UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

MAYSA MAGALHÃES VAZ

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA PULPAR HUMANA DIANTE DE DIFERENTES

TÉCNICAS DE CLAREAMENTO

GOIÂNIA

2014

2

MAYSA MAGALHÃES VAZ

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA PULPAR HUMANA DIANTE DE

DIFERENTES TÉCNICAS DE CLAREAMENTO

Pesquisa apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Odontologia da

Faculdade de Odontologia da

Universidade Federal de Goiás para o

exame qualificação.

Linha de Pesquisa: Perspectivas em

odontologia clínica.

Orientador: Lawrence Gonzaga Lopes

Co-orientadora: Aline Carvalho Batista

GOIÂNIA

2014

2014

3

RESUMO

O clareamento dental é a primeira alternativa para a obtenção de dentes

claros. Contudo, sabe-se que o material clareador pode ocasionar danos à

polpa. O objetivo deste estudo foi caracterizar a resposta pulpar humana diante

de diferentes técnicas de clareamento. Foram utilizados terceiros molares

humanos hígidos e com indicação de exodontia. Os pacientes foram divididos

em 3 grupos: Grupo Controle – não foi realizada nenhuma técnica de

clareamento (n=7); Grupo 01- clareamento caseiro com peróxido de carbamida

15% (n=10); Grupo 02- clareamento profissional com peróxido de hidrogênio

38% (n=12). Os dentes foram extraídos e as polpas removidas e submetidas à

análise microscópica utilizando a técnica de coloração por hematoxilina e

eosina(H&E) e a imunoistoquímica. Na análise microscópica, os grupos foram

avaliados quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, degradação de

colágeno e organização da camada odontoblástica. Pela técnica de

imunoistoquímica, foram identificados: mastócitos, macrófagos e vasos

sanguíneos.

Para os dados da microscopia, foi realizada análise descritiva seguida

da aplicação do teste Qui Quadrado (p<0,05). Foi encontrada diferença

estatística entre os grupos somente no critério: intensidade do infiltrado

inflamatório (p=0,0). Para os critérios degradação de colágeno e organização

da camada odontoblástica, não houve diferença estatística: p=0,194 e p=0,343;

respectivamente.

Os dados obtidos na imunoistoquímica foram submetidos à análise não

paramétrica - Kruskall-Wallis (p<0,05) seguido de Mann Whitney (p<0,05). Em

todas as polpas dos grupos avaliados houve ausência de mastócitos. Os

macrófagos foram encontrados em todos os grupos, apresentando menor

densidade no Grupo Controle e maior no Grupo 02. Quando os grupos foram

comparados entre si, houve diferença estatística entre o grupo 02 e os demais

grupos (grupo controle: p=0,03 e grupo 01: p=0,009). Os grupos controle e

caseiro não apresentaram diferença estatística entre si (p=0,537). Os vasos

sanguíneos apresentaram-se com densidade semelhante entre os três grupos

avaliados (p=0,744). Conclui-se que, o clareamento profissional provoca

4

resposta imunoinflamatória mais intensa quando comparado ao clareamento

caseiro ou à ausência de tratamento.

Palavras-chave: Clareamento dental, polpa dentária, microscopia.

5

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO............................................................................................... 6

1.1-OBJETIVOS.................................................................................................7

1.1.1- OBJETIVO GERAL........................................................................7

1.1.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................8

1.2HIPÓTESE.................................................................................................... 8

2- REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................9

2.1- CLAREAMENTO DENTAL..........................................................................9

2.2- RESPOSTA INFLAMATÓRIA....................................................................11

2.3- ALTERAÇÕES PULPARES PROVENIENTES DO CLAREAMENTO.......14

3-MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................18

3.1- SELEÇÃO DA AMOSTRA..........................................................................18

3.2- ETAPA I- ENSAIO CLÍNICO.......................................................................18

3.3- ETAPA II- ANÁLISES MICROSCÓPICA E IMUNOISTOQUÍMICA........... 23

3- RESULTADOS............................................................................................. 29

4-REFERÊNCIAS............................................................................................. 33

6

1 INTRODUÇÃO

Visto que o sorriso é considerado a mais importante forma de interação

e, atualmente, a odontologia estética tem focado na obtenção de dentes

brancos, o clareamento dental tem sido um tratamento frequentemente

solicitado pelos pacientes na rotina clínica (HATTAB, QUDEIMAT, AL-RIMAWI,

1999; GOKAY et al., 2000; KODONAS , GOGOS E TZIAFA, 2009). Dentre os

procedimentos estéticos, ele é tido como um meio eficaz, conservador e com

alta taxa de sucesso para o que objetiva realizar (DAHL & PALLENSEN, 2003;

LEE et al., 2006; MA et al., 2011) .

Vários métodos e técnicas de clareamento de dentes vitais têm sido

aplicados. De forma geral, as variações das técnicas de clareamento

encontram-se na composição dos agentes clareadores, nas concentrações do

agente clareador, no tempo de aplicação, na forma que o produto encontra-se

disponível, no modo de aplicação e no fato de ser ou não ativado por luz

(GREENWALL, 2001; SULIEMAN et al., 2004). Contudo, a principal diferença

entre as técnicas é a concentração do agente clareador e o tempo de uso

(HAYWOOD E HEYMANN, 1989; GREENWALL, 2001).

No que se refere aos diferentes tipos de clareamento, três técnicas

fundamentais tem seu uso reconhecido: clareamento caseiro supervisionado,

clareamento profissional em consultório e a associação de ambos os métodos

(Heymann, 2005). O clareamento caseiro usa o agente clareador em menor

concentração por um maior período de tempo de aplicação (10-16% de

peróxido de carbamida durante 16 dias). O clareamento profissional usa o

clareador em maiores concentrações (25 a 38% de peróxido de hidrogênio) por

um menor período de tempo (HAYWOOD E HEYMANN,1989 REINHARDT et

al., 1993; LEONARD, 1998; HEYMANN, 2005).

