UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós...

71
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Tese Prospecção de leveduras não-Saccharomyces com potencial enológico oriundas de uvas finas da Região da Campanha do Estado do Rio Grande do Sul Suziane Antes Jacobs Pelotas, 2015

Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Tese

Prospecção de leveduras não-Saccharomyces com

potencial enológico oriundas de uvas finas da

Região da Campanha do Estado do Rio Grande do

Sul

Suziane Antes Jacobs

Pelotas, 2015

Suziane Antes Jacobs

Prospecção de leveduras não-Saccharomyces com potencial enológico

oriundas de uvas finas da Região da Campanha do Estado do Rio Grande do

Sul

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do Conhecimento: Biotecnologia).

Orientador: César Valmor Rombaldi

Coorientador: Fernando Zocche

Pelotas, 2015

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Vitor Manfroi (UFRGS/ICTA)

Prof. Dr. Luciano Manfroi (IFRS – Campus Bento Gonçalves)

Prof. Dr. Rosane da Silva Rodrigues (UFPel/CCQFA)

Prof. Dr. César Valmor Rombaldi (Orientador, UFPel/DCTA)

Aos meus pais, Roque e Rosani,

Irmãos Márcio e Marco,

Pelo apoio e incentivo,

Ofereço

Ao meu marido Bruno, pelo amor, incentivo e compreensão e

ao meu filho Mathias, o melhor de mim,

Dedico

Agradecimentos

À Coordenação do Curso de Pós Graduação em Biotecnologia, da Universidade

Federal de Pelotas, e aos seus professores pelos ensinamentos ministrados.

À todos os professores do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da

UFPel, pelo auxílio.

Ao professor Dr. César Valmor Rombaldi que desde meu mestrado vem sabiamente

guiando meus trabalhos de pesquisa, tendo seus ensinamentos e encorajamento

constantes sido fundamentais para minha formação acadêmica e científica, o meu

sincero agradecimento.

Ao professor, colega e amigo Fernando Zocche, que como co-orientador sempre

orientou, auxiliou e esteve presente em todas as etapas do trabalho.

Às colegas e amigos que contribuíram muito para execução deste trabalho, Renata

G. S. Zocche e Gabriela H. Pötter, companheiras de sala de aula, de laboratório e de

pesquisa, pelo auxílio constante.

À Embrapa Clima Temperado e ao Dr. Rufino Fernando Flores Cantillano, pelo

auxílio no início do doutorado.

Aos viticultores do município de Dom Pedrito-RS, por toda a colaboração na

cedência das uvas e amostras para o estudo;

Aos colegas da Unipampa Anelise Martins, Daniele Nascimento, Cíntia Saydelles da

Rosa e Lourdes Hirschmann e Daniel Eckhardt e aos alunos Lucas Martins Simões,

Tiago Stein e Pedro Pohlmann Giriboni, pelo auxilio neste trabalho.

Aos colegas e amigos, Gisele Crizel, Aline Tiecher, Joseana Severo.

Aos amigos e amigas que incentivaram o trabalho e me apoiaram em momentos

difíceis. Não vou tentar citar todos para não cometer nenhum esquecimento.

À meus pais e meus irmãos, que me apoiaram sempre nesta jornada, dando forças

para ir sempre em frente.

À minha sogra Nair, meus cunhados Diogo e Daniel, minhas cunhadas Adriane e

Renata, pelo apoio e amizade.

À meu marido Bruno e meu filho Mathias, pelo amor incondicional e compreensão e

apoio nos momentos mais difíceis.

Agradeço a todos que estiveram ao meu lado e me ajudaram de alguma forma.

E sobretudo a Deus, pela força que me move.

"A mente que se abre a uma nova ideia nunca mais volta ao seu tamanho original"

(Albert Einstein)

Resumo

JACOBS, Suziane A. Prospecção de leveduras não-Saccharomyces com potencial enológico oriundas de uvas finas da Região da Campanha do Estado do Rio Grande do Sul. 2015. 75f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. A prospecção de leveduras autóctones é relevante para a produção de vinhos com sinais distintivos. Embora seja amplamente reconhecido que o crescimento de leveduras não-Saccharomyces (NS) pode afetar positivamente a complexidade de sabor e aroma durante a fermentação do vinho com Saccharomyces cerevisiae, a incapacidade de controlar os processos de co-fermentação espontânea por leveduras NS inviabiliza o seu uso na produção de vinho. Neste estudo, selecionamos três leveduras NS de isolados autóctones da região da Campanha do Rio Grande do Sul-Brasil, e estudou-se o comportamento em processos fermentativos em mosto sulfitado e suco pasteurizado de uva. As três cepas estudadas, isoladas a partir de uvas Cabernet Sauvignon, Merlot e Cabernet Sauvignon cultivada em sistema orgânico, apresentaram 99% de identidade com a espécie Lachancea thermotolerans, 98% com o gênero Hanseniaspora uvarum e 97% de identidade com a espécie Metschnikowia pulcherrima, respectivamente. O comportamento das cepas foi distinto quando comparadas as microvinificações em suco pasteurizado e mosto sulfitado principalmente na produção de álcool durante a fermentação devido, provavelmente, ao desenvolvimento posterior de leveduras do gênero Saccharomyces. Variáveis como índice de polifenóis totais, antocianinas totais e tonalidade de cor também foram influenciadas pela ação das leveduras. Palavras-chave: Enologia, Vinho, Leveduras autóctones.

Abstract

JACOBS, Suziane A. Non-Saccharomyces yeast prospection with oenological potential derived from fine grapes of the Campanha Region of Rio Grande do Sul State. 2015. 75f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. The prospect of indigenous yeast is relevant to the production of wines with distinctive features. Although it is widely recognized that the growth of non-Saccharomyces yeasts (NS) can positively affect the complexity the flavor and volatile compounds of the wine during fermentation with Saccharomyces cerevisiae, but the inability to control the spontaneous co-fermentation processes NS yeast prevents their use in the winemaking. In this study, we selected three yeast (among 39 isolates) NS indigenous isolated from the Campanha region of Rio Grande do Sul, Brazil, and studied the behavior in fermentation processes in sulphited must and pasteurized grape juice. Studied three strains isolated from Cabernet Sauvignon, Cabernet Sauvignon and Merlot in organic system, showed 99% identity with the Lachancea thermotolerans species, with 98% genus Hanseniaspora uvarum and 97% identity to the Metschnikowia pulcherrima species, respectively. The behavior of the strains was different when compared to microvinifications in pasteurized juice and sulphited must mainly in the production of alcohol during fermentation, probably due to the further development of Saccharomyces yeasts. Variables such as index of total polyphenols, anthocyanins and color tone were also influenced by the action of yeast. Keywords: Oenology, wine, autochthonous yeasts.

Lista de Tabelas

Tabela 1. Características morfológicas de cepas autóctones isoladas a partir de 3 cv. de Vitis vinífera cultivadas na região da Campanha do Rio Grande do Sul.. 31 Tabela 2. Caracterização tecnológica de cepas autóctones isoladas a partir de 3 vinhedos localizados na região da Campanha do Rio Grande do Sul................ 32 Tabela 3. Identificação das cepas autóctones isoladas a partir de 3 vinhedos localizados na região da Campanha do Rio Grande do Sul................................... 34 Tabela 4. Características físico-químicas de vinhos obtidos através de fermentação em mosto sulfitado com levedura comercial e leveduras nativas...... 35 Tabela 5. Características físico-químicas de vinhos obtidos através de fermentação em suco pasteurizado com levedura comercial e leveduras nativas. 36

Lista de Figuras

Figura 1. Regiões vitivinícolas do Rio Grande do Sul, com destaque para a região da Campanha............................................................................................ 21

Lista de Abreviaturas

% - por cento

l - microlitro

DNA - ácido desoxiribonucleico

et al. - e colaboradores

ºBrix - gramas por cento de sólidos totais

ºC - grau Celsius

v/v - volume por volume

PCR - reação em cadeia da polimerase

pH - potencial hidrogeniônico

SC - Saccharomyces cerevisiae

NS - não-Saccharomyces

m - metro

mm - milímetro

ha - hectare

t/ha - toneladas por hectare

m - micrometro

SO2 - Dióxido de enxofre

rDNA - DNA ribossomal

Kg - quilograma

mL - mililitro

h - horas

mg mL-1 - miligramas por mililitros

meq L-1 - miliequivalente-grama por litro

mg Kg-1 - miligramas por quilogramas

UFC mL-1 - unidades formadoras de colônias por mililitro

cv. - cultivar

H2S - Ácido sulfídrico/Sulfeto de hidrogênio

CV - coeficiente de variação

g mL-1 - gramas por mililitro

RS – Estado do Rio Grande do Sul

Sumário

1 INTRODUÇÃO GERAL .......................................................................................... 14

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 16

2.1 A vitivinicultura no Brasil...................................................................................... 16

2.2 A vitivinicultura na Campanha do Rio Grande do Sul .......................................... 19

2.3 As Leveduras e o processo de vinificação .......................................................... 21

2.3.2 Saccharomyces cerevisiae ........................................................................ 21

2.3.3 Leveduras não-Saccharomyces ................................................................ 22

2.4 Técnicas moleculares empregadas na caracterização de linhagens de

leveduras... ................................................................................................................ 23

2.4.1 Sequenciamento do DNA ribossomal ........................................................ 23

2.4.2 Análise de restrição do DNA ribossomal .................................................... 24

2.4.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR), Eletroforese de gradiente em gel

desnaturante (DGCE) ......................................................................................... 24

3 HIPÓTESE E OBJETIVOS ..................................................................................... 25

3.1 Hipótese .............................................................................................................. 25

3.2 Objetivo Geral ..................................................................................................... 25

3.3 Objetivos Específicos .......................................................................................... 25

4 CAPÍTULOS ....................................................................................................... 26

4.1 CAPÍTULO 1 – Relatório de Atividades ........................................................ 26

4.1.1 Material e Métodos ................................................................................ 26

4.2.2 Resultados ............................................................................................. 30

4.2.3 Discussão .............................................................................................. 35

4.2 CAPÍTULO 2 – Microbiological characterization of grapes in the Campanha

Region of Rio Grande do Sul, Brazil reveals non-Saccharomyces autochthonous

yeasts with oenological potential. .............................................................................. 39

5 DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS ............................................................ 60

6 CONCLUSÃO GERAL............................................................................................ 61

7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 62

7 ANEXOS ................................................................................................................ 68

Anexo A – Resumos aprovados para apresentação e publicação nos anais do XV

Congresso Latino-Americano de Viticultura e Enologia ............................................ 68

Anexo B – Arquivo de submissão do artigo “ Prospecção microbiológica na região da

Campanha do Rio Grande do Sul-Brasil revela leveduras autóctones não-

Saccharomyces com potencial enológico”, à revista International Journal Food

Microbiology. ............................................................................................................. 69

Anexo C – Sequências nucleotídicas genômicas e respectivos alinhamentos para a

geração dos percentuais de identidade entre as espécies. ....................................... 70

14

1 INTRODUÇÃO GERAL

As leveduras empregadas na fermentação alcoólica são interferentes

importantes na enologia, por afetarem a concentração de álcool, a cor, o sabor, o

aroma e a estrutura do vinho (Fleet, 2003; Álvarez-Pérez et al., 2012; Holt et al.,

2013; Liang et al., 2013; Loira et al., 2013). No âmbito geral da enologia, as

leveduras mais importantes no processo de fermentação do mosto da uva em vinho

estão classificadas em dois grupos principais: i) espécies não-Saccharomyces, que

se desenvolvem nos primeiros estágios da fermentação, dificilmente completando

fermentações com elevadas concentrações de álcool; e, ii) cepas de

Saccharomyces, que se tornam dominantes conforme aumenta a concentração de

etanol (Suárez Lepe E Iñigo Leal, 2004; Barata et al., 2012; Tristezza et al., 2013).

Na atualidade, há ampla oferta de leveduras selecionadas para uso

enológico, desde as que realizam fermentações alcoólicas ortodoxas, sem grande

interferência nas demais propriedades do vinho, até aquelas mais utilizadas para

realçar aromas (Molina et al., 2009; Callejon et al. 2010). No entanto, os avanços

conceituais em enologia, com a busca de produtos com sinais distintivos, como a

vinificação valorizando leveduras autóctones, é uma alternativa que vem sendo

buscada e validada em vários países (Chavan et al., 2009; Capece et al, 2012;

Scacco et al, 2012; Settani et al., 2012; Liang et al, 2013; Synos et al., 2015). Isso se

deve ao fato de que, quando leveduras autóctones são isoladas e têm potencial

enológico, elas podem conferir ao produto final características únicas no que se

refere à qualidade do vinho (Domizio et al., 2007; Moreira et al., 2011; Holt et al.,

2013; Liang et al., 2013). Exemplo disso é o trabalho de Settani et al. (2012), que

isolaram três cepas autóctones com aptidão tecnológica para elaboração de vinhos

quando avaliaram 51 cepas de S. cerevisiae do bioma local (Sicília, Itália). De modo

similar, Scacco et al. (2013) estudaram cepas de leveduras autóctones capazes de

produzir maiores concentrações de compostos responsáveis pelas notas frutadas

de pêra, que confere aroma característico aos vinhos da Sicília.

Além disso, nos últimos anos, aumentou o interesse na fermentação mista

utilizando leveduras vínicas de Saccharomyces e não-Saccharomyces com o intuito

de melhorar a qualidade e a complexidade dos vinhos. Gobbi et al. (2013)

demonstraram que a fermentação simultânea utilizando Lachancea (Kluyveromyces)

thermotolerans e Saccharomyces cerevisiae permitiu aumentos significativos nas

notas picantes (pimenta, hortelã, canela e anis) do vinho. Em estudo semelhante

15

sobre as interações entre S. cerevisiae e leveduras não-Saccharomyces, Sadoudi et

al. (2012) revelaram que uma via metabólica aromática inteira pode ser alterada de

acordo com o tipo de levedura empregada durante a vinificação.

No Brasil, uma das principais regiões para a produção de vinhos finos é a

Campanha, participante do Pampa Gaúcho (Latitude 30° S, Longitude 54° W;

altitude de 100-300m). A região se caracteriza por ter solo arenoso, com boa

drenagem, clima temperado com verões quentes e secos, pluviosidade média anual

de 1.370 mm, amplitude térmica média no verão de 17 ºC, e radiação total média de

2.372h (INMET, 2015). Os vinhos oriundos dessa região têm tido destaque no

cenário nacional e internacional, no entanto, há necessidade de investir-se na

elaboração de produtos com características únicas. A prospecção de leveduras com

potencial enológico na Região do Pampa Gaúcho entra nesse cenário como um

elemento inovador, para serem utilizadas individualmente ou em associação com

outras leveduras, agregando valor ao vinho. Nesse sentido, o objetivo desse estudo

foi prospectar leveduras isoladas a partir de uvas finas da Região da Campanha do

Rio Grande do Sul e avaliar o potencial enológico desses microrganismos. Um

possível sucesso nessa etapa contribuirá para outra iniciativa paralela, que é a

produção orgânica de uvas finas na região, o que potencializará, ainda mais, a

sobreposição de sinais distintivos (produção orgânica e uso de leveduras

autóctones).

16

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 A vitivinicultura no Brasil

Baseando-se nos cadastros vitivinícolas, até 1950 a vitivinicultura comercial

brasileira estava restrita aos três Estados do Sul do Brasil e algumas regiões do

Leste de São Paulo e Sul de Minas Gerais. A partir daí, houve uma grande

ampliação da fronteira vitícola, com o plantio de uvas no Vale do Submédio São

Francisco, seguindo-se as regiões Norte do Paraná, Noroeste de São Paulo e Norte

de Minas Gerais. Nas regiões tradicionais, os sistemas de produção foram sendo

modificados ao longo dos anos, em função das oportunidades e exigências do

mercado. A pesquisa deu suporte ao empreendedorismo do viticultor brasileiro,

aportando tecnologias, sem as quais não seria possível atingir o atual nível de

desenvolvimento do setor. Como exemplos, podem ser citadas a seleção de clones

e novas cultivares adaptadas às diferentes regiões, a definição de diferentes

tecnologias de manejo, especialmente para as regiões tropicais e subtropicais, e a

certificação de produtos vitivinícolas, como produção integrada, indicações

geográficas e produção orgânica (Camargo et al., 2011).

