UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR TRANSFERIBILIDADE E VALIDAÇÃO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES DERIVADOS DE EST PARA DUAS ESPÉCIES DE Campomanesia (MYRTACEAE) DO CERRADO Elen Amoreli Gonçalves Cintra Miranda Goiânia - GO Junho - 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA
MOLECULAR
TRANSFERIBILIDADE E VALIDAÇÃO DE MARCADORES
MICROSSATÉLITES DERIVADOS DE EST PARA DUAS ESPÉCIES DE
Campomanesia (MYRTACEAE) DO CERRADO
Elen Amoreli Gonçalves Cintra Miranda
Goiânia - GO
Junho - 2014
Elen Amoreli Gonçalves Cintra Miranda
TRANSFERIBILIDADE E VALIDAÇÃO DE MARCADORES
MICROSSATÉLITES DERIVADOS DE EST PARA DUAS ESPÉCIES DE
Campomanesia (MYRTACEAE) DO CERRADO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular, da Universidade Federal de
Goiás, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em
Genética e Biologia Molecular.
Orientador (a): Dra. Mariana Pires de Campos Telles
Goiânia - GO
Junho - 2014
Epígrafe
“Talvez eu não tenha conseguido fazer o
melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito.
Não sou o que eu deveria ser, mas sou o que
irei ser e graças a Deus não sou o que eu era”.
(Martin Luther King)
Ofereço...
A Deus, o Grande “EU SOU”, sem o qual eu nada seria, pois foi Ele quem me deu
o dom da vida. E até aqui Ele esteve comigo muitas vezes me carregando no colo, sem ti
Senhor eu não chegaria até aqui. Glórias te darei sempre.
Dedico...
Aos meus dois grandes AMORES Dnart Davlly Miranda esposo querido e a minha
filha amada Maria Clara Amoreli Miranda.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Capes pela concessão da bolsa de mestrado com a qual foi possível
realizar uma dedicação exclusiva ao curso. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro por meio do Edital
MCT/CNPq/FNDCT/FAPs/MEC/CAPES/PRO-CENTRO-OESTE nº31/2010 (processo
563839/2010-4). À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG) pelo
auxílio financeiro realizado por meio das Chamadas CH007/2009 e CH031/2010.
Os meus sinceros agradecimentos ao pesquisador Dr. Dario Grattapaglia (Embrapa
CENARGEN), por ter cedido todo o conjunto de primers que permitiu a realização desse
trabalho.
Ao professor Dr. Lázaro José Chaves pelas primeiras coletas e ensinamentos
preciosos, e também ao professor Dr. Heleno Dias Ferreira pela ajuda na identificação de
parte do material utilizado neste trabalho.
Ao professor Dr. Edésio Fialho dos Reis, por disponibilizar a coleção de
germoplasma mantida no campus de Jataí da Universidade Federal de Goiás. Em especial
agradeço ao Técnico Jefferson Fernando Naves Pinto e também à estudante de graduação
Eliane Alves, pela colaboração nas coletas em campo que, apesar de exaustivas, foram
muito divertidas. Obrigada pelo apoio essencial!
Devo muito à orientação da Dra. Mariana Pires de Campos Telles, por ter me
acolhido quando mais precisei, assumindo minha orientação e depositado inteira confiança
em minha pessoa. Obrigada pela oportunidade! Obrigada pelos grandes conhecimentos
transmitidos que são os pilares para o meu futuro profissional. São em pessoas como ela
que me espelho e busco inspiração para o meu desenvolvimento profissional e pessoal.
Agradeço conjuntamente às professoras Dra. Thannya Nascimento Soares e Dra.
Rosane Garcia Collevatti pelos ensinamentos e pelo espírito de colaboração, e também a
todos os professores do Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular da
Universidade Federal de Goiás, pela minha formação de mestre.
Agradeço a todos os alunos do Laboratório de Genética e Biodiversidade (LGBio).
A todas as técnicas, Ramila Braga, Thaís Castro, Ludymila Guedes, Daniela Anjos,
Fernanda Fraga e especialmente a Sara Giselly Gondim (Sarinha) pelos conhecimentos,
amizade, pela grande ajuda comigo. As boas amizades que fiz no LGBio, Mariana
Siqueira, Vanessa Bernardes, Rejane Araújo, Kássia Marquês, Luciana Vitorino, Warita,
Tatianne Piza, e em especial a grande amiga e companheira de todas as horas Ariane
Rolins, obrigada meninas pela acolhida calorosa de todas vocês. E não poderia deixar
passar os inesquecíveis amigos Sabrina Delgado e Ueric José, pelos muitos momentos
compartilhados, e as gargalhadas que deixava tudo mais colorido e divertido que vão ficar
na história. Obrigada de coração!
À Deus, que sempre esteve diante de mim nessa jornada cheia de dificuldades, me
fortalecendo e me mantendo de pé para continuar nas vezes em que pensei em deixar tudo
para trás. Ouviu minhas orações, pois muitas vezes me encontrava perdida e em prantos.
Proporcionou-me paz e serenidade para chegar ao fim e fechar mais um ciclo de minha
vida.
À minha família, em especial meu amado Esposo Dnart (meu porto seguro), este
trabalho é compartilhado 100% com você e é isso que o faz tão especial. Obrigada por ser
o melhor esposo do mundo e por ter cumprido meu grande sonho de formar juntos uma
família maravilhosa, e a pessoa que conseguiu mudar completamente o sentido da minha
vida, minha princesa Maria Clara (presente de Deus). Nunca imaginei que meu coração
tinha tanto amor para dar. Cada dia com um simples sorriso você me faz a mamãe mais
feliz do mundo. Foram vocês meus lindos que sempre me incentivaram e apoiaram nas
decisões tomadas, que me ampararam e consolaram nos momentos de angústia e choro,
que seguraram a minha mão e não me deixaram cair em momento algum e muito menos
desistir, frisando sempre que o esforço um dia seria recompensado, e será; quantas
madrugadas de estudos, preparando seminários passaram juntos comigo, dormindo no sofá
só pra não me deixar sozinha, sem falar nos deliciosos cafezinhos e na companhia
maravilhosa nas coletas no campo... e gabirobas que deram trabalho não é mesmo? São
vocês minha base, meu estímulo pra continuar lutando... simplesmente Meus Amores!!!
Sem esquecer minha querida Mamãe Fátima e meu amado Papai Ivan, que sempre
torceram por mim, minha mãezinha que muitas vezes ouviu meus desabafos e sempre tinha
uma palavra de ânimo. Meu estimado Irmão João Neto, minha Cunhada Ana Paula,
Sobrinho Gabriel Gustavo e, claro, a “pequenina” que está a caminho, obrigada pela
preocupação, atenção e carinho. Amo todos vocês. À minha querida Tia Guiomar, meu Tio
Olímpio e minha linda e amada priminha Isabela que me apoiaram desde o início dessa
jornada e hoje se orgulham de me ver concluir essa etapa.
Aos meus sogros Mary Iara e Dwight, meus Cunhados e Cunhada, Dwight Filho,
Danilo e Danielly, e não poderia esquecer os meus amados e lindos sobrinhos Pedro
Eduardo, Lucas, Samuel Roger, e Ike Zaion por estarem presente em todos os momentos
da minha vida e dividindo comigo mais essa conquista. Vocês são especiais.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................ 9
LISTA DE TABELAS........................................................................................................11
RESUMO............................................................................................................................ 12
ABSTRACT………………………………………………………………………………14
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................16
2. REFERENCIAL TEÓRICO.........................................................................................19
2.1 VARIABILIDADE GENÉTICA E MARCADORES MICROSSATÉLITES..............19
2.1.1 DESENVOLVIMENTO E TRANSFERIBILIDADE DE MARCADORES
MICROSSATÉLITES......................................................................................................... 28
2.1.2 OBTENÇÃO DE GENÓTIPOS PARA MARCADORES MICROSSATÉLITES....31
2.2 BIOMA CERRADO E ESPÉCIES DE ESTUDO.........................................................33
2.2.1 FAMÍLIA MYRTACEAE.......................................................................................... 35
2.2.2 ESPÉCIES DO GÊNERO CAMPOMANESIA NO CERRADO................................ 36
3. OBJETIVOS.................................................................................................................. 44
4. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................... 45
4.1 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO, EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO
DNA..................................................................................................................................... 45
4.2 AMPLIFICAÇÃO CRUZADA E GENOTIPAGEM.................................................... 47
4.3 DESENVOLVIMENTO DO PAINEL MULTIPLEX DE MICROSSATÉLITES.........48
4.4 ANÁLISE DOS DADOS...............................................................................................50
4.4.1 VARIABILIDADE GENÉTICA NOS MARCADORES TRANSFERIDOS........... 50
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................... 53
5.1 TRANSFERIBILIDADE E SISTEMA MULTIPLEX DE GENOTIPAGEM..............53
5.2 VARIABILIDADE GENÉTICA EM CAMPOMANESIA ADAMANTIUM..................59
5.3 VARIABILIDADE GENÉTICA EM CAMPOMANESIA PUBESCENS......................66
6. CONCLUSÕES.............................................................................................................. 74
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................75
ANEXOS............................................................................................................................. 90
Lista de Figuras
Figura 1. Base genética e detecção de polimorfismos de microssatélite. Painéis A e B
ilustram respectivamente os genótipos homozigoto e heterozigoto para uma região
genômica que compreende um microssatélite de elementos (CA) / (GT). Painel C ilustra
um gel de eletroforese com diferentes genótipos homozigotos (banda única) e
heterozigotos (duas bandas) em indivíduos diploides (adaptado de Ferreira & Grattapaglia,
1998). ................................................................................................................................... 24
Figura 2. Deslizamento da polimerase (slippage) durante a replicação do DNA.
Suponhamos que na molécula de DNA original havia cinco repetições do motivo,
simbolizados por cada grupo de sequencias. O deslizamento conduz à formação de novos
alelos com 6 e 4 repetições, dependendo da fita que contém o erro da polimerase
(Modificado de Goldsteind & Schötterer, 1999) (adaptado de Oliveira et al., 2006). ........ 25
Figura 3. Crossing-over desigual entre os cromossomos homólogos. Regiões pretas e
cinza correspondem a sequências repetidas de microssatélites. (Oliveira et al., 2006). ..... 27
Figura 4. Mapa mostrando a abrangência do bioma do Cerrado e suas transições, Fonte:
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2011. ............................................. 33
Figura 5. Aspecto geral de Campomanesia ssp. Cerrado de Goiás região de Montes
Claros. Foto: A autora, outubro 2013. ................................................................................. 38
Figura 6. Mapas de distribuição geográfica de Campomanesia adamantium O. Berg, e
Campomanesia pubescens (DC.). O. Berg. (adaptado de Sobral et al., 2014). ................... 38
Figura 7. Aspecto geral de Campomanesia adamantium na coleção de germoplasma
UFG/Jataí. Foto: Jefferson, 2013. ........................................................................................ 39
Figura 8. Flor de gabiroba (Campomanesia pubescens). Foto: A autora, 2013. ................ 40
Figura 9. Características dos frutos de Campomanesia sp. . Foto: A autora, Coleção de
Germoplasma UFG/Jataí-Go agosto de 2013. ..................................................................... 40
Figura 10. Mapa indicando a origem do material coletado das espécies Campomanesia
adamantium e Campomanesia pubescens que faz parte da coleção “ex situ” de
germoplasma da Universidade Federal de Goiás/Campus Jataí. ......................................... 46
Figura 11. Porcentagem de locos microssatélites ESTs com bom padrão de amplificação e
não amplificados ou inespecíficos em três indivíduos de Campomanesia adamantium
avaliados em gel de poliacrilamida. .................................................................................... 53
Figura 12. Perfil eletroforético em gel de acrilamida 6% dos testes de polimorfismo de
alguns pares de primers com oito indivíduos, sendo quatro da espécie Campomanesia
adamantium e quatro da espécie Campomanesia pubescens. Os primers que estão de
amarelo apresentam amplificação desejada (bandas esperadas nítidas e sem
inespecificidade), bem como polimorfismo. ....................................................................... 54
Figura 13. Perfis dos eletroferogramas apresentados por doze locos polimórficos de
Eucalyptus sp. transferidos para Campomanesia adamantium e Campomanesia pubescens
(EMBRA 809, EMBRA 1335, EMBRA 1364, EMBRA 1363, EMBRA 1362, EMBRA
1470, EMBRA 1939, EMBRA2011, EMBRA 1374, EMBRA 1076, EMBRA 1811,
EMBRA 1868), organizados em três sistemas multiplex de genotipagem. ........................ 58
Figura 14. Representação do polimorfismo encontrado nos 12 locos transferidos para
Campomanesia adamantium. .............................................................................................. 60
Figura 15. Histograma das frequências alélicas de 6 locos microssatélites dos 12
transferidos, estimado para 40 indivíduos da espécie C. adamantium. O eixo Y indica as
frequências alélicas e o eixo X indica os alelos................................................................... 62
Figura 16. Histograma das frequências alélicas de 6 locos microssatélites dos 12
transferidos, estimado para 40 indivíduos da espécie C. adamantium. O eixo Y indica as
frequências alélicas e o eixo X indica os alelos................................................................... 63
Figura 17. Representação do polimorfismo encontrado nos 12 locos transferidos para
Campomanesia pubescens. .................................................................................................. 67
Figura 18. . Histograma das frequências alélicas de 6 locos microssatélites dos 12
transferidos, estimado para 40 indivíduos da espécie C. pubescens. O eixo Y indica as
frequências alélicas e o eixo X indica os alelos................................................................... 69
Figura 19. Histograma das frequências alélicas de 6 locos microssatélites dos 12
transferidos, estimado para 40 indivíduos da espécie C. pubescens. O eixo Y indica as
frequências alélicas e o eixo X indica os alelos................................................................... 70
Lista de Tabelas
Tabela 1. Relação de trabalhos que avaliaram o potencial de tranferibilidade de primers de
regiões microssatélites entre espécies vegetais. .................................................................. 31
Tabela 2. Relação das Localidades e suas respectivas coordenadas geográficas, números
de matrizes amostradas e indivíduos amostrados. ............................................................... 45
Tabela 3. Protocolo das Reações em Cadeia da Polimerase demonstrando os reagentes
utilizados e suas concentrações de uso e volumes, para um sistema de 10μl. ..................... 47
Tabela 4. Relação das temperaturas de anelamento testadas nos 12 pares de primers
transferidos com sucesso para as duas espécies de Campomanesia. ................................... 55
Tabela 5. Sequências dos pares de primers desenvolvidos para Eucalyptus sp. que
amplificaram locos microssatélites em duas espécies de Campomanesia, com as
respectivas amplitudes alélicas de cada espécie e temperatura de anelamento (Ta). .......... 56
Tabela 6. Relação dos sistemas multiplex e seus respectivos primers com fluorescência e
amplitude alélica. ................................................................................................................. 57
Tabela 7. Relação dos 12 marcadores avaliados em 40 indivíduos de C. adamantium com
seus respectivos números de alelos por loco (A), heterozigosidade esperada (He),
observada (Ho), probabilidade de exclusão de paternidade (PE) e probabilidade de
identidade (PI). .................................................................................................................... 61
Tabela 8. Teste exato Fisher de aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg em duas
populações de Campomanesia adamantium para cada loco. .............................................. 64
Tabela 9. Estimativas de parâmetros genéticos de diversidade e estrutura genética em duas
populações de Campomanesia adamantium, sendo (A) número médio de alelos;
heterozigosidade esperada (He), heterozigosidade observada (Ho), índice médio de fixação
dentro das populações (f), índice de fixação total das populações (F) e divergência genética
entre populações (θp). .......................................................................................................... 65
Tabela 10. Relação dos 12 marcadores avaliados em 40 indivíduos de C. pubescens com
seus respectivos números de alelos por loco (A), heterozigosidade esperada (He),
observada (Ho), probabilidade de exclusão de paternidade (PE) e probabilidade de
identidade (PI). .................................................................................................................... 68
Tabela 11. Teste exato de Fisher de aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg em 2
populações de Campomanesia pubescens para cada loco. .................................................. 71
Tabela 12. Estimativas de parâmetros genéticos de diversidade e estrutura genética em 2
populações de Campomanesia pubescens, (A) número médio de alelos; heterozigosidade
esperada (He), heterozigosidade observada (Ho), índice médio de fixação dentro das
populações (f), índice de fixação total das populações (F) e divergência genética entre
populações (θp).................................................................................................................... 72
RESUMO
MIRANDA E. A. G. C. Transferibilidade e validação de marcadores microssatélites
derivados de EST para duas espécies de Campomanesia (Myrtaceae) do Cerrado.
2014. 103 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular), Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014.1
O Cerrado apresenta uma grande diversidade e possui a mais rica e endêmica flora
do mundo, abrigando cerca de 12.000 espécies de plantas nativas. A família Myrtaceae
está entre as 10 famílias representativas deste bioma, composta por 14 gêneros. Dentre
estes, o gênero Campomanesia apresenta várias espécies frutíferas, conhecidas
popularmente como gabiroba. As espécies Campomanesia adamantium e Campomanesia
pubescens apresentam ampla ocorrência no Bioma Cerrado. Os seus frutos podem ser
consumidos “in natura”, na forma de doces, sorvetes, refrescos e como flavorizantes em
destilados alcoólicos, além de possuírem propriedades antidiarréicas, suas cascas e suas
folhas são usadas sob a forma de chás. Sua exploração ocorre por extrativismo e, também,
pode ser cultivada em pequenos pomares familiares, sendo uma fonte de renda extra para
algumas famílias. Desta forma o estudo da diversidade genética e estrutura genética de
populações aliados com outras áreas do conhecimento, pode fornecer informações
importantes para o planejamento e execução de programas de conservação de espécies
nativas. Atualmente, os marcadores moleculares têm ampla aplicação para estudos
referentes à genética de populações. Dentre os tipos de marcadores utilizados, os
microssatélites têm sido amplamente utilizados nos últimos anos, pelo alto poder de
detecção da variabilidade genética. Estudos genéticos-populacionais com espécies do
gênero Campomanesia sp. são escassos e não foram encontrados marcadores
microssatélites disponíveis na literatura para nenhuma espécie do Cerrado. Nesse contexto,
a proposta deste trabalho foi testar o potencial de tranferibilidade de marcadores
microssatélites provinientes de regiões gênicas (EST) desenvolvidos para Eucalyptus sp.,
em duas espécies de Campomanesia (C. adamantium e C. pubescens), disponibilizando um
painel de marcadores polimórficos para as espécies. Para tanto, foram amostradas duas
populações de cada espécie e o DNA foi extraído a partir de tecido foliar. Foi avaliado o
potencial de transferibilidade de 120 pares primers. Os produtos de PCR derivados dos
marcadores microssatélites transferidos foram avaliados em analisador automático de
DNA. A matriz de genótipos foi utilizada para estimar os parâmetros de variabilidade
genética para o painel de marcadores. Dos 120 primers testados, 87 foram descartados por
não apresentarem produtos de amplificação, 22 amplificaram muitos fragmentos
inespecíficos e 12 foram considerados transferidos com sucesso para as duas espécies. Os
12 marcadores transferidos apresentaram bom poder de discriminação individual, com alta
probabilidade de exclusão de paternidade (0,99939 para C. adamantium e 0,99982 para C.
pubescens) e baixa probabilidade de identidade (5,718 x 10-10
para C. adamantium e 1,182
x 10-11
para C. pubescens). O número médio de alelos nos locos polimórficos foi igual a
6,8 para C. adamantium, variando entre 2 (EMBRA 1335 e EMBRA 1811) a 16 (EMBRA
1364) e em C. pubescens foi de 7,8 variando entre 2 (EMBRA 1811 e EMBRA 1076) a 16
(EMBRA 2011) alelos por loco. A média da diversidade genética de Nei (1973) nas
populações foi igual a 0,517 (C. adamantium) e 0,579 (C. pubescens). A heterozigosidade
média observada (Ho) para as populações foi igual a 0,505 (C. adamantium) e 0,503 (C.
pubescens). Para alguns marcadores foi observado desvios para as proporções esperados
para o equilíbrio Hardy-Weinberg. As estimativas de endogamia intrapopulacional (f) não
foram significativas para nenhuma das populações. A endogamia total (F) foi
significativamente diferentes de zero, sugerindo certa estruturação da variabilidade
genética das populações. A estruturação da variabilidade genética no componente entre
populações (θp) foi igual a 0,105 (C. adamantium) e 0,249 (C. pubescens).
