UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós...
69
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Dissertação Otimização de metodologia de extração química clássica de poli(3-hidroxibutirato) sintetizado por Ralstonia solanacearum Karine Laste Macagnan Pelotas, 2014
Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós...
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Dissertação
Otimização de metodologia de extração química
clássica de poli(3-hidroxibutirato) sintetizado por
Ralstonia solanacearum
Karine Laste Macagnan
Pelotas, 2014
Karine Laste Macagnan
Otimização de metodologia de extração química clássica de poli(3-
hidroxibutirato) sintetizado por Ralstonia solanacearum
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia da
Universidade Federal de Pelotas, como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre em Ciências (área do
Conhecimento: Microbiologia Industrial).
Orientador: Claire Tondo Vendruscolo
Coorientador(es): Angelita da Silveira Moreira
Lígia Furlan
Pelotas, 2014
Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901
Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dra. Lígia Furlan (UFPel, CCQFA)
Prof. Dra. Patrícia Diaz de Oliveira (UFPel, CDTec)
Prof. Dra. Angelita da Silveira Moreira (Co-orientadora, UFPel, CCQFA e CDTec)
M113o Macagnan, Karine Laste
Otimização de metodologia de extração química clássica de poli (3-hidroxibutirato) sintetizado por Ralstonia solanacearum / Karine Laste Macagnan. – 69f. : il. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2014. – Orientador Claire Tondo Vendruscolo; coorientadores Angelita da Silveira Moreira, Lígia Furlan.
1.Biotecnologia. 2.Bioplástico. 3.Clorofórmio. 4.Poli (3-
hidroxibutirato). 5.Polihidroxialcanoato. 6.Ralstonia solanacearum. I.Vendruscolo, Claire Tondo. II.Moreira, Angelita da Silveira. III.Furlan, Lígia. IV.Título.
CDD: 668.9
Agradecimentos
À Universidade Federal de Pelotas, ao Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia pela oportunidade de realizar o mestrado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul pelo
apoio financeiro.
À Professora Dra. Claire Tondo Vendrusculo pela oportunidade e pelos
ensinamentos durante esta orientação.
À Professora Dra. Angelita da Silveira Moreira pela grandiosa orientação,
disponibilidade e amizade.
À Professora Dra. Lígia Furlan por dedicar seu tempo nesta co-orientação.
À Dra. Cátia Schwartz Radatz pela realização das análises de FTIR, DSC e
TGA na central analítica UFPel.
À Sônia Maria Kesserlingh pela realização da análise de massa molar na
PHB Industrial, Serrana/SP.
À banca examinadora, Prof. Dra. Lígia Furlan, Prof. Dra. Patrícia Diaz de
Oliveira e Prof. Dra. Angelita da Silveira Moreira, pelo aceite para avaliar o meu
trabalho.
A todos os professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia.
Aos amigos do Laboratório de Biopolímeros, Amanda, Andiara, Carolina,
Dener, Júlia, Karoline, Letícia, Lúcia, Maria, Mariane, Natiele, Paula e Vanessa, pela
amizade, apoio nos experimentos, colaboração e parceria.
À minha preciosa família, meus pais Vanderlei e Odete e minha irmã Kelly,
por sempre me apoiar nas minhas decisões e por simplesmente ser o meu exemplo
de vida.
Ao meu namorado, Vinícius, por sempre me incentivar a alcançar os meus
objetivos, pela confiança e por estar sempre ao meu lado.
A todos aqueles que de alguma forma participaram da elaboração deste
trabalho.
Muito Obrigada!
Resumo
MACAGNAN, Karine Laste. Otimização de metodologia de extração química clássica de poli(3-hidroxibutirato) sintetizado por Ralstonia solanacearum. 2014. 69f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. O poli(3-hidroxibutirato) [P(3HB)] é o biopolímero mais estudado e caracterizado dentre a família dos polihidroxialcanoatos (PHAs), termoplásticos que têm como principais características a rápida biodegradabilidade e a biocompatibilidade. O processo de recuperação do bioplástico consiste em uma etapa importante no processo de produção. O desenvolvimento de metodologias mais seguras, econômicas e ambientalmente corretas, e que permitam um alto rendimento desse biopolímero, torna-se necessário para uma produção de P(3HB) economicamente e ecologicamente atrativa. Portanto, o objetivo do trabalho foi otimizar a metodologia clássica de recuperação de poli(3-hidroxibutirato) utilizando clorofórmio como solvente. O bioprocesso foi realizado em duas etapas, utilizando linhagem de Ralstonia solanacearum. O inoculo foi produzido em Erlenmeyers aletados de 500 mL, contendo 160 mL de meio YM e 40 mL de suspensão bacteriana, mantidos em incubador agitador orbital por 24 h, 150 rpm e 28 °C. A segunda etapa, produção de P(3HB), foi realizada utilizando Erlenmeyers aletados de 500 mL, contendo 160 mL de meio F4 e 20 % de inóculo, mantidos em 28 °C, 200 rpm e 72 h em incubador agitador orbital. Após a fermentação, as células foram separadas por centrifugação a 10.000 x g, lavadas com solução salina 0,89 % e secas a 56 °C. O acúmulo de P(3HB) na célula foi quantificado por cromatografia gasosa. A metodologia de extração foi otimizada em relação aos parâmetros: tempo de extração (2 h a 15 min), separação da biomassa/solução extrativa (papel filtro ou funil de separação), estado de célula (seca ou fresca) e proporção de solvente (10:1, 20:1 e 40:1 v/m). Por evaporação da solução extrativa foram obtidos filmes poliméricos. Os filmes recuperados foram analisados física e quimicamente por Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), Análise Termogravimétrica (TGA) e Cromatografia de Permeação em Gel (GPC). O acúmulo de P(3HB) foi de 51,15 %. Os maiores rendimentos de filme foram obtidos após 30 min de aquecimento, utilizando funil de decantação para separar a solução extrativa da biomassa, célula seca, e proporção de solvente 40:1 v/m, alcançando-se recuperação de 98 % do polímero acumulado. A análise dos filmes através de FTIR resultou em bandas características de P(3HB). Os filmes oriundos de células secas tiveram temperaturas inicial e final de degradação e grau de cristalinidade superiores aos filmes de célula fresca. Todavia, os últimos apresentaram massa molar maior do que os primeiros. A metodologia clássica de extração química de poli(3-hidroxibutirato) por clorofórmio com aquecimento pode ser otimizada, resultando em redução de 75 % do tempo de aquecimento e separação da biomassa/solução extrativa mais rápida e econômica. Porém, não foi possível substituir a utilização de massa celular seca por fresca nem reduzir a proporção inicial de solvente de 40:1 (v/m). Palavras-chave: Bioplástico, Clorofórmio, Poli(3-hidroxibutirato), Polihidroxialcanoato, Ralstonia solanacearum.
Abstract
MACAGNAN, Karine Laste. Optimization methodology of classical chemical extraction of poly(3-hydroxybutyrate) synthesized by Ralstonia solanacearum. 2014. 69f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Poly (3-hydroxybutyrate) [P(3HB)] is the most important biopolymer from the polyhydroalcanoates (PHAs) families, and they are thermoplastics with rapid biodegradability and biocompatibility. The recovery process of bioplastics is an important stage in the production process. Development of safe, economic and environmentally friendly methodologies, that result in high yield biopolymer, is necessary for the attractive P(3HB) production. Therefore, the objective was to optimize the classical methodology for poly (3-hydroxybutyrate) recovery using chloroform as solvent. The bioprocess was performed in two phases, with Ralstonia solanacearum strain. In the first phase, inoculum production, was performed in Erlenmeyer 500 mL flasks, containing 160 mL medium YM and 40 mL bacterial suspension. The flasks were incubated in shaker for 24 h, 150 rpm and 28 °C. The second phase, P(3HB) production, was performed using Erlenmeyer 500 mL flask, containing 160 mL medium F4 and 20 % (v/v) inoculum, maintained in 28 °C, 200 rpm and 72 h. After fermentation cells were separated by centrifugation at 10,000 x g, washed with saline (0,89 % w/v) and dried at 56 °C. P(3HB), accumulation was quantified by gas chromatography. The extraction methodology was optimized according to: extraction time (2 h - 15 min), extractive solution/biomass separation (paper filter or separation funnel), state of cell (dry or fresh), and solvent ratio (10:1, 20:1 and 40:1 v/m). Polymeric films were obtained by evaporation from extractive solutions and they were analysed by Fourier Transform Infrared (FTIR), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Thermogravimetric Analysis (TGA) and Gel Permeation Chromatography (GPC). The P(3HB) accumulation was 51,15 %. Highest yields of film were obtained after 30 min heating, by funnel for extractive solution recovery, dry cell and solvent ratio 40:1 v/m; and highest recovery was 98 % of cumulated polymer in the cell. Characteristic bands of P(3HB) were obtained to produced films by FTIR analysis. Films from dried cells showed initial and final degradation temperature and crystallinity degree higher than and films these from fresh cell, however, they showed higher molar weight than the first ones. The classical chemical extraction of P(3HB) by chloroform with heating can be optimized, resulting in a 75 % reduction as well heating time extraction solution most fastest and economical. However, wasn’t possible replace the dry cell mass use by fresh cell mass or reduce the initial solvent proportion [40:1 (v/m)]. Keywords: Bioplastic, Chloroform, Poly(3-hydroxybutyrate), Polyhydroxyalcanoate, Ralstonia solanacearum.
Lista de Figuras
Figura 1.
Estrutura geral dos
polihidroxialcanoatos.................................................................
18
Figura 2. Micrografia eletrônica de transmissão de células de Ralstonia
eutropha contendo 90 % em massa de grânulos de poli(3-
hidroxibutirato) no interior das bactérias....................................
19
Figura 3.
Esquema demonstrando o ciclo fechado de produção de
PHAs..........................................................................................
20
Figura 4.
Morfologia dos grânulos de PHA nas células
bacterianas................................................................................
24
Figura 5. Produtos da Acetil-Coa em condições de crescimento
balanceado e de excesso de carbono.......................................
25
Figura 6. Esquema da via metabólica de síntese e degradação de
P(3HB) em bactérias..................................................................
26
Figura 7. Esfregaço do inóculo de R. solanacearum, obtido após 24h de
incubação em meio Yest Malt, corado com Sudan Black
visualizado em lente de imersão em microscopia óptica...........
46
Figura 8.
Rendimento dos filmes utilizando as metodologias de
extração com papel filtro e com funil de decantação, após
aquecimento, em diferentes intervalos de tempo, sob
agitação.....................................................................................
47
Figura 9. Filmes poliméricos extraídos em Massa Celular Seca (S) e
Fresca (F) nas proporções de solvente 10:1, 20:1 e 40:1
(v/m)...........................................................................................
49
Figura 10. Rendimento dos filmes utilizando as metodologias de
extração com massa celular seca (S) e massa celular fresca
(F) nas proporções de solvente 10:1, 20:1 e 40:1
(v/m)...........................................................................................
50
Figura 11. Espectro FT-IR para o polímero extraído pela metodologia
otimizada com massa celular seca e proporção de solvente
40:1 (v/m)...................................................................................
53
Lista de Tabelas
Tabela 1.
Comparação entre as características do P(3HB) e do
polipropileno (PP)......................................................................
22
Tabela 2. Comparação dos métodos de extração de
polihidroxialcanoatos.................................................................
34
Tabela 3.
Rendimento de extração de P(3HB) de célula seca com
proporção de solvente 40:1 (v/m) na 1° extração e 20:1, 40:1
(v/m) na 2° extração...................................................................
52
Tabela 4.
Principais frequências vibracionais para o sistema o
Biopolímero P(3HB)...................................................................
53
Tabela 5. Valores de temperatura de fusão cristalina (Tm) no primeiro e
segundo ciclo de aquecimento e grau de cristalinidade (Xc)
para análise de DSC e temperatura de início de degradação
(Ti), temperatura máxima de degradação (Tpico) e
porcentagem de perda de massa determinados a partir das
curvas de TGA de filmes de P(3HB) extraídas de célula seca
(S) e fresca (F) nas diferentes proporções de solvente e
P(3HB) comercial Sigma-Aldrich® e
Biocycle®...................................................................................
54
Tabela 6. Dados de polidispersão e médias de massa molar de filmes
de P(3HB) extraídos a partir de massa celular seca ou fresca
nas diferentes proporções de solvente......................................
56
Lista de Abreviaturas
3HB - 3-hidroxibutirato
DSC - Calorimetria Diferencial de Varredura
FID - Detector de Ionização de Chama
FTIR - Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
GC - Cromatografia Gasosa
GPC - Cromatografia de Permeação em Gel
HA – Hidroxialcanoato
MCF - Massa Celular Fresca
MO - Microscopia Óptica
MSC - Massa Celular Seca
Mn – Massa Molar média
Mw - Massa Molar
Mw/Mn – Polidispersão
NYA - Nutritive Yest Agar
P(3HB) – Poli(3-hidroxibutirato)
PE – Polietileno
PET - Poli(Tereftalato de Etileno)
Pha A - β-cetotiolase
Pha B - Acetoacetil-CoA-redutase NADPH Dependente
Pha C - PHB Sintase
PHAMSC - Cadeia Lateral Média ou Cadeia Lateral Longa
PHAs – Polihidroxialcanoatos
PHASSC - Cadeia Lateral Curta
PP – Polipropileno
PS – Poliestireno
PVC - Poli(Cloreto de Vinila)
TCA - Ciclo do Ácido Tricarboxílico
Tg - Transição Vítrea
TGA – Termogravimetria
Ti - Temperatura do Início de Degradação
Tm - Temperatura de Fusão Cristalina
Tpico - Temperatura Máxima Degradação
Xc - Grau de Cristalinidade
YM - Yest Malt
ΔHm - Entalpia de Fusão da Amostra
Sumário
1 INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................... 13
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 15
2.1 O plástico e seu impacto ambiental ................................................................ 15
2.2 Polihidroxialcanoatos (PHAs) .......................................................................... 16
2.3 Poli(3-hidroxibutirato) – P(3HB) ...................................................................... 21
2.4 Biossíntese e degradação de PHAs ................................................................ 24
2.5 Microrganismos acumuladores de PHAs ........................................................ 27
2.6 Ralstonia solanacearum.................................................................................. 28
2.7 Visualização e detecção de PHAs .................................................................. 29
2.8 Recuperação de PHAs.................................................................................... 30
2.9 Identificação e caracterização de PHAs .......................................................... 35
3 HIPÓTESE E OBJETIVOS .................................................................................... 37
3.1 Hipótese ......................................................................................................... 37
3.2 Objetivo Geral ............................................................................................. 37
3.3 Objetivos Específicos ...................................................................................... 37
4 capítulo 1 - OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA DE EXTRAÇÃO QUÍMICA clássica
DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO) SINTETIZADO POR Ralstonia solanacearum ..... 38
4.1 Material e Métodos ......................................................................................... 40
4.1.1 Microrganismo .......................................................................................... 40
4.1.2 Produção de P(3HB) ................................................................................. 40
4.1.3 Avaliação da presença de corpos lipofílicos .............................................. 40
4.1.4 Determinação do rendimento em massa celular fresca e seca ................. 41
4.1.5 Extração do polímero ................................................................................ 41
4.1.5.1 Otimização de tempo de extração e separação célula/solvente ......... 41
4.1.5.2 Otimização de estado da célula (fresca ou seca) e proporção de
solvente ......................................................................................................... 42
4.1.6 Quantificação de acúmulo de P(3HB) por Cromatografia Gasosa (GC) .... 42
4.1.7 Determinação de rendimento dos processos de recuperação .................. 43
4.1.8 Métodos analíticos .................................................................................... 44
4.1.8.1 Espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier (FTIR)
...................................................................................................................... 44
4.1.8.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) e Análise
termogravimétrica (TGA) ............................................................................... 44
4.1.8.3 Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)..................................... 45
4.2 Resultados e Discussão.................................................................................. 45
4.2.1 Avaliação da presença de corpos lipofílicos .............................................. 45
4.2.3 Extração do polímero ................................................................................ 47
4.2.3.1 Otimização de tempo de extração e separação célula/solvente ......... 47
4.2.3.2 Otimização de estado da célula (seca ou fresca) e proporção de
solvente ......................................................................................................... 48
4.2.3.3 Teste de proporção de solvente decrescente na 2° extração para
massa celular seca ........................................................................................ 51
4.2.4 Caracterização dos P(3HB)s extraídos ..................................................... 52
4.2.4.1 Espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier (FTIR)
...................................................................................................................... 52
4.2.4.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) e Análise
termogravimétrica (TGA) ............................................................................... 54
4.2.4.3 Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)..................................... 56
4.3 Conclusão ....................................................................................................... 57
5 CONCLUSÃO GERAL .......................................................................................... 59
6 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 60
13
1 INTRODUÇÃO GERAL
Os plásticos convencionais, obtidos a partir do petróleo, devido a sua
durabilidade e resistência, têm sido, por décadas, usados indiscriminadamente
(FRANCHETTI & MARCONATO, 2006). Estes materiais têm despertado
preocupação devido a sua rápida descartabilidade e a lenta degradação por não
reagirem quimicamente com a maioria das substâncias, provocando problemas nos
aterros sanitários, dificultando a troca de gases e a decomposição de outros
compostos (LUENGO et al., 2003). O crescente interesse científico pela área
ambiental, e associado à área industrial pelo alto crescimento de consumo de
plásticos têm tornado necessário a pesquisa e o desenvolvimento de substitutos
ecologicamente corretos. E uma das principais linhas de pesquisa destes novos
materiais que tem despertado interesse é a obtenção de biopolímeros
biodegradáveis produzidos por microrganismos com o uso de fontes renováveis com
características térmicas e mecânicas relevantes que permitam a sua industrialização
(VINHAS et al., 2007).