A vitivinicultura brasileira está passando por uma transformação. É uma

atividade importante para a sustentabilidade da pequena propriedade no Brasil e tem

se tornado também importante no desenvolvimento de algumas regiões, na geração

de emprego em grandes empreendimentos. Na principal região produtora de uvas

no Brasil, a Serra Gaúcha, a vitivinicultura está fortemente ligada à tradição e ao

turismo. Nos últimos anos, com a popularizada crise econômica mundial, associada

ao ingresso de outros países no mercado, dificultou as exportações de uvas de

mesa do Vale do São Francisco, e ampliou a oferta de vinhos no mercado

internacional, incluso o Brasil, pelo aumento do poder aquisitivo dos brasileiros, o

que facilitou o ingresso de vinhos importados no país (Mello, 2013). O fato é que a

vitivinicultura brasileira é fortemente ameaçada por aquela desenvolvida nos países

vizinhos, como Uruguai, Argentina e Chile, além do input de vinhos europeus. Isso é

consequência da escala de produção adotada nesses países, decorrente das

condições edafoclimáticas favoráveis, dos menores custos de insumos, e,

sobretudo, do “prestígio” e do marketing consolidado desenvolvido por esses países.

Nesse último aspecto, os países de relevância na vitivinicultura evoluíram

significativamente na valorização de sinais distintivos, como as indicações

17

geográficas, as denominações de origem, a produção orgânica, a produção

integrada, a produção biodinâmica, a produção e comércio equitativo, dentre outros.

Além disso, procuraram incorporar conceitos importantes na perspectiva de cadeia

produtiva sustentável, também sob o aspecto cultural e biológico, inserindo valores e

riquezas biológicas da região de produção (relação das famílias produtoras com o

consumidor, envolvimento do setor com o desenvolvimento local, valorização do

bioma e da tradição, uso e valorização de recursos locais, como insumos e

leveduras) (Bengtsson et al., 2005; Saint-Ges e Bélis-Bergouignan, 2009; Gennari,

2014).

É nesse cenário que a região da Campanha vem atuando. Embora esteja

seguindo um perfil de empreendimento mais empresarial do que da agricultura

familiar, as ações vêm para valorizar e incorporar os valores regionais, amplamente

referenciados na história regional, pela produção pecuária, no bioma pampa. A

produção vitícola da região é pautada 100% em cultivares Vitis vinifera, visando a

elaboração de vinhos finos, tintos, brancos e roses, e espumantes. A definição exata

da aptidão de cada cultivar e clone ainda não está estabelecida, mas já há

apontamentos claros para cultivares e clones potenciais, como é o caso de Cabernet

Sauvignon R5/SO4, Tannat A717, Merlot B347, Pinot Noir 668, Chardonnay e

Gewurztraminner. Além disso, a região se caracteriza por ter boa ventilação,

amplitude térmica no período de maturação da uva e, na maioria dos anos, boa

insolação e baixa pluviosidade, o que permite produzir uvas com melhor maturação

do que a maioria das outras regiões brasileiras, além de permitir a produção com

menor aporte de insumos, principalmente fungicidas (Daudt et al, 1973; Rathmann et

al., 2008; Tonietto et al., 2012). Esses atributos deverão constituir diferenciais

positivos na promoção dos vinhos da região.

As exigências do mercado por produtos de qualidade comprovada, oriundos

de processos produtivos que valorizam a origem dos produtos, bem como o

comprometimento com a segurança do vinho e com a proteção ambiental, são cada

vez maiores, tornando indispensável a adoção de sistemas de certificação da

produção para competir em mercados mais exigentes. O setor vitivinícola brasileiro

avançou significativamente nos últimos anos através da produção integrada de uvas

finas de mesa, da definição das primeiras indicações geográficas para a produção

de vinhos finos e da produção orgânica de uva, vinho e suco de uva (Camargo et al.,

2011).

18

De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), houve,

em 2012, redução de 0,52% na produção de uvas no Brasil, em relação ao ano de

2011. A maior redução da produção ocorreu no Estado do Paraná (-32,86%). Nos

Estados de Pernambuco, Minas Gerais, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, houve

aumento de produção de uvas de 7,71%, 3,09%, 4,64% e 1,29%, respectivamente,

em relação ao ano de 2011. A produção de uvas destinadas ao processamento foi

de 830,92 milhões de quilos, representando 57,07% da produção nacional, sendo o

restante (42,93%) destinado ao consumo in natura. No Estado maior produtor de

uvas do Brasil, Rio Grande do Sul, ocorreu aumento da área plantada de apenas

1%, em 2012. Em Pernambuco, a área plantada com videiras sofreu redução de

2,15% e na Bahia, a redução foi de 5% em 2012. Em 2014, observou-se um

aumento de 1,64% na produção nacional de uvas, sendo os principais responsáveis

por este aumento os estados da Bahia e Santa Catarina com um aumento de

46,77% e 24,37%, respectivamente (Mello, 2015).

A produção de vinhos, sucos e derivados do Rio Grande do Sul, em 2012, foi

de 579,31 milhões de litros, 0,09% superior à quantidade produzida em 2011, sendo

o maior acréscimo na produção de suco de uva concentrado e no mosto de uva

(mosto simples). Para os vinhos finos houve um aumento de 4,6% e redução na

produção de vinhos de mesa em 17,48%. Em Santa Catarina foram produzidos

21,18 milhões de litros de vinhos e derivados da uva e do vinho em 2012, sendo

72,57% vinhos de mesa. A produção de vinhos de mesa apresentou aumento de

11,77% e redução de 19,14% na produção de vinhos finos (Mello, 2013). Em 2014, o

Rio Grande do Sul apresentou uma redução na produção de vinhos finos (12,71%) e

vinhos de mesa (0,37%) (Mello, 2015).

O Rio Grande do Sul (RS), em 2012, apresentou redução na comercialização

de suco e vinhos, em relação ao ano anterior, de 3,61%. Os vinhos de mesa tiveram

redução de 10,13%, enquanto os vinhos finos apresentaram aumento de 12,53%.

Esse aumento decorreu do aumento das exportações, devido ao Programa de

Escoamento da Produção do governo federal (PEP). Os vinhos espumantes, em

2012, continuaram sua trajetória crescente. Os espumantes moscatéis obtiveram

aumento de 20,49%, e os espumantes apresentaram crescimento de 9,41% nas

vendas. O aumento crescente dos espumantes nos últimos anos, aliado à trajetória

descendente dos vinhos finos nacionais, mostra que em apenas cinco anos a

proporção de vinhos finos em relação aos vinhos espumantes passou de 2,43 para

19

1,51, ou seja, enquanto em 2008 para cada garrafa de espumante (inclusive

moscatéis) nacional vendida eram comercializadas 2,43 garrafas de vinhos finos, em

2012 essa relação foi de uma garrafa de espumante para 1,51 garrafa de vinho fino

(Mello, 2013). Um estudo mostrou que, entre os anos de 2004 e 2014, houve um

decréscimo na elaboração de vinhos no estado do Rio Grande do Sul, sendo

10,47% para vinhos finos e 37,49% para vinhos comuns (IBRAVIN, 2015).

No primeiro semestre de 2013, o mercado interno brasileiro registrou um

pequeno incremento de 2,54% na comercialização de vinhos finos, de mesa e

espumantes, totalizando 107,9 milhões de litros. Este resultado diz respeito à

comparação ao mesmo período do ano anterior, quando foram comercializados

105,2 milhões de litros. Para o setor vitivinícola brasileiro, este desempenho reflete

uma estagnação nas vendas, com índices tímidos de alta no vinho de mesa, de

3,21%, com quase o mesmo percentual de retração no vinho fino, -3,10%, e um

pequeno recuo nos espumantes, de -1,97% (IBRAVIN, 2015).

Em 2014, o setor vitivinícola apresentou déficit de 350,77 milhões de dólares,

32,49% superior ao verificado em 2013. Enquanto isso, as importações mostraram

aumento de 8,96%, e as exportações tiveram uma redução de 35,84% em valor

(Mello, 2015).

2.2 A vitivinicultura na Campanha do Rio Grande do Sul

A instalação da indústria vinícola na região da Campanha do RS ocorreu de

forma simultânea à diversificação da produção agrícola, principalmente a

fruticultura, cujos efeitos podem ser percebidos em cidades como Aceguá, Bagé,

Dom Pedrito, Pedras Altas, Santana do Livramento e Uruguaiana , com a produção

de uva (BRASIL, 2005).

Localizada na "Metade Sul do Estado", a região da Campanha do RS é uma

região de campo, com topografia ondulada, apta à mecanização, cuja situação

geográfica está entre 29º45'23"S/57º05'37" W (município de Uruguaiana) e

31º33'45"S/53º26'15" W (município de Pinheiro Machado), com altitude variando

entre 75m e 420m. A temperatura média na região varia entre 17,6 ºC e 20,2 ºC, a

precipitação pluviométrica anual média varia entre 1.367mm e 1.444mm, e a

umidade relativa do ar, em média, situa-se entre 71% e 76%. Esta diversidade

ambiental oportuniza a produção de uvas que originam vinhos com diferentes

20

características de tipicidade dentro da própria região, de acordo com as condições

climáticas específicas de cada zona de produção.

A região da Campanha (Figura 1), atualmente com aproximadamente 1.500

ha, consolidou-se como produtora de vinhos finos na década de 1980, a partir de um

projeto implantado por uma empresa multinacional no município de Santana do

Livramento, na fronteira com o Uruguai. Caracteriza-se pelo cultivo de uvas Vitis

vinifera, com predominância das uvas tintas Cabernet Sauvignon, Merlot, Tannat,

Cabernet Franc, Pinot Noir, Touriga Nacional e Tempranillo; e as uvas brancas

Chardonnay, Sauvignon Blanc, Pinot Griogio e Ugni Blanc (Trebbiano) (Tonietto et

al., 2012). A produtividade dos vinhedos na região situa-se entre 8 e 12 t há-1,

dependendo da cultivar e das condições climáticas da safra. As uvas produzidas

originam principalmente vinhos tranquilos, embora venha crescendo em importância

a produção de uvas, das castas Chardonnay e Pinot Noir, para a elaboração de

espumantes (IBRAVIN, 2015).

Figura 1. Regiões vitivinícolas do Rio Grande do Sul, com destaque para a

região da Campanha.

Fonte: Revista Eno Estilo, 2015.

21

2.3 As Leveduras e o processo de vinificação

A conversão do mosto da uva em vinho é promovida por um processo de

fermentação, que ocorre naturalmente pela ação de leveduras autóctones, e que

contribuem significativamente para as características químicas e organolépticas do

produto final (Fleet, 2003). A função principal das leveduras enológicas é garantir a

conversão rápida e completa de açúcar de uva em etanol, dióxido de carbono, e

metabólitos secundários, evitando a produção de defeitos (Jiménez-Martì et al,

2011). Embora muitos compostos do vinho estejam relacionados diretamente às

uvas, parte essencial do sabor do vinho é alcançada durante o processo de

fermentação alcoólica (Ilieva et al., 2015). É amplamente conhecido que a

diversidade de leveduras autóctones é responsável pela produção de vinhos com

qualidade diferenciada por originar produtos de sabor peculiar, pois desempenham

um papel central no desenvolvimento de sabor e aroma de vinho, como resultado de

seus mecanismos bioquímicos e metabólicos (Fleet, 2003; Loira et al., 2015; Medina

et al., 2013).

Para o processo de vinificação, um dos mais importantes avanços

tecnológicos tem sido o uso de culturas selecionadas de Saccharomyces cerevisiae

para a inoculação em mosto de uva. Isto porque o controle microbiológico do

processo de fermentação permite uma melhor gestão da fermentação alcoólica,

garantindo qualidade e predição das suas características (Molina et al., 2009). No

entanto, são as espécies não-Saccharomyces que dominam a fase inicial de

processo de vinificação, e podem persistir durante outros estádios da vinificação,

sendo também responsáveis pela fermentação alcoólica, podendo afetar o estilo do

produto final (Contreras et al., 2015).

2.3.2 Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (SC) está incluída no Domínio Eukaryota, Reino

Fungi, Filo Ascomycota, Classe Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales,

Família Saccharomycetaceae, Gênero Saccharomyces e espécie cerevisiae. São

fungos unicelulares diplóides que se reproduzem assexuadamente por brotamento

ou sexuada por esporulação (meiose, segregação e formação de haplóides). S.

cerevisiae consiste em células com aproximadamente 3µm de diâmetro que são

22

capazes de dividir-se a cada 90 minutos em condições nutricionais adequadas

(Ribéreau-Gayon et al., 2003; Suárez-Lepe e Iñigo Leal, 2004).

O gênero Saccharomyces teve inúmeras mudanças taxonômicas ao longo

dos anos. Atualmente, de acordo com a última revisão taxonômica, 14 espécies são

aceitas dentro do gênero Saccharomyces, as quais estão classificadas em três

grupos. O complexo Saccharomyces senso lato inclui Saccharomyces barnettii,

Saccharomyces castellii, Saccharomyces dairenensis, Saccharomyces exiguus,

Saccharomyces rosinii, Saccharomyces servazzii, Saccharomyces spencerorum,

Saccharomyces transvaalensis e Saccharomyces unisporus. O segundo grupo inclui

a Saccharomyces kluyveri. O terceiro grupo, o qual inclui espécies de interesse

biotecnológico, consiste do complexo Saccharomyces senso stricto, compreendendo

Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus,

todos associados com fermentação industrial, e Saccharomyces paradoxus, a única

espécie Saccharomyces senso stricto, tipicamente isolada a partir de habitat natural

(insetos, árvores e exsudatos). Recentemente, três novas espécies isoladas a partir

de habitat natural, Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces kudriavzvii e

Saccharomyces mikatae, têm sido incluídas dentro do grupo Saccharomyces senso

stricto (Querol e Belloch, 2003).

Segundo Querol et al. (2003), a fermentação alcoólica é uma das principais

fases da produção de vinho e é geralmente conduzida por leveduras pertencentes a

espécies de Saccharomyces cerevisiae. As cepas nativas e industriais de S.

cerevisiae são organismos altamente especializados, que evoluíram para utilizar

todo o seu potencial nos diferentes ambientes ou nichos ecológicos. Assim, durante

a fermentação alcoólica, as leveduras foram adaptadas aos diferentes tipos de

condições, tais como o estresse oxidativo, osmótico e etanólico. Condições

extremas como essas, podem conduzir a uma redução na velocidade de

crescimento e taxa de sobrevivência, e portanto, tendem a reduzir a eficiência de

fermentação. A melhor e mais rápida levedura é capaz de adaptar-se às mudanças

no ambiente, aumentando a probabilidade de ser espécie dominante durante o

processo de vinificação.

2.3.3 Leveduras não-Saccharomyces

Para espécies não-Saccharomyces (NS), podem ser citadas como

representativas no processo enológico Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia

23

pulcherrima, Candida zemplinina, Lachancea thermotolerans e Hanseniaspora

uvarum (Rodríguez et al, 2010; Comitini et al, 2011; Medina et al, 2012.; Sadoudi et

al, 2012.; Gobbi et al, 2013.; Hong e Park, 2013; Medina et al., 2013).

Recentemente, tem havido um interesse crescente na valorização de cepas

não-Saccharomyces em cultura mista com S. cerevisiae para produção de vinho

(Comitini et al., 2011; Sadoudi et al., 2012; Gobbi et al., 2013; Medina et al., 2013).

Estes estudos demonstraram que as espécies não-Saccharomyces poderiam ter

tanto influências benéficas como negativas sobre as características de fermentação

de vinhos. Para o aspecto benéfico, algumas espécies não- Saccharomyces foram

testados para modificar positivamente a composição química do vinho, contribuindo

especialmente para as características sensoriais (Whitener et al., 2015). Como

impacto negativo, o crescimento de certas cepas não-Saccharomyces em mostos de

uvas podem causar o desenvolvimento e interações antagonistas entre leveduras, e

levarem a excessivo acúmulo de vários metabolitos indesejáveis, tais como ácido

acético, acetato de etila, aldeído, e de acetoína. Outra preocupação é que, algumas

espécies não-Saccharomyces, quando se desenvolvem durante a fermentação,

diminuem o poder de fermentação, bem como a tolerância ao etanol e/ou SO2,

havendo a necessidade de se conduzir co-fermentação. Portanto, o emprego de

cepas não-Saccharomyces ainda não é uma prática comum, sendo que novos e

mais exaustivos estudos são necessários para o conhecimento da influência de

inoculação microbiana no início da elaboração de vinhos.

2.4 Técnicas moleculares empregadas na caracterização de linhagens de

leveduras

A identificação molecular de leveduras é um procedimento amplamente aceito

para a caracterização desses microrganismos (Esteve-Zarzozo et al., 1999; Josepa

et al., 2000; Xufre et al., 2000; Renault et al., 2009; Zott et al, 2010; Tofalo et al.,

2014) . Embora as técnicas estejam em permanente evolução, o princípio é

semelhante entre elas. A seguir estão descritas as principais estratégias.

