UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ESTUDO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Ocimum campechianum

Mill. E DETERMINAÇÃO DE SEU PERFIL FITOQUÍMICO

Sabrina Torres de Sousa

Dissertação

Mestrado do Departamento de Ciências

Farmacêuticas/UFPE

Orientadora: Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza

Co-orientadora: Profa. Dra. Eulália Azevedo Ximenes

Recife – PE

2004

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ESTUDO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Ocimum campechianum Mill. E

DETERMINAÇÃO DE SEU PERFIL FITOQUÍMICO

Sabrina Torres de Sousa

Dissertação de Mestrado, submetidaao Programa de Pós-Graduação doDepartamento de CiênciasFarmacêuticas do Centro de Ciênciasda Saúde da Universidade Federalde Pernambuco, como requisito àobtenção do grau de Mestre emCiências Farmacêuticas.

Área de concentração: Produtos Naturais

Orientadora: Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza

Co-orientadora: Profa. Dra. Eulália Azevedo Ximenes

Recife – 2004

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Reitor

AMARO HENRIQUE PESSOA LINS

Vice-Reitor

GILSON EDMAR GONÇALVES E SILVA

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

CELSO PINTO DE MELO

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

JOSÉ THADEU PINHEIRO

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde

MÁRCIO ANTÔNIO DE ANDRADE COELHO GUEIROS

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

SILVANA CABRAL MAGGI

Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

ANTÔNIO RODOLFO DE FARIA

Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

DAVI PEREIRA DE SANTANA

Vice-Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

DALCI JOSÉ BRONDANI

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

SABRINA TORRES DE SOUSA

ESTUDO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Ocimum campechianum Mill. E

DETERMINAÇÃO DE SEU PERFIL FITOQUÍMICO

BANCA EXAMINADORA:

Membro Externo Titular

Profa. Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira

Departamento de Biologia Molecular da Universidade Federal da Paraíba

Membros Internos Titulares

Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier

Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco

Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza

Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco

Membro Externo Suplente

Profa. Dra. Alessandra de Albuquerque Tavares Carvalho

Departamento de Clínica e Odontologia Preventiva da Universidade Federal de

Pernambuco

Membro Interno Suplente

Profa. Dra. Jane Sheila Higino

Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

“Mas em tudo isto somos mais que

vencedores, graças àquele que

nos amou.” (Romanos 8, 37)

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo seu infinito amor, que me fortalece a cada dia e me faz

perseverar.

À minha família, meu porto seguro, que esteve sempre presente com amor,

compreensão e incentivo.

Aos meus amigos, uma das maiores riquezas de minha vida, pela força

que encontrei, tantas vezes, em cada um deles.

À Profa. Ivone Antônia de Souza, pela valiosa orientação acadêmica, mas

principalmente, pela serenidade, amizade, apoio e compreensão.

À Profa. Eulália Azevedo Ximenes, pela co-orientação acadêmica, amizade

e colaboração na realização dos testes antimicrobianos.

Ao Prof. Haroudo Satiro Xavier, pelo apoio e cooperação técnica no

desenvolvimento do estudo fitoquímico.

À Profa. Jane Sheila Higino, pelo incentivo e colaboração na preparação

dos extratos.

À Profa. Maria do Carmo Alves de Lima, pelo incentivo na minha vida

acadêmica e pela amizade.

Aos amigos Elisângela Barbosa e Aldo Passilongo, pela amizade e pelo

valioso auxílio durante os ensaios farmacológicos.

Ao corpo docente do Mestrado em Ciências Farmacêuticas da UFPE, pela

colaboração durante o curso.

Aos colegas de mestrado: Ana Amélia Lira, Cristiane Rocha, Cristiano

Soares da Rocha, Eduardo Gonçalves, Francisco Jaime Júnior, Lúcia Roberta de

Souza Filizola, Roseane Maria Costa, Risonildo Cordeiro, Rosiel Santos, Simone

Bezerra, Thiago Aquino, Tereza Raquel, Valderes Almeida, Márcia Francisca, por

todos os momentos compartilhados durante o tempo que passamos juntos.

A Iguacy Duque, secretária do Mestrado, pela sua dedicação e amizade.

Ao meu pai, que não está mais entre nós, por todo amor e dedicação e

pela descoberta da profissão farmacêutica, da qual tanto se orgulhou durante sua

vida profissional.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

7

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS 10

LISTA DE GRÁFICOS 11

LISTA DE QUADROS 12

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 13

RESUMO 14

ABSTRACT 15

1- INTRODUÇÃO 16

2 – OBJETIVOS 18

Capítulo I: Estudo Farmacoquímico

1. Revisão da Literatura 19

2. Determinação do Perfil Fitoquímico 21

2.1 Material 21

2.1.1 Extratos Vegetais 21

2.1.2 Drogas e Reagentes 21

2.1.3 Equipamentos 22

2.1.4 Outros 22

2.1.5 Identificação do Material Botânico 22

2.1.6 Coleta do Material Vegetal 23

2.2 Metodologia 23

2.2.1 Preparação dos Extratos 23

2.2.2 Identificação dos Grupos de Moléculas 23

2.2.3 Pesquisa de Polifenóis 24

2.2.4 Pesquisa de Saponinas 26

2.2.5 Pesquisa de Monoterpenos e Sesquiterpenos 26

2.2.6 Pesquisa de Triterpenos e Esteróides 26

2.2.7 Pesquisa de Alcalóides 27

2.2.8 Pesquisa de Glicosídeos Iridóides 27

2.2.9 Pesquisa de Açúcares Redutores 27

2.3 Resultados e Discussão 27

2.3.1 Pesquisa de Polifenóis 28

2.3.2 Pesquisa de Saponinas 28

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

8

2.3.3 Pesquisa de Monoterpenos e Sesquiterpenos 29

2.3.4 Pesquisa de Triterpenos e Esteróides 30

2.3.5 Pesquisa de Açúcares Redutores 30

Capítulo II: Atividade Biológica de Ocimum campechianum Mill.

1. Atividade Farmacológica 32

1.1 Revisão da Literatura 32

1.2 Atividade Antiinflamatória 34

1.2.1 Material 34

1.2.1.1 Material Vegetal 34

1.2.1.2 Animais 34

1.2.1.3 Extrato Vegetal 35

1.2.1.4 Drogas e Reagentes 35

1.2.1.5 Equipamentos e Materiais 35

1.2.2 Metodologia 35

1.3 Atividade Antitumoral 36

1.3.1 Material 36

1.3.1.1 Animais 36

1.3.1.2 Extrato Vegetal 36

1.3.1.3 Drogas e Reagentes 36

1.3.1.4 Equipamentos 37

1.3.2 Metodologia 37

1.3.2.1 Implante da Massa Tumoral 37

1.3.2.2 Testes de Inibição Tumoral 37

1.4 Estudo Histológico 38

1.5 Resultados e Discussão 38

1.5.1 Atividade Antiinflamatória 38

1.5.2 Atividade Antitumoral 40

1.5.3 Estudo Histológico 42

2. Atividade Antimicrobiana 45

2.1 Revisão da Literatura 45

2.2 Procedimento Experimental 46

2.2.1 Material 46

2.2.1.1 Extratos Vegetais 46

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

9

2.2.1.2 Meios de Cultura 46

2.2.1.3 Microrganismos 47

2.2.1.4 Padrões Antimicrobianos 47

2.2.1.5 Solventes 47

2.2.1.6 Equipamentos 48

2.2.2 Metodologia 48

2.2.2.1 Método de Difusão em Agar 48

2.2.2.2 Preparação dos Extratos 48

2.2.2.3 Preparação do Padrão Antifúngico 49

2.2.2.4 Preparação dos Inóculos Microbianos 49

2.2.2.5 Semeio 50

2.2.2.6 Leitura 50

2.2.3 Resultados e Discussão 50

3 – CONCLUSÃO 51

4 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52

ANEXOS 60

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Folhas e Inflorescência de Ocimum campechianum Mill. 17

Figura 2 - Cromatograma mostrando polifenóis encontrados nas folhas de

Ocimum campechianum. 28

Figura 3 - Cromatograma mostrando mono e sesquiterpenos encontrados em

Ocimum campechianum. 29

Figura 4 - Cromatograma de eugenol encontrado em Ocimum campechianum. 29

Figura 5 - Cromatograma de terpenóides encontrados em Ocimum

campechianum. 30

Figura 6 - Cromatograma mostrando açúcares encontrados em Ocimum

campechianum. 30

Figura 7 - Fotomicrografia de testículos de camundongos do grupo tratado com O.

campechianum Mill., mostrando túbulo seminífero (1), tecido intersticial e células

de Leydig (2). 43

Figura 8 - Fotomicrografia de testículos de camundongos do grupo controle,

mostrando túbulo seminífero (1), tecido intersticial e células de Leydig (2). 43

Figura 9 - Fotomicrografia do túbulo seminífero (1) e tecido intersticial com células

de Leydig (2) de camundongos do grupo tratado com O. campechianum Mill. 44

Figura 10 - Fotomicrografia do túbulo seminífero de camundongos do grupo

controle corado com HE, mostrando espermatogônias, espermatócitos,

espermátides, espermatozóides. 44

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

11

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Comparação do desenvolvimento do edema de pata induzido com

injeção subplantar de carragenina em ratos machos tratados com Indometacina,

extrato de Ocimum campechianum Mill. e Solução Salina 0,9%, por via oral. 39

Gráfico 2 - Comparação do desenvolvimento do edema de pata induzido com

injeção subplantar de carragenina em ratos machos tratados com Indometacina,

extrato de Ocimum campechianum Mill. e Solução Salina 0,9%, por via

intraperitoneal. 40

Gráfico 3 – Comparação das médias dos pesos dos tumores sarcoma 180 em

camundongos machos tratados com extrato bruto das folhas de Ocimum

campechianum Mill. e Solução Salina 0,9%, por via intraperitoneal. 41

Gráfico 4 - Comparação das médias dos pesos dos tumores carcinoma de

Ehrlich em camundongos machos tratados com extrato bruto das folhas de

Ocimum campechianum Mill. e Solução Salina 0,9%, por via intraperitoneal. 41

Gráfico 5 - Comparação do percentual de inibição tumoral apresentado pelos

grupos de camundongos portadores de sarcoma 180 e carcinoma de Ehrlich,

tratados com o extrato de Ocimum campechianum., por via intraperitoneal. 42

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

12

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Substâncias encontradas em diversas espécies de Ocimum. 20

Quadro 2 - Interpretação dos cromatogramas para a pesquisa de cumarinas,

derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos e flavonóides. 24

Quadro 3 – Usos medicinais de O. campechianum Mill. em algumas regiões do

Brasil e do México. 32

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

13

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ATCC American Type Culture Collection0C Graus Celsius

CCB Centro de Ciências Biológicas

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CCS Centro de Ciências da Saúde

cm2 centímetro quadrado

DAUFPE Departamento de Antibióticos da UFPE

DL50 Dose Letal Média

EPM Erro Padrão Médio

g gramas

HE Hematoxilina-Eosina

IC Isolado Clínico

kg quilograma

m metro

mg miligrama

mL mililitro

mm milímetro

nm nanômetro

Obj. objetiva

pH Potencial hidrogeniônico

ppm partes por milhão

Rf Relação de Frente

SNC Sistema nervoso central

ton. tonelada

UFC Unidade Formadora de Colônia

UFPE Universidade Federal de Pernambuco

UV Ultravioleta

β Beta

µg micrograma

µL microlitro

m micrômetro

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

14

RESUMO

Ocimum campechianum Mill. é uma erva aromática conhecida

popularmente no Brasil como “alfavaca de cobra”. Pode ser encontrada em

Pernambuco e em outras regiões do país. Na medicina popular, é bastante

utilizada como analgésico, antipirético, diurético, estimulante e antigripal. Este

trabalho apresenta uma investigação acerca da atividade biológica e da

composição química das folhas do vegetal. Os testes para avaliação da toxicidade

aguda foram realizados através da observação de efeitos gerais sugestivos de

ações sobre o sistema nervoso central e periférico, a partir dos quais foi

determinada a DL50 que resultou em 1017,4 mg/kg de peso do animal. Um estudo

histopatológico com tecidos provenientes dos testículos dos animais, que

apresentaram cianose durante os experimentos, demonstrou não haver nenhuma

alteração do material analisado. As atividades antiinflamatória, antitumoral e

antimicrobiana também foram investigadas, resultando em uma inibição

significativa dos tumores sarcoma 180 (47,34%) e carcinoma de Ehrlich (84,86%)

e acentuada redução dos edemas na 4a hora do ensaio realizado para avaliar a

ação antiinflamatória. Com relação à atividade antimicrobiana, os extratos não se

mostraram ativos contra Staphylococus aureus, Micrococus flavus, Escherichia

coli, Enterobacter sp., Candida albicans, Candida krusei. O “screening”