Bioprocessos podem ser empregados como ferramenta para obtenção de
polímeros biodegradáveis como os da família dos polihidroxialcanoatos (PHAs).
PHAs são acumulados no citoplasma bacteriano como inclusões de poliésteres
insolúveis em água e utilizados como material de reserva intracelular de energia e
carbono (KUNASUNDARI & SUDESH, 2011). Estes bioplásticos se degradam
completamente em curto período de tempo pela ação enzimática de microrganismos
e sob condições apropriadas no meio ambiente, sendo esta a principal característica
destes materiais; além disso, são termoplásticos e biocompatíveis ao ser humano
(PIEMOLINI, 2004). Por possuir propriedades físicas comparáveis ao polipropileno
(PP), o polihidroxibutirato P(3HB) é o biopolímero mais estudado dentre os PHAs e
utilizado em plásticos biodegradáveis (HOLMES, 1985; CHANPRATEEP, 2010).
São conhecidos mais de 300 microrganismos capazes de sintetizar PHAs,
mas são poucos os efetivamente empregados na sua produção, incluindo Ralstonia
sp., Cupriavidus necator e Pseudomonas sp., e Escherichia coli recombinante
(CHANPRATEEP, 2010). Dentre eles, a Ralstonia sp. é um dos que apresenta
condições mais favoráveis à produção industrial, por resultar em elevados
rendimento e velocidade de produção (RAMSAY et al., 1990). Este microrganismo
14
pode acumular cerca de 80 % de sua massa seca em polímero com alta massa
molar, e utilizar diferentes tipos de substratos, como glicose, frutose, entre outros
(BYROM, 1987).
O processo de síntese de PHAs ocorre em duas etapas: primeiramente uma
etapa inicial de crescimento celular utilizando meio de cultura complexo, sem
limitação de nutrientes no cultivo, seguida de uma fase de produção e acúmulo de
polímero, a qual ocorre sob a condição de excesso de fonte de carbono, geralmente
associada a limitação de um nutriente essencial como P, Fe, Mg, N. A maioria das
bactérias acumula uma pequena porcentagem de PHA (1 a 15 %), mas em
condições especiais de crescimento e estratégias de fermentação, podem alcançar
acúmulos de PHAs próximos a 90 % de sua massa celular seca (KHANNA &
SRIVASTAVA, 2005). Assim, a seleção do microrganismo para produção industrial
de PHA é baseada em vários fatores como, alta velocidade de crescimento,
utilização de diferentes substratos, principalmente de baixo custo, capacidade de
acumular grande quantidade de polímero, e que haja um fator de conversão do
substrato em biopolímero bastante elevado (LEE, 1996).
O inconveniente para a utilização é o preço, que em alguns casos chegam a
custar até cinco vezes o preço do plástico sintético. Conhecendo-se o processo, a
etapa de extração é a mais problemática e também a mais onerosa, a qual
compreende 50 % ou mais do custo total do processo (KUNASUNDARI & SUDESH,
2011), pesquisas têm sido orientadas buscando a melhoria e a minimização dos
custos dessa etapa. Vários métodos de extração foram desenvolvidos para a
recuperação de PHAs, como extração do polímero por solventes, como clorofórmio
(DACALTON, 2006), por digestão com hipoclorito de sódio (LEE et al., 1996),
surfactante e quelante (KESSLER & WITHOLT, 2001), enzimas (JACQUEL et al.,
2008), e rompimento mecânico (GARCIA, 2006).
Portanto, a recuperação do bioplástico consiste em uma etapa importante no
processo de produção. O desenvolvimento de metodologias que utilizem solventes
nos quais o biopolímero seja mais solúvel, ou a diminuição do volume desses, torna-
se necessário para uma produção de P(3HB) economicamente e ecologicamente
atrativa (REDDY et al., 2003).
15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O plástico e seu impacto ambiental
O uso de materiais poliméricos vem crescendo na sociedade, sendo que os
plásticos mais utilizados, desde 1940, têm sido o polipropileno (PP), o poliestireno
(PS), o polietileno (PE), o poli(tereftalato de etileno) (PET) e o poli(cloreto de vinila)
(PVC). Esses polímeros são de origem petroquímica e que, apesar do avanço no
processamento e fabricação, geram dois grandes problemas: o uso de fonte não-
renovável de matéria-prima e as baixas velocidades de degradação, o que pode
levar a sérios problemas relativos ao desequilíbrio ambiental, pois, grande
quantidade de resíduos plásticos é acumulada na natureza (VOGELSAGER et al.,
2004).
Os polímeros petroquímicos podem levar mais de uma centena de anos para
se decomporem, pondo em risco as relações presentes nos ecossistemas terrestres
e marítimos (CHIELLINI & SOLARO, 1996; VOGELSAGER et al., 2004). O acúmulo
de sacos, caixas, garrafas, entre outros, contribui para a superlotação dos aterros
sanitários e lixões (BUCCI, 2003). A presença dos plásticos convencionais nestes
aterros representa um grave problema, pois são extremamente estáveis, podendo
permanecer intactos por longo tempo. Esta condição leva à formação de uma
camada impermeabilizante, comprometendo a circulação de gases e líquidos,
dificultando a degradação de outros materiais constituintes do lixo e retardando a
estabilização das áreas dos aterros (GOMES & BUENO NETTO, 1997). Em áreas
fluviais, contamina os rios, provoca enchentes e cria zonas mortas nos mares com a
exterminação de espécies de animais (SARTORI, 1998).
A reciclagem e incineração são métodos utilizados para a solução desse
problema ambiental. Entretanto, esses procedimentos não são suficientes para
processar a grande quantidade de polímeros descartáveis, observando-se ainda que
as propriedades físico-químicas finais obtidas para os polímeros reciclados são
inferiores ao do natural de partida. A incineração, quando controlada, é uma
alternativa já praticada em muitos países. No entanto, provoca uma poluição
ambiental secundária, devido à produção de gases tóxicos que podem ter efeito
16
carcinogênico, como as dioxinas (KIM, 2000; ROCHA, 2000). Um exemplo é a
incineração do PVC, que libera ácido clorídrico (KRUPP & JEWELL, 1992). Sendo
uma substância tóxica e muito corrosiva que provoca a destruição completa da pele
e das mucosas, causando sérios danos à saúde. Além de suas propriedades
tóxicas, o HCl promove a redução das propriedades mecânicas de outros polímeros
durante o processo de reciclagem. Por exemplo, o PVC presente na reciclagem de
garrafas de PET sofre a quebra de sua cadeia polimérica, devido à presença de
ácido clorídrico liberado durante a reciclagem (PACI & LA MANTIA, 1999).
A solução para esse grave problema ambiental está na fabricação em larga
escala de materiais produzidos com plásticos biodegradáveis, uma vez que a
reciclagem e a conscientização nunca serão suficientes para deter essa poluição
que alcança níveis alarmantes. O crescente interesse científico pela área ambiental,
associado ao desenvolvimento da área industrial, têm fomentado a pesquisa e o
desenvolvimento de substitutos ecologicamente corretos.
Uma das principais linhas de pesquisa destes novos materiais tem sido a
obtenção de biopolímeros biodegradáveis produzidos por microrganismos com o uso
de fontes renováveis e que suas características térmicas e mecânicas permitam a
industrialização (VINHAS et al., 2007). Além disso, esses materiais biodegradáveis
vêm despertando um crescente interesse devido à amplitude de suas aplicações,
que não ficam restritas somente à área de artefatos de rápido descarte, mas
também à área biomédica (DUARTE et al., 2004).
Neste contexto, destacam-se os polihidroxialcanoatos (PHAs), que são
poliésteres biológicos e biodegradáveis (DUARTE et al., 2004), passíveis de serem
produzidos a partir de fontes renováveis, oferecendo a possibilidade de um ciclo
fechado e, consequentemente, minimizando o impacto ambiental (KAHAR et al.,
2004).
2.2 Polihidroxialcanoatos (PHAs)
A primeira determinação da composição de PHAs ocorreu em 1923, por
Maurice Lemoigne, que verificou que culturas da bactéria Bacillus subtilis, quando
sofriam autólise em água destilada, reduziam o pH devido à excreção de um ácido
17
desconhecido. Logo, Lemoigne identificou que o ácido liberado pela autólise de
Bacillus megaterium era o ácido 3-hidroxibutírico, originalmente acumulado no
citoplasma bacteriano na forma de polímero, o poli(3-hidroxibutirato) (LEMOIGNE,
1926). Em 1958, a via funcional de P(3HB) foi proposta por Macrae e Wilkinson, que
observaram que B. megaterium estocava o homopolímero especialmente quando a
razão das fontes de glicose/nitrogênio no meio estava alta, e que a subsequente
degradação ocorria rapidamente na ausência da fonte de carbono e energia
(LUNDGREN et. al, 1965). Então, Braunegg e colaboradores (1978) concluíram que
P(3HB) era um material de reserva de carbono e energia.
A partir de 1974 trabalhos iniciados por Wallen e Rohwedder, que
analisaram amostras de lodo ativado, descobriu-se que outros hidroxialcanoatos
(HA), além do 3-hidroxibutirato (3HB), podem compor os PHAs. Estes compostos
são formados principalmente de 3-hidroxiácidos, mas unidades monoméricas do tipo
4, 5 e 6-hidroxialcanoatos já foram observadas (WALLEN & ROHWEDDER, 1974;
DOI et al., 1988; STEINBUCHEL & VALENTIN, 1995).
Os PHAs mais conhecidos são o poli(3-hidroxibutrato) [P(3HB)], o poli(3-
hidroxivalerato) (PHV) e o poli(hidroxibutirato-co-valerato) (PHVB) e dependendo do
grupo substituinte (S) presente na sua estrutura, esses polímeros podem apresentar
características de material duro e quebradiço, amorfo e/ou elastomérico (TSUGE,
2002).
O tipo de unidades monoméricas depende da fonte de carbono utilizada
pelas bactérias e diferem entre si pela composição da cadeia lateral ou do grupo
substituinte e pelo valor de n (LEE, 1996a). A Figura 1 esquematiza a estrutura geral
das unidades monoméricas desses biopolímeros.
18
Figura 1. Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos. Fonte. LEE, 1996, modificado.
Assim, os polihidroxialcanoatos são definidos como homo ou
heteropoliésteres, sintetizados e armazenados intracelularmente por numerosos
procariotos. São acumulados pela célula microbiana em forma de grânulos, podendo
chegar até 90 % de seu peso seco, o que pode ser observado na Figura 2
(MADISON & HUISMAN, 1999; SUDESH et al., 2000). A função mais
frequentemente atribuída a esses grânulos é a de reserva de carbono e energia;
assim, quando há limitação de carbono ou energia os mesmos podem ser
reutilizados para suprir essas necessidades (SCHLEGEL et al., 1961; MADISON &
HUISMAN, 1999).
n
S
19
Figura 2. Micrografia eletrônica de transmissão de células de Ralstonia eutropha contendo 90
% em massa de grânulos de poli(3-hidroxibutirato) no interior das bactérias. Fonte: SUDESH et al.,
2000.
O processo de síntese de PHAs ocorre em duas etapas: primeiramente uma
etapa inicial de crescimento não limitado, visando o crescimento celular, seguida de
uma etapa de produção e acúmulo de polímero, a qual ocorre somente sob a
condição de limitação de um nutriente essencial como P, Fe, Mg, N, associada a um
excesso de fonte de carbono (KHANNA & SRIVASTAVA, 2005).
A Figura 3 demonstra um esquema de um ciclo fechado da produção de
PHAs. Uma cultura de cana-de-açúcar usa a luz solar para converter CO2 e H2O em
carboidratos através da fotossíntese e, por sua vez, na forma de açúcares simples,
fornecem a matéria-prima necessária para a produção do biopolímero. Um
microrganismo específico, potencialmente acumulador de PHAs, consome o
carboidrato convertendo-o em polímero, que por sua vez, é extraído e processado
em produtos plásticos. Embora os PHAs sejam estáveis no uso normal, quando
depositados no meio ambiente microbiologicamente ativo são metabolizados
enzimaticamente. A biodegradação, sob condições aeróbicas, produz novamente
CO2 e H2O, concluindo o ciclo de vida sem impacto [significativo] ao ambiente
(GARCIA, 2006).
20
Figura 3. Esquema demonstrando o ciclo fechado de produção de PHAs. Fonte: GARCIA,
2006.
Dentre as importantes características dos PHAs pode-se destacar a sua
biodegrabilidade, biocompatibilidade e termoplasticidade (REDDY et al., 2003). Além
disso, outras características os tornam similares aos plásticos convencionais,
principalmente ao polipropileno, como o alto grau de polimerização, a elevada
cristalinidade e insolubilidade em água (MADISON & HUISMAN, 1999; REDDY et
al., 2003).
