania podem
inibir a produção de quantidades necessárias de O2- e NO pelos macrófagos humanos
para destruir o parasito ao contrário do que acontece com os camundongos. A interação
entre NO e O2- conduz à formação de ONOO
- que tem sido demonstrado ter um maior
efeito tóxico in vitro em amastigotas quando comparado com o NO (Linares et al. 2000;
Van Assche et al. 2011). Mais estudos são necessários para avaliar o papel do
peroxinitrito na morte de L. braziliensis.
As quimiocinas desempenham um papel crítico no recrutamento de leucócitos
para o local da infecção, o que é essencial para a defesa do hospedeiro. Vários estudos
têm mostrado que as quimiocinas desempenham um papel importante no
desenvolvimento da imunidade inata, bem como da adquirida contra uma variedade de
vírus, bactérias, fungos, e parasitas (Luther e Cyster 2001; Jones et al. 2003; Rodriguez-
Sosa et al. 2003). Na leishmaniose, as quimiocinas participam da reação inflamatória
durante a infecção por Leishmania. Estas moléculas não só apresentam a função de
mediar os eventos celulares necessários para controlar o parasita, como também são
exploradas pelo parasita. No nosso estudo, enquanto CCL3 foi produzido em
quantidades semelhantes por macrófagos de todos os quatro grupos, a produção de
CCL2, CXCL8 e CXCL9 após infecção por L. braziliensis foi significativamente maior
em macrófagos de pacientes com LC e LM do que em macrófagos de indivíduos SC. Na
literatura, vários trabalhos mostraram que as quimiocinas especificamente, CCL2 e
CCL3 ajudam na morte de várias espécies de Leishmania tanto in vitro como in vivo
(Ritter et al. 1996; Bhattacharyya et al. 2002). A CCL2 também age em sinergia com
IFN- para promover a morte do parasita (Ritter e Moll 2000) e na infecção por L.
mexicana a baixa expressão desta quimiocina pode resultar no desenvolvimento de
LCD em vez da forma mais branda, a LC (Ritter et al. 1996). CXCL8 atrai neutrófilos
para o local inflamatório onde eles são fagocitados por macrófagos. Dependendo da
natureza dos neutrófilos (apoptóticos ou necróticos), os macrófagos podem controlar ou
permitir o crescimento de carga parasitaria (Afonso et al. 2008; Novais et al. 2009). A
adição exógena de CCL2 atua como um fator quimiotático altamente específico para
macrófagos e linfócitos T sendo capaz de aumentar a morte da L. infantum em
macrófagos humanos (Brandonisio et al. 2002). Esta quimiocina mostrou um aumento
da expressão em lesões com LC quando comparadas com amostras de biópsia de
controles sadios (Campanelli et al. 2010). A expressão de CCL2 e CXCL9 foi maior em
62
células de tecido de LC do que nas células do tecido de LCD (Ritter e Korner 2002).
CXCL9, tem a capacidade de atrair células T para o local da inflamação. Estas
observações sugerem que diferentes quimiocinas podem influenciar na multiplicação do
parasita, na inflamação e nas manifestações clínicas da leishmaniose (Brandonisio et al.