cromatográfico realizado com os extratos benzênico e metanólico das folhas

permitiu detectar a presença de polifenóis (fenilpropanoglicosídeos e flavonóides),

monoterpenos e sesquiterpenos, triterpenos e esteróides, eugenol e açúcares

redutores bem como a ausência de cumarinas, derivados cinâmicos, iridóides,

proantocianidinas e leucoantocianidinas, alcalóides, saponósidos e taninos

gálicos.Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

15

ABSTRACT

Ocimum campechianum Mill is a known aromatical grass popularly in Brazil

as "snake basil". It can be found in Pernambuco and in other regions of the

country. In popular medicine, it is widely used as analgesic, antipyretic, diuretic,

stimulant and antigripal. This work presents an inquiry about biological activity and

the chemical composition of its leaves. The tests for evaluation of the acute toxicity

had been carried through the comment of suggestive general effect of action on

the central and peripherical nervous system, from which the DL50 was determined

and resulted in 1017,4 mg/kg of weight of the animal. A histopatological study with

fabrics proceeding from the testicules of the animals, that had presented cianose

during the experiments, showed no alteration of the analyzed material. The

antiinflammatory, antitumoral and antimicrobiana activities had been also

investigated, resulting in a significant inhibition of the tumors: sarcoma 180

(47,34%) and carcinoma of Ehrlich (84,86%), and accented reduction of edemas

in 4a hour of the carried essay to evaluate the anti-inflammatory action. Reffering

to the antimicrobiana activity, the extracts had not revealed asset against

Staphylococus aureus, Micrococus flavus, Escherichia coli, Enterobacter sp.,

Candida albicans, Candida krusei. Chromatographic screening carried through

with benzenic and metanolic extracts of level allowed to detect the reducing

presence of polyphenols (phenylpropane glucosides and flavonoids),

monoterpenes, sesquiterpenes, triterpenes and steroids, eugenol and sugars as

well as the coumarin absence, cinnamics derivatives, iridoids, proanthocyanidins

and leucoanthocyanidins, alkaloyds, saponosids and galic tannins.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

16

1- INTRODUÇÃO

As antigas civilizações já demonstravam bastante interesse pelo uso e

conhecimento de plantas medicinais. Os romanos usavam largamente as plantas

para a higiene e como relaxante muscular durante o banho, enquanto que os

antigos egípcios, bastante respeitados no campo da medicina, possuíam uma rica

farmacopéia baseada em vegetais (GRANDI & TRINDADE, 1989). Na Grécia

Antiga, Hipócrates já recomendava a utilização de remédios de origem vegetal

para diversos tipos de doenças (CAMPÊLO, 1990).

Uma das maiores biodiversidades vegetal da Terra encontra-se no Brasil,

sendo que pelo menos metade das espécies vegetais pode apresentar alguma

propriedade terapêutica útil à população, porém nem uma percentagem ínfima

dessas plantas foi ainda estudada (MARTINS et al., 1994). Das 120 mil espécies

distribuídas nas formações vegetais do país, apenas uma pequena parte é

aproveitada em função de suas propriedades (RIZZO, 1990).

As espécies aromáticas ou produtoras de óleos essenciais assumem

grande importância sob o aspecto econômico, devido ao valor dessas substâncias

e seus derivados. A importância desses óleos era praticamente ignorada até

1959, sendo que, em 1978, 13.300 toneladas de mercadorias classificáveis como

plantas aromáticas, óleos essenciais e derivados já eram exportados pelo Brasil,

sendo o Nordeste responsável por um percentual relevante nesse total

(CRAVEIRO, 1981).

Óleos essenciais conhecidos como “Óleos de basílico” são vastamente

utilizados como aromatizantes nos alimentos, produtos oral e dental, em

fragrâncias e em rituais tradicionais e medicamentos (SIMON et al., 1984).

A família Lamiaceae é constituída por 220 gêneros e aproximadamente

4000 espécies (HEDGE,1992) e assume grande importância econômica, pois

40% dos gêneros que a constituem são compostos por plantas com propriedades

aromáticas (LAWRENCE, 1992).

O gênero Ocimum é considerado como o mais importante entre as plantas

herbáceas, pela sua utilização em diversas áreas (KHOSLA,1993), especialmente

o O. basilicum, cujo óleo é um dos mais difundidos, sobretudo na Europa, onde é

largamente produzido. É também atualmente produzido em países como Índia (15

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

17

ton.), Bulgária (7 ton.), Egito (5 ton.), Paquistão (5 ton.), Israel (2 ton.), Iugoslávia ,

EUA e Madagascar (1 ton.), Albânia (0,5 ton.), Hungria (0,3 ton.) e Argentina (0,2

ton.) (LAWRENCE, 1992).

Ocimum campechianum Mill., conhecida popularmente como alfavaca do

campo, é um arbusto de até 2 m de altura, com folhas pequenas e pecioladas,

ovadas, agudas e levemente pubescentes. Ocorre no Caribe e no Peru, sendo

encontrada também em Pernambuco e em outras regiões do Brasil (CORREA,

1978; SHULTZ, 1961, ALMEIDA & ALBUQUERQUE, 2002). Diante da

importância da espécie, que é bastante utilizada na medicina popular e rica em

óleos essenciais (CHARLES et al., 1990), procurou-se com este trabalho

investigar algumas propriedades químicas e biológicas deste vegetal.

Figura 1 – Folhas e Inflorescência de Ocimum campechianum Mill.Zeo

n PDF D

river

Tria

l

www.zeon

.com.tw

18

2 - OBJETIVOS

GERAL

Avaliação da atividade biológica (toxicológica, microbiológica e

farmacológica) e investigação do perfil fitoquímico da espécie Ocimum

campechianum Mill.

ESPECÍFICOS

Investigar o perfil fitoquímico da espécie Ocimum campechianum Mill.,

através da análise cromatográfica;

Realizar ensaios de toxicidade aguda do extrato bruto das folhas;

Avaliar a atividade biológica (microbiológica e farmacológica) do extrato

bruto das folhas.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

19

Capítulo I: Estudo Farmacoquímico

1. Revisão da Literatura

Várias espécies pertencentes ao gênero Ocimum são ricas em óleos

essenciais e o principal enfoque dos estudos fitoquímicos realizados com esses

vegetais tem recaído sobre a análise desses óleos, que são secreções vegetais,

cujos constituintes químicos são compostos de baixo peso molecular, como

monoterpenos e sesquiterpenos (MOOKHERGJEE & MUSSIAN, 1979). A

associação entre o tipo de óleo e a espécie produtora é, por vezes, difícil, sendo a

análise fitoquímica do óleo importante para a taxonomia, pois torna possível situar

a espécie dentro de um grupo (MURILLO & VINÃ, 2003; LAWRENCE, 1989). De

acordo com a composição química e a origem geográfica, as espécies foram

classificadas em quatro grupos, facilitando a identificação dentro do gênero:

“EUROPA”, encontradas na Europa e América do Norte; “REUNIÃO”, originárias

das Ihas Reunião, Madagascar e Ilhas Seychelles; “CINAMATO”, provenientes da

Bulgária, Egito e Haiti; “EUGENOL”, de Java, Ilhas Seychelles, Samoa e Rússia

(CRAVEIRO, 1981).

Óleos essenciais provenientes desse gênero apresentam diferenças

qualitativas e quantitativas na sua composição química mesmo entre exemplares

da mesma espécie, quando coletados em solos diferentes. A cânfora foi

encontrada no óleo extraído de espécimes brasileiras de Ocimum campechianum,

porém não está presente em amostras coletadas no Peru e na Índia (JORGE et

al., 1992).

A caracterização de diversidades químicas de Ocimum spp, para identificar

quimiotipos de potencial interesse econômico, tem sido estudada desde 1984

(SIMON et al., 1984).

O Quadro 1 mostra alguns componentes químicos já isolados e

identificados em espécies pertencentes ao gênero Ocimum.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

20

Quadro 1 – Substâncias encontradas em diversas espécies de Ocimum.

Espécie Principais Constituintes Químicos Referência

O. americanum metil cinamato Simon & Vieira,

2000*

O. basilicum linalol, metil chavicol, metil cinamato,

linalol, 1,8 cineol, geraniol, metil chaviol,

metil cinamato, metil eugenol

1,8 cineol, linalol, metil chavicol, metil cinamato

Guenther, 1949

Simon et al., 1990

Simon, 2000*

O.campechianum 1,8 cineol, β-cariofileno, elemenos, eugenol

1,8 cineol, β-cariofileno

eugenol, β-cariofileno, elemicina

1,8 cienol, cânfora, eugenol, sesquiterpenos

eugenol, metil eugenol e sesquiterpenos

alcalóides

Charles et al., 1990

Simon, 2000*

Silva et al., 1998

Jorge et al., 1992

Khosla et al., 1980

Coe, 1996

O. canum cânfora, limoneno

metil cinamato, linalol

cânfora, 1,8 cineol, metil cinamato, β-pireno

Xaasan, 1981

Guenther, 1949

Simon et al., 1990

O.citriodorium citral

citral, geraniol

Darrah, 1980

Simon et al., 1990

O.gratissimum eugenol

timol

eugenol, ocimeno

eugenol, timol

Sobti et al., 1982

Guenther, 1949

Simon et al., 1990

Simon, 2000*

O.kilimandscharium cânfora, limoneno, 1,8-cineol

1,8-cineol

Bekele &

Hassanali, 2001

Ntezurubanza et

al., 1984

O.sanctum eugenol, β-cariofileno

metil eugenol, β-cariofileno

eugenol, β-cariofileno, β-elemeno

Asha et al., 2001

Lawrence et al.,

1972

Simon et al., 1990

O.suave Eugenol Chogo & Crank,

1981

O.trichodon Eugenol Janssen et al.,

1989

O.viride Timol Ekundayo, 1986

*Espécies coletadas no Brasil, introduzidas e cultivadas na Universidade de Purdue nos Estados

Unidos.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

21

2. Determinação do Perfil Fitoquímico

2.1 Material

2.1.1 Extratos Vegetais

Extrato bruto benzênico das folhas – EBF (10% p/v) – utilizado para a

pesquisa de monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos e esteróides.

Extrato bruto metanólico das folhas – EMF (10% p/v) – utilizado para a

pesquisa de polifenóis, iridóides, saponinas, alcalóides e açucares

redutores.

2.1.2 Drogas e Reagentes

Acetato de Etila P. A (Vetec);

Acetona P. A (Merck);

Ácido Acético P. A (Merck);

Ácido Clorídrico P. A (Merck);

Ácido Fórmico P. A (Merck);

Ácido Sulfúrico P. A (Merck);

Ácido Ursólico (Extrasynthese);

Água Destilada;

Alúmen de Ferro a 1% (Merck);

Anidrido Acético P. A (Reagen);

Benzeno P. A (Merck);

n-Butanol P. A (Merck);

Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio P. A (Merck);

Clorofórmio P. A (Reagen);

Difenilborinatodeamino2etila (Merck);

Etanol P. A (Vetec);

Iodo-bismutato de Potássio;

Metanol P. A (Vetec);

Tampão Fosfato (pH = 5,0);

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

22

Tolueno P. A (Merck);

Vanilina P. A (Carlo Erba);

β-Amirina (Extrasynthese);

β-Sitosterol (Extrasynthese).

2.1.3 Equipamentos

Balança analítica;

Balança semi – analítica;

Câmara Ultra-Violeta (250 – 365 nm);

Estufa;

Placa aquecedora;

Câmara fotográfica;

Bomba de vácuo;

Rotaevaporador (Buchi Instruments).

2.1.4 Outros

Borrifadores para Revelação em Cromatografia em Camada Delgada

(CCD);

Placas prontas de Gel de Sílica 60 (Merck, art. 105553);

Cubas para CCD;

Duolite S-861;

Filmes fotográficos (Kodak).

2.1.5 Identificação do Material Botânico

Uma exsicata do material vegetal foi depositada no Herbário UFP –

Geraldo Mariz do Departamento de Botânica da Universidade Federal de

Pernambuco sob o número 34868, onde foi efetuada a identificação botânica do

mesmo.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

23

2.1.6 Coleta do Material Vegetal

Folhas de Ocimum campechianum Mill. foram coletadas no período de

Dezembro de 2003 a Janeiro de 2004, no município de Surubim, em

Pernambuco. O material vegetal acondicionado em sacos plásticos foi levado ao

Departamento de Antibióticos e mantido em local arejado, à temperatura ambiente

(300C), até sua utilização.

2.2 Metodologia

2.2.1 Preparação dos Extratos

Para a realização destes ensaios, foram preparados dois extratos: um

metanólico e outro benzênico. A extração foi efetuada utilizando-se as folhas

frescas, que, após trituradas e pesadas, foram submetidas ao processo de

infusão, sob agitação por 30 minutos, sendo os infusos obtidos, posteriormente,

filtrados.