Quanto ao número de carbonos do grupo substituinte (s) os PHAs podem
ser classificados em dois grupos: polímeros constituídos de unidades monoméricas
de 5 carbonos ou menos, denominados de cadeia lateral curta (PHASSC); polímeros
com unidades monoméricas com mais de 6 carbonos, classificados como de cadeia
lateral média ou cadeia lateral longa (PHAMSC) (RAMSAY, 1994). Os PHASSC
possuem características próximas às dos termoplásticos, enquanto que os PHAMSC
21
aproximam-se às de termofixos (TIM & STEINBÜCHEL, 1990). Os polímeros
PHAMSC têm menor nível de cristalinidade e são mais elásticos, tendo aplicações
potencialmente diferentes dos PHASSC (MADISON e HUISMAN, 1999).
Os polímeros também podem ser diferenciados por possuir uma cadeia
longa, identificada por sua massa molar (Mw) e essa característica tem grande
influência sobre suas propriedades físico-químicas, de tal forma que seu
conhecimento e controle é de fundamental importância (CANEVAROLO, 2002),
sendo portanto, a principal propriedade que confere a um material polimérico
propriedades mecânicas interessantes e úteis. A Mw do P(3HB) produzido por
bactérias nativas é usualmente na faixa de 1x104 a 3x106 Da (SUDESH et al., 2000)
e, dentro dessa variação, há uma faixa de massa molar na qual uma determinada
propriedade do polímero terá uma aplicação ótima (NOGUEIRA et al., 2002). Por
exemplo, a empresa Zeneca Bioproducts considera uma massa molar de
aproximadamente 6x105 Da aceitável para aplicações do termoplástico produzido
BIOPOL® (LUZIER, 1992). Já polímeros com baixa massa molar possuem aumento
da taxa de degradação, o que promoverá um acréscimo na velocidade de liberação
de um determinado princípio ativo quando aplicados em sistemas de liberação
controlada, e consequentemente, a matriz polimérica será mais facilmente absorvida
pelo organismo (MONTORO, 2005).
Existem algumas propriedades termoplásticas desejadas em PHAs, como
baixa rigidez, elevado ponto de fusão, forte resistência a impactos e pressão e
resistência ao alongamento antes da ruptura (CANEVAROLO, 2003). Cada
microrganismo, seja ele naturalmente produtor de PHAs ou com modificação
genética, originam bioplásticos com propriedades termoplásticas diferentes obtendo
produtos com características diferentes, sendo bastante ampla a busca por PHAs
que apresentem essas propriedades.
2.3 Poli(3-hidroxibutirato) – P(3HB)
O P(3HB) é o PHA mais estudado e caracterizado, é um poliéster alifático
natural e biodegradável tipo homopolímero, composto por unidades monoméricas de
22
quatro átomos de carbono (TSUGE, 2002). É solúvel em [alguns] solventes
orgânicos e insolúvel em água (STEINBÜCHEL & FÜCHTENBUSCH, 1998).
O interesse industrial na utilização do P(3HB) iniciou na década de 60,
quando suas propriedades termoplásticas foram primeiramente descritas (GOMEZ et
al.,1997). Durante a década de 70, em decorrência do aumento do preço e da
escassez do petróleo, e devido à semelhança das suas propriedades com o
polipropileno e ainda pelo fato de poder ser sintetizado a partir de fontes renováveis,
o P(3HB) foi considerado potencial substituto para os plásticos convencionais de
origem petroquímica, (BRAUNEGG et al., 1998).
O P(3HB) apresenta, em alguns aspectos, propriedades e características
semelhantes àquelas do polipropileno: é termoplástico com temperatura de fusão
semelhante, é altamente cristalino, possui grau elevado de polimerização (apresenta
massa molar elevada) e é insolúvel em água. A partir da Tabela 1 podemos verificar
as principais características do P(3HB) e do polipropileno.
Tabela 1. Comparação entre as características do P(3HB) e do polipropileno (PP). Fonte: GOMEZ &
BUENO NETTO, 1997; DUARTE, 2004+ e ROSA, 2007*.
Características P(3HB) PP
Temperatura de fusão 180 °C 174 °C
Temperatura de transição vítrea 5 °C -17 °C
Temperatura de degradação 220+ °C 455* °C
Densidade 1,18 – 1,25 g.cm-3 0,91 g.cm-3
Cristalinidade 70 % 68 %
Permeabilidade ao O2 45 cm3.m-2.at-1.dia-1 1700 cm3.m-2.at-1.dia-1
Módulo de elasticidade 3500 MPa 1700 MPa
Tensão de cisalhamento 40 MPa 38 MPa
Resistência à ruptura 5 % 400 %
Massa molar 1 – 8.105 g.mol-1 2,2 – 7.105 g.mol-1
Segundo Astar e Gruys (2002), a temperatura de degradação térmica do
P(3HB) normalmente ocorre a temperaturas logo acima da sua temperatura de fusão
cristalina (Tm) (190 °C e 170 ºC, respectivamente), liberando um odor característico
23
de “ácido crotônico” (trans-2-butenoico). Porém, Duarte (2004), ao estudar as
condições ótimas de processamento do P(3HB), observou que o polímero submetido
ao aquecimento à 200 °C por 2 horas não sofreu degradação térmica; no entanto,
este fenômeno pôde ser observado de maneira expressiva e dependente do tempo e
temperaturas a partir de 220 ºC.
A temperatura de transição vítrea (Tg) é característica de cada polímero na
qual ocorre a passagem do estado vítreo para o borrachoso, adquirindo um certo
grau de flexibilidade, devido à maior movimentação entre as cadeias
macromoleculares. Os valores de Tg dos dois polímeros indicam que o PP (Tg = -17
°C) é mais flexível que o P(3HB) (Tg = 5°C). Essa maior flexibilidade é confirmada
através do módulo de elasticidade (módulo de Yong ou simplesmente módulo) do
PP (1700 MPa), que é bem inferior ao do P(3HB) (3500 MPa). O módulo de
elasticidade de um polímero está diretamente relacionado com a sua rigidez ou
flexibilidade de forma que, quanto mais alto, maior a rigidez do polímero. No entanto,
ambos os polímeros apresentam alto grau de cristalinidade (FORMOLO et al., 2003).
A resistência à ruptura do P(3HB) (5 %) é muito menor do que a do plástico
convencional (400 %), já a tensão de cisalhamento desses polímeros são similares.
A alta massa molar é uma característica desejável para aplicações industriais. O
polímero o qual apresenta essa característica é um material muito útil para a
preparação de filmes e fibras fortes por extração quente ou fria (AGUS et al., 2006).
A massa molar dos PHAs pode ser reduzida durante o seu processamento
(BOURQUE et al., 1995), e esta diminuição pode ocorrer também durante o
processo de extração da biomassa (LAFFERTY et al., 1988).
Diferentemente do PP, o P(3HB) possui elevada densidade e baixa
permeabilidade ao oxigênio. A elevada densidade, apesar de negativa sob alguns
aspectos, como em relação ao transporte, é favorável sob o aspecto ambiental, visto
que, além de biodegradável, possui rápida tendência à submersão, o que dificulta a
ingestão de seus fragmentos por aves marinhas, por exemplo. A reduzida
permeabilidade ao oxigênio, aliada à elevada resistência à água e à radiação
ultravioleta tornam o P(3HB) adequado para ser usado na confecção de embalagens
alimentícias (GROTHE et al., 1999).
24
2.4 Biossíntese e degradação de PHAs
Os polihidroxialcanoatos são compostos lipídicos sintetizados por muitos
microrganismos como forma de reserva de carbono e energia. Após a síntese, os
PHAs são acumulados sob a forma de grânulos no citoplasma da célula bacteriana.
A média do tamanho dos grânulos é, aproximadamente, 0,2-0,5 µm. A Figura 4
mostra a morfologia de grânulos de PHA quando observada por diversas técnicas de
microscopia. A análise microscópica de força atômica revelou a presença de uma
monocamada de proteína sobre a superfície dos grânulos de PHA (SUDESH et al.,
2004). Para a finalidade de recuperar os grânulos é necessário realizar a ruptura
celular bacteriana e remover a camada proteica que os reveste (KUNASUNDARI &
SUDESH, 2011).
Figura 4. Morfologia dos grânulos de PHA nas células bacterianas observadas em (a) microscópio de
contraste de fase; (b) de transmissão eletrônica; (c) A imagem de microscópio de força atômica
mostra a presença de partículas globulares na superfície dos grânulos; (d) Um modelo que
representa o grânulo PHA com uma monocamada de proteína na superfície (Não desenhadas de
acordo com a escala real). Fonte: KUNASUNDARI & SUDESH, 2011.
Proteínas associadas ao grânulo
Monocamada da membrana fosfolipídica
Grânulo PHA
25
A formação de grânulos de PHA é dependente da presença de vias
metabólicas adequadas. Na maioria dos microrganismos, o P(3HB), por exemplo, é
sintetizado aerobicamente a partir de moléculas de acetil-CoA. Quando o cultivo
destes ocorre em condições de crescimento balanceado, o acetil-CoA entra no ciclo
do ácido tricarboxílico (TCA) para geração de energia e material celular. Porém,
quando o cultivo ocorre em condições de excesso de fonte de carbono e limitação
de algum nutriente essencial, o acetil-CoA é convertido em PHA por uma sequência
de três reações catalisadas pelas enzimas β-cetiolase, NADPH dependente
acetoacetil-CoA redutase e PHA sintase (OEDING & SCHLEGEL, 1973; BYROM,
1987), o que pode ser observado na Figura 5.
Figura 5. Produtos da Acetil-Coa em condições de crescimento balanceado e de excesso de
carbono. Fonte: BYROM, 1987.
A biossíntese de P(3HB) é iniciada pela condensação de duas moléculas de
acetil-CoA pela enzima β-cetotiolase (Pha A) para formar a acetoacetil-CoA.
Subsequentemente, a acetoacetil-CoA-redutase NADPH dependente (Pha B)
catalisa a redução da acetoacetil-CoA para o (R)-isômero de 3-hidroxibutiril-CoA). O
monômero (3HB) é então polimerizado para formar o poli(3-hidroxibutirato) pela PHB
sintase (Pha C) (Figura 6) (SUDESH et al., 2000).
Quando são utilizados ácidos graxos como fonte de carbono, estes entram
pela via da β-oxidação em que a β-cetotiolase e acetoacetil-CoA redutase catalisam
26
a conversão da acetil-CoA a (S)-3-hidroxibutiril-CoA, que é o precursor direto do
poli(3-hidroxibutirato), fornecendo pequenas quantidades de (R)-3-hidroxibutiril-CoA
diretamente à via de produção do poli(3-hidroxibutirato).
Figura 6. Esquema da via metabólica de síntese e degradação de P(3HB) em bactérias, PhaA (β-
cetiolase), PhaB (NADPH dependente acetoacetil-CoA redutase), PhaC (PHA sintase), PhaZ (PHA
depolimerase), 1 (dímero hidrolase), 2 ((R)-3-hidroxibutirato dehidrogenase), 3 (acetoacetil-CoA
sintetase) e 4 (NADH-dependente acetoacetil-CoA redutase). Fonte: SUDESH et al., 2000.
Pelo fato do P(3HB) ser um composto de reserva, é natural que os
microrganismos sejam equipados com um sistema de despolimerização, para
recuperação do material armazenado quando necessário. Alguns microrganismos
também produzem uma PHAdepolimerase extracelular que é secretada para
degradar os PHAs no ambiente (SUDESH et al., 2000).
27
A degradação intracelular de P(3HB) é realizada pela ação das enzimas
PHAdepolimerase, dímero hidrolase, (R)-3-hidoxibutirato desidrogenase e
acetoacetil-CoA sintase (SUDESH et al., 2000). Primeiramente, a enzima
PHAdespolimerase e a dímero hidrolase hidrolisam o P(3HB) em ácido (R)-3-
hidroxibutírico e pequenas quantidades de 3HB-oligômeros. Posteriormente, este
produto é convertido ácido acetoacético e acetoacetil-CoA, pelas enzimas 3-
hidroxibutirato desidrogenase NAD+ específica e acetoacetil-CoA sintase,
respectivamente.
Quando o microrganismo é cultivado em condições balanceadas, os altos
níveis de NADH e de acetoacetato podem inibir a ação enzimática da 3-
hidroxibutirato desidrogenase, ocasionando a interrupção da despolimerização do
polímero até que os níveis de CoASH sejam novamente reduzidos (SAITO &
KOBAYASHI, 2002). Em condições de excesso de energia, o nível de NADH inibe a
despolimerização de PHA e o ciclo do ácido tricarboxílico. A diminuição da
concentração de CoA faz com que a β-cetiolase inicie a síntese de P(3HB). Quando
há deficiência de carbono, o ciclo move-se no outro sentido, sendo que a
degradação do polímero é controlada pelo acetoacetato e NADH, inibindo a enzima
3-hidroxibutirato desidrogenase (BYROM, 1987).
Portanto, os microrganismos são capazes de utilizar este recurso
sustentando seu metabolismo por mais tempo na ausência de fonte de carbono,
podendo inclusive sintetizar proteínas, desde que em presença de fonte de
nitrogênio (SAITO & KOBAYASHI, 2002).
2.5 Microrganismos acumuladores de PHAs
Os microrganismos capazes de acumular PHAs são geralmente bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas, podendo ser encontradas em diversos locais na
natureza, como solo, água do mar, efluentes entre outros (BYROM, 1987). Na
literatura são reportados mais de 300 microrganismos capazes de sintetizar PHAs,
mas somente uma pequena parte é empregada para a produção e desenvolvimento
de processos, incluindo Ralstonia sp., Azotobacter vinelandii, Alcaligenes latus,
28
Cupriavidus necator, vários isolados metilotróficos, as versões recombinantes de
Cupriavidus necator, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes (LEE, 1996a) e
recentemente, Pseudomonas (CROCHEMORE, 2012) e Bacillus megaterium
(RODRIGUES et al., 2014). A maioria das bactérias acumula uma pequena
porcentagem de PHA (1 % a 15 %), mas em condições especiais de crescimento e
estratégias de fermentação, podem alcançar altos valores (próximos a 90 %) de sua
massa celular seca (KHANNA & SRIVASTAVA, 2005).
Assim, a seleção do microrganismo para produção industrial de PHA é
baseada em vários fatores, como alta velocidade de crescimento, utilização de
diferentes substratos, principalmente de baixo custo, capacidade de acumular
grande quantidade de polímero e que haja um fator de conversão do substrato em
biopolímero bastante elevado (LEE, 1996a). O alto custo de produção de PHAs
deve-se, em grande parte, ao processo de extração do polímero. Para que este seja
rentável, é necessário que a linhagem produtora seja capaz de acumular, pelo
menos, 60 % de sua massa celular em polímero (RAMSAY et al., 1990).
Os microrganismos usados para a produção de PHAs podem ser divididos
em dois grupos, sendo esses baseados nas condições de cultura requeridas para a
síntese do bioplástico. O primeiro grupo requer a limitação de um nutriente essencial
como N, P, Mg, K, O ou S, paralelamente ao excesso de fonte de carbono, para a
síntese eficiente de PHAs. Fazem parte deste grupo Ralstonia eutropha,
Protomonas extorquens, Pseudomonas oleovorans, entre outros. Já o segundo
grupo não requer a limitação de nutrientes para a síntese de polímero, acumulando-
o durante o crescimento. Para este grupo pode-se citar Alcaligenes latus,
Alcaligenes vinelandii recombinante e Escherichia coli recombinante (LEE, 1996b),
além de Pseudomonas (CROCHEMORE, 2014).