2.4.1 Sequenciamento do DNA ribossomal

As espécies de leveduras podem ser identificadas por comparação de

sequências de nucleotídeos de regiões de rDNA. As duas regiões mais vulgarmente

24

utilizados são as regiões D1 e D2, que codificam as subunidades ribossomais 26S e

18S (James et al., 1997; Kurtzman e Robnett, 1998). A disponibilidade de

sequências em bancos de dados de DNA, particularmente para a região de D1 / D2

do gene 26S, torna esta técnica útil para a atribuição de levedura desconhecidas

para uma espécie específica, quando a homologia da sequência é superior a 99%

(Kurtzman e Robnett, 1998).

2.4.2 Análise de restrição do DNA ribossomal

Métodos mais simples foram concebidos com base na amplificação por PCR

de regiões de rDNA, seguido por análise de restrição dos produtos amplificados.

Uma região muito útil do DNAr que pode ser usada para diferenciar as espécies é o

gene 5.8S e as regiões adjacentes intergênicas ITS1 e ITS2. Esta técnica foi usada

para identificação de leveduras vínicas (Guillamón et al., 1998). Os fragmentos

amplificados e perfis de restrição para estas espécies com HaeIII, HinfI, CfoI e DdeI

estão disponíveis online em http://yeast-id.com/. Na ausência de perfis de restrição,

o procedimento é sequenciar o DNA ribossomal, como descrito no item anterior.

Quando perfis de restrição são coincidentes, a identificação pode também contar

com a utilização de testes bioquímicos clássicos (Barata et al., 2008).

2.4.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR), Eletroforese de gradiente

em gel desnaturante (DGCE)

Esta técnica de impressão digital genética baseada na amplificação por PCR

e eletroforese de gradiente em gel desnaturante (DGGE) foi introduzido na ecologia

microbiana por Muyzer et al. (1993). Ela permite separar fragmentos de DNA com o

mesmo comprimento mas com diferentes sequências. A migração do DNA é

retardada quando as fitas de DNA se dissociam a uma concentração específica do

agente desnaturante. Uma técnica relacionada é a eletroforese em gel com

gradiente de temperatura (TGGE), que se baseia em um gradiente linear de

temperatura para a separação de moléculas de DNA (Fernández-Espinar et al.,

2011). Os métodos de DGGE e TGGE foram recentemente utilizados por Andorrà et

al. (2008) e Renouf e Lonvaud-Funel (2007), para a identificação de leveduras em

fermentações. Estas técnicas são diretamente aplicadas à amostra, mas a baixa

sensibilidade é uma grande desvantagem para estudar as populações minoritárias.

25

3 HIPÓTESE E OBJETIVOS

3.1 Hipótese

Acredita-se que, pela amplitude da atividade vitícola já existente , assim

como pelas peculiaridades do bioma local (radiação, ventos, pluviosidade,

temperaturas), existam cepas de leveduras autóctones, com potencial enológico.

3.2 Objetivo Geral

Prospectar leveduras com potencial enológico dentro do bioma local.

3.3 Objetivos Específicos

- Prospectar cepas de leveduras a partir de 3 variedades de uvas, Cabernet

Sauvignon, Tannat e Merlot, produzidas no município de Dom Pedrito, localizado na

Região da Campanha do RS.

- Caracterizar cepas de leveduras com aptidão enológica;

- Caracterizar cepas de leveduras tolerantes à altas concentrações de açúcar;

- Caracterizar cepas de leveduras tolerantes à altas concentrações de álcool;

- Caracterizar cepas de leveduras com baixa produção de ácido sulfídrico.

26

4 CAPÍTULOS

4.1 CAPÍTULO 1 – Relatório de Atividades

4.1.1 Material e Métodos

4.1.1.1 Leveduras

Foram utilizadas cepas de leveduras autóctones, isoladas a partir de uvas

Vitis vinifera das variedades Tannat, Cabernet Sauvignon e Merlot em estádio de

maturação industrial (acima de 22 °Babo), colhidas em 9 vinhedos, em três

propriedades do município de Dom Pedrito-RS (Latitude 30º 58' 58" S, Longitude 54º

40' 23" W), além de uma levedura comercial Saccharomyces cerevisiae UCD522

(Maurivin, London, UK) como microrganismo controle. Para cada variedade de uva,

foram colhidos aleatoriamente no vinhedo, na safra 2014/15 em torno de 15 kg de

uvas e, destes, 1,5 kg foram utilizados para isolar as leveduras. Para o isolamento,

uma alíquota 0,1 mL de mosto de cada variedade de uva foi semeada na superfície

de ágar YEPD (yeast extract peptone dextrose), com 10 repetições, e incubadas a

30 ºC/72h. Foram selecionadas 55 colônias típicas de leveduras que foram

repicadas para YEPD suplementado com 6 g L-1 ácido tartárico e incubadas a

30ºC/72h. AS 39 colônias que cresceram no meio suplementado com ácido tartárico

e o controle positivo foram semeadas em ágar YEPD suplementado com 30 mg mL-1

de cloranfenicol e incubadas a 30 ºC/72h. As cepas, após isolamento, foram

conservadas em ágar YEPD a 4 ºC, com repiques a cada 15 dias.

4.2.1.2 Caracterização Morfológica

As leveduras já isoladas, foram repicadas em meio YEPD, por esgotamento, e

incubadas a 30 °C/24h. Após, as colônias foram visualizadas em microscópio óptico

Olympus CX21, utilizando lente com aumento de 10X, para avaliação da morfologia

da colônia. Para avaliação da morfologia celular, foi realizada coloração de Gram

dos isolados, que foram visualizados em microscópio óptico, utilizando lente de

imersão com aumento de 100X.

27

4.2.1.3 Caracterização Enológica

Os 39 isolados e o controle positivo foram submetidos à testes para avaliação

da aptidão enológica. Os dados obtidos por caracterização enológica foram

convertidos em valores adimensionais, atribuindo para cada isolado os seguintes

valores: “0” para o nível muito baixo/nulo; “1” para nível baixo; “2” para nível médio;

e, “3” para nível alto (Adaptado de Capece et al., 2012).

- Teste de exclusão por estresse:

As leveduras foram crescidas em meio sólido YEPD a 37 ºC durante 72 horas.

As leveduras que cresceram nesta temperatura foram transferidas para o meio

sólido YEPD contendo 8% (v/v) de etanol e colocadas em estufa a 30 ºC durante 72

horas. As leveduras crescidas na presença de etanol foram semeadas em meio

YEPG 20% (p/v) de glicose e colocadas em estufa a 30 ºC durante 72 horas. As

leveduras resistentes a esta concentração de fonte de carbono foram crescidas em

meio YEP (Yeast Extract Peptone) contendo 20 g% (p/v) de sacarose adicionado de

8% (v/v) de etanol a 30 ºC durante 72 horas.

- Capacidade fermentativa:

A capacidade fermentativa dos isolados foi verificada em tubos de ensaio

contendo tubos de Durhan invertidos, 10 mL de meio para fermentação e um volume

de inóculo contendo 107 UFC (Adaptado de Anchorena-Matienzo, 2002).

- Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S):

Os isolados e a levedura controle foram semeadas em placas de Petri

contendo meio Agar LA e em placas de Petri contendo o meio sólido YEPD

(controle) e para o crescimento foram colocadas em estufa a 30 ºC durante 10 dias.

Decorrido o tempo, foi observado o aparecimento ou não de colônias enegrecidas,

característica de produção do sulfeto de hidrogênio (Guimarães, 2006).

- Tolerância à temperatura

Os isolados e a levedura controle foram semeadas em placas de Petri

contendo meio sólido YEPD e colocadas em estufas com diferentes temperaturas

28

durante 72 horas. Para verificar o efeito da temperatura no crescimento foram

empregados 25 ºC, 30 ºC, 37 ºC e 45ºC (Guimarães, 2006).

- Tolerância ao etanol

Para verificar o efeito da concentração de etanol no crescimento, as leveduras

isoladas e a levedura controle foram semeadas em placas de petri contendo meio

YEPD sem e com a suplementação de etanol nas concentrações de 10% (v/v), 13%

(v/v) e 15% (v/v). As placas foram incubadas a 30 ºC durante 72 horas (Adaptado de

Guimarães, 2006 e Reis, 2011).

4.2.1.4 Identificação molecular das leveduras

Foram selecionadas três cepas de leveduras (CS45, GM50 e ORG55) que

apresentaram desempenho semelhante ao controle positivo nos testes de

caracterização tecnológica para identificação molecular, através de sequenciamento

pelo método de Sanger (França et al., 2002). O DNA foi extraído utilizando kit ZR

Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™, amplificação (PCR) da região ITS 1 e 2

utilizando primers específicos e purificação do DNA amplificado com o kit QIAquick

Gel Extraction®. A reação foi preparada utilizando kit Big Dye Terminator v 3.1 Cycle

Sequencing (Applied Biosystems, Warrington, UK) e posterior sequenciamento em

plataforma ABI 3500 life Technologies. As sequências obtidas foram comparadas

com a base de dados do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia

(BLAST/NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

4.2.1.5 Microvinificação

As três cepas selecionadas para identificação molecular foram utilizadas para

microvinificação. Esse processo foi realizado em dois ensaios: microvinificação em

mosto sulfitado, buscando simular uma condição usual de vinificação, e

microvinificação em suco pasteurizado, com o intuito de se evitar a competição com

a contaminação existente no mosto.

4.2.1.5.1 Ensaio 1: Microvinificação em mosto sulfitado

As uvas da cv. Cabernet Sauvignon, oriundas de um vinhedo localizado no

município de Dom Pedrito-RS, foram recebidas e armazenadas por 1 dia em câmara

fria a 2 ºC, seguindo-se o desengace e esmagamento, análise físico-química

29

(densidade de 1,1319, 26,01 °Babo, pH 3,23, acidez total de 92,7 meq L-1, e acidez

volátil de 1,9 meq L-1), pesagem e sulfitagem com metabissulfito de potássio (15 mg

Kg-1). O experimento foi realizado em triplicata, utilizando um volume de 12 Kg para

cada repetição. O inóculo do controle positivo e das leveduras autóctones foi

adicionado um dia após a sulfitagem do mosto em uma concentração de 107 UFC

mL-1. A maceração com casca ocorreu até o 5º dia de fermentação, com três

remontagens diárias. A descuba aconteceu no 5º dia de fermentação, que foi

acompanhada até o 40º dia, quando realizou-se a trasfega e avaliação do vinho.

4.2.1.5.2 Ensaio 2: Microvinificação em suco pasteurizado

O inoculo do controle positivo e das leveduras autóctones foram adicionados

na concentração de 107 UFC mL-1, em amostras de suco pasteurizado (densidade de

1,1007, 20,37 °Babo, pH 3,26, acidez total de 92,4 meq L-1, e acidez volátil de 5,35

meq L-1), sem adição de conservantes, chaptalizado com quantidade suficiente de

glicose para produzir 14,5% de álcool (v/v). O experimento foi conduzido em

triplicata, com um volume de 500 mL para cada repetição. À semelhança da

microvinificação com mosto sulfitado, procederam-se as análises físico-químicas do

vinho após 40 dias.

4.2.1.6 Análises físico-químicas dos vinhos

Para os vinhos elaborados conforme os itens 4.2.1.5.1 e 4.2.1.5.2, foram

realizadas análises físico-químicas de concentração de densidade, pH, acidez total,

acidez volátil, álcool, açúcares redutores, índice de polifenóis totais (IPT),

antocianinas totais, intensidade de cor, tonalidade de cor, SO2 total e SO2 livre, de

acordo com Rizzon (2010).

4.2.1.7 Análises Estatísticas

Para os resultados obtidos através das análises físico-químicas, foi realizado

teste de análise de variância (ANOVA) com probabilidade de 5% pelo teste de

Tukey, utilizando o Software Satística® 12.

30

4.2.2 Resultados

4.2.2.1 Caracterização morfológica

Da prospecção de leveduras na três cultivares de Vitis vinífera e amostradas,

foi possível isolar 39 cepas, das quais 27 foram isoladas a partir de uvas da cv.

Cabernet Sauvignon, 5 a partir de uvas da cv. Tannat e 7 a partir de uvas da cv.

Merlot. A partir da caracterização morfológica, verificou-se que, das 39 cepas

autóctones analisadas, 21 apresentaram colônias lisas, textura mucosa e formato

convexo e 18 (CS4, CS5, M8, M9, CS11, CS12, CS13, CS14, CS15, CS16, CS17,

M19, M20, CS21, T22, T31, ORG54 e ORG56) apresentaram colônias rugosas,

textura farinosa e formato achatado. Por análise de morfologia celular evidenciou-se

que, das 39 cepas autóctones, 3 (GT47, ORG55 e GCS57) eram células esféricas, 7

(GM59, GT48, GM49, GM 50, GCS51, GCS52 e GT46) células apiculadas, 4

(GCS58, CS45, CS41b e CS41a) células ovoides e as 25 restantes, eram células

ovoide-alargadas (Tabela 1).

Tabela 1. Características morfológicas de cepas autóctones isoladas a partir de

vinhedos cultivados na região da Campanha do Rio Grande do Sul

Código da amostra

Característica morfológica da colônia*

Característica Morfológica

celular**

Código da amostra

Característica morfológica da colônia*

Característica Morfológica

celular**

CT (controle)

1 3 CS 40 1 4

CS 4 3 4 CS 41a 2 3

CS 5 3 4 CS 41b 2 3

M 8 3 4 CS 43 1 4

M 9 3 4 CS 44 1 4

CS 11 3 4 CS 45 1 3

CS 12 3 4 GT 46 1 2

CS 13 3 4 GT 47 2 1

CS 14 3 4 GT 48 1 2

CS 15 3 4 GM 49 1 2

CS 16 3 4 GM 50 1 2

CS 17 3 4 GCS 51 1 2

M 19 3 4 GCS 52 1 2

M 20 3 4 GCS 53 2 4

CS 21 3 4 ORG 54 3 4

T 22 3 4 ORG 55 2 1

T 31 3 4 ORG 56 3 4

31

CS 34 1 4 GCS 57 1 1

CS 35 1 4 GCS 58 1 3

CS 36 1 4 GM 59 1 2

*1= Colônias lisas, textura mucosa e formato convexo; 2= Colônias lisas, textura mucosa com pigmento de coloração laranja e formato convexo; 3= Colônias rugosas, textura farinosa e formato achatado; 4= N/A(não se aplica) ** 1= células esféricas; 2= células apiculadas; 3= células ovoides; 4= células ovoide-alargadas

4.2.2.2 Caracterização Enológica

A capacidade fermentativa das cepas autóctones foi avaliada através da

produção de gás e pelo aprisionamento do gás em tubos de Durham. Dos 39

isolados, apenas 7 (T31, CS40, CS41a, CS41b, GCS53, ORG54 E ORG56)

apresentaram baixa ou nula capacidade fermentativa, enquanto que 10 (CS40,

GT46, GM49, GCS51, GCS53, ORG54, ORG56, GCS57, GCS58 e GM59) cepas

não toleraram estresse osmótico e térmico. A produção de Sulfeto de Hidrogênio

(H2S) foi média ou alta para 16 (CS4, CS5, CS11, CS12, CS15, CS16, CS17, M19,

M20, CS21, CS34, CS35, CS36, CS43, ORG54 e GCS57) isolados estudados.

Todos isolados cresceram nas temperaturas testadas no teste de tolerância e

apenas 4 (CS40, CS43, CS44, GCS51) tiveram baixa tolerância ao etanol (Tabela

2).