2.2.2 Identificação dos Grupos de Moléculas

A análise cromatográfica foi realizada através de cromatografia em

camada delgada, utilizando-se placas prontas de gel de sílica 60 Merck, art.

105553, nas quais foram aplicadas alíquotas de 15 µL dos extratos previamente

preparados. Os sistemas de desenvolvimento e reveladores foram selecionados

de acordo com o grupo de moléculas a ser pesquisado, obedecendo aos

procedimentos do Laboratório de Farmacognosia, baseados nos estudos de

Harborne (1998), Wagner (1996); Markham (1982) e Florencio e Xavier (2003).

Os grupos de moléculas investigados através dos cromatogramas obtidos

foram os seguintes: alcalóides e açúcares redutores, polifenóis (cumarinas,

flavonóides, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, esteróides,

proantocianidinas condensadas, leucoantocianidinas, ácido gálico e taninos

hidrolisáveis), terpenos (monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, glicosídeos

de iridóides e saponinas).

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

24

2.2.3 Pesquisa de Polifenóis

A análise destas substâncias foi dividida em três etapas, em função da

metodologia utilizada para cada classe:

1. Pesquisa de cumarinas, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos e

flavonóides;

2. Pesquisa de proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas;

3. Pesquisa de taninos gálicos.

1. Cumarinas, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos e flavonóides

Para essa pesquisa foi preparado um cromatograma, empregando-se

como sistema de eluição polar acetato de etila – ácido fórmico – ácido acético –

água (100:11:11:26 v/v) e reagente de NEU (difenilborinatodeamino2etila), como

revelador.

O cromatograma foi observado sob luz ultravioleta (UV-365 nm), antes e

depois da aplicação do revelador e os resultados foram interpretados de acordo

com o Quadro 2.

Quadro 2 - Interpretação dos cromatogramas para a pesquisa de cumarinas,derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos e flavonóides.

Moléculas Antes da revelação Após a revelação

Cumarinas Intensa fluorescência azul Sem alteração

Derivados cinâmicos Fluorescência azul-claro Intensa fluorescência azul

Fenilpropanoglicosídeos Fluorescência azul-claro Fluorescência verde-

amarelada.

Flavonóides Fluorescência marrom-

escuro

Fluorescência do laranja

ao verde-musgo*

* A coloração varia de acordo com o esqueleto e os grupos substituintes das moléculas.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

25

2. Proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas

Os cromatogramas foram obtidos utilizando-se como fase móvel acetato

de etila – ácido fórmico – ácido acético – água (100:11:11:26 v/v) e vanilina

clorídrica a 1%, como revelador. O aparecimento de manchas em vermelho vivo

com Rf de valores muito baixos representam a presença de proantocianidinas

condensadas (taninos catéquicos). As manchas das leucoantocianidinas

apresentam a mesma coloração, porém o valor do Rf é superior a 0,5 dímeros ou

entre 0,8 a 0,9 monômeros.

3. Pesquisa de taninos gálicos

A investigação de taninos gálicos foi realizada obedecendo ao protocolo

experimental proposto por Stiasny (1912) modificado por Xavier (2003).

Inicialmente, foi realizada a investigação da presença de ácido gálico, cujo padrão

foi co-cromatografado com uma alíquota do extrato de Ocimum campechianum. A

placa cromatográfica foi submetida ao sistema de eluição acetato de etila-

benzeno-ácido fórmico (10:3:1 v/v) e à revelação com Alúmen de Ferro a 1%. A

presença de ácido gálico produz uma mancha de coloração azul quase preta com

um Rf aproximadamente igual a 0,60.

Em seguida, foram preparados 5 mL de uma solução a 10 % do extrato em

água destilada, que foi submetida a tratamento hidrolítico, utilizando-se 15 mL de

formol e 5 mL de ácido clorídrico concentrado, sob refluxo e agitação por 30

minutos. O hidrolisado, depois de frio, foi submetido a uma filtração simples em

papel. O filtrado foi lavado com água destilada e cromatografado em coluna de

Duolite S-861, eliminando-se como eluato o formol e o ácido. A resina foi lavada

com acetona para desadsorção dos fenóis aí retidos e a fração acetônica

submetida a CCD, como descrito previamente para o ácido gálico. No

cromatograma, as manchas produzidas pelo ácido gálico proveniente de taninos

apresentam uma coloração mais intensa do que aquelas pertencentes ao ácido

gálico que se encontra na forma livre, caso essas duas moléculas estejam

presentes no mesmo material vegetal.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

26

2.2.4 Pesquisa de Saponinas

Neste ensaio, foi preparada uma solução do extrato bruto em água, a qual

sofreu intensa agitação manual, observando-se então as suas características

afrogênicas. A presença de saponósidos promove a formação de espuma de

forma abundante e persistente, durante pelo menos 1 hora e deve ser confirmada

através de CCD, utilizando-se uma fase móvel polar e vanilina sulfúrica ou

anisaldeído como revelador.

2.2.5 Pesquisa de Monoterpenos e Sesquiterpenos

Uma alíquota do extrato foi submetida a CCD, utilizando-se tolueno-

acetato de etila (97:3 v/v) como sistema eluente. A revelação foi efetuada com

aplicação de soluções etanólicas de ácido sulfúrico a 5% e de vanilina a 2% e

posterior aquecimento em estufa a 1000C, durante 3 minutos. Ao reagirem com a

vanilina sulfúrica, moléculas terpênicas com baixo peso molecular, formam

manchas com coloração predominantemente entre o azul e o violeta.

2.2.6 Pesquisa de Triterpenos e Esteróides

A pesquisa dessas moléculas foi efetuada através de uma adaptação da

reação de Liebermann-Burchard à CCD (HARBORNE, 1998; SHARMA &

DAWRA, 1991). A fase móvel utilizada foi tolueno-acetato de etila (90:12) e as

placas cromatográficas foram reveladas utilizando-se o reagente de Liebermann-

Burchard (solução clorofórmica adicionada de anidrido acético e ácido sulfúrico

concentrado), seguido de aquecimento a 1000C em estufa, durante 5 minutos.

Manchas com colorações que variam do azul esverdeado (esteróides) ao

castanho avermelhado (triterpenos) são produzidas por essas moléculas em

presença do revelador (HASHIMOTO, 1970), quando observadas sob luz visível.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

27

2.2.7 Pesquisa de Alcalóides

O cromatograma foi submetido à fase móvel polar acetato de etila-ácido

fórmico-ácido acético-água (100:11:11:26 v/v), utilizando-se o reagente de

Dragendorff (iodo-bismutato de potássio) como revelador. O surgimento de

manchas com coloração laranja forte caracteriza a presença de alcalóides.

2.2.8 Pesquisa de Glicosídeos Iridóides

Algumas moléculas desse grupo (glicosídeos de monoterpenos

modificados, do tipo asperulina, aucubina e monoproteína) produzem uma

coloração violácea ao reagirem com vanilina sulfúrica (HARBORNE, 1998). A

cromatografia foi realizada, utilizando-se acetato de etila-ácido fórmico-ácido

acético-água (100:11:11:26 v/v) como fase móvel polar e aplicação de vanilina

sulfúrica, seguida de aquecimento a 1000C, durante 5 minutos, para a revelação.

2.2.9 Pesquisa de Açúcares Redutores

Alíquotas do extrato metanólico foram utilizadas para preparação dos

cromatogramas, que foram submetidos à fase móvel butanol-tampão fosfato, pH =

5,0 – acetona (4:1:5 v/v). A revelação foi realizada com solução metanólica a 4%

de cloreto de trifeniltetrazólio, seguida de aquecimento a 1000C, durante 5

minutos (RUSSEL, 1983). O aparecimento de manchas com coloração vermelho-

sangue indica a existência de açúcares redutores.

2.3 Resultados e Discussão

Análises cromatográficas do “Screening” Fitoquímico das Folhas de

Ocimum campechianum Mill.

Após a realização das análises cromatográficas dos extratos brutos

(benzênico e metanólico) das folhas de Ocimum campechianum, foram

identificados os seguintes grupos de moléculas:

Triterpenóides e esteróides: ácido ursólico

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

28

Monoterpenóides

Sesquiterpenóides

Eugenol

Polifenóis: fenilpropanoglicosídeos e flavonóides

Açucares redutores

2.3.1 Pesquisa de Polifenóis

No cromatograma, observado à luz ultravioleta (365 nm), manchas com

fluorescência laranja revelaram a presença de flavonóides e a existência de

fenilpropanoglicosídeos foi caracterizada pelo surgimento de manchas com

fluorescência verde como mostra a Figura 2. Manchas com forte fluorescência

azul pertencentes ás cumarinas não foram encontradas, indicando ausência

dessas moléculas.

Figura 2 – Cromatograma mostrando polifenóis encontrados nas folhas de Ocimumcampechianum, sob luz ultravioleta.

2.3.2 Pesquisa de Saponinas

Durante o ensaio de afrogenicidade (via úmida), a formação de espuma foi

escassa e pouco persistente. Para confirmação do resultado, foi realizada uma

cromatografia, que demonstrou ausência de saponinas.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

29

2.3.3 Pesquisa de Monoterpenos e Sesquiterpenos

Essas moléculas são terpenóides de baixo peso molecular e sua presença

foi evidenciada pelo aparecimento de várias manchas com Rf de valores

diferentes, conforme observado na Figura 3.

Figura 3 – Cromatograma mostrando mono e sesquiterpenos encontrados em Ocimumcampechianum.

A formação de uma mancha de fluorescência amarela sugere a presença

de eugenol. A existência dessa molécula foi confirmada através de uma co-

cromatografia realizada utilizando-se alíquotas de extratos de cravo da índia (1-

padrão) e de O. campechianum (2), havendo o aparecimento de duas manchas

com coloração e Rf semelhantes, como mostra a Figura 4.

Figura 4 - Cromatograma de eugenol encontrado em Ocimum campechianum.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

30

2.3.4 Pesquisa de Triterpenos e Esteróides

Para a investigação dessas moléculas foram utilizados padrões de ácido

ursólico (1), β – sitosterol (2) e β – amirina (3) que foram co-cromatografados com

uma alíquota do extrato. A presença de ácido ursólico foi evidenciada pelo

aparecimento de uma mancha semelhante à do padrão, como pode ser

observado na Figura 5.

Figura 5 – Cromatograma de terpenóides encontrados em Ocimum campechianum.

2.3.5 Pesquisa de Açúcares Redutores

Manchas de coloração vermelha, observadas na placa cromatográfica

(Figura 6), indicam a presença de açucares redutores nas folhas do vegetal.

Figura 6 - Cromatograma mostrando açúcares encontrados em Ocimum campechianum.(1) – EMF; (2) – EMF; (3) – padrão de glicose.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

31

Iridóides, alcalóides, cumarinas, derivados cinâmicos, proantocianidinas,

leucoantocinidinas, taninos gálicos e saponinas não foram encontrados, conforme

foi observado nos cromatogramas obtidos.

A presença de terpenóides, como monoterpenos e sesquiterpenos, e de

eugenol, confirma o que está descrito na literatura quanto à composição química

dos óleos essenciais extraídos do vegetal (JORGE et al., 1992; KHOSLA et al.,

1980).

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

32

Capítulo II: Atividade Biológica de Ocimum campechianum Mill.

1. Atividade Farmacológica

1.1 Revisão da Literatura

Tendo em vista a sua importância econômica, o gênero Ocimum tem sido

bastante estudado sob vários aspectos, inclusive quanto à atividade biológica de

suas espécies.

No Brasil, várias espécies de Ocimum são popularmente utilizadas para

tratar gripe, febre e problemas estomacais e ainda como analgésicos e

estimulantes (CORREA, 1984).

Investigações sobre a etnofarmacologia de Ocimum campechianum Mill.

revelaram que essa espécie é bastante utilizada na medicina popular de algumas

regiões do Brasil e do México, conforme demonstra o Quadro 3.

Quadro 3 – Usos medicinais de O. campechianum Mill. em algumas regiões do Brasil edo México.

Localidade Partes

Utilizadas

Formas de

Preparação

Usos Medicinais Referência

Caxiuanã-

Amazônia

folhas banho gripe Andrade et al.,

2003

Região do Vale do

Ribeira-São Paulo

folhas infusão bronquite, tosse e

infecções em geral

Stasi et al.,

2002

Pernambuco - - febre, distúrbios

intestinais, cefaléia,

gripe, como

diurético

Albuquerque,

1997

Yucatán, Oaxaca e

Veracruz

(México)

- -

afecções

gastrintestinais e

dermatológicas

Heinrich et al.,

1998

Oaxaca, Puebla

and Veracruz

(México)

folhas infusão limpeza de feridas e

diarréia

Zamora-

Martinez & Póla,

1992

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

33

O eugenol, principal constituinte químico de várias plantas pertencentes a

este gênero, é um líquido volátil com ação analgésica, antisséptica e anestésica

local, bastante usado na odontologia (THE MERCK INDEX,1996).

