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Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental

Mestrado em Engenharia Ambiental

Patrícia da Luz Mesquita

“Caracterização de Produtos Microbianos Solúveis (SMPs) em Reatores

Aeróbio e Anaeróbio de Bancada em Diferentes Condições Operacionais”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de Ouro

Preto, como parte dos requisitos necessários para a

obtenção do título: “Mestre em Engenharia Ambiental –

Área de Concentração: Saneamento Ambiental”

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino

Ouro Preto, MG

2009

iii

Esta dissertação é dedicada ao meu esposo, Leonardo, meu “porto-seguro” e principal

incentivador desta etapa de minha vida e aos meus pais e irmã, por todo o carinho e

investimento em minha educação básica, que me permitiram chegar até aqui. Que Deus os

retribua em bênçãos os imensuráveis amor e apoio que sempre me fizeram seguir adiante,

apesar dos atropelos da vida.

“Um dos grandes desafios atuais da humanidade é transformar

toda a informação disponível em conhecimento e, por fim,

todo o conhecimento em verdadeira sabedoria.”

iv

AGRADECIMENTOS Senhor, já não me recordo quantas vezes chamei por Ti todo este tempo. Clamei Teu nome

de várias formas, cada dia de uma maneira.... E Tu, ali, comigo. Companheiro firme, fiel.

Estendendo a mão nas horas aflitas. Encorajando para a batalha. Sorrindo junto com as

vitórias. Senhor, já nem me lembro quantos foram os momentos alegres. Poucos ou

muitos, foram sempre intensos. Tu me mostravas portas abertas, caminhos múltiplos,

soluções iluminadas, amizades eternas. Recordações inumeráveis! Senhor, me falha a

mente ao relembrar o quanto tenho a agradecer. Mas, me é clara, é transparente, Tua

importância até aqui. Elevo agora todo o meu ser para Te louvar , para bendizer, quem

com certeza esteve a cada instante, ao meu lado dizendo: “Filha, segue em frente, você vai

vencer!”.

Primeiramente, agradeço ao Senhor, meu Deus, e à minha amada Nossa Senhora, que me

guiaram e protegeram a cada dia de atividades e de estrada, me abençoando com Sua

companhia sempre.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Sérgio Aquino, toda a minha gratidão e respeito, pela

confiança ao me aceitar como mestranda e pela enorme amizade e contribuição ao meu

aprendizado com disposição em ajudar e dividir seu conhecimento sempre.

Agradeço ao meu co-orientador, Prof. Dr. Robson Afonso, por toda a confiança no meu

trabalho, amizade e carinho, desde sempre, que me permitiram crescer pessoal e

profissionalmente de maneira gigantesca e apostar mais em meu potencial.

Gostaria de agradecer à FAPEMIG, pelo completo suporte financeiro ao projeto, sem o

qual sua conclusão teria sido impossível.

Agradeço à UFOP, por ceder suas instalações e infra-estrutura ao nosso aprendizado e ao

PROAGUA, seus professores e funcionários, que agregaram conhecimento ou auxiliaram

com sua experiência, formação e opiniões diante dos mais variados problemas e assuntos.

De forma especial, agradeço aos Professores Maurício Coutrim, Jorge Adílio, Cornélio e

v

Silvana, que mesmo sem vínculo formal com este projeto, contribuíram sobremaneira

dividindo seu espaço, conhecimento e experiência em sua área de atuação.

Agradeço a todos os colegas de laboratório, sem exceção, cuja ajuda foi muito além de

treinamentos e resolução de problemas e que com seu sorriso e amizade, proporcionaram

um ambiente leve e alegre, onde boas idéias e conversas puderam surgir. Gratidão muito

especial aos meus colegas da iniciação científica que compartilharam esta pesquisa comigo

em alguma etapa ou por completo, Amália, Mark, Miriany, Emanuel e Nathália, cujo

esforço e dedicação foram fundamentais na conclusão do meu mestrado e sem os quais eu

jamais teria conseguido. Gostaria de expressar toda a minha enorme gratidão e apreço ao

Júlio, cujo auxílio foi ímpar para as análises cromatográficas e por espectrometria de

massas e sem o qual a etapa final do projeto não teria sido concluída no prazo. Mesmo na

sobrecarga, ele tinha sempre uma incomparável boa vontade e um “calma, Patrícia!” para

me ajudar. Deus te pague, Júlio! Ao Anselmo, ao Carlúcio, à Fernanda, à Lorena, ao

Gustavo, ao Davi e ao Aniel, meus agradecimentos por compartilharem seu conhecimento

e me treinarem em algumas análises fundamentais para esta pesquisa. À Cássia e à Débora,

todo o meu carinho, por toda a ajuda e pela grande amizade construída, por cada sorriso e

palavra de apoio e incentivo! Aos colegas do laboratório de espectrometria de massas, que

me acolheram tão bem em seu espaço e agregaram muito com cada “troca de idéias”, meu

“muito obrigado”!

Gostaria de agradecer à minha mãe, Rosângela, e à minha irmã, Fernanda, pelo ombro

amigo sempre, por todo o apoio, preocupação e incentivo para mais este desafio. Agradeço

ao meu pai, Léo, que, mesmo de longe, não cansou de torcer por mais esta vitória. A eles,

agradeço também pela base de caráter e comprometimento e por todo o investimento num

ensino básico de qualidade, que me preparou para “vôos mais altos”.

Finalmente, agradeço enormemente ao meu esposo, Leonardo, meu “anjo e porto-seguro”,

que tantas vezes abdicou da minha companhia e presença em função das minhas

atividades, pela enorme paciência, por acreditar tanto em mim e apostar na minha

capacidade, por ter sido o grande incentivador desta etapa da minha vida e por dividir

comigo todos os momentos, por mais difíceis que sejam. Esta vitória é nossa!

vi

SUMÁRIO Resumo ................................................................................................................................ xv

Abstract..............................................................................................................................xvii

1. Introdução...................................................................................................................... 1

2. Objetivos........................................................................................................................ 4

2.1. Objetivo geral ........................................................................................................ 4

2.2. Objetivos específicos............................................................................................. 4

3. Revisão da Literatura..................................................................................................... 5

3.1. Bioenergética e microbiologia do tratamento biológico........................................ 5

3.2. A DQO residual e os Produtos Microbianos Solúveis - SMPs ........................... 11

3.3. Fatores que afetam a produção de SMPs............................................................. 15

3.4. Consequências da produção de SMPs ................................................................. 22

3.5. Caracterização da DQO efluente de reatores biológicos ..................................... 25

3.6. Conclusões da revisão de literatura ..................................................................... 30

4. Material e Métodos...................................................................................................... 32

4.1. Aparato experimental .......................................................................................... 32

4.2. Condições operacionais dos reatores de bancada................................................ 34

4.3. Técnicas analíticas............................................................................................... 35

4.3.1. Preparação geral das amostras........................................................................... 35

4.3.2. pH e Oxigênio Dissolvido (OD)........................................................................ 36

4.3.3. Demanda Química de Oxigênio (DQO) ............................................................ 36

4.3.4. Sólidos Suspensos Voláteis (SSV) .................................................................... 37

4.3.5. Ácidos Graxos Voláteis (AGVs) e glicose........................................................ 37

4.3.6. Análise de Proteínas .......................................................................................... 38

4.3.7. Análise de Carboidratos .................................................................................... 39

4.4. Cálculo da concentração de SMPs ...................................................................... 40

4.5. Análise por espectrometria de massas ................................................................. 40

4.6. MALDI-ToF-MS................................................................................................. 43

4.7. Lise Celular e Extração de EPS de Amostras de Lodo........................................ 44

4.7.1. Preparação das amostras para os procedimentos de lise celular e extração de

EPS de amostras de lodo.............................................................................. 44

4.7.2. Extração de EPS .......................................................................................... 45

4.7.3. Lise Celular ................................................................................................. 46

vii

5. Resultados e Discussão.................................................................................................... 47

5.1. Quantificação dos SMPs em diferentes condições operacionais.................................. 47

5.1.1. Tipo de tratamento: aeróbio x anaeróbio............................................................... 47

5.1.2. Condições operacionais ......................................................................................... 65

5.2. Caracterização dos SMPs ......................................................................................... 75

5.2.1. Proteínas e carboidratos......................................................................................... 75

5.2.1. Espectrometria de massas...................................................................................... 83

6. Conclusões e sugestões para trabalhos futuros................................................................ 96

7. Referências Bibliográficas............................................................................................. 100

Anexo ................................................................................................................................ 107

Apêndice............................................................................................................................ 117

viii

Lista de Figuras

Figura 3.1 - Esquema ilustrativo do ciclo de Krebs

Figura 3.2 - Etapas de degradação anaeróbia da matéria orgânica

Figura 3.3 – Classificação da DQO residual de tratamento biológico de águas residuárias

Figura 3.4 – Produção de SMPs em função da idade do lodo. Fonte: Aquino (2003)

Figura 4.1 - Foto da montagem experimental

Figura 4.2 – Critérios utilizados para a escolha das relações m/z a serem consideradas para

identificação

Figura 5.1 - Variação da DQO no afluente e efluente dos reatores aeróbio e anaeróbio ao

longo das fases operacionais estudadas (valores expressos como mediana)

Figura 5.2 – Interação entre o tipo de reator e as fases operacionais para o parâmetro DQO

Figura 5.3 – Variação do teor de sólidos suspensos totais (SST) e voláteis (SSV) nos

reatores aeróbio e anaeróbio ao longo das fases operacionais estudadas (valores expressos

como medianas)

Figura 5.4 – Interação entre o tipo de reator e as fases operacionais para o parâmetro SSV

Figura 5.5 – Variação do pH nos reatores, antes de sua correção para a faixa neutra

Figura 5.6 – Composição da DQO residual para o reator aeróbio nas diferentes fases

operacionais: (a) fase I, (b) fase II, (c) fase III, (d) fase IV, (e) fase V, (f) fase VI

Figura 5.7 – Composição da DQO residual para o reator anaeróbio nas diferentes fases

operacionais: (a) fase I, (b) fase II, (c) fase III, (d) fase IV, (e) fase V, (f) fase VI

Figura 5.8 – Variação do oxigênio dissolvido no reator aeróbio (valores expressos em

medianas)

Figura 5.9 – Acúmulo de ácidos graxos voláteis (AGVs) nos reatores aeróbio e anaeróbio

nas diferentes fases operacionais (valores expressos em medianas).

Figura 5.10 – Estimativa de acúmulo dos SMPs nos reatores aeróbio e anaeróbio para as

diferentes condições operacionais (valores expressos em medianas)

Figura 5.11 – Interação entre o tipo de reator e as fases operacionais para o parâmetro

SMPs

Figura 5.12 – Produção de SMPs normalizada em relação à DQO afluente (SMP/So) nos

reatores anaeróbio e aeróbio durante as fases operacionais estudadas (valores expressos

como medianas)

ix

Figura 5.13 – Interação entre o tipo de reator e as fases operacionais para a produção

normalizada (SMP/So) de SMPs

Figura 5.14 – Estimativa da conversão diária de biomassa a SMPs nos reatores aeróbio e

anaeróbio durante as fases operacionais estudadas (valores expressos como medianas)

Figura 5.15 – Interação entre o tipo de reator e a razão entre o acúmulo de SMPs e a

biomassa presente no sistema

Figura 5.16 – Temperatura das fases operacionais

Figura 5.17 – Interação da temperatura na produção normalizada de SMPs em relação à

DQO afluente (SMP/So), por reator

Figura 5.18 – Interação da temperatura na razão entre a quantidade de SMPs acumulada e

a quantidade de biomassa presente no sistema

Figura 5.19 – Efeito do TDH no acúmulo de SMPs nos reatores aeróbio e anaeróbio

Figura 5.20 – Efeito do TDH na taxa de conversão da DQO afluente em SMPs, por reator.

Figura 5.21 – Interferência do TDH na razão entre o acúmulo de SMPs e a biomassa

presente no sistema

Figura 5.22 – Efeito do substrato na produção de SMPs, por reator

Figura 5.23 – Efeito do tipo de substrato na taxa de conversão da DQO afluente em SMPs,

por reator

Figura 5.24 – Efeito do tipo de substrato na razão entre o acúmulo de SMPs e a biomassa

presente no sistema

Figura 5.25 – Composição acumulada da DQO residual, dos polímeros extracelulares e

dos produtos de lise celular em termos de proteínas e carboidratos – Reator Aeróbio


dos produtos de lise celular em termos de proteínas e carboidratos – Reator Anaeróbio

Figura 5.27 – Composição percentual da DQO residual (porcentagens das contribuições

dos teores de proteínas, carboidratos e porcentagem indeterminada da DQO) para o reator

aeróbio



anaeróbio

Figura 5.29 – Efeitos principais para análise de carboidratos por amostra, reator e fase

operacional

Figura 5.30 – Interação entre o tipo de reator, fases operacionais e amostras para análise

de carboidratos

x

Figura 5.31 – Efeitos principais para análise de proteínas por amostra, reator e fase

operacional


de proteínas

Figura 5.33 – Análise de componentes principais das relações m/z obtidas por

espectrometria de massas, por amostra


espectrometria de massas nas amostras dos afluentes e efluentes a cada fase operacional,

nas amostras de extratos de polímeros extracelulares (EPS) e de produtos de lise celular

para as fases IV, V e VI

Figura 5.35 – Gráfico dinâmico para a contagem das relações m/z presentes nos efluentes

e ausentes nos afluentes

Figura 5.36 – Espectro de massas para o efluente anaeróbio da fase VI, para as relações

massa/carga m/z=339,20 e m/z=325,18

Figura 5.37 – Espectro de massas obtido para análise de massa segunda da relação

massa/carga m/z=339,1987. Amostra do efluente anaeróbio da fase VI



Figura 5.39 – Estrutura química típica do alquilbenzeno sulfonado de cadeia linear (LAS)

Figura A.1 – Ajustes para a determinação da faixa de aplicação para os AGVs (a) fórmico;

(b) acético; (c) propiônico; (d) isobutírico; (e) butírico; (f) isovalérico; (g) valérico

Figura A.2 – Linearidade e análise de regressão para o ácido fórmico

Figura A.3 – Linearidade e análise de regressão para o ácido acético

Figura A.4 – Linearidade e análise de regressão para o ácido propiônico

Figura A.5 – Linearidade e análise de regressão para o ácido isobutírico

Figura A.6 – Linearidade e análise de regressão para o ácido butírico

Figura A.7 – Linearidade e análise de regressão para o ácido isovalérico

Figura A.8 – Linearidade e análise de regressão para o ácido valérico

Figura A.9 – Seletividade e análise de regressão para o ácido fórmico

Figura A.10 – Seletividade e análise de regressão para o ácido acético

Figura A.11 – Seletividade e análise de regressão para o ácido propiônico

Figura A.12 – Seletividade e análise de regressão para o ácido isobutírico

Figura A.13 – Seletividade e análise de regressão para o ácido butírico

Figura A.14 – Seletividade e análise de regressão para o ácido isovalérico

xi

Figura A.15 – Seletividade e análise de regressão para o ácido valérico

Figura A.16 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido fórmico

Figura A.17 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido acético

Figura A.18 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido

propiônico


isobutírico

Figura A.20 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido butírico

Figura A.21– Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido

isovalérico

Figura A.22 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido valérico.

xii

Lista de Tabelas

Tabela 3.1 – Reações químicas envolvidas no processo de degradação de acetato e glicose

em sistemas aeróbios e anaeróbios

Tabela 3.2 - Fatores que dão origem à produção de compostos microbianos

Tabela 4.1 - Composição da solução nutricional para DQO afluente de 5.000mg/L

Tabela 4.2 – Fases operacionais dos reatores de bancada

Tabela 5.1 – Estatística descritiva para o parâmetro DQO

Tabela 5.2 – Resultados dos testes de medianas para as diferentes fases operacionais nos

reatores aeróbio e anaeróbio

Tabela 5.3 – Amostras mais frequentemente consideradas para investigação, presentes nos

efluentes e ausentes nos afluentes das fases operacionais

Tabela 5.4 – Novas relações m/z para investigação, presentes nos efluentes e ausentes nos

afluentes das fases operacionais estudadas

Tabela A.1 – Resultados da relação sinal/ruído (signal/noise) para a determinação dos

limites de detecção e quantificação da metodologia de análise de AGVs

Tabela A.2 – Dados de áreas de picos para a concentração de 200mg/L da mistura de

AGVs para a avaliação da precisão do método

Tabela A.3 – Valores dos coeficientes angulares, em ordem crescente, para os AGVs,

revelando a sensibilidade de cada ácido

xiii

Lista de Notações

A/M - relação alimento/microrganismo

ABR - reator anaeróbio compartimentado

AFAE – afluentes aeróbios

AFAN – afluentes anaeróbios

AGV – ácidos graxos voláteis

ASM 3 – modelo de lodos ativados no 3 (activated sludge model 3)

ATP - trifosfato de adenosina

BAP – SMPs produzidos como resultado do decaimento endógeno

CABR - reator anaeróbio compartimentado com carreador

CLP - produtos de lise celular

CMD - concentração média determinada

CST - tempo de sucção capilar

CV - coeficiente de variação

DBO - demanda bioquímica de oxigênio

DP – desvio padrão

DQO – demanda química de oxigênio

DQO:N:P – relação DQO:nitrogênio:fósforo

EFAE – efluentes aeróbios

EFAN – efluentes anaeróbios

EI – impacto por elétrons

EPS – substâncias poliméricas extracelulares

EPSAE – substâncias poliméricas extracelulares extraídas do lodo aeróbio

EPSAN – substâncias poliméricas extracelulares extraídas do lodo anaeróbio

ETE – estação de tratamento de esgoto/efluente

FI a FVI – fases operacionais, de I a VI

FIA - análise por injeção de fluxo

GC-MS - cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massa

HPLC – cromatografia líquida de alta eficiência

IT – armadilha de íons

LAS - alquilbenzeno sulfonados de cadeia linear

LC - cromatografia de fase líquida

xiv

LD - limite de detecção

LISE – amostras de lisados

LISEAE – amostras de lisados de células do lodo aeróbio

LISEAN – amostras de lisados de células do lodo anaeróbio

LQ - limite de quantificação

M/Z – relação massa/carga

MALDI-ToF-MS - técnica de espectrometria de massas por ionização e dessorção assistida

por laser

MBR - bioreator a membranas

MS – espectrômetro de massas

MS2 – massa segunda

OD – oxigênio dissolvido

PCA – análise estatística por componentes principais

r2 - coeficiente de determinação

rut - taxa de utilização do substrato

SAB – proteína soro-albumina-bovina

SBR - reatores seqüenciais a batelada

SMP – produtos microbianos solúveis

SMP/So - produção normalizada, em relação à DQO afluente, de SMPs

So – DQO afluente

SST – sólidos suspensos totais

SSV – sólidos suspensos voláteis

TDC – tempo de detenção celular

TDH – tempo de detenção hidráulica

TOF – tempo de vôo

UAP – SMPs produzidos como resultado da utilização do substrato

UASB – reator anaeróbio de manta de lodo de fluxo ascendente

Vd - valor desejado

Vr - valor real

xv

Resumo

O tratamento biológico é caracterizado pela utilização de bactérias, aeróbias e/ou

anaeróbias, para a degradação da matéria orgânica poluente. A análise da demanda química

de oxigênio (DQO) é frequentemente utilizada para quantificar a matéria orgânica nos

efluentes e medir a eficiência do tratamento biológico. A DQO efluente de reatores

biológicos é compreendida não apenas por compostos afluentes que não foram degradados,

mas também por compostos produzidos pelos microrganismos durante o tratamento,

denominados na literatura internacional de SMPs (Soluble Microbial Products). Acredita-

se que a minimização da DQO residual de sistemas biológicos operados na ausência de

estresse e alimentados com esgoto tipicamente biodegradável pode estar diretamente

relacionada à minimização da produção de SMPs e, muito embora a importância dos SMPs

já tenha sido reconhecida, a revisão da literatura mostra que poucas pesquisas tentaram

identificar sua estrutura química bem como relacionar sua produção a parâmetros de

operação dos reatores. Portanto, o principal objetivo desta pesquisa foi caracterizar, do

ponto de vista quantitativo e qualitativo, os compostos microbianos presentes na fração

centrifugada do efluente de reatores aeróbio e anaeróbio de mistura completa operados em

escala de bancada e alimentados com glicose e acetato. Conforme esperado, a produção de

SMPs no reator aeróbio foi superior à do anaeróbio (a produção normalizada em relação à

DQO afluente para as diferentes condições operacionais – SMP/So - variou de 2 a 68% no

reator aeróbio e de 9 a 27% no reator anaeróbio). No reator anaeróbio, a carga orgânica

aplicada não apresentou interferência significativa na conversão da DQO afluente a SMPs

sugerindo que os SMPs acumulados podem ter origem principal no decaimento da

biomassa ao invés da utilização do substrato. Já no reator aeróbio parece ter ocorrido o

contrário. Considerando o tipo de substrato, a utilização de acetato contribuiu para uma

maior produção normalizada de SMPs em ambos os reatores, comparativamente à glicose

(no reator aeróbio, SMP/So de 41,9% para o acetato versus 14,1% para a glicose; no reator

anaeróbio, 21,9% e 16,6% para o uso de acetato e de glicose, respectivamente). Já a

temperatura parece não ter interferido significativamente na relação SMP/So no reator

anaeróbio (18,1% a 15oC e 18,3% a 25oC). Por outro lado, no reator aeróbio, a produção

normalizada de SMPs foi superior à temperatura de 15oC (33,8% contra 18,7% a 25oC). No

reator aeróbio, a DQO relacionada ao teor de proteínas representou de 5 a 34% da DQO

residual e o teor de carboidratos (também em termos de DQO) não ultrapassou 16%; já

para o reator anaeróbio, o teor de proteínas atingiu seu máximo em 17% da DQO residual,

xvi

o que confirma que a maior parte da DQO residual não foi proveniente de proteínas e

carboidratos. Em relação aos resultados de espectrometria de massas, os SMPs produzidos

em cada fase operacional não pareceram provenientes de lise celular ou de EPS. A

ocorrência predominante de SMPs de baixas massas molares indicou produtos associados à

utilização do substrato ou provenientes da degradação e/ou hidrólise de SMPs de alta

massa molar.

xvii

Abstract Biological wastewater treatment is characterized by aerobic and/or anaerobic bacteria that

degrade pollutant organic matter and parameters such as chemical oxygen demand (COD)

are usually used to assess these treatments efficiency. Biological reactors effluent COD is

comprised not only of influent compounds that have not been degraded, but also of some

compounds produced by microorganisms during treatment, known as SMPs (Soluble

Microbial Products) in the literature. It is believed that the decrease of effluent COD in

non-stressed conditions biological systems fed with typically biodegradable sewage can be

straightly connected to minimizing SMP production and, even though SMP importance had

already been recognized, literature review shows that only few researches were dedicated

to identifying their chemical structure, as well as to relating their production to reactors

operational parameters. Therefore, the main goal of this research was to characterize,

through quantitative and qualitative approaches, the microbial products present in the

supernatant of aerobic and anaerobic bench scale CSTR fed with glucose and acetate. As

expected, SMP production in the aerobic CSTR was higher than in the anaerobic one

(normalized production of SMP concerning influent COD in different operational

conditions – SMP/So – varied from 2 to 68% in the aerobic reactor and from 9 to 27% in

the anaerobic reactor). In the anaerobic CSTR, the organic load did not seem to have

interfered to the conversion from influent COD to SMP (SMP/So ratio), what suggests that

accumulated SMP can have come mainly from biomass decay, rather than from substrate

use. However, in the aerobic CSTR the opposite seems to have happened. Concerning

substrate kind, acetate use contributed to a higher normalized production of SMP in both

reactors, compared to glucose (in the aerobic reactor, SMP/So was 41,9% for acetate

versus 14,1% for glucose; in the anaerobic reactor, 21,9% and 16,6% for acetate and

glucose, respectively). Temperature did not seem to have significantly interfered to

SMP/So rate in the anaerobic reactor (18,1% at 15oC and 18,3% at 25oC). On the other

hand, in the aerobic CSTR, normalized SMP production was higher at 15oC (33,8% against

18,7% at 25oC). In the aerobic reactor, COD related to protein amount represented 5 to

34% of effluent COD and carbohydrates COD was not higher than 16%; in the anaerobic

CSTR, protein amount achieved its maximum at 17% of effluent COD, what confirms that

the majority of effluent COD had not come from proteins and carbohydrates. As far as

mass spectrometry results are concerned, SMP produced by each operational phase did not

xviii

seem to have come from cell lysis or EPS. The predominance of low molecular weight

SMP indicated products related to substrate use or to degrading/ hydrolysis of high

molecular weight SMP.

1

1. Introdução

Embora haja uma ampla variedade de processos disponíveis para o tratamento de águas

residuárias, o emprego de sistemas biológicos para o tratamento de esgotos sanitários já é

consolidado no mundo. Durante o tratamento biológico, seja ele aeróbio, facultativo ou

anaeróbio, microrganismos utilizam a matéria orgânica presente na água residuária como

fonte de carbono e energia. Sendo assim, o crescimento de microrganismos nos reatores

biológicos é acompanhado pela redução na quantidade de matéria orgânica, geralmente

expressa como demanda química de oxigênio (DQO), afluente ao reator. Com base na

premissa de que o aumento da massa microbiana nos reatores biológicos causa aumento na

degradação da matéria orgânica afluente, acreditava-se que o aumento do tempo de

retenção dos microrganismos (TDC – tempo de detenção celular ou idade do lodo) e/ou do

tempo de detenção hidráulica (TDH) no reator biológico resultaria em maiores eficiências

de remoção e consequentemente redução da DQO efluente. Entretanto, estudos feitos por

Chudoba e seu grupo, ainda na década de 60 (Chudoba, 1967; Chudoba et al., 1968;

Chudoba et al., 1968 apud Aquino, 2004), mostraram que o aumento exagerado da idade

do lodo em sistemas de lodos ativados, ao invés de resultar em aumento da eficiência de

remoção, causou um aumento na DQO efluente dissolvida.

Pode-se dizer que os resultados controversos de Chudoba lançaram as bases para a teoria

dos produtos microbianos solúveis (SMPs – do inglês Soluble Microbial Products). Tal

teoria surgiu da constatação de que a interação dos microrganismos com o meio de cultivo

resulta na liberação de compostos orgânicos que causam DQO, tanto na forma solúvel

quanto particulada. Assim, a DQO efluente de reatores biológicos é compreendida não

apenas por compostos afluentes que não foram degradados, mas também por compostos

produzidos pelos microrganismos durante o tratamento. De fato, estudos sobre a

caracterização da DQO residual em sistemas de tratamento biológico, feitos por diferentes

grupos de pesquisa, demonstraram que a maioria dos compostos dissolvidos efluentes de

sistemas aeróbios e anaeróbios não estava presente no afluente, mas foram produzidos

durante o tratamento (Grady Jr e Williams 1975; Siber e Eckenfelder 1980; Parkin e

McCarty 1981 apud Aquino 2004; Namkung e Rittmann 1986; Noguera et al. 1994;

Barker et al. 1999; Barker e Stuckey 1999). Tais compostos oriundos do decaimento

endógeno, do metabolismo do substrato e/ou deliberadamente excretados para

2

desempenhar alguma função microbiana, são agrupados no conjunto de compostos

comumente denominado de SMPs que, segundo Jarusutthirak e Amy (2007), constituem a

maioria da matéria orgânica solúvel em efluentes biológicos.

Para a maioria dos sistemas de tratamento bem operados, os fatores que afetam a produção

de SMPs são os fatores que também afetam a concentração da DQO residual (Barker e

Stuckey, 2001). Em outras palavras, foi mostrado que em sistemas alimentados com

afluente biodegradável, em que não há acúmulo de intermediários, tais como os ácidos

graxos voláteis (AGVs) formados durante a digestão anaeróbia, a DQO residual efluente

será determinada pela produção dos SMPs (Noguera et al. 1994; Aquino e Stuckey 2004).

Desta forma, alguns pesquisadores acreditam que a minimização da DQO residual de

sistemas biológicos operados na ausência de estresse e alimentados com esgoto

tipicamente biodegradável pode estar diretamente relacionada à minimização da produção

de SMPs (Barker e Stuckey 1999; Barker e Stuckey 2001).

Além do impacto na qualidade dos efluentes biológicos, a produção de SMPs também é

um aspecto importante nos reatores biológicos acoplados a membranas. Vários

pesquisadores têm demonstrado que a colmatação interna de membranas tem sido atribuída

em grande parte a tais compostos microbianos (Wang, 2007; Drews et.al, 2007; Fonseca

et.al, 2007). De fato, os SMPs já têm sido incorporados à modelagem de reatores

biológicos (com ou sem membranas, aeróbios e anaeróbios) (Aquino e Stuckey, 2008;

Oliveira-Esquerre et al., 2006; Le-Clech et al., 2006; Rittmann e McCarty, 2001). Como

exemplo, Oliveira-Esquerre et al. (2006) adaptaram um modelo matemático de plantas

MBR já consolidado (ASM 3 – Activated Sludge Model no 3), incorporando o conceito da

formação de produtos microbianos. Segundo os autores, tais produtos foram incluídos na

descrição do processo de biotransformação por constituírem a maioria da matéria orgânica

no efluente, pelo papel que desempenham no fornecimento de substrato orgânico aos

heterótrofos e pela crítica influência que exercem na taxa de fluxo da filtração das

membranas. Entretanto, é difícil determinar estas interferências, devido à complexidade

química, ao potencial de biodegradação e da carência de informações quanto à natureza

dos SMPs.

