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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA EDUARDO MARTINS DE SOUSA CONSTRUÇÃO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE PROTEICA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE E ANTIGENICIDADE. Goiânia 2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
EDUARDO MARTINS DE SOUSA
CONSTRUÇÃO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE PROTEICA DE
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E AVALIAÇÃO DA
IMUNOGENICIDADE E ANTIGENICIDADE.
Goiânia 2013
ii
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a
disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [X] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Eduardo Martins de Sousa
E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ ]Sim [ X ] Não
Vínculo empregatício do autor
Agência de fomento: CNPq Sigla:
País: Brasil UF:Go CNPJ:
Título: CONSTRUÇÃO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE PROTEICA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE E ANTIGENICIDADE.
Palavras-chave: Tuberculose, vacina de subunidade, proteína recombinante.
Título em outra língua: CONSTRUCTION OF A PROTEIN SUBUNIT VACCINE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AND EVALUATION OF IMMUNOGENICITY AND ANTIGENICITY.
Palavras-chave em outra língua: Tuberculosis, subunit vaccine, recombinant protein.
Área de concentração: Imunologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa) 27/03/2013
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador (a): Ana Paula Junqueira kipnis
E-mail: [email protected]
Co-orientador (a):* João Alves de Araújo Filho, André Kipnis
E-mail: [email protected]
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1
Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.
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1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo.
iii
EDUARDO MARTINS DE SOUSA
CONSTRUÇÃO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE PROTEICA DE
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E AVALIAÇAO DA
IMUNOGENICIDADE E ANTIGENICIDADE.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientadora: Drª Ana Paula Junqueira Kipnis Co-orientadores: Dr. João Alves de Araújo Filho Dr. André Kipnis
Goiânia 2013
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Sousa, Eduardo Martins de.
Construção de uma vacina de subunidade proteica de
Mycobacterium tuberculosis e avaliação da
imunogenicidade e antigenicidade./ Eduardo Martins de
Sousa. - 2013.
98 f. : figs, tabs.
Orientador: Prof. Dr. Ana Paula Junqueira Kipnis.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2013.
Bibliografia.
v
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluno (a): Eduardo Martins de Sousa
Orientador (a): Ana Paula Junqueira Kipnis
Co-orientador (a): João Alves de Araújo Filho e André Kipnis
Membros:
1. Ana Paula Junqueira Kipnis
2. Maria Cláudia Dantas Porfírio Borges André
3. Anamelia Lorenzentti Bocca
4. Moisés Palaci
5. Simone Gonçalves da Fonseca
Data: 27/03/2013
vi
Dedico este trabalho ao meu sobrinho João Pedro por estar/ser presente em minha vida me iluminando em todos os momentos e por me dar a esperança para seguir em frente na vida.
vii
“O degrau de uma escada não serve simplesmente para que alguém permaneça em cima dele, destina-se a sustentar o pé de um homem pelo tempo suficiente para que ele coloque o outro um pouco mais alto.” (Thomas Huxley)
viii
Agradecimentos
Pelos mais variados motivos, este trabalho me é muito caro, e devo agradecer
a muitas pessoas que estiveram comigo durante todo o processo. Para mim
mesmo, chamo este agradecimento de “desabafo de quatro anos”, então, não
estranhem se o acharem um pouco longo!
Agradeço em primeiro lugar a Deus que iluminou o meu caminho durante esta
caminhada em busca dos meus objetivos.
Aos meus pais, que me ensinaram a não temer desafios e a superar os
obstáculos com humildade.
A toda minha família, tão normal e tão louca ao mesmo tempo; as figuras mais
presentes (presentes DEMAIS, algumas vezes) na minha vida, meu norte
(embora eu sempre prefira o sul) e, muitas vezes, minha consciência.
À Professora Ana Paula Junqueira-Kipnis, por ter acreditado no meu trabalho
desde o princípio (mestrado), quando parecia que ninguém acreditava. Por ter
sido amiga, orientadora em todos os momentos de dificuldades e alegrias
vividos. A sua disponibilidade irrestrita, sua forma exigente, crítica e criativa de
arguir as idéias apresentadas, creio que deram norte a este trabalho, facilitando
o alcance de meus objetivos.
ix
Ao Professor André Kipnis pelas suas importantes reflexões criativas sobre
nosso trabalho, as quais muito nos ajudaram a compreendê-lo e a realizar uma
análise critica sobre o mesmo, meus sinceros agradecimentos.
Ao Professor João Alves de Araújo Filho pelas suas importantes ponderações e
co-orientação deste trabalho, as quais muito nos ajudaram a realizá-lo de uma
forma mais aplicável à prática clínica e a comunidade, meus sinceros
agradecimentos.
Aos professores pelos quais cruzei nesta pós-graduação, que foi tão rica em
informações. Obrigado por me mostrar como um profissional deve agir
realmente. Através dos exemplos vistos em sala e na vida, posso afirmar que
aprendi como devo proceder.
Aos meus colegas do Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas
(Abadio, Adeliane, Alexsander, André, Bruna, Danilo, Joseane, Marcos,
Monalisa, Micaela, Sara) e Bacteriologia Molecular (Aline, Fabiana, Fábio,
Jaqueline, Lázaro, Renato, Rogério, Suellen, Viviane) que contribuíram com
uma mão a mais para realização dos experimentos, na manutenção dos
animais no biotério ou sugestões científicas para a realização dessa tese.
Agradeço a colega Adeliane Castro da Costa e Monalisa Martins Trentini pela
realização dos ensaios de ELISA, a colega Bruna Daniela Sousa Silva pela
coleta das amostras sorológicas utilizadas para a realização dos ensaios de
ELISA.
x
A todos os funcionários do biotério que me auxiliaram na realização deste
trabalho.
A todos os funcionários do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública.
Agradeço ao professor Dr. Rui Appelberg meu co-orientador no programa de
doutorado com estágio no exterior do Instituto de Biologia Molecular e Celular
da Universidade do Porto, pela colaboração, paciência e seus conhecimentos
repassados durante todo o estágio, além da grande amizade formada.
Agradeço aos colegas: António Barroso, Silvia Costa, Margarida Borges,
Sandro Gomes, Matteo Bosi, Tânia Moniz, Nuno Valente, Amélia Sarmento,
Rosinha, enfim todos os amigos do Laboratório de Microbiologia e Imunologia
da Infecção do Instituto de Biologia Molecular e Celular pela divisão de
conhecimentos me proprocionou durante o estágio, pela amizade e pela
receptividade, todos foram muitos queridos.
Agradeço a professora Drª Eliana Martins Lima da faculdade de farmácia da
UFG e sua aluna Marilisa Gaeti pela colaboração na preparação do lipossoma
utilizado nas formulações vacinais.
Aos amigos que me apoiaram e aguentaram durante estes anos de curso, e
sempre manifestaram apoio ou estiveram ao menos curiosos a respeito deste
trabalho.
xi
Considero que a elaboração de uma tese de doutorado é um produto coletivo
embora sua redação, responsabilidade e stress seja predominantemente
individual. Várias pessoas contribuíram para que este trabalho chegasse a um
bom termo. A todas elas registro minha gratidão.
Agradeço a todos os demais que estiveram ao meu lado neste trabalho.
Precisei muito do apoio de todos para que este, que parecia ser apenas um
delírio meu, virasse um sonho que se torna realidade.
Agradeço as agências de fomento que contribuíram para a realização deste
trabalho: FAPEG (Nº 200910267000381) CAPES (Nº 5015/10-3) pela bolsa do
Programa de Doutorado com Estágio no Exterior e ao CNPq (Nº 142846/2009-
0) pela bolsa de doutorado e pela bolsa de taxa de bancada.
xii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ......................................................................................... 1
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... 2
LISTA DE QUADROS ........................................................................................ 3
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................ 4
RESUMO............................................................................................................ 6
ABSTRACT ........................................................................................................ 8
CAPÍTULO 1 – REVISÃO DA LITERATURA .................................................... 9
1.1 Tuberculose .............................................................................................. 9
1.2 Agente Etiológico .................................................................................... 10
1.2.1 Genoma do Mycobacterium tuberculosis ......................................... 11
1.3 Resposta Imune ...................................................................................... 11
1.4 Vacinas contra Tuberculose ................................................................... 14
1.4.1 Bacilo Calmette-Guérin (BCG) ......................................................... 14
1.4.2 Novas Vacinas para Tuberculose .................................................... 16
1.5 Proteínas selecionadas do Mycobacterium tuberculosis para confecção
de uma vacina .............................................................................................. 20
1.6 Adjuvantes .............................................................................................. 23
2 – Justificativa ............................................................................................... 29
3 – Objetivos ................................................................................................... 31
3.1 Objetivo Geral ......................................................................................... 31
3.2 Objetivos Específicos.............................................................................. 31
4 – Material e Métodos ................................................................................... 32
4.1 Construção da Proteína de Fusão .......................................................... 32
xiii
4.1.1 Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores ..................................... 32
4.1.2 Amplificação dos genes e construção de fusão gênica Ag85C-
MPT51-HspX ............................................................................................. 33
4.1.3 Digestão com Enzimas de Restrição ................................................ 35
4.1.4 Ligação do inserto aos Vetores pGEM T easy e pET 23a ................ 36
4.1.5 Análise eletroforética em gel de agarose ......................................... 38
4.1.6 Construção do vetor de expressão................................................... 38
4.1.7 Extração Plasmidial por Lise Alcalina. .............................................. 39
4.2 Preparação de bactérias E. coli XL1 Blue e E. coli BL21(DE3) pLysS
eletrocompetentes ........................................................................................ 40
4.3 Transformação das bactérias por choque elétrico .................................. 40
4.4 Indução da expressão da proteína de fusão com IPTG (Isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside) .................................................................................. 41
4.5 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida contendo Dodecil Sulfato de Sódio
(SDS-PAGE) ................................................................................................. 41
4.6 Análise da expressão das proteínas recombinantes por Imunoblotting
anti-Histag ..................................................................................................... 42
4.7 Purificação de proteína de fusão recombinante Ag85C-MPT51-HspX: .. 43
4.8 Animais ................................................................................................... 43
4.9 Grupos Experimentais ............................................................................ 44
4.10 Obtenção de soro ................................................................................. 45
4.11 Ensaio Imunoenzimático (ELISA). ........................................................ 45
4.12 Citometria de Fluxo e Culturas celulares. ............................................. 46
4.13 Análise Estatística ................................................................................ 46
xiv
1º Artigo – Immunogenicity of a Fusion Protein Containing
Immunodominant Epitopes of Ag85C, MPT51, and HspX from
Mycobacterium tuberculosis in Mice and Active TB Infection ................... 48
5 – Considerações Finais .............................................................................. 60
6 – Conclusões ............................................................................................... 64
7 - Perspectivas .............................................................................................. 64
8 – Referências Bibliográficas ...................................................................... 65
1
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sequências de Oligonucleotídeos Iniciadores usados neste
estudo................................................................................................................32
Tabela 2: Reação de ligação do gene contendo a fusão de proteínas ao vetor
pET23a..............................................................................................................37
Tabela 3: Reação de ligação do gene contendo a fusão de proteínas ao vetor
pGEM T easy.....................................................................................................37
2
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura terciária do Ag85C..............................................................21
Figura 2. Estrutura terciária do MPT51............................................................ 22
Figura 3: Esquema de construção do vetor recombinante expressando a fusão
gênica de epítopos de proteínas de M. tuberculosis. Os epítopos
correspondentes aos genes Ag85C (A), MPT-51 (B) e HSPX (C) ficaram
separados por sequências hinge contendo os aminoácidos
descritos............................................................................................................ 34
3
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Classificação de adjuvantes conforme o mecanismo de ação........26
.
4
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
µg: Microgramas
µL: Microlitros
amp: Ampicilina
APC: do inglês Allophycocyanin
BCG: Bacillus Calmette-Guérin
CD: do inglês Cluster of
Differentiation
Clor: chloramphenicol
CTLA: do inglês Cytotoxic T-
Lymphocyte Antigen
DCs: Células Dendríticas
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
dNTPs: Desoxirribonucleotídeos
Fosfatados
EDTA: Ácido Etilenodiamino Tetra-
acético
FCA: Adjuvante Completo de
Freund
FIA; Adjuvante Incompleto de
Freund
FITC: isotiocianato de fluoresceína
h: horas
HFL: Hidratação de Filme Lipídico
HIV: Vírus da Imunodeficiência
Humana
IFN-γ: Interferon gama
Ig: Imunoglobulina
IL: Interleucina
iNOS: Óxido Nítrico-Sintase
Induzível
IP: Proteína induzível
IPTG: Isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside
kDa: quilodáltons
LAM: Lipoarabinomanana
LB: Luria Bertani
LM: Lipomanana
M: Molar
MCP: Proteína Quimioatraente de
Macrófagos
MDR-TB: Multidrug-Resistant
Tuberculosis
MHC: Complexo de
Histocompatibilidade Principal
min: minutos
5
MIP: Proteína Inflamatória de
Macrófagos
MM: Marcador Molecular
mM: Milimolar
Mtb: Mycobacterium tuberculosis
N: Normal
ɳg: nanogramas
NO: Óxido Nítrico
nt: nucleotídeos
pb: Pares de Base
PBMC: do inglês Peripheral Blood
Mononuclear Cell
PBS: Tampão Salina Fosfato
PCR: Reação em Cadeia da
Polimerase
PE: do inglês Phycoerythrin
PerCP: do inglês Peridinin
Chlorophyll Protein
PIMs: Fosfatidil Inositol Manosídeo
PPD: Derivado Protéico Purificado
RANTES: do inglês Regulated
on Activation, Normal T cell Express
ed and Secreted
RCs: Receptores de Complemento
RD: Regiões de Diferenças
RNA: Ácido Ribonucléico
s: segundos
SDS: Sódio Dodecil Sulfato
SDS-PAGE: Eletroforese em gel de
poliacrilaminda com Sódio Dodecil
Sulfato
TB: Tuberculose
TBE: Tris Borato EDTA
TCR: Receptores de Células T
TDM: Dimecolato de Trealose
TGF-β: Fator Transformador de
Crescimento beta
TLR: do inglês Toll-like Receptors
TNF-α: Fator de Necrose Tumoral
alfa
UFC: Unidade Formadora de
Colônia
WHO: do inglês World Health
Organization
XDR- TB: do inglês Extremely Drug-
Resistent Tuberculosis
6
RESUMO
A tuberculose é uma doença infecciosa re-emergente que permanece como um dos
maiores problemas de saúde pública mundial. Embora exista a vacina BCG que é eficiente
contra formas graves de TB na infância, em adultos a eficácia é variável (0 a 85%). Nesse
contexto existe a necessidade do desenvolvimento de novas vacinas para controlar a
disseminação da TB. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma nova
proteína de fusão recombinante (Ag85C-MPT51-HspX) de M. tuberculosis a partir da
clonagem molecular, expressão em E. coli com uma cauda de histidina e purificação através
de cromatografia de troca iônica. A proteína de fusão foi construída com sucesso expressa
em E. coli BL21 e purificada. Ensaios em camundongos foram realizados para avaliar a
imunogenicidade da proteína recombinante de fusão Ag85C-MPT51-HspX de M.
tuberculosis. Os camundongos foram imunizados três vezes com a proteína Ag85C-MPT51-
HspX formulada com CpG-DNA encapsulada em lipossoma, CpG-DNA encapsulado em
lipossoma, lipossoma ou salina como controle negativo e a resposta imune humoral e celular
foi avaliada . A imunização com a formulação vacinal induziu a produção de altos títulos de
anticorpos específicos anti-proteína de fusão Ag85C-MPT51-HspX (IgG1 =3,08±0,04;
IgG2a=3,10±0,03), bem como, favoreceu o aumento de células T CD4+IFN-γ (2,14%±0,17),
CD4+TNF-α (2,16%±0,34) específicas. A avaliação do reconhecimento desta proteína de
fusão tanto por IgM quanto IgG humana sérica permitiu discriminar pacientes com
tuberculose ativa de controles saudáveis, demonstrando a antigenicidade desta molécula em
humanos. Conclui-se que a proteína CMX poderá ser testada tanto como vacina, assim
como para o desenvolvimento de testes de diagnóstico para a tuberculose.
7
Palavras-chave: tuberculose, vacina de subunidade, proteína recombinante.