O extrato etanólico das folhas de Ocimum sanctum prolongou o tempo da

perda dos reflexos induzida por pentobarbital em ratos e reduziu o tempo e a

severidade de eletrochoques e convulsões induzidas por pentilenotetrazol

(SAKINA et al., 1990). O óleo essencial desse vegetal causou diminuição da

pressão sanguínea, quando administrado em cães anestesiados, e também o

aumento do tempo de coagulação sanguínea em ratos e do sono barbitúrico

induzido em camundongos (SINGH et al., 2001).

Extratos aquosos e metanólicos, obtidos a partir de O. sanctum, inibiram

inflamações agudas e crônicas, e promoveram ações analgésicas e antipiréticas

em ratos (GODHWANI et al., 1987).

Ratos tratados com o extrato acetônico de O. sanctum, por via tópica,

durante 15 dias, apresentaram redução de tumores (PRASHAR & KUMAR, 1995).

O óleo obtido das sementes foi administrado em camundongos albinos Swiss

(100 mL/kg de peso corpóreo), reduzindo significativamente tumores do tipo

fibrosarcomas induzidos na região da coxa dos animais (PRAKASH & GUPTA,

2000).

As toxicidades aguda e sub-crônica do óleo essencial de Ocimum

gratissimum foram investigadas através da administração de uma emulsão (4%

v/v) em ratos e camundongos, pelas vias intraperitoneal e oral. Durante os

ensaios, foi observado um efeito sedativo dose-dependente e significativas

alterações bioquímicas, hematológicas e histopatológicas (ORAFIDIYA et al.,

2004). O óleo essencial obtido das folhas mostrou efeitos antinociceptivos,

quando administrados por via oral em camundongos albinos Swiss (RABELO et

al., 2003).

Em estudos realizados na Colômbia, extratos das folhas, caule e raiz de O.

campechianum foram capazes de promover 24% de neutralização in vitro do

efeito hemorrágico produzido pelo veneno de B. atrox (OTERO et al., 2000).

Significativa diminuição da freqüência cardíaca foi observada em ratos, após a

administração de extratos brutos das folhas (40 mL/kg) de Ocimum

campechianum (RIBEIRO et al., 1986).

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

34

Extratos hidroalcoólicos (50:50, v/v) das folhas de O. campechianum

apresentaram efeitos diuréticos significativos, quando administrados oralmente

(40 mL/kg) em ratas Wistar (RIBEIRO et al., 1988).

Várias espécies de Ocimum foram ainda estudadas, demonstrando

atividades antiulcerogênica, anti-HIV, inseticida e nematicida (AKHTAR &

MUHAMMAD, 1989; AYISI & NYADEDZOR, 2003; BHATNAGAR et al., 1993;

CHATTERJEE et al., 1982).

1.2 Atividade Antiinflamatória

1.2.1 Material

1.2.1.1 Material Vegetal

Nos ensaios realizados para determinação da atividade biológica, foram

utilizadas folhas obtidas de espécimes adultos, coletadas no período

compreendido entre Janeiro e Março de 2003, no município de Surubim,

Pernambuco.

O material coletado foi acondicionado em sacos plásticos e depositado em

local arejado, para secagem e conservação à temperatura ambiente (300C),

sendo assim mantidos até sua utilização.

As folhas secas foram pesadas e submetidas à maceração com solvente

hidroalcoólico (70%), durante 7 dias. O produto foi então filtrado, eliminando-se,

posteriormente, o solvente, através de evaporação a vácuo, para obtenção do

extrato bruto, que foi solubilizado em solução salina 0,9% para a realização dos

ensaios de toxicidade aguda e determinação da DL50 (cf. ANEXO A),

antiinflamatório e antitumoral.

1.2.1.2 Animais

Para a realização deste ensaio, foram selecionados ratos Wistar machos

(Rattus norvegicus), com faixa etária de 60 dias e pesos entre 200 e 320 g, todos

provenientes do Biotério do Departamento de Antibióticos – UFPE. Divididos em

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

35

grupos de seis, os animais, mantidos em condições controladas de iluminação

(ciclo 12 horas claro/escuro) e temperatura (25 ± 20C), receberam água ad libitum,

sendo privados de alimento por um período de 18 horas antes do experimento.

1.2.1.3 Extrato Vegetal

Extrato bruto hidroalcoólico (70%) das folhas – EHF (10% p/v).

1.2.1.4 Drogas e Reagentes

Cloreto de Sódio a 0,9% (salina);

Carragenina (Sigma-Aldrich);

Indometacina (Merck Sharp & Dohme);

Tween 80 (Merck).

1.2.1.5 Equipamentos e Materiais

Plestimômetro (Ugo Basile Itália Modelo 7150);

Cronômetro;

Balança semi-analítica;

Balança analítica.

1.2.2 Metodologia

Para a indução do edema, foi utilizado 0,1 mL de carragenina a 1%, que foi

injetado na região subplantar da pata esquerda posterior dos animais

pertencentes aos grupos controle, padrão e teste (WINTER et al., 1962). Antes da

injeção de carragenina e 30 minutos após, foram medidos os volumes das patas.

Em seguida, procedeu-se à administração do extrato de Ocimum campechianum

(100 mg/kg) nos animais do grupo teste, de Indometacina (10 mg/kg) nos animais

do grupo padrão e de solução salina 0,9% no grupo controle. Posteriormente, os

volumes das patas continuaram sendo medidos em intervalos constantes de uma

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

36

hora com o auxílio de um pletismômetro (Ugo Basile Itália Modelo 7150), durante

um período de 6 horas.

Neste experimento, foram utilizadas as vias de administração oral e

intraperitoneal, tanto para a Indometacina como para o extrato testado.

O cálculo da redução percentual do volume da pata foi realizado através

de seguinte fórmula:

% de inibição do edema = (Vc – Vt/Vc) × 100

onde:

Vc = média do aumento do volume das patas dos animais do grupo

controle;

Vt = média do aumento do volume das patas dos animais do grupo teste

Os resultados observados nos grupos teste, padrão e controle foram

comparados entre si.

1.3 Atividade Antitumoral

1.3.1 Material

1.3.1.1 Animais

Para a investigação da atividade antitumoral, foram utilizados

camundongos albinos Swiss machos (Mus musculus), com aproximadamente 60

dias de idade e pesos entre 30 e 40 g, divididos em grupos de seis. Os animais

foram mantidos sob condições controladas de iluminação (ciclo claro/escuro de 12

horas cada) e temperatura de 25 ± 30C, em gaiolas de polipropileno. Eles

receberam alimentação específica e água ad libitum.

1.3.1.2 Extrato Vegetal

Extrato bruto hidroalcoólico (70%) das folhas – EHF (10% p/v).

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

37

1.3.1.3 Drogas e Reagentes

Cloreto de Sódio a 0,9% (salina);

Tween 80 (Merck);

Garamicina – 80 mg (Schering-Plough).

1.3.1.4 Equipamentos

Balança semi-analítica;

Balança analítica.

1.3.2 Metodologia

1.3.2.1 Implante da Massa Tumoral

Para o transplante dos tumores (sarcoma 180 e carcinoma de Ehrlich), a

massa tumoral retirada de um animal doador, após remoção do material

necrosado, foi fragmentada e colocada em solução antibiótica. Um fragmento

tumoral de cerca de 3 mm de diâmetro foi introduzido subcutaneamente na região

axilar do animal receptor (STOCK et al., 1955; KOMIYAMA & FUNAYAMA, 1992).

1.3.2.2 Testes de Inibição Tumoral

Para cada experimento, os animais transplantados foram divididos em dois

grupos: teste e controle. O grupo teste foi tratado com o extrato de Ocimum

campechianum, sendo administradas doses de 100 mg/kg de peso do animal

diariamente por via intraperitoneal, durante 8 dias. A quimioterapia experimental

teve início 48 horas após o transplante dos tumores. Ao término do tratamento,

todos os animais foram pesados e sacrificados, sendo os tumores retirados,

dissecados e pesados, para a observação de suas características macroscópicas

A inibição tumoral foi calculada segundo a fórmula abaixo

TWI% = C – T.100 C

onde:

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

38

TWI% = % de inibição tumoral

C = média dos pesos dos tumores dos animais do grupo controle

T = média dos pesos dos tumores dos animais do grupo teste

Os ensaios foram realizados conforme metodologia descrita por Geran et

al. (1972).

1.4 Estudo Histológico

Camundongos albinos Swiss pertencentes aos grupos teste e controle do

ensaio realizado para determinação da atividade antitumoral contra sarcoma 180

foram selecionados para uma investigação histológica dos testículos, que

apresentaram cianose durante o experimento.

Os animais, após terem sido anestesiados, foram colocados em decúbito

dorsal e submetidos a toracolaparotomia mediana. Em seguida, foram

perfundidos por via transcardíaca com uma solução salina (0,85%) e depois com

uma solução fixadora de formol (10%).

Dos animais sacrificados, foram retirados os testículos, que foram cortados

em pequenos fragmentos e imersos em solução de formol a 10%, no qual

permaneceram em temperatura ambiente durante 24 horas, segundo a

metodologia adaptada de Santiago (1991).

Após fixação, as peças foram lavadas e processadas para inclusão em

parafina. Em seguida, foram cortadas com 7m de espessura e coradas pela

técnica de Hematoxilina-Eosina (MICHALANY, 1980) e observadas em

microscopia óptica.

1.5 Resultados e Discussão

1.5.1 Atividade Antiinflamatória

Os animais tratados com Indometacina e com o extrato de Ocimum

campechianum Mill., por via oral, apresentaram diminuição no volume dos

edemas, quando comparados aos animais do grupo controle. Essa redução, no

entanto, foi significativa 4 horas após a administração do extrato, quando houve

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

39

um pico máximo de inibição dos edemas, conforme pode ser observado no

Gráfico 1. Nesta hora, o extrato promoveu maior redução do volume dos edemas

do que a Indometacina.

O Gráfico 2 mostra que houve redução do volume dos edemas nos ratos

tratados com Indometacina e com o extrato, por via intraperitoneal. Esses

resultados foram significativos, quando comparados aos do grupo controle, na 4a

hora após administração do extrato, que promoveu uma inibição mais acentuada

do que a Indometacina.

Gráfico 1 – Comparação do desenvolvimento do edema de pata induzido com injeçãosubplantar de carragenina em ratos machos tratados com Indometacina, extrato deOcimum campechianum Mill. e Solução Salina 0,9%, por via oral. Os valores representama média do volume dos edemas (mL) EPM (Erro Padrão Médio). Resultadossignificativos na 4a hora, quando comparado ao grupo controle, para p < 0,05 (ANOVAseguida do teste t de Student).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6

TEMPO (horas)

VO

LU

ME

MÉ

DIO

DO

ED

EM

A (

mL

)

Controle

Padrão

Tratado

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

40

Gráfico 2 - Comparação do desenvolvimento do edema de pata induzido com injeçãosubplantar de carragenina em ratos machos tratados com Indometacina, extrato deOcimum campechianum Mill. e Solução Salina 0,9%, por via intraperitoneal. Os valoresrepresentam a média do volume dos edemas (mL) EPM (Erro Padrão Médio).Resultados significativos na 4a hora, quando comparado ao grupo controle, para p < 0,05(ANOVA seguida do teste t de Student).

1.5.2 Atividade Antitumoral

O extrato foi testado contra dois tipos de tumores: sarcoma 180 e

carcinoma de Ehrlich, apresentando resultados significativos em ambos os testes.

Sarcoma 180

Como pode ser observado no Gráfico 3, houve significativa inibição

tumoral no grupo de animais tratados com o extrato de Ocimum campechianum,

quando comparado ao grupo controle.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6

TEMPO (horas)

VO

LU

ME

MÉ

DIO

DO

ED

EM

A (

mL

)

CONTROLE

PADRÃO

TRATADO

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

41

0,74169

0,42963

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

GRUPOS DE ANIMAIS

MÉ

DIA

DO

S P

ES

OS

DO

S T

UM

OR

ES

(g

)Grupo co ntro leGrupo tratado

Gráfico 3 – Comparação das médias dos pesos dos tumores sarcoma 180 emcamundongos machos tratados com extrato bruto das folhas de Ocimum campechianumMill. e Solução Salina 0,9%, por via intraperitoneal. Resultados significativos, quandocomparado ao grupo controle, para p < 0,05 (teste t de Student).

Carcinoma de Ehrlich

A inibição tumoral observada nos animais tratados com o extrato foi

bastante significativa em relação aos animais do grupo controle (Gráfico 4).

1,469

0,2668

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

GRUPOS DE ANIMAIS

MÉ

DIA

DO

S P

ES

OS

DO

S T

UM

OR

ES

(g

)

Grupo co ntro leGrupo tratado

Gráfico 4 - Comparação das médias dos pesos dos tumores carcinoma de Ehrlich emcamundongos machos tratados com extrato bruto das folhas de Ocimum campechianumMill. e Solução Salina 0,9%, por via intraperitoneal. Resultados significativos, quandocomparado ao grupo controle, para p < 0,05 (t de Student).