3

Há vários fatores envolvidos na geração de produtos microbianos. Alguns deles foram

observados trabalhando-se com culturas puras, enquanto outros foram demonstrados em

sistemas de tratamento aeróbios e anaeróbios. Diferentes estudos mostraram que alguns

SMPs desempenham uma função metabólica, seja pela propriedade quelante que pode

ajudar na assimilação de metais nutrientes ou proteção contra toxicidade (Kuo e Parkin,

1996; Aquino e Stuckey, 2003; Aquino e Stuckey, 2004), seja para desempenhar outras

funções, tais como para comunicação intercelular em sistemas de biofilmes (quorum

sensing). Os SMPs podem ser excretados como resultado de uma deficiência nutricional,

como no caso de excreção de compostos orgânicos no meio como mecanismo de

‘descarga’ de elétrons que não puderam ser utilizados no crescimento celular (Rittmann e

McCarty, 2001). Finalmente, os SMPs podem advir ainda da hidrólise de substâncias

poliméricas extracelulares (EPS) ou do decaimento endógeno (lise celular).

Embora a comunidade científica internacional já tenha reconhecido a importância dos

SMPs para a definição da DQO residual em sistemas de tratamento biológico, pouco se

avançou no conhecimento da identidade química desses compostos e nos fatores que

afetam sua produção em sistemas aeróbios e anaeróbios. Dessa forma, o objetivo principal

deste trabalho foi investigar os fatores operacionais e ambientais que afetam a produção de

SMPs em reatores de bancada aeróbio e anaeróbio efetuando ainda uma caracterização

química mais detalhada de tais compostos.

4

2. Objetivos

2.1. Objetivo geral

A pesquisa teve como objetivo principal caracterizar os compostos microbianos

(SMPs) presentes nos sobrenadantes (fração centrifugada) do efluente de reatores

aeróbio e anaeróbio de mistura completa operados em escala de bancada e

alimentados com substrato sintético biodegradável e de fácil detecção.

2.2. Objetivos específicos

• Avaliar o efeito do tipo de tratamento (aeróbio x anaeróbio) na produção

(quantidade e tipo) de compostos microbianos solúveis (SMP) durante o tratamento

biológico, em escala de bancada, de substrato biodegradável e de fácil detecção.

• Avaliar o efeito das diferentes condições operacionais (tempo de detenção

hidráulica , tipo de substrato, temperatura) na produção (quantidade e tipo) de

compostos microbianos solúveis (SMP) durante o tratamento biológico, em escala

de bancada, de substrato biodegradável e de fácil detecção.

• Efetuar uma caracterização química, usando técnicas de espectrometria de massas,

para tentar identificar os principais compostos causadores da DQO residual no

sobrenadante de efluentes de reatores anaeróbio e aeróbio de mistura completa

operados em escala de bancada sob diferentes condições.

5

3. Revisão da Literatura

3.1. Bioenergética e microbiologia do tratamento biológico

O crescimento dos microrganismos no tratamento biológico ocorre devido à energia

interna (energia potencial) armazenada em compostos reduzidos que, ao serem oxidados,

perdem elétrons para agentes oxidantes. É essa movimentação de elétrons que fornece

energia para a manutenção e o crescimento celular. A transformação de compostos

químicos por reações de oxi-redução é responsável pela obtenção de energia, que

desencadeia na célula processos metabólicos e reprodutivos. Os elétrons são removidos do

doador primário e transferidos para carreadores de elétrons intracelulares (dispersos no

citoplasma ou ligados a enzimas na membrana citoplasmática). Estes transportam os

elétrons ao receptor final, que é, então, reduzido de forma a regenerar o carreador. A

energia livre liberada ao longo de tal transferência é, pois, capturada pelas células e a

quantidade de energia liberada por elétron transferido depende das propriedades químicas

do doador e do receptor de elétrons. A energia produzida é obtida a partir das semi-reações

envolvidas no processo. O metabolismo é a soma total de todos os processos químicos da

célula e pode ser dividido em catabolismo e anabolismo. O catabolismo engloba todos os

processos envolvidos na oxidação do substrato para a obtenção de energia; já o anabolismo

está relacionado aos processos para a síntese de componentes celulares a partir das fontes

de carbono (Rittmann e McCarty, 2001).

As reações apresentadas na Tabela 3.1 a seguir (Eq. 3.1 a 3.12), extraídas de Rittmann e

McCarty (2001), mostram a energia envolvida em processos aeróbios e anaeróbios de

degradação de dois substratos simples, a glicose e o acetato.

Observa-se que a metanogênese, que é um processo anaeróbio, fornece muito menos

energia comparativamente à oxidação aeróbia da glicose e do acetato. De fato, em reatores

aeróbios, o crescimento microbiano se dá muito mais rapidamente e favoravelmente que

em reatores anaeróbios. Além disto, comparando-se o tipo de substrato, a glicose é capaz

de fornecer mais energia que o acetato, em quaisquer dos processos (aeróbio ou

anaeróbio), e isso ocorre devido à maior energia armazenada (potencial) na molécula de

glicose.

6

Tabela 3.1 – Reações químicas envolvidas no processo de degradação de acetato e glicose

em sistemas aeróbios e anaeróbios

Metanogênese do acetato usando dióxido de carbono como aceptor final de elétrons:

Doador: 1/8 CH3COO- + 3/8 H2O = 1/8 CO2 + 1/8 HCO3- + H+ + e- ΔG0 = -27,40 kJ

(Eq. 3.1)

Aceptor: 1/8 CO2 + H+ + e- = 1/8 CH4 + 1/4H2O ΔG0 = 23,53 kJ

(Eq. 3.2)

Global: 1/8 CH3COO- + 1/8 H2O = 1/8 CH4 + 1/8 HCO3- ΔG0 = -3,87 kJ

(Eq. 3.3)

Metanogênese da glicose usando dióxido de carbono como aceptor final de elétrons:

Doador: 1/24 C6H12O6 + 1/4 H2O = 1/4 CO2 + H+ + e- ΔG0 = -41,35 kJ

(Eq. 3.4)

Aceptor: 1/8 CO2 + H+ + e- = 1/8 CH4 + 1/4 H2O ΔG0 = 23,53 kJ

(Eq. 3.5)

Global: 1/24 C6H12O6 = 1/8 CH4 + 1/8 CO2 ΔG0 = -17,82 kJ

(Eq. 3.6)

Oxidação aeróbia do acetato usando oxigênio molecular como aceptor final de elétrons:

Doador: 1/8 CH3COO- + 3/8 H2O = 1/8 CO2 + 1/8 HCO3- + H+ + e- ΔG0 = -27,40 kJ

(Eq. 3.7)

Aceptor: 1/4 O2 + H+ + e- = 1/2 H2O ΔG0 = -78,72 kJ

(Eq. 3.8)

Global: 1/8 CH3COO- + 1/4 O2 = 1/8 CO2 + 1/8 HCO3- + 1/8 H2O ΔG0 = -106,12 kJ

(Eq. 3.9)

Oxidação aeróbia da glicose usando oxigênio molecular como aceptor final de elétrons:

Doador: 1/24 C6H12O6 + 1/4 H2O = 1/4 CO2 + H+ + e- ΔG0 = -41,35 kJ

(Eq. 3.10)

Aceptor: 1/4 O2 + H+ + e- = 1/2 H2O ΔG0 = -78,72 kJ

(Eq. 3.11)

Global: 1/24 C6H12O6 + 1/4 O2 = 1/4 CO2 + 1/4 H2O ΔG0 = -120,07 kJ

(Eq. 3.12)

Os ácidos graxos voláteis (AGVs) são ácidos orgânicos advindos da fermentação da

matéria orgânica, principalmente em sistemas anaeróbios. São referidos como produtos

7

intermediários do tratamento biológico anaeróbio. O processo de fermentação acontece

quando compostos orgânicos são usados por microrganismos tanto como doadores quanto

como aceptores de elétrons. Neste caso, parte da molécula é oxidada e outra parte é

reduzida. Em processos anaeróbios de degradação da matéria orgânica que contém

carboidratos, a formação de AGVs é notada preferencialmente à de etanol. Isto se deve ao

fato de os microrganismos serem, na maioria dos casos, aqueles que encontraram as

melhores rotas para a extração da energia disponível a partir dos carboidratos nas

condições impostas. A energia disponível para a fermentação da glicose a etanol, por

exemplo, é de ΔG0 = -10 kJ/e- eq. Todavia, para a fermentação de glicose a acetato, a

energia fornecida seria maior (ΔG0 = -14 kJ/e- eq) (Rittmann e McCarty, 2001).

Os carboidratos são polissacarídeos, tais como celulose, amido e açúcares complexos. A

hidrólise enzimática de carboidratos normalmente produz 6-carbonos (hexoses) ou 5-

carbonos (pentoses). Estes açúcares simples possuem um conteúdo de energia maior do

que o acetato ou a maioria de outras moléculas orgânicas simples. Por esta razão, os

microrganismos frequentemente podem obter energia dos carboidratos por rotas

fermentativas anaeróbias que levam a produtos finais menos energéticos (Rittmann e

McCarty, 2001). Entretanto, quando um aceptor final de elétrons (como o oxigênio ou gás

carbônico exemplificados nas Equações 3.1 a 3.12, por exemplo) está disponível, os

carboidratos seguem as rotas de formação de acetil-coenzima A (CH3COSCoA ou

acetilCoA), que então entra no ciclo de ácido cítrico ou ciclo de Krebs, ilustrado na Figura

3.1. A Eq. 3.13 mostra a reação de conversão da glicose em acetil-CoA:

C6H12O6+2 HSCoA+4 NAD++2ADP 2Pi → 2CH3COSCoA+4NADH+2ATP+2CO2 + 4H+

(Eq. 3.13)

Se um aceptor final de elétrons não está disponível, muitos microrganismos facultativos

podem obter energia da glicose usando este substrato orgânico como o doador e o aceptor

de elétrons. Este processo fermentativo termina na etapa de produção de piruvato ou antes

da formação de acetil-CoA:

C6H12O6 + 2 NAD+ + 2ADP + 2Pi → 2CH3COCOO- + 2NADH + 2ATP + 4H+

(Eq. 3.14)

8

Figura 3.1- Esquema ilustrativo do ciclo de Krebs.1

A energia liberada da transformação da glicose em piruvato é usada para produzir duas

moléculas de trifosfato de adenosina (ATP), que é usada dentro da célula como moeda

energética. Entretanto, duas moléculas de NADH (carreador orgânico reduzido, ou seja,

com elétrons) também são formados. Uma vez que o microrganismo não tem aceptor final

de elétrons para regenerar a molécula de NAD+ (carreador orgânico oxidado, ou seja, sem

elétrons) necessária para completar a reação, a célula precisa expulsar os elétrons presentes

nos dois mols de NADH, e isto é conseguido por meio da transferência destes elétrons de

volta para o piruvato, levando à formação de uma variedade de possíveis compostos.

Produtos finais possíveis são etanol, acetato ou ainda uma mistura de compostos orgânicos

simples, tais como propanol, butanol, formiato, propionato, butirato. Estes produtos finais

1Fonte: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ciclo_de_Krebs.svg, consultado em 26/05/09

9

formados dependem dos microrganismos envolvidos e das condições

ambientais/operacionais presentes (Rittmann e McCarty, 2001).

Três grupos distintos de microrganismos são essenciais no tratamento anaeróbio de águas

residuárias: (i) bactérias fermentativas (acidogênicas); (ii) bactérias sintróficas

(acetogênicas) e (iii) microrganismos metanogênicos. A maioria dos microrganismos

acidogênicos fermenta açúcares, aminoácidos e ácidos graxos resultantes da hidrólise da

matéria orgânica complexa, produzindo ácidos orgânicos (principalmente acético,

propiônico e butírico), álcoois (etanol), cetonas (acetona), dióxido de carbono e

hidrogênio. A Figura 3.2 adaptada de Gujer e Zehnder (1983) apresenta um esquema da

degradação anaeróbia da matéria orgânica.

Os microrganismos fermentativos são os primeiros a atuar na degradação do substrato e

são os que mais se beneficiam energeticamente. Portanto, as bactérias acidogênicas

possuem as mais elevadas taxas de crescimento do consórcio microbiano, com tempo

mínimo de geração (cerca de 30 minutos). Os microrganismos sintróficos acetogênicos

convertem compostos orgânicos intermediários (propionato, butirato...) em acetato,

hidrogênio e dióxido de carbono. Entretanto, as reações acetogênicas não são

termodinamicamente favoráveis em condições padrão, ocorrendo apenas graças à interação

de microrganismos acetogênicos e metanogênicos. Mesmo assim, a energia obtida no

processo é baixa (56,6 kJ/mol propionato) e tem que ser divida entre as três espécies de

microrganismos envolvidas (acetogênicos, metanogênicos acetoclásticos e metanogênicos

hidrogenotróficos). Portanto, esta etapa é fundamental em reatores anaeróbios e as baixas

taxas de crescimento de determinadas espécies do consórcio microbiano contribuem para

problemas relacionados à sua estabilidade (Aquino e Chernicharo, 2005).

Os microrganismos metanogênicos acetoclásticos são os mais importantes no consórcio

microbiano, uma vez que a remoção de DQO da fase líquida depende da conversão de

acetato a gás metano. Conforme discutido em Aquino e Chernicharo (2005), os

microrganismos metanogênicos possuem lento crescimento (tempo de geração mínimo de

2 a 3 dias) e é provável que a acumulação de acetato ocorra no meio pela limitação de tais

microrganismos. De qualquer forma, o acúmulo de AGVs ocorre em sistemas de escala

real como resultado do não atendimento às condições cinéticas e termodinâmicas ótimas,

refletindo ou indicando uma condição de instabilidade (Aquino e Chernicharo, 2005).

10

Figura 3.2 - Etapas de degradação anaeróbia da matéria orgânica Fonte: Gujer e Zehnder

(1983).

Em sistemas aeróbios, existe disponibilidade de oxigênio (para atuar como aceptor de

elétrons) e os microrganismos que podem usá-lo preferem esta rota, uma vez que é

desejável a obtenção do máximo de energia possível (o que se dá quando se dispõe de

oxigênio, conforme descrito anteriormente). Portanto, “microrganismos aeróbios precisam

dispor de poucos elétrons do doador para fornecer ao oxigênio e gerar a energia requerida

para sintetizar uma determinada quantidade de biomassa, o que os permite ter uma taxa de

crescimento muito superior (quando as células crescem rapidamente em condições

favoráveis, o investimento da energia para a síntese é máximo)” (Rittmann e McCarty,

2001). Além disto, esta conversão acontece “em paralelo”, uma vez que, apesar da

diferença populacional presente em sistemas aeróbios em diferentes condições

operacionais, há uma forte redundância funcional destes microrganismos (muitos atuam da

mesma forma e fazem a mesma coisa); desta forma, uma estabilidade maior no consórcio

microbiano aeróbio é verificada e condições adversas não comprometem a população tão

seriamente quanto aconteceria em sistemas anaeróbios.

11

A conversão de substrato a produto final leva à formação de intermediários que,

juntamente com o substrato não degradado, causam DQO residual. Contudo, outros

compostos advindos diretamente da morte de células ou excretados para desempenhar

alguma função microbiana também são produzidos e um dos objetivos deste trabalho é

avançar na caracterização desse material.

3.2. A DQO residual e os Produtos Microbianos Solúveis - SMPs

A demanda química de oxigênio (DQO) é definida como a quantidade de oxigênio

necessária para oxidar os componentes de uma amostra que sejam oxidáveis por um agente

oxidante forte (geralmente dicromato de potássio) em uma solução ácida (APHA, 1998).

Uma vez que as reações de oxi-redução envolvem a transferência de elétrons, a DQO

quantifica, indiretamente, a quantidade de elétrons que pode ser potencialmente transferida

da matéria orgânica não estabilizada (poluente e doador) para um aceptor final que esteja

disponível (Aquino, 2003).

Dessa forma, a DQO residual mede a matéria passível de oxidação que aparece no efluente

e que não é removida nas condições operacionais/ambientais impostas durante o

tratamento. Como a transferência de elétrons é responsável pela obtenção de energia

necessária aos microrganismos, conforme descrito anteriormente, a DQO residual

dissolvida constitui-se, em última instância, em elétrons não investidos na produção

energética ou em elétrons convertidos em compostos intermediários e produtos

microbianos solúveis (do inglês soluble microbial produts – SMPs) (Aquino, 2003). De

fato, Barker e Stuckey (1999) definem DQO residual dissolvida como sendo o “conjunto”

formado por substrato residual degradável, compostos refratários do afluente, compostos

intermediários (ácidos graxos voláteis – AGVs) formados no tratamento e SMPs

produzidos durante o tratamento. A Figura 3.3, adaptada de Aquino (2003), apresenta um

esquema da DQO residual efluente ao tratamento biológico de águas residuárias.

12

Figura 3.3 - Classificação da DQO residual de tratamento biológico de águas residuárias

Vários pesquisadores têm demonstrado que, em sistemas de tratamento bem operados, a

maior parte da DQO residual não é proveniente do substrato não degradado ou de

intermediários produzidos, mas sim de SMPs (Chudoba, 1967; Grady e Williams, 1975;

Siber e Eckenfelder, 1980 apud Aquino, 2004; Parkin e McCarty, 1981; Namkung e

Rittmann, 1986; Noguera et al., 1994; Barker e Stuckey, 2001; Aquino e Stuckey, 2004;

Jarusutthirak e Amy, 2007; Aquino e Stuckey, 2008). Drewes e Fox (1999) apud

Jarusutthirak e Amy (2006) demonstraram que a matéria orgânica efluente a sistemas de

tratamento de água residuária consiste de (i) matéria orgânica natural refratária contida nas

fontes naturais de água potável, (ii) compostos orgânicos sintéticos em níveis-traço

produzidos durante o uso doméstico e subprodutos de desinfecção gerados durante os

processos de desinfecção da água e do tratamento de águas residuárias, e (iii) produtos

microbianos solúveis (SMPs) produzidos durante processos biológicos de tratamento de

águas residuárias. Segundo Liang et al. (2007), a concentração de SMPs no efluente

determina efetivamente os níveis de DQO residual em águas residuárias tratadas, sendo

necessário um melhor entendimento sobre os SMPs e fatores que levem à sua

minimização, com vistas a melhorar o desempenho do tratamento biológico .

Presente no afluente Produzida pelo sistema de tratamento

Biodegrável

DQO residual

Dissolvida Particulada

Não Biodegradável

13

Boero et al. (1991), estudando sistemas aeróbios, definiram SMPs como “intermediários e

produtos finais da degradação do substrato e produtos originários do decaimento

endógeno”. Noguera et al. (1994), abordando sistemas anaeróbios, consideraram SMPs

como “compostos orgânicos resultantes do decaimento endógeno e da completa

mineralização do substrato”. Aquino (2003) sugere que, na prática, “SMPs seja qualquer

matéria orgânica dissolvida causadora de DQO que aparece no efluente e que não estava

originalmente presente no afluente”.

Os ácidos graxos voláteis (AGVs) também são intermediários presentes na degradação

anaeróbia da matéria orgânica. Contudo, não são considerados SMPs. A exclusão dos

AGVs do pool de SMPs parece um contra-senso; contudo Nogueira et al. (1994)

esclarecem que os AGVs podem ser convertidos posteriormente a metano e gás carbônico

se condições operacionais forem propícias, ao passo que com os SMPs isso não

necessariamente acontece uma vez que alguns podem ser recalcitrantes. Além disso, a

conversão dos SMPs a metano e gás carbônico passa necessariamente pela sua conversão

inicial (pelos microrganismos acidogênicos) a AGVs, que são então usados pelos

microrganismos acetogênicos e/ou metanogênicos.

Os SMPs são classificados como UAPs (utilization-associated products - produtos

decorrentes do metabolismo associados à utilização do substrato e ao crescimento da

biomassa) e BAPs (biomass-associated products – produtos gerados a partir da biomassa

como parte do decaimento e morte celular) (Namkung e Rittmann, 1986; Laspidou e

Rittmann, 2002). Os UAPs são compostos carbonáceos predominantemente pequenos

advindos do substrato original, ao passo que os BAPs seriam macromoléculas celulares

contendo carbono e nitrogênio (Urbain et al., 1998 apud Jarusutthirak e Amy, 2006). Foi

verificado que a taxa de produção de UAPs é proporcional à taxa de utilização do substrato

e que na produção de BAPs, as células consomem substratos doadores de elétrons para a

formação de biomassa ativa, produzindo, concomitantemente, substâncias poliméricas

extracelulares (EPS) e UAPs (Jarusutthirak e Amy, 2006).

Em 2002, Laspidou e Rittmann propuseram uma teoria “unificadora”, estudando sistemas

aeróbios, associando a produção e a degradação dos SMPs à formação de EPS. Contudo,

um ponto fraco de tal teoria seria assumir que todos os EPS solúveis seriam UAPs e BAPs,

sugerindo que os SMPs são, de fato, EPS solubilizados (Aquino e Stuckey, 2008). Em um

14

estudo para caracterizar os SMPs e EPS produzidos em um reator anaeróbio de mistura

completa alimentado com glicose, Aquino e Stuckey (2004) sugeriram, a partir de dados de

cromatografia por exclusão de tamanho, que parte dos compostos orgânicos de alta massa

molar e presentes no efluente poderiam ser consequência dos EPS liberados da matriz

celular. Contudo, Ramesh et al. (2006) verificaram que amostras de SMPs e EPS obtidas a

partir de diferente lodos não apresentaram todas as características físico-químicas avaliadas

idênticas, confirmando que SMPs e EPS solubilizados não são a mesma coisa.

Aquino et al. (2006) definem EPS como materiais poliméricos ligados à superfície celular

que são extraídos por métodos físicos e químicos e diferenciam EPS e SMPs pelo caráter

extracelular do primeiro. Segundo Jang et al. (2007), “EPS são de origem biológica,

participam na formação de agregados microbianos e consistem de materiais insolúveis”, ao

passo que os SMPs seriam considerados “EPS solúveis (macromoléculas solúveis e

colóides)”. Wingender et al. (1999) apud Jang et al. (2007) caracterizam EPS, de modo

geral, como proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e substâncias húmicas.

Aquino e Stuckey (2008) apresentam um modelo para a predição de SMPs em reatores

anaeróbios de mistura completa, incorporando o conceito de produção e degradação de

EPS. De acordo com o modelo, em condições estacionárias, cerca de 58% dos SMPs

seriam UAPs e 42%, BAPs. Dentre os últimos, aproximadamente 7% seriam EPS solúveis.

Os autores afirmam ainda que, mediantes condições de estresse (ex. choque de carga

orgânica), a importância de BAPs e de EPS solúveis diminui, sendo que UAPs passam a

constituir mais de 95% dos SMPs.

O interesse na determinação da composição química e propriedades físico-químicas dos

SMPs vêm crescendo pelo papel fundamental que desempenham em agregados

microbianos tais como o lodo de tratamento biológico. Segundo Jang et al. (2007), a

investigação das características dos SMPs e EPS em reatores a membranas é fundamental

para o propósito de reuso da água. De fato, Jarusutthirak e Amy (2006) afirmam que a

presença de SMPs em efluentes não só afeta sua qualidade no que se refere à presença de

compostos orgânicos como também se torna um fator limitante para seu reuso.

15

Segundo Wingender et al. (1999) apud Sheng e Yu (2006), os SMPs, envolvidos na

formação de agregados microbianos, na aderência a superfícies e na floculação, contêm

grandes quantidades de estruturas aromáticas e cadeias de gorduras insaturadas com vários

tipos de grupos funcionais, sendo os principais componentes as proteínas, as substâncias

húmicas e os carboidratos. Portanto, sua produção gera DQO residual podendo, pois, afetar

a qualidade do efluente.

Bilgili et al. (2008) mencionam que, às vezes, as concentrações dos poluentes de lixiviados

tratados biologicamente excedem os padrões de descarte devido à não inclusão dos SMPs

como parâmetro de projeto. Portanto, segundo os autores, seria muito importante

considerar os SMPs no projeto de tratamento biológico de lixiviados para a otimização da

do processo e dos parâmetros operacionais bem como para a estimativa da DQO residual.

3.3. Fatores que afetam a produção de SMPs

Há vários fatores envolvidos na geração de produtos microbianos. Alguns deles foram

observados trabalhando-se com culturas puras, enquanto outros foram demonstrados em

sistemas de tratamento aeróbios e anaeróbios de tratamento de efluentes. Diferentes

estudos mostraram que alguns SMPs desempenham uma função metabólica, seja pela

propriedade quelante que pode ajudar na assimilação de metais nutrientes ou proteção

contra toxicidade (Kuo e Parkin, 1996; Aquino e Stuckey, 2003; Aquino e Stuckey, 2004),

seja para desempenhar alguma outra função, tais como quorum sensing em sistemas de

biofilmes, por exemplo (Hastings e Greenberg 1999; Nies 2003). Estudos usando culturas

puras sugeriram que produtos microbianos podem ser produzidos tanto como o resultado

de escassez de substrato ou de excesso de fonte energética (Boylen e Ensign, 1970;

Neijssel e Tempest, 1976 apud Huajun et al., 2008). A Tabela 3.2, extraída de Aquino

(2003), apresenta os principais fatores que levam microrganismos a produzir SMPs.

A literatura sugere que a produção de SMPs está intimamente relacionada à concentração

de biomassa presente no sistema. À luz dessa hipótese é de se esperar que o tipo de reator,

por determinar maior ou menor retenção de biomassa, também afete a quantidade de SMPs

produzidos. De fato, algumas pesquisas (Barker et al., 2000; Aquino e Stuckey, 2002)

mostraram que a produção de SMPs em reatores anaeróbios seguiu a ordem: reator

16

membrana (MBR) > reator compartimentado (ABR) > reator mistura completa (CSTR). O

reator de membranas estudado usava membranas submersas, cuja função era reter a

biomassa no sistema. Como não havia descarte de lodo, a não ser durante o processo

esporádico de limpeza da membrana, o tempo de detenção celular (TDC) era bastante

elevado, e Aquino (2003) sugeriu que os elevados tempos de retenção celular associados

ao MBR e ao ABR tenham contribuído significativamente para a maior produção de SMPs

naqueles reatores.

Desta forma, de valiosa importância é a avaliação dos parâmetros operacionais e fatores

ambientais para a produção dos SMPs. Entretanto, estudos abrangendo este assunto são

escassos na literatura. Um dos fatores mais importantes para projeto e operação dos

sistemas de tratamento biológico é o tempo de detenção celular (conhecido como idade do

lodo e definido como o tempo médio de permanência da biomassa no reator biológico) e é

de se esperar que ele influencie significativamente a produção de SMPs. Jarusutthirak e

Amy (2006) de fato afirmaram que o tempo de detenção celular possivelmente afeta

significativamente não só a quantidade, mas também as características dos SMPs

produzidos.

Kuo et al. (1996), trabalhando com reatores anaeróbios de mistura completa, mostraram

que a produção normalizada de SMPs (SMP/So) decresceu com o aumento da idade do

lodo até atingir um valor mínimo, quando a idade do lodo era de aproximadamente 25 dias,

e depois aumentou novamente. Vale salientar que os autores determinaram a concentração

de SMPs com base na diferença entre a DQO residual dissolvida e a DQO causada pelo

substrato não degradado e pelos ácidos graxos intermediários presentes. O comportamento

de “variação em U”, mostrado na Figura 3.4, também foi observado para sistemas aeróbios

e um tempo de retenção entre 2 a 15 dias foi reportado como ideal para a produção mínima

de SMPs (Baskir e Hansford 1980; Rittmann et al. 1987; Hao e Lau 1988; Pribyl et al.

1997 apud Aquino, 2003).

Essa “variação em U” foi modelada e explicada baseando-se no fato de que SMPs podem

ser produzidos como resultado da utilização do substrato (UAP) ou como resultado do

decaimento endógeno (BAP), conforme discutido anteriormente. Dessa forma, quando a

idade do lodo é alta, maior será a produção de BAPs devido à maior propensão ao

17

decaimento endógeno e consequente lise celular. Além disso, na medida em que a idade do

lodo aumenta, maior é a remoção de compostos de fácil biodegradação (substrato original e

intermediários) e a DQO residual, nesse caso, seria representada pelo acúmulo de

compostos microbianos de difícil biodegradabilidade (Kuo et al. 1996). Por outro lado, nas

condições em que o tempo de retenção é pequeno e as taxas de carregamento orgânico

elevadas, a taxa de utilização do substrato (rut) será maior e, por causa disso, maior será a

produção de UAPs, uma vez que tal produção é diretamente proporcional à rut (Rittmann e

McCarty, 2001). Em outras palavras, o lodo é “saturado” com substrato biodegradável,

resultando em acúmulo de compostos intermediários e metabólitos excretados pela

biomassa devido à elevada relação A/M (relação alimento/microrganismo).

Figura 3.4 – Produção de SMPs em função da idade do lodo. Fonte: Aquino (2003).

Liang et al. (2007), avaliaram a influência do tempo de detenção celular (TDC) na

produção de SMPs em um bioreator a membranas (MBR), estudando os tempos de

detenção celular de 10, 20 e 40 dias para uma concentração afluente de 600 mgDQO/L,

substrato acetato de sódio. Com o estudo, verificaram um acúmulo de SMPs mais

pronunciado em baixos valores de TDC, e que a diminuição do TDC levou ao aumento do

potencial de colmatação da membrana. Além disso, os autores relacionaram a percentagem

de compostos aromáticos no efluente com o valor de TDC, sugerindo que a produção de

compostos aromáticos foi mais favorecida em altos valores de TDC (baixa relação A/M).