Tabela 2. Caracterização tecnológica de cepas autóctones isoladas de vinhedos

localizados na região da Campanha do Rio Grande do Sul

Código da

amostra

Capacidade Fermentativa

Tolerância ao

estresse

Produção de H2S

Tolerância à

temperatura

Tolerância ao

Etanol

CT (controle)

3 3 0 3 3

CS 4 2 3 2 3 3

CS 5 2 3 2 3 3

M 8 3 3 1 3 3

M 9 2 3 1 3 3

CS 11 3 3 3 3 3

CS 12 2 3 3 3 3

CS 13 2 3 1 3 3

CS 14 2 3 1 3 3

CS 15 2 3 3 3 3

CS 16 2 3 3 3 3

CS 17 2 3 2 3 3

32

M 19 3 3 2 3 3

M 20 3 3 2 3 3

CS 21 2 3 2 3 3

T 22 2 3 1 3 3

T 31 1 3 1 3 3

CS 34 2 3 2 3 3

CS 35 3 3 2 3 3

CS 36 2 3 3 3 3

CS 40 0 0 4 2 1

CS 41a 0 3 0 3 2

CS 41b 0 3 0 3 2

CS 43 2 3 2 3 1

CS 44 2 2 0 3 1

CS 45 3 3 0 3 3

GT 46 3 0 0 2 2

GT 47 3 3 0 3 2

GT 48 3 3 0 3 2

GM 49 3 0 0 2 2

GM 50 3 3 0 3 3

GCS 51 3 0 0 2 1

GCS 52 3 1 0 3 2

GCS 53 0 0 4 2 4

ORG 54 0 0 3 2 4

ORG 55 3 3 0 3 3

ORG 56 0 0 4 2 4

GCS 57 3 0 2 2 3

GCS 58 2 0 0 2 2

GM 59 3 0 0 2 2

0= nível muito baixo/nulo; 1= nível baixo; 2= nível médio; 3= nível alto (CAPECE, 2012), 4= N/A (não se aplica).

4.2.2.3 Identificação molecular das leveduras

Para a identificação molecular das leveduras, foram escolhidos três isolados

(CS45, GM50 e ORG55) com comportamento similar ou superior ao controle positivo

nas avaliações de caracterização tecnológica. A cepa CS45, que é um isolado da

uva Cabernet Sauvignon, ao ter sequenciada a região do rDNA, apresentou 99% de

identidade com a espécie Lachancea thermotolerans; a cepa GM50, que é um

isolado de uva Merlot, apresentou sequência do rDNA 98% idêntico ao gênero

Hanseniaspora uvarum, a terceira cepa (ORG55), foi um isolado de uva Cabernet

Sauvignon, cultivada no sistema orgânico, e apresentou 97% de identidade de rDNA

com a espécie Metschnikowia pulcherrima (Tabela 3).

33

Tabela 3. Identificação das cepas autóctones isoladas a partir de 3 vinhedos

localizados na região da Campanha do Rio Grande do Sul

Espécie Identificação

do isolado*

Número de

acesso

% de

identidade Variedade de uva

Lachancea

thermotolerans1 CS45

CU928180

99%

Cabernet

Sauvignon

Hanseniaspora

uvarum2 GM50 KF728823 98% Merlot

Metschnikowia

pulcherrima3 ORG55 HG421420 97%

Cabernet

Sauvignon

cultivada em

sistema orgânico

* CS45: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon; GM50: isolado autóctone de uvas Merlot; ORG55: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon cultivadas em sistema orgânico.

4.2.2.4 Microvinificação

Para estudar a aptidão enológica, realizou-se microvinificação em mosto sulfitado.

Para isso, foram utilizadas uvas com maturação avançada, de colheita tardia, com

elevada concentração de açúcares. O resultado das análises físico-químicas dos

vinhos produzidos com a cepa comercial (controle) e com as cepas autóctones

(CS45, GM50 e ORG55) diferiu estatisticamente para as variáveis acidez total,

índice de polifenóis totais (IPT), intensidade de cor, acidez volátil (> 15 meq.L-1) e

concentração alcoólica. Apenas as variáveis tonalidade de cor, SO2 livre e SO2 total

não diferiram estatisticamente entre as amostras (Tabela 4). Concluídas as

fermentações, observou-se que todas as leveduras foram capazes de realizar o

processo fermentativo, atingindo elevadas concentrações de álcool (16,98 a 17,90%,

v/v), o que é coerente com o elevado grau Babo inicial (26,01). Da mesma forma, os

valores de densidade (0,9775 a 0,9785) e pH (4,09 a 4,20), após o processo

fermentativo, são coerentes com as características do mosto inicial e indicam que

houve uma evolução normal da fermentação, com o consumo de açúcares (baixo

valores de açúcares residuais) e elevação do conteúdo de álcool. A acidez volátil

34

aumentou em todos os ensaios de fermentação, passando de 1,9 meq.L-1 no mosto,

para valores de até 18,83 meq.L-1 no vinho.

A implicação das leveduras vínicas na cor vinho tinto é dupla. Influenciam na

extração de antocianinas durante a maceração e fermentação, em função da sua

capacidade de produção de álcool e também podem ter efeito sobre a formação de

formas mais estáveis de antocianina durante a maturação e envelhecimento. Por

outro lado, podem promover a degradação das antocianinas e participar de

interações com pigmentos que resultam na perda de cor (Ribéreau-Gayon et al.,

2003). Para antocianinas totais, o isolado CS45 se mostrou capaz de influenciar

significativamente na extração desses compostos em relação aos demais, resultado

que não foi verificado para a variável de intensidade de cor, onde o vinho elaborado

a partir da levedura controle apresentou maior valor.

Tabela 4. Características físico-químicas de vinhos obtidos através de fermentação

em mosto sulfitado com levedura comercial e leveduras nativas

CT** CS45 GM50 ORG55 CV (%)

Densidade 0,9775 b* 0,9785 a 0,9784 a 0,9780 ab 0,02

pH 4,17 ab 4,09 b 4,14 ab 4,20 a 0,87

Acidez total (meq.L-1) 90,533 a 91,067 a 83,733 b 80,067 b 2,86

Acidez volátil (meq.L-1) 16,78 ab 18,83 a 16,08 b 17,48 ab 5,37

Álcool (% v/v) 17,883 a 16,977 b 17,090 b 17,507 ab 1,35

Açúcares redutores ( g.L-1) 4,11 b 8,52 a 3,963 b 5,143 b 17,27

IPT 34,93 a 24,90 b 27,43 ab 27,93 ab 10,39

Antocianinas totais (mg.L-1) 36,601 b 76,565 a 43,068 ab 32,333 b 27,74

Intensidade de cor 1,1993 a 0,5147 b 0,7593 b 0,6730 b 15,16

Tonalidade de cor 1,5627 a 1,6620 a 1,6363 a 1,5317 a 9,54

SO2 total (mg.L-1) 8,67 a 21,93 a 15,33 a 26,47 a 65,44

SO2 livre (mg.L-1) 4,83 a 4,5 a 4,67 a 4,80 a 19,81

* Letras diferentes na linha indicam diferença significativa ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. ** CT: controle positivo (levedura Saccharomyces cerevisiae UCD522, Maurivin); CS45: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon; GM50: isolado autóctone de uvas Merlot; ORG55: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon cultivadas em sistema orgânico.

Os vinhos elaborados a partir de suco pasteurizado apresentaram

características distintas em função da cepa utilizada. As variáveis de densidade e

açúcares redutores apresentaram diferença estatística para todas as amostras. Para

35

as demais variáveis, o isolado com resultados similares ao controle positivo foi

CS45, enquanto ORG55 foi o que mais se diferenciou da cepa controle (Tabela 5).

Ao contrário que diz a literatura (Ribéreau-Gayon et al., 2003), para os vinhos

elaborados a partir de suco pasteurizado as variáveis antocianinas totais e índice de

polifenóis totais foram significativamente maiores para os vinhos com menor

quantidade de álcool, o que pode ser explicado pelo efeito da constante dielétrica

sobre a extração desses compostos. Assim, pode-se relacionar esse resultado a

uma menor interação entre as leveduras e os compostos de cor, em relação os

demais isolados testados. Quando se avaliou tonalidade de cor, os isolados

ORG55 e GM50 foram os que geraram vinhos com menor valor, indicando que os

vinhos apresentavam coloração mais intensa para os matizes vermelhos em relação

aos amarelos (atijolados).

Tabela 5. Características físico-químicas de vinhos obtidos através de fermentação

em suco pasteurizado com levedura comercial e leveduras nativas.

AMOSTRA CT** CS45 GM50 ORG55 CV (%)

Densidade 0,9955 d* 1,0452 c 1,0683 b 1,0849 a 0,32

pH 3,41 a 3,19 c 3,33 b 3,27 b 0,71

Acidez total (meq.L-1) 108,63 b 146,93 a 101,53 bc 99,9 c 2.82

Acidez volátil (meq.L-1) 8,42 b 8,60 b 11,93 a 6,97 b 10,09

Álcool (% v/v) 14,13 a 7,53 b 4,34 c 2,14 d 4,05

Açúcares redutores ( g.L-1) 5,3 d 124,4 c 181,88 b 221,36 a 3,83

IPT 45,63 c 48,17 b 51,37 a 52,23 a 1,45

Antocianinas totais (mg.L-1) 117,31 b 125,19 ab 129,33 ab 143,56 a 6,52

Intensidade de cor 1,0833 a 1,2300 a 1,2567 a 1,2580 a 12,41

Tonalidade de cor 1,0572 a 1,0412 a 0,9884 b 0,9857 b 1,27

* Letras diferentes na linha indicam diferença significativa ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. ** CT: controle positivo (levedura Saccharomyces cerevisiae UCD522, Maurivin); CS45: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon; GM50: isolado autóctone de uvas Merlot; ORG55: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon cultivadas em sistema orgânico.

4.2.3 Discussão

É amplamente conhecido que a vinificação com leveduras autóctones pode

conferir tipicidade a um vinho ou, no mínimo, agregar sinal distintivo, como é o caso

de vinhos orgânicos e biodinâmicos (Fleet, 2003; Domizio et al., 2007; Viana et al.,

36

2008; Moreira et al., 2011; Holt et al., 2013; Liang et al., 2013). Mas, para isso, há

que se prospectar leveduras em cada bioma, tendo em vista que a diversidade e

variabilidade de leveduras na superfície da uva é influenciada, além das condições

climáticas e localização geográfica da região (Raspor et al., 2006), também pela

integridade das bagas (Ribereau-Gayon et al., 2003). É nesse contexto que foram

isoladas 39 leveduras de uvas Cabernet Sauvignon, Tannat e Merlot, todas

produzidas na região da Campanha Gaúcha, novo território da produção de uvas e

vinhos finos no Brasil. Para avaliar a aptidão dessas leveduras, foram feitas

caracterizações morfológicas, tecnológicas e moleculares. A partir da caracterização

morfológica e tecnológica, verificou-se que 3 isolados autóctones (CS45, GM50 E

ORG55) apresentaram potencial enológico, com alta capacidade fermentativa, alta

tolerância ao estresse e baixa produção de H2S, na condição de leveduras não-

Saccharomyces.

Em função do bom desempenho na caracterização tecnológica, 3 cepas

foram selecionadas para sequenciamento do rDNA, região ITS 1 e 2, permitindo a

confirmação de que se tratam de três espécies de leveduras não-Saccharomyces,

com, no mínimo, 97% de identidade genômica às sequências depositadas no

GenBank (Tabela 3). As 3 leveduras autóctones isoladas são Lachancea

thermotolerans, Hanseniaspora uvarum e Metschnikowia pulcherrima e foram

isoladas das cultivares Cabernet Sauvignon, Merlot e Cabernet Sauvignon orgânico,

respectivamente. Essas espécies de leveduras vêm sendo amplamente estudadas

na enologia principalmente por agregarem características sensoriais importantes aos

vinhos (Settanni et al., 2012, Gobbi et al., 2013, Domizio et al., 2014), e por estarem

presentes nas uvas e nas primeiras fases da fermentação espontânea (Ortiz et al.,

2013).

As uvas utilizadas para microvinificação, na forma de mosto sulfitado,

estavam sobremaduras. Nesse caso, a fermentação alcoólica ocorreu nos níveis

clássicos para vinificação em tinto, e atingindo concentração de álcool elevada, de

16,98 a 17,88% (v/v). Esse achado indica que houve desenvolvimento de

Saccharomyces ou outra espécie que tolera altas concentrações de álcool, tendo em

vista que as leveduras-alvo desse trabalho (M. pulcherrima; H. uvarum; L.

thermotolerans), normalmente não toleram produção de álcool acima de 8% (v/v), o

que foi comprovado com o teste de microvinificação em suco pasteurizado. As cepas

testadas, geraram vinhos com 14,13% (Controle), 7,53% (CS45) , 4,34% (GM50) e

37

2,14% (ORG55) de álcool, o que é coerente com as características de leveduras dos

gêneros Saccharomyces, Lachancea, Hanseniaspora e Metscnikowia,

respectivamente (Clemente-Jimenez et al., 2004; Comitini et al., 2011). Quanto aos

resultados observados, nos vinhos obtidos a partir de microvinificação em suco

pasteurizado, para antocianinas totais e índice de polifenóis totais, os maiores

valores foram encontrados nos vinhos com menor concentração de álcool, o que

pode ser explicado pelo aumento da constante dielétrica do meio, sabendo-se que a

solubilidade desses compostos depende mais fortemente da polaridade por serem

pigmentos hidrossolúveis (Gruz et al., 2013). Essas mesmas variáveis, quando

observadas nos vinhos obtidos a partir de microvinificação em mosto sulfitado, foram

influenciadas tanto pela menor concentração de álcool, como pela maior

concentração de SO2 total, que afeta de maneira significativa a extração dos

compostos fenólicos, principalmente as antocianinas (Lopes et al., 2007).

Sob o aspecto tecnológico, o mercado atual já oferece isolados selecionados

de Lachancea (CONCERTOTM/ Viniflora®) e Metschnikowia (Flavia® MP346,

Lallemand). Segundo Comitini, et al. (2011) e Gobbi et al. (2013), quando inoculada

em associação com S. cerevisiae, L. thermotolerans resulta em reduções no pH e

na acidez volátil, aumento de acidez total, de glicerol e de 2- feniletanol. Além

disso, o co-inóculo de uma cepa selvagem com S. cerevisiae contribui para uma

adequada cinética de fermentação com rápido arranque de fermentação,

continuidade e regularidade da fermentação associada. Esse evento provavelmente

ocorreu na fermentação inoculando as cepas não-Sacharomyces no mosto sulfitado.

Mais especificamente, quando se inoculou Lachancea (Kluyveromyces)

thermotolerans isolada em uvas Cabernet Sauvignon do bioma Pampa Gaúcho

(Região da Campanha do Rio Grande do Sul), o vinho se assemelhou àquele

produzido pela levedura controle no que tange ao pH, acidez total e acidez volátil.

Isso indica que, embora se trate de mesmo gênero e espécie daquela usada por

Comitini et al. (2011) e Gobbi et al. (2013), é possível que haja comportamento

enológico distinto principalmente quando a cepa é utilizada individualmente ou como

co-inóculo no início da fermentação, e com uvas de regiões distintas.

Conforme descrito por Clemente-Jimenez et al. (2004), Metschnikowia

pulcherrima, em geral, tem baixo poder fermentativo, o que foi evidenciado nesse

estudo, quando se realizou a microvinificação em suco pasteurizado. Porém, em

efeito sinérgico na co-cultura com S. cerevisiae, é capaz de promover a produção de

38

muitos compostos aromáticos, incluindo os ácidos graxos, ésteres e terpenóis

(Comitini et al., 2011; Sadoudi et al., 2012).

No que concerne à levedura Hanseniaspora uvarum isolada na Campanha do

RS se observou que, embora tolere etanol (Tabela 2), não tem capacidade para

produção de altas concentrações de álcool, tendo atingido até 4,34% (v/v). Além

disso, H. uvarum podem proporcionar aumento da síntese de alguns compostos

desejáveis, tais como álcoois superiores e ésteres (Moreira et al., 2005; Medina et

al., 2013), além de aumentar a acidez volátil (Suárez-Lepe e Iñigo Leal, 2004).

Durante o processo fermentativo com mosto sulfitado de uva C. Sauvignon

sobremadura, as leveduras autóctones foram capazes de produzir um vinho de

elevada concentração de álcool, semelhante ao que ocorreu à cepa comercial. Isso

ocorreu, provavelmente, em função de que, o SO2 tem poder de seleção sobre as

leveduras nativas, entretanto as leveduras do gênero Saccharomyces são bastante

resistentes à esse aditivo (Comitini et al., 2011), podendo ter ocorrido o

desenvolvimento das mesmas ao longo da fermentação, garantindo a fermentação

completa dos vinhos. Frente ao exposto, ficou evidenciado que as 3 cepas isoladas

e caracterizadas têm potencial enológico para serem usadas em processo

fermentativo em co-cultivo.

39

4.2 CAPÍTULO 2 – Microbiological characterization of grapes in the

Campanha Region of Rio Grande do Sul, Brazil reveals non-Saccharomyces

autochthonous yeasts with oenological potential.