O mecanismo de clareamento é pouco compreendido (SULIEMAN et

al.,2005). Sabe-se que os radicais provenientes da decomposição do peróxido

de hidrogênio agem sobre a estrutura dental (FEINMAN; MADRAY;

7

YARBOROUGH, 1991; ZANTNER et al., 2007; EIMAR et al., 2012). Estudos

tem mostrado que parece haver uma oxidação dos componentes orgânicos dos

tecidos dentários, provocando as alterações observadas clinicamente

(RAGGAIN & JONHSTON, 2001; EIMAR et al., 2011; EIMAR et al., 2012).

A sensibilidade dolorosa é o efeito adverso mais frequente do

clareamento dental (BONAFÉ et al., 2013). Esse efeito, provavelmente, ocorre

em resposta à difusão do peróxido de hidrogênio para as estruturas mais

próximas da polpa dental, sendo capaz de provocar uma resposta inflamatória

(COOPER et al.; 1992, COSTA et al., 2010). O baixo peso molecular do

peróxido de hidrogênio permite sua difusão para as estruturas dentais com

consequente obtenção do seu objetivo clareador, porém, ao mesmo tempo

promove uma resposta inflamatória e é capaz de danificar as células da polpa

(COHEN, 1979; ROBERTSON, MELFI; 1980; BENETTI et al., 2004,

CAVIEDES-BUCHELI et al., 2008; COSTA et al., 2010). O poder de penetração

do peróxido de hidrogênio é diferente entre os diversos produtos, dependendo

da concentração e tempo de aplicação, agravando-se na presença de

restaurações (GOKAY et al. , 2004;CAMARGO et al., 2007).

1.1-Objetivos

1.1.1- Objetivo Geral

Avaliar a resposta inflamatória e imunológica, bem como o dano tecidual,

de polpas humanas de dentes permanentes frente a diferentes técnicas de

clareamento.

8

1.1.2- Objetivos Específicos

Investigar as alterações microscópicas (intensidade do infiltrado

inflamatório, degradação do colágeno e organização da camada

odontoblástica) da polpa dentária frente às diferentes técnicas de clareamento

dental.

Identificar e quantificar vasos sanguíneos, macrófagos e

mastócitos nas polpas analisadas para caracterizar a resposta inflamatória.

1.2- Hipótese

Para este estudo, considera-se como hipótese nula que nenhuma

técnica de clareamento produz alterações microscópicas no tecido pulpar.

9

2 CONCEITOS GERAIS E REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Clareamento Dental

O clareamento dental tem sido utilizado há mais de cem anos. O

primeiro relato de clareamento de dentes vitais ocorreu em 1868, realizado por

Latimer, com uso do acido oxálico (COSTA & HUCK, 2006; JOINER,2006). O

peróxido de hidrogênio começou efetivamente a ser utilizado no inicio do

Século XX. Utilizava-se compressas de algodão embebidas em solução de

peróxido de hidrogênio 30% (COSTA & HUCK, 2006). Em 1989, Haywood e

Heyman introduziram a técnica do clareamento caseiro (HAYWOOD &

HEYMAN, 1989; JOINER, 2006).

As técnicas de clareamento caseiro e profissional são largamente

utilizadas na atualidade. O clareamento pela técnica caseira utiliza produtos

com concentrações baixas, entre 10% a 16% de peróxido de carbamida

(HAYWOOD & HEYMANN, 1989; REINHARDT et al., 1993; LEONARD, 1998).

No entanto, na técnica de consultório são utilizadas concentrações mais altas,

variando de 30% a 38% de peróxido de hidrogênio em poucas aplicações

(ROSENSTIEL et al., 1991; GÖKAY, et al, 2000; ZEKONIS et al., 2003;

AUSCHILL et al., 2005).

Alguns estudos questionam a maior eficiência de uma técnica quando

comparada à outra. Moghadam et al. (2013) realizaram um ensaio clínico

randomizado para avaliar a alteração de cor, durabilidade e sensibilidade

produzidas pelo clareamento caseiro com peróxido de carbamida a 15% e

profissional com peróxido de hidrogênio a 38%. O estudo concluiu que ambas

as técnicas apresentaram mesma sensibilidade e variação total da cor. O

dentes submetidos a clareamento profissional, porém, tiveram uma regressão

de cor mais rápida imediatamente após o tratamento. Contudo, em 6 meses foi

realizada nova avaliação e não houve diferença entre as tonalidades dos

dentes para as duas técnicas.

Referente ao clareamento profissional, a utilização da luz durante o

tratamento é um aspecto bastante discutido. He et al. (2012) realizaram uma

metanálise com o objetivo de avaliar a influência da luz sobre a eficácia do

10

clareamento profissional de dentes vitalizados e a sensibilidade dentária a ela

relacionada. Foram selecionados os ensaios clínicos randomizados (ECR) que

compararam o clareamento com e sem uso de luz. Onze estudos foram

incluídos na meta-análise. Os resultados mostraram que o clareamento ativado

por luz apresenta melhores resultados imediatos quando são usadas baixas

concentrações de peróxido de hidrogênio (15-20% HP). Quando altas

concentrações do agente clareador foram usadas (25-35% HP) não houve

diferença imediata ou a curto prazo quando se usa ou não a fotoativação. No

entanto, o sistema fotoativado produz maior ocorrência de sensibilidade para

todos os casos, o que alerta para o cuidado no seu uso.