A/M Decaimento endógeno (Formação de BAPs) A/M

rut

Tempo de retenção

SMP/So Faixa reportada como ideal: Sistemas anaeróbios: ~ 25 d Sistemas aeróbios: 2 – 15 d

(Formação de UAPs)

18

Tabela 3.2 - Fatores que dão origem à produção de compostos microbianos

Fator Comentário Referências

Concentração

de equilíbrio

Organismos podem excretar SMPs para estabelecer a

concentração de equilíbrio através da membrana.

Parkin e McCarty

(1981)

Deficiência

nutricional

SMPs podem ser produzidos para auxiliar na absorção de

metais nutrientes ou devido ao mecanismo de ‘descarga’

de elétrons que não puderam ser utilizados no

crescimento devido à ausência de nutrientes essenciais.

Emery (1982);

Rittmann e

McCarty (2001)

Toxicidade SMPs possuem propriedades quelantes e podem estar

envolvidos no processo de mitigação da toxicidade

causada por metais pesados. Compostos microbianos

podem ainda ser produzidos como conseqüência direta da

lise celular causada pelas substâncias tóxicas.

Kuo e Parkin

(1996); Aquino e

Stuckey (2004)

Crescimento

biomassa

Durante o crescimento da biomassa, enzimas

extracelulares são produzidas para a hidrólise de

biopolímeros, e algumas estruturas celulares, ao serem

renovadas, são excretadas em solução. Além disso,

polímeros extracelulares são produzidos para auxiliar na

granulação e na floculação da biomassa, e quando

liberados em solução constituem parte dos SMPs.

Hejzlar e

Chudoba (1986);

Laspidou e

Rittmann (2002)

Quorum

sensing

Um mecanismo de comunicação entre células,

denominado quorum sensing foi descoberto em bactérias

gram-negativas, e envolve a excreção de lactonas no

meio de cultivo.

Hasting and

Greenberg

(1999); Fuqua

and Greenberg

(1998)

Decaimento

endógeno

Durante a morte e lise celulares uma miríade de SMPs é

lançada em solução, e enquanto alguns SMPs podem ser

prontamente biodegradáveis, outros podem ser mais

refratários e escapar com o efluente secundário.

Barker et al.

(1999)

Jarussuthirak e Amy (2006) também avaliaram a influência do TDC na produção de SMPs

em reatores a batelada seqüenciais de bancada (SBR – sequencing batch reactors) - para

simular o processo de lodos ativados – com testes subsequentes de filtração por

19

membranas e concentração inicial de carbono orgânico dissolvido de 100mgC/L,

observando uma baixa produção de colóides hidrofílicos e macromoléculas,

comparativamente a TDC mais elevados.

Para TDCs longos, a variação do conteúdo orgânico residual pode ser atribuída à

ocorrência de mudanças na composição de componentes degradáveis dos SMPs

acumulados (Chipasa e Medrzycka, 2004). Longos TDCs poderiam causar uma queda no

número de células viáveis na biomassa, de forma que uma maior quantidade de material

celular de menor biodegradação ou de metabolismo mais lento seria retida no meio (Shin e

Kang, 2003). Jarusutthirak e Amy (2006) mencionam que um aumento no TDC leva a um

acúmulo de biomassa no sistema, o que levaria a um aumento na quantidade de SMPs.

A mudança na composição das comunidades microbianas em sistemas de tratamento com o

aumento do TDC é reportada na literatura, e podem ser relacionadas com a produção de

SMPs (Kucnerowicz e Verstraete, 1983; Madoni, 1994; Wanner, 1994 apud Chipasa e

Medrzycka, 2008). Chipasa e Medrzycka (2004) estudaram a influência dos SMPs na

concentração de biomassa e na remoção de DQO e DBO em dois experimentos com

bioreatores aeróbios de batelada alimentados por 16 dias com soja e peptona (DQO

afluente de ~860 mg/L) O primeiro experimento permitia o acúmulo de SMPs e, no

segundo, os SMPs eram removidos por meio da lavagem diária da biomassa. Uma vez que

a concentração de SMPs aumentou proporcionalmente ao TDC, os autores concluíram que

microrganismos superiores (protozoa, flagelados heterótrofos, amebas, ciliados)

proliferavam mediante concentrações elevadas de SMPs, e que a presença de SMPs causou

um acúmulo irregular da biomassa devido a possíveis mudanças de espécies e populações

microbianas. De fato, o estudo de Chipasa e Medrzycka (2008) mostrou que mudanças de

espécies microbianas ocorreram rapidamente com o aumento do TDC.

Alguns trabalhos mostram que o aumento do TDC levou ao decréscimo da proporção de

compostos orgânicos de alta massa molar (>10.000 Da) e, em contrapartida, à elevação de

compostos de baixa massa molar e facilmente degradáveis (<1.000 Da) (Shin e Kang, 2003

e Huang et al., 2000 apud Liang et al., 2007). Por outro lado, Liang et al. (2007),

estudando reatores de membrana, reportaram distribuições de massas molares similares em

diferentes TDC.

20

Huajun et al. (2008) avaliaram os efeitos da carga orgânica aplicada, do tempo de detenção

hidráulica (TDH) e da temperatura na produção de SMPs em um reator anaeróbio

compartimentado com carreador (CABR). O CABR era um reator retangular com seis

câmaras de igual volume e preenchido com carreadores esféricos ocos feitos de bambu,

possibilitando a retenção da biomassa por aderência, combinando, portanto, as vantagens

de um reator anaeróbio compartimentado com as características de um reator de biofilme.

A alimentação usada tinha como substrato uma solução sintética tamponada de proteína-

carboidrato (contendo açúcar e peptona) com nutrientes e metais-traço. As concentrações

utilizadas foram de 300, 450 e 600 mgDQO/L, às temperaturas de 10, 18 e 28ºC e valores

de TDHs de 9, 12 e 18 horas. A concentração de SMPs foi calculada subtraindo-se as

contribuições medidas de glicose e dos ácidos acético, propiônico, isobutírico e butírico da

DQO residual filtrada. Considerando o efeito da carga orgânica aplicada, em geral, a

produção de SMPs respondeu de forma proporcional, ou seja, o aumento da carga orgânica

levou ao aumento da produção de SMPs, controversamente aos resultados de Jarussuthirak

e Amy (2006), Chipasa e Medrzycka (2008) e Chipasa e Medrzycka (2004).

Os resultados de Huajun et al. (2008) mostraram ainda que a diminuição da temperatura

levou ao aumento da produção de SMPs, fato este atribuído à diminuição do metabolismo

bacteriano (menor taxa de degradação de SMPs e de substrato) e à condição de estresse da

biomassa (que produziria maior quantidade de SMPs para proteção celular). Os picos na

concentração de SMPs foram obtidos nas temperaturas de 18 e 10º C e no TDH

intermediário de 12 horas. A relação SMP/DQO filtrada efluente foi alta à maior

temperatura (28oC) e maior TDH, fato este atribuído à completa degradação de AGVs. Os

autores reportaram ainda uma participação de SMPs de 50 a 70% na DQO filtrada efluente.

A produção e a caracterização de SMPs em reatores anaeróbios compartimentados (ABR)

com carga orgânica aplicada de 0,5 g/L também foi estudada por Barker et al. (1999) que

avaliaram a influência do TDH, concentração de biomassa e temperatura na produção de

SMPs. Os autores mostraram que a produção de SMPs diminuiu com a redução do TDH,

em desacordo com trabalho anterior feito com o mesmo tipo de reator usado (ABR)

(Schiener et al,1998 apud Barker et al. 1999). Contudo, esta observação foi justificada

pelo elevado decaimento da biomassa e, consequentemente, elevada produção de BAPs

nos ABRs em questão. A diminuição da temperatura fez com que a produção de SMP

21

crescesse, justificada pela condição de estresse gerada e pela desaceleração da taxa de

degradação. Além disso, foi observado que a produção de SMPs aumentou quando a

concentração inicial de biomassa era elevada.

Outro parâmetro relevante na produção de SMPs é a relação alimento/microrganismo

(A/M). Jang et al. (2007), estudando reatores de membrana, verificaram que a qualidade do

efluente melhorou com o decréscimo da relação alimento/microrganismo. Além disto, os

autores verificaram que a concentração total de carboidratos diminuiu com o decréscimo

de A/M e que a concentração de EPS aumentou com o aumento de A/M. Estes resultados

parecem concordar com as observações de Huajun et al. (2008); todavia, são contraditórios

a outros estudos reportados (Jarussuthirak e Amy, 2006; Chipasa e Medrzycka, 2008;

Chipasa e Medrzycka, 2004; Aquino, 2003; Shin e Kang, 2003).

O principal efeito de algum tipo de adversidade no sistema (mudanças bruscas de

temperatura, choques osmóticos, deficiência nutricional ou ainda presença de compostos

tóxicos) é a produção de AGVs e SMPs (Aquino e Stuckey, 2004). Contudo, a alta

biodegradabilidade dos AGVs é clara e, tão logo as condições de estresse (causadoras de

limitações cinéticas e termodinâmicas) sejam minimizadas, eles são metabolizados. Por

outro lado, os SMPs possuem uma lenta cinética de biodegradação, contribuindo, pois,

para o aumento da DQO residual (Barker e Stuckey, 1999).

O efeito da toxicidade (adição de clorofórmio e cromo) em reatores anaeróbios de mistura

completa alimentados com glicose (10gDQO/L) foi estudado por Aquino e Stuckey (2004).

De acordo com o estudo, cerca de 82 a 98% da DQO efluente foi devida a SMPs e de 0,9 a

2% da DQO afluente foi convertida a SMPs. O acúmulo final de SMPs aumentou mediante

condições de estresse, apesar da sua diminuição percentual devido à produção de AGVs. O

aumento de SMPs pareceu proporcional à carga tóxica aplicada, indicando que parte

significativa dos SMPs acumulados advém provavelmente de lise celular. Aquino e

Stuckey (2004) mostraram ainda que as condições de estresse impostas contribuíram ainda

para a produção de polímeros extracelulares (EPS) , que contribuíram, em parte, para a

produção de SMPs e formação de DQO residual.

22

3.4. Consequências da produção de SMPs

Os efeitos da produção de SMPs podem ser interessantes na determinação do

comportamento das comunidades microbianas presentes no meio. Alguns estudos

abordam o efeito dos SMPs nas atividades biológicas, desde potencial ecotoxicidade

produzida por microrganismos em biofilmes (Ross et al., 1998) até atividade mutagênica

aumentada (Rappaport et al., 1979). Estudos recentes têm sido realizados para o

aprofundamento destas interferências (Ichihashi et al., 2006; Chipasa e Medrzycka, 2004;

Chipasa e Medrzycka, 2008). Como exemplo, Ichihashi et al. (2006), estudando dois

reatores anaeróbio-aeróbio com lodos ativados de fluxo contínuo, em escala de bancada

(um com TDH=48h e o outro com TDH=6,4h), alimentados com esgoto sintético contendo

acetato e peptona, avaliaram o efeito de SMPs sobre o metabolismo microbiano para a

remoção de fosfato e nitrogênio e verificaram o efeito inibitório dos SMPs na nitrificação.

Segundo Chipasa e Medrzycka (2004), as diferenças nas taxas de consumo de substrato

podem ser atribuídas a diferenças nas atividades microbianas e à concentração de SMPs

presente. Seu estudo, realizado em sistemas aeróbios, indica que as comunidades

microbianas desenvolvidas na presença de SMPs englobam microrganismos que dependem

dos metabólitos de outros microrganismos, capazes de utilizar os componentes da

alimentação. Já as comunidades microbianas desenvolvidas em níveis reduzidos de SMPs

apresentaram maior eficácia e rapidez no consumo da alimentação sintética. Portanto, a

presença e o acúmulo de SMPs no meio retardaria a degradação do substrato, fato este

atribuído pelos autores à redução na atividade microbiana.

Em outro estudo Chipasa e Medrzycka (2008) avaliaram a interferência dos SMPs na

composição e sucessão da comunidade microbiana de lodos ativados em bioreatores a

batelada em escala de bancada alimentados com esgoto sintético. Os autores observaram e

compararam a ocorrência dos microrganismos desenvolvidos em níveis significativos de

SMPs e também em níveis reduzidos de SMPs. A composição da comunidade microbiana

(principalmente protozoários e metazoários) foi monitorada e na medida em que a

concentração de SMPs crescia, a comunidade microbiana se modificava rapidamente

favorecendo a presença de microrganismos de dimensões bem maiores, tais como

invertebrados. Os autores confirmaram microscopicamente a mudança de espécies

23

microbianas que passaram de ciliados fixos (12 – 175µm) a ciliados livre-natantes (35 –

330µm) e, por fim, a invertebrados, tais como rotíferos (0,2 – 1mm) e nematóides (1 –

50mm). Por outro lado, tais mudanças não foram observadas mediante baixas

concentrações de SMPs, onde foi verificada a proliferação de microrganismos pequenos

tais como ciliados fixos, ciliados livre-natantes, bactérias formadoras de flocos e

flagelados. Portanto, a mudança de tamanho da população foi reportada como uma das

influências mais relevantes da presença de SMPs no meio. Chipasa e Medrzycka (2008)

sugeriram ainda que o acúmulo de SMPs seria um dos mecanismos regulatórios intrínsecos

que controlariam a viabilidade e a atividade microbiana no sistema de lodos ativados.

Esta interferência dos SMPs na atividade microbiana interfere diretamente no desempenho

do tratamento biológico. Os resultados obtidos por Chipasa e Medrzycka (2004) sugerem

que o ajuste do acúmulo de SMPs poderia servir como um método operacional para a

estabilização da comunidade microbiana bem como do processo de biodegradação.

Reforçam, pois, a necessidade de um maior esclarecimento acerca dos SMPs e sua

interferência na determinação da população microbiana e suas variações ao longo do

tratamento.

Atualmente, os SMPs têm sido de particular interesse em sistemas de tratamento que

dispõem de reatores biológicos de membranas (MBR). A difusão cada vez maior dos

processos de membranas impõe restrições quanto à diminuição do fluxo através da

membrana e sua durabilidade. Grande parte dos estudos recentes sobre SMPs é dedicada a

avaliar a influência de sua produção no desempenho de tais reatores, uma vez que estes

compostos são considerados os principais responsáveis pela biocolmatação (biofouling)

das membranas (Drews et al., 2007; Fonseca et al., 2007; Holakoo et al., 2006,

Jarusutthirak e Amy, 2007,Le-Clech et al., 2006, Rosenberger et al., 2006, Trussell et al.,

2006; Oliveira-Esquerre et al.,2006).

O fenômeno de colmatação pode advir de adesão das células microbianas à superfície da

membrana, adsorção de compostos orgânicos ou ainda de precipitação de espécies

inorgânicas (Aquino et al., 2006). Shin e Kang (2003) apud Aquino et al. (2006) reportam

o estreitamento dos poros da membrana pela formação de uma camada gelatinosa,

diminuindo seu cut-off nominal. A colmatação reduz o fluxo de permeado, fator

determinante para definir a viabilidade econômica deste tipo de tratamento. A literatura

24

reporta uma contribuição de 26 a 52% dos SMPs para a colmatação de membranas de

microfiltração ou ultrafiltração normalmente usadas em reatores MBR (Wisniewski e

Grasmick, 1998; Bouhabila et al., 2001 apud Liang, 2007).

Trussell et al. (2006) mostraram que as taxas de colmatação estavam correlacionadas com

a concentração total de SMPs. Os resultados de Fonseca et al. (2007) sugeriram que,

mesmo na ausência de atividades microbianas significativas e de formação de biofilmes, os

SMPs podem ter propriedades intrínsecas para a colmatação de membranas em níveis

operacionais. Na mesma linha, Drews et al. (2007) reportam que mudanças repentinas de

temperatura levam à produção de SMPs e elevam a taxa de colmatação das membranas.

Le-Clech et al. (2006) usaram alginato para modelar a colmatação de membranas por

SMPs-carboidratos, por acreditarem que dentre os SMPs, os desta natureza são os

principais responsáveis pelo biofouling. Segundo Grelier et al. (2006), o parâmetro mais

relevante para a colmatação da membrana é a concentração de polissacarídeos coloidais e

solúveis. De fato, Liang et al. (2007) verificaram que carboidratos e proteínas parecem ser

os principais componentes dos SMPs a acumular nos reatores de membrana,

comparativamente aos compostos aromáticos.

Reid et al. (2008), estudando as características bioquímicas de SMPs e EPS de lodos de

reatores de membranas, observaram que as proteínas foram os componentes dominantes

destes compostos para as cinco plantas estudadas. Entretanto, apesar dos carboidratos

estarem presentes em menores concentrações do que as proteínas, os primeiros pareceram

ter um maior impacto tanto na capacidade de filtração da membrana, quanto na sua

colmatação. Os autores verificaram que o tempo de sucção capilar - CST (medida

quantitativa, em tempo, de liberação de água pelo lodo, particularmente interessante em

processos de secagem de lodo, na avaliação de sua dosagem e acondicionamento) estava

positivamente correlacionado aos SMP-carboidratos e que o índice volumétrico de lodo

(SVI), com a presença de EPS-proteínas. Portanto, a tentativa de elucidação das

características químicas dos SMPs e EPS torna-se particularmente relevante para o

entendimento das interações físico-químicas destes compostos com as membranas dos

reatores. De fato, Li et al. (2000) afirmam que se os compostos não eliminados pelo

tratamento de águas residuárias e presentes na DQO residual fossem conhecidos, sua

25

retenção no reator poderia ser melhorada por adaptação e otimização das membranas de

acordo com os tipos de moléculas presentes no efluente.

As propriedades quelantes dos SMPs já foram estudadas em sistemas anaeróbios e também

têm sido de interesse em reatores aeróbios de membranas. A produção de SMPs

aconteceria para seqüestrar metais nutrientes em sistemas onde ocorre precipitação de

metais, como nos anaeróbios (MeS, Me(OH)2 , MeCO3) (Kuo e Parkin,1996). Holakoo et

al. (2006) estudaram estas propriedades para o metal cobre e, neste caso, os SMPs

demonstraram ser quelantes moderados. Os autores verificaram ainda que a adição de

cobre reduziu significativamente a capacidade de complexação dos SMPs acumulados,

devido à maior massa molar apresentada pelos compostos microbianos (MM > 100.000

Da). Do ponto de vista de distribuição de massas molares dos SMPs, aqueles com tamanho

entre 1.000 e 10.000 Da se mostraram com maior capacidade de complexação com o metal

cobre. A adição de cobre aumentou o acúmulo de SMPs de alta massa molar (> 100.000

Da) – 76% do total de SMPs, reduzindo, pois, a capacidade de complexação dos SMPs

acumulados.

Holakoo et al. (2006) também avaliaram a interferência das condições operacionais na

produção de SMP em sistemas aeróbios de reatores de membranas alimentados com esgoto

sintético na ausência de cobre (condição normal) e após a adição de cobre à alimentação.

Os resultados mostraram que elevados valores de TDCs e baixa relação A/M

(alimento/microrganismo) parecem levar ao acúmulo de SMPs de alta massa molar (>

100.000 Da), associado, pois, ao decaimento da biomassa.

3.5. Caracterização da DQO efluente de reatores biológicos

A caracterização da DQO residual pode subsidiar a adoção mais racional de sistemas de

pós-tratamento e facilitar o entendimento acerca dos processos biológicos envolvidos, com

vistas ao aumento de eficiência de remoção de matéria orgânica. Além disto, é

fundamental para a avaliação dos riscos impostos pela disposição do efluente tratado no

ambiente.

26

Segundo Aquino (2003), a caracterização de efluentes biológicos pode ser efetuada em três

níveis: i) identificação de compostos individuais, ii) identificação das principais classes de

compostos presentes, iii) determinação de parâmetros indiretos e globais (demanda

química de oxigênio – DQO; toxicidade; distribuição de tamanho). Embora haja trabalhos

publicados contemplando os três níveis, a caracterização de efluentes usando parâmetros

indiretos é, em geral, preferida devido à maior conveniência e utilidade prática da

informação. Parâmetros como biodegradabilidade (importante para se avaliar a DBO e o

uso de sistemas biológicos para pós-tratamento), toxicidade (importante para se considerar

a disposição do efluente tratado) e distribuição de tamanho (importante para avaliar a

eficiência e subsidiar a escolha de técnicas de remoção a serem empregadas) são

amplamente citados na literatura (Amy et al. 1987; Barcelo et al. 1999; Galassi e Benfenati

2000 apud Aquino, 2003). Contudo, a caracterização química destes compostos tem sido

pouco estudada e há poucos trabalhos na literatura. Isso talvez ocorra devido ao fato de tal

caracterização não ser trivial, demandando técnicas mais sofisticadas e de custo mais

elevado.

Um dos primeiros resultados publicados sobre a caracterização química da DQO residuária

de sistemas anaeróbios foi feito por Reemtsma e Jekel (1997). Os autores usaram

cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massa (GC-MS) para identificar

compostos de baixo peso molecular de uma água residuária de curtume tratada

anaerobiamente seguida por pós-tratamento aeróbio. Os compostos orgânicos presentes

foram agrupados em 12 classes, de acordo com seu comportamento em relação à separação

físico-química empregada. Nenhuma das 12 classes foi completamente removida durante o

tratamento anaeróbio e 25% da DQO efluente desse processo era compreendido de

substâncias que não estavam originalmente presentes no efluente do curtume. Digno de

nota é o fato de que a concentração de compostos aromáticos (principalmente fenóis,

ácidos carboxílicos aromáticos e hidroxilados carboxílicos aromáticos) aumentou

significativamente durante o tratamento anaeróbio. O pós-tratamento aeróbio, por outro

lado, mostrou-se eficiente na remoção dos compostos originalmente presentes no efluente

do curtume e refratários ao tratamento anaeróbio, bem como dos compostos aromáticos

produzidos pelo processo anaeróbio.

27

Dignac et al. (2000) realizaram um trabalho de caracterização no afluente e efluente de um

sistema de lodos ativados tratando esgoto sanitário. As análises permitiram a identificação

de 41% do carbono orgânico solúvel afluente ao sistema e 22% do carbono orgânico

solúvel efluente. Contudo, 67% do nitrogênio afluente ao sistema não pode ser

caracterizado, e após o tratamento a fração não caracterizada aumentou para 90%, sendo os

10% do nitrogênio efluente caracterizado constituídos predominantemente por proteínas. A

análise individual de aminoácidos, carboidratos, lipídios e compostos fenólicos no esgoto

bruto contribuiu para a identificação de 46% do carbono orgânico presente. As classes

químicas proteínas e lipídios foram as mais removidas durante o tratamento, e como

consequência a maior fração do carbono orgânico total efluente era desconhecida. A fração

conhecida era composta por apenas 13% de proteínas e menos que 1% de lipídios. A fração

de matéria orgânica efluente que não pôde ser caracterizada é, segundo os autores,

provavelmente constituída de compostos recalcitrantes e de estrutura mais complexa

formados durante o tratamento biológico.

Dois estudos de caracterização foram feitos em efluentes anaeróbios utilizando-se técnicas

analíticas mais sofisticadas. Em um deles, Barker et al. (2000) mostraram que proteínas e

carboidratos representavam menos que 10% da DQO efluente de um reator de bancada

alimentado com esgoto sintético, e que a maioria da DQO residual permanecia não

identificada. Usando ressonância magnética nuclear, os autores sugeriram ainda a presença

de álcoois, compostos carboxilados e significativa quantidade de compostos aromáticos

(6%) nos efluentes anaeróbios caracterizados. No outro estudo, Aquino e Stuckey (2002)

caracterizaram efluentes de reatores CSTR de bancada alimentados com glicose, usando

extração líquido-líquido seguido de GC-MS. Alguns compostos identificados - compostos

fenólicos, ftalatos e outros aromáticos – parecem ter sido produzidos pelo sistema de

tratamento uma vez que não foram identificados no afluente. É sabido que microrganismos

podem sintetizar variedade enorme de compostos a partir de monômeros básicos e

acredita-se que os compostos aromáticos identificados tenham sido produzidos a partir de

aminoácidos que contêm o anel benzeno. Devido à característica refratária exibida por

compostos aromáticos perante a degradação anaeróbia não é de todo surpreendente a

identificação desses compostos em efluentes anaeróbios.

28

Li et al. (2000) usaram diferentes técnicas analíticas para tentar avaliar a eficiência de

remoção de poluentes de difícil degradação, bem como identificar e comparar compostos

individuais presentes na DQO residual em sistemas reais convencionais de tratamento

biológico e em tratamento biológico assistido por membranas alimentados com esgoto

sanitário. As técnicas utilizadas no estudo foram GC-MS (cromatografia gasosa -

espectrometria de massas), FIA (análise por injeção de fluxo) e LC (cromatografia líquida).

As duas últimas técnicas foram utilizadas acopladas a detectores de massa (MS) e massa

tandem (MS-MS). Os resultados obtidos mostraram taxas favoráveis de eliminação dos

poluentes, principalmente no sistema com membrana, e nenhuma diferença foi observada

dispondo de micro ou ultrafiltração com porosidade nominal (cut-off) da membrana de

200.000 Da. Os autores verificaram que poluentes não eliminados nos efluentes,

observados por GC-MS e FIA-MS e identificados por GC-EI-MS (EI – impacto por

elétrons), FIA-MS-MS e por LC-MS-MS, eram predominantemente ftalatos. Contudo,

poliéteres não voláteis polares e seus precursores (éteres aril e alquilpoliglicóis) foram

observados no modo positivo de ionização. No modo negativo, observou-se a presença de

surfactantes aniônicos tais como os alquilbenzeno sulfonados de cadeia linear ou LAS

(linear-alquil-sulfonates), compostos de difícil degradação anaeróbia. Os métodos

analíticos utilizados na pesquisa mostraram ser as ferramentas mais poderosas para

monitoramento dos processos de tratamento bem como para sua otimização, uma vez que

abordam substâncias específicas.

Especificamente sobre a caracterização dos SMPs, a literatura reporta como sendo uma

ampla gama de compostos de massas molares altas e baixas, incluindo proteínas,

polissacarídeos, ácidos húmicos e fúlvicos, ácidos nucléicos, enzimas e compostos

estruturais (DeWalle e Chian, 1974; Hejzlar e Chudoba, 1986a,b apud Liang et al., 2007;

Rittmann et al., 1987; Chudoba et al., 1980 apud Aquino, 2004; Parkin e McCarty, 1981).

Drews et al. (2007) e Liang et al. (2007) caracterizaram SMPs em reatores de membranas

(MBR) como proteínas e polissacarídeos. No estudo de Jang et al. (2007), de 83 a 91% da

DQO no permeado de um MBR aeróbio em escala piloto alimentado com esgoto sanitário

era constituída de SMPs-carboidratos e de SMPs-proteínas, sendo que os primeiros

apresentaram concentrações superiores. Controversamente, Barker et al. (2000) mostraram

que proteínas e carboidratos representavam menos que 10% da DQO efluente e que sua

maioria permanecia não identificada. Segundo Aquino e Stuckey (2004), proteínas e

29

carboidratos somaram menos de 50% dos compostos orgânicos presentes em solução. De

acordo com Liang et al. (2007), a maioria dos SMPs seriam substâncias húmicas aquáticas

hidrofóbicas.

Alguns resultados de uma caracterização química mais detalhada feita com efluentes de

reatores de manta de lodo (UASB) em escala de demonstração e alimentados com esgoto

sanitário demonstram que de fato a maioria dos compostos que constituem a DQO filtrada

efluente tem baixa massa molar (Elisiário et al. 2006), sendo, portanto, passíveis de análise

por cromatografia gasosa. Além disso, inúmeros estudos de distribuição de tamanho foram

realizados na tentativa de obter mais informações acerca do perfil dos compostos presentes

na DQO residual (Klinkow et al., 1998; Confer e Logan, 1997a, 1997b; Boero et al., 1996

apud Aquino, 2003; Parkin e McCarty, 1981; Kuo e Parkin, 1996; Barker et al.,1999;

Barker e Stuckey, 1999). A revisão de literatura sugere que a maioria dos compostos

causadores de DQO residual tem massas molares baixas, inferiores a 1.000 Da (Aquino,

2003).

Mais recentemente, Jang et al. (2007) reportam que mais de 86% dos SMPs-carboidratos

presentes no permeado de MBR tinham massas molares inferiores a 1.000 Da. Todavia, é

significativa a quantidade de compostos de massas molares elevadas (> 50.000 Da) em

efluentes biológicos. Além disto, observa-se que a distribuição de massas molares está

intimamente relacionada às condições operacionais adotadas no tratamento (Confer e

Logan, 1997a, 1997b; Boero et al., 1996; Klinkow et al.,1998 apud Aquino, 2003; Kuo e

Parkin,1996; Barker e Stuckey, 1999; Barker et al., 1999; Aquino et al., 2006).