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

42

O extrato, no entanto, foi mais ativo contra o carcinoma de Ehrlich, que

apresentou maior índice de inibição, quando comparado ao sarcoma 180, como

demonstra o Gráfico 5.

81,84%

42,07%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

CARCINOMA DEEHRLICH

SARCOMA 180

GRUPOS DE ANIMAIS TRATADOS

INIB

IÇÃ

O T

UM

OR

AL

(%)

Gráfico 5 – Comparação do percentual de inibição tumoral apresentado pelos grupos decamundongos portadores de sarcoma 180 e carcinoma de Ehrlich, tratados com o extratode Ocimum campechianum. Resultados significativos, quando comparado ao grupocontrole, para p < 0,05 (ANOVA seguida do teste t de Student).

1.5.3 Estudo Histológico

Análise dos aspectos morfológicos dos testículos de camundongos

tratados com extrato das folhas de Ocimum campechianum Mill.

Na análise histológica dos testículos, foi observada a presença de uma

cápsula fibrosa (túnica albugínea) preservada, recobrindo os túbulos seminíferos

(Figura 7), com aspecto semelhante ao do grupo controle (Figura 8).Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

43

Figura 7 - Fotomicrografia de testículos de camundongos do grupo tratado com O.campechianum Mill., mostrando túbulo seminífero (1), tecido intersticial e células de Leydig(2) corado com HE. Obj. 10×.

Figura 8 - Fotomicrografia de testículos de camundongos do grupo controle, mostrandotúbulo seminífero (1), tecido intersticial e células de Leydig (2) corado com HE. Obj. 10×.

Internamente, o epitélio estratificado dos túbulos seminíferos que

resguarda as células germinativas (espermatogônia, espermatócito, espermatides

e espermatozóides) e células não germinativas (célula de Sertoli) aparentemente

não apresentou alteração morfológica, assim como as respectivas células (Figura

9). O tecido e as células intersticiais (células de Leydig) também mostraram uma

morfologia com aspecto provavelmente normal semelhante ao grupo controle

(Figura 10).

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

44

Figura 9 - Fotomicrografia do túbulo seminífero (1) e tecido intersticial com células deLeydig (2) de camundongos do grupo tratado com O. campechianum Mill. corado com HE.Obj. 20×.

Figura 10 - Fotomicrografia do túbulo seminífero de camundongos do grupo controlecorado com HE, mostrando espermatogônias (1), espermatócitos (2), espermátides (3),espermatozóides (4).

A ação de Ocimum campechianum Mill. não apresentou influência na

organização estrutural das peças analisadas. A topografia dos testículos dos

animais tratados com Ocimum campechianum Mill. não mostrou nenhuma

alteração na morfologia das gônadas.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

45

2. Atividade Antimicrobiana

2.1 Revisão da Literatura

Várias espécies do gênero Ocimum apresentam na composição de seus

óleos essenciais substâncias biologicamente ativas de caracter fungicida

(REUVENI et al., 1984) e bactericida (NTEZURUBANZA et al., 1984).

O óleo essencial de O. gratissimum foi testado “in vitro” sobre fungos

filamentosos responsáveis por dermatites humanas e demonstrou possuir ação

fungicida (LIMA et al., 1993). Extratos de O. gratissimum mostraram-se eficazes

contra Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes (NWOSU & OKAFOR, 1995).

A ação fungicida de óleos essenciais de O. gratissimum foi comparada

com a de fungicidas sintéticos e foi constatado uma atividade direcionada para

Candida albicans, Sporothrix schenkii, Epidermophyton cresens, Microsporum

gypsum e Tricophyton mentagrophytes, bem como bactérias Gram-positivas e

Gram-negativas (SINHA & GULATI, 1990).

Óleos essenciais extraídos das partes aéreas de Ocimum basilicum L.

mostraram significativa atividade antimicrobiana contra isolados clínicos

multiresistentes pertencentes aos gêneros Staphylococus, Enterococus e

Pseudomonas, microrganismos que apresentam sérias dificuldades terapêuticas

devido ao seu alto nível de resistência (OPALCHENOVA & OBRESHKOVA,

2003).

Extratos alcoólico e aquoso de Ocimum sanctum foram testados contra

patógenos entéricos e Candida albicans, mostrando ampla zona de inibição em

torno dos discos. O extrato alcoólico foi mais ativo contra Vibrio cholerae, já o

extrato aquoso mostrou maior ação frente a Klebisella, E. Coil, Proteus e

Staphylococcus aureus (GEETA et al., 2001).

Quatro espécies de Ocimum foram testadas quanto à atividade

antimicrobiana. Óleos essenciais de O. canum, O. gratissimum, O. trichodon e O.

suave foram ativos contra Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococus aureus

e Trichophyton mentagrophytes (JANSSEN et al., 1989).

Através da realização de ensaios “in vitro”, foi constatada a atividade

antimicrobiana de óleos essenciais obtidos das folhas de O. campechianum Mill.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

46

contra B. subitilis, S. aureus, M. luteus, E. coli, S. marcescens e A. oryzae

(CARVALHO et al., 1999). Extratos metanólicos e aquosos das folhas desse

vegetal foram ativos contra Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e

Salmonella typhi em concentrações superiores a 2 mg/mL e contra as formas

tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, a 500 ppm (NAVARRO et al., 2003).

2.2 Procedimento Experimental

2.2.1 Material

2.2.1.1 Extratos Vegetais

Extrato bruto hidroalcoólico (70%) das folhas – EHF (10% p/v);

Extrato bruto hidroalcoólico (80%) das folhas – EHF (50% p/v);

Extrato bruto metanólico das folhas – EMF (10% p/v);

Extrato bruto com acetato de etila das folhas – EAEF (10% p/v);

Extrato bruto benzênico das folhas – EBF (10% p/v).

2.2.1.2 Meios de Cultura

Bactérias:

Ágar Mueller - Hinton (Oxoid) – utilizado para a manutenção e determinação

da atividade antibacteriana.

Caldo Mueller - Hinton (Oxoid) – utilizado para a preparação dos inóculos

bacterianos.

Fungos:

Ágar Sabouraud (Vetec) - utilizado para a manutenção e determinação da

atividade antifúngica.

Caldo Sabouraud (Vetec) - utilizado para a preparação dos inóculos fúngicos.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

47

2.2.1.3 Microrganismos

Para a investigação da atividade antimicrobiana, foram utilizadas bactérias

Gram positivas, Gram negativas e fungos leveduriformes pertencentes ao gênero

Candida.

Cocos Gram positivos: Staphylococus aureus-ATCC 6538;

Staphylococus aureus-IC 133;

Staphylococus aureus-IC 155;

Micrococus flavus-DAUFPE 06.

Bacilos Gram negativos: Escherichia coli-DAUFPE 84;

Enterobacter sp.-IC 06.

Fungos Leveduriformes: Candida albicans-DAUFPE 1007;

Candida krusei-DAUFPE 1002.

2.2.1.4 Padrões Antimicrobianos

Cetoconazol (potência: 1000 µg/mL);

Discos de Norfloxacina com 30 µg (DMD).

2.2.1.5 Solventes

Acetato de Etila P. A (Vetec);

Água destilada;

Benzeno P. A (Merck);

Clorofórmio P. A (Labsynth);

Etanol P. A (Vetec);

Metanol P. A (Vetec);

Propileno Glicol P. A (Vetec).

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

48

2.2.1.6 Equipamentos

Alça de platina;

Autoclave;

Balança analítica;

Capela de fluxo laminar;

Estufa bacteriológica;

Forno de microondas;

Micropipetas automáticas;

Swabs esterilizados.

2.2.2 Metodologia

2.2.2.1 Método de Difusão em Agar

Para a determinação da atividade antimicrobiana dos extratos de O.

campechianum Mill., foi utilizado o Método de Difusão em Meio Sólido (BAUER &

KIRBY, 1966), através do qual é possível determinar se o microrganismo é

sensível ou resistente a uma determinada substância numa concentração

conhecida (MOURA et al., 1992). Essa metodologia baseia-se na inibição do

crescimento de um microrganismo semeado na superfície do meio de cultura

sólido. Esta inibição é avaliada de acordo com um halo formado em torno de um

disco de papel de filtro impregnado com a droga.

2.2.2.2 Preparação dos Extratos

Extrato bruto hidroalcoólico (70%) das folhas – EHF (10%p/v)

O extrato hidroalcoólico (70%) das folhas secas, obtido através de

maceração, após filtração, foi submetido à evaporação para eliminação do

solvente. Em seguida, foram pesados em balança analítica, 500 mg do mesmo e

dissolvidos em 5 mL de clorofórmio, obtendo-se uma solução de concentração

100 mg/mL.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

49

Extrato bruto hidroalcoólico (80%) das folhas – EHF (50% p/v);

As folhas, depois de pesadas, foram submetidas à maceração, utilizando-

se solvente hidroalcoólico (80%), e posterior filtração, para obtenção do extrato a

ser testado.

Demais extratos

Os extratos metanólico, benzênico e de acetato de etila foram obtidos a

partir das folhas, através do processo de infusão, sob agitação por 30 minutos, e

posterior filtração. Alíquotas destas soluções foram reservadas para investigação

da atividade antimicrobiana.

2.2.2.3 Preparação do Padrão Antifúngico

Solução de Cetoconazol a 1000 µg/mL foi utilizada como padrão

antifúngico e discos de papel de filtro padronizados foram saturados com esta

solução de modo a obter discos com uma concentração de 20 µg.

Discos de Norfloxacina (DMD) contendo 30 µg foram utilizados como

padrão antimicrobiano.

2.2.2.4 Preparação dos Inóculos Microbianos

A partir das culturas mantidas sob refrigeração foram preparadas culturas

em Caldos Mueller – Hinton ou Sabouraud. Os inóculos foram então incubados a

370C por 24 horas. Em seguida, foi realizada a padronização dos inóculos pela

comparação da cultura suspensa em água destilada esterilizada com uma

suspensão padrão correspondente a 0,5 da escala de Mac Farland (MURRAY et

al., 1995), o que equivale a 108 unidades formadoras de colônias (UFC/mL).

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

50

2.2.2.5 Semeio

Após padronização, as suspensões de micorganismos foram semeadas

sobre os meios sólidos de Mueller-Hinton ou de Sabouraud por esgotamento,

utilizando-se swabs esterilizados. Discos de papel com 6 mm de diâmetro e peso

de 30 ± 4 cm2 foram saturados com os extratos de Ocimum campechianum ou

com o padrão antimicrobiano. Após eliminação do solvente, estes discos foram

depositados sobre a superfície dos meios previamente semeados. As placas

foram incubadas a 370C por 24 horas (ACAR et al., 1996 & COURVALIN et al.,

1985).

2.2.2.6 Leitura

Após o período de incubação, foram realizadas as leituras dos diâmetros

dos halos de inibição em torno dos discos contendo os extratos ou os padrões,

utilizando-se, para isso, uma régua milimetrada.

2.2.3 Resultados e Discussão

Os extratos de O. campechianum foram testados com o objetivo de

verificar sua atividade antimicrobiana. Após a leitura dos halos de inibição, foi

observado que os extratos não foram ativos frente aos microrganismos testados.

O padrão Cetoconazol apresentou halos de inibição em torno dos discos

de 35 mm e 40 mm para Candida albicans DAUFPE 1007 e Candida krusei 1002,

respectivamente. Os halos produzidos pelo padrão Norfloxacina foram os

seguintes:

Staphylococus aureus-ATCC 6538 – 23 mm

Staphylococus aureus-IC 133 – 23 mm

Staphylococus aureus-IC 155 – 20 mm

Micrococus flavus-DAUFPE 06 – 16 mm

Escherichia coli-DAUFPE 84 – 20 mm

Enterobacter sp.-IC 06 – 23 mm

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

51

3 - CONCLUSÃO

Os ensaios realizados contribuíram para o conhecimento das atividades

biológicas (toxicológica, farmacológica e antimicrobiana) e identificação do perfil

fitoquímico de O. campechianum Mill.

De acordo com os resultados obtidos no estudo farmacoquímico, foi

observada a presença de eugenol, monoterpenos e sesquiterpenos, triterpenóides

e esteróides, polifenóis (fenilpropanoglicosídeos e flavonóides) e açucares

redutores. Iridóides, alcalóides, cumarinas, derivados cinâmicos,

proantocianidinas, leucoantocinidinas, taninos gálicos e saponinas não se

mostraram presentes nos cromatogramas obtidos.