Palavras-chave: Campomanesia sp., diversidade genética, microssatélites,
transferibilidade.
1Orientadora: Prof
a. Dr
a. Mariana Pires de Campos Telles. EA-UFG
ABSTRACT
MIRANDA E. A. G. C. Transferability and validation of EST - derived microsatellite
markers for two species of Campomanesia (Myrtaceae) from the Savanna. 2014. 103 f.
Dissertation (Master in Genetics and Molecular Biology), Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014.1
The Savanna is highly diverse and has the richest flora and endemic in the world,
comprising about 12,000 species of native plants. The family Myrtaceae is among the 10
families representative of this biome, comprising 14 genera. Among these, gender
Campomanesia has several fruit species, known popularly as gabiroba. The species
Campomanesia adamantium and Campomanesia pubescens have widespread occurrence in
the Savanna. Its fruits can be consumed " in nature ", in the form of candy, ice cream , soft
drinks and as flavoring in alcoholic distillates, besides having antidiarrheal properties, its
bark and leaves are used in the form of teas. His exploration is by extractivism and can also
be grown in small family orchards, being a source of extra income for some families. Thus,
the study of genetic diversity and genetic structure of populations’ allies with other areas of
knowledge can provide important information for planning and execution of native species
conservation programs information. Currently, molecular markers have wide application
for studies on the genetics of populations, among the types of markers used; microsatellites
have been widely used in recent years by high power to detect genetic variability.
Population - genetic studies of the genus Campomanesia sp. are scarce and so not found
microsatellite markers available in the literature for any species of the Savanna o. In this
context, the aim of this study was to test the potential for transferability of microsatellite
markers derived gene regions (EST) developed for Eucalyptus sp., Campomanesia in two
species (C. adamantium and C. pubescens), providing a panel of polymorphic markers for
the species. To do so, we sampled two populations of each species and DNA was extracted
from leaf tissue. The potential for transferability of 120 primers pairs were evaluated. The
PCR products derived from the microsatellite markers were assessed in automatic
transferred DNA analyzer. The array of genotypes was used to estimate the parameters of
genetic variability for the panel of marker. Of the 120 primers tested, 87 were discarded
for not having amplification products, many nonspecific fragments amplified 22 and 12
were considered successfully transferred the two species. The 12 markers transferred
showed good discrimination power of the individual , with high probability of paternity
exclusion (0,99939 to C. adamantium and 0,99982 for C. pubescens) and low probability
of identity (5,718 x 10-10
for C. adamantium and 1,182 x 10-11
to C. pubescens). The
average number of alleles at polymorphic loci was equal to 6,8 to C. adamantium, ranging
from 2 (EMBRA1335 and EMBRA 1811) 16 (EMBRA 1364) and C. pubescens was 7,8
ranging from 2 (EMBRA1811 and EMBRA 1076) to 16 (EMBRA 2011) alleles per locus.
Mean genetic diversity of Nei (1973) in populations was equal to 0,517 (C. adamantium)
and 0,579 (C. pubescens). Mean observed heterozygosity (Ho) for the populations was
equal to 0,505 (C. adamantium) and 0,503 (C. pubescens). For some markers for
deviations expected for the Hardy-Weinberg equilibrium was observed due proportion’s
estimates of intrapopulation inbreeding (f) were not significant for any population.
Inbreeding full level (F) was significantly different from zero, suggesting some genetic
variability structure populations. The structure of genetic variability in component among
populations (θp) was equal to 0,105 (C. adamantium) and 0,249 (C. pubescens).
Keywords: Campomanesia sp., genetic diversity, microsatellites, transferability.
_________________________________________________________________________ 1Adviser: Prof
a. Dr
a. Mariana Pires de Campos Telles. EA-UFG
16
1. Introdução
A diversidade genética é a variação da sequência de DNA dentro da espécie, a partir
de seu estudo se pode identificar os alelos que afetam a capacidade de um organismo em
sobreviver no seu próprio habitat, ou pode permitir a sobrevivência em habitats mais
diversificados. Esse conhecimento é essencial para estabelecer bancos de germoplasma,
estudos de conservação, individuais e populacionais (Duran et al., 2009).Para a detecção de
variabilidade genética e consequentemente polimorfismo genético, há várias técnicas em
biologia molecular, como a obtenção de marcadores moleculares. Dentre estes, temos os
marcadores microssatélites (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Regiões microssatélites ou repetições curtas em tandem ou sequências simples
repetidas (SSR) são repetições em tandem que apresentam de 1 a 6 nucleotídeos como
motivos de repetição (Agarwal et al., 2008). Possuem altas taxas de polimorfismo,
apresentam co-dominância, variação multi-alélica e alta reprodutibilidade (Duran et al.,
2009). Além disso, são abundantes por todo o genoma, tanto em procariotos quanto em
eucariotos, o que é muito importante para acessar a variabilidade genética intra e
interpopulacional (Brondani et al., 2007). Tais características tornaram os microssatélites
um dos marcadores genéticos mais populares para mapeamento, testes de paternidade e
genética de populações (Schlötterer, 2004). Ao considerar a localização dos marcadores
microssatélites, estes podem ser classificados em gênicos (EST-SSR), aqueles presentes
em regiões codificantes do genoma, ou em genômicos, os quais são encontrados por todo
genoma (Varshney et al., 2005).
Marcadores microssatélites desenvolvidos para uma espécie podem ser usados para
identificar marcadores SSR em espécies relacionadas, de um mesmo gênero ou até mesmo
de uma mesma família. A habilidade de transferir marcadores microssatélites entre
espécies relacionadas é conhecida como transferibilidade. Tanto marcadores SSR gênicos e
genômicos podem ser transferidos entre espécies, porém marcadores gênicos tendem a
apresentar uma maior taxa de transferibilidade, devido à conservação das regiões
transcritas entre as espécies (Kalia et al., 2010). Busca-se com a transferibilidade de
marcadores SSR desenvolvidos suprir uma demanda de trabalhos e recursos financeiros
necessários ao desenvolvimento de marcadores microssatélites, já que desenvolver
marcadores é caro e dispendioso (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
17
Há um grande número de marcadores microssatélites desenvolvidos para espécies
de plantas cultivadas, como soja (Glycine max) (Hisano et al., 2007), e o feijão (Phaseolus
vulgaris) (Garcia et al., 2007; Garcia et al., 2011). Também existem marcadores
microssatélites desenvolvidos para algumas espécies nativas, como as do Cerrado. Mas, no
entanto em um número menor se comparado aos marcadores disponíveis para plantas
cultivadas (Telles et al., 2011; Menezes et al., 2012; Soares et al., 2012; Telles et al.,
2013). A disponibilização destes marcadores para as espécies nativas é importante para que
se possa avaliar a distribuição da diversidade genética das populações, e dessa forma,
contribuir para estudos que visam o uso racional e sustentável destas espécies.
O Cerrado apresenta uma grande diversidade genética, ocupando aproximadamente
23,1% do território brasileiro, é considerado uma savana tropical (Klink & Machado,
2005). A família Myrtaceae está entre as 10 famílias representativas deste bioma,
composta por 14 gêneros. Dentre estes, temos o gênero Campomanesia, que apresenta
várias espécies frutíferas como guavirova, guabiroba-miúda e guabiroba-do-mato
(Landrum, 1986).
As espécies Campomanesia adamantium e Campomanesia pubencens apresentam
ampla ocorrência no Cerrado, Cerradão, Campo Sujo e mata ciliar (Silva et al., 2001). São
plantas de ampla distribuição, podendo ser encontrada nos Estados de São Paulo,
Tocantins, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Distrito Federal, Bahia, Minas Gerais
até a Santa Catarina (Almeida et al., 1998). Os seus frutos são consumidos “in natura”, na
forma de doces, sorvetes, refrescos e como flavorizantes em destilados alcoólicos (Carrara,
1997), além de possuírem propriedades antidiarréicas, suas cascas e suas folhas são usadas
sob a forma de chás (Rodrigues & Carvalho, 2001).
Nesse sentido, marcadores microssatélites desenvolvidos para Eucalyptus sp. foram
escolhidos para testar amplificação heteróloga no genoma de duas espécies de
Campomanesia, sendo essas espécies frutíferas e endêmicas do Cerrado brasileiro, pois
ainda não foram desenvolvidos iniciadores microssatélites para as referidas espécies,
disponibilizando assim um painel multiplex de marcadores microssatélites, que poderá ser
usado para estudos genético populacional, já que não há estudos populacionais
desenvolvidos com estes marcadores para estas espécies. Levando em consideração a
necessidade de estudos sobre a quantidade e a distribuição da variabilidade dentro e entre
populações destas espécies, uma vez que os recursos genéticos referentes às frutíferas
nativas estão seriamente ameaçados pela progressiva destruição de seu habitat. O uso de
18
marcadores moleculares como os microssatélites torna-se, portanto, uma opção viável para
atingir estes objetivos, além de gerar informações importantes para um eficiente plano de
conservação e manejo.
19
2. Referencial Teórico
2.1 Variabilidade genética e marcadores microssatélites
A variabilidade genética de cada espécie é considerada um componente
fundamental da diversidade biológica, a qual tem se dado uma importância especial.
Podendo ser observada no nível de espécie, dentro de uma mesma população ou entre
diferentes populações. A diversidade genética tem papel importante na conservação de
espécies ameaçadas e na manutenção de suas populações ao longo do tempo, pois permite
que as populações se adaptem a um ambiente em transformação. Indivíduos com certos
alelos podem ter as características necessárias para sobreviver e reproduzir em situações
novas. Portanto, a diversidade genética pode assegurar às populações um alto potencial
adaptativo e evolutivo para contrapor os efeitos gerados pelas estocasticidades ambientais
(Frankham, 2008, Geburek & Konrad, 2008).
O estudo da variabilidade tem por finalidade conhecer as relações genéticas,
quantificar ou predizer o nível de variabilidade total existente e a sua distribuição entre e
dentro de unidades taxonômicas. Este conhecimento proporciona importantes
contribuições ao melhoramento genético, ao gerenciamento de bancos de germoplasma, a
conservação de recursos genéticos e ao entendimento dos processos evolutivos de
diferentes espécies (Mohammadi & Prasanna, 2003; Reif et al., 2005). Essa variação é
produto de mutações, fluxo gênico, seleção e deriva genética, dentre esses fatores, a
mutação e fluxo gênico aumentam a diversidade genética, enquanto que a seleção e a
deriva diminuem a diversidade genética dentro das populações.
A variabilidade dentro de populações pode ser medida pelo número de alelos por
loco (A), pelo nível de heterozigozidade esperada nas proporções do equilíbrio de Wardy-
Weinberg (He), e heterozigosidade observada (Ho), estes têm sido os parâmetros genéticos
mais utilizados em vários estudos para quantificar a variabilidade genética em populações
de plantas (Pinto, 2001). Uma vez que o conhecimento da frequência dos heterozigotos é
um importante indicador da diversidade genética, pois cada heterozigoto carrega diferentes
alelos, os quais demonstram a existência de variação genética na população (Weir, 1996).
Até meados da década de 60 a diversidade genética era medida por meio de
diferenças morfológicas. Com o surgimento dos diversos métodos de detecção de
polimorfismo genético baseados em dados moleculares, além dos marcadores
morfológicos, os marcadores moleculares vêm sendo utilizados e considerados como
20
vantajosos em relação aos métodos antigos devido a um maior número de características
estudadas, outra característica importante dos marcadores moleculares é o fato de sua
herança não ser influenciada pelo meio ambiente e eles serem, em geral, neutros.
Marcadores moleculares que apresentam um comportamento Mendeliano simples podem,
por sua vez, serem empregados como marcadores genéticos (Ferreira & Grattapaglia,
1998).
Os marcadores moleculares vêm sendo crescentemente utilizados para mapeamento
genético, caracterização da variabilidade genética (Varshney et al., 2005), discriminação de
indivíduos, além de possuir uma ampla aplicação em diversas áreas, como no
melhoramento genético para o mapeamento de características genéticas desejadas, estudos
de associação, seleção assistida (Salazar et al., 2013; Du et al., 2013; Guo et al., 2013),
estudos genético populacionais de plantas, incluindo espécies de Cerrado (Ferreira &
Grattapaglia, 1998). Podem ser definidos como sendo qualquer fenótipo molecular oriundo
de um gene expresso, como no caso das isoenzimas, ou de um segmento especifico de
DNA correspondente a regiões expressas ou não do genoma (Ferreira & Grattapaglia,
1998).
O advento da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) na década de 1980,
desenvolvida por Mullis e Faloona (1987), permitiu a síntese enzimática de milhões de
cópias de um segmento específico de DNA, requerendo pequenas quantidades de DNA
mesmo sem grande pureza, o que provocou uma verdadeira revolução nas técnicas de
biologia molecular, facilitando enormemente em estudos genético moleculares envolvendo
grande número de indivíduos de qualquer organismo vivo. As aplicações desta técnica são
inúmeras, sendo utilizada, por exemplo, desde experimentos relacionados ao
sequenciamento de DNA até aplicações comerciais na área de diagnose (Ferreira &
Grattapaglia, 1996; Nicholas, 1999; Ramalho; Santos & Pinto, 2000). A partir dessa
técnica surgiram novos marcadores moleculares e consequentemente aumentou muito a
eficiência de detecção de polimorfismo em nível de DNA ou RNA (Lopes et al., 2002).
Os principais tipos de marcadores moleculares podem ser classificados conforme a
metodologia utilizada para identificá-los. Entre os marcadores dominantes destacam-se
aqueles do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) e os VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), estes
últimos baseados em polimorfismo de minissatélites. Entre os mais utilizados estão os
marcadores codominantes, que podem ser baseados em polimorfismo de isoenzimas, ou
21
polimorfismo no DNA, tais como o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e
o SSR (Simple Sequence Repeats) ou microssatélites. (Ferreira e Gratapaglia, 1996). Sendo
que, as izoenzimas, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e minissatélites,
não utilizam PCR e assim apresentam algumas limitações quanto ao número de indivíduos
analisados por estudo, principalmente pela grande quantidade de material genético
necessário e do excessivo trabalho laboratorial com resultados demorados. Por outro lado,
os RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism) e os Microssatélites, são baseados em PCR e permitem a obtenção
de resultados mais rapidamente, além de possibilitarem estudos populacionais com grande
número de indivíduos (Ferreira & Grattapaglia, 1996 e 1998).
A escolha da técnica depende da pergunta científica a ser respondida e dos recursos
disponíveis para realização do trabalho, bem como a experiência do pesquisador (Solferini
& Selivon, 2001). Os marcadores dominantes necessitam de duas a dez vezes mais
indivíduos e mais locos quando comparados com marcadores co-dominantes (Baverstock
& Moritz, 1996). Sendo que os marcadores co-dominantes fornecem maior informação
genética por loco e possibilitam inferir sobre a heterozigozidade de uma população
(Ferreira & Grattapaglia, 1998), tornando assim valiosos para avaliar endogamia em
populações.
O DNA satélite foi descoberto em 1960, após moléculas de DNA serem submetidas
a um gradiente de centrifugação utilizando cloreto de césio, foi então observado uma banda
principal e outras bandas de densidades de flutuação distintas, que foram denominadas de
DNAs satélites, sendo sequências de DNA repetidas (Ellegren, 2004). Os DNA satélites
estão localizados na heterocromatina, principalmente ao redor do centrômero e mais
raramente no telômero, sendo importantes para a organização do cromossomo. A
proporção desse DNA no genoma total de uma espécie pode variar entre 1 % e 65%
(Madalena, 2008).
No fim dos anos 80, os microssatélites, também denominados SSR (Simple
Sequence Repeats) (Tautz, 1989), ou STRs (Short Tandem Repeats) (Edwards & Elgar,
1998) foram isolados e descritos por três grupos de pesquisadores, consistindo de
fragmentos de DNA contendo pequenas repetições em tandem (lado a lado), com
sequências contendo de 1 a 6 nucleotídeos flanqueados por sequências altamente
conservadas (Litt & Luty, 1989; Tautz, 1989). Estas repetições são então chamadas de
22
motivos de repetição, que podem ser repetidos de 5 a 50 vezes, podendo repetir centenas
de vezes em alguns casos (Chin et al., 1996; Ellegren, 2004).
De acordo com o número de nucleotídeos repetidos em tandem os microssatélites
podem ser classificados como: mononucleotídeos quando os motivos são compostos por
apenas um nucleotídeo, como (G)n, onde n é o número de repetições; dinucleotídeos
quando os motivos são compostos por dois nucleotídeos, como (GA)n, seguidos pelos
trinucleotídeos (GAT)n, tetranucleotídeos (GATA)n, pentanucleotídeos (GATAC)n e
hexanucleotídeos (GATACA)n (Tautz, 1989). Segundo Goldstein & Scholotterer (1999),
os microssatélites são organizados em quatro classes: perfeitos, imperfeitos, interrompidos
e compostos. Sendo que repetições perfeitas são quando não existe nenhuma interrupção
nos motivos de repetição, por nenhuma base diferente das que compõe seu motivo (por
exemplo, TATATATATATATATA), já nas repetições imperfeitas observa-se interrupções
por uma base diferente entre as repetidas (por exemplo, TATATATACTATATA). Nos
microssatélites interrompidos outra sequência interrompe o microssatélite (por exemplo,
CTCTCAAAACTCTCT), e por último, os microssatélites compostos são formados por
duas ou mais sequências de repetições, que estão dispostas de forma adjacente (por
exemplo, TATATATATAGTGTGTGTGT).
Regiões microssatélites podem ser encontradas amplamente distribuídas pelo
genoma dos eucariotos, embora também estejam presentes em procariotos. Os
microssatélites localizam-se em maior proporção em regiões genômicas (regiões não
codificantes) do genoma, mas também ocorrem em regiões gênicas ou EST (Expressed
Sequencing Tags ou Sequências Expressas Marcadas), ou seja, regiões codificante (Litt &
Luty, 1989; Tautz, 1989; Tautz et al., 1994). Os marcadores SSR-EST demonstram maior
nível de transferibilidade em relação aos marcadores microssatélites derivados de regiões
genômicas, por serem regiões ricas em genes, e por sua vez, são mais conservadas entre
espécies relacionadas. Sendo assim, primers SSR-EST exibem menos polimorfismo em
comparação com SSR genômicos (Varshney et al., 2005). Assim, SSR genômicos são mais
eficientes do que SSR-EST para distinguir os genótipos estreitamente relacionados (Gupta
et al., 200).