Jarusutthirak e Amy (2007), tentando elucidar as características da matéria orgânica

efluente ao tratamento biológico, observaram uma distribuição bimodal de compostos de

alta e baixa massa molar. Em análise por cromatografia por exclusão de tamanho

(HPSEC), os compostos orgânicos foram segregados em três grupos de acordo com a

massa molar apresentada: massas molares inferiores a 1.000 Da, entre 1.000 e 10.000 Da e

maiores que 10.000 Da. Cerca de 30 a 50% dos SMPs apresentaram massas molares

inferiores a 1.000 Da e 25 a 45%, superiores a 10.000 Da. Ainda segundo este estudo,

compostos de alta massa molar (>10.000 Da) – SMPs-BAP - apresentaram características

hidrofílicas e baixa aromaticidade. Moléculas de massas molares inferiores a 500 Da

30

podem indicar pequenos ácidos orgânicos, aminoácidos ou açúcares simples

provavelmente produzidos durante o crescimento da biomassa. Os autores afirmam, pois,

que a matéria orgânica efluente consiste da composição SMP-BAP e matéria húmica

advinda de processos biológicos, uma vez que a fração de baixa massa molar (< 1.000 Da)

– SMP-UAP - é prontamente biodegradada.

No estudo de Barker (1999) para reatores ABR, DQO de alimentação de 0,5g/L,

utilizaram-se técnicas de ultrafiltração e de cromatografia por exclusão de tamanho, para a

caracterização dos SMPs. Notou-se que compostos de alta massa molar ficaram

concentrados nos compartimentos intermediários do reator sendo, provavelmente, produtos

de lise celular. Já os compostos retidos no primeiro compartimento do reator, e também no

efluente, apresentaram-se como sendo de baixa massa molar. Foram, pois, caracterizados

como UAPs ou produtos da degradação dos compostos de alta massa molar. O trabalho de

Schiener et al. (1998) apud Barker et al. (1999), utilizando carga orgânica inicial de 4 g/L

de DQO também para reatores ABR alimentados com solução sacarose-nutrientes, sugeriu

uma distribuição bimodal de massas molares para os SMPs efluentes, pelos resultados de

ultrafiltração. Cerca de 25% dos SMPs teriam massas molares maiores que 100.000 Da,

enquanto 30% apresentaram massas molares inferiores a 1.000 Da. Os autores

identificaram a fração hidrolisada de elevada massa molar como heteropolissacarídeos

consistindo de glicose, fucose e N-acetilgalactoseamina, que são constituintes da parede

celular. Barker et al. (1999) também sugeriram que a fração de alta massa molar de

efluentes anaeróbios era composta por açúcares (glicose, galactose, fucose, ramnose),

conhecidos constituintes dos polissacarídeos encontrados em envólucros capsulares e

paredes celulares.

3.6. Conclusões da revisão de literatura

• Estudos feitos por diversos pesquisadores em reatores aeróbios e anaeróbios

alimentados com esgoto sintético concluíram que a maior parte da DQO residual

efluente não era devido ao substrato não degradado ou intermediários formados

(AGVs no caso dos anaeróbios), mas sim de compostos produzidos por

microrganismos e chamados de SMPs (compostos microbianos solúveis).

31

• A literatura mostra que os SMPs são importantes porque, em sistemas operados na

ausência de estresse, constituem a maior parte da matéria orgânica efluente ao

tratamento biológico, sendo, em última instância, os responsáveis pela DQO

residual. Possuem também crítica influência no fluxo de filtração e biocolmatação

em bioreatores de membrana. Além disto, considerando suas interferências

microbiológicas, desempenham papel fundamental no fornecimento de matéria

orgânica aos heterótrofos, na absorção de metais nutrientes (propriedades

quelantes), na proteção contra toxicidade, deficiência nutricional e comunicação

intercelular, na formação de agregados microbianos e na população microbiana

(tipo e função) do sistema de tratamento.

• A produção de SMPs é afetada por vários fatores, sendo os principais a

concentração da biomassa presente, o tempo de detenção celular (e,

consequentemente, a relação alimento/microrganismo), cargas tóxicas aplicadas ao

sistema e a temperatura.

• Em relação à identificação química de efluentes biológicos, em particular dos

SMPs, percebe-se que há poucos trabalhos publicados. Dos trabalhos publicados,

verifica-se que os SMPs não são idênticos a EPS, e são constituídos em parte de

proteínas e carboidratos; contudo, outros compostos têm sido sugeridos com igual

relevância, tais como, ácidos húmicos e fúlvicos, álcoois, compostos carboxilados e

aromáticos, compostos fenólicos e ftalatos.

• Em relação à distribuição de tamanhos ou massa molar, a literatura assume que a

distribuição de massas molares está relacionada às condições operacionais adotadas

no tratamento; contudo, percebe-se uma tendência em admitir uma distribuição

predominantemente bimodal de massas molares para os compostos constituintes da

DQO residual (<1.000Da e >10.000Da), e que UAPs são sempre associados à baixa

massa molar e os BAPs, à alta massa molar.

• Os trabalhos publicados divergem acerca da caracterização (quantitativa e

qualitativa) da DQO residual, uma vez que as condições ambientais e operacionais

adotadas são distintas, bem como as metodologias empregadas.

32

4. Material e Métodos

4.1. Aparato experimental

A pesquisa foi desenvolvida utilizando-se reatores de mistura completa (volume útil de 6L)

mantidos sob condições aeróbias e anaeróbias, e alimentados com substrato biodegradável

de fácil detecção (glicose ou acetato). Os reatores foram construídos em PVC e foram

alimentados continuamente por meio de bomba peristáltica de dois canais, mantidos sob

constante agitação com o uso de placas de agitação magnética e à temperatura constante

com o uso de um banho termostatizado. O reator anaeróbio foi vedado com um cap para

impedir a entrada de ar e o gás produzido foi descartado na água do banho. O reator

aeróbio foi mantido aberto e teve sua aeração garantida por meio da utilização de

compressores de ar. A Figura 4.1 ilustra o aparato experimental construído.

As soluções nutricionais foram sempre autoclavadas antes de serem introduzidas nos

reatores para evitar crescimento microbiano no meio de cultura e na linha de alimentação.

O substrato (glicose ou acetato) era, então, injetado na solução autoclavada após seu

resfriamento usando filtros de tamanho de poro 0,22µm, evitando assim sua caramelização

pela alta temperatura da autoclavagem e garantindo a esterilização do meio. O mesmo

afluente (substrato e solução nutricional) alimentava simultaneamente, no mesmo TDH, os

dois reatores, por meio da bomba de dois canais.

A solução nutricional utilizada foi adaptada às condições operacionais adotadas e tiveram

como base as sugestões de Aquino et al. (2007) e a relação DQO:N:P mínima de 100:5:1,

conforme Chernicharo (2007) (a relação DQO:N:P adotada foi de 100:6,33:1,03). A Tabela

4.1 mostra a composição nutricional adotada para os afluentes dos reatores.

33

Figura 4.1: Foto da montagem experimental

Tabela 4.1 - Composição da solução nutricional para DQO afluente de 5.000mg/L.

MACRONUTRIENTES (mg/L) NH4Cl 1.112 (NH4)H2PO4 153,2 (NH4)2HPO4 44,5 MgCl2 250 CaCl2 189 NaHCO3 2.500

MICRONUTRIENTES (mg/L) Extrato de levedura 125 FeCl3.6H2O 5 ZnCl2 0,13 MnCl2.4H2O 1,25 (NH4)6Mo7O24.4H2O 1,60 AlCl3.6H2O 0,13 CoCl2.6H2O 5 NiCl2.6H2O 13 H3BO3 3 CuCl2.2H2O 8 HCl 1 mL/L

(c) Sistema de alimentação

(a) Montagem experimental: alimentação/ bombeamento/ controle de temperatura/ reatores aeróbio e anaeróbio

(b) Reatores em banho termostatizado

(d) Sistema de agitação magnética

34

4.2. Condições operacionais dos reatores de bancada

A operação dos reatores de bancada foi feita observando-se as fases descritas na Tabela

4.2. Uma faixa ótima de tempos de detenção hidráulica (TDHs) de 2 a 15 dias foi reportada

por Barker e Stuckey (1999) para sistemas de tratamento aeróbios e de aproximadamente

25 dias para sistemas anaeróbios, em que a produção de SMPs seria mínima. Diante disto,

optou-se por conduzir o experimento avaliando os TDHs de 4, 10 e 16 dias, o que resultou

em cargas orgânicas volumétricas aplicadas de 1,25, 0,5 e 0,31 kgDQO/m3.d,

respectivamente.Ressalta-se, contudo, que em processos de lodos ativados, os TDHs

normalmente adotados são muito inferiores (da ordem de apenas algumas horas).

Os reatores foram inoculados e operados continuamente por um período mínimo de 3

vezes o tempo de detenção hidráulica, para garantir que a condição de equilíbrio dinâmico

aparente (steady-state) fosse atingida. O sistema aeróbio foi inoculado com lodo de retorno

coletado na planta de lodos ativados da ETE-Arrudas, que trata os esgotos de Belo

Horizonte - MG. Para o sistema anaeróbio, o lodo foi coletado de reator UASB operado em

escala de demonstração e alimentado com esgoto sanitário após tratamento preliminar. Tal

reator encontra-se em operação no Centro de Treinamento e Pesquisas em Saneamento

(CTpS) da UFMG-COPASA.

Tabela 4.2 – Fases operacionais dos reatores de bancada

Aeróbio Anaeróbio Fases TDH

(d) S0

(gDQO/L)

Tipo Substrato

TDH (d)

S0 (gDQO/L)

Tipo Substrato

Temp(oC)

Fase I 4 5 Glicose 4 5 Glicose 25

Fase II 10 5 Glicose 10 5 Glicose 25

Fase III 16 5 Glicose 16 5 Glicose 25

Fase IV 10 5 Glicose 10 5 Glicose 15

Fase V 10 5 Acetato 10 5 Acetato 15

Fase VI 10 5 Acetato 10 5 Acetato 25

A escolha da temperatura de 25oC se deu pelo fato ser esta a temperatura ambiente

predominante no Brasil. A temperatura de 15oC simularia a operação de reatores em

35

regiões mais frias (como Ouro Preto e sul país). Portanto, desejou-se simular temperaturas

em que sistemas reais são operados.

Para a avaliação do substrato, a glicose representaria um substrato mais completo e o

acetato, mais simples. O uso de substrato mais complexo (tais como ração animal, esgoto

bruto) dificultaria a interpretação dos resultados de identificação, uma vez que não se teria

informações precisas acerca dos compostos presentes no afluente (difícil distinção entre o

que estava no afluente e o que realmente seria produzido pelo sistema de tratamento).

A concentração da DQO foi fixada em 5.000mg/L em função de os reatores serem de

mistura completa (não há imobilização de biomassa) favorecendo o sistema anaeróbio

(maior DQO de entrada significa maior crescimento microbiano, mesmo no menor TDH).

Além disso, maior concentração de substrato resultaria em maior produção de SMPs, o que

facilitaria o trabalho de quantificação e identificação. Os TDHs foram escolhidos em

função do sistema anaeróbio (4 dias é o menor TDH para o crescimento suspenso de

bactérias anaeróbias). O sistema aeróbio até poderia ser operado com TDH menor (1 dia ou

menos), contudo a intenção foi comparar a produção de SMPs nos dois sistemas nas

mesmas condições. Além disso, havia também a limitação técnica de a bomba ser de dois

canais, o que não permitia adoção de vazões diferentes.

4.3. Técnicas analíticas

4.3.1. Preparação geral das amostras

Os reatores eram monitorados até atingir o steady-state por meio de medições esporádicas

de pH e DQO. Uma vez estabilizada a DQO efluente, as amostras eram coletadas com

mais freqüências para quantificação dos SMPs e caracterização do efluente.

Durante a condição de steady-state, amostras de efluente foram coletadas para análise de

DQO (para o acompanhamento da degradação da matéria orgânica), sólidos suspensos

totais e sólidos suspensos voláteis (monitoramento da biomassa no interior do reator) e

ácidos graxos voláteis (AGVs), de forma que a quantidade de SMPs produzida pudesse ser

36

estimada para cada condição operacional. Também foram monitorados o pH, a temperatura

e o oxigênio dissolvido (para o reator aeróbio).

As amostras dos efluentes dos reatores eram centrifugadas numa centrífuga Fanem

Centrífuga Excelsa II 206 BL, a 5.000rpm durante 15 a 30 minutos, até completa remoção

de sólidos do sobrenadante. O sobrenadante era, então, encaminhado para as análises que

serão descritas a seguir. Vale ressaltar que, para as análises cromatográficas, os

sobrenadantes eram ainda filtrados através de filtros de membrana de 0,45µm para a

completa remoção de sólidos.

4.3.2. pH e Oxigênio Dissolvido (OD)

O pH dos reatores foi medido diariamente usando um pHmetro da Analion, modelo PM

608, calibrado ao uso. Por sua vez, o oxigênio dissolvido foi medido no reator aeróbio

usando um oxímetro CG 867, da Schott Gerate, calibrado ao uso. Como a aeração era

permanente, as medições eram realizadas com a sonda diretamente no interior do reator.

4.3.3. Demanda Química de Oxigênio (DQO)

As medidas de DQO foram feitas de acordo com o método colorimétrico de refluxo

fechado, descrito em APHA (1998). A solução ácida era preparada adicionando Ag2SO4 e

HgSO4 a H2SO4 concentrado. A solução de K2Cr2O7 era preparada secando-se previamente

o dicromato em estufa e resfriando-o em dessecador.

O protocolo para a análise de DQO consistia em adicionar, nesta ordem, 3mL da solução

ácida de ácido sulfúrico, 1,5mL da solução de dicromato de potássio 0,03mol/L e 3mL da

amostra (diluída de 20 vezes para as amostras de afluente e efluente e de 2 vezes para as

amostras de EPS e lisados) em frascos de vidro próprios para esta análise. Os frascos eram,

então, cuidadosamente fechados e seu conteúdo agitado apropriadamente. Em seguida, as

misturas eram aquecidas em termoreator Dry Block MA 4004 da Marconi por 2 horas, à

temperatura de 148ºC. Após seu completo resfriamento, as amostras eram decantadas ou

centrifugadas para eliminação de sólidos em suspensão e, posteriormente, encaminhadas

37

para análise em espectrofotômetro FEMTO 600 PLUS, no comprimento de onda de

585nm. As análises de DQO foram feitas sempre em triplicata. Solução estoque de

biftalato de potássio 1.000mg/L, cuja DQO pode ser calculada, foi usada para preparação

dos padrões para a curva analítica.

4.3.4. Sólidos Suspensos Voláteis (SSV)

A análise de SSV foi realizada para estimar a concentração de biomassa no interior dos

reatores aeróbio e anaeróbio. Cadinhos de porcelana eram levados à estufa 315 SE da

Fanem de um dia para o outro à temperatura de 105º C. No dia seguinte, após resfriamento

em dessecador, os cadinhos eram pesados em balança analítica Mettler Toledo, modelo AB

204, até estabilização da leitura. Em seguida, 10mL de amostras coletadas do interior dos

reatores eram centrifugados e os sobrenadantes eram adicionados aos cadinhos e

encaminhados para estufa novamente para evaporação de água. Após a completa secagem

da amostra e de novo resfriamento em dessecador, a nova massa era registrada. A seguir,

os cadinhos com as amostras eram encaminhados a uma mufla (Coel, TLK 49) à 550ºC por,

no mínimo, 1,5 horas, para combustão e evaporação da fração orgânica. Novamente, as

amostras resfriavam em um dessecador e a massa final era registrada. Efetuando-se os

cálculos descritos em APHA (1998), por diferença de massas, estimava-se a concentração

de SSV em cada sistema. Todas as análises foram realizadas em duplicata.

4.3.5. Ácidos Graxos Voláteis (AGVs) e glicose

A análise de AGVs e glicose residual nos efluentes dos dois reatores foi feita para permitir

o cálculo da produção de SMPs, conforme as equações 4.1 e 4.2 apresentadas no item 4.4

deste capítulo.

O preparo inicial das amostras para análise cromatográfica consistia na sua centrifugação e

remoção de material particulado residual por filtração usando membranas de porosidade

0,45µm. A fração filtrada era, então, congelada a -10oC até análise, que era feita em no

máximo 40 dias.

38

A análise de cromatografia líquida de alta eficiência foi feita em cromatógrafo HPLC da

Shimadzu (nas fase I e VI) ou da Hewlett Packard Series 1050 (nas demais fases),

utilizando-se uma coluna de troca iônica Aminex HPX-87H da Bio-Rad. A fase móvel

empregada foi ácido sulfúrico 0,01mol/L, com uma vazão de 0,6mL/min. A temperatura da

coluna foi mantida em 55ºC e o volume de injeção empregado foi o de 10μL. Os AGVs

foram detectados por ultravioleta no comprimento de onda de 210nm, enquanto que a

detecção da glicose foi feita empregando-se um detector de índice de refração HP 1047A

da Hewlett Packard. Foram feitas curvas analíticas com padrões dos principais ácidos

orgânicos (fórmico, acético, propiônico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico) e com

padrão de glicose utilizada na alimentação dos reatores, nas faixas de 12,5 a 400mg/L para

os AGVs e de 10 a 160mg/L para a glicose.

O método foi validado para as condições descritas e este detalhamento é apresentado no

Apêndice.

4.3.6. Análise de Proteínas

O teor de proteínas foi medido usando o método Lowry modificado descrito em Pontes

(2003), tendo como padrão da curva analítica a proteína SAB (soro albumina bovina) na

faixa de concentração de 0 a 800mg/L.

O método de Lowry se baseia na reação do cobre com a proteína, em meio alcalino, e pela

posterior redução do reagente de fosfomolibdato-fosfotungstenato no reagente Folin-

ciocalteau. Quando o reagente Folin-ciocalteau é adicionado à amostra contendo proteínas

e previamente tratada com o cobre, ocorre sua redução, resultando em uma cor mais

intensa, com absorção máxima em 550nm. Desta forma, as amostras foram analisadas

colorimetricamente a um comprimento de onda de 550nm num espectrofotômetro FEMTO

600 PLUS.

Todas as análises foram feitas em triplicata com a presença de um ‘branco’, constituído de

0,5mL de água destilada em substituição à amostra. Os procedimentos da análise são

apresentados a seguir:

39

• adição de 0,5mL de amostra e 5mL de solução “D” em tubos de ensaio e agitação

dos tubos;

• incubação dos tubos por 10 minutos, à temperatura ambiente, e acréscimo de

0,5mL do reagente Folin 1N. O reagente Folin é preparado pela diluição do

reagente Folin - ciocalteau na proporção de 1:2, com água deionizada;

• agitação dos tubos e, em seguida, incubação por 30 minutos, à temperatura

ambiente;

• leitura da absorbância em espectrofotômetro FEMTO 600 PLUS a 550 nm.

A solução “D” foi preparada a partir da mistura de:

• 98mL da solução A: 20g de carbonato de sódio e 4g de hidróxido de sódio em

1000mL de água destilada.

• 1mL da solução B: 1g de sulfato de cobre pentahidratado em 100mL de água

destilada.

• 1mL da solução C: 2g de tartarato de sódio e potássio em 100mL de água.

4.3.7. Análise de Carboidratos

O método utilizado para a determinação de carboidratos foi o método do fenol e ácido

sulfúrico, baseado na metodologia descrita por Dubois et al. (1956) apud Blundi e Gadêlha

(2001), que consiste na adição de fenol e ácido sulfúrico concentrado que, em presença de

carboidratos, resultam em uma cor laranja.

Para a análise de carboidratos, toma-se 0,5 ml da amostra a ser analisada, adiciona-se 0,5

ml de solução de fenol a 5%p/v e 2,5 ml de H2SO4. O ácido deve ser adicionado

rapidamente, com jato direcionado para a superfície do líquido, de modo a se obter uma

boa mistura. Os tubos de ensaio são deixados em repouso por 10 minutos, período após o

qual são agitados e depois colocados em um banho de água entre 25 e 30ºC por 15

minutos. A absorbância foi lida a 488 nm em espectrofotômetro FEMTO 600 Plus. Deve

ser preparada uma amostra em branco, substituindo-se a amostra por água destilada. A

concentração de carboidratos nas amostras foi determinada usando glicose para a curva de

calibração (faixa de 0 a 400mg/L) e as análises foram realizadas em triplicata.

40

4.4. Cálculo da concentração de SMPs

A quantificação dos principais ácidos orgânicos (C1 a C5) e o uso de relações

estequiométricas possibilita o cálculo da contribuição dos AGVs para a DQO residual

efluente dos reatores, principalmente o anaeróbio, de bancada. O conhecimento da DQO

filtrada efluente, da DQO devido aos AGVs e da DQO devido ao substrato não degradado

(glicose ou acetato) possibilitou estimar a DQO devido a compostos microbianos solúveis

(SMPs) produzidos durante o tratamento biológico, conforme as equações a seguir

(Aquino, 2004):

DQOAGV = 0,35×[formiato] + 1,07×[acetato] + 1,51×[propionato] + 1,82×[butirato +

isobutirato] + 2,04×[valerato + isovalerato] (Eq. 4.1)

DQOSMP = [DQOCent] – [DQOAGV + DQOSubRes] (Eq. 4.2)

onde,

DQOAGV = DQO devido aos ácidos graxos voláteis

DQOSMP = DQO devido aos compostos microbianos solúveis

DQOSubRes = DQO do substrato (glicose ou acetato) não degradado

DQOCent = DQO centrifugada efluente

Vale ressaltar que, para a determinação de SMPs, os AGVs são ‘subtraídos’ da DQO

residual porque eles são os principais metabólitos intermediários da digestão anaeróbia que

se acumulam no meio devido a um desbalanço entre os microrganismos acidogênicos

(rápido crescimento) e acetogênicos e metanogênicos (de crescimento mais lento). Os

AGVs também são produtos microbianos, mas são normalmente excluídos do pool de

SMPs porque se têm interesse em quantificar os produtos microbianos não-intermediários.

4.5. Análise por espectrometria de massas

Testes com injeção direta das amostras de efluentes (previamente centrifugados e filtrados

por membrana de 0,22 µm) no espectrômetro de massas foram realizados, sem êxito.

41

Portanto, verificou-se a necessidade de se dispor de uma técnica de concentração das

amostras destinadas às análises por espectrometria de massas. Foi escolhida a técnica de

liofilização, pela sua característica de preservação do ter orgânico da amostra e, para tal,

foi utilizado o equipamento L101 da Liotop.

Ao fim de cada fase operacional, amostras dos efluentes e afluentes aos reatores foram

centrifugadas em centrífuga Fanem Centrífuga Excelsa II 206 BL, a 5000rpm por 15 a 30

minutos até completa eliminação de sólidos no sobrenadante. O volume de 50mL de

sobrenadante era, então, congelado em vidraria apropriada. Após seu completo

congelamento, as amostras eram encaminhadas ao liofilizador, onde permaneciam até

completa sublimação da água (1 a 2 dias). Os liofilizados (amostra seca) eram, então,

preservados de umidade e luz (os frascos foram completamente cobertos com papel

alumínio e acondicionados em dessecadores, onde permaneceram até a preparação das

amostras para injeção no espectrômetro de massas).

Testes de solventes (para ressuspensão dos liofilizados e fase móvel durante a análise)

foram conduzidos com metanol, acetonitrila e solução aquosa de metanol 30%v/v. A

definição da condição ótima de resposta foi embasada na solubilidade dos sólidos e no

número de picos de relação mz/ obtidos nas amostras em cada solvente testado. Portanto, a

solução de metanol a 30%v/v foi empregada como solvente para ressuspensão dos sólidos

e preparação das amostras e esta mesma proporção foi mantida na composição da fase

móvel durante a análise no espectrômetro de massas. Após sua preparação, as amostras

foram congeladas (-10oC) até sua injeção no equipamento.

Procedeu-se, pois, em uma única batelada, a injeção direta das amostras provenientes de

todas as fases operacionais previamente descongeladas. O volume de injeção foi 5µl, o

fluxo de 0,2mL/min e as análises por espectrometria de massas para a identificação dos

SMPs foram realizadas no equipamento Shimadzu LC-IT-TOF. Os cromatogramas de íons

foram divididos em segmentos contendo eventos de varredura completa, seleção de íons

específicos e massa segunda (MS2) usando argônio como gás de colisão. O espectro obtido

no modo MS2 permite obter a “impressão digital” do composto detectado o que

possibilita, em alguns casos, a sua identificação. Com este procedimento, foi possível obter

os cromatogramas de íons específicos para as amostras dos liofilizados. Os liofilizados

foram analisados no modo de íons negativo e positivo, varrendo as relações m/z de 100 a

42

4.000Da, com a fase móvel consistindo de (A) H2O e (B) Metanol. As análises ocorreram

em modo isocrático com 70% de A e 30% de B, por um tempo de 5 minutos.

De posse de todas as relações m/z presentes em cada amostra, os dados foram extraídos do

equipamento e analisados por análise estatística multivariada de componentes principais

(PCA), bem como por contagem de ocorrências no programa Excel®. A seleção das

relações m/z para reinjeção e análise no modo MS2 foi realizada segundo critérios de

priorização, conforme descrito a seguir:

• dentre todas as relações m/z, foram excluídas aquelas cujas intensidades apareciam

também no afluente da fase considerada;

• determinou-se a frequência de ocorrência de m/z ao longo das diferentes fases e

selecionaram-se as relações m/z mais freqüentes ;

• os espectros das amostras cujas relações m/z tinham sido consideradas prioritárias

foram avaliados e quando os picos eram viáveis (boas intensidades e eliminadas as

hipóteses de ruídos), procedeu-se a reinjeção das amostras para análise no modo

MS2;

• no caso de picos inviáveis, novas relações m/z foram escolhidas, segundo os

critérios de freqüência nos efluentes e intensidade nos espectros de massas.

A Figura 4.2 apresenta os critérios utilizados para a escolha das relações m/z a serem

consideradas para identificação.

43

Figura 4.2 – Critérios utilizados para a escolha das relações m/z a serem consideradas para

identificação

4.6. MALDI-ToF-MS

Amostras de efluentes de duas fases (I e II) foram encaminhadas para análise em

equipamento MALDI-ToF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of

Flight-Mass Spectrometry - técnica de espectrometria de massas por ionização e dessorção

assistida por laser) da Shimadzu em São Paulo, SP. O objetivo de tal análise era obter

informações acerca do perfil de elevadas massas molares que pudessem estar presentes

nestes efluentes, uma vez que o espectrômetro de massas da UFOP analisava relações m/z

até 4.000 Da (1 Dalton equivale ao peso molecular do átomo de hidrogênio).

Planilha Completa de Massas

Massa presente também em amostras

de afluentes?

Desconsiderar massa

NÃOSIM

Classificar as massas prioritárias por ordem decrescente de

frequência

Contar número de efluentes em que a

massa aparece

NÃO SIM

Verificar intensidade dos picos nos espectros de massa das amostras. Alta intensidade ou picos viáveis?

Reinjetar amostra para análise no modo

MS2.

44

A preparação das amostras seguiu o mesmo protocolo estabelecido para a espectrometria

de massas. Ao fim de cada fase operacional (I e II), as amostras dos efluentes aos reatores

foram centrifugadas (Fanem Centrífuga Excelsa II 206 BL), a 5000rpm por 15 a 30

minutos até completa remoção de sólidos no sobrenadante. O volume de 50mL de

sobrenadante foi, então, congelado em vidraria apropriada. Após seu completo

congelamento, as amostras eram encaminhadas para concentração, em liofilizador L101 da

Liotop, onde permaneciam até completa sublimação da água (1 a 2 dias). Os liofilizados

foram, então, preservados de umidade e luz (os frascos foram completamente cobertos com

papel alumínio e acondicionados em dessecadores). A massa de 10,0 mg dos liofilizados

foi acondicionada em vials e encaminhada para a Shimadzu, em São Paulo. Os

procedimentos específicos adotados para esta análise estão descritos em detalhes no

relatório gerado pela empresa, apresentado em anexo.

4.7. Lise Celular e Extração de EPS de Amostras de Lodo

Segundo Jarusutthirak e Amy (2007), substâncias orgânicas tais como substâncias

poliméricas extracelulares (EPS) e produtos de lise celular (CLP) são produzidas e

liberadas concomitantemente ao consumo de substrato. Desta forma, o monitoramento

destes parâmetros foi feito para tentar entender a principal origem dos SMPs, comparando-

se o perfil químico dos EPS e dos CLP com o perfil químico dos SMPs. Para tal, as

amostras de EPS e CLP foram analisadas no espectrômetro de massas, nas mesmas

condições adotadas para as amostras de efluentes (item 4.5), e incluídas na análise

estatística por componentes principais (PCA).

4.7.1. Preparação das amostras para os procedimentos de lise celular e extração de

EPS de amostras de lodo

Anteriormente aos procedimentos de extração de EPS e lise celular, as amostras foram

lavadas e preparadas conforme a descrição a seguir.

• o volume de 100mL de amostra dos efluentes aos reatores foram coletados nas

Fases IV, V e VI e acondicionados em 2 tubos Falcon de 50mL ;

45

• as amostras foram, então, centrifugadas em centrífuga Fanem Centrífuga Excelsa II

206 BL, a 5.000rpm durante 15 minutos, até completa remoção de sólidos do

sobrenadante;

• o sobrenadante era, então, descartado e o pellet, ressuspenso no mesmo volume

original em uma solução fosfato de potássio (K2HPO4) estéril (previamente

autoclavada), 120mmol/L, pH 8 para lavagem do lodo;

• após a agitação do tubo contendo a solução fosfato e o lodo, a amostra era

novamente encaminhada à centrifugação, de forma idêntica à descrita

anteriormente. Este procedimento foi repetido por 2 vezes, de modo a garantir a

eficácia na lavagem da biomassa;

• após a última centrifugação, o pellet era novamente ressuspenso no mesmo volume

original (50mL) na solução de tampão-fosfato e, só então, encaminhado aos

procedimentos específicos.