2002; Campanelli et al. 2010). Nossos dados mostraram que os macrófagos de LC e
LM apresentaram uma maior produção de CCL2 e CXCL9 mas não mataram a
Leishmania, tornando mais provável que essas quimiocinas estejam mais envolvidas na
reação inflamatória e lesão tecidual na LC e LM do que na proteção. A CXCL9 é
secretada em níveis elevados em doenças inflamatórias crônicas e autoimunes, tais
como infecção pelo vírus linfotrópico em células humanas T (HTLV-1) e em esclerose
múltipla. Em ambos os casos, CXCL9 está associada com a inflamação e patologia da
doença (Trebst e Ransohoff 2001; Guerreiro et al. 2006). TNF-α desempenha um papel
importante na proteção em humanos e camundongos contra a leishmaniose (Kanaly et
al. 1999; Pizzorni et al. 2007). No entanto, TNF- também pode mediar a patologia da
LTA (Da-Cruz et al. 1996; Bafica et al. 2003; Antonelli et al. 2005; Sadeghian e
Nilforoushzadeh 2006; Machado et al. 2007). Neste estudo foi observado que apesar
dos macrófagos dos pacientes com LC e LM matarem menos leishmânias, eles
produziram mais TNF- do que os macrófagos de SC. Sugerindo que talvez a produção
elevada desta citocina seja consequência da resposta imune do indivíduo em tentar
controlar a infecção, mas esta resposta exacerbada está contribuíndo, no final, para a
lesão tecidual do que para eliminação do parasito. As razões para uma maior produção
de quimiocinas por pacientes com leishmaniose LC e com LM em comparação com
indivíduos saudáveis e infecção subclínica por L. braziliensis devem ser investigadas.
Na verdade, acreditamos que fatores genéticos do hospedeiro podem ser a explicação de
nossos dados. É importante lembrar que efetivamente apenas 25% dos indivíduos com a
exposição à infecção por L. braziliensis desenvolvem leishmaniose cutânea e cerca de
3% dos pacientes com leishmaniose cutânea irão desenvolver leishmaniose mucosa.
Estudos recentes têm mostrado a presença de um virus RNA na espécie Leishmania
associada com leishmaniose mucosa (Ives et al. 2011). Neste caso, a ativação de
macrófagos em pacientes com CL e ML pode ser devido a fatores relacionados com o
parasito. Os TLRs são expressos em vários tipos celulares, incluindo macrófagos e
células dendríticas, e a ativação desses receptores inicia vias de sinalização que resulta
principalmente na produção de citocinas pró-inflamatórias. Alguns estudos têm
63
mostrado a participação do TLR2 e TRL9 na resposta imune inata mediada por células
NK na leishmaniose cutânea experimental (Becker et al. 2003; de Veer et al. 2003;
Liese et al. 2007). Adicionalmente, camundongos deficientes de TLR4 infectados com
Leishmania major, apresentam um aumento na síntese de IL-10 e da expressão do
receptor de IL-4 (Kropf et al. 2004a; Kropf et al. 2004b). Esses estudos indicam que
esses receptores podem ter também um papel na forte resposta inflamatória observada
na LTA. Por último, muito deste assunto precisa ser elucidado, deixando um vasto
potencial para futuros estudos.
Os monócitos são células importantes da defesa imunológica, elas são as
primeiras células onde parasitas vivem, além disso, essas células podem fagocitar
material estranho, apresentar antígenos para as células T e produzir uma série de
citocinas, incluindo TNF- α, IL-1 e IL-6 que regulam a resposta imune e inflamação
(Belge et al. 2002). Apesar disto, existe pouca informação aínda na resposta dos
monócitos na infecção por Leishmania, principalmente relacionado com moléculas co-
estimulatórias. Estudos têm demonstrado que os monócitos são uma população celular
heterogénea com funções específicas e fenótipos (Passlick et al. 1989; Ziegler-
Heitbrock 1996) e esta heterogenidade começa a ser cada vez mais relevante na saúde
humana, como também do camundongo. O encontro entre um monócito diferenciado e
um parasita é um passo essencial no controle inicial de uma infecção (Ropert e
Gazzinelli 2000) . Um aumento significativo do número de monócitos CD14+CD16
+ na
LC humana foi descrita (Soares et al. 2006). Os resultados apresentados neste estudo
mostraram que macrófagos de indivíduos SC infectados por L. braziliensis
apresentaram uma menor taxa de infecção e um menor número de amastigotas
intracelulares quando comparados com as células de pacientes com LC. Além disso,
esses macrófagos apresentaram uma menor produção de CXCL9 e TNF-α do que os
macrófagos de pacientes LC. Existem algumas evidências de que populações
específicas de monócitos dão origem a macrófagos específicos nos tecidos. Neste
trabalho, foi observado uma maior frequência de monócitos pró-inflamatórias
CD14+CD16
+ em pacientes com LC quando comparados com os monócitos de
indivíduos SC, portanto, é possível que o aumento da frequência destas células
contribua para o aumento da produção de quimiocinas e TNF- pelos macrófagos de
pacientes com LC, sugerindo então que esta população de monócitos possa estar
relacionada com o desenvolvimento de lesões. Além do que, isto pode ser relevante
64
principalmente na fase inicial da infecção, quando o monócito é a célula inicialmente
infectada. Os monócitos CD14+CD16
+ são considerados mais ativados e maduros. Estas
células produzem constitutivamente citocinas pró-inflamatórias e in vitro secretam
pouco ou níveis indetectáveis de IL-10 após estimulos com LPS (Frankenberger et al.