Os microssatélites gênicos podem ser utilizados para uma variedade de propósitos,
incluindo estudos de diversidade genética, mapeamento comparativo e seleção assistida
por marcadores, sendo que, são complementares com relação aos genômicos para o
mapeamento do genoma, por serem menos polimórficos. Neste sentido os SSR gênicos são
23
importantes na avaliação da diversidade genética funcional, ou seja, variação em genes de
função conhecida, pois a expansão e contração de repetições dos SSR em genes de função
conhecida podem estar associadas com uma função biológica ou variação fenótipica
desejável. No entanto, os SSR genômicos são superiores para estudos de fingerprinting ou
de identificação varietal, por apresentarem um potencial maior de polimorfismo (Varshney
et al., 2005).
Em plantas as regiões microssatélites são largamente distribuídas com uma
frequência de um a cada 50 mil pares de bases, e as repetições dinucleotídicas mais
frequentes são (AT)n, seguidas de (GA)n e (AC)n. Já em relação às repetições
trinucleotídicas, as mais frequentes são (AAT)n e (AAC)n e entre as tetranucleotídicas são
(AATT)n e (AAAT)n (Morgante & Oliviere 1993; Ferreira & Grattapaglia, 1998; Ciampi,
2007).
Os microssatélites apresentam herança co-dominante, ou seja, podem ser
observados ambos os alelos presentes em um loco, sendo que os diferentes alelos de um
loco microssatélite diferenciam entre si pelo número de motivos de repetição que
apresentam nos cromossomos homólogos. Além disso, apresentam variação multi-alélica e
alta reprodutibilidade, sendo ainda automatizáveis em sistemas multiplex, permitindo
avaliar rapidamente um grande número de indivíduos para um grande número de locos,
necessitam de pequenas quantidades de DNA dos indivíduos analisados. São capazes de
detectar altos níveis de polimorfismo por loco, quando comparados com outras classes de
marcadores (Fereira & Grattapaglia, 1998; Duran et al., 2009) (Figura 1).
Os SSR possuem altas taxas de polimorfismo, uma vez que apresentam grande
variação do tipo e no número de repetições encontradas em diferentes espécies, mas as
sequências de DNA que flanqueiam essas regiões são geralmente, conservadas dentro de
uma mesma espécie. Isso permite o desenvolvimento de primers para amplificação
específica desses locos. O polimorfismo decorrente destas variações é detectado pela
análise dos produtos de PCR gerados com primers específicos que flanqueiam o
microssatélite (Morgante e Olivieri, 1993; Ferreira, 2001).
O polimorfismo elevado presente nas regiões microssatélites é devido à alta taxa de
mutação em regiões não codificantes, variando de 10-2
a 10-6
em eventos por loco por
gametas por geração, comparado com regiões codificantes do genoma que apresentam taxa
de mutação entre 10-9
a 10-10,
mas tende a ser altamente variável entre espécies (Goldstein,
1999; Ellegren, 2000). Devido à alta taxa de mutação, espera-se que o DNA codificante
24
tenha uma baixa frequência de microssatélites, já que profundas transformações
implicariam em uma perda de funcionalidade das proteínas a serem codificadas (Oliveira et
al., 2006).
Figura 1. Base genética e detecção de polimorfismos de microssatélite. Painéis A e B
ilustram respectivamente os genótipos homozigoto e heterozigoto para uma
região genômica que compreende um microssatélite de elementos (CA) / (GT).
Painel C ilustra um gel de eletroforese com diferentes genótipos homozigotos
(banda única) e heterozigotos (duas bandas) em indivíduos diploides (adaptado
de Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Alguns mecanismos são propostos para explicar a instabilidade dos microssatélites,
como erros durante a recombinação, crossing-over desigual e a mutação slippage, que
parece ser o mecanismo mais provável para explicar o polimorfismo encontrado nos
microssatélites, que é o mecanismo de deslizamento da polimerase, que ocorre durante a
replicação do DNA, ocorrendo assim um realinhamento errado pela formação de um laço
em uma das fitas (Figura 2). Esse mecanismo pode gerar um aumento no número de
repetições se o laço se formar na fita molde ou decréscimo no número de repetições se o
25
laço se formar na fita sintizada. Podendo ser esse o mecanismo pelo qual as sequências
simples repetitivas foram formadas pela primeira vez (Levinson & Gutman, 1987;
Ellegren, 2000; Goldstein & Schötterer, 2001; Zane et al., 2002; Oliveira et al., 2006). Há
relatos em alguns estudos que a taxa de deslizamento da polimerase é maior em repetições
de dinucleotídeos, seguida pelas repetições tri e tetranucleotídeos e está inversamente
correlacionado com o tamanho das unidades repetitivas (Ellegren, 2004).
Figura 2. Deslizamento da polimerase (slippage) durante a replicação do DNA.
Suponhamos que na molécula de DNA original havia cinco repetições do
motivo, simbolizados por cada grupo de sequencias. O deslizamento conduz à
formação de novos alelos com 6 e 4 repetições, dependendo da fita que contém
o erro da polimerase (Modificado de Goldsteind & Schötterer, 1999) (adaptado
de Oliveira et al., 2006).
Outro mecanismo que pode levar a mutações nas regiões microssatélites é crossing-
over desigual, o polimorfismo surge como consequência do emparelhamento equivocado
entre os cromossomos homólogos, causado pela presença de sequências repetitivas,
resultando em uma fita dupla mais curta e outra mais longa após a recombinação
(Hancock, 1999) (Figura 3). Em alguns organismos, como a levedura, Drosophila e
humanos foram demonstrado que as taxas de mutação dos microssatélites estavam
26
positivamente correlacionadas com o número de repetições (Jin et al., 1996; Wierd et al.,
1997; Schötterer et al., 1998).
Três modelos evolutivos foram inicialmente adaptados de modo a traduzir e
compreender melhor o comportamento mutacional dos microssatélites: o Infinite Allele
Model (IAM), proposto por Kimura e Crow (1964); o K-Allele Model (KAM), de Crow e
Kimura (1970) e o Stepwise Mutation Model (SMM), desenvolvido por Kimura e Ohta
(1978).
O modelo de alelos infinitos (IAM) diz que cada mutação envolve um número
variável de repetição em tandem, sendo sempre responsável pela criação de um novo alelo
(não presente na população) a uma taxa de mutação μ; estes diferentes estados podem não
coexistir numa população, pois alguns serão perdidos por deriva ou serão negativamente
selecionados, enquanto outros persistirão por serem benéficos em heterozigose. O modelo
KAM assume que existe um determinado número (K) de alelos possíveis em um dado loco
e a mutação em cada um dos K-1 alelos ocorre com a probabilidade μ/ (K-1), em que μ é a
taxa de mutação. O terceiro modelo, SMM, presume que a mutação é responsável pelo
aumento ou diminuição de uma única unidade de repetição ao alelo original, com igual e
constante probabilidade μ; o alelo resultante poderá encontrar-se ou não previamente na
população, havendo apenas dois estados adjacentes para os quais um alelo pode mutar.
Posteriormente, Di Rienzo e colaboradores (1994) desenvolveram um novo
modelo, o Two Phase Model (TPM), que consiste num extensão do modelo SMM. Este
modelo sugere que a variação nestes marcadores resulta, principalmente, de alterações
numa única unidade no número de repetições, contudo, outras mutações podem ocorrer
implicando a alteração em mais do que uma unidade, sendo esta alteração explicada pelo
modelo Generalized Stepwise Model (GSM). Deste modo, o alelo original é modificado em
uma única unidade com a probabilidade aproximada P e em mais do que uma unidade com
a probabilidade 1-P. Independente dos locos de uma determinada espécie seguirem o
modelo de mutação do tipo Stepwise ou two-phase, para ambos os modelos há a
possibilidade de mutações levarem à formação de alelos já existentes na população e,
portanto, idênticos por estado, mas não por descendência. No caso do modelo de alelos
infinitos, necessariamente dois alelos idênticos serão idênticos por descendência (Ellegren,
2000; Schötterer, 2000).
27
Figura 3. Crossing-over desigual entre os cromossomos homólogos. Regiões pretas e
cinza correspondem a sequências repetidas de microssatélites. (Oliveira et al.,
2006).
Os marcadores SSRs vem sendo aplicados em estudos de estrutura genética, fluxo
gênico de plantas e diversidade genética (Conte et al., 2008; Carvalho et al., 2010; Oliveira
et al., 2012), na determinação de origem parental por teste de paternidade (Gaiotto et al.,
2003), em estudos de conservação (Melo et al., 2006), dinâmica populacional (Maluf et al.,
2005; Mühlen et al., 2000), seleção assistida por marcadores e na construção de mapas de
ligação (Faleiro, 2003). Em espécies nativas do Cerrado os SSR têm sido aplicados com
sucesso em estudos de fluxo gênico, análise de diversidade e paternidade e estrutura
genética de populações, tais como: Caryocar brasilienses (Collevatti et al., 2001a, 2001b),
Eugenia dysenterica (Zucchi et al., 2005), Solanum spp. (Moura et al., 2009), Solanum
lycocarpum (Moura et al., 2012), Dipteryx alata (Tarazi et al., 2010), Hancornia speciosa
(Moura et al., 2011). Nos estudos de conservação genética de populações naturais, o
emprego dos SSR contribuiu para a melhoria das estimativas de parâmetros genéticos,
especialmente em populações com baixa densidade populacional ou que não eram
detectados por outras classes de marcadores.
28
2.1.1 Desenvolvimento e transferibilidade de marcadores microssatélites
Como as sequências de DNA que flanqueiam as regiões microssatélites são
altamente conservadas é possível o desenvolvimento de primers específicos para a
amplificação dos locos. A obtenção de regiões microssatélites e posteriormente o
desenvolvimento de primers específicos para estas regiões envolve uma série de etapas.
Primeiramente procede com identificação das sequências, que podem ser obtidas
diretamente de bibliotecas genômicas, bibliotecas de cDNA, bibliotecas enriquecidas para
sequências microssatélites, ou ainda a partir de sequências depositadas em bancos como o
GenBank (Zane et al., 2002; Gao et al., 2003).
Entende-se por biblioteca genômica, uma coleção de clones que representam a
totalidade do genoma de um organismo. O método de biblioteca genômica basea-se na
fragmentação de DNA genômico de alta qualidade utilizando sonicação (quebra mecânica)
esta última é conhecida por biblioteca Shotgun DNA Sequencing (estratégia de clonagem
em associação ao método de sequenciamento aleatório de DNA). No primeiro caso, a
escolha da enzima de restrição depende do comprimento desejado dos fragmentos de DNA
e do tipo de extremidades coesivas dos fragmentos de restrição. Então é realizada uma
seleção dos fragmentos de DNA, preferencialmente fragmentos pequenos de 300pb a
700pb, onde dependendo da enzima de restrição utilizada os fragmentos de DNA são
inseridos em vetores de clonagem específicos e submetidos a uma triagem feita com
sondas para a identificação das regiões microssatélites, as quais são sequenciadas para
determinar sua extensão. Sendo o passo seguinte a síntese dos primers específicos,
construídos com base na sequência de pares de bases das regiões flanqueadoras das
microssatélites (Schötterer, 1998; Zane, et al. 2002).
O método Shotgun apresenta grande poder informativo com alta capacidade de
detectar regiões microssatélites com diferentes composições de motivos e distribuídas
aleatoriamente no genoma, de modo rápido e eficiente. O DNA é fragmentado em
pequenos pedaços, através de quebra mecânica (por sonicação ou nebulização), estes
fragmentos são selecionados pelo tamanho em gel de agarose, inseridos em vetores de
clonagem. Depois que as regiões microssatélites são identificadas, é realizada a síntese de
iniciadores específicos, construídos com base na seqüência de pares de bases que
flanqueiam as regiões das SSR (Zane, et al. 2002; Brondani et al., 2007).
29
Biblioteca de cDNA é o conjunto de clones das sequências codificadoras que estão
sendo expressas pela célula naquele momento, obtido por meio de clonagem de cópias de
mRNA, sendo este tipo de biblioteca usado quando o intuito é gerar EST (Expressed
Sequence Tags). As bibliotecas de cDNA se diferenciam das bibliotecas genômicas por
usar o mRNA, sendo posteriormente convertido em DNA complementar com a utilização
da enzima transcriptase reversa, podendo ser enriquecida ou não (Zane et al., 2002).
O método de bibliotecas genômicas enriquecidas para microssatélites possibilita um
aumento na proporção de clones numa dada biblioteca contendo o motivo de
microssatélites de interesse. O primeiro passo envolve a seleção de bibliotecas genômicas
já desenvolvidas, ao em vez de DNA genômico. Os fragmentos são amplificados e
purificados. O enriquecimento das regiões contendo os microssatélites é realizado através
da hibridização dos fragmentos com uma sonda marcada com biotina. Esta proteína, por
afinidade, se liga a estreptavidina contida em esferas paramagnéticas, assim os fragmentos
são selecionados e submetidos à lavagem para a remoção do DNA ligado. O DNA é
suspenso em um tampão e amplificado. Em seguida, é clonado em vetores como BAC,
PAC, e YAC, extraído, sequenciado e posteriormente é feito o desenvolvimento dos
primers que flanqueiam essas regiões (Paetkau, 1999).
A principal desvantagem das regiões microssatélites é o custo do desenvolvimento
dos primers, que são espécie-específicos. Portanto, mesmo que atualmente a tecnologia
esteja mais acessível os avanços com uso dos microssatélites têm sido dificultados devido
ao custo elevado e tempo gasto, pois há um grande volume de trabalho necessário para o
desenvolvimento dos primers específicos para cada loco, e ainda necessitando de mão de
obra especializada (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Boweter & Weels 2000; Olveira et al.,
2006). Mas em contrapartida, quando já se tem as sequências do organismo de interesse
depositadas em bancos de dados (Genbank), o desenvolvimento dos marcadores
microssatélites tem menor custo, uma vez que as sequências já estão prontas para serem
utilizadas. Contudo, para espécies nativas existem poucas ou nenhumas sequências
disponíveis e apropriadas (Varshney et al., 2005), dificultando assim o desenvolvimento de
primers para estas espécies.
Porém, têm-se observado que pode ocorrer a conservação de regiões flanqueadoras
de microssatélites entre espécies relacionadas. Sendo possível, portanto, utilizar primers
denominados heterólogos, que foram desenvolvidos para uma espécie e empregá-los nas
demais espécies do gênero (Barbará et al., 2007), proporcionando assim um aumento no
30
número de dados que podem ser obtidos a partir desses marcadores, principalmente em
relação às espécies frutíferas do Cerrado, para as quais não existem sequências disponíveis
em bancos de dados.
Neste contexto, marcadores microssatélites desenvolvidos para uma espécie podem
ser usados para identificar regiões microssatélites em espécies relacionadas, de um mesmo
gênero ou até mesmo de uma mesma família (Kalia et al., 2010). Busca-se com a
transferibilidade de marcadores SSR desenvolvidos suprir uma demanda de trabalhos e
recursos financeiros necessários ao desenvolvimento de marcadores microssatélites
(Ferreira & Grattapaglia, 1998). Tanto marcadores microssatélites gênicos como os
genômicos podem ser transferidos entre espécies, porém marcadores gênicos (ou derivados
de EST) tendem a apresentar uma maior taxa de transferibilidade. Isso ocorre devido ao
fato de que são localizadas em regiões expressas (éxons) e, por sua vez, possuem um alto
grau de conservação evolutiva, embora estas regiões normalmente apresentem menos
polimorfismos do que regiões genômicas, devido à conservação das regiões transcritas
entre as espécies (Barbará et al., 2007, Kalia et al., 2010).
A transferibilidade de locos microssatélites nucleares é bastante desigual
dependendo de qual nível taxonômico as espécies alvo da transferibilidade estão inseridas
(família – gênero – espécie), observando grande sucesso entre animais em qualquer nível
taxonômico, mas variável em plantas. Além disso, o potencial da amplificação cruzada
parece estar relacionado com o tempo de geração e tamanho do genoma da espécie em
estudo. Em espécies monocotiledôneas de mesmo gênero, o porcentual de transferibilidade
é em média 40%, e em dicotiledôneas, 60%. Entre espécies de genêros diferentes da
mesma família, o porcentual de transferibilidade em monocotiledônias é quase nulo e em
dicotiledôneas é em média 10% (Bárbara et al., 2007).
Alguns estudos têm mostrado a possibilidade de amplificação cruzada de regiões
microssatélites entre espécies pertencentes ao mesmo gênero, ou até mesmo entre gêneros
diferentes (Tabela 1). Para espécies que já possuem uma grande quantidade de primers
microssatélites disponíveis e já desenhados, a transferibilidade desses primers em espécies
relacionadas se torna uma alternativa ao desenvolvimento. Esse procedimento se baseia em
vários testes de amplificação do DNA por PCR, alterando as temperaturas de anelamento
dos primers e, se necessário, a concentração dos reagentes usados na amplificação, até a
obtenção de produtos de amplificações satisfatórias (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
31
Tabela 1. Relação de trabalhos que avaliaram o potencial de tranferibilidade de primers de
regiões microssatélites entre espécies vegetais.
Espécie/Família
Desenvolvida
Espécie
Transferida
Número
de
Primers
Testados
Porcentagem de
Transferibilidade Referência
Prunus persica
(Rosaceae)
Espécies do gênero
Prunus (Rosaceae) 15 59%
Cipriani et al.,
1999
Orizza sp.
(Poaceae)
Orizza sp.
(Poaceae) 15 53%
Brondani et
al., 2003
Centrosema
pubescens
(Fabaceae)
Espécies do gênero
Centrosema
(Fabaceae)
26 73% Souza, et al.,
2009
Jatropha curcas
L.
(Euphorbiaceae)
Espécies do gênero
Jatropha
(Euphorbiaceae)
9 67% Bressan et al.,
2012
Enterolobium
cyclocarpum
(Fabaceae)
Enterolobium
contortisiliquum
(Fabaceae)
9 100% Moreira et al.,
2012
Anarcadium
occidentale
(Anacardiaceae)
Anacardium
humile
(Anacardiaceae)
14 86% Soares et al.,
2013
Eucalyptus spp.
(Myrtaceae)
Eugenia
dysenterica
(Myrtaceae)
365 2,80% Zuchi et al.,
2003
Aegiphila
sellowiana
(Lamiaceae)
Espécies de
diferentes gêneros
(Lamiaceae)
11 81% Ruas et al.,
2010
Psidium guajava
L. (Myrtaceae)
Eucalyptus
citriodora
(Myrtaceae)
23 78% Rai et al., 2013
Morus alba L.
(Moraceae)
Artocarpus
heterophyllus
(Moraceae)
42 76% Mathithumilan
et al., 2013
2.1.2 Obtenção de genótipos para marcadores microssatélites
Existem vários métodos de se realizar a genotipagem de locos microssatélites,
desde a utilização de gel de poliacrilamida desnaturante, gel de agarose de alta resolução
que ainda são muito utilizados devido o baixo custo, e também em analisadores
automáticos de DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
O método que vem ganhando espaço é a genotipagem baseada no uso de sistemas
automatizados que permitem a análise de fragmentos produzidos por PCR utilizando
primers marcados com fluorescência. Neste contexto, a utilização de marcadores
32
microssatélites para fins de genotipagem em larga escala tem evoluído para o
desenvolvimento de sistemas de genotipagem multiloco semi-automatizados, os
denominados sistemas multiplex, onde os locos podem ser amplificados em uma única
reação de PCR (multiplex de PCR), ou podem ser amplificados separadamente,
procedendo assim a detecção simultânea de vários locos em uma mesma corrida de
eletroforese capilar (Brondani et al., 2007; Guichoux et al., 2011).