4.7.2. Extração de EPS

O procedimento para a extração de EPS foi embasado no estudo de Frolund et al. (1996)

adaptado às condições operacionais/ambientais do laboratório. A extração foi feita com a

resina de troca catiônica Dowex® Marathon® C, Na+-Form, da Sigma-Aldrich. Com base

nos resultados obtidos pelos autores, foram adotadas as condições reportadas para extração

efetiva, quais sejam, tempo mínimo de extração de 12 horas em alta intensidade de

agitação, utilizando de 65 a 80g resina/gSSV. Portanto, 100mL de amostra de biomassa e

solução fosfato preparadas conforme descrito no item 4.7.1 foram encaminhadas em um

béquer para agitação, após a adição de 70g resina/gSSV. Este cálculo era feito com base na

média de SSV de cada fase operacional (da Fase IV em diante), uma vez que os reatores

são de mistura completa. Esta agitação foi feita com agitadores magnéticos Fisatom,

modelo 752, na maior intensidade possível, à temperatura ambiente, de um dia para o

outro, por 12 a 14 horas. Após este período, as amostras foram centrifugadas numa

centrífuga Fanem Centrífuga Excelsa II 206 BL, a 5.000rpm durante 15 a 30 minutos, até

completa remoção de sólidos do sobrenadante. O sobrenadante, contendo os EPS extraídos,

foi então congelado para posterior liofilização e preparação para análise por espectrometria

de massas.

46

4.7.3. Lise Celular

Zhang et al. (2007), Wang et al. (2006) e Tiehm et al. (2001) usaram em seus estudos a

técnica de ultrassom para lisar as células e estabilizar lodos de tratamento biológico

(sistemas de lodos ativados nos primeiros dois estudos e lodo anaeróbio, no último).

Guerlava et al. (1998) compararam diferentes métodos de lise celular em Clostridium

perfringens e indicam a sonicação (ultrassom) como um dos métodos mais eficazes para

este fim. Os autores observaram que 3 a 5 minutos de sonicação foram suficientes para a

lise completa das células. Portanto, com base neste estudo, 100mL de amostra de biomassa

e solução fosfato preparadas conforme descrito no item 4.7.1 foram encaminhadas em um

béquer para um banho de ultrassom da Unique, modelo Maxiclean 1600, por 1 hora, de

modo a garantir tempo suficiente para a completa lise das células da biomassa. Após este

tempo, as amostras foram centrifugadas numa centrífuga Fanem Centrífuga Excelsa II 206

BL, a 5.000 rpm durante 15 minutos, até completa remoção de sólidos do sobrenadante. O

sobrenadante, contendo os produtos da lise (CLP) foi então congelado para posterior

liofilização e preparação para análise por espectrometria de massas.

47

5. Resultados e Discussão

5.1. Quantificação dos SMPs em diferentes condições operacionais

5.1.1. Tipo de tratamento: aeróbio x anaeróbio

O tratamento empregado deve ser avaliado pela diferença da microbiota presente em cada

tipo de reator. Conforme abordado no Capítulo 3, as diferentes características da população

microbiana interferem sobremaneira no desempenho do tratamento da água residuária.

Para a avaliação da interferência do tipo de tratamento na produção/acúmulo dos SMPs,

estão sendo apresentados e discutidos os resultados obtidos para a DQO centrifugada, série

de sólidos, ácidos graxos voláteis (AGVs) e SMPs.

A Figura 5.1 mostra a variação de DQO no afluente e efluente dos reatores aeróbio e

anaeróbio para as diferentes condições operacionais estudadas (ver Tabela 4.2). Um

resumo da estatística descritiva deste parâmetro é apresentado na Tabela 5.1. Conforme

esperado, verifica-se para todas as fases operacionais, uma maior eficiência de remoção da

matéria orgânica afluente pelo reator aeróbio. A Figura 5.2 confirma a melhor eficiência no

reator aeróbio por meio do gráfico de interação por reator. Para a mesma DQO afluente,

resultados consideravelmente distintos foram obtidos para a DQO residual.

Esta observação era prevista, uma vez que há, no processo aeróbio, uma maior

disponibilidade de energia a ser canalizada para a multiplicação da população microbiana,

por ser o oxigênio o aceptor final de elétrons (Rittmann e McCarty, 2001). Na ausência de

oxigênio, ocorre a fermentação do substrato, ou seja, parte da molécula de substrato é

oxidada enquanto outra parte reduzida. Isso implica em menos liberação de energia para a

síntese de ATPs, o que traduz nas baixas taxas de crescimento dos microrganismos

anaeróbios. Em reatores aeróbios, o crescimento microbiano se dá muito mais rapidamente

e favoravelmente do que em reatores anaeróbios, o que pode ser verificado na Figura 5.3,

com os resultados de sólidos suspensos voláteis (SSV). Enquanto o reator aeróbio

apresentou um aumento ou manutenção da biomassa em condições operacionais não

estressantes, o reator anaeróbio mostra um declínio sistemático da biomassa (Figura 5.4),

principalmente em condições adversas (fases IV e V, operadas a baixa temperatura, 15oC).

48

Vale ressaltar que a Figura 5.3 mostra que há mais sólidos no reator anaeróbio do que no

aeróbio pelo fato de a quantidade de lodo inoculada ter sido diferente.

Tabela 5.1 – Estatística descritiva para o parâmetro DQO

Fases Reator Tipo DQO Média Desvio

Padrão Mín Mediana Máx

Afluente 4700 538 3700 4700 5967 Aeróbio Efluente 1646 594 767 1433 3100

Afluente 4740 540 3567 4700 5767 I Anaeróbio Efluente 3410 816 1833 3500 4833


Afluente 5004 693 3633 4900 6567 II Anaeróbio Efluente 2719 621 1367 2967 3700


Afluente 5423 579 4590 5290 6590 III Anaeróbio Efluente 1317 458 390 1390 2090


Afluente 5999 581 4690 6090 7190 IV Anaeróbio Efluente 4419 290 3890 4440 5090


Afluente 5040 713 3513 5080 6380 V Anaeróbio Efluente 4613 781 2980 4513 5913


Afluente 4882 805 3113 4947 6647 VI Anaeróbio Efluente 3475 705 2313 3580 4513

49

DQ

O (

mg/

L)VIVIVIIIIII

8000

6000

4000

2000

0

FASES VIVIVIIIIII

8000

6000

4000

2000

0

AFLUENTE; AERÓBIO AFLUENTE; ANAERÓBIO

EFLUENTE; AERÓBIO EFLUENTE; ANAERÓBIO

511350475890

539050334700

4947

5080

60905290

49004700

1513

3347

54039011671433

3580

45134440

1390

29673500

Demanda Química de Oxigênio

Figura 5.1 - Variação da DQO no afluente e efluente dos reatores aeróbio e anaeróbio ao

longo das fases operacionais estudadas (valores expressos como mediana)

FA SES

REA T OR

T IPO

A NA ERÓ BIOA ERÓ BIO EFLUENTEA FLUENTE

6000

4000

2000

6000

4000

2000

FASES

IIIIVVVI

III

REATORAERÓBIOANAERÓBIO

Gráficos de Interação - DQO

Figura 5.2 – Interação entre o tipo de reator e as fases operacionais para o parâmetro DQO

50

O reator anaeróbio, na fase VI, mesmo operando a 25oC, apresentou menor acúmulo de

biomassa, devido ao substrato utilizado (acetato), que suportava apenas o crescimento dos

microrganismos metanogênicos. Para o reator aeróbio, a mudança de 25oC para 15oC

(comparação das fases II e IV, para o mesmo TDH), parece ter favorecido o crescimento

de biomassa, a despeito da redução na eficiência de remoção de DQO. Isto poderia ser

atribuído à maior solubilização de oxigênio em temperaturas menores. Contudo, os dados

de OD não revelaram tal tendência.

No reator anaeróbio, a principal causa de abaixamento do pH é a produção de CO2 pelos

microrganismos acidogênicos de rápido crescimento. Entretanto, a literatura prevê o

acúmulo de acetato em reatores anaeróbios durante condições de estresse, provavelmente

devido às limitações cinéticas dos microrganismos metanogênicos, que é acentuada com a

redução de pH (Aquino e Chernicharo, 2005). Portanto, apesar de a degradação de acetato

também produzir CO2, o acetato se acumulou no meio devido à condição adversa. De fato,

a Figura 5.5 mostra a redução expressiva do pH do reator anaeróbio em duas fases

operacionais que impuseram condições adversas à biomassa (fase I, TDH de 4 dias e fase

IV, com temperatura de 15oC). Na fase V (reatores alimentados com acetato), em que

também se operou em condição adversa de temperatura, houve uma elevação do pH. Isto

se explica devido à redução da produção de CO2 decorrente na mudança do substrato

(1C6H12O6 => 3CO2 + 3CH4; 1CH3COO- + H2O => 1HCO3- + 1CH4), e também devido à

reação de hidrólise do acetato (ácido fraco, ou seja, base forte) com a água (CH3COO- +

H2O <=> CH3COOH + OH-) . Além disto, observou-se que a biomassa nesta fase estava

muito escassa e que a remoção de DQO foi seriamente comprometida, o que levou à

necessidade de aclimatação de novo lodo para a operação da fase subseqüente (fase VI).

51

SÓLI

DO

S (m

g/L)

FASES VIVIVIIIIII

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

0

VIVIVIIIIII

SST SSVREATORESAERÓBIOANAERÓBIO

6675

3945

3520

5145

9280

7825

18490

4535

16300

1650

15795

2555

3090

3390

1365

4115

4000

5290

9210

2930

7660

1285

8305

1810

Série de Sólidos

Figura 5.3 – Variação do teor de sólidos suspensos totais (SST) e voláteis (SSV) nos

reatores aeróbio e anaeróbio ao longo das fases operacionais estudadas (valores expressos

como medianas)

FASEFASE

REATORREATOR

ANAERÓBIOAERÓBIO

12000

9000

6000

3000

0

VIVIVIIIIII

12000

9000

6000

3000

0

FASE

IIIIVVVI

III


Gráficos de Interação (dados de média) para SSV (mg/L)

Figura 5.4 – Interação entre o tipo de reator e as fases operacionais para o parâmetro SSV

52

pH

Fase VIVIVIIIIII

9,0

8,5

8,0

7,5

7,0

6,5

6,0

VIVIVIIIIII

AERÓBIO ANAERÓBIO

7,927,83

7,007,157,21

7,79

7,60

7,51

6,676,83

6,72

6,47

Perfil do pH (antes de ajustar a alcalinidade)

Figura 5.5 – Variação do pH nos reatores, antes de sua correção para a faixa neutra

No reator aeróbio, a mesma tendência de elevação de pH nas fases V e VI, que utilizaram

acetato como substrato, e da fase I (de baixo TDH) foi observada. Além disto, houve uma

redução na eficiência de remoção de DQO nestas fases. Portanto, estes resultados podem

sugerir que, como o acetato é um substrato mais simples e contém menos energia potencial

armazenada em sua molécula, ele pode apresentar uma situação menos favorável à

atividade da população microbiana aeróbia (condição adversa). O mesmo seria válido para

TDHs baixos, que levaria também a uma condição operacional desfavorável.

Para avaliação da quantidade de substrato residual nos reatores, foi utilizada cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC) para detecção de glicose e acetato (nas fases V e VI),

conforme descrito no Capítulo 4. Em todas as amostras analisadas (principalmente na pior

condição de operação, ou seja, na fase I onde o TDH foi o menor e a carga orgânica diária

aplicada de 1,25kgDQO/m3.d) verificou-se a completa degradação deste substrato (nenhum

pico foi observado no tempo de retenção típico de 9,45 min). Portanto, pode-se afirmar que

não há contribuição de substrato residual para a DQO efluente (ver equação 4.2) nas fases I

a IV e, por isto, a quantificação de SMPs nessas fases foi feita utilizando a concentração de

glicose igual a zero. De fato, Jarusutthirak e Amy (2007) confirmam o desaparecimento

dos picos de glicose em efluentes de reatores aeróbios sequenciais a batelada (SBR –

53

sequencing batch reactors) em escala de bancada dentro de, no máximo, 1 hora de

tratamento. Da mesma forma, Chipasa e Medrzycka (2004), estudando reatores aeróbios a

batelada em escala de bancada, reportaram o aumento da DQO residual como sendo

unicamente devido ao acúmulo de SMPs e não devido ao substrato não degradado.

No caso das fases V e VI houve acúmulo de acetato e outros AGVs no meio, sendo que o

acetato acumulado pode se originar do substrato não degradado ou do metabolismo de

outros AGVs, que foram formados no meio a partir da degradação de SMPs. As Figuras

5.6 e 5.7 mostram o perfil de acúmulo de AGVs nas diferentes fases operacionais para os

reatores aeróbio e anaeróbio, respectivamente (os resultados de validação do método de

quantificação de AGVs encontram-se dispostos no Apêndice).

Com base na quantificação de AGVs, foi realizada a quantificação dos SMPs, segundo a

equação 4.2, descrita no capítulo 4. O valor da DQO residual é, pois, a soma dos

parâmetros AGV e SMP em cada gráfico. Nota-se que, no reator aeróbio, na grande

maioria dos casos, praticamente toda a DQO residual é advinda da produção de SMPs,

conforme reportado por outros pesquisadores (Grady Jr e Williams 1975; Siber e

Eckenfelder 1980; Parkin e McCarty 1981; Namkung e Rittmann 1986; Noguera et al.

1994; Barker et al. 1999; Barker e Stuckey 1999, apud Aquino 2004; Laspidou e Rittmann,

2002; Jarusutthirak e Amy, 2007).

Na fase III, no reator aeróbio, houve, inesperadamente, um acúmulo expressivo de AGVs.

As amostras foram analisadas cromatograficamente mais de uma vez, inclusive com sua

fortificação (spike), para a confirmação dos resultados controversos. Contudo, a presença

de AGVs no sistema aeróbio foi de fato detectada. Apesar de o reator ter operado com

média de oxigênio dissolvido de 6,4 mg/L, conforme mostra a Figura 5.8, foi decidido

aumentar sua aeração. De fato, após esta interferência, os AGVs produzidos reduziram ou

desapareceram. Nas demais fases, apesar de a observação de AGVs ter sido mais

esporádica, há que se considerarem também quedas de energia que ocorreram em épocas

chuvosas, interrompendo, ainda que por pouco tempo, o funcionamento do compressor de

ar do reator aeróbio. Portanto, os resultados de AGVs obtidos podem ser explicados pelo

fato de que, em condições de microaerofilia, há mudança de metabolismo e os

microrganismos aeróbios facultativos passam a fermentar e a produzir AGVs. Ressalta-se

ainda que, conforme descrito no Capítulo 4, a calibração do oxímetro ocorreu ao uso,

54

sendo pouco provável a hipótese de insuficiente oxigenação no meio. A Figura 5.8 mostra

o monitoramento de oxigênio dissolvido neste reator nas diferentes fases operacionais.

Já no reator anaeróbio, grande parte da DQO residual é constituída por AGVs. Observa-se

que as situações de estresse das fases I, IV e V (baixo TDH e/ou baixa temperatura)

contribuíram substancialmente para que a maior parte da DQO residual se devesse aos

AGVs. Em outras palavras, durante situações de estresse (baixo TDH e baixa temperatura)

a maior parte da DQO afluente é canalizada para a produção de AGVs. O acúmulo de

AGVs ocorre em sistemas de escala real como resultado do não atendimento às condições

cinéticas e termodinâmicas ótimas, podendo refletir ou indicar uma condição de

instabilidade (Aquino e Chernicharo, 2005). Com o baixo TDH, ocorre maior washout de

microrganismos de lento crescimento e em baixas temperaturas, os microrganismos de

lento crescimento não conseguem acompanhar o passo dos organismos fermentativos. O

acúmulo de acetato no meio desencadeia mudanças metabólicas e induz formação de

outros AGVs (propiônico, butírico, valérico...) e o acúmulo de tais subprodutos inibem,

termodinamicamente, a conversão de AGVs a acetato (o substrato principal da

metanogênese). A Figura 5.9 apresenta o boxplot para o parâmetro AGVs, onde esta

avaliação pode ser mais bem visualizada.

55

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

6 9 16 20 27 34 41 48Dia de operação - Reator aeróbio - Fase I

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

3 4 5 10 12 15 17 19Dia de operação - Reator aeróbio - Fase II

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 2 3 4 5 8 9 11 12 13 14 15 16Dia de operação - Reator aeróbio - Fase III

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 3 4 7 8 10 11 15 17 21Dia de operação - Reator aeróbio - Fase IV

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 2 3 4 5 8 9 10 11 12Dia de operação - Reator aeróbio - Fase V

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 3 5 8 9 10 11 12 15 16 17Dia de operação - Reator anaeróbio - Fase VI

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

Figura 5.6 – Composição da DQO residual para o reator aeróbio nas diferentes fases

operacionais: (a) fase I, (b) fase II, (c) fase III, (d) fase IV, (e) fase V, (f) fase VI.

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

56

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

6 9 16 20 27 34 41 48Dia de operação - Reator aeróbio - Fase I

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

4 5 10 15 17 19Dia de operação - Reator anaeróbio - Fase II

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 2 3 4 5 8 9 11 12 13 14 15 16Dia de operação - Reator anaeróbio - Fase III

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 3 4 8 9 10 11 15 17Dia de operação - Reator anaeróbio - Fase IV

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 2 3 4 5 8 9 10 11 12Dia de operação - Reator anaeróbio - Fase V

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 3 5 8 9 10 11 12 15 16 17Dia de operação - Reator anaeróbio - Fase VI

Con

c. (m

g/L)

AGV (DQO) SMP (DQO)

Figura 5.7 – Composição da DQO residual para o reator anaeróbio nas diferentes fases

operacionais: (a) fase I, (b) fase II, (c) fase III, (d) fase IV, (e) fase V, (f) fase VI.

(e) (f)

(c) (d)

(a) (b)

57

Fases

OD

(m

g/L)

VIVIVIIIIII

9

8

7

6

5

4

3

2

6,08

4,18

6,356,4

5,7

4,70

Oxigênio Dissolvido - Reator Aeróbio

Figura 5.8 – Variação do oxigênio dissolvido no reator aeróbio (valores expressos em

medianas)

O monitoramento feito mostrou que a produção de SMPs, em termos da DQO residual, no

reator aeróbio foi superior à do anaeróbio. Este resultado era previsto, uma vez que no

reator anaeróbio, os elétrons do doador (substrato) são canalizados tanto para a produção

de SMPs quanto para a de AGVs que se acumulam no meio devido a limitações de ordem

cinética e termodinâmica. Microrganismos aeróbios crescem mais rápido e degradam

substrato em velocidade maior. Se há mais microrganismos no meio, pode haver mais

SMP-BAPs e se há mais degradação de substrato há mais SMP-UAPs. Se os SMPs

desempenharem um papel ecológico no meio (para seqüestrar metais nutrientes, para

comunicação entre células), os microrganismos que crescem mais rápido precisam

produzir mais SMPs, por isso esperar-se-ia, de fato, que o aeróbio produzisse mais SMPs.

A menor produção de SMPs verificada para o reator anaeróbio comparativamente ao

aeróbio, quando avaliada a DQO residual, indica que os elétrons do doador (no caso, a

glicose ou acetato) foram utilizados preferencialmente na produção de intermediários

(AGVs), e que a elevada produção de AGVs foi o principal indicador de situações de

estresse (baixo TDH e baixa temperatura). Estas condições comprometem

significativamente o consórcio microbiano do reator anaeróbio, interferindo,

principalmente, nas taxas de crescimento da população metanogênica e acetogênica. Com

58

menos microrganismos acetogênicos e metanogênicos, os ácidos orgânicos produzidos

pelos microrganismos acidogênicos se acumularam no sistema. Em outras palavras,

condições adversas no reator anaeróbio resultaram em um descompasso entre os

microrganismos produtores de ácidos (acidogênicos) e os consumidores de ácido

(metanogênicos) resultando no acúmulo de compostos reduzidos no meio, causadores de

DQO (Aquino, 2004).

AGV

s (m

gDQ

O/L

)

Fase VIVIVIIIIII

4000

3000

2000

1000

0

VIVIVIIIIII

AERÓBIO ANAERÓBIO

0

29372

204401

0

2338

3780

3272

467

1649

2780

Acúmulo de Ácidos Graxos Voláteis

Figura 5.9 – Acúmulo de ácidos graxos voláteis (AGVs) nos reatores aeróbio e anaeróbio

nas diferentes fases operacionais (valores expressos em medianas)

Vale ressaltar que nas fases V e VI (que empregaram o acetato como substrato), para o

reator anaeróbio, o acúmulo de ácido acético representou 99 e 98% do total da DQO

relacionada a AGVs, respectivamente. Na fase V, para o reator aeróbio, o acetato

representou 88% deste valor. Para as demais fases, de I a IV (utilizando glicose), outros

AGVs também foram produzidos; contudo, os principais AGVs acumulados foram o ácido

acético (39%, 35%, 36% e 47% da concentração total de AGVs para as fases I, II, III e IV,

respectivamente) e o propiônico (26%, 28%, 41% e 38% da concentração total de AGVs

para as fases I, II, III e IV, respectivamente).

59

As Figuras 5.10 e 5.11 apresentam os resultados da estimativa de acúmulo de SMPs feita

para ambos os reatores em todas as fases operacionais. SM

Ps (

mgD

QO

/L)

Fase VIVIVIIIIII

5000

4000

3000

2000

1000

0

VIVIVIIIIII

AERÓBIO ANAERÓBIO

1602

3207

458

91

522

1667

1370

608

1160892

1504

379

Quantificação dos SMPs

Figura 5.10 – Estimativa de acúmulo dos SMPs nos reatores aeróbio e anaeróbio para as

diferentes condições operacionais (valores expressos em medianas)2

Os valores de SMPs apresentados na Figura 5.11 permitem estimar a contribuição de tais

compostos para a DQO residual. No reator aeróbio os SMPs representaram de 23% (fase

III) a 100% (fases I e VI) da DQO centrifugada efluente, sendo que no reator anaeróbio

essa variação foi de 11% (fase I) a 64% (fase III), em termos de medianas.

As Figuras 5.12 e 5.13 exibem as taxas de conversão da matéria orgânica afluente em

SMPs para os reatores aeróbio e anaeróbio. Elas mostram a relação entre os SMPs

formados e a concentração de substrato afluente a cada reator (So) a fim de se estimar a

porcentagem da DQO afluente que é convertida em SMPs.

2 Os poucos valores de concentração aparentemente divergentes entre SMPs (Fig. 5.10) e DQO residual (Fig. 5.1), em termos de medianas, se devem ao diferente volume de dados disponíveis e utilizados para o cálculo de medianas e obtenção dos gráficos para um e outro parâmetro, não representando, de forma alguma, qualquer contrasenso.

60

Fase

Reator

ANAERÓBIOAERÓBIO3000

2000

1000

0

VIVIVIIIIII

3000

2000

1000

0

Fase

IIIIVVVI

III

ReatorAERÓBIOANAERÓBIO

Gráfico de interação (médias) para SMPs

Figura 5.11 – Interação entre o tipo de reator e as fases operacionais para o parâmetro

SMPs

SMP/

So

Fase VIVIVIIIIII

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

VIVIVIIIIII

AERÓBIO ANAERÓBIO

0,28

0,68

0,085

0,02

0,11

0,35

0,27

0,13

0,190,17

0,27

0,090

Conversão da DQO afluente em SMPs

Figura 5.12 – Produção de SMPs normalizada em relação à DQO afluente (SMP/So) nos

reatores anaeróbio e aeróbio durante as fases operacionais estudadas (valores expressos

como medianas)

61

Na avaliação da produção normalizada de SMPs, comportamentos distintos foram

apresentados pelos dois reatores. Enquanto os resultados do tratamento aeróbio divergem

substancialmente entre as fases operacionais, variando de 2 a 68% da matéria orgânica

afluente, em termos de mediana, o tratamento anaeróbio pareceu seguir uma tendência

similar, exceto para a fase I, de menor TDH (em que apenas 9% da matéria orgânica

afluente foi convertida a SMPs). A Figura 5.13 revela que, de modo geral, a produção

normalizada de SMPs foi menor para o reator anaeróbio (de 9 a 27%), o que confirma

dados observados por outros pesquisadores (Barker e Stuckey, 2001; Kuo e Parkin,1996;

Aquino e Stuckey, 2004). Boero et al. (1991), estudando reatores aeróbios de mistura

completa mostraram que a produção de SMPs (normalizada em relação à concentração de

substrato afluente, só que em termos de carbono orgânico) variou de 3,1% a 14,7% quando

utilizados glicose e fenol como substratos, respectivamente. Ressalta-se que o TDH

utilizado em sua pesquisa foi de 48 horas, bem inferior a todos os TDHs adotados neste

trabalho. A maior produção de SMPs observada nesse estudo em relação aos resultados,

para a glicose, apresentados por Boero et al. (1991) podem ser explicados pelo maior TDH

adotado nesse trabalho (4 a 20 d), o que provavelmente resultou em maior lise celular e

produção de SMPs.

Fase

Reator

ANAERÓBIOAERÓBIO0,60

0,45

0,30

0,15

0,00

VIVIVIIIIII

0,60

0,45

0,30

0,15

0,00

Fase

IIIIVVVI

III


Gráfico de Interação (médias) para SMP/So

Figura 5.13 – Interação entre o tipo de reator e as fases operacionais para a produção

normalizada (SMP/So) de SMPs

62

As fases I e V foram aquelas que apresentaram maior discrepância entre as taxas de

conversão da DQO afluente em SMPs entre os reatores aeróbio e anaeróbio (na fase I, 35%

do aeróbio contra 9% do anaeróbio; na fase V, 68% do aeróbio contra 13% do anaeróbio).

Estes resultados são particularmente interessantes quando associados às condições

operacionais adversas de baixo TDH e baixa temperatura. Nestes casos, para o reator

anaeróbio, há um comprometimento dos microrganismos metanogênicos e acetogênicos no

meio, levando a um acúmulo de AGVs, conforme discutido anteriormente. Como os SMPs

são quantificados a partir da DQO residual e da DQO atribuída ao acúmulo dos ácidos,

taxas menores de conversão a SMPs realmente seriam esperadas. Da mesma forma, caso os

AGVs fossem englobados no “pool” de SMPs, sua maior produção normalizada (SMP/So)

também teria acontecido nas fases I e V (80% e 94%, respectivamente, para o reator

anaeróbio).

Portanto, os resultados confirmam que, em condições de estresse, a produção de SMPs é

minimizada em função do acúmulo de produtos intermediários (AGVs) não incluídos na

classe dos produtos microbianos solúveis.

Já para o reator aeróbio, condições adversas podem colaborar para o acúmulo de SMPs no

meio, uma vez que o metabolismo na presença de oxigênio dissolvido não resulta em

acúmulo de intermediários. A população microbiana poderia responder às condições

adversas alterando seu metabolismo, excretando SMPs no meio, ou ainda, caso as

condições levassem ao aumento do decaimento endógeno, liberando produtos de lise

celular. Variando-se apenas o TDH (avaliação das fases I, II e III), percebe-se que a

produção de SMPs no reator aeróbio foi inversamente proporcional ao TDH, ou seja,

quanto maior a carga orgânica aplicada maior a produção de SMPs, sendo o máximo de

produção observado na fase I (carga orgânica máxima de 1,25kgDQO/m3.d). Tais

resultados sugerem que os SMPs produzidos no reator aeróbio foram mais associados à

degradação do substrato (UAPs – utilization associated products) do que à lise celular

(BAPs – biomass associated products), conforme discutido por Aquino e Stuckey (2004).

Para as fases II e III, operadas com glicose na ausência de estresse, a quantidade de SMPs

produzida no reator aeróbio foi menor que no anaeróbio (11 e 2% contra 27 e 17%,

respectivamente). Contudo, a diferença não é discrepante como os resultados das fases I e

63

V, reportados anteriormente. Isto demonstra que o aumento do TDH nas fases II e III

propiciou uma situação mais favorável à degradação dos AGVs no reator anaeróbio. Na

ausência de estresse, sem acúmulo de AGVs, parte significativa dos elétrons disponíveis na

matéria orgânica afluente foi destinada à produção dos produtos microbianos. Na fase III, a

porcentagem de SMPs produzida nos dois reatores diminuiu comparativamente à fase II.

De fato, uma vez que ambos operaram com uma melhor eficiência, as DQOs efluentes

foram consideravelmente menores, para um valor aproximado de alimentação - DQO

afluente ao reator aeróbio de 5.596 ± 604 mg/L e ao reator anaeróbio de 5.423 ± 579 mg/L.

O baixo valor de SMPs acumulado no reator aeróbio parece ter sido decorrente da aeração

deficiente nos momentos de ‘picos de energia’, que levou à produção de AGVs (conforme

discutido anteriormente), bem como da melhor eficiência de remoção de DQO.

Finalmente, na fase VI, os resultados obtidos para ambos os reatores foram equivalentes

(28% para o aeróbio e 27% para o anaeróbio). Contudo, para o reator aeróbio, esta foi a

terceira maior produção normalizada de SMPs em relação à DQO afluente. Isto pode

sugerir que o acetato utilizado como substrato, por ser uma molécula mais simples e por

prover menos energia que a molécula de glicose para a população microbiana, possa

ocasionar uma maior produção normalizada de SMPs (por exemplo, provenientes de lise

celular devido ao menor fornecimento de energia no reator). No reator anaeróbio, a

produção de AGVs também foi intensa (mantendo a taxa de produção de SMPs

relativamente baixa) e pode ser justificada da mesma forma (acetato é uma molécula mais

simples, fornece menos energia e interfere no consórcio microbiano por suportar o

crescimento apenas dos microrganismos metanogênicos acetoclásticos).