8
ABSTRACT
Tuberculosis is a re-emerging infectious disease that remains a major public health
problem worldwide. Although there is the BCG vaccine that is effective against severe forms
of childhood TB, in adults its efficacy is variable (0-85%). In this context there is a need to
develop new vaccines to control the spread of TB. This thesis proposes the development of a
new recombinant fusion M. tuberculosis protein (Ag85C-MPT51-HspX) by molecular cloning,
expression in E. coli with a histidine tag and purified by ion exchange chromatography. The
fusion protein was constructed successfully, expressed in E. coli BL21 and purified. Tests in
mice were performed to evaluate the immunogenicity of the recombinant fusion protein
Ag85C-MPT51-HspX of M. tuberculosis. Mice were immunized three times with the protein
Ag85C-MPT51-HspX formulated with CpG-DNA encapsulated in liposomes, CpG-DNA
encapsulated in liposomes, liposome or saline as negative control and the humoral and
cellular immune response was evaluated. The immunization with the vaccine formulation
induced the production of high titers of specific anti-fusion protein Ag85C-MPT51-HspX IgG1
= 3.08 ± 0.04; IgG2a = 3.10 ± 0.03) and, favored the increase of specific CD4+ IFN-γ (2.14%
± 0.17), CD4+ TNF-α (2.16 ± 0.34%). The recognizing of this protein by seric IgG and IgM
discriminated patients with active TB infection from healthy individuals. We conclude that
CMX protein has potential to be used for the development of vaccine against M. tuberculosis
as well also for TB diagnostic kits.
Key-words: tuberculosis, subunit vaccine, recombinant protein.
9
CAPÍTULO 1 – REVISÃO DA LITERATURA
CAPÍTULO 1 – REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Tuberculose
A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa que representa um dos principais
problemas sociais, econômicos e de saúde pública no mundo. Em 2011 foram estimados 8,7
milhões de casos novos e 1,4 milhões de mortes associadas com epidemias de TB (WHO,
2012). A epidemia de tuberculose associada à co-infecção com HIV (do inglês Human
Immunodeficiency Virus) aumenta a incidência de TB principalmente nos países em
desenvolvimento (NUNN et al., 2005). A multidroga-resistência (ESPINAL, 2003) e, mais
recentemente o surgimento das cepas de M. tuberculosis (M.tb) extremamente resistentes
(XDR) (RAVIGLIONE, 2006), associados a ausência de métodos de diagnóstico precisos e a
variação da proteção efetiva da vacinação com BCG são os principais obstáculos para o
controle global da TB (MEACCI et al., 2005). O início do conhecimento sobre a Tuberculose
foi à identificação do bacilo M. tuberculosis (Mtb) por Robert Koch, em 1882. A TB é
causada primariamente pelo Mtb (bacilo de Koch), entretanto em muitas partes do mundo
uma quantidade significativa da doença é também devida à infecção por organismos
altamente relacionados como: M. africanum, M. canetti, M. bovis, M.bovis, M. microti e M.
pinnipedii (COUSINS et al, 2003), essas micobactérias são coletivamente referidas como
complexo M. tuberculosis. Apesar das estatísticas mostrarem que grande parte da
população mundial está infectada com o bacilo, uma parcela relativamente pequena
desenvolve a doença. A maioria dos indivíduos infectados (90%) desenvolve a forma latente
e assintomática da doença. Uma pequena porcentagem dessas pessoas (cerca de 10%)
10
pode apresentar reativação da infecção, geralmente como consequência de uma infecção
secundária, imunossupressão, desnutrição, consumo alcoólico, condições sanitárias
precárias ou elevado grau de exposição, podendo desenvolver a TB ativa. Raramente, a
doença progride logo após a infecção primária (5-10% dos casos) (FLYNN & CHAN, 2005;
BOOM et al., 2003; VERNON 2013).
1.2 Agente Etiológico
Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose pertence à ordem dos
Actinomycetales, subordem Corynebacteriaceae, família Mycobacteriacea e gênero
Mycobacterium. Bactérias deste gênero são bacilos aeróbios, não formadores de esporos,
sem flagelos, parasita intracelular facultativo, medindo de 1 – 4 m de comprimento por 0,3 –
0,6 m de largura. Caracterizam-se por serem álcool-ácido resistentes (BAAR). A parede
celular do M. tuberculosis tem como principais constituintes os lipídeos, polissacarídeos e
proteínas (BRENNAN & NIKAIDO 1995; DAFFE & DRAPER 1998). Os lipídeos constituem-
se de um complexo de ácidos micólicos e os polissacarídeos constituem-se de
arabinogalactanas e peptidoglicano (do inglês mycolyl arabinogalactan-peptidoglican,
mAGP). O M. tuberculosis apresenta também glicolipídeos como lipoarabinomana (LAM),
lipomanana (LM) que parece ser um precursor de LAM e fosfatidil inositol manosídeo (do
inglês phosphatidylinositol mannosides, PIMs) (MCNEIL et al 1990; DAFFE & DRAPER
1998; MIKUSOVA et al 2000), que são fatores corda (como o dimicolato de trealose) um dos
fatores de virulência que em meio glicerinado, leva a bactéria a crescer em formato de
corda.
11
1.2.1 Genoma do Mycobacterium tuberculosis
Na análise da sequência original da cepa padrão H37Rv do Mycobacterium
tuberculosis foram identificados 3.974 genes, destes 3.924 genes que codificam proteínas.
Após a reanálise do genoma, foram incluídos 82 genes todos codificantes para polipeptídeos
e nenhuma alteração foi detectada no número de moléculas de RNA. A atual sequência
nucleotídica contém agora 4.411.532 nt (CAMUS et al 2002).
1.3 Resposta Imune
O estabelecimento da infecção pelo Mtb nos pulmões depende do encontro do bacilo
com as células do hospedeiro, geralmente macrófagos alveolares (FREGUSON &
SCHELESINGER 2000) ou células dendríticas (HINGLEY-WILSON, 2000).
O M. tuberculosis tem desenvolvido diferentes mecanismos para entrar nos
macrófagos e induzir sua própria fagocitose através de diferentes receptores como: CD14,
receptores Fc (FcR), receptores de complemento (RC) 1, RC3/4, presentes na superfície dos
macrófagos. (ERNEST 1998; ADEREM & UNDERHILL 2002). Após a fagocitose, a maioria
dos bacilos é degradada no interior dos fagolisossomos pelas enzimas lisossomais
(HINGLEY-WILSON, 2000). A presença dos bacilos remanescentes e dos produtos
resultantes da degradação de micobactérias ativa macrófagos alveolares, que secretam
citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias, como: TNF-, IL-6, IL-1, IL-8, MCP-1, MCP-3,
IP10, RANTES, MIP1 e MIP2, recrutando leucócitos para o local da infecção. Inicialmente,
ocorre a migração de neutrófilos (SADEK et al 1998) para o sítio da infecção e em seguida
monócitos e precursores de células dendríticas (KAUFMANN, 2004; FLYNN & CHAN, 2001;
12
DANNENBERG, 1993; ADAMS, 1976).
Alguns componentes da micobactéria (arabinogalactanas, peptideoglicanas, LAM,
proteínas) podem interagir com os receptores Toll/ TLR2/ TLR4 dos macrófagos e induzir a
produção de IL-23/IL-10 (COOPER & KHADER 2008). Estes mecanismos utilizam vias
comuns de sinalização intracelular que incluem principalmente a molécula adaptadora
MyD88. (UNDERHILL et al 1999; DOHERTY & ARDITE 2004; QUESNIAUX et al 2004).
O desenvolvimento da resposta imune adaptativa depende em grande parte da via de
ativação da resposta imune inata, dependendo de qual via o M. tuberculosis é reconhecido
pelas células dendríticas (DCs) pulmonares, diferentes populações celulares podem ser
geradas. Se o reconhecimento do M. tuberculosis se der pela via TLR2 levará as DCs a
secretarem IL-12 (COOPER & KHADER 2008) polarizando para a resposta imune celular
(RIC) tipo Th1, eficiente nas infecções causadas por microrganismos intracelulares e
caracterizadas pela produção de citocinas como IFN-, IL-2, IL-12, IL-18 e TNF-
(SCHLUGER 2001; FLYNN & CHAN 2001; ORME 2004). Pode ocorrer também uma
resposta imune do tipo Th17 caracterizada pela secreção de IL-17 (COOPER & KHADER
2008), uma importante citocina quimioatraente para neutrófilos (CRUZ et al 2006). O
reconhecimento do M. tuberculosis via TLR4 estimula a secreção de IL-10 que ativa uma
população de linfócitos T reguladores e uma resposta imune humoral (Th2) que não é
protetora para tuberculose e que se caracteriza pela produção de citocinas como IL-4, IL-5,
IL-6, IL-13, IL-10 e TGF-β, mas que atua na regulação das lesões inflamatórias induzidas
pela infecção (COOPER & KHADER 2008).
Várias subpopulações de linfócitos T estão envolvidas na resposta à tuberculose,
além de mecanismos múltiplos de reconhecimento de antígenos e funções efetoras distintas
13
no controle do M. tuberculosis (STENGER & MODLIN 1999). Fenotipicamente, as células T
que contribuem para uma imunidade protetora incluem os linfócitos T CD4+, CD8+ e T . Os
antígenos peptídicos e não peptídicos podem ser reconhecidos pelas células T (CONSTANT
et al 1994; PORCELLI et al 1992; NEWPORT et al 1996) em moléculas de complexo de
histocompatibilidade principal de classe I ou II (MHC I ou II) e em moléculas de MHC não
polimórficas como a CD1 (PORCELLI et al 1992; ROSAT et al 1999).
Na resposta imune efetora ao M. tuberculosis, em humanos, observa-se que os
linfócitos TCD4+CD45RO+ produzem IFN- e podem também ter uma função citolítica pela
secreção de granulisina (MUELLER et al 2011). Além dos linfócitos TCD4 e as células NK,
outra fonte importante de IFN- são os linfócitos TCD8 (TCR β), os quais reconhecem
antígenos micobacterianos em moléculas MHC I ou CD1 apresentando funções de
citotoxicidade sobre as células infectadas (STENGER & MODLIN 1999; ORME & COOPER
1999; TAN et al 2000; RAJA 2004; KAUFMANN 2004).
O IFN- apresenta as seguintes funções efetoras: induz à produção de intermediários
do oxigênio; intermediários do nitrogênio; a acidificação do fagossoma e a fusão do fago-
lisossoma; a expressão de iNOS2 para a produção de óxido nítrico utilizando L-arginina
como substrato; a redução de ferro intracelular para limitar o desenvolvimento da
micobactéria através da desregulação do receptor para transferrina; o aumento das
moléculas MHC I e II envolvidas na apresentação de antígenos; e o aumento da capacidade
de fagocitar, além de induzir a produção de IL-12 (FLYNN & CHAN 2001; BOEHM et al
1997; DUPUIS et al 2000).
De acordo com DIELI et al (2000) os linfócitos Tγδ têm uma função importante na
tuberculose pulmonar: esses linfócitos são uma das primeiras células recrutadas até o sítio
14
de infecção e secretam quimiocinas e citocinas. A subpopulação dos linfócitos T γδ Vγ9δ2
participam da resposta imune protetora contra o M. tuberculosis mediante mecanismos de
citotoxicidade dependente de grânulos similares aos linfócitos T CD8. No entanto, estudos
realizados com PBMC e lavado brônquico provenientes de pacientes com tuberculose têm
demonstrado que a infecção por M. tuberculosis induz uma diminuição na população de
linfócitos T Vγ9 e Vδ2 comparados com indivíduos sadios e indivíduos com doenças
granulomatosas como a sarcoidose (LIN et al 1996). Nesse caso, parece que esta
diminuição seja devido a apoptose induzida pela via Fas/ Fas ligante dos linfócitos T Vγ9
/Vδ2 reativos a antígenos de M. tuberculosis (LI et al 1998; ORDWAY et al 2004; ORDWAY
et al 2005).
1.4 Vacinas contra Tuberculose
1.4.1 Bacilo Calmette-Guérin (BCG)
A história do bacilo Calmette-Guérin (BCG) começa em 1908 quando Albert Calmette
e Camille Guérin iniciaram seu trabalho a partir de uma cepa virulenta de Mycobacterium
bovis chamada Lait Nocard, esta foi isolada por Nocard em vaca com mastite tuberculosa.
Calmette e Guérin subcultivaram o organismo em um meio de papa glicerinada, meio
prevalente na época, ao qual acrescentaram bílis bovina para assegurar uma melhor
homogeneização do cultivo. Animais de experimentação foram infectados regularmente com
esta cepa que perdeu a virulência logo no décimo quinto subcultivo e não provocou lesões
nos coelhos e cobaias (BENENSON 1997).
Em 1921 depois de 13 anos e 230 subcultivos, da cepa original do BCG foram
produzidas várias cepas “filhas”. As cepas recentes de BCG foram mantidas como cultivos
15
frescos através de uma série de subcultivos em um meio de papa-bilis ou papa-Sauton. Esta
repetição de subcultivos resultou em cepas de BCG que diferem entre si. Apresentam
características heterogêneas in vitro como morfologia da colônia, a viabilidade em meios de
cultivo, composição e atividade bioquímica, resistência à drogas, imunogenicidade em
animais e humanos, e virulência em animais (ABOU-ZEID et al 1987). O primeiro menino
imunizado com BCG em julho de 1921 foi um recém-nascido cuja avó tinha tuberculose
(MARTIN 2005, BLOOM & JACOBS 1999, GRANGE et al 1993). Nesse mesmo ano,
utilizou-se pela primeira vez na França a BCG por via oral, com fins de vacinação. Desde
então foram administradas mais de 3.000 milhões de crianças no mundo. A BCG foi
incorporada ao esquema de vacinação infantil em 1974 no Brasil (BENENSON 1997). Desde
1985 tem-se realizado estudos de caso controle utilizando diferentes cepas de BCG, e se
observou que a eficácia da vacina varia de zero a 80% (SMITH, 1987). Em crianças, a
proteção estimada é de 52 a 100%, para a prevenção de meningite tuberculosa, e de 2 a
80% na prevenção de tuberculose pulmonar (ROMANUS, 1987; TIDJANI et al 1986).
A vacina BCG está contra indicada para pacientes com HIV, recém-nascidos com
peso menor que dois quilogramas, pacientes imunocomprometidos, ou que apresentam
alguma afecção cutânea grave, aqueles que estão submetidos a algum tratamento
prolongado com esteróides ou drogas imunossupressoras e doenças infecciosas como
sarampo e varicela, mulheres grávidas e pessoas com prova tuberculínica positiva. Para os
indivíduos HIV positivos, com ausência de sinais clínicos, a vacinação não é considerada
uma contra indicação (PAUL & FINE 2001). A vacina BCG é geralmente administrada para
proteger contra a tuberculose, no entanto tem se notado que ela confere proteção contra
hanseníase (20-80%); também há evidências que a BCG confere proteção cruzada contra
16
infecção por M. ulcerans e contra doenças atribuídas a outras micobactérias em particular o
M. avium-intracellulare (PAUL & FINE 2001).
A eficácia da vacina BCG, no entanto é variável. Algumas hipóteses têm sido
propostas para explicar este fenomeno, uma destas é a infecção com micobactérias atípicas;
(PAUL & FINE 2001; HUEBNER 1994; BLACK et al 2002); outra seria as variações
genéticas da população ou das cepas de BCG utilizadas como vacinas nas diferentes partes
do mundo (KAUFMANN 2005); ou as diferenças nutricionais nos indivíduos vacinados
(BLOOM & FINE 1994) e ainda a existência de co-infecções (FERREIRA et al 2002).
A segurança da BCG é uma preocupação crescente, devido à alta prevalência de
infecção por HIV. Para prevenir os efeitos adversos da BCG em indivíduos
imunocomprometidos, bactérias modificadas com diminuição da virulência têm sido
propostas. Os resultados mostram que estas cepas são seguras em camundongos com
imunodeficiência severa combinada e demonstraram a mesma proteção nos camundongos
normais susceptíveis à tuberculose, sugerindo que este poderia ser um método mais seguro
de vacinação (HUEBNER 1994).