Para montagem do sistema multiplex de genotipagem semi-automatizado, locos
com amplitudes alélicas não sobrepostas, ou seja, os fragmentos destes locos tem que
diferir no mínimo 20 pares de bases um do outro para que não ocorra sobreposição.
Verificado este pressuposto os locos são marcados com a mesma fluorescência e locos com
alelos sobrepostos são marcados com fluorescência distintas. Em cada amostra é
adicionado uma quantidade de um marcador de peso molecular (size standard), que é
utilizado para estimar o tamanho dos alelos em cada amostra. Estes sistemas permitem que
vários fragmentos microssatélites sejam detectados e analisados simultaneamente em
analisadores automáticos de DNA, resultando em maior precisão na detecção alélica,
redução de custos e tempo de análise, além da minimização dos erros inerentes à
genotipagem (Brondani et al., 2007; Guichoux et al., 2011).
Apesar de todas as vantagens citadas, a análise de dados de microssatélites
apresentam algumas dificuldades. Durante a amplificação, vários artefatos da técnica de
PCR podem interferir na interpretação e na determinação dos alelos, subestimando a
frequência de heterozigotos em uma população. Os três artefatos principais são: 1) “alelos
nulos”- quando ocorre uma mutação na região onde o primer se anela, prejudicando assim
a amplificação de um dos alelos. Dessa forma, em muitos casos de indivíduos
heterozigotos, somente o alelo menor é detectado e o indivíduo é considerado
erroneamente sendo homozigoto (Paetkau et al., 1995); 2) “stutter”- é um deslizamento da
DNA polimerase durante a amplificação (Halge, 1993), produzindo fragmentos que
contém uma ou mais unidades de repetição a menos do que o alelo verdadeiro; e 3)
“dropout”- refere-se à amplificação preferencial de alelos menores (Walttier et al., 1998),
isso se deve a natureza competitiva da PCR.
Em contrapartida, o desenvolvimento de métodos estatísticos tem possibilitado a
detecção e discriminação de diferentes tipos de erros de genotipagem em estudos
populacionais (Van Oosterhout et al., 2004). Sendo assim, os microssatélites são muito
utilizados para responder várias perguntas relacionadas à genética de populações, como
33
análise de fluxo gênico, paternidade, estruturação populacional, que resultam em dados
sobre a distribuição da variabilidade genética dentro e entre populações, que são essenciais
para adoção de medidas de conservação seja tanto in situ quanto ex situ (Oliveira et al.,
2006). Além de serem empregados com sucesso na discriminação de acessos conservados
em bancos de germoplasma, no mapeamento genético, e na caracterização da diversidade e
diferenciação genética (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Milach, 1998), permitindo a
identificação de variedades morfologicamente indistinguíveis (Tantasawat et al., 2010).
2.2 Bioma Cerrado e espécies de estudo
O Brasil é considerado como um dos países de maior biodiversidade no mundo,
pois estima-se que nada menos do que 10% de toda a biota terrestre encontram-se no país
(Mittermeier et al., 1997). O Cerrado é o segundo maior bioma brasileiro, superado em
área apenas pela Amazônia, ocupando 22% do território nacional, incidindo sobre os
estados de Goiás, Tocantins, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Bahia,
Maranhão, Piauí, Rondônia, Paraná, São Paulo e Distrito Federal, além dos encraves no
Amapá, Roraima e Amazonas (MMA, 2013) (Figura 4).
Figura 4. Mapa mostrando a abrangência do bioma do Cerrado e suas transições, Fonte:
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2011.
O Cerrado brasileiro é reconhecido como a savana que possui a mais rica e
endêmica flora do mundo, com cerca de 40% de flora endêmica e abrigando 12.669
espécies de plantas nativas já catalogadas (Foezza et al., 2012). Essa grande diversidade de
espécies de plantas está associada com a não menos desprezível diversidade de ambientes,
34
pois a heterogeneidade espacial (a variação dos ecossistemas ao longo do espaço) presente
neste bioma seria um fator determinante para a ocorrência de um variado número de
espécies. Isso seria devido à variação de ambientes do Cerrado, sendo que áreas
campestres, capões de mata, florestas e áreas brejosas podem existir em uma mesma região
(Ratter et al., 2003; Machado et al., 2004).
Ainda que seja o segundo maior bioma brasileiro em extensão, sua biodiversidade
ainda é pouco conhecida, o que parece contraditório por se tratar da mais rica e ameaçada
savana tropical do planeta. Já que nas três últimas décadas o Cerrado tem sido degradado
pela expansão da fronteira agrícola brasileira, sendo também palco de uma exploração
extremamente predatória de seu material lenhoso para produção de carvão (MMA, 2013).
Cerca de 55% do bioma já foi desmatado ou transformado pela ação humana, o que
ameaça a flora e a fauna. Tais transformações ocorridas no Cerrado também trouxeram
grandes danos ambientais – fragmentação de hábitats, extinção da biodiversidade, invasão
de espécies exóticas, erosão dos solos, poluição de aquíferos e degradação de ecossistemas
dentre outros danos (Klink & Machado, 2005). Juntos estes fatores podem acarretar a
extinção de inúmeras espécies de plantas e animais. Segundo estimativa do MMA (2013)
20% das espécies nativas e endêmicas já não ocorrem em áreas protegidas e que pelo
menos 137 espécies de animais que ocorrem no Cerrado estão ameaçadas de extinção.
A perda de biodiversidade gerada pelo avanço agrícola no Cerrado é preocupante,
pois muitas plantas são fornecedoras de frutos comestíveis, servindo de alimento para
muitas espécies da fauna, além de ser fonte de renda para muitas famílias. Esse fato
justifica a necessidade de estudos sobre essas espécies, principalmente as endêmicas, de
forma a minimizar os efeitos da ação do homem sobre o Cerrado. O conhecimento sobre a
biologia das espécies contribui para a preservação e permite estabelecer condições para sua
incorporação ao processo tradicional de cultivo (Mesquita et al., 2007).
A elevada taxa de endemismo associada à possibilidade imediata de perda dos
habitats conduziu a sua inclusão em uma das 25 regiões do globo que são consideradas
áreas prioritárias para a conservação (hotspots) (Myers et al., 2000). Mesmo diante da sua
relevância, no que se refere à diversidade biológica, as espécies do Cerrado foram pouco
contempladas com estudos relacionados a conservação genética, quando comparado a
outros ecossistemas (Melo Júnior et al., 2004).
No Cerrado são encontradas diversas espécies frutíferas nativas com potencial para
introdução ao cultivo, cuja variabilidade está cada vez mais ameaçada pelos
35
desmatamentos indiscriminados (Peixoto et al., 2003). Dentre as espécies frutíferas, estão
as Gabirobeiras, pertencente à família Myrtaceae, gênero Campomanesia, cujos frutos são
bastante apreciados pela população regional e com um potencial econômico considerável,
além de servir de alimento para várias espécies de pássaros e mamíferos, e que tem sido
ameaçada pelas atividades antrópicas.
2.2.1 Família Myrtaceae
A família Myrtaceae possui distribuição predominante pantropical e subtropical,
concentrada na região neotropical e na Austrália. É uma grande família de plantas lenhosas
dicotiledôneas inserida dentro da ordem Myrtales que abrange mais de 5.650 espécies
organizadas em 130-150 gêneros (Govaerts et al., 2008). Seus representantes são
distribuídos principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, com centros de
diversidade na América tropical e Austrália e poucas espécies ocorrendo nas regiões
temperadas (Barroso, 1984).
Segundo a nova classificação infra-família proposta por Wilson e colaboradores
(2005) as espécies da família Myrtaceae estão organizadas em duas subfamílias, Mytoideae
e Psiloxyloideae, e 17 tribos. Sendo que todas as mirtáceas brasileiras estão incluídas na
tribo Myrtaceae. Seus representantes são tipicamente diploides, e são encontrados em
muitos dos hotspots de biodiversidade do mundo, como no sudoeste da Austrália, e no
Brasil se encontram na Mata Atlântica e Cerrado, onde são encontradas até 90 espécies de
Myrtaceae por hectare (Govaerts et al., 2008). Portanto é considerada uma das maiores
famílias da flora brasileira, com 26 gêneros e aproximadamente 1000 espécies (Lorenzi e
Souza, 2008), destacando os gêneros Eugenia, Campomanesia, Psidium e Myrciaria, que
reúne o maior número de espécies de importância econômica do país.
As mirtáceas brasileiras têm potencial e um significativo interesse econômico,
várias espécies são utilizadas na alimentação, fornecimento de madeira, propriedades
medicinais e potencial ornamental. Há numerosas espécies frutíferas, algumas exploradas
comercialmente, como é o caso da goiaba (Psidium guajava L.), a uvaia (Eugenia uvalha
L.), o jambo (Syzygium jambos (L.) Alston) e a jabuticaba (Plinia cauliflora L.) Essas
espécies apresentam uma pequena fração do grande potencial econômico da família, tendo
em vista o grande número de frutos comestíveis de espécies não comerciais, como por
exemplo as gabirobeiras. Entre as grandes produtoras de madeira e também antissépticos,
36
destacam-se várias espécies de Eucalyptus L. Her. Como ornamentais, merecem destaque
Myrtus communis L. e Melaleuca L. (Landrum & Kawasaki, 1997; Costa, 2004).
As flores das mirtáceas brasileiras são hermafroditas, geralmente de cor branca,
com estames numerosos, os ovários são usualmente ínferos a semi-ínferos, com número
variável de lóculos (Barroso, 1991; Landrum & Kawasaki, 1997), a estrutura geral das
flores varia pouco entre as espécies. Flores menores são mais comuns, embora o tamanho
varie de pequeno (menor que 1,5 cm de diâmetro), como em Calyptranthes e Myrcia, a
relativamente grande (maior que 2,0 cm), como em Acca e Campomanesia (Nic Lughadha
e Proença, 1996). Os frutos são carnosos (Landrum & Kawasaki, 1997), as sementes são
potencialmente dispersas por vertebrados frugívoros. Em relação aos agentes polinizadores
das mirtáceas as abelhas formam o principal grupo de polinizadores na região central do
Brasil, área de ocorrência natural da maior parte do Cerrado no país (Proença & Gibbs,
1994).
2.2.2 Espécies do gênero Campomanesia no Cerrado
O gênero Campomanesia Ruiz e Pav. é um dos gêneros pertencente à família
Myrtaceae, o qual foi descrito por Ruiz e Pavon (1794), revisto por De Candolle (1828) e
aceito por Berg (1857-1859), monografista da obra de Martius, Flora Brasiliensis (Soares-
Silva, 2000). O referido gênero é composto por árvores e arbustos, encontrando-se
distribuído do Norte da Argentina a Trindade e da Costa do Brasil ao Peru, Equador e
Colômbia (Landrum, 1986). Segundo o referido autor, as árvores são encontradas nas
florestas subtropicais e tropicais do Leste do Brasil, norte da Argentina e nos Andes, já os
arbustos ocorrem nos campos e cerrados do interior do Brasil. As plantas arbóreas medem
entre 8 e 15 m, podendo chegar a 25 m, e as arbustivas, entre 0,80 e 1,5 m, ocorrendo
normalmente em moitas. Durante o período de inverno, há a ocorrência de caducifólia e, na
primavera as plantas rebrotam e florescem abundantemente (Almeida et al., 2000).
Dentre os gêneros pertencentes à família Myrtaceae, o gênero Campomanesia
distinguem-se de outros gêneros pela forma de desenvolvimento dos frutos e sementes,
possuindo hipocótilo desenvolvido e cotilédones pequenos. As folhas são opostas, simples,
inteiras com pontuações translúcidas, ápice agudo, base obtusa, membranáceas, levemente
avermelhadas quando novas; coriáceas, oblongas com face ventral pruinosa e dorsal
amarelada, quando adultas. Flores pequenas de coloração creme-esbranquiçadas e axilares
isoladas, pedicelos glabros; pentâmeras; dialipétalas; sépalas triangulares, agudas, ciliadas;
37
pétalas ovais, conchiformes; androceu com muitos estames, anteras pequenas, rimosas;
ovário ínfero apresentando de 4 a 18 lóculos, cujas paredes se tornam mais espessas e
glandulares quando os frutos amadurecem, servindo como um falso envoltório nas
sementes que, apresentam testa membranácea, apresentando uma característica peculiar
que é a presença de vários óvulos por lóculo, que após a fecundação, todos, exceto um,
abortam, placentação axial, estigma captado. Fruto globoso, polpa amarelada suculenta
envolvendo numerosas sementes, produz de 30 a 100 frutos por planta, com dimensões de
1 a 3 cm de comprimento por 2 a 3 cm de diâmetro quando madura. Sementes pequenas,
discóides, reniformes e pardas (Ferreira, 1972; Landrum, 1986; Lorenzi et al., 2006; Lima
et al., 2011). Amadurece entre setembro e novembro, a primeira frutificação ocorre de 2 a
3 anos após o plantio (Peixoto et al., 2003)(Figura 5).
O referido gênero possui cerca de 31 espécies, sendo que 21 delas são endêmicas
para o Brasil, seis são nativas para o estado de Goiás: C. adamantium, C. cavalcantina, C.
eugenioides, C. pubescens, C. sessiliflora e C. velutina. (Forzza, et al., 2010; Florecer,
2011), que são popularmente conhecidas como gabiroba, guavirova, guavira, guabiroba-
miúda e guabiroba-do-mato (Landrum, 1986). São plantas pouco exigentes quanto ao tipo
de solo. Algumas crescem naturalmente em solo pobres em nutrientes, como é o caso de
Campomanesia adamantium. Os frutos da gabirobeira destacam-se como importante
alimento para pássaros, pequenos mamíferos, peixes e até répteis, que representam os
principais agentes dispersores das sementes das espécies deste gênero (Vallilo et al.,
2006b). Espécies de Campomanesia vivem em clima tropical quente com baixo índice
pluviométrico, necessitando sempre de exposição ao sol. A propagação ocorre por meio de
sementes, que devem ser semeadas logo após a extração do fruto porque perde rapidamente
a capacidade germinativa. Isso ocorre, pois as sementes são classificadas como sendo
recalcitrantes, por não suportarem armazenamento a baixas temperaturas e ser intolerante à
dessecação.
Dentre as espécies do gênero, Campomanesia adamantium O. Berg e
Campomanesia pubescens (DC.). O. Berg apresentam ampla ocorrência no Cerrado, são
frutíferas nativas e não cultivadas; por serem morfologicamente semelhantes, torna-se
difícil diferenciá-las. Entretanto, uma característica marcante entre elas é a presença de
pubescência em folhas jovens e nos frutos de C. pubescens (Arantes e Monteiro, 2002). De
acordo com Itayguara e Forni-Martins (2006) populações dessas duas espécies por eles
38
estudadas apresentam estado diplóide (2n = 22 ou n = 11) assim como a maioria dos
gêneros da família Myrtaceae.
Figura 5. Aspecto geral de Campomanesia ssp. Cerrado de Goiás região de Montes
Claros. Foto: A autora, outubro 2013.
Na literatura, a ocorrência está descrita para as fitofisionomias de cerrado sentido
stricto, cerradão, campo sujo e mata ciliar (Almeida et al., 1998; Silva et al., 2001), além
da Mata Atlântica e Caatinga (Sobral et al., 2014). São plantas de ampla distribuição,
podendo ser encontradas nos Estados de São Paulo, Tocantins, Mato Grosso, Mato Grosso
do Sul, Goiás, Distrito Federal, Bahia, Minas Gerais, Espírito Santo, Paraná e Santa
Catarina, (Sobral et al., 2014) (Figura 6).
Figura 6. Mapas de distribuição geográfica de Campomanesia adamantium O. Berg, e
Campomanesia pubescens (DC.). O. Berg. (adaptado de Sobral et al., 2014).
39
As plantas das duas espécies estudadas se desenvolvem de forma arbustiva seu
porte varia de acordo com a fertilidade do solo, podendo atingir até 2 m de altura,
apresenta bastantes ramificações com ramos delgados. Flores solitárias formadas de
agosto-setembro, axilares, brancas, sépalas agudas triangulares, bractéolas lineares e são
sempre visitadas por abelhas das famílias Apidae e Halictidae, distinguindo a Apis
mellifera e Melipona quadrifasciata, portanto indicando o potencial melífero do gênero
(Figuras 7 e 8). O fruto é globuloso, de coloração amarelo-esverdeada com polpa suculenta
de sabor acidulado que amadurecem de novembro-dezembro (Figura 9) (Torezan & Del -
Claro, 1998; Proença & Gibbs 1994; Andena et al., 2005; Vallilo et al., 2006b.
Além da presença de pubescência no caule e folhas C. pubescens distingue–se de
outras gabirobeiras arbustivas por geralmente apresentarem, pedúnculos densamente
pubescentes e normalmente mais longos que o broto floral, além de ter folhas ainda
imaturas por ocasião da antese e serem coriáceas (Almeida et al., 1998; Sousa et al., 2004;
Lorenzi et al., 2008). Segundo Landrum (1986), as variações apresentadas pelas espécimes
de C. pubescens podem estar relacionadas aos seus locais de ocorrência.
Figura 7. Aspecto geral de Campomanesia adamantium na coleção de germoplasma
UFG/Jataí. Foto: Jefferson, 2013.
40
Figura 8. Flor de gabiroba (Campomanesia pubescens). Foto: A autora, 2013.
Segundo Oliveira e colaboradores (2008), frutos de C. adamantium apresentaram,
de maneira geral, características biométricas semelhantes aos de C. pubescens, embora o
comprimento transversal e a massa da matéria fresca dos frutos tenham sido superiores
para a primeira espécie. A espécie Campomanesia adamantium revelou maior
variabilidade para as características analisadas (como comprimento longitudinal e
transversal dos frutos e das sementes, além da determinação da matéria fresca, e o número
de locos por fruto e lóculos com semente), o que favorece a seleção de materiais
promissores para comercialização de frutos.
Figura 9. Características dos frutos de Campomanesia sp. . Foto: A autora, Coleção de
Germoplasma UFG/Jataí-Go agosto de 2013.
41
Com relação ao sistema reprodutivo da Campomanesia pubescens segundo Proença
e Gibbs (1994), é considerada auto-incompatível (AI), sendo polinizada por abelhas do
gênero Bombus e também por espécies da família Aphidae. Sendo assim, sugere-se que
esta espécie seja alógama, tendo em vista que se realmente a espécie for auto-incompativel,
não haverá formação de sementes quando fertilizada por seu próprio pólen. É um
mecanismo fisiológico, com base genética, que promove a alogamia (Wittmann et al.,
2002). Além disso, foi observado por Borém (2009) em populações de C. pubescens
assincronia de floração entre os indivíduos, sendo verificada a ocorrência de plantas na
fase reprodutiva ao mesmo tempo em que outras se encontravam na fase vegetativa. Esta
característica pode aumentar as taxas de polinizações cruzadas dentro da população, pois
promove uma maior amplitude de forrageio dos polinizadores em busca de alimento como
descrito por Bawa e colaboradores (1985).