Para qualquer técnica de clareamento, o mecanismo pelo qual os dentes

são clareados é o mesmo, porém ele ainda não foi perfeitamente explicado

(KAWAMOTO & TSUJIMOTO, 2004; EIMAR et al.,2012). Há duvidas se os

radicais de peróxido clareiam os dentes por desproteinização,

desmineralização ou oxidação dos tecidos dentários. Contudo, acredita-se

fortemente que os radicais hidroxila (OH-), produto da decomposição do

peróxido de hidrogênio (H2O2) agem sobre os componentes orgânicos da

dentina e pigmentos, levando ao clareamento. (EIMAR et al., 2012)

Kawamoto e Tsujimoto (2004) avaliaram o efeito do radical hidroxila

(OH-) e do peróxido de hidrogênio (H2O2) no clareamento dental. Observaram

que a dentina intertubular e peritubular foram dissolvidos com o uso de

concentrações elevadas de peróxido de hidrogênio, mas a hidroxiapatita não foi

influenciada. Notou-se ainda, que quando prolina e alanina, foram adicionados

de H2O2, a geração de OH- diminuiu, mas não houve nenhuma alteração

quando a glicina foi adicionada. Do mesmo modo, a prolina foi degradada

completamente pelo peróxido de hidrogênio, a estrutura da alanina mudou

pouco, e glicina não foi afetada pelo mesmo. Sugere-se que H2O2 e OH- não

influenciam o tecido inorgânico da dentina, mas atacam o componente orgânico

da dentina (proteínas). Esses fatos sugerem que OH- tem o papel fundamental

no clareamento dental com H2O2.

Ainda sobre o mecanismo de clareamento, Eimar et al. (2012) realizaram

um estudo com o objetivo de avaliar o mecanismo de clareamento dental e

determinar quais dos componentes químicos do esmalte são afetados pelo

clareamento. Foram utilizados sessenta dentes hígidos coletados de pacientes

11

adultos, divididos em seis grupos (n=10). Os grupos1, 2, 3 e 4 foram tratados

durante 4 dias nas seguintes soluções: desproteinizadora com NaOH (Grupo

1), desmineralizadora com EDTA (Grupo 2), oxidante com H2O2 (Grupo 3) e

conservados em água destilada (controle/Grupo 04). Para os grupos 5 e 6, os

dentes foram pré-tratados, respectivamente, com soluções desproteinizantes

ou desmineralizadoras por 4 dias, depois lavados com água destilada e

deionizada e imersos em solução oxidante por mais 4 dias. Os resultados

apontaram para aumento da luminosidade nos casos de desproteinização

(4,8±2,7º), diminuição da luminosidade em casos de desmineralização

(8,5±5,6) e aumento da luminosidade para os dentes oxidados (19,9±6,5). A

oxidação de dentes desproteinizados não influencia na alteração da

luminosidade, mas a oxidação dos dentes desmineralizados resultou em

aumento na luminosidade (10,7± 5,8). O estudo concluiu que o peróxido de

hidrogênio não induziu alterações significativas na proporção dos componentes

orgânicos e inorgânicos do esmalte e tem sua ação clareadora por oxidação da

matriz orgânica.

2.2- Resposta Inflamatória

A inflamação é uma resposta de defesa inata do organismo frente a uma

injúria aos tecidos, que pode ser físico, químico ou biológico, caracterizada por

fenômenos vasculares que resultam no acúmulo de fluidos (exsudato

inflamatório), células e moléculas no tecido conjuntivo extravascular

(BERGENHOLTZ, 1990; ABBAS; LICHTMAN & POBER, 2000; KUMAR;

ABBAS & FAUSTO, 2005; LOPES & SIQUEIRA JR, 2010).

A inflamação tem a finalidade de reparar o tecido, porém, quando não

controlada, pode levar à morte tecidual. O reparo ou necrose são diretamente

influenciados pela intensidade e frequência do agente agressor, bem como

pelas condições anátomo-clínicas do dente afetado. (SELTZER & BENDER,

1979)

12

O processo inflamatório na polpa não difere de outros tecidos. Com

exceção de que ela está em uma situação de baixa complacência criada pela

dentina e esmalte (PEREZ & SILVA, 1997). Essa característica propicia ao

tecido pulpar apresentar diferentes mecanismos de controle, principalmente da

homeostase, após início do processo inflamatório, quando comparado aos

demais tecidos conjuntivos (GOLDBERG et al., 2008). O esmalte e dentina

também protegem-na de agentes agressores externos (LUISI, BARBACHAN &

CHIES, 2004) Na polpa, os primeiros eventos inflamatórios frente à entrada de

um agente agressor são a vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular,

formação de exsudato inflamatório e liberação de mediadores químicos. Neste

contexto, a principal substância responsável pelos fenômenos vásculo-

exsudativos da resposta inflamatória inicial é a histamina (BERGENHOLTZ,

1990). Essa substância é secretada principalmente pelos mastócitos

(DOCKRILL, 1961; HOLZER, 1988; MAGGI, 1991; WALSH; DAVIS &

SAVAGE, 1995) que são estimulados por proteínas de baixo peso molecular

(proteínas do sistema complemento), as quais extravasam dos vasos

sangüíneos capilares que apresentam pequena contração de suas células

endoteliais (WALSH; DAVIS & SAVAGE, 1995).

Os mastócitos são células residentes no tecido conjuntivo, localizados

principalmente próximos de vasos sangüíneos e feixes nervosos, e apresentam

grânulos citoplasmáticos contendo várias substâncias biologicamente ativas,

como a histamina e metabólitos do ácido aracdônico (WALSH; DAVIS &

SAVAGE, 1995; JONTELL et al., 1998; RODINI; BATISTA & LARA, 2004;

FREITAS et al.,2007).