1.4.2 Novas Vacinas para Tuberculose
Desde a introdução do conceito de vacinação pelo médico inglês Edward Jenner, há
mais de 200 anos, esta se tornou a medida mais eficiente e menos dispendiosa de evitar
doenças infecciosas. As vacinas têm como objetivo fundamental a imunização prévia do
indivíduo, de modo que este possa responder rápido e eficientemente quando em contato
com o agente infeccioso, evitando assim, o desenvolvimento da doença. Com esta ideia em
mente, pesquisadores do todo mundo vem trabalhando para o desenvolvimento de novas
17
vacinas contra o M. tuberculosis que compreendem formulações: antígeno-adjuvante, vacina
de DNA, vacinas de subunidades proteicas ou vetores recombinantes expressando
antígenos de M. tuberculosis (OKKELS et al 2003) (Quadro 1).Tem sido demonstrado que as
proteínas do complexo 85 induzem imunogenicidade em coelhos infectados com M.
tuberculosis. A importância e relevância destas proteínas se devem, provavelmente, ao seu
papel na síntese da parede celular da micobactéria. De modo igual, demonstrou-se que
quando os monócitos humanos são infectados por M. tuberculosis, estas micobactérias
secretam as proteínas do complexo 85. Esta propriedade poderia ser vantajosa para
desenvolver uma vacina, visto que a liberação destas proteínas é de suma importância para
o processamento intracelular deste patógeno via molécula MHCII (HUEBNER 1994,
VORDERMEIER et al 2006, SABLE et al 2007). A imunização de camundongos utilizando
plasmídeo para expressão de Ag85 induz resposta imune humoral e mediada por células,
conferindo significante proteção, quando os animais são desafiados com M. tuberculosis e
BCG (HUYGEN et al 1998).
A Mtb 72F foi a primeira vacina recombinante contra TB, testada em humanos
(SKEIKY et al 2004). Essa proteína é obtida da fusão dos antígenos Mtb39 e Mtb32, e foi
testada como subunidades vacinais (SKEIKY et al 2004) e na estratégia de “primer-boost”
como reforço à BCG (BRANDT et al 2004), sendo que a primeira fase já está completa
(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00730795).
GELUK et al (2007) mostraram o efeito da vacinação com BCG-HspX ou imunização
induzida com HspX um antígeno de latência, em camundongos HLA-A2/Kb e HLA-DR3.Ab0
transgênicos. Neste estudo concluíram que a vacina BCG sozinha não induz respostas de
células T contra o antígeno HspX, mas que o HspX é um antígeno imunogênico que abriga
18
vários epítopos de células T. Assim, acredita-se que o BCG, expressando fragmentos de
antígenos relacionados à latência do M. tuberculosis (BOSHOFF & BARRY 2005; LEYTEN
et al 2006), pode ter potencial como vacinas contra a tuberculose latente.
Uma nova abordagem em vacinas que atualmente vem sendo empregada na busca
de um substituto para a BCG são as vacinas de DNA. A seleção do antígeno usado nas
vacinas de DNA está limitada pela imunogenicidade da proteína. Várias vacinas de DNA
contendo plasmídeo com genes de antígenos micobacterianos como os membros das
micolil-transferase (complexo 85) (HUYGEN 1998) e proteínas do choque térmico (Hsp60,
65, 70) (LOWRIE & SILVA 2000; LOWRIE 2003; JOHANSEN et al 2003), tem sido
extensivamente testadas contra tuberculose em modelos animais. As vacinas de DNA não
somente geram linfócitos Th1 específicos como também linfócitos TCD8, os quais são
considerados importantes na proteção contra tuberculose. Associou-se a proteção neste
caso, à produção do fenótipo CD8/CD44hi IFN-+, que foi predominante após a infecção
(LOWRIE et al 1994; LOWRIE et al 1999).
Utilizando o modelo murino de infecção vários autores testaram vacinas de
subunidades proteicas na proteção contra a tuberculose. Por exemplo: D’ SOUZA e
colaboradores (2002) usaram uma vacina contendo os antígenos Ag85A, Ag85B ou PstS-3
de M. tuberculosis encapsulados em lipossomos catiônicos e verificaram que houve indução
de resposta imune celular e humoral. Esta vacina mostrou eficácia quando utilizada tanto por
via intramuscular quanto intranasal. Após a quarta semana após o desafio com Mtb, a
vacinação utilizando o Ag85 como vacina, os autores observaram quase meio log de
proteção (CFU de 5,8 comparada com 5,5 do BCG). Também SILVA e colaboradores (2009)
19
demonstraram que a vacinação com subunidade protéica composta do antígeno MPT51 de
Mtb induziu resposta imune T específicas com produção aumentada de IFN-, o que
provavelmente reduziu a carga bacilar em quase dois log de CFU quando comparada a
vacinação com BCG.
M. vaccae e M. microti vivos, tem sido sugeridos como candidatos à vacina para a
tuberculose, mas quando utilizados em animais mostraram grande variabilidade na proteção
(BRUYN & GARNER 2003). M. tuberculosis mutante com defeito em um lipídeo
micobacteriano (Mtb drrC) mostrou ser mais protetor que a BCG quando administrado em
camundongos (PINTO et al 2004). Vetores vivos, como as vacinas virais recombinantes ou
Salmonella modificada contendo genes imunodominantes de M. tuberculosis, são candidatos
à vacina que tem mostrado boa proteção em modelos animais (MCSHANE et al 2001,2004;
MOLLENKOPF et al 2001). As vacinas virais recombinantes expressando Ag85A (MVA 85A)
(Clinical Trials.gov Identifier: NCT00423566) têm sido testadas pré-clinicamente usando
diferentes estratégias de vacinação em humanos (Homólogas ou Heterólogas) sendo o
primeiro candidato à vacina a concluir a fase de testes clínicos. Em comparação com M.
tuberculosis, a vacina BCG não contém cerca de 130 genes que estão agrupados em 16
regiões de diferença (RD) (BEHR et al 1999) e são, ao menos em parte, envolvidos na
patogenicidade e resistência do M. tuberculosis. PYM et al (2003) introduziu toda a região
RD1 de M. tuberculosis em BCG. Nesta situação, embora o BCG recombinante expressando
RD1 apresente melhor imunogenicidade e antigenicidade esta cepa apresentou maior
virulência em camundongos imunocomprometidos, quando comparados ao BCG original. A
reintrodução de genes que não conferem virulência poderia aumentar a eficácia da vacina
BCG, sem diminuir a sua segurança. HORWITZ et al (2000) introduziram o gene que
20
codifica o Ag85 em BCG, embora o gene também seja expresso em BCG, presumiu-se que
a superexpressão deste antígeno imunodominante aumentaria a proteção contra infecção
por M. tuberculosis. Com efeito, em cobaias, rBCG expressando Ag85 induziu
substancialmente maior proteção que o BCG original contra tuberculose. Esta vacina foi pelo
menos tão segura como o BCG e entrou recentemente na fase I de ensaio clínico. Outra
abordagem para melhorar a imunogenicidade do BCG foi utilizar a atividade biológica da
listeriolisina (Hly) (HESS et al 1998). No seu hospedeiro natural a L. monocytogenes, secreta
listeriolisina que forma poros na membrana fagossomal, no citosol, antígenos listeriais são
facilmente introduzidos na via de MHC de classe I, levando a uma estimulação preferencial
de células TCD8. Estudos sugerem que BCG não estimula suficientemente células TCD8,
enquanto que a estimulação de células TCD4 é satisfatória (KAUFMANN & NASSER 2005)
logo, o gene que codifica Hly foi introduzido no BCG para melhorar a estimulação de células
TCD8. Este BCG recombinante induziu uma melhor proteção do que o BCG parental em
camundongos, e já passou por vários ensaios clínicos e está em fase final de testes pré-
clínicos.
1.5 Proteínas selecionadas do Mycobacterium tuberculosis para confecção de uma vacina
O M. tuberculosis expressa e secreta três enzimas micoliltransferases conhecidas
como complexo 85 que consistem de Ag85 A, B e C, uma série homóloga de
micoliltransferases expresso em uma proporção de 3:2:1 (HART et al 1997; RONNING et al
2000) por M. tuberculosis, todas com peso molecular de 30-32 kDa e com propriedades
isoelétricas similares. Estas enzimas são responsáveis por converter a monomicolato de
trealose (TMM) em dimicolato de trealose (TDM) (KILBURN et al 1982; BELISLE et al 1997;
TAKAYAMA et al 2005). A estrutura cristalográfica do Ag85C (Figura 1) recombinante de M.
21
tuberculosis revela um polipeptídeo alfa/beta-hidrolase, e uma tríade catalítica formada por
124 resíduos de serina (Ser), 228 resíduos de glutamato (Glu) e 260 resíduos de histidina
(His). Embora proteínas do complexo 85 sejam secretadas e liberadas para a cultura, são
também encontradas associadas com a superfície da parede celular da micobactéria
(HORWITZ et al 1995). Esta localização transiente na parede celular micobacteriana pode
explicar porque vacinas vivas geram uma resposta imune às proteínas Ag85, enquanto
vacinas mortas não o fazem (ORME 1988). Investigações têm reforçado que o uso de
proteínas do complexo Ag85, isoladamente ou em combinação com outros antígenos de M.
tuberculosis induz uma forte resposta imunológica mediada por célula (HORWITZ et al
1995).
Figura 1. Estrutura terciária do Ag85C. Fonte: http://proteopedia.org/wiki/index.php/3hrh, acessado em
fevereiro de 2012.
O MPT51 (Rv3803c) é um antígeno de 27 kDa codificado na região FbpC1 adjacente
ao gene FbpA do M. tuberculosis (Figura 2) também denominado como Ag.85 D ou MPB 51
(NAGAI et al 1991, 2007; RAMBUKKANA et al 1993). Apesar de possuir 40% de homologia
ao complexo Ag85 este não possui atividade micolil transferase (RINKE DE WIT et al 1993;
22
WILSON et al 2004) caracterizando-o como uma nova família não catalítica de α/β
hidrolases que liga-se a fibronectina e potencialmente a carboidratos. (KITAURA et al 2000).
O MPT51 é expresso em outras micobactérias como M. leprae (RINKE DE WIT et al. 1993),
M. avium (OHARA et al 1997a) e M. bovis BCG (OHARA et al 1997b). Este antígeno tem se
mostrado um bom marcador para diagnóstico de tuberculose principalmente em pacientes
co-infectados com HIV (SINGH et al 2005) onde a imunodeficiência favorece uma rápida
disseminação do patógeno, tornando-a importante na detecção precoce da doença.
Demosntrou-se previamente que na resposta imune humoral anti-MPT51 recombinante, os
níveis de IgM foram discriminatórios entre pacientes com tuberculose e indivíduos
saudáveis (ALMEIDA et al 2008) e também é capaz de induzir um aumento de células T
CD4 e CD8 produzindo IFN- e IL10 (ARAÚJO-FILHO et al 2008)
Figura 2. Estrutura terciária do MPT51. Fonte: Adaptado de WILSON et al. 2004.
A proteína de choque-térmico de 16-kDa, HspX (Rv2031c) é necessária para
persistência micobacteriana dentro do macrófago, também conhecida como -cristalina, em
geral, é produzida durante a fase estacionária ou sob privação de oxigênio do M.
23
tuberculosis (YUAN et al 1998; SHERMAM et al 2001). O HspX desempenha diversas
funções celulares tais como ligação à outras proteínas para o transporte no retículo
endoplasmático e citoplasma, atuando como chaperoninas
A proteína HspX mostrou ser antigênica e imunogênica, uma vez que é reconhecida
por anticorpos de indivíduos com TB ativa e latente. Apesar de ser impossível determinar a
evolução precisa da doença em humanos, experimentos com primatas demonstraram o
reconhecimento desta proteína na fase inicial da infecção (KHAN et al 2008). Além disso, a
presença de resposta imune humoral no soro de doentes com tuberculose (SARTAIN et al
2006), ambas as respostas de linfócitos T e B estão associadas com a infecção latente de
M. tuberculosis (DEMISSIE et al 2006), evidenciando a importância da proteína HspX
durante a infecção latente pelo M. tuberculosis.
Estas três proteínas expressas em diferentes fases da infecção natural pelo M.
tuberculosis foram selecionadas para a construção da proteína de fusao, porque uma vacina
formada com antígenos multiestágios poderia aumentar a prevenção e reinfeção da
tuberculose.
1.6 Adjuvantes
O objetivo da vacinação é gerar uma resposta imunológica ao antígeno administrado,
proporcionar proteção em longo prazo contra infecções. Para alcançar este objetivo é
necessário adicionar um adjuvante. Adjuvantes de vacinas são componentes que
potencializam a resposta imunológica a um antígeno ou modulam para a resposta imune
desejada.
Uma ferramenta fundamental para reforçar e intervir na resposta imunológica
adaptativa contra antígenos vacinais é o uso de adjuvantes na formulação vacinal. A
24
resposta imunológica adaptativa é mediada principalmente por linfócitos T e B. Depois de
ativados linfócitos B diferenciam-se em células B de memória específicas para o antígeno e
plasmócitos que secretam grandes quantidades de anticorpos. A ativação de linfócitos B é
mediada por citocinas secretadas por linfócitos T helper ativados, principalmente Th1 e Th2.
Os linfócitos Th1 secretam principalmente IFN-ɣ que ativa os macrófagos e induz à produção
de anticorpos opsonizantes pelos linfócitos B. A resposta Th1 leva a uma resposta
imunológica celular ativando linfócitos T citotóxicos (CTL) que induz a morte de células
infectadas com patógenos intracelulares, levam a ativação de células NK que tem importante
papel na indução de apoptose de células infectadas por patógenos intracelulares. Os
linfócitos Th2 secretam citocinas como IL-4 que induz a produção de anticorpos
neutralizantes pelos linfócitos B. A resposta Th2 leva a uma resposta imunológica humoral
com a produção de anticorpos (LEROUX-ROELS 2010).
Glenny demonstrou em 1926 a atividade de adjuvante composto por sais de alumínio
(GLENNY et al 1926) e este foi o primeiro adjuvante licenciado para uso em vacinas
humanas (DE GREGORIO et al 2008). Em meados de 1930 Freund desenvolveu um
adjuvante imunológico composto por uma emulsão de água em óleo mineral contendo
micobactérias mortas, conhecido como adjuvante completo de Freund (FCA) (FREUND et al
1937). Embora o adjuvante de Freund seja referido como padrão ouro, é ao mesmo tempo
um dos adjuvantes mais potente e relativamente tóxico frequentemente induz uma forte
inflamação, o que impede sua utilização em vacinas para humanos. Adjuvante incompleto de
Freund (FIA) que é uma emulsão de água em óleo mineral sem micobactérias mortas, é
menos tóxico, e tem sido utilizado em algumas formulações de vacinas humanas
(PETROVSKY & AGUILLAR 2004). Adjuvantes baseados em alumínio são os únicos
utilizados em vacinas licenciadas para utilização em humanos nos Estados Unidos. Mesmo
25
que outros adjuvantes sejam mais potentes do que o alumínio, eles têm geralmente um nível
de toxicidade mais elevado e este tem sido o motivo de não serem utilizados como
adjuvantes para formulações de vacinas humanas.
Uma série de novos adjuvantes já está em desenvolvimento em fases de teste pré-
clínica e clínica nos Estados Unidos (BURDIN et al 2004). Adjuvantes são tradicionalmente
definidos como agentes adicionados à formulações de vacinas para aumentar a
imunogenicidade de antígenos in vivo. Uma proposta de atualização desta definição divide
os adjuvantes em duas classes: sistemas de entrega e imunopotenciadores, com base no
seu mecanismo de ação (O'HAGAN & RAPPUOLI, 2004) (conforme quadro 2).
Imunopotenciadores são detectados por vários membros da família de Receptores
Semelhante ao Toll (TLR) (JANEWAY 2002). Ambos os sistemas de entrega e os
imunopotenciadores são capazes de aumentar a resposta imune antígeno específico in vivo
e as combinações de sistema de entrega e de imunopotenciadores podem ser usados em
sinergia para aumentar a resposta imunológica.
O perfil dos linfócitos T helper e a intensidade da resposta imunológica de uma
vacina podem ser modulados através do uso de adjuvantes. Há quase 80 anos, têm sido
utilizados sais de alumínio, conhecidos como “alúmen”, como o único adjuvante em vacinas
para seres humanos, apenas nas ultimas décadas novos adjuvantes foram introduzidos em
vacinas licenciadas como o MF59® e o AS04 (SEUBERT et al 2011). Os adjuvantes têm
seus efeitos através de mecanismos diferentes, alguns adjuvantes como alúmen e emulsões
(por exemplo, o MF59®), funcionam como sistemas de entregas gerandos depósitos de
antígenos no local da vacinação proporcionando a liberação lenta do antígeno aumentando
o recrutamento e ativação de células apresentadoreas de antígenos (APC), assegurando a
estimulação do sistema imunológico.