2.6 Ralstonia solanacearum
A primeira descrição de Ralstonia solanacearum foi feita por Smith em 1896,
quando foi denominada Bacillus solanacearum. Desde então, sua nomenclatura
sofreu algumas modificações, em 1914 passou a Pseudomonas solanacearum. Já
em 1992 foi proposto um novo gênero por Yabuuchi e colaboradores, Burkholderia,
29
para o qual transferiram sete espécies do gênero Pseudomonas, dentre elas P.
solanacearum, que passou a ser denominada de Burkhoderia solanacearum
(YABUUCHI et al., 1992). Com base na análise molecular da sequência do gene da
região 16S do rRNA e análises quimiotaxonômicas, em 1995 passou a ser
denominada de Ralstonia solanacearum (YABUUCHI et al., 1995). O gênero
Ralstonia se classifica no reino Procariotae, divisão Bactéria, classe Proteobacteria,
subclasse b-Proteobacteria, ordem Burkholderiales, família Burkholderiaceae
(EUZÉBY, 2011).
Ralstonia solanacearum é uma bactéria Gram-negativa em forma de bacilo
com dimensões aproximadas de 0,5 x 1,5 μm. Naturalmente habitante do solo e da
água, é aeróbica e não formadora de esporos. Os isolados virulentos não possuem
flagelos e são imóveis, enquanto os isolados avirulentos têm alta motilidade,
possuindo de 1 a 4 flagelos. É tolerante a sais e cresce em temperatura entre 25 a
35 °C, variando de acordo com os isolados, e acumula P(3HB) como reserva de
carbono e energia (MEHAN et al., 1994).
Dentre os microrganismos acumuladores, a Ralstonia sp. é um dos que
apresentam condições mais favoráveis à produção industrial, possui elevados
rendimento e velocidade de produção (RAMSAY et al., 1990). Pode acumular cerca
de 80 % de sua massa seca em polímero com alta massa molar, e utilizar diferentes
tipos de substratos, como glicose, frutose, entre outros (BYROM, 1987).
2.7 Visualização e detecção de PHAs
Os grânulos de PHA podem ser detectados por vários métodos. A
bioprospecção de bactérias produtoras de PHAs pode ser realizada pela avaliação
da presença de corpos lipofílicos nas células, através dos testes colorimétricos com
vermelho nilo e sudan black.
O vermelho do Nilo ou azul do Nilo A-oxazona é pouco solúvel em água,
mas solúvel em diversos solventes orgânicos e substâncias lipofílicas, nos quais
permanece intensamente fluorescente (GREENSPAN et al., 1985). A visualização
das manchas fluorescente formadas pela interação do corante com os PHAs pode
ser feita em microscopia de fluorescência ou confocal (GOVENDER et al., 2012). A
30
fluorescência se reduz em meio aquoso, mas é ressaltada em presença de lipídeos,
o que favorece a visualização, e tem sido usado para avaliar o conteúdo lipídico em
bactérias (IZARD & LIMBERGER, 2003).
O corante sudan black é ligeiramente solúvel em solvente orgânico e
insolúvel em água; ao ligar-se a estruturas hidrofóbicas confere coloração negra
azulada, visível em microscópio óptico (LELLIOT & STEAD, 1987). Após a
coloração, a detecção dos grânulos de PHAs pode ser realizada utilizando um
microscópio óptico comum (ANDERSON & DAWES, 1990).
A Microscopia Óptica (MO) permite a análise de grandes áreas em curto
espaço de tempo, além de ser de fácil utilização, rápida e pouco dispendiosa. Os
melhores microscópios ópticos têm um poder de resolução de 0,2 micrômetros, ou
aproximadamente 200 nanômetros e aumentam a resolução do olho nu em 500
vezes (RAVEN et al.,1996).
2.8 Recuperação de PHAs
O desenvolvimento de metodologia que permita a recuperação dos PHAs
por processo simples, eficiente e menos poluente é uma proposta necessária e
atrativa. É fundamental que o processo de extração e purificação seja de baixo
custo, uma vez que esta etapa representa 50 % ou mais do custo total do produto
(KHANNA & SRIVASTAVA, 2005). A literatura relata diversos estudos com o
propósito de criar metodologias para aumentar o rendimento de extração e melhorar
a pureza do produto.
A extração é o último estágio da produção dos PHAs. Após o cultivo, a
suspensão celular contendo os bioplásticos é separada do caldo por processos
convencionais, como filtração, centrifugação ou floculação, para posteriormente ser
rompida e o polímero extraído (NASCIMENTO, 2001).
Vários métodos foram desenvolvidos para a recuperação de PHAs, como
rompimento celular e extração do polímero por solvente, normalmente clorofórmio;
digestão celular por hipoclorito de sódio, enzimas ou rompimento mecânico; uso de
31
surfactante e quelante para extração (LEE et al., 1996a; LEE, 1996, KESSLER &
WITHOLT, 2001; GARCIA, 2006; JACQUEL et al., 2008)
A maioria dos processos de extração de PHAs, propostos na literatura,
envolve o rompimento das células com o uso de solventes, tais como:
hidrocarbonetos clorados, clorometano, tricloroetano ou clorofórmio e dicloroetano.
Esses solventes rompem as células, solubilizando seus lipídios, inclusive os PHAs.
Compostos orgânicos de baixa polaridade como acetonas, e de maior polaridade
como alcoóis, também podem ser citados, pois rompem o material celular não
polimérico, deixando os grânulos de PHAs intactos (KESSLER e WITHOLT, 2001).
O uso de solventes pode trazer alta pureza para o material formado (>99 %),
porém devido à alta viscosidade de soluções contendo PHAs, é necessário utilizar
volumes elevados de solvente tóxico e/ou volátil (aproximadamente 20 partes de
solvente para 1 parte de polímero), aumentando os custos de produção e causando
danos ao meio ambiente, gerando problemas ambientais e aumento significativo de
custo (LEE, 1996a). Outro fator muito importante é que o processo de extração pode
alterar significativamente as propriedades físico-químicas finais do produto (LING et
al., 1997), sendo imperativo o desenvolvimento de novos métodos de extração de
baixo custo e com bases nas tecnologias limpas (CHEN et al., 2001a,b).
Métodos simples baseados na digestão da porção não PHA da célula, como
por exemplo a utilização de hipoclorito de sódio (BERGER et al., 1998), resulta na
redução da massa molar de P(3HB), devido à ocorrência de grande degradação
durante a digestão, e, consequentemente, perda de suas propriedades, trazendo
ainda o problema da dificuldade de eliminação completa de traços de hipoclorito do
polímero (HEJAZI et al., 2003).
Hahn et al. (1995) desenvolveram um método que utiliza uma dispersão de
hipoclorito em clorofórmio. Os autores observaram que os grânulos de P(3HB)
intracelulares apresentaram-se predominantemente no estado amorfo, o que teria
facilitado o acesso das depolimerases. Operações realizadas no processo de
extração como armazenamento por congelamento a baixas temperaturas,
tratamento com acetona ou solução de hipoclorito ou ainda o uso de fortes
centrifugações das células contendo PHA tendem a elevar a cristalinidade do
polímero.
32
Ainda, Hahn et al. (1995) compararam as propriedades de cristalinidade,
estabilidade térmica e massa molar do polímero antes e depois do processo de
extração e concluíram que esta técnica apresentava a vantagem de reduzir a
degradação polimérica, porém, continuava promovendo diminuição da massa molar
com o aumento da concentração do hipoclorito. A cristalinidade foi extremamente
incrementada após o processo, passando de 16 % no estado amorfo no interior da
célula para 65 % após a extração. Quanto à estabilidade térmica, após o processo
de extração, o P(3HB) apresentou-se mais estável. Hejazi et al. (2003) observaram
que esta técnica utilizava um volume elevado de solvente organoclorado.
Já a digestão enzimática é um método vantajoso por ser um processo
seletivo e eficiente em termos energéticos, além de oferecer menor risco de danos
ao produto quando comparado com outras metodologias, porém não é um processo
economicamente atrativo (JACQUEL et al., 2008).
A empresa química Britânica Imperial Chemical Industries (ICI) desenvolveu
um método diferenciado que consiste no tratamento térmico da biomassa contendo
P(3HB) seguido de digestão enzimática, dissolvendo o material celular (exceto
P(3HB)) com surfactantes aniônicos (HOLMES & LIM, 1990). O método atingiu cerca
de 90 % de eficiência, porém, resultou em alto custo, devido ao tratamento
enzimático e à etapa de digestão adicional para obter alta pureza.
Outra técnica usando uma solução aquosa de surfactante e quelante foi
desenvolvida com o objetivo de melhorar a pureza. O rendimento de extração e a
massa molar viscosimétrica também foram investigados. Porém, os autores Chen et
al. (2001b) concluíram que apesar do aumento de pH elevar o grau de pureza do
polímero obtido, este causava redução da massa molar viscosimétrica, gerando
ainda, um grande volume de águas residuais durante o processo.
Os métodos de ruptura mecânicos surgem como uma alternativa
interessante, por serem econômicos e amplamente aplicáveis para técnicas de
extração em larga escala (MIDDELBERG, 1995).
Um método mecânico alternativo desenvolvido para extração do P(3HB)
baseia-se na ruptura celular por pérolas de vidro em um moinho de bolas, resultando
em um produto com rendimento de extração 64 % e pureza de 89 % (GARCIA,
2006).
33
Outro processo mecânico, homogeneização por alta pressão, foi baseado na
solubilização dos componentes não-P(3HB) usando detergentes e enzimas
acopladas com múltiplas centrifugações. A técnica apresentou-se eficiente na
ruptura celular, contudo o processo para remoção dos resíduos celulares recebeu
pouca atenção, pois o processo elevou o custo de produção e produziu um polímero
de qualidade inferior, o que foi considerado inaceitável para a indústria (LING et al.,
1997).
Outros autores também adotaram um processo de homogeneização por alta
pressão, porém muitos inconvenientes foram relatados, como, por exemplo, a
micronização (processo de moagem ultrafina de produtos) de resíduos celulares,
que dificultava a separação subsequente sólido-líquido por processos convencionais
como a centrifugação ou a filtração (CHEN et al., 1999).
De acordo com Kim et al. (2003), a maioria das técnicas acima mencionadas
para extração de P(3HB) requerem passos adicionais e pré-tratamentos, métodos
considerados ambientalmente incorretos ou não-amigáveis, devido à excessiva
geração de resíduos, sendo ainda dispendiosos. Desta forma, faz-se necessário o
desenvolvimento de novos métodos de extração que dispensem passos de pré-
tratamento.
Assim, nenhum método é totalmente inócuo ao polímero quando se trata de
isolamento ou extração de PHAs ou P(3HB) e por isso inúmeros estudos têm sido
realizados para reduzir os danos que podem ocorrer ao polímero ainda na fase de
extração (GARCIA, 2006; FIORESE, 2008).
Pode-se observar a partir da Tabela 2 a comparação entre os métodos de
recuperação de PHAs.
34
Tabela 2: Comparação dos métodos de extração de polihidroxialcanoatos. Fonte: JACQUEL
et al., 2008, modificado.
Método de isolamento Vantagens Desvantagens
Extração com solvente Eliminação de endotoxina
Alta pureza
Não degrada o polímero
Rompimento da
morfologia natural do
grânulo de PHA
Riscos relacionados à
utilização de solventes
halogenados
Baixa recuperação
Quantidade elevada de
solvente
Digestão com surfactantes Tratamento de alta
densidade celular
Não degradação do
polímero
Baixa pureza
Necessidade de
tratamento de águas
residuais
Digestão com NaOCl Alta pureza Degradação do polímero
Digestão com NaOCl e
clorofórmio
Baixa degradação do
polímero
Pureza elevada
Quantidade elevada de
solvente
Digestão com surfactante
e quelante
Grau de pureza elevado
Impacto ambiental
reduzido
Grande volume de água
residual
Digestão enzimática Boa recuperação Alto custo com enzimas
Mecânico Método econômico
Amplamente aplicável em
larga escala
Quantidade reduzida de
solvente
Dificuldade de remoção
de resíduos celulares
35
2.9 Identificação e caracterização de PHAs
A caracterização do bioplástico é necessária pelo fato de os PHAs
pertencerem a uma grande família de diferentes poliésteres, com mais de 100
unidades monoméricas já identificadas (SQUIO & ARAGÃO, 2004). Assim, as suas
propriedades irão depender da sua composição monomérica e poderão ser definidas
as suas aplicações em função das características específicas (STEINBUCHEL &
VALENTIN, 1995).
Diversas técnicas de identificação e caracterização de polímeros têm sido
utilizadas para os polihidroxialcanoatos. Dentre as técnicas espectroscópicas pode-
se citar Espectrometria de Massas (EM), Espectrometria de Ressonância Magnética
Nuclear (ERMN), Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR) e raios-X. Análises térmicas como, por exemplo, a termogravimetria (TGA) e
a calorimetria exploratória diferencial (DSC) podem ser utilizadas para
caracterização, pelo fato de os polímeros serem compostos orgânicos, sendo suas
características físicas e químicas fortemente influenciadas pela temperatura
(SILVERSTEIN et al., 2007; CANEVAROLO et al., 2007).
O espectro de absorção no infravermelho é hoje um dos métodos mais
rápidos para caracterizar os grupos funcionais de um composto químico (COSTA
NETO, 2005). Através desta análise, moléculas simples podem produzir espectros
extremamente complexos, e correlacionando as bandas formadas, como com a
comparação de um espectro de um composto desconhecido com o de uma amostra
conhecida obtém-se boa prova de identidade, é muito pouco provável que dois
compostos diferentes tenham o mesmo espectro de infravermelho (SILVERSTEIN et
al., 2007). A característica mais importante de um espectro no infravermelho é o
valor das frequências de absorção da molécula (bandas), parâmetro fundamental
para sua identificação ou para a interpretação do espectro, visando à caracterização
de funções químicas nele presentes (COSTA NETO, 2005).
Outra técnica bastante utilizada para caracterização de polímeros é
calorimetria diferencial de varredura (DSC), na qual é medida a absorção ou
liberação de calor em função da temperatura em que ocorrem as mudanças
químicas ou físicas no polímero. Alterações de temperatura da amostra são devidas
36
a variações de entalpia endotérmicas ou exotérmicas decorrentes de transições
físicas ou de reações químicas. As variações de entalpia são chamadas transições
de primeira ordem, como fusão, cristalização, vaporização, solidificação e adsorção
(GALEGO et al., 2000).
A transição térmica dita de segunda ordem, conhecida como transição vítrea
(Tg), é acompanhada pela variação da capacidade calorífica da amostra, juntamente
com variações dimensionais e viscoelásticas, mas não apresenta variações de
entalpia. Assim, estas transições não geram picos nas curvas de DSC,
manifestando-se na forma de uma alteração na linha de base (SPIER, 2005).
37
3 HIPÓTESE E OBJETIVOS
3.1 Hipótese
A otimização da metodologia clássica de extração de poli(3-hidroxibutirato)
aumentará o rendimento e diminuirá a degradação do polímero e impacto econômico
e ambiental.
3.2 Objetivo Geral
Otimizar a metodologia clássica de extração de poli(3-hidroxibutirato)
utilizando clorofórmio como solvente.
3.3 Objetivos Específicos
- Otimizar o tempo de extração;
- otimizar a separação célula/solvente;
- apontar o estado da célula (fresca ou seca) mais adequado;
- otimizar a proporção de solvente;
- determinar o rendimento de biofilme para cada metodologia;
- caracterizar química e termicamente os biofilmes extraídos;
- avaliar a influência das metodologias nas características do polímero.