Embora os mastócitos estejam presentes em todos os tecidos

conjuntivos do organismo, inclusive da cavidade bucal, ainda existe muita

controvérsia quanto à presença dessas células em polpas normais e

inflamadas (FREITAS et al., 2007). Freitas et al. (2007) avaliaram a presença

de mastócitos, através da técnica de imunoistoquímica, em 40 amostras de

tecido pulpar humano de dentes permanentes em diferentes situações clínicas:

dentes não irrompidos, parcialmente irrompidos e sem cárie dentária,

irrompidos e sem cárie dentária, irrompidos com cárie rasa de dentina e dentes

com pulpite hiperplásica (pólipo pulpar) e verificaram que essas células

13

estavam ausentes em todas as polpas sem exposição e presentes apenas nas

pulpites hiperplásicas. Assim, os autores sugeriram que os mastócitos não

contribuem, através da liberação de histamina, para a resposta inflamatória

vascular inicial da polpa dentária. Esses resultados estão em concordância

com o estudo de Dockrill (1961) que detectou a presença dessa célula somente

em pólipos pulpares.

A inflamação é dividida em padrões agudo e crônico. A inflamação

aguda tem uma duração relativamente curta, de minutos ou algumas horas e

suas principais características são a exsudação de líquido e de proteínas

plasmáticas (edema) e a infiltração de leucócitos, predominantemente de

neutrófilos. Essas células são as primeiras a migrarem para o local da

agressão, pois respondem mais rapidamente aos fatores de quimiotaxia

(ABBAS; LICHTMAN & POBER, 2000; KUMAR; ABBAS & FAUSTO, 2005).

A inflamação crônica, por sua vez, tem uma duração maior e associa-se,

em termos histológicos, com a infiltração especialmente de macrófagos para o

local da agressão e com a proliferação de vasos sanguíneos (ABBAS;

LICHTMAN & POBER, 2000; KUMAR; ABBAS & FAUSTO, 2005).

Os macrófagos são células mononucleares que derivam de um

precursor comum da medula óssea, os monócitos. A meia-vida dos monócitos

sanguíneos é de cerca de um dia, enquanto que a duração média dos

macrófagos teciduais é de vários meses. (JONTELL et al., 1998). Essas células

possuem importante capacidade de fagocitar e destruir o agente agressor, pois

sintetizam diversas substâncias biologicamente ativas como enzimas

microbicidas e espécies oxigênio reativas (H2O2 e NO) (JONTELL et al., 1998;

ABBAS; LICHTMAN & POBER, 2000). Além disto, os macrófagos estão

envolvidos no processo de reparo da polpa por induzir neovascularização e

proliferação de fibroblastos, devido a síntese de fatores de crescimento como o

fator de crescimento fibroblástico básico e o fator de crescimento endotelial

(JONTELL et al., 1998; ABBAS; LICHTMAN & POBER, 2000).

O tecido pulpar possui uma matriz extracelular composta em grande

parte por proteínas colagenosas: colágeno tipo I, seguido de colágeno tipo III e

14

tipo V (GOLDBERG & LASFARGUES, 1995). Os macrófagos, juntamente com

células epiteliais, endoteliais e fibroblastos, são responsáveis pela produção de

citocinas que controlarão a atividade das colagenases. As colagenases são

responsáveis pela degradação do colágeno. No processo inflamatório, a

degradação do colágeno se inicia precocemente e é muito ativa, sendo um

importante indicador da progressão da inflamação pulpar (WISITHPHROM,

MURRAY & WINDSOR, 2006; CAMPOS, BORGES-BRANCO & GROTH,

2007). São conhecidos quatro tipos de colagenases: as séricas (elastases,

catepsina C e proteinase neutra) e as metaloproteinases (CAMPOS, BRANCO

& GROTH, 2007).

No que se refere à organização do tecido pulpar, sabe-se que a polpa

dental é um tecido conjuntivo frouxo composto de odontoblastos na sua zona

periférica, seguidos de uma zona praticamente acelular (basal ou acelular de

WEIL), uma zona rica em células e uma região central rica em vasos e nervos.

(TEN CATE, 2001; HARGREAVIS & GOODIS, 2002).

A camada odontoblástica é constituida pelos corpos celulares dos

odontoblastos que ficam sob a pré-dentina (HERMOZA & NOVOA, 2005).

Abaixo desta camada, encontra-se a zona acelular de Weil que contem fibras

nervosas amielínicas, capilares sanguíneos e processos citoplasmáticos dos

fibroblastos (MUNFORD & BJORN, 1962). Abaixo da zona acelular, encontra-

se a zona celular. A zona celular é povoada por fibroblastos, células

mesenquimais indiferenciadas, macrófagos e linfócitos. Finalmente, na região

central da polpa, encontra-se uma área constituída por vasos sanguíneos e

nervos imersos em um tecido conjuntivo rico em fibroblastos e células

ectomesenquimais indiferenciadas (MUNFORD & BJORN, 1962).

2.3- Alterações pulpares provenientes do clareamento

O efeito adverso mais comum após a realização do clareamento dentário

de dentes vitais é a sensibilidade dolorosa. Esta dor ou desconforto pós-

15

operatório pode ser resultante da difusão, através do esmalte e dentina, do

peróxido de hidrogênio (H2O2) ou de outros componentes tóxicos liberados pela

decomposição do gel clareador (CAMARGO et al., 2007).

Apesar de não se conhecer exatamente os mecanismos pelos quais os

dentes são clareados, sabe-se que o baixo peso molecular do H2O2 não só

favorece sua difusão através do esmalte e dentina, permitindo a obtenção de

dentes mais claros, mas também pode ocasionar danos a polpa (COHEN,

1979; ROBERTSON & MELFI; 1980; BENETTI et al., 2004).