26
Outros adjuvantes, principalmente ligantes para os receptores de padrão de
reconhecimento (PRR), induzem a resposta imunológica inata visando as APCs e
consequentemente influenciar na resposta imunológica adaptativa. Estes receptores incluem
os receptores “Toll-like” (TLR), receptores “NOD-like” (NLRs), receptores “RIG-I-like” (RLRs)
e receptores de lectina tipo C (CLRs). Eles sinalizam através de vias que envolvem
moléculas adaptadoras diferentes que levam à ativação de diferentes fatores de transcrição
como o NF-KB, IRF3 que induzem a produção de citocinas e quimiocinas importantes na
iniciação, expansão e polarização da resposta imunológica. Ativação de alguns membros da
família, tais como NLR, NLRP3 e NLRC4 desencadeiam a formação de um complexo de
proteína chamado inflamassoma, implicado na indução de citocinas pró-inflamatórias IL-1β e
IL-18 (LI et al 2008) e tem sido envolvidos na imunidade inata induzida por certos adjuvantes
como o alúmen por ativação do inflamassoma NLRP3 e um bom potenciador da resposta
imunológica humoral (SUTTERWALLA et al 2007).
Quadro 1: Classificação de adjuvantes conforme o mecanismo de ação.
SISTEMA DE ENTREGA DE ANTÍGENOS
IMUNOPOTENCIADORES
Compostos de alumínio Monophosphoryl lipid A (MP)L e derivados sintéticos
Fosfato de Cálcio N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) e derivados
Lipossomas Oligonucleotídeos (CpG, etc.)
Virossomas™ Fita dupla de RNA (dsRNA)
ISCOMS® (complexo estruturado de saponinas e lipídios)
Padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) (enterotoxina ; flagelina)
Micropartículas [e.g., poly-lactide-co-glycolide (PLG )]
Saponina (Quils, QS-21)
Emulsões (e.g., MF59, Montanides) Pequenas moléculas imunopotenciadoras (SMIPs) (e.g., resiquimod [R848])
Vetores virais Citocinas e quimiocinas
Fonte: Adaptado de O'HAGAN & RAPPUOLI, 2004.
27
O desenvolvimento de novos adjuvantes de vacinas é muito importante. Muitas das
vacinas tradicionais formuladas com adjuvantes compostos por alumínio foram
desenvolvidas para induzir uma resposta imune do tipo Th2 com a produção de anticorpos
(IgG1, IgE e certas citocinas) contra moléculas de superfície viral ao em vez de resposta
imune do tipo Th1 (BURDIN et al 2004; PETROVSKY & AGUILLAR 2004). No entanto,
muitos candidatos a novas vacinas para a prevenção de doenças infecciosas (por exemplo,
malária e tuberculose) contem combinações elaboradas de antígeno/adjuvante (por
exemplo, AS04 [alumínio + MPL] e AS01 [lipossoma + MPL + QS21]) destinadas a proteger
pela indução de reposta imune celular principalmente do tipo Th1 (GARCON et al 2007;
BREWER 2006). A busca de mecanismos pelos quais os adjuvantes influenciam a resposta
das células T é a chave para o desenvolvimento de vacinas eficazes.
Estudos demonstraram que células do sistema imunológico de mamíferos são
ativadas por oligodesoxinucleotídeos sintéticos, contendo motivos de citosina-fosfato-
guanina (CPG-motif) não metilados. Esta ativação afeta uma variedade de células que
conduzem à proliferação de células B, macrófagos, bem como a produção de citocinas IL-6,
IL-12, IFN-γ, TNF-α (GURUNATHAN et al 2000). Embora a presença de um motivo de CPG
seja um importante fator para a atividade imunoestimulante do CpG-DNA, a presença
específica de nucleotídeos de purina e pirimidina nas regiões flanqueadoras também são
importantes na atividade imunoestimulante (TIGHE et al 2000). Foi demonstrado que o CPG-
DNA é reconhecido por receptores transmembrânicos de proteínas, TLR 9, que conduz à
ativação de vias de quinases, incluindo a ativação de NFKB e indução de citocinas como
TNF-α e IL-1 (HEMMI et al 2000).
Os lipossomas são esferas sintéticas constituídas por camadas lipídicas que podem
28
encapsular antígenos e atuar tanto como um veículo de entrega de vacinas ou adjuvante. Os
lipossomas têm sido amplamente utilizados em vacinas experimentais. Trabalhos vêm
demonstrando que lipossomas promovem a imunidade humoral e celular, esta ação
imunoadjuvante depende das suas características estruturais, que controlam o destino da
vesícula in vivo, incluindo a interação do antígeno com as células apresentadoras de
antígenos (APCs) (GREGORIADIS et al 1996). A ação de adjuvante de lipossomas é
mediada por receptores para macrófagos e pela sua capacidade para atuar como um
transportador para células B e T, eliminando a necessidade de uma proteína transportadora
garantindo uma eficiente apresentação de antígeno e prolongando a semi-vida do antígeno
(PETROVSKY & AGUILLAR 2004).
29
2 – Justificativa
A tuberculose é uma doença infecciosa re-emergente que permanece como um dos
maiores problemas de saúde pública mundial, agravado depois de 1980 pelo surgimento de
casos de infecção com HIV 1/2 e o aumento da multidroga-resistência (MDR). São
notificados aproximadamente nove milhões de novos casos e 1,4 milhões de mortes por
ano, sendo que 98% destes casos se encontram nos países em desenvolvimento. O Brasil
encontra-se em 19º lugar no “ranking” dos 22 países com maior índice de prevalência de
tuberculose (WHO 2012). Embora a TB possa ser controlada por antibioticoterapia, o
tratamento é demorado e exige medicamentos antimicobacterianos específicos, que na
maior parte do mundo, não são acessíveis à população. Muitas vezes o esquema de drogas
utilizados no tratamento não é suficiente, levando ao surgimento e multiplicidade de cepas
multidroga-resistentes. Uma solução para o controle da tuberculose seria o desenvolvimento
de vacinas novas e melhores, capazes de prevenir a infecção e/ou o desenvolvimento da
doença ativa. A tuberculose é uma doença que acompanha a humanidade por mais tempo
devido ao fato do M. tuberculosis ser capaz de controlar o sistema imunológico, adaptar e
sobreviver no hospedeiro. O conhecimento sobre a dinâmica dessa doença tem como marco
a identificação do bacilo M. tuberculosis (Mtb) por Robert Koch, em 1882, e a partir daí
começou a busca pelo desenvolvimento de uma vacina contra a tuberculose, entretanto, a
mesma resposta imune envolvida na proteção contra a infecção por M. tuberculosis também
está envolvida na patologia da doença e a chave para o desenvolvimento de novas vacinas
é estimular essa resposta imune sem causar patologia (CRUZ et al 2010).
Apesar de muitas falhas, o BCG é a vacina utilizada para a prevenção da tuberculose
30
amplamente usada, administrada logo após o nascimento. A BCG reduz a incidência das
formas graves de TB de forma eficaz na infância, mas sua proteção em adultos varia de 0 –
80% responsável pela atual emergência global. Com 1,4 milhões de mortes em 2011,
somando os indivíduos HIV positivos (WHO 2012), existe uma necessidade premente de
vacinas mais efetivas na prevenção da infecção, reinfecção ou reativação da tuberculose.
Uma ferramenta importante para a construção de novas vacinas contra TB é a fusão de
proteínas contendo antígenos multivalentes, de diferentes estágios da infecção pelo Mtb,
induzindo resposta imune a diferentes estágios da infecção com isso aumentando a eficácia
de proteção contra TB (ANDERSEN 2007). Neste trabalho construiu-se uma proteína de
fusão contendo antígenos multi-estágios: de fase precoce da infecção como Ag85C e
MPT51 e também HspX um antígeno altamente expresso em fase de infecção latente de M.
tuberculosis utilizando clonagem molecular, expressão e purificação de proteínas e avaliou-
se sua utilização como vacina de subunidade proteica em modelo murino de infecção.
31
3 – Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Este trabalho tem como objetivo construir uma vacina de subunidade proteica
contendo a fusão de três antígenos de M. tuberculosis Ag85C, MPT51 e HspX
e avaliar sua imunogenicidade e antigenicidade.
3.2 Objetivos Específicos
Clonar o epítopo antigênico da proteína Ag85C em um vetor de clonagem em
E. coli;
Clonar o epítopo antigênico da proteína MPT51 em um vetor de clonagem em
E. coli;
Clonar o epítopo antigênico da proteína HspX em um vetor de clonagem em E.
coli;
Construir uma fusão dos genes Ag85A-MPT51-HspX e clonar em um vetor de
clonagem pGEM T easy e expressão pET23a em E. coli.
Avaliar a imunogenicidade da proteína de fusão Ag85C-MPT51-HspX em
camundongos.
Avaliar a antigenicidade da proteína de fusão Ag85C-MPT51-HspX em
amostras sorológicas de pacientes com tuberculose.
32
4 – Material e Métodos
4.1 Construção da Proteína de Fusão
4.1.1 Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores
A partir da sequência gênica das proteínas Ag85C (NCBI-GeneID: 886132), MPT51
(NCBI-GeneID:886121), HspX (NCBI-GeneID: 887579), foram desenhados
oligonucleotídeos iniciadores, que permitiram a amplificação das regiões correspondentes
aos epítopos de interesse de cada um dos três genes e ao mesmo tempo a criação de sítios
para enzimas de restrição que permitiu a fusão dos três fragmentos em fase de leitura e
posterior clonagem no vetor expressão E. coli, conforme tabela abaixo:
Tabela 1: Sequências de Oligonucleotídeos Iniciadores usados neste estudo.
Gene Alvo Sequência do Oligonucleotídeo Iniciador
5´to 3´
Sítio de
Restrição
Ag85C amino Tagggtacccggtctgcgggcccaggatg BamHI
Ag85C carboxi taggcggccgcttagttgcctgtcggggacacgcc NheI
MPT51 amino aggggtaccgtctagagcggtgtatctgctggacgcc XbaI
MPT51 carboxi taggcggccgcttactcgagttgctgttgctgttggccatc
ctg ctcccagttggt
XhoI
HspX amino aggggtacctctcgagatggccaccacccttcccg XhoI
HspX carboxy taggcggccgctcagttggtggaccggatctgaatgtg HindIII
33
4.1.2 Amplificação dos genes e construção de fusão gênica Ag85C-MPT51-HspX
A amplificação de parte do gene Ag85C criou na extremidade correspondente à
porção carboxiterminal (COOH), códons para cinco, aminoácido: (a.a) glicina (Gly), um a.a
Alanina (Ala), um a.a Aginina (Arg) e um sítio para a enzima de restrição NheI. Na porção
aminoterminal (NH2) foi criado um sítio para enzima de restrição BamHI. Igualmente com a
amplificação do gene MPT51 criou-se na extremidade COOH terminal cinco códons para os
resíduos Gly, um para Leucina (Leu), um para Ácido Glutâmico (Glu) e um sítio para a
enzima de restrição XhoI, enquanto que na extremidade NH2 terminal foi criada o sítio para a
enzima de restrição XbaI. Finalmente com a amplificação do gene HspX, criou-se um códon
de terminação de tradução e um sítio para a enzima restrição KpnI na extremidade COOH
terminal, e na extremidade NH2 terminal foi criado um sítio para uma enzima de restrição
XhoI (Figura 3). As amplificações foram realizadas em reações contendo 50 µL de Taq DNA
polimerase 1U (Fermentas®), 0,2 mM dNTPs, 10 M de cada oligonucleotídeo iniciador, e 10
g de DNA molde de M. Tuberculosis H37Rv. As condições de reação foram padronizadas:
uma desnaturação inicial de 94°C por 5 min, seguido por 35 ciclos de 92°C durante 1 min,
53°C durante 1 min e 72°C por 45 s. A extensão final foi fixada em 72°C por 10 min.
34
Figura 3: Esquema de construção do vetor recombinante expressando a fusão gênica de epítopos de proteínas de M. tuberculosis. Os epítopos correspondentes aos genes Ag85C (A), MPT-51 (B) e HSPX (C) ficaram separados por sequências hinge contendo os aminoácidos descritos.
35
Os produtos de PCR dos genes Ag85C, MPT51 e HspX foram individualmente
clonados no vetor pGEM-T easy (PROMEGA ®) e células E.coli XLI Blue foram
transformadas com estes plasmídeos recombinantes para amplificação dos genes. Os
plasmídeos recombinantes obtidos foram digeridos com as enzimas de restrição apropriadas
para liberar os insertos. Os insertos digeridos foram purificados pelo Gel Elute Extraction Kit
(5 PRIME®) e a ligação dos três insertos foi realizada com o auxílio da enzima T4 DNA
Ligase (Invitrogen, USA) em uma reação com um volume total de 10 µL, utilizando-se 1 µL
da enzima, e deixada a temperatura ambiente por 1h seguido de uma incubação a 4ºC, por
14 h. Dois microlitros da reação de ligação foi usado em um PCR com os primers Ag85C
amino e HspX carboxi para amplificar o gene de fusão ligada. O produto da PCR
correspondente ao gene de fusão foi purificada pelo Gel Elute Extraction Kit (5 PRIME®) a
partir de gel de agarose e clonados no vetor pGEM-T easy (PROMEGA®), que possui gene
de resistência a ampicilina permitindo a seleção de clones transformantes, seguindo as
orientações do fabricante, transformado em E.coli XLI Blue e plaqueados em meio LB
contendo ampicilina (100 µg/mL). A confirmação da clonagem foi realizada pela extração do
DNA plasmidial de colônias e digestão com a enzima de restrição BamHI e HindIII para
visualizar a liberação do inserto
4.1.3 Digestão com Enzimas de Restrição
Após a obtenção dos plasmídeos recombinantes foi realizada a restrição dos
vetores pGEM T easy e pET 23a, utilizando-se as enzimas HindIII e BamHI (ambas da New
England Biolabs). A digestão enzimática foi realizada em duas etapas, tendo em vista a
necessidade de uso de diferentes tampões próprios das enzimas HindIII e BamHI.
Primeiramente esta foi realizada com a enzima HindIII seguido da digestãp com a enzima
36
BamHI. Para cada 25 μL de DNA foi adicionado, 3 μL de tampão da enzima 10x, da enzima
HindIII 2 μL completando o volume final da reação de 30 μL. A reação foi incubada a 37° C
durante 2 horas. Após incubação, ao produto das reações foram adicionados 3,5 μL de
tampão da enzima 10x, da enzima BamHI 2 μL, 5 μL de BSA para ajustar a concentração de
sal e 9,5 μL de água milliQ completando o volume final da reação para 50 μL. A reação foi
incubada a 37° C durante 2 horas. A digestão foi analisada por eletroforese em gel de
agarose a 1 %.
4.1.4 Ligação do inserto aos Vetores pGEM T easy e pET 23a
Para a ligação do inserto contendo a fusão dos epítopos das proteínas Ag85C,
MPT51 e HspX foi realizado o protocolo do fabricante da enzima T4 DNA Ligase
(Promega®). As reações foram realizadas conforme Tabelas abaixo:
37
Tabela 2: Reação de ligação do gene contendo a fusão de proteínas ao vetor pET23a.
Reagentes VOLUME
pET 23a (50 ɳg/µL) 6 µL
Inserto (100 ɳg/µL) 5 µL
Tampão 10X (300mM Tris-HCl pH 7.8 , 100mM
MgCl2, 100mM DTT e 10mM ATP) 1,5 µL
T4 DNA Ligase (3u/µL) 1 µL
Água q.s.p. 15 µL
Tabela 3: Reação de ligação do gene contendo a fusão de proteínas ao vetor pGEM T easy.
Reagentes VOLUME
pGEM T easy (50 ɳg/µL) 1 µL
Inserto (100 ɳg/µL) 3 µL
Tampão 10X (300mM Tris-HCl pH 7.8 , 100mM
MgCl2, 100mM DTT e 10mM ATP) 1 µL
T4 DNA Ligase (3u/µL) 1 µL
Água q.s.p. 10 µL
Esta reação foi incubada a 4 °C por 16 horas. O produto de ligação foi usado para
eletrotransformação de células hospedeiras como descrito posteriormente.
38
4.1.5 Análise eletroforética em gel de agarose
A análise do DNA amplificado foi realizada por eletroforese em gel de agarose 0,5 ou
1 %. Aos produtos das reações foram adicionados tampão amostra 5 vezes concentrado e o
material após aplicação no gel foi submetido a eletroforese em tampão TBE (Tris-borato 40
mM; EDTA 1 mM pH 8,3). As corridas eletroforéticas tiveram duração aproximada de 2 - 3
horas (50 V, 25 mA). Os fragmentos de DNA foram visualizadas no gel, sob luz ultravioleta
após a coloração com 0,5 µg/mL de brometo de etídio (Gibco) e a imagem foi capturada
através do Gel Doc™ XR (BIO RAD).