A Figura 5.14 apresenta a estimativa da conversão diária de biomassa a SMPs nos reatores

aeróbio e anaeróbio durante as fases operacionais estudadas.

64

SMP.

Q/S

SV.V

(d-

1)

Fase VIVIVIIIIII

0,30

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00

VIVIVIIIIII

AERÓBIO ANAERÓBIO

0,05

0,07

0,0080,002

0,04

0,21

0,05

0,040,03

0,0060,010,01

Taxa diária de conversão da biomassa em SMPs

Figura 5.14 – Estimativa da conversão diária de biomassa a SMPs nos reatores aeróbio e

anaeróbio durante as fases operacionais estudadas (valores expressos como medianas)

Na Figura 5.15, observa-se, no reator aeróbio, a mesma tendência de decréscimo

sistemático obtida para o parâmetro SMP/So, comparando-se os diferentes TDHs (fases I,

II e III). Já no reator anaeróbio, esta taxa permaneceu praticamente constante nas três

primeiras (0,6 a 1%) e três últimas fases operacionais (3 a 5%). Esses resultados podem

indicar que, no reator anaeróbio, a produção de SMPs esteve mais relacionada à biomassa

presente, sugerindo que a lise celular pode ter contribuído mais para a produção de SMPs

quando comparado à degradação de substrato. Em outras palavras, o fato de a carga

orgânica aplicada não ter tido interferência significativa na conversão da DQO afluente a

SMPs sugere que, provavelmente, os SMPs acumulados são principalmente advindos da

biomassa (SMPs-BAP), ao invés da utilização do substrato (SMPs-UAP).

65

Figura 5.15 – Interação entre o tipo de reator e a razão entre o acúmulo de SMPs e a

biomassa presente no sistema

5.1.2. Condições operacionais

Conforme descrito no capítulo 4, as condições operacionais testadas para a produção de

SMPs foram a temperatura, o tempo de detenção hidráulica (TDH, que, neste caso, é

assumido igual à idade do lodo devido ao emprego de reatores de mistura completa) e o

tipo de substrato (acetato e glicose). Por meio do teste estatístico não paramétrico de

medianas (Mood´s median test) realizado no software Minitab® e transcrito a seguir na

Tabela 5.2, pode-se afirmar com 95% de confiança que, em ambos os reatores, as

diferentes condições operacionais influenciaram a quantidade produzida/acumulada de

SMPs no meio (o valor p obtido foi inferior a 0,05, o que indica a não igualdade entre os

valores testados – no caso, as fases operacionais).

Para avaliar o efeito da temperatura, deve-se comparar as fases II e IV (glicose como

substrato e TDH de 10 dias, a 25 e 14oC, respectivamente) e as fases V e VI (acetato como

substrato e TDH de 10 dias, a 15 e 25oC, respectivamente). Para a avaliação do TDH, cabe

Fase

Reator

ANAERÓBIOAERÓBIO

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00

VIV IV IIIIII

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00

Fase

IIIIV V VI

III

Reator AERÓBIO ANAERÓBIO

Gráfico de Interação (médias) para a razão SMP.Q/SSV.V

66

a comparação das três primeiras fases operacionais (I – TDH de 4 dias, carga orgânica

aplicada de 1,25kgDQO/m3.d; II – TDH de 10 dias, carga orgânica aplicada de

0,5kgDQO/m3.d; e III – TDH de 16 dias, carga orgânica aplicada de 0,32kgDQO/m3.d),

em que todas as demais condições operacionais foram mantidas constantes em cada reator

(glicose como substrato, temperatura de 25oC). Finalmente, para avaliar o efeito do tipo de

substrato, as fases II e VI (TDH de 10 dias e temperatura de 25oC) e as fases IV e V (TDH

de 10 dias e temperatura de 10oC) foram comparadas entre si.

Tabela 5.2 – Resultados dos testes de medianas para as diferentes fases operacionais nos

reatores aeróbio e anaeróbio.

Teste de Mediana de Mood: SMPs versus Fase - AERÓBIO Teste de mediana de Mood para SMPs

Qi-quadrado = 34,27 DF = 5 P = 0,000 => rejeita Ho => não iguais

Individual 95,0% CIs

Fase N<= N> Mediana Q3-Q1 +---------+---------+---------+------

I 0 8 1667 629 (--*---)

II 6 3 522 812 (-*------)

III 13 0 91 405 (*--)

IV 8 2 458 897 (----*---)

V 1 9 3207 1813 (--------------*---)

VI 3 8 1602 1023 (--------*)

+---------+---------+---------+------

0 1000 2000 3000

Mediana geral = 906

Teste de Mediana de Mood: SMPs versus Fase - ANAERÓBIO Teste de mediana de Mood para SMPs

Qi-quadrado = 14,34 DF = 5 P = 0,014 => rejeita Ho => não iguais

Individual 95,0% CIs

Fase_1 N<= N> Median Q3-Q1 +---------+---------+---------+------

I 7 1 379 653 (-------*-----)

II 2 5 1504 993 (--------------------*---)

III 8 5 892 678 (-------*---)

IV 1 8 1160 355 (-*-----)

V 7 3 608 1084 (-------*--------------)

VI 4 7 1370 1010 (-------------*------)

+---------+---------+---------+------

0 500 1000 1500

Mediana geral = 993

67

Temperatura

Conforme descrito no capítulo 4, a temperatura foi um dos parâmetros controlados para

monitoramento da produção de SMPs. As fases I, II, III e VI empregaram a mesma

temperatura de 25 oC. Nas fases IV e V, a temperatura desejada foi de 15 oC, para a qual se

empregou banho de água resfriada com adição periódica de gelo. A Figura 5.16 mostra o

boxplot das temperaturas medidas nas fases operacionais. Portanto, pode-se dizer que

ambas as fases operadas para temperaturas inferiores à ambiente (e que simularam o

comportamento dos reatores biológicos em regiões de clima mais frio), o fizeram

praticamente à mesma temperatura (15 ± 3 oC na fase IV e 16 ± 4 oC na fase V).

FASES

TEM

PER

ATU

RA

S (o

C)

VIVIVIIIIII

28

26

24

22

20

18

16

14

12

10

26,0

1514

25,025,025,0

TEMPERATURAS

Figura 5.16 – Temperaturas efetivamente medidas ao longo das fases operacionais

De modo geral, a temperatura interfere inversamente na produção de SMPs. Em outras

palavras, os resultados sugerem que, a temperaturas mais baixas, a produção de SMPs é

maior. Observando-se o gráfico da Figura 5.17, pode-se verificar que esta tendência é bem

acentuada para o reator aeróbio, o que corrobora a discussão feita anteriormente para este

reator, de que condições adversas de baixa temperatura contribuiriam para a elevação da

produção/acúmulo de SMPs no meio. De fato, a Figura 5.17, que mostra a interferência da

Estatística Descritiva: TEMPERATURAS FASES Média DP Mediana I 25,3 0,5 25,0 II 25,2 0,4 25,0 III 24,9 0,4 25,0 IV 15 3 14 V 16 4 15 VI 25,7 0,5 26

68

temperatura na taxa de conversão do substrato a SMPs, mostra que, a 15oC, cerca de 33,8%

da DQO afluente foi convertida a SMPs, enquanto que 18,7% foi a proporção obtida a

25oC. Portanto, é possível que a DQO residual de efluentes de reatores operados em climas

mais frios seja devida a substrato não degradado por causa do baixo metabolismo, bem

como ao maior acúmulo de SMPs.

Os SMPs podem se acumular mais em temperaturas menores devido à combinação de

fatores: maior produção e menor degradação. A maior produção pode ser devido à maior

lise celular, ou então devido à maior excreção de metalóforos (pequenos peptídeos

excretados em situações de deficiência nutricional) que teriam a função de quelar e

solubilizar mais metais nutrientes cuja solubilidade teria sido diminuída pela redução na

temperatura. Para o reator anaeróbio, essa tendência não foi verificada, e a Figura 5.17 que

a conversão da DQO afluente a SMPs ficou praticamente constante com a mudança de

temperatura (18,1% para temperatura de 15oC e 18,3% a 25oC). Isto se deveu ao fato de

que, mediante condições adversas, a rota metabólica caminha preferencialmente no sentido

de acúmulo de AGVs, pelo comprometimento das etapas de acetogênese e metanogênese,

conforme discutido anteriormente.

TEMPERATURA (oC)

SMP/

So

2515

0,36

0,32

0,28

0,24

0,20


Interferência da temperatura na conversão da DQO afluente em SMPs

Figura 5.17 – Interação da temperatura na produção normalizada de SMPs em relação à

DQO afluente (SMP/So), por reator

18,1% 18,3% 18,7%

33,8%

69

A Figura 5.18 mostra a interação da temperatura na razão entre a quantidade de SMPs

acumulada e a quantidade de biomassa presente no sistema (SMP.Q/SSV.V). Os resultados

obtidos sugerem que, no tratamento aeróbio, a elevação da temperatura aumenta a

porcentagem de conversão da biomassa a SMPs, o que pode ser um indício do aumento da

proporção de SMPs-BAP (decaimento endógeno). Tal resultado é condizente com o

aumento dos valores do coeficiente de decaimento endógeno (elevado nos aeróbios em

relação aos anaeróbios) com o aumento da temperatura. Já no tratamento anaeróbio, o

inverso é observado, indicando que são as baixas temperaturas que favorecem a produção

de SMPs-BAP. Tal resultado está de acordo com o que foi observado por Feng et al.

(2008) que, em um estudo com reator anaeróbio compartimentado com carreador (CABR),

verificaram o maior acúmulo de SMPs em menores temperaturas. Os autores sugeriram

que baixas temperaturas podem levar à redução na taxa de degradação de substrato e dos

SMPs ou inibir o crescimento microbiano.

TEMPERATURA (oC)TEMPERATURA (oC)

SMP.

Q/S

SV.V

(d-

1)

2515

0,35

0,30

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00


Interação da temperatura na conversão da biomassa a SMPs

Figura 5.18 – Interação da temperatura na razão entre a quantidade de SMPs acumulada e

a quantidade de biomassa presente no sistema

3,7% 1,8%

4,3%

6,6%

70

Tempo de detenção hidráulica

A variação no tempo de detenção hidráulica (TDH) ocorreu nas três primeiras fases da

pesquisa, conforme mostrado no Capítulo 4, na tabela 4.2. Os resultados da análise de

interferência deste parâmetro na produção de SMPs estão expostos na Figuras 5.19.

Observa-se que, no tratamento aeróbio, o aumento do TDH leva a uma diminuição

sistemática na produção/acúmulo de SMPs, para a faixa estudada de 4 a 16 dias (próxima

da faixa ideal de 2 a 15 dias reportada por Baskir e Hansford 1980; Rittmann et al. 1987;

Hao e Lau 1988; Pribyl et al. 1997 apud Aquino, 2003). De fato, tempos de detenção

muito baixos impõem uma carga orgânica aplicada mais elevada, o que poderia

desencadear um excesso de atividade metabólica e excreção de SMPs para o consumo do

substrato. Além disto, esta relação pode ser um indicativo de que, no reator aeróbio, há

uma maior produção de SMPs-UAP, conforme discutido no item 5.1.1.

TDH

SMP

(mgD

QO

/L)

16104

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0


Interferência do TDH na produção de SMPs

Figura 5.19 – Efeito do TDH no acúmulo de SMPs nos reatores aeróbio e anaeróbio

Para o reator anaeróbio, a mesma tendência é observada, exceto para o menor TDH (4

dias). Isto pode ser explicado pela elevada produção de AGVs diante da situação de

71

estresse imposta nesta condição, confirmada pelo monitoramento do pH. A análise da série

de sólidos da fase I confirmou a hipótese de arraste (washout) de microrganismos que têm

baixas taxas de crescimento específico (microrganismos metanogênicos e acetogênicos),

uma vez que pôde-se verificar uma diminuição sistemática dos sólidos suspensos voláteis

no reator. Como a quantificação de SMPs é obtida por meio dos resultados de AGVs,

explica-se o baixo resultado no menor TDH.

Huajun et al. (2008), estudando reatores anaeróbios compartimentados, confirmam os

resultados obtidos, pois também verificaram que, em geral, o aumento da carga orgânica

levou ao aumento da produção de SMPs. Da mesma forma, Aquino et al. (2009),

estudando a produção de SMPs em reatores UASB, também verificaram um maior

acúmulo de SMPs em menores TDHs (maiores cargas orgânicas). De fato, estudos usando

culturas puras sugeriram que produtos microbianos podem ser produzidos tanto como

resultado de falta ou de excesso de fonte energética, que seria o caso (Boylen e Ensign,

1970; Neijssel e Tempest, 1976 apud Huajun et al., 2008). Kuo et al., trabalhando com

reatores anaeróbios de mistura completa, mostraram que a produção normalizada de SMPs

(SMP/So) decresceu com o aumento da idade do lodo até atingir um valor mínimo, quando

a idade do lodo era de aproximadamente 25 dias, e depois aumentou novamente. As

Figuras 5.20 e 5.21 mostram esta relação para os resultados obtidos e as mesmas

observações são confirmadas, exceto pelo TDH de 4 dias no reator anaeróbio (condição de

estresse – washout do lodo e acúmulo de AGVs).

72

TDH (d)

SMP/

So

16104

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0


Interferência do TDH na conversão da DQO afluente em SMPs

Figura 5.20 – Efeito do TDH na taxa de conversão da DQO afluente em SMPs, por reator

TDH (d)TDH (d)

SMP.

Q/S

SV.V

(d-

1)

16104

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00


Interferência do TDH na conversão de biomassa em SMPs

Figura 5.21 – Interferência do TDH na razão entre o acúmulo de SMPs e a biomassa

presente no sistema.

37,1%

27,4%

3,8%

9,1%

21,5%

14,9%

22,2%

4,1%

0,4%

1,3% 3,7% 0,6%

73

Tipo de substrato

De modo geral, quando a glicose foi utilizada como substrato, a produção de SMPs

diminuiu, comparativamente ao emprego do acetato. As Figuras 5.22 e 5.23 descrevem

este efeito por reator, inclusive para a taxa de conversão da DQO afluente. Isto pode

sugerir que o acetato utilizado como substrato, por ser uma molécula mais simples e por

prover menos energia que a molécula de glicose para a população microbiana, possa

ocasionar uma maior produção normalizada de SMPs (por exemplo, provenientes de lise

celular). Isto justificaria, inclusive, a interferência do substrato bem mais pronunciada no

reator aeróbio que, mediante condições adversas, praticamente não produzem AGVs.

Contudo, tais resultados contradizem o observado por Kuo et al. (1996), que afirmaram

que a produção de SMPs em sistemas anaeróbios de mistura completa alimentados com

glicose é maior que naqueles alimentados com acetato.

A Figura 5.24 apresenta e efeito do tipo de substrato na razão de produção de SMPs em

função da biomassa presente no sistema. No reator aeróbio, o substrato parece não

interferir significativamente na produção de SMPs-BAP, uma vez que a taxa de conversão

da biomassa a SMPs ficou praticamente constante. Já no reator anaeróbio, a taxa inferior

obtida para a glicose no reator anaeróbio pode indicar que, em condições operacionais em

que este substrato é utilizado, a maior produção de SMPs estaria relacionada à utilização

do substrato (SMP-UAP) e não ao decaimento endógeno, comparativamente a situações

dispondo de acetato.

74

SUBSTRATO

SMPs

(m

gDQ

O/L

)

GLICOSEACETATO

2250

2000

1750

1500

1250

1000

750

500


Interferência do substrato na produção de SMPs

Figura 5.22 – Efeito do substrato na produção de SMPs, por reator

SUBSTRATO

SMP/

So

GLICOSEACETATO

0,45

0,40

0,35

0,30

0,25

0,20

0,15

0,10


Interferência do substrato na conversão da DQO afluente em SMPs

Figura 5.23 – Efeito do tipo de substrato na taxa de conversão da DQO afluente em

SMPs, por reator

41,9%

14,1%

16,6% 21,9%

75

SUBSTRATOSUBSTRATO

SMP.

Q/S

SV.V

(d-

1)

GLICOSEACETATO

0,35

0,30

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00


Interação do tipo de substrato na conversão da biomassa em SMPs

Figura 5.24 – Efeito do tipo de substrato na razão entre o acúmulo de SMPs e a biomassa

presente no sistema.

5.2. Caracterização dos SMPs

5.2.1. Proteínas e carboidratos

Conforme descrito no Capítulo 4, ensaios de proteínas e carboidratos foram realizados na

tentativa de caracterizar a DQO residual das diferentes fases operacionais. Além disto, os

mesmos testes foram feitos nas amostras de polímeros extracelulares e lisados, após a fase

IV, quando estes protocolos foram adotados. Os resultados estão reportados em termos de

DQO para que a comparação seja adequada. Para a conversão da concentração de proteínas

e carboidratos em DQO, foram usados os fatores 1,5 e 1,2, respectivamente, que são

coeficientes estequiométricos derivados da fórmula química típica de cada tipo de

composto (C16H24O5N4 para proteínas C6H10O5 para carboidratos). As Figuras 5.25 e 5.26

apresentam a composição da DQO residual nas amostras e fases descritas, nos reatores

aeróbio e anaeróbio, respectivamente.

5,2%

1,4% 4,8%

5,9%

76

LISEEPSEFLUENTE

3000

2000

1000

0

AMOSTRA LISEEPSEFLUENTE

3000

2000

1000

0LISEEPSEFLUENTE

I

DQ

O (

mg/

L)II III

IV V VI

DQO CARBOIDRATOSDQO PROTEÍNASDQO NÃO IDENTIFICADA

REATOR = AERÓBIOComposição da DQO residual - Proteínas e Carboidratos


dos produtos de lise celular em termos de proteínas e carboidratos – Reator Aeróbio

LISEEPSEFLUENTE

4000

3000

2000

1000

0

AMOSTRA LISEEPSEFLUENTE

4000

3000

2000

1000

0LISEEPSEFLUENTE

I

DQ

O (

mg/

L)

II III

IV V VI

DQO CARBOIDRATOSDQO PROTEÍNASDQO NÃO IDENTIFICADA

REATOR = ANAERÓBIOComposição da DQO residual - Proteínas e Carboidratos


dos produtos de lise celular em termos de proteínas e carboidratos – Reator Anaeróbio

77

Os resultados indicam que o conteúdo protéico e de carboidratos nas amostras de efluentes

são baixos e que a maior parte da DQO residual em todas as fases operacionais permanece

não identificada. Esta avaliação é válida exceto para a fase II no reator aeróbio, em que se

verificou que o conteúdo protéico representou 63% da DQO residual. Nas demais fases

ainda no reator aeróbio, a DQO relacionada ao teor de proteínas representou de 5 a 34% da

DQO residual e o teor de carboidratos (também em termos de DQO) não ultrapassou 16%.

Já para o reator anaeróbio, o teor de proteínas em termos de DQO atingiu seu máximo na

fase I, de TDH igual a 4 dias, representando 17% da DQO residual. Já para avaliação do

teor de carboidratos, nenhuma amostra analisada advinda deste reator apresentou

contribuição de carboidratos para a DQO residual.

O baixo conteúdo protéico e de carboidratos das amostras condiz com os resultados

obtidos para as amostras de efluentes das fases I e II encaminhadas para análise de

MALDI-TOF-MS (técnica de espectrometria de massas por ionização e dessorção assistida

por laser ideal para a identificação de macromoléculas como as proteínas), cujo relatório

encontra-se em Anexo. Os ensaios feitos não indicaram presença de macromoléculas

compreendidas na faixa de massa molar de 20.000 a 80.000 Da.

As Figuras 5.27 e 5.28 apresentam os dados de proteínas e carboidratos em termos

percentuais com relação à DQO residual, em cada fase, para os reatores aeróbio e

anaeróbio, respectivamente.

78

10%

34%

63%

22%

100%

5%

92%

0%

22%

0%

0%

17%

7%

1%

2%

8%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

73%

59%

36%

76%

0%

95%

8%

100%

78%

100%

100%

92%

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

EFAEI

EFAEII

EFAEIII

EFAEIV

EPSIV

LISEIV

EFAEV

EPSV

LISEV

EFAEVI

EPSVI

LISEVI

%PROTEÍNA

%CARBOIDRATOS

%INDETERMINADA



aeróbio. EFAE – efluentes aeróbios; FI a FVI – fases operacionais, de I a VI; LISE –

amostras de lisados; EPS – amostras de polímeros extracelulares.

Nas amostras de lise e EPS, praticamente todo o seu conteúdo pode ser caracterizado como

protéico. A concentração de carboidratos é nula em praticamente todas as amostras,

aparecendo apenas nas amostras de EPS provenientes do lodo aeróbio na fase IV e do lodo

anaeróbio na fase VI, nas baixas concentrações de 18 e 29 mgDQO/L, respectivamente. Os

valores baixos das concentrações de carboidratos obtidos nas amostras de EPS estão de

acordo com a literatura especializada. Her et al. apud Sheng e Yu (2006), utilizando a

técnica de fluorescência por matriz excitação-emissão (EEM), afirmaram que,

“comparativamente a proteínas e substâncias húmicas, a intensidade do espectro de

carboidratos poderia ser desprezada”. Portanto, os principais sinais de fluorescência para

EPS seriam os correspondentes a proteínas e substâncias húmicas (Sheng e Yu, 2006).

79

Dois dos picos obtidos no estudo de Sheng e Yu (2006) para EPS foram associados a

proteínas (a fluorescência seria associada ao aminoácido aromático triptofano).

9%

8%

13%

9%

100%

0%

100%

100%

16%

100%

93%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

7%

91%

92%

87%

91%

0%

0%

100%

0%

0%

84%

0%

0%

100%

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

EFANI

EFANII

EFANIII

EFANIV

EPSIV

LISEIV

EFANV

LISEV

EPSV

EFANVI

LISEVI

EPSVI

%PROTEÍNA%CARBOIDRATOS%INDETERMINADA



anaeróbio. EFAN – efluentes anaeróbios; FI a FVI – fases operacionais, de I a VI; LISE –

amostras de lisados; EPS – amostras de polímeros extracelulares.

A Figura 5.29 apresenta o gráfico de efeitos principais para a avaliação da DQO

proveniente de carboidratos e a Figura 5.30, o de interação entre fases, amostras e reator.

Observa-se que nenhuma amostra de produtos de lise celular apresentou carboidratos. Em

uma análise conjunta das Figuras 5.29 e 5.30 verifica-se que, de modo geral, o conteúdo de

carboidratos nas amostras de efluentes foi maior que em amostras de EPS, destaque dado

às fases I e II, para o reator aeróbio. Isto pode indicar que, nas amostras de efluentes em

que apareceram carboidratos, estes não eram exclusivamente advindos de polímeros

80

extracelulares. Como em amostras de lise verificou-se sua completa ausência, parte destes

carboidratos presentes no efluente poderiam ser talvez advindos de SMPs-UAP. Isso é

coerente com os relatos da literatura de que BAPs seriam de difícil degradação e de maior

peso molecular, ao passo que UAPs são de mais fácil degradação e de baixo peso

molecular.

Méd

ia d

a D

QO

- C

AR

BOID

RA

TOS

(mg/

L)

EPSEFLUENTE

300

200

100

0ANAERÓBIOAERÓBIO

VIIVIIIIII

300

200

100

0

AMOSTRA REATOR

FASE

Gráfico de Efeitos Principais (médias dos dados) para DQO CARBOIDRATOS

Figura 5.29 – Efeitos principais para análise de carboidratos por amostra, reator e fase

operacional

A Figura 5.31 apresenta o gráfico de efeitos principais para a avaliação da DQO

proveniente de proteínas e a Figura 5.32, o de interação deste parâmetro entre fases,

amostras e reator. De modo geral, as amostras provenientes do reator anaeróbio

apresentaram maior concentração de proteínas. Os resultados indicam que o maior

conteúdo protéico é observado nas amostras de EPS. Contudo, aumentou

consideravelmente na fase VI, empregando-se acetato como substrato a 25oC,

especialmente no reator aeróbio. Em uma avaliação deste resultado e daqueles

apresentados no item 5.1, pode-se levantar a hipótese de que, nesta fase, teria ocorrido a

liberação de polímeros extracelulares no meio e seu conteúdo protéico solubilizado no

efluente teria contribuído consideravelmente para o aumento observado na concentração de

81

SMPs. Em outras palavras, parte do conteúdo de SMPs na fase VI para o reator aeróbio

seria constituída de proteínas provenientes de polímeros extracelulares.

FA SE

REA T OR

A MOST RA

A NA ERÓ BIOA ERÓ BIO EPSEFLUENTE

200

100

0

200

100

0

FA SE

IIIIVV I

III

REA TO RA ERÓ BIOA NA ERÓ BIO

Gráfico de Interação (médias) - DQO CARBOIDRATOS


de carboidratos

Portanto, diante da observação de que, em todos os efluentes aeróbios (36% a 95%) e

anaeróbios (87% a 100%), há uma considerável fração da DQO que não parece ser

proteína e carboidratos, permanecendo não-identificada, optou-se pela utilização da técnica

de espectrometria de massas na tentativa de identificar tais compostos.

82

Méd

ia d

e D

QO

PR

OTE

ÍNA

S (m

g/L)

LISEEPSEFLUENTE

600

500

400

300

200ANAERÓBIOAERÓBIO

VIVIVIIIIII

600

500

400

300

200

AMOSTRA REATOR

FASE

Gráfico de Efeitos Principais - DQO PROTEÍNAS

Figura 5.31 – Efeitos principais para análise de proteínas por amostra, reator e fase

operacional

FA SE

REA T OR

A MOST RA

A NA ERÓ BIOA ERÓ BIO LISEEPSEFLUENTE

1000

500

0

1000

500

0

FASE

IIIIVVVI

III


Gráfico de Interação (médias) - DQO PROTEÍNAS


de proteínas

83

5.2.1. Espectrometria de massas

Como os resultados obtidos nas análises de MALDI-TOF não indicaram presença de

macromoléculas até 80.000Da, conforme mostra o relatório do Anexo II, tentou-se utilizar

outra técnica de espectrometria de massas (LC-IT-TOF-MS), em que a ionização da

amostra se dá por eletronspray, na tentativa de identificação dos SMPs que possuem

massas molares menores (100 a 4.000 Da). Na avaliação das relações massa/carga (m/z)

obtidas por espectrometria de massas, foi utilizada a análise estatística de componentes

principais (PCA) e o software Excel®, conforme descrito no Capítulo 4.

A análise por componentes principais (PCA) foi descrita originalmente por Karl Pearson,

em 1901, e consolidada por Hotelling, em 1931, com o propósito de analisar estruturas de

correlações. Na Química ela foi introduzida por Malinowski, cerca de 30 anos depois. O

PCA é um dos métodos mais frequentemente usados na extração e interpretação de dados

multivariados. A análise permite: (i) transformar as variáveis originais em novos eixos

(componentes principais), que são ortogonais, de tal maneira que os dados expressos como

os “scores” naqueles eixos não apresentam correlação entre si; (ii) expressar, tanto quanto

possível, a variação total dos dados em poucos componentes, agrupando dados similares,

mediante exames visuais em dispersões gráficas no espaço bi ou tridimensional; (iii)

expressar quantidades decrescentes da variação por cada componente principal derivado

sucessivamente. Os dados químicos multivariados podem ser arranjados na forma de uma

matriz, cujos objetos são dispostos em linhas e as variáveis em colunas. Numa

representação geométrica, a matriz dos dados originais pode ser considerada como m

pontos colocados em um gráfico em um espaço p-dimensional, em que os eixos originais

sofreram rotação para um novo conjunto de eixos ortogonais. As coordenadas dos pontos

originais nesse novo espaço são dadas pela matriz dos “scores”, e a orientação dos novos

eixos no espaço dos eixos originais é dada pelos autovetores. Portanto, diante do gráfico de

PCA, é possível interpretar a distribuição dos pontos e identificar as variáveis originais

com maior peso na combinação linear das componentes principais mais importantes.3

A Figura 5.33 mostra um perfil obtido por análise de componentes principais com os

resultados dos espectros de massas obtidos por amostras. Esta figura é particularmente

3 Fonte: http://www.posgraduacao.ufla.br/gauss/congresso/47rbras/p2-4.pdf, consultado em 25/05/09.

84

interessante para a avaliação da formação de clusters, que representariam amostras com

certa semelhança química.

Três grupos podem ser destacados e encontram-se realçados na Figura 5.33. Observa-se

claramente a formação do cluster para os produtos de lise celular. Este grupo é bem

distinto dos demais, principalmente das amostras de efluentes. Isto sugere que, na

caracterização química, os SMPs produzidos em cada fase operacional não parecem ser,

em sua maioria, provenientes de lise celular. Portanto, nos casos em que SMPs-BAP

fossem produzidos, estes produtos teriam sido degradados/hidrolisados em compostos de

menores massas molares, conforme discutiram Shin e Kang (2003).