Camargo et al. (2007) compararam a presença de peróxido de

hidrogênio na câmara pulpar de dentes humanos e bovinos submetidos ao

clareamento. Os grupos foram divididos segundo a origem do dente (humana

ou bovina) e subdivididos segundo a presença de material restaurador

(ausência de restauração, resina composta, cimento de ionômero de vidro e

cimento de ionômero de vidro modificado por resina). O estudo concluiu que

independente da presença de restauração, todos os dentes apresentaram

peróxido de hidrogênio na câmara pulpar, os dentes humanos apresentaram

concentração de H2O2 mais alta e a penetração de peróxido de hidrogênio

depende do material restaurador, sendo mais alta em cimentos de ionômero de

vidro modificados por resina.

A concentração e o tempo de aplicação dos agentes clareadores sobre

os dentes são capazes de interferir diretamente na penetração dos mesmos até

a polpa e, consequentemente, na citotoxidade desses (SACONO et al., 2010).

Considerando as possíveis variações de concentração do agente

clareador e tempo de contato do mesmo com o dente, Soares et al. (2014)

realizaram um estudo experimental para avaliar a eficácia de tratamento

clareador e toxicidade dos protocolos clareadores em células pulpares. O

estudo utilizou discos de esmalte/dentina adaptados em dispositivos sobre

poços com cultura de células odontoblásticas humanas (MDPC-23) ou células

pulpares humanas (HDPCs). Para os grupos, variou-se a concentração de

Peróxido de Hidrogênio (35% e 17,5%) e o tempo de aplicação (3x15min; 1x15

min e 1x5 min). O grupo controle não recebeu qualquer técnica de

clareamento. A viabilidade celular e a morfologia foram avaliados

imediatamente e 72h após o clareamento. Conclui-se que a redução do tempo

de clareamento para 5 min, quando o Peróxido de Hidrogênio a 35% foi

16

utilizado ou a redução da concentração para 17,5% com qualquer intervalo de

tempo é capaz de produzir alterações graduais na cor do dente e reduzir a

toxicidade das células da polpa.

Sacono et al. (2010) avaliaram a citotoxidade de diferentes agentes

clareadores empregados em diferentes técnicas. Sessenta discos de

esmalte/dentina foram adaptados sobre câmaras pulpares artificiais, com

cultura de células odontoblástica (MDPC 23) e divididos em 6 grupos (n=10).

Foi utilizado peróxido de hidrogênio a 20% (clareamento caseiro) e 38%

(clareamento profissional), com aplicações de 45 minutos para clareamento

caseiro e 10 minutos para o profissional, variando o número de aplicações

entre os grupos (1-2 para o caseiro e 1-3 para o profissional). Ambas as

técnicas produziram efeito citotóxico acentuado para as células MDPC-23.

Na polpa, os primeiros eventos inflamatórios frente à entrada de um

agente agressor são a vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular,

formação de exsudato inflamatório e liberação de mediadores químicos.

Cintra et al. (2013) investigaram o efeito do número de sessões de

clareamento no tecido pulpar de ratos. Foram utilizados 50 animais, divididos

em 5 grupos (n=10) divididos de acordo com o numero de sessões (1-5). Após

a realização da técnica de clareamento, os animais foram mortos e as polpas

avaliadas microscopicamente. Todos os cortes de polpa dentária mostraram

significativas mudanças induzidas pelo clareamento. Depois de uma sessão,

foram observados tecidos necróticos nos cornos pulpares e alterações

inflamatórias subjacentes. A extensão e a intensidade dessas mudanças

aumentaram com o número de sessões. Após cinco sessões, a mudanças

incluíram áreas de necrose no tecido pulpar envolvendo o segundo terço da

polpa radicular e inflamação intensa no terço apical.

Costa et al. (2010) avaliaram e compararam a resposta de incisivos e

premolares após o clareamento. Para todos os grupos experimentais foi

realizado clareamento profissional com peróxido de hidrogênio a 38% durante

45 min. Não foi realizado clareamento no grupo controle. Os dentes foram

extraídos dois dias após o clareamento e processados para avaliação

histológica. Nessa avaliação, foram considerados: resposta inflamatória celular,

desorganização da camada odontoblástica e formação de dentina reacional. Os

resultados mostraram que houve alterações pulpares somente nos incisivos,

17

sendo que foi notada uma grande zona de necrose de coagulação na polpa

coronária dos mesmos, enquanto a polpa radicular mostrou alterações

inflamatórias leves. Nos pré-molares não foram observadas alterações, bem

como no grupo controle.

18

3- MATERIAL E MÉTODOS

3.1- Seleção da amostra

O presente estudo foi realizado em duas etapas. Na primeira etapa, foi

realizado o ensaio clínico que gerou as amostras pulpares para as análises

histológica e imunoistoquímica. O ensaio clínico foi realizado previamente,

durante a execução da pesquisa de Pós-Doutorado da Doutora Paula de

Carvalho Cardoso. Para este trabalho, foram avaliadas somente as alterações

microscópicas provocadas pelas técnicas de clareamento. O delineamento

deste ensaio clínico cego de grupos paralelos encontra-se apresentado a

seguir.

3.2- ETAPA I- ENSAIO CLÍNICO

Aspectos éticos

Este estudo experimental in vivo foi submetido ao Comitê de Ética em

Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Goiás, de acordo com a

Resolução nº 196/96 do Conselho Nacional do Ministério da Saúde e aprovado

com protocolo nº 281/11

Os pacientes selecionados para o estudo receberam orientações

individuais por meio de uma apresentação no computador em Power Point

sobre a pesquisa pelo pesquisador responsável.