4.1.6 Construção do vetor de expressão
O gene correspondente a fusão foi liberado do plasmídeo pGEM-T easy
(PROMEGA®) recombinante pelas digestões com as endonucleases BamHI e HindIII e
purificados pelo Gel Elute Extraction Kit (5 PRIME®). Após a purificação, o fragmento de
DNA contendo a proteína de fusão foi clonado no vetor de expressão pET23a (Novagen/
Biosciences), previamente digeridos com as mesmas enzimas. Estes vetores
comercializados pela Novagen são caracterizados pela presença do forte promotor do
bacteriófago T7, que é capaz de produzir altos níveis de expressão da ORF clonada sob seu
controle. O sistema de ligação foi transformado em E. coli XL1 Blue e plaqueado em LB/Amp
para selecionar colônias recombinantes e confirmar a construção do vetor recombinante
através da digestão dos plasmídeos com as enzimas de restrição BamHI e HindIII. O vetor
recombinante pET23a/Ag85C-MPT51-HspX foi transformado em E. coli BL21(DE3) pLysS
ou seja, uma linhagem bacteriana que possuem uma cópia do gene da RNA polimerase do
fago T7 em seu genoma, e plaqueadas em meio LB contendo ampicilina (100 µg/mL),
39
cloranfenicol (20 µg/mL) , IPTG (0,4mM) que induz a expressão de genes sob o controle do
operon lac e os transformantes foram analisados para a correta montagem das fusões
gênicas.A sequência do gene contendo a proteína de fusão foi verificada pelo
seqüenciamento do vetor pET23a/Ag85C-MPT51-HspX recombinante usando primers
universais, bem como primers internos em um sequenciador de DNA capilar ABI 3130
(Applied Biosystems, CA).
4.1.7 Extração Plasmidial por Lise Alcalina.
Uma colônia bacteriana isolada confirmadamente positiva obtida na placa com
devido antibiótico, foi selecionada e inoculada em um tubo de cultura contendo 5 mL de meio
LB-caldo com antibiótico adequado, que foi incubado sob agitação a temperatura de 37° C
por 16 horas. Após este período a cultura foi centrifugada a 5.000 x g durante 10 minutos a
10°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células foi ressuspendido em 210 μL
de solução I (150 mM de Tris-HCl pH 8,0 e 10 mM de EDTA pH 8,0 ) contendo 1μL de
Ribonuclease e incubação por 5 minutos a temperatura ambiente. A seguir foi adicionado
210 μL de solução II (120 mM de NaOH e 1% de SDS) e o tubo foi agitado por inversão até
que a suspensão obtivesse uma consistência viscosa, caracterizando a lise celular. Foram
adicionados 280 μL de solução III (3 M de acetato de sódio, 2 M de ácido acético glacial) e o
tubo foi agitado por inversão. O sobrenadante foi recolhido por centrifugação a 12.000 x g
por 15 minutos e transferido para um microtubo de 1,5 mL novo. Foram adicionadas 500 μL
de isopropanol 100 % (Merck) e deixados à temperatura ambiente por 10 minutos. A solução
foi centrifugada novamente a 12.000 x g por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o
DNA plasmidial precipitado no fundo do tubo foi lavado duas vezes com 500 μL de etanol a
70% gelado. A seguir o DNA foi seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 30 μL de
40
água MilliQ.
4.2 Preparação de bactérias E. coli XL1 Blue e E. coli BL21(DE3) pLysS eletrocompetentes
A partir de uma colônia isolada da bactéria E. coli BL21(DE3) pLysS ou E. coli XLI
Blue, foi feita uma cultura por 16 h, sob agitação a 200 rpm a 37°C, em meio LB líquido
(Difco, USA) com cloranfenicol (10 µg/mL) para bactérias E. coli BL21(DE3) pLysS e sem
antibiótico para bactérias E. coli XLI Blue. Posteriormente, o pré-inóculo foi diluído 1:100 em
meio SOB (triptona 2%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 0,05%, KCl 250 mM, MgCl2 1M) e
mantido a 200 rpm e a 37°C até atingir a densidade óptica (DO) de aproximadamente 0,5 –
0,6 a 660 ɳm. A cultura foi centrifugada à 5000 g, por 10 min a 4°C e as células foram
lavadas 2 vezes com igual volume de Glicerol 10% gelado. A cultura foi centrifugada
novamente e o precipitado ressuspendido em glicerol 10% gelado. Alíquotas de 50 µL foram
separadas e imediatamente armazenadas a -70°C para serem usadas nas transformações
por eletroporação.
4.3 Transformação das bactérias por choque elétrico
E. coli BL21(DE3) pLysS ou E. coli XL1 Blue competentes foram transformadas com
plasmídeos ou sistemas de ligação por eletroporação. Para eletroporação, uma alíquota
estoque de bactéria competente foi misturada com 1-3 µL de DNA plasmidial ou sistema de
ligação em cuveta de eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsos de 2,5kV, 25 µF e
1000 Ω, num eletroprorador de pulsos. Após eletroporação, o conteúdo das cuvetas foi
ressuspendido em 1 mL de meio SOC (triptona 2%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 10mM,
KCl 2,5mM, MgCl2 10mM, MgSO4 10mM, Glicose 20mM) sem antibiótico e incubado a 37ºC
por 1h antes de ser plaqueado sobre meio LB agar contendo ampicilina (100 µg/mL) e
cloranfenicol (20 µg/mL). Foi incubado por 24h a 37ºC em estufa com atmosfera úmida
41
contendo 5% de CO2 para seleção de colônias transformadas.
4.4 Indução da expressão da proteína de fusão com IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)
A partir das colônias transformantes de E. coli BL21(DE3) pLysS com pET23a/Ag85C-
MPT51-HspX ou controle pET23a sem o inserto foi preparado uma cultura em 5 mL de caldo
LB contendo ampicilina (100 µg/mL) e cloranfenicol (10 µg/mL) e incubada por 16h à 37º
sob agitação.
Posteriormente, o inóculo foi diluído 1:100 em caldo LB contendo ampicilina (100
µg/mL) e cloranfenicol (20 µg/mL) e mantido a 200 rpm a 37°C até atingir a DO de
aproximadamente 0,6 – 0,8 a 660 ηm. Para induzir a expressão de proteína foi adicionado
IPTG (0,4mM) e a cultura foi mantida a 200 rpm em 37°C por 4h. Uma alíquota controle da
cultura foi incubada nas mesmas condições acima, porém sem a adição de IPTG. Ao final do
tempo de indução, as células foram coletadas por centrifugação 5000 xg, por 10 min a 4°C
para análise da expressão de proteína por SDS-PAGE.
4.5 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida contendo Dodecil Sulfato de Sódio (SDS-PAGE)
Os géis de SDS-PAGE foram feitos em sistema descontínuo (Bio Rad Mini Protean II),
constituído de gel separador com 12% de acrilamida (1,5 mL de Tris-HCl 3M pH 8.8; 2,4 mL
de acrilamida/bisacrilamida 30%; 20µL de SDS a 10%; 45µL de APS a 10%; 5µL de TEMED)
e o gel de empilhamento com 4% de acrilamida (1,5mL de Tris-HCl pH:6.8; 400µL de
acrilamida/bisacrilamida; 30µL SDS a 10%; 30µL de APS a 10%; 6µL de TEMED) em
tampão de corrida Tris-Glicina (Tris-base 1,5%; Glicina 7,2%; SDS 0,5%: pH:8.3). A corrente
elétrica utilizada foi de 80v até as amostras alcançarem o gel de separação, em seguida,
42
ajustadas para 120v até o fim da corrida.
Após a corrida eletroforética o gel foi corado com uma solução Coomassie Brilliant
Blue (0,3% de Coomassie Brilliant Blue, 45% de metanol, 10% ácido acético) por 2h sob
agitação, seguido por descoloração com solução descorante (45% ácido acético, 10%
metanol) e a imagem foi capturada através do Gel Doc™ XR (BIO RAD).
4.6 Análise da expressão das proteínas recombinantes por Imunoblotting anti-Histag
Após a corrida de eletroforese, o gel de poliacrilamida foi colocado no sistema de
transferência em contato com uma membrana de nitrocelulose (Trans-Blot® Transfer
Medium, BIO-RAD), ambos entre papel filtro Watman. O sistema foi colocado em uma cuba
de transferência Trans-Blot (BIO-RAD), sendo esta preenchida com tampão de transferência
(1 mM de glicina,1mM Tris). A eletrotransferência foi realizada em câmara fria com 400 amp
ou 100 V por 60 minutos. Após a transferência de proteínas do gel de poliacrilamida para a
membrana de nitrocelulose e coloração por Ponceou Red foi realizado o bloqueio da
membrana de nitrocelulose com uma solução de 5% de Leite Desnatado em PBS por 2h a
temperatura ambiente (TA). A membrana de nitrocelulose foi lavada com PBS 0,05% Tween
20, 3 vezes por 5 minutos para incubação com anticorpo anti-histag (Monoclonal Anti-
polyHistidine Peroxidase Conjugate, Clone HIS-1. Sigma-Aldrich®) diluído 1:200 em PBS
0,05% tween 20 e 1% BSA por 2 h à TA. Este anticorpo reconhece a presença de um cauda
de histidina produzida a partir da expressão em vetor pET23a. A membrana foi lavada com
PBS 0,05% tween 20, 3 vezes por 5 minutos seguidos pela revelação do blot com DAB
(Sigma-Aldrich®).
43
4.7 Purificação de proteína de fusão recombinante Ag85C-MPT51-HspX:
A proteína de fusão recombinante foi purificada com base na presença de
6xHis-tag no N-terminal através da aplicação em colunas de cromatografia por afinidade de
Ni-NTA (Qiagen, Alemanha) sob condição desnaturante. Para purificar a proteína, uma
preparação em larga escala de células de E. coli que expressa a proteína de fusão
recombinante (pET23a/Ag85C-MPT51-HspX) foi cultivado em 1 litro de caldo LB. Ao final o
sedimento celular foi coletado por centrifugação e ressuspendido em 8 mL de tampão de lise
de desnaturação (6 M guanidina HCl, fosfato de sódio 20 mM, pH 7,8, 500 mM NaCl). Após
a adição dos lisados sobre a coluna de Ni-NTA e extensas etapas de lavagem, a proteína de
fusão recombinante foi eluída com tampão de eluição (8 M uréia, 20 mM de Na2HPO4, 500
mM de NaCl, 500 mM de imidazole, pH 4,0). A proteína foi dialisada em tampão de diálise
contendo 50 mM de Tris e 1 mM de EDTA durante 48 h, com mudança de tampão a cada 12
h para remover a ureia e imidazol. A pureza da proteína recombinante foi então avaliada em
SDS-PAGE. A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad
Protein Assay ®), utilizando albumina de soro bovino como padrão de acordo com as
instruções do fabricante.
4.8 Animais
Foram utilizados camundongos BALB/c, fêmeas com idade entre 4-8 semanas,
proveniente do biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG, mantidos
em isoladores em cabine de segurança biológica classe 3 (BL3) com água e dieta ad libitum.
A temperatura ambiente foi mantida entre 20-24ºC, com umidade relativa entre 40-70% com
ciclos de luz/escuro de 12h.
O uso dos camundongos foi conduzido de acordo com as orientações da Sociedade
44
Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL/COBEA)
4.9 Grupos Experimentais
Os animais foram separados ao acaso em 4 grupos de 5 animais, cada grupo
recebeu o seguinte tratamento:
Grupo 1 (PBS): camundongos imunizados 3 vezes com 100 µL de PBS estéril
subcutâneo (sc) com intervalo de 15 dias entre cada imunização;
Grupo 2 (Lipossoma): camundongos imunizados 3 vezes com 100 µL de lipossoma,
subcutâneo (sc) com intervalo de 15 dias entre cada imunização;
Grupo 3 (Lipossoma + CpG-DNA): camundongos imunizados 3 vezes com100 µL de
lipossoma contendo CpG-DNA (20µg), subcutâneo (sc) com intervalo de 15 dias entre cada
imunização;
Grupo 4 (Lipossoma +CpG-DNA+Proteína de Fusão): camundongos imunizados 3
vezes com100 µL de lipossoma contendo CpG-DNA (20µg) e Proteína de Fusão (Ag85C-
MPT51-HspX) (10µg), subcutâneo (sc) com intervalo de 15 dias entre cada imunização.
As formulações vacinais foram preparadas em lipossoma pelo Laboratório de
Tecnologia Farmacêutica (FARMATEC-UFG), empregando as metodologias de hidratação
do filme lipídico (HFL) com CpG-DNA (20µg) sem e com a proteína de fusão (Ag85C-
MPT51-HspX) (10µg). Lipossomas obtidos pelo método HFL foram preparados da seguinte
maneira: a fase orgânica foi colocada em um balão de fundo redondo, no qual se formou um
filme por evaporação do clorofórmio induzida por atmosfera de N2. O filme foi hidratado com
a fase aquosa (tampão IPB - Isotonic Palitzsch Buffer) e levado ao agitador tipo vórtex, após
10 minutos de sonicação em processador ultrassônico (Misonix 2020) resultou em uma
preparação semitransparente contendo vesículas unilamelares pequenas (SUVs) de
tamanho uniforme. Após a sonicação, as amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 05
45
minutos (DINIZ et al 2007).
4.10 Obtenção de soro
O soro dos camundongos foi obtido após coleta de sangue por punção retro-orbital,
15 dias após a terceira imunização. As amostras foram incubadas por uma hora a 37ºC e
centrifugadas a 1200 xg, a 4ºC por 15 minutos para retração do coágulo e separação do
soro, e posteriormente armazenados a menos 20ºC. Os níveis de anticorpos anti-proteína de
fusão (Ag85C-MPT51-HspX) IgG2a e IgG1 foram determinados através da técnica de
ELISA, descrita no item 4.11.
4.11 Ensaio Imunoenzimático (ELISA).
Placas de poliestireno (Nunc®) de 96 poços foram inicialmente sensibilizadas com
proteína de fusão (Ag85C-MPT51-HspX) (5 μg/mL) diluída em tampão carbonato /
bicarbonato de sódio 0,05M (pH 9,6), e incubadas a 4ºC por 16 horas. Posteriormente a
placa foi lavada e incubada por uma hora a 37ºC com tampão carbonato de sódio (PBS) 1X
contendo 1% de leite Desnatado. A essa etapa seguiu-se a adição de 50 μL das amostras
de soro diluídas 1:1000 , incubando-se por 2 horas a 37ºC, sendo depois lavada 6 vezes
por 5 minutos com PBS 0,05% tween 20. Os anticorpos conjugados à biotina, diluídos a
1:5000, foram adicionados: anti-IgG1 e anti-IgG2a de camundongo (Pharmingen). As placas
foram incubadas por 1 hora a 37ºC sendo depois lavada 6 vezes por 5 minutos com PBS
0,05% tween 20. Foi adicionada estreptoavidina peroxidase, diluída a 1:1000 foi adicionada
e as placas foram novamente incubadas por 1 hora a 37ºC sendo depois lavada 6 vezes por
5 minutos com PBS 0,05% tween 20. A reação foi então revelada com o substrato orto-
fenilenodiamina (OPD) e bloqueada adicionando-se ácido sulfúrico a 4N. A leitura da
46
absorbância foi realiza em 492 ηm em leitor de ELISA (Multiskan Thermo Labsystems).
4.12 Citometria de Fluxo e Culturas celulares.
Após a eutanásia dos animais, os baços e pulmões foram retirados e divulsionados.
As suspensões celulares, após a lise dos eritrócitos com solução de Lise de eritrócitos
(0,82% de NH4Cl, 0,1% KHCO3, 0,0037% EDTA) foram lavadas com RPMI incompleto e o
sedimento celular coletado através de centrifugação a 1500 rpm durante 5 minutos.Linfócitos
obtidos do baço e do pulmão foram distribuídos em placas de cultura de 96 poços (Nunc),
contendo 105 células em um volume de 200 µL de meio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, USA),
contendo 100U/ml de penicilina (Sigma), 100 μg/ ml de estreptomicina (Sigma), 2μg de L-
glutamina (Sigma) e 10% de soro fetal bovino. Posteriormente, foram adicionados diversos
estímulos: ConA (5 μg/mL); proteína de fusão (Ag85C-MPY51-HspX) (5 μg/mL) e sem
estímulo apenas meio RPMI e 4 horas de incubação a 37ºC em ambiente contendo 5% de
CO2 com monensina. Para análise fenotípica das moléculas de superfície e para análise de
citocinas intra-celulares “ex vivo”. Na realização da análise fenotípica das células, as
suspensões celulares foram incubadas com anticorpos conjugados a FITIC anti-TNF-α
(eBioscience, Cat. Nº11-7321-82); a APC anti-IFN-γ (eBioscience, Cat. Nº17-7311-82); a
PerCP anti-CD4 (BD Pharmingen™, Cat. Nº553052).