38
4 CAPÍTULO 1 - OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA DE EXTRAÇÃO QUÍMICA
CLÁSSICA DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO) SINTETIZADO POR Ralstonia
solanacearum
Os plásticos convencionais, obtidos a partir do petróleo, devido a sua
durabilidade e resistência, têm sido por décadas, usados indiscriminadamente,
porém, provocam sérios impactos ambientais, seja nos aterros sanitários ou nos
ambientes em que são erroneamente descartados (SERAFIM et al., 2002; LUENGO
et al., 2003; REDDY et al., 2003).
Preocupados em minimizar este desequilíbrio ambiental, pesquisadores têm
buscado substitutos para os plásticos petroquímicos. Bioprocessos podem ser
empregados como ferramenta para obtenção de polímeros biodegradáveis da
família dos polihidroxialcanoatos (PHAs).
PHAs são acumulados no citoplasma bacteriano como inclusões de
poliésteres insolúveis, correspondendo até 90 % da massa celular (KUNASUNDARI
& SUDESH, 2011). A síntese de PHAs, materiais de reserva intracelular de energia
e carbono para os microrganismos, ocorre quando há condições desfavoráveis de
crescimento e excesso de carbono (MADISON & HUISMAN, 1999). Por possuir
propriedades físicas, como ponto de fusão, grau de cristalinidade e temperatura de
transição vítrea comparáveis ao polipropileno (PP), o polihidroxibutirato P(3HB) é o
biopolímero mais estudado dentre os PHAs e o mais utilizado em plásticos
biodegradáveis (HOLMES, 1985; CHANPRATEEP, 2010).
São conhecidos mais de 300 microrganismos capazes de sintetizar PHAs,
mas são poucos os efetivamente empregados na sua produção, incluindo Ralstonia
sp., Cupriavidus necator e Pseudomonas sp. e Escherichia coli recombinante
(CHANPRATEEP, 2010). Dentre eles, a Ralstonia spp. é um dos que apresenta
condições mais favoráveis à produção industrial, possui elevados rendimento e
velocidade de produção (RAMSAY et al., 1990). Este microrganismo pode acumular
cerca de 80 % de sua massa seca em polímero com alta massa molar, e utilizar
diferentes tipos de substratos, como glicose, frutose, entre outros (BYROM, 1987).
O inconveniente para a utilização é o preço, que em alguns casos chegam a
custar até cinco vezes o preço do plástico sintético. Conhecendo-se o processo e
39
sabendo-se que a etapa de extração é a mais problemática e também a mais
onerosa, a qual compreende 50 % ou mais do custo total do processo
(KUNASUNDARI & SUDESH, 2011), as pesquisas têm sido orientadas buscando a
melhoria e a minimização dos custos dessa etapa. Vários métodos de extração
foram desenvolvidos para a recuperação de PHAs, como extração do polímero por
solventes, como clorofórmio, por digestão com hipoclorito de sódio, surfactante e
quelante, enzimas, e rompimento mecânico (LEE et al., 1996a; LEE, 1996,
KESSLER & WITHOLT, 2001; GARCIA, 2006; JACQUEL et al., 2008)
Entretanto, a extração também influi na qualidade do polímero recuperado, o
uso de solventes, por exemplo, pode trazer alta pureza para o material formado (>99
%), porém, muitas vezes, gera problemas ambientais e como são necessários
grandes quantidades de solventes, cerca de 20 partes para 1 de polímero, resulta
em um aumento significativo de custo (LEE, 1996a). Métodos baseados na digestão
da porção não PHA da célula, como a utilização de hipoclorito de sódio, ocasiona
redução da massa molar do biopolímero devido a ocorrência de grande degradação
de P(3HB) durante a digestão (LEE, 1996a). Já a digestão enzimática, é um método
vantajoso, por ser um processo seletivo e eficiente em termos energéticos, além de
oferecer menor risco de danos ao produto, quando comparado com outras
metodologias, porém, não é um processo economicamente atrativo (JACQUEL et
al., 2008). Assim, nenhum método é totalmente inócuo ao polímero, quando se trata
de isolamento ou extração de PHAs ou P(3HB), por isso, inúmeros estudos têm sido
realizados para reduzir os danos que podem ocorrer ao polímero ainda na fase de
extração (GARCIA, 2006; FIORESE, 2008).
Portanto, a recuperação do bioplástico consiste em uma etapa importante no
processo de produção. O desenvolvimento de metodologias seguras e econômicas
que utilizem solventes nos quais o biopolímero seja solúvel é fundamental para uma
produção de P(3HB) economicamente atrativa (REDDY et al., 2003).
40
4.1 Material e Métodos
4.1.1 Microrganismo
Foi utilizada linhagem de Ralstonia solanacearum, cedida pelo Laboratório
de Bacteriologia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de
Pelotas. A bactéria foi preservada por meio das técnicas de liofilização e repiques
mensais em Nutritive Yest Agar (NYA), com composição em g/L, de peptona, 5,0 g;
glicose, 5,0 g; extrato de levedura, 1,0 g; extrato de carne, 3,0 g e agar, 15,0 g
(SCHAAD et al., 2001, modificado) estocadas sob congelamento a -8 °C e
refrigeração a 4 °C, respectivamente.
4.1.2 Produção de P(3HB)
A produção de P(3HB) foi realizada em duas etapas, sendo a primeira a
multiplicação celular. Para esta etapa foi utilizado o meio de cultivo Yest Malt (YM)
(JEANES, 1974). O inóculo foi realizado em frascos Erlenmeyers aletados de 500
mL, contendo 160 mL de meio YM e 40 mL suspensão bacteriana (obtida através da
raspagem de placas incubadas durante 48 h a 28 °C). As condições de cultivo foram
28 ºC e 150 rpm por 24 h em incubador agitador orbital. Ao final do processo obteve-
se inoculo contendo 5,5 g/L de massa celular seca.
O inóculo obtido foi utilizado na segunda etapa, denominada de acúmulo ou
produção de P(3HB). Para a produção de PHA foram utilizados frascos Erlenmeyers
aletados de 500 mL contendo 160 mL de meio de produção F4 (OLIVEIRA, 2010), e
40 mL de inóculo. A fermentação foi mantida na temperatura de 28 °C e 200 rpm em
período de tempo de 72 h.
4.1.3 Avaliação da presença de corpos lipofílicos
A investigação prévia da presença de corpos lipofílicos na linhagem
estudada foi feita por método de coloração com Sudan Black (LELLIOT, 1987)
modificado por Oliveira (2010) através da redução do tempo de coloração com
41
safranina. Os esfregaços foram feitos em lâminas de vidro utilizando alçadas do
inóculo da linhagem Ralstonia solanacearum fixadas em bico de Bunsen. O
esfregaço foi coberto com o corante Sudan Black 0,3 % m/v por tempo de 10 min,
logo as lâminas foram lavadas com xilol e posteriormente com água, foram secas
com papel absorvente e cobertas com o corante safranina 0,5 % por 15 s. Após,
foram lavadas com água e secas naturalmente. Por fim, foram visualizadas em
microscópio óptico utilizando lente de imersão.
4.1.4 Determinação do rendimento em massa celular fresca e seca
Ao completar 72h de fermentação o caldo foi centrifugado a 10.000 x g por
15 min, o pellet foi ressuspenso em solução salina 0,89 % e novamente centrifugado
por 10 min. A massa celular fresca (MCF) obtida foi determinada por gravimetria. A
massa celular seca (MSC) foi obtida mediante secagem da MCF em placas de Petri
em estufa a 56 °C. Para analisar a equivalência de célula fresca comparada à célula
seca, foram pesadas 1 g de célula fresca em placas de Petri em triplicata e foram
secas em estufa na temperatura de 56 °C. Após, atingir peso constante foi realizado
o cálculo de proporção.
4.1.5 Extração do polímero
4.1.5.1 Otimização de tempo de extração e separação célula/solvente
A extração foi realizada utilizando clorofórmio 40:1 (v/m) e MCS. A amostra
foi mantida em frasco de Duran, submetida à agitação magnética em temperatura de
58 °C em diferentes tempos (2 h, 1 h 30 min, 1 h, 30 min e 15 min). Após, a massa
celular foi separada do solvente por duas formas (DALCANTON, 2006, modificado):
a) filtragem da amostra em papel filtro quantitativo e transferência para placa de
Petri tampada e armazenada em capela de exaustão de gases, para a lenta
evaporação do solvente e formação do biofilme;
42
b) Transferência da amostra para funil de decantação e adição de 40 partes de água
destilada, leve agitação e, após, repouso para a separação de fases e transferência
da fase orgânica para placa de Petri tampada e armazenada em capela de exaustão
de gases, para a lenta evaporação do solvente e formação do biofilme.
4.1.5.2 Otimização de estado da célula (fresca ou seca) e proporção de
solvente
Para esta etapa foi utilizada a metodologia com melhores rendimentos de
filme, ou seja, no tempo de extração de 30 min e separação da célula/solvente com
funil de decantação. A extração foi realizada utilizando clorofórmio nas proporções
40:1, 20:1 e 10:1 (v/m) e massa celular seca ou fresca. Para verificar se ainda
restava polímero na célula, foi realizada uma segunda passagem de solvente no
funil de decantação, sendo este conteúdo transferido para uma segunda placa de
Petri.
4.1.6 Quantificação de acúmulo de P(3HB) por Cromatografia Gasosa
(GC)
Para determinar o percentual de P(3HB) acumulado em relação à massa
celular seca foi realizada a GC. A metanólise foi realizada segundo metodologia
proposta por Braunegg et al. (1978) modificada por Brandl et al. (1988). Em tubos de
ensaio com vedação foram pesadas 10 mg de MCS para cada amostra e adicionado
2 mL de metanol acidificado (H2SO4 15 %), contendo ácido benzóico 0,4 g/L (padrão
interno), e 2 mL de clorofórmio. Os tubos foram agitados e mantidos a 100 ºC
durante 60 min, quando foram agitados novamente e colocados por mais 80 min no
aquecimento. Os tubos foram transferidos para banho de gelo, adicionados de 1 mL
de água destilada e agitados. Após, os tubos foram mantidos por 24 h em repouso
para decantação dos restos celulares e formação das fases; a fase orgânica inferior,
que contém o éster solubilizado no clorofórmio, foi transferida com pipetas Pasteur
para vials e as amostras armazenadas sob refrigeração e enviadas para análise.
43
A análise da fase inferior foi realizada em cromatógrafo gasoso Shimadzu®
GC 17A, equipado com coluna DB Waxetr (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) e detector de
ionização de chama (FID). O gás de arraste foi o hidrogênio (1 mL/min).
Temperatura inicial de 80 °C foi mantida durante 1 min, após a temperatura foi
elevada a 11 °C/min até 200 °C e mantida durante 4 min. Foi injetado manualmente
1 µL de amostra. A temperatura do injetor foi de 260 °C e a do detector foi de 280
°C. A análise quantitativa foi realizada pelo método de padronização interna pelo
ácido benzoico. A curva de calibração foi preparada a partir de P(3HB) e do padrão
interno ácido benzoico.
4.1.7 Determinação de rendimento dos processos de recuperação
Após sua recuperação, os filmes foram pesados para o cálculo de
rendimento, que foi expresso em porcentagem. Para a determinação de rendimento
foi utilizada a seguinte equação (1).
rendimento= mf
P(3HB) ×100 (1)
onde: mf é a massa total do filme recuperado e P(3HB) é o acúmulo de
polímero na massa celular antes da extração.
Todas as médias foram comparadas e analisadas estatisticamente pelo teste
de Tukey p < 0,05 no programa Statistix 9.
44
4.1.8 Métodos analíticos
4.1.8.1 Espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier
(FTIR)
Os biopolímeros recuperados foram identificados por FTIR. Os filmes
poliméricos dissolvidos em clorofórmio e o padrão de P(3HB) foram dispostos em
pastilhas de KBr. Para confecção das pastilhas, 1 mg de amostra foi dissolvida em 1
mL de clorofórmio. Para obtenção do espectro foi utilizado o espectrômetro IR com
transformada de Fourier Shimadzu® modelo IR Prestige 21. As imagens foram
adquiridas dentro de uma faixa de 4500-500 cm-1 com uma resolução de 4 cm-1
(CROCHEMORE, 2012).
4.1.8.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) e Análise
termogravimétrica (TGA)
A análise de DSC foi realizada com o aparelho Perkin Elmer®, modelo Pyris
6. As condições de análise às quais as amostras foram submetidas são descritas a
seguir: isoterma de 20 °C durante 1 min; aquecimento de 20 °C a 200 °C com taxa
de 10 °C/min; isoterma de 200 °C durante 5 min; resfriamento de 200 °C a 20 °C
com taxa de 10 °C/min; isoterma de 20 °C durante 5 min; aquecimento de 20 °C a
200 °C com taxa de 10 °C/min. Usou-se uma atmosfera de nitrogênio a uma razão
de 20 mL/min.
Para verificar a influência da história térmica na obtenção das amostras,
foram observados os valores de temperatura de fusão cristalina (Tm) no primeiro
ciclo de aquecimento. Contudo, a fim de eliminar a história térmica do material as Tm
foram obtidas também no segundo ciclo de aquecimento. O grau de cristalinidade
(Xc) foi determinado a partir da entalpia de fusão da amostra (ΔHm) e a entalpia de
fusão de P(3HB) puro cristalino (ΔHm = 146 J/g) (GOGOLEWSKI et al., 1993).
45
Para verificar a estabilidade térmica [temperatura do início de degradação
(Ti) e temperatura de máxima degradação (Tpico)] dos polímeros extraídos pelas
diferentes metodologias, realizou-se a análise de TGA.
As amostras foram aquecidas de 30 a 500 °C a uma taxa de aquecimento de
10 °C/min sob uma atmosfera de nitrogênio com uma razão de 50 mL/min; no
equipamento Perkin Elmer®, modelo Pyris 6.
4.1.8.3 Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)
A análise de cromatografia de permeação em gel (GPC), para estimar a
massa molecular dos polímeros extraídos, foi realizada pelos analistas da PHB
Industrial S.A, sediada em Serrana/SP, segundo metodologia própria e não
disponibilizada, utilizando bomba isocrática Waters® 1515, forno para colunas
Waters®, injetor automático Waters® 717 plus, detector de índice de refração
Waters® 2414 e colunas Styragel® (103, 104, 105 e 106 Aº; de 7,80 mm x 300 mm).
As amostras foram solubilizadas em clorofórmio, filtradas em membrana
0,45 µ e adicionadas de tolueno como pico marcador, antes da injeção. Para a fase
móvel foi utilizado clorofórmio grau HPLC. A massa molecular foi calculada a partir
de uma curva de calibração, que foi construída com no mínimo 10 pontos, os quais
cobrissem a faixa de concentração para as massas molares das amostras.
4.2 Resultados e Discussão
4.2.1 Avaliação da presença de corpos lipofílicos
Os esfregaços de amostra do inóculo, corados e visualizados em lente de
imersão de microscópio óptico, com câmera fotográfica acoplada, foram registrados
fotograficamente. O resultado é demonstrado na Figura 7.
46
Figura 7. Esfregaço do inóculo de R. solanacearum, obtido após 24h de incubação em meio
Yest Malt, corado com Sudan Black e visualizado em lente de imersão em microscopia óptica.
Exemplos de células coradas contendo a) dois grânulos e b) três grânulos lipofílicos em destaque.