A avaliação da toxicidade aguda permitiu a observação de várias reações

nos animais, como: tremores, piloereção, contorções abdominais e efeitos sobre a

respiração. A DL50 resultante neste ensaio foi de 1017,4 mg/kg de peso do animal,

sabendo-se que, até a dose 625 mg/kg, o extrato bruto hidroalcoólico (70%) das

folhas não provocou morte de nenhum animal, quando administrado por via

intraperitoneal.

O extrato hidroalcoólico (70%) apresentou atividade antiedematogênica

significativa 4 horas após sua administração pelas vias intraperitoneal e oral,

causando redução do volume dos edemas de pata em ratos machos,

caracterizando atividade antiinflamatória. Apresentou também significativo efeito

antitumoral frente aos tumores sarcoma 180 e carcinoma de Ehrlich, quando

administrados em camundongos machos por via intraperitoneal.

A análise dos aspectos morfológicos dos tecidos dos testículos de

camundongos tratados com extrato das folhas de Ocimum campechianum Mill.

para determinação da atividade antitumoral demonstrou não haver alterações

significativas na organização estrutural do material analisado.

Vários extratos de O. campechianum foram testados contra algumas

espécies de fungos e bactérias para a investigação de sua atividade

antimicrobiana, mas não se mostraram ativos frente aos microrganismos testados.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

52

4 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ACAR, K. A.; OGUNLEYE, V. O.; ASHIDI, J. S. Antimicrobial potential Spondiasmombin, Croton zambesicus and Zygotritonia crocea. Phytother. Res., v. 13, p.494-497, 1996.

AKHTAR, M. S.; MUHAMMAD, M. Evaluation of the gastric antiulcerogenic effectsof Solanum nigrum, Brassica oleracea and Ocimum basilicum in rats. J.Ethnopharmacol., v. 27, n. 1-2, p. 163-176, 1989.

ALBUQUERQUE, U. P. Contribuição ao estudo das alfavacas no Brasil. Rev.Bras. Farm., v. 78, n. 4, p. 74-78, 1997.

ALMEIDA, C. de F. C. B. R. de; ALBUQUERQUE, U. P. de. Check-list of theFamily Lamiaceae in Pernambuco, Brazil. Braz. Arch. Biol. Technol., v. 45, n. 3,p.343-353, 2002.

ANDRADE, E. H. A.; RIBEIRO, A. F.; SILVA, M. H. L. da; ZOGHBI, M. G. B.;MAIA, J. G. S. Plantas medicinais aromáticas usadas pelas populaçõestradicionais de Caxiuanã. In: Montag, L. F. de A.; Maschio G. F. (eds.). Livro deResumos Seminário. Belém: Museu Paraense Emilio Goeldi, 2003. n. 6.

ASHA, M. K.; PRASHANTH, D.; MURALI, B.; PADMAJA, R.; AMIT, A.Anthelmintic activity of essential oil of Ocimum sanctum and eugenol. Fitoterapia,v. 72, n. 6, p. 669-670, 2001.

AYISI, N. K.; NYADEDZOR C. Comparative in vitro effects of AZT and extracts ofOcimum gratissimum, Ficus polita, Clausena anisata, Alchornea cordifolia, andElaeophorbia drupifera against HIV-1 and HIV-2 infections. Antiviral Res., v. 58,n. 1, p. 25-33, 2003.

BAUER, A. W.; KIRBY, W. M. Antibiotic susceptibility testing by a standard singledisc method. Am. J. Clin. Pathol., n. 45, p. 493-499, 1966.

BEKELE, J.; HASSANALI, A. Blend effects in the toxicity of the essential oilconstituents of Ocimum kilimandscharicum and Ocimum kenyense (Labiateae) ontwo post-harvest insect pests. Phytochemistry, v. 57, p. 385–391, 2001.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

53

BHATNAGAR, M., et al. Laboratory evaluation of inseticidal proprieties of Ocimumbasilicum Linnaeus and O. sanctum Linnaeus plant’s essential oils their majorconstituents against mosquito species. J. Entomol. Res., v. 17, p. 21-26, 1993.

BUDAVARI, S. (Ed.).The Merck Index. 12 ed. New Jersey: Merck & Co., Inc.Whitehouse Station, 1996. 3947 p.

CAMPÊLO, C. R. Contribuição ao estudo das plantas medicinais no Estado deAlagoas I. Sci. Sap., v. 9, p. 18-22, 1990.

CARVALHO, J. C. T.; VIGNOLI, V. V.; SOUZA, G. H. B. de; UJIKAWA, K.; NETO,J. J. Antimicrobial activity of essential oils from plants used in brazilian popularmedicine. Acta Hort., 501, p. 77-81, 1999.

CHARLES, D. J.; SIMON, J. E.; WOOD, K. V. Essential oil constituents of Ocimummicranthum Willd. J. Agric. Food Chem., v. 38, p. 120-122, 1990.

CHATTERJEE, A.; SUKUL, N. C.; LASKAL, S.; GHOSHMAJUMDAR, S.Nematicidal principles from two species of Lamiaceae. J. Nematol., v. 14, p. 118-120, 1982.

CHOGO, J. B.; CRANK, G. Chemical composition and biological activity of theTanzanian plant Ocimum suave. J. Nat. Prod., v. 44, n. 3, p. 308-311, 1981.

COE, F. G.; GREGORY, J. A. Screening of medicinal plants used by the Garífunaof Eastern Nicaragua for bioactive compounds. J. Ethnopharmacol., v. 53, n. 1,p. 29-50, 1996.

CORREA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticascultivadas. Rio de Janeiro: IBDF, 1984. v. 1, p. 63-64.

CORREA, M. P. Dicionário das plantas úteis e das exóticas cultivadas. Rio deJaneiro: Ministério da Agricultura, 1978. 84 p.

COURVALIN, P., et al. L’Antibiogramme. 1 ed. Paris: MPC-Videom, 1985. 343 p.

CRAVEIRO, A. Secretory tissue in plant. New York: Academic Press, 1981. p.158-222.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

54

DARRAH, H. H. The cultivated basils. Independence: Buckeye PrintingCompany, 1980.

EKUNDAYO, O. Essential oils. VIII. Volatile constituents of leaves of Ocimumviride. Planta Med., n. 3, p. 200-202, 1986.

FLORENCIO, D. C.; XAVIER, H. S. Prospecção fitoquímica em farmacognosia II.In: CONGRESSO DE GRADUAÇÃO, 4. 2003. Recife. Anais... Recife: UFPE,2003.

GEETA; VASUDEVAN, D. M.; KEDLAYA, R.; DEEPA, S.; BALLAL, M. Activity ofOcimum sanctum (the traditional Indian medicinal plant) against the entericpathogens. Indian J. Med. Sci., v. 55, n. 8, p. 434-438, 472, 2001.

GERAN, R. I.; SCHUMCH, A. M.; ABBOTT, B. J.; GREENBERG, N. H.;MACDONALD, M. M. Protocols for screening chemical agents and natural-products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother.Rep., part 3, n. 3, v.2, 1972.

GODHWANI, S.; GODHWANI, J. L.; VYAS, D. S. Ocimu sanctum: Anexperimental study evaluating its anti-inflammatory, analgesic and antipyreticactivity in animals. J. Ethnopharmacol., v. 21, n. 2, p. 153-163, 1987.

GRANDI, T. S. M.; TRINDADE, J. A. Plantas medicinais de Minas Gerais, Brasil.In: CONGRESSO NACIONAL DE BOTÂNICA, 1989, Cuiabá. Anais... Cuiabá:Universidade Federal de Mato Grosso, 1989. 406 p.

GUENTHER, E. The essential oils. 3 ed. Florida: Robert E. Krieger Publ. Co.Malabar, 1949. p. 399-433.

HARBORNE, J. B. Phytochemical methods. 3ed. London: Chapman & Hall,1998. 288 p.

HASHIMOTO, Y. Diferenciação de esteróides e triterpenóides pela reação corada.An. Acad. Bras. de Ciências, n. 42 (Suplemento), p. 95-96, 1970.

HEDGE, I. C. A global survey of the biogeography of the Lamiaceae. In: HARLEYR. M.; REYNOLDS, T. (eds.). Advances in Labiatae Science. UK, 1992. p 7-17.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

55

HEINRICH, M.; ANKLI, A.; FREI, B.; WEIMANN, C.; STICHER, O. Medicinalplants in mexico: healers' consensus and cultural importance. Soc. Sci. Med., v.47, n. 11, p. 1859-1871, 1998.

JANSSEN, A. M.; SCHEFFER, J. J. C.; NTEZURUBANZA, L.; SVENDSEN, A. B.Antimicrobial activities of some Ocimum species grown in Rwanda. J.Ethnopharmacol., v. 26, n. 1, p. 57-63, 1989.

JORGE L. I. F.; ROQUE N. F.; FERRO V. O. Ocimum micranthum Willd. –Manjericão do Brasil. Caracterização histológica e química. Rev. Inst. AdolfoLutz, v. 52, n. 1/2, 1992.

KHOSLA, M. K. Study on inter-relationship, phylogeny and evolutionary tendencesin genus Ocimum. J. Plant Anat. Morphol., v. 6, n.1, p. 93-106, 1993.

KHOSLA, M. K.; PUSHPANGADAN, P.; THAPPA, R. K.; SOBTI, S. N. Search fornew aroma chemicals from Ocimum species. III. Studies on genetic variability foressential oil and other allied characters of South American species O. micranthumWilld. Indian Perf., v. 24, n. 3, p. 148-152, 1980.

KOMIYAMA, K.; FUNAYAMA, S. Antitumor agents. In: OMURA, S. (edt.). Thesearch for bioactive compounds from microrganisms. New York: Spriger-Verlag, 1992. p. 79-97.

LAWRENCE, B. M. Chemical components of Labiatea oils and their exploitation.In: HARLEY R. M.; REYNOLDS, T. (eds.). Advances in Labiatae Science. RoyalBotanics Gardens, Kew, 1992. p. 399-436.

LAWRENCE, B. M.; Proceedings of the 11th International Congress ofEssential Oils, Fragrance and Flavors, New Delhi, India, 1989.

LAWRENCE, B. M.; HOGG, J. W.; TERHUNE, S. J.; PICHITAKUL, N. Essentialoils and their constituents. IX. The oils of Ocimum sanctum and Ocimum basilicumfrom Thailand. Flavor Ind., p. 47-49, 1972.LIMA, E. O.; GOMPERTZ, O. F.; GIEABRECHT A. M.; PAULO M. Q. In Vitroantifungal activity of essential oils obtained from officinal plants againstdermatophytes. Mycoses, v. 36, n. 9/10, p. 333 – 336, 1993.

MARKHAM, K. R. Techiniques of flavanoids identificacion. London: Acad.Press., 1982. p.52-61.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

56

MARTINS, E. R.; CASTRO, D. M.; CASTELLANI, D. C.; DIAS, J. E. Plantasmedicinais. Viçosa: UFV, 1994. 220 p.

MICHALANY, J. Métodos selecionados de coloração e de impregnação argêntica.In: MICHALANY, J. Técnica histológica em Anatomia Patológica cominstruções para cirurgião, enfermeira e citotécnico. São Paulo: EPU, 1980.179 p.

MOOKHERGJEE, B. D.; MUSSIAN, C. J. Essential oils. USA: Allurel PlublishingCorp., 1979.

MOURA, R. R., et al. Técnicas de Laboratório. 3ed. Rio de Janeiro: Atheneu,1992. 263 p.

MURILLO, E.; VINÃ, A. Essential oil composition from twelve varieties of basil(Ocimum spp) grown in Colombia. J. Braz. Chem. Soc., v. 14, n. 5, p. 744-749,2003.

MURRAY, P. R.; BAROU, E. J.; FALLER, M. A.; TENOVER, F. C.; YOLKEN, R. H.Manual of clinical microbiology. 6 ed. Washington: American Society ofMicrobiology, 1995.

NAVARRO, M. C.; MONTILLA, M. P.; CABO, M. M.; GALISTEO, M.; CACERES,A.; MORALES, C.; BERGER, I. Antibacterial, antiprotozoal and antioxidant activityof five plants used in Izabal for infectious diseases. Phytother. Res., v. 17, n. 4, p.325-329, 2003.

NTEZURUBANZA, L.; SCHEFFER, J. J. C.; LOOMAN, A.; SVENDSEN, A. B.Composition of essential oil of Ocimum kilimandischaricum grown in Rwanda.Planta Med., v. 50, n. 5, p. 385-388, 1984.

NWOSU, M. O.; OKAFOR, J. I. Preliminary studies of the antifungal activities ofsome medicinal plants against Basidiobolus and some other pathogenic fungi.Mycoses, v. 38, n. 5/6, p. 191-195, 1995.