4.13 Análise Estatística
O teste “t” de student foi usado para comparar 2 grupos nos casos com distribuição
normal. Nos outros casos foram utilizados testes não-paramétricos, como o teste de Mann-
Whitney para comparação os grupos.
As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando a
47
probabilidade de rejeição da hipótese de nulidade for menor que 5%.
48
CAPÍTULO 2 – Immunogenicity of a Fusion Protein CMX
1º Artigo – Immunogenicity of a Fusion Protein Containing Immunodominant Epitopes of Ag85C, MPT51, and HspX from Mycobacterium tuberculosis in Mice and Active TB Infection Autores: Eduardo Martins de Sousa, Monalisa Martins Trentini, João Alves de Araújo Filho, André Kipnis, Ana Paula Junqueira-Kipnis. Artigo publicado na Revista: PlosOne
49
Immunogenicity of a Fusion Protein Containing Immunodominant Epitopes of Ag85C, MPT51, and HspX from Mycobacterium tuberculosis in Mice and Active TB Infection Eduardo Martins de Sousa, Adeliane Castro da Costa, Monalisa Martins Trentini, João Alves de Araújo Filho,
André Kipnis, Ana Paula Junqueira-Kipnis* Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil
Abstract
Tuberculosis (TB) remains a major global health problem. The only vaccine against tuberculosis, attenuated Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG), has demonstrated relatively low efficacy and does not provide satisfactory protection against the disease in adults. More effective vaccines and better therapies are urgently needed to reduce the global spread of TB. This study evaluated the immunogenicity of a recombinant M. tuberculosis Ag85C-MPT51-HspX fusion protein (CMX) in mice and individuals with active tuberculosis. BALB/c mice were immunized with the CMX protein liposome-encapsulated with CpG DNA or with CpGDNA liposome-encapsulated, liposome or saline as negative controls. The immunization produced high levels of anti-CMX -specific IgG1 and IgG2a antibodies and induced an increase
in the relative and absolute numbers of specific TCD4 IFN-ɤ+ and TNF-α
+ cells in the spleen. Sera from a cohort of
individuals with active tuberculosis contained higher levels of IgG and IgM that recognized CMX when compared to healthy individuals. In conclusion, this protein was shown to be immunogenic both in mice and humans.
Citation: de Sousa EM, da Costa AC, Trentini MM, de Arau´jo Filho JA, Kipnis A, et al. (2012) Immunogenicity of a Fusion Protein Containing Immunodominant Epitopes of Ag85C, MPT51, and HspX from Mycobacterium tuberculosis in Mice and Active TB Infection. PLoS ONE 7(10): e47781. doi:10.1371/journal.pone.0047781 Editor: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, India Received July 26, 2012; Accepted September 17, 2012; Published October 25, 2012 Copyright: 2012 de Sousa et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was supported by following CNPq grants: 472909/2011-8, 301976/2011-2, 561004/2010-2, 301198/2009-8 and EDM received a graduate
fellowship from CAPES (Nº 5015/10-3). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: [email protected]
Introduction
Tuberculosis (TB) is an infectious disease arousing great public
health concerns [1]; there were 1.1 million deaths from TB and
8.8 million new cases in 2010, according to WHO [2]. The
epidemic of tuberculosis associated with HIV co-infection has
increased the incidence of TB considerably, especially in
developing countries. The main obstacles to controlling TB
worldwide are multidrug resistance, the absence of concise
diagnostic methods, and variations in the protective effects of the
BCG vaccination. In some developing countries, such as Brazil, TB is primarily
diagnosed in the clinic by radiological evaluation of the lungs and
other tests, such as the tuberculin skin test (TST) and detection of
acid-fast bacilli in sputum samples by direct staining or by
microbiological culture. However, the currently used tests have not
been effective in further reducing the incidence of TB in these
countries. Brazil is 19th
out of the 22 countries responsible for 80%
of the TB cases worldwide. According to the Ministry of Health,
seventy one thousand new cases of tuberculosis were diagnosed in
Brazil in 2010, and consequently, TB is considered endemic in Brazil.
In Brazil, 86.7% of the pulmonary TB cases are diagnosed by acid-
fast bacilli detection in sputum samples [3]. Worldwide estimates
indicate that about two billion people have latent
infections, and 10% of these individuals will develop active disease [4].
New tests to diagnose TB and latent TB infections (LTBI) have
been developed based on the evaluation of the specific cellular
immune response against Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the
causative agent of TB. These tests evaluate the production of
IFN-ɤ by cells stimulated with two specific Mtb antigens (ESAT-
6 and CFP-10), which are absent from the BCG vaccine strains
and most environmental mycobacteria [5]. The interferon-ɤ
release assay (IGRA) has improved the capacity to diagnose TB
and LTBI over the tuberculin skin test (TST), as a consequence of
the increased specificity [6]. In a TB endemic area, where most of
the population has already been in contact with Mtb, an IGRA
response may reflect the increased bacterial replication associated
with the development of active TB [7]. Some advantages of the
IGRA for the diagnosis of TB and LTBI include the following:
the test requires only one laboratory visit, the results are rapid,
and the criteria for interpreting the results are less subjective than
for the TST. The main disadvantages of the IGRA include the
requirements for laboratory infrastructure and skilled personnel to
perform the tests. Another recently developed approach to
improve TB diagnosis is the Xpert MTB/RIF test, a molecular
detection test that can concomitantly detect Mtb DNA in the
sputum samples and mutations in the major genes responsible for
Rifampin (RIF) resistance [8]. The rapid availability of result
50
provided by the Xpert MTB/RIF test, together with the analysis of
resistance to chemotherapeutics provides another choice for the
detection of the bacilli in sputum samples from patients. However, the
ability of this test to exclude the disease is not optimal because the
sensitivity for the detection of bacilli in extrapulmonary TB is less
than 50% [9]. In addition, the use of the Xpert MTB/RIF test for the
diagnosis of TB in developing countries, such as places in Africa
where most people are co-infected with TB-HIV, is highly cost-
effective [10]. Therefore, developing a reliable diagnostic method to
effectively discriminate between TB and LTBI, which can rapidly
generate results and is easy to perform at a low cost, is of utmost
importance. An alternative to improving the immunological-based diagnos-tic
tests is the use of a source of recombinant Mtb proteins produced
under different growth conditions that can be detected in vitro or
during different stages of in vivo infection. Thus, the association of
proteins recognized at different stages of human infection could
efficiently identify individuals infected with TB at different stages of
disease development. Our group and others have demonstrated that
the antigens MPT51 and HspX are recognized by the immune
systems of individuals with active and latent TB infections [11–13].
Analyzing both the humoral and cellular immune response to MPT51,
for example, a discrimina-tion between patients with active TB versus
healthy individuals was observed, while the humoral immune
response to HspX seems to be associated with latency. The MPT51
protein belongs to the family of α/ß non-catalytic hydrolases that are
likely to be involved in bacterial adhesion to the extracellular matrix.
HspX, or alpha-crystallin protein, is expressed preferentially during
the lag phase of the Mtb infection [14], and has also been
demonstrated in bacilli that are confined within granulomas or
macrophages, under conditions of limited energy sources and oxygen
deprivation. Furthermore, HspX epitopes are also recognized by CD4
and CD8 T cells from patients with active TB [15].
The Ag85 complex is a family of 30–32 kDa proteins (Ag85A,
Ag85B, Ag85C) secreted by Mtb. Antigen 85 is involved in the
formation of the mycobacteria cell wall by catalyzing the transfer of
mycolates, leading to the synthesis of trehalose dimycolate (TDM),
which is an important mycobacteria virulence factor [16]. Ag85A is a
major component of the Ag85 complex, which confers protection
when used as subunit vaccine in mice and guinea pigs challenged
with Mtb [17]. Ag85 has been shown to be crucial for Mtb growth in
macrophage cell lines and is also recognized at the early stages of
experimental TB infection and by T cells from TB patients [18–19].
Ag85C has a specific mycolyltransferase activity during cell wall
biosynthesis that is distinct from Ag85A and Ag85B [20]. Ag85C can
be recognized by T CD4 and CD8 cells from individuals with active
TB. Moreover, sera from children with TB infections distinctly
recognize Ag85C, despite exhibiting negative acid fast staining
smears and Mtb cultures [21–22]. In the present study, we have assessed whether a recombinant
fusion protein (CMX), containing immunodominant epitopes of the Ag85C, MPT51, and HspX proteins from M. tuberculosis, was immunogenic in mice, and could be specifically recognized by the humoral immune response in individuals with active TB. Materials and Methods Ethics Statement
This study was carried out in strict accordance with the
recommendations in the Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals of Sociedade Brasileira de Animais de Laboratorio and
COBEA- Colégio Brasileiro de Experimentacão Animal. The
protocol for this work was approved by the
Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis Committee on the Ethics of Animal Experiments of the University Federal de Goias (Permit Number: 229/11).
The ethical requirement for research on human subjects was
obtained. The Ethical Committee from Universidade Federal de
Goias (CoEP - Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal de Goias) approved this work and the informed consent
using the CNS196/96 that follows the Declaration of Helsinki. All
patients provided written informed consent for the collection of samples and subsequent analysis. (Permit number: 002/05). Collection of Blood Serum
Blood samples were collected from individual TB patients at the Anuar Auad Hospital (Anuar Auad Tropical Disease Hospital, HDTAA) in Goiânia, Goiás and the Reference Center for Diagnosis and Therapy, Brazil between March 2005 and March 2006.
Forty-three sera samples from healthy controls, involving
twenty-two samples from individuals vaccinated with BCG and
twenty-one samples from patients of unknown health status, were
included in this study. Fifty-three samples from individuals with active TB were analyzed; among these patients, forty-seven were
TB-positive by smear microscopy. The details regarding the study
population are shown in Table 1. Criteria for Inclusion and Exclusion
The volunteers were selected independently of sex, age, and residency in the state of Goias, Brazil (Table 1).
The patients were enrolled at two Public Health Units of Goiás, the
Dr. Anuar Auad Tropical Diseases Hospital and the Reference Center
for Diagnosis and Therapy, between March 2005 and March 2006.
The inclusion criteria for the subjects included a diagnosis of TB
according to the Brazilian Ministry of Health guidelines [23], which
considers patients who present with clinical manifestations, such as
fever and productive cough, for more than three weeks, a positive
acid-fast smear or Mtb culture, and a chest x-ray suggestive for the
disease as having active TB infection. Individuals with other chronic
diseases, immunosuppressed individuals, such as those with HIV
infections or using suppressive drugs (steroids), pregnant women or
those without a confirmed diagnosis, or individuals under the age of
18 were excluded. The control group was randomly selected among healthy
volunteers in the community. They were residents of the state of Goia´s who met the following criteria: not known to have had prior contact with an indexed case of TB, TST non-reactive, HIV-
seronegative and without manifestations of chronic or parasitic disease. We excluded individuals using immunosuppressive drugs
Table 1. Clinical and epidemiological characteristics of the individuals used in the study.
Group Healthy Controls Active TB
Gender (Male/Female) 32/11 40/13
Average Age (Variance) 35,2: (19–73) 41,5: (20–73)
BCG (Vaccinated/NIa) 22/21 39/14
AFBc (Positive/Negative/NI
a) - 47/04/02
Culture (Positive/Negative/NRb) - 16/01/36
aNo information.
bNot tested.
cAcid-fast bacilli smear.
doi:10.1371/journal.pone.0047781.t001
51
and pregnant women. The control group was paired according to sex and age (66 years) with patients with active tuberculosis.
The clinical and epidemiological data about the individuals with active TB were obtained after review of their clinical charts. The data from healthy controls were obtained upon recruitment. PCR Amplification, Cloning and Sequencing
The nucleotide sequences corresponding to epitopes 85 to 159 bp of Ag85C (RV0129c) and 91 to 112 bp of MPT51 (RV3803c) and the entire of HspX gene (RV2031c) were PCR amplified from the M. tuberculosis H37Rv genome using primers (Table S1) designed to facilitate posterior cloning and fusion construction.
The PCR products of the Ag85C, MPT51 and HspX genes
were individually cloned into the pGEM-T easy vector
(PROMEGA®). Each recombinant plasmid was digested with the
appropriate enzymes (as listed in Table S1). The digested genes
where purified from agarose gels and used in a 15 µL ligation
reaction. Two microliters of the ligation reaction was used in a
new PCR containing primers for the amino portion of Ag85C and
the carboxy portion of HspX to amplify the ligated fusion gene.
The PCR product corresponding to the fusion gene was purified
from an agarose gel and cloned into the pGEM-T easy vector
(Fig. S1). Cloning into the pET23a Vector and Expression of the Fusion Gene
The recombinant pGEM-T vector was digested with HindIII and
BamHI to release the fusion gene. After agarose gel elution, the
digested fusion gene was ligated into the pET23a expression vector
(Novagen Biosciences), which had previously been digested with the
same enzymes. The recombinant pET23a construct containing the
fusion gene (pET23a/CMX) (Fig. S2) had its sequence checked with
a BI 3130 capillary DNA sequencer (Applied Biosystems, CA) and
was then inserted into the expression host E. coli BL21 (DE3) pLysS.
Bacteria containing the recombinant expression vector were grown in
Luria–Bertani (LB) broth supplemented with ampicillin (100 µg/mL)
and chloramphenicol (20 µg/mL). When the bacterial cells reached
mid-log growth (OD600 measurements of 0.4–0.6), the expression of
the fusion protein was induced by the addition of isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside (IPTG) to a final concentration of 1 mM, and
the incubation continued at 37ºC for 4 h. Similar culture conditions
without the addition of IPTG were used to control for protein
induction. The bacterial cells were collected by centrifu-gation
(10,000 g for 5 min), and the cell pellets were suspended in sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
sample buffer to analyze the expression of the recombinant proteins.
E. coli BL21 (DE3) pLysS carrying the empty pET23a vector was
used as a negative control. SDS-PAGE and Western Blotting
Western blotting was performed based on the identification of
the histidine tag expressed at the carboxyl end of the recombinant
fusion protein, provided by the pET23a vector. Accordingly, the
SDS-PAGE separated proteins were electrotransferred onto a
nitrocellulose membrane and incubated with a 1:2000 dilution of
horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-penta-His antibody
(Sigma-AldrichH). The presence of histidine tagged proteins was
detected by incubation with diaminobenzidine (DAB) substrate
(Roche, Germany).
Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis Purification of Recombinant Fusion Protein
The recombinant fusion protein was purified based on the presence of the 6 X His-tag at the N-terminus using Ni-NTA affinity columns (Qiagen, Germany) under denaturing conditions. To purify the protein, a large-scale preparation of E. coli cells
expressing the recombinant fusion protein (pET23a/CMX) was grown in 1 L of LB. The final bacterial cell pellet was
resuspended in 8 mL of denaturing lysis buffer (6 M guanidine HCl, 20 mM sodium phosphate, pH 7.8, 500 Mm NaCl). After
the lysates were loaded on the Ni-NTA column and extensively washed, the recombinant fusion protein was eluted with elution
buffer (8 M urea, 20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 500 mM
imidazole, pH 4.0). The purity of the recombinant protein was then evaluated by SDS-PAGE. The protein concentration was determined by the Bradford assay (Bio-Rad
® Protein Assay) using
bovine serum albumin as a standard, according to the manufacturer’s instructions. Indirect ELISA for Detection of Human Serum IgM and IgG
Ninety-six well polystyrene plates (Costar) were adsorbed with the fusion protein (10 µg/mL) diluted in 0.015 M carbonate-bicarbonate buffer, (pH 9.6). After incubation for 18 h at 4–8ºC, the plates were blocked using 100 mL of blocking solution, composed of carbonate-bicarbonate buffer and 1% skim milk, and again incubated for two hours at 37ºC. Fifty microliters per well of the serum samples from pulmonary TB patients and healthy controls diluted 1:40 in PBS containing 0.06% skim milk were added and incubated at 37ºC for 2 h. After incubation, the plates were washed six times with PBS containing 0.05% Tween 20, and 50 µL of human IgM and IgG conjugated to horseradish peroxidase (Sigma Aldrich
®) were added at concentrations of
1:2,500 and 1:10,000, respectively, diluted in PBS containing 0.06% skim milk and incubated for one hour at 37ºC. The washes were repeated and 50 µL of citrate-phosphate buffer containing
OPD (1 mg/mL) and 20 µL of H2O2 were added and incubated
for 15 min at room temperature in the dark. After this period, 4 N
H2SO4 was added to block the enzymatic reaction. The samples
were read using an ELISA reader (Multiskan Plus) at 492 ɳm. The samples were tested in duplicate, and the mean optical density was expressed as the absorbance. Animals
Specific pathogen-free 4–6 week old BALB/c female mice
from the animal care facility of the Institute of Tropical Pathology
and Public Health at UFG were maintained in isolators in class 2
biosafety level (BL2) cabinets with water and food provided ad
libitum. The temperature was maintained between 20–24ºC with
the relative humidity set between 40–70%, and 12 h light/dark
cycles. The use of mice was conducted in accordance with the
guidelines of the Brazilian Society of Animal Science Laboratory
(SBCAL/COBEA). The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the Universidade Federal
de Goiás, (Permit Number: 229/11). Immunization
Mice were immunized three times with an interval of 15 days between immunizations. Ten micrograms of the CMX fusion protein combined with 20 µg of CpG DNA (ODN 1826, InvivoGen
®) liposome-encapsulated in a volume of 100 µL were
subcutaneously (sc) injected into the neck. The control groups received 100 µL of the combination of 20 µg liposome-encapsu-lated CpG DNA or 100 µL of liposome alone. The liposome
52
vaccine formulations were prepared by the Laboratory of Pharmaceutical Technology (FARMATEC-UFG), using the lipid film hydration (HFL) method. Negative control mice received 100 µL of sterile saline. Serum Collection
Serum samples were obtained 15 days after the third immunization. The samples were incubated for one hour at 37ºC, centrifuged at 1,200 g at 4ºC for 15 min for serum separation, and
stored at -20ºC. ELISA of Mouse Samples
Ninety-six well polystyrene plates (Nunc®) were initially
coated with the CMX fusion protein or recombinant MPT51 or
recombinant HspX or Ag85C (5 µg/mL) diluted in 0.05 M sodium
carbonate/bicarbonate buffer (pH 9.6) and incubated at 4ºC for 16
h. Subsequently, the plate was washed and incubated for one h at
37ºC with sodium carbonate buffer (PBS) containing 1% skim
milk. The samples were diluted 1:1,000, added to the wells and
incubated for 2 h at 37ºC. After several washes, 1:5,000 diluted
biotin-conjugated antibody was added to the plates (anti-IgG1 and
anti-mouse IgG2a; Pharmingen®). The plates were incubated for 1
h at 37ºC, after which time streptavidin peroxidase diluted
1:1,000 was added, and the plates were again incubated for 1 h at
37ºC. The reaction was then developed with citrate phosphate
buffer containing ortho-phenylenediamine (OPD) and hydrogen
peroxide and stopped after 15 min by adding 4 N sulfuric acid.
The absorbance at 492 ɳm was read in an ELISA reader
(Labsystems Multiskan Thermo®). Between each step, the plates
were washed six times with PBS containing 0.05% Tween 20. Evaluation of the Cellular and Cytokine Components of the Spleens of Immunized Mice
Thirty days after the final immunization, the mice were sacrificed. The spleen was removed aseptically, and the cells were separated using sterile tweezers. A cell suspension was prepared, and the erythrocytes were lysed with Gey’s solution. The cells were washed in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine
serum. The cell concentration was adjusted to 1x106 cells/mL,
and the cells were plated in a 96-well plate. The splenocytes were stimulated with ConA (10 µg/mL) or CMX (10 µg/mL) or not
stimulated. After incubation for 4 h at 37ºC and 5% CO2 with
monensin (eBioscience), the cells were harvested for intracellular cytokine staining. Thereafter, the cells were stained with CD4, IFN-ɤ and TNF-α using the BD Cytofix/Cytoperm kit according to the manufacturer’s instructions. The cells were fixed with PBS
0.05% sodium azide. The acquisition was performed using a BD Biosciences FACSCanto II flow cytometer, and the data were analyzed using BD FACSDiva software. For each sample, 100 thousands events were acquired. Statistical Analysis
The results were tabulated using Excel (version 2007) and Prism 4
software (GraphPad Software 4.0). The differences between groups
were assessed using the two-tailed Student’s t-test after the
nonparametric (Mann Whitney U) test. Trials were considered
significantly different when p˂0.05. The cut-off value was used to
determine the positivity criteria of the test, which was determined by
analyzing the ROC (Receiver Operating Characteristic) curve used to
evaluate the sensitivity and specificity of the assay.
Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis Results Construction, Expression and Purification of the Recombinant Fusion Protein from Mycobacterium tuberculosis
To construct the recombinant CMX fusion protein (C from
Ag85C, M from MPT-51 and X from HspX) containing epitopes
from Mtb Ag85C, MPT51 and HspX, an expression plasmid
encoding the 6 X His-tagged pET23a/CMX fusion as a single
protein under the control of T7 promoter was constructed by PCR
amplification and subsequent cloning of genes into
BamHI/HindIII sites of the pET23a plasmid (Fig. S1 and S2). The
strategy also incorporated a flexible linker between each protein. The gene corresponding to the fusion protein was cloned,
sequenced, and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The
recombinant protein was purified by affinity chromatography
using Ni-NTA affinity columns. The purified recombinant protein
was analyzed by SDS-PAGE. The protein had the expected size
of, 30 kDa (Fig. 1A), and the expression was confirmed by immunoblot analysis using an anti-his tag monoclonal antibody
(Fig. 1B), which confirmed the correct expression of the
recombinant fusion protein. The Liposome-encapsulated CMX Fusion Protein Vaccine is Antigenic and Immunogenic to Mice
To evaluate whether CMX could be used as a subunit vaccine, vaccines were formulated using liposome encapsulation and CpG DNA as an adjuvant. BALB/c mice received three subcutaneous immunizations with CMX and CpG DNA. The control groups were vaccinated with only liposome-encapsulated CpG DNA, liposome alone, or saline.
The IgG1 and IgG2a antibody levels were measured fifteen days after vaccination. Higher levels of IgG1 (3.08±0.04) and IgG2a (3.10±0.03) were observed in mice from the vaccinated group (Fig. 2). Thus, the CMX vaccine formulation was able to induce a specific humoral immune response in BALB/c mice.
To determine whether a Th1-specific immune response was
induced, TCD4+ splenocytes were analyzed by flow cytometry.
The percentage of TCD4+ cells expressing IFN-ɤ (Fig. 3A and
3E) in the group of mice immunized with CMX was greater than the percentage of these cells in the group of mice immunized with liposome-encapsulated CpG DNA, liposome alone or saline.
Similarly, higher percentages of TCD4+ cells expressing TNF-α
(Fig. 3B and 3E) were observed in the group of mice immunized
with CMX when compared to the percentage of TCD4+TNF-α
+
cells in the groups of mice immunized with liposome-encapsulated CpG DNA, liposome alone or saline. The same differences remained when total numbers of cells were analyzed (Fig. 3C and 3D). These results suggested that the vaccine formulation containing the CMX protein was able to induce a TCD4-specific immune response. CMX is Recognized Essentially by Antibodies from Patients with Active TB
The CMX protein is not naturally produced by Mtb but
contains portions of three distinct proteins (Ag85C, MPT51 and
HspX) that have individually been shown to induce a specific
immune response in TB patients. Therefore, we asked whether the
recombinant protein maintained the ability to be recognized by
sera from patients with active TB. An ELISA was optimized
using the fusion protein, and serum samples from patients with
active TB or healthy controls individuals were assessed.
53
Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis
Figure 1. Purification and expression of the recombinant Ag85C-MPT51-HspX (CMX) fusion protein. (A) Purification under denaturing conditions and analysis of the recombinant CMX protein by 12% SDS-PAGE stained with Coomassie Blue. MW: molecular weight marker. Lane 1: cell lysate fraction of the column before application (without IPTG); lane 2: cell lysate fraction of the column before application (with IPTG); lane 3, the supernatant fraction before application onto the column; lane 4, the binding fraction after application on the column; lane 5, the wash fraction after application on the column; lane 6 and 7, fractions of the eluted recombinant protein of approximately 30 kDa. Each lane contains the equivalent of 10 ml of each fraction. (B) The expression of the recombinant CMX protein was analyzed by immunoblot using anti his tag-HRP. MW: molecular weight marker. Lane 1: Cell lysate containing pET23a without IPTG; lane 2: cell lysate containing pET23a with IPTG; lane 3: cell lysate containing pET23a/CMX without IPTG; lane 4: cell lysate containing pET23a/CMX with IPTG. doi:10.1371/journal.pone.0047781.g001
The study population was mainly composed of male patients
and 73.5% were vaccinated with BCG, as shown in Table 1. Of
the participants, 88.6% were sputum AFB positive. In the control
group, 51% of the individuals were vaccinated with BCG, and all
had negative tuberculin skin test (TST less than 10 mm). The
groups were matched according to sex and age. The number of
individuals with TB and healthy controls comprising the study
population was determined based on the incidence of TB in the
region of Goiânia, Goias, Brazil. Individuals with active TB had higher serum levels of IgGs
specific to CMX (0.776±0.309) compared to healthy controls
(0.373±0.271) (p˂0.0001) (Fig. 4). The receiver operating
characteristic (ROC) curve describing the relationship between
the sensitivity and specificity at any cut-off value is also
presented, and the area under the curve (AUC) was 0.934. Based
on the AUC value and an adopted cut-off value of 0.210, the
specificity was 71.79% (CI = 95%; 55.13% to 85.0%), and the
sensitivity was 92.45% (CI = 95%; 81.79% to 97.91%). The
analysis of the accuracy of the ELISA test found a positive
predictive value (PPV) of 81.6% and a negative predictive value
(NPV) of 87.5%. The analysis of specific IgM serum antibody levels in
individuals with active TB also revealed an increase (0.305±0.09)
when compared to the healthy controls (0.212±0057; p˂0.0001)
(Fig. 5). The area under de curve was 0.82, and an arbitrary cut-
off was established at 0.229. The specificity for the ELISA was
61.54%, and the sensitivity was 80.0%. This test showed a PPV
of 65.0% and an NPV of 77.0%. Thus, the ELISA results
presented here (Fig. 5 and 5) demonstrate that the humoral
immune response to the CMX protein could discriminate between
patients with active TB and healthy controls.
Discussion
To control the spread of TB and its MDR/XDR-TB forms is
one of the greatest public health challenges. This may be achieved
by combining multiple strategies, such as by developing more
accurate diagnostic tests to differentiate between TB and latent TB infection, especially in endemic areas, or developing new
vaccines that confer effective protection by improving the
protection provided by BCG, and finally by developing new anti-
mycobac-terial drugs. In this study, we constructed a fusion
protein incorporating the Mtb antigens Ag85C, MPT51 and
HspX, which are expressed at different stages during TB infection
and are consequently recognized at diverse stages of the human
disease. We have demonstrated here that our protein construct
continued to be immunogenic in mice and could be distinctly recognized by individuals with active TB, suggesting the
successful expression of the recombinant protein, most likely
preserving the original antigenic epitopes. The Th1 immune response is associated with the induction of
specific IgG2a antibodies due to the IFN-ɤ production, while the induction of the Th2 immune (mainly IL-4/IL-10) response is associated with IgG1 antibodies [24–25]. To examine the immune response elicited by the vaccine formulation containing the CMX protein, the levels of the different subclasses of antibodies were analyzed. Higher levels of IgG1 (3.08±0.04) and IgG2a (3.10±0.03) antibodies specific to the CMX protein were observed (Fig. 2). These antibody classes were similarly induced to levels comparable to those induced by other fusion protein
constructs, such as the Ag85B-MPT64190–198-HspX construct
that was used as vaccine booster for BCG in mice or Mtb10.4-HspX (MH) emulsified in DDA–TDM for use as subunit vaccine [26–27].
The importance of antibodies in Mtb Infection is still
54
controversial; however, during the extracellular phase, specific Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis
Figure 2. Production of antibodies against the anti-fusion protein Ag85C-MPT51-HspX (CMX) antibodies. Mice were immunized three times with the CMX fusion protein; 15 days after the final immunization, serum samples were collected from the mice, and the levels of IgG1 (A) and IgG2a (B) antibodies were evaluated. A and C show the absorbance from IgG1 specific responses and B and D show the absorbance for IgG2a. The results show the means and standard deviations of five animals per group. Statistically differences: * Comparison between the group immunized with CMX vaccine formulation and the group immunized with CpG DNA formulation; ** Comparison between the group immunized with CMX vaccine formulation and the group immunized with liposome; *** Comparison between the group immunized with CMX vaccine formulation and the group immunized with saline. # Response to CMX compared to other antigens. This experiment was independently repeated with similar results. doi:10.1371/journal.pone.0047781.g002
antibodies can bind to mycobacteria, facilitating absorption and phagocytosis [28]. In addition, IgG2a, followed by and to a lesser degree IgG1, antibodies increase the microbicidal activity of macrophages, NK cells and cytotoxic T cells by ADCC [24–29]– [30].
The CMX fusion protein was tested in a vaccine formulation,
and here it was demonstrated that IFN-ɤ (4.16%) and TNF-α
(3.6%) specific TCD4 positive cells were induced (Fig. 3). The TCD4 cells play a central role in TB-induced immunity [31] by
producing IFN-ɤ and TNF-α, which activate the macrophages that
play an important role in the initial immune response against Mtb,
including the formation of the granuloma [32–33]. IFN-ɤ
and TNF-α synergistically enhance the microbicidal mechanisms of murine macrophages in vitro [34].
Studies have provided convincing evidence that the protection
against TB in humans and mice mainly depends on the Th1
response and the protective cytokines IFN-ɤ, IL-17 and TNF-α
[35]. Strategies to enhance the immunogenicity of a vaccine, such
as the use of CpG (a pathogen associated molecular pattern,
PAMP), allows cells of the innate immune system to be activated
via TLR-9, a pattern recognition receptor (PRR) that induces
preferentially a Th1 immune response [36–37]. Additionally, a
good delivery system can dictate the success or failure of a
vaccine candidate. Here, liposomes were used to improve antigen
delivery and presentation to B and T cells [38–
55
39]–[40]. Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis
Figure 3. Induction of Th1 cytokines after immunization with the Ag85C-MPT51-HspX (CMX) fusion protein. Groups of mice were immunized three times, 15 days apart, by subcutaneous administration of CMX vaccine formulation, CpG DNA liposome-encapsulated, liposome alone or saline. Four weeks after the last immunization splenocytes were stimulated with CMX protein prior to flow cytometry acquisition. The frequency (A and B) and
total number (C and D) of T CD4+ lymphocytes expressing IFN-ɤ
+, (A and C) or TNF-α
+ (B and D) are demonstrated. Dot plots representing the
gating settings are shown in (E), demonstrating the CD4+ lymphocytes gating and its expression of IFN-ɤ
+ and TNF-α
+. The results represent the
means and standard deviations of five animals per group. Statistically differences: * Comparison between the group immunized with CMX vaccine formulation and the group immunized with CpG DNA formulation; ** Comparison between the group immunized with CMX vaccine formulation and the group immunized with liposome; *** Comparison between the group immunized with CMX vaccine formulation and the group immunized with saline. This experiment was independently repeated with similar results.