Anteriormente, foi feita a obtenção do consentimento dos pacientes para

sua participação na pesquisa através da assinatura de um termo de

19

consentimento livre esclarecido (TCLE). Os pacientes foram informados que

todos os materiais e dados coletados foram utilizados exclusivamente para os

fins de pesquisa.

Foram incluídos no estudo:

Voluntários de ambos os gêneros, na faixa etária entre 17 e

30 anos;

Pacientes com índice gengival do voluntário menor ou igual

a 1 (Tabela 1), segundo a classificação sugerida por Loe (1967);

Dentes terceiros molares hígidos, livres de trincas e

fraturas, extraídos por motivos ortodônticos. Os dentes foram extraídos,

por indicação prévia de exodontia.

Tabela 1- Classificação clínica dos tecidos gengivais.

Grau Índice gengival

0 Gengiva normal, sem evidência de inflamação

1 Suave inflamação; leve mudança de cor, leve edema, sem

evidência de ulceração

2 Moderada inflamação; vermelhidão, edema, superfície brilhante,

suave ulceração

3 Severa inflamação; vermelhidão acentuada, edema, superfície

brilhante, ulceração, tendência a sangramento espontâneo

Os fatores de exclusão foram:

gravidez e lactação;

presença de manchamento causado por tetraciclina

ou fluorose;

presença de tratamento endodôntico;

20

presença de resina composta nos terceiros molares;

dentes com lesões cariosas, patologias periapicais,

dilacerações radiculares ou qualquer outra patologia que

impedisse o experimento ou a extração do dente.

Divisão dos grupos

Os dentes foram selecionados aleatoriamente e divididos em grupos

(Tabela 2).

Tabela 2: Divisão do grupos

Grupos Técnica de Clareamento

Grupo Controle (n=07) Sem ação de agentes

clareadores

Grupo 01 (n=10) Clareamento Caseiro

Grupo 02 (n=12) Clareamento Profissional

Clareamento dental caseiro

Inicialmente, foi realizada a moldagem da arcada superior com Jeltrate

Plus (Caulk Division, Dentsply) e o vazamento do molde com gesso-pedra

(Vigodent). Após a obtenção do modelo, foi realizado um alívio dos braquets

com pasta pesada da silicona de condensação Oranwash- Zetaplus

21

(ZHERMACK s.p.a.) e, em seguida, obtida a placa de clareamento a partir de

máquina de formação a vácuo. A placa em seguida foi recortada, deixando um

excedente de plástico tanto por vestibular como por palatal.

Na próxima sessão clínica, foi realizado o teste para verificar o

assentamento da placa: 1) boa adaptação de maneira geral; 2) áreas de

interferência na região dos dentes; 3) áreas de interferência e/ou pressão sobre

o tecido gengival; 4) áreas desconfortáveis durante os movimentos de lábio,

bochechas e língua e 5) interferências oclusais significativas.

As instruções sobre modo e tempo de aplicação do agente clareador

(Opalescence® PF 15%, Ultradent Products) (2hs diária durante 16 dias) foram

entregues ao paciente por escrito.

Durante o procedimento clareador nos molares, os pacientes foram

acompanhados de forma direta, sendo monitorados em 1 (uma) visita semanal

durante o clareamento caseiro.

Clareamento dental profissional

Inicialmente, foi inserido afastador de bochecha de plástico autoportante.

Em seguida, o dente foi seco e a gengiva protegida com resina

fotopolimerizável OpalDam (Ultradent). A resina OpalDam foi dispensada em

uma faixa com 4 a 6 mm por 1,5 a 2 mm de espessura sobre a gengiva. Após a

aplicação da barreira de resina, foi realizada a polimerização durante 20

segundos.

Após isolamento, iniciou-se a aplicação do Opalescence Boost,

Ultradent. Para ativação do agente clareador, o profissional pressionou com os

polegares o material da seringa vermelha para a seringa transparente. Desta

forma, o ativador misturou-se com o agente de clareamento de forma rápida,

promovendo o rompimento da membrana interna do êmbolo que permitiu a

mistura. A ação foi invertida e misturada por no mínimo de 25 vezes

22

rapidamente. Em seguida, a seringa transparente foi retirada e descartada.

Uma ponta Micro 20g FX foi posicionada na seringa vermelha e, então, aplicou-

se o Opalescence Boost sobre a vestibular da estrutura dental com 0,5 a

1,0mm de espessura.

O Opalescence Boost foi aplicado por três vezes, sendo que cada

aplicação teve duração de 15 minutos, totalizando 45 minutos de contato do

produto com os dentes. Para a maior eficácia o agente clareador foi agitado a

cada 5 minutos. Antes do enxaguamento, o Opalescence Boost foi retirado dos

dentes utilizando apenas aspiração cirúrgica.

Três sessões de clareamento dental foram realizadas, respeitando

intervalos de 3 dias de uma sessão para outra.

As etapas de seleção, avaliação clínica e radiográfica e realização da

parte experimental (Avaliação da sensibilidade e mensuração da cor inicial e

clareamento) foram executadas nos ambulatórios da Faculdade de Odontologia

da Universidade Federal de Goiás.

Os pacientes que se submeteram ao clareamento profissional, foram

monitorados durante o procedimento clínico, sendo que os cuidados

necessários foram dados durante a inserção da barreira para proteção gengival

e, também, durante a inserção do material clareador. Tais cuidados como: uso

de óculos para proteção dos olhos, entrega das instruções de uso do agente

clareador, prova da placa de clareamento e uso de lubrificante para proteção

dos lábios do paciente minimiza a possibilidade de problemas inerentes ao

agente clareador.

Extração dos dentes

Os dentes foram extraídos 7 dias após o término do clareamento. As

exodontias foram realizadas sob anestesia local, empregando fórceps. Os

23

fórceps tiveram como ponto de apoio o terço cervical dos molares. A extração

aconteceu de forma menos traumática possível.