(Artigo submetido à revista International Journal of Food Microbiology)

Suziane A. Jacobs a, b, *, Bruno Jacobs b, Fernando Zocche b, Renata G. S. Zocche b,

Gabriela H. Pötter c, Lucas M. Simões b, César V. Rombaldi a

a Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, CDTec, Universidade Federal de

Pelotas, RS, Brasil

b Curso de Enologia, Universidade Federal do Pampa, RS, Brasil

c Guatambu Estância do Vinho, Dom Pedrito, RS, Brasil

* Corresponding author. Tel.: +55 05399369395; fax: +55 05332437301

E-mail address: [email protected] (Suziane A. Jacobs)

Curso de Enologia, Universidade Federal do Pampa, 96450-000, Dom Pedrito-RS,

Brazil

40

Abstract

Investigation of autochthonous yeasts is essential to enhance the production of wines

with regionally distinctive traits in a globally competitive market. Although the growth

of non-Saccharomyces yeasts during wine fermentation is widely recognized

to positively affect flavour and aroma when used with S. cerevisiae, the inability to

control spontaneous co-fermentation by these yeasts prevents their use in some

areas. In this study, we analyzed 39 autochthonous yeasts from grapes collected in

the Campanha region of Rio Grande Sul-Brazil, focusing on 3 primary isolates that

shared similar characteristics with an S. cerevisiae control. The behavior of these

yeasts, isolated from Cabernet Sauvignon, Merlot, and organically-grown Cabernet

Sauvignon grapes, during sulphited must and pasteurized grape must fermentation

was also evaluated. Notably, the strains (designated CS45, GM50, and

ORG55) shared 99% identity with Lachancea thermotolerans, 98% identity with

Hanseniaspora uvarum, and 97% identity with Metschnikowia pulcherrima,

respectively. The yeasts also displayed distinct behaviors during microvinification,

particularly in alcohol production. Other variables, such as the total polyphenols

index, total anthocyanins, and color tonality also appear to be influenced. Taken

together, the three autochthonous yeasts characterized here would be ideal

alternatives in co-culture fermentations with other Saccharomyces species during the

production of region-specific wines.

Keywords:

autochthonous yeast

wine

Lachancea thermotolerans

Metschnikowia pulcherrima

Hanseniaspora uvarum.

41

Introduction

Yeasts employed in alcoholic fermentation play an important

role in oenology, and can affect the alcohol content, color, taste, aroma, and

structure of the wine (Álvarez-Pérez et al., 2012; Fleet, 2003; Holt et al., 2013; Liang

et al., 2013; Loira et al., 2013). Notably, the various species of yeast typically

involved in the fermentation of grape must into wine can be classified into two

primary groups: (i) non-Saccharomyces species, which develop in the early stages of

fermentation and are associated with low alcohol levels; and, (ii) Saccharomyces

strains, which become dominant with increasing ethanol concentrations (Barata et.

al., 2012; Suárez-Lepe & Íñigo Leal, 2004; Tristezza et al., 2013). Furthermore, in

these two groups, there is currently an ample assortment of yeasts that can be used

for oenological manipulation, ranging from those that perform orthodox alcoholic

fermentations without significantly affecting other properties of the wine to those

employed with the specific aim of enhancing wine flavour (Callejon et al., 2010;

Molina et al., 2009). While the properties of many of these yeast strains and their

subsequent effect on winemaking have been characterized, the search for final

products with distinctive traits continues worldwide.

Recently, winemaking that utilizes autochthonous yeasts has been evaluated

as an alternative way to enhance wine fermentation in several countries (Capece et

al, 2012; Chavan et al., 2009; Contreras et al., 2015; Liang et al., 2013; Scacco et al.,

2012; Settanni et al., 2012; Synos et al., 2015). This oenological advancement is

largely related to the ability of the autochthonous yeasts to impart unique features to

the wine, making the quality of the final product more region-specific (Domizio et al.,

2007; Holt et al., 2013; Liang et al., 2013; Moreira et al., 2011). For example,

Settanni et al. (2012) isolated three autochthonous yeast species with a technological

aptitude for wine production when evaluating 51 strains of S. cerevisiae from the

local biome (Sicily, Italy). Similarly, Scacco et al. (2012) previously identified other

native yeast strains found in Sicilian wines that are capable of producing higher

concentrations of the compounds responsible for pear fruit notes, a characteristic

aroma of wines from this region.

In addition to the use of autochthonous yeast strains, there has also been a

recent surge of interest in mixed fermentation using both Saccharomyces and non-

Saccharomyces wine yeasts, with the aim of improving wine quality and complexity.

In fact, Gobbi et al. (2013) showed that simultaneous fermentation using Lachancea

42

(Kluyveromyces) thermotolerans and S. cerevisiae significantly increased the spicy

notes found in a wine. Moreover, in a similar study on the interactions between S.

cerevisiae and non-Saccharomyces yeasts (Sadoudi et al., 2012), it appears that the

entire aromatic metabolic pathway can be altered depending on the type of yeast

used during vinification. Thus, it would appear that various techniques, including the

use of native yeasts and mixed species fermentation, can be used to produce

enhanced region-specific wines. However, these techniques have gone largely

underused in some countries.

In Brazil, the main region for the production of fine wines is the Campanha

Gaúcha, a part of the Pampa Gaúcho (Latitude 30°S, Longitude 54°W; altitude 100-

300 m). Notably, this region is characterized by sandy soil with good drainage, a

temperate climate with hot and dry summers, an average annual rainfall of 1,370

mm, an average thermal amplitude of 17 ºC in the summer, and an average total

sunlight of 2.372 h each year. The wines from this region have been praised at both

the national and international level. However, there is currently a need to investigate

oenological alternatives in order to continue developing distinctive features in such a

competitive global market.

In the present study, we sought to evaluate the oenological potential of various

non-Saccharomyces yeasts isolated from fine grapes collected from the Campanha

region of Rio Grande do Sul in Brazil. In doing so, three specific strains, isolated from

Cabernet Sauvignon, Merlot, and organic-grown Cabernet Sauvignon grapes, were

identified as having fermentation properties similar to or better than an S.

cerevisiae control strain and were, therefore, further characterized here. Thus, it

would appear that yeasts with oenological potential in the Pampa Gaúcho region

could constitute an innovative element, to be employed either individually or in

association with other yeasts, in order to add value to wine produced in the area.

43

Materials and Methods

1. Yeasts

Autochthonous yeast strains isolated from Vitis vinifera grapes at a stage of

industrial maturation were collected from the Tannat, Cabernet Sauvignon, and

Merlot varieties in vineyards of the Dom Pedrito-RS city (Latitude 30º 58' 58" S,

Longitude 54º 40' 23" W). Further, a commercial S. cerevisiae UCD522 yeast strain

(Maurivin, London, UK) was used as a control microorganism. For each grape

variety, approximately 15 kg of grapes were randomly collected in the vineyard

during the 2014/2015 season, 1.5 kg of which was used to isolate the yeasts. A 0.1

mL aliquot of grape must from each variety was inoculated on the surface of yeast

extract peptone dextrose (YEPD) agar (n = 10) and incubated at 30 ºC for 72 h. A

total of 55 typical yeast colonies were then selected and subcultured into YEPD

medium supplemented with 6 g/L tartaric acid and incubated at 30 ºC for 72 h. Of

these, 39 colonies, as well as the positive control, were also inoculated in YEPD

medium supplemented with 30 mg/mL chloramphenicol and incubated at 30 ºC for 72

h. After isolation, the strains were conserved in YEPD agar at 4 ºC.

2. Technological characterization

The 39 yeast isolates and the positive control underwent various

characterization tests, including stress tolerance, fermentative capacity, production of

hydrogen sulphide (H2S), tolerance to temperature (24, 28, 32, and 37

ºC), and tolerance to ethanol (10, 13, and 15 %) (Guimarães et al., 2006). The data

obtained in this technological characterization were converted into dimensionless

values, assigning the following values to each isolate: "0" for very low/null levels;

"1" for low levels; "2" for medium levels; and "3" for high levels as previously

described (Capece et al., 2012).

3. Yeast identification

Three yeast strains (CS45, GM50, and ORG55) that presented a performance

similar to that of the positive control in the technological characterization assays were

selected for molecular identification by sequencing according to the Sanger method

(França et al., 2002). DNA was extracted using the ZR Fungal/Bacterial DNA

MiniPrep™ kit. PCR amplification of the ITS 1 and 2 regions was performed

44

using specific primers, and purification of amplified DNA was performed with the

QIAquick Gel Extraction® kit. The reaction was prepared using the Big Dye

Terminator v 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Warrington, UK), and

subsequent sequencing was performed on a Life Technologies ABI 3500 platform.

The sequences obtained were compared with those from the National Center for

Biotechnology Information using BLAST software (BLAST/NCBI)

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

4. Microvinification

The three strains selected for molecular identification were then subjected to

microvinification. This process was carried out in two independent assays:

microvinification in sulphited must, simulating a common vinification condition, and

microvinification in pasteurized must, which was intended to represent an

environment without competition from contamination present in the must. These

assays are described below.

i. Microvinification in sulphited must

Cabernet Sauvignon grapes were received and stored for 1 day in a cold

chamber at 2 ºC, followed by destemming and crushing, physicochemical analysis

(density of 1.1319, 26.01 degrees Babo, pH 3.23, total acidity of 92.7 meq/L, and

volatile acidity of 1.9 meq/L), weighing, and sulphiting with potassium

metabisulphite (15 mg/kg). The isolated positive control and three autochthonous

yeast strains were added one day later at a concentration of 107 CFU/mL. The

maceration with skin took place on the fifth day of fermentation, with three daily

pumpings. The solids-liquids separation also occurred on the fifth day of

fermentation, and was monitored up to the fortieth day, when the racking and

evaluation of the completely fermented wines were carried out.

ii. Microvinification in pasteurized must

The positive control and three autochthonous yeasts were added at a

concentration of 107 CFU/mL to pasteurized grape juice samples (density of 1.1007,

20.37 degrees Babo, pH 3.26, total acidity of 92.4 meq/L, and volatile acidity of 5.35

meq/L). These samples lacked preservatives and were chaptalized with enough

45

glucose to yield 14.5 % alcohol (v/v). As in the sulphited must, the physicochemical

analysis of the wine took place 40 days into the fermentation process.

Results

The prospection and sampling of yeasts in three Vitis vinífera cultivars led to

the isolation of 39 strains, 27 of which were isolated from Cabernet Sauvignon

grapes, 5 from Tannat grapes, and 7 from Merlot grapes. Our technological

characterization of these strains revealed that, of the 39 autochthonous

strains isolated, 21 yielded smooth colonies with mucous texture and convex shape,

while 18 (CS4, CS5, M8, M9, CS11, CS12, CS13, CS14, CS15, CS16, CS17, M19,

M20, CS21, T22, T31, ORG54, and ORG56) yielded rough colonies with grainy

texture and flat shape. Further, it appears that the cell morphology of 3 strains

(GT47, ORG55, and GCS57) was spherical, while that of 7 others (GM59, GT48,

GM49, GM 50, GCS51, GCS52, and GT46) appeared to be apiculate, 4 (GCS58,

CS45, CS41b, and CS41a) were ovoid, and the remaining 25 strains were expanded

ovoid cells (Table 1).

Table 1. Morphological characteristics of autochthonous yeast strains isolated

from vineyards located in the Campanha region of Rio Grande do Sul.

Sample Code

Morphological feature of the colony *

Cellular morphologica

l feature **

Sample Code

Morphological feature of the colony *

Cellular morphologica

l feature **

CT (control)

1 3 CS 40 1 4

CS 4 3 4 CS 41a 2 3

CS 5 3 4 CS 41b 2 3

M 8 3 4 CS 43 1 4

M 9 3 4 CS 44 1 4

CS 11 3 4 CS 45 1 3

CS 12 3 4 GT 46 1 2

CS 13 3 4 GT 47 2 1

CS 14 3 4 GT 48 1 2

CS 15 3 4 GM 49 1 2

CS 16 3 4 GM 50 1 2

CS 17 3 4 GCS 51 1 2

M 19 3 4 GCS 52 1 2

M 20 3 4 GCS 53 2 4

46

CS 21 3 4 ORG 54 3 4

T 22 3 4 ORG 55 2 1

T 31 3 4 ORG 56 3 4

CS 34 1 4 GCS 57 1 1

CS 35 1 4 GCS 58 1 3

CS 36 1 4 GM 59 1 2

* 1: Smooth colonies with mucous texture and convex shape; 2: Smooth colonies

with mucous texture, orange pigmentation, and convex shape; 3: Rough colonies

with grainy texture and flat shape.

** 1: spherical; 2: apiculate; 3: ovoid; 4: extended ovoid.

The fermentative capacity, via the production of gas, of the 39 autochthonous

yeast strains was assessed by trapping the gas in Durham tubes. Of the isolates

analyzed, only 7 strains (T31, CS40, CS41a, CS41b, GCS53, ORG54, and ORG56)

showed little to no fermentative capacity, whereas 10 strains (CS40, GT46, GM49,

GCS51, GCS53, ORG54, ORG56, GCS57, GCS58, and GM59) were unable to

tolerate osmotic and thermal stress. Medium or high production of H2S was observed

for 16 yeasts (CS4, CS5, CS11, CS12, CS15, CS16, CS17, M19, M20, CS21, CS34,

CS35, CS36, CS43, ORG54, and GCS57) in this study. Further, all isolates grew at

the temperatures employed during the tolerance test, and only 4 strains (CS40,

CS43, CS44, and GCS51) had low tolerance to ethanol (Table 2).

Table 2. Technological characterization of 39 autochthonous strains isolated

from vineyards located in the Campanha region of Rio Grande do Sul.

Sample Code

Fermentative Capacity

Stress Tolerance

Production of H2S

Temperature tolerance

Tolerance to

Ethanol

CT (control)

3 3 0 3 3

CS 4 2 3 2 3 3

CS 5 2 3 2 3 3

M 8 3 3 1 3 3

M 9 2 3 1 3 3

CS 11 3 3 3 3 3

CS 12 2 3 3 3 3

CS 13 2 3 1 3 3

CS 14 2 3 1 3 3

CS 15 2 3 3 3 3

CS 16 2 3 3 3 3

47

CS 17 2 3 2 3 3

M 19 3 3 2 3 3

M 20 3 3 2 3 3

CS 21 2 3 2 3 3

T 22 2 3 1 3 3

T 31 1 3 1 3 3

CS 34 2 3 2 3 3

CS 35 3 3 2 3 3

CS 36 2 3 3 3 3

CS 40 0 0 4 2 1

CS 41a 0 3 0 3 2

CS 41b 0 3 0 3 2

CS 43 2 3 2 3 1

CS 44 2 2 0 3 1

CS 45 3 3 0 3 3

GT 46 3 0 0 2 2

GT 47 3 3 0 3 2

GT 48 3 3 0 3 2

GM 49 3 0 0 2 2

GM 50 3 3 0 3 3

GCS 51 3 0 0 2 1

GCS 52 3 1 0 3 2

GCS 53 0 0 4 2 4

ORG 54 0 0 3 2 4

ORG 55 3 3 0 3 3

ORG 56 0 0 4 2 4

GCS 57 3 0 2 2 3

GCS 58 2 0 0 2 2

GM 59 3 0 0 2 2 Values indicate the following levels: 0: very low/null; 1: low; 2: medium; 3: high (Capece et

al., 2012).

Interestingly, three isolates (CS45, GM50, and ORG55) appeared to behave

similar or better than the positive control in our technological characterization assays.

These strains were, therefore, selected for further molecular

identification. Sequencing of the rDNA region of strain CS45, isolated from Cabernet

Sauvignon grapes, showed 99% identity with the Lachancea thermotolerans species.

On the other hand, the rDNA sequence of strain GM50, isolated from Merlot

grapes, was observed to have 98% sequence identity to the Hanseniaspora uvarum

species. Finally, the rDNA sequence of the third strain (ORG55), an isolate from

organically grown Cabernet Sauvignon grapes, appears to share 97% identity with

the Metschnikowia pulcherrima species (Table 3, Figs. 1–3).

48

Table 3. Identification of three specific autochthonous strains isolated from vineyards

located in the Campanha region of Rio Grande do Sul.

Species Identification

of isolate *

Accession

Number % identity Grape Variety

Lachancea

thermotolerans CS45

CU928180

99%

Cabernet

Sauvignon

Hanseniaspora

uvarum GM50 KF728823 98% Merlot

Metschnikowia

pulcherrima ORG55 HG421420 97%

Cabernet

Sauvignon grown in

organic system

* The genomic nucleotide sequences and alignments to determine the percentage of

identity between the species are shown in Figs. 1–3.