OPALCHENOVA, G.; OBRESHKOVA, D. Comparative studies on the activity ofbasil – an essential oil from Ocimum basilicum L. – against multidrug resistantclinical isolates of the genera Staphylococus, Enterococus and Pseudomonas byusing different test methods. J. Microbiol. Methods, v. 54, n. 1, p. 105-110, 2003.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

57

ORAFIDIYA, L. O.; AGBANI, E. O.; IWALEWA, E. O.; ADELUSOLA, K. A.;OYEDAPO, O. O. Studies on the acute and sub-chronic toxicity of the essential oilof Ocimum gratissimum L. leaf. Phytomedicine, v. 11, n. 1, p. 71-76, 2004.

OTERO, R.; NÚNEZ, V.; BARONA, J.; FONNEGRA, R.; JIMÉNEZ, S. L.;OSORIO, R. G.; SALDARRIAGA, M.; DÍAZ, A. Snakebites and ethnobotany in thenorthwest region of Colombia Part III: Neutralization of the haemorrhagic effect ofBothrops atrox venom. J. Ethnopharmacol., v. 73, p. 233–241, 2000.

PRAKASH, J.; GUPTA, S. K. Chemopreventive activity of Ocimum sanctum seedoil. J. Ethnopharmacol., v. 72, p. 29–34, 2000.

PRASHAR, R.; KUMAR, A. Chemopreventive action of Ocimum sanctum on 2,12dimethilbenzen (A) ontraceno DMBA-induced papillomagenesis in the skin ofmice. Int. J. Pharmacog., v. 33, n. 3, p. 181-187, 1995.

RABELO, M.; SOUZA, E. P.; SOARES, P. M. G.; MIRANDA, A. V.; MATOS, F. J.A.; CRIDDLE, D. N. Antinociceptive properties of the essential oil of Ocimumgratissimum L. (Labiatae) in mice. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 36, n. 4, p. 521-524, 2003.

REUVENI, R.; FLEISHER, A.; PUTIEVSKY, E. Fungistatic activity of essential oilsfrom Ocimum basilicum chemotypes. Phytopath. Z, v. 110, p. 20-22, 1984.

RIBEIRO, R. de A.; BARROS, F. de; MELO, M. M. R. F. de; MUNIZ, C.; CHIEIA,S.; WANDERLEY, M. das G.; GOMES, C.; TROLIN, G. Acute diuretic effects inconscious rats produced by some medicinal plants used in the state of São Paulo,Brasil. J. Ethnopharmacol., v. 24, p.19-29, 1988.

RIBEIRO, R. de A.; MELO, M. M. R. F. de; BARROS, F.; GOMES, C.; TROLIN, G.Acute antihypertensive effect in conscious ratsproduced by some medicinal plantsused in the state of São Paulo. J. Ethnopharmacol., v. 15, p. 261- 269, 1986.

RIZZO, J. A. Banco de dados – plantas medicinais e tóxicas. In: CONGRESSONACIONAL DE BOTÂNCIA, 36., 1990. Resumos... Curitiba. v. 2, p. 691-714.

RUSSEL, J. L. Contribuition a l’etude botanique et Chiniotaxonomique duGenre Verbascum em Languedoc-Cevennes.1983. Tese de Doutorado -Universidade de Montpelier I.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

58

SAKINA, M. R.; DANDIYA, P. C.; HAMDARD, M. E.; HAMEED, A. Preliminarypsychopharmacological evaluation of Ocimum sanctum leaf extract. J.Ethnopharmacol., v. 28, n. 2, p. 143-150, 1990.

SANTIAGO, R. C. Aspectos ultra-estruturais e morfométricos de células dopâncreas de ratos albinos submetidos à alcoolização crônica. 1991.Tese deDoutorado - – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de SãoPaulo, Ribeirão Preto.

SHARMA, O. P.; DAWRA, R. K. Thin-layer chromatographic separations oflantadens, the pentacyclic triterpenoids from (Lantana camara) plant. J. Chrom.,587, p. 351-354, 1991.

SHULTZ, A. R. Introdução ao estudo da botânica sistemática. Rio de Janeiro:Editora Globo, 1961. v. 2, 286 p.

SILVA, M. G. de V.; CRAVEIRO, A. A.; MACHADO, M. I. L.; ALENCAR, J. W.;MATOS, F. J. A.; AURELIO, F. K. F. Essential oils from leaves and inflorescencesof Ocimum micranthum Willd. from northeastern Brazil. J. Essent. Oil Res., v. 10,n. 1, p. 77-78, 1998.

SIMON, J. E.; CHADWICK, A. F.; CRAKER, L. E. Herbs: an indexed bibliography1971-1980. In: The scientific literature on selected herbs, and aromatic andmedicinal plants of the temperate zone. Hamden: Archon Books, 1984.

SIMON J. E.; QUINN J.; MURRAY R. G. Basil: A source of essential oils. In:JANICK J.; SIMON J. E. (eds.). Advances in new crops. Portland: Timber Press,1990. p. 484-489.

SIMON, J. E.; VIEIRA, R. F. Chemical characterization of Basil (Ocimum spp.)found in the markets and used in traditional medicine in Brazil. Econ. Bot., v. 54,n. 2, p. 207-216, 2000.

SINGH, S.; REHAN, H. M. S.; MAJUMDAR, D. K. Effect of Ocimum sanctum fixedoil on blood pressure, bloodclotting time and pentobarbitone-induced sleepingtime. J. Ethnopharmacol., v. 78, p. 139–143, 2001.

SINHA, G. K.; GULATI, B. C. Antibacterial and antifungal study of some essentialoils and some of their constituents. Indian Perf., v. 34, n. 02, p. 126-129, 1990.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

59

SOBTI, S. N.; PUSHPANGADAN, P.; ATAL, C. K. Clocimum: A new hybrid strainof Ocimum gratissimum as a potential source of clove type oil, rich in eugenol. In:ATAL, C. K.; KAPUR, B. M (eds.). Cultivation and utilization of aromatic plants.Jammu-Tawi: Reg. Res. Lab., 1982. p. 473-480.

STASI, L. C. di; OLIVEIRA, G. P.; CARVALHAES, M. A.; QUEIROZ-JUNIOR, M.;TIEN, O. S.; KAKINAMI, S. H.; REIS, M. S. Medicinal plants popularly used in theBrazilian Tropical Atlantic Forest. Fitoterapia, v. 73, p. 69-91, 2002.

STIASNY, E. The qualitative and differenciation of vegetable tannins.Collegium, 1912. p. 483-499.

STOCK, C. C., et al. Sarcoma 180 inhibition screening data. Cancer Res., supl. 2,p. 179 – 194, 1955.

WAGNER, H.; BLADT. S. Plant drug analyses. A Thin Layer ChromatographyAtlas. 2ed. Berlin: Springer Verlag, 1996. 384 p.

WINTER, C. A.; RISHLEY, E. A.; NUSS, G. W. Carrageenan induced edema enhind paw as an assay for anti-inflamatory drugs. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., v. 3,p. 544-547, 1962.

XAASAN, C. C.; CABDULRAXMAAN, A. D.; PASSANNANTI, S.; PIOZZI, F.;SCHMID, J. Constituents of essential oil of Ocimum canum. J. Nat. Prod., v. 44,p. 752–753, 1981.

ZAMORA-MARTINEZ, M. C.; PÓLA, C. N. de P. Medicinal plants used in somerural populations of Oaxaca, Puebla and Veracruz, Mexico. J. Eillnapãruãlagy, v.35, p. 229-251, 1992.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

ANEXOS

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

ANEXO A - Artigo enviado para publicação – Revista Brasileira de Ciências

da Saúde

Avaliação da Toxicidade Aguda e Determinação da DL50 do Extrato das

Folhas de Ocimum campechianum Mill.

Evaluation of the Acute Toxicity and Determination of the LD50 of the

Extract of the Leaves of Ocimum campechianum Mill.

Sabrina Torres de Sousa1

Ivone Antônia de Souza2

Eulália Azevedo Ximenes3

Jane Sheila Higino4

Aldo César Passilongo da Silva5

Elisângela Christianne Barbosa da Sliva6

1. Aluna do Curso de Mestrado em Ciências Farmacêuticas. Departamento de

Ciências Farmacêuticas/CCS/UFPE. Av. João de Barros, n.633, apt0 1104, Ed.

Carpina, Boa Vista, CEP-50100-020,. Recife-PE, Brasil, sab.t.s@bol.com.br.

2. Profa. Dra. do Departamento de Antibióticos. CCB/UFPE.

3. Profa. Dra. do Departamento de Antibióticos. CCB/UFPE.

4. Profa. Dra. do Departamento de Farmácia. CCS/UFPE.

5. Aluno do Curso de Mestrado em Ciências Farmacêuticas. Departamento de

Ciências Farmacêuticas/CCS/UFPE.

6. Aluna do Curso de Mestrado em Ciências Farmacêuticas. Departamento de

Ciências Farmacêuticas/CCS/UFPE.

Instituição onde o trabalho foi desenvolvido: Universidade Federal de Pernambuco

Apoio financeiro: CAPES

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

Resumo

Ocimum campechianum Mill. é um arbusto pertencente ao gênero

Ocimum, rico em óleos essenciais constituídos por substâncias biologicamente

ativas, que apresentam atividades antimicrobiana e analgésica. O objetivo deste

trabalho foi determinar a toxicidade aguda do estrato bruto hidroalcoólico (70%)

das folhas de Ocimum campechianum, avaliando-se parâmetros gerais de

toxicidade (mortes, tremores, lacrimejamento, piloereção, ptose, contorções

abdominais, efeitos sobre a respiração, movimentação e tônus muscular). Foram

utilizadas doses intermediárias entre 625 e 3000 mg/kg por via intraperitoneal em

camundongos adultos machos (n=6). As principais reações observadas nos

animais foram tremores, piloereção, contorções abdominais, e efeitos sobre a

respiração. A DL50 encontrada foi de 1017,4 mg/kg de peso do animal. Os

resultados permitiram concluir que doses do extrato estudado acima de 625

mg/kg apresentaram toxicidade aguda em camundongos, quando administradas

por via intraperitoneal.

Palavras-chave: Ocimum campechianum, toxicidade aguda, extrato

hidroalcoólico.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

Abstract

Ocimum campechianum Mill. is a shrub that concern to genus Ocimum,

rich in essential oils composed for biologically-active substances that present

antimicrobial and analgesic activities. The aim of this work was performed to

determine the acute toxicity of the hydro-alchoolic crude extract of Ocimum

campechianum leaves by the evaluation of general toxicity parameters (mortality

rate, tremor, lacrimation, piloerection, ptosis, writhing and effects on respiration,

movement and muscular tonus). Intermediates doses among 625 e 3000 mg/kg

were utilized by intraperitoneal route and administered to male adult mice (n=6).

The principals effects observed were tremors, piloerection, writhing and effects on

respiration. The LD50 found corresponded to 1017,4 mg/kg. According to the

obtained results it can be concluded that doses of the studied extract above 625

mg/kg presented acute toxicity in mice when administered by intraperitoneal

routes.

Key Words: Ocimum campechianum, acute toxicity, hydro-alchoolic extract .

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

INTRODUÇÃO

O gênero Ocimum é considerado um dos mais importantes dentre os 220

constituintes da família Lamiaceae, devido à riqueza de suas espécies em óleos

essenciais (SIMON, 1990), que são secreções vegetais bastante ricas em

compostos biologicamente ativos (CHATTERJEE et al., 1982; REUVENI et al.,

1984; NTEZURUBANZA et al., 1984).

Óleos essenciais extraídos de várias espécies pertencentes a este gênero

têm apresentado atividades antiinflamatória, antitumoral, analgésica e fungicida

(GODHWANI et al., 1987; PROSHAR & KUMAR, 1995; CRAVEIRO et al. 1981;

LIMA et al., 1993).

A espécie demonstrou possuir atividades alucinogênicas (PINKLEY, 1969),

sugerindo possuir ação sobre o sistema nervoso central.

Quando se pretende estudar as ações terapêuticas de qualquer

substância, é de suma importância a investigação de sua toxicidade, com a

realização de testes em animais, antes de administrá-la ao homem (DALE, 2000).

As doses tóxicas de uma substância podem promover efeitos imediatos ou

no decorrer de alguns dias, podendo também causar óbito de 50% dos animais do

grupo (DL50) utilizado no ensaio. Quando se administra um composto, os seus

efeitos são observados pelas reações comportamentais, através de sinais e

sintomas de intoxicação.

A DL50 é um parâmetro utilizado para expressar a toxicidade de uma droga.

É possível ainda se determinar as doses consideradas efetivas que se

correlacionam com aquelas que irão determinar o índice terapêutico (IT) para

aumentar a margem de segurança.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

MATERIAL E MÉTODOS

Folhas de Ocimum campechianum foram coletadas no município de

Surubim do estado de Pernambuco. O material botânico seco foi triturado, pesado

e submetido ao processo de maceração, utilizando-se solvente hidroalcoólico a

70%. O produto resultante foi filtrado e o solvente foi eliminado por evaporação a

vácuo, obtendo-se 15,76 g de extrato bruto.