3.3- ETAPA II- ANÁLISES MICROSCÓPICA E IMUNOISTOQUÍMICA

Preparação dos dentes para avaliação da resposta pulpar

Remoção das polpas

Imediatamente após a extração, os dentes foram seccionados no terço

apical da raiz com ponta diamantada n. 2136 (KG Sorensen, Barueri, Brasil)

acoplada a alta rotação sob abundante refrigeração, para permitir a penetração

da solução fixadora. Em seguida, foram etiquetados e armazenados em frascos

individuais contendo solução de formalina a 10% tamponada em tampão

fosfato pH 7,2 (Formaldeído em solução 37% PA ACS, Merck) onde

permaneceu por três dias. Em seguida, as polpas foram removidas com auxílio

de lima Hedstrom (Maillefer, Dentsply) no sentido anti-horário.

Fixação das polpas

As polpas foram armazenadas na formalina a 10% tamponada em

tampão fosfato pH 7,2 (Formaldeído em solução 37% PA ACS, Merck) onde

permaneceram em média por 10 dias.

Processamento, inclusão e corte dos espécimes

24

As peças foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol a

70%, 90% e 100%, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina (Merck KGaA,

Damstadt, Alemanha). As polpas foram seccionadas com auxílio de um

micrótomo (Leica – Jung RM2045 – Leica Instruments Gmbh D-6907 –

Alemanha). Os cortes foram montados em número de 3 a 4 cortes por lâmina,

as quais foram adequadamente codificadas e numeradas.

Coloração das lâminas

Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (H&E). A técnica de

H&E foi realizada para avaliação das características microscópicas gerais (a

serem descritas posteriormente). Após coloração, a avaliação dos possíveis

artefatos de técnica foi realizada, comparando os espécimes dos grupos

experimentais (G1 e G2) com o do grupo controle (caracterizado por dente não

submetido ao agente clareador).

Análise descritiva

A interpretação dos cortes teciduais corados pela técnica de H&E foi

realizada com a utilização de microscópico trinocular (Axiostar Plus-Carl Zeiss)

e possibilitaram o estudo das possíveis alterações morfológicas e dos

processos inflamatórios gerais nas polpas dentárias. A resposta pulpar foi

determinada a partir dos seguintes critérios: (1) Intensidade do infiltrado

inflamatório; (2) Degradação do colágeno e (3) Organização do tecido pulpar

adjacente ao clareamento dental.

Alterações microscópicas gerais

25

Para analisar as alterações microscópicas gerais, foram consideradas

tanto a polpa coronária quanto radicular e um total de 10 campos

microscópicos representativos, utilizando uma objetiva de 40x, foi investigado:

Foram considerados:

a) Intensidade do infiltrado inflamatório, graduada em:

Escores

0 Nenhuma ou poucas células inflamatórias presentes

no tecido pulpar, caracterizando polpa normal

1 Discreto infiltrado inflamatório (quando a maioria dos

campos (>7) apresentava menos de 35% do espaço do

preenchido por células inflamatórias)

2 Severo infiltrado inflamatório (quando a maioria dos

campos (>7) apresentava mais de 35% do espaço do

preenchido por células inflamatórias)

b) Degradação do colágeno

Escores

0 Colágeno preservado

1 Discreta degradação do colágeno (quando a maioria dos

campos (>7) apresentava menos de 35% do espaço com

colágeno degradado.

2 Severa degradação do colágeno (quando a maioria dos

campos (>7) apresentava mais de 35% do espaço do com

colágeno degradado.

26

c) Organização do tecido pulpar

Escores

0 Tecido Normal

1 Desorganização da camada odontoblástica, porém

com tecido pulpar adjacente sadio

2 Tecido pulpar com desorganização total

3 Necrose pulpar

Técnica de Imunoistoquímica e análise quantitativa

A realização da técnica de imunoistoquímica teve como parâmetro a

metodologia descrita por Bruno et al.(2010).

As polpas viáveis foram submetidas à técnica de Imunoistoquímica para

identificação de células imune-inflamatórias e angiogênese. Cortes seriados de

3,0mm de espessura também foram obtidos de cada bloco, mediante a

utilização de um micrótomo (Leica–RM2155), estendidos sobre lâminas de

vidro silanizadas (DAKO, S3003, Glostrup-Denmark) e submetidos à Técnica

de Imunoistoquímica, utilizando o método da imunoperoxidase e/ou do

polimero, preconizada no protocolo técnico do Laboratório de Patologia Bucal

da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás (FO/UFG). As

proteínas identificadas foram: triptase (mastócito), CD68 (macrófagos) e CD31

(vasos sanguíneos).

Os cortes sobre as lâminas foram desparafinizados e hidratados por

meio de banhos consecutivos em xilol, álcool absoluto, álcool etílico 95% e em

solução salina tamponada (PBS) com pH de 7.2. O bloqueio da peroxidase

endógena foi realizada com peróxido de hidrogênio (Merck) a 3% em PBS, por

40 minutos. Após lavagens (no mínimo 3) com PBS, as lâminas foram

27

mergulhadas em tampão Citrato com pH de 6.0 (SIGMA, P4809, Saint Louis –

USA), aquecido a uma temperatura de 95oC, com auxílio de Banho Maria

Digital (DeLeo) para exposição dos seguintes antígenos: triptase, CD68 e

CD31 por 20 minutos.