After identifying these three strains, their oenological suitability was also

assessed by microvinification of sulphited must. To this end, grapes in an advanced

stage of maturation, late-harvested, with high sugar content, were

utilized. Interestingly, the result of various physicochemical analyses of the wines

produced with the commercial control strain and with the autochthonous

strains (CS45, GM50, and ORG55) showed statistically significant differences in

terms of total acidity, total polyphenol index (TPI), color intensity, volatile acidity (> 15

meq/L), and alcoholic content. Only color tonality, free SO2, and total SO2 did not

show statistically significant differences between the samples (Table 4). Following

complete fermentation, all the yeasts assayed appeared to have the ability to carry

out the fermentation process, producing high alcohol content levels (16.98 to 17.90

%, v/v), in agreement with the high initial Babo degree (26.01). Likewise, the density

(0.9775 to 0.9785) and pH (4.09 to 4.20) values obtained after the fermentation

process also appear to be consistent with the characteristics of the original must,

suggesting a normal fermentation process, with sugar consumption (low values of

residual sugars) and an increase of the alcohol content, occurred for each. Notably,

the volatile acidity increased in all fermentation trials, starting from 1.9 meq/L in the

must and increasing up to 18.83 meq/L in the final wine product. Our analysis also

49

indicated that the CS45 isolate was able to significantly influence the extraction of

total anthocyanins in relation to the other isolates; however, this result was not

reflected in the color intensity, which was higher for the wine produced from the

control yeast.

Table 4. Physicochemical characteristics of wines obtained through fermentation in

sulphited must with commercial and three autochthonous yeasts.

CT** CS45 GM50 ORG55 CV 1 (%)

Density 0.9775 b* 0.9785 a 0.9784 a 0.9780 ab 0.02 pH 4.17 ab 4.09 b 4.14 ab 4.20 a 0.87

Total Acidity (meq/L) 90.533 a 91.067 a 83.733 b 80.067 b 2.86

Volatile acidity (meq/L) 16.78 ab 18.83 a 16.08 b 17.48 ab 5.37

Alcohol (% v/v) 17.883 a 16.977 b 17.090 b 17.507 ab 1.35 Reducing Sugars (g/L) 4.11 b 8.52 a 3.963 b 5.143 b 17.27

IPT 34.93 a 24.90 b 27.43 ab 27.93 ab 10.39 Total Anthocyanins (mg/L) 36.601 b 76.565 a 43.068 ab 32.333 b 27.74

Color Intensity 1.1993 a 0.5147 b 0.7593 b 0.6730 b 15.16

Color tonality 1.5627 a 1.6620 a 1.6363 a 1.5317 a 9.54 Total SO2 (mg/L) 8.67 a 21.93 a 15.33 a 26.47 a 65.44

Free SO2 (mg/L) 4.83 a 4.5 a 4.67 a 4.80 a 19.81

* Different letters in the row indicate a significant difference at 5% probability, by the

Tukey test.

** CT: positive control (yeast Saccharomyces cerevisiae UCD522, Maurivin); CS45:

autochthonous isolate from Cabernet Sauvignon grapes; GM50: autochthonous

isolate from Merlot grapes; ORG55: autochthonous isolate from organically grown

Cabernet Sauvignon grapes.

1 Variation Coefficient.

The wines produced from pasteurized grape juice displayed distinct

characteristics depending on the strain employed. The density and levels of reducing

sugars were significantly different for all of the samples. For the remaining variables,

the autochthonous yeasts presented similar results as the positive control, with the

ORG55 being the strain that differed the most from the control strain (Table 5).

Interestingly, the total anthocyanins and index of total polyphenols variables were

significantly higher for those wines with the lowest amount of alcohol. This result is

likely caused by a lower interaction between the yeasts and the colour compounds,

when compared to the other isolates assayed. Moreover, the ORG55 and GM50

50

isolates yielded wines with lower values of color tonality, indicating that the intensity

of the red hues in the wine was higher than that of the yellow hues (brick colored).

Table 5. Physicochemical characteristics of wines obtained through fermentation in

pasteurized must with commercial and three autochthonous yeast strains.

SAMPLE CT ** CS45 GM50 ORG55 CV 1 (%)

Density 0.9955

d* 1.0452

c 1.0683

b 1.0849

a 0.32

pH 3.41 a 3.19 c 3.33 b 3.27 b 0.71

Total Acidity (meq/L) 108.63

b 146.93

a 101.53

bc 99.9 c 2.82

Volatile acidity (meq/L) 8.42 b 8.60 b 11.93 a 6.97 b 10.09

Alcohol (% v/v) 14.13 a 7.53 b 4.34 c 2.14 d 4.05

Reducing Sugars (g/L) 5.3 d 124.4 c 181.88

b 221.36

a 3.83

IPT 45.63 c 48.17 b 51.37 a 52.23 a 1.45

Total Anthocyanins (mg/L) 117.31

b 125.19

ab 129.33

ab 143.56

a 6.52

Color Intensity 1.0833

a 1.2300

a 1.2567

a 1.2580

a 12.41

Color Tonality 1.0572

a 1.0412

a 0.9884

b 0.9857

b 1.27

* Different Letters in the row indicate significant difference at 5% probability, by the

Tukey test.

** CT: positive control (yeast Saccharomyces cerevisiae UCD522, Maurivin); CS45:

autochthonous isolate from Cabernet Sauvignon grapes; GM50: autochthonous

isolate from Merlot grapes; ORG55: autochthonous isolate from organically grown

Cabernet Sauvignon grapes.

1 Variation Coefficient.

Discussion

It is widely known that winemaking with autochthonous yeasts can imbue

typicality to a wine or, at least, add a distinctive feature, as is the case for biodynamic

wines (Domizio et al., 2007; Fleet, 2003; Holt et al., 2013; Liang et al., 2013; Moreira

et al., 2011; Viana et al., 2008). Such unique characteristics are ideal for marketing

and retailing wines in a competitive global market. However, to achieve this,

vineyards must search for yeasts specific to their unique biome as the diversity and

51

variability of each species present on the surface of the grape is influenced by the

region’s climatic conditions and geographical location (Raspor et al., 2006) as well as

the integrity of the grapes (Ribéreau-Gayon et al., 2003). In the present study, 39

yeasts were isolated from Cabernet Sauvignon, Tannat, and Merlot grapes produced

in the new territory (since 1970) Campanha Gaúcha in order to evaluate their use in

the production of grapes and fine wines in Brazil. To assess the suitability of these

yeasts, we performed various morphological, technological, and molecular

characterizations. These data indicate that three autochthonous isolates (CS45,

GM50, and ORG55) have the highest oenological potential under non-

Saccharomyces yeast conditions.

Notably, sequencing of the ITS regions 1 and 2 of the rDNA of the CS45,

GM50, and ORG55 strains confirmed that they correspond to three non-

Saccharomyces yeast species (all with 97% identity): Lachancea

thermotolerans, Hanseniaspora uvarum, and Metschnikowia pulcherrima,

respectively. The three autochthonous strains were isolated from Cabernet

Sauvignon, Merlot, and organic Cabernet Sauvignon cultivars, respectively,

indicating that these yeasts could be exploited during the fermentation of these

particular varieties of wine. To more fully understand the potential unique qualities

these yeasts could add to a wine, we sought to investigate their performance during

the fermentation of sulphited must as well as pasteurized must.

It is important to note that the grapes used for sulphited must

microvinification were over-mature. When using these grapes, we observed typical

alcoholic fermentation levels used for red wine making, and attained high alcoholic

levels, from 16.977 to 17.883 % (v/v), for the CS45, GM50, ORG55, and control

yeasts. These findings suggest that the growth of Saccharomyces and other yeast

species can in fact tolerate high alcohol concentrations, a surprising result

considering that the M. pulcherrima, H. uvarum, and L. thermotolerans do not usually

tolerate alcohol production above 8 % (v/v) (Clemente-Jimenez et al., 2004; Comitini

et al., 2011). Indeed, this low alcohol tolerance was demonstrated during the

microvinification assay using pasteurized grape juice for all three species, whereby

we measured 14.13 % alcohol when using the control yeast and only 7.53 %, 4.34 %,

and 2.14 % alcohol for the CS45, GM50, and ORG55 strains, respectively. Moreover,

we were also particularly interested in the role of these three autochthonous yeasts in

wine color as their involvement in this process, particularly in red wine production, is

52

twofold. They influence the extraction of anthocyanins during maceration and

fermentation, according to their ability to produce alcohol, and can also have an

effect on the formation of more stable forms of anthocyanins during maturation and

aging. On the other hand, they can also promote anthocyanin degradation and

interact with pigments that result in colour loss (Ribéreau-Gayon et al., 2003). During

our analysis, we were surprised to find that the CS45 isolate was able to significantly

influence the extraction of total anthocyanins compared to the other isolates;

however, this result was not reflected in the color intensity, which was higher for the

wine produced by the control yeast. Further, contrary to published data (Ribéreau-

Gayon et al., 2003), the total anthocyanins and index of total polyphenols variables in

the wines produced from pasteurized must were significantly higher for those wines

with the lowest amount of alcohol. These results are supported by the findings

of Loira et al. (2015). Taken together, we believe that these species may be best

used to enhance wine produced in the region when utilized in mixed fermentations

with other Saccharomyces species, thus maximizing their benefits.

Importantly, this is not the first time these species have been detected or used

in oenology. For example, selected isolates of Lachancea (CONCERTOTM/ Viniflora®)

are already commercially available, which, according to Comitini et al. (2011) and

Gobbi et al. (2013), when inoculated with S. cerevisiae, a decrease in pH and volatile

acidity along with an increase in total acidity, glycerol, and 2- phenylethanol can be

achieved. The co-inoculation of a wild-type Lachancea strain with S. cerevisiae also

appears to enhance the fermentation kinetics, speeding up initiation of the

fermentation process while maintaining continuity and regularity. We believe this

phenomenon is likely responsible for the heightened fermentation observed when the

CS45 strain, as well as the other non-Saccharomyces yeasts studied, was inoculated

in the sulphited must. It is, therefore, possible that this Lachancea strain could have

distinct oenological behaviour, when used individually or as co-inoculum at the start

of fermentation, during the fermentation of grapes from different regions.

Similarly, the other two yeasts investigated also appear to be particularly

useful in mixed fermentations. For example, although the H. uvarum yeast species

isolated in this study (GM50) tolerates ethanol, it does not have the ability to

produce high enough levels of alcohol during fermentation when used on its own,

much like the other species. However, using H. uvarum in co-cultures has

been shown to lead to increased synthesis of some desirable compounds, such as

53

higher alcohols and esters (Medina et al., 2013; Moreira et al., 2005;) while also

increasing volatile acidity (Suárez-Lepe & Íñigo Leal, 2004). For the M. pulcherrima

(ORG55) species, we observed a low fermentation capacity during microvinification

of pasteurized must, which is supported by Clemente-Jimenez et al. (2004).

However, in co-culture with S. cerevisiae, this yeast is able to synergistically promote

the production of many aromatic compounds, including fatty acids, esters, and

terpenoids (Comitini et al., 2011; Sadoudi et al., 2012).

In conclusion, we isolated 39 autochthonous yeast strains from grapes

collected in the Campanha Gaúcha region of Brazil, 3 of which appear to have similar

characteristics as the Saccharomyces control strain. During fermentation of sulphited

must from overripe Cabernet Sauvignon grapes, these three autochthonous yeasts

were able to produce wines with high alcohol content, similar to what was observed

for the control strain. However, when using pasteurized must, low alcohol levels were

observed. Overall, our results indicate that these three isolated and characterized

autochthonous strains have oenological potential and would be best used in co-

cultivation fermentation processes with other Saccharomyces species in order to

exploit their full potential. This study represents a significant step in advancing wine

production in the Campanha Gaúcha region, acting as a foundation for the continued

investigation of progressive oenological manipulation. Additional studies are

necessary to determine additional applications for these strains and further evaluate

their distinctive effects on wine produced in the area.

Acknowledgements

We thank the Guatambu Estância do Vinho and the Universidade Federal do

Pampa for their financial support (grant number 4.015.13).

54

References

Álvarez-Pérez, J.M., Campo, E., San-Juan, F., Coque, J.J., Ferreira, V., Hernández-

Orte, P., 2012. Sensory and chemical characterisation of the aroma of Prieto

Picudo rosé wines: the differential role of autochthonous yeast strains on

aroma profiles. Food Chem. 133, 284–292.

Barata, A., Malfeito-Ferreira, M., Loureiro, V., 2012. The microbial ecology of wine

grape berries. Int. J. Food Microbiol. 153, 243–259.

Callejon, R.M., Clavijo, A., Ortigueira, P., Troncoso, A.M., Paneque, P., Morales,

M.L., 2010. Volatile and sensory profile of organic red wines produced by

different selected autochthonous and commercial Saccharomyces cerevisiae

strains. Anal. Chim. Acta. 660, 68–75.

Capece, A., Romaniello, R., Siesto, G., Romano, P., 2012. Diversity of

Saccharomyces cerevisiae yeasts associated to spontaneously fermenting

grapes from an Italian “heroic vine-growing area”. Food Microbiol. 31, 159–

166.

Chavan, P., Mane, S., Kulkarni, G., Shaikh, S., Ghormade, V., Nerkar, D.P.,

Shouche, Y., Deshpande, M.V., 2009. Natural yeast flora of different varieties

of grapes used for wine making in India. Food Microbiol. 26, 801–808.

Clemente-Jimenez, J.M., Mingorance-Cazorla, L., Martínez-Rodríguez, S., Las

Heras-Vázquez, F.J., Rodríguez-Vico, F., 2004. Molecular characterization

and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous

fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiol. 21, 149–155.

Comitini, F., Gobbi, M., Domizio, P., Romani, C., Lencioni, L., Mannazzu, I., Ciani,

M., 2011. Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter

fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Food Microbiol. 28, 873–882.

55

Contreras, A., Hidalgo, C., Schmidt, S., Henschke, P.A., Curtin, C., Varela, C., 2015.

The application of non-Saccharomyces yeast in fermentations with limited

aeration as a strategy for the production of wine with reduced alcohol content.

Int. J. Food Microbiol. 205, 7–15.

Domizio, P., Lencioni, L., Ciani, M., Di Blasi, S., Pontremolesi, C., Sabatelli, M.P.,

2007. Spontaneous and inoculated yeast populations dynamics and their

effect on organoleptic characters of Vinsanto wine under different process

conditions. Int. J. Food Microbiol. 115, 281–289.

Fleet, G.H., 2003. Yeast interactions and wine flavour. Int. J. Food Microbiol. 86, 11–

22.

França, L.T., Carrilho, E., Kist, T.B., 2002. A review of DNA sequencing techniques.

Q. Rev. Biophys. 35, 169–200.

Gobbi, M., Comitini, F., Domizio, P., Romani, C., Lencioni, L., Mannazzu, I., Ciani,

M., 2013. Lachancea thermotolerans and Saccharomyces cerevisiae in

simultaneous and sequential co-fermentation: a strategy to enhance acidity

and improve the overall quality of wine. Food Microbiol. 33, 271–281.

Guimarães, T.M., Moriel, D.G., Machado, I.P., Fadel Picheth, C.M.T., Bonfim, T.M.B.,

2006. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae strains of

winery interest. Rev. Bras. Cienc. Farm. 42, 119–126.

Holt, H., Cozzolino, D., McCarthy, J., Abrahamse, C., Holt, S., Solomon, M., Smith,

P., Chambers, P.J., Curtin, C., 2013. Influence of yeast strain on Shiraz wine

quality indicators. Int. J. Food Microbiol. 165, 302–311.

Liang, H.Y., Chen, J.Y., Reeves, M., Han, B.Z., 2013. Aromatic and sensorial profiles

of young Cabernet Sauvignon wines fermented by different Chinese

autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains. Food Res. Int. 51, 855–

865.

56

Loira, I., Vejarano, R., Morata, A., Ricardo-da-Silva, J.M., Laureano, O., González,

M.C., Suárez-Lepe, J.A., 2013. Effect of Saccharomyces strains on the quality

of red wines aged on lees. Food Chem. 139, 1044–1051.

Loira, I., Morata, A., Comuzzo, P., Comuzzo, P., Callejo, M.J., González, C.,

Calderón, F., Suárez-Lepe, J.A., 2015. Use of Schizosaccharomyces pombe

and Torulaspora delbrueckii strains in mixed and sequential fermentations to

improve red wine sensory quality. Food Res. Int. In Press.

doi:10.1016/j.foodres.2015.06.030

Medina, K., Boido, E., Fariña, L., Gioia, O., Gomez, M.E., Barquet, M., Gaggero, C.,

Dellacassa, E., Carrau, F., 2013. Increased flavour diversity of Chardonnay

wines by spontaneous fermentation and co-fermentation with Hanseniaspora

vineae. Food Chem. 141, 2513–2521.