Outro grupo que pode ser destacado, ainda que menos intensamente que os lisados, é o

formado pelas amostras de EPS. Portanto, da mesma forma, em termos de relação m/z, os

polímeros extracelulares diferem dos efluentes dos reatores nas fases operacionais

estudadas. Curioso é o comportamento da amostra proveniente do reator UASB que, apesar

de não constituir objeto deste estudo, indica que grande parte das massas no seu efluente

pode ser advinda de polímeros extracelulares. Isso talvez ocorra porque o reator é de fluxo

ascendente e operado em TDH bem menor (19 horas). Isso pode ter favorecido a formação

de flocos no lodo resultando na maior liberação de polímeros extracelulares. Além disto, é

interessante observar que na fase IV, quando foi imposta a condição de declínio de

temperatura, os polímeros extracelulares extraídos parecem ser de natureza química um

pouco diferente (a amostra de EPS desta fase encontra-se claramente separada das demais).

85

PC2

PC1

-20000-25000-30000-35000-40000

-185000

-190000

-195000

-200000

-205000

UASB

LISEANF6LISEANF5

LISEANF4

LISEAEF6

LISEAEF5LISEAEF4

EPSANF6 EPSANF5

EPSANF4

EPSAEF6

EPSAEF5EPSAEF4

AFANF6

EFANF6

AFANF5

EFANF5

EFANF4EFANF3

EFANF2

AFANF1EFANF1

AFAEF6EFAEF6

AFAEF5EFAEF5

EFAEF4

EFAEF3EFAEF2

AFAEF1

EFAEF1

PCA amostras


espectrometria de massas, por amostra (AFAE – afluentes aeróbios; AFAN – afluentes

anaeróbios; EFAE – efluentes aeróbios; EFAN – efluentes anaeróbios; EPSAE –

substâncias poliméricas extracelulares extraídas do lodo aeróbio; EPSAN – substâncias

poliméricas extracelulares extraídas do lodo anaeróbio; LISEAE – amostras de lisados de

células do lodo aeróbio; LISEAN – amostras de lisados de células do lodo anaeróbio; F –

fase operacional; UASB – amostra de um efluente de um reator de manta de lodo de fluxo

ascendente alimentado com solução de glicose e nutrientes na concentração de DQO

afluente de 500mg/L)

O mesmo é observado quando se avaliam as amostras de efluentes ao reator aeróbio. A

amostra referente à fase IV destoa completamente das demais, se aproximando inclusive da

amostra de EPS desta mesma fase. Ressalta-se, contudo, que, na fase V, em que a

temperatura continuou baixa, o efluente aeróbio parece apresentar características químicas

similares às demais fases (distintas, pois, dos polímeros extracelulares). Portanto, estas

observações podem sugerir que, em termos químicos, condições de choque (por exemplo,

baixa temperatura) podem contribuir para SMPs advindos de polímeros extracelulares

liberados e solubilizados no meio em resposta ao estresse imposto. Além disto, tais

resultados sugerem também que, à medida que a biomassa se adequa a esta nova condição,

LISADOS

EPS

EFAE,exceto F4

86

estes SMPs seriam degradados e os SMPs produzidos voltariam a ser produtos de natureza

química diferente de polímeros extracelulares. Em outras palavras, a produção de SMPs

advindos de EPS em reatores aeróbios de mistura completa aconteceriam mediante

choques de condições ambientais/operacionais e, na medida em que a biomassa fosse se

adequando a esta nova condição, os SMPs não possuiriam mais característica química de

polímeros extracelulares.

Para os efluentes do reator anaeróbio, nenhuma característica específica foi observada. Os

SMPs produzidos foram quimicamente distintos de amostras de lise e EPS, bem como

distintos entre si, avaliando-se cada fase operacional. Este resultado sugere que, pela

complexidade da bioquímica do consórcio microbiano presente neste reator, cada condição

operacional imporá características químicas distintas para os produtos microbianos

produzidos e que estes não são provenientes de lise celular e nem da extração de polímeros

extracelulares. Ressalta-se também a importância de se realizar, em trabalhos futuros,

testes para avaliação da metodologia de lise celular aplicada aos lodos de tratamento

biológico.

A Figura 5.34 apresenta o PCA para a análise das relações m/z nas amostras injetadas no

LC-MS, agrupados os modos positivo e negativo. Ressalta-se que foram rastreadas

relações m/z de 100 a 4.000 Da.

87

PC2 m/z

PC1

m/z

0,20,10,0-0,1-0,2

0,15

0,10

0,05

0,00

-0,05

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477,15

476,78475,79475,78475,77475,76474,83474,78474,77474,76474,72474,66473,80473,65473,64473,34473,25472,75472,69471,27470,81470,80470,79470,76470,75470,73470,68470,66470,40470,29470,04469,78469,73469,16

469,03468,86468,82468,81468,80468,79468,78468,69468,37468,19

467,80467,78

467,19

466,84466,79466,76466,74466,73466,71466,27466,08465,81465,75465,74465,72465,58464,80464,79464,78464,77464,72464,71464,33463,76463,73463,72463,42463,01462,94462,85462,81462,78462,75462,67461,80461,75460,86460,80460,79460,77460,73460,21459,81459,80459,78459,72458,79458,78458,74457,81457,79457,72457,04456,98456,84456,83456,82456,81456,80456,79456,78456,74456,73456,68456,08455,79455,76455,74455,73455,02455,01454,89454,83454,81454,76454,71454,42453,79452,82452,80452,74452,73452,06451,82451,80451,79451,78450,85450,80450,78450,76450,72450,40450,26449,80449,79448,83448,82448,81448,80448,76448,73447,77447,76447,04447,03446,89446,82446,80446,79446,75446,74446,67446,20445,84445,80444,98444,82444,75444,74444,67444,02443,76442,81442,80442,76442,68442,67441,84441,74441,01441,00440,99440,82440,81440,79439,82439,81439,76439,10438,83438,81438,80438,78438,53

438,10438,09

437,82437,81437,79437,78437,06436,83436,79436,77436,66436,48435,84434,86434,81434,80434,79434,78434,76434,69433,85433,83433,79433,78433,76433,20433,01432,91432,85432,70431,73431,63431,17

430,83430,82430,81430,80430,78430,75430,73430,71430,70430,15429,83429,81429,80429,73429,25429,24429,07428,84428,83428,80428,79428,78428,77428,76428,75428,74428,69427,99427,82427,81427,80427,79427,78427,73427,18426,85426,83426,82426,81426,80426,79426,74425,81425,77424,98424,85424,80424,71423,81423,78423,55422,83422,79422,76422,48421,84421,76421,19420,83420,82420,78420,72420,33419,81419,80419,07418,88418,83418,82418,81418,80417,83417,81417,80417,79

417,11416,83416,82416,81416,80416,79415,81415,80415,78415,30415,05414,98414,85414,84414,82414,80414,78414,77413,69413,27413,26413,11412,88412,80412,78411,81411,34410,82410,79410,76410,28409,80409,78409,27409,23409,22409,20409,19408,82408,81408,79408,23407,83407,82407,81407,80407,54407,05406,89406,81406,79406,73406,41406,02405,82405,80404,85404,84404,80403,85403,79402,95402,84402,83402,81402,80402,79402,63402,50402,15402,09401,84401,63401,21

401,10

401,09

401,03400,87400,82400,81400,80400,77400,73400,66400,31400,17400,10399,83399,80399,79399,74399,10

399,09

399,00398,96398,82398,81398,76398,74398,73398,54398,10397,82397,73397,08396,84396,83396,82396,81396,75396,29395,93395,84395,76395,73395,69395,57395,08394,84394,82394,76394,15393,79393,78393,30393,26393,22393,21393,20393,17

393,15

393,05392,80392,78392,74392,09391,94391,84391,83391,79391,43391,29390,84390,80390,78390,69390,25389,83388,86388,84388,82388,79388,78388,76388,74388,26388,25388,21388,03387,76387,74387,03387,02386,82386,74386,72386,71385,89385,87385,82385,76384,91384,83384,81384,72384,21384,14383,12383,10383,03382,87382,72382,68382,13381,98381,84381,80381,21381,01380,85380,83380,82380,13379,84378,86378,82378,80378,46378,16

378,10

377,84377,83377,10

376,90376,85376,81376,77376,48

376,10

375,79374,86374,82374,81374,74373,83373,82373,39373,01372,78372,74371,77371,75370,82370,79370,77370,74370,16369,86369,84369,83369,76369,37369,31369,15369,08

368,84368,19368,15368,09367,75366,87366,53366,14366,13366,02

365,16

365,09365,03364,97364,87364,81364,32364,14

364,12

363,84363,76363,00362,98362,88362,85362,84362,69362,30361,85361,15361,09361,04360,82360,80360,33360,17360,15360,14359,85359,84359,46359,02359,00358,87358,86358,85358,84358,71357,84357,78356,98356,85356,83356,80356,30356,06355,82355,51354,83354,82354,32353,96353,85353,23353,16353,09352,84352,81352,80352,77352,62351,00350,87349,72349,24349,19349,18

348,85348,83348,82348,79348,77347,84347,75347,46347,25347,07345,88345,85345,78345,73345,03344,94344,81344,25344,23344,19344,15344,13344,04343,87343,84343,40

343,14

343,03342,88342,86342,85342,84342,78342,13341,82341,51341,10

341,09

340,98340,90340,85340,84340,77340,21340,20340,11340,10

339,90339,88339,85339,83339,75339,21339,20339,19

339,10

339,09

339,05338,87338,86338,82338,79337,59337,35336,89336,88336,87336,86336,85336,74335,87335,15

334,86333,79333,63332,85332,72332,61332,15331,86331,82331,80330,88330,84330,83330,79330,76329,84329,44328,94328,89328,85328,80328,76328,75328,12327,21

327,12

326,76326,75325,94325,68325,19325,18325,08324,89324,76324,15322,85322,83321,82

321,13

320,93320,88320,87

320,15

319,82319,03318,86318,85318,12318,00

317,12

316,98316,89316,88316,87316,86316,83316,78315,87315,67315,23315,22314,90314,89314,87314,78313,91313,61313,21312,89312,84312,78311,78311,48311,29311,18311,17311,16310,86310,83310,82310,81310,04309,01308,89308,86308,84308,81308,76306,87306,86306,85

306,13306,12

305,45

305,16

305,15305,14

305,02304,87304,06303,16

303,02302,30302,15302,14301,15

301,14

301,03300,91300,86300,83300,63300,21300,20300,02299,88299,26299,01299,00298,93298,92297,95296,98296,97296,93296,90296,84295,87295,30295,19294,98294,90294,89294,30293,06

293,03292,87292,84292,83292,54292,53292,37291,73291,54291,01291,00290,87288,76288,35288,34288,29287,05286,59286,53285,03284,99284,89284,88284,79284,37284,03283,27283,26283,23283,03282,26281,25281,14280,98280,95280,85280,83280,39279,67279,17279,15278,88277,89277,87

277,11

277,10277,04

277,02277,01276,99276,89276,87276,86276,85274,91274,90274,89274,88274,24273,86271,79271,28271,27271,21271,02270,93270,92270,91270,86270,82270,80269,87269,84

269,11

269,09269,01269,00268,88268,87268,85268,80267,38267,07266,88266,80

263,06

263,01262,91262,90262,89262,85262,54261,73

261,13

260,95260,89260,88260,87259,17259,16258,98258,96258,89258,82258,69257,94257,78257,49257,39257,15256,91256,82256,18256,17255,82255,46255,23255,20254,98254,87254,85254,83254,82254,04253,21253,17252,95252,92252,85

252,05

251,94249,35249,20248,99248,96248,89248,79248,76246,95246,52246,41246,30246,28245,17245,01244,96244,95243,59242,96242,95240,89240,58239,67239,25239,13238,91238,90238,88237,28237,08237,07236,93236,91236,87236,83236,79236,49236,11

236,07

235,08234,87234,42233,98233,36233,08232,94232,90231,81231,12231,09230,94230,93230,90230,25230,16228,94227,98227,21227,10226,98226,81226,47226,14225,05224,92223,48223,26223,02222,52221,06221,05220,90220,89220,23219,80218,17217,15217,11217,10217,04

217,03216,93216,92216,91216,90216,14215,96215,04

215,03

214,94214,93214,92214,89214,85214,09213,24213,08

212,85

212,34212,08212,07210,98210,96210,95210,37209,07206,84205,15203,39203,05201,78201,58201,04201,03200,96200,87200,86200,09199,81199,03198,63198,50197,82

197,81

197,48197,26196,94195,93195,91195,81195,71195,13195,06

195,05194,99194,96194,92193,80193,60193,04192,67192,37191,44190,92189,92189,31189,08187,56

187,04

187,00186,99186,19186,05185,16184,81184,40183,74183,17183,16182,60181,55181,31180,90180,72178,98178,97177,28177,07176,94175,88175,43174,97174,95174,94174,93174,34173,96173,38173,08172,62172,49171,58170,95170,83170,64170,01167,77166,99166,96166,95166,49165,53164,95164,93164,84164,16163,54163,44162,85162,84161,84161,83161,71161,28161,13160,85160,84159,34159,19158,98157,55156,01154,93154,87154,85154,38153,80152,44150,89150,69150,66149,67149,15148,34146,95146,27144,87143,68143,15143,11142,92142,82142,59141,12141,02139,44138,43136,89136,84134,93134,36132,64132,47131,56131,07130,41129,79129,39129,07128,95128,93128,67128,03127,91127,90127,02127,00126,47126,29125,79125,72124,06123,08122,72122,29121,87119,85118,81118,62117,90117,46117,19116,72116,10116,02116,00114,08113,12112,99112,98112,47112,30110,01108,90108,42108,15107,97105,10103,84102,88102,31101,07100,11

PCA massas


espectrometria de massas nas amostras dos afluentes e efluentes a cada fase operacional,

nas amostras de extratos de polímeros extracelulares (EPS) e de produtos de lise celular

para as fases IV, V e VI.

Os espectros das amostras destoantes no gráfico de PCAs foram verificados em relação à

ocorrência nos afluentes, uma vez que tais relações m/z seriam relacionadas a compostos já

provenientes da alimentação, o que não seria interessante na caracterização de SMPs.

Diante da verificação desta ocorrência para tais amostras e do fato de o PCA não prover

diretamente esta informação, houve uma mudança na estratégia para a seleção das relações

m/z de interesse, conforme o fluxograma apresentado no Capítulo 4, na Figura 4.1.

Portanto, a priorização de m/z se deu segundo os critérios de (i) frequência de

aparecimento no efluente e ausência no afluente; (ii) intensidade de picos e (iii) viabilidade

dos picos. A Figura 5.35 mostra os resultados de m/z obtidos por meio de tabela dinâmica

do software Excel, com os mesmos dados extraídos do espectrômetro de massas e usados

na confecção do gráfico de PCA.

88

102,88

105,1

112,98

112,99

116

116,72117,46118,62123,08

124,06

127,02

127,9

128,67128,93128,95129,39131,56132,47134,36136,89141,02

141,12142,59

143,15

146,27

148,34

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321

71,4

321

92,9

122

01,2

922

15,2

122

31,5

922

78,1

622

94,5

822

99,7

423

02,1

723

19,7

323

37,9

923

44,4

523

48,8

223

51,2

723

75,2

824

13,5

724

18,9

624

19,3

624

24,0

824

45,5

524

48,5

924

60,6

724

79,8

724

86,1

524

94,4

125

06,7

425

18,0

725

22,2

925

37,5

925

65,7

425

91,8

2592

,33

2598

,46

2600

,84

2623

,22

2632

,66

2638

,39

2644

,44

2658

,91

2695

,19

2719

,99

2748

,127

73,4

628

08,8

928

51,9

329

48,5

130

50,8

732

27,7

832

40,9

6

Fase 2 Fase 3 Fase 4 Fase 5 Fase 6 Fase 1

Contar de MASSA

MASSA

FASE

Figura 5.35 – Gráfico dinâmico para a contagem das relações m/z presentes nos efluentes

e ausentes nos afluentes

Pôde-se constatar que, houve, de fato, a predominância de baixas massas molares,

conforme esperado diante dos resultados de MALDI-TOF. De fato, a ocorrência

predominante de compostos de baixas massas molares nos SMPs não é surpresa. Aquino et

al. (2009), estudando a produção de SMPs em reatores UASB, verificaram que, apesar da

distribuição de massas molares dos efluentes dependerem das condições operacionais, a

maior parte é constituída de compostos de massa molar inferior a 1.000 Da. Segundo

Jarusutthirak e Amy (2007), produtos associados à utilização do substrato (UAPs) são

esperados em condições abundantes de substrato, enquanto aqueles associados ao

decaimento da biomassa (BAPs) prevalecem em ambientes em que haja sua escassez . Ora,

a alimentação de substrato empregada neste trabalho foi contínua e as cargas orgânicas

aplicadas (1,25; 0,5 e 0,32kgDQO/m3.d) devidamente abundantes para se justificar a

prevalência de SMPs-UAP. Shin e Kang (2003) sugeriram ainda a decomposição de SMPs

de alta massa molar a compostos de massas molares inferiores a 10.000Da por

microrganismos aclimatados (longo TDC) em bioreatores de membrana cerâmica. Nesta

pesquisa, todas as amostras foram coletadas após o tempo de aclimatação da biomassa.

Portanto, a predominância de compostos de baixa massa molar também poderia ser

explicada pela degradação e/ou hidrólise de SMPs de alta massa molar (SMPs-BAP).

89

Diante dos inúmeros dados de m/z detectados pelo equipamento, com base na Figura 5.35,

foi possível selecionar algumas relações m/z para reavaliação dos espectros de massas

obtidos. Esta etapa foi particularmente importante, uma vez que a alta resolução do

equipamento, que permite a obtenção de m/z com 4 casas decimais, havia sido

“mascarada” pelo arredondamento em 2 casas decimais para a planilha de dados do PCA.

Além disto, como o equipamento é capaz de detectar m/z em níveis-traço, foi fundamental

verificar se as relações m/z realmente eram picos ou apenas ruídos, uma vez que a

avaliação matemática também não havia considerado intensidades.

Portanto, com os espectros em mãos e avaliação individual de cada m/z da Tabela 5.3

verificou-se que (i) m/z de 217,10 era a mesma descrita como 217, 11, que estava presente

nos afluentes e que, portanto, foi desconsiderada da análise; (ii) as relações m/z 256,82;

349,18; 349,19 e 305,16 tinham intensidades similares ao ruído da análise sendo, portanto,

desconsideradas da análise. A Tabela 5.3 apresenta, então, o resultado desta análise com as

relações m/z escolhidas e as amostras em que apareceram.

Diante do exposto, as amostras que obtiveram maior intensidade de picos para m/z em

questão foram reinjetadas no equipamento, nas mesmas condições anteriores (descritas no

Capítulo 4) para reavaliação do espectro e obtenção também da massa segunda (modo

MS2). Os espectros de massas obtidos são apresentados nas Figuras 5.36, 5.37 e 5.38.

Tabela 5.3 – Amostras mais frequentemente consideradas para investigação, presentes nos

efluentes e ausentes nos afluentes das fases operacionais.

RELAÇÃO MASSA/CARGA (M/Z) AMOSTRAS EM QUE APARECEM

EFAN F2, F3, F6

EPSAN F4 325,18

UASB

EFAN F2, F3, F6

EPSAE F4 / EPSAN F4, F6

LISEAN F4, F6

339,20

UASB

90

280 290 300 310 320 330 340 350 360 m/z0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Inten.(x10,000)

339.1994

325.1847

311.1657

14.0147

14.0190

Figura 5.36 – Espectro de massas para o efluente anaeróbio da fase VI, para as relações

massa/carga m/z=339,20 e m/z=325,18

175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 m/z0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0Inten.(x100,000)

339.1987

183.0132



91

175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 m/z0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0Inten.(x100,000)

325.1832

183.0133



A Figura 5.36 mostra que a diferença entre as relações m/z 325,1832 e 339,1987

corresponde à m/z= 14,0147, atribuída a um CH2. Isto sugere que as relações m/z são

referentes ao mesmo composto, diferindo apenas pelo número de carbonos da cadeia. As

análises de MS2 para ambas as relações m/z confirmaram a hipótese de se tratarem de

mesmos compostos, uma vez que m/z da massa segunda obtida a partir da colisão para as

duas m/z foi a mesma (183,0133). A seqüência de m/z obtida (339/325/311) diferindo

apenas por um CH2 e a massa segunda de relação m/z 183,0133 confirmaram a

caracterização química de LAS (Alquilbenzenos de cadeia linear), que são agentes

surfactantes muito utilizados na fabricação de detergentes comerciais, conforme detectado

por Leite (2008) analisando esgoto sanitário por espectrometria de massas. A Figura 5.39

mostra a estrutura química típica do surfactante aniônico LAS.

Figura 5.39 – Estrutura química típica do alquilbenzeno sulfonado de cadeia linear (LAS)

92

Entretanto, como LAS são compostos indicadores de contaminação por detergentes,

levantou-se a hipótese de que estes compostos poderiam ser provenientes do processo de

obtenção das amostras para identificação ou que poderiam estar adsorvidos no lodo usado

no tratamento anaeróbio. Contudo, algumas observações são relevantes para consideração:

(i) a hipótese de contaminação a partir do afluente e ao longo de toda a linha até a

chegada da alimentação ao reator está descartada pelo fato de esta relação m/z

não aparecer nos afluentes;

(ii) a hipótese de contaminação por lavagem de vidraria, obtenção e concentração

das amostras e preparo para injeção no LC-MS é praticamente nula, uma vez

que, se fosse este o caso, as demais amostras apresentariam a mesma relação

m/z, por terem todas seguido os mesmos procedimentos anteriores à análise de

espectrometria;

(iii) a hipótese restante de adsorção destes compostos LAS nos lodos provenientes

da estação de tratamento de esgoto de Belo Horizonte quando de sua inoculação

é remota. Apenas duas inoculações de lodo anaeróbio foram realizadas: a

primeira, em 25/10/07, um mês e meio antes do início da coleta de amostras

para resultados de caracterização da fase I (17/12/07). A segunda reinoculação

ocorreu no início da fase VI, por necessidade de reposição da população

anaeróbia, conforme descrito anteriormente. A data de inoculação foi 01/10/08,

27 dias antes do primeiro resultado obtido para a caracterização dos SMPs desta

fase. Estes tempos provavelmente seriam suficientes para que a biomassa

tivesse degradado estes contaminantes. Além disto, nas fases II e III, não houve

qualquer inoculação de novo lodo; contudo, nestas fases estes compostos

também foram observados. Ressalta-se ainda, como citado no Capítulo 4, que o

reator foi operado por, no mínimo, 3 vezes o TDH para a coleta de amostras

para as análises de espectrometria de massas (30 e 48 dias para as fases II e III,

respectivamente).

Desta forma, os resultados abrem a possibilidade de produção de LAS por microrganismos

anaeróbios. Sabe-se que alguns microrganismos produzem agentes surfactantes e isso é

coerente com as observações de que tais compostos são de difícil degradação anaeróbia,

havendo indícios até de ligeiro aumento da concentração de surfactantes nos reatores

anaeróbios (Leite, 2008). Contudo, isto deve ser avaliado com cautela, uma vez que os

biosurfactantes reportados pela literatura não são LAS.

93

A formação de complexos com metais seria uma hipótese forte e promissora diante das

relações m/z obtidas, considerando a produção de metalóforos (SMPs deliberadamente

excretados para complexar metais nutrientes e transportá-los para dentro das células ou

para mitigar toxicidade de metais).

Os metalóforos são constituídos de pequenas sequências de peptídeos (portanto dão

positivo no teste de proteínas – o que é coerente com os resultados obtidos) e possuem

baixa massa molar (por isso não seriam identificados nas análises de MALDI-TOF aqui

realizadas). De fato, os surfactantes microbianos incluem lipopeptídeos e glicopeptídeos e

estão tendo aplicação cada vez maior na produção de cosméticos, detergentes e agentes

anti-microbianos e também na recuperação mineral e de óleo (Price et al., 2009; Nayak et

al., 2009). Portanto, os surfactantes microbianos não são sulfonados como o LAS (Price et

al., 2009; Nayak et al, 2009; Patel et al., 2009), mas sim constituídos de uma parte lipídica

apolar e uma parte glucosídica polar. Como exemplo, os ramnolipídeos são uma classe de

biosurfactantes constituída de moléculas de açúcar ramnose e de ácidos β-

hidroxilalcanóicos. Nayak et al. (2009) indentificaram, também por meio de

espectrometria de massas, a produção deste biosurfactante, verificando a predominância de

unidade mono e di-ramnose ligadas a duas unidades de ácidos β-hidroxilalcanóicos com

cadeia carbônica variando de C5 a C12 e relação m/z baixa (entre 284 e 689).

Na tentativa de se avançar mais na caracterização dos SMPs, novas relações m/z foram

levantadas para análise de MS2, agora com base nos critérios de intensidade e frequência

de duas aparições nos efluentes. Eliminando-se ruídos e aquelas m/z presentes nos

afluentes, selecionaram-se algumas relações m/z, conforme Tabela 5.4.

Apesar da reinjeção destas amostras para obtenção de massas segunda, pouco foi possível

avançar na identificação de sua fórmula química. O software do equipamento LC-MS

utilizado não possui biblioteca, o que dificulta sobremaneira este trabalho. Além disto, os

espectros obtidos não foram conclusivos, o que leva à necessidade de adoção de outras

técnicas de identificação para auxiliarem na identificação química precisa, o que

demandaria um tempo ainda longo de pesquisa.

94

Outro dificultador desta avaliação foi o fato de, exceto para as relações m/z já analisadas e

identificadas, não haver um perfil de relações m/z típico nas amostras das diversas fases

operacionais. Em outras palavras, a maioria das relações m/z detectadas apareceu

pontualmente, em uma ou duas fases, o que pode sugerir que, talvez, muitos compostos

diferentes em baixas concentrações compõem a parcela de SMPs da DQO residual, ao

invés de alguns poucos compostos típicos em alta concentração. Desta forma, cada

condição operacional parece interferir intensamente e ser determinante para a característica

química dos SMPs produzidos, o que leva a uma necessidade ainda maior de esforços no

avanço de sua identificação.

Tabela 5.4 – Novas relações m/z para investigação, presentes nos efluentes e ausentes nos

afluentes das fases operacionais estudadas.

RELAÇÃO MASSA/CARGA (M/Z)

173,0794

236,0714

248,9597

320,8690

342,1338

351,0022

362,9802

368,1489

434,8060

560,5892

Outra hipótese a ser considerada ainda diante das relações m/z obtidas seria a formação de

complexos com metais. Os compostos orgânicos complexados com metais do meio

formaria ‘adducts’, dificultando a sua identificação química no espectrômetro de massas.

Se tal fato aconteceu com as amostras analisadas, abre-se a perspectiva de os SMPs serem

agentes complexantes produzidos por microrganismos para seqüestrar metais nutrientes em

condições de escassez nutricional.

Segundo Aquino (2004), os SMPs possuiriam grupos funcionais quelantes típicos

(carboxilatos, hidroxilas, sulfidrilas, fenóis, aminas) que agiriam como ligantes e

95

complexariam metais normalmente encontrados na água. Kuo e Parkin (1996) verificaram

a produção de SMPs níquel-quelantes, e mostraram que o aumento no TDC (tempo de

detecção celular) implicou no maior acúmulo de SMPs quelantes. Para os autores, os

microrganismos excretariam tais substâncias para reposição nutricional em altos TDCs.

Estudos recentes têm sido realizados na avaliação da produção de sideróforos por

microrganismos (Patel et al., 2009; Nayak et al., 2009). Sideróforos são ligantes ferro-

quelantes de massa molar relativamente baixa (550 a 1.000 Da) sintetizados pela maioria

dos microrganismos em condições ferro-limitantes (Hider, 1984; Neilands, 1981, Neilands,

1995 apud Patel, 2009). Os microrganismos transportam ferro para dentro da célula por

meio da formação de complexos sideróforos-ferro. Os sideróforos solubilizam o ferro

circundante não solúvel para torná-lo biologicamente disponível (Neilands, 1995;

Winkelmann, 1991 apud Patel et al., 2009).

Portanto, uma avaliação de espécies microbianas presentes nos reatores por meio da

tentativa de identificação de espécies com capacidade de produção de sideróforos e a

procura dos metalóforos e seus complexos seria uma abordagem atrativa para a

continuação dessa pesquisa de elucidação acerca da natureza química dos SMPs.

96

6. Conclusões e sugestões para trabalhos futuros

• No reator aeróbio, na grande maioria dos casos, praticamente toda a DQO residual

é advinda da produção de SMPs, conforme previsto em literatura. Alguns atípicos

resultados de AGVs obtidos e confirmados para este reator sugerem possíveis

condições de microaerofilia, em que há mudança de metabolismo e os

microrganismos aeróbios facultativos passam a fermentar e a produzir AGVs.

• No reator anaeróbio, grande parte da DQO residual é constituída por AGVs,

principalmente nas condições de estresse. Observou-se que as situações de estresse

das fases I, IV e V (baixo TDH e/ou baixa temperatura) contribuíram

substancialmente para que a maior parte da DQO residual se devesse aos AGVs,

conforme previsto na literatura, como resultado do não atendimento às condições

cinéticas e termodinâmicas ótimas.

• A produção relativa de SMPs, considerando a DQO residual, no reator aeróbio foi

superior à do anaeróbio, uma vez que no reator anaeróbio, os elétrons do doador

(substrato) são canalizados tanto para a produção de SMPs quanto para a de AGVs

que se acumulam no meio e a elevada produção de AGVs foi o principal indicador

de situações de estresse (baixo TDH e baixa temperatura). Além disto, como os

microrganismos aeróbios crescem mais rápido e degradam substrato em velocidade

maior, pode haver mais SMP-BAPs e SMP-UAPs.