Mas em contra partida em outro estudo realizado por Torezan e Del Claro (1998),
no qual foi analisada a biologia reprodutiva e a polinização de Campomanesia pubescens,
polinizações controladas realizadas demonstraram que a espécie é auto-compatível, ainda
que a formação de frutos ocorra especialmente por polinização cruzada. No entanto, a falta
de estudos com essa e outras espécies deste gênero nos impossibilita afirmar com exatidão
qual destas características se aplica para C. pubescens e às demais espécies.
As espécies do gênero Campomanesia têm importância econômica diversificada,
sendo que alguns dos seus frutos, além de serem consumidos “in natura”, também são
utilizados na indústria de alimentos na forma de doces, sorvetes, refrescos e, muitas vezes,
como flavorizantes em destilados alcoólicos (Ferreira, 1972; Carrara, 1997; Almeida et al.,
1998; Rodrigues e Carvalho, 2001; Piva, 2002). A composição química dos frutos de C.
adamantium compreende: proteínas, carboidratos, niacina sais minerais e vitaminas do
complexo B. A parte mais usada são os frutos e brotos. Também apresenta propriedades
medicinais, adstringente e antidiarreica (Vallilo et al., 2006a).
Algumas espécies do gênero Campomanesia são consideradas plantas medicinais,
uma vez que as folhas e os frutos possuem propriedades anti-inflamatórias, antidiarréicas,
infecção do trato urinário, regula as funções intestinais, além de serem utilizadas no
tratamento da gripe por serem ricos em vitamina C, sendo suas cascas e suas folhas usadas
sob a forma de chás. A infusão das folhas é relaxante para aliviar dores musculares, por
meio de banhos de imersão, sendo ainda considerada uma planta melífera, nesse sentido é
importante para o pasto apícola. Sua exploração ocorre por meio de extrativismo e
42
também, é cultivada em pequenos pomares familiares, sendo uma fonte de renda para
muitas famílias (Almeida et al., 1998).
Por ser uma planta rústica, a gabirobeira pode ser utilizada na arborização urbana,
de fácil manutenção, quase não necessita de podas de condução e ainda produz abundante
floração branca, o que lhe confere aptidão paisagística (Piva, 2002; Lima, 2004). Sua
madeira pode ainda ser usada para confecção de cabos de ferramentas (Sangalli, 2000). O
plantio de Campomanesia tem sido recomendado para projetos de reflorestamento de áreas
degradadas (Hardt et al., 2006), e a espécie é observada na composição florística de
recuperação natural (Caldato et al., 1996).
Dentre os poucos estudos encontrados na literatura para C. adamantium pode ser
citado o trabalho realizado por Coutinho et al., (2008a) que se refere a determinação de
compostos fenólicos e atividade antioxidante das folhas. Em outro estudo realizado pelo
mesmo autor determinou–se a composição química dos compostos voláteis das folhas
(Coutinho et al., 2008b). Identificação de terpenos no óleo essencial de frutos de C.
adamantium (Vallilo et al., 2006a), estudos de germinação de sementes (Melchior et al.,
2006), avaliação do potencial citotóxico e atividades antioxidante (Ramos et al., 2007).
Para C. pubescens foram encontrados estudos referentes à composição química de
óleos essenciais das folhas, frutos e flor (Silva et al., 2009b; Cardoso & Re-Popp1, 2009).
Aplicação dos frutos na fermentação para produção de vinhos e a identificação de
flavanonas em chalconas (Silva et al., 2007; Duarte et al., 2009). Avaliação do crescimento
inicial de populações de gabiroba (Peixoto et al., 2005). Aspectos de germinação de
sementes, da emergência de plântulas e da morfologia dos frutos e sementes de
Campomanesia pubescens (DC). O. Berg (Myrtaceae) (Periotto, 2008). Avaliação dos
constituintes fenológicos e voláteis, atividade antioxidante e antimicrobiana de
Campomanesia pubescens (DC.) O. Berg (Rocha, 2011). Além de um estudo sobre a
Biologia reprodutiva de Campomanesia pubescens Mart. (Myrtaceae) uma espécie
arbustiva dos Cerrados do Brasil e sua ocorrência no Parque ecológico Quedas do Rio
Bonito (Borém, 2009).
Poucos estudos relacionados com análise de diversidade genética em gabiroba
foram encontrados. Peloso e colaboradores (2008) realizaram a avaliação da diversidade
genética de uma população de guavira (Campomanesia adamantium Cambess, O. Berg),
onde a diversidade genética foi avaliada baseado em dados de características fenotípicas de
frutos maduros de C. adamantium. Outro estudo relacionado a estimativas de diversidade
43
genética em espécies de gabiroba foi realizado por Teixeira e colaboradores (2005), onde
foi concluído que a espécie C. pubescens apresenta maior variabilidade fenotípica do que a
espécie C. adamantium em relação às populações por ele estudada.
Com a realização de uma revisão cuidadosa, o único trabalho encontrado com
espécies de Campomanesia, que estima diversidade genética destas espécies utilizando
dados de marcadores moleculares foi o realizado por Assis e colaboradores (2013), no qual
além de dados moleculares foram utilizados também dados de características morfológicas,
e foi verificada uma diversidade genética significativa em populações de C. adamantium e
C. pubescens.
Considerando que várias espécies endêmicas do Cerrado, incluindo as do gênero
Campomanesia sp. estão sujeitas à perda da variabilidade genética devido à constante
degradação do bioma e também em função da exploração dessas espécies ser realizada de
forma extrativista, existe um risco para a manutenção da variabilidade genética dessas
espécies. Embora alguns autores tenham avaliado a variabilidade genética existente em
algumas espécies de Campomanesia, os estudos ainda são escassos. Diante deste quadro,
evidencia-se a necessidade de estudos genético-populacionais com estas espécies, na
tentativa de implementação de programas de conservação e manutenção da variabilidade
genética, contribuindo para o manejo e uso sustentável dessas espécies.
44
3. Objetivos
O objetivo geral do trabalho foi avaliar o potencial de transferibilidade de
marcadores microssatélites gênicos desenvolvidos para Eucalyptus sp. em espécies do
gênero Campomanesia. Para tanto, os seguintes objetivos específicos foram estabelecidos:
i. Testar a amplificação cruzada de primers para amplificar regiões microssatélites derivadas
de bibliotecas EST, desenvolvidos para Eucalyptus sp., em indivíduos das espécies
Campomanesia adamantium e Campomanesia pubescens;
ii. Determinar um painel multiplex de marcadores microssatélites polimórficos, a partir dos
primers transferidos para as espécies Campomanesia adamantium e Campomanesia
pubescens;
iii. Validar os marcadores transferidos a partir da caracterização da variabilidade genética em
duas populações de cada uma das espécies de Campomanesia adamantium e
Campomanesia pubescens.
45
4. Material e Métodos
4.1 Coleta de material biológico, extração e quantificação do DNA
Parte do material vegetal utilizado neste trabalho é proveniente da Escola de
Agronomia da Universidade Federal de Goiás/Campus Samambaia, sendo coletados três
indivíduos da espécie Campomanesia adamantium, para dar início aos testes de
amplificação cruzada. Uma exsicata foi preparada para confirmação da espécie. A secagem
do material foi realizada em estufa, com o material prensado em jornal. Após a secagem, a
planta foi fixada em cartolina, com o auxilio de linha e agulha. A direita da planta foram
anexados seus dados, em uma etiqueta contendo nome científico, nome popular, local e
data da coleta, nome do coletor e o nome do botânico quem a identificou. A exsicata foi
depositada no Herbário da Universidade Federal de Goiás como holótipo para fins de
identificações posteriores.
O material utilizado para a validação dos marcadores transferidos são provenientes
na Coleção de Germoplasma de Campomanesia sp. do Cerrado, que é mantida in vivo em
uma estação experimental da Universidade Federal de Goiás, no campus Jataí, que foi
constituída entre os anos de 2009 e 2013. Foi coletado tecido foliar de 40 indivíduos da
espécie Campomanesia adamantium procedentes das populações de Mineiros/GO e Três
Ranchos/GO, e 40 indivíduos da espécie Campomanesia pubescens, procedentes das
populações de Santa Rita do Araguaia/GO e Caiapônia/GO (Tabela 2 e Figura 10).
Tabela 2. Relação das Localidades e suas respectivas coordenadas geográficas, números
de matrizes amostradas e indivíduos amostrados.
População Altitu
de (m)
Latitude
(S)
Longitu
de (W)
Número de
Matrizes
Número de
indivíduos
Coletadas coletados
Mineiros 760 17º33'88
5”
52º36'78
6” 4 20
Santa Rita do
Araguaia 704
17º22'46
2”
53º06'02
7” 4 20
Caipônia 711 16º56'00
5”
51º49'61
7” 4 20
Três Ranchos 699 18º21'88
7”
47º46'49
7” 4 20
46
Figura 10. Mapa indicando a origem do material coletado das espécies Campomanesia
adamantium e Campomanesia pubescens que faz parte da coleção “ex situ” de
germoplasma da Universidade Federal de Goiás/Campus Jataí.
A obtenção e a análise dos dados moleculares foram realizadas no Laboratório de
Genética e Biodiversidade, localizado no Instituto de Ciências Biológicas I da
Universidade Federal de Goiás, em Goiânia, GO.
Para o isolamento e posterior amplificação cruzada dos primers de regiões
microssatélites, o DNA das duas espécies de Campomanesia foi extraído a partir de tecido
foliar, utilizando o protocolo de extração proposto por Doyle e Doyle (1987). Este
protocolo utiliza o CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) como
detergente no tampão de extração. Depois de extraído, o DNA total de cada indivíduo foi
quantificado por comparação visual, utilizando a técnica de eletroforese em gel de agarose
(1%), com marcador de massa molecular o λ DNA (10, 20, 50, 100 e 200ng/μL), em uma
cuba horizontal contendo tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) (0,89M Tris, pH 8,0; 0,89M
ácido bórico; 0,02M EDTA) na concentração de 1X. Cada amostra, incluindo o marcador
de massa molecular, foi preparada contendo 4µL de tampão de carregamento.
47
A eletroforese foi submetida a uma voltagem de 70V, durante cerca de uma hora.
Para coloração do gel, foram adicionados 3µL de Brometo de Etídeo no gel. Ao final do
processo, o gel foi colocado sob luz ultravioleta para captura da imagem com o auxílio do
fotodocumentador LPIX da Loccus Biotecnologia®. Depois de quantificado, o DNA foi
diluído para uma concentração de aproximadamente 2,5 ng/µl com água estéril, para as
posteriores reações de PCR (Polimerase Chain Reaction).
4.2 Amplificação Cruzada e Genotipagem
Neste trabalho foi testado o potencial de transferibilidade de 120 pares de primers
microssatélites (Anexo II), derivados de bibliotecas EST, desenvolvidos para Eucalyptus
sp. (Brondani et al. 1998; Faria et al., 2010a; Faria et al., 2010b).
Para verificar o padrão de amplificação de cada par de primer foram utilizados três
indivíduos da espécie Campomanesia adamantium. Inicialmente foi testada a temperatura
de anelamento igual a 56ºC, a fim de possibilitar a individualização dos alelos no loco e a
obtenção dos genótipos. A padronização de amplificação foi realizada pela busca da
temperatura de anelamento ideal para cada par de primers e que apresentasse o mínimo de
amplificações inespecíficas, com o máximo de nitidez nos alelos.
A amplificação dos fragmentos de DNA foi realizada em termociclador GeneAmp
PCR System 9700 (Applied Biosystems). As reações de PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase) foram feitas em sistemas simples, onde as amostras foram amplificadas com
um par de primers de cada vez. Cada sistema de amplificação foi montado para um volume
final igual a 10 µL, conforme descrito na Tabela 3.
Tabela 3. Protocolo das Reações em Cadeia da Polimerase demonstrando os reagentes
utilizados e suas concentrações de uso e volumes, para um sistema de 10μl.
Reagentes Concentração Volume (µL) Concentração final
H2O ultrapura - 1,25 -
DNA 2,5ng/µL 3 7,5ng
Primer (F+R) 0,9µM 2,4 0,216µM
Tampão da enzima c/ MgCl2 10X 1 1x
BSA 25mg/ml 1,3 3,25mg
dNTP’s 2,5µM 0,9 0,225µM
Taq-polimerase 5 U 0,15 1 U
TOTAL - 10 -
48
Em seguida, as reações de PCR foram acondicionadas em placas e levadas ao
termociclador, que foi programado conforme os passos descritos a seguir: desnaturação do
DNA por aquecimento à 94ºC por cinco minutos; 35 ciclos de amplificação que ocorreu a
94°C por um minuto, um minuto para o anelamento dos primers (temperatura específica
para cada primer), extensão da molécula de DNA a 72ºC por um minuto, seguido de uma
extensão final de 72°C por 45 minutos. O ajuste da temperatura de anelamento dos locos
foi realizado com o aumento ou diminuição da temperatura, até que a visualização das
bandas no gel apresentasse a melhor resolução possível.
Os produtos de PCR foram primeiramente avaliados em eletroforese horizontal em
gel de agarose 3%, por aproximadamente 1 hora, imerso em TBE 1X submetido, a uma
corrente elétrica com voltagem fixa em 70V. Os produtos da amplificação foram
identificados por meio da visualização das bandas em um fotodocumentador de imagem
exposto a luz UV.
Alíquotas de cada amostra que apresentou produto de amplificação quando
observado no gel de agarose, foram submetidas à eletroforese vertical em gel desnaturante
de poliacrilamida 6%, utilizando TBE 1X. Para a visualização dos produtos amplificados,
foi realizada a coloração dos géis de poliacrilamida com nitrato de prata, seguindo o
protocolo de Creste e colaboradores (2001) (Anexo III). Após a revelação e secagem as
placas contendo os géis foram colocadas sobre a luz branca para a obtenção dos genótipos,
e os melhores locos foram determinados utilizando como parâmetro para a atribuição do
tamanho dos alelos os marcadores Ladder 10bp e/ou 50bp como padrão de peso molecular.
Essa etapa é fundamental, pois somente esse gel permite visualizar a qualidade dos
produtos de amplificação no que diz respeito à nitidez das bandas, bem como a existência
ou não de amplificação inespecífica que pode dificultar a obtenção dos genótipos.
4.3 Desenvolvimento do painel multiplex de microssatélites
Os primers que apresentaram um padrão de amplificação satisfatório, ou seja,
apresentaram um mínimo de especificidade e o máximo de nitidez dos alelos para cada
uma das espécies de Campomanesia sp. foram então avaliados em quatro indivíduos de
cada espécie, procedentes da Coleção de Germoplasma da Universidade Federal de Goiás/
Campus Jataí. Para essa etapa, os produtos de amplificação foram avaliados em
eletroforese vertical em gel desnaturante de poliacrilamida 6%, conforme descrito
anteriormente.
49
Após a verificação da qualidade de amplificação no gel de acrilamida, os pares de
primers considerados transferidos com sucesso foram avaliados quanto ao polimorfismo
em um sistema de eletroforese capilar, uma vez que os primers fowards utilizados estavam
marcados com fluorocromos HEX (verde), NED (amarelo) ou 6-FAM (azul). Para a
montagem de um sistema multiplex de aplicação com os marcadores transferidos, os
mesmos foram agrupados levando-se em consideração a amplitude do tamanho dos
fragmentos (alelos) e a cor da fluorescência. Com isso, todos os marcadores considerados
transferidos foram avaliados quanto ao polimorfismo, utilizando 40 indivíduos de cada
uma das espécies.
Depois de definidos os conjuntos de primers em cada sistema multiplex, foram
preparadas as reações reunindo quantidades específicas do produto de PCR, para cada
marcador no preparo da “placa-mãe”, a fim de otimizar a visualização dos alelos no
software de obtenção dos genótipos. Sendo assim, dependendo do resultado do
eletroferograma gerado, definiu-se as quantidades do produto de PCR nessa etapa de
padronização.
O preparo das amostras para a análise dos fragmentos constituiu-se de 1 µL da
mistura da “placa-mãe” (de um mesmo sistema multiplex) acrescido de 8,75 µL de
formamida Hi-Di (Applied Biosystems) e 0,25 µL de marcador interno fluorescente de
tamanho padrão (size standard) ROX500TM
, marcado com fluorescência vermelha. As
amostras foram desnaturadas a 95°C por 5min e posteriormente imersas em gelo durante
um período de um minuto. Finalmente, as amostras foram injetadas no analisador
automático de fragmentos ABI-3500 (Applied Biosystems), para a obtenção dos genótipos
de cada loco.
Os dados foram coletados automaticamente no software Data Collection que
detecta e estima os tamanhos dos alelos em pares de bases (pb) por meio da fluorescência
emitida. Para a filtragem dos picos, interpretação e compilação dos dados, os valores
definidos pelo Data Collection, e para a obtenção dos genótipos, os dados fornecidos pelo
analisador automático de fragmentos ABI-3500 foram avaliados e editados no software
GeneMapper 5.0 (Applied Biosystems).
Para a confirmação de cada um dos alelos em cada loco, após a conclusão da
obtenção dos genótipos de todos os indivíduos, foi realizada uma escada alélica, obtida a
partir de uma nova eletroforese capilar, contendo duas amostras de cada um dos alelos
50
existentes para cada loco, confirmando, assim, a existência e o tamanho de todos os alelos.
No caso de não confirmação de algum dos alelos, a matriz de genótipos foi revisada.
4.4 Análise dos Dados
4.4.1 Variabilidade genética nos marcadores transferidos
A fim de investigar a ocorrência de possíveis erros de genotipagem, foi utilizado o
software Micro-Checker (Van Oosterhout, 2004), que permite avaliar a existência de alelos
nulos, stutter e dropout. Portanto, para detectar a presença de alelos nulos foram realizadas
1000 reamostragens dos genótipos com um nível de significância de 95%, a frequência de
alelos nulos é calculada por indivíduo/por locos. Portanto, a análise foi realizada
comparando os genótipos, utilizando três algoritmos (Chakiraborty, Brokfield 1 e Brokfild
2), os quais estimam a frequência real do alelo nulo.
Em seguida, o conjunto de genótipos foi utilizado para as análises estatísticas
descritivas, a fim de caracterizar a variabilidade genética para cada uma das espécie de
Campomanesia utilizadas nesse estudo. Para tanto, foram avaliados o número médio de
alelos por loco (A), heterosigozidade esperada (He) ou diversidade de Nei (Nei, 1973) sob
as condições de equilíbrio de Hardy-Weinberg e heterosigozidade observada (Ho)
utilizando o software FSTAT 2.9.3 (Goudet, 2002), é obtida utilizando-se o seguinte
estimador conforme Nei (1973):
no qual n é o número de indivíduos, r é o número de locos, k é o número de alelos no loco i
e pij é a freqüência do j-ésimo alelo do i-ésimo loco. Quanto maior a equidistribuição das
frequências alélicas, maior será o valor de He, sendo que para um loco com dois alelos este
valor máximo é de 0,5 (Vencovsky, et al., 2007). A Heterozigosidade observada (Ho) foi
obtida pela fórmula proposta por Weir (1966):
f sendo assim, Ho = (-He x f) + He
O FSTAT utiliza a correção de Bonferroni para ajustar o nível de significância 5%
em função do número de testes a serem realizados. Assim cada valor de (p) gerado é
comparado com o nível de significância corrigido. O valor de (p) corresponde à
He
HoHe )(
51
probabilidade associada à observação de valores tão ou mais extremos do que os que foram
observados. Dessa forma, se o valor de (p) for menor ou igual ao nível de significância
corrigida, o índice de endogamia (f) será significativo, sendo, índices positivos, indica
excesso de homozigotos e índices negativos, excesso de heterozigotos. Se o valor de (p) for
maior que o nível de significância corrigido o índice de endogamia não será significativo,
indicando que não existem diferenças entre as frequências de He e Ho e por sua vez
corrobora que o loco está em Equilíbrio de Hardy Weinberg.