Camundongos albinos Swiss machos (Mus musculus), com faixa etária de

60 dias e pesos entre 25 e 35g, foram selecionados e divididos em grupos de seis

animais. Mantidos em gaiolas de polipropileno, em temperatura de 25 ± 30C e

condições controladas de iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas cada), os

animais receberam água ad libitum e foram privados de alimento por 12 horas

antes do experimento.

A via de administração utilizada foi a intraperitoneal e os extratos foram

solubilizados em solução fisiológica a 0,9% para obtenção das doses desejadas.

Para a realização da investigação da toxicidade aguda, foi utilizada a

metodologia preconizada por Karber e Behrens (1964). O ensaio foi dividido em

duas fases: preliminar e definitiva. Na fase preliminar, foram administradas doses

crescentes entre 625 e 3000 mg/kg de peso do animal com o objetivo de se

determinar a maior dose que não apresenta letalidade (D1) e a menor dose capaz

de provocar morte de 100 % dos animais do grupo (D2). Com base nos dados da

etapa preliminar, os animais receberam doses crescentes entre D1 e D2, com a

finalidade de se determinar a DL50 (dose letal para 50% de um grupo de animais),

concluindo-se a fase definitiva. Os animais ficaram sob observação durante 2

horas após a administração de cada dose, realizando-se anotações a cada 10

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

minutos, sendo, a partir de então, acompanhados periodicamente durante 48

horas.

A DL50 foi calculada utilizando-se a seguinte fórmula:

DL50 = Df - ∑(a.b)/n

Onde:

Df = dose mínima capaz de matar todos os animais

a = diferença entre duas doses consecutivas

b = média de animais mortos entre duas doses consecutivas

n = número total de animais por lote

RESULTADOS

No quadro 1 estão relacionadas as doses que apresentaram efeitos mais

significativos durante a fase preliminar.

Os efeitos estimulantes permaneceram durante, aproximadamente, 40

minutos após administração do extrato, quando foi verificado o aparecimento dos

efeitos depressores.

Concluída a etapa preliminar do estudo de toxicidade, foi iniciada a fase

definitiva, a partir da qual foi possível calcular a DL50 e construir a curva dose-

resposta da letalidade do extrato vegetal testado. Foram então administradas

doses intermediárias entre 625 e 3000 mg/kg, calculadas de acordo com uma

progressão geométrica de razão 1,2. Os efeitos tóxicos resultantes desta última

etapa podem ser conferidos no quadro 2, onde estão relacionadas as doses mais

relevantes.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

A partir dos dados encontrados em ambas as etapas, foi calculada a DL50,

que resultou em 1017,4 mg/kg de peso do animal.

A curva dose-resposta, construída a partir dos resultados provenientes do

ensaio realizado, está representada na figura 1, mostrando que doses acima de

2687,4 mg/kg foram capazes de matar 100% dos animais.

DISCUSSÃO

As reações comportamentais verificadas a partir dos efeitos causados

pelas doses administradas foram sugestivas de ação sobre o sistema nervoso,

tanto em nível central como periférico.

As substâncias que atuam no sistema nervoso central podem agir

estimulando-o ou inibindo-o. As ações estimulantes são provocadas por drogas

capazes de bloquear a inibição ou causar excitação neuronal direta, através de

três mecanismos: aumento da liberação do transmissor ou do seu tempo de ação,

labilização da membrana pós-sináptica ou redução do tempo de recuperação

sináptica. Drogas que atuam levando à redução na quantidade de transmissor

liberado pelo impulso nervoso, bem como à depressão geral da resposta pós-

sináptica e do movimento iônico promovem depressão do SNC (GILMAN et al.,

1996).

As reações de excitabilidade, movimentos esteriotipados, tremores,

movimentos circulares foram freqüentemente observadas com as diversas doses

testadas, sugerindo a presença de compostos estimulantes do SNC. Efeitos

característicos de ações depressoras também foram observados, sendo os mais

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

comuns sonolência e acomodação, o que ocorreu aproximadamente 40 minutos

após administração do extrato.

A atuação das drogas no sistema nervoso periférico ocorre através da

interação com os receptores ou da interferência na síntese, recaptação ou

liberação de seus neurotransmissores (DALE, 2000). Dentre os efeitos em nível

periférico, foram observadas alterações nos sistemas vascular e digestivo.

A determinação de uma dose terapêutica segura é de suma importância

para o uso de uma droga. Através da DL50, é possível calcular o índice terapêutico

de uma substância, fornecendo alguma idéia da margem de segurança no uso da

mesma (DALE, 2000). Determinada a DL50 do extrato vegetal estudado, pode-se

estimar uma dose adequada para realização do estudo de sua atividade biológica.

REFERÊNCIAS

1. CHATTERJEE A, SUKUL NC, LASKAL S, GHOSHMAJUMDAR S. Nematicidal

principles from two species of Lamiaceae. J. Nematol. 14: 118-120, 1982.

2. CRAVEIRO A. Secretory tissue in plant. New York: Academic Press, 1981, p.

158-222.

3. DALE MM, RANG HP, RITTER JM. Farmacologia. 4 ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2001.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

4. DODHWANI S, GODHWANI JL, VYAS DS. O. Sanctum: na experimental study

evaluating its anti-inflamatory, analgesic and antipyretic activity in animals.

Journal of ethnopharmacology, 12 (02): 153-164, 1987.

5. GILMAN, A. G. et al. (Ed.). Goodman & Gilman As bases farmacológicas da

terapêutica. 9 ed. México: McGraw-Hill, 1996.

6. KARBER G, BEHRENS B. Estatistical Methods in Biological Assays. London:

Ed. Griffin Ch. and C., 1964.

7. JORGE LIF, ROQUE NF, FERRO VO. – Ocimum micranthum Willd. –

Manjericão do Brasil. Caracterização histológica e química. Rev. Inst. Adolfo

Lutz, 52 (1/2): 1992.

8. LIMA EO, GOMPERTZ OF, GIEABRECHT AM, PAULO MQ. In Vitro antifungal

activity of essential oils obtained from officinal plants against dermatophytes.

Mycoses, 36 (9/10): 333 – 336, 1993.

9. NTEZURUBANZA L, SCHEFFER JJC, LOOMAN A, SVENDSEN AB.

Composition of essential oil of Ocimum kilimandischaricum grown in

Rwanda. Planta Medica, p. 385-388, 1984.

10. PINKLEY HV. Plant admixtures to ayahuasaca, the South América

hallucinegic drink. Lloydia, 32: 305 – 14, 1969.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

11. PIO CORREA, M. – Dicionário das plantas úteis e das exóticas cultivadas. Rio

de Janeiro, Ministério da Agricultura, 1978, p. 84.

12. PRASHAR R, KUMAR A. Chemopreventive action of Ocimum sanctum on

2,12 dimethilbenzen (A) ontraceno DMBA-induced papillomagenesis in the

skin of mice. International journal of pharmacognosy, 33 (03): 181-187,

1995.

13. REUVENI R, FLEISHER A, PUTIEVSKY E. Fungistatic activity of essential oils

from Ocimum basilicum chemotypes. Phytopath. Z, 110: 20-22, 1984.

14. SHULTZ, A. R. – Introdução ao estudo da botânica sistemática. Rio de

Janeiro: Editora Globo, v. 2, 1961, p. 286.

15. SIMON JE, QUINN J, MURRAY RG. Basil: A source of essential oils. In:

Janick J, Simon JE, Advances in new crops. Oregon: Timber Press,

Portland, 484 – 489, 1990.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

Quadro 1 - Efeitos toxicológicos e letalidade relacionados às doses administradas

na fase preliminar.

EFEITOS OBSERVADOSDose

(mg/kg) ESTIMULANTES DEPRESSORES OUTROS EFEITOS

625

Aumento da freqüência

respiratória, agressividade,

piloereção, tremores,

movimento de vibrissas,

excitabilidade, ereção de

cauda, movimentos

esteriotipados, convulsão.

Diminuição da freqüência

respiratória, alteração do

sistema músculo-

esquelético (deambulação

difícil), alteração de marcha.

Contorções, espasmos,

reações de fuga,

levantamento de

membros anteriores,

fotofobia, excreção fecal

(diarréia), diurese.

1000

Aumento da freqüência

respiratória, agressividade,

discreta piloereção, tremores

finos, excitabilidade, ereção de

cauda, movimentos

esteriotipados, emissão de

ruídos, saltos, postura em

garra.

Alteração de marcha,

prostração, sonolência,

arrastamento da cauda.

Diurese, excreção fecal

com muco, espasmos,

fotofobia, reação de fuga,

equilíbrio sobre as patas

posteriores, reações de

fuga, contorções, irritação

ao redor da boca. Houve

óbito de apenas um

animal.

1500

Aumento da freqüência

respiratória, excitabilidade,

piloereção, ereção de cauda,

movimento de vibrissas,

postura em garra.

Alteração de marcha

(marcha lenta), diminuição

da freqüência respiratória,

sonolência.

Espasmos, diurese

contorções, palidez,

reação de fuga.

Ocorreram quatro óbitos,

alteração da coordenação

motora.

3000

Aumento da freqüência

respiratória, excitabilidade,

piloereção, ereção de cauda,

movimentos circulares,

movimentos esteriotipados,

agressividade, tremores finos,

saltos, postura em garra.

Alteração de marcha,

abaixamento dos membros

posteriores, sonolência.

Lacrimejamento,

espasmos, distensão

abdominal, diurese

(observada apenas em

um dos animais),

contorções, palidez,

perda de líquido

intersticial, edema das

faces, excreção fecal

(fezes pastosas),

escurecimento dos olhos.

Morreram seis animais.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

Quadro 2 - Efeitos toxicológicos e letalidade relacionados às doses administradas

na fase definitiva.

EFEITOS OBSERVADOSDose

(mg/kg) ESTIMULANTES DEPRESSORES OUTROS EFEITOS

900

Aumento da freqüênciarespiratória, piloereção,excitabilidade, ereção decauda, movimentosesteriotipados.

Diminuição da freqüênciarespiratória, sonolência.

Contorções, fotofobia,diurese, palidez. Apenas umanimal morreu.

950

Aumento da freqüênciarespiratória, piloereção,excitabilidade, ereção decauda, movimentosesteriotipados.

Diminuição da freqüênciarespiratória, sonolência.

Diurese, excreção fecal commuco, fotofobia, contorções,edema de focinho, palidez,exoftalmia, rompimentocapilar ao longo da cauda.Houve óbito de doisanimais.

1080

Aumento da freqüênciarespiratória, excitabilidade,piloereção, ereção decauda, movimentosesteriotipados, movimentode vibrissas.

Alteração de marcha,sonolência, diminuição dafreqüência respiratória,acomodação.

Contorções, excreção fecal,exoftalmia, escurecimentodos testículos, levantamentode membros anteriores.Morreram três animais.

1555,2

Aumento da freqüênciarespiratória, tremores finosexcitabilidade, piloereção,ereção de cauda,movimentos esteriotipados,movimento de vibrissas,movimentos circulares,saltos.

Alteração de marcha,diminuição da freqüênciarespiratória, abaixamento demembros posteriores, perdada coordenação motora.

Espasmos, contorções,palidez, reação de fuga,excreção fecal,escurecimento dostestículos. Ocorreram quatroóbitos.

1866,24

Aumento da freqüênciarespiratória, excitabilidade,piloereção, ereção decauda, movimentosesteriotipados, movimentoscirculares.

Alteração de marcha,abaixamento de membrosposteriores, acomodação.

Espasmos, contorçõesabdominais intensas efreqüentes, palidez,excreção fecal (fezespastosas), edema defocinho, dificuldade paradefecar, excreção nasal,diurese, distensãoabdominal, rompimentocapilar ao longo da cauda,escurecimento dostestículos. Cinco animaismorreram.

2687,4

Aumento da freqüênciarespiratória, excitabilidade,piloereção, ereção decauda, movimentosesteriotipados, movimentode vibrissas.

Sonolência, dispnéia, perdada coordenação motora.

Contorções abdominais,exoftalmia, diurese,escurecimento dostestículos, levantamento demembros anteriores.Morreram todos os animais.

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

Fig. 1. Curva dose-resposta da toxicidade da O. Campechianum Mill.

0

20

40

60

80

100

2,6 2,8 3 3,2 3,4 3,6

Log da Dose

Leta

lidad

e (%

)

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw

De: rebrasa

Para: sab.t.s@bol.com.br

Data: 11/05/2004 09:18

Assunto: Artigo da Rebrasa

Sabrina Torres de Sousa,

recebemos o seu trabalho pelos Correios. Está faltando o disquete

com o artigo. Mande-nos urgente (caixa postal correta 5131). Enquanto

isso, o seu artigo está na avaliação para posterior contato informando

os consertos a serem feitos para publicação.

Henrique Gil

Editor da Rebrasa

Zeon P

DF Driv

er T

rial

www.zeon

.com.tw