56
doi:10.1371/journal.pone.0047781.g003 Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis
Figure 4. Analysis of the IgG antibody response to the Ag85C-MPT-51-HspX fusion protein in individuals with active TB and healthy controls. Each dot represents one patient or control. (A) The solid lines in each group indicate the median value. The dotted line indicates the cut-off value, which was determined by ROC Curve analysis; the cut off is identified by the arrowhead on B inset. The P-values of the differences in absorbances between the groups, indicated above the plots, was determined by t-tests. doi:10.1371/journal.pone.0047781.g004
Several studies describing the development of new subunit
vaccines against TB suggest that for a protein to be considered a
good subunit candidate vaccine, it must first induce pro-
inflammatory cytokines and specific antibodies before other
groups of subset T cells or cytokines are evaluated. The
immunogenicity of the CMX fusion protein was demonstrated in
mice by the elicitation of Th1 cytokine production (IFN-ɤ and
TNF-α) by splenocytes and the induction of specific antibodies in
mice immunized with the CMX protein. The results indicate that
the CMX fusion protein was immunogenic, and although only the
antibody responses and cytokine production were assayed, the
data show that the CMX protein could significantly induce Th1
and Th2 immunity that may act specifically against TB infection. Our results are in agreement with others that also tested fusion
proteins, as a vaccine candidate for TB, although in our assay, the
protective efficacy was not tested. Bertholet et al [41] character-
ized the immunogenicity of ID93, a fusion protein containing
Rv3619, Rv1813, Rv3620, and Rv2608, with the adjuvant GLA-
SE in mice and demonstrated that the combined induction of
polyfunctional CD4 Th1 cells producing specific IFN-ɤ, TNF-α
and IL-2 was able to reduce the number of bacteria in the lungs of
animals infected with Mtb and MDR-TB. Niu et al [27] evaluated
the immunogenicity of an MH fusion protein (Mtb10.4-HspX) with DDA–TDM as adjuvant in mice and observed the induction of a humoral immune response and cell-mediated immunity [27].
Previous studies have shown that immunization of mice with
the combination of Ag85A and HspX enhanced the protective
effect in the acute phase and chronic TB infection [42]. Similarly,
Uto et al. [43] showed in mice that a fusion protein containing the
MPT51 and Hsp70 antigens in a subunit vaccine induced an
immune response of CD4 T cells producing IFN-ɤ in response to
in vivo MPT51 antigen stimulation. Thus, we believe our vaccine
has good potential use in a protection assay, and we are currently
addressing this issue. To further validate the immunogenic properties of the CMX
fusion protein, further studies are required to evaluate the subset of T cells involved and the ability to generate memory cell populations to produce regulatory cytokines as well as other inflammatory mediators, and most importantly challenge with M.
tuberculosis to address the vaccine efficacy. Because CMX was shown to be immunogenic in mice, the next
step was to investigate the usefulness of CMX in the diagnosis of
human TB. To determine the ability of the CMX fusion protein to
distinguish active TB, we evaluated the humoral immune response
57
Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis
Figure 5. Analysis of the IgM antibody response to the Ag85C-MPT-51-HspX fusion protein in individuals with active TB and healthy controls. Each dot represents one patient or control. (A) The solid line on each group indicate the median values. The dotted line indicates the cut-off value, which was determined by ROC Curve analysis; the cut off is identified by arrowhead on B inset. The P-value of the differences in absorbances between the groups, indicated above the plots, was determined by t-tests. doi:10.1371/journal.pone.0047781.g005
of individuals from a TB-endemic area, where most of the population had been vaccinated with BCG and most likely had come in contact with other environmental mycobacteria.
In the search for new antigens for the diagnosis of TB, it has
been shown that IgG antibodies specific to the HspX antigen were
not able to distinguish between patients with tuberculosis and
healthy controls (sensitivity of 60.8%) compared to other proteins
produced and tested in TB serological tests (such as HspX alone,
sensitivity of 67.3%; or a mixture of ESAT-6, CFP10 and antigen
85A, sensitivity of 77.7%) [44]. Here, when a fusion combining
three different proteins was used, the levels of specific IgG
measured by ELISA improved the sensitivity to 92.45%,
overcoming the WHO goals [45], which determine that the
sensitivity of a diagnostic test for TB must be above 80%.
Furthermore, previous work evaluating the ability of IgM
antibodies specific to MPT51 to distinguish patients with active
TB from healthy controls revealed that this antigen was promising
(p˂0.001); however, the sensitivity of this assay was 67.3% [11].
IgG antibodies specific to MPT51, however, were not able to
discriminate between patients with active TB and healthy controls
[11]. Again, in this study, IgG antibodies against the CMX fusion
protein efficiently discriminated between the two groups (p˂0.0001).
Due to its immune dominance, Ag85C has been rated as a
strong candidate marker for the diagnosis of tuberculosis [46–48].
Previous work using antigen 85C for TB serodiagnosis showed a
good discrimination between individuals with TB and healthy
controls, where 80% of the TB patients were responsive to the test
[48]. Using the immunodominant fragments of Ag85C, MPT51,
and HspX proteins, in the CMX fusion protein, improved the
recognition by active TB patients, although we could not directly
compare our data with the results obtained with Ag85 alone or in
a different TB endemic setting. The results of this study allowed
us to achieve improved sensitivity, specificity and accuracy (ROC
with an area under the curve of 0.9), that seems better than other
studies using fusion proteins for TB diagnosis, though a direct
comparison cannot be made [44–48]–[49–50]. Future work, using
increased number of active TB individuals both sputum AFB
negative and positive, may show the importance of ours or other
ELISAs to help to improve the TB diagnosis. To validate the
effectiveness of the CMX fusion protein in the serodiagnosis of
TB infection, another sampling of the endemic area is necessary.
58
Surprisingly, in an analysis of the cost and effectiveness of TB
serological diagnostic tests, Menzies et al. reported that most of the
serological diagnostic tests for TB in India presented false positive
and false negative results, representing a social and financial risk
[51]. We believe that a serological test would be a financial risk if the
health authorities did not assume its cost. Moreover, instead of
condemning these tests, one should address the usefulness of them in
a different population to test for the effectiveness. Despite the complexity of the cellular and humoral immune
response induced by Mtb, serological markers to distinguish
between healthy and sick individuals remains attractive to
researchers around the world [52]. The known protective immune
response against TB is the predominant T cell response. However,
TB patients produce antibodies to Mtb proteins, so there is still
much to be explored in terms of the relationship between the production of antibodies, the antibody specificity and the disease
progression [53]. Several diagnostic tests based on the cellular
immune response have been developed, reducing the problem of
cross-reactivity with environmental mycobacteria, BCG vaccina-
tion and even latent TB infection. However, these tests do not
discriminate between LTBI in healthy individuals who had TB
and were cured [54]. Furthermore those tests are expensive for
any country that presents estimates of over 70,000 TB cases per
year, such as Brazil. Thus, a serological test continues to be a goal, although the ideal test has not been yet been developed.
An ideal screening test for TB should have the ability to
identify individuals with latent TB infection that can develop active TB and consequently, direct those individuals to perform
an IFN-c release assay so that other respiratory diseases can be ruled out. A test based on serodiagnosis with a high sensitivity
and the predictive capability to rule out the disease is also an
important tool in the diagnosis of TB, which would impact the financial resources devoted to additional tests, such as sputum,
culture or X-ray, reducing the waiting time between the diagnosis and treatment initiation. Another advantage of a test based on
serodiagnosis over the IGRA assay is the cost and time needed to obtain results.
In summary we demonstrated that the CMX fusion protein was shown to be immunogenic for both mice and humans. The capacity to induce both humoral and cellular specific immune response may potentiate the chances of this antigen to be used as vaccine for TB. Also we showed that ELISA using this protein was able to discriminate active TB patients from healthy controls showing a strengthen use of this protein in the development of new diagnostics tests. References
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Recombinant Fusion Protein on Tuberculosis Supporting Information Figure S1 Schematic of the construction of the CMX expression
cassette. The first step in the construction of the recombinant protein
was to amplify by polymerase chain reaction (PCR) the selected
epitopes of the proteins of interest and to create specific restriction
endonuclease sites. The amplicons were cloned in the pGEM-T easy
vector, and each plasmid was digested with the appropriate restriction
enzymes to generate a ligation mixture containing the three
amplicons. The ligation mixture containing the three genes of interest
was amplified using the most external primers, i.e., the amino
terminal of Ag85C and the carboxy terminal of HSPX. The amplicon
resulting from this amplification was inserted into the pGEM-T easy
vector, digested with the enzymes BamHI and HindIII, purified, and
ligated into the expression vector pET23a. (TIFF) Figure S2 Map of the construction of the recombinant plasmid
containing the gene for the Ag85C-MPT-51-HspX (CMX) fusion
protein. The PCR product correspond-ing to the fusion of the three
epitopes was cloned into the pGEM-T easy vector, sequenced and
subsequently transferred to the pET23a expression vector by
digestion with specific restriction enzymes and cloned into the
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. The expression of the CMX
fusion protein is driven by a T7 promoter, and the arrow indicates the
direction of transcription. (TIFF)
Table S1 Primer sequences used in this study and introduced restriction sites. (DOCX) Acknowledgments The authors thank Dr
a Eliana Martins Lima and Marilisa Pedroso
Nogueira Gaeti from the Laboratory of Pharmaceutical Technology (FARMATEC-UFG) for the liposome vaccine formulations. Author Contributions Conceived and designed the experiments: APJK AK. Performed the experiments: EMS ACC MMT. Analyzed the data: APJK AK EMS ACC. Contributed reagents/materials/analysis tools: APJK AK JAAF. Wrote the paper: APJK AK EMS. Patient recruitment and follow up: JAAF.
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Reader Comments (1) Post a new comment on this article Funding Posted by anakipnis on 24 Feb 2013 at 12:57 GMT
This work was supported by the following CNPq grants: 472909/2011-8, 472906/2011-9, 301976/2011-2, 561004/2010-2, and FAPEG grants: 200910267000381, 200910267000446. EMS, MMT, APJK and AK received fellowships from CNPq. ACC received fellowship from CAPES. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
No competing interests declared.
60
5 – Considerações Finais
Atualmente a pesquisa na área de vacinas contra a tuberculose tem concentrado
esforços para identificar os antígenos micobacterianos mais imunogênicos e sintetizá-los em
laboratório para servirem como vacinas. Há várias novas vacinas sendo desenvolvidas
contra M. tuberculosis, tanto em ensaios clínicos ou em estudos pré-clínicos. Diferentes
estratégias vêm sendo abordadas como: vacinas com micobactérias vivas (por exemplo,
rBCG30 (HORWITZ 2000), rBCG: ΔureC-llo+ (GRODE et al 2005) e M. tuberculosis
atenuada (SAMBANDAMURTHY et al 2005; MARTIN et al 2006) e vacinas de subunidades
protéicas (por exemplo, MAV-85A (VERRECK ET AL 2009), Aeras-402 (MAGALHAES et a
2008), Ag85B-ESAT-6 (WEINRICH et al 2001), Ag85B-TB10.4 (DIETRICH et al 2005) e
Mtb72f (SKEIKY et al 2004) como booster ao BCG. No entanto, estas vacinas são na
maioria baseadas em antígenos secretados no início da infecção e replicação da bactéria.
Para construção de novas vacinas a utilização de antígenos da fase de replicação da
bactéria devem ser associados também a antígenos de latência para aumentar a proteção
(GELUK et al 2007; ANDERSEN 2007). De acordo com estas tendências nós buscamos
desenvolver uma vacina formada por uma proteína de fusão contendo três antígenos
multiestágio da infecção por Mtb.
Quando analisamos a indução da resposta imune humoral específica induzida
pela vacinação com a proteína CMX, foi observado níveis séricos aumentados de IgG1
(D.O.= 2.8 ± 0,04) e IgG2a (D.O.= 3.1 ± 0,05) e após o desafio com M. tuberculosis, estes
níveis também estavam aumentados (IgG1 D.O.= 3.0 ± 0,01; IgG2a D.O.= 3.0 ± 0,01). Sabe-
se que na vacinação, a indução da resposta imunológica humoral é diretamente proporcional
aos adjuvantes utilizados para a preparação da vacina, pois estes modulam a resposta
61
imunológica e podem atuar como veículos de entrega dos antígenos aumentado a meia vida
biológica e assegurando maior tempo de recrutamento e ativação de células apresentadoras
de antígenos (APCs). Estudos têm demonstrado a possibilidade do uso de antígenos
lipídicos de M. smegmatis com o adjuvante hidróxido de alumínio. Estas vacinas induziu uma
resposta imune humoral específica em camundongos BALB/c, porém mesmo com a
utilização do hidróxido alumínio que polariza para resposta imunológica humoral, os níveis
de anticorpos da classe IgG (OD=0.4) (GARCÍA et al 2013) foram menores que os
observados em nosso estudo.
Têm-se buscado a identificação de perfis de proteção de células T tanto de
memória efetora quanto de memória central, estudos vêm demonstrando que a ativação de
linfócitos T CD4 multifuncionais capazes de secretar simultaneamente diferentes citocinas
como IL-2, TNF-α e IFN- podem estar associados à proteção contra patógenos
intracelulares, tais como Mtb. Nossos resultados demonstraram a capacidade da proteína
CMX em induzir a produção de TNF-α e IFN- por linfócitos T CD4 específicas para a
proteína CMX. Outros estudos testando uma proteína de fusão composta por Ag85B e
TB10.4 (HyVac4), preparadas com IC31 ou DDA/MPL em camundongos, demonstraram a
correlação entre a expressão tripla de IL-2, TNF-α e IFN- por células T CD4 com o nível de
proteção contra a infecção por Mtb (BILLESKOV et al 2012). Embora não tenhamos testado
a proteção nos nossos ensaios, estudos que avaliam a correlação entre presença de de IL-2,
TNF-α e IFN- produzidas por linfócitos T CD4 são controversos, enquanto Dey et al (2011)
mostraram que após a vacinação com vacina de sub unidade protéica sozinha ou em
combinação como reforço para a BCG, existe relação direta com a proteção a tuberculose,
enquanto que TCHILIAN et al (2009) não observou esta assocuaação quando uma vacina
de DNA foi utilizada. Uma explicação para os dados discrepantes podem ser os diferentes
antígenos utilizados nas vacinas, porém talvez a eficácia de proteção contra a doença possa
62
ser melhorada quando utilizando uma vacina contendo antígenos multiestágio da infecção
por Mtb. Nosso trabalho demonstrou a capacidade da proteína CMX em induzir a produção
de TNF-α e IFN-ɣ específicos, porém outros estudos precisam ser realizados para a
caracterização desta população de linfócitos T CD4 multifuncionais.
A construção da proteína de fusão CMX foi importante não apenas pela
possibilidade de testar uma nova vacina de subunidade proteica para TB, mas por permitir a
construção de outras proteínas de fusão com diferentes antígenos de Mtb. Este trabalho foi
o primeiro passo para a busca de outras vacinas com maior seguridade e maior eficácia de
proteção que a vacina BCG. A implementação da técnica abre várias possibilidades para o
desenvolvimento de outros modelos de vacina como: a contrução de um BCG recombinante,
a utilização de outras micobactérias como vetores vivos aumentando a estimulação do
sistema imunológico, a possibilidade de usar um vetor viral para a proteína CMX.
Paralelamente aos estudos de vacinas, a proteína CMX poderia ser estudada
como um marcador para o diagnóstico ou triagem da tuberculose. Isto se deve ao fato de
utilizando o método de ELISA a proteína CMX discriminar pessoas com TB ativa de
controles saudáveis. Este uso para a proteˆna recombinante, no entanto, precisa ser
referendado utilizando soros de indivíduos de uma coorte maior e avaliando amostras
sorológicas de diferentes regiões demográficas. Caso a proteína CMX continue
discriminando indivíduos com tuberculose de indivíduos saudáveis, a mesma poderia ser
utilizada em teste de triagem para TB como os testes de fluxo lateral (cromatografia em
papel- teste rápido em fita).
A construção da proteína CMX foi um trabalho que demonstrou inovação
tecnológica e científica em saúde pública diante da necessidade global para o controle da
tuberculose, tendo em vista que o controle da tuberculose está baseado na vacinação, no
diagnóstico e tratamento da infecção, a proteína CMX poderá ser utilizada como vacina e no
63
diagnóstico da TB e quem sabe futuramente baseados nestes estudos também poderão ser
desenvolvidas novas drogas para o tratamento da TB tendo como alvo terapêutico algumas
das proteínas Ag85C, MPT51 e/ou HspX. Os resultados do estudo demonstraram a
capacidade imunogênica da proteína CMX em induzir uma forte resposta imunológica
humoral específica em camundongos após a imunização.
64
6 – Conclusões
Construíu-se uma proteína de fusão formada por epítopos antigênicos das
proteínas Ag85C, MPT51 e HspX e a proteína recombinante foi expressa e purificada
satisfatoriamente.
Formulou-se uma vacina contendo a proteína de fusão com CpG-DNA, MPL
encapsulada em lipossoma que mostrou ser imunogênica em camundongos.
A proteína de fusão CMX foi capaz de discriminar os pacientes com TB ativa de
controles saudáveis mostrando ser antigenica.
7 - Perspectivas
Esta proteína é uma forte candidata para o desenvolvimento de novas
formulações vacinais contra a TB ou para ser usada em novos kits de diagnóstico.
65
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