Após serem lavadas com PBS, as lâminas foram incubadas com soro

albumina bovina (BSA) por 20 minutos, a fim de se obter o bloqueio das

ligações protéicas inespecíficas. Em seguida, as lâminas foram secas e

incubadas com os anticorpos primários por 18 horas, e mantidas na

temperatura de 4oC. Todas as diluições foram realizadas utilizando PBS

associado a soro albumina bovina (PBS-BSA) a 1,0%. Após o período de 18

horas, lavagens consecutivas foram realizadas para posterior incubação com

os anticorpos biotinilados anti-IgG de coelho/camundongo/cabra por 30

minutos, à temperatura de 22 a 25 0C, seguido pela incubação da streptavidina

marcada com peroxidase por 30 minutos, à temperatura ambiente (kit DAKO

LSAB+, Peroxidase- Universal- K0690) e/ou com anticorpos marcados com

polimero (kit DAKO Advanced HRP).

Posterior às lavagens consecutivas com PBS-BSA a 1,0%, realizou-se a

revelação da reação utilizando o substrato 3.3’- Diaminobenzidina (Liquid DAB

+ Substrate Chromogen System) (DAKO K3468). A revelação foi feita, por 2 a 3

minutos, à temperatura ambiente e protegida da luz. A reação foi interrompida

com água destilada e as lâminas contra-coradas com hematoxilina de Mayer,

por 5 minutos, à temperatura ambiente. Após serem lavadas com água

destilada por duas vezes, as lâminas foram desidratadas com álcoois (95% e

100% GL), passadas em xilol (3 vezes) e montadas com solução de resina não

aquosa (Entellan-Mikroskopie-Merck).

Os controles negativos das reações foram realizados pela da

substituição dos anticorpos primários por PBS-BSA 1%, bem como por soro

normal de coelho (DAKO, X0903-1, Glostrup-Denmark) ou de camundongo

(DAKO, X0910-1, Glostrup-Denmark), descartando assim possíveis falsos

positivos.

A análise morfométrica foi realizada utilizando microscópio óptico

contendo um retículo de integração em rede quadrada (CARL ZEISS,

Germany) acoplado na objetiva de 40x. A área do retículo no aumento de 40x

28

corresponde a 0,0961mm2. Para cada amostra, foram analisados 10 campos

microscópicos alternados, com área total de 0,961mm2.

.

Analise estatística

Para os dados obtidos na análise microscópica, foi realizada análise

descritiva seguida da aplicação do teste Qui Quadrado (p<0,05). Para os

valores obtidos referentes à quantificação de células realizadas na técnica de

imunoistoquímica, foi aplicado o teste de Kuskall Wallis seguido de Mann

Whitney (p<0,05).

29

4 RESULTADOS

No que se refere à intensidade do infiltrado inflamatório (Figura 1), a

análise descritiva apontou que no grupo controle (n=7), no qual não foi

realizado clareamento, nenhum infiltrado inflamatório foi encontrado em 100%

das polpas. No grupo 1 (n=10), no qual foi realizada a técnica de clareamento

caseiro, foi encontrado presença de discreto infiltrado inflamatório em 20% das

amostras, nas demais não foi observada a presença de células inflamatórias.

No grupo 2 (n=12), no qual os pacientes foram submetidos ao clareamento

profissional, 25% das amostras não apresentaram a presença de infiltrado

inflamatório. Neste grupo, discreto infiltrado foi encontrado em 67% das

lâminas analisadas, enquanto 8% das lâminas apresentou severo infiltrado

inflamatório.

Quando os grupos foram comparados no quesito Infiltrado Inflamatório,

o teste estatístico Qui Quadrado foi aplicado e houve diferença estatística entre

os grupos (p= 0,01).

Para avaliação do tecido pulpar, com relação a desorganização das

polpas (Figura 2), observou-se que: no Grupo Controle, 71% das polpas

apresentaram nenhuma evidência de desorganização e 29% encontraram-se

com a camada odontoblástica desorganizada. No Grupo 01, 40% das polpas

apresentaram tecido normal, 50% desorganização da camada odontoblástica e

10% apresentaram desorganização total do tecido pulpar. No grupo Grupo 02,

17% das polpas mantiveram a normalidade do tecido pulpar, 50%

apresentaram desorganização da camada odontoblástica e 33% mostraram

tecido pulpar totalmente desorganizado. Não foi observada necrose pulpar em

nenhuma polpa analisada de quaisquer grupos.

Quando os dados foram submetidos à análise estatística, não houve

diferença estatisticamente significante (p=0,343).

Para analisar os dados referentes à análise microscópica da degradação

do colágeno (Figura 02), foram consideradas a preservação ou degradação de

colágeno. O grupo controle (n=7) mostrou colágeno preservado em 86% das

30

polpas e degradado em 14% delas. O grupo 01 (n=10) apresentou preservação

do colágeno em 78% dos casos e degradação em 22%. Já no grupo 02 (n=12),

o colágeno esteve preservado em 42% das amostras e degradado em 58%.

Para comparar os grupos quanto à degradação do colágeno, o teste Qui

Quadrado foi aplicado e nenhuma diferença estatística entre os grupos foi

encontrada (p=0,194).

Na técnica de Imunoistoquímica, mastócitos , macrófagos (Figura 3) e

vasos sanguíneos (Figura 4) foram quantificados.

Em todas as polpas dos grupos avaliados foi observada ausência de

mastócitos.

Os macrófagos foram encontrados em todos os grupos. A menor

densidade destas células foi encontrada nas polpas do Grupo Controle e maior

nas polpas do Grupo 02. Quando comparados os grupos entre si, houve

diferença estatística entre o grupo submetido ao clareamento profissional e os

grupos controle (p=0,03) e caseiro (p=0,009). Os grupos controle e caseiro não

apresentaram diferenças estatísticas entre si (p=0,537).

Os vasos sanguíneos (CD 31+) apresentaram-se com densidade

semelhante entre os três grupos avaliados. Não houve diferença estatística

entre os grupos (p=0,744).

31

32

33

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