Molina, A.M., Guadalupe, V., Varela, C., Swiegers, J.H., Pretorius, I.S., Agosin, E.,

2009. Differential synthesis of fermentative aroma compounds of two related

commercial wine yeast strains. Food Chem. 117 (2), 189–195.

Moreira, N., Mendes, F., Hogg, T., Vasconcelos, I., 2005. Alcohols, esters and heavy

sulphur compounds production by pure and mixed cultures of apiculate wine

yeasts. Int. J. Food Microbiol. 103 (3), 285–294.

Moreira, N., Pina, C., Mendes, F., Couto, J.A., Hogg, T., Vasconcelos, I., 2011.

Volatile compounds contribution of Hanseniaspora guilliermondii and

Hanseniaspora uvarum during red wine vinifications. Food Control. 22, 662–

667.

Raspor, P., Milek, D.M., Polanc, J., Mozina, S.S., Cadez, N., 2006. Yeasts isolated

from three varieties of grapes cultivated in different locations of the Dolenjska

vine-growing region, Slovenia. Int. J. Food Microbiol. 109, 97–102.

Ribéreau-Gayon, P., Dubordieu, D., Donèche, B., Lonvaud, A., 2003. Tratado de

Enologia: Microbiologia del vino Vinificaciones. Mundi Prensa, Madrid. 655p.

57

Sadoudi, M., Tourdot-Maréchal, R., Rousseaux, S., Steyer, D., Gallardo-Chacón,

J.J., Ballester, J., Vichi, S., Guérin-Schneider, R., Caixach, J., Alexandre, H.,

2012. Yeast-yeast interactions revealed by aromatic profile analysis of

Sauvignon Blanc wine fermented by single or co-culture of non-

Saccharomyces and Saccharomyces yeasts. Food Microbiol. 32, 243–253.

Scacco, A., Oliva, D., Di Maio, S., Polizzotto, G., Genna, G., Tripodi, G., Lanza, C.M.,

Verzera, A., 2012. Indigenous Saccharomyces cerevisiae strains and their

influence on the quality of Cataratto, Inzolia and Grillo white wines. Food Res.

Int. 46, 1–9.

Settanni, L., Sannino, C., Francesca, N., Guarcello, R., Moschetti, G., 2012. Yeast

ecology of vineyards within Marsala wine area (western Sicily) in two

consecutive vintages and selection of autochthonous Saccharomyces

cerevisiae strains. J. Biosci. Bioeng. 114, 606–614.

Suárez-Lepe, J.A., Íñigo Leal, B., 2004. Microbiología Enológica: Fundamentos de

Vinificación, third ed. Ediciones Mundi Prensa: Madrid. 716 p.

Synos, K., Reynolds, A.G., Bowen, A.J., 2015. Effect of yeast strain on aroma

compounds in Cabernet franc icewines. LWT - Food Sci. Technol. 64, 227–

235.

Tristezza, M., Vetrano, C., Bleve, G., Spano, G., Capozzi, V., Logrieco, A., Mita, G.,

Grieco, F., 2013. Biodiversity and safety aspects of yeast strains characterized

from vineyards and spontaneous fermentations in the Apulia Region, Italy.

Food Microbiol. 36, 335–342.

Viana, F., Gil, J.V., Genovés, S., Vallés, S., Manzanares, P., 2008. Rational selection

of non-Saccharomyces wine yeasts for mixed starters based on ester

formation and enological traits. Food Microbiol. 25, 778–785.

58

Figure Legends

Fig. 1. Sequence alignments between the CS45 strain and Lachancea

thermotolerans.

Fig. 2. Sequence alignments between the GM50 strain and Hanseniaspora uvarum.

Fig. 3. Sequence alignments between the ORG55 strain and Metschnikowia

pulcherrima.

59

60

5 DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS

A busca por elementos distintivos constitui em fator importante para a

valorização e para o marketing dos vinhos. Nesse sentido, torna-se importante a

utilização de distintas cepas de micro-organismos que possam auxiliar o processo

fermentativo de mosto de uvas para diferenciação qualitativa dos vinhos. Nesse

sentido, a região da Campanha do RS, já estabelecida e consolidada como polo

vitivinícola, possui elementos diferenciais para o processo, entre eles, a microbiota

autóctone, que poderá, assim que bem caracterizada e registrada, ser incluída no

processo enológico. A prospecção e o estudo de leveduras nativas, incluindo

gêneros Saccharomyces e não-Saccharomyces, assim como suas interações nos

distintos processos enológicos têm sido alvo de constantes pesquisas, sendo a

busca por produtos sustentáveis e de características únicas o fomento para este

tipo de estudo.

A vitivinicultura na região da Campanha do Rio Grande do Sul iniciou na

década de 70, entretanto somente nos últimos anos foi consolidada a partir do

reconhecimento de seus produtos. É nesse sentido que, pela necessidade de

informações e pesquisas na área da enologia nessa região, se tem perspectivas de

continuidade do trabalho, avaliando a utilização dessas espécies na elaboração de

vinhos tintos e brancos, avaliando a necessidade da inoculação de espécies do tipo

Saccharomyces e a produção dos compostos voláteis, com resultados importantes

para a consagração da região frente às melhores regiões vinícolas mundiais.

A principal contribuição dessa tese foi prospectar leveduras com potencial

enológico e, nesse caso, três leveduras não-Saccharomyces foram isoladas e

identificadas. Os ensaios preliminares, tanto no mosto de uva sulfitado quanto no

mosto pasteurizado, mostraram o potencial dessas leveduras. No entanto, fica claro

que, novos ensaios, com maiores volumes, e avaliando maior numero de variáveis

(químicas e sensoriais), serão necessários. Também, na medida em que esse

recurso genético for validado como útil à enologia, a devida tramitação junto à

Comissão Nacional de Biodiversidade deverá ser dada.

61

6 CONCLUSÃO GERAL

As três espécies de leveduras estudadas (L. thermotolerans; H. uvarum; M.

pulcherrima) apresentaram aptidão enológica, quando avaliados os aspectos de

capacidade fermentativa, tolerância a diferentes concentrações de etanol, tolerância

a diferentes temperaturas, tolerância ao estresse osmótico e etanólico e quanto a

produção de sulfeto de hidrogênio (H2S). Cabe salientar que, essas espécies

apresentam comportamentos distintos quando avaliadas individualmente, como no

caso deste estudo, ou em associação com outras leveduras, tanto em fermentações

espontâneas como naquelas conduzidas com fermentos selecionados.

Em estudos realizados com essas espécies individualmente ou na utilização

das mesmas como co-inoculos, foi verificado a produção de compostos voláteis que

conferem complexidade aromática aos vinhos, resultado que não foi observado na

maioria dos experimentos onde a fermentação foi conduzida de forma espontânea.

Neste estudo não foram analisados os compostos aromáticos, pois os vinhos obtidos

pelas duas microvinificações utilizaram para cada uma matérias-primas (mosto de

uva e suco pasteurizado comercial) distintas.

Assim sendo, as leveduras acima podem ser caracterizadas como úteis na

elaboração de vinhos, desde que sejam realizados experimentos com avaliação dos

compostos aromáticos e utilizando-as em co- inoculo com leveduras do tipo

Saccharomyces.

62

7 REFERÊNCIAS

ÁLVAREZ-PÉREZ, J. M., CAMPO, E., SAN-JUAN, F., COQUE, J. J. R., FERREIRA, V., HERNÁNDEZ-ORTE, P. (2012). Sensory and chemical characterization of the aroma of Prieto Picudo rosé wines: The differential role of autochthonous yeast strains on aroma profiles. Food Chemistry, 133, 284-292.

ANCHORENA-MATIENZO, P. (2002) Re-identificação e caracterização genética da levedura IZ- 987 utilizando marcadores moleculares. Dissertação – Programa de pós–graduação em Ciência e Tecnologia de Alimento, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba.

ANDORRÀ, I., LANDI, S., MAS, A., GUILLAMÓN, J.M., ESTEVE-ZARZOSO, B. (2008). Effect of oenological practices on microbial populations using culture-independent techniques. Food Microbiology, 25, 849–856.

BARATA, A., SEBORRO, F., BELLOCH, C., MALFEITO-FERREIRA, M., LOUREIRO, V. (2008). Ascomycetous yeast species recovered from grapes damaged by honeydew and sour rot. Journal of Applied Microbiology, 104, 1182–1191.

BARATA, A., MALFEITO-FERREIRA, M., LOUREIRO, V. (2012). The microbial ecology of wine grape berries. International Journal of food Microbiology, 153, 243-259.

BENGTSSON, J., AHNSTRÖM, J., WEIBULL, A.C. (2005). The effects of organic agriculture on biodiversity and abundance: a meta-analysis. Journal of Applied Ecology, 42, 261–269. doi:10.1111/j.1365-2664.2005.01005.x.

BRASIL. Ministério da Integração Nacional. Proposta de reestruturação do Programa de Desenvolvimento da faixa de Fronteira: bases de uma política integrada de desenvolvimento regional para a faixa de fronteira. Brasília: Ministério da Integração Nacional, 2005.

CALLEJON, R. M., CLAVIJO, A., ORTIGUEIRA, P., TRONCOSO, A. M. , PANEQUE, P., MORALES, M. L. (2010). Volatile and sensory profile of organic red wines produced by different selected autochthonous and commercial Saccharomyces cerevisiae strains. Analytica Chimica Acta, 660, 68–75.

CAMARGO, U. A., TONIETTO, J., HOFFMANN, A. (2011). Progressos na viticultura brasileira. Revista Brasileira de Fruticultura, 33, http://dx.doi.org/10.1590/S0100-29452011000500017.

CAPECE, A., ROMANIELLO, G., SIESTO, G. ROMANO, P. (2012). Diversity of Saccharomyces cerevisiae yeasts associated to spontaneously fermenting grapes from an italian “heroic vine-growing area”. Food Microbiology, 31, 159-166.

CHAVAN, P., MANE, S., KULKARNI, G., SHAIKH, S., GHORMADE, V., NERKAR, D. P., SHOUCHE, Y., DESHPANDE, M. V. (2009). Natural yeast flora of different varieties of grapes used for wine making in India. Food Microbiology, 26, 801-808.

CLEMENTE-JIMENEZ, J. M., MINGORANCE-CAZORLA, L., MARTÍNEZ-RODRÍGUEZ, S., LAS HERAS-VÁZQUEZ, F. X., RODRÍGUEZ-VICO, F.

63

(2004). Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology, 21, 149-155.

COMITINI, F., GOBBI, M., DOMIZIO, P., ROMANI, C., LENCIONI, L., MANNAZZU, I.,CIANI, M. (2011). Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Food Microbiology, 28, 873-882.

CONTRERAS, A., HIDALGO, C., SCHMIDT, S., HENSCHKE, A., CURTIN, C., VARELA, C. (2015). The application of non-Saccharomyces yeast in fermentations with limited aeration as a strategy for the production of wine with reduced alcohol content. International Journal of Food Microbiology, 205, 7–15.

DAUDT, C.E. et al. (1973) Possibilidades de produção de Vitis vinifera em Uruguaiana e vizinhanças. Revista Centro de Ciências Rurais, v.3, n.1-4, p.163-163.

DOMIZIO, P., LENCIONI, L., CIANI, M., DI BLASI, S., PONTREMOLESI, C., SABATELLI, M. P. (2007). Spontaneous and inoculated yeast populations dynamics and their effect on organoleptic characters of Vinsanto wine under different process conditions. International Journal of Food Microbiology, 115, 281-289.

DOMIZIO, P., LIU, Y., BISSON, L.F., BARILE, D. (2014). Use of non-Saccharomyces wine yeasts as novel sources of mannoproteins in wine. Food Microbiology, 43, 5-15.

ESTEVE-ZARZOSO, B., BELLOCH, C., URUBURU, F., QUEROL, A. (1999). Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. International Journal of Systematic Bacteriology, 49, 329-337.

FERNÁNDEZ-ESPINAR, M.T., LLOPIS, S., QUEROL, A., BARRIO, E. (2011). Molecular identification and characterization of wine yeasts, In: Carrascosa, A.V., Muñoz, R., González, R. (Eds.), Molecular Wine Microbiology, 1st ed. Elsevier, Academic Press, London, UK, 111–141.

FLEET, G. H. (2003). Yeast interactions and wine flavour. International Journal of Food Microbiology, 86, 11-12.

FRANÇA, L.T.C., CARRILHO, E., KIST, T. B. L. (2002). A review of DNA sequencing techniques. Quarterly Reviews of Biophysics, 35, 2, 169-200.

GENNARI, A. J. (2014). A letter by the Regional Editor for South America: From varietals to terroir. Wine Economics and Policy, 3, 69–70.

GOBBI, M., COMITINI, F., DOMIZIO, P., ROMANI, C., LENCIONI, L., MANNAZZU, I., CIANI, M. (2013). Lachancea thermotolerans and Saccharomyces cerevisiae in simultaneous and sequential co-fermentation: A strategy to enhance acidity and improve the overall quality of wine. Food Microbiology, 33, 271-281.

GRUZ, A.P. G., SOUZA, C. G. S., TORRES, A. G., FREITAS, S. P., CABRAL, L. M. C. (2013). Recuperação de compostos bioativos a partir do bagaço de uva. Revista Brasileira de Fruticultura, 35 (4), 1147-1157.

64

GUILLAMÓN, J.M., SABATÉ, J., BARRIO, E., CANO, J., QUEROL, A. (1998). Rapid identification of wine yeast species based on RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region. Archives of Microbiology, 169, 387–392.

GUIMARÃES, T. M., MORIEL, D. G., MACHADO, I. M. P., PICHETH, C. M. T. F., BONFIM, T. M. B. (2006). Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae strains of winery interest. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 42, 119-126.

HOLT, H., COZZOLINO, D., MCCARTHY, J., ABRAHAMSE, C., HOLT, S., SOLOMON, M., SMITH, P., CHAMBERS, P. J., CURTIN, C. (2013). Influence of yeast strain on Shiraz wine quality indicators. Internacional Journal of Food Microbiology, 163, 302-311.

HONG, Y.A., PARK, H.D. (2013). Role of non-Saccharomyces yeasts in Korean wines produced from Campbell Early grapes: potential use of Hanseniaspora uvarum as a starter culture. Food Microbiology, 34 (1), 207-214.

IBRAVIN. Instituto Brasileiro do vinho. Acesso em 15 de julho de 2015. Disponível em: http://www.ibravin.org.br/

ILIEVA, F., VELIČOVSKA, S.K., DIMOVSKA, V., SPASOV, H., The impact of some wine-making practices on the quality of Vranec red wines from Macedonia produced by the newly-selected local strain “F-78”. Food Chemistry (2015), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.08.088

INMET. Instituto Nacional de Meteorologia. http://www.inmet.gov.br/portal/index.php?r=home2/index. Acesso em 10 de Julho de 2015.

JAMES, S.A., CAI, J., ROBERTS, I.N., COLLINS, M.D. (1997). A phylogenetic analysis of the genus saccharomyces based on 18S rRNA gene sequences: description of saccharomyces kunashirensis sp. nov. and saccharomyces martiniae sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 47, 453–460.

JIMÉNEZ-MARTÍ, E., GOMAR-ALBA, M., PALACIOS, A., ORTIZ-JULIEN, A., DEL OLMO, M.L. (2011). Towards an understanding of the adaptation of wine yeasts to must: relevance of the osmotic stress response. Applied Microbiology and Biotechnolology, 89 (5), 1551-1561.

JOSEPA, S.; GUILLAMON, J.M.; CANO, J. (2000). PCR differentiation of Saccharomyces cerevisiae from Saccharomyces bayanus/ Saccharomyces pastorianus using specific primers. FEMS Microbiology Letters, 193, 255-259.

KURTZMAN, C.P., ROBNETT, C.J. (1998). Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek, 73, 331–371.

KURTZMAN, C. P., FELL, J. W., BOEKHOUT, T., ROBERT, V. (2011). Methods for isolation maintenance, classification and identification of yeast. In: KREGER-VAN RIJ, N. S. W. (Ed). The yeasts: a taxonomy study. Amsterdam: Elsevier Science, p.88-110.

LIANG, H. Y., CHEN, J. Y., REEVES, M., HAN, B. Z. (2013). Aromatic and sensorial profiles of young Cabernet Sauvignon wines fermented by different Chinese

65

autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains. Food Research International, 51, 855-865.

LOIRA, I., VEJARANO, R., BAÑUELOS, M. A., MORATA, A, TESFAYE, W., UTHURRY, C., VILLA, A., CINTORA, I., SUÁREZ-LEPE, J. A. (2013). Effect of Saccharomyces strains on the quality of red wines aged on lees. LWT – Food Science and Technology, 59, 915-922.