O corante Sudan Black atua por difusão simples, corando corpos lipofílicos,
como os grânulos de PHAs, gerando uma coloração negro azulada (LELLIOT &
STEAD, 1987), a qual possibilita sua visualização em microscópio óptico e indica
resultado positivo (ANDERSON & DAWES, 1990). Assim, pode-se inferir que a
linhagem de Ralstonia solanacearum é potencialmente produtora de P(3HB)s,
apresentando pontos negros azulados.
Quanto à disposição dos grânulos nas células, observando-se as
micrografias, as amostras corresponderam ao relatado na literatura para o gênero
bacteriano analisado, ou seja, os esfregaços apresentaram no mínimo dois grânulos
distribuídos um em cada polo da célula. Esta distribuição é encontrada em grande
parte das células no estágio inicial de acúmulo de P(3HB)s e também foi observada
por Jendrossek et al. (2007), que relataram que algumas bactérias, como
Xanthobacter autotrophicus, Caryophanon lattum, Rhodospirillum rubrum, Ralstonia
eutropha e Escherichia coli recombinante também apresentaram o mesmo padrão
de formação dos grânulos de P(3HB) no início do estágio de formação; os autores
sugeriram que um novo grânulo pode ser formado próximo ao local de formação do
septo de divisão celular. Já a presença de um terceiro grânulo, também observado
em nossas análises, normalmente ocorre na região central do bacilo
(CROCHEMORE et al., 2012).
47
4.2.3 Extração do polímero
4.2.3.1 Otimização de tempo de extração e separação célula/solvente
Através da quantificação de P(3HB) por cromatografia gasosa, foi verificado
o acúmulo de 51,15% de polímero em relação à massa celular seca. A partir deste
resultado, foram analisados os rendimentos de polímero nas extrações realizadas.
Os rendimentos da extração dos biopolímeros para os filmes obtidos nesta
etapa podem ser observados na Figura 8.
Figura 8. Rendimento dos filmes utilizando as metodologias de extração com papel filtro e com
funil de decantação, após aquecimento, em diferentes intervalos de tempo, sob agitação. Letras
minúsculas e maiúsculas diferentes significam que as médias obtidas com as respectivas
metodologias diferiram estatisticamente pelo teste de Tukey p < 0,05.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2h 1h30min 1h 30min 15min
ba a
bc
C C C
A
B
Ren
dIm
en
to (
%)
Tempo (h)
Papel Filtro Funil Separação
48
Ao comparar as duas metodologias verificou-se que os melhores
rendimentos foram obtidos através da metodologia utilizando o funil de decantação
para a separação da massa celular do clorofórmio, independentemente do tempo de
extração. Utilizando a metodologia com papel filtro para separar restos celulares/
solução extrativa, o rendimento foi 49,5; 52,8; 52,2; 48,9 e 45,2 % para os tempos de
extração de 2 h, 1 h 30 min, 1 h, 30 min e 15 min, respectivamente. Já para a
metodologia utilizando funil de decantação, o melhor rendimento, 96,8 %, foi obtido
no tempo de 30min, seguido do tempo de 15min, 77,2 %, e os menores rendimentos
para esta metodologia foram obtidos pelas extrações mais longas, 2 h, 1 h 30 min e
1 h, com rendimentos de 66,9; 68,2 e 69 %, respectivamente, sem diferença
estatística significativa.
O menor rendimento obtido com o processo de extração utilizando filtragem
deve-se ao fato de que ocorrem perdas devido ao acúmulo de polímero adsorvido no
papel filtro. A interação entre PHAs e celulose é um fato conhecido e que, inclusive,
pode ser aproveitado para confecção de materiais híbridos, como papelão revestido
por P(3HB), para obtensão de impermeabilidade (VIEGAS, 2005).
Pode-se perceber que os rendimentos não foram proporcionais ao tempo de
extração. A redução de rendimento ocasionada com o aumento de tempo de
agitação com aquecimento ocorreu, provavelmente, devido à degradação do
polímero.
4.2.3.2 Otimização de estado da célula (seca ou fresca) e proporção de
solvente
Após a realização da etapa anterior foi observado que o melhor rendimento
foi obtido através da utilização do funil de decantação para separação dos resíduos
celulares/solução extrativa no tempo de 30 min. Assim, a segunda etapa foi
elaborada levando em consideração estes resultados. Os biofilmes extraídos podem
ser visualizados na Figura 9, obtiveram-se filmes poliméricos maleáveis ao
manuseio, não quebradiços e de coloração esbranquiçada.
49
Figura 9. Filmes poliméricos extraídos em Massa Celular Seca (S) e Fresca (F) nas
proporções de solvente 10:1, 20:1 e 40:1 (v/m).
Os rendimentos da extração para os filmes obtidos nessa etapa podem ser
observados na Figura 10.
50
Figura 10. Rendimento dos biofilmes obtidos utilizando as metodologias de extração dupla a
partir de massa celular seca (S) e massa celular fresca (F) com proporções de solvente 10:1, 20:1 e
40:1 (v/m). Letras minúsculas e maiúsculas diferentes significam que as médias obtidas diferiram
estatisticamente pelo teste de Tukey p < 0,05.
Os rendimentos obtidos para a massa celular seca na primeira extração
foram 41,8; 57,9 e 98 %, para as proporções de solvente 10:1, 20:1 e 40:1 (v/m),
respectivamente. Para verificar se ainda restava polímero presente na massa
celular, foi realizada uma segunda extração nas mesmas proporções de clorofórmio.
Na segunda extração foram extraídas 21,7; 8,8 e 1,4 % de polímero para as
proporções 10:1, 20:1 e 40:1 (v/m), respectivamente.
Pode-se observar que o rendimento foi diretamente proporcional ao volume
de solvente utilizado, ou seja, o melhor rendimento para a célula seca foi alcançado
na proporção 40:1 (v/m). A utilização de maior volume de solvente induz à quebra da
emulsão formada durante a adição de água para formação de fases de polaridade
distintas: fase aquosa com restos celulares (maior polaridade)/fase clorofórmica ou
solução extratora (menor polaridade). Além disso, essa condição foi a que extraiu a
menor porcentagem de polímero na segunda extração, o volume de solvente
utilizado foi o mais eficiente, evidenciando assim, a extração de praticamente todo o
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S F S F S F
B
a
B
ab
A
b
Re
nd
ime
nto
(%
)
Proporção solvente (v/m)
1° Extração 2° Extração
10:1 20:1 40:1
51
biopolímero produzido. Para verificar a quantidade realmente necessária de solvente
na segunda extração, realizou-se testes com quantidades decrescentes de solvente.
Como qualquer forma de aquecimento ou secagem implica em maiores
gastos de energia, verificou-se a possibilidade da extração do P(3HB) ser realizada
a partir da massa celular fresca. Para estas, o rendimento foi inversamente
proporcional ao volume de solvente utilizado. O melhor rendimento (17,6 %) foi
obtido com a menor proporção de clorofórmio, 10:1 (v/m); os outros rendimentos
foram 16,4 % para 20:1 (v/m) e 7,2 % para 40:1 (v/m). Da mesma forma que foi
realizada a segunda extração para massa celular seca, foi feita para a célula fresca,
na qual a proporção de solvente 40:1 (v/m) foi a que retirou a menor porcentagem de
filme (0,6 %). Nas outras proporções de solvente, 20:1 e 10:1 (v/m) foram retirados
1,7 e 3,3 %, respectivamente.
Através da análise de proporção célula seca x fresca, sabe-se que 1g de
célula seca equivale a 3,18 g de célula fresca. Com isso, os melhores rendimentos
para a célula fresca equivaleriam 55,9 e 52,2 % de filme nas proporções de
solventes 10:1 e 20:1 (v/m) respectivamente, médias que não se diferiram
estatisticamente. Sendo estes rendimentos ainda muito inferiores aos 98 %
conseguidos com a extração na célula seca na proporção de solvente 40:1 (v/m).
Para as extrações com massa celular fresca não se realizou a etapa de verificação
da quantidade de solvente adequada à segunda extração.
4.2.3.3 Teste de proporção de solvente decrescente na 2° extração
para massa celular seca
Para verificar a quantidade realmente necessária de solvente na segunda
extração, realizou-se testes com quantidades decrescentes de solvente, os
rendimentos foram dispostos na Tabela 3.
52
Tabela 3. Rendimento de extração de P(3HB) de célula seca com proporção de solvente 40:1
(v/m) na 1° extração e 20:1, 40:1 (v/m) na 2° extração.
Proporção de
solvente (v/m)
Rendimento 1°
Extração (%)
Rendimento 2°
Extração (%)
20:1 97,8 1,3
40:1 97,3 2,1
Os rendimentos de polímero na segunda extração com proporção de
solvente 20:1 e 40:1 (v/m) foram 1,3 e 2,1 %, respectivamente. Estes resultados não
diferiram estatisticamente. Não foi possível realizar a segunda extração com
proporção de solvente 10:1 (v/m) devido à formação de emulsão, impossibilitando a
separação das fases orgânica e inorgânica no funil de separação. A partir destes
resultados, selecionou-se o uso da proporção de solvente 20:1 (v/m) na segunda
extração, para maior redução do volume de solvente utilizado.
4.2.4 Caracterização dos P(3HB)s extraídos
4.2.4.1 Espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier
(FTIR)
A identidade química do filme formado a partir dos filmes extraídos foi
confirmada por Espectrometria no Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR). As principais bandas obtidas foram analisadas e o espectro FTIR do P(3HB)
obtido pela metodologia com célula seca e proporção de solvente 40:1 (v/m) é
mostrado na Figura 11, como exemplo. Foram obtidas bandas características de
P(3HB) para todas as amostras analisadas.
53
Figura 11. Espectro FT-IR para o polímero extraído pela metodologia otimizada, com massa
celular seca e proporção de solvente 40:1 (v/m).
Todos os espectros apresentaram as frequências vibracionais características
para o P(3HB) de acordo com os dados apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Principais frequências vibracionais para o sistema o Biopolímero P(3HB).
Grupo Funcional Número de
Onda (cm-1)
*Modo
Vibracional
Referência
CH3 2972 as SILVERSTEIN et al., 1981
CH3 2872 s SILVERSTEIN et al., 1981
CH2 2933 as STUART et al., 2004
CH2 2853 s STUART et al., 2004
C=O 1721-1727 PAVIA et al., 2010
CH2 1454-1459 s STUART et al., 2004
CH3 1378 s SILVERSTEIN et al., 1981
C-O 1300-1000 PAVIA et al., 2010
= estiramento = deformação s = simétrico (a) as = assimétrico (a)
*Valores obtidos experimentalmente
As bandas características identificadas no biopolímero obtido neste estudo
estão de acordo com os reportados na literatura para P(3HB) (KHARDENAVIS et al.,
2006; LUGG et al., 2008; CROCHEMORE et al., 2012).
10001500200030004000
1/cm
60
80
100
%T
54
4.2.4.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) e Análise
termogravimétrica (TGA)
Os resultados das análises de DSC e TGA podem ser observados na Tabela
5.
Tabela 5. Valores de temperatura de fusão cristalina (Tm) no primeiro e segundo ciclo de
aquecimento e grau de cristalinidade (Xc) para análise de DSC e temperatura de início de degradação
(Ti), temperatura máxima de degradação (Tpico) e porcentagem de perda de massa determinados a
partir das curvas de TGA de filmes de P(3HB) extraídos de célula seca (S) e fresca (F), com
diferentes proporções de solvente, e P(3HB) comercial Sigma-Aldrich® e Biocycle®.
Amostra de P(3HB) Tm1 (°C) Tm 2 (°C) Xc (%) Ti (°C) Tpico (°C) Perda de
massa (%)
Sigma-Aldrich® 167 144 19 230 262 99
Biocycle® 167 166 49 259 280 100
S10 176 172 52 223 289 86
S20 176 170 63 220 270 79
S40 176 172 52 219 292 82
F10 179 172 51 210 269 87
F20 178 175 37 213 266 85
F40 177 170 44 208 241 76
Todas as amostras de P(3HB) extraídas obtiveram temperaturas de fusão
superiores aos P(3HB) comerciais Sigma-Aldrich (144 °C) e Biocycle (166 °C), e
apresentaram temperaturas dentro do intervalo literário referenciado para P(3HB).
Esses valores podem variar de 154 °C (CROCHEMORE, 2014) a 180 °C (LIMA,
1992), sendo mais comum valores a partir de 160 °C (VALAPPIL et al., 2007; YEZZA
et al., 2007; CHAIJAMRUS & UDPUAY, 2008; HONG et al., 2008). Não foi possível
estabelecer uma relação entre as temperaturas de fusão encontradas e as
proporções de solventes utilizadas. Dalcanton (2006) extraiu P(3HB) de Ralstonia
eutropha pela metodologia padrão de extração por clorofórmio com aquecimento e
encontrou valores semelhantes aos citados no presente estudo, a Tm dos
bioplásticos teve valores próximos de 175 °C no segundo ciclo de aquecimento.
55
Semelhantemente ao ponto de fusão, não foi encontrada, para as demais
propriedades térmicas analisadas, relação com as proporções de solvente.
Entretanto, a utilização de células secas resultou em maiores cristalinidades Xc (%).
O P(3HB) é definido como um material semicristalino, rígido e quebradiço, o
que limita suas aplicações, pois apresenta um grau de cristalinidade na faixa de 60 a
80 % (KHANNA e SRIVASTAVA, 2005). Porém, na literatura são encontrados
valores de grau de cristalinidade (Xc) bastante variados, como de 41 a 54 % para
P(3HB) produzidos por Ralstonia solanacearum (RODRIGUES et al., 2014), de 42 a
50 % para P(3HB) produzidos por Bacillus megaterium (REDDY et al., 2009) e de 29
a 58 para P(3HB)s produzidos por Pseudomonas sp CMM43 (CROCHEMORE,
2014). Os valores de Xc dos biofilmes oriundos de célula seca, 52 a 63 %, foram
superiores aos valores obtidos para célula fresca, os quais se encontraram na faixa
de 35 a 51 %. Todos os filmes extraídos tiveram baixa cristalinidade, quando
comparados à valores da literatura, sendo esta uma característica importante, pois
aumenta a flexibilidade.
O tempo de biodegradação também é diretamente influenciado pelo grau de
cristalinidade, o que torna os polímeros de baixa cristalinidade desejáveis, em
função do menor tempo de biodegradação (LEE, 1996). No presente estudo, os
polímeros extraídos de células frescas apresentam menor cristalinidade e menor
temperatura de degradação. Os filmes com menor grau de cristalinidade possuem
propriedades mecânicas desejáveis para algumas aplicações específicas na área
médica, como em fios de sutura (REDDY et al., 2003), e propriedades de
degradabilidade desejáveis na área farmacêutica, como exemplo em liberação
controlada de fármacos (LEE, 1996).
Através da análise de TGA observa-se que para os filmes extraídos a partir
de massa celular seca as temperaturas de início (Ti 219 a 223 °C) e de máxima
degradação (Tpico 270 a 292 °C) foram superiores às obtidas pelos filmes extraídos a
partir de células frescas (208 a 212 °C para Ti e 241 a 269 °C para Tpico). Esses
resultados indicam que os filmes obtidos a partir de células secas possuem maior
diferença entre as temperaturas de fusão e de degradação e são mais resistentes a
altas temperaturas, o que aumenta a janela de processabilidade, tornando o seu
processamento mais seguro.