A fim de conhecer o poder de discriminação dos locos, foi estimado a probabilidade
de identidade genética (PI) (Paetkau et al., 1995), que corresponde à probabilidade de dois
indivíduos amostrados ao acaso apresentar o mesmo genótipo para um determinado loco e
a probabilidade de exclusão de paternidade (PE) (Weir, 1996), que corresponde ao poder
que determinado loco tem de excluir um indivíduo erroneamente, designado como pai,
obtidos através do software Identity 1.0 (Wagner & Sefc, 1999). De acordo com
Mommens et al. (1998), um bom microssatélite para análise de vínculo genético é aquele
que apresenta altos valores de probabilidade de exclusão de paternidade, sendo que Q
maiores que 50% são considerados satisfatórios, e que uma ótima probabilidade de
exclusão de paternidade é de 0,99. Esta probabilidade foi calculada conforme sugerido por
Evett & Weir (1998) que pode ser estimada por: generalizando para todos os locos, tem-se:
L
LQQ 11 .
Onde pu se refere às freqüências alélicas do loco u na população e Q à probabilidade de
que pelo menos um loco do sistema permita a exclusão de um dos prováveis pais.
A Probabilidade de Identidade é a probabilidade de dois indivíduos escolhidos
aleatoriamente em uma população terem genótipos idênticos. Sendo assim, bons
marcadores devem apresentar valores de PI quase nula, para demonstrar que são ótimos
para discriminar os indivíduos. A PI foi calculada segundo Paetkau et al. (1998) em que:
321
629222 223
2
4
2
2
3
nnn
anaanaanPI
Onde n é o número de amostras, ai é dado por: j
i
jp , em que pj é a freqüência do j-ésimo
alelo calculado por loco e multiplicada para todos os locos.
Além disso, foi verificado a existências de desvios do esperado para frequências
alélicas em equilíbrio de Hardy-Weinberg utilizando o software GDA (Lewis & Zaykin,
2001). . Para tal foi utilizado um teste de aleatorização dos genótipos para o cálculo das
52
probabilidades, seguindo a metodologia do Teste Exato de Fisher, utilizando a correção de
Bonferroni (Goudet, 1996).
Foi realizado o teste de desequilíbrio de ligação entre os locos, bem como as
estimativas de estruturação genética, ou seja, os valores das estatísticas F desenvolvidos
por Wright (1965), que se basea na análise de variância das frequências gênicas. Este
método mede a correlação entre frequências alélicas em diferentes níveis hierárquicos
populacionais através de três índices: FIT, FIS e FST. O FIT se refere ao índice de fixação ou
coeficiente de endogamia para o conjunto de populações (devido ao sistema reprodutivo e
subdivisão). O FIS (FIS = f) equivale ao índice de fixação ou coeficiente de endogamia
intrapopulacional (devido ao sistema reprodutivo) e o FST se refere ao índice de fixação ou
coeficiente de endogamia entre populações (devido à subdivisão). O programa calcula
estas estatísticas a partir dos estimadores f, F e θ, propostos por Weir & Cockerham
(1984), aos quais são derivados dos índices de fixação de Wright (1965), sendo utilizado o
software Fstat 2.9.3.2 (Goudet, 2002).
53
5. Resultados e Discussão
5.1 Transferibilidade e sistema multiplex de genotipagem
A transferibilidade das regiões microssatélites foi bem sucedida para as duas
espécies, utilizando um único protocolo de PCR. Os 120 primers testados foram
classificados conforme a qualidade da amplificação dos produtos de PCR nas várias
temperaturas testadas para cada par de primer (Anexo II). Do total de primers testados, 87
(72,5%) foram descartados por não apresentarem produtos de amplificação, 21 (17,5%)
amplificaram muitos fragmentos inespecíficos e 12 (10%) apresentaram um bom padrão de
amplificação (Figura 11).
Os 12 pares de primers transferidos com sucesso apresentaram polimorfismo
quando avaliados nos indivíduos procedentes da Coleção de Germoplasma da
Universidade Federal de Goiás/Campus Jataí, sendo quatro indivíduos de cada espécie
(Figura 12). Para cada um dos pares de primers foi possível padronizar uma temperatura de
anelamento, conforme descrito na Tabela 4.
Figura 11. Porcentagem de locos microssatélites ESTs com bom padrão de amplificação e
não amplificados ou inespecíficos em três indivíduos de Campomanesia
adamantium avaliados em gel de poliacrilamida.
54
Figura 12. Perfil eletroforético em gel de acrilamida 6% dos testes de polimorfismo de
alguns pares de primers com oito indivíduos, sendo quatro da espécie
Campomanesia adamantium e quatro da espécie Campomanesia pubescens.
Os primers que estão de amarelo apresentam amplificação desejada (bandas
esperadas nítidas e sem inespecificidade), bem como polimorfismo.
Segundo Barbará et al. (2007) espera-se um maior rendimento com relação à
técnica de transferibilidade em plantas dentro de gêneros (cerca de 60%) e entre gêneros
(cerca de 10%), o que confirma os resultados obtidos por Zucchi et al. (2003), onde a
amplificação cruzada foi realizada entre gêneros, retratando baixa porcentagem de
transferibilidade (2,8%), e por Alves et al. (2006), que realizou transferibilidade entre
espécies de um mesmo gênero obtendo um alto valor de transferibilidade (60,40%). Neste
sentido, o resultado obtido neste trabalho pode ser considerado satisfatório, uma vez que a
porcentagem de transferibilidade observada foi igual a 10%, que está dentro do esperado
para espécies de gêneros diferentes.
55
Tabela 4. Relação das temperaturas de anelamento testadas nos 12 pares de primers
transferidos com sucesso para as duas espécies de Campomanesia.
Primers Temperatura de Anelamento Testadas
48°C 52°C 54°C 55°C 56°C 58°C 59°C 60°C 62°C
EMBRA 809 / / ok / T / / / /
EMBRA 1076 / / / / ok T / T /
EMBRA 1335 / / / / ok T / / /
EMBRA 1362 / / / / T T ok T /
EMBRA 1363 / / / T T ok / / /
EMBRA 1364 / / / / T T ok T /
EMBRA 1374 T T T ok T T / / /
EMBRA 1470 T T T / ok T / / /
EMBRA 1811 / / / / T T / T ok
EMBRA 1868 / / / / T T / T ok
EMBRA 1939 / / T T T ok / / /
EMBRA2011 / / / / T ok / / /
T – primers testado que não foi padronizado na temperatura; TN – primers testados que
não padronizou em nenhuma temperatura; / - temperatura não utilizada nos testes; ok –
primers testados e padronizados para essa temperatura.
Os marcadores transferidos são compostos por motivos de repetição que variam, de
dois (di) a seis (hexa) nucleotídeos. Na Tabela 5 estão apresentadas as condições de
amplificação de cada um dos 12 marcadores, bem como suas respectivas amplitudes dos
tamanhos dos alelos. As condições de amplificação foram as mesmas tanto para C.
adamantium quanto para C. pubescens. A faixa de variação do tamanho dos alelos ficou
entre 199 e 384 pares de bases (pb) para as duas espécies, não havendo muita diferença
entre elas. Para cada loco, foi confirmada a existência de cada um dos alelos a partir de
uma nova eletroforese dos fragmentos amplificados obtidos pelo menor número de
indivíduos que contemplava todos os alelos de cada loco, formando uma escada alélica.
56
Tabela 5. Sequências dos pares de primers desenvolvidos para Eucalyptus sp. que amplificaram locos microssatélites em duas espécies de
Campomanesia, com as respectivas amplitudes alélicas de cada espécie e temperatura de anelamento (Ta).
Marcador Sequência dos Primers Fluorescência Ta (°C) Motivo Amplitude Alélica (pb)
C. damantium
Amplitude Alélica (pb)
C. pubescens Autor
EMBRA 809 F-5'CCTCACGCCAAAAGAAGAAG3'
NED 54ºC (CT)7* 201/227 199/225 Não publicado R-'GGGAATCGAAGAAACGATGA3'
EMBRA1076 F-5'GCTGAACCTGATGGACCAGT3'
HEX 56ºC (AGG)4* 313/331 313/331 Não publicado R-5'CTTAGGGACCACCACCTTGA3'
EMBRA1335 F-5'TTGCTCCCATGATTACTCCC3'
HEX 56ºC (GTT)5* 314/318 314/338 Não publicado R-5'GTCTTCATCCTGGCAAGAGC3'
EMBRA1362 F-5'ACTTGATGGGTTCTCATCGC3'
HEX 59ºC (TGC)6* 274/296 270/290 Não publicado R-'GGAAATCCTTACCACCAGCA3'
EMBRA1363 F-5'CCATAGCCCTCTGCTGATTC3'
HEX 58ºC (GCC)15* 304/318 304/322 Faria et al., 2010a R-5'AATGGAAAATGGGTTCCTCC3'
EMBRA1364 F-5'CGTTTTCGCTCCTCTCTCTC3'
FAM 59ºC (CTCC)15* 305/345 305/335 Faria et al., 2010b R-5'TGTAGAGATCGGGGTCCTTG3'
EMBRA1374 F-5'GTCTGAACTCGGCTTCCTTG3'
FAM 55ºC (CGCCGT)26* 354/384 354/384 Faria et al., 2010b R-5'TTCTTCCCGTTGTAAATCCG3'
EMBRA1470 F-5'GCCAACCCCTCTAAAAGACC3'
FAM 56ºC (AG)10* 321/325 321/329 Não publicado R-5'CAACTGCTACGACGTCCAAA3'
EMBRA1811 F-5'GTCGAGTTGAGTTCGCTTCC3'
NED 62ºC (CTCCTG)26* 199/203 199/203 Faria et al., 2010b R-'AGTGAATCGGGAGAGGAGGT3'
EMBRA1868 F-5'TGTGGAGCATGGAGTAGCAG3'
NED 62ºC (TC)36* 269/297 269/307 Faria et al., 2010a R-5'CAAATCTCAGAGACGCCACA3'
EMBRA1939 F-5'AGATCTCATCCATGGCGTTC3'
NED 58ºC (GCG)6* 228/250 232/252 Não publicado R-5'ACATCGCGATCTTCTTCGAC3'
EMBRA2011 F-5'AAAATACGACCGCCATGAAG3'
NED 58ºC (CTC)4* 266/298 234/300 Não publicado R-5'TTGTGAGAGACGGAGACGTG3'
*Motivo de repetição observado em Eucalyptus sp.
57
A partir dos 12 marcadores transferidos foi possível estabelecer três sistemas
multiplex para genotipagem, cada um contendo 4 pares de primers, conforme descrito na
Tabela 6. Na Figura 13 pode-se observar o perfil dos eletroferogramas dos alelos nos
diferentes multiplex. O protocolo utilizado para o preparo da placa-mãe, para cada sistema
multiplex, está descrito no Anexo IV. Com isso, a possibilidade de utilizar três sistemas
multiplex para analisar 12 marcadores, permite tonar mais eficiente a obtenção dos dados,
diminuindo o tempo e reduzindo os custos dos reagentes utilizados no analisador
automático de fragmentos.
Esta abordagem tem sido utilizada por alguns autores na caracterização de locos
microssatélites em espécies nativas. No trabalho de Barreto (2010), foi realizado sistema
multiplex para 10 locos microssatélites, de modo a maximizar a quantidade de locos
analisados simultaneamente. Braga e colaboradores (2006) desenvolveram, a partir de 12
locos microssatélites, 4 sistemas multiplex, cada um com 3 primers, demonstrando boa
eficiência na detecção dos genótipos em Tabebuia aurea.
Tabela 6. Relação dos sistemas multiplex e seus respectivos primers com fluorescência e
amplitude alélica.
Multiplex Primer Fluorescência
Amplitude
Alélica
1
EMBRA 809 NED /
Amarelo 199/227
EMBRA 1335 HEX / Verde 314/338
EMBRA 1364 FAM / Azul 305/345
EMBRA 2011 NED /
Amarelo 266/300
2
EMBRA 1363 HEX / Verde 304/322
EMBRA 1374 FAM / Azul 354/384
EMBRA 1811 NED /
Amarelo 199/203
EMBRA 1868 NED /
Amarelo 269/307
3
EMBRA 1076 HEX / Verde 313/331
EMBRA 1362 HEX / Verde 270/296
EMBRA 1470 FAM / Azul 321/329
EMBRA 1939 NED /
Amarelo 228/252
58
Figura 13. Perfis dos eletroferogramas apresentados por doze locos polimórficos de Eucalyptus sp.
transferidos para Campomanesia adamantium e Campomanesia pubescens (EMBRA
809, EMBRA 1335, EMBRA 1364, EMBRA 1363, EMBRA 1362, EMBRA 1470,
EMBRA 1939, EMBRA2011, EMBRA 1374, EMBRA 1076, EMBRA 1811, EMBRA
1868), organizados em três sistemas multiplex de genotipagem.
59
Foi realizada uma análise de qualidade da genotipagem, na qual os genótipos
obtidos foram submetidos a uma análise de qualidade de genotipagem utilizando o
software MICRO-CHEKER. A análise mostrou-se significativa para os seguintes locos
EMBRA 1364, EMBRA 1374 (C. adamantium), EMBRA 1335, EMBRA 1364, EMBRA
2011, EMBRA 809, EMBRA 1374 e EMBRA 1470 (C. pubescens). A presença de alelos
nulos é comum em marcadores transferidos, uma vez que existe possibilidade de ter havido
mutação em alguma parte da região de anelamento do primer. No entanto, um estudo mais
detalhado precisa ser realizado, uma vez que pode haver excesso de homozigoto em função
de características da biologia reprodutiva da espécie ou também de alguns processos
microevolutivos atuando nas populações naturais.
Estes erros são frequentemente observados e ocorrem quando o genótipo
determinado após a análise molecular não corresponde ao genótipo real do indivíduo
considerado, podendo ocorrer em qualquer um dos passos da genotipagem (Bonin et al.,
2004; Pompanon et al., 2005), sendo esta informação de extrema importância para estudos
de genética de populações, em que o alelo nulo leva à superestimativa aparente de
homozigotos, resultando em estimativas de frequência alélica incorreta e superestimando
coeficientes de endogamia.
Quando se utilizam primers heterólogos (transferidos de outras espécies) é muito
provável encontrar na espécie alvo, altas incidências de alelos nulos ou frequências
genotípicas diferentes das esperadas no EHW (Robinson e Harris, 1999; Chapuis e Estoup,
2007), portanto estes resultados podem ser erros inerentes ao processo de transferibilidade,
e não de erros do sistema de detecção utilizado na genotipagem.
5.2 Variabilidade genética em Campomanesia adamantium
Para a espécie C. adamantium o número médio de alelos nos 12 locos
microssatélites polimórficos foi igual a 6,8 (Figura 14 e Tabela 7), variando entre 2
(EMBRA 1335 e EMBRA 1811) e 16 (EMBRA 1364). Os níveis de polimorfismo
observados para os locos transferidos são semelhantes e, em alguns casos, até maiores
quando comparados com as espécies para as quais foram desenvolvidos os SSR (Faria et
al., 2010a; 2010b), como é o caso do marcador EMBRA 1364 que apresenta mais alelos
para C. adamantium em relação a espécie para qual foi desenvolvido.
O polimorfismo de determinado loco pode estar positivamente correlacionado com
a natureza gênica ou genômica, com os tipos de motivos de repetição destas regiões (mono,
60
di, tri, tetra, penta ou hexa), e o número de repetições dos motivos e interrupções nas
repetições (Weber, 1990; Ellegren, 2004). De fato, os locos que apresentaram menor
polimorfismo para Campomanesia adamantium foram EMBRA 1335 (GTT)5, EMBRA
1076 (AGG)4, ambos apresentando pequeno número de repetições, além de serem
trinucleotídeos.
Por outro lado, os locos mais polimórficos foram EMBRA 1364 (CTCC)15 e
EMBRA 1868 (TC)36, apresentando maiores extensões da repetição. No caso do EMBRA
1868 espera-se maior polimorfismo também pelo fato de ser um dinucleotídeo, pois este
tipo de motivo, por ser menor, está mais sujeito ao slippage e, com isso, as mutações
podem ser mais frequentes (Ellegren, 2004), explicando o grande número de alelos
encontrado para este loco.
Figura 14. Representação do polimorfismo encontrado nos 12 locos transferidos para
Campomanesia adamantium.
C. adamantium
61
Tabela 7. Relação dos 12 marcadores avaliados em 40 indivíduos de C. adamantium com
seus respectivos números de alelos por loco (A), heterozigosidade esperada
(He), observada (Ho), probabilidade de exclusão de paternidade (PE) e
probabilidade de identidade (PI).
Marcador A He Ho PE PI
EMBRA 809 8 0,731 0,625 0,487 0,122
EMBRA 1076 3 0,541 1,00 0,232 0,324
EMBRA 1335 2 0,025 0,025 0,012 0,951
EMBRA 1362 10 0,832 0,832 0,653 0,053
EMBRA 1363 6 0,826 0,825 0,632 0,059
EMBRA 1364 16 0,927 0,750 0,829 0,013
EMBRA 1374 8 0,788 0,256 0,579 0,078
EMBRA 1470 3 0,142 0,125 0,068 0,746
EMBRA 1811 2 0,025 0,025 0,012 0,951
EMBRA 1868 11 0,820 0,825 0,646 0,055
EMBRA 1939 8 0,643 0,700 0,426 0,164
EMBRA 2011 5 0,167 0,175 0,088 0,700
Média 6,833 0,539 0,504 0,999 5,718 x 10-10
A partir dos 12 locos utilizados foi possível verificar um total de 82 alelos para
Campomanesia adamantium. As frequências alélicas para os indivíduos avaliados, para
cada loco, estão apresentadas nas Figuras 15 e 16. O padrão de distribuição de frequências
alélicas de todos os locos analisados não foi uniforme, demonstrando poucos alelos com
uma frequência alta, e alguns locos com vários alelos de baixa frequência (<0,05).
De um modo geral a variabilidade genética em Campomanesia adamantium foi
alta, considerando o conjunto de locos microssatélites. O loco EMBRA 1364 apresentou a
maior heterozigosidade esperada (He = 0,927), enquanto os locos EMBRA 1335 e
EMBRA 1811 o menor valor (He = 0,025), com uma média de 0,539. Os valores de
heterozigosidade observada foram maiores para o loco EMBRA 1076 (Ho = 1,00) e menor
para os locos EMBRA 1335 e EMBRA 1811(Ho = 0,025) e uma média de todos os locos
igual a 0,504. Dos 12 locos microssatélites, três locos apresentaram heterozigosidade
observada maior do que a esperada (EMBRA 1076, EMBRA 1939 e EMBRA 2011)
demonstrando um excesso de heterozigotos. Em contrapartida, dois locos apresentaram
valores de heterozigosidade observada bem abaixo da esperada (EMBRA 1364 e EMBRA
1374), essa baixa heterozigosidade pode ser devido à presença de alelos nulos (Callen et
al., 1993), os quais acarretam desvios em relação às heterozigosidade esperadas por Hardy-
Weinberg, devido ao excesso de homozigoto (Tabela 7).