1996). Monócitos CD16+
expressam também elevados níveis de HLA-DR comparados
com monócitos CD16- (Frankenberger et al 1996; Ziegler et al 1996). Para caracterizar
esta população nos indivíduos subclínicos e nos pacientes com leishmaniose cutânea
nós avaliamos a expressão de HLA-DR, CD80, CD86 e de TNF- (estimulada ou não
com SLA) observamos que monócitos CD14+CD16
+ apresentaram uma maior
expressão destas moléculas quando comparadas com os monócitos CD14+CD16
-.
Apesar de não ter sido encontrada diferença entre os grupos, a observação de que
pacientes com LC apresentam uma maior frequência desses monócitos inflamatórios, e
o fato dessas células estarem mais ativadas, de produzirem uma maior concentração de
TNF-, sugere que essas células podem estar contribuindo para o processo inflamatório
exagerado observado nessa doença.
Alguns estudos sugerem que os monócitos apresentam padrões diferenciais e
podem ter funções distintas (Muller 2001). O conhecimento da heterogeneidade dos
monócitos humanos é aínda incompleta. Recentemente estas células foram classificadas
seguindo a diferenciação dos monócitos CD16+ em CD14
++CD16
+ e CD14
+CD16
++,
sendo então 3 subtipos de monócitos, que são os monócitos clássicos (CD14++
CD16-),
monócitos intermediários (CD14++
CD16+) e os monócitos não clássicos
(CD14+CD16
++), (Zawada et al. 2011).
As observações obtidas nesse estudo de que macrófagos de pacientes com LC e
LM produzem mais moléculas inflamatórias do que macrófagos de indivíduos com
infecção subclínica e que existe uma menor frequencia de monócitos inflamatórios
nesses indivíduos, apontam para um papel importante dessas células na patogênese da
leishmaniose tegumentar americana.
65
9. CONCLUSÕES
1. A observação de que o número de amastigotas em macrófagos de indivíduos com
infecção subclínica infectados com L. braziliensis, diminue após 48 horas de infecção,
sugere que os macrófagos desses indivíduos têm uma maior capacidade de matar
Leishmania do que macrófagos de pacientes com LM e LC.
2. Como não foi observado diferença na produção de NO e O2- entre os grupos, outros
radicais também podem participar de forma mais relevante na eliminação do parasito.
3. O fato dos macrófagos de pacientes com LC e LM não apresentarem capacidade de
eliminar o parasito mas produzirem uma maior expressão de moléculas inflamatórias,
sugere que as quimiocinas e o TNF- analisadas neste estudo estão mais envolvidas na
patologia do que na proteção na leishmaniose tegumentar.
4. Pacientes com LC apresentaram uma maior frequência de monócitos inflamatórios
quando comparados com indivíduos subclínicos, reforçando a hipótese de que estas
células podem estar envolvidas no processo inflamatório observado na leishmaniose
tegumentar.
66
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