56
Os polímeros tiveram perda de massa de 76 a 87 %, sem relação direta
entre esta e o estado da célula e a proporção de solvente utilizado. Na maioria das
amostras de P(3HB) a degradação térmica ocorreu em apenas um estágio de perda
de massa, indicando que o processo ocorre em um único mecanismo de
degradação, como também observado por Duarte (2004) e Garcia (2006). Apenas
para as amostras extraídas na proporção de solvente 40:1 (v/m) a degradação
térmica ocorreu em dois estágios de perda de massa. Normalmente este fenômeno
é tido como consequência da presença de impurezas remanescentes do processo
de extração, como resíduos celulares. Entretanto, as metodologias que empregam o
maior volume de solvente possibilitam, em tese, maior purificação, como também
maior polidispersão do polímero.
4.2.4.3 Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)
Os resultados obtidos para massa molecular podem ser observados na
Tabela 6. Pode-se perceber que os filmes extraídos de célula seca apresentaram
massa molecular inferior aos filmes oriundos de célula fresca. Os valores variaram
de 2,9 a 3,3.105 Da para filmes de MCS e 5,1 a 6,3.105 Da para filmes de MCF.
Tabela 6. Dados de polidispersão e médias de massa molar de filmes de P(3HB) extraídos
a partir de massa celular seca ou fresca nas diferentes proporções de solvente.
Amostras Polidispersão Médias de Massa Molar (Daltons)
(Mw/Mn) Mn Mw
S10 2,3 1,4.105 3,2.105
S20 2,1 1,6.105 3,3.105
S40 2,9 1,0.105 2,9.105
F10 2,2 2,8.105 6,3.105
F20 2,4 2,7.105 6,3.105
F40 3,7 1,4.105 5,1.105
57
A massa molecular (Mw) do P(3HB) produzido por bactérias nativas é
usualmente na faixa de 1x104 a 3x106 Da, com polidispersão (Mw/Mn) em torno de
2,0 (SUDESH et al., 2000), valores os quais corroboram com os encontrados no
trabalho.
A Mw é um fator de extrema importância, pois afeta diretamente a
resistência mecânica do polímero, bem como a capacidade de intumescimento e de
hidrólise e, consequentemente, a taxa de biodegradação, também relacionada com
a sua cristalinidade. Com isso, para o desenvolvimento de sistemas de liberação
controlada utilizando-se os PHAs, há a necessidade de que o polímero tenha a
massa molecular reduzida. Em adição, o aumento da taxa de degradação
promoverá um acréscimo na velocidade de liberação do princípio ativo e,
consequentemente, a matriz polimérica será mais facilmente absorvida pelo
organismo (MONTORO et al., 2010). Além disso, PHAs de baixa massa molecular
podem ser usados como componentes para construir diversas arquiteturas, tais
como, copolímeros em blocos (ARSLAN et al., 2002; ZHANG et al., 2005) e
enxertados, que podem aumentar sua flexibilidade (NGUYEN & MARCHESSAULT,
2004; LAO et al., 2007).
Ainda, é possível verificar uma maior polidispersão nos biofilmes extraídos
com solventes na proporção 40:1 (v/m), para ambos estados de célula utilizados,
confirmando que as metodologias que empregam o maior volume de solvente
resultam em maior polidispersão do polímero.
4.3 Conclusão
A metodologia clássica de extração química de poli(3-hidroxibutirato) por
clorofórmio com aquecimento pôde ser otimizada pela redução em 75 % do tempo
de aquecimento e manutenção da proporção célula/solvente de 40:1 (v/m), seguida
de separação mais rápida e econômica da biomassa seca/solução extrativa
mediante o uso de funil de decantação. Embora o uso de células frescas possa
trazer benefícios pela redução da cristalinidade, há necessidade de manter-se a
utilização de massa celular seca em função da elevada perda de rendimento
58
ocasionada pela utilização de células frescas, nessa metodologia. O estado da
massa celular, principalmente, influi no rendimento da extração, características
térmicas e massa molar.
59
5 CONCLUSÃO GERAL
A metodologia clássica de extração de P(3HB) pôde ser otimizada, resultando
em extração de 98 % do polímero acumulado intracelularmente.
60
6 REFERÊNCIAS
AGUS, J.; KAHAR, P.; ABE, H.; DOI, Y. & TSUGE, T. (2006). Molecular weight characterization of poly[(R)-3-hydroxybutyrate] synthesized by genetically engineered strains of Escherichia coli. Polymer Degradation and Stability, v. 91, p. 1138-1146.
ANDERSON, A.J. & DAWES, E.A. (1990). Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiology Review, v. 54, p. 450-472.
ARSLAN, H.; HAZER, B. & KOWALCZUK, M. (2002). Synthesis and characterization of poly[(R, S)-3-hydroxybutyrate] telechelics and their use in the synthesis of poly(methyl methacrylate)-b- poly(3-hydroxybutyrate) block copolymers. Journal of Applied Polymer Science. 85, p. 965 – 973.
ASTAR, J. & GRUYS, K.J. (2002). Biodegradable polymer: Biopol®. In: STEINBÜCHEL, A. & DOI, Y. Biopolymers, v. 4. Weinheim: WILEY-VCH.
BERGER, E.; RAMSAY, B.A.; RAMSAY, J.A.; CHAVARIE, C. & BRAUNEGG, G. (1998). PHB recovery by hypochlorite digestion of non-PHB biomass. Biotechnology Technology, v. 3, p. 227-232.
BOURQUE, D.; POMERLEAU, Y. & GROLEAU, D. (1995). High-cell-density production of poly-b-hydroxybutyrate (PHB) from methanol by Methylobacterium extorquens: production of high-molecular-mass PHB. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 44, p. 367-376.
BRANDL, H.; GROSS, R.A.; LENZ, R.W. & FULLER R.C. (1988). Pseudomonas oleovorans as a Source of Poly(β-Hydroxyalkanoates) for Potential Applications as Biodegradable Polyesters. Applied and Environmental Microbiology, v. 54, p. 1977-1982.
BRAUNEGG, G.; SONNLEITNER, B. & LAFFERTY, R.M. (1978). A rapid gas chromatographic method for determination of Poly-β-hydroxybutyric acid in microbial biomass. European Journal of Applied Microbiolology and Biotechnology, v. 6, p. 29-37.
BUCCI, D.Z. (2003). Avaliação de embalagens de PHB (poli(ácido 3-hidroxibutírico)) para alimentos. Dissertação de Mestrado (Engenharia de Produção). Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
BYROM, D. (1987). Polymer synthesis by microorganisms: technology and economics. Tibtech, v. 5, p. 246-250.
CANEVAROLO, S.V. (2002). Ciência dos Polímeros: um texto básico para tecnólogos e engenheiros. São Paulo: Artliber Editora.
61
CANEVAROLO, S.V. (2003). Técnicas de Caracterização de Polímeros. São Paulo: Artliber, 1 ed. p. 444.
CANEVAROLO, S.V. (2007). Ciência dos Polímeros: um texto básico para tecnólogos e engenheiros. São Paulo: Artliber Editora. p. 183.
CHAIJAMRUS, S. & UDPUAY, N. (2008). Production and Characterization of Polyhydroxybutyrate from Molasses and Corn Steep Liquor produced by Bacillus megaterium ATCC 6748. Agricultural Engineering International: the cigr e journal, v.7, p. 030.
CHANPRATEEP, S. (2010). Current trends in biodegradable polyhydroxyalkanoates. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 110, n. 6, p. 621-632.
CHEN G.Q & PAGE W.J. (1994). The effect of substrate on the molecular weight of polyhydroxybutyrate produced by Azotobacter vinelandii UWD. Biotechnology Letters, v. 16, p. 155-160.
CHEN, Y.; CHEN, J.; YU, C.; DU, G. & LUN, S. (1999). Recovery of poly-3-hydroxyburate from Alcaligenes eutrophus by surfactante-chelate aqueous system. Process Biochemistry, v. 34, p. 153-157.
CHEN, Y.; YANG, H.; ZHOU, Q.; CHEN, J. & GU, G. (2001a). Cleaner recovery of poly(3-hydroxybutyric acid) synthesized in Alcaligenes eutrophus. Process Biochemistry, v. 36, p. 501-506.
CHEN, Y.; XU, Q.; YANG, H. & GU, G. (2001b). Effects of cell fermentation time and biomass drying strategies on the recovery of poly-3-hydroxyalkanoates from Alcaligenes eutrophus using a surfactant-chelate aqueous system. Process Biochemistry, v. 36, p. 773-779.
CHIELLINI, E. & SOLARO, R. (1996). Biodegradable polymeric materials. Advanced Materials, v. 8, p. 305-313.
COSTA NETO, C. (2005). Análise Orgânica – Métodos e procedimentos para a caracterização de organoquímios. Editora UFRJ, Rio de Janeiro, v. 2.
COUTINHO, B.C., MIRANDA, G.B., SAMPAIO, G.R., SOUZA, L.B.S., SANTANA, W.J. & COUTINHO, H.D.M. (2004). A importância e as vantagens do polihidroxibutirato (plástico biodegradável). Holos, Ano 20.
CROCHEMORE, A.G. (2010). Bioprospecção de espécies de Pseudomonas isoladas de solo de várzea subtropical do Rio Grande do Sul para produção de Polihidroxibutirato. Dissertação (Mestrado em Ciência) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS.
CROCHEMORE, A.G. (2014). Poli(3-hidroxibutirato) com propriedades térmicas diferenciadas produzido por Pseudomonas sp. CMM43 degradadora de agrotóxico. Tese (Doutorado em Ciência) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS.
62
CROCHEMORE, A.G.; MATTOS, M.L.T.; VENDRUSCOLO, C.T.; CASTRO, L.A.S. & MOREIRA, A. S. (2012). Identification of pesticide-degrading Pseudomonas strains as poly-β-hydroxybutyrate producers. African Journal of Biotechnology, v. 11, n. 85, p. 15144-15149.
DALCANTON, F. (2006). Produção, Extração e Caracterização de Poli(3-Hidroxibutirato) por Ralstonia eutropha em diferentes substratos. Florianópolis. Dissertação (Mestrado em Engenharia de alimentos) - Centro Tecnológico, Universidade Federal de Santa Catarina.
DOI, Y.; TAMAKI, A.; KUNIOKA, M. & SOGA, K. (1988). Production of copolyesters of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyvalerate by Alcaligenes eutrophus from butyric and pentanoic acids. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 28, p. 330-334.
DUARTE, M.A.T. et al. (2004). Estudo da compactação a frio de poli(3-hidroxibutirato) – morfologia e resistência à compressão. Revista Matéria, v. 9, p. 386-391.
EUZÉBY, J. P. List of prokaryotic names with standing in nomenclature. Disponível em: < http://www.bacterio.cict.fr/classifphyla.html>. Acesso em: 14 jan. 2011.
FIORESE, M.L. (2008). Estratégias de cultivo e recuperação e caracterização de poli(3-hidroxibutirato) produzido por Ralstonia eutropha. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
FORMOLO, M.C.; VOGELSANGER JR, N.; SCHNEIDER, A.L.; FURLAN, S.A.; ARAGÃO, G.M.F.; PEZZIN, S.H. & PEZZIN, A.P.T. (2003). Biossíntese de polímero biodegradável: caracterização térmica e espectroscópica. Anais do VII Congresso Brasileiro de Polímeros. Anais. Belo Horizonte. Associação Brasileira de Polímeros.
FRANCHETTI, S.M. & MARCONATO, J.C. (2006). Biodegradable polymers - A partial way for decreasing the amount of plastic waste. Quimica Nova, v. 29, n. 4, p. 811-816.
GALEGO, N., ROZSA, C., SÁNCHEZ, R., FUNG, J., VÁSQUEZ, A. & TOMÁS, J.S. (2000). Characterization and aplication of poly (β-hydroxyalkanoates) family as composite biomaterials. Polymer Testing, v. 19, p. 485-492.
GARCIA, M.C.F. (2006). Proposta de um processo de extração de poli(3-hidroxibutirato) produzido por Cupriavidus necator e seu efeito sobre ascaracterísticas do polímero. Dissertação – Programa de Pós-graduação em Engenharia de alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina.
63
GOGOLEWSKI, S.; JOVANOVIC, M.; PERREN, S.M.; DILLON, J.G. & HUGHES, M.K. (1993). Tissue response and in vivo degradation of selected polyhydroxyacids: polylactides (PLA), poly(3-hydroxybutyrate) (P(3HB)), and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (P(3HB):VA). Journal of Biomedical Material Research, v. 27, p. 1135-1148.
GOMES, J.G.C. & BUENO NETTO, C.L. (1997). Produção de plásticos biodegradáveis por bactérias. Revista Brasileira de Engenharia Química, v. 17, p. 24-29.
GOMEZ, J.G.C. & BUENO NETTO, C.L. (2001). Produção de poliésteres bacterianos. In: LIMA, U.D.A. Biotecnologia Industrial,v. 3. São Paulo: Editora Edgar Blucher, p. 219-248.
GOMEZ, J.G.C.; FONTOLAN, V.; ALLI, R.C.P.; RODRIGUES, M.F.A.; BUENO NETTO, C.L.; SILVA, L.F. & SIMÕES, D.A. (1997). Production of P3HB-co-3HV by soil isolated bacteria able to use sucrose. Review Microbiology, v. 28, p. 43-48.
GOVENDER, T. et al. (2012) BODIPY staining, an alternative to the Nile Red fluorescence method for the evaluation of intracellular lipids in microalgae. Bioresource Technology, v. 114, p. 507-511.
GREENSPAN, P.; MAYER, E.P. & FOWLER, S.D. (1985). Nile red: A selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. Journal of Cell Biology, v. 100, n. 3, p. 956-973.
GROTHE, E.; MOO-YOUNG, M. & CHISTI, Y. (1999). Fermentation optimization for the production of poly(b-hydroxybutyrate acid) microbial thermoplastic. Enzyme and Microbial Technology, v. 25, p. 132-141.
HAHN, S.K.; CHANG, Y.K. & LEE, S.Y. (1995). Recovery and characterization of poly (3-hydroxybutyric acid) synthesized in Alcaligenes eutrophus and recombinant Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, v. 61, n. 1, p 34-39.
HEJAZI, P.; VASHEGHANI-FARAHANI, E. & YAMINI, Y. (2003). Supercritical fluid dispertion of Ralstonia eutropha for Poly(b-hydroxybutyrate) recovery. Biotechnology Progress, v. 19, p. 1519-1523.
HOLMES, P.A. & LIM, G.B. (1990). Separation process. US Patent 4, 910, 14.
HOLMES, P.A. (1985). Applications of PHB – A microbially produced biodegradable thermoplastic. Physical Technology, v. 16, p. 32-36.
HONG, S.G.; LIN, Y.C. & LIN, C.H. (2008). Crystallization and degradation behaviors of treated polyhydroxybutyrates. Reactive and Functional Polymers, v. 68, p. 1516–1523.
64
IZARD, J. & LIMBERGER, R.J. (2003). Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. Journal of Microbiological Methods, v. 55, n. 2, p. 411-418.
JACQUEL, N. et al. (2008). Isolation and purification of bacterial poly(3-hydroxyalkanoates). Biochemical Engineering Journal, v. 39, p. 15-37.
JEANES, A. (1974). Extracellular microbial polysaccharides – New hydrocolloids of interest to the food industry. Food Technology, v. 28, p. 34-40.
JENDROSSEK, D.; SELCHOW, O. & HOPPERT, M. (2007). Poly(3-Hydroxybutyrate) Granules at the Early Stages of Formation Are Localized Close to the Cytoplasmic Membrane in Caryophanon latum. Applied and Environmental Microbiology, v. 73, p. 586-593.