C. adamantium
62
Figura 15. Histograma das frequências alélicas de 6 locos microssatélites dos 12 transferidos, estimado para 40 indivíduos da espécie C.
adamantium. O eixo Y indica as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos.
63
Figura 16. Histograma das frequências alélicas de 6 locos microssatélites dos 12 transferidos, estimado para 40 indivíduos da espécie C.
adamantium. O eixo Y indica as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos.
64
Portanto, pode-se verificar que esse conjunto de locos permite uma detecção de alta
variabilidade genética, permitindo um bom poder de discriminação individual, por
apresentarem polimorfismo considerável, levando em consideração que o alelo mais
comum tem que ter frequência menor que 99% e o polimorfismo têm que ser exibido em
pelo menos um indivíduo da amostra (Cole, 2003).
O teste de aderência ao equilíbrio Hardy-Weinberg (Tabela 8) indicou desvios na
proporção do EHW em pelo menos cinco locos em cada uma das quatro populações de C
adamantium, sendo que sete locos estão sob o EHW em todas as populações (EMBRA
1335, EMBRA 1362, EMBRA 1363, EMBRA 1811, EMBRA 1868, EMBRA 1939 e
EMBRA 2011). Portanto dos 12 locos avaliados cinco locos não estão sob o equilíbrio de
Hardy-Weinberg.
Tabela 8. Teste exato Fisher de aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg em duas
populações de Campomanesia adamantium para cada loco.
Locos
População
Mineiros Três Ranchos
EMBRA 809 0,041* 0,002*
EMBRA 1076 0,000* 0,0001*
EMBRA 1335 1,000 1,000
EMBRA 1362 0,295 0,654
EMBRA 1363 0,568 0,249
EMBRA 1364 0,0001* 0,323
EMBRA 1374 0,000* 0,000*
EMBRA 1470 1,000 0,023*
EMBRA 1811 1,000 1,000
EMBRA 1868 0,765 0,620
EMBRA 1939 0,482 0,091
EMBRA 2011 1,000 1,000
*Valores significativos p < 0,05.
No entanto é pouco provável que estes desvios observados sejam todos devidos à
presença de alelos nulos, pois nem todos os locos que se desviaram do EHW apresentaram
alelos nulos, e também alguns dos locos que apresentaram alelos nulos se encontram sob o
EHW. Neste caso esse resultado pode ser em função do tamanho amostral reduzido.
A probabilidade de exclusão de paternidade (PE) variou de 0,012 (EMBRA 1335 e
EMBRA 1811) a 0,829 (EMBRA 1364), apresentando um valor combinado igual a
0,99939 (Tabela 7). A probabilidade de identidade (PI) variou de 0,951 (EMBRA 1335 e
EMBRA 1811) a 0,013 (EMBRA 1364), apresentando um valor combinado igual a 5,718 x
65
10-10
(Tabela 7). Esses valores combinados obtidos pode ser considerados adequados, uma
vez que tem sido utilizado com sucesso em outros trabalhos com espécies vegetais
(Collevatti et al., 1999; Collevatti et al., 2001; Rodrigues et al., 2002; Braga et al., 2007).
A análise de desequilíbrio de ligação (DL) para os locos de Campomanesia
adamantium (Anexo V), indicou que um par de locos está em desequilíbrio de ligação. Isto
indica que esses locos não estão localizados em cromossomos diferentes ou
suficientemente afastados um do outro de modo que possa ocorrer uma recombinação entre
seus alelos, ou seja, eles não estão em associação aleatória (Hartl, Clark, 2010). Esta
informação é relevante, pois o equilíbrio de ligação garante a transmissão independente e
mendeliana dos locos através das gerações.
O padrão de diversidade genética nas populações foi acessado pela medida de
diversidade de Nei (1973) e o número médio de alelos por loco (A). A média da
diversidade genética de Nei (1973) nas duas populações de C. adamantium foi de 0,517,
enquanto que a média de alelos por loco foi de 5,500. A heterozigosidade média observada
(HO) para as duas populações foi de 0,504 (Tabela 9).
Comparando estes valores com outros encontrados na literatura pode-se concluir
que existe uma moderada diversidade genética nas populações de C. adamantium. Zucchi e
colaboradores (2003) utilizaram dez locos microssatélites desenvolvidos para Eucalyptus
sp. e estimaram para dez populações de Eugenia dysenterica, uma espécie arbórea do
Cerrado brasileiro, uma heterozigosidade esperada média de 0,442.
Tabela 9. Estimativas de parâmetros genéticos de diversidade e estrutura genética em duas
populações de Campomanesia adamantium, sendo (A) número médio de alelos;
heterozigosidade esperada (He), heterozigosidade observada (Ho), índice médio
de fixação dentro das populações (f), índice de fixação total das populações (F)
e divergência genética entre populações (θp).
População A He Ho f F θp
Mineiros 5,75 0,531 0,504 0,052
0,306 0,105 Três Ranchos 5,25 0,504 0,505 -0,002
Média 5,5 0,517 0,504 0,025
* Níveis de significância foram ajustados através da correção sequencial de Bonferroni (p-
valor de 5% = p ≤ 0,00208).
Martins e colaboradores (2006) utilizando cinco locos microssatélites
desenvolvidos para Capsicum spp. encontraram baixos valores de heterozigosidade
esperada (He = 0,331) entre quatro populações de Solanum lycocarpum, um arbusto
66
lenhoso do Cerrado brasileiro. Por outro lado, Assis e colaboradores (2013) analisaram 140
matrizes de gabirobeiras representantes de populações nativas, para a avaliação da
variabilidade genética com base em dados morfológicos e moleculares baseados em
marcadores moleculares RAPD e observaram uma taxa de polimorfismo superior a 60%,
na analise molecular.
O índice de fixação total (F), considerando as populações de C. adamantium, foi
significativamente diferente de zero e igual a 0,306 (Tabela 9), sugerindo que a
variabilidade genética está estruturada dentro e entre as populações. Essa hipótese foi
confirmada com a avaliação da divergência genética (θp) entre populações de C.
adamantium que foi igual a 0,105 (Tabela 9). No componente do índice de fixação
intrapopulacional (f) nas populações de C. adamantium não foi significativamente
diferente de zero, e assumiu valor igual a 0,025, variando entre 0,052 (Mineiros) e -0,002
(Três Ranchos).
Sendo assim, 10% da variabilidade genética total encontra-se entre as populações e
90% desta variabilidade ocorre dentro das populações. Hamrick e Godt (1989) e Reis
(1996), dentre outros, demonstraram que as espécies de fecundação cruzada, portanto, com
um maior potencial de movimentação de genes, são tipicamente caracterizadas por altas
taxas de diversidade intrapopulacional e pouca diversidade entre as populações. Neste
caso, os resultados encontrados indicam que provavelmente esta espécie de Campomanesia
damantium seja alógama, porém, estudos mais detalhados a cerca do sistema reprodutivo
da espécie se fazem necessários.
5.3 Variabilidade genética em Campomanesia pubescens
Os doze locos microssatélites polimórficos avaliados nos indivíduos de C.
pubescens apresentaram um número médio de alelos igual a 7,8, variando entre 2
(EMBRA 1811 e EMBRA 1076) e 16 (EMBRA 2011) alelos nos locos (Figura 17 e Tabela
10). Os níveis de polimorfismo observados para os locos transferidos são semelhantes aos
observados nas espécies para as quais foram desenvolvidos os marcadores microssatélites
(Faria et al., 2010a, Faria et al., 2010b). Dois locos foram menos polimórficos, EMBRA
1076 (AGG)4 que é um trinucleotídeo que apresenta pequeno número de repetições,
corroborando com o que foi descrito por Wierdl (1997), em que microssatélites com um
menor número de repetições são menos mutáveis, independentemente do motivo, devido à
menor probabilidade de slippage. O outro loco menos polimórfico foi o EMBRA 1811
67
(CTCCTG)26, que embora tenha um grande número de repetições, é um hexanucleotídeo e
está inserido em um gene, provavelmente diminuindo a chance de acumular mutações.
Esse resultado foi diferente do apresentado para C. adamantium.
Diferente do que está previsto na literatura, o loco que apresentou maior
polimorfismo foi o EMBRA 2011 (CTC)4, que é um trinucleotídeo com poucas repetições.
Neste caso, como estes locos não foram desenvolvidos para Campomanesia pubescens
pode-se sugerir que os motivos de repetição podem ter acumulado mutações, ou o número
de repetições não deve ter se mantido entre as espécies.
Figura 17. Representação do polimorfismo encontrado nos 12 locos transferidos para
Campomanesia pubescens.
A partir dos 12 locos microssatélites utilizados foi verificado um total de 95 alelos
para Campomanesia pubescens. As frequências alélicas, para cada loco, e para os 40
indivíduos avaliados, estão apresentadas nas Figuras 18 e 19. O padrão de distribuição de
frequências alélica de C. pubescens seguiu o mesmo padrão encontrado em C.
adamantium, demonstrando poucos alelos com uma frequência alta, e alguns locos com
vários alelos de baixa frequência (<0,05).
A diversidade genética, considerando o conjunto de locos microssatélites avaliados,
foi maior no loco EMBRA 1868, com a heterozigosidade esperada (He) igual a 0,921. Por
outro lado, o loco EMBRA 1811 apresentou menor valor de He (0,073), com uma média
de 0,639. Os valores de heterozigosidade observada foram maior no loco EMBRA 1868
(Ho = 0,850) e menor no loco EMBRA 1811(Ho = 0,075) e uma média igual a 0,503
(Tabela 10). Neste casso, da mesma forma como foi observado para C. adamantium, pode-
68
se verificar que esse conjunto de locos permite a detecção de alta variabilidade genética,
permitindo um bom poder de discriminação individual por apresentarem polimorfismo
considerável.
Dos 12 locos microssatélites transferidos para C. pubescens, três locos
apresentaram heterozigosidade observada maior do que a esperada (EMBRA 1076,
EMBRA 1811 e EMBRA 1939) demonstrando um excesso de heterozigotos, e em
contrapartida, os demais locos apresentaram valores de heterozigosidade observada
menores do que a esperada, essa baixa heterozigosidade pode ser devido à presença de
alelos nulos (Callen et al., 1993), os quais acarretam desvios em relação às
heterozigosidade esperadas por Hardy-Weinberg, devido ao excesso de homozigoto
(Tabela 10).
Tabela 10. Relação dos 12 marcadores avaliados em 40 indivíduos de C. pubescens com
seus respectivos números de alelos por loco (A), heterozigosidade esperada
(He), observada (Ho), probabilidade de exclusão de paternidade (PE) e
probabilidade de identidade (PI).
C. pubescens
Loco A He Ho PE PI
EMBRA 809 6 0,614 0,324 0,4301 0,159
EMBRA 1076 2 0,202 0,225 0,089 0,660
EMBRA 1335 7 0,730 0,500 0,475 0,126
EMBRA 1362 7 0,814 0,700 0,617 0,065
EMBRA 1363 8 0,818 0,775 0,622 0,063
EMBRA 1364 12 0,741 0,625 0,552 0,091
EMBRA 1374 7 0,692 0,325 0,434 0,152
EMBRA 1470 5 0,584 0,175 0,358 0,215
EMBRA 1811 2 0,073 0,075 0,034 0,863
EMBRA 1868 15 0,921 0,850 0,816 0,015
EMBRA 1939 7 0,582 0,800 0,343 0,227
EMBRA 2011 16 0,895 0,666 0,768 0,023
Média 7,833 0,639 0,503 0,999 1,182 x 10-11
69
Figura 18. . Histograma das frequências alélicas de 6 locos microssatélites dos 12 transferidos, estimado para 40 indivíduos da espécie C.
pubescens. O eixo Y indica as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos.
70
Figura 19. Histograma das frequências alélicas de 6 locos microssatélites dos 12 transferidos, estimado para 40 indivíduos da espécie C.
pubescens. O eixo Y indica as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos
71
Portanto, verifica-se que esse conjunto de locos permite a detecção de alta
variabilidade genética, permitindo um bom poder de discriminação individual por
apresentarem polimorfismo considerável. Considerado que o alelo mais comum tem que
ter frequência menor que 99% e o polimorfismo têm que ser exibido em pelo menos um
indivíduo da amostra (Cole, 2003).
O teste de aderência ao equilíbrio Hardy-Weinberg (Tabela 11) indicou desvios na
proporção do EHW em pelo menos 4 locos em cada uma das duas populações de
Campomanesia pubescens, sendo que somente 5 locos estão sob o EHW, para as
populações em estudo (EMBRA 1076, EMBRA 1335, EMBRA 1362, EMBRA 1364,
EMBRA 1811). Portanto dos 12 locos avaliados 7 locos não estão sob o equilíbrio de
Hardy-Weinberg.
No entanto, é pouco provável que estes desvios observados sejam todos devido à
presença de alelos nulos, pois conforme foi observado em C. adamantium nem todos os
locos que se desviaram do EHW apresentaram alelos nulos, e também alguns dos locos que
apresentaram alelos nulos se encontram sob o EHW. Neste caso esse resultado também
pode ser em função do tamanho amostral reduzido.
Tabela 11. Teste exato de Fisher de aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg em 2
populações de Campomanesia pubescens para cada loco.
Locos
Populações
Santa Rita Caiapônia
EMBRA 809 0,123 0,0003*
EMBRA 1076 0,330 1,000
EMBRA 1335 0,150 0,135
EMBRA 1362 0,195 0,96
EMBRA 1363 0,040* 0,965
EMBRA 1364 0,268 0,123
EMBRA 1374 0,0003* 0,305
EMBRA 1470 0,000* 1,00
EMBRA 1811 1,00 1,00
EMBRA 1868 0,268 0,021*
EMBRA 1939 0,949 0,022*
EMBRA 2011 0,004* 0,624
*Valores significativos p < 0,05.
A probabilidade de exclusão de paternidade (PE) variou entre 0,034 (EMBRA
1811) a 0,816 (EMBRA 1868), apresentando um valor combinado igual a 0,99982 (Tabela
72
10). A probabilidade de identidade (PI), variou de 0,863 (EMBRA 1811) a 0,015 (EMBRA
1868) apresentando um valor combinado igual a 1,182 x 10-11
(Tabela 10). Esses valores
combinados obtidos pode ser considerados adequados, uma vez que tem sido utilizado com
sucesso em outros trabalhos com espécies vegetais (Collevatti et al., 1999; Collevatti et al.,
2001; Rodrigues et al., 2002; Braga et al., 2007).
A análise do desequilíbrio de ligação (DL), para os locos de Campomanesia
pubescens (Anexo V), indicou que 9 pares de locos estão em desequilíbrio de ligação.
Como foi observado em C. adamantium, esses locos provavelmente não estão localizados
em cromossomos diferentes ou suficientemente afastados um do outro de modo que possa
ocorrer uma recombinação entre seus alelos, ou seja, eles não estão em associação aleatória
(Hartl, Clark, 2010). Sendo esta informação relevante, pois o equilíbrio de ligação garante
a transmissão independente e mendeliana dos locos através das gerações.
O padrão de diversidade genética nas populações foi acessado pela medida de
diversidade de Nei (1973) e o número médio de alelos por loco (A). A média da
diversidade genética de Nei (1973) nas duas populações de C. pubescens foi de 0,579,
enquanto que a média de alelos por loco foi de 5,833. A heterozigosidade média observada
(HO) para as duas populações foi de 0,503 (Tabela 12).
Tabela 12. . Estimativas de parâmetros genéticos de diversidade e estrutura genética em 2
populações de Campomanesia pubescens, (A) número médio de alelos;
heterozigosidade esperada (He), heterozigosidade observada (Ho), índice
médio de fixação dentro das populações (f), índice de fixação total das
populações (F) e divergência genética entre populações (θp).
População A He Ho f F θp
Santa Rita
do Araguaia 6,5 0,629 0,498 0,213
0,422 0,249 Caiapônia 5,16 0,529 0,507 0,042
Média 5,83 0,579 0,503 0,138
* Níveis de significância foram ajustados através da correção sequencial de Bonferroni (p-
valor de 5% = p ≤ 0,00208).
O valor de diversidade genética encontrada nesse estudo é considerado
relativamente moderado, comparado com os valores encontrados por Siqueira e
colaboradores (2010) utilizando nove locos microssatélites desenvolvidos para Manihot
esculenta em que encontraram altos valores de heterozigosidade esperada (0,668) entre 83
acessos de mandioca, incluindo diversas variedades crioulas do Cerrado no Mato Grosso
do Sul. Ritter e colaboradores (2012) utilizando oito locos microssatélites desenvolvidos
73
para Qualea grandiflora, encontraram valores moderados de heterozigosidade esperada
(He = 0,568) em 110 indivíduos coletados a partir de um fragmento de cerrado em São
Paulo. Sendo este valor bem próximo dos encontrados neste estudo para C. pubescens.
O índice de fixação total (F), considerando as populações de C. pubescens, foi
significativamente diferente de zero e igual a 0,422 (Tabela 12), sugerindo que a
variabilidade genética está estruturada dentro e entre as populações. Essa hipótese foi
confirmada com a avaliação da divergência genética (θp) entre populações de C. pubescens
que foi igual a 0,249 (Tabela 12). O componente do índice de fixação intrapopulacional (f)
nas populações de C. pubescens não foi significativamente diferente de zero, e assumiu
valor igual a 0,138, variando entre 0,213 (Santa Rita) e 0,042 (Caiapônia).
Portanto, 24,9% da variabilidade genética total encontra-se entre as populações e
75,1% desta variabilidade ocorre dentro das populações. Neste caso, estes resultados
também se enquadram nas mesmas suposições feitas para C. adamantium de que
provavelmente esta espécie seja realmente alógama como sugerido por Proença e Gibbs,
(1994) e Borém, (2009), ou de sistema misto como relatado por Torezan e Del Claro
(1998) também em um estudo com Campomanesia pubescens. Sendo que, para
confirmação destas suposições, estudos mais detalhados em relação ao sistema de
cruzamento destas duas espécies do gênero Campomanesia se fazem necessários.
74
6. Conclusões
i. Houve sucesso na transferibilidade de primers de regiões microssatélites gênicas
para Campomanesia adamantium e Campomanesia pubescens;
ii. Foi possível estabelecer três sistemas multiplex para os 12 marcadores
microssatélites polimórficos, transferidos para as espécies Campomanesia
adamantium e Campomanesia pubescens;
iii. Não foi verificado endogamia e a variabilidade genética está estruturada entre e
dentro das populações de Campomanesia adamantium e Campomanesia pubescens.
75
7. Referências Bibliográficas
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90
Anexos
Anexo I
Protocolo de extração de DNA de tecido vegetal: (Doyle e Doyle, 1987)
PROCEDIMENTOS
1. Preparo do Material
» Primeiro verifique se todas as soluções estão preparadas;
» Ligue o banho-maria a 65ºC;
» Prepare três conjuntos idênticos de tubos devidamente numerados (2 conjuntos de
tubos de 2ml e 1 conjunto de 1,5ml);
» Anote na ata de laboratório a correspondência entre os números nos tubos e a
identificação das amostras;
» Para cada extração serão utilizados 1mL de tampão de extração. Calcule a
quantidade total necessária de tampão de extração multiplicando o número de
amostras + 1 (para segurança) por 1mL.