• As fases I e V foram aquelas que apresentaram maior discrepância entre as taxas de

conversão da DQO afluente em SMPs entre os reatores aeróbio e anaeróbio (na fase

I, 35% do aeróbio contra 9% do anaeróbio; na fase V, 68% do aeróbio contra 13%

do anaeróbio). Considerando as condições operacionais adversas de baixo TDH e

baixa temperatura, para o reator anaeróbio, há um comprometimento dos

microrganismos metanogênicos e acetogênicos no meio, levando a um acúmulo de

AGVs e para o reator aeróbio, condições adversas podem colaborar para o acúmulo

de SMPs no meio, uma vez que não é prevista a produção de intermediários.

• O aumento do TDH em condições não estressantes propiciou uma situação mais

favorável à degradação dos AGVs no reator anaeróbio. Nas fases II e III, operadas

com glicose na ausência de estresse, a quantidade de SMPs normalizada em função

da DQO afluente no reator aeróbio foi menor que no anaeróbio (11 e 2% contra 27

e 17%, respectivamente). Portanto, sem acúmulo de AGVs, parte significativa dos

97

elétrons disponíveis na matéria orgânica afluente foi destinada à produção dos

produtos microbianos.

• No reator anaeróbio, a carga orgânica aplicada não apresentou interferência

significativa na conversão da DQO afluente a SMPs sugerindo que, provavelmente,

os SMPs acumulados são principalmente advindos da biomassa (SMPs-BAP), ao

invés da utilização do substrato (SMPs-UAP). Já no reator aeróbio, os SMPs

acumulados parecem principalmente advindos da utilização do substrato (SMPs-

UAP), uma vez que a carga orgânica interferiu proporcionalmente na conversão da

matéria orgânica afluente em SMPs.

• A temperaturas mais baixas, a produção de SMPs parece ser maior, especialmente

para o reator aeróbio, uma vez que condições adversas de baixa temperatura

contribuiriam para a elevação da produção/acúmulo de SMPs no meio. A 15oC,

cerca de 33,8% da DQO afluente foi convertida a SMPs, enquanto que 18,7% foi a

proporção obtida a 25oC neste reator, sugerindo que a DQO residual de efluentes de

reatores aeróbios operados em climas mais frios seja devida a substrato não

degradado por causa do baixo metabolismo, bem como ao maior acúmulo de SMPs

(maior produção e menor degradação). Para o reator anaeróbio, uma tendência

praticamente constante de conversão da DQO afluente a SMPs (18,1% para

temperatura de 15oC e 18,3% a 25oC) foi observada, uma vez que, mediante

condições adversas, a rota metabólica caminha preferencialmente no sentido de

acúmulo de AGVs.

• No tratamento aeróbio, a elevação da temperatura aumenta a porcentagem de

conversão da biomassa a SMPs, o que pode ser um indício do aumento da

proporção de SMPs-BAP (decaimento endógeno). Já no tratamento anaeróbio, o

inverso é observado, podendo indicar que são as baixas temperaturas que

favorecem a produção de SMPs-BAP.

• A utilização do acetato como substrato, por ser uma molécula mais simples e por

prover menos energia que a molécula de glicose para a população microbiana, pode

ocasionar uma maior produção de SMPs (por exemplo, excretados para

desempenhar alguma função microbiana ou provenientes de lise celular).

• O conteúdo protéico e de carboidratos nas amostras de efluentes são baixos e a

maior parte da DQO residual em todas as fases não podem ser atribuídas a estes

compostos. No reator aeróbio, a DQO relacionada ao teor de proteínas representou

98

de 5 a 34% da DQO residual e o teor de carboidratos (também em termos de DQO)

não ultrapassou 16%. Já para o reator anaeróbio, o teor de proteínas em termos de

DQO atingiu seu máximo na fase I, de TDH igual a 4 dias, representando 17% da

DQO residual. Já para avaliação do teor de carboidratos, nenhuma amostra

analisada advinda deste reator apresentou contribuição de carboidratos para a DQO

residual.

• O baixo conteúdo de proteínas e carboidratos nas amostras foi confirmado pelos

ensaios feitos por MALDI-ToF-MS, cujos resultados não indicaram presença de

macromoléculas compreendidas na faixa de massa molecular de 20.000 a

80.000Da.

• Nas amostras de lise e EPS, praticamente todo o seu conteúdo pode ser

caracterizado como protéico e a concentração de carboidratos foi nula em

praticamente todas as amostras, aparecendo apenas nas amostras de EPS

provenientes do lodo aeróbio na fase IV e do lodo anaeróbio na fase VI, nas baixas

concentrações de 18 e 29 mgDQO/L, respectivamente.

• De modo geral, o conteúdo de carboidratos nas amostras de efluentes foi maior que

em amostras de EPS sugerindo que, nas amostras de efluentes em que apareceram

carboidratos, estes não eram exclusivamente advindos de polímeros extracelulares e

que, como em amostras de lise verificou-se teor de carboidratos nulo, parte destes

carboidratos presentes no efluente poderiam ser talvez advindos de SMPs-UAP.

• De modo geral, as amostras provenientes do reator anaeróbio apresentaram maior

concentração de proteínas e o maior conteúdo protéico é observado nas amostras de

EPS. Contudo, a concentração de proteínas aumentou consideravelmente na fase

VI, empregando-se acetato como substrato a 25oC, especialmente no reator aeróbio,

sugerindo que parte do conteúdo de SMPs na fase VI para o reator aeróbio seria

constituída de proteínas provenientes de polímeros extracelulares.

• Os resultados da espectrometria de massas indicaram que os SMPs produzidos em

cada fase operacional não parecem provenientes de lise celular. Portanto, nos casos

em que SMPs-BAP fossem produzidos, estes produtos teriam sido

degradados/hidrolisados em compostos de menores massas molares.

• Os polímeros extracelulares diferem dos efluentes dos reatores nas fases

operacionais estudadas, sugerindo também que os SMPs produzidos não seriam

provenientes de substâncias poliméricas extracelulares. Em termos químicos, a

99

produção de SMPs advindos de EPS em reatores aeróbios de mistura completa

parecem acontecer mediante condições ambientais/operacionais adversas e, na

medida em que a biomassa vai se adequando a esta nova condição, estes SMPs são

degradados e os SMPs produzidos voltam a ser produtos de natureza química

diferente de polímeros extracelulares.

• Para os efluentes do reator anaeróbio, pela complexidade da bioquímica do

consórcio microbiano presente neste reator, cada condição operacional impõe

características químicas distintas para os produtos microbianos produzidos e estes

não são provenientes de lise celular e nem da extração de polímeros extracelulares.

• A ocorrência predominante de SMPs de baixas massas molares foi verificada na

análise de espectrometria de massas, indicando produtos associados à utilização do

substrato (SMPs-UAP) ou provenientes da degradação e/ou hidrólise de SMPs de

alta massa molar (SMPs-BAP).

• Na tentativa de identificação por espectrometria de massas, a seqüência de relações

m/z obtidas (339/325/311) diferindo apenas por um CH2 e a massa segunda de

183,0133 confirmaram a caracterização química de LAS (alquilbenzeno sulfonados

de cadeia linear). Portanto, os resultados abrem a possibilidade de produção de

LAS por microrganismos anaeróbios. Contudo, isto deve ser avaliado com cautela,

uma vez que LAS são possíveis indicadores de contaminação por detergentes (que

poderiam estar adsorvidos no lodo quando de sua inoculação e que se apresentaram

refratários ao tratamento por serem de difícil degradação anaeróbia) e os

biosurfactantes microbianos relatados na literatura não serem reportados como

LAS.

• A formação de complexos com metais seria uma hipótese forte e promissora diante

das relações m/z obtidas, considerando a produção de metalóforos.

• Como sugestão para trabalhos futuros, uma avaliação de espécies microbianas

presentes nos reatores e a procura dos metalóforos e seus complexos seria uma

abordagem atrativa para a continuação da elucidação acerca da natureza química

dos SMPs.

• Uma vez que os espectros obtidos não foram conclusivos, outra sugestão para

trabalhos futuros é a adoção de outras técnicas de identificação, complementares à

espectrometria de massas, para auxiliarem na identificação química precisa dos

SMPs.

100

7. Referências Bibliográficas

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107

Anexo

Relatório Schimadzu – MALDI-ToF-MS

117

Apêndice

Validação do Método para Análise e Quantificação de AGVs

118

• Validação do método de quantificação de AGVs

Limite de Detecção e de Quantificação

“O limite de detecção (LD) corresponde à menor quantidade de um analito que pode ser

detectada, porém não necessariamente quantificada como um valor exato. Na prática, o LD

é determinado como a menor concentração do analito que pode ser diferenciada do ruído

do sistema com segurança. Um procedimento comum é aceitar como LD a concentração do

analito que produz um sinal três vezes maior que o ruído do sistema” (Lanças, 2004). Para

determinação do LD da mistura de AGVs, foram injetadas amostras-padrão preparadas em

diferentes concentrações. Os relatórios gerados foram programados para especificarem a

relação sinal/ruído da análise. Com base nestes resultados, padrões de concentrações mais

diluídas foram sendo preparados até ser atingido o valor sinal/ruído aproximado de 3.

“O limite de quantificação (LQ) corresponde à menor quantidade de um analito que pode

ser quantificada com exatidão e com uma fidelidade determinada. Na prática, pode também

ser definida em relação ao ruído empregando-se o branco como referência; valores ao

redor de 10s (sendo s o desvio-padrão do sinal gerado empregando-se um branco) são

comumente aceitos” (Lanças, 2004). Portanto, a escolha do LQ pode ser feita como 10

vezes o ruído ou aproximadamente 3 vezes o LD. Para a determinação do LQ da mistura

de AGVs, foram injetadas amostras-padrão preparadas em diferentes concentrações. Os

relatórios gerados foram programados para especificarem a relação sinal/ruído da análise.

Com base nestes resultados, padrões de concentrações mais diluídas foram sendo

preparados até ser atingido o valor sinal/ruído aproximado de 10.

Soluções-padrão da mistura dos principais ácidos orgânicos (fórmico, acético, propiônico,

butírico, isobutírico, valérico e isovalérico) foram preparadas de acordo com as

concentrações de interesse para cada parâmetro a ser validado. Para a determinação dos

Limites de Detecção e de Quantificação, uma solução-padrão estoque de 400mg/L foi

preparada a partir dos ácidos puros e as demais concentrações foram obtidas por diluição.

Para este caso, em especial, foram avaliadas as concentrações de 25, 12,5 e 6,25mg/L.

119

Vale ressaltar que a avaliação de LD e LQ foi feita para a mistura de ácidos, uma vez que

as calibrações das amostras reais seriam feitas sempre com os padrões de mistura. Como o

pico do ácido valérico era sempre o menos intenso, ele foi usado como parâmetro para a

escolha destes limites (por apresentar a pior condição). Portanto, o estabelecimento destes

limites para este ácido garante a detecção e quantificação de todos os demais. Como este

ácido nem apareceu para a concentração de 6,25mg/L e a relação sinal/ruído para o ácido

isovalérico nesta concentração ainda foi inferior a 3 (signal/noise=2,9), o LD foi definido

como 12,5mg/L para a mistura de ácidos. Utilizando-se o critério da relação sinal/ruído=10

para o limite de quantificação, 12,5mg/L seria o LQ para todos os ácidos, exceto para o

ácido valérico, para o qual se adotou LQ=25,0mg/L. A Tabela A.1 mostra os resultados

obtidos para a relação sinal/ruído, de onde se extraíram os LD e LQ.

Tabela A.1 – Resultados da relação sinal/ruído (signal/noise) para a determinação dos

limites de detecção e quantificação da metodologia de análise de AGVs.

Sample Name : PADRAO 6.25mg/L Vial : 1

Acq. Operator : Patricia Inj : 1 Inj Volume : 40 µl

Acq. Method : C:\HPCHEM\CORE\PATRICIA.M

Analysis Method : C:\HPCHEM\CORE\PATRICIA.M

Analise de Acidos Organicos Volateis

RetTime k' Area Height SymmWidth Plates Resolution Signal/Noise

[min] [mAU*s] [mAU] [min]

-------|------|--------------|---------------|-------|-------|----------|-----------|------

14.366 - 18.36525 7.18612e-1 0.67 0.3833 7781 10.71 10.0

15.593 - 12.32450 3.96348e-1 0.76 0.4400 6958 1.75 5.5

18.395 - 12.42247 3.32585e-1 0.63 0.5167 7023 3.44 4.6

20.726 - 25.59664 4.36817e-1 1.49 1.0400 2200 1.76 6.1

22.586 - 7.49855 2.28080e-1 0.89 0.5700 8698 1.36 3.2

26.021 - 9.03175 2.06074e-1 0.70 1.4850 1701 1.96 2.9

Sample Name : PADRAO 12,5mg/L Vial : 21




Analise de Acidos Organicos Volateis

120

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resolution Signal/Noise

[min] [mAU*s] [mAU] [min]

-------|------|--------------|------------|-----|------------|----------|---------|------

14.336 - 38.62683 1.56103 0.68 0.3733 8169 20.12 37.1

15.560 - 22.20067 8.45468e-1 0.68 0.3967 8525 1.87 20.1

18.358 - 24.39956 7.05665e-1 0.66 0.5067 7273 3.64 16.8

20.721 - 49.46189 9.16192e-1 1.02 0.6967 4901 2.31 21.8

22.555 - 33.66142 6.48969e-1 0.73 0.7133 5539 1.53 15.4

25.970 - 20.29851 4.47284e-1 0.78 0.7133 7343 2.81 10.6

31.643 - 22.39542 3.54140e-1 0.72 0.9867 5698 3.92 8.4

Sample Name : PADRAO 25,0mg/L Vial : 14




Analise de Acidos Organicos Voláteis RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resolution Signal/Noise [min] [mAU*s] [mAU] [min] -------|------|--------------|------------|-------|---------|-------|---------------|------ 14.352 - 77.49631 3.09350 0.67 0.3733 8188 4.23 75.5 15.575 - 47.07532 1.71485 0.69 0.4133 7866 1.83 41.9 18.364 - 51.31936 1.42887 0.63 0.5167 6999 3.52 34.9 20.733 - 79.34251 1.68639 0.88 0.6233 6129 2.44 41.2 22.569 - 51.17665 1.13819 0.69 0.6500 6679 1.69 27.8 26.023 - 40.88130 9.12786e-1 0.81 0.7133 7373 2.98 22.3 31.589 - 42.03296 6.99631e-1 0.72 0.9233 6484 4.00 17.1

Faixa dinâmica (Intervalo dinâmico)

“Segundo a IUPAC, a faixa dinâmica tem como limite inferior o limite de quantificação

(LQ)”. O limite superior pode ser obtido removendo-se os pontos superiores até que o

coeficiente de determinação (r2) apresente um valor satisfatório (0,98, por exemplo)

(Lanças, 2004).

121

Para a determinação do intervalo de aplicação, soluções-padrão da mistura de ácidos foram

preparadas em diferentes concentrações, partindo do limite de quantificação. As

concentrações foram 12,5; 25; 50; 100; 200; 400; 700; 1000; 1500 e 2000mg/L.

A Figura A.1 revela que a partir de 1000mg/L, os coeficientes de determinação apresentam

valores muito ruins (em torno de 0,5) e que perde-se completamente a linearidade. A

primeira coluna da Figura A.1 contém os gráficos incluindo os resultados para as

concentrações de 1500 e 2000mg/L. A segunda coluna apresenta os gráficos dos mesmos

compostos, considerando a faixa dinâmica de 25 a 1000mg/L, que foi adotada como válida.

Fórmico y = 1,1904x + 265,73

R2 = 0,5401

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

3500,00

0 500 1000 1500 2000 2500

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Fórmico y = 3,0075x + 13,931

R2 = 0,9993

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

3500,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Acético y = 0,7906x + 160,93

R2 = 0,5408

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

0 500 1000 1500 2000 2500

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Acético y = 1,993x - 5,6701

R2 = 0,9971

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Propiônico y = 0,7474x + 149,34

R2 = 0,5516

0,00200,00400,00600,00800,00

1000,001200,001400,001600,001800,002000,00

0 500 1000 1500 2000 2500

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Propiônico y = 1,8586x - 4,5998

R2 = 0,9964

0,00200,00400,00600,00800,00

1000,001200,001400,001600,001800,002000,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

(a)

(b)

(c)

122

Isobutírico y = 0,9506x + 202,03

R2 = 0,5503

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

0 500 1000 1500 2000 2500

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Isobutírico y = 2,369x + 5,622

R2 = 0,9976

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Butírico y = 0,7317x + 143,59

R2 = 0,5536

0,00200,00400,00600,00800,00

1000,001200,001400,001600,001800,002000,00

0 500 1000 1500 2000 2500

Conc. (mg/L)

Ingt

ensi

dade

Pic

o

Butírico y = 1,8147x - 6,4771

R2 = 0,996

0,00200,00400,00600,00800,00

1000,001200,001400,001600,001800,002000,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc. (mg/L)In

gten

sida

de P

ico

Isovalérico y = 0,754x + 142,83

R2 = 0,5609

0,00200,00400,00600,00800,00

1000,001200,001400,001600,001800,002000,00

0 500 1000 1500 2000 2500

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Isovalérico y = 1,8536x - 9,4916

R2 = 0,9958

0,00200,00400,00600,00800,00

1000,001200,001400,001600,001800,002000,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Valérico y = 0,6148x + 153,93

R2 = 0,5287

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

0 500 1000 1500 2000 2500

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Valérico y = 1,6039x - 9,3208

R2 = 0,9949

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Figura A.1 – Ajustes para a determinação da faixa de aplicação para os AGVs (a) fórmico;

(b) acético; (c) propiônico; (d) isobutírico; (e) butírico; (f) isovalérico; (g) valérico.

Linearidade

“A linearidade é a resposta obtida em função da concentração do analito, a qual deve ser

estudada em um intervalo de concentração apropriado. Na prática, a linearidade é

determinada por intermédio de gráficos de calibração, seguidos de um tratamento

(d)

(e)

(f)

(g)

123

estatístico, o qual deve envolver, no mínimo, a equação da função, a análise da regressão e

os dados de correlação” (Lanças, 2004).

Os dados para a determinação da linearidade foram obtidos a partir das mesmas amostras

injetadas para determinar a precisão, em sete replicatas por concentração. As

concentrações foram de 12,5; 25; 50; 100; 200 e 400mg/L da mistura de ácidos, atendendo

à demanda mínima recomendada de 5 pontos para a curva analítica. As respostas obtidas

foram plotadas em função da concentração dos padrões, conforme mostram as Figuras A.2,

A.3, A.4, A.5, A.6, A.7 e A.8. Em seguida, foi feita análise de regressão por mínimos

quadrados e as equações das retas foram registradas em cada gráfico. A correlação foi

obtida por meio do coeficiente de determinação r2. Registrou-se, pois, a linearidade do

método para a faixa de concentração comumente usada (de 12,5 a 400mg/L).

Fórmico y = 3,0334x + 11,163R2 = 0,9986

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Figura A.2 – Linearidade e análise de regressão para o ácido fórmico.

124

Acético y = 1,8928x + 4,9011R2 = 0,9974

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

900,00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Figura A.3 – Linearidade e análise de regressão para o ácido acético.

Propiônico y = 1,7584x + 5,9292R2 = 0,9967

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Figura A.4 – Linearidade e análise de regressão para o ácido propiônico.

125

Isobutírico y = 2,2968x + 13,187R2 = 0,9958

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Figura A.5 – Linearidade e análise de regressão para o ácido isobutírico.

Butíricoy = 1,717x + 3,865

R2 = 0,9952

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Conc. (mg/L)

Ingt

ensi

dade

Pic

o

Figura A.6 – Linearidade e análise de regressão para o ácido butírico.

126

Isovalérico y = 1,7675x - 0,2247R2 = 0,9934

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

900,00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Figura A.7 – Linearidade e análise de regressão para o ácido isovalérico.

Valéricoy = 1,4942x + 4,2345

R2 = 0,9962

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Conc. (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Figura A.8 – Linearidade e análise de regressão para o ácido valérico.

Precisão (Repetibilidade)

A avaliação da precisão do método foi obtida com base na repetibilidade. “A repetibilidade

expressa a fidelidade obtida nas mesmas condições operacionais (mesmo analista, mesmo

equipamento, etc) aplicadas em um curto intervalo de tempo. A repetibilidade da área de

um pico cromatográfico é importante por ser o parâmetro utilizado na quantificação do

composto de interesse” (Lanças, 2004).

127

Soluções-padrão foram preparadas pelo mesmo analista para a concentração de 200mg/L

(concentração intermediária da curva analítica), em sete replicatas e foram analisadas

cromatograficamente, em seqüência, no mesmo equipamento, com o mesmo eluente e

usando as mesmas condições operacionais. As médias e os desvios-padrão foram obtidos

com vistas a se determinar a precisão a partir do coeficiente de variação (CV), conforme a

Equação A.1:

CV = DP/CMP x 100

(Eq. A.1)

onde:

DP = desvio padrão;

CMD = concentração média determinada

Os valores de precisão obtidos com o cálculo de CV estão expressos na Tabela A.2 e

foram confirmados pelo software Validate®, da Croma. Valores de CV de até 20% são

aceitos pelo INMETRO (2003); portanto, pode-se afirmar que o método é preciso.

Tabela A.2 – Dados de áreas de picos para a concentração de 200mg/L da mistura de

AGVs para a avaliação da precisão do método. Concentração

(mg/L) Fórmico Acético Propiônico Isobutírico Butírico Isovalérico Valérico

200 617,16 378,12 354,19 452,32 329,18 341,08 302,07 200 618,82 378,76 351,56 451,13 329,56 343,06 295,57 200 613,37 375,59 350,74 452,72 329,27 337,11 298,21 200 625,80 385,51 355,81 456,45 331,33 352,65 299,77 200 616,94 374,00 349,25 453,76 331,00 343,26 297,11 200 627,55 389,95 358,84 461,63 339,23 351,47 305,69 200 626,00 379,56 354,52 455,96 331,36 347,98 294,32 DP 5,55 5,62 3,29 3,55 3,51 5,68 3,93

MEDIA 620,81 380,21 353,56 454,85 331,56 345,23 298,96 CV 0,89% 1,48% 0,93% 0,78% 1,06% 1,64% 1,31%

Sensibilidade

“A sensibilidade de um método indica sua capacidade de discriminar, com uma fidelidade

estabelecida, concentrações próximas de um analito. A sensibilidade pode ser determinada

128

por intermédio da inclinação do gráfico de calibração.” Quanto maior o coeficiente

angular, mais sensível é o método (Lanças, 2004).

Para cada curva analítica construída (Figuras A.2 a A.8) foi avaliado o coeficiente angular

obtido a partir da análise regressão. Desta forma, foi possível comparar a sensibilidade do

método para cada ácido orgânico. A Tabela A.3 sistematiza a informação dos coeficientes

angulares, em ordem crescente. Portanto, o método empregado é mais sensível para o ácido

fórmico e bem menos sensível para o ácido valérico.

Tabela A.3 – Valores dos coeficientes angulares, em ordem crescente, para os AGVs,

revelando a sensibilidade de cada ácido.

Ácido Coeficiente angular

Valérico 1,49

Butírico 1,72

Propiônico 1,76

Isovalérico 1,77

Acético 1,89

Isobutírico 2,30

Fórmico 3,03

Seletividade

“A seletividade de um método instrumental de separação é a capacidade de avaliar, de

forma inequívoca, as substâncias em exame na presença de componentes que podem

interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. O método de adição padrão

também pode ser aplicado para os estudos de seletividade, porém este método é utilizado

quando não é possível obter a matriz isenta da substância de interesse.” (Ribani et al.,

2004).

Este método foi o escolhido para avaliação da seletividade, uma vez que é praticamente

impossível obter a matriz dos efluentes anaeróbios isenta dos ácidos orgânicos. Foi feita

uma curva analítica com a adição dos padrões da mistura de ácidos em diferentes

129

concentrações em amostras reais de efluente anaeróbio. Esta curva foi comparada à curva

analítica obtida para os padrões isentos da matriz. Comparam-se, pois, as duas curvas e,

caso elas sejam paralelas, pode-se dizer que o método é seletivo (não há interferência da

matriz na determinação da substância de interesse). Portanto, avaliando-se as Figuras A.9 a

A.15, o método parece satisfatoriamente seletivo para todos os ácidos, à exceção do ácido

isobutírico, em que o efeito da matriz parece mais pronunciado (ajustes não paralelos,

coeficientes angulares distintos na presença e na ausência da matriz – 0,6849 versus

0,7934, respectivamente).

Fórmico

y = 0,8643x - 0,6317R2 = 0,9982

y = 0,8868x + 4,0703R2 = 0,9981

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

900,00

1000,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico

Na matrizIsento matrizLinear (Na matriz)Linear (Isento matriz)

Figura A.9 – Seletividade e análise de regressão para o ácido fórmico.

Acético

y = 0,5598x + 167,61R2 = 0,9959

y = 0,5761x - 1,3648R2 = 0,9979

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico


Figura A.10 – Seletividade e análise de regressão para o ácido acético.

130

Propiônico

y = 0,5397x + 52,09R2 = 0,9976

y = 0,5482x - 1,9341R2 = 0,9962

0

100

200

300

400

500

600

700

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico


Figura A.11 – Seletividade e análise de regressão para o ácido propiônico.

Isobutírico

y = 0,6849x + 11,694R2 = 0,9957

y = 0,7934x - 5,1676R2 = 0,9929

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico


Figura A.12 – Seletividade e análise de regressão para o ácido isobutírico.

131

Butírico

y = 0,5377x + 5,0782R2 = 0,9959

y = 0,5607x - 0,2143R2 = 0,9934

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico


Figura A.13 – Seletividade e análise de regressão para o ácido butírico.

Isovalérico

y = 0,5388x + 5,8619R2 = 0,9973

y = 0,5139x + 2,0911R2 = 0,9794

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico


Figura A.14 – Seletividade e análise de regressão para o ácido isovalérico.

132

Valérico

y = 0,4713x + 5,4296R2 = 0,9953

y = 0,4812x + 2,6474R2 = 0,9849

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Conc (mg/L)

Inte

nsid

ade

Pico


Figura A.15 – Seletividade e análise de regressão para o ácido valérico.

Exatidão (Fortificação)

A exatidão “representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados

em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. Os processos

mais utilizados para avaliar a exatidão de um método são: materiais de referência,

comparação de métodos, ensaios de recuperação, adição padrão. Este último método é

usado quando for difícil ou impossível preparar um branco da matriz sem a substância de

interesse” (Ribani et al., 2004). Este foi o caso adotado para avaliação da exatidão neste

estudo, uma vez que é praticamente impossível obter a matriz dos efluentes anaeróbios

isenta dos ácidos orgânicos.

Foram preparadas soluções-padrão de 100, 200, 500 e 1000mg/L da mistura de ácidos

(fórmico, acético, propiônico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico). Amostras de

efluentes anaeróbios foram coletadas e fortificadas em 50% com adição dos padrões. Para

cada concentração adotada, três ensaios foram conduzidos (ensaios em triplicata), de modo

que, ao final, 12 amostras foram obtidas. Em seguida, todos os procedimentos adotados

para a preparação da amostra anteriores ao encaminhamento à análise cromatográfica

133

foram seguidos: centrifugação, filtração do sobrenadante através de membranas de 0,45µm

e alocação em vials. As amostras foram injetadas para análise cromatográfica.

Para o cálculo da exatidão, duas informações são necessárias: o valor real (aquele tido

como verdadeiro; neste caso, corresponde à concentração do padrão preparado para a

fortificação da matriz) e o valor obtido (que é aquela concentração obtida pela curva

analítica a partir da resposta intensidade do pico). Contudo, após a obtenção das respostas,

foi necessário determinar a concentração de cada ácido na matriz original, uma vez que

esta não era isenta dos analitos. Para tal, foi feita uma curva analítica com adição de padrão

nas concentrações de 25, 50, 100, 200, 500 e 1000mg/L, ensaios em triplicata. Por meio da

extrapolação da curva, a intercessão com o eixo x proveu a informação, anteriormente

desconhecida, quanto à concentração de cada ácido presente na matriz original (Ribani et

al., 2004). Este valor foi deduzido da concentração total, proveniente de uma curva

analítica dos padrões isentos da matriz (calibração externa) usando as respostas da matriz

fortificada e a diferença foi utilizada como valor obtido. Segundo Lanças (2004), a

exatidão pode ser determinada pela expressão dada na Equação A.2:

Exatidão = [1-(Vr-Vd)/Vr] x 100

(Eq. A.2)

Onde:

Vr = valor real, aquele tido como verdadeiro

Vd = valor desejado, ou obtido pela curva analítica

A média da triplicata dos valores obtidos e dos verdadeiros foram inseridos no software

Validate®, da Croma, para o cálculo da exatidão do método. As Figuras A.16 a A.22

mostram os relatórios gerados pelo software, com os resultados de exatidão. O método se

mostra exato para todos os ácidos, uma vez que a porcentagem média de exatidão obtida

ficou compreendida entre 85 e 104% (segundo Lanças (2004), a faixa média aceitável para

avaliação de exatidão por ensaios de recuperação, por exemplo, fica entre 70 e 120%).

134

Figura A.16 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido fórmico.

Figura A.17 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido acético.

135


propiônico.


isobutírico.

136

Figura A.20 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido butírico.

Figura A.21– Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido

isovalérico.

137

Figura A.22 – Resultado da exatidão do método de análise de AGVs para o ácido valérico.

Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação … · Gustavo, ao Davi e ao Aniel,...

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