JIANCHUN, L.; ZHU, B.; HE, Y. & INOUE, Y. (2003). Thermal and Infrared Spectroscopic Studies on Hydrogen-Bonding Interaction between Poly(3-hydroxybutyrate) and Catechin. Polymer Journal, v. 35, p. 384.
KAHAR, P.; TSUGE, T.; TAGUCHI, K. & DOI, Y. (2004). High yield production of polyhydroxyalkanoates from soybean oil by Ralstonia eutropha and its recombinant strain. Polymer Degradation and Stability, v. 83, p. 79-86.
KESSLER, B. & WITHOLT, B. (2001). Factors involved in the regulatory network of poly-hydroxyalkanoate metabolism. Journal of Biotechnology, v. 86, p. 97-104.
KHANNA, S. & SRIVASTAVA, A.K. (2005). Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochemistry, v. 40, p. 607-619.
KHARDENAVIS, A.A.; KUMAR, M.S.; MUDLIAR, S.N. & CHAKRABARTI, T. (2006). Biotechnological conversion of agro-industrial wastewaters into biodegrable plastic, poly β-hydroxybutyrate. Bioresource Technology, v. 98, p. 3579-3584.
KIM, B.S. (2000). Production of poly(3-hydroxybutyrate) from inexpensive substrates. Enzyme Microbiology and Technology, v. 27, p. 774-777.
KIM, M.; CHO, K-S.; RYU, H.W.; LEE, E.G. & CHANG, Y.K. (2003). Recovery of poly(3-hydroxybutyrate) from high cell density culture of Ralstonia eutropha by direct addition sodium dodecyl solfate. Biotechnology Letters, v. 25, p. 55-59.
KRUPP, L.R. & JEWELL, W.J. (1992). Biodegradability of modified plastics films in controlled biological environments. Environmental Science Technology, v. 26, p. 193-198.
KUNASUNDARI, B. & SUDESH, K. (2011). Isolation and recovery of microbial polyhydroxyalkanoates. Express Polymer Letters, v. 5, n. 7, p. 620–634.
LAFFERTY, R.M.; KORSATKO, B. & KORSATKO, W. (1988). Microbial Production of Poly-b-hydroxybutyric Acid. In: Biotechnology, REHM, H.J & REED, G. (eds.), VCH Publishers, New York, p. 135-176.
65
LAO, H.; RENARD, E.; LINOSSIER, I.; LANGLOIS, V. & VALLÉE-REHEL, K. (2007). Modification of Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) Film by Chemical Graft Copolymerization. Biomacromolecules, v. 8, p. 416-423.
LEE, S.Y. (1996a). Improvement of hydroxyvalerate fraction in poly(β-hydroxybutyrate-co-β-hydroxyvalerate) by a mutant strain of Alcaligenes eutrophus. Journal of Fermentation and Bioengineering, v. 81, p. 255-258.
LEE, S.Y. (1996b). Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnology and Bioengineering, v. 49, p. 1-14.
LEE, S.Y. (1996c). Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria. Tibtech, v. 14, p. 431-438.
LELLIOT, R.A. & STEAD, D.E. (1987). Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Palo Alto, Blackwell, 1 ed., v. 216, p. 171-172.
LEMOIGNE, M. (1926). Produits de dehydration et de polymerisation de l’acide ß-oxobutyrique. Bulletin Societe Chimique Biological, v. 8, p. 770–782.
LING, Y.; WONG, H.H.; THOMAS, C.J.; WILLIAMS, D.R.G. & MIDDELBERG, A.P.J. (1997). Pilot-scale extraction of PHB from recombinant E. coli by homogenization and centrifugation. Bioseparation, v. 7, p. 9-15.
LUENGO, J.M.; GARCÍA, B.; SANDOVAL, A.; NAHARROY, G. & OLIVEIRA, E.R. (2003). Bioplastics from microorganisms. Current Opinion in Microbiology, v. 6, p. 251–260.
LUGG, H.; SAMMONS, R.L; MARQUIS, P.M; HEWITT, C.J; YONG, P.; PATERSON-BEEDLE, M.; REDWOOD, M.D.; STAMBOULIS, A.; KASHANI, M.; JENKINS, M. & MACASKIE, L.E. (2008). Polyhydroxybutyrates accumulation by a Serratia sp. Biotechnology Letters., v. 30, p. 481-491.
LUNDGREN, D.G.; ALPER, R.; SCHNAITMAN, C.; & MARCHESSAULT, R.H. (1965). Characterization of Poly-β-Hydroxybutyrate Extracted from Different Bacteria. Journal of Bacteriology, v. 89, n. 1, p. 245–251.
LUZIER, W.D. (1992). Materials derived from biomass biodegradable materials. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, v. 89, p. 839-842.
MADISON, L.L. & HUISMAN, G.W. (1999). Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 63, p. 21-53.
MEHAN, V.K.; LIAO, B.S.; TAN, Y.J.; ROBINSON-SMITH, A.; McDONALD, D. & HAYWARD, A.C. (1994). Bacterial wilt of Groundnut. Patancheru: Internacional Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics. Information Bulletin, v. 35, p. 28.
66
MIDDELBERG, A.P.J. (1995). Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnology Advances, v. 13, n. 3, p. 491 – 551.
MONTORO, S.R.; SHIGUE, C.Y.; SORDI, M.L.T; SANTOS, A.M. & RÉ, M.I. (2010). Estudo cinético da redução da massa molar do poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBHV). Polímeros, v. 20, n. 1, p. 19-24.
MYSHKINA, V.L.; NIKOLAEVA, D.A.; MAKHINA, T.K.; BONARTSEV, A.P. & BONARTSEVA, G.A. (2008). Effect of Growth Conditions on the Molecular Weight of Poly-3-hydroxybutyrate Produced by Azotobacter chroococcum 7B. Applied Biochemistry and Microbiology, v. 44, p. 482–486.
NASCIMENTO, J.F. (2001). Estudo da processabilidade e da caracterização do poli (ácido 3- hidroxibutirico) - PHB obtido a partir de cana-de-açúcar. Campinas, SP. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Faculdade de Engenharia Quimica Universidade Estadual de Campinas.
NGUYEN, S. & MARCHESSAULT, R.H. (2004). Synthesis and properties of graft copolymers based on poly(3-hydroxybutyrate) macromonomers. Macromolecular Bioscience, v. 4, p. 262–268.
NOGUEIRA, A.L.; MACHADO, R.A.F. & SCHLISTING, R. (2002). Polímeros e reações de polimerização. Laboratório de controle de processos. Universidade Federal de Santa Catarina.
OEDING, V. & SCHLEGEL, H.G. (1973). β-ketothiolase from Hydrogemonas eutropha H16 and its significance in the regulation of poly-β-hydroxybutyrate metabolism. Biochemical Journal, v. 134, p. 239-248.
OLIVEIRA, C. (2010). Produção de polihidroxibutirato: bioprospecção de Beijerinckia sp. da coleção de bactérias do Laboratório de Biopolímeros do CDTec - UFPel. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
OLIVEIRA, F.C.; DIAS, M.L.; CASTILHO, L.R. & FREIRE, D.M.G. (2007). Characterization of poly(3-hydroxybutyrate) produced by Cupriavidus necator in solid-state fermentation. Bioresource Technology, v. 98, p. 633-638.
PACI, M. & LA MANTIA, F.P. (1999). Influence of small amounts of polyvinylchloride on the recycling of polyethylenetherephtalate. Polymer Degradation and Stability, v. 63, p. 11-14.
PAVIA, D.L; LAMPMAN, G.M; GEORGE S.; KRIZ, G.S & VYVYAN, J.R. (2010). Introdução à Espectroscopia. 4ª ed, São Paulo: Cencgage Learning.
PIEMOLINI, L.T. (2004). Modelagem estrutural da PHA sintase de C. violaceun para estudos de mutação sítio-dirigida. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Departamento de Engenharia Química e de Alimentos, UFSC, Florianópolis.
67
RAMSAY, B.A. (1994). Physiological factor affecting PHA production. Physiology, kinetics, production and use of biopolymers (Proceedings) p. 9-17, Austria.
RAMSAY, J.A.; BERGER, E.; VOYER, R.; CHAVRIE, C. & RAMSAY, B.A. (1990). Extraction of poly-β-hydroxybutyrate using chlorinated solvents. Biotechnology Techniques, v.8, p. 589-584.
RAVEN, P.H. (1996). Biology of plants. New York: Worth Publisher, p. 728.
REDDY, C.S.K.; GHAI, R.; RASHMI, T. & KALIA, V.C. (2003). Polyhydroxyalkanoates: an overview. Bioresource Technology, v. 87, p. 137-146.
REDDY, S.V.; THIRUMALA, M. & MAHMOOD, S.K. (2009). Production of P(3HB) and P (3HB-co-3HV) biopolymers by Bacillus megaterium strain OU303A isolated from municipal sewage sludge. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 25, p. 391-397.
ROCHA, A.J. (2000). Papel versus Plástico. A batalha da proteção do ambiente. Revista Ciências, n° 14, mar/abr.
RODRIGUES, A.A.; SANTOS, B.C.; MACAGNAN, K.L.; ALVES, M.I.; MOURA, A.B.; MOREIRA, A.S. & VENDRUSCOLO, C.T. (2014). Poli-3hidroxibutirato: identificação molecular de linhagens bacterianas positivas para sintese de bioplástico. Anais do XXII Congreso Latinoamericano de Microbiología y 4 Congreso Colombiano de Microbiología, Cartagena, Colômbia.
ROSA, S.M.L. (2007). Estudo das propriedades de compósitos de polipropileno com casca de arroz. Dissertação (Mestrado em Engenharia) – Departamento de Materiais, UFRGS, Porto Alegre.
SAITO, T. & KOBAYASHI, T. (2002). Intracellular degradation of PHAs. In: STEINBÜCHEL, A & DOI, Y. Biopolymers. v. 3b. Weinheim: WILEY-VCH.
SARTORI, D.M. (1998). Obtenção de um mutante de Alcaligenes eutrophus melhorado geneticamente para a produção do co-polímero polihidroxibutirato-polihidroxivalerato (PHB-PHV). Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP.
SCHAAD, N.W.; JONES, J.B. & CHUN, W. (2001). Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 3ª Ed. APS Press, 373 p.
SERAFIM, L.S., LEMOS, P.C., LEVANTESI, C.; TANDOI, V.; SANTOS, H. & REIS, M.A.M. (2002). Methods for detection and visualization of intracellular polymers stored by polyphosphate-accumulating microorganisms. Journal of Microbiological Methods, v. 51, p. 1 – 18.
SILVERSTEIN, R.M.; BASSIER, G.C. & MORRIL, T.C. (2007). Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. Editora Guanabara Dois.
68
SILVERSTEIN, R.M.; BASSLER, G.C. & MORRI L,T.C. (1981). Spectrometric Identification of Organic Compounds, 4th ed, John Wiley e Sons: New York.
SPIER, V.C. (2005). Caracterização espectroscópica e cromatográfica de co-poliésteres biodegradáveis. Dissertação (Mestrado em Ciência e Engenharia de Materiais). Universidade do Estado de Santa Catarina.
SQUIO, C.R. & ARAGÃO, G.M.F. (2004). Estratégias de cultivo para produção de plásticos biodegradáveis poli(3-hidroxibutirato) e poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) por bactérias. Química Nova, v. 27, n. 4, p. 615-622.
STEINBÜCHEL, A. & FÜCHTENBUSCH, B. (1998). Bacterial and other biological systems for polyester production. Tibtech, v. 16, p. 419-427.
STEINBÜCHEL, A. & VALENTIN, H.E. (1995). Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. Biotechnology and Bioengineering, v. 128, p. 219-228.
STUART, B.H. (2004) Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications, John Wiley e Sons: London.
SUDESH K.; ABE H. & DOI Y. (2000). Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: Biological polyesters. Progress in Polymer Science, v. 25, p. 1503–1555.
SUDESH, K.; MAEHARA, A.; GAN, Z.; IWATA, T. & DOI, Y. (2004). Direct observation of polyhydroxyalkanoate granule associated-proteins on native granules and on poly(3-hydroxybutyrate) single crystals by atomic force microscopy. Polymer Degradation and Stability, v. 83, p. 281–287.
TIM, A. & STEINBÜCHEL, A. (1990). Formation of polyester consisting of medium-chain-lenght 3-hydroxyalkanoic acids from gluconate by Pseudomonas aeruginosa and other fluorescent Pseudomonas. Applied and Environ. Microbiol., v. 56, n. 11, p. 3360-3367.
TSUGE, T. (2002). Metabolic improvements and use of inexpensive carbon sources in microbial production of polyhydroxyalkanoates. Journal of Bioscience and Bioengineering, v.94. n.6, p. 579-584.
VALAPPIL, S.P.; MISRA, S.K.; BOCCACCINI, A.R.; KESHAVARZ, T.; BUCKE, C. & ROYA, I. (2007). Large-scale production and efficient recovery of P(3HB) with desirable material properties, from the newly characterized Bacillus cereus SPV. Journal of Biotechnology, v. 132, p. 251-258.
VINHAS, G.M.; ALMEIDA, Y.M.B. & LIMA, M.A.G.A. (2007). Estudo das propriedades e biodegradabilidade de blendas de poliéster/amido submetidas ao ataque microbiano. Química Nova, v. 6, p. 1587-1588.
69
VINHAS, G.M.; ALMEIDA, Y.M.B. & LIMA, M.A.G.A. (2007). Estudo das propriedades e biodegrabilidade de blendas de poliéster/amido submetidas ao ataque microbiano. Química Nova, v. 6, p. 1587-1588.
VOGELSAGER, N.JR. et al. (2004). Filmes de P(3HB) e PCL: Acompanhamento da Biodegradação em Solo por Propriedades Térmicas e Morfológicas. Revista Matéria, v. 9, n. 4, p. 370-377.
WALLEN, L.L. & ROHWEDDER, W.K. (1974). Poly-b-hydroxyalkanoate from activated sludge. Environmental Science & Technology, v. 8, p. 576–579.
YABUUCHI, E.; KOSAKO, Y.; YANO, I.; HOTTA, H. & NISHIUCHI, Y. (1995). Transfer of two Burkholderia and an Alcaligenes species to Ralstonia gen. nov.: proposal of Ralstonia pickettii (Ralston, Palleroni and Doudoroff, 1973) comb. nov., Ralstonia solanacearum (Smith 1896) comb. nov. and Ralstonia eutropha (Davis 1969) comb. nov. Microbiology Immunology, v. 39, n. 11, p. 897-904.
YABUUCHI, E.; KOSARO, Y.; OYIZU, H.; YANO, I.; HOTTA, H.; HASHIMOTO, Y.; EZAKI, T. & ARAKAWA, M. (1992). Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes, 1981) comb. nov. Microbiology and Immunology, v. 36, n. 12, p. 1251-1275.
YEZZA, A.; HALASZ, A.; LEVADOUX, W.; HAWARI, J. (2007). Production of poly-hydroxybutyrate (P(3HB)) by Alcaligenes latus from maple sap. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 77, p. 269–274.
ZHANG, X.; YANG, H.; LIU, Q.; ZHENH, Y.; XIE, H.; WANG, Z. & CHENG, R. (2005). Synthesis and characterization of biodegradable triblock copolymers based on bacterial poly[(R)-3-hydroxybutyrate] by atom transfer radical polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, v. 43, p. 4857- 4869.