LOIRA, I., MORATA, A., COMUZZO, P., CALLEJO, M. J., GONZÁLEZ, C., CALDERÓN, F., SUÁREZ-LEPE, J. A. (2015). Use of Schizosaccharomyces pombe and Torulaspora delbrueckii strains in mixed and sequential fermentations to improve red wine sensory quality. Food Research International, 76, 325–333.

LOPES, T. J., XAVIER, M. F., QUADRI, M. G. N., QUADRI, M. B. (2007). Antocianinas: uma breve revisão das características estruturais e da estabilidade. Revista Brasileira de Agrociência, 13 (3), 291-297.

MEDINA, K., BOIDO, E., DELLACASSA, E., CARRAU, F. (2012). Growth of non-Saccharomyces yeasts affects nutrient availability for Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation. International Journal of Food Microbiology, 157 (2), 245-250.

MEDINA, K., BOIDO, E., FARINA, L., GIOIA, O., GOMEZ, M.E., BARQUET, M., GAGGERO, C., DELLACASSA, E., CARRAU, F. (2013). Increased flavour diversity of Chardonnay wines by spontaneous fermentation and co-fermentation with Hanseniaspora vineae. Food Chemistry, 141 (3), 2513-2521.

MELLO, L. M. R. (2013). Vitivinicultura Brasileira: Panorama 2012. Comunicado Técnico 137. Embrapa Uva e Vinho: Bento Gonçalves.

MELLO, L. M. R. (2015). Panorama da Vitivinicultura Brasileira 2014. Revista Campo e Negócios. Acesso em: 15 de julho de 2015. Disponível em: http://www.revistacampoenegocios.com.br/panorama-da-vitivinicultura-brasileira-2014/

MOLINA, A. M., GUADALUPE, V., VARELA, C., SWIEGERS, J. H., PRETORIUS, I. S., AGOSIN, E. (2009). Differential synthesis of fermentative aroma compounds of two related commercial wine yeast strains. Food Chemistry, 117 (2), 189-195.

MOREIRA. N., PINA, C., MENDES, F., COUTO, J. A., HOGG, T., VASCONCELOS, I. (2011). Volatile compounds contribution of Hanseniaspora guilliermondii and Hanseniaspora uvarum during red wine vinifications. Food Control, 22, 662-667.

MUYZER, G., DE WAAL, E.C., UITTERLINDEN, A.G. (1993). Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 59, 695–700.

ORTIZ, M. J., BARRAJÓN, N., BAFFI, M. A., ARÉVALO-VILLENA, M., BRIONES, A. (2013). Spontaneous must fermentation: Identification and biotechnological properties of wine yeasts. LWT - Food Science and Technology, 50, 371-377.

QUEROL, A., BELLOCH, C. (2003). Molecular evolution in yeast of biotechnological interest. International Microbiology, 6, 201-205.

66

QUEROL, A., FERNÁNDEZ-ESPINAR, M. T., DEL OLMO, M., BARRIOC, E. (2003). Adaptive evolution of wine yeast. International Journal of Food Microbiology, 86, 3-10.

RATHMANN, R., HOFF, D. N., SANTOS, O. I. B., PADULA, A. D. (2008). Diversificação produtiva e as possibilidades de desenvolvimento: um estudo da fruticultura na região da Campanha no RS. Revista de Economia e Sociologia Rural. http://dx.doi.org/10.1590/S0103-2003200800020000

REIS, V. R. (2011). Caracterização de linhagens selvagens de Saccharomyces cerevisiae isoladas de processos fermentativos para a produção de etanol. Dissertação – Programa de pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba.

RENOUF, V., LONVAUD-FUNEL, A. (2007). Development of an enrichment medium to detect Dekkera/Brettanomyces bruxellensis, a spoilage wine yeast, on the surface of grape berries. Microbiological Research, 162, 154–167.

RENAULT, P., MIOT-SERTIER, C., MARULLO, P., HERNÁNDEZ-ORTE, P., LAGARRIGUE, L., LONVAUD-FUNEL, A., BELY, M. (2009). Genetic characterization and phenotypic variability in Torulaspora delbrueckii species: Potential applications in the wine industry. International Journal of Food Microbiology, 134, 201–210.

RIBÉREAU- GAYON, P., DUBORDIEU, D., DONÈCHE, B., LONVAUD, A. (2003). Tratado de Enologia: Microbiologia del vino, Vinificaciones. Mundi Prensa: Madrid. 655p.

RIZZON, L. A. (2010). Metodologia para análise de vinho. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica. 120 p.

RODRÍGUEZ, M.E., LOPES, C.A., BARBAGELATA, R.J., BARDA, N.B., CABALLERO, A.C. (2010). Influence of Candida pulcherrima Patagonian strain on alcoholic fermentation behaviour and wine aroma. International Journal of Food Microbiology, 138 (1-2), 19-25

SADOUDI, M., TOURDOT-MARÉCHAL, R., ROUSSEAUX, S., STEYER, D., GALLARDO-CHACÓN, J. J., BALLESTER, J., VICHI, S., GUÉRIN-SCHNEIDER, R., CAIXACH, J., E , ALEXANDRE, H. (2012). Yeast-yeast interactions revealed by aromatic profile analysis of Sauvignon Blanc wine fermented by single or co-culture of non-Saccharomyces and Saccharomyces yeasts. Food Microbiology, 32, 243-253.

SAINT-GES, V., BÉLIS-BERGOUIGNAN, M. C. (2009). Ways of reducing pesticides use in Bordeaux vineyards. Journal of Cleaner Production, 17(18), 1644–1653

SETTANI, L., SANNINO, C., FRANCESCA, N., GUARCELLO, R., MOSCHETTI, G. (2012). Yeast ecology of vineyeards within Marsala wine area (western Sicily) in two consecutive vintages and selection of autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains. Journal of Bioscience and Bioengineering, 114, 606-614.

SCACCO, A., OLIVA, D., DI MAIO, S., POLIZZOTTO, G., GENNA, G., TRIPODI, G.; LANZA, C. M., VERZERA, A. (2012). Indigenous Saccharomyces cerevisiae strains and their influence on the quality of Cataratto, Inzolia and Grillo white wines. Food Research International, 46, 1-9.

67

SUÁREZ-LEPE, J. A., ÍÑIGO LEAL, B. (2004). Microbiología Enológica: Fundamentos de vinificación. Mundi Prensa: Madrid. 3ª Ed. 716p.

SYNOS, K., REYNOLDS, A. G., BOWEN, A. J. (2015). Effect of yeast strain on aroma compounds in Cabernet franc icewines. LWT - Food Science and Technology, 64, 227-235.

TOFALO, R.; PERPETUINI, G.; FASOLI, G.; SCHIRONE, M.; CORSETTI, A.; SUZZI, G. (2014). Biodiversity study of wine yeasts belonging to the “terroir” of Montepulciano d’Abruzzo “Colline Teramane” reveled Saccharomyces cerevisiae strains exhibiting atypical and unique 5.8S-ITS restriction patterns. Food Microbiology, 39, 7-12.

TONIETTO, J., RUIZ, V. S., GÓMEZ-MIGUEL, V. D. (2012). Clima, Zonificación y Tipicidad del vino en regiones vitivinícolas Iberoamericanas. Madrid: CYTED. 411p.

TRISTEZZA, M., VETRANO, C., BLEVE, G., SPANO, G., CAPOZZI, V., LOGRIECO, A., MITA, G., GRIECO, F. (2013). Biodiversity and safety aspects of yeast strains characterized from vineyards and spontaneous fermentations in the Apulia Region, Italy. Food Microbiology, 36, 335-342.

VIANA, F., GIL, J. V., GENOVÉS, S., VALLÉS, S., MANZANARES, P. (2008). Rational selection of non-Saccharomyces wine yeasts for mixed starters based on ester formation and enological traits. Food Microbiology, 25, 778– 785.

WHITENER, M. E. B., CARLIN, S., JACOBSON, D., WEIGHILL, D., DIVOL, B., CONTERNO, L., DU TOIT, M., VRHOVSEK, U. (2015). Early fermentation volatile metabolite profile of non-Saccharomyces yeasts in red and white grape must: A targeted approach. LWT - Food Science and Technology, 64, 412-422.

XUFRE, A.; SIMÕES, F.; GÍRIO, F.; CLEMENTE, A.; AMARAL-COLLAÇO, M.T. (2000). Use of RAPD analysis for differentiation among six enological Saccharomyces spp. Strains. Food Technology and Biotechnology, 38, 53-58.

ZOTT, K.; CLAISSE, O.; LUCAS, P.; COULON, J.; LONVAUD-FUNEL, A.; MASNEUF-POMAREDE, I. (2010). Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR. Food Microbiology, 27, 559-567.

68

7 ANEXOS

Anexo A – Resumos aprovados para apresentação e publicação nos anais

do XV Congresso Latino-Americano de Viticultura e Enologia

69

Anexo B – Arquivo de submissão do artigo “ Prospecção microbiológica na

região da Campanha do Rio Grande do Sul-Brasil revela leveduras

autóctones não-Saccharomyces com potencial enológico”, à revista

International Journal Food Microbiology.

70

Anexo C – Sequências nucleotídicas genômicas e respectivos alinhamentos

para a geração dos percentuais de identidade entre as espécies.

Lachancea Thermotolerans

CS45 10 CCTACCCTGATTTGAGGTC-AACTTTATGAATACTGTTTGCCAGACTGTCTGTACTTTCA 68

L. thermotolerans 1137580 CCTA-CCTGATTTGAGGTCAAACTTTATGAATACTGTTTGCCAGACTGTCTGTACTTTCA 1137638

CS45 69 GTAAAAGCCTTTAAAACGCCTACTAACGCCACTACGAGTTGGTAAAACCTAATACGCAGA 128

L. thermotolerans 1137639 GTAAAAGCCTTTAAAACGCCTACTAACGCCACTACGAGTTGGTAAAACCTAATACGCAGA 1137698

CS45 129 GTATCAGCGGACTGGACTAAAACCTCAGTCAGCAACAGCCAGATGGCCAGCATTTTCAAG 188

L. thermotolerans 1137699 GTATCAGCGGACTGGACTAAAACCTCAGTCAGCAACAGCCAGATGGCCAGCATTTTCAAG 1137758

CS45 189 TTAACCCAGAAAGAGTACCACTCACTACCAAACCCGAGGGTTTGAGAAGGAAATGACGCT 248

L. thermotolerans 1137759 TTAACCCAGAAAGAGTACCACTCACTACCAAACCCGAGGGTTTGAGAAGGAAATGACGCT 1137818

CS45 249 CAAACAGGCATGCCCCCTGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGAT 308

L. thermotolerans 1137819 CAAACAGGCATGCCCCCTGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGAT 1137878

CS45 309 TCACGAATATCTGCAATTCACAATACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGA 368

L. thermotolerans 1137879 TCACGAATATCTGCAATTCACAATACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGA 1137938

CS45 369 GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAttttttttCTAAAATGAAAAATAATT 428

L. thermotolerans 1137939 GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATATTTTTTTTCTAAAATGAAAAATAATT 1137998

CS45 429 GACAATGTTTAAAATACAATAGTTGTTTGTGTTTGTAACCCTTGGGCCGTAAAGCCCAAA 488

L. thermotolerans 1137999 GACAGTGTTTAAAATACAATAGTTGTTTGTGTTTGTAACCCTTGGGCCGTAAAGCCCAAA 1138058

CS45 489 GAAGAAGCGTTGTAAAATAAATTACTCCACAGTGTGTGTGTAGAGAGACAGTCGTTAACA 548

L. thermotolerans 1138059 GAAGAAGCGTTGTAAAATAAATTACTCCACAGTGTGTGTGTAGAGAGACAGTCGTTAACA 1138118

CS45 549 GAAAGCATCATCGGCCGCGCAATCAAGCGCAGGCTTTCTGAACTTTCCCGGCTGCTCTAA 608

L. thermotolerans 1138119 GAAAGCATCATCGGCCGCGCAATCAAGCGCAGGC-TTCTGAACTTTCCCGGCTGCTCTAA 1138177

CS45 609 CAAAATTCTTTWAATGATCCTTCCRCARGGTTYCACYCTACGGAA 653

L. thermotolerans 1138178 CAAAATTCTTT-AATGATCCTTCCGCA-GGTT-CAC-CTACGGAA 1138218

Hanseniaspora uvarum

GM50 1 TTGTTTAGATCTTTTACAATAATGTGTATCTTTATTGGAGATGYKYGCTTAATTGCGCTG 60

H.uvarum 36 TTGTTTAGATCTTTTACAATAATGTGTATCTTTATTGGAGATGTGCGCTTAATTGCGCTG 95

GM50 61 CTTCATTAGAGTGTCGCAGTAGAAGYWKTCTTGCTTGAATCTCAGTCAACGTTTACACAC 120

H.uvarum 96 CTTCATTAGAGTGTCGCAGTAGAAGTAGTCTTGCTTGAATCTCAGTCAACGTTTACACAC 155

GM50 121 ATTGGAGTTTTTTACTTTAATTTAATTCTTTCTGCTTTGAATCYAAAGGTTCAAGGcaaa 180

H.uvarum 156 ATTGGAGTTTTTTACTTTAATTTAATTCTTTCTGCTTTGAATCGAAAGGTTCAAGGCAAA 215

GM50 181 aaacaaacacaaacaattttattttattatwattttttaaactaaaccaaaattcctaac 240

H.uvarum 216 AAACAAACACAAACAATTTTATTTTATTATAATTTTTTAAACTAAACCAAAATTCCTAAC 275

GM50 241 ggaaattttaaaataatwtaaaacTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGA 300

H.uvarum 276 GGAAATTTTAAAATAATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGA 335

GM50 301 AGAACGTAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATACTCGTGAATCATTGAATTT 360

H.uvarum 336 AGAACGTAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATACTCGTGAATCATTGAATTT 395

GM50 361 TTGAACGCACATTGCGCCCTTGAGCATTCTCAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCC 420

H.uvarum 396 TTGAACGCACATTGCGCCCTTGAGCATTCTCAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCC 455

GM50 421 TTCTCAAAAGATAAttttttattttttGGTTGTGGGCGATACTCAGGGTTAGCTTGAAAT 480

H.uvarum 456 TTCTCAAAAGATAATTTTTTATTTTTTGGTTGTGGGCGATACTCAGGGTTAGCTTGAAAT 515

GM50 481 TGGAGACTGTTTCAGTCTTTTTTAATTCAACACTTAGCTTCTTTGGAGACGCTGTTCTCG 540

H.uvarum 516 TGGAGACTGTTTCAGTCTTTTTTAATTCAACACTTAGCTTCTTTGGAGACGCTGTTCTCG 575

GM50 541 CTGTGATGTATTTATGGATTTATTCGTTTTACTTTACAAGGGAAATGGTAATGTACCTTA 600

H.uvarum 576 CTGTGATGTATTTATGGATTTATTCGTTTTACTTTACAAGGGAAATGGTAATGTACCTTA 635

GM50 601 GGCAAAGGGTTGCTTTTAATATTCATCAAG-TTGACCTCAAATCA 644

H.uvarum 636 GGCAAAGGGTTGCTTTTAATATTCATCAAGTTTGACCTCAAATCA 680

71

Metschikowia pulcherrima

ORG55 1 TTTTAGGCACAAACTCTAAATCTTAACCYTCAWATAYACAATTaaaaaaaCTTTCAACAA 60

M.pulcherrima 31 TTTTAGGCACAAACTCTAAATCTTAACCCTCAAATACAC-TTTAAAAAAACTTTCAACAA 89

ORG55 61 CGGATCTCTT-GTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAATATGA-T 118

M.pulcherrima 90 CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAATATGACT 149

ORG55 119 TGCAGACGTGAATCATTGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCGGGGTATTCCCCAGGGC 178

M.pulcherrima 150 TGCAGACGTGAATCATTGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCGGGGTATTCCCCAGGGC 209

ORG55 179 ATGCGTGGGTGAGCGATATTTACTCTCAAACCTCCGGTTTGGTCCTGCTTCGGCATAATA 238

M.pulcherrima 210 ATGCGTGGGTGAGCGATATTTACTCTCAAACCTCCGGTTTGGTCCTGCTTCGGCATAATA 269

ORG55 239 TCAACGGCGCTAGAATAAGTTTTAGCCCCAT-CTTTT-CCTCACCCT 283

M.pulcherrima 270 TCAACGGCGCTAGAATAAGTTTTAGCCCCATTCTTTTTCCTCACCCT 316