*Adicione 2-mercapto-etanol à quantidade necessária de tampão, na proporção de
2μl de 2-mercapto-etanol para cada ml de tampão de extração. Mantenha tampão de
extração quecido em banho-maria a 65ºC.
2. Pese 50 a 200 mg de tecido fresco para cada amostra diretamente dentro do tubo.
Quantidades em torno de 150 mg são geralmente ideais;
» Se estiver utilizando folhas, corte-as em tiras de aproximadamente 3 a 5 mm de
largura;
» Disponha as tiras aproximadamente 3 a 5mm de tecidos dentro do tubo
verticalmente de maneira a permitir a maceração do tecido contra as paredes do tubo.
Utilização das beads:
Beads menores de zircônio, colocar até 10 esferas em cada tubo Eppendorf de uma forma
que fiquem espalhadas no meio do tecido;
Adicionar no tubo, já com as folhas e as beads, 700μl tampão de extração mais 2-
mercapto-etanol e macerar o tecido utilizando o macerador Mini Beadbeater-96, por 2
minutos. OBS: este é um tempo estimado, depente do tipo de tecido a ser macerado;
91
Beads maiores de metal ou porcelana, colocar 2 beads em cada tubo Eppendorf, uma em
baixo (de forma esférica) do tecido e a outra em cima (de forma poliédrica), como se fosse
um sanduiche.Adicionar no tubo, já com as folhas e as beads, 700μl tampão de extração
mais 2-mercapto-etanol e macerar o tecido utilizando o macerador Mini Beadbeater-96,
por 20 a 25 segundos. OBS: este é um tempo estimado, então depente do tipo de tecido a
ser macerado. Agite no vórtex e misture bem.
3. Incube os tubos em banho-maria a uma temperatura de 65ºC por um mínimo de 30
minutos
» Durante a incubação, agite os tubos a cada 10 minutos para homogeneizar;
» Retire os tubos do banho-maria;
» Deixe-os chegar a temperatura ambiente;
4. Em capela de exaustão, faça a primeira extração com solvente orgânico adicionando
600μl de CIA (clorofórmio-álcool isoamílico 24:1)
» Agite os tubos no vórtex e depois invertendo-os durante 5 minutos (no mínimo 20
vezes), ou até fazer uma emulsão homogênea;
5. Centrifugue os tubos em microcentrífuga a velocidade máxima (14000 rpm) durante 5
minutos.
6. Retire cuidadosamente os tubos da centrífuga, evitando perturbar a interface entre
as duas fases formadas » Pipete a fase superior (aquosa) para um novo tubo;» Para
acelerar esta operação regule a pipeta para 180 e retire 3 alíquotas (~540) fixas.
Mesmo que isso implique em deixar algum volume para trás, este procedimento ajuda a
evitar possíveis contaminações com a fase orgânica inferior.
7. À fase aquosa no novo tubo adicione 1/10 do volume (~50) de uma solução 10% CTAB,
1,4 M NaCl (solução bastante viscosa);
» Agite no vórtex e misture bem durante 5 minutos até homogeneizar a solução.
8. Repita a extração com 600μl de CIA (passos 7 e 8);
» Em capela de exaustão, faça a primeira extração com solvente orgânico adicionando
600μl de CIA (clorofórmio-alcool isoamílico) 24:1);
92
» Agite os tubos no vórtex e depois invertendo-os durante 5 minutos (no mínimo 20
vezes) ou até fazer uma emulsão homogênea;
9. Centrifugue os tubos em microcentrifuga a velocidade máxima (1200 rpm) durante 5
minutos.
10. Retire novamente a fase aquosa superior e transfira-a, cuidadosamente, para um novo
tubo.
11. Adicione 2/3 do volume da solução aquosa (~ 400 μl) de isopropanol gelado (-20ºC).
» Misture calmamente para precipitar os ácidos nucléicos;
» Leve os tubos ao freezer -20°C por 1 a 2 horas (isso vai depender do tipo de
tecido a ser extraído).
Este é um ponto adequado para parar o procedimento de extração se não for
possível continuar no mesmo dia. (se for pode deixar para outro dia a qualidade do
DNA será menor).
Precipitação e quantificação do DNA.
12. Centrifugue os tubos a 7500 rpm em microcentrífuga durante 5 minutos, para formar
um pellet.
Se o pellet não for visível coloque o tubo a -20° por 30 minutos ou mais, e
centrifugue novamente
Se o pellet obtido se apresentar muito grande, viscoso e/ou escuro é sinal de
contaminantes – Deve-se fazer uma LAVAGEM COM NaCl – VER NAS
OBSERVAÇÕES
13. Com cuidado derrame o máximo possível de sobrenadante sem perder o pellet
14. Lave o pellet 2 vezes em 1mL de etanol 70%
» Deixe o pellet imerso por 10 minutos cada vez;
» Descarte o etanol;
15. Lave o pellet 1 vez em 1mL de etanol 95% (ou absoluto) durante 3 minutos
» Retire o máximo possível do etanol, deixando secar (utilizar Concentrador Plus);
16. Ressuspender o pellet em 50l ou 100l de TE com RNAse
93
Observações: Pode deixar
» No banho maria por 37ºC por 4 horas;
» Ou deixar em over- night na geladeira.
Anexo II
Relação das temperaturas de anelamento testadas nos 120 pares de primers
otimizados para as duas espécies de Campomanesia.
Primers Temperatura de Anelamento Testadas
48°C 52°C 54°C 55°C 56°C 58°C 59°C 60°C 62°C
EMBRA 12 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 13 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 14 x x x / x / / / /
EMBRA 15 x x x / x / / / /
EMBRA 16 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 809 / / ok / T / / / /
EMBRA 813 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 835 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 850 x x x / x / / / /
EMBRA 870 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA878 x x x / x / / / /
EMBRA 914 x x x / x / / / /
EMBRA 915 x x x / x / / / /
EMBRA 904 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 925 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 928 x x x / x / / / /
EMBRA 941 x x x / x / / / /
EMBRA 943 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 949 x x x / x / / / /
T – primers testados mas que não otimizaram nesta temperatura; TN – primers testados
mas que não otimizaram em nenhuma das temperaturas; x – primers testados mas
descartados; / - temperatura não utilizada nos testes; ok – primers testados e otimizados
nesta temperatura.
94
Primers Temperatura de Anelamento Testadas
48°C 52°C 54°C 55°C 56°C 58°C 59°C 60°C 62°C
EMBRA 954 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 975 x x x / x / / / /
EMBRA 979 x x x / x / / / /
EMBRA 1007 x x x / x / / / /
EMBRA 1008 x x x / x / / / /
EMBRA1039 x x x / x / / / /
EMBRA 1040 x x x / x / / / /
EMBRA 1041 x x x / x / / / /
EMBRA 1056 x x x / x / / / /
EMBRA 1057 x x x / x / / / /
EMBRA 1071 x x x / x / / / /
EMBRA 1076 / / / / ok T / T /
EMBRA 1081 x x x / x / / / /
EMBRA 1122 x x x / x / / / /
EMBRA 1133 x x x / x / / / /
EMBRA 1135 x x x / x / / / /
EMBRA 1142 x x x / x / / / /
EMBRA 1144 x x x / x / / / /
EMBRA 1193 x x x / x / / / /
EMBRA 1211 x x x / x / / / /
T – primers testados mas que não otimizaram nesta temperatura; TN – primers testados
mas que não otimizaram em nenhuma das temperaturas; x – primers testados mas
descartados; / - temperatura não utilizada nos testes; ok – primers testados e otimizados
nesta temperatura.
95
Primers Temperatura de Anelamento Testadas
48°C 52°C 54°C 55°C 56°C 58°C 59°C 60°C 62°C
EMBRA 1213 x x x / x / / / /
EMBRA 1284 x x x / x / / / /
EMBRA 1307 x x x / x / / / /
EMBRA 1310 x x x / x / / / /
EMBRA 1314 x x x / x / / / /
EMBRA 1316 x x x / x / / / /
EMBRA 1319 x x x / x / / / /
EMBRA 1320 x x x / x / / / /
EMBRA 1326 x x x / x / / / /
EMBRA 1332 x x x / x / / / /
EMBRA 1333 x x x / x / / / /
EMBRA 1335 / / / / ok T / / /
EMBRA 1341 x x x / x / / / /
EMBRA 1346 x x x / x / / / /
EMBRA 1362 / / / / T T ok T /
EMBRA 1363 / / / T T ok / / /
EMBRA 1364 / / / / T T ok T /
EMBRA 1374 T T T OK T T / / /
EMBRA 1382 x x x / x / / / /
EMBRA 1390 x x x / x / / / /
T – primers testados mas que não otimizaram nesta temperatura; TN – primers testados
mas que não otimizaram em nenhuma das temperaturas; x – primers testados mas
descartados; / - temperatura não utilizada nos testes; ok – primers testados e otimizados
nesta temperatura.
96
Primers Temperatura de Anelamento em Testadas
48°C 52°C 54°C 55°C 56°C 58°C 59°C 60°C 62°C
EMBRA 1398 x x x / x / / / /
EMBRA 1427 x x x / x / / / /
EMBRA 1428 x x x / x / / / /
EMBRA 1441 x x x / x / / / /
EMBRA 1445 x x x / x / / / /
EMBRA 1450 x x x / x / / / /
EMBRA 1451 x x x / x / / / /
EMBRA 1456 x x x / x / / / /
EMBRA 1463 x x x / x / / / /
EMBRA 1468 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1469 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1470 T T T / ok T / / /
EMBRA 1488 x x x / x / / / /
EMBRA1492 x x x / x / / / /
EMBRA 1494 x x x / x / / / /
EMBRA 1499 x x x / x / / / /
EMBRA 1507 x x x / x / / / /
EMBRA 1532 x x x / x / / / /
EMBRA 1551 x x x / x / / / /
EMBRA 1578 x x x / x / / / /
EMBRA 1582 x x x / x / / / /
T – primers testados mas que não otimizaram nesta temperatura; TN – primers testados
mas que não otimizaram em nenhuma das temperaturas; x – primers testados mas
descartados; / - temperatura não utilizada nos testes; ok – primers testados e otimizados
nesta temperatura.
97
Primers Temperatura de Anelamento Testadas
48°C 52°C 54°C 55°C 56°C 58°C 59°C 60°C 62°C
EMBRA 1584 x x x / x / / / /
EMBRA 1616 x x x / x / / / /
EMBRA 1625 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1627 x x x / x / / / /
EMBRA 1639 x x x / x / / / /
EMBRA 1643 x x x / x / / / /
EMBRA 1656 x x x / x / / / /
EMBRA 1661 x x x / x / / / /
EMBRA 1752 x x x / x / / / /
EMBRA 1753 x x x / x / / / /
EMBRA 1757 x x x / x / / / /
EMBRA 1722 x x x / x / / / /
EMBRA 1761 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1798 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1800 x x x / x / / / /
EMBRA 1805 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1810 x x x / x / / / /
EMBRA 1811 / / / / T T / T ok
EMBRA 1812 x x x / x / / / /
EMBRA 1825 x x x / x / / / /
T – primers testados mas que não otimizaram nesta temperatura; TN – primers testados
mas que não otimizaram em nenhuma das temperaturas; x – primers testados mas
descartados; / - temperatura não utilizada nos testes; ok – primers testados e otimizados
nesta temperatura.
98
Primers Temperatura de Anelamento Testadas
48°C 52°C 54°C 55°C 56°C 58°C 59°C 60°C 62°C
EMBRA 1829 x x x / x / / / /
EMBRA 1845 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1851 x x x / x / / / /
EMBRA 1868 / / / / T T / T ok
EMBRA 1875 x x x / x / / / /
EMBRA 1924 x x x / x / / / /
EMBRA 1928 x x x / x / / / /
EMBRA 1934 x x x / x / / / /
EMBRA 1939 / / T T T ok / / /
EMBRA 1944 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1945 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1960 x x x / x / / / /
EMBRA 1969 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA1977 x x x / x / / / /
EMBRA 1990 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 1993 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 2000 / / / / TN TN / TN TN
EMBRA 2002 x x x / x / / / /
EMBRA2011 / / / / T ok / / /
EMBRA 2014 x x x / x / / / /
T – primers testados mas que não otimizaram nesta temperatura; TN – primers testados
mas que não otimizaram em nenhuma das temperaturas; x – primers testados mas
descartados; / - temperatura não utilizada nos testes; ok – primers testados e otimizados
nesta temperatura.
99
Anexo III
Sistema de coloração do gel de acrilamida, apresentados por Creste et al. (2001).
Procedimento Solução Tempo N° de vezes para reutilização
da solução
1. Fixação Etanol 10%, ácido acético 1% 10’ 3
2. Lavagem Água destilada deionizada 1’ -
3. Pré-
tratamento Ácido Nítrico 1,5% 3’ 4
4. Lavagem Água destilada deionizada 1’ -
5. Impregnação 0,2% AgNO3 20’ 3
6. Lavagem Água destilada deionizada 30’’ -
7. Lavagem Água destilada deionizada 30’’ -
8. Revelação1,2
15g/500mL Na2CO3, 0,27 mL
formaldeído¹ 4-7’ -
9. Bloqueio Ácido acético 5’ 5
10. Lavagem Água destilada deionizada 1’ -
¹-Acrescentar na solução de revelação na hora de utilizar.
²-Durante a revelação colocar aproximadamente metade da solução (resfriada a 12°C) e
manter sob lenta agitação até a solução ficar escura e adicionar então o restante da
solução.
100
Anexo IV
Protocolo de montagem da placa-mãe para genotipagem em analisador automático de
fragmentos. Baseado na intensidade de amplificação de cada par de primer.
Primers Volume (µl) da PCR
utilizado na placa-mãe
EMBRA 809 4 µl
EMBRA 1076 4 µl
EMBRA 1335 4 µl
EMBRA 1362 2 µl
EMBRA 1363 2 µl
EMBRA 1364 2 µl
EMBRA 1374 3 µl
EMBRA 1470 2 µl
EMBRA 1811 2 µl
EMBRA 1868 2 µl
EMBRA 2011 4 µl
101
Anexo V
Teste de desequilíbrio de ligação com 66 combinações dos 12 locos transferidos para as
duas espécies de Campomanesia.
Combinação dos Locos C. adamantium C. pubescens
EMBRA 1335 X EMBRA 1364 0,54963 0,00221
EMBRA 1335 X EMBRA 2011 0,17531 0,03848
EMBRA 1335 X EMBRA 809 0,24996 0,08353
EMBRA 1335 X EMBRA 1363 0,3484 0,12867
EMBRA 1335 X EMBRA 1374 1,000 0,25464
EMBRA 1335 X EMBRA 1811 1,000 0,47492
EMBRA 1335 X EMBRA 1868 0,54933 0,18249
EMBRA 1335 X EMBRA 1076 1,000 0,00162
EMBRA 1335 X EMBRA 1362 0,57429 0,02522
EMBRA 1335 X EMBRA 1470 0,12532 0,00269
EMBRA 1335 X EMBRA 1939 0,70052 0,00008*
EMBRA 1364 X EMBRA 2011 0,69486 1,000
EMBRA 1364 X EMBRA 809 0,53109 0,69501
EMBRA 1364 X EMBRA 1363 0,03525 0,01759
EMBRA 1364 X EMBRA 1374 0,78503 0,03742
EMBRA 1364 X EMBRA 1811 0,55034 0,02656
EMBRA 1364 X EMBRA 1868 0,0709 0,06251
EMBRA 1364 X EMBRA 1076 0,61289 0,0001*
EMBRA 1364 X EMBRA 1362 0,06725 0,00521
EMBRA 1364 X EMBRA 1470 0,43921 0,00056*
EMBRA 1364 X EMBRA 1939 0,01541 0,00001*
EMBRA 2011 X EMBRA 809 0,45282 0,26753
EMBRA 2011 X EMBRA 1363 0,04803 1,000
EMBRA 2011 X EMBRA 1374 0,96964 0,67407
EMBRA 2011 X EMBRA 1811 1,000 0,82152
EMBRA 2011 X EMBRA 1868 0,98337 0,26843
EMBRA 2011 X EMBRA 1076 0,12711 0,00936
EMBRA 2011 X EMBRA 1362 0,05322 0,13611
EMBRA 2011 X EMBRA 1470 0,63923 0,02193
102
EMBRA 2011 X EMBRA 1939 0,22346 0,32629
EMBRA 809 X EMBRA 1363 0,30047 0,54007
EMBRA 809 X EMBRA 1374 0,85945 0,6693
EMBRA 809 X EMBRA 1811 1,000 0,3036
EMBRA 809 X EMBRA 1868 0,59978 0,09667
EMBRA 809 X EMBRA 1076 0,16482 0,00003*
EMBRA 809 X EMBRA 1362 0,31862 0,43956
*P-valor ajustado para um nível de 5% é p ≤ 0,00076.
103
Combinação dos Locos C. adamantium C. pubescens
EMBRA 809 X EMBRA 1470 0,00123 0,00039*
EMBRA 809 X EMBRA 1939 0,51807 0,01224
EMBRA 1363 X EMBRA 1374 0,01115 0,39262
EMBRA 1363 X EMBRA 1811 0,1499 0,81249
EMBRA 1363 X EMBRA 1868 0,10874 0,06436
EMBRA 1363 X EMBRA 1076 0,58639 0,2851
EMBRA 1363 X EMBRA 1362 0,000* 0,00002*
EMBRA 1363 X EMBRA 1470 0,17179 0,00014*
EMBRA 1363 X EMBRA 1939 0,3826 0,00473
EMBRA 1374 X EMBRA 1811 0,29995 0,13703
EMBRA 1374 X EMBRA 1868 0,89351 0,50427
EMBRA 1374 X EMBRA 1076 0,54123 0,02197
EMBRA 1374 X EMBRA 1362 0,3803 0,56936
EMBRA 1374 X EMBRA 1470 0,67948 0,01711
EMBRA 1374 X EMBRA 1939 0,1892 0,18977
EMBRA 1811 X EMBRA 1868 0,6992 0,98903
EMBRA 1811 X EMBRA 1076 1,000 0,1213
EMBRA 1811 X EMBRA 1362 0,57626 0,10761
EMBRA 1811 X EMBRA 1470 1,000 0,09333
EMBRA 1811 X EMBRA 1939 0,25053 0,02658
EMBRA 1868 X EMBRA 1076 0,33771 0,11902
EMBRA 1868 X EMBRA 1362 0,08625 0,1931
EMBRA 1868 X EMBRA 1470 0,25823 0,03655
EMBRA 1868 X EMBRA 1939 0,0629 0,05633
EMBRA 1076 X EMBRA 1362 0,0095 0,05407
EMBRA 1076 X EMBRA 1470 1,000 0,000*
EMBRA 1076 X EMBRA 1939 0,01743 0,00168
EMBRA 1362 X EMBRA 1470 0,05529 0,00504
EMBRA 1362 X EMBRA 1939 0,41931 0,01067
EMBRA 1470 X EMBRA 1939 0,92123 0,00334
*P-valor ajustado para um nível de 5% é p ≤ 0,00038.
